TR201806939T4 - Paroksismal nokturnal hemoglobinuri tedavisi için masp 1 ve/veya Masp 3 ün inhibe edilmesine yönelik bileşimler ve yöntemler. - Google Patents

Abstract

Bir yönünde buluş, MASP-3?e bağımlı kompleman aktivasyonunu inhibe etmek için etkili bir miktarda bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarını içeren bir bileşimin deneğe uygulanmasıyla paroksismal nokturnal hemoglobinüriden muzdarip bir denekte MASP-3?e bağımlı kompleman aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik yöntemleri ve bileşimleri sağlamaktadır. Bir diğer yönünde buluş, kırmızı kan hücrelerinin sağkalımını arttırmak için etkili olan bir MASP-1 inhibitör maddesinden ve/veya bir MASP-3 inhibitör maddesinden en az birisinin bir miktarını içeren bir bileşimin deneğe uygulanmasıyla paroksismal nokturnal hemoglobinüriden muzdarip bir denekte kırmızı kan hücrelerinin sağkalımının arttırılmasına yönelik yöntemleri ve bileşimleri sağlamaktadır. Bazı yapılandırmalarda, deneğe, bir MASP-2 inhibitör maddesi ve bir MASP-1 inhibitör maddesi, bir MASP-2 inhibitör maddesi ve bir MASP-3 inhibitör maddesi, bir MASP-3 inhibitör maddesi ve bir MASP-1 inhibitör maddesi veya bir MASP-1 inhibitör maddesi, bir MASP-2 inhibitör maddesi ve bir MASP-3 inhibitör maddesi uygulanmaktadır.

Description

TARIFNAME PAROKSISMAL NOKTURNAL HEMOGLOBINURI TEDAVISI IÇIN MASP- 1 VE/VEYA MASP- 3'ÜN INHIBE EDILMESINE YÖNELIK BILESIMLER VE YÖNTEMLER ÖNCEKI TEKNIK Kompleman sistemi, insanlarda ve diger omurgalüârda mikrobiyal enfeksiyona ve diger akut travmalara immün yan-[baslatmak, güçlendirmek ve organize etmek için bir erken hareket eden mekanizmayEtaglamaktadEl(M.K. Liszewski and J.P. Atkinson, 1993, in Fundamental aktivasyonu, potansiyel patojenlere karsEldegerli birinci basamak savunmayüsaglarken, koruyucu, inflamatuvar bir yanmüarüßn kompleman aktiviteler de hosta potansiyel bir tehdidi temsil edebilmektedir (K.R. Kalli, ve ark., Springer Semin. Immunopathol. 15:417- proteolitik ürünler, nötrofilleri kullanlEl ve aktif hale getirir. Konak defansEl için daglfllâmayabilirken, aktif halde nötrofiller, ylKIEEl enzimlerin saIIIilara aylEli edilmemektedir ve organ hasar. yol açabilmektedir. Ek olarak, kompleman aktivasyonu, mikrobiyal hedeflerin yanüslß, konak hücrelerinin de yakIlEUa konak hücre lizisi ile sonuçlanarak sekilde litik kompleman bilesenlerinin birikimine yol açabilmektedir.

Kompleman sistemine, miyokardiyal enfarktüs, inme, ARDS, reperfüzyon hasarüseptik sok, termal yanilZlardan sonra kapiler smüpostcardiopulmoner bypass inflamasyonu, transplant rejeksiyonu, romatoid artrit, multipl skleroz, miyastenia gravis ve Alzheimer hastal[giEtlahil saylîlZ akut ve kronik hastalik] kosullarlElI patojenezinde vurgu yapllîhlgtlü Neredeyse bu kosullari hepsinde, kompleman bir sebep degildir, fakat patojenezde dahil olan çesitli faktörlerden bir tanesidir. Buna karslEl, kompleman aktivasyonu, büyük bir patolojik mekanizma olabilir ve bu hastalilZJ kosullarIan bir çogunda klinik kontrolün etkili bir noktasIEtemsil etmektedir. Çesitli hastalik] kosullarIa kompleman araclIIIdoku hasarII öneminin büyüyen tanilanmasüetkili kompleman inhibitör ilaçlar. olan ihtiyaca vurgu yapmaktadE Günümüzde, C5'e karsElbir antikor olan Ekulizumab (Solaris®), insanda kullanIi için onaylanmlgltek kompleman hedefleyici ilaçtlB Bununla birlikte, C5, kompleman sisteminde “asag Blonde" konumlandlEllân çesitli efektör moleküllerden birisidir ve C5 blokajlÇI kompleman sisteminin aktivasyonunu inhibe etmemektedir. Bu sekilde, kompleman aktivasyonunun ilk adllarlElI bir inhibitörü, bir “asagElyönde” kompleman inhibitörü üzerinde önemli avantajlar sahip olmaktadlü Mevcut olarak, kompleman sisteminin, üç seçkin yol üzerinden aktif hale getirilebilmesi genis oradan kabul edilmektedir: klasik yol, lektin yolu ve alternatif yol. Klasik yol genellikle yabancEl bir partiküle (örn. bir antijen) antikor bagEIile baglanmaktadlB ve bu sekilde, spesifik antikorun olusumu için bu antijene olan önceki maruziyete gerek duymaktadEi Klasik yolun aktivasyonu, konak vasitâslîla bir önceki adaptif immün yari- bagllîrbldugu için, klasik yol, edinilen immün sisteminin bir bölümüdür. Buna karslü, lektin ve alternatif yollar, adaptif immüniteden bagIislîUEve kal[t3al immün sisteminin bir bölümüdür.

Kompleman sisteminin aktivasyonu, serin proteaz zimogenlerinin sßillîlaktivasyonu ile sonuçlanmaktadlE Klasik yolun aktivasyonun olan bir ilk asama, özel bir tanIilama molekülünün C1q, antijen bagDgG ve IgM, bagIlEi C1q, C1 olarak adlandlEiilân bir kompleks olarak C1r ve Cl'ler serin proteaz proenzimleri ile iliskilendirilmektedir. Clq'nun, bir immün sistemine baglanmasII üzerine, Clr'nin Arg-Ile alanlEliEl otoproteolitik bölünmesi, bu sekilde C4 ve C2'yi ayßabilme kabiliyetini edinen C1'Ierin C1r aracIIJIlhöIünmesi ve C1'Ier aktivasyonu tarafIan takip edilmektedir. C4, iki fragmana bölünmektedir, C4a ve C4b olarak belirlenmektedir ve benzer bir sekil C2, C2a ve C2b'ye bölünmektedir. C4b fragmanlarübitisik hidroksil veya amino gruplarla kovalent baglarüalusturabilmektedir ve aktif halde C2'nin C3a fragmanEiIe kovalent olmayan etkilesim vaslâsiýla C3 konvertazE(C4b2a) üretebilmektedir.

C3 konvertazEl(C4b2a), C5'i bölerek hücre lizisinde elde edilen hücresel membranlariZI kesebilen membran saldüilompleksinin formasyonuna (C6, C7, C8 ve 09 ile birlestirilen C5b, aynlîamanda "MAC" olarak da adlandiîllfhaktadiiî) yol açan C5 konvertazII (C4b2a3b) üretimine yönelen C3a ve C3b ait bilesenlerine proteolitik bölünme vasltîisisîla C3'ü aktif hale getirmektedir. C3 ve C4'ün (C3b ve C4b) aktif halde olan formlarüçoklu fagositler üzerinde kompleman reseptörler ile tanilanan yabancüîiedef yüzeylerde biriktirilmektedir.

Bagnsiîibir sekilde, lektin yolu ile kompleman sistemin aktivasyonuna yönelik ilk adli ayrlîla iliskili serin proteazlarI aktivasyonu ile takip edilen özel tanIilama moleküllerinin baglanmasIIB Fakat, C1q ile immün komplekslerinin baglanmaslian ziyade, lektin yolu üzerinde bulunan tannlama molekülleri, kolektif olarak lektinler olarak ifade edilen karbonhidrat baglaylEEbroteinlerdir (Manan baglaylEEIektin (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L- kapllZl eritrositleri vermesi için baglanma üzerine, kompleman sistemini aktif hale protein ailesinin bir elemanüblan MBL, piranoz halkasII ekvatorel düzleminde yönlendirilen 3 ve 4-hidroksi gruplarla karbonhidratlarEbaglayan kalsiyuma bagilEbir Iektindir. MBL için öne ç[Kbn Iigandlar bu sekilde D-mannoz ve N-asetil-D-glukozamin olurken, bu sterik gereksinime uymayan karbonhidratlar, MBL için tespit edilemez affiniteye sahiptir (Weis, etkilesim, tek haneli milimolar arallEta genellikle bozunma sabitleri ile oldukça zaylEI olmaktadlB MBL birbirleri ile yakI bir temas halinde yerlestirilen çok say. monosakkarit kallEtElile es zamanlElolarak etkilesime geçerek avidite vaslßslýla glikan Iigandlara SIKÇ] spesifik baglantüla ulasmaktadE (Lee ve ark., Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992)). MBL, bakteri, maya, parazitler ve belirli virüsler gibi genellikle mikroorganizmalarü tasarlayan karbonhidrat modellerini tannlamaktadß Buna karsi MBL, D-galaktoz ve sialik asidi tannlamamaktadlîl mevcut olan “olgun” kompleks glikokonjügatlarEl genellikle tasarlayan sondan bir evvelki ve son sekerleri tanIilamamaktadlB Bu baglama özgüllügünün, oldugu düsünülmektedir. Fakat, MBL, yüksek affinite ile N bagllîglikoproteinlerde bulunan yüksek mannoz “prekürsör” glikanlarII kümelerine ve endoplazmik retikulüm ve Memeli hücrelerinin Golgisinde tek basi olan glikolipidlerle baglanmaktadlEI(Maynard ve ark., J. ortaya çlElarllâbiIen polinükleotidleri, DNA ve RNA'yEIbaglayabildigi gösterilmistir (Palaniyar ve 748 (2009)). Bu sekilde, hasar alan hücreler, MBL baglayEHJglElvaleislîla Iektin yolu aktivasyonu için potansiyel hedeflerdir.

Fikolinler, fibrinojen benzeri alan olarak adlandlEllân MBL'den farklEtürde bir lektin alan- sahiptir. Fikolinler, bir Ca++-bagIiIEbir sekilde seker kallEtllârIEbaglamaktadlEl Insanlarda (L-fikolin, M-fikolin ve H-fikolin), gibi üç türde fikolin tannlanmlSIlB Serum fikolinleri olan L- fikolin ve H-fikolin, N-asetiI-D-glukozaminin bir özgüllügüne aleni olarak sahiptir, fakat H- fikolin, aynllamanda N-asetiI-D-galaktozamine de baglamaktadlEl L-fikolin, H-fikolin, CL-11 ve MBL seker özgüllügünde bulunan bir fark, farklljektinlerin, üst üste gelmesine ragmen tamamlayüîblabildigi ve farklEhedef glikokonjügatlar olabildigi anlam. gelmektedir. Bu konsept, sadece L-fikolinin belirgin bir sekilde lipoteikoik aside, Gram-pozitif bakterilerde bulunan bir hücre çeperi glikokonjügat- bagland[gll:llektin yolunda bilinen Iektinlerin güncel Asetile seker parçalar. ek olarak, fikolinler aynlîlzamanda asetile amino asitleri ve Kollektinler (örn. MBL) ve fikolinler, amino asit sekansIa önemli bir benzerlik tasnamaktadlü Fakat, proteinlerin iki grubu, benzer alan organizasyonlar. sahiptir ve C1q gibi, çok alanlEbaglantlîilasiIJEIlIilnaksimuma çiKbrtan oligomerik yapllâra düzenlenmektedir.

MBL'nin serum konsantrasyonlarßagl[Klüiopülasyonlar aç-an oldukça degiskendir ve bu, MBL geninin promoterinde ve kodlama bölgelerinde polimorfizm/mutasyonlar sayesinde genetik olarak kontrol edilmektedir. Bir akut faz proteini olarak, MBL ekspresyonu ayrlîh inflamasyon esnasIa yukarEl regüle edilmektedir. L-ûkolin, MBL'ninkiIere benzer konsantrasyonlarda serumda mevcuttur. Bu sekilde, lektin yolunun L-fikolin kolu, güç bakIilEtlan MBL kolu ile potansiyel olarak klsîlaslanabilmektedir. MBL ve fikolinler aynEi zamanda fagositlerin, MB- ve fikolin ile tasarlanmgyüzeyleri hedef almasiEla olanak saglayan ogoninler olarak islev gösterebilmektedir (bkz. Jack ve ark., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 Insan MBL'si, MBL ile iliskili serin proteazlarD(MASP'Iar) olarak adlandElIân benzersiz C1r/C1'Ier benzeri serin proteazlarla kolajen benzeri alan üzerinden spesifik ve yüksek affiniteli bir etkilesimi olusturmaktadlEi Bugüne kadar, üç MASP tarif edilmistir. Ilk olarak, tek bir enzim “MASP”, kompleman kaskadIdan (örn. C2 ve C4 ayrilihasLIl sorumlu olan enzim olarak belirlenmistir ve karakterize edilmistir (Matsushita ve ark., JExp Med 176(6):1497- aktivitesinin asIlEUa iki proteaz. bir karSlînllIibldugu belirlenmistir: MASP-1 ve MASP-2 (Thiel kompleman aktivasyonu için yeterli oldugu gösterilmistir (Vorup-Jensen, T., ve ark., J.

C2'nin, C3 konvertazElolan C4b2b Üretmesi için aktif hale getirmesinden sorumlu olan proteazdlE Bu, iki spesifik serin proteazII koordineli eyleminin (Clr ve C1'Ier), kompleman sisteminin aktivasyonuna yol açt[g]l:klasik yolun C1 kompleksinden önemli bir farktlEl Ek olarak, üçüncü yenilikçi proteaz olan MASP-3 izole edilmistir (Dahi, M.R., ve ark., Immunity MASP'Ier, C1 kompleksinin enzimatik bilesenleri olan Clr ve C1'inkilerle benzer olan alan organizasyonlarIÜJaylasmaktad[El(Sim, R.B., ve ark., Biochem. Soc. Trans. 28:545, 2000).

Bu alanlar, bir N terminal C1r/C1'ler/deniz kestanesi Vegf/kemik morfojenik protein (CUB) alanlüepidermal bir büyüme faktörü benzeri alanüikinci bir CUB alanIÇlkompleman kontrol protein alanlarlEllEl bir tandemini ve bir serin proteaz alanIEiçermektedir. C1 proteazlarIa oldugu gibi, MASP-Z'nin aktivasyonu, enzimi, daha sonrasIa serin proteaz alanIan olusan disülfide baglü ve B zincirlerine bölen serin proteaz alan. bitisik olan bir Arg-Ile bagII bölünmesi sayesinde olusmaktadlîl MBL aynlZlzamanda 19 kDa (MAp19) MBL ile iliskili protein veya MASP-2 katalitik aktivitesinden mahrum olan az MBL ile iliskili protein (sMAP) olarak bilinen MASP-Z'nin alternatif olarak eklenmis bir formla birlesebilmektedir. (Stover, J. Immunol. 162:3481-90, alanlüiçermektedir, bunu dört benzer amino asidin bir ekstra sekanslîltakip etmistir.

Map19'un islevi net degildir (Degn ve ark., J Immunol. Methods, 2011). MASP-1 ve MASP-2 genleri, slHislsîla insan kromozomlarlEUa (3 ve 1) yerlestirilmektedir (Schwaeble ve ark., Çesitli türden kanmhr, farkIIZlMBL-MASP komplekslerinin mevcut oldugunu ve serumda bulunan toplam MASP'larI büyük bir fraksiyonunun, MBL ile kompleks olmadigIEl MASP'Iere baglanmaktadIEl ve MBL'de oldugu gibi Iektin kompleman yolunu aktif hale olusturmaktadlîlve bu yollar, bu adIida birlesmektedir.

Lektin yolunun genis oranda enfeksiyona karsßlan konak savunmaleL'la büyük bir role sahip oldugu düsünülmektedir. Konak savunmasIa MBL'nin dahil olmas. dair güçlü olan bir kanlEl islevsel MBL'nin azalan serum seviyelerine sahip olan hastalar. analizinden yinelenen bakteriyel ve mantarslîl enfeksiyonlara duyarlIIJKl sergilemektedir. Bu semptomlar genellikle maternal olarak türeyen antikor titeri azaldlEga, görünür bir korumaslîlllîl penceresi esnasIa, antikor yanElbrII tam repertuarII gelismesinden önce olacak sekilde gençlikte ortaya çiKmaktadB Bu sendrom genellikle MBL'nin kolajen bölümünde çesitli alanlarda bulunan, MBL oligomerlerinin uygun formasyonuna müdahale eden mutasyonlardan sonuçlanmaktadlü Fakat, MBL, tamamlay-n baglislîl olan bir opsonin olarak islev gösterebildigi için, enfeksiyona olan artan duyarlltlgill hangi ölçüde bozulmus kompleman aktivasyonundan kaynakland[glEIiJilinmemektedir.

Klasik ve Iektin yollarII aksine, C1q ve Iektinlerin, diger iki yolda uygulanmas- dair olan tanIiIama islevlerinin yerine getirilmesine yönelik herhangi bir alternatif yol baslatlîlîlîl bulunmamlStE Mevcut olarak, alternatif yolun, denetlemede kompleman aktivasyonunu spontane bir vaziyette tutan uygun moleküler elemanlardan mahrum olan yabancEleya diger anormal yüzeylerde (bakteriler, maya, viral olarak enfekte hücreler veya hasarIEüoku) hali hazlîda güçlendirilebilen düsük seviyeli bir dönüsüm aktivasyonuna spontane bir sekilde tabi oldugu genis oranda kabul edilmektedir. Alternatif yolun aktivasyonunda dogrudan dahil olan dört plazma proteini mevcuttur: C3, B ve D faktörleri ve properdin.

Enfeksiyonlu olmayan insan hastalilZIarII patojenezinde klasik ve alternatif kompleman yollara vurgu yapan yayglEl bir kanlt] olmas. ragmen, lektin yolunun rolü henüz degerlendirilmeye baslanmaktadlE Son zamanlarda yapllân çallglnalar, Iektin yolunun aktivasyonunun, iskemi/reperfüzyon hasarIa kompleman aktivasyonundan ve ilgili inflamasyondan sorumlu olduguna dair kanttîlsunmaktadlü Collard ve meslektaslarE(2000), oksidatif gerilime tabi olan kültürlenmis endotelyal hücrelerin MBL'yi bagland[g]IEi/e insan serumuna maruziyet üzerine C3 birikimi sergiledigini rapor etmistir (Collard ve ark., Am. J. monoklonal antikorlarla tedavi edilmesi, MBL bagIEl/e kompleman aktivasyonunu inhibe etmistir. Bu bulgular, slgian MBL'sine karsüyönlendirilen bloke edici bir antikor ile tedavi edilen slglanlarlEl, bir kontrol antikoru ile tedavi edilen slÇhnIardan, bir koroner atar damarI oklüzyonu üzerine önemli ölçüde daha az miyokardiyal hasar sergiledigi miyokardiyal iskemi- (2001)). Oksidatif gerilim sonraleda vasküler endotele baglanan MBL'nin moleküler mekanizmaslîhet degildir; son zamanlarda yapilân bir çallStna, oksidatif gerilim sonrasIa glikokonjügatlara baglanmayan MLB ile yönlendirilebildigini göstermektedir (Collard ve ark., patojenezinde klasik ve alternatif yollara vurgu yapmlgtlB ve bu hastal[tha bulunan Iektin yolunun rolü tartlglnallîkalmlgtlîl(Riedermann, N.C., ve ark., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).

Güncel çallgh'ialar, MASl ve MASP-3'ün, alternatif yolun aktivasyonunun enzim faktörünü (D) zimogen formundan enzimatik olarak aktif forma dönüstürdügünü göstermistir (bkz. 58 (2011)). Bu sürecin fizyolojik önemine, MASP-1/3'ü eksik farelerin plazmaleUa alternatif yol islevsel aktivitesinin yoklugu ile vurgu yapUBiaktadB Natif C3'ten C3b'nin proteolitik olusumuna, alternatif yolda islev göstermesi için ihtiyaç vardB Alternatif yol C3 konvertazEl (C3bBb), temel bir alt birim olarak C3b içerdigi için, alternatif yol sayesinde birinci C3b kaynagElle ilgili soru, saslElllEEbir sorunu ortaya çllZlarmlg ve önemli miktarda arastlEnayEl baslatmlgtlü C3, bir tiyoester bagElolarak bilinen nadir bir post dönüsümsel modifikasyonu içeren proteinlerin bir ailesine (C4 ve 0-2 makroglobülin ile birlikte) aittir. Tiyoester grup, terminal karbonil grubunun, bir sisten üç amino asitten uzakta sülfihidril grupla bir kovalent tiyoester baglîcblusturdugu bir glutaminden olusmaktadlEl Bu bag stabil degildir ve elektrofilik glutamil- tiyoester, hidroksil veya amino gruplar gibi nükleofilik parçalarla reaksiyona girebilmektedir ve bu sekilde diger moleküllerle kovalent bir bagEqusturabilmektedir. BozulmamlSl C3'ün hidrofobik bir paketi içerisinde tek bas. oldugunda, tiyoester bag makul bir sekilde stabil kalmaktadlEl Fakat, C3 ila C3a ve C3b'nin proteolitik bölünmesi, C3b'de oldukça reaktif olan tiyoester baglBl ifsa olmasEile sonuçlanmaktadßve hidroksil veya amino gruplarEHçeren bitisik parçalarla nükleofilik saldlElEhn sonra, C3b, bir hedef kovalent bir sekilde baglEIhale gelmektedir. C3b'nin kompleman hedeflerine kovalent bir sekilde baglanmasIa olan detaylEl olarak hazlEllanmlglrolüne ek olarak, C3 tiyoesterinin ayri& alternatif yolu tetiklemede önemli bir role sahip oldugu düsünülmektedir. Genis oradan kabul edilen “kenetlenme teorisine” ek olarak, alternatif yol, hidrolize tiyoester (iC3; C3(H20)) ve B faktörü ile C3'ten olusturulan bir slîEfaz konvertazEblan iC3Bb'nin olusumu tarafIan baslatllBiaktadlEl(Lachmann, P.J., ve dahili tiyoesterin yavas bir spontane hidrolizi taraflEtian natif C3'ten Üretilmektedir aktivitesi sayesinde, C3b molekülleri, alternatif yolu baslatacak sekilde hedef yüzey üzerinden biriktirilmektedir.

Burada açllZJanan mevcut kesiften önce, alternatif yolun aktivasyonunun baslatlîllârütiakkia oldukça az bilgi bilinmekteydi. Aktivatörlerin, maya hücresi çeperlerini (zimosan), bir çok saf polisakkaridi, tavsan eritrositlerini, belirli immünoglobulinleri, virüsleri, mantarlarÇlbakterileri, hayvansal tümör hücrelerini, parazitleri ve hasarlEhücreleri içerdigi düsünülmektedir. Bu aktivatörlerle ortak olan tek özellik, karbonhidrat mevcudiyetidir, fakat kompleksite ve genis say. karbonhidrat yaplîütanllanan, paylasIiIülnoIeküler determinantlarI olusturulmasIEl zor bir hale getirmistir. Alternatif yol aktivasyonunun, faktör H, faktör I, DAF ve CR1 gibi bu yolun inhibitör düzenleyici bilesenleri arasIEdaki ince ayar vasitâsüa kontrol edildigi genis oranda kabul edilmistir, sonraki alternatif yolun tek pozitif düzenleyicisidir (bkz. Schwaeble Yukarlîzlh açEIZlanan görünürde düzenlenmemis aktivasyon mekanizmasi ek olarak, alternatif yol aynllamanda, üretilen herhangi bir C3b'ün, ek alternatif yol C3 konvertazII (C3bBb) olusturulmasIa faktör B'ye katilâbilmesinden dolayülektin/klasik yol C3 konvertaz.

(C4b2a) yönelik güçlü bir amplifikasyon döngüsünü de saglayabilmektedir. Alternatif yol C3 konvertazü properdinin baglanmasEIIe stabilize edilmektedir. Properdin, alternatif yol C3 konvertazII yarEömrünü aItEIIa on kat uzatmaktadlB C3b'nin C3 konvertazlEla eklenmesi, alternatif yol C5 konvertazII formasyonuna yol açmaktadE Tüm bu üç yolun (ör. klasik, Iektin ve alternatif), çoklu proinflamatuar etkilere sahip ürünleri olusturmasEl için bölünen C5'te birlestigi düsünülmektedir. Birlestirilen yol, terminal kompleman yolu olarak ifade edilmistir. C5a, vasküler geçirgenligin yanßß, yumusak kas ve vasküler tonunda olan degisiklikleri tetikleyen en önemli anaflatoksindir. Bunun yanEllei, güçlü bir kemotaksin ve nötrofiller ve monositlerin aktivatörüdür. C5a araclIthücreler aktivasyon, sitokinleri, hidrolitik enzimleri, arakidonik asit metabolitleri ve reaktif oksijen türlerini içeren çok say. ek inflamatuvar aracllârI saIIIiIEltetikleyerek inflamatuvar yanltlhrlîönemli ölçüde güçlendirmektedir. C3 bölünmesi, membran saldElEkompleksi (MAC) olarak da bilinen C5b-9 formasyonuna yol açmaktadIEI Sublitik MAC birikiminin, Iitik gözenek olusturan bir kompleks olarak rolüne ek olarak, inflamasyonda önemli bir rol oynayabildigine dair güçlü bir kaniElmevcuttur. yolunun Kompleman 1 inhibitörünü açlElamaktadlEl Wong ve meslektaslarüMol Immunol vol Molecular Immunology vol , kompleman ile iliskili yolla yönlendirilen hastallKlarI tedavisine yönelik C3/C5 konvertaz inhibitörünü (TBD) açlEIamaktadE Immün savunmasIa olan temel rolüne ek olarak, kompleman sistemi, birçok klinik kosulda doku hasarlEia katklöh bulunmaktadlü Bu sekilde, bu yan etkilerin engellenmesi için terapötik olarak etkili kompleman inhibitörlerinin gelistirilmesine oldukça ihtiyaç vardE BU LUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, paroksismal nokturnal hemoglobinüriden (PNH) muzdarip bir sujede MASP-3'e bagnllîkompleman aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik bir yöntemi saglamaktadß Yöntem, MASP3'e bagIiIElkompIeman aktivasyonun inhibe edilmesi için etkili olan bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarIEiçeren bir bilesimin denege uygulanmasi dair bir adIiEl içermektedir. Bazlîdurumlarda, yöntem aynüamanda bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir bilesimin denege uygulanmasIEIçermektedir.

Bir yönünde, mevcut bulus, paroksismal nokturnal hemoglobinüriden (PNH) muzdarip bir denegin tedavi edilmesinde kullanIia yönelik MASP-3'e bagIiIEkompIeman aktivasyonunu inhibe etmek için etkili bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarIEliçeren bir bilesimi saglamaktadlB burada söz konusu MASP-3 inhibitör maddesi, insan MASP-3'ün bir bölümüne spesifik olarak baglanan bir MASP-3 monoklonal antikoru veya bunun bir fragmanIlEl (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8).

Bir diger yönünde, mevcut bulus, paroksismal nokturnal hemoglobinüriden (PNH) muzdarip bir sujede künlîlîkan hücrelerinin sagkalIiIßrttlElnak için, PNH'den muzdarip bir denegin tedavi edilmesinde kullanIi için etkili olan bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarID içeren bir bilesimi saglamaktadü burada söz konusu MASP-3 inhibitör maddesi, insan MASP- 3'ün bir bölümüne spesifik olarak baglanan bir MASP-3 monoklonal antikor veya bunun bir fragmanIlEi(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8).

Mevcut bulus, en az bir inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesimi saglamaktadlü burada en az bir inhibitör maddesi, bir MASP-2 inhibitör maddesini ve bir MASP-3 inhibitör maddesini ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslsîlaEIçermektedir.

Mevcut bulus, MASP-l'in bir bölümüne baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10: tam uzunluk) ve aynElzamanda MASP-3'ün bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanan bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesimi ve bir farmasötik tas Waglamaktadlîl Mevcut bulus, MASP-2'nin bir bölümüne baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5: tam uzunluk) ve aynüzamanda MASP-3'ün bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanan bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesimi ve bir farmasötik tas Waglamaktadlü Mevcut bulus, MASP-l'in bir bölümüne baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10: tam uzunluk) ve aynüzamanda MASP-3'ün bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) baglanan bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesimi ve bir farmasötik taslýlaýßaglamaktadlîl Mevcut bulus, MASP-l'in bir bölümüne baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10 tam uzunluk), MASP-Z'nin bir bölümüne baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5: tam uzunluk) ve aynElzamanda MASP-3'ün bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanan bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesimi ve bir farmasötik taslsîlîlîlîl saglamaktadB Burada açlEIandiglEüzere, bulusun farmasötik bilesimler, bulusun yöntemleriyle uyumlu bir sekilde kullanllâbilmektedir.

Burada açIanan bulus, asagßhki kapsamlüçilîlamaya ve çizimlere referansla açllZIanacaktE SEKILLERIN AÇIKLAMASI Mevcut bulus, ayri lîljekteki çizimlerle baglantlIIIlîiir sekilde aIlEtllgllEtla asaglîzlhki kapsamIEl açlKIamaya referansla daha iyi anlasiIJElhale geldigi için hali hazlîdla daha çok takdir edilecektir, burada: SEKIL 1, Iektin ve alternatif yollarI yeni bir anlaylglüügiöstermektedir; uyarlanan, MASP-2 ve MAp19 protein alanlarIEl/e ayn-l:k0dlayan eksonlarEgösteren bir sematik diyagramdlB uyarlanan, MASP-3 ve MAp44 protein alanlarIEl/e ayn-[kodlayan eksonlarEgösteren bir sematik diyagramdlü SEKIL 4, MASP-l, MASP-2 ve MASP-3 proteinlerinin amino asit sekanslarII bir hizalamasllîgiöstermektedir ve burasßrasiaki konsensüs bölgeleri göstermektedir; SEKIL 5, MASP-l, MASP-2 ve MASP-3 Alfa zincirlerin amino asit sekanslarII bir hizalamaslEllIgliöstermektedir; SEKIL 6, MASP-l, MASP-Z ve MASP-3 Beta Zincirlerin amino asit sekanslarII bir hizalamaslügiöstermektedir; SEKIL 7A, MASP-l ve MASP-2 Proteaz AlanlarII (Beta-Zincirler) amino asit sekanslarlElI bir ikili hizalamasIlIçliöstermektedir; SEKIL 7B, MASP-l ve MASP-3 Proteaz AIanIarII (Beta-zincirler) amino asit sekanslarII bir ikili hizalamalellîgöstermektedir; SEKIL 7C, MASP-2 ve MASP-3 Proteaz AIanlarII (Beta-zincirler) amino asit sekanslarII bir ikili hizalamalelügiöstermektedir; uygulanmasIan sonra MASP-2 KO ve WT farelerinin sagkalIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren, MASP-2'si eksik farelerin, Örnek 1'de açlKlandlgiEüzere N. menihgit/di'sile indüklenen mortaliteden korundugunu gösteren bir Kaplan-Meyer grafigidir; SEKIL 9, N. men/hg/t/d/'s serogrup B susu MC58'in 6 x 106 cfu etkisiz bir dozunun uygulanmaledan sonra MASP-2 KO ve WT farelerinin sagkaIIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren, Örnek 1'de açiElandlgEÜizere MASP-2'si eksik farelerin N. men/hg/t/'d/;sile indüklenen mortaliteden korundu[gLinu gösteren bir Kaplan-Meyer grafigidir; SEKIL 10, N. men/hg/I/d/'s serogrup B susu MC58'in 6 x 106 cfu ile i.p. enjeksiyonundan sonra farklßüre noktalarIa (her iki fare grubu için farklßüre noktalarIa n=3) MASP-2 KO ve WT farelerinden kazanlßn mL kan bas. N. men/ng/Iial's serogrup B susu MC58'in log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir, MASP-2 KO fareler, WT fareleri gibi N. men/'ng/t/'d/'s serogrup B susu MC58'in aynlîlozu ile enfekte olmalarlEla ragmen, MASP-2 KO farelerinin, Örnek 1'de açlEIandigiüliibi WT ile klýlaslandgilîilizere gelismis bakteriyemi klerensine sahip oldugunu göstermektedir; SEKIL 11, IV. men/'ng/'t/a'is` serogrup B susu MC58'in 6x106 cfu'su ile enjeksiyondan 3, 6, 12 ve 24 saat sonrasIa MASP-Z KO ve WT farelerinin ortalama hastalllZJskorunu grafiksel olarak göstermektedir, MASP-2'si eksik farelerin, Örnek 1'de açllZIandlgllîlizere WT farelerine klýbsla enfeksiyondan 6 saat, 12 saat ve 24 saat sonras-a çok daha düsük hastalllîlsergiledigini göstermektedir.

SEKIL 12, IV. mening/'ti'd/'s serogrup B susu MC58'in 4 X 106 cfu etkisiz bir dozunun uygulanmasIan sonra, ardIan inhibitör MASP-2 antikorunun (1 mg/kg) veya kontrol izotip antikorunun enfeksiyondan 3 saat sonra uygulanmasIan sonra farelerin sagkalIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren, MASP-2 antikorunun, Örnek 2'de açiKlandigiEgibi N. men/hg/I/d/;s enfekte olan sujeleri tedavi etmek ve sujelerde sagkalIiÜiittlElnak için etkili oldugunu gösteren bir Kaplan-Meyer grafigidir; SEKIL 13, Örnek 3'de açlElandEglEüzere N. men/hg/tid/s serogrup B susu MC58'in inkubasyonundan sonraki çesitli süre noktalarIda al-n TABLO 5'de gösterilen Insan serum numunelerindeki farklßüre noktalarIa geri kazanüân N. meningit/d/Ls serogrrup B susu MC58'in canIIZIbakteri sayIiIIlar log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 14, TABLO 7'de gösterilen insan serum numunelerindeki farkllîlsüre noktalarHa geri iyilestirilen N. menthgit/d/s serogrup B-MC58'in canllîlbakteri sayIiII log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir, bu da Insan menseli %20 (v/v) serumda komplemana bagIiIEl/V. meningiüaý's ölümünün, Örnek 3'de açlElandlglüüzere MASP-3 ve MBL bagIilElglüoldugunu göstermektedir; SEKIL 15, TABLO 9'da gösterilen fare serum numunelerindeki farklElsüre noktalaria geri iyilestirilen IV. men/hgit/'d/'s serogrup B- MC58'in canIEbakteri sayIiII log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir, bu da MASP-2 -/- nakavt farelerinin (“MASP-Z -/-" olarak ifade edilmektedir) serumu, N. meningitidis için WT fare serumundan daha yüksek bir bakterisidal seviyeye sahip olurken, MASP-1/3 -/- fare serumunun, Örnek 3'de açllZlandigiElüzere herhangi bir bakterisidal aktiviteye sahip olmad Igllügiöstermektedir.

SEKIL 16, Örnek 4'de açiKIand[g]lZiIizere WT, C4-/-, MASP-1/3-/-, Faktör B-/- ve MASP-2-/- fare serumlarIa lektin yoluna özgü kosullar (%1 plazma) altIa C3 aktivasyonunun kinetiklerini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 17, Örnek 4'de açüglandglîüizere MASP-3'ü eksik, C3'ü eIGik ve MBL'si eksik insan sujelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak “geleneksel" alternatif yola özgü (AP'ye özgü) kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EG-TA/Mg++) aItIa zimosan kaplEl miktrotitre plakalarüda alternatif yolla hareket eden (AP ile hareket eden) C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 18, Örnek 4'de aç[lZland[g]I:iizere MASP-3'ü eksik, C4'ü eksik ve MBL'si eksik insan sujelerden elde edilen %10 insan serum numunelerinde bir süre islevi olarak “geleneksel" AP'ye özgü kosullar (örn. Ca” olmadan BBS/EGTA/Mg++) altlEUa zimosan kaplüiniktrotitre plakalarIa AP ile hareket eden C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 19A, “geleneksel" AP'ye özgü kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/MgH) altlEUa veya Örnek 4'de açlKlandEgJEI Üzere lektin yolunun ve alternatif yolun (AP) islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altIa WT, MASP-Z'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak mannoz kapllînhikrotitre plakalarEUa C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 19B, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca** olmadan BBS/EGTA/Mg++) altlTitla veya Örnek 4'de açilZlandlgilZüzere Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar aItIa WT, MASP- 2'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kapIElmikrotitre plakalaria C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 19C, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn.

Ca** olmadan BBS/EGTA/Mg++) aItIia veya Örnek 4'de açlEJandlgllîüzere Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg*+/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altHa WT, MASP-Z'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak 5. pneumon/iae D39 kaplElmikrotitre plakalar-a C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 20A, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/Mg+*) altHa veya Örnek 4'de açlElandIglElüzere %0 ila %125 arallgllEHa serum konsantrasyonlarElkullanilârak Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) Izin veren fizyolojik kosullar aItIda mannoz kaplElmiktrotitre plakalarIa uygulanan yüksek derecede seyreltilmis serumlarda bir C3b birikim denemesinin sonuçlarlElEl grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL ZOB, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca** olmadan BBS/EGTA/Mg++) altlEUa veya Örnek 4'de açElZlandigllîlüzere %0 ila %125 araligiIa serum konsantrasyonlarlZl kullanilârak Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altlEba zimosan kaplüriiktrotitre plakalarlEUa uygulanan bir C3b birikim denemesinin sonuçlarlügrafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 20C, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/Mg*+) altlEtla veya Örnek 4'de açilZlandlgiElüzere %0 ila %1.25 arallgiIa serum konsantrasyonlarü kullanüârak Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altlEtla 5. pneumon/ae D39 kaplElmiktrotitre plakalarlEtla uygulanan bir C3b birikim denemesinin sonuçlarllîgiirafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 21, Örnek 5'de açllîlandigllîüzere MASP-3-/-'den gelen serumlarda, @Ma aktif halde olmayan normal insan serumunda (HI NHS), MBL-/-, NHS + MASP-Z monoklonal antikorda ve NHS kontrolünde serum seyreltilerinin belirli bir araliglîboyunca fizyolojik kosullar (örn. Ca*+ mevcudiyetinde) alt-a insan serumu ile mannoz kapIElmürin eritrositlerin hemoliz seviyesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin (Crry/C3-/-) hemoglobin salIIiElile ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 22, Örnek 5'de açÜZlandlglElizere MASP-3-/-'den gelen serumlarda, @Ida aktif halde olmayan normal insan serumunda (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 monoklonal antikorda ve NHS kontrolünde serum konsantrasyonunun belirli bir arallgiljboyunca fizyolojik kosullar (Örn. Ca++ mevcudiyetinde) altia insan serumu ile mannoz kaplünürin eritrositlerin hemoliz seviyesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin (Crry/C3- /-) hemoglobin saIIIiEiIe ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 23, Örnek 5'de açlEland [glEiTizere 3MC'den (MASP-3-/-) gelen serumlarda, EMa aktif halde olmayan normal insan serumunda (HI) NHS, MBL-/-, NHS + MASP-2 monoklonal antikorda ve NHS kontrolünde serum konsantrasyonunun belirli bir aral[g]l:lboyunca fizyolojik kosullar (örn. Ca++ mevcudiyetinde) aItIa insan serumu ile kaplElolmayan mürin eritrositlerin hemoliz seviyesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen WT faresi eritrositlerin hemoglobin saIIIiEl ile ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 24, Örnek 5'de açlElandlgiElüzere, Elsîla aktif halde olmayan NHS'den gelen serumlarda, MBL-/-, NHS + MASP-2 monoklonal antikorda ve NHS kontrolünde serum konsantrasyonunun belirli bir aral[gll]i›oyunca fizyolojik kosullar (örn. Ca++ mevcudiyetinde) altIia insan serumu ile kapll]›lmayan mürin eritrositlerin hemoglobin seviyesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin (CD55/59-/-) hemoglobin salInElle ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 25, Örnek 6'da açlKland[giEiJzere, serum konsantrasyonunun belirli bir aral[gll:l boyunca fizyolojik kosullar (örn. Ca++ mevcudiyetinde) aItIa MASP-1/3-/- fare serumu ve WT kontrol fare serumu ile mannoz kaplEçözünmüs tavsan eritrositlerin hemoliz seviyesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünmüs tavsan eritrositlerin hemoglobin saIInDIe ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 26, Örnek 7'de açlKIandEglDIizere AP'ye özgü kosullar aItIda uygulanan bir C3 birikim denemesinde faktör D-/-, MASP-2-/- ve WT fare serumlarlîidan serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak bir zimosan kaplünikrotitre plakasIa C3b birikiminin (CD 405 nm) seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 27, Örnek 7'de aç[E]and[g]l:üzere fizyolojik kosullar (Ca++ mevcudiyetinde) aItIia uygulanan bir C3 birikim denemesinde faktör D-/-; MASP-Z-/- ve WT fare serumlarian serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak bir zimosan kapIEl mikrotitre plakasIa C3b birikiminin (OD 405 nm) seviyesini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 28, Örnek 7'de açllZland[g]I:l üzere fizyolojik kosullar (Ca++ mevcudiyetinde) altlEba uygulanan bir C3 birikim denemesinde faktör D-/-; faktör B-/-; artEl/e eksi ve MASP-Z monoklonal antikordan elde edilen fare serum numunelerinde serum inkubasyon süresinin (dakika) bir islevi olarak bir zimosan kaplElmikrotitre plakasia C3b birikiminin (CD 405 nm) seviyesini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 29A, bir zimosan kaplülnikrotitre plakasIa bulunan, Örnek 13'de açlKlandigiEilizere 0.3 mg/kg veya 1.0 mg/kg fareye MASP-Z MoAb'nin subkütanöz dozajlEUan sonra çesitli süre noktalarIa farelerden (n=3 fare/grup) alin seyreltilmemis serum numunelerinde ex i//i/o ölçülen Iektin yoluna özgü C4b birikimini graûksel olarak göstermektedir; SEKIL 29B, Örnek 13'de açlEland [glüljzere farelerde 0.6 mg/kg'de fareye MASP-2 MoAb'nin tekli bir intraperitoneal uygulamasIan sonra üç haftallgil Iektin yolunun düzelmesine yönelik süre seyrini grafiksel olarak göstermektedir; SEKIL 30A, Örnek 15'de açiEland[giEüzere M3J5 klonuna yönelik MASP-3 antijen/antikor baglant-I bir FACS histogramIEl SEKIL 3OB, Örnek 15'de açlElandgElüzere M3M1 klonuna yönelik MASP-3 antijen/antikor baglant-I bir FACS histogramllîj SEKIL 31, Örnek 15'de açllZlandlglEEJzere MASP-3 antijenine yönelik M3J5 klonunun (Klon 5) bir satürasyon baglanma egrisini grafiksel olarak göstermektedir. amino asit sekanslZhizalamasIlîJ burada Örnek 15'de açlKland[g]l:L'izere noktalar, DT40 sekansEile amino asit kimligini temsil etmektedir ve kesik çizgiler, hizalamaylîrlnaksimuma çilZlarmak için dahil edilen bosluklargöstermektedir. amino asit sekanslZhizalamasIlEI burada Örnek 15'de aç[lZIand[gi|:L'izere noktalar, DT40 sekansEiIe amino asit kimligini temsil etmektedir ve kesik çizgiler, hizalamayülnaksimuma çlKbrmak için dahil edilen bosluklarlîgliöstermektedir.

SEKIL 33, Wieslab Kompleman Sistemi Ekranütla mAb1E10'un, deneme kiti ile saglanan pozitif seruma klýbsla MBL Yolunun ve aynlZlzamanda bir izotip kontrol antikorunun inhibitör aktivitesini gösteren, Örnek 15'de aç[EIandlg]l:üzere mAb1E10, LEA-2'ye bagIiID aktivasyonu (MASP-Z'nin MASP-l'e baglilülaktivasyonunun inhibisyonu vasitîhslýla) inhibe ederken, izotip kontrol antikorunun inhibe etmedigini gösteren bir çubuk grafigidir; SEKIL izotip kontrolü SGMI-lFc veya SGMI-2Fc için C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir, bu da SGMI-lFc ve SGMI-2Fc'nin, Örnek 16'da açilîlandlgiüijzere yaklasllg olarak 27nM ve 300nM IC50 degerlerle mannoz kapIEELISA haznelerde normal serumdan C3b birikimini inhibe ettigini göstermektedir; SEKIL 35A, @Zile öldürülen S Staphy/ococcus aureugun aklg sitometrisi analizine yönelik olan, Örnek 17'de açliîlandtgilîilizere Iektin ve alternatif yollarlZEtkisiz hale getirdigi bilinen EDTA mevcudiyetinde normal insan serumunda, herhangi bir C3b birikiminin gözlemlenmedigini (panel 1), Mg++/EG-TA ile tedavi edilen normal insan serumunda, alternatif yolla harekete geçirilen C3b birikiminin gözlemlendigini (panel 2) ve panel 3, 4 ve 5'de gösterildigi üzere, slfaslýla faktör B-tükenmis, faktör D-tükenmis ve uygun dürtü (faktör P) -tükenmis edilmis serumda, herhangi bir alternatif yolu harekete geçirilen C3b birikiminin gözlemlenmedigini gösteren sonuçlarßaglamaktadlü SEKIL 358, @Zile öldürülen 5. aureus'da C3b birikimine yönelik aklg sitometrisine yönelik olan, EDA ile tedavi edilen normal serumda (panel 1) oldugu gibi, Örnek 17'de açlKlandlglD üzere, AP ile harekete geçirilen C3b birikimi, Mg++/EGTA (panel 3) mevcudiyetinde 3MC serumunda mevcut olmazken, panel 4 ve 5, aktif tam uzunlukta rMASP-3 (panel 4) ve aktif rMASP-3'ün (CCPl-CCPZ-SP) (panel 5), 3MC serumundaki PA ile harekete geçirilen C3b birikimini, Mg++/EGTA (panel 2) ile tedavi edilen normal serumda gözlemlenen seviyelere restore ettigini, aktif olmayan rMASP-3 (5679A) (panel 6) veya sokak türü rMASP-l'in (panel 7) AP ile harekete geçirilen C3b birikimini restore edebildigini gösterdigini sergileyen sonuçlarElsaglamaktadE SEKIL 36, rMASP-3 mevcudiyetinde veya yoklugunda 3MC serumunda 5. aureus'a yanllîlolarak faktör B bölünmesini belirlemek için bir Western blot analizine yönelik olan, EDTA mevcudiyetinde (negatif kontrol, serit 1) normal insan serumunun, serit 2'de (pozitif kontrol) gösterildigi üzere Mg++/EGTA mevcudiyetinde normal insan serumuna göre oldukça az Faktör B bölünmesi sergiledigini, serit 3'de gösterildigi üzere, 3MC serumunun, Mg++/EGTA mevcudiyetinde oldukça az Faktör B bölünmesi sergiledigini gösteren sonuçlarügöstermektedir. Fakat serit 4'de gösterildigi üzere, Faktör B bölünmesi, Örnek 17'de açlElandlglEüzere tam uzunlukta, rekombinant MASP-3 proteininin 3MC serumuna eklentisi ve preinkubasyonu ile restore edilmektedir.

SEKIL 37, faktör B bölünmesinin analiz edildigi, Örnek 17'de açlElandlglIZL'izere Faktör B bölünmesinin, C3, MASP-3 ve pro-faktör D (serit 1) mevcudiyetinde en optimal oldugunu ve serit 4 ve 5'de gösterildigi üzere, MASP-3 veya pro-faktör D'nin tek bas. Faktör B bölünmesini yönlendirebildigini gösteren bir protein jelinin Comassie boyasIlZl göstermektedir.

SEKIL 38, rMASP-3 mevcudiyetinde 3MC serumunda mAb konsantrasyonunun bir islevi olarak tasarlanan mAbD14 (MASP-3'e baglanmaktadlE), mAblAS (negatif kontrol antikoru) ve bir izotip kontrol antikorunun C3b boyasII ortalama floresan yogunluklarIIZ(MFI) grafiksel olarak göstermektedir, bu da mAbD14'ün, Örnek 17'de açlKland[gll:üzere bir konsantrasyona bagIilü sekilde MASP-3'e bagIilEl C3b birikimini inhibe ettigini göstermektedir; SEKIL 39, pro-faktör D sübstrat bölünmesinin Western blot analizini göstermektedir, burada Örnek 18'de açlElandfglEüzere tek baslEta pro-faktör D (serit 1) veya aktif olmayan tam uzunlukta rekombinant MASP-3 (8679A; serit 3) veya MASP-l'e MASP-l'in (serit 5), olgun faktör D'yi üretmek için tamamen veya klginen pro-faktör D'yi bölmektedir; SEKIL 40, Örnek 18'de açiKland[giEL`izere sadece MASP-3 ve pro-faktör D (herhangi bir mAb, serit 1) içeren bir kontrol reaksiyonuna ve aynüamanda MASP-l'e baglanan, fakat MASP-3'e baglanmayan (serit 4) DTLacO kütüphanesinden elde edilen bir mAb içeren bir kontrol reaksiyonuna klýlasla MASP-3'e bagIilEbro-faktör D bölünmesinde mAbs D14 (serit 2) ve M3M1'i (serit 3) baglayan MASP-3'n inhibitör aktivitesini gösteren bir Western blotudur.

SEKIL 41, MASP-3'ü eksik (3MC), C4'ü eksik ve MBL'si eksik sujelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kapIElmikrotitre plakalarIa AP ile harekete geçirilen C3b birikiminin seviyesini grafiksel olarak göstermektedir, bu da Örnek 19'da açiEIandlgiEiizere 2. Hastadan ve 3. Hastadan MASP- 3'ü eksik serumlarlEl, yüksek serum konsantrasyonlarüda (%25, %125, %6.25 serum konsantrasyonlarlIl kalan AP aktivitesine, fakat önemli ölçüde daha yüksek AP50'ye (örn. maksimum C3 birikiminin %50'sine ulasmak için gerekli serumun %8.2'si ve %12.3'ü) sahip oldugunu göstermektedir; SEKIL 42, Örnek 19'da açiKland[gll]izere MASP-3'ü eksik, C4'ü eksik ve MBL'si eksik insan sujelerinden elde edilen %10 insan serum numunelerinde bir süre islevi olarak “geleneksel” AP'ye özgü kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/Mg++) aItIa zimosan kaplünikrotitre plakalarda AP ile harekete geçirilen C3b birikiminin seviyesini grahksel olarak göstermektedir.

SEKIL 43, Ca” yoklugunda ölçülen iki normal insan sujeden (NHS) ve iki 3MC hastadan (2. Hasta ve 3. Hasta) serumda serum konsantrasyonlarII bir aral[g]l:b0yunca mannoz kapIEl tavsan eritrositlerinin hemoliz yüzdesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünmüs tavsan eritrositlerinin hemoglobin salIIiEiIe ölçüldügü üzere) grafiksel olarak göstermektedir, bu da MASP-3 eksikliginin, Örnek 19'da açiKlandigiEüzere normal insan serumuna klýbsla mannoz kaplEéritrositlerin kompleman arac[[]]]izisin yüzdesini azaltt[giIü göstermektedir; SEKIL 44, insan 3MC 2. Hastadan (MASP-3'/') elde edilen serum numunelerine eklenen rekombinant tam uzunlukta MASP-3 proteinin konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kaplülnikrotitre plakalarIa AP harekete geçirilen C3b birikiminin seviyesini grafiksel olarak göstermektedir, bu da negatif kontrol aktif halde olmayan rekombinant MASP-3 (MASP-3A; $679A) ile klîilaslandlglüizere, aktif rekombinant MASP-3 proteinin, Örnek 19'da açilîland [glEiTizere bir konsantrasyona bagnlßekilde zimosan kaplEI plakalarda AP ile harekete geçirilen C3b birikimini yeniden olusturmaktadlü SEKIL 45, Ca++ yoklugunda ölçülen (1) normal insan serumunda (NHS); (2) 3MC hasta serumunda; (3) 3MC hasta serumu artEiIam uzunlukta rekombinant MASP-3 (20 mg/ml); ve (4) Elsîla etkisiz hale getirilen insan serumunda (HIS) serum konsantrasyonlarII bir arallgiüboyunca mannoz kaplDtavsan eritrositlerinin hemoliz yüzdesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünmüs tavsan eritrositlerin hemoglobin salIIiEile ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir, bu da tavsan eritrositlerin lizis yüzdesinin, Örnek 19'da açllZJandIgEüizere rekombinant MASP-3 (p=0.0006) olmadan 3MC'de lizis yüzdesi ile klibslandigllîl üzere rMASP-3 içeren 3MC serumunda önemli ölçüde artt-[glIEl göstermektedir.

SEKIL 46, 0 ila bir konsantrasyon araliglIa aktif rekombinant MASP-3 içeren 3MC 2. Hastadan ve 3MC 3. hastadan %7 insan serumunda tavsan eritrosit Iizisin yüzdesini graûksel olarak göstermektedir, bu da tavsan eritrosit liziSinin yüzdesinin, Örnek 19'da açiKlandlgiüüzere bir konsantrasyona bagIiIElsekilde rekombinant MASP-3'ün miktarEiIe altlgsergiledigini göstermektedir; SEKIL 47, bir normal insan sujeden (NHS), iki 3MC hastadan (2. hasta ve 3. Hasta), 3. HastanI esaslîidan ve bir MBL'si eksik sujeden allEIan serum için 885 tamponunda seyreltilen insan serumunun konsantrasyonunun bir islevi olarak Mannoz kaplEELISA plakalarIa LEA-2 ile harekete geçirilen C3b birikiminin seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKANS LISTESISININ AÇIKLAMASI SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1 insan MAp19 cDNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2 insan MAp19 proteini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3 insan MAp19 proteini (olgun) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4 insan MASP-z cDNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 insan MASP-Z proteini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6 insan MASP-Z proteini (olgun) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 insan MASP-3 cDNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8 MASP-3 proteini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9 insan MASP-l cDNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10 MASP-l proteini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI :11 insan MAp44 proteinini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12, Sigian MASP-Z cDNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13, scan MASP-Z proteini (öncü ile) SEKANS KIMLIK NUMARASI NO: ag IElzincirIi degisken bölgeyi (VH) (sinyal peptidi olmadan) kodlayan DNA bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 16 17N16mc aglEzincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 18 17N16_dc hafif zincirli degisken bölgeyi (VL) (sinyal peptidi olmadan) kodlayan DNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 20: scFv bag klonu 17N16m_d17N9 tam uzunlukta polipeptit polipeptit SEKANS KIMLIK NUMARASI: 22: tam uzunlukta polipeptidi (sinyal peptidi olmadan) kodlayan scFv bag klonu 17N16m_d17N9 DNA SEKANS KIMLIK NUMARASI: 22: tam uzunlukta polipeptidi (Sinyal peptidi olmadan) SEKANS KIMLIK NUMARASI:24: ana DTLacO aglEIzincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25: MASP-3'e özgü klon M3J5 aglElzincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 26 MASP-3'e özgü kion M3M11 ag Ezincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27: ana DTLacO hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 28 MASP-3'e özgü klon M3J5 hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 29 MASP-3'e özgü klon M3M1 hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI:30: MASP-3 klonu Dl4 aglElzincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 31 MASP-3 klonu D14 hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 32 MASP-l klonu 1E10 aglElzincirli degisken bölge (VH) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 33: MASP-l klonu 1E10 hafif zincirli degisken bölge (VL) polipeptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 34 SGMI-l peptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI: 35 SGMI-2 peptidi SEKANS KIMLIK NUMARASI NO:36 insan IgGl-Fc polipeptidi; SEKANS KIMLIK NUMARASI NO:37 Peptit baglaymi (12aa); SEKANS KIMLIK NUMARASI NO:38 Peptit bagiaymz (12aa); SEKANS KIMLIK NUMARASI: 39: insan IL-2-sinyal sekansüSGMI-l, baglaylîlîl ve insan SEKANS KIMLIK NUMARASI:40: SMGI-l, baglaylöâl ve insan IgGl-Fc (SGMI-lFc) içeren olgun polipeptit füzyonu; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 41: inan IL-2 sinyal sekanSlElÇBGMI-Z, baglay-l ve insan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 42: SGMI-2, bagiaymi ve insan IgGl-Fc (SGMI-ZFC) içeren olgun polipeptit füzyonu.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Burada aksi belirtilmedikçe, burada kullanllân tüm terimler, mevcut bulusun tekniginde tecrübe sahibi kisiler taraflEtlan anlasilânla aynünlama sahip olmaktadlü Asaglfihki tan lar, mevcut bulusu tarif etmesi için tarifnamede ve istemlerde kullan [Etken, terimlere göre açiKlilZl saglamasüçin sunulmalIlE Burada kullan-@Üzere Iektin yolu efektör kolu 1 ("LEA-1"), MASP-3 vasltâslsîla faktör B ve faktör D'nin Iektine bagnlßktivasyonunu ifade etmektedir.

Burada kullan-[glîüizere, Iektin yolu efektör kolu 2 (“LEA-2"), MASP-Z'ye bagIiIEkompIeman aktivasyonunu ifade etmektedir.

Burada kullanI[glI:iüzere, “MASP-3'e bagIilEkompleman aktivasyonu" terimi, iki bileseni içermektedir: (i) LEA-1 aracilIikompleman aktivasyonunda kapsanan faktör B ve faktör B'nin D'nin dönüsümüne yol açan Ca++ mevcudiyetinde olusmaktadlîj ve (ii) Ca++ yoklugunda olusabilen, genellikle C3bB ila C3bBb'nin ve pro-faktör D ila faktör D'nin dönüsümüne yol açan faktör B ve faktör D'nin lektinden baglisü dönüsümü. LEAT-1-araciIJDk0mpleman aktivasyonu ve faktör B ve faktör D'nin lektinden bagIislîl dönüsümünün, opsonizasyona ve/veya Iizise yol açtIgllîbelirlenmistir. Herhangi bir teori ile sIlEllanmak istenmese de, sadece çok say. c3b molekülü yakI temas halinde birlestiginde ve baglandlglülcla, C3bBb C3 konvertazlEllEl, sübstrat özgüllügünü degistirdigine ve C3bBb(C3b)n olarak adlandlEIlân, alternatif yolun C5 konvertazlîblarak C5'i bölmektedir.

Burada kullanllgilîüizere, burada LEA-Z-aracHJIlkompIeman aktivasyonu olarak da ifade edilen C3 konvertazEC4b2a'nI formasyonuna yol açan ve opsonizasyona ve/veya lizise yol açt[g]l:l belirlenen C5 konvertazEl C4b2a(C3b)n'den sonra C3 bölünme ürünü C3B'nin akümülasyonundan sonra MASP-2 lektine bagnlßktivasyonu içermektedir.

Burada kullan-[glEüzere, “geleneksel alternatif yol" olarak da ifade edilen “alternatif yolun geleneksel” terimi, örnegin mantar ve maya hücresi çeperlerinden, Gram negatif dlgl membranlardan lipopolisakkarit (LPS) ve tavsan eritrositlerinden ve aynElzamanda saf polisakkaritler, virüsler, bakteriler, hayvan tümör hücreleri, parazitler ve hasarlEhücrelerden zimosan ile tetiklenen ve geleneksel olarak kompleman faktörü C3'den C3b'nin spontane proteolitik olusumundan ortaya çlthlglEldüsünülen kompleman aktivasyonu gibi burada açllZIanan mevcut kesiften önceki alternatif yolu ifade etmektedir. Burada kullanIlglEüzere, burada “alternatif yo olarak ifade edilen “geleneksel alternatif yolun” aktivasyonu, Mg++/EGTA tamponunda (örn. Ca++ yoklugunda) ölçülmektedir.

Burada kullan-[gElüzere, “Iektin yolu” terimi, mannoz baglaylEEllektin (MBL(, CL-11 ve fikolinler (H-fikolin, M-fikolin veya L-fikolin) içeren serum ve serum olmayan karbonhidrat baglaylEEbroteinlerin spesifik baglantlglîl/asßslîla olusan kompleman aktivasyonunu ifade etmektedir. Burada açllZJandlglEüzere, mucitler, Iektin yolunun, iki efektör kol tarafIdan, MASP-3'e bagIlllîcbldugu bilinen Iektin yolu efektör kolu 1 (LEA-l) ve MASP-2'ye baglillîcblan üzere, lektin yollarlEl aktivasyonu, tamponlarügeren Ca*+ kullanllârak ölçülmektedir.

Burada kullanIEglEl'L'izere, "klasik yol” terimi, yabanchir partiküle antikorun baglanmasü sayesinde tetiklenen ve tanIiIama molekülü C1q'nun baglaylElUglIEgerektiren kompleman aktivasyonunu ifade etmektedir.

Burada kullanIIglEüzere, “HTRA-l” terimi, serin peptidaz Yüksek lelakllEl gereksinimi olan serin proteaz Al'i ifade etmektedir.

Burada kullan-[glîlüzere, “MASP-3 inhibitör maddesi", MASP-3'e baglilükompleman aktivasyonunu dogrudan veya dolaylüilarak inhibe eden, MASP-3'e baglanan veya dogrudan MASP-3 ile etkilesime geçen maddeleri içeren, bunlarlEl MASP-3 antikorlarIElve MASP-3 baglantEfragmanIarIüdogal ve sentetik peptitleri, rekabetçi sübstratlarÇlküçük molekülleri, ekspresyon inhibitörlerini ve izole dogal inhibitörleri içeren ve aynüamanda lektin yolunda bir diger tanIIama molekülüne (örn. MBL, CL-11, H-fikolin, M-fikolin veya L-fikolin) baglanmasEl için MASP-3 ile rekabet eden peptitleri de kapsayan herhangi bir maddeyi ifade etmektedir.

Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-3'e özgüdür ve MASP-l veya MASP-2'ye baglanmamaktadlü Dogrudan MASP-3'ü inhibe eden bir inhibitör madde, bir dogrudan MASP- 3 inhibitör maddesi (örn. bir MASP-3 antikoru) olarak ifade edilebilirken, MASP-3'ü dolayIIZI olarak inhibe eden bir inhibitör maddesi, bir dolayIEMASP-3 inhibitör maddesi (örn. MASP-3 aktivasyonunu inhibe eden bir MASP-l antikoru) olarak ifade edilebilmektedir. Bir dogrudan MASP-3 inhibitör maddesinin bir örnegi, kompleman sisteminde diger bilesenlerden en az 10 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-3'ün bir bölümüne spesifik olarak baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) bir MASP-3 inhibitör maddesi gibi bir MASP-3'e özgü inhibitör maddesidir. Bir durumda, bir MASP-3 inhibitör maddesi, örnegin MASP-l araclIil] MASP-3 aktivasyonu (örn bunlari bir MASP-1 antikoru veya MASP-l baglaylEIZfragmanlarÇl dogal ve sentetik peptitler, küçük moleküller, ekspresyon inhibitörleri ve izole dogal inhibitörleri ve aynDzamanda MASP-3'e baglanmasüçin MASP-l ile rekabet eden peptitleri kapsamaktadlE) dahil olmak üzere MASP-3 aktivasyonunun bir inhibitörü gibi MASP-3 aktivitesini dolayllîcblarak inhibe etmektedir. Bir diger durumda, bir MASP-3 inhibitör madde, faktör D'nin MASP-3 aracHJJInatürasyonu inhibe etmektedir. Bir diger durumda, bir MASP-3 inhibitör maddesi, faktör B'nin MASP-3 araciIJJIlaktivasyonu inhibe etmektedir. Bulusun yönteminde kullanSIElolan MASP-3 inhibitör maddeleri, %10'dan daha büyük, örnegin 3'e bagnlükompleman aktivasyonunu azaltabilmektedir. Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-3'e baglllîlkompleman aktivasyonunu, %90'dan daha fazlaslîile (ör. sadece MASP-3 inhibisyonunun, tamamen veya klglnen LEA-1 ile iliskili Iizisi ve opsonizasyonu ve faktör B ve faktör D ile iliskili lizisin ve opsonizasyonu bloke etmesi beklenmektedir.

Burada kullanligiEli'jzere, “MASP-l inhibitör maddesi", MASP-l'e baglanan veya bununla dogrudan etkilesime geçen ve (i) MASP-3'e bagnlükompleman aktivasyonundan ve/veya (ii) MASP-Z'ye bagIiIEIkompleman aktivasyonundan ve/veya (iii) faktör D'nin lektinden baglislîl veya lektine bagIiIEIMASP-l aracUJJJInatürasyonundan en az birisini inhibe eden herhangi bir maddeyi ifade etmektedir, burada faktör D'nin lektine baglillZlMASP-l matürasyonu, MASP-l antikorlarüve bunlarI MASP-1 baglaylîEfragmanlarIü dogal ve sentetik peptitler, küçük moleküller, ekspresyon inhibitörleri ve izole dogal inhibitörleri içeren ve aynüamanda Iektin yolunda bir diger tanIiIama molekülüne (örn. MBL, CL-11, H-fikolin, M-fikolin veya L-fikolin) baglanmasüiçin MASP-1 ile rekabet eden peptitleri kapsayan faktör D'nin dogrudan aktivasyonunu Içermektedir. Bulusun yönteminde kullanlglüylan MASP-2 inhibitör maddeleri, bagIiIEkompleman aktivasyonunu azaltabilir. MASP-1 inhibitör maddesi, MASP-3'e bagIiIIZI kompleman aktivasyonunu, %90'dan daha fazlasEüe (ör. sadece %10 veya daha az MASP-3 kompleman aktivasyonuyla sonuçlanacak sekilde) azaltmaktadE Bir diger durumda, bulusun yönteminde kullanlgllîlolan MASP-2 inhibitör maddeleri, %10'dan daha fazlasl,-_I örnegin kompleman aktivasyonunu azaltmaktadß Bir durumda, MASP-1 inhibitör maddesi, MASP-Z'ye bagIiIElkompleman aktivasyonunu, %90'dan daha fazlasEille (ör. sadece %10 veya daha az MASP-2 kompleman aktivasyonuyla sonuçlanacak sekilde) azaltmaktadB Bulusun yönteminde kullanlgllîblan MASP-1 inhibitör maddeleri, faktör B ve faktör D'nin MASP-3'e bagilükompleman aktivasyonunu (LEA-l), Iektinden bagIislZl dönüsümü ve MASP-Z'ye bagIilElkompIeman aktivasyonunu (LEA-2) %10'dan daha fazlas|,__| örnegin azaltmaktadlE] MASP-1 inhibitör maddesi, faktör B ve faktör D'nin MASP-3'e bagIiIEi kompleman aktivasyonunu (LEA-1), Iektinden bagIisiZI dönüsümü ve MASP-Z'ye bagIiIEl kompleman aktivasyonunu (LEA-2) %90'dan daha fazla (örn. sadece %10 veya daha az MASP-3 kompleman aktivasyonu ve sadece %10 veya daha az MASP-2 kompleman aktivasyonu ile sonuçlanacak sekilde) yüzde ile azaltmaktadlü Bir dogrudan MASP-1 inhibitör maddesinin bir örnegi, MASP-1'in bir bölümüne, kompleman sisteminde bulunan diger bilesenlerden en az 10 kat daha büyük olan bir baglantßffinitesi ile spesifik olarak baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) bir MASP-1 inhibitör maddesi gibi bir MASP-l'e özgü inhibitör maddesidir. Bir çok durumda, MASP-1'in MASP-l'ü aktif hale getirebilmesinin saglanmaslîla ve MASP-l'In, MASP-Z'yi aktif hale getirebilmesinin saglanmasüla, MASP-1'in inhibisyonunun, MASP-3 ve/veya MASP-2'nin inhibe edilmesinde etkili olmasEbekIenecektir. Fakat bazEtlurumIarda, MASP-1 veya MASP-3 veya MASP-Z'nin Inhibisyonu, diger MASP hedeflerinin inhibisyonuna göre tercih edilen bir durum olabilmektedir. Örnegin Staphy/ococcus aureus (5. aureus) enfeksiyonunun ayarlanmasIa, MASP-3'ün, aktif hale getirildigi ve MASP-1 yoklugunda 5. aureus opsonizasyonundan sekilde, paroksismal nokturnal hemoglobinürinin (PNH) tedavisinde, örnegin PNH'nin LEA-l- inhibitör tedavisi slüslükia 5. aureus'a potansiyel duyarllligllîlazalttlglîlsekilde MASP-3'den ziyade MASP-l'i dogrudan inhibe etmesi avantajlßlabilmektedir.

Burada kullanIfglEüzere, “MASP-Z inhibitör maddesi”, MASP-Z'ye baglanan veya bununla dogrudan etkilesime geçen ve (i) MASP-2'ye bagIiIEkompleman aktivasyonundan ve/veya (ii) MASP-l'e bagilükompleman aktivasyonundan en az birisini inhibe eden, MASP-l antikorlarEl/e bunlarI MASP-1 baglaylElIfragmanlarIÇl dogal ve sentetik peptitler, küçük moleküller, ekspresyon inhibitörleri ve izole dogal inhibitörleri içeren ve aynüamanda Iektin yolunda bir diger tanIiIama molekülüne (örn. MBL, CL-11, H-nkolin, M-fikolin veya L-fikolin) baglanmasüçin MASP-2 ile rekabet eden peptitleri kapsayan herhangi bir maddeyi ifade etmektedir. Bulusun yönteminde kullanlgIEblan MASP-2 inhibitör maddeleri, %10'dan daha fazlas, örnegin %20'den daha fazla, %50'den daha fazla veya %90'dan daha fazla yüzde ile MASP-2'ye bagIiIElkompleman aktivasyonunu azaltabilmektedir. Bir durumda, MASP-2 inhibitör maddesi, MASP-2'ye bagIllEkompleman aktivasyonunu, %90'dan daha fazlasElle (ör. sadece %10 veya daha az MASP-2 kompleman aktivasyonuyla sonuçlanacak sekilde) azaltmaktadlE Bir dogrudan MASP-2 inhibitör maddesinin bir örnegi, kompleman sisteminde diger bilesenlerden en az 10 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-2'nin bir bölümüne spesifik olarak baglanan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) bir MASP-Z inhibitör maddesi gibi bir MASP-2'ye özgü inhibitör maddesidir.

Burada kullanI[gll]'izere, “antikor" terimi, herhangi bir antikor üretici memeliden (örn. fare, slgbn, tavsan ve insan dahil olmak üzere primat) veya örnegin MASP-l, MASP-2 veya MASP-3 polipeptitler veya bunlari bölümleri gibi bir hedef polipeptidine spesifik olarak baglanan bir hibridom, faj seçimi, rekombinant ekspresyon veya transjenik hayvanlardan (veya antikorlar. veya antikor fragmanlarII üretilmesine yönelik diger yöntemlerden) türetilen antikorlarElve bunlarlEl antikor fragmanlarIElkapsamaktadlEI “Antikor” teriminin, antikor kaynagi veya yaplIJE biçimine (örn. hibridom, faj seçimi, rekombinant ekspresyonu, transjenik hayvan, peptit sentezi ve benzeri vasltiislîla) göre klîlfllanmasü amaçlanmamaktadlEl Örnek teskil eden antikorlar, poliklonal, monoklonal ve rekombinant antikorlar; pana özgü, çok spesifik antikorlar (ör. bispesiûk antikorlar, trispesifik antikorlar), InsanlastlEIIhE antikorlar; murin antikorlarü kimerik, fare-Insan, fare primat, primat-insan monoklonal antikorlarüve anti-idiotip antikorlarüçermektedir ve bozulmamE antikor veya bunun fragmanElolabilmektedir. Burada kullanI[g]l:]üzere, “antikor" terimi, sadece el degmemis poliklonal veya monoklonal antikorlarlîtlegil, aynüamanda bunlarI varyantlarlü (örnegin dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), tek zincirli (scFv), bunlarI sentetik varyantlarüdogal yollarla olusan varyantlar, gerekli özgüllüge sahip bir antijen baglaylEEfragman bir antikor bölümünü içeren füzyon proteinleri, insanlastlEllmlglantikorlar, kimerik antikorlar ve gerekli özgüllüge sahip bir antijen baglaylEEbölgeyi veya fragmanüepitop tanllama alanDîliçeren immünoglobulin molekülünün herhangi bir diger modifiye edilmis konfigürasyonunu ka psamaktad lü Bir “monoklonal antikor" terimi, bir homojen antikor popülasyonunu ifade etmektedir, burada monoklonal antikor, bir epitopun seçici baglant-a dahil edilen amino asitlerden (dogal yollarla olusan ve dogal yollarla olusmayan) olusmaktadlEl Monoklonal antikorlar, hedef antijene yüksek derecede özgüdür. “Monoklonal antikor” terimi, sadece bozulmamlgl monoklonal antikorlarü'e tam uzunlukta monoklonal antikorlarlîcllegil, aynüamanda bunlarI fragmanlarmörnegin Fab, Fab', F(ab')2, Fv), tek zinciri (scFv), bunlarI varyantlarübir antijen baglaylEElbölümü içeren füzyon proteinler, insanlastlîllüig monoklonal antikorlar, kimerik monoklonal antikorlar ve bir epitopa baglanmasülçin gerekli özgüllüge ve kabiliyete sahip bir antijen baglaylE]:lfragmanl:l(epitop tannlama alanDZl içeren immünoglobulin molekülünün herhangi bir diger modifiye edilmis konfigürasyonunu da kapsamaktadlE Antikor kaynaglEla veya yapiIJEbiçimine (örn. hibridom, faj seçimi, rekombinant ekspresyonu, transjenik hayvan, peptit sentezi ve benzeri vasitâslýla) göre klîlflianmasüamaçlanmamaktadlîl Terim, tüm immünoglobulinleri ve aynElzamanda yukarlâla "antikor” teriminin tanIilZBltlEUa açßZJanan fragmanlarülre benzerini içermektedir.

Burada kullanIlgiEüzere, “antikor fragmanlîlterimi, genellikle antijen bagElveya bunlarI degisken bölgesi dahil olmak üzere bir MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 antikoru gibi tam uzunlukta bir antikordan türetilen veya tam uzunlukta antikor ile iliskili bir bölümü ifade etmektedir. Antikor fragmanlari. açiElaylEElörnekleri, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 ve Fv fragmanlarIÇlscFv fragmanlarIDdiakorlarÇllineer antikorlarütek zincirli antikor moleküllerini ve antikor fragmanlarlüldan olusturulan multispesifik antikorlarüçermektedir.

Burada kullanIlglEiizere, "tek zincirli bir Fv” veya "scFv" antikor fragmanübu alanlarlEl, tek bir polipeptit zincirde mevcut oldugu bir antikorun VH ve VL alanlarlübermektedir. Genellikle, Fv polipeptidi ayrlEla scFv'nin, antijen baglîçin istenilen bir yapmlusturmaslülnümkün kilân VH ve VL alanlarßraslîida olan bir polipeptit baglaylîllilçermektedir.

Burada kullanI[giEIizere, “kimerik bir antikor”, antikor molekülünün arta kalanübir insan antikorundan türetilirken, insan olmayan türlerin (ör. kemirgen) antikordan türetilen degisken alanlarüre tamamlaylEHJJZl belirleyici bölgeleri içeren rekombinant bir proteindir.

Burada kullanIlgiülizere, “insanlastlElllIhlgbir antikor" bir insan antikor çerçevesine nakledilen insan olmayan immünoglobulinden türetilen özel tamamlayEIHEJ belirleyici bölgelere uyan minimum bir sekansEliçeren kimerik bir antikordur. InsanlastlElB1lgl antikorlar genellikle sadece antikor tamamlayEiIJKJ belirleyici bölgelerin, insan kaynakIEl olmadlgü (faj görüntüsünden veya mayadan üretilen antikorlar dahil) rekombinant proteinlerdir Burada kullanIlglElüzere, “mannoz baglaylEEllektin" (“MBL") terimi, mannoz baglaylaj proteinin (“MBP”) es degeridir.

Burada kullanlglîüzere, “membran saldlEEkompleksi” (“MAC”), membranlara yerlesen ve membranlarü(aynüzamanda C5b-9 olarak da ifade edilmektedir) bozan bes terminal kompleman bileseninin (C6, C7, C8 ve C9 ile birlestirilen C5b) bir kompleksini ifade etmektedir.

Burada kullanIlglElizere, “bir suje”, kEiEIhylEEblmaks- insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler, kediler, atlar, koyunlar, keçiler, inekler, tavsanlar, domuzlar ve kemirgenler dahil tüm memelileri içermektedir.

Burada kullanIlgilîilJzere, amino asit kalEtilârüasagIki gibi klgaltilmaktadlîl Alanin (Ala;A), asparajin (Asn;N), Aspartik asit (Asp;D), Arjinin (Arg;R), sistein (Cys;C), Glutamik asit (GIu;E), Glutamin (GIn;Q), Glisin (Gly;G), Histidin (His;H), Izolösin (IIe;I), Lösin (Leu;L), Lizin (Lys;K), Metiyonin (Met;M), Fenilalanin (Phe;F), Prolin (Pr0;P), Serin (Ser;S), Treonin (Thr;T), triptofan (Trp;W), Tirosin (Tyr;Y) ve Valin (VaI;V).

En genis anlamda, dogal yollarla olusan amino asitler, ilgili amino asitlerin yan zincirinin kimyasal özelligine dayaIEblarak gruplara bölünebilmektedir. “Hidrofobik” terimiyle, amino asidin, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys veya Pro kast edilmektedir. “Hidrofilik” amino asit terimi ile, Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg veya His kastedilmektedir.

Amino asitlerin bu gruplandlEnasElayrlEla asaglîlb oldugu gibi alt sIlfliara ayrilâbilmektedir Burada kullanIlglEüzere, “koruyucu amino asit ikamesi" terimi, asagldhki gruplardan her birisinin içerisinde bulunan amino asitlerin arasIa olan bir ikame ile gösterilmektedir: (1) glisin, alanin, valin, Iösin ve izolösin, (2) fenilalanin, tirozin ve triptofan, (3) serin ve treonin, (4) aspartat ve glutamat, (5) glutamin ve asparajin ve (6) lizin, arjinin ve histidin.

Burada kullanI[gil:üzere, “oligonükleotid” terimi, ribonükleik asidin (RNA) bir oligomerini veya polimerini veya deoksiribonükleik asidi (DNA) veya bunlari mimetiklerini ifade etmektedir. Bu terim ayrlîla dogal yollarla olusan nükleotidlerden, sekerlerden ve kovalent internükleosit (temel) baglantllârdan olusan bu oligonükleotidleri ve bunun yanElei, dogal yollarla olusmayan modifikasyonlara sahip olan oligonükleotidleri kapsamaktadIEl Burada kullanIEgIIJJzere, bir “epitop” terimi, bir antikorla baglanan bir protein bulunan alanlIl (örn. bir insan MASP-3 proteini) ifade etmektedir. “Üst üste gelen epitoplar”, dogrusal ve dogrusal olmayan epitoplar dahil yayg amino asitlerden en az birisini (örn. iki, üç, dört, bes veya altlIliçermektedir.

Burada kullanI[gll:lüzere, “polipeptit”, “peptit” ve “protein” terimleri, birbirlerinin yerine kullanmakta ve uzunluk veya post dönüsümsel modifikasyona bakllüiaks- amino asitlerin herhangi bir peptide baglEkincir anlam. gelmektedir. Burada açüîlanan MASP proteinleri (MASP-1, MASP-2 veya MASP-3), sokak türü proteinleri Içereiblmekte veya sokak türü proteinler olabilmektedir veya 50'den daha fazla (örn. bir, iki, üç, dört, bes, altÇIyedi, sekiz, amino asit Ikamesine sahip olan varyantlar olabilmektedir. Tutucu ikameler genellikle asaglElhki gruplar içerisindeki ikameleri içermektedir: glisin ve alanin; valin, izolösin ve Iösin; aspartik asit ve glutamik asit; asparajin, glutamin, serin ve treonin; lisin, histidin ve arginin; ve fenilalanin ve tirozin.

Burada açllZlanan insan MASP-1 proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10 olarak belirtilmektedir), insan MASP-2 proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 olarak belirtilmektedir) ve insan MASP-3 proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8 olarak belirlenmektedir) aynüamanda bir MASP proteininin peptit fragmanlarlîdahil tam uzunlukta ve/veya olgunlasmamlgl(pre-pro) MASP proteinlerinden daha klgla olan "peptit fragmanlarIlZl içermektedir ve aynElzamanda proteinin iç delesyon varyantlarIEiçermektedir. Delesyon varyantlar, (iki veya ikiden fazla amino asidin) bir iki, üç, dört, bes, altÇiyedi, sekiz, dokuz, olabilmektedir. Insan MASP-1 proteini, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'da belirtilen amino asit sekans. sahip olan insan MASP-1 proteinine benzerlik %'si aç-an 70 olan veya olabilmektedir.

Insan MASP-3 proteini, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'de belirtilen amino asit sekans- sahip olan insan MASP-3 proteinine benzerlik %'si aç-an 70 olan veya 70'den daha fazla BazEtlurumlarda, insan MASP-2 proteini, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'de belirtilen amino asit sekanlela sahip olan insan MASP-3 proteinine benzerlik %'si aç-an 70 olan veya olabilmektedir.

Bazüziurumlarda, peptit fragmanlarüuzunluk aç-dan en az 6 (örn. en az 7, 8, 9, 10, 11, 600 daha fazla) amino asit kalIiglIda olabilmektedir (örn. SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5, 8 veya 10 arasiEdan herhangi birisinde en az 6 aralilîlsîlamino asit kaIlEtlgm Bazlîdurumlarda, bir insan MASP proteinin bir antijenik peptit fragmanÇiuzunluk aç-an 500'den daha az NUMARASI: 5, 8 veya 10 arasIan herhangi birisinde 500'den daha az araliKSlîl amino asit kaIlEtEDZl BazEtlurumIarda, MASP-1, MASP-2 ve/veya MASP-3'e baglanan bir antikorun üretilmesine yönelik içerikte, peptit fragmanlarüantijeniktir ve bir memelide tam uzunlukta proteinin bir indükleyebilme kabiliyetini tutmaktadlîl (bkz. asag- “Bir Antikorun Üretilmesine Yönelik Yöntemler”).

Amino asit sekansElbenzerliginin yüzdesi (0/0), gerekli olmasElhaIinde maksimum sekans benzerligi yüzdesine ulasmak için sekanslar. hizalanmasIan ve bosluklari doldurulmasIan sonra bir referans sekansia amino asitlere benzer olan bir aday sekansta amino asitlerin yüzdesi olarak belirlenmektedir. Sekans benzerligi yüzdesinin belirlenmesi amaçlar. dair hizalama, örnegin BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 veya Megalign (DNASTAR) yazlüiîlilîlgibi kamusal olarak mevcut bilgisayar yazlHEllZlkullanllârak teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafIan bilinen çesitli yöntemlerle ulasllâbilmektedir. Klibslanan tam uzunlukta sekanslar üzerinde maksimum hizalamaya ulasmak için gerekli herhangi bir algoritma dahil hizalamanI ölçülmesine yönelik uygun parametreler, bilinen yöntemlerle belirlenebilmektedir.

Insan MASP-l proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10), SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9 olarak belirlenen cDNA sekansEile kodlanmaktadlB insan MASP-2 proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5), SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4 olarak belirtilen cDNA sekansEl ile kodianmaktadiîj ve insan MASP-3 proteini (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8), SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7 olarak belirtilen cDNA sekansEiIe kodlanmaktadß Teknikte tecrübe sahibi olan kisiler, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4, SEKANS KIMLIK NUMARASI:50 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI:53'te tarif edilen sekanslarliîl, leisMa insan MASP-l, MASP-Zve MASP-3'ün tek bir alelini temsil ettigini ve alelik varyasyonun ve alternatif birlesmenin olusmaSII beklendigini anlayacaktlB Sessiz mutasyonlarlZlve mutasyonlarlEl, amino asit sekansüdegisimleri ile sonuçlan mutasyonlar dahil olmak üzere SEKANS KIMLIK NUMARASI:9, SEKANS KIMLIK NUMARASI:4 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI:7'de gösterilen nükleotid sekanslarII alelik varyantlarümevcut bulusun kapsamEiçeriSinde kalmaktadlEI MASP-l, MASP-2 veya MASP-3 sekansII allelik varyantlarüstandart prosedürlere göre farklEbireylerden gelen cDNA veya genomik kütüphanelerin sondalanmasEile klonlanabilmektedir veya bu tarz bilgileri içeren ver tabanlarII homoloji klîzlaslama arastlElnasEGörn. BLAST arastlElnasLIlile belirlenebilmektedir. i. Genel Baklâl lektin volu yeniden tanIiIanmlgt_lEl Burada açlKlandlglEüzere, mucitler, kompleman. lektin yolunun, her ikisi de karbonhidrat tanIiIa bilesenlerinden (MBL, CL-11 ve fikolinler) olusan lektin yolu aktivasyon kompleksleri ile komplemanüiktif hale getirmek için iki efektör kola sahip olduguna dair sasIiEEliJir kesifte bulunmustur: (i) burada “lektin yolu efektör kolu 1” veya "LEA-l” olarak burada ifade edilen lektin yolu ile iliskili serin proteazlarEfMASP-l ve MASP-3) ile olusturulan efektör kol; ve (ii) geçirilen aktivasyon efektör kol. LEA-1 ve LEA-2, Iizisi ve/veya opsonizasyonu etkileyebilmektedir.

Aynüamanda MASP-3 ile faktör B'nin Iektinden bagislîldönüsümünün ve HTRA-l, MASP-1 ve MASP-3 ile faktör D'nin lektinden bagislîldönüsümünün (her ikisi de Ca++ yoklugunda olusabilmektedir) yaygI olarak C3bB ila C3bBb'nin ve pro-faktör D ila faktör D'nin dönüsümüne yol açmaktadlü Bu sekilde, MASP-3'ün inhibe edilmesi, Iizis ve/veya opsonizasyonun inhibisyonu ile sonuçlanabilen faktör B ve/veya faktör D'nin LEA-1 ve lektinden baglislîlaktivasyonunu inhibe edebilmektedir.

SEKIL 1, kompleman aktivasyonunun yollarII bu yeni anlaylglElEgöstermektedir. SEKIL 1'de gösterildigi üzere, LEA-1, faktör D'nin zimogenini aktif formuna aktif hale getirebilen ve/veya C3b- veya C3b(H20)-bagll:faktör B'yi bölebilen Iektine bagIEMASP-3 ile harekete geçirilmektedir, bu da C3bB zimogen kompleksinin, enzimatik olarak aktif formuna (C3bBb) dönüsümüne yol açmaktadlEl MASP-3 ile üretilen aktif halde faktör D aynEzamanda C3bB veya C3b(H20) zimogen kompleksleri enzimatik olarak aktif formlar. dönüstürebilmektedir.

MASP-1, hlîllîsielf aktivasyon yetenegine sahipken, MASP-3 degildir. Bir çok durumda, MASP- 1, MASP-3'ün aktivatörüdür.

Birçok örnekte Iektinler (örn. MBL, CL-11 veya fikolinler) hücresel yüzeylere aktiviteyi yönlendirebilirken, SEKIL 1 aynEIzamanda faktör B aktivasyonunda ve/veya faktör D matürasyonunda MASP-3, MASP-1 ve HTRA-l'in lektinden baglislîl islevlerini tasarlamaktadlB LEA-l'de MASP-3'ün lektin ile iliskili formu ile oldugu gibi, MASP-3'ün SEKIL 36 ve 37) ve profaktör D'nin faktör D'ye (bkz SEKIL 39) dönüsümünü yönlendirebilmektedir. MASP-1 (bkz. aynllamanda SEKIL 39) ve MASP ile iliskili olmayan protien HTRA-l aynüamanda herhangi bir lektin bileseninin gerekli olmadlgiESekilde faktör D'sini aktif hale getirebilmektedir (Stanton ve meslektaslarü4 Maylgl2011 tarihinde Vizyon ve Oftalmoji 2011 konferansIa ArastiElna Derneginde sunulan HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration konusunda Kan[fJ.

Bu sebepten ötürü, MASP-l (LEA-1 ve Iektinden bagnsE] formlar), MASP-3 (LEA-1 ve faktör D - faktör B ekseni boyunca bir veya birden fazla noktada dogrudan veya dolayllZl aktivasyonu yapabilmektedir. Bu sekilde, C3bBb, alternatif yolun C3 konvertazIEi üretmektedirler ve mikrobiyal yüzeylerde C3b'nin üretimini ve birikimini uyarmaktadiEllar. C3b birikimi, makrofajlar gibi konak fagositik hücrelerle y-i için mikroplar. yüzeylerini isaretleyerek opsonizasyonda kritik bir rol oynamaktadlü Burada bulunan bir örnek olarak (SEKIL 35), MASP-3, 5. aureus opsonizasyonu için kritiktir. C3b birikimi, bir MASP-3'e baglilünodelde insan serumuna maruz büküân 5. aureus'da hiîllîbir sekilde olusmaktadlîl Fakat, LEA-1 katkilârüve MASP-3, MASP-l veya HTRA-1'in lektinden bagIislZI islevleri, opsonizasyona kiglfllßlmamaktadlü SEKIL 1'de sema haline getirildigi üzere, bu üç bilesen aynüamanda, faktör B'nin dolaylüleya dogruda aktivasyonu ve C3b üretimi vaslüislýla hücre kompleksleri olusturmaktadlEi Burada açmandigiüüzere, 5. men/hg/'Üaý's lizisinde MASP-2 olmayacak sekilde (ve bu sekilde bu örnekte LEA-2 olmayacak sekilde) MASP-3 ve MBL gereksinimi, (bkz. SEKIL 13, 14 ve 15), Iiziste LEA-l'e yönelik bir rolü göstermektedir. Özet olarak, 5. aureus çallginalariEUan elde edilen opsonizasyon sonuçlarüve N. meni'ngi't/'d/s` çallglnalarIa gözlemlenen Iizis sonuçlarÇlher iki süreçte (SEKIL 1'de sema haline getirildigi üzere) LEA-1 rolünü desteklemektedir. DahaslIJ bu çallgmalar, her iki opsonizasyonun ve sonuçlanabilmektedir, bu sekilde her iki süreç, MASP-3, MASP-l veya HTRA-1'in lektinden bagIislZl rollerinin sonuçlarüolabilmektedir. Bu sebepten ötürü, SEKIL 1'de mucitler taraflEUan gelistirilen model, opsonizasyonu ve/veya Iizisi bloke etmek için ve bu süreçlerin düzensizliginin yol açtigllîbatolojileri tedavi etmek için prensip olarak MASP-3'ün, fakat aynEl zamanda MASP-l ve/veya HTRA-l'in inhibitörlerinin kullanIiElüliesteklemektedir. 1. Lektin Yolu Efektör Kolu (LEA-1) Lektin yolunun birinci efektör kolu (LEA-i), lektin yolu ile iliskili serin proteazlarEQMASP-l ve MASP3) ile olusturulmaktadlü Burada açiEIandEglElüzere, mucitler, MASP3 yoklugunda ve MASP-l mevcudiyetinde, alternatif yolun yüzey yapüârlîüzerinde etkili bir sekilde aktif hale getirilmedigini göstermistir. Bu sonuçlar, MASP-3'ün, MASP-3'ün islev bozuklugunun serin proteaz alanIEbrtaya koyan mutasyonlarla alternatif yolun baslatllmasia öncesinde tarif edilmemis bir rol 0ynad[g]IElve bunun, nadiren 3MC otozomal resesif bozukluga sahip hastalardan elde edilen MASP-3'ü eksik 3MC serumu kullanllârak onaylandiglID esasIa, geleneksel olarak belirlendigi üzere alternatif yolu içeren kompleman aktivasyonunun, MASP-3'e bagIiIIZlolmasElbeklenmektedir. AsllEUa MASP-3 ve LEA-1 aktivasyonu, alternatif yolun simdiye kadar anlasühiasüor baslatlEls-Lllliemsil edebilmektedir.

Burada Örnek 1-4 arasIda açllZland[g]l:lüzere, MASP-2'si eksik serumlarda, mucitler, /V. men/hg/I/'d/S'e karslîdaha yüksek bir bakterisidal aktivite (örn. Iitik aktivitesi) ile sonuçlanan lektine bagIiIElalternatif yol aktivasyonunun daha yüksek bir aktivitesini gözlemlemistir.

Herhangi bir teoriye ile baglEkalmak istenmese de, MASP-2 yoklugunda, MASP-l taslýhn karbonhidrat tanIilama komplekslerinin, MASP-3'ü aktif hale getirmek için MASP-3 taslîlîlîl karbonhidrat tanIilama komplekslerine yakI bir sekilde baglanmasEldaha muhtemel olduguna inanllüiaktadlB Birçok durumda, MASP-3, bir oto aktif hale getirici enzim olmazken MASP-3 aktivasyonunun, MASP-l aktivitesine bagIilEbldugu ve genellikle oldukça sllZJ bir sekilde zimogen formundan enzimatik olarak aktif forma MASP-l aktivite dönüsümünü gerektirmektedir. MASP-l (MASP-Z benzeri), bir oto aktif hale getirici enzim olurken, MASP-3, enzimaitk olarak aktif forma dönüstürülecek olan MASP-l'in enzimatik aktivitesini oto aktif hale getirmemektedir ve bir çok durumda buna ihtiyaç duymaktadlEl Bkz. Zundel S, ve ark., kompleksleri, MASP-l veya MASP-3 ile yüklenmektedir. Bu sekilde, MASP-Z yoklugu, MASP- 3'ün, enzimatik olarak aktif forma MASP-l aracllIlîllönüsümüne olanak saglamaktadlîl MASP-3 aktif hale getirildiginde, aktif halde MASP-3, C3bB'nin C3bBb'ye MASP-3 araCUJIlbir dönüsümü ve/veya pro-faktörü D'nin faktör D'ye dönüsümü vaslâslîla “LEA-1” aktivasyonu olarak ifade edilen alternatif yolu baslamaktadü Aynlîtamanda alternatif yol C3 konvertazlîblarak ifade edilen C3bBb, opsonik C3b moleküllerinin birikimi veren ek C3 moleküllerini bölmektedir. Çesitli C3b fragmanlarIlEl, C3bBb konvertaz kompleksine yakI bir iliskide baglanmasEl halinde, bu, MAC formasyonunu arttlßn alternatif yol C5 konvertazlZlC3bBb(C3b)n'nin formasyonu ile sonuçlanmaktadE Ek olarak, yüzeyde biriktirilen C3b molekülleri, alternatif yol C3 ve C5 konvertaz komplekslerinin olusturulabildigi ek alanlarljblusturmak için faktör D ve/veya MASP-3 ile bölünebilen faktör B baglant- yönelik yeni alanlarlZblusturmaktadlB aynElzamanda mucitlerden üretilen veri (SEKIL 37), alternatif yol C3 konvertaz zimogen kompleksinin (C3bB), aktif halde MASP-3 ile enzimatik olarak aktif forma dönüstürüldügünü göstermektedir. Mucitler, faktör B'nin MASP-3 aracillübölünmesinin, alternatif yol C3 konvertazlElI (C3bBb) Iektine baglillîformasyonunu arttün, yeni açlEIanan LEA-l'in bir alt bilesenini temsil ettigini kesfetmistir. 2. Lektin Yolu Efektör Kolu (LEA-2) Lektin yolunun birinci efektör kolu (LEA-2), Iektin yolu ile iliskili serin proteazüMASP-Z) ile olusturulmaktadlü MASP-Z, ilgili modellere tanllama bilesenlerinin baglanmasEbonrasIda aktif hale getirilmektedir ve aynüamanda MASP-l ile aktif hale getirilebilmektedir ve daha sonrasEUa C4 kompleman bilesenini C4a ve C4b'ye bölmektedir. C4b bölünme ürününün C2 plazmas- baglant-an sonra, C4b'ye bagIECZ, C4b'ye baglECZ'yi, enzimatik olarak aktif komplekse (C4bC2a) ve bir küçük C2b bölünme fragman. dönüstüren bir ikinci MASP-Z araclIÜbölünme adIiII sübstratElîialine gelmektedir. C4b2a, bol plazma bilesenini (C3), C3a ve C3b'ye dönüstürerek Iektin yolunun C3 dönüstürücü C3 konvertazIE C3b, bir tiyoester bagüiasiüslsîla yakI iliskide herhangi bir yüzeye baglanmaktadlB Çesitli C3b fragmanlarIlEJ, C3 konvertaz kompleksine (C4b2a) baglanmasElhalinde, bu konvertaz, C5 konvertaz kompleksini (C4b2a(C3b)n) olusturarak C5'i C5b ve C5a'ya dönüstürmeye yönelik özgüllügünü degistirmektedir. Bu C5 konvertaz, MAC formasyonunu baslatabilirken, bu sürecin, kendisinde lizisi arttlîrlnak için yetersiz miktarda tekili oldugu düsünülmektedir.

Bundan ziyade, LEA-2 ile üretilen ilk C3b opsoninler, en nihayetinde bol MAC formasyonuna ve Iizise yol açan yeni alternatif yol C3 konvertaz ve C5 konvertaz alanlarII formasyonuna yönelik nükleusu olusturmaktadlü Bu sonraki eylem, LEA-2 ile olusturulan C3b ile iliskili faktör B'nin faktör D aktivasyonu ile yönlendirilmektedir ve bu sekilde, faktör D'nin matürasyonunda MASP-l'e yönelik temel rolden dolayELEA-l'e bagIiIEblmaktadlE Aynlîtamanda MASP-2'si eksik fareler iskemi-reperfüzyon hasarlîidan korunurken C4'ü eksik fareler, iskemi- reperfüzyon hasarIan korunmadlg'lEliçin iskemi-reperfüzyon hasarII patofizyolojisinde önemli bir rol oynayan, C4 yoklugunda C3'ü aktif hale getirebilmeye yönelik bir MASP-2'den bagIislZl C3 baypas aktivasyon yolu mevcuttur. LEA-2 aynüamanda protrombinin trombine (ortak yol) bölünmesini ve enzimatik aktif formuna (XIIa) dönüstürmek için faktör XII'nin (Hageman faktörü) bölünmesini içeren koagülasyon yola baglanmaktadlEl Faktör IIX slîaêslýla faktör XI'nI Xia'ya (ekstrinsik yol) bölmektedir. PDîtUâsma kaskacIII instrinsik yol aktivasyonu, trombüs formasyonu için kritik öneme sahip olan fibrin formasyonuna olanak saglamaktadlE SEKIL 1, burada saglanan sonuçlarI esasIa Iektin yolunun ve alternatif yolun yeni anlaylglElElgöstermektedir. SEKIL 1, hem opsonizasyonda ve liziste LEA-2'nin rolünü betimlemektedir. MASP-2, fizyolojik olarak çoklu Iektine bagIiIEbyarda “asaglîyönde” C3b birikiminin (ve ortaya ç[lZlan opsonizasyon) baslatElîßlurken (SEKILL 20A, 205, 20C), aynEl zamanda seruma duyarIElbakteriIerin lizisinde bir rol oynamaktadlîl SEKIL 1'de gösterildigi üzere, IV. mening/t/'d/'s gibi seruma duyarllîihatojenlere yönelik MASP-2'si eksik veya MASP-Z'si bosaltlEhE serum/plazmanI artan bakterisidal aktivitesinden sorumlu olan, önerilen komplekslerinin, MASP-l'in MASP-3'ü bölmesine olanak saglandlgilîsekilde bakteriyel yüzeyde birbirlerine yakI bir iliskide baglanmasEgerekmesidir. MASP-l ve MASP-Z'nin aksine, MASP- 3, bir oto aktif hale getirici enzim degildir, fakat birçok durumda, MASP-l vasiûslîla aktivasyonun/bölünmenin, enzimatik olarak aktif formuna dönüstürülmesini gerektirmektedir.

SEKIL 1'de gösterildigi üzere, aktif halde MASP-3 daha sonraslüda leasMa enzimatik olarak aktif alternatif yol C3 ve C5 konvertazlarI (C3bBb ve C3bBb(C3b)n) formasyonu vasiüslsîla alternatif aktivasyon kaskadIEbaslatmak için patojen yüzeyinde C3b'ye baglEfaktör B'yi bölebilmektedir. MASP-Z taslîIEEIiektin yolu aktivasyon kompleksleri, MASP-3 aktivasyonunda herhangi bir parçaya sahip degildir ve MASP-Z yoklugunda veya MASP-Z'nin tükenmesinden sonra, tüm Iektin yolu aktivasyon kompleksleri, MASP-l veya MASP-3 ile yüklenecektir. Bu sekilde, MASP-Z yoklugunda, mikrobiyal yüzey MASP-l ve MASP-3 taslglEZilektin yolu aktivasyon komplekslerinde, MASP-3'ün daha aktif hale gelmesine ve mikrobiyal yüzeyde alternatif yol C3 ve C5 konvertazlarIEQC3bBb ve C3bBb(C3b)n) olusturmak için C3b'ye bagIEI faktör B'nin MASP-3 araciÜIböIünmesinin daha yüksek bir oranlEla yol açtl'gißekilde birbirlerine yakI bir iliskiye gelip yerlestirmesi olasiEglElönemli ölçüde arttlEllBwaktadlEI Bu, Membran SaldEEKompleksini olusturan, C6 ile iliskili yüzeye baglEtSb'sinden, C7 ile iliskili C5bC6'dan, C8 ile iliskili C5bC6C7'den ve C5bC6C7C8'den olusan, bakteriyel yüzey yap_ eklenen C9 polimerizasyonuna yol açan ve komplemanEhedeflenen bakterinin osmolitik ölümüne yol açacak olan bakteriyel çeperdeki bir gözenegi olusturan terminal aktivasyon kaskadlarII (C5b-C9) aktivasyonuna yol açmaktadlEl Bu yeni konseptin temeli, burada saglanan verinin, SEKIL 1'de gösterildigi üzere lektin yolu aktivasyon komplekslerinin iki ayrElaktivasyon yolunu hareket ettirdigini net bir sekilde göstermesidir: i) LEA-1: Aktivatör yüzeylerinde faktör B'nin ilk bölünmesi ve aktivasyonu vasltîi'slýla alternatif yol konvertaz.i:l(C3bBb) üreterek kompleman aktivasyonunu baslatan ve harekete geçiren bir MASP-3'e bagilßktivasyon yol, alternatif yol konveitaleEl (C3bBb) C3b birikimini ve formasyonunu katalize edecektir. MASP-3 ile harekete geçirilen aktivasyon yolu, mikroplar. opsonizasyonunda ve Iizisinde bir temel rol oynamaktadlElve membran saldlEIEkomplekslerini üretmek için optimal aktivasyon oranlar. yol açarak bakterilerin yüzeyinde alternatif yolu harekete geçirmektedir; ve ii) LEA-2: Lektin yolu c3 konvertaz. (C4b2a) formasyonuna yol açan ve daha sonraleUa, C3 bölünme ürünü C3b'nin akümülasyonundan sonra C5 konvertazlEla (C4b2a(C3b)n) yol açan bir MASP-Z'ye bagIiIElaktivasyon yolu. Kompleman C4 yoklugunda, MASP-2, C2 ve pllîtllâsma faktör XI'i içeren bir alternatif C3 konvertaz kompleksi olusturabilmektedir.

Liziste rolüne ek olarak, MASP-2 ila harekete geçirilen aktivasyon yolu, alIi için hedef alicak kovalent bir sekilde bagllIBb ve bunlar. bölünme ürünleri (örn. iC3b ve C3dg) ile kaplanan ve granülositler, makrofajlar, monositler, mikroglia hücreleri ve retiküloendotelyal sistemi gibi C3 reseptör taslýlûjfagositlerle öldürülen mikroplara yol açan bakteriyel opsonizsyonda önemli bir rol oynamaktadlü Bu, kompleman Iizisine dirençli olan bakterilerin ve mikroorganizmalar.. klerensinin en etkili yoludur. Bunlar, çogu gram-pozitif bakteriyi içermektedir.

LEA-l ve LEA-2'ye ek olarak, MASP-3, MASP-l ve/veya HTRA-l ile faktör D'nin lektinden baglislîl aktivasyonuna dair potansiyel mevcuttur ve aynüamanda MASP-3 ile faktör B'nin lektinden baglisüaktîvasyonuna dair potansiyel de mevcuttur.

Herhangi bir belirli teoriye baglD LEA-1, (ii) LEA-2 ve (iii) lektinden bagnslîl aktivasyonunun, elde edilen Iizis ile MAC opsonizasyonuna ve/veya formasyonuna yol açtlgiliîla inanllüiaktadß ii. MASP-1, MASP-2 ve MASP-3'ün Öncesi Üç mannoz baglaylEEliektin ile iliskili serin proteazlarI(MASP-1, MASP-Z ve MASP-3), mannoz baglaylEEllektin (MBL) ile insan serumunda mevcut olarak iliskili oldugu bilinmektedir.

Mannoz baglaylaîlektin aynElzamanda güncel literatürde `mannoz baglaylEEprotein' veya mikroorganizmada mevcut karbonhidrat yapilâr- MBL baglant-an dolayEl/ap-a olan immünitesinde önemli bir rol oynamaktadE Karbonhidrat yapHârII spesifik dizileri ile MBL etkilesimi, bu sekilde, C3 konvertaleî(C4b2b) olusturmak için kompleman bilesenlerini (C4 ve C2) bölerek komplemanEl aktif hale getiren MASP protenzimlerin atkivasyonunu MBL-MASP proenzim kompleksinin, günümüze kadar, sadece bir proteaz türünü (MASP-1) Içerdigi düsünülmüstür, fakat suanda MBL ile iliskili iki diger ayrüwoteazl (örn. MASP-2 ve (2001)) ve aynEkamanda “MAp19” veya “sMAP” olarak adlandlEllân 10 kDa bir ek serum 63 (1999)).

MAp19, MASP-Z'nin yapisal geninin bir alternatif olarak birlestirilmis gen ürünüdür ve serin endopeptidaz alanüliahil MASP-Z'nin dört C-terminal alanlarIan mahrum olmaktadlü Bolca elßprese edilen, MAp19'u kodlayan tepesi kesik mRNA transkripti, MASP-2 geninin bir alternatif birlestirici/poliadenilasyon eylemi ile üretilmektedir. Benzer bir mekanizma vasüâslýia, MASP- ve MASP-1 ilk olarak, MBL artEMASP'den olusan bir kompleks olarak tanilanan serum Ra- reaktif faktörünün P-100 proteaz bileseni olarak açilîianmlgtElWatsushita ve ark., Collectins kompleksi içerisinde bir MBL ile iliskili endopeptidazlEl, kompleman. klasik yolun C1q-(C1r)2- (C1'Ier)2 kompleksi içerisinde C1'Ier enziminkine açlKJ bir vaziyette benzer bir sekilde kompleman bilesenlerinde (C4 ve C2) hareket edebilmesi kabiliyeti, C1q-(C1r)z-(C1'Ier)2 kompleksine islevsel olarak analog olan bir MBL-MASPs kompleksinin mevcut oldugu açlKIamaktadlEl C1q-(C1r)2-(C1'Ier)2 kompleksi, immün komplekslerinde mevcut antikorun (IgG veya IgM) Fc bölgeleri ile C1q etkilesimi ile aktif hale getirilmektedir. Bu, daha sonraleIda kompleman bilesenlerde (C4 ve C2) hareket eden C1'Ier proenzimi sßslîla aktif hale getiren C1r proenzimin otoaktivasyonunu ortaya çiEbrmaktadlEI MBL-MASP'Ierin kompleksinin stokiometrisi, farklEMB oligomerlerinin, MASP-l/MAp19 veya MASP-Z/MASP-3'ün farklEbranIarlîLla iliskilendirildigi görülmesi aç-an C1q-(C1r)z-(C1'ler)2 Serumda MASP'Ierin ve MAp19'un çogunlugu, MBL ile komplekslenmemektedir (Thiel ve ark., baglayabilen bir fibrinogen benzeri alana sahip olan Iektinlerin güncel olarak açlEJanan fikolin ve M-fikolin, MASP'Ierle ve aynElzamanda MAp19 ile birlesmektedir ve fikolinlerle tanIElan spesifik karbonhidrat yapllâra baglanmasIan sonra Iektin yolu aktif hale bir MBL benzeri Iektin kolektin, bir Iektin yolu tanilama molekülü olarak belirlenmistir (2011)). Bu alternatif karbonhidrat tanIilama moleküllerin fizyolojik önemine vurgu yapan önemli bir kaniElmevcuttur ve bu sekilde, MBL'nin, lektin aktivasyon yolunun tek tanIilama bileseni olmadlglIElie MBL eksikliginin, Iektin yolu eksikligi için hatalEblmadlgllElanlamak önemlidir. MBL ile yaplîbl olarak iliskili alternatif karbonhidrat tanIilama komplekslerinin biri dizisinin mevcut olma olasHJgJÇl kompleman aktivasyonu vaslüslýla dogustan gelen immün sisteminin dogrudan bir yan_ baslatan mikrobiyal yapllârI spektrumunu genisletebilmektedir.

Tüm Iektin yolu tanIilama molekülleri, kolajen-homolog gövde bölgeleri içerisinde bir spesifik MASP baglaylEEfnotif ile karakterize edilmektedir (Wallis ve ark. J. Biol Chem 279:14065- ayrljriotif ile karakterize edilmektedir. Hyp-GIy-Lys-Xaa-GIy-Pro, burada Hyp, hidroksiprolin ve Xaa'nI genellikle alifatiktir. Bu sekansta bulunan nokta mutasyonlarüMASP baglant-Ei kesmektedir. 1. Ilgili yapilhr, sekanslar, kromozomal lokalizasyon ve birlesme varyantlarEl SEKIL 2, MASP-2 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) ve MAp19 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) alan yap-üye aynlîEIkodlayan eksonlarElgösteren bir sematik diyagramdlü SEKIL 3, MASP-1 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10), MASP-3 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) ve Map44 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11) alan yap-Elle ayn-Ekodlayan eksonlarEgösteren bir sematik diyagramdlü SEKIL 2 ve 3'de gösterildigi üzere, serin proteazlar (MASP-1, MASP-2 ve MASP-3), C1r ve C1'Ier'de, örnegin (I) bir N-terminali Clr/Cl'ler/ eniz kestanesi VEGF/kemik morfojenik protein (veya CUBI) alanEl(II) bir epidermal büyüm faktörü (EGF) benzeri alanlîl (III) bir ikinci CUB alanüCUBII); (IV ve V) iki kompleman kontrol proteini (CCPl ve CCP2) alanlarüve (VI) bir serin proteaz (SP) alania bulundugu gibi düzenlenen altüyrüilandan olusmaktadlü bu proteazlarlEl, varsayllân katalitik alanlarEliçerisinde His, Asp ve Ser kallütliârII karakteristik üçlemesine sahip olan serin peptidazlarlügöstermektedir (Genbank Erisi erisilmektedir).

SEKIL 2 ve 3'de gösterildigi üzere, zimogenin aktif forma dönüsümünden sonra, aglrîlzincir (alfa veya A zinciri) ve hafif zincir (beta veya B zinciri), serin proteaz alanEtemsil eden bir disülfüre baglBi` zincirini ve bir daha küçük B zincirini vermek için bölünmektedir. Tek zincirli protenzim MASP-1, ikinci CCP alanEl(aIan V) ve serin proteaz alanEl(alan VI) arasIia konumlandEllân bir Arg-Ile bagI bölünmesi vaslßslýla aktif hale getirilmektedir (proenzim C1r ve C1'Ier benzeri). Proenzimlerin (MASP-2 ve MASP-3), MASP-1'inkine benzer bir modelde aktif hale getirildigi düsünülmektedir. Her bir MASP proteini, homodimerleri olusturmaktadlEI ve bir Ca++-baglll:l sekilde MBL ve fikolinlerle bireysel olarak birlestirilmektedir. 2. MASP- Insan MASP-1 polipeptidi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-3 polipeptidi (SEKANS kolunun 3q27-28 bölgesine eslestirilmis olan bir yaplgial genden (Dahi ve ark., Immunity birlestirme/poliadenilasyon süreci ile birincil transkriptten üretilmektedir. MASP-3 dönüsüm ürünü, MASP-l ve MASP-3'e ortak olan bir alfa zincirden ve MASP-3'e benzersiz olan bir beta zincirden (serin proteaz alanmolusmaktadlîl SEKIL 3'de gösterildigi üzere, insan MASP-l geni, 18 eksonu kapsamaktadlEl Insan MASP-1 cDNA (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9 olarak kodlanmaktadlEl SEKIL 3'de gösterildigi üzere, insan MASP-3 geni, on iki eksonu kapsamaktadlEl Insan MASP-3 cDNA (SEKANS KIMLIK NUMARASI:7 olarak belirtilmektedir), NUMARASI:11 olarak belirtilmektedir) olarak adlandlEllân bir protein ile sonuçlanmaktadlE Insan MASP-l polipeptidi (Genbank BAA, 19 kallEtII bir öncü peptidini içeren 699 amino asit kallEt- sahiptir. Öncü peptit çlKbrIigIIa, MASP-1'in hesaplanan moleküler kütlesi 76,976 Da olmaktadB SEKIL 3'de gösterildigi üzere, MASP-l amino asit sekansüdört N baglglikosilasyon alanIEitermektedir. gösterilmektedir ve bir N-terminal C1r/C1'Ier/deniz kestanesi VEGF/kemik morfojenik protein (CUBI) alanIEl(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 25-137'si), bir epidermal büyüme faktörü benzeri alanEQSEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 139-181'i), bir ikinci CUB alanIlZI 432'si) alanlari. ve bir serin proteaz alanII (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 449- Insan MASP-3 polipeptidi (Genbank AAK, 19 kallEtIElbir öncü peptidini içeren 728 amino asit kaIlEt- sahiptir. Öncü peptitler çlElarIIgIIia, MASP-3'ün hesaplanan moleküler kütlesi 81,873 Da olmaktadlE SEKIL 3'de gösterildigi üzere, MASP-3'de yedi N-baglElglikosilasyon alanElmevcut olmaktadE Insan MASP-3 proteininin alanlarEl(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'e referansla), SEKIL 3'de gösterilmektedir ve bir N-terminal C1r/C1'ler/deniz kestanesi VEGF/kemik morfojenik protein (CUBI) alan EGSEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 25-137'si), bir epidermal büyüme faktörü benzeri alanlJSEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 185-296'SDJ ve aynlZlzamanda kompleman kontrol proteininin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in CCP1 aa alanlarlEllEl ve bir serin proteaz alanIlEl (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 450-711',) tandemini içermektedir.

MASP-3 dönüsüm ürünü, MASP-l ve MASP-3'e ortak olan CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 alanlarIEîçeren bir alfa zincirden (alfa zinciri: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 1-448'i) ve MASP-3 ve MASP-l'e benzersiz olan serin proteaz alanIEliçeren bir hafif zincirden olusmaktadlü 3. MASP-2 Insan MASP-2 gen, kromozom 1p36.3-2'de (Stover ve ark., Cytogenet and Cell Genet kapsamaktadlEI MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) ve MAp19 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2), alternatif birlestirme/poliadenilasyon vaslliislîla olusturula tek bir yaplîlal 12 ile kodlanmaktadlü MBL ile iliskili protein (19) (“SMAP” olarak ifade edilen “MAp19”) (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1) tarafEUan kodlanan 20 kDa protein, eksonlar 2, 3, 4 ve 5'den meydana gelmektedir. MAp19, SEKIL 2'de gösterildigi üzere ekson 5'den türeyen dört ek kaIlEtEl(EQSL) ile MASP-2'nin N-terminal CUBl-EGF bölgesini Içeren enzimatik olmayan bir proteindir.

MASP-Z polipeptit (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5), insan MASP-Z'den (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) olgunlasma ile sonuçlanacak sekilde salgüâma sonraSIa bölünen 15 kallBtII bir öncü peptidini içeren 686 amino asit kallEt- sahiptir. SEKIL 2'de gösterildigi üzere, MASP-Z amino asit sekansÇlherhangi bir N-bagllîglikosilasyon alanlülçermemektedir.

MASP-Z polipeptidi, MASP-l, MASP-3, C1 kompleman sisteminin proteazlarElolan C1r ve C1'ler'ye benzer olan bir moleküler yaplîßergilemektedir. Insan MASP-2 proteininin alanlarEl (SEKANS KIMLIK NUMARASI: S'e referansla numaralandlîllîhaktadE), SEKIL 2'de gösterilmektedir ve bir N-terminal C1r/C1'Ier/deniz kestanesi VEGF/kemik morfojenik protein (CUBI) alan EQSEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 24-136'S[)Çl bir epidermal büyüme faktörü benzeri alanlJSEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 184-295'i) ve aynüzamanda kompleman kontrol proteininin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in CCP1 aa aianiarlElEi ve bir serin proteaz alanII (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 445-682'Si) tandemini içermektedir.

SEKIL 2'de gösterildigi üzere, MASP-Z polipeptidi, CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 alanlarID içeren bir alfa zincirine (agEzincir) (alfa zinciri: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 1-443'ü) ve serin proteaz alanIEiçeren bir beta zincirine (hafif zincir) (beta zinciri: aa-444,686) sahiptir. CUB-l, EGF ve CUB-Z alanlarÇIdimerizasyon için gerekli olmaktadlElve CUB-1, EGF, CUB-Z ve CCP-l alanlarl,`_l MBP'ye yönelik baglama bölgesini içermektedir. Wallis ve MASP-2 dimeri, iki MBL alt birimine baglanmaktadE 4. MASP-i, MASP-z ve MASP-3 amino asit sekanslarII kliaslamasEl SEKIL 4, serin proteaz (SP) alanlarIEUa CUBI, EGF, CUBII, CCP1, CCP2 alanlarIü/e korunan katalitik üçlü kaiiEtiiârEiH, D, 5) gösteren MASP-l (SEKANS KIMLIK NUMARASI:10), MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) ve MASP-3'ün (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) protein sekanslarII bir amino asit hizalamasIE sembolü, bir benzer amino asit sekansIIZI göstermektedir.

SEKIL 5, CUBI-EGF-CUBII-CCPl-CCPZ dahil olmak üzere MASP-l'in alfa zincir sekanslarII (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 1-447'si), MASP-2 (alfa zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 1-443'ü) ve MASP-3'ün (alfa zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 1-448'i) bir amino asit hizalamasIlEl SEKIL 5'de noktaIEkutucuklarIa gösterildigi üzere CUBI, EGF ve CUBII alanlarlEUa sayElîl kimlik eklentileri mevcuttur. CCP2 ve CCP2 alanlarü koyu gölgeli kutucuklarla gösterilmektedir. Insan MASP1/3 ve insan MASP-2'nin alfa zincirleri araleUaki genel yüzde özdesligi, TABLO 1'de asaglâa saglanmaktadIB SEKIL 6, MASP-l'in (beta zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 448-699'u), MASP- 2'nin (beta zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 444-686's[)]ve MASP-3'ün (beta zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 429-728'i) beta zincir sekanslarII (serin proteaz alanlarEldahiI) bir amino asit hizalamasIlEl SEKIL 7A, MASP-l'in (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 448-699'u) ve MASP-Z'nin (beta zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 'in aa 444-686'sm beta zincir sekanslarElarasIaki bir ikili amino asit hizalamasIlZl göstermektedir. SEKIL 7B, MASP-l'in (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 448-699'u) ve MASP-3'ün (beta zincir: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 449-728'i) beta zincir sekanslarEl araleUaki bir ikili amino asit hizalamasIEgöstermektedir. SEKIL 7C, MASP-2'in (SEKANS NUMARASI: 8'in aa 449-728'i) beta zincir sekanslarüraslütlaki bir ikili amino asit hizalamasIlZl göstermektedir. SEKIL 5-7'de kimlik bölgeleri, benzer amino asitleri çevreleye noktaID kutucuklar olarak gösterilmektedir (“.” sembolü olarak gösterilmektedir).

Insan MASP-1, MASP-2 ve MASP-3 proteinlerinin alfa ve beta zincirleri arasIaki yüzde özdesligi, asag- TABLO 1'de saglanmaktadlü TABLO 1: Insan MASP Droteinleri arasIaki Yüzde Benzerligi A Zincirleri arasIdaki % B Zincirleri arasIdaki °/o Ozdesligi Ozdesligi Yukarlah TABLO 1'de gösterildigi üzere alfa zincirlerle (agEzincirler) ilgili olarak, MASP-1 ve MASP-3 alfa zincirleri özdestir (3' ucunda 15 amino asit sekansüiariç). MASP-2 ve MASP-3 alfa zinciri arasIaki genel % özdesligi, SEKIL 5'de gösterildigi üzere CUBI-EGF-CUBII alanlarIEtla saylgîlözdeslik eklentisi ile Beta zincirlere (hafif zincirler) göre, üç beta zinciri arasIaki genel yüzde özdesligi düsüktür, ragmen, SEKIL 6'da gösterildigi üzere saylîlîlözdeslik eklentisi mevcuttur. SEKIL 7A-C'de gösterildigi üzere, sekansI özdes eklentileri, MASP-2 ve 3 arasIa, 1 ve 2 veya 1 ve 3 araletla olandan daha genis olarak dagEllE1aktadlEl MASP-2, MASP-3, C1r ve C1'Ier'de mevcut tüm sistein kaIlEtllârÇI MASP-1'de esdeger kallEtHârla hizalanmaktadlB fakat MASP-1, MASP-2, MASP-3, C1r ve C1'Ier'de bulunmayan iki sistein kaIlEt- (L zincirinde 465 ve 482 konumlarIa) sahiptir. MASP-1'de bu iki sistein kallEtlîIJ tripsin ve kimotrisinde bulundugu gibi `histidin döngülü' disülfür köprüsünü olusturmak için kullanilân, beklenen konumlarda bulunmaktadlE Bu, MASP-2, MASP-3, C1r ve C1'lerin, MASP-1'den gen çogaltma ve farklllâstlEina ile degismis olabildigini açlEIamaktadE . Ilgili insan genetik veri dahil ilgili biyolojik islevler/aktiviteler Dogustan gelen immünitede MBL/Fikolin-MASP komplekslerinin rolü, C türü Iektin alanlarlEJI kalsiyuma bagIiIEbaglantlEEl/asißsEla (MBL molekülünde mevcut) veya fibrinojen benzeri alanlar. baglantElJfikolin molekülünde mevcuttur) maya, bakteri, virüsler ve mantarlarda bulunan karbonhidrat yapllârlEla yönlendirilmektedir. Bu tannlama asamasüproenzim MASP- 2 aktivasyonunu gerçeklestirmektedir, daha sonrasIda C3 konvertaleZ(C4b2b) olusturmak için C4 ve C2'nin bölünmesi vasßslýla C1q-(C1r)z-(C1'ler)2 kompleksi içerisindeki aktif halde C1'Ierin eylemini taklit etmektedir. Bu, hedef patojenlerde C4b ve C3b'nin birikimine olanak saglamaktadßve bu sekilde fagositoz vasßslýla ölümü ve klerensi arttünaktadß Güncel Iiteratüre dair kanlü lektin yolu aktivasyon kompleksinin, sadece C4 ve C2'yi bölmek için MASP-Z aktivitesine ihtiyaç duydugunu göstermektedir: i) rekombinant MBL ve rekombinant olarak eksprese edilen MASP-Z kullanilârak bir minimum Iektin yolu aktivasyon kompleksinin yeniden olusturulmasIlEl, canlthllgEC4 ve C2'yi etkili bir sekilde bölmesi için hedeflenmis eksiklige sahip farelerin serumu, herhangi bir Iektin yolu islevsel aktivitesinden genetik olarak belirlenen bir MASP-2 eksikligini tarif edilmistir (Stengaard-Pedersen ve ark., Asp-Gly dönüsümüne yol açmakta ve MBL'ye baglanamayan MASP-2'yi dönüstürmektedir.

Ek olarak, MASP-l ve MASP-3'ü eksik farelerin serumlarII islevsel karakterizasyonu, Iektin yolu aktivitesinin daha yavas oldugunu, fakat fizyolojik kosullar aItIa sokak türü ve MASP- 1/MASP-3 nakavt (MASP-1/3'/') farelerinin serumlarElle klýhslandlglhîda mevcut olmadiglll] PNAS (2011)). Bu çallginalar, klasik yol efektör endopeptidaz C1'lerin aksine, MASP-2 aktivasyonunun, herhangi bir diger MBL ile iliskili serin endopeptidazlarI (örn. MASP-l veya MASP-3) aktivitesini temelde içermedigini veya gerektirmedigini ve MASP-2'nin proteolitik aktivitesinin, Iektin yolunun (örn. MBL, fikolinler veya CL-11) karbonhidrat tanIiIama moleküllerinin kompleman aktivasyonuna baglanmasIEtlönüstürmesi için yeterli oldugunu göstermektedir. Fakat daha güncel çallglnalar, MASP-2 otoaktif hale getirme kapasitesine sahip olmazken, MASP-2 zimogenin MASP-l aktivasyonunun katalitik oranIlEI, yaklasik] 85,000 kat ile zimogen formunun MASP-2 bölünmesininkini astgilgöstermistir (Héja ve ark., sekilde, fizyolojik ayarlarda MASP-Z'nin birincil aktivatörünün MASP-1 olmasünuhtemeldir. Üretilen C4 fragmanlarII boyutuna ve üretilen islevsel C3 konvertaz aktivitesine göre karar verildigi üzere, aktif halde MASP-2'nin, örnegin C4'ün alfa zinciri içerisinde tek bir arginil bagda (Arg76 Ala77) ve C2'nin proenzim zinciri içerisinde tek bir arginil bagia (Ar9223 Ly5224) aktif halde C1'lerle uygulanana benzer bir sekilde C4 ve C2'yi böldügü görülmektedir.

AynEl zamanda Fare MASP'nin (Ra-reaktif faktör olarak belirlenen fare MBL-MASP kompleksinin formunda), C1'lerin aksine, biyolojik olarak aktif fragmanlarEl(C3a ve C3b) sunmak için kompleman bileseninin (C3) alfa zincirini bölebildigi bildirilmistir (Ogata ve ark, J. zinciri içerisinde tek bir arginil bag (Arg77 Ser78) bölünmesine ihtiyaç duyacaktEI Aktif halde C1'lerin benzeri aktif halde MASP-Z, kompleman bilesenini (C5) bölememektedir.

MASP-l ve MASP-2'nin proteolitik aktiviteleri, C1 inhibitörleri tarafIan inhibe edilirken MASP-l ve MASP-3'Ün biyolojik islevleri ortaya çllZlnakta yavas olmustur. Sübstrat özgüllügü MASP-l'in fizyolojik rolü, kesfinden bu yana tartlginaIEbir konu olmustur. Saygi potansiyel Sübstrat, son yl]]}arda tanIiIanmlStfEl MASP-l'in, natif C3'ü yavasça bölebildigi ve C3'ün bu dogrudan bölünmesinin, muhtemelen alternatif yolun katkEElile kompleman kaskadIIII SonrasIa, rekombinant MASP-l'in, kompleman kaskadII baslatllüiasElaç-an üretken olmayan C3'ün aktif olmayan (hidrolize tiyoester) formu bölmektedir (Ambrus ve ark., J aktivitesinin eksikligi, MASP-l ile harekete geçirilen C3 baypas mekanizmasIlEl mevcut (2011)). Önemli ölçüde verimlilige sahip MASP-l ile bölünen kompleman bilesenleri, C2'dir (2010)). MASP-l'in C2'yi bölebilmesi kabiliyetine gelecek olursak, MASP-l'in, C2 bölünmesi vaslüslsîla MASP-Z'nin C3 konvertazIEI(C4b2a)-olusturabilme kabiliyetini arttßbilmesi durdurulmaktadlEl Bu aç[lZlama, Iektin yolunun aktivitesinin, MASP-l'i tükenmis Insan serumunda ve MASP-1/3'ü eksik farelerin serumunda bozuldugunun gözlemi ile zamanda MASP-l'in, MASP-Z'nin aktif hale getirilmesinde bir role sahiptir. DahasÇl MBL- MASP'IarI kompleksi ile biriktirilen her bir C4b, C4b2a konvertaleItblusturabiIirken, klasik yol C1 kompleksi ile biriktirilen C4b'den sadece birisi ayn-Ü/apabilmektedir (Rawal ve ark., J MASP-l aynüamanda MASP-2 ve MASP-3'ü bölmektedir (Megyeri M., ve ark, J Biol Chem.

MASP-l'in, izmogen MASP-2'in birincil aktivatörü oldugunu göstermektedir. MASP-Z aktivasyonu, MASP-l nakavt farelerinin serumunda geciktirilmistir (Takahashi ve ark., J inhibitörle bloke edildiginde benzer bir sonuç elde edilmistir (Kocsis ve ark., J Immunol (2012)), MASP-l'in, insan serumunda MASP-2 aktivasyonu ve sonraki C4 bölünmesi için kritik oldugunu bulmustur. Zimogen MASP-2'nin aktif MASP-Z'ye dönüsümü için katalitik olan oran, MASP-Z'nin otoaktif olabildigi orandan 85,000 kat daha fazla olmaktadlEl(Megyeri ve ark., J.

Güncel kesifler aynüamanda MASP-l'i, alternatif yola baglamlgtlEl MASP-l, zimogen faktör D'nin enzimatik olarak aktif forma dönüstürebilmektedir (SEKIL 39; Takahashi ve ark., J Exp (SEKIL 39) ve aynüamanda alternatif yolun bir diger temel bileseni olan faktör B'yi, aktif D'nin ve pro-faktör B'nin dönüsümünün LEA-2'nin aktivasyon kosulundan bagIisIZ olmasi] muhtemeldir ve kompleks olmaya baglÜl/lASP-l vaslßslîla olusabilmektedir.

Bir kaç kanlElsatIElZlMASP-l'in, bir trombin benzeri enzim oldugunu ve koagülasyon yolunun aktivasyonunda önemli oldugunu göstermektedir. MASP-l, fibrinojen (Hajela K. ve ark., (Megyeri ve ark., J heparin mevcudiyetinde antitrombin, C1'in inhibitöründen ziyade MASP-1'nd aha etkili bir yolu arasIaki baglantlýla aynElzamanda MASP-2'nin protrombini aktif hale getirilmesi gözlemi ile vurgu yapUEnaktadlB(Krarup A. ve ark., PLoS One 2(7):e623 (2007)). Klgflllîl koagülasyon, isgalci patojenlerin yayüüiasüfibrin pütüâsmasüile önlendiginde dogustan gelen immünitenin eski bir türünü temsil etmektedir. SaIIn fibrinopeptit B, proinflamatuvar aktiviteye sahiptir. PAR4'ün MASP-l arac[[I]Ilbölünmesi, endotelyal hücrelerini baslatan inflamatuvar reaksiyonunu aktif hale getirmektedir (Megyeri ve ark., J Immunol 183(5):3409- 16 (2009)).

MASP-3, C4, C2 veya C3 sübstratlar. dogru herhangi bir proteolitik aktivitesine sahiptir.

Buna karslül, MASP-3'ün, Iektin yolun bir inhibitörü olarak hareket ettigi bildirilmistir (Dahl ve oto aktif hale getirici enzim olmamaslüdan dolayüneydana gelebilmektedir (Zundel S. ve (2013).

Son zamanlarda, MASP-l ve MASP-3'ün muhtemel fizyolojik islevlerinin kanlfllglbirlestirilmis bir MASP-l ve MASP-3 eksikligi ile bir fare susunu kullanan transjenik fare çallSlnalarlEtlan ortaya çllîmlgtlü MASP-1/3-nakavt fareleri, bir islevsel Iektin yoluna sahip olabilirken aktivitesinin eksikliginin, alternatif yol aktivitesi için gerekli olan kompleman faktör D'nin bir islem bozuklugundan kaynakland[gllîgörülmektedin MASP-1/3 nakavt farelerinde, tüm faktör D, bir proteaolitik olarak aktif olmayan pro-form olarak dolaslHken, normal fare serumunda, büyük ölçüde tüm faktör D, aktif formda olmaktadE Biyokimyasal analiz, MASP-l'in, zimogen formundan enzimatik aktif forma kompleman faktör D'sini dönüstürebilmektedir (SEKIL 39; bölmektedir ve aktif faktör D'yi in vitro üretmektedir (SEKIL 39; Takahashi ve ark., JEM mevcuttur ve MASP-1 ve MASP-3 ve aynElzamanda HTRA-1, bu aktivasyondan sorumlu olabilmektedir. Dahasübirlestirilmis MBL ve fikolin eksiklikleri olan fareler, normal faktör D seviyelerini üretmektedir ve tamamen islevsel bir alternatif yola sahiptir. Bu sebepten ötürü, MASP-l ve MASP-3'ün bu fizyolojik islevlerinin, Iektinleri içermesi gerekli degildir ve bu sekilde, Iektin yolu ile Iliskilidir. Rekombinant fare ve insan MASP-3'ün aynlîamanda faktör B'yi böldügü ve 5. aureus'da in vitro C3 birikimini destekledigi görülmektedir (SEKIL 36; MASP-3'ün beklenmedik bir fizyolojik rolü, 3MC sendromu olan hastalar. güncel çallglnalarian ortaya çiKmEtlEl (öncesinde Carnevale, Mingarelli, Malpuech ve Michels sendromu olarak belirlenmistir; OMIM # 257920). Bu hastalar, yarlid damak, yarim dudak, kranial malformasyonlar ve mental retardasyon dahil siddetli gelisimsel anormallikler sergilemektedir. Genetik analiz, bir islevsiz MASP-3 geni için homozigot olan 3MC hastalarIIZl grubunun, islevsel MASP-l ve MASP-3 proteinlerinin yokluguna yol açan MASP-l geninde bir mutasyon için homozigot oldugu kesfedilmistir. 3MC hastalarII bir diger grubu, bir islevsel sebepten ötürü, CL-11 MASP-3 ekseninin, embriyonik gelisim sßsIa bir rol oynad[gi|:l görülmektedir. Bu gelisimsel yolun moleküler mekanizmalarlîhet olmamaktadE Fakat genel kompleman bilesenlerinin (C3) eksikliklerini yasayan bireyler bu sendromu gelistirmedigi için, bir geleneksel kompleman ile harekete geçirilen süreçle yönlendirilmesi mümkün degildir. Bu sebepten ötürü, burada açlKland[gil:l üzere mucitlerin kesfinden önce, lektine bagllü kompleman aktivasyonunda MASP-3'ün bir islevsel rolü öncesinde olusturulmamlgtlB MASP-l ve MASP-Z'nin katalitik fragmanII yapliârüX @EEkrIStalografisi ile belirlenmistir.

Diger kompleman proteazlarlEkiIere sahip MASP-l proteaz alanlElI yaplglal klýbslamasü rahatlamlgl sübstrat özgüllügünün temelini ortaya çlKhrmlStlEwobö ve ark., J. Immunol proteazlarIan ziyade tripsininkini düzenleyen bir açiEJ sübstrat baglama bosluguna sahiptir.

MASP-l yap-I bir trombin benzeri özelligi, sübstratlarla etkilesime geçebilen, nadiren büyük 60 amino asit döngüsü (döngü B) olmaktadlü MASP-l yap-I bir diger ilgi çekici özelligi, Sl Asp189 ve Ar9224 araleUa iç tuz köprüsüdür. Bir benzer tuz köprüsü, proteaz aktivitesini düzenleyebilen faktör D'nin sübstrat baglama boslugunda bulunabilmektedir.

Cl'ler ve MASP-2, neredeyse özdes sübstrat özgüllüklerine sahiptir. SasIEEbir sekilde, sübstrat özgüllüklerini belirleyen MASP-Z'nin sekiz yüzey döngüsünden bazlgîl C1'inkilere klýbsla oldukça farklElkonformasyonlara sahip olmaktadlB Bu, iki islevsel olarak iliskili enzimlerin, bir farklElsekilde aynElsübstratlarla etkilesime geçtigi anlam. gelmektedir.

Zimogen MASP-Z'nin yapa-_kesilen oksianyon deligi ve sübstrat baglama boslugu ile bir aktif SaslElilEEbir sekilde, zimogen MASP-2, bir genis protein sübstratia (C4) önemli ölçüde aktivite sergilemektedir. Zimogen MASP-2'nin yap-[El, aktif olmayan ve aktif formlar araletlaki geçise izin verdigi sekilde oldukça esnek olmasülnuhtemeldir. Yaplöh yansltJlân bu esneklik, otoaktivasyon sürecinde bir rol oynayabilmektedir.

Northern blot analizi, karacigerin, MASP-1 ve MASP-2 mRNA'sII ana kaynagEbIdugunu göstermektedir. Bir MASP-l'e yönelik bir 5' spesifik cDNA probu kullanllârak, ana MASP-1 transkripti 4.8 kb'de oldugu görülmüstür ve küçük olan. yaklaslEl olarak 3.4 kb oldugu görülmüstür, her ikisi de insan ve fare karacigerinde mevcut olmaktadE(Stover ve ark., Genes Immunity , karaciger dokusunda bolca eksprese edilmektedir. MASP-3, nöronal doku dahil karacigerde ve aynElzamanda bir çok diger dokularda eksprese edilmektedir (Lynch N. J. ve ark., J Enfeksiyonlar. ve kronik inflamatuvar hastalllZl geçmisine sahip bir hastanIEl, bir aktif MBL- MASP kompleksini olusturmada basarlgli olan MASP-Z'nin bir mutasyona ugramlSiformuna Bazüarastlülnacllâr, MBL eksikliginin, çocukluk çaglEUa sÜZl enfeksiyonlara bir egilime (Super enfeksiyonuna bir azalan dirence yol açmaktad @(Nielsen ve ark., Clin Exp Immunol 100:219- artan enfeksiyonlara sahip düsük MBL seviyelerinin önemli bir korelasyonunu sergilemistir karlglKl olsa da, MASP eksikligi veya kullanlgsügiübir bireyin belirli patojenlere karsEhlîllÇI antikor olmayan bagnlEbavunmaylîbaslatabilmesi kabiliyetine yönelik olumsuz bir etkiye sahip olabilmektedir. iii. Yeni anlavlîlicin verileri destekleyen. Ca” icermeven geleneksel analiz kosullara vurqu vapan ve Ca++ iceren daha fizvoloiik bir dizi kosul kullanilârak elde edilen sonuclar.

Güçlü deneysel kari- çesitli baglislîlsatlBhrÇlburada kompleman. lektin yolu aktivasyon yolunun, iki bagIislZ efektör mekanizmasüvasltâslýla komplemanElaktif hale getirmesi sonucuna vurgu yapacak sekilde saglanmaktadB i LEA-2; kompleman ile harekete geçirilen yönlendiren bir MASP-2 ile harekete geçirilen yol ve ii) LEA-1: aktivatör yüzeylerinde faktör B'nin bölünmesi ve aktivasyonu vaslßslýla alternatif yol konvertazII (C3bBb) üretilmesi vasllîiislýla kompleman aktivasyonunu baslatan bir yeni MASP-3'e bagIiIElaktivasyon yolu, daha sonrasIa alternatif yol konvertazII (C3bBb) C3b birikimini ve formasyonu katalize edecektir, bu da hücre Iizisi ve aynEl zamanda mikrobiyal opsonizasyonu ile sonuçlanabilmektedir. Ek olarak, burada açlKIandlgiEüzere, MASP-l, MASP-3 veya HTRA-1 veya bunlari herhangi bir üçlü kombinasyonu ile faktör B ve/veya faktör D'nin ayrülektinden bagIislZl aktivasyonu, alternatif yol vasltâlea kompleman aktivasyonuna da yol açabilmektedir.

Alternatif yolun bir lektin yoluna bagIiIEIMASP-3 ile harekete geçirilen aktivasyonunun, hücresel yüzeyinde C5b-9 membran saldlîgan komplekslerinin (MAC) formasyonu vaslüslýla bakteriyel hücreleri eritmek için terminal aktivasyon kaskadü/asßsüla komplemana bagllü lizise yönelik optimal aktivasyon oranlarlEla ulasmak için C3b'ye baglElfaktÖr B'nin iyi olusturulmus faktör D aracllJIbölünmeye katklElh bulundugu görülmektedir (SEKIL 14-15).

Bu oranüklgnllîewem, MASP-3 islevsel aktivite yoklugunda ve aynlâamanda faktör D islevsel aktivite yoklugunda eksik oldugu için optimum koordinasyona ihtiyaç duydugu görülmektedir.

Burada Örnek 1-4 arasIa açllîland[gll:üzere, mucitler, bu MASP-3'e bagllüektin yolu, N. men/'git/'d/'s enfeksiyonunun deneysel fare modellerinde MASP-Z eksikligi ve MASP-2 inhibisyon fenotipi incelendiginde islev gösterdigini kesfetmistir. Gen hedefli, MASP-2'si eksik fareler ve antikor tabanlül/IASP-Z inhibitörleri ile tedavi edilen sokak türü fareler, deneysel N. men/hg/I/'ms enfeksiyonuna yüksek oranda dirençli olmustur (bkz. SEKIL 8-12). BulaslElEoz, sokak türü yavrularda yaklaslß olarak %60 mortalite vermesi için düzenlendiginde, tüm MASP-Z'si eksik veya MASP-2'si tükenmis fareler, enfeksiyonu temizlemis ve sagkalmlgtlîl (bkz. SEKIL 8 ve SEKIL 12). Bu asiEllZderecede yüksek direnç derecesi, MASP-2'si eksik veya MASP-Z'si tükenmis fare serumunda serum bakterisidal aktivitesinin önemli bir artiSlEda yanslfllüîlgtß Diger denemeler, bu bakterisidal aktivitenin, alternatif yolu harekete geçirilen bakteriyel lizise bagIiIIJJIdugunu göstermistir. Faktör B veya faktör D veya C3'ün eksik fare serumlarlZl N. men/hg/'t/'di's'e dogru herhangi bir bakterisidal aktivite sergilememistir, bu da alternatif yolun, terminal aktivasyon kaskadII harekete geçirilmesi için esastlB MBL-A ve MBL-C'si eksik fare serumlarüher ikisi de N. men/hg/Iid/.ÇI tanlýlan lektin yolu tanllama molekülleridir) ve aynllamanda lekitn yolu ile iliskili serin proteazlarHMASP-l ve MASP-3) eksik fare serumlarlEllEl, N. men/'ng/'tid/'s'e dogru tüm bakteriolitik aktiviteye sahip olmasEl sasIEIIbir sonuç olmustur (SEKIL 15). Burada sunulan güncel bir makale (Takahashi M. ve formunun, enzimatik olarak aktif forma dönüsebildigini ve bu serumlarda enzimatik olarak aktif faktör D'nin yoklugu vasi'glislîla litik aktivitesinin kaybIElklginen açilîlayabildigini göstermektedir. Bu, bu farelerin, normal enzimatik olarak aktif faktör D'ye sahip olmalarian dolayD/IBL'si eksik farelerde bakterisidal aktivite yoksunlugunu açlEamamaktadE(Banda ve proteaz alanIElolusturan mutasyonlara sahip nadir 3MC otozomal resesif bozuklugu ola hastalardan (Rooryck C, ve ark., Nat Genet. 43(3):197-203) insan serumlarIEllest ettiginde, serumlar, MASP-l ve faktör D'ye sahiptir, fakat MASP-3'e sahip degildir).

Insan serumunun, Iektin yolu araciIJIIMASP-3'e bagIiIIIIaktivitenin, bakterisidal aktiviteyi gelistirmesini ihtiyaç duydugu hipotez aynElzamanda MBL'si eksik insan serumlarÇl N. men/hg/'t/dis'i, parçalayamamasügözlemi ile desteklenmektedir (SEKIL 13-14). MBL sadece bu aptojene baglanan insan lektin yolu tanilama molekülüdür. MASP-3 otomatik olarak aktif olmadglîilçin, mucitler, MASP-2 yoklugunda, bakteriyel yüzeye baglanan tüm Iektin yolu aktivasyon komplekslerinin, MASP-l veya MASP-3 ile yüklenecek olmasIan dolayEMASP-l vasltâsüla MASP-3'ün önemli aktivasyonu ile açiElanabildigi hipotezinde bulunmaktadE Aktif halde MASP-3, ilgili enzimatik olarak aktif formlarIIanlmlgEblarak (SEKIL 37 ve Iwaki D., için, MASP-3'ün en olasEislevi, alternatif yol C3 konvertazII (örn. C3bBb) formasyonu olanak saglamaktlEl Lektin baglilüolünün verileri mecburi olurken, çok saylEIh deneme, MASP-3 ve MASP-l'in, lektin molekülleri ile bir komplekste islev göstermesinin zorunlu olmadigJIEgöstermektedir.

SEKIL 3SB'de gösterilen gibi denemeler, MASP-3'ün, Iektinle olan komplekslerin mevcut olmadlgllîlkosullar aItIEUa (örn. EGTA mevcudiyeti) alternatif yolunu (5. aureus'da C4b birikimi ile gösterildigi üzere) aktif hale getirebilme kabiliyetini göstermektedir. SEKIL 35A, bu kosullar aItIaki birikimin, alternatif yolun tüm kritik bilesenleri olarak faktör B, faktör D ve faktör P'ye bagIIEbldugunu göstermektedir. Ek olarak, MASP-3 ve MASP-l ile faktör D aktivasyonu (SEKIL 39) ve MASP-3 ile faktör B aktivasyonu (SEKIL 37), lektin yoklugunda canlmmlarak olusabilmektedir. Son olarak, insan serumu mevcudiyetinde fare eritrositlerin MBL eksikligi, tüm islevsel MASP-3'ün MBL ile komplekslenmesi halinde beklenenin aksine çesitli MASP-3 eksikligini tamamen çogaltmamaktadE Bu sebepten ötürü, mucitler, burada gösterilen MASP-3'ün (ve MASP-l) tüm rollerine, tek baslEb Iektin ile iliskili olarak islev göstermesi için katki bulunabilmesi düsüncesine klglflilîkalmaylîiistememektedir.

Lektin yolunun iki efektör kolunun ve aynüamanda MASP-l, MASP-3 ve HTRA-l'in muhtemel hücrelerin veya metabolik birikimlerin mevcudiyetinde aslEIEkompleman aktivasyonunun yol açtigilîbelirlenmis insan patolojileri etkili olarak tedavi etmek için terapötik müdahalelere yönelik yeni fBatlarütemsil etmektedir. Burada açlElandlgiEl üzere, mucitler, MASP-3 yoklugunda ve MASP-l mevcudiyetinde, alternatif yolun yüzey yapHârEüzerinde etkili bir Alternatif yol, bakteriyel Iizise ve aynlâamanda hücre lizisine yol açan oranßIElilîylemlerin harekete geçirilmesinde önemli oldugu için (Mathieson PW, ve ark., J Exp Med 177(6):1827-3 (1993)), sonuçlarlilî) aktif halde MASP-3'ün, Iitik kompleman aktivitesinde önemli bir rol MASP-3'den yoksun olan, fakat MASP-l'den yoksun olmayan 3MC hastalarII serumunda, kompleman. Iitik terminal aktivasyon kaskadlîleksik olmaktadlE SEKIL 14 ve 15'de gösterilen veriler, MASP-3 ve/veya MASP-l/MASP-3 islevsel aktivitesinin yoklugunda bir bakteriolitik aktivite kaybIlîgöstermektedir. Benzer bir sekilde, rekombinant MASP-3 (SEKIL 46-47) eklenerek hemolizizi yeniden olusturabilme kabiliyeti birlestirilen MASP-3'ü eksik yüzeylerinde (bilesen aracim] Iizisi hareket ettirmek için esastlE) alternatif yolun aktivasyonunun, aktif halde MASP-3 mevcudiyetine baglEblmasllonucunu güçlü bir sekilde desteklemektedir. Yukarida detaylandEllân Iektin yolunun yeni anlayiSIElI esaleda, hedef yüzeylerin alternatif yol aktivasyonu bu sekilde LEA-l'e bagIiIEbImaktadIEve/veya aynEI zamanda MASP-3 ile yönlendirilen faktör B ve/veya faktör D'nin lektinden baglisiîl aktivasyonu ve bu sekilde, MASP-3'e bagiIElkompleman aktivasyonunu bloke eden maddeler, hedef yüzeylerde alternatif yol aktivasyonunu önleyecektir.

Alternatif yol aktivasyonunun MASP-3'e bagIlEbir sekilde baslatilmasi yönelik esas rolün açiElamasÇIalternatif yolun, temelde komplemana yönelik tüm mevcut tlîil kitaplarIa ve güncel inceleme makalelerinde açilZIand[gil:gibi kompleman aktivasyonunun bir baglislîl tek bas. duran yolu olmadlgil vurgu yapmaktadlE Mevcut ve genis oradan tutulan bilimsel görüs, alternatif yolun, spontane "t-a giden” C3 aktivasyonunun amplifikasyonu sayesinde belirli partikülat hedeflerinin (mikroplar, zimosan, tavsan eritrositler) yüzeyinde aktif hale getirilmesidir. Fakat MASP-l ve MASP-3'ü eksik farelerin serumlarIa ve hem hasta serumunda herhangi bir alternatif yol aktivasyonunun yoklugu ve insan ve fareden MASP-3'ü eksik serumlarda eritrositlerin hemolizinin azaltlliiasübu yüzeylerde alternatif yol aktivasyonunun baslatilü1asüislevsel MASP-3'ünü gerektirdigini göstermektedir. MASP-3'ün gerekli rolü, Iektine bagIiIEl'eya Iektinden bagnsliolabilmektedir ve örnegin süslîla C3bBb ve C3bBb(C3b)n gibi alternatif yol C3 konvertazII ve C5 konvertaz komplekslerinin formasyonuna yol açmaktadE Bu sebepten ötürü, mucitler, alternatif yolun öncesinde anlasllîhaz baslatma yollarII mevcudiyetini tarif etmektedir. Bu baslatma yolu, (i) Iektin yolunun yeni kesfedilmis bir aktivasyon kolu olan LEA-l'e, ve/veya (ii) proteinlerin Iektin baglislîlrollerine (MASP-3, MASP-l ve HTRA-l) baglmlmaktadü VE MASP-2 VE MASP-3 INHIBITÖR MADDELERINI KULLANAN TERAPÖTIK YÖNTEMLER i. PNH'ye Genel Bakg Bazen Marchiafava-Micheli sendromu olarak da ifade edilen paroksismal nokturnal hemoglobinüri (PNH), edinilmis, potansiyel olarak hayati tehlike olusturan kan hastallglIlB baglamIa, “ikincil PNH" olarak ifade edilen PNH kendi bas. gelisebilmektedir. Bir çok durum, birincil PNH'dir. PNH, klEinlZEkan hücrelerinin (hemoliz), düsük künlZEkan hücresi sayllârE(anemi), trombozun kompleman ile indüklenen y-iEl/e kemik iligi yetmezligi ile karakterize edilmektedir. PNH'de laboratuvar bulgularüintravasküler hemolitik anemi ile tutarlülegisimleri göstermektedir: bir olasElsebep olarak otoreaktif RBC baglaylîüntikorlarl yoklugunda düsük hemoglobin, yükselmis Iaktat dehidrogenaz, yükselmis retikülosit sayiEl (ymg hücrelerin degistirilmesi için kemik iligi taraflTitlan salgüânan olgun olmayan kan hücreleri), yükselmis bilirubin (hemoglobinin bir parçalanma ürünü).

PNH niteligi, dolasan RBC'lerin yüzeyinde membran saldlBgan kompleks dahil terminal kompleman bilesenlerinin düzenlenmemis aktivasyonunun yol açtlgiElkronik kompleman aracEIJJZI hemolizdir. PNH RBC'Ier, yüzeylerinde kompleman düzenleyicilerinin (CD55 ve CD59) yoklugundan dolayEkontroIsüz kompleman aktivasyonuna ve hemolize tabi tutulmaktadlEl kompleman aktivasyonunda bolca eksprese edilmektedir. CD55, membran saldlgan kompleks (MAC) formasyonu bloke ettigi sekilde alternatif yol C3 konvertaz (C3bBb) kompleksinin tertibatIElnhibe ederek ve uygulanan konvertazI bozulmalelEhlîlandÜrak alternatif yolun bir negatif düzenleyicisi olarak hareket etmektedir. CD59, C5b678 kompleksini baglayarak ve C9'un baglanmasIIZl/e polimerize olmasIlZbnleyerek dogrudan kompleman membran saldBgan kompleksi inhibe etmektedir.

Hemoliz ve anemi, PNH'nin baskI klinik özellikleri olurken, hastallEl klinik bulgularI bir bölümü olarak trombozunu ve kemik iligi yetmezligini içeren bir kompleks hematolojik seviyede, PNH'ye, bir islevsel PIG A geninden mahrum olan hematopoietik kök hücrelerin anormal klonal genisletmesi yol açmaktadlB PIG A, CD55 ve CD59 dahil GPI'ya bagll] sIlElEl glikoproteinlerin stabil yüzey ekspresyonu için gerekli bir glikosiI-fosfatidil inositol transferazIEkodlayan bir X-baglEgendir. Mevcut olarak inceleme altia olan sebeplerden dolayÇlspontane somatik mutasyonlarI sonucu olarak ortaya çllgn bir islevsel PIG A genini içeren hematopoietik kök hücreler, yavrularIEl, periferik hematopoietik hücre havuzunun önemli bir bölümünü olusturdugu noktaya klonal genislemeye tabi olabilmektedir. Mutant kök hücre klonunun eritrosit ve lenfosit progeni CD55 ve CD59'dan yoksun olurken, sadece RBC'Ier, dolasIia girmelerinden sonra aç[lZlbir sekilde lizise tabi olmaktadlE PNH'nin mevcut tedavisi, anemi için kan nakli, tromboz için antikoagülasyon ve kompleman sistemini inhibe ederek immün y-iI karsEkan hücrelerini koruyan monoklonal antikorun (ekulizumab (Soliris®)) kullannIIiçermektedir (Hillmen P. ve ark., N. Engl. J. Med. sekilde C5 konvertazlarEile bölünmeyi bloke ederek kompleman bilesenini (C5) hedef alan bir insanlastlElIBilSl monoklonal antikordur. PNH hastalarII ekulizumab ile tedavisi, laktat dehidrogenaz (LDH) ile ölçüldügü üzere, hastalar. yaklaslE yar-a bagslîl hemoglobin stabilizasyonu ve nakline yol açan intravasküler hemoliz azalmasüle sonuçlanmlStlEl(Risitan0 ve ark, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6) (2011)). Ekulizumab içeren tedaviye tabi olan neredeyse tüm hastalar, normal veya neredeyse normal LDH seviyelerine (intravasküler hemoliz kontrolünden dolaymulaslîlken, hastalari sadece yaklasllîl üçte biri, yaklasllîl llgr/dL bir hemoglobin degerine ulasmaktadlrîl ve ekulizumab tedavisinde kalan hastalar, yaklasllZl olarak esit oranlarda orta ila siddetli (örn. nakle bag IilDZl anemi sergilemeye devam ekulizumab tedavisinde bulunan PNH hastalarIlEl, PNH eritrositlerine bagllîglienis miktarda C3 fragmanIEiçerdigini (bu esnada tedavi edilmemis hastalar içermemistir) göstermistir. Bu bulgu, Soliris ile tedavi edilen PNH hastalarIa, C5 blokaann dolayüartllîl hemolize olmayan PNH RBC'lerin, opsoninler olarak isle gösteren, spesifik C3 reseptörleri ve sonraki ekstravasküler hemoliz vaslßsüa retiküloendotelyal hücrelerde tutulmalarEile sonuçlanan membrana bagllîl C3 fragmanlar.. verimli miktarlütoplayabilmesi ile iliskili tanIla yönelmektedir. Bu sebepten ötürü, intravasküler hemolizi ve ortaya çikan sekelleri önlerken, ekulizumab tedavisi, bir çok hastada büyük ölçüde kalan tedavi edilmemis anemi ile sonuçlanacak sekilde bu RBC birikimlerini, intravaskülerden ekstravasküler hemolize basit bir ekulizumab kullanIlEla ek olarak , künlîlîkan nakillerine ihtiyaç duymaya devam ettikleri için C3-fragmanElaracElIlekstravasküler hemoliz gelistiren bu hastalar için terapötik stratejilere gereksinim duyulmaktadlEl Bu C3 fragmanühedefleyici yaklasIilar, deneysel sistemlerde ii. PNH'de kompleman baslatlEljlnekanizmalar PNH'de negatif kompleman düzenleyicilerinin (CD55 ve CD59) eksik yüzey ekspresyonu araleUa bulunan, intravasküler hemolizin önlenmesinde ekulizumab etkililigi ile birlestirilen nedensel iliski, PNH'yi net bir sekilde kompleman sistemi ile yönlendirilen bir kosul olarak belirlemektedir. Bu paradigma genis oranda kabul edilirken, kompleman aktivasyonunu baslatan eylemlerin yapEElve dahil olan kompleman aktivasyon yollarÇl çözülmemis kalmaktadiEl Cd55 ve CD59, tüm kompleman baslatma yollar. ortak olan kompleman kaskadEtla terminal amplifikasyon adilarllîlnegatif bir sekilde düzenledigi için, bu moleküllerin verimliligi, kompleman aktivasyonunun, Iektin yoluyla, klasik yolla veya alternatif yolun spontane dönüsümüyle baslatUJE baslatllîhad[gi. bakliIhaks- membran saldlBgan komplekslerinin abartilüilgl formasyonuna ve membran entegrasyonuna yol açacaktE Bu sebepten ötürü, PNH hastalarIa, RBC yüzeyinde C3B birikimine yol açan herhangi bir kompleman aktivasyon eylemi, sonraki amplihkasyonu ve patolojik hemolizi (intravasküler ve/veya ekstravasküler) tetikleyebilmektedir ve bir hemolitik krizi hlZandlEabilmektedir. PNH hastalarübla hemolitik krizi tetikleyen moleküler eylemlerin bir net mekanistik anlaylgEl anlasllîhasüor kaImIStlEl Bir hemolotik krize tabi olan PNH hastalarIa açlKça herhangi bir kompleman baslatma eylemine dair kanlîlolmadigiüçin, PNHIde kompleman aktivasyonunun, daha sonraslia CD55 ve CD59 mahrumiyetinden dolayEl terminal kompleman aktivasyonunun uygun olmayan kontrolü ile büyütülen alternatif yolun düsük seviyeli Fakat, dogal geçmisinde, PNH'nin genellikle gelistigi veya kompleman aktivasyonunu tetikledigi gösterilen bir enfeksiyon veya bir yaralanma gibi belirli eylemlerden sonra aktivasyon yanüüklgkllîüaatojene dogru konagI önceki immünitesine bagllüjegildir ve bu sekilde klasik yolu içermesi muhtemel degildir. Bunun yerine, bu kompleman aktivasyon yan-El, mikrobiyal maddelerin veya hasarllIkonak dokusunun yüzeyinde eksprese edilen yabancElveya “kendi bas. degistirilmis” karbonhidrat modellerine baglanan Iektinle baslatilîhaktadlîl Bu sebepten ötürü, PNH'de hemolitik krize katüân eylemler, Iektinler vasEslýla baslatllân kompleman aktivasyonuna sila& baglanmaktadlü Bu, lektin aktivasyonu yollarllEl, en nihayetinde PNH hastalarIaki hemolize yol açan baslatlEEltetiklemeyi saglamasllîbldukça mümkün hale getirmektedir.

Aktivasyon kaskadlarIElmoleküIer seviyeye aylîrlnaya yönelik deneysel modeller olarak klgklîlllîünikroba bagIEdJIarak, kompleman aktivasyonunun, opsonizasyona ve/veya Iizise yol açarak LEA-2 veya LEA-l vaslBislýla baslatüâbildigini göstermekteyiz. Lektin baslatma eylemlerine ikili yanEIhrlEl bu aynElprensibin (örn. opsonizasyon ve/veya Iizis) bulaslEI] maddelerin diger türleri veya konaga doku hasarlüdan sonra Iektinlerle kompleman aktivasyonu veya PNH'yi hlîlandßn diger lektin ile harekete geçirilen kompleman aktivasyon eylemleri için geçerli olmasülnuhtemel olacaktE Lektin yolundaki bu ikili durumun temelinde PNH hastalarlrîda LEA-2 ve/veya LEA-l ile baslatuân kompleman aktivasyonunun, C3b ve sonraki ekstravasküler ve intravasküler hemoliz ile RBC'Ieirn opsonizasyonunu ve/veya Iizisini arttEliglEtonucuna varmaktayü Bu sekilde, PNH ayarIa, LEA-1 ve LEA-2 inhibisyonunun, C5 inhibitörü ekulizumab üzerinde önemli bir avantaj sunarak intravasküler ve ekstravasküler hemolizi ele almasEliieklenecektir. . pneumon/'ae'ye olan maruziyetin tercihen C3b ile bu mikrobun opsonizasyonuna yol açan LEA-2'nin lektinden bagIislZl aktivasyonunu tetikledigi belirlenmistir. 5. pneumon/'a, MAC aracUJDlizise dirençli oldugu için, dolasIidan klerensi, C3b ile opsonizasyon vaslliasüla olusmaktadE Dolasldan bu opsonizasyon ve daha sonrasIa çilZarilIhasÇlMASP-Z'si eksik farelerde ve MASP-2 monoklonal antikorlarla tedavi edilen farelerde tehlikede olan bakteriyel Mikrobiyal maddelere dogustan gelen konak yanlfllarIa LEA-2'nin rolünün kesfedilmesinde, ek patojenleri test ettik. Ne/sser/a men/ng/'t/a'i's; bir model organizmasüalarak incelendiginde, çarpiEElbir biçimde farklüalan sonuç gözlemlenmistir. N. menihg/I/a'i's aynüamanda lektinler vasiiîiislýla komplemanlîihktif hale getirmektedir ve kompleman aktivasyonu, naif konakta N. men/h-g/'Ud/Ls enfeksiyonlarlEl dahil edilmesi için gerekli olmaktadlE Fakat LEA-2, bu yanllîla herhangi bir konak koruyucu islevsel rol oynamamaktadB SEKIL 8 ve 9'da gösterildigi Üzere, MASP-Z'nin genetik ablasyonu vaslßslýla LEA-2'nin blokajÇi N. menihg/I/d/'s ile enfeksiyondan sonra sagkaIIElazaItmamaktadlE Buna karsiEl, MASP-2 ablasyonu ile LEA-2 blokajü bu çalismalarda sagkallEl(SEKIL 8 ve 9) ve aynElzamanda hastal[lZl skorlarIIZl (SEKIL 11) önemli ölçüde gelistirmistir. MASP-Z antikorunun uygulanmasEile LEA-2 blokajü bir olasßebep olarak nakavt fare susunda ikincil veya telafi edici etkileri elimine ederek aynIZI sonucu (SEKIL 12) sunmustur. LEA-Z'si çilZlarllân hayvanlarda bu önemli sonuçlar, kandan daha hlîlEbir IV. men/'ngit/'d/'s eliminasyonu ile iliskilendirilmistir (SEKIL 10). Aynüzamanda burada açilZlandigElüzere, normal insan serumu ile N. mening/ti'di's inkubasyonu, /V. men/hg/I/'d/'s'i öldürmüstür (SEKIL 13). LEA-2'yi bloke eden, fakat bir izotip kontrollü monoklonal antikorun uygulanmasIEbIoke etmeyen insan MASP-Z'ye ye özgü bir islevsel monoklonal antikorun eklentisi, bu öldürme yan.Eigelistirebilmektedin Fakat, bu süreç, lektinlere ve MBL'si eksik insan serumu veya EDle etkisiz hale getirilen insan serumu /V. men/hg/I/d/S'i öldüremedigi için en azian kEinen islevsel kompleman sistemine baglEl olmaktadlEl(SEKIL 13). Kolektif olarak, bu yeni bulgular, bir islevsel kompleman sisteminin mevcudiyetinde IV. men/ng/t/d/'s enfeksiyonlarIIEI, bir lektine bagilÇl fakat kompleman aktivasyonunun LEA-2'den bagmslîlyolla kontrol edilmektedir.

LEA-1'in, IV. meningitidß'in lektine bagIiIEblümünden sorumlu kompleman yolu olabildigi hipotezleri, bir 3MC hastadan alin bir serum numunesi kullanilârak test edilmistir. Bu hasta, MASP-1/3 geninin ekson 12'sinde bir anlamslîl mutasyon için homozigot olmustur.

Sonuç olarak, bu hasta, bir islevsel MASP-3 proteininden mahrum olmustur, fakat baska bir sekilde yeterli kompleman olmustur (ekson 12, MASP-3 transkriptine özgüdür; mutasyon, MASP-l islevinde veya ekspresyon seviyelerinde herhangi bir etkiye sahip degildir) (bkz. Nat öldürmektedir, fakat MBL'de eksik, @Sila etkisiz hale getirilen serum (Iektin yolunun tanIiIama moleküllerinden birisi) ve MASP-3'ü eksik serum, IV. men/hg/t/d/si öldürememistir (SEKIL 14). Bu sebepten ötürü, LEA-1'in, IV. men/ng/tidigs ölümünü yönlendirdigi görülmektedir. Bu bulgu, nakavt fare suslar-an serum numuneleri kullanllârak onaylanmlgtü Kompleman içeren normal fare serumu hali hazlma IV. men/ng/t/d/si öldürürken, MBL'sI eksik veya MASP-1/3'ü eksik fare serumu, islevsel komplemandan mahrum olan Elsîla etkisiz hale getirilmis serum kadar etkisiz olmustur (SEKIL 15). Buna karsIEl, MASP-2'si eksik serum, etkili IV. men/ng/'t/'d/s ölümü sergilemîstir.

LEA-1'in, N. men/ng/I/'d/sin Iektine bagIiIEblümünden sorumlu kompleman yolu olabildigi hipotezleri, bir 3MC hastaledan allEbn bir serum numunesi kullanlßrak test edilmistir. Bu hasta, MASP-1/3 geninin ekson 12'sinde bir anlamslîl mutasyon için homozigot olmustur.

Sonuç olarak, bu hasta, bir islevsel MASP-3 proteininden mahrum olmustur, fakat baska bir sekilde yeterli kompleman olmustur (ekson 12, MASP-3 transkriptine özgüdür; mutasyon, MASP-l islevinde veya ekspresyon seviyelerinde herhangi bir etkiye sahip degildir) (bkz. öldürmektedir, fakat MBL'de eksik, @Elitkisiz hale getirilen serum (Iektin yolunun tanIiIama moleküllerinden birisi) ve MASP-3'ü eksik serum, N. men/ng/t/U/si öldürememistir (SEKIL 14). Bu sebepten ötürü, LEA-1'in, N. men/ng/'t/d/'s ölümünü yönlendirdigi görülmektedir. Bu bulgu, nakavt fare suslarIan serum numuneleri kullanüârak onaylanmlgtlEl Kompleman içeren normal fare serumu hali haina N. men/'ng/'t/d/'s'i öldürürken, MBL'si eksik veya MASP- 1/3'ü eksik fare serumu, islevsel komplemandan mahrum olan Elîlîletkisiz hale getirilmis serum kadar etkisiz olmustur (SEKIL 15). Buna karslEl, MASP-2'si eksik serum, etkili /V. men/hg/'t/a'i's ölümü sergilemîstir.

Bu bulgular, Iektine bagnllîlkompleman aktivasyonunun ayrIZILEA-Z ve LEA-1 yollarII mevcudiyetini ortaya çllîbrarak Iektin yolunda simdiye kadar bilinmeyen bir ikilik için kaniEl sunmaktadE Yukar- detaylandlîilân örneklerde, LEA-2 ve LEA-1, gereksiz degildir ve ayrü islevsel sonuçlarElyönIendirmektedir. Veri, belirli türde Iektin yolu aktivatörleri (klglfllaylîlj olmayacak sekilde 5. pneumonia dahil) tercihen opsonizasyona yönelen LEA-Z vasltjisûla kompleman aktivasyonunu baslatlHken, digerlerinin (N. mening/t/'dis ile örneklendirilmektedir) tercihen LEA1 vaslßslîla kompleman aktivasyonunu baslatt[glII:l ve sitolitik süreçleri arttlîctllgilliiöstermektedir. Fakat veriler, diger ayarlarda her iki yol, opsonizasyonu ve/veya zorunda degildir.

LEA-1 kollarIlEl, LEA-2 blokajÇlorganizmanI LEA-1'e bagIiIEIitik yllEl/'n Vitra olarak gelistirdigi için birbirleri ile rekabet içinde olduklarElgörüImektedir (SEKIL 15). Yukarlöla detayland-[glüjzere, bulgu, MASP-Z yoklugunda Iektin MASP-3 komplekslerine yakI bir iliskide duran Iektin MASP-l komplekslerinin artan olasUJgJEile açllZIanabilmektedir, bu da LEA- 1 aktivasyonunu gelistirecek ve bu sekilde IV. men/'ng/l'ides'in Iizisini daha etkili bir hale getirecektir. /V. menihg/tid/'s lizisi, naif konakta ana koruyucu mekanizma oldugu için, in i/i'i/o LEA-2 blokaj CW. men/hgitiws klerensini arttlElnaktad lElve gelismis ölüme yol açmaktadlEl Yukarlilh açlKlanan örnekler, N. men/hgit/d/'s ile enfeksiyonun artIan sonuçlarla ilgili LEA-2 ve LEA-1'in opsonize edici etkilerini gösterirken, LEA-2 ve LEA-1'in, belirli bir sonucu üretmek için sineiji olusturdugu diger ayarlar mevcut olabilmektedir. Asagi detayland-[gllîl'izere, PNH, LEA-2- ve LEA-1 ile harekete geçirilen kompleaman aktivasyonunda mevcut olanlar gibi patolojisine katki bulunmak için sinerjik bir sekilde hareket edebilmektedir. Ek olarak burada açiEIandEgiüizere, MASP-3 aynlîtamanda Ca"+ yoklugunda olusabilen, genel olarak C3bB'nin C3bBb'sine ve pro-faktör D'nin faktör D'ye dönüsümüne yol açan, PNH patolojisine katk- bulunabilen faktör B'nin ve faktör D'nin Iektinden bagIisE dönüsümüne katklîzlh bulunmaktadlü iii. PNH'de bivoloîi ve beklenen islevsel aktivite Bu bölüm, PNH'nin bir canIEtllgElnodelinde hemolizde LEA-2 ve LEA-l bIokajIlEl inhibitör etkilerini aç[ElamaktadlEl Bulgular, bir veya birden fazla yönden muzdarip olan sujeleri tedavi etmek için LEA-2 bloke edici maddeler (klîlflbylîlîlolmayacak sekilde MASP-2 islevine baglanan ve bu islevi bloke eden antikorlar dahil) ve LEA-l bloke edici maddelerin (klglflbylîlîl olmayacak sekilde MASP-3, MASP-4 veya her ikisinin MASP-l aracMktivasyonunun islevine baglanan ve bu islevi bloke eden antikorlar dahil) kullanIiIEl/e aynlîtamanda ekulizumab gibi bir C5 inhibitörü ile tedaviye tabi olan PNH hastalarlîida C3 fragmanElaracmD ekstravasküler hemolizin etkilerini hafifletmek için LEA-2 ve/veya LEA-1 inhibitörlerinin ve/veya MASP-3'de bagIlÇl lektinden bagIisIZl kompleman aktivasyonunun (MASP-Z inhibitörleri, MASP-3 inhibitörleri ve çift veya bispesifik MASP-2/MASP-3 veya MASP-l/MASP-Z inhibitörleri ve pana özgü MASP-l/MASP-Z/MASP-3 inhibitörleri dahil) kullanIiIIZI desteklemektedir. iv. Retikülo-endotelival sistem vasßslîla PNH RBC'lerin 0Dsonizasvonunun ve ekstravasküler hemolizinin bloke edilmesine vönelik MASP-2 inhibitörleri Yukarlâb detayland-[giElüzere, PNH hastalarlî.] dolasIidan RBC klerensinin iki ayrEl mekanizmasIan dolayElanemik hale gelmistir, bu iki mekanizma su sekildedir: membran saldßan kompleksin (MAC) aktivasyonu vasßsma intravasküler hemoliz ve C3b ile opsonizasyondan sonra ekstravasküler hemoliz ve retikülo-endoteliyal sistem vasßslýla kompleman reseptör baglantlgüie alIiIian sonraki klerens. Bir hasta ekulizumab ile tedavi edildiginde, intravasküler hemoliz genis oranda önlenmektedir. Ekulizumab, kompleman baslatlEÜiktivasyon eyleminin ve sonraki opsonizasyonun asaglîyönünde olusan terminal Iitik efektör mekanizmasIEl bloke ettigi için, ekulizumab, ekstravasküler hemolizi bloke edilmemis PNH hastalarda hemolize tabi olan RBC'Ier, yüzeylerinde, retikülo-endoteliyal sistem ile alIiDarttlGn ve ekstravasküler hemolizlerini gelistiren aktif halde C3b proteinleri toplayabilmektedir. Bu sebepten ötürü, ekulizumab tedavisi, intravasküler hemolizden potansiyel ekstravasküler hemolize RBC birikimini etkili bir sekilde yönlendirmektedir. Sonuç olarak, bazElekulizumab ile tedavi edilen PNH hastalarEhnemik kalmaktadlEl Kompleman aktivasyonunu yukarEIyönde bloke eden ve PNH RBC'lerin opsonizasyonunu önleyen maddelerin, ara si& ekulizumab ile görülen ekstravasküler hemolizi bloke etmesi için özellikle uygun olabilecegini takip etmektedir.

Burada sunulan mikrobiyal veri, LEA-2'nin genellikle lektinden bagIisE opsonizasyon için baski bir yol oldugunu göstermektedir. DahaslÇllektine bagnlljbpsonizasyon (C3b birikimi olarak ölçülmektedir), üç prototipik lektin aktivasyon yüzeyinde test edildiginde (mannoz, SEKIL 19A; zimosan, SEKIL 193 ve 5. pneumomia; SEKIL 19C), LEA-2'nin, fizyolojik kosullar altlEtla (örn. tüm kompleman yolarII islevsel oldugu Ca*+ mevcudiyetinde) lektine bagIiIElopsonizasyonun baski yolu oldugu görülmektedir. Bu deneysel kosullar altIa, MASP-Z'si eksik serum (LAE-2'den mahrum), test yüzeylerinin opsonize edilmesinde WT serumunundan büyük ölçüde daha az bir etkiye sahiptir. Bu etki, LEA-Z'den mahrum seruma klýasla çok daha az telaffuz edilmesine ragmen, MASP-1/3'ü eksik serum da (LEA-l'den mahrumdur) tehlikeli olmaktadIEl Lektine ile harekete geçirilen opsonizasyona LEA-2 ve LEA- 1'in katkllârII nispi büyüklügü, SEKIL 20A - 20C'de gösterilmektedir. KomplemanlEl alternatif yolunun, lektin yolunun veya klasik yolunun yoklugunda Iektini aktif hale getiren yüzeylerin opsonizasyonunu destekledigi bildirilirken (Selander ve ark., J Clin Invest 116(5): ölçülmektedir), burada açlElanan LEA-2 ve LEA-1 ile baslatllân süreçlerden büyük ölçüde daha az etkili oldugu görülmektedir. Ekstrapolasyon sayesinde, bu veriler, lektine bagllEI alternatif yol aktivasyonunun sonucundan ziyade PNH PBC'Ierin opsonizasyonunun tercihen LEA-2 ile de baslatllâbildigini ve LEA-1 ile daha küçük bir ölçüye (muhtemelen alternatif yol amplifikasyon döngüsüyle güçlendirilmistir) baslatllâbildigini göstermektedir. Bu nedenle, LEA-2 inhibitörlerinden, opsonizasyonunun klîlflianmasüda ve PNH'de ekstravasküler hemolizin önlenmesinde en etkili olmasElbeklenmektedir. Fakat fikolinler gibi MBL'den baska lektinlerin, asetile proteinler gibi karbonhidrat olmayan yapüâra baglanmasEi/e MASP-3'ün tercihen H-fikolin ile birlesmesi gerçeginin anlasilîhasEl(Skjoedt ve ark., Immunobiol. olasHJgllEiaçlKl bükmaktadß Bu nedenle, LEA-l inhibitörlerinin, ek anti-opsonizasyon etkilerine sahip olmasEibeklenmektedir ve LEA-1 ve LEA-2 inhibitörlerinin kombinasyonundan, PNH hastalarIa opsonizasyonun ve ekstravasküler hemolizin klgifibnmasIa optimum olmasEive en güçlü tedavi faydasIEisunmasEbeklenmektedir. Bu konsept aynEizamanda SEKIL 28'de gösterilen opsonizasyon verileri ile desteklenmektedir: WT serumuna klýiasla opsonizasyonda herhangi bir kusur sergilemeyen faktör D'si eksik fare serumu (slîlîfazIa alternatif yolu aktif hale getirebilme kabiliyetinden yoksundur, fakat bir islevsel klasik yolu ve aynüamanda islevsel LEA-1 ve LEA-2 yollar. sahiptir). LEA-1'den mahrum olan faktör B'si eksik serum, azalmlgopsonizasyon sergilerken, LEA-2 aracii]IIk0mpIeman aktivasyonunu bloke etmek için MASP-2 monoklonal antikorla tedavi edilen faktör D'si eksik serum, opsonizasyonun daha dayanilZiEIbir sekilde bastIEiIIEiasIEtaglamaktadiEI(SEKIL 28). Önemli bir sekilde, faktör B'si eksik seruma MASP-Z monoklonal antikorun eklenmesi, opsonizasyonu, tek baslEia MASP-2 blokaann veya faktör D bIokaann daha etkili bir sekilde bastlElnlgtE Bu sebepten ötürü, LEA-2 ve LEA-1, opsonizasyonu arttiîrinak için ek olarak veya sinerjik olarak hareket etmektedir ve çapraz reaktif veya bispesifik LEA-1/LEA-2 inhibitöründen, PNH'de opsonizasyonun ve ekstravasküler hemolizin bloke edilmesinde en etkili olmasEI beklenmektedir. v. PNH'de MASP-3 inhibitörlerin rolü PNH'nin bir in vitro modeli kullanilârak, PNH'de kompleman aktivasyonunun ve ortaya çiiZian hemolizin, LEA-2 ve/veya LEA-l aktivasyonu ile baslatlligiÜ/e alternatif yolun bir bagIislZl islevi olmadlgilüsergiledik. Bu çallgi'nalar, Crry'si eksik farelerden (farelerde terminal kompleman yolunun bir öenmli negatif düzenleyici) ve aynEizamanda CD55/CD59'u eksik farelerden RBC'Ier dahil, PNH hastalarIa olmayan aynEikompIeman düzenleyicilerinden yoksun olan çesitli fare suslarII mannoza duyarlERBC'leri kullanmlgtlü Mannoza duyarIEl Crry'si eksik RBC'Ier, komplemanEyetersiz insan serumuna maruz bükligilüda, komplemanEl eksik serum (HI: @Sile etkisizlestirilmis) hemolitik olmazken, RBC'Ier %3 bir serum konsantrasyonunda etkili bir sekilde hemolize olmustur (SEKIL 21 ve 22). Önemli biçimde, LEA-2'nin, MASP-2 antikorunun eklentisi ile bloke edildigi komplemanEiyetersiz serum, hemolitik aktiviteyi azaltmlStE ve %6 serum, etkili hemoliz için gerekli olmustur.

CD55/CD59'u eksik RBC'Ier test edildiginde benzer gözlemler olmustur (SEKIL 24). MASP-2 monoklonal antikoru (örn. LEA-2'nin bast-[gllîberum) ile desteklenen komplemanEieksik insan serumu, hemolizin desteklenmesinde tedavi edilmemis serumdan yaklasiKl iki kat daha az etkili olmustur. DahasÇiLEA-Z bloke edilmis serumun (antiMASP-Z monoklonal antikorla tedavi edilen) daha yüksek konsantrasyonlar, tedavi edilmemis seruma klýhsla tedavi edilmis WT RBC'Ierin etkili hemolizini arttiîiinak için ihtiyaç duyulmustur (SEKIL 23).

Hatta daha çok sasIiEEbir sekilde, bir islevsiz MASP-3 proteini (ve bu sekilde LEA-1'den mahrum) için homozigot olan bir 3MC hastasIdan serum, mannoz duyarllerry'si eksik RBC'Ieri tamamen hemolize edememistir (SEKIL 22 ve SEKIL 23). DuyarlilâstlEliÜiEInormal RBC'ler kullan-[glîida, bir benzer sonuç gözlemlenmistir. SEKIL 23'te gösterildigi üzere, bir 3MC hastasian izole LEA-1'i eksik serum, hemolizin yönlendirilmesinde tamamen etkisiz olmustur. Kolektif olarak, bu veriler, LEA-2 intravasküler hemoliz yanitâ önemli sekilde katki bulunurken, LEA-l'in, hemolize yol açan en etkili kompleman baslatlEÜ/ol oldugunu göstermektedir. Bu sebepten ötürü, LEA-2 bloke edici maddelerden, PNH hastalarlEUa RBC'Ierin intravasküler hemolizini önemli ölçüde azaltmasiîbeklenirken, LEA-1 bloke edici maddelerden, daha büyük bir etkiye sahip oImasEive kompleman ile harekete geçirilen hemolizi büyük miktarda elimine etmesi beklenmektedir.

Bu çaligmada kullanllân LEA-l'i eksik 3MC hastasII serumunun, geleneksel alternatif yol deneme kosullarEaltIa test edildiginde bir bozulmus, fakat islevsel alternatif yola sahip oldugu belirtilmelidir (SEKIL 17). Bu bulgu, LEA-1'in, hemolize olan katklýia, PNH'nin bu deneysel ayariîitia geleneksel olarak belirlendigi gibi alternatif yol aktivitesinden daha büyük hale getirmektedir. Anlam çliZiarma vasiûsüla, LEA-1 bloke edici maddelerin, PNH hastalariEtia intravasküler hemolizin önlenmesinde veya tedavi edilmesinde en azIan, alternatif yolun diger yönleri bloke eden maddeler kadar etkili olacagiîina edilmektedir. vi. PNH'de MASP-Z inhibitörlerinin rolü Burada sunulan veriler, PNH'de anemiye yönelik asag-ki patojenik mekanizmalarEl göstermektedir: terminal kompleman bilesenlerinin düzenlenmemis aktivasyonudan dolayEI intravasküler hemoliz ve LEA-1 vasitâsiýia münhaslßn olmayacak sekilde baskI bir sekilde baslatlßn MAC formasyonu ile RBC lizisi ve LEA-Z ile basklEl bir sekilde baslatIlgllîgörülen, C3b ile RBC'Ierin opsonizasyonunun yol açtigiEi ekstravasüler hemoliz. Kompleman aktivasyonunun baslatiimaslütia ve MAC formasyonunun ve hemolizin arttiElBrasIa LEA- 2'ye yönelik fark edilebilir bir rol görünürken, bu süreç, hemolize yol açan LEA-1 ile baslatllân kompleman aktivasyonundan büyük ölçüde daha az oldugu etkili görülmektedir. Bu sebepten ötürü, bu terapötik aktiviteden sadece klglni olmasElbeklenmesine ragmen, LEA-2 bloke edici maddelerden PNH hastalarda intravasküler hemolizi önemli ölçüde azaltmasElbeklenmektedir.

Klýlaslama vasltâslîla, PNH hastalarIa LEA-1 bloke edici maddeler için intravasküler hemolizde daha büyük bir azalma beklenmektedir.

PNH'de anemiye yol açan RBC y-iII daha az dramatik, fakat esit miktarda önemli mekanizmasIlEl ekstravasküler hemolizi, birincil olarak LEA-2 ile baskI bir sekilde yönlendirilmesi görülen C3b ile opsonizasyon sonucudur. Bu sebepten ötürü, LEA-bloke edici maddelerden, tercihen PNH'de RBC opsonizasyonunu ve sonraki ekstravasküler hemolizi bloke etmesi beklenebilmektedir. LEA-2 bloke edici maddelerin bu benzersiz terapötik aktivitesinden, bu patojenik süreci deneyimleyen bu PNH hastalarEliçin mevcut olarak herhangi bir tedavi bulunmad[gEi'lçin tüm PNH hastalar. önemli bir tedavi faydaslîsaglamaslîl beklenmektedir. vii. LEA-1 inhibitörlerine veya terminal kompleman bloke edici maddelere yard ncüiedavi olarak LEA-2 inhibitörleri Burada sunulan veri, terapötik maddelerin ayrElsIlfllarElvaslÜislýla ayrEIbir sekilde veya kombinasyon halinde hedeflenebilen PNH'de RBC klerensine ve anemisine yönelik iki patojenik mekanizmayEUetaylandlîrlnaktadIîi LEA-1 vasißslýla münhasEin olmadan basklEl bir sekilde baslatüân intravasküler hemoliz ve bu sekilde, bir LEA-1 bloke edici madde ve LEA-2 vaslüslýla baskI bir sekilde harekete geçirilen ve bu sekilde bir LEA-Z bloke edici madde ile etkili bir sekilde önlenmesi beklenen C3b opsonizasyonundan dolayüzkstravasküler hemoliz.

Hemolizin intravasküler ve ekstravasküler mekanizmalarIIEl, PNH hastalar-a anemiye yol sekilde, birincil olarak ekstravasküler hemolizi önleyen bir LEA-2 bloke edici madde ile kombinasyon halinde intravasküler hemolizi önleyen bir LEA-l bloke edici maddenin, PNH hastalarIa gelisen aneminin tek bas. önlenmesinde maddelerden birisinden daha etkili olmasüeklenmektedir. AslIa, LEA-l ve LEA-2 bloke edici maddelerin kombinasyonunun, PNH'de komplemanI baslatllBiasIEyönelik ilgili tüm mekanizmalarEönlemesi ve bu sekilde PNH'de aneminin tüm semptomlarIEliiloke etmesi beklenmektedir.

Aynlîamanda C5 bloke edici maddelerin (örnegin ekulizumab) intravasküler hemolizi etkili bir sekilde bloke ettigi, fakat opsonizasyona müdahale etmedigi bilinmektedir. Bu, bazen tedavi edilmemis kalan LEA-2 vaslßslýla yönlendirilen ekstravasküler hemolizden dolayElbüyük ölçüde kalan anemisi olan anti-C5 ile tedavi edilenmis PNH hastalarlElEblEkmaktadlEl Bu nedenle, ekstravasküler hemolizi azaltan bir LEA-2 bloke edici madde ile kombinasyon halinde intravasküler hemolizi önleyen bir C5 bloke edici maddenin (ekulizumab) maddenin, PNH hastalarIa gelisen aneminin tek bas. önlenmesinde maddelerden birisinden daha etkili olmasEllieklenmektedir.

C5 aktivasyonuna ve MAC birikimine (klglflhylîlîblmayacak sekilde properdin faktör 8 veya faktör D'yi bloke eden veya faktör I, faktör H veya diger kompleman inhibitör faktörlerin inhibitör aktivitesini arttlûn maddeler dahil) yol açan kompleman sisteminin terminal amplifikasyon döngüsünü bloke eden diger maddelerin, intravasküler hemolizi inhibe etmesi beklenmektedir. Fakat bu maddelerden, PNH hastalarIa LEA-2 aracEUJopsonizasyonuna müdahale etmesi beklenmemektedir. Bu, bazen tedavi edilmemis kalan LEA-2 vasltîislîla yönlendirilen ekstravasküler hemolizden dolayEl büyük ölçüde kalan anemisi olan bu maddelerle tedavi edilenmis PNH hastalarIlZlblßkmaktadlB Bu sekilde, ekstravasküler hemolizi minimize eden bir LEA-2 bloke edici madde ile kombinasyon halinde intravasküler hemolizi önleyen bu tarz maddelerle tedavinin, PNH hastalarlEtla gelisen aneminin tek baslEla önlenmesinde maddelerden birisinden daha etkili olmasEbeklenmektedir. AsIIa, bu tarz maddelerin ve LEA-2 bloke edici maddenin kombinasyonunun, PNH'de RBC y-iI yönelik ilgili tüm mekanizmalarEbnlemesi ve bu sekilde PNH'de aneminin tüm semptomlarIEbloke etmesi beklenmektedir. viii. PNH'nin tedavi edilmesine vönelik cok sav., bispesifik veva Dana özciü antikorlar olan LEA-l ve LEA-2 kullanIiEl Yukari detayland-[gllîl üzere, LEA-1 ve LEA-2'yi bireysel olarak bloke eden ve intravasküler ve aynElzamanda ekstravasküler hemolizi yönlendiren tüm kompleman aktivasyon eylemlerini kombinasyon halinde bloke eden farmakolojik maddelerin bir kombinasyonundan, PNH hastalarElçin en iyi klinik sonucu saglamasEbeklenmektedir. Bu sonuca, örnegin LEA-2 bloke edici aktiviteye sahip bir antikorlar birlikte LEA-1 bloke edici aktiviteye sahip olan bir antikorun birlikte uygulanmaslZlile ulasllâbilmektedir. BazEl durumlarda, LEA-1 ve LEA-Z bloke edici aktiviteler, tek bir moleküler parçaya birlestirilmektedir ve birlestirilmis LEA-1 ve LEA-2 bloke edici aktivite ile bu tarz bir parça, intravasküler ve aynDzamanda ekstravasküler hemolizi etkili bir sekilde bloke edecektir ve PNH'de anemiyi önleyecektir. Bu tarz bir parça, bir antijen birlestirici bölgenin, MASP-l'i spesifik olarak tanIiIadlglEl/e LEA-1'i bloke ettigi ve LEA-2'yi yok ettigi ve ikinci antijen birlestirici bölgenin MASP-Z'yi spesifik olarak tanllad[g]l:lve aynElzamanda LEA-2'yi bloke ettigi bir bispesifik antikoru içerebilmekte veya bispesifik antikordan olusabilmektedir.

Alternatif olarak, bu tarz bir parça, bir antijen birlestirici bölgenin, MASP-3'i spesifik olarak tanIiladfgD/e bu sekilde LEA-1'i bloke ettigi ve ikinci antijen birlestirici bölgenin MASP-Z'yi spesifik olarak tannladigllîive aynEIzamanda LEA-2'yi bloke ettigi bir bispesifik antikoru içerebilmekte veya bispesifik antikordan olusabilmektedir. Bu tarz bir parça, bir antijen birlestirici bölgenin, MASP-l ve MASP-3'ü spesifik olarak tanIiIadlgiiZl/e bu sekilde LEA-1'i bloke ettigi ve LEA-Z'yi yok ettigi ve bu esnada ikinci antijen birlestirici bölgenin MASP-Z'yi spesifik olarak tanIiIadigiEl/e aynEkamanda LEA-2'yi bloke ettigi bir bispesifik antikordan optimal bir sekilde olusabilmektedir. Genel protein sekansIa ve yap-a olan benzerliklerin esasia, LEA-1 ve LEA-2'nin islevsel blokaj. ulasIlgiElsekilde bir islevsel biçimde MASL-l'e ve MASP-Z'ye ve MASP-3'e spesifik olarak baglanan iki özdes baglama bölgesine sahip bir geleneksel antikorun gelistirilebildigi görülebilmektedir. Pan-MASP inhibitör aktivitesini içeren bu tarz bir antikordan, intravasküler ve aynü zamanda ekstravasküler hemolizi bloke etmesi ve bu sekilde PNH hastalaria anemiyi etkili bir sekilde tedavi etmesi beklenmektedir. v1. MASP INHIBITÖR MADDELERI KomplemanI Iektin yolunun, iki ana kompleman aktivasyon kolundan (LEA-l ve LEA-2) olusmasEl/e aynlîizamanda bir lektinden bagIislZ kompleman aktivasyon kolunun mevcut olmasünlayiglîla, kompleman. immün savunma kapasitelerini tamamen kapatmadan (örn. klasik yolu bozulmamISl halde bßikarak) PNH ile iliskili bir patolojiye yol açan bu bir veya birden fazla efektör kolu spesifik olarak inhibe etmesinin yüksek derecede arzu edilebilir hale gelmesi gerçeklestirilmektedir. Bu, immün kompleks islemini idare etmek için ve enfeksiyona karsü bozulmamEbßkacaktE i. LEA-1 aracl]]]]kompleman aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik bilesimler Burada açliZIandlgiEüzere, mucitler, Iizise yol açan LEA-l aktivasyonunun, MASP-3'e bagIiIEI oldugunu beklenmedik bir sekilde kesfetmistir. Burada açlElandlglEüzere, üzyolojik kosullar aItIa, MASP-3'e bagIIEILEA-l aktivasyonu aynEIzamanda LEA-2 aracülijkompleman aktivasyonu ile bir katkEletkisini sagladlglElsekilde opsonizasyona katki bulunmaktadlîl Örnek 7'de gösterildigi üzere, Ca*+ mevcudiyetinde, MASP-3, faktör D'/` serumlarIa LEA-1in aktivasyonunu harekete geçirebildigi için faktör D gerekli olmamaktadlü MASP-3, MASP-l ve HTRA-l, profaktör D'yi aktif faktör D'ye dönüstürebilmektedir. Benzer bir sekilde, MASP-3 (MASP-l ve MASP-2'nin aksine), bir oto aktif hale getirici enzim olmad[gl|:lve MASP-l'in yardIiElolmadan aktif formuna dönüstürülemedigi için, MASP-3 aktivasyonunun birçok durumda MASP-l'e bagilEdJIdugu görülmektedir (Zundel, S. ve ark., J.Immun0l. 172: 4342- 1 islevsel aktivitesinin yoklugunda, MASP-3, zimogen formunda kalmad @Ele alternatif yol C3 konvertazII (C3bBb) dogrudan formasyonu vasltâslîla LEA-1'i harekete geçiremedigi için MASP-3 otomatik olarak aktif hale gelmedigi ve birçok durumda MASP-l aktivitesinin, enzimatik olarak aktif forma dönüstürmeye gerek duymazken, alternatif yol C3 konvertazII (C3Bb) MASP-3 aracHJBktivasyonu, MASP-3 zimogen veya hali hazlîda aktif halde MASP-3'ün hedeflenmesi vasiûislýla veya MASP-3'ün MASP-i araclIJIbktivasyonunun veya her ikisinin hedeflenmesi vasltâsüla inhibe edilebilmektedir.

LEA-1'i spesifik olarak inhibe etmek için terapötik maddelerin gelisiminde hedef tercih edilen protein bileseni, MASP-3'ün bir inhibitörüdür (MASP-l araclülîlMASP-3 aktivasyonunun inhibitörleri (örn. MASP-3 aktivasyonunu inhibe eden bir MASP-l inhibitörü) dahil).

Yukarlab bahsi geçenlerle uyumlu bir sekilde, bulus, PNH'den muzdarip olan veya PNH gelistirme riski taslýlan bir sujede LEA-l'in olumsuz etkilerinin (örn. hemoliz ve opsonizasyon) inhibe edilmesine yönelik olan, MASP-3'e bagIilEkompleman aktivasyonunu ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslîlülihhibe etmek için bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarIEl içeren bir farmasötik bilesimin denege uygulanmasIEiÇeren yöntemleri saglamaktadlEl MASP-2 inhibitör maddeleri, PNH gelistirmesinden muzdarip olan veya gelistirme riski tasühn bir canlEbujede MASP-3'e bagnlEkompleman aktivasyonunu inhibe etmek için etkili bir miktarda uygulanmaktadlEI Temsili MASP-3 inhibitör maddeleri: en azlîidan asagülaki bir veya birden fazla özelligi inhibe eden moleküller: faktör B'nin Iektin MASP-3'e bagnlüktivasyonu, pro-faktör D'nin Iektin MASP-3'e bagIiIElaktivasyonu, faktör B'nin MASP-3'e baglill,`_l lektinden baglislîl aktivasyonu ve pro-faktör D'nin MASP-3'e bagIilÇllektinden bagIislZl aktivasyon (örnegin küçük moleküllü inhibitörler, MASP-3 antikorlarü/e bunlarI fragmanlarEl veya MASP-3 ile etkilesim halinde olan veya bir protein-protein etkilesimine müdahale eden bloke edici peptitler) ve MASP-3 ekspresyonunu azaltan moleküller (örnegin MASP-3 antisens nükleik asit molekülleri, MASP-3'e özgü RNAi molekülleri ve MASP-3 ribozimleri) dahil MASP- 3'ün biyolojik aktivitesini inhibe eden molekülleri içermektedir. Bir MASP-3 bir inhibitör maddesi, MASP-3 protein-protein etkilesimlerini etkili bir sekilde bloke edebilmektedir, MASP- 2 dimerizasyonuna veya düzenegine müdahale edebilmektedir, Caz* bagIEl bloke edebilmektedir, MASP-3'ün, LEA-l aracilIBJeya Iektinden baglslîlkompleman aktivasyonunu aktif hale getirmesinin önlendigi sekilde MASP-3 protein ekspresyonunu azaltabilmektedir.

MASP-3 inhibitör maddeleri, birincil bir tedavi olarak veya diger tIi tedavilerin terapötik faydalarII arttlElIlÜiasEiçin destekleyici bir tedavi olarak diger terapötiklerle kombinasyon halinde kullanilâbilmektedir.

Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger bilesenlerden en az 10 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile bir MASP-3 bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) spesifik olarak baglanmaktadlü Bir diger durumda, bir MASP-3 inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger bilesenlere, en az 100 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-3'ün bir bölümüne spesiûk olarak baglanmaktadIEl(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8). Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, inhibitör maddesinin, MASP-1'in serin proteaz alan. baglanmamasEl(SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-2'nin serin proteaz alanlEb baglanmamasEKSEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) sartlîla MASP-3'ün serin proteaz alanlEEi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 450-711'i) spesifik olarak baglanmaktadlîlve MASP-3'e bagIiIEikompleman aktivasyonunu inhibe etmektedir. Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-3'e spesifik olarak baglanan bir MASP-3 monoklonal antikordur veya bunun bir fragman B Bir diger durumda, bir MASP-3 inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger bilesenlere, en az 10 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-l'in bir bölümüne spesifik olarak baglanmaktadlîl (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-3'ün MASP-l arac[[[l] aktivasyonunu inhibe etmektedir. Bir diger durumda, bir MASP-3 inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger bilesenlere (örn. polipeptitler veya bunlari fragmanlarLD en az 100 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-l'in bir bölümüne spesifik olarak baglanmaktadlîl(SEKANS KIMLIK NUMARASI:10) ve MASP-3'ün MASP-l araclDßktivasyonunu inhibe etmektedir. Bazüjurumlarda, MASP-3 inhibitör maddesi, inhibitör maddesinin, MASP- 2'nin serin proteaz alan. baglanmamasEKSEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) ve MASP-3'ün serin proteaz alan. baglanmamasEdSEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) sartEIa MASP-l'in serin proteaz alan. (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 449-694'ü) spesifik olarak baglanmaktadlElve MASP-3'ün MASP-l aracmktivasyonunu inhibe etmektedir. Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-l'e spesifik olarak baglanan bir MASP-l monoklonal antikordur veya bunun bir fragmanIlEl ve MASP-3'ün MASP-l aracl]]]]aktivasy0nunu inhibe etmektedir. BazIZIdurumlarda, MASP-l'e baglanan MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-3'ün MASP-l araclIIBktivasyonunu inhibe etmektedir ve ayn üamanda faktör D'nin MASP-l arac[[[l] matürasyonunu inhibe etmektedir.

Bir diger durumda, inhibitör maddesinin, MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) veya MAp19'a (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) baglanmamasESartlýla MASP-3 inhibitör maddesi, bir MASP-3 bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanmaktadEl ve aynElzamanda MASP-l'in bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) baglanmaktadE Bir durumda, inhibitör maddesinin, MASP-Z'ye (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) veya MAp19'a (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) baglanmamasüsartlýla MASP-3 inhibitör maddesi, bir MASP-3 bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanmaktadlElve aynlîtamanda MASP-l'in bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) baglanmaktadß Bir durumda, inhibitör maddesinin, insan serumunda yüksek bir konsantrasyonda mevcut olan, Map44'e baglantEEI olmamasIan dolayEMASP-3'e bagIilElkompIeman aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik bir düsük etkili doza olanak sagladiglElsekilde MASP-2'ye (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5), MAp19'a (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) veya Map44'e (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11) baglanmamasüsartüla MASP-3 inhibitör maddesi, bir MASP-3 bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) baglanmaktadlElve aynüzamanda MASP-l'in bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) baglanmaktadlü Bir durumda, MASP-3 inhibitörü, örnegin SEKIL 3-5'de gösterildigi üzere CUBI-CCPZ alanü (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 25-432'si) gibi MASP-l ve MASP-3 arasiiia tutulan amino asit bölgesi içerisinde bir epitopa baglanan bir MASP-l/MASP-3 çift inhibitör maddesidir. Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, örnegin CUBI alanE{SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 367-432'si) gibi MASP-l ve MASP-3 arasIa tutulan amino asit bölgesi içerisinde bir epitopa baglanan bir MASP-l/MASP-3 çift inhibitör maddesidir. Bir diger durumda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-3 proteininde bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) ve MASP-l proteininde bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) spesifik olarak baglanan, bir bispesifik monoklonal antikor gibi bir bispesifik inhibitör maddesidir.

BazEldurumlarda, MASP-3 inhibitör maddesi, MASP-l'in serin proteaz alan. (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 449-694'ü) baglanan ve aynEIzamanda MASP-3'ün serin proteazlEUa bulunan bir alana (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 450-711'I) baglanan bir bispesifik monoklonal antikordur.

MASP-3 inhibitör maddelerin baglama affinitesi, bir uygun baglama denemesi kullanilârak belirlenebilmektedir.

MASP-3'e baglükompleman aktivasyonunun inhibisyonu, mevcut bulusun yöntemleri ile uyumlu olan bir MASP-3 inhibitör maddesinin uygulamasII bir sonucu olarak olusan kompleman sistemin bir bileseninde asag-ki en az bir degisim ile karakterize edilmektedir: LEA-1 araclEÜkompleman aktivasyonunun inhibisyonu (hemoliz ve/veya opsonizasyon inhibisyonu); faktör B'nin Iektinden bagIislZl dönüsümün inhibisyonu; faktör D'nin Iektinden bagIislîl dönüsümünün inhibisyonu, MASP-3 serin proteaz sübstrata özgü bölünme inhibisyonu, hemolizin azaltllmaslîaörnegin Örnek 5'de açlEandlggibi ölçülmektedir) veya C3 bölünmesinin ve CBBbbirikiminin azaltllü1aslZl(Örnek 4 ve Örnek 11'de açllZlandfglElgibi ölçülmektedir).

BazEljurumIarda, MASP-3 inhibitör maddeleri, Clq'ya baglü islevsel olarak bozulmamg bir vaziyette bükarak MASP-3'e bagnllîl kompleman aktivasyonunu (örn. LEA-1 aracll]]] baglislîl dönüsümü ve/veya faktör D'nin Iektinden baglislîl dönüsümü) seçici bir sekilde inhibe etmektedir.

BazIZIdurumlarda, MASP-3 inhibitör maddeleri, MASP-3 antikorlarElve bunlarI MASP-3 baglama fragmanlarüMASP-l antikorlarü/e bunlar. fragmanlarüdogal ve sentetik peptitler veya küçük moleküller dahil antikorlar veya bunlari fragmanlarIlEl Bazülurumlarda, MASP-3 inhibitör maddeleri, MASP-l için seçici olan veya MASP-3 için seçici olan veya MASP-l v MASP-3 için seçici olan küçük moleküllü proteaz inhibitörleridir. ii. LEA-2'nin aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik bilesimler Burada açlKlandEglEüzere, LEA-2 aracEIJIkompleman aktivasyonu, MASP-Z'ye bagIiIILEI ve opsonizasyona ve/veya Iizise yol açmaktadlEl Bu sekilde, LEA-2 Iektine bagillîkompleman sistemini spesifik olarak inhibe etmeye yönelik terapötik maddelerin gelisiminde hedef tercihen edilen protein bileseni, MASP-Z'dir. Çesitli proteinlerin, protein-protein etkilesimleri üzerinden MASP-Z'ye baglandlgllîlve MASP-2 ile etkilesime geçtigi gösterilmistir. Örnegin, MASP-2'nin, Iektin proteinleri MBL, H-fikolin ve L-fikolin ve kolektin-ll ile kalsiyuma bagIilEl komplekslere baglandfgllîive bu kompleksleri olusturdugu bilinmektedir. Ma Y., ve ark., J proteinlerinin MASP-Z'ye bagIIIElbölünmesi üzerinden tamamlaylEMIIaktif hale getirdigi yanlîtlß, CUBlEGFCUBII alanlarIlEl, aktif bir MBL kompleksinin formasyonu için gerekli olan MASP-2'nin dimerizasyonuna araciEiIZl ettigi de gösterilmistir (Wallis, R., ve ark., J. Biol. Chem. oldugu bilinen MASP-Z hedef bölgelerine baglanan veya bu bölgelere müdahale eden MASP-2 inhibitör maddeleri tannlanabilmektedir.

YukarlZlla bahsi geçenlerle uyumlu bir sekilde, bulus, PNH'den muzdarip olan veya PNH gelistirme riski taslýlan bir sujede LEA-1'in olumsuz etkilerinin inhibe edilmesine yönelik olan, MASP-Z'ye bagnllîllEA-Z'yi ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlîlýlîihhibe etmek için bir MASP-2 inhibitör maddesinin bir miktarIDiçeren bir farmasötik bilesimin denege uygulanmasIEkeren yöntemleri saglamaktadlü MASP-2 inhibitör maddeleri, PNH gelistirmesinden muzdarip olan veya gelistirme riski tasiyan bir canIEI sujede MASP-Z'ye bagIiiE] LEA-2'yi inhibe etmek için etkili bir miktarda uygulanmaktadlü Temsilci MASP-Z inhibitör maddeler, asaglahkileri içermektedir: MASP-Z'nin biyolojik aktivitesini inhibe eden moleküller (MASP-Z ile etkilesime geçen veya protein-protein etkilesimine müdahale eden küçük molekül inhibitörleri, anti-MASP-Z antikorlarlZi/eya bloke edici peptitler gibi) ve MASP-2'nin, alternatif kompleman yollarIEbktif hale getirmesinin engellendigi sekilde, MASP-2 ekspresyonunu düsüren moleküller (MASP-Z rehber nükleik asit molekülleri, MASP-2'ye özgü RNAi molekülleri ve MASP-2 ribozomlarügiibi).

Bir MASP-2 bir inhibitör maddesi, MASP-2 protein-protein etkilesimlerini etkili bir sekilde bloke edebilmektedir, MASP-Z dimerizasyonuna veya düzenegine müdahale edebilmektedir, Ca++ bagIEbloke edebilmektedir, MASP-2'nin, LEA-2'nin aktif hale getirmesinin önlendigi sekilde MASP-Z protein ekspresyonunu azaltabilmektedir. MASP-2 inhibitör maddeleri, burada açllZIand[gELizere birincil bir tedavi olarak tek baslEia veya diger tIi tedavilerin terapötik faydalarII arttlEllBiasEIçin destekleyici bir tedavi olarak diger terapötiklerle kombinasyon halinde kullanllâbilmektedir.

Bir durumda, MASP-2 inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger antijenlere en az 10 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-Z'nin bir bölümüne spesifik olarak (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) bagianmaktadiîi Bir diger durumda, MASP-Z inhibitör maddesi, kompleman sisteminde diger antijenlere en az 100 kat daha büyük bir baglama affinitesi ile MASP-Z'nin bir bölümüne spesifik olarak (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) baglanmaktadß Bir durumda, MASP-Z inhibitör maddesi, inhibitör maddesinin, MASP-l'in (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) serin proteaz alan. baglanmamaslZlve MASP-3'ün (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) serin proteaz alan. baglanmamasüsartüla (i) MASP-Z'nin CCP1-CCP2 alanIan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 300-431'i) veya MASP-2'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI. 5'IN aa 445-682'si) serin proteaz alanian en az birisine spesifik olarak baglanmaktadlEl ve MASP-2'ye baglilElkompleman aktivasyonunu inhibe etmektedir. Bir durumda, MASP-2 inhibitör maddesi, MASP-2'ye spesifik olarak baglanan bir MASP-2 monoklonal antikordur ve bunun fragmanIlB MASP-2 inhibitör maddesinin baglaylîlîlaffinitesi, uygun bir baglaylEEldeneme kullanllârak belirlenebilmektedir.

MASP-Z'ye bagnIEkompleman aktivasyonunun Inhibisyonu, mevcut bulusun yöntemleri ile uyumlu olan bir MASP-Z inhibitör maddesinin uygulamasII bir sonucu olarak olusan kompleman sistemin bir bileseninde asagIki en az bir degisim ile karakterize edilmektedir: MASP-Z'ye baglilllompleman aktivasyon sistemi ürünleri olan C4b, C3a, C5a ve/veya C5b- 9'un (MAC) (US 7,919,094 SayEIIIIlPatent DokümariII Örnek 2'sinde açllZlandgElgibi ölçülmektedir) yapIiII veya üretiminin inhibisyonu, C4 bölünmesinin ve C4b birikiminin (örnegin Örnek 8 veya Örnek 9'da açllZlandIgIElgibi ölçülmektedir) azaltilBiasüveya C3 bölünmesinin ve C3b birikiminin (örnegin Örnek 11'de açllZlandIglElgibi ölçülmektedir) azaltllîhaslîl BazEl durumlarda, MASP-Z inhibitör maddeleri, C1q'ya bagIiIElkompleman aktivasyon sistemini islevsel olarak bozulmamEbßkarak MASP-Z kompleman aktivasyonunu (örn. LEA- 2) seçici bir sekilde inhibe etmektedir.

BazEldurumlarda, MASP-2 inhibitör maddeleri, MASP-Z antikorlarüve bunlarI MASP-2 baglama fragmanlarüdogal ve sentetik peptitler veya küçük moleküller dahil antikorlar veya bunlari fragmanlarIlEl Bazülurumlarda, MASP-2 inhibitör maddeleri, MASP-2 için seçici olan küçük moleküllü proteaz inhibitörleridir. iii. LEA-1 araCIIJIkomDleman aktivasyonunun ve LEA-2 araclIlIlIomDIeman aktivasyonunun inhibe edilmesine yönelik bilesimler Bir diger yönünde, bulus, LEA-l'in olumsuz etkilerinin inhibe edilmesine ve bir veya birden fazla PNH yönünden muzdarip olan veya PNH'nin gelistirilmesi riskini tasglan bir sujede LEA- 2'nin olumsuz etkilerinin inhibe edilmesine yönelik yöntemleri saglamaktadlEl Bir durumda, bulusun bu yönü, PNH'den muzdarip olan bir sujede künlîlîkan hücrelerinin sagkalIII arttlElIIhas- yönelik, kIEnlîEkan hücrelerinin sagkalIiIBrttÜnasEilçin etkili olan en az bir MASP-l inhibitör maddesinin ve/veya bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarlüberen bir bilesimin denege uygulanmaslüberen bir yönteme yönlendirilmektedir.

Bir durumda, bilesim, bir MASP-l inhibitör maddesini içermektedir. Bir durumda, MASP-l inhibitör madde, MASP-3 araclIEükompIeman aktivasyonunu inhibe etmektedir ve aynEl zamanda MASP-Z aracll]]]10mpleman aktivasyonunu inhibe etmektedir.

Bir durumda, bilesim, bir MASP-3 inhibitör maddesini içermektedir. Bir durumda, MASP-3 inhibitör maddesi asaglkilerden en az birisini inhibe etmektedir: faktör B'nin lektin MASP- 3'e bagilüktivasyonu; faktör D'nin lektin MASP-3'e bagnlüktivasyonu; faktör B'nin MASP- 3'e baglllülektinden bagIislZaktivasyonu; ve/veya faktör D'nin MASP-3'e baglilülektinden baglislîlaktivasyonu.

Bir durumda, bilesim, bir MASP-l inhibitör maddesini ve bir MASP-3 inhibitör maddesini içermektedir.

Bazülurumlarda, yöntem aynüamanda bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir bilesimin denege uygulanmaslübermektedir.

Bir diger durumda, bulusun bu yönü, MASP-2'ye bagllEkompleman aktivasyonunun inhibe edilmesi için etkili bir MASP-Z inhibitörünün bir miktarIEl/e MASP-3'e bagIiIEkompIeman aktivasyonunu inhibe etmek için etkili bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarIEilçeren bir farmasötik bilesimin ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslîLIEIElI PNH'den muzdarip bir denege uygulanmasIEilçermektedir.

Bazüiurumlarda, bilesim, LEA-1 ve LEA-2'yi (örn. bir çift MASP-2/MASP-3 inhibitör maddesi, bir çift MASP-l/MASP-Z inhibitör maddesi, bir bispesifik MASP-Z/MASP-3 inhibitör maddesi, bir bispesifik MASP-l/MASP-Z inhibitör maddesi ve bir pan-MASP-1/2/3 inhibitör maddesi veya bir trispesifik MASP-1/2/3 inhibitör maddesi). Bazülurumlarda, bilesim, LEA-l ve LEA-2 inhibitör maddelerinin bir kombinasyonunu, örnegin çift inhibitör maddeleri artlîlbir tek inhibitör maddesinin bir kombinasyonunu, bispesifik inhibitör maddeleri artDJIr tek inhibitör maddesinin bir kombinasyonunu veya kombinasyonun burada açllgandlgilîüzere LEA-1 ve LEA-2'yi inhibe ettigi, burada açilZlanan herhangi bir MASP-1, MASP-2 ve/veya MASP-3 inhibitör maddesinin bir kombinasyonunu içermektedir.

Bir durumda, LEA-1 ve LEA-2'nin inhibe edilmesine yönelik olan, en az bir MASP-3 inhibitör maddesini ve en az bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir farmasötik bilesim ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslEElElilîl Farmasötik bilesim, bir MASP-3 inhibitör maddesi olan bir birinci molekülün bir kombinasyonunu ve bir MASP-2 inhibitör maddesi olan bir ikinci molekülü içermektedir. Bir diger durumda, farmasötik bilesim, bir MASP-3 inhibitör maddesi olarak aktiviteyi ve bir MASP-2 inhibitör maddesi olarak aktiviteyi (örn. MASP-2 araclIlilEA-Z aktivasyonunu ve MASP-3 araclilllEA-l aktivasyonunu inhibe eden bir inhibitör maddesi) içeren tek bir moleküler parçayüçermektedir. Bir durumda, inhibitör madde, SEKIL 4, 6 ve 7C'de gösterildigi üzere beta zincirin N terminal bölgesi benzeri (örn. SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in beta zincirinin N-terminal bölgesinin ilk ve MASP-3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) araSIEtla korunan bir amino asit bölgesi içerisindeki bir epitopa baglanan bir MASP-2/MASP-3 çift inhibitör maddesidir. Bir durumda, inhibitör maddesi, bir bispesifik monoklonal antikor gibi olan, MASP-2 proteininde bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) ve MASP-3 proteininde (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) bir epitopa Spesifik olarak baglanan bir bispesifik inhibitör maddesidir. Bazüdurumlarda, inhibitör maddesi, MASP-2'nin CCPl-CCPZ alanIan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 300-431'i) veya MASP-2'nin proteaz aianiiian (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 445-682'si) en az birisine baglanan ve aynüamanda MASP-3'ün serin proteazIa bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 450-711'i) baglanan bir bispesifik monoklonal antikordur.

Bir diger durumda, bulus, LEA-1 ve LEA-2'nin inhibe edilmesine yönelik olan, MASP-3 araclIlIl LEA-1 aktivasyonunun inhibe edildigi (ve tercihe baglEblarak faktör D'nin MASP-l aracIIJJZl matürasyonun inhibe edildigi) sekilde MASP-Z aracIIHlEA-Z aktivasyonunu ve MASP-3'ün MASP-l araciIJDaktivasyonunu inhibe eden bir inhibitör maddesini içeren bir bilesimi saglamaktadB Bir durumda, inhibitör maddesi, SEKIL 4, 6 ve 7A'da gösterildigi üzere serin proteaz alanEgibi MASP-1 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) arasIEUa korunan bir amino asit bölgesi içerisindeki bir epitopa baglanan bir MASP-l/MASP-Z çift inhibitör maddesidir. Bir durumda, inhibitör maddesi, MASP-1 proteininde bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-2 proteininde bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) spesifik olarak baglanan, bir bispesifik monoklonal antikor gibi bir bispesifik inhibitör maddesidir. Bazüdurumlarda, inhibitör maddesi, MASP-1'in (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 449-694'ü)serin proteaz alan. baglanan ve aynEl zamanda MASP-Z'nin CCPl-CCPZ (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 300-431'i) alanian veya MASP-2'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 445-682'si) erin proteaz alanIan en az birisine baglanan bir bispesiûk monoklonal antikordur.

Bir diger durumda, bulus, LEA-1 ve LEA-2'nin inhibe edilmesine yönelik olan, MASP-2 aracl]]]] LEA-2 aktivasyonunu, MASP-3 araclIJIlEA-l aktivasyonunu dogrudan MASP-3'e baglanarak inhibe eden ve aynElzamanda MASP-3 araclIUZlLEA-l aktivasyonunu inhibe ettigi sekilde (tercihe baglljblarak faktör D'nin MASP-1 araclIJDnatürasyonunu inhibe ettigi sekilde) MASP- 3'ün MASP-1 aracmlhktivasyonunu inhibe eden bir inhibitör maddesini içeren bir bilesim saglamaktadlB Bir durumda, inhibitör maddesi, örnegin SEKIL 4 ve 5'de gösterildigi üzere CUBI-EGF-CUBZ alanIa bir korunan bölge gibi MASP-1 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:10), MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:5) ve MASP-3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) araslîibia korunan bir amino asit bölgesine baglanan bir pan-MASP inhibitörüdür. SEKIL 4 ve 5'de gösterildigi üzere, pana özgü MASP antikorlarII olusumuna olanak sagladIglEsekilde CUBI- EGF-CUBII alanlarda MASP-1, MASP-2 ve MASP-3 arasIa paylaslßn saylâlîl kimlik eklentisi mevcuttur. BazEl durumlarda, pana özgü MASP antikoru, MASP-1 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa ve MASP-3'ün (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 185-296'SIBCUBZ alan ülçerisinde bir epitopa baglanabilmektedir. MASP-1, MASP-2 ve MASP-3'ün CUBI-EGF'sine baglanan bir pana özgü MASP inhibitörünün de MAp19 ve Map44'e baglandlgiübu sekilde bu tarz bir inhibitörün etkili terapötik dozajIlEl, bu baglantmelafi etmek için daha yüksek bir seviyeye düzenlendigi belirtilmektedir. MASP-1, MASP-2 ve MASP-3'ün CUBII alanlEla baglanan bir pana özgü MASP inhibitörünün de Map44'e de baglandigiübu sekilde bu tarz bir inhibitörün etkili terapötik dozajlEIlEl, bu baglantlîlîl telafi etmek için daha yüksek bir seviyeye düzenlendigi belirtilmektedir.

Bir durumda, inhibitör maddesi, MASP-1 proteininde (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) bir epitopea, MASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) proteinin bir epitopa ve MASP-3 proteininde (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) bir epitopa baglanan bir trispesifik MASP-1/inhibitörüdür. Bazlîlzlurumlarda, inhibitör maddesi, MASP-1'in serin proteaz alanlEb (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10 aa 449-694'ü) baglanan, MASP-Z'nin ccpi-ccpz aianiiian (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 300-431'i) veya MASP-2'nin proteaz alanIan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 445-682'si) en az birisine baglanan ve ayri Etamanda MASP-3'ün serin proteazIa bir epitopa (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in aa 450-711'i) baglanan bir bispesifik monoklonal antikordur.

LEA-1, LEA-2 veya LEA-1 ve LEA-2'nin inhibe edilmesine yönelik olarak örnek teskil eden inhibitör maddeler, asag- TABLO 2'de açlKIanmaktadlEl TABLO 2: MASP Inhibitör Maddeleri MASP Inhibitör Baglama Çapraz Reaktîvite* Inhibitör Aktivitesine Terapötik Inhibitör AlanlarEl yönelik deneme kullariüi MASP-3'e MASP-3 serin proteaz MASP-3'e MASP-3 serin proteaz LEA-l-araCIIJIJ özgü alanEQSEKANS KIMLIK baglanmaktadlü sübstrata özgü kompleman NUMARASI: 8'in aa 450- MASP-1; bölünmenin inhibisyonu; aktivasyonunun 711'i). MASP-2; Faktör D aktivasyonunun inhibe edilmesi MAp44 veya inhibisyonuna yönelik (lizisin ve MAp19'a suje, LEA-l inhibisyonu; opsonizasyonun baglanmamaktadlî] insan serumu ile Insan inhibe edilmesi) olmayan RBC'Ierin hemolizinin inhibisyonu MASP-Z'ye MASP-2 CCPl-CCPZ alan MASP-Z'ye MASP-Z'ye özgü serin LEA-Z-aracmIl özgü (SEKANS KIMLIK baglanmaktadlEJ proteaz sübstrata özgü kompleman NUMARASI: 5'in aa 300- MASP-1; bölünmenin inhibisyonu, aktivasyonunun 431'i) VEYA serin proteaz MASP-3; LEA-2 inhibisyonu inhibe edilmesi alanEQSEKANS KIMLIK MAp19 veya (opsonizasyon NUMARASI: 5'in aa 445- MAp44'e ve/veya Iizisin 682'si). baglanmamaktadlîl inhibe edilmesi) MASP-i'e MASP-1 serin proteaz MASP-1'e MASP-1'e özgü serin LEA-l ve LEA-2- özgü alanEQSEKANS KIMLIK baglanmaktadlîj proteaz sübstrata özgü aracl]]]]10mpleman NUMARASI: 10'un aa MASP-2; bölünmenin inhibisyonu; aktivasyonunun 449-694'ü) MASP-3; LEA-1 ve LEA-2 inhibe edilmesi MAp44 veya inhibisyonui Faktör D (lizisin ve MAp19'a aktivasyonunun opsonizasyonun baglanmamaktadlîl inhibisyonuna yönelik inhibe edilmesi) deneme; pro-faktör D ile desteklenen faktör D'si' tükenmis serumda AP-1 aktivitesinin restorasyonuna yönelik MASP- Serin proteaz alanÇI MASP-2 ve MASP-3' MASP-2 ve MASP-3 LEA-l ve LEA-2- 2/MASP-3 özellikle baglanmaktadlü proteaz sübstrat. özgü aracmompleman çift inhibitör MASPZ ve MASP3 MASP-1; bölünmeye yönelik aktivasyonunun (bir antikor, arasIa korunan beta MAp44 veya MAp19'a deneme, inhibe edilmesi korunan zincirinin (ilk 150 aa) N- baglanmamaktadlü LEA-l ve LEA-2'nin bölgeye terminal bölgesi inhibisyonu baglanlE (lizisin ve opsonizasyonun inhibe edilmesi) MAp44'ü MASP-1/3 CCP2 alani] MASP-Z ve MASP3'e MASP-3 ve MASP-i LEA-1 ve LEA-2- içermeyen (SEKANS KIMLIK baglanmaktadlü proteaz sübstrat. özgü araciIDJIompleman MASP-1/3 NUMARASI: 10'un aa MAp44; MASP-Z veya bölünmeye ve faktör D aktivasyonunun çift 367-432'si) MAp19'a aktivasyonunun inhibe edilmesi inhibitörü baglanmamaktadlü inhibisyonuna, LEA-1 ve (lizisin ve LEA-2'nin inhibisyonuna opsonizasyonun yönelik deneme inhibe edilmesi) MAp44'ü MASP-1/3 CUBI-CCPI MASP-l, MASP3'e ve MASP-3 ve MASP-i LEA-1 ve LEA-2- içeren alanEaSEKANS KIMLIK MAp44'e proteaz sübstrat- özgü aracilmlompleman MASP-1/3 NUMARASI: 10'un aa 25- baglanmaktadlrj bölünmeye ve faktör D aktivasyonunun çift 363'ü) MASP-Z veya aktivasyonunun inhibe edilmesi inhibitörü MAp19'a inhibisyonuna, LEA-l ve (lizisin ve baglanmamaktadlü LEA-2'nin inhibisyonuna opsonizasyonun yönelik deneme inhibe edilmesi) MASP1/2 MASP-l ve MASP-Z MASP-l ve MASP-2'ye MASP-l ve MASP-Z serin LEA-1 ve LEA-2- çift inhibitör arasIa korunan serin baglanmaktadlü proteaz sübstrat. özgü aracHBlompleman proteaz alanI bölgesi MASP-3, MAp19 veya bölünmeye yönelik aktivasyonunun MAp44'e deneme; LEA-l ve LEA-2 inhibe edilmesi baglanmamaktadlîl inhibisyonu (lizisin ve opsonizasyonun inhibe edilmesi) MASP-112/3 CUBl-EGF-CUBZ, özellikle Ek olarak, MASP-1/2/3, MASP-l, MASP-2 ve LEA-l ve LEA-2- pan CUBZ alan korunan MAp44'e ve MASP-3'e özgü serin araclIDJIompleman inhibitörü bölgesi (genel etkilesim muhtemelen Map 1% proteaz sübstrat. özgü aktivasyonunun bölgesi) baglanacaktEl bölünmeye yönelik ve inhibe edilmesi faktör D aktivasyonunun (lizisin ve inhibisyonuna deneme; opsonizasyonun LEA-1 ve LEA-2 inhibe edilmesi) inhibisyonu MASP- CCPl-CCPZ'ye MASP-2'ye MASP-Z'ye ve MASP- MASP-2 ve MASP-3'e LEA-1 ve LEA-2- 2/MASP-3 özgü baglantEaSEKANS 3'e baglanmaktadlü özgü serin proteaz aracHIDlompleman bispesifik KIMLIK NUMARASI: S'in MASP-l, MAp44'e veya sübstrat- özgü aktivasyonunun inhibitör aa SGD-431); veya MASP- MAp19'a bölünmeye, LEA-1 ve inhibe edilmesi 2 seirn proteaz alanEl baglanmamaktadlE LEA-2'ye yönelik deneme (lizisin ve (SEKANS KIMLIK opsonizasyonun NUMARASI: 5"in aa 445- inhibe edilmesi) 682) ve serin proteaz alan. MASP3'e özgü baglantElJSEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'i aa 450- MASP- MASP-i seirn proteaz MASP-l'e ve MASP- MASP-l ve MASP-Z'ye LEA-l ve LEA-2- 1/ MASP-2 alanEQSEKANS KIMLIK Z'ye baglanmaktadlB özgü serin proteaz araciIIIJIompleman bispesifik NUMARASI: 10'un aa449- MASP-3'e, MAp19'a sübstratlEla özgü aktivasyonunun inhibitör 694'ü) ve CCPl-CCPZ'ye veya MAp44'e bölünmeye, LEA-l ve inhibe edilmesi MAP-Z'ye özgü baglanti] baglanmamaktadlîl LEA-2'ye yönelik deneme (lizisin ve (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa300- opsonizasyonun inhibe edilmesi) 431'i); eya MASP-2 serin proteaz alan EdSEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in aa 445-682'si) MASP- MASP-1 serin proteaz MASP-1 ve MASP-3'e MASP-1 ve MASP-3 LEA-l ve LEA-2- 1/ MASP-3 alanEQSEKANS KIMLIK baglanmaktadlü protaz sübstrat- özgü aracllîülompleman bispesifik NUMARASI: 10'n aa449- MASP-2, MAp44'e veya bölünmeye ve faktör D aktivasyonunun 694'ü) ve serin proteaz MAp19'a aktivasyonun inhibe edilmesi alan. baglanmamaktadlîl inhibisyonuna, LEA-l (lizisin ve opsonizasyonun inhibe edilmesi) MASP-3' özgü baglantEl ve LEA-2 inhibisyonuna (SEKANS KIMLIK yönelik deneme NUMARASI: 8'in aa 450- 711'i MASP- MASP-1 seirn proteaz MASP-1 ve MASP-Z'ye MASP-1, MASP-2 ve LEA-l ve LEA-2- 1/MASP- alanÇlMASP-Z seirn ve MASP-3'e MASP-3 protaz araclIlRompIeman 2/MASP-3 proteaz alan Eleya CCPl, baglanmaktadlû sübstrat- özgü aktivasyonunun trispesifik CCPZ alan Be MASP-3 MASP-2; MAp19'a veya bölünmeye ve faktör D inhibe edilmesi serin proteaz alanlII MAp44'e aktivasyonun (lizisin ve baglanmamaktadlîl inhibisyonuna, LEA-1 ve opsonizasyonun LEA-2 inhibisyonuna inhibe edilmesi) yönelik deneme *TABLO 2'de belirtildigi gibi çapraz reaktivite kolona göre, belirlenen MASP inhibitörü, “baglanmamaktadlEl olarak listelenen diger bilesenlere (örn. Polipeptitler veya bunlari fragmanlarDIlolandan en az 10 kat daha büyük (örn. En az 20 kat, en az 50 kat veya en az 100 kat daha büyük) bir baglaylöâffinite ile inhibitör baglama alanßb baglanmaktadlEl Bazüiurumlarda, bilesim, örnegin yukarlflb açÜZlandlglüVe TABLO 2'de gösterildigi üzere tek inhibitör maddelerinin bir kombinasyonu gibi LEA-1 ve LEA-2 inhibitör maddelerinin bir kombinasyonunu içermektedir. Örnegin bilesim, bir MASP-1 ve bir MASP-2 antikorunun bir kombinasyonunu içermektedir. Bir durumda, bilesim, bir MASP-1 ve bir MASP-3 antikorunun bir kombinasyonunu içermektedir. Bir durumda, bilesim, bir MASP-2 ve bir MASP-3 antikorunun bir kombinasyonunu içermektedir. Bir durumda, bilesim, bir MASP-1 ve bir MASP-2 ve bir MASP-3 antikorunun bir kombinasyonunu içermektedir. BazEldurumlarda, bulusun yöntemleri, inhibitör maddelerinin bir kombinasyonunu içeren tek bir bilesimin uygulanmaslljlçermektedir. Diger durumlarda, bulusun yöntemleri, ayrElbilesimIerin birlikte uygulanmasIEtermektedir.

Bazüjurumlarda, bilesimler, bir çift inhibitör madde artlZIJir tek inhibitör maddenin (örn. bir MASP-2/3 çift inhibitör artEbir MASP-1 inhibitör; bir MASP-1/3 çift inhibitör artlîbir MASP-2 inhibitör; veya bir MASP- bir kombinasyonunu içermektedir. Bulusun yöntemleri, bir çift inhibitörü ve bir tek inhibitörü içeren ayrEl bilesimlerin birlikte uygulanmaslüçermektedir.

BazEtlurumlarda, bilesimler, bir bispesifik inhibitör maddesi artEbir tek inhibitör maddenin (örn. bir MASP-2/3 bispesifik inhibitör artlîlbir MASP-1 inhibitör; bir MASP-1/3 bispesifik inhibitör artEbir MASP-2 inhibitör; veya bir MASP-1/2 bispesifik inhibitör artEbir MASP-3 inhibitör) bir kombinasyonunu içermektedir. Bulusun yöntemleri, bir bispesifik inhibitörü ve bir tek inhibitörü içeren ayrEbilesimlerin birlikte uygulanmasllîçermektedir.

MASP-3 inhibitör maddelerinin ve/veya MASP-2 inhibitör maddelerinin ve/veya MASP-1 inhibitör maddelerinin, eylem alan. lokalize edilmesi gereken bir C5 antikoru ile külasland [glEl üzere plazmadan hedef proteini temizlemek için kullan llâcaktE V. MASP ANTIKORLARI MASP inhibitör maddesi, en az bir LEA-1 ve/veya LEA-2 kompleman aktivasyon yolun inhibe eden bir MASP antikorunu (örn. bir MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 antikoru) içermektedir.

Bulusun bu yönünde kullanlglljblan MASP antikorlarüherhangi bir antikor üreten memeliden türetilen poliklonal, monoklonal veya rekombinant antikorlarüçermektedir ve multispesifik (örn. bispesifik veya trispesifik), kimerik, insanlastlülîhlgl tamamen insan, anti-idiyotip ve antikor fragmanlarlîblabilmektedir. Antikor fragmanlarüaçllîlandgllîüzere, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv fragmanlarlüscFv fragmanlarIEle tek zincirli antikorlarülçermektedir.

MASP antikorlarÇl burada açHZlanan denemeler kullanllârak LEA-1 veya LEA-2'ye baglillj kompleman aktivasyon sistemini inhibe edebilme kabiliyetleri için görüntülenebilmektedir. Çesitli MASP-1, MASP-2 ve MASP-3 antikorlarlZlliteratürde açlElanmlgtlE ve bazEElyeni üretilmistir, bir klîmübe asag. TABLO 3'de listelenmektedir. Bu örnek teskil eden MASP antikorlarüburada açllZlanan deneyler kullanllârak LEA-1 veya LEA-2'ye bagIilEkompleman aktivasyon sistemini inhibe edebilme kabiliyetleri için görüntülenebilmektedir. Örnegin burada Örnek 11-13'de açllZIandigllîüzere, MASP-Z'ye bagIlEkompleman aktivasyonunu bloke eden anti-tavsan MASP-2 Fab2 antikorlar tanIiIanmlStlEl Örnek 14'de açllgandglîüzere, MASP-Z'ye bagIiIElkompleman aktivasyonunu bloke eclen tamamen insan MASP-2 scFv antikorlarEl tanIilanmIStlE Örnek 15'de açllZlandiglEüzere, MASP-3 antikorlarEüretilmistir. LEA-1 veya LEA-2'nin bir inhibitörü olarak islev gösteren bir MASP antikoru belirlendiginde, burada açllZland[gEilizere bir farmasötik bilesimde kullanllâbilmektedir ve aynlIz'amanda TABLO 2'de belirtildigi üzere ve aynlîzamanda burada açlEIandlglEüzere bispesifik ve trispesifik inhibitör maddelerini üretmek Için kullanllâbilmektedir (bkz. örn. Örnek 8).

TABLO 3: MASP-l, MASP-Z ve MASP-3' ÖZGÜ ANTIKORLAR HEDEF ANTIJEN ANTIKOR TÜRÜ REFERANS MASP-Z Rekombinant MASP-Z Stan Poliklonal Peterson, S.V., ve ark., Mol.

CCP1/2-SP fragmanEGMoAb of Immunol.Methods 282:159- 855) 167, Moller-Kristensen, M., ve ark., J. çapraz reaksiyona 167, 2003 girmektedir) MASP-Z hMASP-Z Fare MoAb (5/ P) Fare MoAb (N- Peterson, S.V., ve ark., Mol. alanm dizisi ile dokümanEI üretilen Nimoab 101 his isaretli) dizisi M ile dokümani] üretilen Nimoab104 hibridom hücre dizisi üretilen Nimoab108 hibridom hücre dizisi üretilen Nimoab109 hibridom hücre dizisi üretilen Nimoab110 MASP-2 Slgn MASP-2 (tam MASP-2 Fab2 antikor Örnekler 11-12 uzunluk) fragmanlarEl MASP-Z hMASP-Z (tam uzunluk) Tamamen insan scFv klonlarEi Örnek 14 MASP-l hMASP-Z (tam uzunluk) Fare MoAb'Ier: Terai I. ve ark., Clin Exp üretilen MoaAb'ler 1E2 ve 2811 MoAb1E2: Hycult Biotech'den (MASP-2 ile çapraz reaksiyona ticari olarak edinilebilmektedir girmemektedir). Her iki abs, Kat#HM2092 MoAbZB 11: Hycult MASP-l ve MASP-2'e ortak agIE Biotech'den ticari olarak zinciri tanIlamaktadlE edinilebilmektedir: Kat#HM Fare MoAb 4C2 Endo M. ve ark., Nephrol Dial MASP-l hMASP-2 (tam uzunluk) MASP-l tavuk ab'ler Örnek 15 MASP-3 hMASP-2 (tam uzunluk) Fare MoAb'Ier: MoAb-7D8; Skjoedt ve ark., Immunobiology MoAb-5H3 MOAb-7D8 ve mAb- 5H3, MASP-3'e özgüdür, digerleri MASP-l ile çapraz reaksiyona girmektedir MASP-3 hMASP-z (tam uzunluk) Slçian MoAb 38: 12-3, MASP-l'i Moller-Kristensen ve ark., Int tanilamamaktadEl Immunol 19: 141 (2007); Hycult Biotech'den ticari olarak edinilebilmektedir: Kat#HM MASP-3 tavuk ab'ler Örnek 15 i. AzaltilBilQefektör islevine sahip MASP antikorlarü Bazü durumlarda, burada açilZlanan MASP antikorlarÇi klasik kompleman yolunun aktivasyonundan ortaya çllZhbilen inflamasyonu azaltmak için azaltllü1lg efektör islevine sahiptir. Klasik kompleman yolunun tetiklenmesi için olan IgG moleküllerinin kabiliyetinin, molekülün Fc bölümü içerisinde kaldigilîgliösterilmistir (Duncan, A.R., ve ark., Nature 332:738- 740 (1988)). Molekülün Fc bölümünün, enzimatik bölünme ile çilZlarliglEIgG molekülleri, bu efektör fonksiyonundan yoksundur (Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 örnegine bakIiî). Dolayma, azaltilîhlg efektör fonksiyonuna sahip olan antikorlar, insan IgG2 veya IgG4 izotipi olarak efektör fonksiyonunu minimize eden genetik olarak degistirilmis bir PC sekans. sahip olarak, molekülün Fc bölümünden mahrum olmasi. bir sonucu olarak olusturulabilmektedir.

Azaltilüîiglefektör islevine sahip olan antikorlar, Jolliffe ve ark., Int'l Rev. Immunol. 10:241- edildigi gibi IgG aglEizincirlerinin Fc bölümünün standart moleküler biyolojik manipülasyonu tarafIan üretilebilmektedir. Azaltilüîlgl efektör islevine sahip olan antikorlar ayrlîla, kompleman aktif hale getirebilen ve/veya Fc reseptörleri ile iletisime geçebilen azaltilîhigi bir kabiliyete sahip olan insan IgG2 ve 1964 izotiplerini de içermektedir (Ravetch, J.V., ve ark., izotiplerinden olusan insan MASP-1, MASP-2 veya MASP-3'e özgü insanlastlEIIBilgl veya referansIa tarif edildigi gibi teknikte sßdan tecrübeye sahip bir kisi tarafIan bilinen çesitli yöntemlerden bir tanesi ile üretilebilmektedir. ii. MASP antikorlar. üretimi MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 antikorlarDMASP-l, MASP-2 veya MASP-3 polipeptitleri (örn. tam uzunlukta MASP-1, MASP-1 veya MASP-3) kullanilârak veya antijenik MASP-1, 2 veya 3 epitop taslîlîiîpeptitler (örn. MAP-2 polipeptidin bir bölümü) kullanilarak üretilebilmektedir.

Immünojenik peptitler, bes amino asit kallEtlgleadar küçük olabilmektedir. Örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASI:5'in tüm amino asit sekansIEliçeren MASP-2 polipeptidi, bulusun yönteminde kullanlSIEblan anti-MASP-2 antikorlarII indüklenmesi için kullanilâbilmektedir.

TABLO 2'de belirtildigi üzere CUBI ve CUBI-EGF alanlarlîgibi protein-protein etkilesimlerinde dahil edildigi bilinen özel MASP alanlarElve bunun yanEIslû, serin-proteaz aktif alanIEl kapsayan bölge, teknikte iyi bilinen ve antijenler olarak kullanilân yöntemler kullanilarak rekombinant polipeptitler olarak ifade edilebilmektedir. Ek olarak, MASP-1 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) veya MASP-2 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: ) veya MASP-3 polipeptidinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) en az 6 amino asidinin bir bölümünü içeren peptitler, sßslýla MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 antikorlarIEindüklemek için kullanlSIIB AntikorlarI yükseltilmesi için kullanllân MASP peptitleri ve polipeptitleri, dogal polipeptitler veya rekombinant veya sentetik peptitler ve katalitik olarak aktif olmayan rekombinant polipeptitler olarak izole edilebilmektedir. MASP antikorlarII üretilmesi için kullanglüilan antijenler ayri& bir immünoglobulin polipeptit ile veya maltoz baglaylîübrotein ile bir MASP polipeptidin füzyonlarElveya bunlar. bir bölümü gibi füzyon polipeptitlerini içermektedir. Polipeptit immünojeni, tam uzunluga sahip bir molekül veya bunlari bir bölümü olabilmektedir. Polipeptit bölümünün, hapten benzeri olmasiZhaIinde, bu tarz bir bölüm, immünizasyon için makromoleküler bir taslýlîiýla (laparoskopik deniz salyangozu hemosiyanini (KLH), bovin serum albumini (BSA) veya tetanoz toksoidi gibi) avantajllîbir sekilde birlestirilebilmektedir veya baglanabilmektedir. iii. Poliklonal antikorlar MASP-1, MASP-2 veya MASP-3'e karsßlan poliklonal antikorlar, MASP-1, MASP-2 veya MASP- 3 polipeptidi ile veya teknikte tecrübe sahibi kisiler tarafldan iyi bilinen yöntemler kullaniiârak bunlarI immünojenik bir bölümü ile bir hayvanlEl immünize edilmesi sayesinde hazEliainabilmektedir. Bkz. örn. Green ve ark., "Production of Polyclonal Antisera," in hidroksit veya Freund destekleyicisi (tamamlanmgl veya tamamlanmamlg) gibi mineral jellerini, Iizolesitin, pluronik polioller, polianyonlar, yag emülsiyonlarüKLH ve dinitrofenol gibi yüzey aktif maddeleri içeren bir destekleyicinin kullanlüsayesinde arttßlâbilmektedir.

Poliklonal antikorlar genellikle atlar, Inekler, köpekler, tavuk, slglan, fare, tavsan, kobay, keçi veya koyun gibi hayvanlarda arttlElBiaktadlEl Alternatif olarak, mevcut bulusta kullanlgllînan bir anti-MASP antikoru, bir insan olmayan primattan da türetilebilmektedir. Babunlarda kullaniglüntikorlarl tan @l olarak ve terapötik olarak arttElIÜiasI yönelik genel teknikler, Goldenberg ve ark., WC 91/ 11465 SayUJDUIuslararasüPatent YayIÜ/e Losman, M.J., ve ark., antikorlarEliçeren serumlar daha sonrasIda teknikte iyi bilinen standart prosedürler kullanllârak, bu tarz immünize hayvanlar. kanlEUan üretilmektedir. iv. Monoklonal antikorlar Bazülurumlarda, LEA-2 inhibitör maddesi, bir MASP-Z monoklonal antikordur ve/veya LEA-1 inhibitör maddesi, bir MASP-3 monoklonal antikordur veya bir MASP-l monoklonal antikordur. Yukari açlEland[giElgibi, bazEIdurumlarda MASP-l, MASP-Z e MASP-3 monoklonal antikorlarÇltek bir MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 epitopuna yönlendirilen yüksek derecede spesifik antikorlardlEl Burada kullanlglîüzere, “monoklonal“ terimi, antikorlar. büyük ölçüde homojen olan bir popülasyonundan elde edildigi gibi antikor karakterini belirtmektedir ve herhangi bir özel yöntem ile antikorun üretimini gerektirdigi üzere açlEIanan hibridom yöntemi gibi kültürde arallllelîl hücre dizileri ile antikor moleküllerinin üretimini saglayan herhangi bir teknik kullanilârak elde edilebilmektedir veya rekombinant DNA yöntemlerle olusturulabilmektedirler (bkz. örn. ABD 4,816,567 SaylillPatent Dokümanü kullanilârak faj antikor kütüphanelerinden izole edilebilmektedir. Bu tarz antikorlar, IgG, IgM, olabilir. Örnegin, monoklonal antikorlar, bir MASP-l polipeptidini, bir MASP-2 polipeptidini veya bir MASP-3 polipeptidini veya bunlarlEl bir bölümünü içeren bir bilesimle uygun bir memeliye (ör. bir BALB/c faresi) enjekte edilmesi ile elde edilebilmektedir. Önceden belirlenmis bir süre zarflEtlan sonra, Splenositler, fareden çilZlartlIJB ve bir hücre kültürü ortamIa asklýh allEtnaktadlE Splenositler daha sonrasIa bir hibridomun olusturulmasüçin ölümsüz bir hücre dizisi ile kaynasllZl hale getirilmektedir. Olusturulan hibridomlar, MASP-l, MASP-2 veya MASP-3'e karsünonoklonal bir antikorun olusturulmasEkabiliyetIeri için hücre kültüründe büyütülmekte ve görüntülenmektedir. (Bkz. aynüamanda Current Protocols in Immunology, Insan monoklonal antikorlar, antijenik baglgliülga yanlEaI olan spesifik Insan antikorlarII üretilmesi için degistirilmis olan transjenik farenin kullanIiElsayesinde elde edilebilmektedir.

Bu teknikte, insan immünoglobulin aglîl ve hafif zincirli loküsün elementleri endojen immünoglobulin agE zincirli ve hafif zincirli mekanI hedeflenen parçalanmalarIEliçeren embriyonik kök hücrelerinden türetilen farelerin dizilerine dahil edilmektedir. Transjenik fareler, burada tarif edilen MASP-2 antijenleri gibi insan antijenlerine özgü insan antikorlarID sentezleyebilir ve fareler, bu tarz hayvanlardan gelen B-hücrelerinin, geleneksel Kohler- Milstein teknolojisi kullanilârak uygun miyelom hücre dizilerine kaynasllîl hale getirilmesi ile insan MASP-2 antikor salgllâylajiibridomlarl üretilmesi için kullanlßbilmektedir. Transjenik farelerden insan antikorlarIlB] elde edilmesi için var olan yöntemler, örnegin Green, L.L., ve ve ark., Int. Immun. 6:579, 1994 tarafian tarif edilmektedir.

Monoklonal antikorlar, çesitli iyi olusturulan teknikler ile hibridom kültürlerinden izole edilebilmekte ve saflastlîllâbilmektedir. Bu tarz izolasyon teknikleri, Protein-A sefaroza, boyut dlglama kromatografisine ve iyon degisim kromatografisine sahip olan affinite ark., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, The Humana Üretildiklerinde, poliklonal, monoklonal veya faz türevi antikorlar ilk olarak spesifik MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 baglantEü/eya istenildigi yerde çift MASP-1/3, MASP-2/3 veya MASP- 1/2 baglantlîü için test edilmektedir. Bir antikorun, bir protein antijenine baglanlöl baglanmamasII belirlenmesine yönelik yöntemler ve/veya bir antikorun bir protein antijenine olan affinitesi, teknikte bilinmektedir. Örnegin bir antikorun bir protein antijenina baglanmasüörnegin klglfliaylEEblmayacak sekilde Western blotu, nokta blotu, plazmon yüzey rezonan yöntemi (örn. BIAcore system; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Isveç ve Piscataway, NJ) veya enzime bagllîlbaglgllîlllg deneyleri (ELISA) gibi çesitli teknikler kullanlßrak tespit edilebilmekte ve/veya ölçülebilmektedir. Bkz. örn. Harlow ve Lane (1988) N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press Freeman ve C0., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford MASP monoklonal antikorlar. affinitesi, teknikte tecrübe sahibi bir kisi tarafIan hali hazlîdla yöntemleri için kullanlSIlîtblan MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 monoklonal antikorlar, <100 nM olan, tercihen <10 nM olan ve en çok tercih edilecek sekilde <2 nM olan bir baglama affinitesi ile MASP-l, MASP-2 veya MASP-3'e baglanmaktadlEI AntikorlarlEl, MASP-l, MASP-2 veya MASP-3'e spesifik olarak bagland[glübelirlendiginde, MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 antikorlarüörnegin TABLO 2'de açüîlandlgllîüzere bir kaç islevsel deneyinden birisinde bir LEA-1 inhibitör maddesi veya bir LEA-2 inhibitör maddesi olarak islev gösterebilme kabiliyeti için test edilmektedir. Örnegin antikorlarlEl, TABLO 2'de açlElandEglgibi çesitli deneylerden birisinde (örn. bir lektine özgü C4 bölünme deneyi (Örnek 8 veya Örnek 9'da açlEIanan deneyi) veya bir C3b birikim deneyi (örnegin Örnek 4 veya Örnek 11'de aç[lZIanan deney) bir LEA-2 inhibitör maddesi olarak islev gösterebilme kabiliyeti için test edildigi belirlenmistir. Bir diger örnek olarak, MASP-1 veya MASP-3'e spesifik olan antikorlar, TABLO 2'de açllZIandgEgibi çesitli deneylerden birisinde (Örnek 5'de aç[lZland[g]I:l gibi ölçülen hemolizin azaltllüiasEli/eya örnegin Örnek 4 ve Örnek 11'de aç[E]and[gll:lgibi ölçülen C3 bölünmesinin ve C3b birikiminin azaltliBiaslIl bir LEA-2 inhibitör maddesi olarak islev gösterebilme kabiliyeti için test edilmektedir. v. Kimerikzinsanlastlîlmîlg antikorlar Bulusun yönteminde kullanlSlElolan monoklonal antikorlar, aglEl ve/veya hafif zincirin bir bölümünün, belirli türlerden türeyen antikorlarda ilgili sekanslarla benzer oldugu veya bu sekanslara homolog oldugu veya belirli bir antikor 5.- veya alt SI- ait oldugu kimerik antikorlarDiçerirken, zincirlerin geri kalanÇI diger türlerden türetilen antikorlarda ilgili sekanslarla benzerdir veya bu sekanslara homologdur ve bu tarz antikorlarI parçalarII yanIZI sü, bir diger antikor 5.- veya ait 5.- aittir (ABD 4,816,567 sayiIJDJatent dokümanü Bulusta kullanlsllîblan bir kimerik antikorun bir formu, insanlastülüilg) monoklonal MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 antikorudur. Insan olmayan (örn. mürin) antikorlarI insanlastlIlIIhS formlarÇl insan olmayan immünoglobulinden türeyen minimal sekansEIiçeren kimerik antikorlardE Insanlastmlgmonoklonal antikorlar, insan olmayan (örn. fare) tamamlaylEJDEl belirleyici bölgelerin (CDR), fare immünoglobulinin aglElve hafif degisken zincirlerinden, bir Insan degiskeni alana aktarllfnaslîlile üretilmektedir. Tipik olarak, insan antikorlarII kallEtllârü daha sonrasIa insan olmayan emsallerinin çerçeve bölgelerinde ikame edilmektedir. Dahasüinsanlastlîlßilgl antikorlar, allEElantikorda veya donör antikorunda bulunmayan kallEtllârEl içerebilmektedir. Bu modifikasyonlar, antikor performansli saflastlEllBiasülçin olusturulmaktadB Genelde insanlastlEllüilgantikor, tüm veya büyük ölçüde tüm hiper degisken döngülerin bir insan olmayan immünoglobulininkilere tekabül ettigi ve tüm veya büyük ölçüde tüm Fc çerçeve bölgelerinin, bir insan immünoglobulin sekansIlEkiler oldugu büyük ölçüde tüm, en az bir ve genellikle iki degisken alanEliçerecektir.

InsanlastlEllBwlSJantikor tercihe bagllîiblarak tipik bir sekilde bir insan immünoglobulininki olan bir immünoglobulini sabit bölgenin (Fc) en az bir bölümünü içerecektir. Detaylar için, bkz.

Bulusta kullanlgllîihsanlastlîllm@antikorlar, en az bir MASP-l, MASP-2 veya MASP-3 baglaylîEl CDR3 bölgesini içeren insan monoklonal antikorlarüçermektedir. Ek olarak, Fc bölümleri, insan IgG antikorlar.. yanEtß, IgA veya IgM'nin üretilmesi için degistirilebilmektedir. Bu tarz insanlastlEllmEl antikorlar, belirgin bir sekilde insan MASP-l, MASP-2 veya MASP-3'ü tanIilayacagü fakat antikorun kendisine karslZlinsanlarda bir immün yan- neden olmayacaglZliçin, belirli klinik kullanIia sahip olacaktE Sonuç olarak, özellikle tekrar edildiginde veya uzun dönemli uygulama gerekli oldugunda, Insanlarda in i/i'i/o uygulama için daha uygun olacaklardE Insanlastliîlllüîlglmonoklonal antikorlar. üretilmesine yönelik teknikler, örnegin P.T., ve ark., Mature ; (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995); Kelley, Patent DokümanÇlQueen, 1997 tarafIan açlKlanmaktadlB Ek olarak, Protein Design Labs (Mountain View, CA) gibi spesifik mürin antikor bölgelerinden insanlastlEIIlE1l$ antikorlarEl sentezleyecek olan ticari kuruluslardlü vi. Rekombinant antikorlar MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 antikorlarEl ayrlîla rekombinant yöntemler kullanilârak olusturulabilmektedir. Örnegin, insan antikorlar, insan antikorlar.. parçalarII (VH, VL, Fv, Faktör D, Fab veya F(ab')2) üretilmesi için insan immünoglobulin ekspresyon kütüphaneleri (örnegin Stratagene, Corp., La Jolla, CA firmasIa mevcut) kullanilârak olusturulabilmektedir. Bu parçalar daha sonrasiEUa kimerik antikorlarI üretilmesi için olanlara benzer teknikler kullanüârak tüm insan antikorlarII olusturulmasEl için kullanüîhaktadlü vii. Anti-idivotiD antikorlar MASP-l, MASP-Z veya MASP-3 antikorlarüistenilen inhibitör aktivitesi ile tan”land[gla, bu antikorlar, teknikte iyi bilinen teknikler kullanllârak MASP-l, MASP-Z veya MASP-3'ün bir bölümüne benzeyen anti-idiyotip antikorlarII olusturulmaslîiçin kullanllâbilmektedir. Bkz. örn. Greenspan, N.S., ve ark., FASEB J. 7:437, (1993). Örnegin, MASP-2'ye baglanan ve kompleman aktivasyonu için gerekli olan bir MASP-2 protein etkilesimini engelleyen antikorlar, MASP-Z proteininde MBL baglaylîlllana benzeyen ve bu sekilde, MBL gibi MASP- 2'nin baglaylEElbir Iigandlübaglayan ve nötrlestiren anti-idiotiplerinin olusturulmaslîliçin kullanllîhaktadlîl viii. Immünoqlobulin fraamanlarEl Bulusun yönteminde kullanlgllîlolan MASP-Z ve MASP-3 inhibitör maddeleri sadece bozulmamlglimmünoglobulin moleküllerini kapsamaz, aynüamanda Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 ve Fv fragmanlarIÇl scFv fragmanlarIÇl diakorlarljlineer antikorlarÇl tek Zincirli antikor moleküllerini ve antikor fragmanlarlEtlan olusturulan multispesifik (örn. bispesifik ve trispesifik) antikorlarIEiçeren iyi bilinen fragmanlarüla kapsamaktadlEl Bir antikor molekülü olan paratopun sadece küçük bir bölümünün, epitopuna antikorun baglanmaletla dahil edilmesi, teknikte iyi bilinmektedir (bkz. örn. Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). Antikorun pFc' ve Fc bölgeleri, klasik kompleman yolun efektörleridir, fakat antijen bagIa dahil edilmemektedir. pFc' bölgesinin enzimatik olarak bölündügü veya pFc' bölgesi olmadan üretilen bir antikor, bir F(ab')2 fragmanmlarak tasarlanmakta ve bir bozulmamlglantikorunun antijen baglaylEEbölgeIerinin her ikisini tutmaktadlEl Izole bir F(ab')2 fragmanÇliki antijen baglaylEElalan-an dolayübir bivalent monoklonal parça olarak ifade edilmektedir. Benzer bir sekilde, Fc bölgesinin enzimatik olarak bölündügü veya Fc bölgesi olmadan üretilen bir antikor, bir Fab fragmanüolarak tasarlanmakta ve bir bozulmamlgl antikor molekülünün antijen baglaylîübölgelerinden bir tanesini tutmaktadE Antikor fragmanlarügeleneksel yöntemlerle tüm antikorlarI pepsin veya papain sindirimi ile oldugu gibi proteolitik hidroliz ile elde edilebilmektedir. Örnegin, antikor fragmanlarüF(ab')z olarak terimlendirilen bir 55 parçasII saglanmasEliçin pepsin ile antikorlarI enzimatik ayrilîhasüsayesinde üretilebilmektedir. Bu fragman, 3.SS Fab' monovalent parçalar.. üretilmesi Için bir tiyol indirgeyici madde kullanHârak ayrllâbilmektedir. Tercihe baglEbIarak ayrIIBia reaksiyonu, disülfir baglantllârII ayrIIBiasIian dogan sülfhidril gruplarlEJI bir bloke edici grup kullanilârak uygulanabilmektedir. Bir alternatif olarak, pepsin kullanan enzimatik bir bölünme, iki monovalent Fab fragmanIElIe bir Fc fragmanllllogrudan üretmektedir. Bu yöntemler, örnegin ABD 4,331,647 SayUJIIPatent DokümanÇlGoldenberg; Nisonoff, A., ve ark., ve 2.10.-2.10.4 sayfalarIda açlKIanmaktadlEI Bazü durumlarda, Fc bölgesinden mahrum antikor parçalarII kullanIiÇl Fc'nin Fcy reseptörüne baglanmasüüzerine baslatilân klasik kompleman yolunun aktivasyonunun engellenmesi için tercih edilmektedir. Birisinin, Fcy reseptör etkilesimlerini engelleyen bir monoklonal antikor üretebildigi çesitli yöntemler mevcuttur. Örnegin, monoklonal bir antikorun Fc bölgesi, örnegin Fab veya F(ab)2 parçalarlîlgibi antijen baglaylEIZIantikor parçalarII üretildigi sekilde, proteolitik enzimler (fisin sindirimi gibi) sayesinde kisim sindirim kullanilârak kimyasal olarak çIKartllâbilmektedir (Mariani, M., ve ark., Mol. Immunol. 28:69- 71, (1991)). Alternatif olarak, FCy reseptörlerini baglamayan insan 74 IgG izotipi, burada tarif edildigi gibi insanlastlîJlBilgl bir antikorun olusumu esnasIa kullanüâbilmektedir. Antikorlar, tek zincirli antikorlar ve Fc alanIan mahrum olan antijen baglaylîlllanlarlîbyrü burada tarif edilen rekombinant teknikler kullan llârak tasarlanabilmektedir. ix. Tek zincirli antikor fragmanlarlîl Alternatif olarak, bir kisi, aglEve hafif zincirli Fv bölgelerinin baglandigilJl/IASP-l, MASP-2 eya MASP-3'e özgü peptit zincirli baglaylaîlnolekülleri olusturabilmektedir. Fc fragmanlarütek zincirli bir antijen baglaylîlîbroteinin (scFv) olusturulmasEIçin bir peptit baglaylEEsayesinde baglanabilmektedir. Bu tek zincirli antijen baglaylEEbroteinler, bir oligonükleotid tarafian baglanan VH ve VL alanlarIEkodlayan DNA sekanslarIEilçeren yaplîlal bir genin olusturulmasEl ile hazlEIlanmaktadlE Yapisal gen, E. CO/I. gibi bir konak hücreye sonrasIda dahil edilen bir ekspresyon vektörüne yerlestirilmektedir. Rekombinant konak hücreleri, iki V alanIIZI baglayan baglaylElIlbir peptit ile tek bir polipeptit zincirini sentezlemektedir. ScFv'lerin üretilmesine yönelik yöntemler, örnegin Whitlow, ve ark., "Methodsz A Companion to tarif edilmektedir.

Görsel bir örnek olarak, MASP-3'e özgü bir scFv, in vitro MASP-3 polipeptide, lenfositlerin maruz bßküfhasüie fajda veya benzer vektörlerde (örnegin, immobilize veya isaretli MASP-3 protein veya peptidinin kullanlüsayesinde) antikor gösterge kütüphanelerinin seçilmesi ile elde edilebilmektedir. Potansiyel MASP-3 polipeptit baglaylEEI alanlar. sahip olan polipeptitleri kodlayan genler, fajda veya E. co/i' gibi bakterilerde görüntülenen rast gele peptit kütüphanelerinin görüntülenmesi ile elde edilebilmektedir. Bu rast gele peptit gösterge kütüphaneleri, MASP-3 ile etkilesimde olan peptitlerin görüntülenmesi için kullanüâbilmektedir. Bu tarz rast gele peptit gösterge kütüphanelerinin (ABD 5,223,409 SayIIJJIl SayiIIIIPatent DokümanÇlLardner; ABD 5,571,698 SaylIJIlPatent DokümanüLardner; ve Kay ve ark., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) ve rast gele peptit göstergesi kütüphanelerinin olusturulmasü/e görüntülenmesine yönelik teknikler ve bu tarz kütüphanelerin görüntülenmesine yönelik kitler, örnegin CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass), ve Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.) firmalarlrîha ticari olarak mevcuttur.

Bulusun bu yönünde kullanlgllîrblan bir MASP-3 antikor fragmanII bir diger formu, bir MASP- 3 antijeninde bir epitopa baglanan ve MASP-3'e bagnllîlkompleman aktivasyonunu (örn. LEA- 1) inhibe eden tek bir tamamlayIEUIE belirleyici bölgenin (CDR) bir peptit kodlamasIB Bulusun bu yönünde kullanlgllîblan bir MASP-l antikor fragmanII bir diger formu, bir MASP- 1 antijeninde bir epitopa baglanan ve MASP-3'e bagilükompleman aktivasyonunu (örn. LEA- 1) inhibe eden tek bir tamamlaylElHEl belirleyici bölgenin (CDR) bir peptit kodlamasIE Bulusun bu yönünde kullanlglüilan bir MASP-2 antikor fragmanII bir diger formu, bir MASP- 2 antijeninde bir epitopa baglanan ve MASP-2'ye bagIiIEkompleman aktivasyonunu (örn.

LEA-2) inhibe eden tek bir tamamlaylEIHKl belirleyici bölgenin (CDR) bir peptit kodlamasIlü CDR peptitleri (“minimum tanllama birimleri“), ilgili bir antikorun CDR'sini kodlayan genlerin olusturulmasEiIe elde edilebilmektedir. Bu tarz genler, örnegin antikor üreten hücrelerin RNA'sIan degisken bölgenin sentezlenmesi için polimeraz zincir reaksiyonu kullanllârak hazlîllanmaktadlîl(bkz. örn. Larrick ve ark., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering ve Clinical Application, Ritter ve ark. (eds.), sayfa 166, Cambridge University Press, (1995); ve Ward ve ark., "Genetic Manipulation ve Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles ve Applications, Birch ve ark. (eds.), sayfa 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

Burada açiElanan MASP antikorlarÇl LEA-l, LEA-2 veya LEA-1 ve LEA-2 kompleman aktivasyonunun bir kombinasyonunu inhibe etmek için buna ihtiyacEloIan bir denege uygulanmaktadlB BazÜdurumlarda, MASP inhibitör maddesi, azaltilBilgefektör islevle yüksek affiniteli insan veya insanlastlEllPnlgmonoklonal MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 antikordur. x. Bispesifik antikorlar Bulusun yönteminde kullanlgllîcblan MASP-2 ve MASP-2 inhibitör maddeleri, multispesifik (örn. bispesifik ve trispesifik) antikorlarlZlkapsamaktadlE] Bispesifik antikorlar, en az iki farklIZI antijene yönelik baglama özgüllügüne sahip olan, tercihen insan veya insanlastlElIhlg monoklonal antikorlardlB Yukarlâa açilîlandigiü/e TABLO 2'de gösterildigi gibi, bir durumda yöntem, MASP-Z'ye yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. CCP1-CCP2'den en az birisine veya MASP-2'in serin proteaz alan. baglanma) ve MASP-3'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-3'ün serin proteaz alan. baglanma) içeren bir bispesifik antikorun kuIIai'iIiIEIiçermektedir. Bir diger durumda, yöntem, MASP-l'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-1'in serin proteaz alan. baglanma) ve MASP-Z'ye yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. CCP1-CCP2'den en az birisine veya MASP-Z'nin serin proteaz alan. baglanma) içeren bir bispesifik antikorun kullanIIEiçermektedir. Bir diger durumda, yöntem, MASP-1'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-l'In serin proteaz alanlEb baglanma) ve MASP-3'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-3'ün serin proteaz alan. baglanma) içeren bir bispesifik antikorun kullanIiIEIçermektedir. Bir diger durumda, yöntem, MASP-l'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-1'in serin proteaz alan. baglanma) ve MASP-Z'ye yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. CCP1-CCP2'den en az birisine veya MASP-Z'nin serin proteaz alan_ baglanma) ve MASP-3'e yönelik bir baglanma özgüllügünü (örn. MASP-3'ün serin proteaz alan. baglanma) içeren bir trispesifik antikorun kullanIiIEiçermektedir.

Bispesifik antikorlar. olusturulmasIEia yönelik yöntemler, teknikte tecrübe sahibi kisiler tarafIdan ele allEmaktadlB Geleneksel olarak, bispesifik antikorlar. rekombinant üretimi, iki aglElzincirin, farkllîdizgüllüklere sahip oldugu iki immünoglobulin agEzincir/hafif zincir çiftinin baglaylîlîlözgülükleri (antikor-antijen birlestirici alanlar) ile antikoru degisken alanlar, immünoglobulin sabit alanESekanslar- kaynasllg hale getirilebilmektedir. Füzyon tercihen destek, mentese, CH2, ve CH3 bölgelerin en azIan bir kEtnIEiçeren bir immünoglobulin aglEl zincirli sabit alana sahiptir. Immünoglobulin aglElzincirli füzyonlarljkodlayan DNA'Iar ve istege bagllîblarak, immünoglobulin hafif zincir, ayrEIekspresyon vektörlerine yerlestirilmekte ve uygun bir konak organizmas- birlikte transfekte edilmektedir. Bispesifik antikorlar. üretilmesine yönelik mevcut olarak bilinen açlElayEZyöntemlerinin kapsamlarljçin, bkz. örn. 147:60 (1991). Bispesifik antikorlar aynElzamanda çapraz baglElveya heterokonjügat antikorlarüiçermektedir. Heterokonjügat antikorlar, herhangi bir uygun çapraz baglaylîlîl yöntemler kullanlßrak olusturulabilmektedir. Uygun çapraz baglaylEIZmaddeler teknikte iyi bilinmektedir ve bir dizi çapraz baglaylîlîlteknik ile birlikte ABD 4,676,980 sayiüIlpatent doküman a tarif edilmektedir.

Rekombinant hücre kültüründen dogrudan bispesifik antikor fragmanlar.. olusturulmas- ve izole edilmesine yönelik çesitli teknikler açiElanmlStE Örnegin, bispesifik antikorlar, Iösin ( referanslîile tarif edilen “antikor“ teknolojisi, bispesifik antikor fragmanlar.. olusturulmasi yönelik alternatif bir mekanizmayßaglamßtlû Fragmanlar, aynüincirde bulunan iki alan arasIaki eslesmeye olanak saglamasEiçin çok kEti olan bir baglaylEEile hafif zincirli degisken bir alana (VL) baglanan aglElzincirli degisken bir alanüVH) içermektedir. Dolaylîlýla, bir fragman. VH ve VL alanlarüiki antijen baglayEEBIanI olusturuldugu sekilde, bir diger parçanI kompleman VL ve VH alanlarüle eslesmeye zorlanmaktadlEI Bispesifik tüm antikorlar. aksine bispesifik diakorlar aynlZl zamanda, E.coli'de hali hazlîrlia olusturulabilmelerinden ve eksprese edilebilmelerinden dolayElözeIIikle kullanlgllîlolabilmektedir. Uygun baglaylEElözgüllüklerin diakorlarlîllve antikor fragmanlarügibi birçok diger polipeptit), kütüphanelerden faj göstergesi (WO94/13804) kullanllârak hali hazEla seçilebilmektedir. Diakorun bir kolunun, örnegin X antijenine karsEI yönlendirilen bir özgüllükle sabit tutulmasEl halinde, diger kolun çesitlendirildigi ve uygun özgüllüge sahip bir antikorun seçildigi bir kütüphane olusturulabilmektedir.

Tek zincirli Fv (scFv) dimerlerinin kullanlü ile bispesifik antikor fragmanlar.. olusturulmasi yönelik bir diger strateji bildirilmistir. (bkz. örn. Gruber ve ark. J. Immunol., açllZland[gEiüzere, bu antikorlar, antijen baglaylîEliJölgelerin bir çiftini olusturan tandem Faktör D segmentlerinin (VH-CHI-VH-CHI) bir çiftini içermektedir. Lineer antikorlar, bispesifik veya monospesifik olabilmektedir. Bulusun yöntemleri aynüamanda Wu ve ark., Nat Biotechnol (DVD-lg) molekülleri gibi bispesifik antikorlarI varyant formlarII kullanlIEI kapsamaktadlEl DVD-Ig molekülleri, iki farklßna antikorlardan iki farklElhafif zincirli degisken alanI (VL), rekombinant DNA teknikleri ile tandemde dogrudan veya bir klgla baglaylEEI vaslßsüla baglandlglîlsekilde tasarlanmaktadlîl bunu sonra hafif zincirli sabit alan takip etmistir. Iki ana antikordan DVD-Ig moleküllerin üretilmesine yönelik yöntemler, örnegin v1. PEPTIT OLMAYAN INHIBITÖRLER Bazüjurumlarda, MASP-3 veya MASP-2 inhibitör maddesi, bir MASP-3 veya bir MASP-2 veya bir MASP-1 inhibitör peptit veya MASP-3'ün veya MASP-Z'nin veya MASP-1'in bir peptit olmayan inhibitörüdür. Peptit olmayan MASP inhibitör maddesi, intraarteriyel, intravenöz, intramüsküler, subkütanöz veya diger parenteral uygulama ile oldugu gibi veya oral uygulama ile denege sistematik olarak uygulanabilmektedir. MASP inhibitör maddesi, kronik bir kosulun tedavisi veya kontrolü için genisletilmis bir süre zarfII üzerinde periyodik olarak uygulanabilmekte veya akut travmasüleya hasarEöncesinde, esnasIa veya sonrasIa olan bir süreçte tekli olabilir veya tekrar edilen bir uygulama olabilmektedir.

VII. FARMASÖTIK BILESIMLER VE TASIMA YÖNTEMLERI Bir diger yönünde bulus, PNH gibi hemolitik bir hastal[than muzdarip olan bir sujede MASP- 3'e bagIilEkompleman aktivasyonunun olumsuz etkilerinin inhibe edilmesine yönelik olan, MASP-3'e bagIIEkompleman aktivasyonunu inhibe etmek için etkili bir MASP-3 inhibitör maddesinin bir miktarIEliçeren bir bilesimin denege uygulanmasIEliçeren bilesimleri saglamaktadlE] Bazlîcliurumlarda, yöntem aynûamanda bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir bilesimin denege uygulanmasIEiçermektedir. MASP-3 ve MASP-2 inhibitör maddeleri, MASP-3'e bagIilElkompIeman aktivasyonu (LEA-1 ve tercihe baglElolarak aynüzamanda MASP-Z'ye bagIiIEkompleman aktivasyonu (LEA-2) ile iliskili olan kosullar. tedavi edilmesi veya hafifletilmesi için terapötik olarak etkili dozlarda bunlara ihtiyacElolan bir hastaya uygulanabilmektedir. Terapötik olarak etkili bir doz, MASP-3 inhibitör maddesinin miktarIlEl'e kosulun semptomlarlEJI hafifletilmesi ile sonuçlanmasüiçin yeterli bir MASP-3 inhibitör maddesinin ve bir MASP-2 inhibitör maddesinin bir kombinasyonunu Ifade etmektedir.

MASP-3 ve MASP-2 inhibitör maddelerinin toksisite ve terapötik verimliligi, deneysel hayvan modellerini kullanan standart farmasötik prosedürlerle belirlenebilmektedir. Bu tarz hayvan modelleri kullanilârak, NOAEL (herhangi bir yan etki seviyesi gözlemlenmemistir) ve MED (minimal olarak etkili doz), standart yöntemler kullanilârak belirlenebilmektedir. NOAEL ve MED etkileri arasIa olan doz oranÇlNOAEL/MED oranljblarak ifad eedilen terapötik orandlEl En çok genis terapötik oranlar veya isaretler sergileyen MASP-3 inhibitör maddeleri ve MASP- 2 inhibitör maddeleri tercih edilmektedir. Hücre kültürü deneylerinden ve hayvan çallglnalarian elde edilen veriler, insanlarda kullanIi için dozajlarI bir arallgill formüle edilmesinde kullanliâbilmektedir. MASP-3 inhibitör maddesinin dozajEltercihen küçük bir toksisite ile veya herhangi bir toksisite olmadan MED içeren dolasan konsantrasyonlarI bir arallîgilîliçerisinde bulunmaktadlEl Dozaj, kullanllân dozaj formuna ve kullanEIân uygulama yoluna baglßlan araliEJiçerisinde degisiklik gösterebilmektedir.

Herhangi bir bilesik formülasyonu için, terapötik olarak etkili bir doz, hayvan modelleri kullanilârak tahmin edilebilmektedir. Örnegin, bir doz, MED içeren, dolasan bir plazma konsantrasyon aralfgil ulasilEnasEiçin bir hayvan modelinde formüle edilebilmektedir.

Plazmada MASP-3 inibitör maddesinin veya MASP-2 inhibitör maddesinin kantitatif seviyeleri de örnegin yüksek performans süromatografisi ile ölçülebilmektedir.

Toksisite çallginalar- ek olarak, etkili dozaj aynüamanda bir canlßujede MASP-3 veya MASP-2 inhibitör maddesinin bir baglama affinitesinde mevcut hedef MASP proteininin miktar. baglüilarak öngörülebilmektedir.

Normal insan sujelerde bulunan MASP-1 seviyelerinin, 1.48 ila 12.83 ug/mL araI[giIa seviyelere sahip serumda mevcut oldugu bildirilmistir (Terai I. ve ark, Clin Exp Immunol sujelerde ortalama serum MASP-3 konsantrasyonlarIlEl, yaklaslEl2.0 ila 12.9 ug/mL (2013). Normal insan hastalarda bulunan MASP-2 seviyelerinin, 500 ng/ml arallglIa düsük seviyelerde olan serumda mevcut oldugu ve belirli bir hastada MASP-2 seviyelerinin, Moller- belirlenebildigi gösterilmistir.

MASP-Z inhibitör maddelerini içeren, uygulanan bilesimlerin dozajEgenellikle hastanI yaslZl kilosu, boyu, cinsiyeti, genel tlEbi kosulu ve önceki tllîbi geçmisi gibi faktörlere baglüalarak degiskenlik göstermektedir. Bir örnek olarak, MASP-3 inhibitör maddeleri veya MASP-Z inhibitör maddeleri örnegin MASP-3 antikorlarüMASP-l antikorlarü/eya MASP-2 antikorlarDJ bir dozajda uygulanabilmektedir. BazIZIdurumlarda, MASP-2 inhibitör maddeleri (örnegin MASP-2 antikorlarDÇl denegin vücut aglElllglEtinsinden tercihen yaklaslIZ] 0.10 ila 10 mg/kg, aral[gllEda uygulanmaktadlü BazEdurumlarda, MASP-l inhibitör maddeleri (örnegin MASP-1 antikorlarDîl veya MASP-3 inhibitör maddeleri (örnegin MASP-3 antikorlarm denegin vücut ila 1.0 mg/kg, daha çok tercih edilecek sekilde 0.010 ila 0.1 mg/kg arallgll dozajda uygulanmaktadlB Tercihe baglEbIarak MASP-2 inhibitör bilesimleriyle kombinasyon halinde MASP-3 inhibitör bilesimlerinin veya tercihe bagllîblarak MASP-2 inhibitör bilesimleri ile kombinasyon halinde MASP-l inhibitör bilesimlerinin terapötik verimliligi ve sunulan bir sujede mevcut bulusun yöntemleri ve uygun dozajlar, teknikte tecrübe sahibi kisiler tarafIan iyi bilinen kompleman deneyleri ile uyumlu bir sekilde belirlenebilmektedir. TamamlaylEÇl saylglîl özel ürünü olusturmaktadlEI Son on ylljiçerisinde, duyarIEl/e özel deneyler gelistirilmistir ve bunlar, küçük aktivasyon parçalarlîilan C3a, C4a ve C5a ve büyük aktivasyon parçalarüC3b, C4d, Bb ve sC5b-9 dahil olmak üzere bu aktivasyon ürünlerinin çogu için ticari olarak mevcuttur. Bu deneylerin çogu, parçada ifsa edilen yeni antijenlerle (neoantijenler) reaksiyona gire monoklonal antikorlardan faydalanlîJ fakat olusturulduklarünatif proteinlerde olmayacak sekilde, bu deneylerin olusturulmaslîbldukça kolay ve spesifiktir. Radyoimmüno deney hala bazen C3a ve C5a için kullanüBwaleb ragmen, çogu, ELISA teknolojisine dayanmaktadE Bu sonraki deneyler, dolasnda bulunan büyük formlar olan islenmemis parçalarEi/e bunlarI reseptörlerine baglanmaslîile hlZlJbir sekilde temizlenmekte ve bu sekilde, C3adesArgi hücrelere baglanmazken ve plazmada toplanmazken, oldukça düsük konsantrasyonlarda mevcuttur.

C3a ölçümü, kompleman aktivasyonunun duyarllZI yoldan baglslZ bir göstergesini saglamaktadß Alternatif yol aktivasyonu, Bb fragmanII ölçülmesi ve/veya faktör D aktivasyonunun ölçümü ile degerlendirilebilmektedir. Membran saldlEgan yol aktivasyonunun slýEilaz ürününün tespiti ile, sC5b-9, komplemanlEl, tamamlaylîlýla aktif hale getirildigine dair bir kanEsunmaktadE Lektin ve klasik yollar, aynElaktivasyon ürünleri olan C4a ve C4d'yi olusturduklarüçin, bu iki parçanI ölçümü, bu iki yolun, aktivasyon ürünlerini olusturdugu herhangi bir bilgiyi sunmamaktadlE MASP-3'e bagIiIIZkompleman aktivasyonunun inhibisyonu, mevcut bulusun yöntemleri ile uyumlu olan bir MASP-3 inhibitör maddesinin uygulamasIlEl bir sonucu olarak olusan kompleman sistemin bir bileseninde asaglöbki en az bir degisim ile karakterize edilmektedir: LEA-1 aracl[[l]kompleman aktivasyonunun inhibisyonu (hemoliz ve/veya opsonizasyon inhibisyonu); MASP-3 serin proteaz sübstrata özgü bölünme inhibisyonu, hemolizin azaltlEhasÜIörnegin Örnek 5'de açliîland[glügibi ölçülmektedir) veya C3 bölünmesinin ve C3B birikiminin azaltllîhasllörnek 4 ve Örnek 11'de açllZland @Egibi ölçülmektedir).

MASP-Z'ye bagilEkompleman aktivasyonunun inhibisyonu, mevcut bulusun yöntemleri ile uyumlu olan bir MASP-2 inhibitör maddesinin uygulamasII bir sonucu olarak olusan kompleman sistemin bir bileseninde asagülaki en az bir degisim ile karakterize edilmektedir: MASP-Z'ye bagIilEkompleman aktivasyon sistemi ürünleri olan C4b, C3a, C5a ve/veya C5b- 9'un (MAC) (ABD 7,919,094 SaylEIJIlPatent DokümanII Örnek 2'sinde açllgland[g]l:lgibi ölçülmektedir) yap!.. veya üretiminin inhibisyonu, C4 bölünmesinin ve C4b birikiminin (örnegin Örnek 8 veya Örnek 9'da açllZlandlglElgibi ölçülmektedir) azaltllfhaslîlveya C3 bölünmesinin ve C3b birikiminin (örnegin Örnek 11'de açllZland[gll:lgibi ölçülmektedir) azaItIIIhasD i. Farmasötik ta r ve ta Iia vehikülleri Genelde, mevcut bulusun MASP-3 inhibitör maddesi bilesimleri ve MASP-2 inhibitör maddesi bilesimleri veya MASP-Z ve MASP-3 inhibitör maddelerinin bir kombinasyonunu içeren bilesimler, herhangi bir diger seçilen terapötik madde ile birlestirilebilmektedir, farmasötik olarak kabul edilebilir bir taslsîlîlâb uygun bir sekilde dahil edilmektedir. Tasülîütoksik degildir, biyo uyumludur ve MASP-2 inhibitör maddesinin (veya burada birlestirilen herhangi bir diger terapötik maddenin) biyolojik aktivitesini zararlElbir sekilde etkilememesi için seçilmektedir. Peptitlerin örnek teskil eden farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlEßrDABD ,211,657 SayEIJJZl Patent DokümanÇl Yamada referanslda tarif edilmektedir. Burada açilZIandigEüzere bulusta kullanlsllîblan MASP-Z antikorlarEi/e inhibitör peptitleri, katliârda, yarEkatllârda, jelde, 5_ veya oral, parenteral veya cerrahi uygulamaya olanak saglayan tabletler, kapsüller, tozlar, granüller, merhemler, çözeltiler, depotlar, inhalantlar ve enjeksiyonlar gibi gazllîlformlarda olan karglEiilara formüle edilebilmektedir. Bulus aynEl zamanda, tliîbi cihazlari ve benzerinin kaplanmasßayesinde bilesimlerin lokal uygulamasIEl tasarlamaktadB Enjekte edilebilirler sayesinde parenteral tasIia, infüzyon veya irigasyon ve topik tasiaya yönelik uygun taslýlaßr, distile suyu, fizyolojik fosfat tamponlu salini, normal veya laktatIEl Ringer çözeltilerini, dekstroz çözeltisini, Hank çözeltisini veya propanediyolu içermektedir. Ek olarak, steril, stabil yaglar, bir çözelti veya süspansiyon ortamIa kullanilâbilmektedir. Bu amaç dahilinde, herhangi bir biyo uyumlu yag, sentetik mono veya digliseritler içerilerek kullanllâbilmektedir. Ek olarak, oleik asit gibi yag asitleri, enjekte edilebilir preparasyonda kullanIi alanElhuImaktadlE Taslýlüîlle madde, bir slîüsüspansiyon, polimerize edilebilmekte veya polimerize edilmez jel, macun veya merhem olarak bilesik hale getirilebilmektedir.

TasMEEIayrlEla, maddelerin tasIlasII sürdürülmesi (ör. uzatlIBiasIZI geciktirilmesi veya düzenlenmesi) için veya terapötik maddelerin tasIiasIÇl tutulumunu, stabilitesini veya farmakokinetiklerini gelistirmesi için bir tasIia aracIDçerebilmektedir. Bu tarz bir tasIia araclZlklgflbylEEImayan örnegin yordamlîla mikropartikülleri, mikrosferleri, nanosferleri veya proteinlerden, lipozomlardan, karbonhidratlardan, sentetik organik bilesiklerden, inorganik bilesiklerden, polimerik veya kopolimerik hidrojellerden ve polimerik misellerden olusan nanopartikülleri içerebilmektedir. Uygun hidrojel ve misel tasIia sistemleri PEO:PHB:PEO komplekslerini içermektedir. Bu tarz hidrojeller, amaçlanan eylem bölgesinde lokal olarak veya sürekli salIIi depotunun olusturulmasEliçin subkütanöz veya intramusküler olarak enjekte edilebilmektedir.

Mevcut bulusun bilesimleri, subkütanöz olarak, intramüsküler olarak, intravenöz olarak, inraerteriyel olarak veya bir inhalant olarak tasla için formüle edilebilmektedir.

Intraartiküler tasIia için, MASP-3 inhibitör maddesi veya MASP-2 inhibitör maddesi, enjekte edilebilen, yukar- bahsi geçen slîüieya jel taslsîlîillârda, enjekte edilebilen, yukar- bahsi geçen sürekli salIIi tasma araçlarIa veya hiyalüronik asitte veya hiyalüronik asit türevinde uygulanabilmektedir.

Peptiderjik olmayan maddelerin oral uygulamasi yönelik olarak, MASP-3 inhibitör maddesi, bir inert doldurucuda veya sakaroz, mlîlEl nisastasüya da selüloz gibi bir seyrelticide uygulanabilmektedir.

Topik uygulama için, MASP-3 inhibitör maddesi veya MASP-2 inhibitör maddesi, merhem, losyon, krem, jel, damla, süpozituvar, sprey, slîlja da tozda veya jelde veya transdermal bir yakßayesinde mikrokapsüler tasIia sistemlerinde uygulanabilmektedir.

Aerosolleri, dozu ölçülmüs inhalerleri, kuru tozlu inhalerleri ve nebülizörleri içeren çesitli nazal ve pulmoner tasma sistemleri gelistirilmekte ve süslîla aerosolde, inhalantta veya nöbülize tasma araclEda mevcut bulusun tasliasüçin uygun bir sekilde uyarlanabilir.

Intratekal (IT) veya intraserebroventriküler (ICV) tasIia için, uygun bir sekilde steril tasIia sistemleri (örn. slîllâr; jeller, süspansiyonlar, vb.), mevcut bulusun uygulanmaslZliçin kullantlâbilmektedir.

Mevcut bulusun bilesimleri ayrlEla ayrlStlElElZlveya nemlendirici maddeler, asklýh alma maddeleri, seyrelticiler, tampon maddeleri, penetrasyon arttlElEllâr, emülgatörler, baglaylîllâr, koyulastlEEIEr, klîlam arttlEEjnaddeler (oral uygulama için) gibi biyo uyumlu eksipiyanlarEl içerebilmektedir. ii. Antikorlar ve Deptitlere vönelik farmasötik taslýlölâr Daha belirgin olarak, burada açlKlandfglEgibi MASP antikorlarlEb göre, örnek teskil eden formülasyonlar, su, yag, salin, gliserol veya etanol gibi steril bir slîlllabilen farmasötik bir taslýlEElile fizyolojik olarak kabul edilebilir bir seyrelticide bilesin bir çözeltisinin veya süspansiyonunun enjekte edilebilir dozajlarüilarak parenteral bir sekilde uygulanabilmektedir.

Ek olarak, nemlendirici veya emülsifiye edici maddeler, sürfaktantlar, pH tamponlaylEEl maddeler ve benzeri gibi yardlclîrnaddeler, MASP antikorlarIEiçeren bilesimlerde mevcut olabilmektedir. Farmasötik bilesimlerin ek bilesenleri, örnegin soya yagÜ/e mineral yaglîgibi petrolü (hayvansal, bitkisel veya sentetik kaynaklgibi) içermektedir. Genelde, propilen glikol veya polietilen glikol gibi glikoller, enjekte edilebilir çözeltiler için tercihen edilen SM: tasElîüârdlEl MASP antikorlarüynüamanda aktif maddelerin devamlü/eya pulsatil salIIiIEla izin verdigi sekilde formüle edilebilen bir depot enjeksiyonunun veya implant karlglEliII formunda uygulanabilmektedir.

VIII. UYGULAMA MODLARI MASP-3 inhibitör maddelerini veya MASP-2 inhibitör maddelerini içeren farmasötik bilesimler, bir lokal veya sistemik uygulama modunun en çok tedavi edilen kosul için uygun olup olmadlglII belirlenmesine baglEblarak bir dizi yolda uygulanabilmektedir. Dahasl: mevcut bulusun bilesimleri, bilesimlerin, implante edilebilir medikal bir cihaza kaplanmasü/eya dahil edilmesi ile iletilebilmektedir. i. Sistemik tasma Burada kullanIlglEüzere, “sistemik tasIia" ve “sistemik uygulama“ terimleri ile, klEIfIlayIEEl olmayacak sekilde intramusküler (IM), subkütanöz, intravenöz (IV), antra-arteriyel, inhalasyonel, dil altl:| bukal topikal, transdermal, nazal, rektal, vajinal ve tek veya çoklu amaçlanan terapötik eylem alanlar. iletilen maddenin dispersiyonu ile etkili bir sekilde sonuçlanan diger uygulama yollarElEl içeren oral ve parenteral yollarEl içermesi amaçlanmaktadE Mevcut bilesimler için tercih edilen sistemik tasIia yollarüintravenöz, intramusküler, subkütanöz, intraarteriyel ve inhalasyonel uygulamayüçermektedir. Mevcut bulusun belirli bilesimlerinde kullanlEn, seçilmis maddeler için kesin sistemik uygulama yolunun, verilen bir uygulama yolu ile iliskili metabolik dönüsüm yollar. duyarlElolan maddenin hesaba katllîhasEIiçin klîlnen belirlenecek olmasEltakdir edilecektir. Örnegin, peptiderjik maddeler, oraldan baska en uygun yollarla uygulanabilmektedir.

Burada açllZJand[glüüzere MASP inhibitör antikorlarÇl herhangi bir uygun araç sayesinde bunlara Ihtiyaç duyan bir hastaya iletilebilmektedir. MASP antikorlarlEllEl ve polipeptitlerinin tasma yöntemleri, oral, pulmoner, parenteral (örn. intramusküler, intraperitoneal, intravenöz (IV) veya subkütanöz enjeksiyon), inhalasyon (ince tozlu formülasyon sayesinde oldugu gibi), transdermal, nazal vajinal, rektal veya dil altElJygulama yollarEile olan uygulamayEiçerebilir ve her bir uygulama yolu için uygun olan dozaj formlarIa formüle edilebilmektedir.

Temsili bir örnegin vaslßsüla, MASP inhibitör antikorlarElve peptitler, örnegin nazal, gastrointestinal ve rektal membranlar gibi polipeptitleri absorbe edebilen bütün halinde bir memrana uygulama ile canlEbir vücuda dahil edilebilmektedir. Polipeptitler genellikle bir permeasyon arttlBEEIe birlikte absorvatif membrana uygulanmaktadlü (Bkz. örn. Lee, V.H.L., (1990); Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivers, Marcel Dekker, New York asidin bir sentetik türevi, safra uzuna yapljblarak benzer bir steroidal sürfaktanttlElve nazal tasIia için bir geçirimli arttlîlElZblarak kullanHRilgtlB (Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990.) Burada aç[lZland[gI1'izere MASP inhibitör antikorlarÇlpolipeptitleri enzimatik degradasyondan korumak için bir Iipid gibi bir diger moleküller birlesik olarak dahil edilebilmektedir. Örnegin, özellikle polietilen glikol (PEG) olmak üzere polimerlerin kovalent bagÇlvücutta enzimatik hidrolizden belirli proteinlerin korunmasül'e bu sekilde yarlîbmrün uzatllüîasülçin kullanilfnlgtß (Fuertges, F., ve ark., J. Controlled Release 11:139, 1990). Birçok polimer sistem, protein tasiasülçin rapor edilmistir (Bae, Y.H., ve ark., J. Controlled Release 92271, 1989; Hori, R., Son zamanlarda, lipozomlar, gelismis serum stabilitesi ve dolasIi yarElömürleri ile gelistirilmistir (bkz. örn. ABD . Dahasüpotansiyel Ilaç olarak Iipozom ve Iipozom benzeri çesitli yöntemler tekrardan incelenmistir (ör. ABD Shinkarenko; ve ABD .

Transdermal uygulamalar için, açllZJandlglElJzere MASP inhibitör antikorlarEltaslEEllâr ve/veya adjuvanlar gibi diger uygun içeriklerle birlestirilebilmektedir. Amaçlanan uygulamalarDçin farmasötik olarak uygulanabilir olmasElgerekmesinin haricinde, bu tarz diger içeriklerin dogasIa herhangi bir klîlfllama mevcut degildir ve bilesimin aktif içeriklerinin aktivitesini bozamaz. Uygun araçlarI örnekleri, saflastlBlBilgl kolajen ile veya saflastmlgl kolajen olmaks- merhemleri, kremleri, jelleri veya süspansiyonlarÜçermektedir. MASP inhibitör antikorlarüaynüzamanda, tercihen slîlîlveya yarElslîElformda transdermal yamalara, plasterlere ve bandajlara emdirilmis olabilmektedir.

Mevcut bulusta kullanIia yönelik bilesimler, terapötik etkinin istenilen bir seviyesinin sürdürülmesi için belirlenen arallEIarda periyodik bir bazda sistematik olarak uygulanabilmektedir. Örnegin, bilesimler, her iki ila dört haftada veya daha az sllZIltha olan aralilZlarda subkütanöz enjeksiyon ile oldugu gibi uygulanabilmektedir. Dozaj rejimi, maddelerin kombinasyonunun eylemini etkileyebilen çesitli faktörleri göz önünde bulunduran bir hekim taraflEUan belirlenecektir. Bu faktörler, tedavi edilen kosulun ilerleme ölçüsünü, hastanI yaslücinsiyetini ve kilosunu ve diger klinik faktörleri içerecektir. Her bir bireysel maddenin dozajü herhangi bir ilaç tasIia araci& (ör. sürekli saIIIiIiIEItasa aracD] mevcudiyetinin ve yap-I yanßß, bilesimde dahil edilen MASP-3 inhibitör inhibitörünün bir islevi olarak degiskenlik gösterecektir. Ek olarak, dozaj miktarljuygulama sliZ] [gllîitla olan varyasyon ve iletilen maddelerin farmakokinetik hareketinin hesaba katllBiaslIl için ayarlanabilmektedir. ii. Lokal tasIia Burada kullanIEglüüzere, “lokal“ terimi, amaçlanan lokalize eylemin bir alanIa veya etrafIa bir ilaci uygulamasElkapsamaktadlE ve örnegin, cilde veya diger etkilenen dokulara topikal tasiasüoftalmik tasliasüintratekal (IT), intraserebroventriküler (ICV), intraartiküler, kavite içi, intrakranial veya intravsekiler uygulama, yerlestirme veya irigasyonu içerebilmektedir. Lokal uygulama, sistemik yan etkilerin engellenmesi ve daha kesin bir tasla zamanlama kontrolü ve lokal tasIia alanEda aktif maddelerin konsantrasyonu için düsük bir doz uygulamasi olanak saglanmasEiçin tercih edilebilmektedir. Lokal uygulama, metabolizmada, kan akglüla ve benzerinde hastalar araslîdegiskenlige baklEnaks- hedef alanda bilinen bir konsantrasyon saglamaktadlü Gelismis dozaj kontrolü ayrlîla dogrudan Bir MASP-3 inhibitör maddesinin lokal tasIialela, örnegin arteriyel bypass cerrahisi, aterektomi, lazer prosedürleri, ultrasonik prosedürler, balon anjiyoplasti ve stent taküBiasEl gibi prosedürler esnaleUa oldugu gibi bir hastaligll veya kosulun tedavi edilmesi için olan cerrahi yöntemlerin kapsamlEtla ulasllâbilmektedir. Örnegin, bir MASP-3 inhibitör maddesi veya bir MASP-Z inhibitör maddesi, bir balon anjiyoplastisi prosedürü ile baglantl]]]]›larak bir denege uygulanabilmektedir. Bir balon anjiyoplasti prosedürü, söndürülmüs bir balona sahip olan bir kateterin bir artere yerlestirilmesini içermektedir. Söndürülen balon, aterosklerotik plaga bitisik olarak konumlandlElBiaktadBve plaglEl, vasküler çepere karsßlElgt-@Sekilde sisirilmektedir. Bunun bir sonucu olarak, balon yüzeyi, kan damarII yüzeyinde vasküler endotel hücrelerin tabakaslîile temas halinde olmaktadlü MASP-3 inhibitör maddesi veya MASP-2 inhibitör maddesi, aterosklerotik plagII alanüda maddenin sal.“ olanak saglad lg'llîlbir sekilde balon anjiyoplasti kateterine baglanabilmektedir. Madde, teknikte bilinen standart prosedürleri ile uyumlu bir sekilde balon kateterine baglanabilmektedir. Örnegin, lokal çevreye salIiigElnoktada balonun sisirilmesine kadar, madde, balon kateterin bir bölmesinde depolanabilmektedir. Alternatif olarak, madde, balon siserken arteriyel çeperin hücreleri ile temasa geçtigi sekilde balon yüzeyinde emdirilebilmektedir. Madde ayrlîh, gözenekli bir balon kateterinde iletilebilmektedir. AynEzamanda, terapötik bir proteinin, bir balon anjiyoplasti kateterine birlestirilmesi için örnek teskil eden bir prosedürün yaynlanan PCT WO 95/23161 sayiIIB/aylüb bakIIîl Benzer bir sekilde, MASP-3 inhibitör maddesi veya MASP-Z inhibitör maddesi, bir stente uygulanan bir jelde veya polimerik kaplamada dahil edilebilmektedir veya stentin, vasküler yerlestirme sonrasIda MASP-3 inhibitör maddesini veya MASP-2 inhibitör maddesini ayrlgtülgllîl sekilde, stentin malzemesine dahil edilebilmektedir.

Artritin tedavisinde ve diger kas iskelete rahatslîllKlarIda kullanllân MASP-3 inhibitör maddesi veya MASP-Z inhibitör bilesimleri, intraartiküler enjeksiyon ile lokal olarak iletilebilmektedir. Bu tarz bilesimler, sürdürülebilir bir sail! tasma aracIlIiliygun bir sekilde içerebilmektedir. Lokal taslanlE] arzu edildigi durumlarI bir diger örnegi olarak, urogenital kosullarI tedavisinde kullanllân MASP-Z inhibitörü, uygun bir sekilde intravezikal olarak veya bir diger urogenital yapüçerisinde islenebilmektedir. 1x. TEDAVI REJIMLERI Profilaktik uygulamalarda, farmasötik bilesimler, kosul semptomlarlEllEl gelisme riskini elimine etmesi veya azaltmasDçin yeterli bir miktarlEl, PNH'ye duyarIEl/eya baska bir sekilde risk taslýlan bir denege uygulanmaktadß Terapötik uygulamalarda, farmasötik bilesimler, kosulun semptomlar.. ortadan kaldlîilîhaslîiveya en azIan klîinen azaltilBiasEiçin yeterli olan terapötik olarak etkili bir miktar, PNH olmasIan süphe edilen veya hali hazlûla PNH'den muzdarip olan bir denege uygulanmaktadIE Bir durumda, denegin kIElniîEkan hücreleri, bilesim yoklugunda C3 fragmanlarEiIe opsonize edilmektedir ve denege bilesimin uygulanmasüsujede klEiniîEkan hücrelerinin sagkaIIiIEi arttlEinaktadlEi Bir durumda, suje, (i) normal seviyelerdeki hemoglobinin alt-a, (ii) normal trombosit seviyelerinin altIa; (iii) normal reikülosit seviyelerinin üzerinde; ve (iv) normal bilirubin seviyelerinin üzerinde olan gruptan seçilen bilesimin yoklugunda bir veya birden fazla semptom sergilemektedir ve denege bilesimin uygulanmasüen az bir veya birden fazla semptomu gelistirmektedir, bu da (i) artan, normal veya neredeyse normal hemoglobin seviyeleri, (ii) artan, normal veya neredeyse normal trombosit seviyeleri, (iii) azalan, normal veya neredeyse normal retikülositlerin seviyeleri ve/veya (iv) azalan, normal veya neredeyse normal bilirubin seviyeleri ile sonuçlanmaktadiEl Profilaktik ve terapötik rejimlerde, MASP-3 inhibitör maddelerini ve tercihe baglüilarak MASP- 2 inhibitör maddelerini içeren bilesimler, yeterli miktarda terapötik bir sonuca hastada ulasllâna kadar, çesitli dozajlarda uygulanabilmektedir. MASP-3 ve/veya MASP-Z inhibitör (örn. 70 kg bir ortalama yetiskin agiîlifglm uygun bir sekilde uygulanabilen bir MASP-l antikoru, bir MASP-Z antikoru veya bir MASP-3 antikorunu içermektedir. Pediatrik hastalara yönelik olarak, dozaj, hastal[giI kilosuna orantlglal olarak düzenlenebilmektedir.

Mevcut bulusun MASP-3 inhibitör bilesimlerinin ve tercihe baglü MASP-2 inhibitör bilesimlerinin uygulanmasÇIbilesimin tek bir uygulamasüörn. MASP-Z ve MASP-3 inhibitör maddelerini veya bispesifik veya çift inhibitör maddeleri içeren tek bir bilesimin veya ayriZl bilesimlerin birlikte uygulanmasmveya PNH tedavisine yönelik olarak uygulamalari bir kiîlfiilîl sekanslîile uygulanabilmektedir. Alternatif olarak, bilesim, PNH tedavisine yönelik uzatllB'ilglbir süre zarfEboyunca günlük, iki haftada bir, haftaliEi her hafta, aylilZi veya iki ayda bir gibi periyodik arallElarda uygulanabilmektedir.

Bazlîdlurumlarda, en az bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir birinci bilesim ve en az bir MASP-Z inhibitör maddesini içeren bir ikinci bilesim, PNH'den muzdarip olan bir denege uygulanmaktadlü Bir durumda, en az bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren birinci bilesim ve en az bir MASP-Z inhibitör maddesini içeren bir ikinci bilesim es zamanllîilarak (örn. yaklasllZl dakikadan daha fazla olmayan veya az bir süre ayIEtna, örnegin herhangi 10, 5 veya 1 dakika arasIan herhangi birisinden daha fazla olmayan) uygulanmaktadE Bir durumda, en az bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren bir birinci bilesim ve en az bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir ikinci bilesim sülEblarak uygulanmaktadlEl(örn. birinci bilesim, ikinci bilesimin uygulanmaslfihan önce veya sonra uygulanmaktadlü burada uygulamanI süre ayrIiLIIIS dakikada daha fazladlî). BazEdurumlarda, en az bir MASP-3 inhibitör maddesini içeren birinci bilesim ve en az bir MASP-Z inhibitör maddesini içeren ikinci bilesim birlikte uygulanmaktadlEl (örn. birinci bilesimin uygulama süreci, ikinci bilesimin uygulanmasEliIe kesismektedir). Örnegin bazlîdlurumlarda, birinci bilesim ve/veya ikinci bilesim, en az bir, iki, üç veya dört haftallEJ veya daha uzun bir süreç için uygulanmaktadE Bir durumda, en az bir MASP-3 inhibitör maddesi ve en az bir MASP-2 inhibitör maddesi, bir birim dozaj formunda birlestirilmektedir. Bir durumda, en az bir MAPS-3 inhibitör maddesini Içeren bir birinci bilesim ve en az bir MASP-2 inhibitör maddesini içeren bir ikinci bilesim, PNH tedavisinde kullanIia yönelik bir kitte birlikte paketlenmektedir.

BazEIclurumIarda, PNH'den muzdarip olan suje öncesinde kompleman proteininin (C5) bölünmesini inhibe eden bir terminal kompleman inhibitörü ile olan tedaviye tabi olmustur veya mevcut olarak tabi olmaktadE BazEljurumlarda, yöntem, bir MASP-3 ve tercihe bagIEl olarak bir MASP-Z inhibitörünü içeren bulusun bir bilesiminin denege uygulanmaslüie aynEI zamanda kompleman proteininin (C5) bölünmesini inhibe eden bir terminal kompleman inhibitörünün denege uygulanmasIEliçermektedir. BazlZldurumlarda, terminal kompleman inhibitörü, bir insanlastlElIBilglanti-CS antikordur veya bunun antijen baglaylElIragmanIlE Bazülurumlarda, terminal kompleman inhibitörü, ekulizumab'dE x. ÖRNEKLER Asagüia bulunan örnekler, sadece bulusun uygulanmasüçin tasarlanan en iyi modu göstermektedir.

Bu Örnek, MASP-Z'si eksik farelerin, IV. men/hg/'Ü'd/'s serogrup A veya N. men/hgiUd/'s serogrup B ile enfeksiyondan eisser/a menihg/'t/'di's ile indüklenen mortaliteden korundugunu göstermektedir.

Yöntemler: MASP-2 nakavt fareleri (MASP-2 KO fareleri), US 7,919,094 SayUJIlPatent DokümanII Örnek 1'inde açmandlglEgibi olusturulmaktadlEI 10 haftalllZl MASP-2 KO farelere (n=10) ve sokak olarak asllânmlgtm Etkili olmayan doz, 400 mg/kg bir nihai konsantrasyonda demir dekstran ile baglantlIJDOIarak farelere uygulanmlgtlE Enfeksiyondan sonra farelerin hayatta kalmasÇI 72 saatlik bir süre boyunca takip edilmistir.

AyrEbir deneyde, 10 haftalüîl MASP-2 KO farelere (n=10) ve sokak türü (WT) C57/BL6 dozajIElçeren enjeksiyon i.p. olarak asllânmlgtß Etkili olmayan doz, 400 mg/kg bir nihai konsantrasyonda demir dekstran ile baglantlliîblarak farelere uygulanmlgtlEI Enfeksiyondan sonra farelerin hayatta kalmasÇl72 saatlik bir süre boyunca takip edilmistir. Bir hastalllg puanElaynlIlzamanda hafif modifikasyonlarla Fransen ve ark. (2010) semasII temelinde olan, asagi TABLO 4'de açlElanan hastalliZJ puanlama parametrelerine dayalElolarak enfeksiyondan sonraki 72 saatlik süreç esnaleUa WT ve MASP-2 KO fareleri içeren belirlenmistir.

TABLO 4: Enfekte farelerde klinik isaretlerle iliskili Hastalüâ Puanlamasü Normal Hafifçe kabarllZl kür Kabarilg kürk, yavas ve yaplgkan gözler Oldukça hasta ve uyarIidan sonra herhangi bir hareket yok Kabarlß kürk, uyusuk ve kapallîgözler 3 Enfeksiyondan sonra saatlik araIHZIarIa farelerden aI-n kan numuneleri, enfeksiyonu dogrulamak ve bakterilerin serumdan temizlenme oranIEibelirlemek için N. men/'ng/I/'d/'sîn serum seviyesini (log cfu/mL) belirlemek üzere analiz edilmistir.

Sonuçlar: uygulanmasIan sonra MASP-Z KO ve WT farelerinin sagkalIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren bir Kaplan-Meyer semasIlEl SEKIL 8'de gösterildigi üzere, MASP-2 KO farelerinin Farelerinin (p=0.012) sadece %80'i, enfeksiyondan 24 saat sonra hala canlElkaImlStEve WT farelerinin sadece %50'si, enfeksiyondan sonra 72. saatte hala canllîlkalmlgtlü Bu sonuçlar, MASP-Z'si eksik farelerin, IV. men/ngiI/d/'s serogrup A 22491 ile indüklenen mortaliteden korundugunu göstermektedir.

SEKIL 9, N. men/hg/'Üdis serogrup B susu MC58'in bir etkisiz 6 x 106 cfu dozunun uygulanmasIan sonra MASP-2 KO ve WT farelerinin sagkalIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren bir Kaplan-Meyer semasIlEI SEKIL 9'da gösterildigi üzere, MASP-2 KO farelerinin farelerinin (p=0.0022) sadece %20'si, enfeksiyon sonrasIa 24 saat canlElkalmlgtE Bu sonuçlar, MASP-2'si eksik farelerin, N. men/ng/'t/di's serogrup B susu MC58 ile indüklenen mortaliteden korundugunu göstermektedir.

SEKIL 10, N. men/ng/'Üd/s serogrup B sulu MC58'in 6x106 cfu'su (her iki fare grubu için farkliZI süre noktalarIda n=3) ile i.p. enfeksiyonundan sonra MASP-2 KO ve WT farelerden aIlEbn kan numunelerinde farkllîtsüre noktalarIEtla iyilestirilen IV. men/ng/t/'d/'s serogrup B susu MC58'in cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir. Sonuçlar, Means±SEM olarak ifade edilmektedir. SEKIL 10'da gösterildigi gibi, WT farelerinde, kanda N. men/ng/tid/'s seviyesi, enfeksiyon sonrasIa 24 saate yaklaslEl 6.0 log cfu/mL bir zirveye ulasmlgtlEl ve enfeksiyondan 36 saat sonrasHa 4.0 log cfu/mL'ye düsmüstür. Buna karsEi, MASP-Z KO farelerinde, kanda /V. men/hg/t/d/'s seviyesi, enfeksiyon sonrasIa 12 saate yaklasliZJ 4.0 log cfu/mL bir zirveye ulasmlgtlîl ve enfeksiyondan 36 saat sonrasIa 1.0 log cfu/mL'ye düsmüstür ("*" sembolü, p<0.05'i göstermektedir; "**" sembolü, p=0.0043'ü göstermektedir). Bu sonuçlar, MASP-Z KO fareleri, WT fareleri gibi N. men/ngi't/d/'s serogrup B susu MC58'in aynEldozu ile enfekte edilmesine ragmen, MASP-2 KO fareleri, WT ile klýhsland [gitüzere bakteriyeminin klerensini gelistirmistir.

SEKIL 11, N. men/'ng/'t/d/'s serogroup B susu MC58'in 6X106 cfu'su ile enfeksiyondan sonra 3, 6, 12 ve 24. saatte MASP-Z KO ve WT farelerinin ortalama hastalllZJ puanIlîgrafikseI olarak göstermektedir. SEKIL 11'de gösterildigi üzere, MASP-Z'si eksik fareler, WT farelerine klýlasla enfeksiyondan sonra 6. saatte ("*" sembolü, p=0.0411'i göstermektedir), 12. saatte göstermektedir) çok daha düsük bir hastallklpuanlsîla enfeksiyona yüksek direnç sergilemistir.

SEKIL 11'de bulunan sonuçlar, Means±EM olarak ifade edilmektedir.

Klîlacasübu Örnekte sonuçlar, MASP-Z'si eksik farelerin, /V. men/ngiI/'dis serogrup A veya N. menihg/t/'d/s serogrup B ile enfeksiyondan sonra N. men/'ng/'t/'des ile inndüklenen mortaliden korundugunu göstermektedir.

Bu Örnek, /V. men/hgit/'d/s ile enfeksiyondan sonra MASP-2 antikorunun uygulanmasIlEi, N. men/hg/I/'d/'sile enfekte edilen farelerin sagkaIIiIlârttIEnaktadIEI On BilgilGerekge: ABD 7,919,094 SaylIJJJDatent DokümanII Örnek 24'ünde tarif edildigi gibi, slglan MASP-Z proteini, Fab2#11'in islevsel olarak aktif bir antikor olarak tanllandfglEbir Fab faj gösterge kütüphanesinin çevrilmesi için kullanilîhlgtiîl Sit-;lan IgG2c ve fare IgG2a izotiplerinin tam uzunlukta antikorlarÇlFabZ #11'den üretilmistir. Fare IgG2a izotipinin tam uzunlukta MASP-2 antikoru, farmakodinamik parametreler için (ABD 7,919,094 SayllillPatent DokümanII Örnek 38'inde açilZIand [gilîüzere) karakterize edilmistir.

Bu Örnekte, Fab2 #11'den türeyen fare MASP-2 tam uzunlukta antikor, IV. men/hg/ti'd/'s enfeksiyonunun fare modelinde analiz edilmistir.

Yöntemler: Yukarüla açlKIandigiEgibi üretilen Fab2 #11'den türetilen fare IgG2a tam uzunlukta MASP-2 antikor izotipi, asag-ki gibi N. men/ng/t/'d/s enfeksiyonunun fare modelinde test edilmistir. 1. Enfeksiyondan sonra fare MASP-Z monok/onal antikor/arif (MoA b) verilmesi 9 haftalllZIC57/BL6 Charles River fareleri, /V. men/ngit/d/'s serogroup B susu MC58'in yüksek bir dozuyla (4x106 cfu) i.p. enjeksiyonundan sonra 3. saatte inhibitör fare MASP-2 antikoru(1.0 mg/kg) (n=12) veya kontrol izotip antikoru (n=10) ile tedavi edilmistir.

Sonuçlar: SEKIL 12, N. men/ng/'t/'d/'s serogrup B susu MC58'in bir etkisiz 4 x 106 cfu dozunun uygulanmasIan sonra farelerin sagkalIi yüzdesini grafiksel olarak gösteren bir Kaplan- Meyer semasIlÜ bunu inhibitör MASP-2 antikorunun (1.0 mg/kg) veya kontrol izotip antikorunun enfeksiyondan 3 saat sonra uygulanmaslîltakip etmistir. SEKIL 12'de gösterildigi üzere, MASP-2 KO farelerinin %90'Çl enfeksiyondan sonra 72 saatlik süreç boyunca sagkalmlgtß Buna karsiEl, farelerin sadece %50'si, enfeksiyondan sonra 72 saatlik süreç boyunca sagkalan izotip kontrollü antikor ile tedavi edilmistir. "*" sembolü, iki sagkaln egrisinin klýlaslamasliüe belirlendigi gibi p=0.0301'i göstermektedir.

Bu sonuçlar, bir MASP-Z antikorunun uygulanmasllül, N. men/hgit/d/'s ile enfekte edilen sujelerde sagkalllîliedavi etmesi ve arttlEinaslIilsin etkili oldugunu göstermektedir.

Burada gösterildigi üzere, N. mening/t/dis ile enfekte edilen bir denegin tedavisinde MASP-2 antikorunun kullanIiD enfeksiyon sonrasEtla 3 saat içerisinde uygulandgßtla etkili olmaktadEve enfeksiyondan sonra 24 saat ila 48 saat içerisinde etkili olmasElbeklenmektedir.

Meningokoksik hastallg]lîl(meningokoksemi veya menenjit), tIi bir aciliyettir ve tedavi genellikle meningokoksik hastallthan süphelenilmesi halinde (örn. /V. menmgit/'d/s, etiyolojik madde olarak pozitif bir sekilde belirlenmeden önce) hemen baslatilâcaktß ÖRNEK 1'de gösterilen MASP-2 KO faresinde ortaya çllZbn sonuçlar aç-dan, IV. men/hg/I/dis ile enfeksiyondan önce MASP-Z antikorunun uygulanmasi. enfeksiyon siddetini önlemek veya hafifletmek için etkili olacagi inanllüiaktadlü Bu örnek, insan serumlarIa N. mening/I/'d/Ls'in komplemana bagllEölümünün MASP-3'e baglilübldugunu göstermektedir.

Islevsel MBL göstergesinin azalan serum seviyelerini sahip hastalar, yeniden nükseden bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara duyarl[I]KIarIßrttlHlnlgtlEl(Kilpatrick ve ark., Biochim bilinmektedir ve MBL'si eksik serumlarlEl, N. mening/'t/d/si parçalamad[glügiösterilmistin Örnek 1 ve 2'de açllZJanan sonuçlar aç-an, komplemanßksik ve kontrol insan serumunda /V. men/ng/'t/d/'senfeksiyonunu tedavi edecek sekilde MASP-2 antikorunun uygulanmasEl verimliligini belirlemek ad. uygulanmlgtlEl Kompleman yolunu korumak için yüksek bir serum konsantrasyonunda (%20) deneyler uygulanmlStE Yöntemler: 1. Çesitli kamp/emanßksik insan serum/ariîi'da ve insan MASP-Z antikoru ile tedavi edilen insan serum/arßda serum bakterisidal aktivite Asag-ki komplemanßksik insan serumlarüie kontrol insan serumlarÇlbu deneyde kullanlmnlgtlîl TABLO 5: Test edilen insan serum numunelerinde (SEKIL 13'de gösterildigi üzere) Numune Serum türü A Normal insan serumlarEaNHS) + insan MASP-Z B NHS + izotip kontrolü Ab C MBL -/- insan serumu E Islýla etkisizlestirilmis olan (HI) NHS Insan MASP-Z'ye karsEbir rekombinant antikor, bir antijen (Chen, C.B. ve Wallis, J. Biol. kombinasyonel Antikor Kütüphanesinden izole edilmistir (Knappik, A., ve ark., J. Mol. Biol. aktivasyonunu öneli bir sekilde inhibe eden bir anti insan scFv fragmanüaelirlenmis ve tam uzunlukta bir insan IgG4 antikoruna dönüstürülmüstür.

N. men/hgit/d/s serogrup B-MC58, her birisi çalkalamayla 37°C'de inhibitör insan MASP-2 antikorunun (100 pl toplam hacminde 3 iJg) eklentisiyle veya eklentisi olmadan %20 bir serum konsantrasyonunda olacak sekilde TABLO 5'de gösterilen farklElserumlarla inkube edilmistir. Numuneler, asaglalaki süre noktalarlda allütnlgtlîi 0-, 30-, 60- ve 90-dakika arallKlar, plakalanmlgve daha sonraletla canlßaylilar belirlenmistir. Ismtkisiz halde olan insan serumu, bir negatif kontrol olarak kullanllßilgIlEI Sonuçlar: SEKIL 13, TABLO 5'de gösterilen insan serumlarlEllEl numunelerinde farklEl süre noktalarIa iyilestirilen IV. menihgit/oý's serogrup B-MC58'in canlEbayllârII log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir. TABLO 6, SEKIL 13'e yönelik ögrenci t-test sonuçlarIEl saglamaktadEI TABLO 6: SEKIL 13'e yönelik ögrenci t-testi SonuçlarEGöO dakikallKlsüre noktasD] Ortalama Fark Önemli? P<0.05? P degerinin özeti AvsD -o.2111 Evet **(00012) CvsD 1.9 Evet ***(p<0.0001) SEKIL 13 ve TABLO 6'da gösterildigi üzere, insan %20 serumunda N. men/hg/tid/sin komplemana bagIilEölümü, insan MASP-2 inhibitör antikorunun eklentisi ile önemli ölçüde arttlElllßilStE 2. Çesitli komplemanüksik insan serum/arZÜda serum bakterisida/ aktivitesi Asagidaki komplemanßksik insan serumlarüie kontrol insan serumlarÇlbu deneyde kullanllßilgtß TABLO 7: Test edilen insan serum numunelerinde (SEKIL 14'de gösterildigi üzere) Numune Serum Türü A Normal Insan serumu (NHS) B Islýla etkisizlestirilmis NHS D MASP-3 -/- (MASP-l +) Not: D numunesinde MASP-3 -/- (MASP-l +) serumu, Carnevale, Mingarelli, Malpuech ve Michels sendromlarI kesismesine yönelik bir birlestirici terim olan 3MC sendromu olan bir sujeden allElnlstlEI Örnek 4'de açllZlandlglîiizere, MAP-1/3 geninin ekson 12'sinde mutasyonlar, MASP-3'n serin proteaz alanlEßlusturmaktadiÜ fakat islevsiz MASP- 1'in serin proteaz alan-IusturmamaktadIE Aynlîamanda faktör D'nin, 3MC serumunda bozulmamlgoldugu bilinmektedir.

/V. men/hgit/di's serogrup B-MC58, her birisi çalkalama ile 37°C'de %20 bir serum konsantrasyonunda olacak sekilde farklükomplemanüeksik insan serumlarlýla inkube 120-dakikal[lZJ aralllîlar, plakalanmlgl ve daha sonrasIa canIElsayllar belirlenmistir. IslgJ etkisiz halde olan insan serumu, bir negatif kontrol olarak kullanilÜilgtE Sonuçlar: SEKIL 14, TABLO 7'de gösterilen insan serumlarII numunelerinde farklEI süre noktalarlEUa iyilestirilen N. men/hg/I/'dis serogrup B-MC58'in canllîlsayllârIlEl log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 14'de gösterildigi üzere, WT (NHS) serumu, N. men/'ng/I/'d/'s'e yönelik en yüksek bakterisidal aktivite seviyesine sahiptir. Buna karslBl, MBL -/- ve MASP-3 -/- (MASP-l'i yeterlidir) insan serumlarüherhangi bir bakterisidal aktiviteye sahip degildir. Bu sonuçlar, insan %20 (hacim/ hacim) serumunda N. men/hg/I/'di's'in komplemana bagIiIEöIümünün, MASP-3'e ve MBL'ye bagllmldugunu göstermektedir. TABLO 8, SEKIL 14'e yönelik Ögrenci t-test sonuçlarlßaglamaktadlîl TABLO 8: SEKIL 14'e Yönelik Ögrenci t-test Sonuçlari: KISaslama Süre Noktasü Ortalama Fark Önemli? P<0.05? P degerinin özeti KEacasÇl SEKIL 14 ve TABLO 8'de gösterilen sonuçlar, %20 insan serumunda N. men/hg/I/ws'in komplemana baglEIölümünün, MASP-3'e ve MBL'ye bagIiIEloldugunu göstermektedir. 3. MASP-2, MASP- fare serumlarIda IV. meningitidis'in komplemana bagüillîölümü Asaglki komplemanüeksik fare serumlarlZlve kontrol fare serumlarEI bu deneyde kullanllîhlgtlîl TABLO 9: Test edilen fare serum numuneleri (SEKIL 15'de gösterildigi üzere) Numune Serum Türü B MASP-Z -/- E WT lîlii'le etkisizlestirilmis (HIS) /V. men/'ng/'t/'d/Ls serogrup B-MC58, her birisi çalkalama ile 37°C'de %20 bir serum konsantrasyonunda olacak sekilde farklEkomplemanllksik fare serumlarls-Lla inkube edilmistir. arallElar, plakalanmlglve daha sonrasIa canlE'lsayIilar belirlenmistir. IsEIltkisiz halde olan insan serumu, bir negatif kontrol olarak kullanHBilSIlEl Sonuçlar: SEKIL 15, TABLO 9'da gösterilen fare serumlarII numunelerinde farkll3üre noktalarlEUa iyilestirilen N. men/hg/ti'dis serogrup B-MC58'In canlßayliârll log cfu/mL'sini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 15'de gösterildigi üzere, MASP-2 -/- fare serumlarü WT fare serumlarIan N. mening/tidis/e yönelik olarak daha yüksek bakterisidal aktivite seviyesine sahiptir. Buna karslEl MASP-1/3-/fare serumlarüherhangi bir bakterisidal aktiviteye sahip degildir. "**" sembolü, p=0.0058'i göstermektedir, "***" sembol, p=0.001'i göstermektedir.

TABLO 10, SEKIL 15 için Ögrenci t-test sonuçlarlEllEaglamaktadlE TABLO 10: SEKIL 15 Için Ögrenci t-test SonuçlarlIl Küaslama Süre Ortalama Fark Önemli? (p<0.05)? P degerinin özeti KElacasÇl bu Örnekte bulunan sonuçlar, MASP-2 -/- serumunun, WT serumundan N. men/hgiI/dise yönelik olarak daha yüksek bakterisidal aktivite seviyesine sahip oldugunu ve oldugunu göstermektedir.

Bu örnek, Örnek 1-3'de açilZlandfglÜlizere MASP-2 KO farelerinde gözlemlenen N. meningitidis enfeksiyonuna MASP-3'e bagilEUirencin mekanizmasIEbeIirlemek için uygulanan bir dizi deneyi açiEJamaktadlEI MASP-2 KO farelerinde (yukarlöia Örnek 1-3'de açiEIanmaktadIE) gözlemlenen N. men/ngiiidis enfeksiyonuna MASP-3'e bagIiIEIdirenç mekanizmasIIZIbelirlemek için, bir dizi deney asaglühki gibi uygulanmlgtlEl 1. MASP-1/3'ü eksik fare/el; Iektin yolu islevsel aktivitesinden mahrum degildir (aynüamanda "LEA- 2' olarak ifade edilmektedir).

Yöntemler: MASP-1/3'ü eksik farelerin, Iektin yolu islevsel aktiviteden (LEA-2 olarak da adlandlEiIBiaktadlE) mahrum olup olmadlgiIElbeIirlemek için, Schwaeble W. ve ark., PNAS vol kosullarEQ%1 plazma) altütja test edilen çesitli komplemanülzksik fare suslarlEUan plazmada C3 konvertaz aktivitesinin kinetiklerini ölçmek için bir deney uygulanmlgtlîi Plazma, asag-ki gibi WT, C4-/-, MASP-1/3-/-; Faktör B-/- ve MASP-2-/- farelerinden test edilmistir.

C3 aktivasyonunun ölçülmesine yönelik olarak, mikrottire plakalarÇlkaplama tamponunda (15 mM Na2C03, 35 mM NaHC03) mannoz (1 ug/hazne), zimosan (1 ug/hazne) veya kaplama tamponunda %1 insan serum albumini (HSA) ile kaplanarak ve daha sonrasIa %0.05 Tween 20 ve 5 mM Ca++ ile TBS'de (10mM Tris, koyun anti-HAS serumu (2 pg/mL) eklenerek in situ üretilen immün kompleksleri ile kaplanmlgIlE Plakalar, TBS'de %0.1 HSA ile bloke edilmistir ve TBS/Tween20/ Ca++ ile üç defa ylKlanmlgIlE Plazma numuneleri, 4 mM barbital, 145 mM NaCI, 2 mM CaClz, 1 mM MgCIZ, pH 7.4'de seyreltilmis, plakalara eklenmis ve 37°C'de 1.5 saatligine inkube edilmistir. Yllîlama sonrasIa, C3b bagü tavsan anti-insan C3c (Dako) kullanllârak tespit edilmistir, bunu alkalin fosfataz-konjüge keçi anti tavsan IgG ve p-nitrofenil fosfat takip etmistir.

Sonuçlar: Lektin yoluna özgü kosular altlEUa C3 aktivasyonunun kinetikleri (%1 serumla mannoz kapIEl plakalarda C3b birikimi ile ölçüldügü gibi), SEKIL 16'da gösterilmektedir. MASP-2-/- plazmaslüda herhangi bir No C3 bölünmesi görülmemistir. Faktör B-/-(Faktör B -/-) plazmasü amplifikasyon döngüsünün kaybIan dolayElWT plazmasII oranII yar-a C3 bölmüstür. C4-/-'de (T1,2=33 dakika) ve aynEIzamanda MASP-1/3-/-'ü eksik plazmada (TI/2:49 dakikada) C3'ün C3b'ye Iektin yoluna bagIiIEldönüsümde önemli bir gecikme görülmüstür. MASP-1/3 -/- plazmaletla C4 aktivasyonunun bu gecikmesinin, MASP-3'e bagIiIIEblmasan ziyade MASP-l'e bagIlEbldugu gösterilmistir. (bkz. Takahashi M. ve islevsel aktivitesinden mahrum olmadlglllîlaynüamanda "LEA-2" olarak Ifade edilmektedir) göstermektedir. 2. Alternatif yol aktivasyonunda kaIZZ'Z'aI MASP-3 eksikliginin etkisi Alternatif yol aktivasyonunda kallßal MASP-3 eksikliginin etkisi, MASP-3'ün serin protealeZl kodlayan eksonda bir kayllZIkaIlÜtüresimînin yol açtlgBMC sendromu olan bir MASP-3'ü eksik hastanI serumu test edilerek belirlenmistir. 3MC sendromu, Carneavale, Mingarelli, Malpuech ve Michels sendromlarII kesismesi ile ilgili birlestirici bir terimdir. Bu nadir otozomal resesif rahatslîllElar, karakteristik fasiyal dismorfizm, yarlEl dudak ve/veya damak, kraniyosinostozis, ögrenme yetersizligi ve genital, ekstremite ve vesi-corenal anormallikler dahil gelisimsel özelliklerin bir spektrumunu sergilemektedir. Rooryck ve meslektaslarü mutasyona ugramlgl geni (COLEC11 ve MASP-l) belirlemistir. MASP-l geninde bulunan mutasyonlar, MASP-3'ün serin proteaz alanIleodlayan eksonu olusturmaktadlîl fakat islevsiz olan MASP-l'in serin proteazlEJEkodlayan eksonlarIlZblusturmamaktadIE Bu sekilde, MASP- 3'ün serin protealeZkodlayan eksonda mutasyonlar. sahip 3MC hastalarIIEl, MASP-3'ü eksiktir, fakat MASP-l'de yeterlidir.

Yöntemler: MASP-3'ü eksik serum, bir 3MC hastasIan (3MC hastasII annesi ve babasüher ikisi de islevsiz MASP-3 serin proteaz alanlElüodlayan eksonu olusturan bir mutasyonu taslýlan alel için heterozigottur)) ve aynüamanda bir C4'ü eksik hastadan (her iki insan C4 genlerinde eksik) ve bir MBL'si eksik sujeden elde edilmistir. Bir alternatif yol deneyi, %05 ila %25 arallglIa serum konsantrasyonlarIa zimosan kapIElmikrotitrede geleneksel AP'ye özgü referanletla açllZlandlglEüzere Ca” içermeyen BBS/ Mg++/EGTA, burada 885 = barbital tamponlu salin içeren sakaroz) ve C3b birikimi zamanla ölçülmüstür.

Sonuçlar: SEKIL 17 MASP-3'ü eksik, C4'ü eksik ve MBL'si eksik sujelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kaplü mikrotitre plakalarEUa alternatif yol ile harekete geçirilen C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 17'de gösterildigi üzere, MASP-3'ü eksik hasta serumu, yüksek serum konsantrasyonlarlEda (%25, %125, %6.25 serum konsantrasyonlarlD kalan alternatif yol (AP) aktivitesine sahiptir, fakat önemli ölçüde daha yüksek bir AP50 0lmaktadlEl(örn. serumun %9.8'i, maksimum C3 birikiminin %50'sine ulasmak için gereklidir).

SEKIL 18, MASP-3'ü eksik, C4'ü eksik ve MBL'si eksik insan sujelerden elde edilen %10 insan serum numunelerinde bir süre islevi olarak “geleneksel“ alternatif yola özgü (AP'ye özgü) kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/Mg*+) altia zimosan kaplEImiktrotitre plakalarlEtla alternatif yol ile hareket eden C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

AsaglElla bulunan TABLO 11, SEKIL 17'de gösterilen APSO sonuçlarIEl/e SEKIL 18'de gösterilen C3b birikiminin yarßürelerini özetlemektedir.

TABLO 11: SEKIL 17 ve 18'de gösterilen Sonuçlar. Klga AçEliilamaslZl Serum türü APso (°/o) Ti/z (dakika) C4'ü eksik 4.0 11.6 MBL'si eksik 4.8 11.0 Not: BBS/ Mg+*/EGTA tamponunda, lektin yolu aracmtkiler, bu tamponda Ca++ yoksunlugundan dolayßzksik olmaktadlEl Belirli bir teoriye bagllealmak istenmese de, MASP-3'ü eksik serumda gözlemlenen düsük alternatif yol aktivitenin, 3MC hastasIlEl, serumunda aktif faktör D'ye sahip olmasEldan kaynaklandigilîila inanilBiaktadlElve bu hastanI hala MASP-l ve HTRAl'i eksprese ettigi için, profaktör D'nin dönüsümü, düsük seviyelerde olmas. ragmen hala MASP-3 yoklugunda olusabilmektedir. 3. MASP-Z veya MASP-1/3'i'i eksik fare serum/arZÜda mannoz, zimosan ve S. pnömani 039 'da C3b birikiminin ölçümü.

Yöntemler: C3b birikimi, MASP-2-/-, MASP-1/3-/- ve WT farelerinden elde edilen %0 ila %20 araliglia fare serum konsantrasyonlarlZlkullanliârak mannoz, zimosan ve 5. pneumon/'a D39 kaplEl mikrotitre plakalarlda ölçülmüstür. C3b birikim deneyleri, “geleneksel“ alternatif yola özgü kosullar (örn. Ca*+ içermeyen BBS/EGTA/Mg++) altIa veya lektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (örn. BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altIa uygulanmlgtlü Sonuçlar: SEKIL 19A, geleneksel alternatif yola özgü kosullar (örn. Ca++ içermeyen BBS/EGTA/Mg++) altlEtla veya lektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca*+) izin veren fizyolojik kosullar altIa WT, MASP-Z'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak mannoz kaplljnikrotitre plakalarlEUa C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 19B, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca” içermeyen BBS/EGTA/Mg++) aItIa veya Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altIa WT, MASP-Z'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kapllZlmikrotitre plakalar-a C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 19C, geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn.

Ca” içermeyen BBS/EGTA/Mg++) altlEL'Ia veya lektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altIa WT, MASP-2'si eksik ve MASP-1/3'ü eksik farelerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak 5. pneumon/'ae D39 kaplljlnikrotitre plakalarIa C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 20A, %0 ila %1.25 aral[glEtla serum konsantrasyonlarEkullanllârak geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca++ içermeyen BBS/EGTA/Mg++) altIia veya lektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) izin veren fizyolojik kosullar altlEtla mannoz kapll] mikrotitre plakalarlEUa uygulanan, yüksek derecede seyreltilmis serumlarda bir C3b birikim deneyinin sonuçlarIEgrafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 205, %0 ila %1.25 aral[g]Ia serum konsantrasyonlarükullanliârak geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca*+ olmadan BBS/EGTA/Mg++) altlüda veya Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/EGTA/Mg”/Ca”) izin veren fizyolojik kosullar altlEtla zimosan kapllIlmiktrotitre plakalarIa uygulanan bir C3b birikim deneyinin sonuçlarIEgrafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 20C, %0 ila %125 arallgllia serum konsantrasyonlarEkullanugrak geleneksel AP'ye özgü kosullar (örn. Ca** olmadan BBS/EGTA/Mg++) altlîiUa veya Iektin yolunun ve alternatif yolun islev göstermesine (BBS/EGTA/Mg*+/Ca+*) izin veren fizyolojik kosullar altIa 5. pneumon/'ae D39 kaplElmiktrotitre plakalarIa uygulanan bir C3b birikim deneyinin sonuçlarllgrafiksel olarak göstermektedir.

SEKILLER 20A ila C'de gösterildigi üzere, C3b birikim deneyleri aynlîlzamanda mannoz kapllZblakalarda (SEKIL 20A); zimosan kaplEblakalarda (SEKIL 208) ve 5. pneumoni'ae D39 kapllZlplakalarda (SEKIL 20C) %0 ila %125 serum arallgllia yüksek seyreltiler kullanllârak geleneksel alternatif yola özgü kosullar (örn. Ca++ olmadan BBS/EGTA/Mg+*) altIa veya Iektin yolunun ve alternatif yolun Islev göstermesine (BBS/Mg++/Ca++) Izin veren fizyolojik kosullar altIa uygulanmlStlEl Alternatif yollar, daha yüksek serum seyreltileri altIda azalarak kaybolmaktadB böylelikle Ca++ mevcudiyetinde MASP-1/3'ü eksik serumda gözlemlenen LP aktivitesi ve Ca++ mevcudiyetinde MASP-2'si eksik serumdaki aktivite, AP'nin MASP-1/3 arac[l]]]kalan aktivasyonudur.

Bu Örnekte açlEIanan sonuçlar, bir MASP-Z inhibitörünün (veya MASP-Z KO), MASP-3 ile harekete geçirilen alternatif yol aktivasyonunu arttßrak N. men/ng/'Üws enfeksiyonundan önemli ölçüde koruma saglamaktadB Fare serum bakteriyoliz deneylerinin ve insan serum bakteriyoliz deneylerinin sonuçlarlÇI/V. men/'ng/'t/U/'s'e karslîlserum bakterisidal aktiviteyi takip ederek, N. men/hg/Ü'd/'s'e karslîlbakterisidal aktivitenin, MBL eksikliginde mevcut olmamaktadlEl (fare MBL A ve MBL c çift eksik ve insan MBL eksik serumlar).

SEKIL 1, burada saglanan sonuçlar. esaleUa Iektin yolunun ve alternatif yolun yeni anlaylglElElgöstermektedir. SEKIL 1, hem opsonizasyonda ve Iiziste LEA-2'nin rolünü betimlemektedir. MASP-2, fizyolojik olarak çoklu Iektine baglilüayarda "asagEyönde" C3b birikiminin (ve ortaya çllZlan opsonizasyon) baslatmlurken (SEKILL 20A, 205, 20C), aynEl zamanda seruma duyarIEbakteriIerin Iizisinde bir rol oynamaktadE SEKIL 1'de gösterildigi üzere, IV. men/'ng/t/d/s gibi seruma duyarllîibatojenlere yönelik MASP-2'si eksik veya MASP-2'si bosaltllBilgl serum/plazmanI artan bakterisidal aktivitesinden sorumlu olan, önerilen moleküler mekanizma, bakteri Iizisi için, MASP-l ve MASP-3 ile birlesik Iektin yolu tanIiIama komplekslerinin, MASP-l'in MASP-3'ü bölmesine olanak sagland[glE$ekilde bakteriyel yüzeyde birbirlerine yakI bir iliskide baglanmaslîgerekmesidir. MASP-l ve MASP-Z'nin aksine, MASP- 3, bir oto aktif hale getirici enzim degildir, fakat birçok durumda, MASP-l vasEislýla aktivasyonun/bölünmenin, enzimatik olarak aktif formuna dönüstürülmesini gerektirmektedir.

SEKIL 1'de gösterildigi üzere, aktif halde MASP-3 daha sonraleda sÜsMa enzimatik olarak aktif alternatif yol C3 ve C5 konvertazlarElBbBb ve C3bBb(C3b)n'nin formasyonu vaslliislîzla alternatif aktivasyon kaskadIEbaslatmak için patojen yüzeyinde C3b'ye baglEfaktör B'yi bölebilmektedir. MASP-Z taslýlîlîllektin yolu aktivasyon kompleksleri, MASP-3 aktivasyonunda herhangi bir parçaya sahip degildir veya MASP-Z'nin tükenmesinden sonra, tüm Iektin yolu aktivasyon kompleksleri, MASP-l veya MASP-3 ile yüklenecektir. Bu sekilde, MASP-2 yoklugunda, mikrobiyal yüzey MASP-l ve MASP-3 taslîlEEl Iektin yolu aktivasyon komplekslerinde, MASP-3'ün daha aktif hale gelmesine ve mikrobiyal yüzeyde alternatif yol C3 ve C5 konvertazlarlZC3bBb ve C3bBb(C3b)n'yi olusturmak için C3b'ye bagllZfaktör B'nin MASP-3 araciEEbölünmesinin daha yüksek bir oran. yol açtigßekilde birbirlerine yakI bir iliskiye gelip yerlestirmesi olasiJJgiElönemli ölçüde arttlElllBiaktadlE Bu, Membran SaldlElEl Kompleksini olusturan, C6 ile iliskili yüzeye baglECSb'sinden, C7 ile iliskili C5bC6'dan, C8 ile iliskili C5bC6C7'den ve C5bC6C7C8'den olusan, bakteriyel yüzey yap_ eklenen C9 polimerizasyonuna yol açan ve komplemanEhedeflenen bakterinin osmolitik ölümüne yol açacak olan bakteriyel çeperdeki bir gözenegi olusturan terminal aktivasyon kaskadlarlISb- C9 aktivasyonuna yol açmaktadlE Bu yeni konseptin temeli, burada saglanan verinin, SEKIL 1'de gösterildigi üzere lektin yolu aktivasyon komplekslerinin iki ayrlIlaktivasyon yolunu hareket ettirdigini net bir sekilde göstermesidir: Bu örnek, paroksismal nokturnal hemoglobinürinin (PNH) bir fare modelinden elde edilen kan numunelerinden klElnlZElkan hücrelerinin lizisindeki MASP-2 eksikliginin ve/veya MASP-3 eksikliginin inhibitör etkisini göstermektedir.

On Bilgi [Gerekçe: Bazen Marchiafava-Micheli sendromu olarak da ifade edilen paroksismal nokturnal hemoglobinüri (PNH), komplemanEindükIenmis intravasküler hemolitik anemi ile karakterize edilen edinilmis, potansiyel olarak hayati tehlike olusturan kan hastaligillEl PNH'nin özelligi, sonraki hemoglobinüri ve anemi ile PNH eritrositlerde kompleman düzenleyicileri CD55 ve CD59'un yoksunlugundan dolayEI kompleman. alternatif yolunun düzenlenmemis aktivasyonunun bir sonucu olan kronik kompleman araciliiîhtravasküler hemolizdir. Lindorfer, M.A., ve ark., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, kaynaklanmaktadE PNH'nin semptomlarü Idrar, sI agrEIZI yorgunluk, nefes darligiElve trombozda hemoglobin görünümünden dolayEkanIEljrini içermektedir. “Birincil PNH” olarak ifade edilen veya aplastik anemi gibi diger kemik iligi rahatsiZilZlarIlEl baglamIa, “ikincil PNH” olarak ifade edilen PNH kendi bas. gelisebilmektedir. PNH'nin mevcut tedavisi, anemi için kan nakli, tromboz için antikoagülasyon ve kompleman sistemini inhibe ederek immün y-ilEb karsElkan hücrelerini koruyan monoklonal antikorun (ekulizumab (Soliris®)) Ekulizumab (Soliris®), C5a üretimini ve MAC tertibatIEönledigi sekilde C5 konvertazlarlîile bölünmeyi bloke ederek kompleman bileseni C5'i hedef alan bir insanlastlElllIhlgl monoklonal antikordur. PNH hastalarlEJI ekulizumab ile tedavisi, Iaktat dehidrogenaz (LDH) ile ölçüldügü üzere, hastalar. yaklasElZJ yar-a bagslîl hemoglobin stabilizasyonu ve nakline yol açan intravasküler hemoliz azalmasElile sonuçlanmßtß (Hillmen P, ve ark., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). Ekulizumab içeren tedaviye tabi olan neredeyse tüm hastalar, normal veya neredeyse normal LDH seviyelerine (intravasküler hemoliz kontrolünden dolay[)Z] ulaslîken, hastalarI sadece yaklasilîl üçte biri, yaklasiIZl llgr/dL bir hemoglobin degerine ulasmaktadlElve ekulizumab tedavisinde kalan hastalar, yaklasim olarak esit oranlarda orta ila siddetli (yani nakle bagID] anemi sergilemeye devam etmektedir hastalarlEllEl, membrana bagIECB fragmanlar.. PNH eritrositlerde opsoninler olarak çallglnasü ile sonuçlanarak ve spesifik C3 reseptörleri ve sonraki ekstravasküler hemoliz vasiüslsîla retiküloendotelyal hücrelerde tutulmalarüile sonuçlanarak PNH eritrositlerin büyük bir bölümüne baglanan C3 fragmanlarEI içerdigi (tedavi edilmemis hastalar için geçerli olmamlStlE) göstermistir. Bu sekilde, ekulizumab kullan“ ek olarak, klElnlîElkan nakillerine ihtiyaç duymaya devam ettikleri için C3-fragman&racilîüîekstravasküler hemoliz gelistiren bu hastalar için terapötik stratejilere gereksinim duyulmaktadlîl Bu örnek, bir PNH fare modelinde elde edilen kan numunelerinden klîilnlZD açlKIamaktadlEI ve PNH'den muzdarip olan deneklerin tedavi edilmesine yönelik MASP-2 inhibisyonunun ve/veya MASP-3 inhibisyonunun verimliligini göstermektedir ve aynûamanda ekulizumab gibi bir C5 inhibitörü ile tedaviye tabi olan PNH deneklerinde C3 fragman aracil]]:l ekstravasküler hemolizin etkilerini hahfletmek için MASP-2'nin inhibitörlerinin ve/veya MASP- 3'ün inhibitörlerinin (çift veya bispesifik MASP-2/MASP-3 inhibitörleri içermektedir) kullanIiIIZI desteklemektedir.

Yöntemler: PNH hayvan modeli: Kan numuneleri, Crry eksilikleri olan geni hedeflenmis farelerden ve C3 (Crry/C3-/-) ve CD55/CD59'u eksik farelerden elde edilmistir. Bu farelerin, eritrositlerinde ilgili yüzey kompleman düzenleyicileri eksiktir ve b eritrositler, bu sekilde PNH insan kan hücrelerinde oldugu gibi spontane kompleman otolizisine duyarllîolmaktadlü Bu eritrositleri daha fazla duyarlilâstlünak için, bu hücreler, mannoz ile kaplama ile ve kaplama olmadan kullanilBilStEve daha sonrasia WT C56/BL6 plazmasÇlMBL'si degersiz plazma, MASP-Z -/- plazma, MASP-1/3 -/- plazma, insan NHS, insan MBL -/plazma ve insan MASP-2 antikoru ile tedavi edilen NHS'de hemoliz için test edilmistir. çift eksik mürin eritrositlerinin hemoliz denemesi Gün 1. Mürin RBC'sinin (± mannoz kaplamasmpreparasyonu.

Dahil edilen malzemeler: taze fare kanüBBS/Mg++/ Ca++ (4.4 mM barbiturik asit, 1.8 mM sodyum barbiton, , krom klorür, CrCI3' ve mannoz, BBS/Mg++/Ca++'da 100 ug/mL.

Tüm kari (2 mL), 4°C'de sogutulmus santrifüjde 2000xg'de 1-2 dakikallgllüa asagEekilmistir.

Plazma ve beyaz kan hücrelerinin bir tabakasÇlaspire edilmistir. Numune daha sonrasIa, 2 mL buz soguklugunda BBS/jelatin/Mg++/Ca++ ve tekrar eden santrifüjleme adIiIa RBC topagII yeniden asklîla aIElnasEile 3x ylKlanmlStlEl Üçünü ylKamadan sonra, topak, 4 mL BBS/Mg”/Ca”'da yeniden asklýb aIIErnlgtE RBC'nin bir 2 mL tamböleni, bir kapIEbImayan kontrol olarak ayrllüilgtlü Kalan 2 mL miktara 2 mL CrCI3 ve 2 mL mannoz eklenmistir ve numune, 5 dakikallgl. RT'de (oda slîhkllgilEUa) nazikçe karlgtlEllârak inkube edilmistir.

Reaksiyon, 7.5 mL BBS/jelatin/Mg++/Ca++ eklenerek sonlandEllBHStE Numune, yukarlîzlla oldugu gibi asagElçekiImis, 2 mL BBS/jelatin/MgH/CaH'da yeniden asklýla aIlErnlSl ve yukar-ki gibi iki defa daha ylKlanmlgl daha sonrasIa 4°C'de depolanmlgtlEl Gün 2. Hemoliz denemesi Malzemeler, BBS/jelatin/MgH/CaJ'+ (yukarlîlla oldugu gibi), test serumlarÇl96 hazneli yuvarlak tabanIElve düz tabanIIZIpIakalar ve 410 ila 414 nm'de 96 hazneli plakalarElokuyan bir spektrofotometreyi içermistir.

RBC konsantrasyonu ilk olarak belirlenmistir ve hücreler, 109/mL'ye ayarlanmlstlîl ve bu konsantrasyonda depolanmßtlü KullanIi öncesinde, hücreler, deney tamponunda 108/mL'ye seyreltilmistir ve daha sonrasia hazne bas. 100 ul kullanilîhlgtlEl Hemoliz, 410 ila 414 nm'de ölçülmüstür (. Test serumlarII seyreltileri, buz soguklugunda BBS/jelatin/Mg++/Ca++'da hazlîllanmlgtlü 100ul her bir serum seyreltisi, yuvarlak tabanllîlplakaya pipetlenmistir. YaklasilZi olarak 100 ul seyreltilmis RBC preparasyonu eklenmistir (yani. 108/mL), yaklas[lZl 1 saatligine 37°C'de inkube edilmistir ve Iizis için gözlemlenmistir. (Plakalar, bu noktada fotograflanabilmektedir).

Plaka daha sonrasIda 5 dakikaliglüia maksimum hlîda asagüekilmistir. 100 ul slîljiaz aspire edilmis, düz tabanllîplakalara aktarilüilgl ve CD, 410 ila 414 nm'de kaydedilmistir. RBC topaklarlîlkalmlgtE (bunlar daha sonrasIa bir ters sonucu elde etmek için suyla çözünebilmektedir).

Taze kan, CD55/CD59 çift eksik farelerden elde edilmistir ve Crry/3 çift eksik farelerin kanül'e eritrositleri, yukari protokolde kapsamlElolarak açiElandlglElgibi hazlEIlanmlStlB Hücreler, bölünmüstür ve hücrelerin yarlâü mannoz ile kaplanmlgtlEl ve diger yarElJ nihai konsantrasyonu 108/mL'ye düzenleyerek tedavi edilmemis kalmlStIEl bunun 100 ul miktarl;l yukar- açilZIand [gilgibi uygulanan hemoliz deneyinde kullanilüilgtEl Denev #1 Sonuclarlîl Lektin volu. PNH hayvan modelinde eritrosit lizisine dahil edilmektedir Bir ilk deneyde, kapllZlolmayan WT fare eritrositlerinin, herhangi bir fare serumunda çözünmedigi belirlenmistir. Mannoz kapllIrry-/- fare eritrositlerinin, WT fare serumunda (37 derecede 3 saatten daha fazlasD] yavasça çözündügü, fakat MBL'siz etkisiz serumda çözünmedikleri belirlenmistir. (Veri gösterilmemistir).

Mannoz kapllIrry-/- fare eritrositlerinin, insan serumunda hlîIEbir sekilde çözündügü, fakat mtkisiz halde NHS'de çözünmedigi belirlenmistir. Önemli bir sekilde, mannoz kaplElErry-/- çallglnamaktadEMP islevsel aktivite, %8 serum konsantrasyonunun ait. önemli ölçüde azaltllîhlgtß.

Deney #1 ;[EarlEilarEl Mannoz kaplElCrry-l- fare eritrositleri, MBL içeren yüksek derecede seyreltilmis insan serumunda oldukça iyi bir sekilde çözünmüstür, fakat MBL içermeyen serumda çözünmemistir. Test edilen her bir serum konsantrasyonunda etkili Iizis, alternatif yolun dahil serumunun ve insan serumunun, mannoz kapllZlCrry-/- fare eritrositlerini çözememe kabiliyetsizligi aynüamanda klasik yolun gözlemlenen lizisi ile yapacak bir bir seyi olmad[giIEl göstermektedir. Lektin yolu tanIilama molekülleri gerekli oldugu için (örn. MBL), bu Iizis, lektin yolu ile yönlendirilmektedir.

Taze kan, Crry/C3 ve CD55/CDS9 çift eksik farelerden elde edilmistir ve mannoz kapllIrry-/- fare eritrositler, asag Eibki insan serumunun mevcudiyetinde yukar- açilZlandlgiügibi hemoliz deneyinde analiz edilmistir: MASP-3 -/-; MBL'si etkisiz; WT; insan MASP-2 antikoru ile önceden tedavi edilmis NHS; ve bir kontrol olarak @Elitkisiz halde olan NHS.

Deney; #2 Sonuç/mm MAST-Z inhibitörleri ve MASP-3 eksikligi; PNH hamam modelinde eritrosit Iizisi önlemektedir.

Mannoz kaplEICrry-/- fare eritrositleriyle, NHS, 1/640'a seyreltilen seyreltilerde inkube eksik serum (3MC hastadan) ve MASP-2 mAb ile önceden tedavi edilen NHS ve bir kontrol olarak @Etkisiz halde NHS.

ELISA mikrotitre plakasElasaglZlçekilmistir ve çözünmemis eritrositler, yuvarlak hazne plakasII tabanlElda biriktirilmistir. Her bir haznenin süpernatantEtoplanmlstlElve çözünmüs eritrositlerden salIn hemoglobin miktarü bir ELISA okuyucusunda OD415 nm okunarak ölçülmüstür.

MASP-3-/- serumunun, mannoz kaplEIlare eritrositlerini tamamen çözemedigi gözlemlenmistir.

Beklendigi üzere kontrol mktif halde olmayan NHS'de (negatif kontrol), herhangi bir Iizis gözlemlenmemistir. MBL-/- insan serumu, 1/8 ve 1/16 seyreltilerde mannoz kaplElfare eritrositlerini çözmüstür. MASP-2 antikoru ile önceden tedavi edilmis NHS, 1/8 ve 1/16 seyreltilerde mannoz kaplEIfare eritrositlerini çözerken, WT insan serumu, mannoz kaplü eritrositleri seyreltileri 1/32 oranIa çözmüstür.

SEKIL 21, MASP-Z antikoru ile öncesinde tedavi edilen MASP-3-/-, EEEEtkisiz halde (HI) NHS, MBL-/-, NHS ve NHS kontrolünden serumda serum seyreltilerinin bir arallgllîboyunca insan serumla mannoz kapIEl mürin eritrositlerinin hemolizini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin (Crry/C3-/-) hemoglobin saIIIiElIe ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 22, MASP-Z antikoru ile öncesinde tedavi edilen MASP-3-/-, Iîlîlîétkisiz halde (HI) NHS, MBL-/-, NHS ve NHS kontrolünden serumda serum konsantrasyonunun bir arallglj boyunca insan serumla mannoz kapIEmürin eritrositlerinin hemolizini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin (Crry/C3-/-) hemoglobin salIIiEile ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 21 ve 22'de gösterilen sonuçlarIan, MASP-3'ün inhibe edilmesinin, otolog kompleman aktivasyonundan eksik koruma ile duyarlllâstEIlân eritrositlerin herhangi bir kompleman araclIJIIizisini önlemeyecegi gösterilmektedir. MASP-Z antikoruna sahip MASP-Z inhibisyonu, CHso'yi önemli ölçüde degistirmistir e belirli bir ölçüde koruyucu olmustur, fakat MASP-3 inhibisyonu daha etkili olmustur.

Crry/C3 ve CD55/CD59 çift eksik farelerden taze kandan elde edilen, kapIEblmayan Crry-I- fare eritrositleri, asaglfIEiki serumlarI mevcudiyetinde yukarIElla açElZland[g]l:lgibi hemoliz deneyinde analiz edilmistir: MASP-3 -/-; MBL-/-; WT; insan MASP-Z antikoru ile önceden tedavi edilmis NHS; ve bir kontrol olarak EIEIEEtkisiz halde olan NHS.

Sonuçlar: SEKIL 23, bir 3MC (MASP-3-/-) hasta, mtkisiz halde (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 antikoru ile önceden tedavi edilen NHS ve NHS kontrolünden insan serumlarIda serum konsantrasyonlarII bir arallglEIboyunca kaplüolmayan mürin eritrositlerinin hemolizini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen WT fare eritrositlerinin hemoglobin salIHEiIe ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 23'te gösterildigi ve TABLO 12'de kompleman arac[l]]]]zisini inhibe ettigi gösterilmistir.

SEKIL 24, @Etkisiz halde (HI) NHS, MBL-/-, MASP-2 antikoru ile önceden tedavi edilen NHS ve NHS kontrolünden alin insan serumlarIa serum konsantrasyonlarII bir araligilîl boyunca kaplEblmayan mürin eritrositlerinin hemolizini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerinin (CD grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 24'te gösterildigi ve TABLO 12'de özetlendigi üzere, MASP- 2'nin inhibe edilmesinin, bir klglflllîölçüye koruyucu oldugu gösterilmistir.

TABLO 12: CHSÜ degerleri, serum konsantrasyonlarüblarak ifade edilmektedir Serum WT CDSSIS9 -/- 3MC hasta Lizis yok Lizis yok MBL AO/XX donörü (MBL'si eksik) %72 %2.1 NHS + MASP-Z Antikoru %5.4 %1.5 Not: “CH50”, kompleman araclEDBiemoIizin %50'ye ulastlgllîilioktadadlü KlglacasÇl bu Örnekte bulunan sonuçlar, MASP-3'ün inhibe edilmesinin, otolog kompleman aktivasyondan eksiksiz koruma ile duyarlllâstmlg ve duyarlllâstlîlliiamlgl eritrositlerin belirli bir ölçüye kadar koruyucu olmaktadE Bu sekilde, MASP-Z ve MASP-3 inhibitörleri tek bas. veya kombinasyon halinde (örn. birlikte uygulanarak, slBillElarak uygulanarak) veya MASP-Z/MASP3 bispesifik veya çift inhibitörler, PNH'den muzdarip olan denekleri tedavi etmek için kullanllâbilmektedir ve aynüamanda ekulizumab (Soliris®) gibi bir C5 inhibitörü ile tedaviye tabi olan PNH hastalarIa ekstravasküler hemolizi hafifletmek için (örnegin siddetini inhibe etmek, önlemek veya azaltmak için) kullanllâbilmektedir.

Bu Örnek, WT veya MASP-1/3-/- fare serumlarII mevcudiyetinde Iizise yönelik mannoz kapllZl tavsan eritrositlerini test eden bir hemoliz deneyini açlKlamaktadlEl Yöntemler: 1. Fare MASP-1/3'ü eksik serum/arda ve WT kontrol serum/arßda tavsan RBC'sinin (mannoz kap/Jhemaliz denemesi Gün 1. Tavsan RBC'sinin preparasyonu.

Dahil edilen malzemeler: taze tavsan kanEBBS/ Mg++/Ca++ (4.4 mM barbiturik asit, 1.8 mM sodyum barbiton, , %0.1 jelatin içeren BBS/ Mg++/Ca+*, tamponda dahil edilen krom klorür; yani. CrCI3.6 HZO (BBS/ Mg++/Ca++'da 0.5 mg /mL) ve mannoz, in 885/ Mg++/Ca"+'da 100 ug/mL. 1.Tavsan tüm kan (2 mL), iki 1.5 mL eppendorf tüplerine bölünmüstür ve 4°C'de bir sogutulmus eppendorf santrifüjünde 8000 dds'de (yaklasiEJ 5.9 rcf) 3 dakikal[giI santrifüjlenmistir. RBC topagübuz soguklugunda BBS/MgH/CaH'da yeniden asklîla allErna sonrasiEUa üç defa yilZlanmlStEl Üçünü yilZlamadan sonra, topak, 4 mL BBS/Mg++/Ca++'da yeniden asklýb allümlgtlü Bu tambölenin iki mL miktarü kaplanmamlgl kontrol olarak kullaniiâcak olan bir 15 mL falkon tüpe eklenmistir. Kalan 2 mL RBC tambölen, 2 mL CrCl3 tamponunda seyreltilmistir, 2 mL mannoz çözeltisi eklenmistir ve süspansiyon, nazikçe karlgtlEllârak 5 dakikaligiiüia oda slîlakligilüda inkube edilmistir. Reaksiyon, 7.5 mL BBS/%0.1 jelatin/Mg++/Ca++'yEkarIsIEiia ekleyerek sonlandlEllmlgtiEl Eritrositler topaklanmgtßve RBC'Ier, yukari açiElandiglü gibi BBS/%0.1 jelatin/Mg`”'/Ca++ ile iki defa ylkîanmlgtlîl RBC süspansiyonu, 4°C'de BBS/%0.1 jelatin/ Mg++/Ca++'da depolanmlStB olarak 5.9 rcf) asagüçekilmistir ve süpernatantlEl OD'si, 541 nm'de 0.7'ye düzenlenmistir (541nm'de . 3.Yeniden askiya al-n RBC, BBS/%0.1 jelatin/Mg*+/Ca++ ile 108 /mL bir konsantrasyona seyreltilmistir. 4.Test serumlarII seyreltileri, buz soguklugunda BBS/jelatin/ Mg++/Ca++'da hazlEIlanmlgtIEl 100 ul her bir seyrelti, yuvarlak tabanllîililakanl ilgili haznesine pipetlenmistir. YaklaslKi olarak seyreltilmis , her bir hazneye eklenmistir. Tam lizisin bir kontrolü olarak, saflastlîllüugl su ( ile karlgtlEllIHken, serum ( içermeyen BBS/%0.1 jelatin/Mg++/Ca++, bir negatif kontrol olarak kullanüüîlgtß Plaka daha sonrasIa 37°C'de 1 saatligine inkube edilmistir.

.Yuvarlak tabanIlIiNaka 5 dakikaliglEb 3250 dds'de santrifüjlenmistir. Her bir hazneden ( süpernatant, bir düz tabanlElpIakanI ilgili haznelerine aktarllüilSIlEl ve CD, 415 ila 490nm'de bir ELISA okuyucusunda okunmustur. Sonuçlar OD'nin 415 nm'de 49 Onm'ye oranEI olarak bildirilmektedir.

Sonuçlar: SEKIL 25, MASP-1/3-/- ve WT kontrolünden serumda serum konsantrasyonunun bir araligilîl boyunca fare serumla mannoz kaplEtavsan eritrositlerinin hemolizini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin hemoglobin salIIiEliIe ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 25'de gösterildigi üzere, MASP-3'ün inhibe edilmesinin, mannoz kapIüNT tavsan eritrositlerinin kompleman aracÜJIlizisini öngördügü gösterilmektedir.

Bu sonuçlar aynlîtamanda Örnek 5'de açilZlandgEgibi bir veya birden fazla PNH yönünün tedavisine yönelik MASP-3 inhibitörlerinin kullanIiIlîllestekIemektedir.

Bu örnek, alternatif yolun, Ca++ mevcudiyetinde faktör D'si eksik serumda aktif hale getirildigini göstermektedir.

Deney #1 : Alternatif yola özgü kosullar altZEda C3b birikim denemesi Yöntemler: Bir zimosan kaplünikrotitre plakasütla bir C3b birikim deneyi: faktör D-/-; MASP- -/-; ve WT gibi fare serumlarlEllEl artan seyreltileri kullanuârak alternatif yola özgü kosullar (BBS/EGTA/Mg”, Ca** yok) aItIda uygulanmlgtirîi Sonuçlar: SEKIL 26, alternatif yola özgü kosullar aItIia uygulanan bir C3 birikim deneyinde faktör D- /-, MASP-Z-/-; ve WT fare serumlarütlan serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak C3b birikiminin seviyesini (CD 405 nm) grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 26'da gösterildigi üzere, bu kosullar aItIa, faktör D -/- fare serumu, C3'ü tamamen aktif hale getirmemektedir ve alternatif yol çalignamaktadB MASP-2-/- serumu, WT serumu olarak benzer bir oranda alternatif yol aktivasyonunu göstermektedir. Bu sonuçlar, Ca++ 3'ün, MASP-l, MASP-3 aktif hale getirici enzim ve ilgili karbonhidrat tanIiIama bilesenlerine sahip MASP-3'ün etkilesimleri Ca“”ya baglilüildugu için bu kosullar altIa enzimatik olarak aktif formuna dönüstürülememesine dair kanltlh tutarIIlB Deney #2: Fizyolojik kosullar altlîi'da C3b birikim denemesi; Yöntemler: Bir C3b birikim deneyi, faktör D -/-; MASP-2 -/-; ve WT gibi fare serumlarII artan seyreltileri kullanüârak fizyolojik kosullar altIa (BBS/Ca++/Mg++) (LP ve AP'nin islev göstermesine izin vermektedir) uygulanmlgtlîl Sonuçlar: SEKIL 27, fizyolojik kosullar (Ca++ mevcudiyetinde) altIa uygulanan bir C3b birikim deneyinde faktör D-/-; MASP-2-/-; ve WT farelerden serumlarI numuneleri kullanilârak serum konsantrasyonunun bir islevi olarak C3b birikim seviyesini (CD 405 nm) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 27'de gösterildigi üzere, faktör D-/- fare serumu, gösterilen serum seyreltileri vasltâslýla WT seruma klýlasla herhangi bir fark içermeyen lektin ve alternatif yol vasltâlea C3'ü aktif hale getirmektedir. MASP--/- serumu, sadece alternatif yolla düsük serum seyreltilerinde C3 dönüsümünü göstermektedir (örn. MASP-3 ile harekete geçirilen alternatif yol aktivasyonu). Bu sonuçlar, Ca** mevcudiyetinde, MASP-3'ün, alternatif yolu harekete geçirebilmesi kaydlsîla faktör D'nin gerekli olmadlglllîgiöstermektedir.

Deney #3: MASP-Z mAb mevcudiyetinde veya yaksunlugunda faktör B veya faktör D'de eksik olan Fare Serum/arümllanzürak C3b Birikim Denemesi Yöntemler: Bir C3b birikim deneyi, asag-ki gibi mannoz kaplülnikrotitre plakalarIa fizyolojik kosullar (BBS/Ca++/Mg++) altIa uygulanmlgtlü sodyum azid, pH 9.6) mannoz (1 ug/mL) ile 4°C'de gece boyunca kaplanmlStlB 2.Sonraki gün, kalan protein baglama bölgeleri, BBS'de (4 mM barbital, 145 mM NaCl, 2 mM CaClz, 1 mM MgClz, pH 7.4) %0.1 HSA içeren 250 ul/hazneyle oda slîtikllglia 2 saatligine bloke edilmistir. 3.Plakalar, ylElama tamponu (% ile üç defa yilgnmlglîl 4.BBS'de 1:10 oranIa seyreltilen serum, belirtilen süre noktalarlEUa haznelere eklenmistir.

Sadece tamponu taslýlan hazneler, negatif kontroller olarak kullanüBilStlEl Plaka, 40 dakikaya kadar 37°C'de inkube edilmistir.

.Plakalar daha sonraleUa yikama tamponu ile 3 defa ylKbnmlStiB 6.Daha sonrasIa ylElama tamponunda 1:5000 oranIa seyreltilen 100 ul tavsan anti-insan C3c (Dako), haznelere eklenmistir ve plakalar, 37°C'de 90 dakikal[g]lEa inkube edilmistir. 7.Y[Ebma tamponu ile üç defa yiKlandiEtan sonra, yiElama tamponunda 1:5000 oranIa seyreltilen 100 pl alkalin fosfataz-konjüge anti tavsan, haznelere eklenmistir, bunu oda slîlakllgia 90 dakikaligi- inkubasyon takip etmistir. 9.15 dakikaligil inkubasyondan sonra, optik yogunluk OD 405 nm'de ölçülmüstür.

Sonuçlar: SEKIL 28, fizyolojik kosullar (Ca++ mevcudiyetinde) altIia uygulanan bir C3b birikim deneyinde MASP-Z mAb mevcudiyetinde veya yoksunlugunda faktör D-/- veya faktör B-/- farelerinden elde edilen fare serum numunelerinde serum inkubasyon süresinin (dakika) bir islevi olarak C3b birikim seviyesini (CD 405 nm) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 28'de gösterildigi üzere, WT ve faktör D/- serumunda C3b birikim miktarIa herhangi bir fark yoktur, bu da MASP-3'ün, faktör D'nin mevcut olmadiglEljurumlarda bile alternatif yol aktivasyonunun baslatabildigi sonucunu güçlü bir sekilde desteklemektedir. Gözlemlenen sinyalin, lektin yolu ve alternatif yol aktivasyonundan kaynaklandl'giülüsünülmektedir. SEKIL 28'de gösterildigi üzere, faktör D-/- artEMASP-Z mAb, sadece MASP-3 araclIJDalternatif yol aktivasyonunu göstermektedir. Faktör B-/- artIZMASP-Z mAb sadece geçmis olmustur (veri gösterilmemistir). IsEßtkisiz halde serum, MASP-2 içeren faktör D-/- ve faktör B-/-'ye özdes olan geçmis kontrol degeri olarak kullanHBjlsHElWeri gösterilmemistir).

Klîacasü bu Örnekte bulunan sonuçlar, faktör D'nin, sadece fizyolojik olmayan kosullar aItIa temel olmadiglllIQCa” yoksunlugunda BBS/EGTA/ Mg“”da alternatif yol aktivasyonu için test edildiginde) göstermektedir. Buna karslEl, alternatif yolun MASP-3 vasBslýla aktif hale getirilmesine olanak saglayan fizyolojik kosullar aItIia (Ca++ mevcudiyetinde) alternatif yol aktivasyonu için test edildiginde, faktör D'si eksik serum, WT kontrolüne külasla alternatif yol aktivitesinde tamamen eksik olmamaktadE Bu sekilde, fizyolojik kosullar altIa faktör D, alternatif yol aktivasyonunun baslatilîhasIlEl MASP-3 ile harekete geçirilmesi aç-an gereksiz olmaktadlEI Bu sonuçlar, lektin yolunun, MASP-3'e bagIilElaktivasyon eylemi vasiiîiislýia AP aktivasyonunu yönlendirmesi sonucunu desteklemektedir.

Bu örnek, insan MASP-1, MASP-2 veya MASP-3'e karsElmürin monoklonal antikorlarlrîl üretilmesine yönelik ve çift, bispesifik veya pana özgü MASP antikorlarII üretilmesine yönelik örnek teskil eden yöntemleri açiiZiamaktadlEi 1. MASP antikarlarZEZE meydana getirilmesine yönelik yöntemler 8 ila 12 haftallEJ erkek A/J farelere (Harlan, Houston, Tex.), 100 09 insan tam uzunlukta polipeptitler subkütanöz olarak enjekte edilmektedir: pH 7.4'de tam Freund adjuvanIa (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) TABLO 2'de belirlendigi gibi rMASP-l (SEKANS KIMLIK NUMARASI:10), rMASP-2 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:5) veya rMASP-3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) veya bunlari antijen fragmanlarEiIki hafta sonra, farelere, tamamlanmamlglFreund adjuvanIa 50 ug ayn [ihsan polipeptidi subkütanöz olarak enjekte edilmektedir. AItlEtIZhaftada, farelere, PBS'de 50 iJg aynlîlnsan polipeptit enjekte edilmektedir ve 4 gün sonra kaynasilîihale getirilmektedir.

Her bir füzyon için, tekli hücre süspansiyonlarÇl immünize bir farenin dalaglühan hazlîlianmakta ve Sp2/0 miyelom hücreleri Içeren füzyonu Için kullanilBiaktadlEi SpZ/O ve ve %5 dimetilsülfoksit (Sigma Chemical C0., St. Louis, Mo.) içeren bir ortamda kaynasiEl hale getirilmektedir. Hücreler daha sonrasüda %10 fetal bovin serumu, 100 birim/ml penisilin, 100 ug/ml streptomisin, 0.1 mM hipoksantin, 0.4 uM aminopterin ve 16 uM timidin ile desteklenen Iscove ortamIa (Gibco, Grand Island, N.Y.) 200 ul süspansiyon bas.1.5x105 dalak hücrelerinin bir konsantrasyonuna ayarlanmaktadlü Iki yüz mikro litrelik hücre süspansiyonu, yaklasilîl yirmi 96-hazneli mikro kültür plakasII her bir haznesine eklenmektedir. YaklasilZ] on gün sonra, kültür süpernatantlarübir ELISA denemesinde hedefi saflastlîiliilg antijen (TABLO Z'den MASP-1, MASP-2 veya MASP-3 antijen fragmanlIliIe reaktiviteye yönelik olarak görüntüleme için çekilmektedir.

ELISA Denemesi (MASP-Z'ye referansla açiElanmaktadlE): Immulon 2 mikrotest plakalarII hazneleri (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.), oda leiaklEgJIa gece boyunca 50 ng/mL miktarIa 50 i.il saflastlElIBilgl hMASP-Z eklenerek kaplanmaktadlEl Kaplama için kullanllân düsük konsantrasyonlu MASP-Z, yüksek affinite antikorlarII seçimini mümkün hale getirmektedir. Kaplama çözeltisi, plakanlB] fiskelenmesi ile çlEarIlthan sonra, PBS'de 200 ul BLOTTO (yagslîl kuru süt), özel olmayan alanlarEbIoke etmesi için bir saatligine her bir hazneye eklenmektedir. Bir saate sonra, hazneler bir tampon PBST (%0.05 Tween 20'yi içeren PBS) ile ylEanmaktadlEI Her bir füzyon haznesinden (50 uL) kültür süpernatantlarDSO pl BLO'I'I'O ile karlgtlülßwakta ve daha sonraleha mikro test plakalarII bireysel MASP-Z kapllZl haznelerine eklenmektedir. Bir saatlik inkubasyon sonrasIa, hazneler, PBST ile yliZlanmaktadlElve MASP-Z'ye antikor baglantlîlÇIyabanturpu peroksidaz (HRP)-konjügeli keçi anti fare IgG (FC'ye özgü) eklenerek tespit edilmektedir (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.). HRP konjüge anti-fare IgG, gürültü oran. uygun bir sinyali saglamak için BLO'I'I'O'da uygun bir sekilde seyreltilmektedir ve her bir numune içeren hazneye eklenmektedir. YlEhma sonras-a, baglD-IRP konjüge antikor, peroksidaz sübstrat çözeltisi ile tespit edilmektedir. %0.1 3,3,5,5 tetrametil benzidin (Sigma, St. Louis, Mo.) ve renk gelisimi için haznelere eklenmektedir. Reaksiyon, hazne basi 50 ul 2M HZSO4 eklentisi ile sona erdirilmektedir ve 450 nm reaksiyon karEsZlEJlIa optik yogunluk, bir BioTek ELISA Okuyucu ile ölçülmektedir (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Baglama Denemesi (MASP-2'ye referansla açlKIanmaktadlE): Yukari tarif edilen MASP-2 ELISA deneyinde pozitif test edilen kültür süpernatantlarÇl MASP-Z inhibitörlerinin, MASP-2'ye sahip olduklarübaglaylîljiffinitenin belirlenmesi için bir baglama deneyinde test edilebilmektedir. Benzer bir deney, inhibitör maddelerinin, kompleman sisteminde diger antijenlere baglanliîl baglanmad[giII belirlenmesi için kullanlßbilmektedir.

Polistiren mikro titre plaka hazneleri (96-hazneli ortam baglayEEtilakalar, Corning Costar, Cambridge, MA), 4°C'de gece boyunca fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4'te MASP-Z (20 ng/ 100 ul/hazne, Advanced Research Technology, San Diego, CA) ile kaplanmaktadlB MASP- 2 çözeltisinin aspire edilmesinden sonra, hazneler, oda lelakHglEkja 2 saatligine %1 bovin serum albüminini (BSA; Sigma Chemical) içeren PBS ile bloke edilmektedir. MASP-Z kaplamasEblmayan hazneler, önceki kontroller olarak hareket etmektedir. BSA PBS bloke edici çözeltisinin çesitli konsantrasyonlarda hibridom süpernatantlarII tam bölenleri veya saflastlîllBilgl MASP-2 MoAb'ler, hazneye eklenmektedir. Oda lehkligllEUa iki saatlik bir inkubasyondan sonra, hazneler kapsamlEliJir sekilde PBS ile durulanmaktadE MASP-Z'ye bagIEI MASP-Z MoAb, bloke edici çözeltide peroksidaz konjüge keçi anti-fare IgG'nin (Sigma Chemical) eklentisi ile tespit edilmektedir, oda slîlakliglia 1 saatligine inkube edilmesine olanak saglanmaktadlîl Plaka, PBS ile boylu boyunca durulanlEI ve 100 pl of 3,3',5,5'- tetrametil benzidin (TMB) alt tabakasEaKirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) eklenmektedir. TMB reaksiyonu, 100 pl miktarIla 1M fosforik asit eklentisi ile sönümlenmektedir ve plaka, bir 450 nm mikro plaka okuyucusunda (SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) nm miktarIa okunur.

Pozitif haznelerden kültür süpernatantlarüdaha sonrasIa burada açlKIandlglElgibi C4 bölünme deneyi gibi islevsel bir deneyde kompleman aktivasyonunun engellenmesi kabiliyeti için test edilmektedir (Örnek 9). Pozitif haznelerde bulunan hücreler, seyrelti klglflhnarak klonlanmaktadE MoAb'lar, yukarlBh tarif edildigi gibi bir ELISA'da hMASP-Z ile reaktivite için tekrardan test edilmektedir. Seçilen hibridomlar, çeviri siselerde ve protein A afinite kromatografisi ile antikor saflastlülnasüiçin toplanan harcanmlgl kültür süpernatantlEUa büyütülmektedir.

MASP-2 antikorlarÇlörnegin Örnek 9'da açiEJandlglEgibi bir C4 bölünme deneyinde LEA-2 inhibitör aktivitesi için test edilebilmektedir.

Yukarlab bahsi geçen ELISA ve Baglama Deneyi, MASP-Z'ye referans açHGanlElken, aynElELISA ve baglama deneylerinin, MASP-l veya MASP-3 polipeptitler ve bunlar. antijen fragmanlarEl (örn. TABLO 2'de aç[lZland[g]Ic_l;ibi) kullan ugrak uygulanabilmesi teknikte tecrübe sahibi kisiler tarafIan anlasilâcaktE MASP-3 antikorlarüörnegin Örnek 4'de açiElandiglEgibi bir C3b birikim deneyinde, Örnek 5'de açilZIand[glIIgibi bir hemoliz deneyinde bir MASP-3 sübstratII MASP-3 serin proteaz bölünmesinin inhibisyonu ve LEA-1 inhibitör aktivitesi için test edilebilmektedir. MASP-l antikorlarü örnegin Örnek 4'de aç[lZIand[gll:lgibi bir C3b birikim deneyinde ve Örnek 5'de açUZIandlgiEgibi bir hemoliz deneyinde, bir MASP-l sübstratII MASP-l serin proteaz bölünmesinin inhibisyonu için, MASP-3 aktivasyonunun inhibisyonu için ve LEA-1 inhibitör aktivitesi için test edilebilmektedir. 2. Çift-MASPAntikor/arlülîi' Meydana Getirilmesine Yönelik Yöntemler MASP-2/3 cift inhibitör antikorlarlîl SEKIL 4, 6 ve 7C'de gösterildigi üzere, serin proteaz aianiiia MASP-2 ve MASP-3 arasiiia korunan, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 ve SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in beta zinciri ile kodlanan bölgeler mevcuttur. Bu sekilde, bir çift MASP-2/3 antikoru, yukarlâb açllîland[g11_iibi bir monoklonal antikoru üretmek için SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5'in (veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) beta zinciri gibi MASP-z'nin (veya MASP-3) serin proteaz alanElçeren veya bu alandan olusan bir antijen kullanilârak üretilebilmektedir veya alternatif olarak bu antijenler, bu antijenlere spesifik olarak baglanan klonlara yönelik bir faj kütüphanesini görüntülemek için kullanüâbilmektedir, bunu MASP-3'e (veya MASP-l) çift baglantII görüntülenmesi takip etmistir. Çift MASP-2/3 antikorlarEdIaha sonrasIda TABLO 2'de açlElandlglElgibi bir islevsel deneyde inhibitör aktivitesi için görüntülenmektedir.

MASP-1/3 cift inhibitör antikorlarlü SEKILLER 3 ila 5'te gösterildigi üzere, MASP-l ve MASP-3, aynlZl zamanda Map44 ile paylasüân CUBI-CCPZ alania (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 25-432'si) bir özdes korunan bölgeyi paylasmaktadIE SEKIL 3'te gösterildigi üzere, MAp44, bir CCP2 alanIEiçermemektedir. Bu sekilde, MAp44 dahil bir çift MASP-1/3 antikoru, yukari açlKIand[glÜgibi bir monoklonal antikoru üretmek için MASP-l'in (veya MASP-3) CUBI-CCP-Z alanIElçeren veya bu alandan olusan bir antijen kullanuârak üretilebilmektedir veya alternatif olarak bu antijen, bu antijene spesifik olarak baglanan klonlara yönelik bir faj kütüphanesini görüntülemek için kullanllâbilmektedir, bunu MASP-3'e (veya MASP-l) çift baglantII görüntülenmesi takip etmistir. MAp44'ün dlglütla bir çift MASP- CCP2 alanIEIçeren veya bu alandan olusan bir antijen kullanilârak benzer bir sekilde üretilmektedir. Çift MASP-1/3 antikorlarüdaha sonrasiEtla TABLO 2'de açllZlandfglügibi bir islevsel denemede inhibitör aktivitesi için görüntülenmektedir.

MASP-l/Z cift inhibitör antikorlarElSEKILLER 4, 6 ve 7A'da gösterildigi üzere, MASP-l ve MASP-Z'nin serin proteaz alanÇlkorunan bölgeleri içermektedir. Bu sekilde, bir çift MASP-l/Z antikoru, yukar- aç[lZIand[gll:lgibi bir monoklonal antikoru üretmek için MASP-l'in (veya MASP-Z) serin proteaz alanlüiçeren veya bu alandan olusan bir antijen kullanüârak üretilmektedir veya alternatif olarak bu antijen, bu antijene spesifik olarak baglanan klonlara yönelik bir faj kütüphanesini görüntülemek için kullanllîhaktadß bunu MASP-Z'ye (veya MASP-l) çift baglantlEJI görüntülenmesi takip etmistir. Çift MASP-1/2 antikorlarEldaha sonrasIia TABLO 2'de açlEIandIglElgibi bir islevsel deneyde inhibitör aktivitesi için görüntülenmektedir. 3. Pan'a özgü MASP antikor/ar/HZE' meydana getirilmesine yönelik yöntemler: Alfa Zincir: MASP-2 ve MASP-1/3 arasIa saylîlîl kimlik eklentisi, MASP-1/3 ve MASP-Z'yi baglanan monoklonal antikorlarEüretmesinin mümkün olabildigini göstermektedir. Belirgin olarak, çogu kimlik, SEKIL 5'de gösterildigi gibi CUBl-EGF-CUBZ alanlarüiçerisinde bulunmaktadEl SEKIL 5'de gösterilen çesitli alanlar, Yongqing, ve ark., Biochemica et belirlenmistir.

Beta Zincir: SEKIL 6'da gösterildigi gibi MASP-2 ve MASP-1/3 aralelja saylîlîl kimlik eklentisi, bir pana özgü MASP-1/2/3 inhibitörünün olusumuna olanak saglayacaktlîl Yöntemler: Pana özgü MASP inhibitör antikorlarEQÖrn. MASP-1, 2 ve 3 aktivitesini inhibe eden antikorlar) asag-ki gibi üretilmektedir: 1. MASP-1/3 ve MASP-2 Alfa-zincir CUBl-EGF-CUBZ alanlarlüla karsEbir kütüphanenin seçilmesi ve MASP-1/3 ve MASP/Z'ye çapraz reaksiyona giren klonlarI seçilmesi. 2.TABLO 2'de açiklandigiügibi islevsel aktivitenin inhibe edilmesi kabiliyeti için klonlarI görüntülenmesi. 3.Tüm Üç proteine ve inhibitör islevine baglant-EI optimize etmek Için DTLacO affinite/islevsellik matürasyon teknolojisinin kullanIiEl (Yabuki ve ark., PLoS ONE, 4.TABLO 2'de açlKland[gll]Jzere, pan-MASP inhibitörleri, LEA-1 ve LEA-2 aracUJIlkompleman aktivasyonunu inhibe etmek için kullanilâbilmektedir. 4. Bispesifik MASP-2/3 antikor/MÜZE meydana getirilmesine yönelik yöntemler Bispesifik MASP-2/3 inhibitör antikorlarüasaglki gibi üretilmektedir: 1.CCP1 alan. baglanan ve MASP-Z'ye bagIiIElkompleman aktivasyonunu inhibe eden, örnek teskil eden MASP-Z'ye özgü inhibitör antikorlarüÖrnekIer 11 ila 14'de açlKIandigilîgibi belirlenmistir. 2.Bir MASP-3'e özgü inhibitör antikor, Örnek 15'de açliîland[glgibi MASP-3 polipeptidine karsEl bir kütüphanenin görüntülenmesi ve MASP-3 antikorlarII belirlenmesi ile üretilmektedir, bunu örnegin TABLO 2'de açlEland [giEgibi bir islevsel deneyde LEA-1 inhibitör aktivitesine yönelik antikorlarI test edilmesi takip etmistir. Örnek teskil eden MASP-3 antikorlarüÖrnek 'de açllZlanmaktadlEl 3.MASP-2 ve MASP-3'e özgü antijen baglama bölgesi, bir bispesifik antikoru üretmek için bir çerçeveye klonlanmaktadlE Immünoglobulin G benzeri formatlarEk/e aynElzamanda çesitli füzyon proteinini ve tek zincirli fragman konfigürasyonunu içeren saylgîl bispesifik antikor antijene karsüntikorlarßksprese eden iki hibridomu enjekte ederek üretilebilmektedir, bu da çesitli aglElve hafif zincir eslesmeleri ile sonuçlanmaktadlü bunlar. bir yüzdesi, diger antijene özgü bir aglîl ve hafif zincir ile eslestirilen bir antijene özgü bir aglEl ve hafif zinciri rekombinant olarak, iki immünoglobulin agBzincirIi/hafif zincirli çiftlerin birlikte eksprese edilmesi ile üretilebilmektedir, burada iki agE zincir, farklEözgüllükIere sahiptir. Istenilen baglama özgüllüklerine sahip antikoru degisken alanlar (antikor-antijen birlestirici bölgeler (örn. Örnekler 11 ila 14'de açlEIandlglEgibi MASP-2 antikorlarDÖrnek 15'de açllZIandlglEgibi MASP-3 antikorlarm immünoglobulini sabit alan sekanslarlEla kaynasllZJ hale getirilebilmektedir. Füzyon tercihen destek, mentese, CHZ, ve CH3 bölgelerin en azlEkJan bir klîlnlüçeren bir immünoglobulin aglElzincirli sabit alana sahiptir. Immünoglobulin aglEl zincirli füzyonlarEkodIayan DNA'Iar ve istege baglEblarak, immünoglobulin hafif zincir, ayrEl ekspresyon vektörlerine yerlestirilmekte ve uygun bir konak organizmasEla birlikte transfekte edilmektedir.

Eslestirilmis immünoglobulin agIElve hafif zincirlere ek olarak, iki farklEHiedefe özgü tek zincirli referansIa örnek teskil etmektedir. Bu örnekte, bir tekli polinükleotid ekspresyon yapElZlbir ayrlîprotein hedefe yönelik özgüllügü veren her bir çiftle baglaylîlleptitler vaslliislîla ayrllân ag& ve hafif zincirli degisken bölgelerin iki çiftini kodlamak için tasarlanmaktadlE Ekspresyondan sonra, bir hedefe özgü agßve hafif zincir çift, proteinin bir antijen baglaylîEl yüzeyi olusturdugu ve diger çiftin, bir ayrElantijen baglayIEDyüzeyi olusturdugu bir konfigürasyonda düzenlenmektedir, bu da bir tek zincirli diakor olarak adlandlEllân bir molekülü olusturmaktadE Merkezi agß ve hafif zincirli degisken bölge çifti araleUaki baglay-I uzunluguna bagIElolarak, polipeptit aynElzamanda dimerize olmasEliçin zorlanabilmektedir, bu da bir tandem diakor formasyonu ile sonuçlanmaktadlü Örnegin asagübki immünoglobulin polipeptitleri kodlayan DNA, bir veya birden fazla vektöre eklenebilmektedir ve bir bispesifik antikorun asagiahki açlKlayiED klîlflhylîlîl olmayan örneklerini üretmek için uygun bir konak organizmasIa eksprese edilebilmektedir.

MASP-Z/ 3 bispesifik antikorlar Bir durumda, insan MASP-2 ve insan MASP-3'e baglanan ve asaglkileri içeren bir bispesifik antikor saglanmaktadß (I) asag-ki en az bir veya birden fazla özelligi içeren bir MASP-2'ye özgü baglama bölgesi: a) asaglkileri içeren bir aglîi zincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 31 ila 35'ten amino asit sekansIEiçeren bir aglEzincirli CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 50 ila 65'inden amino asit sekanSIElçeren bir agE zincirli CDR2; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 95 ila 102'den amino asit sekansIEive/veya asag-ki en az bir veya birden fazla özelligi içeren bir aglEl zincir CDR3: b) asaglâbkileri içeren bir hafif zincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25 veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 24 ila 34'ünden amino asit sekansIüiçeren bir hafif zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 50 ila 56'sIEUan amino asit sekansIEIçeren bir hafif zincir CDRZ; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'sinin 89 ila 97'sinden amino asit sekanslüçeren bir hafif zincir CDR3; ve (II)tercihe baglüilarak asag-kileri içeren en az bir a) bir aglElzincirli degisken bölgeyi içeren bir MASP-3'e özgü baglama bölgesi olmak üzere bir MASP-3'e özgü baglama bölgesi: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 26'nI 31 ila 35'inden amino asit sekansIiZiiçere bir aglEI zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25 veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 26'nI 50 ila 65'inden amino asit sekansIEiçeren bir agEi zincir CDRZ; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 26'nI 95 ila 102'sinden amino asit sekansIülçeren bir aglîl zincir CDR3; ve b) asagüiakileri içeren bir hafif zincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 28'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 29'un 24 ila 34'ünden amino asit sekanSIEl içeren bir hafif zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 28'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 29'un 50 ila 56'sIan amino asit sekansIEiçeren bir hafif zincir CDRZ; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 28'In veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 29'un 89 ila 97'sinden amino asit sekanlellILçeren bir hafif zincir CDR3.

Bir durumda, insan MASP-l ve insan MASP-Z'e baglanan ve asaglkileri içeren bir bispesifik antikor saglanmaktadE (I)asag-ki en az bir veya birden fazla özelligi içeren bir MASP-2'ye özgü baglama bölgesi: a) asag-ki özellikleri içeren bir aglüzincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 31 ila 35'den amino asit sekansIElçeren bir aglElzincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 50 ila 65'inden amino asit sekanSIElçeren bir aglEl zincir CDR2; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 95 ila 102'sinden amino asit sekansIlIl ve/veya asaglki en az bir veya birden fazla özelligi içeren içeren bir aglEl zincir CDR3: b) asaglkileri içeren bir hafif zincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 24 ila 34'ünden amino asit sekanslüçeren bir hafif zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25 veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 50 ila 56'dan amino asit sekansIEilçeren bir hafif zincir CDRZ; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 89 ila 97'den amino asit sekansIEEÇeren bir hafif zincir DR3; ve (II)bir MASP-l'e özgü baglama bölgesi. 4. MASP-2 ve/veya MASP-3'e karsEiSlevsel inhibitör aktivitesinin testi, örnegin TABLO 2'de açllZland[glÜgJibi ve burada açlEIand[g]IIg`iibi uygulanmaktadE Bu örnek, L-fikolin/P35, H-fikolin, M-fikolin veya mannoz sayesinde MASP-Z'ye bagIiIEl kompleman aktivasyonunu bloke edebilen MASP-Z inhibitör maddelerinin tanIiIanmaslZIçin islevsel bir görüntü olarak kullanllân bir canlülglzm bölünme deneyini tarif etmektedir.

C4 Bölünme Denemesi: Bir C4 bölünme deneyi, Petersen, S.V., ve ark., J. Immunol. lipoetikoik asitle (LTA) sonuçlanan lektin yol aktivasyonunu ölçmektedir.

Reaktifler: Formalini sabit 5. aureus (DSM20233), asagüh oldugu gibi hazlEIbnmaktadlE bakteriler, tripitik soya kanEbrtamIa 37°C'de gece boyunca büyütülür, PBS ile üç kez y[lZanl:l daha sonrasIa PES/%05 formalinde oda slîlakl[glIa 1 saatligine sabitlenir ve önce, PBS ile üç kez daha yllZbnlB NY) hazneleri, asaglâlakiler ile kaplanmaktadlEi kaplama tamponunda 1 ug L-fikolin içeren kaplama tamponunda . Gece boyunca inkubasyon sonraslüha, hazneler, TBS'de (10 mM Tris-HCI, bulunan % ile bloke edilir, daha sonrasIda %0.05 Tween 20 ve 5 mM CaClz (ylKlama tamponu) içeren TBS ile ylElanmaktadlB Insan serum numuneleri, endojen C4'ün aktivasyonunu engelleyen ve C1 kompleksini (Clq, Clr ve Cl'ler'den olusmaktadlf.) birbirinden ayün 20 mM TrIs-HCI, 1 M NaCl, 10 mM CaCIz, %0.05 Triton X- 100, 0.1% HSA, pH 7.4'te seyreltilmektedir. MASP-2 MoAb'leri dahil MASP-2 inhibitör maddeleri, degisken konsantrasyonlarda serum örneklerine eklenmektedir. Seyreltilen numuneler, plakaya eklenmekte ve gece boyunca 4°C'de inkube edilmektedir. 24 saat sonrasIa, plakalar, yikama tamponu ile boylu boyunca yllZlanlîl daha sonrasIa 100 ul of 4 mM barbital, 145 mM NaCI, 2 mM CaCIz, 1 mM MgClz, pH 7.4'te saflastlîllüilglûi ug insan edilmektedir), her bir hazneye eklenmektedir. 37°C'de 1.5 saat kaldllîtan sonra, plakalar tekrar yilZlanmaktadIEl ve C4b birikimi, alkalin fosfataz-konjüge tavuk anti-insan C4c (Immunsystem, Uppsala, Isveç firmasIian elde edilmektedir) kullan ilârak tespit edilmektedir ve kolorimetrik alt tabaka p-nitrofenil fosfat kullan [lârak ölçülmektedir.

Mannozda C4 Denemesi: Yukari tarif edilen deney, çesitli MASP-2 inhibitör maddeleri ile karlgtlîllân serum eklentisinden önce LSP ve mannoz ile plakanI kaplanmasEile MBL sayesinde lektin yolu aktivasyonunun ölçülmesi için uyarlanmaktadE H-fikolinde (Hakata Ag) C4 denemesi: YukarlEIla tarif edilen deney, çesitli MASP-Z inhibitör maddeleri ile karlgtülân serum eklentisinden önce LPS ve H-fikolin ile plakanI kaplanmasüle H-fikolin sayesinde lektin yolu aktivasyonunun ölçülmesi için uyarlanmaktadlE Asaglalaki deney, klasik yolun, immün kompleksleri taraflüdan baslat-@Ekosullarlülaltlütla bir MASP inhibitör maddesinin etkisinin analiz edilmesi ile klasik yolu, bir MASP inhibitör maddesinin bloke edip etmedigini test etmesi için kullanilBiaktadlEl Yöntemler: Klasik yolun, immün kompleksleri tarafIan baslatllglü kompleman aktivasyonunun kosullar-a bir MASP inhibitör maddesinin etkisinin test edilmesi için, %90 NHS içeren üç tekrar 50 ul numune, 10 ug/ml immün kompleksinin veya PBS'nin mevcudiyetinde 37°C'de inkube edilmektedir ve paralel üç kopya numuneler de (+/- immün kompleksleri), 37°C inkubasyon esnasIa 200 nM anti-properdin monoklonal antikor içerecek sekilde dahil edilmektedir. 37°C'de iki saatlik bir inkubasyon sonrasIa, 13 mM EDTA, kompleman aktivasyonunun durdurulmasüiçin tüm numunelere eklenmektedir ve numuneler hlZIElbir sekilde 5°C'ye sogutulur. Numuneler daha sonrasIa, imalatçEl talimatlarIEltakip ederek ELISA kitleri (Quidel, Katalog No. A015 ve A009) kullanilârak kompleman aktivasyon ürünleri (C3a ve sC5b-9) için degerlendirilmeden önce -70°C'de depolanmaktadlîl Bu örnek, MASP-2 aktivitesini bloke eden yüksek affinite MASP-2 Fab2 antikor fragmanlari. tanIiIlanmasüçHZlamaktadlE Ön Bilgi ve Gerekçe: MASP-2, asag-kileri içeren bir çok ayrlZilslevsel alana sahip olan bir kompleks proteindir: MBL ve fikolinler için baglaylîlllanlar, bir serin proteaz katalitik alan, proteolitik alt tabaka C2 için baglaylEElbir alan, proteolitik alt tabaka C4 için baglaylîljbir alan, MASP-2 zimogeninin oto aktivasyonu için bir MASP-2 bölünme alanüle iki Ca*+ baglaylîülan.

MASP-Z'ye yüksek afûnite ile baglanan Fab2 antikor fragmanlarEûanIilanmlgtlElve tan lanan Fab2 fragmanlarÇlMASP-Z islevsel aktivitesinin bloke edebilip edemediklerini degerlendirmesi için islevsel bir deneyde test edilmistir.

MASP-2 islevsel aktivitesinin bloke edilmesi için, bir antikor veya Fab2 antikor fragmanÇl MASP-2 islevsel aktivitesi için gerekli olan MASP-2'de yaplîlal bir epitopa baglanmalüve müdahale etmelidir. Bu sekilde, bir çok veya bütün yüksek affinite baglaylEEIl/IASP-Z FabZ'Ier, dogrudan MASP-2 islevsel aktivitesinde dahil edilen MASP-2'de yaplîhl epitoplara baglanmadmarßürece, MASP-2 islevsel aktivitesini inhibe etmeyebilmektedir.

Lektin yolu C3 konvertaz formasyonunun inhibisyonunu ölçen islevsel bir deney, MASP-Z Fab2'lerin “bloke edici aktivitesinin” degerlendirilmesi için kullanlEhlStlEl Lektin yolunda MASP- 2'inin birincil fizyolojik alanIIEi, Iektin yolu C3 konvertazEbIarak Iektin aracillgiüompleman yolunun sonraki islevsel tamamlay_I olusturulmasüçin oldugu bilinmektedir. Lektin yolu C3 konvertazüproteolitik olarak C3'ü C3a'ya ve C3”ye bölen önemli, enzimatik bir komplekstir (C4bC2a). MASP-2, Iektin yolu C3 konvertazII (C4bC2a) yaplghl bir bileseni degildir, fakat, MASP-Z islevsel aktivitesine, Iektin yolu C3 konvertazIEiçeren iki protein bileseninin (C4b, C2a) olusturulmaslîçin gerek duyulmaktadlEl DahasÇlyukarEJa listelenen MASP-Z'nin tüm ayrIZI islevsel aktivitelerine, MASP-Z'nin, lektin yolu C3 konvertaz.. olusturmasEliçin gerek duyuldugu görülmektedir. Bu sebeplerden dolayLZlMASP-Z Fab2'lerin “bloke edici aktivitesinin" degerlendirilmesinde kullanIilZIiçin tercih edilen bir deneyin, lektin yolu C3 konvertaz formasyonunun inhibisyonunu ölçen islevsel bir deney olduguna inanilB1aktadlEI Yüksek Affiniteli Fab2'lerin Meydana Getirilmesi: Insan degisken hafif ve aglElzincirli antikor sekanslarII ve seçilen ilgili ligandlarla reaksiyona giren Fab2'lerin tanIilanmasülçin otomatiklestirilmis antikor seçim teknolojisinin bir faj göstergesi kütüphanesi, sir-;bn MASP-2 proteinine (SEKANS KIMLIK NUMARASI:13) yüksek affinite Fab2'lerinin olusturulmasüçin kullanilîhlstlEl Slglan MASP-2 (~1 mg, >%85 saf) proteinin bilinen bir miktarü antikor görüntülemesi için kullanilBilStiEl Bu amplifikasyon döngülerinden en iyi affiniteye sahip antikorlarI seçimi için faydalanüîniStE Antikor parçalarIElsentezleyen yaklasüg olarak 250 farklllarbe, ELISA görüntülemesi için toplanmlgtlîl Yüksek affinite darbeleri daha sonrasiEtla farkllîalntikorlarl benzersizliginin belirlenmesi için sßlanmaktadlEl Elli benzersiz MASP-Z antikoru saflastlEIllBiStEve her bir 250 ug saflastElßîlglFabZ antikoru, asaglElh daha kapsamlElbir sekilde tarif edildigi üzere, MASP-2 baglaylîiîlaffinitesinin karakterizasyonu ve bilesen düzlemi islevsel testi için kullanilmßtlü Kullan ilân Denemeler 1. Lektin Yolu C3 konvertazCO/usumunun Inhibisyonunun Ölçülmesine Yönelik Ön Bilgi: Lektin yolu C3 konvertazlZliki önemli proinflamatuvar parça olan anafilotoksin C3a ve opsonik C3b'ye C3'ü proteolitik olarak bölen enzimatik komplekstir (C4bC2a). C3 konvertazlEllEl formasyonu, inflamasyonunun yönlendirilmesi aç-an Iektin yolunda önemli bir asama olarak görülmektedir. MASP-Z, Iektin yolu C3 konvertazII (C4bC2a) yaplîial bir bileseni degildir; bu sekilde MASP-Z antikorlarü(veya Fab2), önceden var olan C3 konvertazII aktivitesini dogrudan inhibe etmeyecektir. Fakat, MASP-Z serin proteaz aktivitesi, lektin yolu C3 konvertazIEiçeren iki protein bileseninin (C4b, CZa) olusturulmasIZI için gereklidir. Bu sekilde, MASP-Z islevsel aktivitesini inhibe eden (ör. MASP-2 Fab2'nin bloke edilmesi) MASP-Z Fab2, Iektin yolu C3 konvertazII daha önce görülmemis formasyonunu inhibe edecektir. C3, yap-I bir bölümü olarak olagan dlgîlve yüksek derecede reaktif tiyoester bir grubu içermektedir. Bu deneyde C3 ile C3 konvertazII bölünmesi üzerine, C3b'de tiyoester grubu, ELISA deneyinde C3b'nin tespitine olanak saglandlglüsekilde, ester veya amit baglantilârüsayesinde plastik haznelerin alt bölümünde immobilize olan makromoleküllerinde hidroksil veya amino gruplarla kovalent bir bagEl olusturabilmektedir.

Maya mannoz, lektin yolunun bilinen bir aktivatörüdür. C3 konvertazII formasyonunun ölçülmesine yönelik asaglElbki yöntemde, mannoz ile kaplEloIan plastik hazneler, lektin yolunun aktif hale getirilmesi için seyreltilen slgian serumu ile 37°C'de 30 dakikaligilEla inkube edilmistir. Hazneler daha sonrasIa standart ELISA yöntemleri kullanilarak haznelere immobilize edilen C3b için yiEbnmlgl ve test edilmistir. Bu deneyde olusturulan C3b miktarü yansIiasIE Seçilen konsantrasyonlarda MASP-2 FabZ'Ier, C3 konvertazlîformasyonunu ve sonuç olarak C3b olusumunu inhibe edebilme kabiliyetleri için bu deneyde test edilmistir.

Yöntemler: 96 hazneli Costar Yüksek BaglaylElIiblakalar, 1 ug/50 pl/haznede 50 mM karbonat tamponu, pH 9.5'te seyreltilen mannoz ile 5°C'de gece boyunca inkube edilmistir. Gece boyu inkubasyon sonrasIa, her bir hazne, 200 |J| PBS ile üç kez yiElanmaktadIE Hazneler daha sonrasIa PBS'de %1 bovin serum albüminin 100 pI/hazne miktarljle bloke edilmis ve yavasça karlStlBlârak oda sIEhkllgilEUa bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne daha sonrasIia 200 ul PBS ile üç kez yikanmlgtlü MASP-2 Fab2 numuneleri, 5°C'de GVB tamponu Ca” ve Mg++'da seçilen konsantrasyonlara seyreltilmistir. Bir %05 slglan serumu, 5°C'de yukari bulunan numunelere eklenmistir ve 100 pl, her bir hazneye aktarliîhlgtlîl Plakalar, kompleman aktivasyonunun 37°C olan bir su banyosunda 30 dakikaligl. kapatilBiasI ve inkube edilmesine olanak saglanmlStlEl Reaksiyon, 37°C su banyosundan, bir buzlu su karlgüilîillîçeren bir kaba plakalar. aktarllünasßayesinde durdurulmustur. Her bir hazne, 200 oranIa seyreltisinin bir 100 uI/hazne, 2.0 mg/ml bovin serum albümini içeren PBS'de eklenmis ve nazikçe karlStlElârak oda lelakIigEja 1 saat inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 i.il PBS ile 5 defa yEElanmlstE Ikincil antikorun (peroksidaz-konjüge keçi anti-tavsan IgG, albümini içeren PBS'de eklenmis ve bir karlSt- nazik bir sekilde karlgtlîllârak oda lelakllglia bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 ul PBS ile bes defa yilibnmlgtlîl eklenmis ve 10 dakikallgllEb oda slîakllgilEUa inkube edilmistir. Peroksidaz reaksiyonu, 100 TI/hazne 1.0 M H3PO4 eklenerek durdurulmus ve OD450 ölçülmüstür. 2. MASP-Z'ye bagli-ME# Bölünmesi Inhibisyonunun Ölçülmesine Yönelik Deneme Ön Bilgi: MASP-2'nin serin proteaz aktivitesi oldukça spesifiktir ve MASP-2'nin sadece iki protein alt tabakasElianIilanmlgIlÜ C2 ve C4. C4'ün bölünmesi, C4a ve C4b olusturmaktadlEl MASP-2 Fab2, C4 bölünmesinde (ör. C4 için MASP-2 baglaylîlîlalan; MASP-2 serin proteaz katalitik alan) dogrudan dahil edilen MASP-2'de bulunan yapisal epitoplara baglanabilmektedir ve bu sekilde, MASP-Z'nin islevsel C4 islevsel aktivitesini inhibe edebilmektedir.

Maya mannoz, Iektin yolunun bilinen bir aktivatörüdür. MASP-2'nin C4 bölünme aktivitesinin ölçülmesine yönelik asaglâhki yöntemde, mannoz ile kapllîiblan plastik hazneler, Iektin yolun aktif hale getirilmesi için seyreltilen slglan serumu ile 37°C'de 30 dakikal[g]- inkube edilmistir. Bu ELISA deneyinde kullanilan birincil antikor sadece insan C4'ü tannladlglüçin, seyreltilen sEbn serum ayrIEla insan C4 (1.0 ug/ml) ile desteklenmektedir. Hazneler daha sonrasIa standart ELISA yöntemleri kullanilârak haznelere immobilize edilen insan C4b için yllîlanmlgl ve test edilmistir. Bu deneyde olusturulan C4b miktarl:l MASP-2'ye bagIIElC4 bölünme aktivitesinin bir ölçüsüdür. Seçilen konsantrasyonlarda MASP-2 Fab2, C4 bölünmesinin inhibe edebilme kabiliyetleri için bu deneyde test edilmistir.

Yöntemler: 96 hazneli Costar OrtamEBaglaylEEPlakalarlZ] 1.0 Tg/50 ul/haznede 50 mM karbonat tamponu, pH 9.5'te seyreltilen mannoz ile 5°C'de gece boyunca inkube edilmistir.

Her bir hazne, 200 pl PBS ile 3 defa yilZlanmisIE Hazneler daha sonrasiEUa PBS'de %1 bovin serum albüminin 100 uI/hazne miktarljile bloke edilmis ve yavasça karigtiülârak oda siîlakllgllda bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 |JI PBS ile 3 defa yllîbnmlstlîi MgCIz, içeren Ca” ve Mg“”da seçilen konsantrasyonlara seyreltilmistir. 1.0 pg/mL insan C4 (Quidel) aynüamanda bu numunelerde dahil edilmistir. hazneye aktarliIhStE Plakalar, kompleman aktivasyonunun 37°C olan bir su banyosunda 30 dakikallgiüia kapatllîhasiEla ve inkube edilmesine olanak saglanmigtlE Reaksiyon, 37°C su banyosundan, bir buzlu su karlgEli IEliçeren bir kaba plakalar. aktarHHiasEisayesinde durdurulmustur. Her bir hazne, ile 5 defa yiElanmiStlEI daha sonrasIa her bir hazne 200 pl PBS ile 2 defa yilZianmlstEI Biyotin-konjüge tavuk anti insan C4c'nin (Immunsystem AB, Uppsala, Isveç) 1:700 oran a seyreltisinin içeren PBS'de yiKbnmigtiEve nazikçe karlgtiîiliârak oda siîlakligilia bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 pl PBS ile 5 pI/haznesi, 2.0 mg/ml BSA içeren PBS'de eklenmis ve bir karigtlElElâEi nazikçe karlStlîllârak oda siîlakl[giIa bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 5 x 200 pl PBS ile yilZbnmlStlEi eklenmis ve 16 dakikallgiiîia oda sükllgiiEUa inkube edilmistir. Peroksidaz reaksiyonu, 100 pI/hazne 1.0 M H3PO4 eklenerek durdurulmus ve OD450 ölçülmüstür. 3. Anti-slâm MASP-Z Fab2'nin, 'Natif'slgn MASP-Z'sine Baglanma Denemesi Ön Bilgi: MASP-2 genellikle spesifik Iektin moleküllerini (mannoz baglaylîljbrotein (MBL) ve fikolinler) içeren bir MASP-2 dimer kompleksi olarak plazmada mevcuttur. Bu sekilde, bir kisinin, MASP-2 Fab2'nin, MASP-2'nin ilgili formuna fizyolojik olarak baglanmasII incelenmesi ile ilgilenmesi halinde, saflastmlglrekombinant MASP-Z'den ziyade, plazmada Fab2 ve `natif' MASP-2 arasIa olan etkilesimin kullan-[glübir baglama deneyinin gelistirilmesi önemlidir. Bu baglama deneyinde, %10 sit-;lan serumundan `natif' MASP-2-MBL kompleksi ilk olarak mannoz kaplElhaznelere immobilize edilmistir. Çesitli anti-MASP-Z Fab2'lerin, immobilize `natif' MASP-Z'ye olan baglayiîilaffinitesi daha sonralebla standart ELISA metodolojisi kullanißrak incelenmistir.

Yöntemler: 96 hazneli Costar Yüksek Baglayiîiîiplakalar, 1 pg/SO pl/haznede 50 mM karbonat tamponu, pH 9.5'te seyreltilen mannoz ile 5°C'de gece boyunca inkube edilmistir.

Her bir hazne, 200 pl PBS ile 3 defa yEIZianmiStiEi Hazneler PBST'de (%005 Tween 20 içeren PBS) 100 pI/hazne, %05 yagslîi kuru süt ile bloke edilmistir ve nazikçe karigtlîilârak oda siîbkl[gi.a bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, TBS/Tween/Ca++ Yikama Tamponunun ( 200 pl miktarEile 3 defa yiElanmlgtE Yüksek Tuzlu BaglayiEEl'amponda (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 inkube edilmistir. Hazneler, 200 pl TBS/Tween/Ca++ YilZiama Tamponu ile 3 defa yilZianmlStB Hazneler daha sonraslüha 200 pl PBS ile 2 defa ylKbnmiStlEi GVB tamponunu (4.0 mM barbital, içeren Ca*+ ve Mg“”da seyreltilen MASP-Z Fab2'nin 100 iJl/hazne seçilmis konsantrasyonu eklenmis ve nazikçe kariStiElliârak oda leiakligiEtla bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 pl PBS ile 5 defa yiKhnmlStB PBS'de 2.0 mg/ml bovin serum albümininde 1:5000 oranI seyreltilen eklenmis ve nazikçe karigtiillârak oda lelakligiiEUa bir saatligine inkube edilmistir. Her bir hazne, 200 |JI PBS ile 5 defa yilihnmlgtlEl 100 iJI/hazne peroksidaz sübstrat TMB (Kirkegaard ölçülmüstür.

SONUÇLAR: Sßn MASP-2 proteinine yüksek affinite ile reaksiyona sokulan yaklaslig 250 farkIIZFabZ, ELISA görüntülemesi için toplanmigtß Bu yüksek afûnite Fab2'leri, farkIElantikorlarI benzersizliginin belirlenmesi için sülanmlgtlîive 50 benzersiz anti-MASP-Z antikoru, bir baska analiz için saflastlîilüiigtlîl Her bir saflastlEllIhEl Fab2 antikorunun 250 ug miktarü MASP-2 baglaymffinitenin ve islevsel kompleman yol testinin karakterizasyonu için kullanißiigtlü Bu analizin sonuçlarüasag- bulunan TABLO 13'te gösterilmektedir.

TABLO 13: LEKTIN YOLU KOMPLEMAN AKTIVASYONUNU BLOKE EDEN MASP-Z FABZ Fab2 Antikoru # C3 KonvertazEaICSÜ (nM) Kd (nM) C4 Bölünmesi ICso (nM) 88 0.32 4.1 ND 11 0.46 0.86 <2 nM 86 0.53 1.4 ND 81 0.54 2.0 ND 66 0.92 4.5 ND 57 0.95 3.6 <2 nM 40 1.1 7.2 0.68 58 1.3 2.6 ND 60 1.6 3.1 ND 52 1.6 5.8 <2 nM 63 2.0 6.6 ND 49 2.8 8.5 <2 nM 89 3.0 2.5 ND 71 3.0 10.5 ND 87 6.0 2.5 ND 67 10.0 7.7 ND Yukar- bulunan TABLO 13'de gösterildigi üzere, test edilen 50 MASP-2 Fab2, 10 nM Fab2'lere esit veya bunlardan daha az olan (bir %34 pozitif isabet oranDZlICso ile C3 konvertaz formasyonunu potansiyel bir sekilde inhibe eden MASP-Z-bloke edici FabZ'Ier olarak belirlenmistir. Belirlenen 17 Fab2'nin sekizi, subnanomolar arallEta IC50'Iere sahiptir. Dahasü TABLO 13'de gösterilen MASP-2 bloke edici Fab2'nin tüm on yedisi, temelde Iektin yolu C3 konvertaz deneyinde C3 konvertaz formasyonunun tamamlanmlglinhibisyonunu sunmustur.

Her bir MASP-Z molekülü, Fab2 sayesinde baglandlgllEtla bile, “bloke edici” bir Fab2'nin sadece MASP-2 islevini fraksiyonel olarak inhibe edebilmesi teorik olarak muhtemel oldugu için, bu önemli bir husustur.

Mannoz, Iektin yolunun bilinen bir aktivatörü olmasIEla ragmen, slglan serumunda anti- mannoz antikorlarII mevcudiyetinin ayr- klasik yolu aktif hale getirebilmesi ve klasik yol C3 konvertazEtayesinde C3b'yi olusturabilmesi teorik olarak mümkündür. Fakat, bu örnekte listelenen on yedi bloke edici MASP-2 Fab2'nin her birisi, Iektin yolu C3 konvertazII bu deneyinin özgüllügünü gösterecek sekilde, C3b olusumunu (>%95) önemli derecede inhibe etmektedir.

Baglama deneyleri ayrEa her birisi için görünür bir Kd'yi hesaplamaslîliçin bloke edici Fab2'lerin tüm on yedisi ile uygulanmlStB Anti-slgan MASP-2 Fab2'lerin, bloke edici Fab2'lerden altEtanesi için natif sir-;lan MASP-Zfye baglama deneylerinin sonuçlarljlla TABLO 13'te gösterilmektedir. Benzer baglama deneyler ayrlîla sonuçlarIlEl, TABLO 13'te gösterildigi diger Fab2'ler için uygulanmiStlEI Genelde, altEi'fabZ'den her birisinin, `natif' MASP- 2'ye olan bagEiiçin elde edilen görünür Kd'ler, islevsel C3 konvertaz deneyinde Fab2 için IC50 ile makul ölçüde hazneye tekabül etmektedir. MASP-Z'nin, proteaz aktivitesinin aktivasyonu üzerine bir `inaktif' formdan bir `aktif' forma uyumlu bir degisime tabi olduguna dair bir kaniEi MASP-2, birincil olarak `etkisiz halde' zimogen konformasyonunda mevcuttur. Buna karsiEJ, baglama deneyinde, MASP-2, immobilize mannoza baglanan MBL ile bir kompleksinin bir bölümü olarak mevcuttur, bu sekilde MASP-2'nin, `aktif' konformasyonunda olabilir (Petersen MASP-2'nin farkIEIbir konformasyonel formu bagladigiüiçin, bir kisi, bu iki islevsel deneyde test edilen on yedi bloke edici Fab2'nin her birisi için IC50 ve Kd arasIa kesin bir uygunlugu zorunlu olarak beklememektedir. Buna karslEl, Fab-2 #88 istisnasEile, iki deneyde test edilen diger on altEFabZ'nin her birisi için ICso ve görünür Kd arasEtla makul seviyede yakI bir uyum oldugu görülmektedir (TABLO 13'e bakIlî).

Bir kaç bloke edici Fab2, C4'ün MASP-2 aracUJD bölünmesinin inhibisyonu için degerlendirilmistir. TABLO 13'te gösterildigi üzere, tüm test edilen Fab2'ler, C3 konvertazlîi deneyinde elde edilenlere benzer olan ICso'Ier ile C4 bölünmesini inhibe ettigi kesfedilmistir.

Mannoz, Iektin yolunun bilinen bir aktivatörü olmas. ragmen, teorik olarak slglan serumunda bulunan anti-mannoz antikorlarII mevcudiyetinin ayn Bamanda klasik yolu aktif hale getirebilmesi ve bu sekilde C4'ün C1 aracliJJZbölünmesi ile C4b'yi üretmesi mümkün olmaktadlEI Fakat, MASP-2 aracl]]]IiC4 bölünmesi için bu deneyin özgüllügünü gösterdigi sekilde, C4b olusumunu önemli derecede (>%95) inhibe eden çesitli anti-MASP-2 Fab2'ler belirlenmistir. C3 benzeri olan C4, yap-I bir bölümü olarak olagan dlglîi/e yüksek derecede reaktif tiyoester bir grubu içermektedir. Bu deneyde MASP-Z ile C4'ün bölünmesi üzerine, C4b'de tiyoester grubu, ELISA deneyinde C4b'nin tespitine olanak sagland[g]i:lsekilde, ester veya amit baglantilâriîl sayesinde plastik haznelerin alt bölümünde immobilize olan makromoleküllerinde hidroksil veya amino gruplarla kovalent bir bagiînlusturabilmektedir.

Bu çalismalar, Iektin yolu aktivasyonunu engelledigi sekilde, C4 ve C3 konvertaz aktivitesini islevsel olarak bloke eden slgian MASP-Z proteinine, yüksek affinite FABZ'Ierin olusumunu net bir sekilde göstermektedir.

Bu örnek, Örnek 11'de tarif edildigi gibi olusturulmus olan bloke edici anti-slghn MASP-Z Fab2 antikorlarIan bir kaçi. epitop eslestirmesini tarif etmektedir.

Yöntemler: Tümü N-terminal 6X His isaretlerini içeren asaglki proteinler, pED4 vektörü kullanilarak CHO hücrelerinde eksprese edilmistir: aktif merkezde serinin alanine (5613A) degistirilmesi ile etkisiz hale getirilen tam uzunlukta bir MASP-Z proteini olan slglan MASP-ZA; otoaktivasyonu azaltmak için degistirilen tam uzunlukta bir MASP-Z proteini olan slgan MASP-2K (R424K); sadece CUBI, EGF-benzeri ve CUBII alanlarIEiçeren slÇlan MASP-Z'nin bir N-terminal fragmanlîilan CUBI-11; ve Sadece CUBI ve EGP-benzeri alanlarEiÇeren slgin MASP-Z'nin bir N-terminal fragmanlîcblan CUBI-EGF-benzeri.

Bu proteinler, öncesinde tarif edildigi üzere nikel-affinite kromatografisi ile kültür Slglan MASP-Z'nin CCPII ve serin proteaz alanIEiçeren bir C-terminal polipeptit (CCPII-SP), pTrxFus (Invitrogen) kullanllârak bir tioredoksin füzyonu olarak E. CO/I sentezlenmistir.

Protein, Tiyol bagßffinite reçinesi kullanilârak hücre Iizatlarüldan saflastEIlIhlgtE Tioredoksin füzyon partneri, negatif bir kontrol olarak bos pTrxFus'den sentezlenmistir.

Tüm rekombinant proteinler, 280 nm'de OD'nin ölçülmesi sayesinde belirlenen TBS tamponuna ve bunlari konsantrasyonlar. diyaliz yoluyla ayrißîlgtlü Nokta BIotAna/izi: Yukarüia tarif edilen bes rekombinant MASP-2 polipeptidinin (ve CCPII-serin proteaz polipeptidinin negatif bir kontrolü olarak tioredoksin polipeptidinin) seri seyreltileri, nitroselüloz membran. lekelenmistir. Lekelenen protein miktarlZlbes katlßsamada 100 ng ila 6.4 pg araliglEida çiEinlStiEl Sonraki deneylerde, protein miktarlÇi tekrardan bes katlü asamada 50 ng'den asagthlogru 16 pg'ye araliglIa çiEmiSIIE Membranlar, TBS'de (bloke edici tampon) %5 yagslZsüt tozu ile bloke edilmistir, daha sonrasiTJkla bloke edici tamponda ( 1.0 ug/ml anti-MASP-2 Fab2'lerle inkube edilmistir. Baglanan Fab2'ler, HRP-konjüge anti-insan Fab (AbD/Serotec; 1/10,000 orania seyreltilmektedir) ve bir ECL tespit kiti (Amersham) kullanilârak tespit edilmistir. Bir membran, pozitif bir kontrol (1999) referansIa tarif edilmistir) ile inkube edilmistir. Bu durumda, baglanan Ab, HRP- konjüge keçi anti-tavsan IgG (Dako; 1/2,000 oraniEUa seyreltilmistir) kullanilârak tespit edilmistir.

MASP-Z Baglama Deneyi: ELISA plakalarülß iJg/hazne rekombinant MASP-ZA veya karbonat tamponunda (pH 9.0) var olan CUBI-II polipeptidi ile gece boyunca 4°C'de kaplanmigtlü Hazneler, TBS'de %1 BSA ile bloke edilmistir, daha sonrasIa anti-MASP-Z Fab2'lerin seri seyreltileri, 5.0 mM Ca** içeren TBS'ye eklenmistir. Plakalar, RT'de bir saatligine inkube edilmistir. TBS/tween/Ca*+ ile üç defa yiKbndiKtan sonra, TBS/ Ca““da 1/10,000 oranüizla seyreltilen HRP-konjüge anti insan Fab (AbD/Serotec) eklenmis ve plakalar, RT'de ekstra bir saat daha inkube edilmistir.

Baglßlan antikor, TMB peroksidaz ait madde kiti (Biorad) kullanilârak tespit edilmistir.

Sonuçlar: Çesitli MASP-2 polipeptitleri ile Fab2'lerin reaktiviteyi gösteren nokta leke analizinin sonuçlarlî.] asagüb bulunan TABLO 14'de saglanmaktadE TABLO 14'de saglanan saylîlal degerler, yaklasilZl olarak yarElmaksimum sinyal gücünün saglanmasEliçin gerekli olan Iekelenmis proteinin miktarlügöstermektedir. Gösterildigi üzere, polipeptitlerin hepsi (tek bas. tioredoksin füzyon partnerinin istisnasElile), pozitif kontrol Ab (tavsanlarda yetistirilen poliklonal anti-insan MASP-Z serumlarDZlile tanIilanmlgtB TABLO 14: NOKTA BLOTLAR ÜZERINDE ÇESITLI REKOMBINANT SIÇAN MASP-2 POLIPEPTITLERI ILE REAKTIVITE Fa b2 Antikoru # MASP-ZA CUBI-II CUBI/EGF- CCPII-SP Tiyoredoksin 40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 49 0.16 ng NR NR >20 ng NR 52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR 57 0.032 ng NR NR NR NR 58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR 63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR 86 0.4 ng NR NR 10 ng NR 87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR NR = Reaksiyon yok. Pozitif kontrol antikoru, tavsanlarda yükseltilen poliklonal anti-insan MASP-Z serumudur.

Fab2'lerin hepsi, MASP-2K'nin yanljslû (veri gösterilmemistir) MASP-ZA ille reaksiyona girmistir. Fab2'lerin büyük klîinü CCPII-SP polipeptidini tannlamlStE N-terminal fragmanlarIEllanIilamamlStlB Fab2 #60 ve Fab2 #57 iki IstisnadlEl Fab2 #60, MASP-ZA ve CUBI-II fragmanIIiEtanlamaktadlEl fakat CUBII'da bir epitopa baglandiglllîl/eya CUBII ve EGF-benzeri alanElkapsad[g]Il:| göstererek CUBI/EGF-benzeri polipeptidi veya CCPII-SP polipeptidi tannlamamaktadß Fab2 # 57, MASP-ZA'yEtanllar, fakat bu Fab2'nin, CCPl'de bir epitopu tannladlglllîgöstererek test edilen MASP-2 fragmanlarIan herhangi birisini tanIilamamaktadlE Fab2 #40 ve #49 sadece MASP-ZA'nin tamamlanmasü için baglanmaktadlü ELISA baglaylEBJenemesinde, Fab2 #60, hafifçe düsük görünür affinite ile olmas. ragmen, CUBI-II polipeptidine baglanmaktadlEl(veri gösterilmemistir).

Bu bulgu, Fab2'lerin, MASP-2 proteinin çoklu bölgelerine benzersiz blogunun tanIiIanmasID göstermektedir.

Bu örnek, Örnek 11'de açlKland[gll]_l]ibi belirlenmis olan temsilci yüksek afünite MASP-2 Fab2 antikorlarII farmakodinamik analizini tarif etmektedir.

On BilgizGerekge: Örnek 11'de açllZlandEglEgibi, slgbn Iektin yolunu bloke eden yüksek affinite antikorlarII tanIilanmasEiçin, slgian MASP-2 proteini, bir faj gösterge kütüphanesinin çevrilmesi için kullaniiîhlgtlü Bu kütüphane, yüksek baglgllzliiîl çesitliligi saglamak üzere tasarlanmßl ve tamamen insan immünoglobin gen sekanslarEkulIanilâ'rak olusturulmustur. Örnek 11'de gösterildigi gibi, ELISA taramasEile sigian MASP-Z proteinine yüksek afinite ile baglanan yaklasim 250 bireysel faj klonu tespit edilmistir. Bu kIonIarI sßalanmasüso essiz MASP-Z antikoru kodlaylED faleltanIilamlSIlEl Fab2 proteini bu klonlardan eksprese edildi, saflastlEilBilgtlE ve MASP-Z baglanma afinitesi ve Iektin kompleman yolunun islevsel inhibisyonu için analiz edilmistir. Örnek 11'in TABLO 13'ünde gösterildigi gibi, islevsel bloke edici aktiviteye sahip 17 MASP- 2 Fab2, bu analizin bir sonucu olarak (bloke edici antikorlar için %34 bir isabet oranli] belirlenmistir. Fab2'ler tarafIan lektin kompleman yolunun islevsel inhibisyonu, MASP-Z'nin C4 bölünmesinin direkt bir ölçüsü olan C4 çökelti seviyesinde belirgin olmustur. Önemli bir sekilde, inhibisyon, C3 dönüstürücü aktivite degerlendirildiginde, esit derecede belirgindi ve bu da Iektin kompleman yolunun islevsel bIokajIEgöstermistir. Örnek 11'de tarif edildigi gibi tanIilanan 17 MASP-2 bloke edici Fab2, 10 nM'ye esit olan veya bu miktardan daha az olan IC50 degerlerini içeren C3 konvertaz formasyonunu önemli ölçüde inhibe etmektedir.

Tannlanan 17 Fab2'nin sekizi, alt nanomolar araIIKta ICSÜ degerlerine sahiptir. DahasüÖrnek 11'in TABLO 13'ünde özetlendigi üzere, 17 MASP-2 bloke edici Fab2, temelde Iektin yolu C3 konvertaz deneyinde C3 konvertaz formasyonunun tamamlanmginhibisyonunu sunmustur.

Dahasü TABLO 13'te gösterilen her bir 17 bloke edici MASP-Z Fab2, lektin yolu C3 konvertazEb yönelik bu deneyin özgüllügünü sergiledigi sekilde C3b olusumunu önemli ölçüde inhibe etmektedir (>%95).

Sßn IgG2c ve fare IgG2a tam uzunluga sahip antikor izotip varyantlarÇl Fab2 #11'den türetilmistir. Bu örnek, farmakodinamik parametrelere yönelik bu Izotiplerin in Viva karakterizasyonunu açiEIamaktadE Yöntemler: Örnek 11'de açlKlandlglEgibi, slgbn MASP-2 proteini, Fab2#11'in tanIiIandlgEbir Fab faj gösterge kütüphanesinin çevrilmesi için kullaniimlsrlü Slgbn IgG2c ve fare IgG2a tam uzunluga sahip antikor izotip varyantlarEIFabZ #11'den türetilmistir. Sigian IgG2c ve fare içi karakterize edilmistir.

Farelerde in Viva çalgna: Farmakodinamik bir çallgma, canlEiçi plazma lektin yolu aktivitesinde MASP-Z antikor dozajü etkisinin incelenmesi için farelerde uygulanmlgtlü Bu çalismada, C4 birikimi, 0.3 mg/kg veya 1.0 mg/kg fare MASP-2 MoAb'nin (Fab2#11'den türetilen fare IgG2a tam uzunlukta antikor izotipi) subkütanöz (sc) ve intraperitoneal (ip) uygulamasi. ardIan çesitli süre noktalarIda bir lektin yolu deneyinde canlüllîölçülmüstür.

SEKIL 29A, fare MASP-2 MoAb'nin 0.3 mg/kg veya 1.0 mg/kg subkütanöz dozaann sonra çesitli süre noktalarIa farelerden (n=3 fare/grup) aI-n seyreltilmemis serum numunelerinde canlEldEElölçülen lektin yoluna özgü C4b birikimini grafiksel olarak göstermektedir. Antikor dozundan önce toplanan farelerden al-n serum örnekleri negatif kontroller (%100 aktivite) olarak görev yaparken, aynEbloke edici 100 nM MASP-Z antikoru ile canllîigüiakviye edilmis serum, pozitif bir kontrol olarak (%0 aktivite) kullanllB'ilglB SEKIL 29A'da gösterilen sonuçlar, 1.0 mg/kg doz fare MASP-Z MoAb'nin subkütanöz uygulamasIEtakiben C4b depolanmasi. hlîIü/e eksiksiz bir inhibisyonunu göstermektedir. 0.3 mg/kg fare MASP-2 MoAb dozunun subkütanöz olarak uygulamasIan sonra C4b depolanmasi. kßni bir inhibisyonu görülmüstür.

Farelerde 0.6 mg/kg fare anti-MASP-Z MoAb'nin tek bir ip olarak uygulamasIEllakiben, lektin yolu iyilesmesinin zaman periyodu üç hafta boyunca takip edilmistir. SEKIL 29B'de gösterildigi gibi, lektin yolu aktivitesinde bir hlîlElbir düsüs, antikor dozaj-an sonra olusmustur, bunu i.p. olarak uygulamadan sonra yaklasllg7 günlügüne süren tam lektin yolu inhibisyonu takip etmistir. Lektin yolu aktivitesinin yavas restorasyonu, MASP-2 MoAb uygulamasldan 17 gün sonraslîile farede tam lektin yolu restorasyonu ile ikinci ve üçüncü haftalar. üzerinde gözlemlenmistir.

Bu sonuçlar, Fab2 #ll'den türetilen fare MASP-Z Moab'nin, sistematik olarak iletildiginde, doza duyarlEliJir sekilde farelerin lektin yolunu inhibe ettigini göstermektedir.

Bu örnek, MASP-2'ye baglanan ve immün sisteminin klasik (Clq'ya baglD] yol bilesenini bozulmamübükarak lektin araciIJIikompleman aktivasyonunu (LEA-2) inhibe eden tamamen insan scFv antikorlarIlEl, faj göstergesi kullanarak kimligini aç[lZlamaktadlEI Genel Bakig: Tamamen insan, yüksek afhnite MASP-Z antikorlarü bir faj gösterge kütüphanesi görüntülenerek belirlenmistir. AntikorlarI degisken hafif ve agiElzincirIi fragmanlarübir scFv formatIa ve bir tam uzunlukta IgG formatIda izole edilmistir. Insan MASP-2 antikorlarü immün sisteminin klasik (Clq'ya baglDÇi yol bilesenini bozulmamlgi bßklîlken Iektin yolu araCUJDalternatif kompleman yol aktivasyonu ile iliskili hücresel hasarI inhibe edilmesi için kullanigliü BazEdurumIarda, MASP-2 inhibitör antikorlarÇisu özelliklere sahiptir: (a) insan MASP-Z'ye yönelik yüksek affinite (örn. 10 nM veya daha az bir KD) ve (b) bir 30 nM veya daha az bir ICso ile %90 insan serumunda MASP-Z'ye baglilükompleman aktivitesini inhibe edilmesi.

Yöntemler: Tam uzunlukta katalitik olarak inaktif MASP-Z 'nin ekspresyonu: Öncü sekansla (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) insan MASP-2 polipeptidini kodlayan insan MASP-Z'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI:4) tam uzunluga sahip cDNA sekansEiayriaa CMV gelistirici/promoter bölgesinin kontrolü altlEUa kontrol ekspresyonu harekete geçiren memeli ekspresyon vektörü pCI-Neo'ya (Promega) ait klonlanmiStIEl(Kaufman R.J. ve ark., Nucleic referansüda açlKlanmaktadE).

Katalitik olarak inaktif insan MASP-ZA proteinlerinin olusturulmaslîliçin, alana yönelik mutagenez, USZOO7/0172483 numaraIIZPatent DokümanIa açiEIandigiEgibi uygulanmlStE PCR ürünleri, agaroz-jel elektroforezi ve bant preparasyonu sonrasIia saflastlEilBiiStiEl ve tekli adenozin çakEmaIarüstandart bir kuyruklanma prosedürü kullanilârak olusturulmustur.

Adenozin kuyruklu MASP-ZA daha sonrasia pGEM-T kolay vektörüne klonlanmigtlîi ve Eco//ye dönüstürülmüstür. Insan MASP-2A aynüamanda memeli ekspresyon vektörlerinden pED veya pCI-Neo birisine alt klonlanmlgtlE Yukarlâb tarif edilen MASP-ZA ekspresyon yaplîü standart kalsiyum fosfat transfeksiyon prosedürü kullanilârak DXBl hücrelerine transfekte edilmistir (Maniatis ve ark., 1989).

MASP-ZA, preparasyonlarlül, diger serum proteinleri ile kontamine olmamasIEtemin etmek için serum içermeyen ortamda üretilmistir. Ortam, iki günde bir (toplamda dört defa) birlesen hücrelerden toplanmlglîl Rekombinant MASP-ZA'nI seviyesi, yaklaslEl olarak 1.5 mg/litre kültür ortamlîbrtalamasü/ermistir. MASP-ZA (yukari tarif edilen Ser-Ala mutantD] MBP-A- agaroz kolonlarIa afûnite kromatografisi ile saflastlEiIIhISIIB Pan/ama/scFv dönüsümü ve filtre taramasÜ/e tanEi/anan scFv Aday Klon/arda MASP-ZA ELISA Insan immünoglobulin hafif ve aglEzincirIi degisken bölge sekanslarII bir faj gösterge kütüphanesi, antijen panlamaslîih tabi tutulmustur, bunu otomatiklestirilmis antikor taramaslj ve insan MASP-2 proteinine yüksek affinite scFv antikorlarlElI belirlenmesine yönelik seçim takip etmistir. HIS isaretli veya biyotin isaretli MASP-2A'ya karsllecFv faj kütüphanesinin üç turluk panlamasüiygulanmlgtß Üç turluk panlama ilk olarak MBL ile ve daha sonraleL'Ia TEA (alkalin) ile ayrlgtmlstß Hedef MASP-2A'ya karsElscFv fragmanlarIEgörüntüleyen fajlarI spesifik zenginlesmesini takip etmek için, immobilize MASP-2A'ya karslîlbir poliklonal faj ELISA uygulanmlîstlEl 3 turluk panlamadan gelen scFv genleri, bir pHOG ekspresyon vektörüne klonlanmlStlEl ve MASP-ZA'ya karsEIspesifik klonlarEIaramak Için bir küçük ölçekli filtre taramasIa çalEIlEllfhlgtlEl Üç turluk panlama isleminden scFv fragmanlarIElkodlayan plazmidleri içeren bakteriyel koloniler toplanmlgl nitroselüloz membranlara ilistirilmis ve ana plakalarElüretmek için indükleyici olmayan bir ortamda gece boyunca büyütülmüstür. Toplam 18,000 koloni toplanmlgl ve yarlgljekabetçi elüsyon ve yarlîüja sonraki TEA elüsyonundan olacak sekilde üçüncü panlama turundan analiz edilmistir. ScFv dönüsümünün takip ettigi MASP-ZA'ya karsEI scFv fajmid kütüphanesinin panlanmasD/e bir filtre taramaslÇl137 pozitif klon sunmustur. 108/137 klon, 45 klonun, normal insan serumunda MASP-Z aktivitesini bloke edebilme kabiliyeti için analiz edildigi MASP-2 baglant- (veri gösterilmemistir) yönelik bir ELISA deneyinde pozitif çilZl'nEtIE Lektin Yolu C3 konvertazÜ-'ormasyonunun Inhibisyonunun Ölçülmesine Yönelik Lektin yolu C3 konvertaz formasyonunun Inhibisyonunu ölçen islevsel bir deney, MASP-Z scFv aday klonlarII"bloke edici aktivitesinin” degerlendirilmesi için kullanUIhlgIlEl Fakat, MASP-2 serin proteaz aktivitesi, lektin yolu C3 konvertazlEiEiçeren iki protein bileseninin (C4b, C2a) olusturulmasEiçin gereklidir. Bu sekilde, MASP-Z islevsel aktivitesini (örn. bir bloke edici MASP-Z scFv) bir MASP-Z scFv, lektin yolu C3 konvertazII formasyonunu yeni bastan inhibe edecektir. C3, yap-I bir bölümü olarak olagan dlgüle yüksek derecede reaktif tiyoester bir grubu içermektedir. Bu deneyde C3 ile C3 konvertazII bölünmesi üzerine, C3b'de tiyoester grubu, ELISA deneyinde C3b'nin tespitine olanak saglandfgllîlsekilde, ester veya amit baglantllârlîkayesinde plastik haznelerin alt bölümünde immobilize olan makromoleküllerinde hidroksil veya amino gruplarla kovalent bir bagßlusturabilmektedir.

Maya mannoz, lektin yolunun bilinen bir aktivatörüdür. C3 konvertazII formasyonunun ölçülmesine yönelik asag-ki yöntemde, mannoz ile kaplüblan plastik hazneler, lektin yolunu aktif hale getirmesi için seyreltilen sigian serumu inkube edilmistir. Hazneler daha sonrasIa standart ELISA yöntemleri kullanilârak haznelere immobilize edilen C3b için yllîanmlglve test edilmistir. Bu deneyde olusturulan C3b miktarÇIlektin yolu C3 konvertazII daha önce görülmemis formasyonunun dogrudan bir yansHIalel Seçilen konsantrasyonlarda MASP-2 scFv konIarüC3 konvertazlîformasyonunu ve sonuç olarak C3b olusumunu inhibe edebilme kabiliyetleri için bu deneyde test edilmistir.

Yöntemler: Yukarlab açlKland[glEgibi belirlenen 45 aday klon eksprese edilmis, saflastEIllBilSve tekrardan tüm klonlarI aynElIampon miktarlEb sahip oldugunu temin etmek için GVB tamponunu ( içeren Ca++ ve Mg++'da seyreltilmis olan aynElstok konsantrasyonuna seyreltilmistir. ScFv klonlarlZlZ ug/mL konsantrasyonda üç nüsha test edilmistir. Pozitif kontrol, OMSlOO Fab2 olmustur ve 0.4 pg/mL miktarda test edilmistir. C3c formasyonu, scFv/IgG klonlarII mevcudiyetinde ve yoksunlugunda takip edilmistir. 9.5'de 20 ug/mL (1 ug/hazne) bir konsantrasyona seyreltilmistir ve 4°C'de gece boyunca bir ELISA plakasIa kaplanmlSIlEl Sonraki gün, mannoz kapllîplakalar, 200 ul PBS ile üç defa yilîbnmlgtlîl 100 pl %1 HSA bloke edici çözelti daha sonras-a haznelere eklenmis ve oda siEiakHgiEUa 1 saatligine inkübe edilmistir. Plakalar 200 |JI PBS ile 3 defa yilZianmlgtE ve numunelerin eklentisine kadar 200 i.iI PBS ile buzda depolanmlglEl Normal insan serumu, CaMgGVB tamponda %O.5'e seyreltilmistir ve scFv klonlarElveya OMSlOO Fab2 pozitif kontrol, ve 10 ug/mL miktarlarda, bu tampona üç nüsha halinde eklenmistir ve bloke edilmis ELISA plakaleb eklentiden önce buzda 45 dakika önceden inkübe edilmistir. Reaksiyon, 37°C'de bir saatligine inkübasyon ile baslatllîhlgtlîlve bir buzlu banyoya plakalara aktarllârak durdurulmustur. C3b birikimi, bir Tavsan u-Fare C3c antikoru ile tespit edilmistir, bunu Keçi u-Tavsan HRP takip etmistir. Negatif kontrol, antikor içermeyen (antikor yok = maksimum C3b birikimi) tampon olmustur ve pozitif kontrol EDTA içeren (C3b birikimi yok) tampon olmustur. Önceki, haznelerin mannozsuz olmasII haricinde aynlZldeney uygulanarak belirlenmistir. Mannoz içermeyen plakalara karsEönceki sinyal, mannoz içeren haznelerde sinyallerden çlEarllBilSIlE Bir kesme kriteri, bir ilgisiz scFv klonunun (VZV) ve tek baslEla tamponun aktivitesinin yarElEEi ayarlanm IStlEl Sonuçlar: Kesme kriterine dayalEblarak, toplamda 13 klon, MASP-2 aktivitesini bloke ettigi bulunmustur. > %50 yol süpresyonu üreten tüm 13 klon, 10 benzersiz klon sunacak sekilde seçilmis ve lehIanmlSIlEl Tüm on klonun, aynEIiiafif zincirin alt S.- (A3), fakat üç farklßglîl zincirin alt lelEfJlarI sahip oldugu bulunmustur: VH2, VH3 ve VH6. Islevsel deneyde, on aday scFv klonundan besi, %0.5 insan serumu kullanarak 25 nM hedef kriterinden daha az IC50 nM degeri vermistir.

Gelismis potansiyele sahip antikorlarEbeIirIemek için, yukari açlKIandlglEgibi belirlenen üç ana scFv klonu, hafif zincir karismasi tabi olmustur. Bu süreç, altüsagllElEldonörden türetilen naif, insan Iambda hafif zincirin (VL) bir kütüphanesi ile eslestirilen her bir ana klonun VH'sInden olusan bir kombinasyonel kütüphane olusumumu içermistir. Bu kütüphane daha sonrasIda gelismis baglaylEElafinite ve/veya islevsellige sahigp scFv klonlarEliçin görüntülenmistir.

TABLO 15: Öncü klîlklonlarI ve ilgili ana klonlarII (tümü scFv format-adlî) IC50'de (nM) islevsel potansiyelinin klýlaslamaslîl scFv klonu %1 insan serumu C3 %90 insan serumu C3 %90 insan serumu C4 denemesi (ICso nM) denemesi (Icso nM) denemesi (Icso nM) 17D20mc 38 nd nd 17N16mc 68 nd nd Asagi, TABLO 15'de yukari gösterilen ve asagi TABLOLAR 16A ila F'de listelenen ana klonlara ve yan klonlara yönelik aglü zincirli degisken bölge (VH) sekanslarEl sunulmaktadIE kodlanan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 15) QVTLKESG PVLVKPTETLTLTCTVSG FSLSRG KM GVSWIRQPPG KALEW LAHIFSSDEKSYRTSLKS RLTISKDTSKNQWLTMTN M DPVDTATYYCARIRRG GIDYWGQGTLVTVSS QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTY ESKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPF DIWGQGTMVTVSS AgmZincirli Degisken Bölgg TABLO 16A: AgIEIzincir (aa 1 ila 20) Aglîlzincir d3521N11QVTL SGPVLVKPTETLTL dI7N9 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSL TABLO 168: AglElzincir (aa 21 ila 40) AgiEJ CDR-H1 d3521N11TCTVSQESLSBQKMGVSWI R dI7N9 TCAISQQSMSSISAAWNWIR TABLO 16C: Aglîlzincir (aa 41 ila 60) AgiEi CDR-H2 d3521N11QPPGKALEWLAuiEssoEKs d17N9 QSPSRGLEWLGßIXIßSKWY NUMARASI TABL016D:AgEündr@a61Ha8m CDR-H2 (devamm d3521N11 (SEKANSJS d17N9 NUMARASI TABLO 16E: AgEzincir (aa81 ila 100) d3521N1 1 d17N9 (SEKANSJ TABLO 16F: AglElzincir (aa101 ila 118) heavy chain (aa L 101-11 Aglü CDR-H3 (devamljl d3521N11 ß R G G I D Y W G Q G T L V T V S S d17N9RDPFGVPFDIWGQGTMVTVS Asagi TABLOLAR 17A ila F'de listelenen ana klonlara ve yan klonlara yönelik hafif zincirli degisken bölge (VL) sekanslarßunulmaktadlü Kabat veya Chothia sistemi ile numaralandEllüilgolsun veya olmasI aynIE OPV LTOPPS LSVS PGOTASITCSG E KLG D KYAYWYOOKPGOS PVLVMYQ DKORPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAM DEADYYCOAW DSSTAVFGGGTKL TVL 17N16m d17N9 hafif zincirli deGISken bölqe (VL) (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 18 ile kodlanan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 19) SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDN LG KKRVHWYQQRPGQAPVLVIYD DSDRPSGIPDRFSASNSG NTATLTITRG EAGDEADYYCQVWDIATDHWFGGGT KLTVLAAAGSEQKLISE TABLO 17A: Hafif zincir (aa 1 ila 20) d3521N11QPVLTQPPSLSVSPGQTA d17N9 SYELIQPPSVSVAPGQTA TABLO 17B: Hanf zincir (aa 21 ila 40) Hafif CDR'Ll d3521N11 T C 5 G d17N9TCAGQNLG5KgyquQQR TABLO 17C: Hafif zincir (aa 41 ila 60) Hafif CDR-LZ d3521N11QSPVLVMYQQKQBESQIPER d17N9 QAPVLVIYDQSQBESQIPDR TABLO 17D: Hafif zincir (aa 61 ila 80) Hafif CDR-L2 (devam[)] d3521N11FSGSNSGNTATLTISGTQAM d17N9FSASNSGNTATLTITRGEAG TABLO 17E: Hafif zincir (aa 81 ila 100) Haûf CDR-L3 d3521N11DXADYYCQAWDSSIAMEGGG d17N9 DEADYYCQMWQLALQHMV G TABLO 17F: Hafif zincir (aa 101-120) Hafif CDR-L3 (devam[)] d3521NITKLTVLAAAGSEQKLISEED d17N9GGTKLTVLAAAGSEQKLISE Yüksek affiniteli insan MASP-Z'ye baglandIgüve islevsel kompleman aktivitesine bloke edilebilme kabiliyetine sahip oldugu gösterilen MASP-Z antikorlarEl OMSlOO ve MOAb_d3521N11VL, nokta blot analizi ile epitop baglant- göre analiz edilmistir. Sonuçlar, d3521N11 ve OMSlOO antikorlarIiEl, MASP-Z için yüksek spesifik oldugu ve MASP-1/3'e baglanmad[giIElgöstermektedir. Ne MAp19'a ne de MASP-Z'nin CCP1 alanIEiiçermeyen MASP-2 fragmanlarIEia antikor baglanmamlgtlîi bu da baglama bölgelerinin CCPl'I kapsadfgIIZI sonucuna varmaktadIE Dolaylsiýla, bir durumda, talep edilen bulusun bilesimlerinde ve yöntemlerinde kullanIia yönelik bir MASP-2 inhibitör maddesi, insan MASP-2'den (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) olusan bir polipeptide baglanan bir insan antikorunu içermektedir, burada antikor asag-ki özellikleri içermektedir: a)asag.kileri Içeren bir aglElzincirIi degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 31 ila 35 arasIan amino asit sekans-çeren bir aglEI zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 21'in 50 ila 65'inden amino asit sekansIÜlçeren bir aglEi zmcn CDR2;veiü)SEKANS KDMJK NUMARASL zym 95ib iozsmden mnwm ast sekansIlIilçeren bir ag lElzincir CDR3; ve b)asag-kileri içeren bir hafif zincirli degisken bölge: i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 24 ila 34'ünden amino asit sekansIEI içeren bir hafif zincir CDR1; ve ii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 50 ila 56'sIan amino asit sekansIEilçeren bir hafif zincir CDRZ; ve iii) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 25'in veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27'nin 89 ila 97'sinden amino asit sekansIEiçeren bir hafif zincir CDR3; veya II) söz konusu aglElzincirli degisken bölgenin söz konusu CDR bölümleri içerisinde toplamda birlestirilmis 6 amino asit ikamesine kadarElve söz konusu hafif zincirli degisken bölgesinin söz konusu CDR bölgeleri içerisindeki toplamda birlestirilmis 6 amino asit ikamesine kadarEhariç söz konusu degisken alanlar. baska bir sekilde özdes olan, bunlar. bir varyantLîi burada antikor veya bununun varyantÇI MASP-Z'ye bagIiIEl kompleman aktivasyonunu inhibe etmektedir.

Bu Örnek, bir modifiye edilmis DT4O hücre dizisini, DTLacO, içeren bir canlEUlgEistem kullanilârak MASP-l ve MASP-3 monoklonal antikorlarI olusumunu açllaamaktadlîl On BilgizGerekge: dokümania açlKlandiglEl üzere belirli bir polipeptidin çesitliligin tersine çevrilebilir indüksiyonuna izin veren bir modifiye edilmis DT40 hücre dizisini, DTLacO, içeren bir canlü dmistem kullanilarak üretilmistir. DT40, kültürde aglElve hafif zincir immünoglobulinini (Ig) temel olarak mutasyona ugrattlgllîbilinen bir tavuk B hücre dizisidir. Diger B hücrelerinin benzeri, bu temel mutagenez, mutasyonlarlîlg genlerinin V bölgesine hedeflemektedir ve bu sekilde eksprese edilen antikor moleküllerinin CDR'Ierine hedeflemektedir. DT40 hücrelerinde temel mutagenez, donör sekanslarlZlolarak her bir islevsel V bölgesinin yukarlZlyönünde konumlandlEllân islevsel olmayan V geni segmentlerinin (psödo-V genleri; uJV) bir dizisini kullanan gen dönüsümü ile yer almaktadE llJV bölgesinin delesyonunun öncesinde somatik hipermutasyona gen dönüsümünden çesitlendirme mekanizmasIa bir degisime neden oldugu gösterilmistir, mekanizma genellikle insan B hücrelerinde gözlemlenmistir. DT40 tavuk B hücresi lenfoma dizisi, canlEUlgEblarak antikor degisimine yönelik bir umut vaat eden saatlik iki kat. çilZlarma süresiyle (insan B hücre dizilerine yönelik 20 ila 24 saatlik sürece klýlasla) kültürde dayanlklllir sekilde hlZa çogalmaktadlüve oldukça verimli homolog gen DT40 hücreleri, sßslsîla tasarlanmgve tasarlanmamgmutasyonlarlîblusturan çesitlendirme, gen dönüsümü ve somatik hipermutasyona yönelik iki ayrEl üzyolojik yola erisim saglayabilmeleri kaydüla sayslîßotansiyel V bölgesi sekansliesitliligi komutunu vermektedir immünoglobulinleri (IG'ler), bir hücre yüzeyi görüntülenmis IgM formunda eksprese edilmektedir. Yüzey IgM'si, bir IgG molekülüne yaplgtil olarak benzer olan bir bivalent formuna sahiptir. Belirli bir antijen özgüllügüne sahip IgM'yi görüntüleyen hücreler, antijenin immobilize çözülebilir veya membranElgörüntülenmis versiyonlar. baglanmaslîlvasltâslýla izole edilebilmektedir. Fakat, antikor degisimine yönelik DT40 hücrelerinin kullanIiÇldiger dönüstürülmüs B hücresi dizilerinde oldugu gibi, %1 fizyolojik orandan daha azIda çesitlendirmenin olusmaleUan dolayüliygulamada kEIflianmlStlB örnekte kullanilân sistemde, DT40 hücreleri, genetik modifikasyon kapasitesi veya mutageneze katklah bulunmasElçin gen dönüsümü ve somatik hipermutasyon potansiyeli feda edilmeden Ig gen çesitlendirme oranlEhlîlandlEnasEtasarlanmlgtlB DT40'a iki ana modifikasyonun, çesitlendirme oranIElarttlElnasDi/e sonuç olarak, hücre kütüphanemizde baglama özgüllüklerinin kompleksligini arttünaslîliçin olusturulmustur. Ilk olarak, Ig gen çesitlendirmesi, önemli Eco/i` Iaktoz operatör/represör düzenleyici ag kontrolü altlEb konulmustur. Önemli Eco/i' Iaktoz operatörün (PolyLacO) yaklaslE] olarak 100 polimerize tekrarIan olusan multimerler, homolog gen hedeflemesi ile yeniden düzenlenen ve eksprese edilen Ig)\ ve IgH'nin yukarüiönünde eklenmistir. Laktoz represör proteine (LacI) kaynasElZl hale getirilen düzenleyici faktörler daha sonrasia çesitlendirmeyi düzenlemek için LacO düzenleyici elemanlara baglanabilmektedir, bu da operatör DNA'sII Iaktoz represörünün yüksek affinitesinden (kD=10'14 M) avantaj saglamaktadlEl PolyLacO'nun sadece IgNda entegre edildigi DT40 PoIyLacO-AR hücreleri, herhangi bir mühendislik öncesinde ana DT40 hücrelerine göre 19 gen çesitlendirme oranlEUa bir 5 kat art& sergilemistir (Cummings, W.J. ve ark. PLoS Biol 5, e246 (2007)). Çesitlendirme aynüamanda yükselmistir. DTLacO hücreleri, ana DT40 PoIyLacO-AR LacI-HP1 dizisinin %2.8 özelligine göre 2.5 ila 9.2 kat yükselmis çesitlendirme oranlEla sahip oldugu gösterilmistir. Bu sebepten ötürü, aglEl ve hafif zincir genlerine PoIyLacO elemanlarII hedeflenmesi, DT40 parental hücre dizisine göre çesitlendirmeyi 21.7 kat hlîlandlünlgtlîl Ig Iokuslarlüla düzenleyici faktörlerin baglanmasüsadece mutagenez frekans[Ellîldegistirmemektedir, aynElzamanda benzersiz sekans degisimlerinin daha büyük bir koleksiyonunu olusturan mutagenez yolunu da degistirebilmektedir (Cummings ve ark. 2007; Cummings ve ark. 2008). Ikinci olarak, baglanan faktör ile hlîlandlElIân Ig gen çesitlendirmesine yönelik sekans baslatma noktalarII bir çesitli koleksiyonu üretilmistir. Bu çesitli sekans baslatma noktalarÇIyeniden düzenlenen 19 aglElzincirli degisken bölgelerinin aglElzincir lokusuna hedeflenmesi vasüâislýla, bir iki aylilîltavuktan izole edilen DTLacO'ya eklenmistir. Bu aglElzincirli degisken bölgelerin eklentisi, antikor çesitlendirmesine yönelik 107 yeni baslanglg] noktalelI bir repertuvarIlZl olusturmustur. Bu yeni baslangü noktalar DTLacO hücre dizisine olusturulmasübelirli bir hedefe baglanan klonlarI tanlllanmas ve daha sonrasia baglanan faktörlerle hlîllîl affinite matürasyonuna izin vermektedir. Affinite matürasyonundan sonra, tam uzunlukta bir rekombinant kimerik IgG, olgunlasmis) yeniden düzenlenmis agIEl ve hafif zincirli degisken sekanslarIJVH ve VA; tavuk çerçeve bölgelerinden ve tamamlayEZIbelirleyicilik bölgelerinden veya CDR'Ierden olusmaktadlE) insan IgGl ve Iambda sabit bölgelerini Içeren ekspresyon vektörlerine klonlayarak olusturulmaktadlB Bu rekombinant mAb'ler, canlEUlgZl/e canlEiçi uygulamalar için uygundur ve insanlastlElnaya yönelik baslanglgl noktasElolarak hareket etmektedirler.

Yöntemler: MASP-I ve MASP-3 antijen baglanmasûçin seçim.

Ilk seçimler, insan MASP-l (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10) ve MASP-3 antijen (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) ile komplekslenen taneciklere gen hedeflemesi vasißslýla çesitlendirilen DTLacO popülasyonlarII baglanmasElle uygulanmlgtß ve FACS ile sonraki seçimler, floresan ile isaretlenen çözülebilir antijeni kullanmaktadlE(Cumbers, S.]. ve ark. Nat 1 ve MASP-3 arasIa paylasllân (SEKIL 5'de gösterilmektedir) alfa zincirde korunan amino asit sekanslîlve ayrEbeta zincir sekanslarHSEKIL 6'da gösterilmektedir) ayrIilZlarEiçin, MASP-l ve MASP-3'e baglaylûßra yönelik paralel görüntüler, MASP-l'e özgü mAb'Ieri, MASP- 3'e özgü mAb'leri ve aynüamanda MASP-l ve MASP-3'e (çift spesifik) baglanabilen mAb'leri belirlemek için uygulanmlgtlEl Iki antijen formu, baglaylEIlârElseçmek ve görüntülemek için kullanHEüStlE Ilk olarak tam uzunlukta veya bir fragman olan, bir Fc aIanIEia baglanan rekombinant MASP-l veya MASP-3, Dynal manyetik Protein G taneciklerine baglanmlgive bir PECy5-isaretli anti inan IgG(Fc) ikincil antikor kullanilarak FACS tabanlü seçimlerde kullanlIIhlStlÜ Alternatif olarak, MASP-l veya MASP-3 proteinlerinin rekombinant versiyonlarü Dylight florlarlîle dogrudan isaretlenmis ve seçimler ve tarama için kullanllBilgtlEi Baglama ve affi'nite.

Rekombinant antikorlar PCR ile güçlendirilmis V bölgelerinin, 293F hücrelerinde insan IgGl'in ekspresyonunu destekleyen bir vektöre klonlanmasEiIe olusturulmustur (Yabuki ve ark., PLOS antijenin çesitli konsantrasyonlarüle antikor baglayEEMASP-l ve MASP-3'ü eksprese eclen DTLacO hücrelerini boyayarak belirlenmistir. MASP-3'e bagIiIEC3b birikimini ve MASP-3'e bagIiIEfaktör D bölünmesini içeren MASP-3'e özgü aktivitenin islevsel deneyleri, süslýla Örnek 17 ve 18'de açiElandlglgibi uygulanmlstlE Basli& MASP-l'e bagIiIlZliI3b birikimi olmak üzere MASP-l'e özgü aktivitenin bir islevsel deneyi, asaglflia açÜZiandEglügJibi uygulanmlgtEI Sonuçlar: Saylîlîl MASP-l ve MASP-3 baglama antikorlarÇiyukarlHla aç[lZlanan yöntemler kullanilarak üretilmistir. FACS analizi ile gösterildigi üzere MASP-3 baglaylîliârüçin eleklerde izole edilen temsilci klonlar M3J5 ve M3M1 için açiEJanmaktadiEI SEKIL 30A, DTLacO klonunun M3J5 MASP-3 antijen/antikor baglant-I bir FACS histogramIiB SEKIL 3OB, DTLacO klonunun M3M1 MASP-3 antijen/antikor baglant-I bir FACS histogramIE SEKIL 30A ve BOB'de, gri doldurulan egriler, IgGl'i boyanmig negatif kontroldür ve kaIIsiyah egriler, MASP-3 boyasIlEl SEKIL 31, MASP-3 antijenine özgü klon M3J5'in (Klon 5) bir satürasyon baglama egrisini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 31'de gösterildigi üzere, MASP-3'e özgü M3J5 antikorunun görünür baglayEßffinitesi, yaklasEIZI 31 nM'dir.

Belirlenen klonlarI sekans analizi, standart yöntemler kullanilârak uygulanmlgtlî.! Tüm klonlar, genel (DT40) VH ve VL sekanslarEi/e birbirleri ile klîlaslanmlgtlü Iki yukari bahsi geçen klonun M3J5 ve M3M1 sekansl: sßslýla MASP-l ve MASP-3'ün CCPl-CCPZ-SP fragmanlar. yönelik eleklerde belirlenen iki ek temsilci klonla D14 ve 1E10 bir hizalamada saglanmaktadlü D14 ve 1E10, MASP-l ve MASP-3'e ortak bölgeleri baglamaktadB amino asit sekansEliiizalamasIiEl amino asit sekansEIiiizaIamasIE Her bir klonun VH ve VL amino asit sekansüsagl saglanmaktadiü A"|IIZincirIi De"i ken Böl e VH sekanslarlîi SEKIL 32A, ana DTLacO'ya yönelik AgiElZincirli Degisken Bölge (VH) sekanslarII (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 24), MASP-3 baglama klonlarII M ve M ve MASP-l/MASP-3 çift baglama klonlarED14 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:30) ve 1E10'un bir amino asit hizalamaslügöstermektedir.

Asagi VH sekanslarIa Kabat CDR'leri, asagIki amino asit konumlarlEUa Asagi VH sekanslarIa Chothia CDR'Ieri, asagIki amino asit konumlarIda Ana DTLacO VH (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 24) AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFI'FSSNAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDD DGSGTRYAPAVKGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDTGTYYCTKCAYSSGCDY EGGYIDAWGHGTEVIVSS AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLEYVAGIRS DGSFTLYATAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCTRSGNVGDIDA WGHGTEVIVSS AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFDFSSYQMNWIRQAPGKGLEFVAAINRF GNSTGHGAAVKGRVTISRDDGQSTVRLQLSNLRAEDTATYYCAKGWGYCGSY SCCGVDTIDAWGHGTEVIVSS AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAM HWVRQAPGKGLEWVAGIYK SGAGTNYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKTFGSGCSSG YRAEYIDAWGHGTEVIVSS AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASG FTFSSYDMVWVRQAPGKG LE FVAGISRN DGRYTEYGSAVKG RATISRDNGQSTVRLQLN N LRAEDTATYYCARDAGGSAYW FDAGQIDAWGHGTEVIVSS Hafif Zincirli De i ken Böl e VL sekanslarEl SEKIL 32B, ana DTLacO'ya yönelik AglElZincirIi Degisken Bölge (VH) sekanslarII (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27), MASP-3 baglama klonlarII M ve M ve MASP-l/MASP-3 çift baglama klonlarED14 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:31) ve bir amino asit hizalamasIljgiöstermektedir.

Ana DTLaCO VL (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 27): ALTQPASVSANLGGTVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNDKR PSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTI'LTVL ALTQPASVSAN PGETVKITCSGGYSGYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYN NK RPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAG'ITLTVL ALTQ PASVSAN PGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKR PSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAWFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Klon D14 VL: (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 31) ALTQ PASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKR PSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTI'LTVL ALTQ PASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKR PSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAWFCGSADNSGAAFGAG'ITLTVL LEA -2 (MASP-Z 'ye baglüilwfsle vse/ Deneme MASP-l, MASP2'nin aktif hale getirilmesi kabiliyeti vasüslsîla LEA-2'ye katklâla bulunmaktadlEl (bkz. SEKIL 1). Wieslab® Kompleman Sistemi EkranEll/IBL deneyi (Euro Diagnostica, Malmö, Isveç), LEA-2'ye bagnlüaktivasyonu (örn. geleneksel Iektin yolu aktivitesi) izole eden kosullar altIa C5b-C9 birikimini ölçmektedir. Deney, 400 nM bir nihai konsantrasyon olarak test edilen temsilci klon 1E10 ile imalatçII talimatlar. göre uygulanm EtlEI SEKIL 33, deney kiti ve aynlîzamanda bir izotip kontrol antikoru ile saglanan pozitif seruma klîbsla mAb 1E10'un inhibitör aktivitesini gösteren bir çubuk gratigidir. SEKIL 33'de gösterildigi üzere, mAb 1E10, LEA-2'ye bagnlüaktivasyonunun klgmi inhibisyonunu (MASP- 2'nin MASP-l'e bagnlüaktivasyonunun inhibisyonu vaslliislîla) gösterirken, izotip kontrollü antikor göstermemektedir. Daha güçlü inhibisyona, DTLacO sisteminde baglanan faktörler kullanilârak MASP-1 baglant- yönelik bu antikorun devam eden affinite matürasyonu sayesinde ulasllIhalIlB Temsilci mAb'Iere yönelik LEA-l (MASP-3'e baglilmIslev Deneyleri, asaglâb Örnek 17 ve 18'de açlElanmaktadlEI Sonuclari Klîh AcllillamaslB YukarlElhki sonuçlar, DTLacO platformunun, Lea-1 (AsaglElh Örnek 17 ve 18'de gösterildigi üzere) ve LEA-2'de (bu Örnekte gösterildigi üzere) inhibitör özelliklere sahip MASP-l ve MASP-3 monoklonal antikorlarI hlîlücanllîlllglîkesfine izin verdini göstermistir.

Bu örnek, MASP-l ve MASP-2'nin polipeptit inhibitörlerinin olusumunu açlKlamaktadE Süslîla SGMI-l ve SGMI-2 olarak adlandlülân MASP-l ve MASP-2'nin spesifik inhibitörlerinin (2012) referanleUa açllZlanmaktadlB SGMI-l ve SGMI-Z, proteaz baglama döngüsünün sekiz konumundan alt-I tamamen randomize edildigi Sch/'stocerca gregar/'a proteaz inhibitörü 2'nin varyantlarII bir faj kütüphanesinden seçilmis olan 36 amino asit peptididir. Daha sonraleUa canlmlgîlegisim, tek haneli nM KI degerlerine sahip mono-spesifik inhibitörlerle poretaz baglama döngüsünün, iki inhibitörün özgüllügünü belirleyen birincil baglama bölgesini olusturdugunu ortaya çilZlarmlgtlB UzatllBiElikincil ve iç baglama bölgelerinin amino asit sekanslarIlEl, iki inhibitör için ortak olmakta ve temas ara yüzüne katkßla bulunmaktadlîl veya alternatif yollarßtkilemeden kompleman aktivasyonunun lektin yolunu bloke etmektedir amino asit sekanslarÇl asag- belirlenmektedir: Tam uzunlukta SGMI-l: LEVTCEPGTI'FKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 34) tam uzunlukta SGMI: LEVTCEPG'I'I'FKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEKANS KIMLIK NUMARASI:35) SGMI-l ve SGMI-2, sßslîla MASP-l ve MASP-Z'nin yüksek derecede spesifik inbibitörleridir.

Fakat, peptitler olarak, biyolojik çalEmalarda kullanIi için klîlîllEl potansiyele sahip olmaktalelar. Bu klgfllamalarülele almak için, bu biyoaktif peptit amino asit sekanslarIlZlbir Fc-füzyon proteinini olusturmak için insan IgGl Fc bölgesinin amino terminaline asllâdllîl Yöntemler: SGMI-IgGl Fc füzyon proteinlerini eksprese etmek için, SGMI-l (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 34) ve SGMI-Z'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 35) kodlayan polinükleotidler sentezlenmistir (DNA 2.0) ve IL-2 sinyal sekanlelükodlayan nükleotid sekanslarüre IgGl Fc bölgesi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 36) araleUaki ekspresyon vektörü pFUSE-hIgGl-Fc2'ye (InvivoGen) eklenmistir. Bir esnek polinükleotidler baglaylEE(örn. SEKANS KIMLIK NUMARASI: 37 veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 38), SGMI peptidi ve 1961 Fc bölgesi araletla dahil edilmistir.

Esnek Polipeptit BaglaylEESekanslar: GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO:37) GTGGGSGSSS (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 38) Elde edilen yapllâr, asaglki gibi açllZJanmaktadlE içeren polipeptit füzyonunu kodlayan bir polinükleotid, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 40 olarak belirlenen SGMI-l (altEizili), baglaylElZlbölge (italik olarak yazHBIlg) ve insan IgGl- FC'sini (birlikte "SGMI-lFc" olarak ifade edilmektedir) içeren olgun polipeptit füzyonunu kodlayan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 39 olarak belirlenmektedir.

SEKANS KIMLIK NUMARASI: 40 LEVTCEPGTTFKD KCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYOGrGGGSGSXmDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNW YVDGVEVH NAKTKPREEQYN STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESN GQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALH N HYT QKSLSLSPGK polipeptit füzyonunu kodlayan bir polinükleotid, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 42 olarak belirlenen SGMI-2 (altEçizili), baglaylEIZbölge (italik olarak yazilmis:) ve insan IgGl-FC'sini (birlikte "SGMI-2Fc" olarak ifade edilmektedir) içeren olgun polipeptit füzyonunu kodlayan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 41 olarak belirlenmektedir.

SEKANS KIMLIK NUMARASI: 42 LEVTCEPGTTFKD KCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNO G TGGGSGSSSRSDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESN GQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALH N HYT QKSLSLSPGK Rekombinant Protein/erin Üretimi: Serbest 293-F veya Expi293F hücreleri (Invitrogen), iki plazmidden birisi (pFUSE-SGMI-lFc (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 39) ve pFUSE-SGMI-ZFc (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 41) ile tedarikçinin protokolüne göre geçici olarak transfekte edilmistir. 37°C'de dört günlük inkubasyondan sonra, kültür ortamüçiEiarilBilStlB Fc-füzyon proteinleri, Protein A affinite kromatografisi ile saflastlülîhlgtlü Lektin yolunun aktivasyonunu ölçen denemeler.

SGMI-1Fc ve SGMI-2Fc füzyon proteinleri, lektin yolu aktivitesinin bir ölçümü ola bir mannoz kapIE96 hazneli plakada %1 serumdan C3b'nin birikimini inhibe edebilme kabiliyeti için test edilmistir. SGMI-1 Fc ve SGMI-2Fc, mannoz ile kaplanan haznelere (2 ug /hazne) eklentiden önce buzda bir saatligine 51 normal insan serumu ile ile önceden inkube edilmistir. C3b ölçülmüstür. izotip kontrolü, SGMI-1Fc veya SGMI-ZFC'ye yönelik C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 34'de gösterildigi üzere, SGMI-lFc ve SGMI-2Fc, süsüa yaklaslig olarak 27nM ve 300nM IC50 degerleriyle mannoz kapIlILISA haznelerinde normal serumdan C3b birikimini inhibe etmistir.

Bu sonuçlar, SGMI peptitlerinin ASMP-l ve MASP-2 inhibitör islevlerinin, SGMI-1 Fc ve SGMI- 2Fc füzyon proteinlerinde tutuldugunu göstermektedir. . aureusile 3MC serumunda kompleman yolunun analizi On Bil i Gerek e: immobilize olmayan, siîEiiaz mannoz, zimosan A veya N-asetil sisteine aruziyet vasiEislîla aktif hale getirilmektedir. Fakat rekombinant ve natif MASP-3'ün, normal insan serumunun (NHS) veya @Etkisi halde insan serumunun (HIS) (veri gösterilmemistir) mevcudiyetinde ve yoksunlugunda iglîüetkisiz halde olan 5. aureus yüzeyinde aktif hale getirilmesi belirlenmistir. C3b birikiminin, normal insan serumunun mevcudiyetinde 5. aureus yüzeyinde olustugu ve birikimin, bir aklgl sitometrisi kullanilârak takip edilebildigi belirlenmistir. Bu sekilde, 5. aureus'a olan alternatif yol (AP) yaniiîiIZlMASP-3'ün LEA-1'e katk-lil ölçülmesine yönelik bir yöntem olarak Örnekte açllîland Igllgibi ölçülmüstür.

Yöntemler: Rekombinant MASP-3: tam uzunlukta rekombinant insan MASP-3'ü kodlayan polinükleotid sekanslarÇlMASP-S'ün (CCPl-CCPZ-SP) tepesi kesik bir serin proteaz (SP) aktif versiyonu ve SP'si etkisiz halde MASP-3 formu (5679A), pTriEx7 memeli ekspresyon vektörüne (Invivogen) klonlanmlStlEl Ortaya çllîlan ekspresyon yapllârÇlbir amino terminal Streptag ve bir karboksi- terminal Hisö tag ile tam uzunlukta MASP-3 veya CCPl-CCPZ-SP fragmanIEkodlamaktadlE Ekspresyon yapllârü ImalatçEltarafIan saglanan protokollere göre serbest 293-F veya Expi293F hücrelerine (Invitrogen) transfekte edilmistir. 37°C'de %5 COz'de kültürün üç ila dört gününden sonra, rekombinant proteinleri, Streptactin affinite kromatografisi kullanllârak saflastlEllBr lStlE SP etkisiz hale getirici (5646A) mutasyonlar ile veya bunlar olmadan rekombinant MASP-l'in tam uzunlukta veya tepesi kesik CCPl-CCPZ-SP formlarülre bir amino terminal Steptag ve bir karboksi-terminal Hisö tag'I taslEtnasÇlyukarlEiaki rekombinant MASP-3 için açlElandlgJEgibi üretilmistir. 1. 3MC (insan) serumdaki S. aereus üzerinde C3b birikimi ve faktör B bölünmesi Bir ilk deney, aklgl sitometri deneyinin, asaglki gibi AP ile harekete geçirilen C3b birikimi (AP-C3b) mevcudiyetini veya yoksunlugunu tespit edebildigini göstermek için uygulanmlîstlü Asaglâlaki serumun yüzde besi: normal insan serumu, faktör B'si (Faktör B) tükenmis insan serumu, faktör D'si tükenmis insan serumu ve properdini tükenmis insan serumu (Complement Technology, Tyler, Texas, ABD'den elde edilmistir) gece boyunca 4°C'de Mg++/EGTA tampon veya EDTA'da test antikoru ile karlgtlElIlIhlStB Islgîbldürülen 5. aureus (IOS/reaksiyon), toplamda 100 i.iL bir hacim olan her bir karEEia eklenmistir ve 40 dakikall'gi. 37°C'de döndürülmüstür. Bakteriler, yllîlama tamponunda yllZlanmlgtlB bakteriyel topak, ylKlama tamponunda yeniden asklýh alIErnlStlElve her bir numunenin 80 uL tamböleni, aklgl sitometrisi kullanllârak anti-insan C3c (Dako, UK) ile tespit edilmis olan bakteriyel yüzeyde C3b birikimi için analiz edilmistir.

C3b'nin aklgsitometrik tespitlnin sonuçlarüSEKIL 35A'da gösterilmektedir. SEKIL 35A'da gösterildigi üzere, panell, AP'yi etkisiz hale getirdigi bilinen EDTA mevcudiyetinde normal Insan serumunda, herhangi bir C3b birikimi gözlemlenmemistir (negatif kontrol). Mg++/EGTA ile tedavi edilen normal insan serumunda, sadece Iektinden bagIisiZkompleman yollarÇlisIev gösterebilmektedir. Panel 2'de, Mg++/EGTA tamponu kullanilÜiaktadB bu sebepten ötürü AP, aktif olmaktadiEIAP ile harekete geçirilen C3b birikimi gözlemlenmektedir (pozitif kontrol).

Panel 3, 4 ve 5'de gösterildigi üzere, leisIEa faktör B'si tükenmis, faktör D'si tükenmis ve properdini tükenmis serumda, beklendigi Üzere herhangi bir alternatif yol ile harekete geçirilen C3b birikimi gözlemlenmemektedir. Bu sonuçlar, deneyin, AP'ye bagIiIEBb birikimi tespit edebildigini göstermektedir. . aureus deneyinde bir C3b birikimi, rekombinant MASP-3'ün MASP-3'de eksik olan insan 3MC serumunda AP'yi yeniden olusturma kabiliyetini ölçmek için yukar- açliZlandigiEgibi kombinasyonlarlîiiest edilmistir. 2.%5 normal insan serumu +Mg/EGTA serum + Mg++/EGTA serum + Mg+*/EGTA artüktif tam uzunlukta rMASP-3 serum + Mg++/EGTA artü tepesi kesik aktif rMASP-3 serum + Mg**/EGTA artüiktif tam uzunlukta rMASP-l Yukarlâia gösterildigi üzere %5 serum ve rekomibnant proteinlerinin (her biri 5 mg) çesitli karigiâilarügece boyunca 4°C'de belirtilen tampon kosullarIa (MgH/EGTA tamponu veya EDTA) inkube edilmistir. Gece boyunca inkubasyondan sonra, 108 lîlgiîöldürülen 5. aureus, 100 uL bir toplam hacimde her bir karigiînia eklenmistir ve 40 dakikal[gi. 37°C'de döndürülmüstür. Bakteriler, yilZiama tamponunda yilZianmßve yeniden asklsîia aliEmlgtIEive her bir numunenin bir 80 pl tamböleni, FACS C3b birikimi için analiz edilmistir. Her bir numunenin kalan 20 pL tamböleni, asaglEIb açiEland igiljgibi anti-faktör B antikor kullanüârak Western blot ile faktör B bölünmesini ölçmek için kullaniiIhigtiÜ C3b'nin aklgi sitometri tespitinin sonuçlarLIl SEKIL 35'de gösterilmektedir. Panel sayllârü yukar- tasarlanan her bir reaktif kombinasyonu için belirlenen sayilâra tekabül etmektedir.

Negatif kontrol (panel 1) ve pozitif kontrol (panel 2), beklendigi üzere C3b birikiminin yoksunlugunu ve mevcudiyetini göstermektedir. Panel 3, AP ile harekete geçirilen C3b birikiminin, 3MC serumunda mevcut olmadigJIEgöstermektedir. Panel 4 ve 5, aktif tam uzunlukta rMASP-3 (panel 4) ve aktif rMASP-3 (CCPl-CCPZ-SP) (panel 5), 3mC serumunda AP ile harekete geçirilen C3b birikimini restore etmektedir. Panel 6, inaktif rMASP-3'ün (5679A), 3MC serumunda AP ile harekete geçirilen C3b birikimini restore etmedigini göstermektedir. Panel 7, rMASP-l'in, 3MC serumunda AP ile harekete geçirilen C3b birikimini restore etmedigini göstermektedir.

Birlikte al“@a, bu sonuçlar, MASP-3'ün, insan serumunda 5. aureus'da AP ile harekete geçirilen C3b birikimi için gerekli oldugunu göstermektedir. 2. Faktör B'nin MASP-3 'ye baga/aktivasyonu Faktör B'nin MASP-3'e bagilühktivasyonunu analiz etmek için, yukar- gösterildigi gibi %5 serum (normal insan serum veya 3MC hasta serumu) ve rekombinant proteinlerin çesitli karlgfnilarüyukar- açiIZlandigiEgibi test edilmistir. Her bir reaksiyon karlglîniian 20 i.iL çüZlariIBilgi ve protein numune yükleme tamponuna eklenmistir. Numuneler, 10 dakikal[gi|Eia 70°C'de _ilgtlrîl ve bir SDS-PAGE jele yüklenmistir. Western blot analizi, bir Faktör B poliklonal antikor (R&D Systems) kullanüârak uygulanmlgtlrîl Faktör B aktivasyonu, yüksek moleküler ag Lama pro-Faktör B proteininden türetilen iki alt moleküler ag EMG bölme ürünlerinin (Bb ve Ba) formasyonu ile görülmüstür.

SEKIL 36, rMASP-3 mevcudiyetinde veya yoksunlugunda 3MC serumunda 5. aureus'a yan[Ei olarak faktör B bölünmesini belirlemek için bir Western blot analizinin sonuçlarIEI göstermektedir. Serit 1'de gösterildigi üzere, EDTA mevcudiyetinde (negatif kontrol) normal insan serumu, serit 2'de gösterilen Mg*+/EGTA mevcudiyetinde (pozitif kontrol) normal insan serumuna göre oldukça az Faktör B bölünmesini göstermektedir. Serit 3'de gösterildigi üzere, 3MC serumu, Mg++/EGTA mevcudiyetinde oldukça az Faktör B bölünmesini göstermektedir.

Fakat serit 4'de gösterildigi üzere, Faktör B bölünmesi, 3MC serumuna, tam uzunlukta rekombinant MASP-3 proteininin (5 ug) eklentisi ve pre-inkubasyonu ile restore edilmektedir. 3. Faktör B/ C3(H20) Bölünmesindeki pro-faktör D üzerinde rMASP-3 etkisinin belirlenmesine yönelik deneme AsagIki deney, faktör B'nin MASP-3'e bagilElaktivasyonu/bölünmesi için minimumum gerekliligi belirlemek adlEia uygulanmlgtlü ve rekombinant insan MASP-3 (200 ng), BBS/Ca++/Mg+*'da 100 mL toplam bir hacimde çesitli kombinasyonlarda (SEKIL 37'de gösterildigi üzere) birlikte karlgtlElIhlgl ve 30 dakikallgllEb °C'de inkube edilmistir. Reaksiyon, %5 2-mekaptoetan0l içeren 25 uL SDS yükleme boyaslZl eklenerek durdurulmustur. Çalkalama aItIa 10 dakikaligi. (300 rpm) 95°C'de kaynama sonrasia, karlglîni, 5 dakikaligl- 1400 rpm'de asagElçekilmistir ve 20 uL süpernatant yüklenmis ve bir %10 SDS jelinde ayrlEhlSIlE Jel, Coomassie parlak mavisi ile boyanmlStE Sonuçlar: SEKIL 37, faktör B bölünmesinin analiz edildigi bir Comassie boyaIDSDS-PAGE jelini göstermektedir. Serit 1'de gösterildigi üzere, faktör B bölünmesi, C4, MASP-3 ve pro-faktör D mevcudiyetinde en optimum olandlElSerit 2'de gösterildigi üzere, C3 mutlaka gerekmektedir, fakat serit 4 ve 5'de gösterildigi üzere, C3 mevcut oldugu sürece MASP-3 veya pro-faktör D, faktör B bölünmesini yönlendirebilmektedir. 4. MASP-3 mAb'Ierin MASP-3'e bagZE'iIMP ile harekete geçirilen C3b birikimini inhibe edebilme kabiliyetinin analizi Bu Örnekte açllZiandiglEiizere, bu sonuçlar, MASP-3'ün, insan serumunda 5. aureus'da AP ile harekete geçirilen C3b birikimi için gerekli oldugunu göstermektedir. Bu sekilde, asaglki deney, Örnek 15'de açilZlandigiElgibi belirlenen bir temsilci MASP-3 mAb'nin, MASP-3 aktivitesini inhibe edebilip edemedigini belirlemek için uygulanmlgtß Aktif, rekombinant MASP-3 (CCP1-CCP2-SP) fragman proteini (250 ng), buzda lsaatligine üç farklEi konsantrasyonda (0.5, 2 ve 4 uM) bir izotip kontrol mAb'si, mAb1A5 (MASP-3 veya MASP-l'e baglanmayan DTLacO platformundan elde edilen kontrol) veya mAbD14 (MASP-3'e baglanmaktadlî) ile önceden inkube edilmistir. Enzim-mAb karlglîniüSO pL bir nihai reaksiyon hacminde % ve 5x107 Elglîöldürülmüs 5. aureusîa maruz blîa'ekllîhlgtß Reaksiyonlar, 30 dakikal[gllEia 37°C'de inkube edilmistir ve daha sonrasIa C3b birikiminin tespiti için boyanmEtlB Boyanan bakteriyel hücreler, bir akgsitometrisi ile analiz edilmistir.

SEKIL 38, rMASP-3 mevcudiyeti ile 3MC serumunda mAb konsantrasyonunun bir islevi olarak çizilen üç antikordan elde edilen C3b boyasII ortalama floresan yogunluklarlElEQMFI) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 38'de gösterildigi üzere, mAbDl4, bir konsantrasyona bagIIElbir sekilde C3b birikiminin inhibisyonunu göstermektedir. Buna karsül, her iki kontrol mAb'si de C3b birikimini inhibe etmemistir. Bu sonuçlar, mAbD14'ün, MASP-3'e bagIllElC3b birikimi inhibe edebildigini göstermektedir. MAbD14'ün gelismis inhibitör aktivitesi, DTLacO sisteminde baglanan faktörler kullanllârak MASP-3 baglant- yönelik bu antikorun affinite matürasyonunun devam ettirilmesinden sonra beklenmektedir.

Sonuçlar. KEh Açtßlamaslîl Klîla açllZlamada, bu örnegin sonuçlari: MASP-3'ü eksik serumda net bir AP bozuklugunu göstermektedir. Bu sebepten ötürü, MASP-3, islevsel son noktalar olarak faktör B aktivasyonu ve C3b birikimi kullanllârak AP'ye bir kritik katklîblusturdugu gösterilmistir. DahasüMASP- 3'ün katalitik olarak aktif C terminal bölümü dahil islevsel rekombinant MASP-3 eklentisi, 3MC hastasIian serumda faktör B aktivasyonunda ve C3b birikiminde bozuklugu dogrulmaktadlîl Buna karslEl, bu Örnekte gösterildigi üzere, rMASP-3 içeren 3MC serumunda bir MASP-3 antikorunun (örn. mAbD14) eklentisi, AP ile harekete geçirilen C3b birikimini inhibe etmektedir. Faktör B aktivasyonunda ve bu sekilde AP'de MASP-3'n bir dogrudan rolü, C3 ile birlikte rekombinant MASP-3'ün, rekombinant faktör B'sini aktif hale getirmesi için yeterli olmaslîjiözlemi ile gösterilmektedir.

Bu Örnek, MASP-l ve MASP-3'ün, faktör D'yi aktif hale getirdigini göstermektedir.

Yöntemler: Rekombinant MASP-l ve MASP-3, pro-faktör D'nin iki farklürekombinant versiyonlarEl bölebilme kabiliyetleri için test edilmistir. Birinci versiyon (pro-faktör D-His), bir N-terminal isaretinden yoksundur, fakat bir C-terminal His isaretine sahiptir. Bu sebepten ötürü, bu pro- faktör D versiyonu, aktivasyon slîaslia bölünme ile çllZlarllân 5 amino asit pro-peptidi içermektedir. Ikinci versiyon (ST-pro faktör D-His), bölünen N-terminal fragmani. 15 amino aside artt-[glISekilde N-terminalinde bir Strep-TagII sekanleb sahiptir. ST-pro-faktör D aynlZl zamanda C-terminalinde bir His;> isaretini içermektedir. ST-pro-faktör D-His'in propeptidinin artan uzunlugu, pro-faktör D-HIS formu ile olasßözünürlüge klýlasla SDS-PAGE ile bölünmüs ve bölünmemis formlar arasIaki çözünürlügü arttlîilnaktadlrîl Rekombinant MASP-l veya MASP-3 proteinleri (2 iJg), pro-faktör D-His veya ST-pro-faktör D- His ssübstratlar. (100 ng) eklenmistir ve 37°C'de 1 saatligine inkube edilmistir.

Reaksiyonlar, pro-faktör D ve aktif faktör D bölünme ürününü çözmek için bir %12 Bis-Tris jelde elektroforeze edilmistir. Çözülen proteinler, bir PVDF membranlEta aktarHB1lgtlElve bir biyotinile faktör D antikor (R&D Systems) ile tespit vasiEaslýla Western blot ile analiz edilmistir.

Sonuçlar: SEKIL 39 pro-faktör D sübstrat bölünmesinin Western blot analizini göstermektedir. SEKIL 39'da gösterildigi üzere, sadece tam uzunlukta MASP-3 (serit 2) ve MASP-l (CCPl-CCPZ-SP) fragmanEaserit 5), ST-pro-faktör D-Hisö'ya bölünmüstür. Katalitik olarak inaktif tam uzunlukta MASP-3 (, sübstratEbölememistir. Pro-faktör D- Hise polipeptit (gösterilmemistir) ile benzer sonuçlar elde edilmistir. MASP-3'e göre MASP-l'in (CCPl-CCPZ-SP) bir molar fazlal[g]II klýlaslamasÇlMASP-3'ün, en azlEUan burada açIElanan kosullar altIa MASP-l'in oldugundan daha etkili bir pro-faktör D bölünmesi katalizörü oldugunu göstermektedir.

Sonuçlar: MASP-l ve MASP-3, faktör D'yi bölebilmekte ve aktif hale getirebilmektedir. Bu aktivite, AP aktivasyonu ile LEA-1'i dogrudan baglamaktadlü Daha belirgin olarak, MASP-l veya MASP-3 ile faktör D'nin aktivasyonu, faktör B aktivasyonuna, C3b birikimine ve olasü opsonizasyona ve/veya Iizise yol açacaktlEl 1. MASP-3 antikorlarEl ile pro-faktör D'nin MASP-3'e baglE1I|Zlbölünmesinin inhibisyonuna yönelik deneme Asag-ki gibi MASP-3'e bagilüfaktör D bölünmesinde Örnek 15'de açllZlandiglügibi belirlenen temsilci MASP-3 ve MASP-l mAb'Ierin inhibitör etkisini belirlemek için bir deney uygulanmlîstlEl Aktif, rekombinant MASP-3 proteini (80 ng), 15 dakikaligl. oda lelakllgJIa 1 i.ig temsilci mAb'ler D14, M3M1 ve bir kontrol antikoru (belirgin olarak MASP-l'e baglanmaktadlîl fakat MASP-3'e baglanmamaktadlE) ile önceden inkube edilmistir. Bir N- terminali Strep-tag (ST-pro-faktör D-His, 70 ng) içeren pro-faktör D eklenmistir ve karlglöli 75 dakikallgl- 37°C'de inkube edilmistir. Reaksiyonlar daha sonrasHa elektroforeze edilmis, blotlanmlglve yukarlElh açlßandgûgibi anti-faktör D ile boyanmlStlE SEKIL 40, sadece MASP-3 ve ST-pro-faktör D-His (herhangi bir mAb yok, serit 1) içeren bir kontrol reaksiyonuna ve aynElzamanda MASP-l'e baglanan, fakat MASP-3'e baglanmayan (serit 4) DTLacO kütüphanesinden elde edilen bir mAb içeren bir kontrol reaksiyonuna külasla mAb'Ier D14 ve M3M1'in kismi inhibitör aktivitesini gösteren bir Western blotudur. SEKIL 40'da gösterildigi üzere, bir inhibitör antikorunun mevcudiyetinde, MASP-3, pro-faktör D'nin yaklaslE %50'sini faktör D'ye (serit 1) bölmektedir. Kontrol MASP-l'e özgü antikor (serit 4), pro-faktör D'nin faktör D'ye oranIEldegistirmemektedir. Buna karslEl, serit 2 ve 3'de gösterildigi üzere, mAb D14 ve mAb M3M1, pro-faktör D'nin faktör D'ye MASP-3'e bagIiIEl bölünmesini inhibe etmektedir, bu da olusturulan faktör D'de bir azalma ile sonuçlanmaktad lü Sonuçlar: Bu sonuçlar, MASP-3 mAb'Ier D14 ve M3M1'in, MASP-3'e bagIiIElfaktör D bölünmesini inhibe edebildigini göstermektedir. mAbD14'ün ve mAb M3M1'in gelismis inhibitör aktivitesi, DTLacO sisteminde baglanan faktörler kullanliârak MASP-3 baglant- yönelik bu antikorun affinite matürasyonunun devam ettirilmesinden sonra beklenmektedir.

Bu Örnek, MASP-3 eksikliginin, mannoz kapllZlNT tavsan eritrositlerinin kompleman araclIJD lizisini önledigini göstermektedir.

On BilgilGerekge: Burada Örnek 5 ve 6'da açlEland [glElüzere, bir PNH fare modelinde elde edilen kan numunelerinden klEln lîEkan hücrelerinin Iizisinde MASP-Z ve MASP-3'ü eksik serumun etkisi, PNH'den muzdarip olan deneklerin tedavi edilmesine yönelik MASP-Z inhibisyonunun ve/veya MASP-3 inhibisyonunun verimliligini sergilemistir ve aynllamanda ekulizumab gibi bir C5 inhibitörü ile tedaviye tabi olan PNH deneklerinde C3 fragman araclDEkstravasküler hemolizin etkilerini hafifletmek için MASP-2'nin inhibitörlerinin ve/veya MASP-3'ün inhibitörlerinin (çift veya bispesifik MASP-Z/MASP-3 inhibitörleri içermektedir) kullanilülesteklemîstir.

Bu Örnekte açllZJand[g]|:lüere, C3b birikim deneyleri ve hemoliz deneyleri, ek 3MC hastalarlEUan MASP-3'ü eksik serumda uygulanmlStB bu da sonuçlari Örnek 5 ve 6'da elde edildigini onaylamaktadlE Ek olarak, 3MC serumuna rMASP-3 eklentisinin, C3b birikimini ve hemolitik aktivitesini yeniden olusturabildigini gösteren deneyler uygulanmlgtlE] Yöntemler: MASP-3'ü eksik serum, asaglki gibi Üç farleMC hastalarIan elde edilmistir: 3MC HastasEil: islevsiz MASP-3 serin proteaz alanIEkodlayan eksonu olusturan, 3MC hastasII annesi ve babasE(her ikisi de islevsiz MASP-3 serin proteaz alanIEkodIayan eksonu olusturan bir mutasyonu taslýhn alele yönelik heterozigo) birlikte tedarik edilen bir mutasyonu taslýlan bir aleli içermektedir, 3MC HastasüZ: Islevsel olmayan MASP-3, fakat islevsel MASP-l proteinleri ile sonuçlanacak sekilde MASP-3'ün serin proteaz alanIEIkodIayan ekson gibi MASP-l'n ekson 12'sinde C1489T (H497Y) mutasyonuna sahiptir. 3MC Hastasü3: Islevsel olmayan MASP-3, fakat islevsel MASP-l proteinleri ile sonuçlanacak sekilde MASP-l geninde onaylanmlSIlbir bozukluga sahiptir.

Bir AP deneyi, %05 ila %25 aral[g]lEUa serum konsantrasyonlarlüha zimosan kapIEl mikrotitrede geleneksel AP'ye özgü kosullar altlEtla uygulanmEtßßitter-Suermann ve ark., Mg++/EGTA, burada 885 = barbital tamponlu salin içeren sakaroz) ve C3b birikimi zamanla ölçülmüstü r.

Sonuçlar: SEKIL 41 MASP-3'ü eksik (3MC), C4'ü eksik ve MBL'si eksik deneklerden elde edilen serum numunelerinde serum konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kaplü mikrotitre plakalarlEUa AP ile harekete geçirilen C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 41'de gösterildigi ve asagi TABLO 18'de özetlendigi üzere, 2. Hastadan ve 3.

Hastadan MASP-3'ü eksik (3MC) hasta serumlarüyüksek konsantrasyonlarda (%25, %125, birikiminin %50'sine ulasmak için gerekli olan serumun %8.2'si ve %12.3'ü) kalan AP aktivitesine sahiptir.

SEKIL 42, MASP-3'ü eksik, C3'ü eksik ve MBL-'si eksik insan deneklerden elde edilen %10 insan serum numunelerinde bir süre islevi olarak “geleneksel” AP'ye özgü kosullar (örn. Ca** içermeyen BBS/EGTA/Mg++) aItIda zimosan kaplElnikrotitre plakalarIa AP ile harekete geçirilen C3b birikim seviyesini grafiksel olarak göstermektedir.

Asagii bulunan TABLO 18, SEKIL 41'de gösterilen AF›50 sonuçlarIEiJe SEKIL 42'de gösterilen C3b birikiminin yarßürelerini özetlemektedir.

TABLO 18: SEKILLER 41 ve 42'de gösterilen Sonuçlar. Klîla AçlElamasEl Serum türü APso (%) Tuz (dakika) Normal 4.5 5.7 27.5 Not: BBS/Mg++/EGTA tamponunda, Iektin oyolu aracUJEtkiler, bu tamponda Ca++ yoksunlugundan dolaylîzksiktir.

Deney #2: Normal insan veya 3MC serumunda (Ca”'+ yoksunlugunda) lizis icin mannoz kapllZl tavsan eritrositleri test eden hemoliz deneyi Yöntemler: Ca** yoksunlugunda tavsan RBC'sinin (örn. EGTA kullan Iliirak) preparasyonu TavsanlEl tüm kanEl(2 mL), iki 1.5 mL eppendorf tüpüne bölünmüstür ve 4°C'de bir sogutulmus eppendorf santrifüjünde 8000 rpm'de (yaklasüîl 5.9 rcf) 3 dakikalg. santrifüjlenmistir. RBC topagübuz soguklugunda BBS/Mg**/Ca++'da (4.4 mM barbiturik asit, yeniden asklýla aIlEhia sonraleUa Üç defa ylEbnmlgtlEl Üçünü yllZlamadan sonra, topak, 4 mL BBS/Mg++/Ca++'da yeniden asklýla allEknlgtlEl Eritrositler topaklanmlgtlüve RBC'Ier, yukar- açiEIandigDgibi BBS/%0.1 jelatin/Mg”'+/Ca++ ile yiEanmlgtIEl RBC süspansiyonu, 4°C'de BBS/%0.1 jelatin/ Mg++/Ca++'da depolanmlStE 100 |Jl askiya aI-n RBC, 1.4 mL su ile seyreltilmis ve 3 dakikalgßla 8000 rpm'de (yaklasllZl olarak 5.9 rcf) asaglîlçekilmistir ve eritrosit/mL'ye tekabül etmektedir). Bundan sonra, OD 0.7'de yeniden asklýia alin 1 mL RBC, 108 eritrosit/ml bir konsantrasyona ulasmak için 9 ml BBS/Mg++/EGTA'ya eklenmistir.

Test serumlarII veya pIazmanlEl seyreltileri, buz soguklugunda BBS, Mg”, EGTA'da ve hazlîilanmlgtiîi 100 pl her bir serum veya plazma seyreltisi, yuvarlak tabanlEplakanI ilgili haznesine pipetlenmistir. Yaklasilö olarak seyreltilmis , her bir hazneye eklenmistir. Nano-su, poziitf kontrolü (%100 lizis) üretmek için kullan[l]IIken, serum veya plazma içermeyen BBS/Mg++/EGTA ile bir seyrelti, bir negatif kontrol olarak kullanüBrlgtlB Plaka daha sonrasIa 37°C'de 1 saatligine inkube edilmistir. Yuvarlak tabanlEl plaka, 5 dakikaligl. 3750 rpm'de asaglîçekilmistir. Daha sonrasIda, her bir hazneden 100 pL süpernatant, bir düz tabanlü>lakanl ilgili haznelerine aktarilBilgtEve OD, 415-490 nm'de okunmustur.

Sonuçlar: SEKIL 43, Ca++ yoksunlugunda ölçülen normal deneklerden ve iki 3MC hastasIa (2. Hasta ve 3. Hasta) serumda serum konsantrasyonunun bir aral[g]i:boyunca fare serumla mannoz kaplEtavsan eritrositlerinin hemolizi yüzdesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen fare eritrositlerin hemoglobin saIIIiEIIe ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir.

SEKIL 43'de gösterildigi üzere, MASP-3 eksikliginin, normal insan serumu ile kiýhslandgilîl üzere mannoz kaplEI eritrositlerin kompleman arac[l]]] Iizisinin yüzdesini azalttigiü gösterilmektedir. Normal insan serumundan iki egri ve 3MC hastalarlrîtian iki egri araslrîhaki farklar önemlidir (p=0.013, Friedman testi).

Asag- bulunan TABLO 19, SEKIL 43'de gösterilen AP5Ü sonuçlarllîözetlemektedir.

TABLO 19: SEKIL 43'te gösterilen Sonuçlari Kisa AçiEiamasEi Serum türü APso (%) Normal insan serumu #1 7.1 Normal insan serumu #2 8.6 3MC Hasta #2 11.9 3MC Hasta #3 14.3 TABLO 19'da gösterilen serum numuneleri havuza al“[gia, normal insan serumuna Wilcox eslestirilmis diziler testi).

Denev #3: Rekombinant MAPS-3 ile insan 3MC serumunun yeniden olusturulmasüzimosan kaolüilakalarda AP ile harekete qecirilen C3b birikimini restore etmektedir Yöntemler: Bir AP deneyi, asag-ki serum numunelerinde zimosan kaplünikrotitre plakalarlEUa Bitter- geleneksel AP'ye özgü kosullar (Ca++ içermeyen BBS/Mg++/EGTA, burada BBS=barbital tamponlu salin içeren sakaroz) altia uygulanmlStlElü) 0 ila 20 ug/ml bir aralllîta eklenen tam uzunlukta aktif rMASP-3 içeren 3MC Hasta #Z'den %5 insan serumu; (Z) 0 ila 20 ug/ml bir aralltha eklenen tam uzunlukta aktif rMASP-3 içeren 3MC Hasta #Z'den %10 insan serumu; ve (3) 0 ila 20 ug/ml bir aralitha eklenen inaktif rMASP-3A (S679A) olan 3MC Hasta Sonuçlar: SEKIL 44, insan 3MC Hasta #Z'den (MASP-3'si eksik) elde edilen serum numunelerine eklenen rMASP-3 protein konsantrasyonunun bir islevi olarak zimosan kapllîlmikrotitre plakalarIa AP ile harekete geçirilen C3b birikiminin seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 44'de gösterildigi üzere, aktif rekombinant MASP-3 proteini, bir konsantrasyona baglilElsekilde zimosan kapIElpIakalarda AP ile harekete geçirilen C3b birikimini yeniden olusturmaktadlEl SEKIL 44'de gösterildigi üzere, inaktif rMASP-3 (5679A) içeren 3MC serumunda herhangi bir C3b birikimi gözlemlenmemistir.

Denev #4: Rekombinant MASP-3 ile insan 3MC serumunun yeniden olusturulmasIZIBMC hasta serumunda hemolitik aktivitevi restore etmektedir.

Yöntemler: Bir hemolitik deney, %0 ila 12 serum arallgiia asaglki test serumlarlýla yukari Deney Insan serum; (2) 3MC hasta serumu; (3) 3MC hasta serumu aktif Aktif tam uzunlukta rMASP- 3 (20 ug/ml); ve (4) @Etkisiz halde insan serumu.

Sonuçlar: SEKIL 45, Ca” yoksunlugunda ölçülen (1) Normal Insan serumu; (2) 3MC hasta serumu; (3) 3MC hasta serumu aktif Aktif tam uzunlukta rMASP-3 (20 ug/ml); ve (4) @Etkisiz halde insan serumunda bir serum konsantrasyonu aral[g]l:l üzerinde mannoz kaplütavsan eritrositlerin hemoliz yüzdesini (fotometri ile ölçülen süpernatanta çözünen tavsan eritrositlerinin hemoglobin sal Elle ölçüldügü gibi) grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 45'de gösterildigi üzere, tavsan RBC'nin Iizis yüzdesi, rMASP-3 (p=0.0006) içermeyen 3MC serumunda lizis yüzdesine klýlasla rMASP-3 içeren 3MC serumunda önemli ölçüde arttEIlBwlgtlE SEKIL 46, BBS/Mg++/EGTA'da 0 ila 110 ug/ml bir konsantrasyon araligiia aktif rMASP-3 içeren 2. 3MC HastaleUan ve 3. 3MC Hastasldan %7 insan serumunda tavsan eritrositin yüzdesini grafiksel olarak göstermektedir. SEKIL 46'da gösterildigi üzere, tavsan RBC ile restore edilmektedir.

Denev #5: MASP-3'ü eksik (CMC) hastasII serumu, MBL'nin mevcut olmasEIiiaIinde islevsel MASP-Z'ye sahiptir Yöntemler: Bir C3b birikim deneyi, 3MC serumunun LEA-2'de eksik olup olmad[g]lElüincelemek için Mannoz kapIEELISA plakalarEkullanllârak uygulanmlStlEl Sitrat plazmasüseri seyreltilerde seyreltilmis ve Mannoz kaplüolakalarda kaplanmiStE Biriktirilen C3b, bir tavuk anti-insan C3b deneyi kullanüârak tespit edilmistir. Mannoz kaplüELISA plakalarIa LEA-2 ile harekete geçirilen C3b birikimi (plazma seyreltileri, AP ve LEA-1'in çallglnasüçin yüksektir), bir normal insan denekten (NHS), iki 3MC hastadan (Hasta 2 ve hasta 3), HastanI 3'ün ebeveynlerinden ve bir MBL'si eksik denekten serumda insan serum konsantrasyonunun bir islevi olarak degerlendirilmistir.

Sonuçlar: SEKIL 47, bir normal insan denekten (NHS), iki 3MC hastadan (2. Hasta ve 3. hasta), 3.

HastanI ebeveynlerinden ve bir MBL'si eksik denekten alin serum için 885 tamponunda seyreltilen insan serumun konsantrasyonunun bir islevi olarak Mannoz kaplEl ELISA plakalarlEba LEA-2 ile harekete geçirilen (örn. MASP-2 ile harekete geçirilen) C3b birikiminin seviyesini grafiksel olarak göstermektedir. Bu veriler, 2. HastanlBl, MBL'sinin yetersiz oldugunu göstermektedir. Fakat 3. Hasta ve 3. HastanI annesinin MBL'si eksiktir ve bu sebepten ötürü, serumlarÇlLEA-Z vasltâsüa Mannozda 3b biriktirmemektedirßu serumlarda MBL degisimi, 3. HastanI (MASP-3 eksikligine yol açan SNP için homozigottur) ve annesinin (mutant MASP-3 aleli için heterozigottur) serumunda LEA-2 araclDJI3b birikimini restore etmektedir (veri gösterilmemistir). Bu bulgu, 3MC serumunun, LEA-2'de eksik oldugunu göstermektedir, fakat bundan ziyade islevsel MASP-Z'ye ve islevsel MASP-l'e sahip oldugu görülmektedir.

Genel klElai aclEIama ve Sonuclar: Bu sonuçlar, insan serumundaki MASP-3 eksikliginin, zimosan kapllZlliaznelerde azaltllBilglC3b birikiminde ve azaltllmgl tavsan eritrosit lizisinde ortaya çlEtlgllZJgibi AP aktivite kaybElle sonuçlandlglIlZlgöstermektedir. AP, islevsel, rekombinant insan MASP-3 ile serumlarü destekleyerek her iki deneyde restore edilebilmektedir.

Claims (10)

ISTEMLER

1. Paroksismal nokturnal hemoglobinüriden (PNH) muzdarip bir sujenin tedavi edilmesinde kullanla yönelik, MASP-3'e bagilükompleman aktivasyonunun inhibe edilmesi için etkili bir MASP-3 inhibitör maddesi miktarlülçeren bir bilesim olup, burada söz konusu MASP-3 inhibitör maddesi, insan MASP-3'ün bir bölümüne (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) spesifik olarak baglanan bir MASP-3 monoklonal antikor veya bunun fragmanIlB .

Istem 1'e göre kullanla yönelik bir bilesim olup, burada bilesim ayrlîla sunlardan en az birisini içermektedir: bir MASP-l inhibitör maddesi, bir MASP-2 inhibitör maddesi, bir MASP-l inhibitör maddesi ve bir MASP-2 inhibitör maddesinin bir kombinasyonu ve/veya kompleman proteininin (C5) bölünmesini inhibe eden bir terminal kompleman inhibitörü. .

Istem 2'ye göre kullanma yönelik bir bilesim olup, burada MASP-l inhibitör maddesi, (i) SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un bir bölümüne spesifik olarak baglanan bir MASP-l monoklonal antikoru veya bunun bir fragmanlîl (ii) MASP-3'e bagland [glIan (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8) en az 10 kat daha fazla bir affinite ile MASP-l'in bir bölümüne spesifik olarak baglanan bir MASP-l inhibitör maddesi;ve/veya (iii) MASP-l'in serin proteaz alanEla (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10'un aa 449- 694'ü) spesiûk olarak baglanan bir MASP-l inhibitör maddesi. .

MASP-2 inhibitör maddesinin, SEKAN

S KIMLIK NUMARASI: 5'in bir bölümüne spesifik olarak baglanan bir MASP-2 monoklonal antikoru veya bunun bir fragmanüildugu, Istem 2'ye göre kullanIla yönelik bir bilesim. .Bilesimin, (i) normal seviyelerin altIa hemoglobin, (ii) normal seviyelerin altia trombositler; (iii) normal seviyelerin üzerinde retikülositler, ve (iv) normal seviyelerin üzerinde bilirubinden olandan olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla semptomu sergileyen bir sujede klElnlZZKan hücrelerinin sagkalnIElarttElkjlEl tercihe baglEblarak sujenin, kompleman proteininin (C5) bölünmesini inhibe eden bir terminal kompleman inhibitörü ile tedaviye önceden tabi oldugu veya hala tabi olmaya devam ettigi Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre kullanIia yönelik bir bilesim.

6. Terminal kompleman inhibitörünün, bir insanlastlEllEnlS anti-C5 antikoru veya bunun antijen baglaylEElfragmanIJJIdugu, veya söz konusu inhibitörün ekulizumab oldugu, Istem 2'ye göre kullanIla yönelik bir bilesim.

7. MASP-3 monoklonal antikorunun veya bunun fragmanIlEl, bir rekombinant antikoru, azaltlJBilgefektör islevine sahip bir antikor, bir kimerik, ve bir insanlastlEllBilSJ veya insan antikorundan olusan gruptan seçildigi, Istem 1'e göre bilesim.

8. Bilesimin, sübkütanöz olarak, intramüsküler olarak, intravenöz olarak, intraarteriyel olarak veya bir inhalant olarak tasIia gibi sistemik tasIia için formüle edildigi, Istem 1'e göre bilesim.

9. Paroksismal nokturnal hemoglobinüriden (PNH) muzdarip olan bir sujede klîilnlîlîlkan hücrelerinin sagkalIiII artlEllB1aslZiçin etkili olan bir MASP-3 inhibitör maddesi miktarIEl içeren, Istem 1'e göre kullanIia yönelik bir bilesim.

10. Ayrlîla bir MASP-Z inhibitör maddesi içeren, Istem 9'a göre kullanIia yönelik bir bilesim.