CN101423552B - 一种人源抗人组织因子Fab及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及应用天然的人源抗体基因库筛选具有抗凝血功能的抗人组织因子Fab片段。本发明通过构建人源抗体基因库并经过ELISA、稀释凝血酶原时间、测序分析等从库中筛选到具有抗凝活性的人源抗人组织因子Fab，命名为hTFFab₁₄₈，经大量的表达纯化及进一步的鉴定，证实本发明的人源抗组织因子Fab抗体具有抗凝活性且不会产生与传统的抗凝剂组合药物相关的不需要的副作用，并具有超出现有技术的TF抗体的特性。

Description

一种人源抗人组织因子Fab及其制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及应用天然的人源抗体基因库筛选具有抗凝血功能的抗人组织因子Fab片段。本发明涉及到编码上述的Fab抗体、特别是编码该抗体V区片段的DNA、以及编码含有V区的L链或H链的DNA。本发明还涉及含有该DNA的重组载体、以及利用该载体转化的宿主。另外本发明还涉及以抗人TF的人源抗体为有效成分的医药组合物和动脉粥样硬化的治疗药物。

背景技术

组织因子(tissue factor，TF)，又称凝血因子III，是一种分子量为47KD的跨膜糖蛋白，其凝血功能已经众所周知，它与活化凝血因子VII(activated factor VII，FVIIa)结合后，形成TF/FVIIa复合物，启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子XI，启动内源性凝血系统，是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用。同时，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋白，近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。

抗人组织因子抗体是否具有抗凝活性，不是取决于抗体与TF抗原点亲和力的强弱，而是取决于其是否封闭了TF与下游相互作用的凝血因子的结合部位。如果抗人组织因子抗体阻碍了TF与FVII的结合，可能会导致一系列的生理功能紊乱，但是如果仅是针对TF和FX结合部位的抗体却能够阻止TF/FVIIa复合物的凝血激活作用，抑制凝血。

至今已经使用的众多抗凝血药物，包括肝素类药物、血小板聚集抑制物、凝血酶抑制剂等，所针对的靶蛋白均位于凝血途径中的中下游，理论上都达不到最理想的抗凝作用，且使用过程中可能出现由于过度抑制引发的出血等不良反应。研制能拮抗TF促凝血作用的抗人组织因子抗体为研制防治血栓类疾病的新型药物奠定了基础，而一些能作为有效抗凝剂的并能结合并中和TF或FVII/TF复合物或这两者的抗体已经被描述例如抗TF的小鼠Mabs的治疗应用在美国专利US6,001,978和US5,223,427中有记载；国际申请WO 99/51743涉及针对人的TF的人/小鼠嵌合单克隆抗体；欧洲专利申请EP833911涉及针抗人TF的CDR接枝抗体；Presta L.等在《Thrombosis andHaemostasis》第85卷(3)pp.379-389(2001)中描述了抗TF抗体的人源化抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab及其制备方法和应用。

本发明所述的人源Fab抗体选自天然的人源抗体基因库。

本发明提供了一种能编码识别人组织因子的人源Fab片段的基因序列，然而产生本发明的基因序列的方法不受特别的限制。

所述的具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，包括重链V区和轻链V区，含有序列1和17的核苷酸序列。

所述的重链V区含有序列2的氨基酸序列；

上述的重链V区由由互补决定区(complementarity-determining region，CDR)和框架区FR(framework region，FR)构成，所述CDR含有序列4、6和8的氨基酸序列；所述的FR含有序列10、12、14和16的氨基酸序列。

所述的轻链V区含有序列18的氨基酸序列；

上述的轻链V区由互补决定区CDR和框架区FR构成，所述CDR含有序列：20、22和24的氨基酸序列；所述的FR含有序列26、28、30和32的氨基酸序列。

含有编码本发明的人源抗组织因子Fab片段基因的质粒载体构成了本发明的一个部分。

本发明提供了一种质粒载体，含有编码所述的重链V区的DNA和所述的轻链V区的DNA，它能插入编码本发明的人源抗组织因子Fab片段的基因。本发明的质粒不受特别限制，优选pFab-His2。

表达本发明的人源抗组织因子Fab片段的宿主细胞构成了本发明的一个部分。

本发明提供了一种宿主细胞，它能表达本发明的人源抗组织因子Fab片段。

本发明的宿主细胞不受特别的限制，可选自大肠杆菌、酵母或真核细胞，，优选大肠杆菌JM109感受态细胞。

本发明通过构建人源抗体基因库并经过ELISA、稀释凝血酶原时间、测序分析等从所述人源抗体基因库中筛选得到具有抗凝活性的人源抗人组织因子Fab，命名为hTFFab148，而后进行了大量的表达纯化及进一步的鉴定。

在本发明的实施中，筛选能表达具有抗凝活性的人组织因子Fab片段的质粒载体的方法不受特别的限制，可通过例如免疫印迹、ELISA等进行选择。

本发明的实施中，纯化具有抗凝活性的人组织因子Fab片段的方法不受特别的限制，但首选是通过表达蛋白上携带的6×His Tag经Ni-NTA柱纯化。

本发明所制备的单克隆抗体进行抗凝活性鉴定的方法不受特别限制，如稀释凝血酶原时间、FX发色底物法等。

本发明的Fab抗体不受特别的限制，可以是任何形式能与人组织因子结合的具有抗凝活性的抗体。

本发明的人源抗组织因子Fab抗体具有如下优点：

与现有技术的小鼠单克隆抗体比较，因所述小鼠单克隆抗体其属于异种蛋白而具有免疫原性，故在人体中反复应用时可产生不同程度的人抗鼠抗体(HAMA)反应，从而削弱其治疗的有效性，并对清除抗体的器官产生损害；与现有技术的嵌合抗体及人源化抗体等比较，虽其与所述的小鼠抗体相比，免疫原性降低，但是产生免疫应答的可能性也是存在的，并存在改造过程中可能会出现抗体亲和力和特异性降低等问题。本发明的人源抗组织因子Fab抗体具有抗凝活性且不会产生与传统的抗凝剂组合药物相关的不需要的副作用，并具有超出以往描述的TF抗体的特性。

附图说明

图1.载体pFab-His2质粒图谱。

图2.HindIII酶切后pFab-His2琼脂糖凝胶电泳图，其中A：DNA Marker，B：pFab-His2空载体。

图3.IgG Fab抗体库琼脂糖凝胶电泳图，其中A：DNA Marker，B：IgG Fab抗体库。

图4.不同浓度hTFFab148 Dot blot，

其中，A：阴性对照，B：TF(1ng/ug)，C：TF(0.5ng/ul)，D：TF(0.25ng/ul)，E：TF(0.125ng/ul)。

图5.hTFFab₁₄₈重、轻链琼脂糖电泳图，其中，M：DNA Marker，A：hTFFab₁₄₈重链，B：hTFFab₁₄₈轻链。

图6.hTFFab₁₄₈轻链序列图。

图7.hTFFab₁₄₈重链序列图。

图8.hTFFab₁₄₈在细菌表达中IPTG诱导前后SDS-PAGE，

其中A：蛋白质Maeker，B：hTFFab₁₄₈在细菌表达中IPTG诱导前，C：hTFFab₁₄₈在细菌表达中IPTG诱导后。

图9.hTFFab₁₄₈表达纯化后SDS-PAGE，

其中A：蛋白质Maeker，B.C：纯化后hTFFab₁₄₈。

图10.hTFFab₁₄₈ Western blot，

其中，A、B：hTFFab₁₄₈重链，C、D：hTFFab₁₄₈轻链。

图11.hTFFab₁₄₈稀释凝血酶原时间测定(dPT)。

图12.hTFFab₁₄₈ Actichrome

TF kit X剩余活性测定。

图13.正常SD大鼠颈动脉HE染色(10×20)。

图14.10％FeCl₃处理后SD大鼠颈动脉血栓组成HE染色(10×20)，

其中，A：未受损的内皮细胞，B：受损的内皮细胞。

图15.血栓造模后各组大鼠不同时间血流速变化图。

图16.是二室模型原理图，其中，

im：肌肉注射，    iv：静脉注射，

po：口服，        ip：腹腔注射。

k12：药物自中央室进入周边室的速率常数，

k21：药物由周边室返回中央室的速率常数，

k10：药物由中央室消除的速率常数，

k20：药物自周边室消除的速率常数。

图17.hTFFab₁₄₈血药浓度随时间变化图。

下面通过实施例更具体的说明本发明。

具体实施方式

实施例1.抗体库的构建

选择近2个月未患感冒等感染性疾病和无慢性疾病的知情健康人300名，各取5ml外周抗凝血，以Ficoll-Paque分离淋巴细胞，混合后用于抗体库的构建，提取总RNA。将总RNA用Gene-Amp RNA PCR试剂盒以Oligo(dT)₁₆逆转录成cDNA，并以人IgG轻重链可变区保守序列的上下游引物(表1)进行免疫球蛋白γ、κ、λ链基因的PCR扩增。

PCR产物经提纯后，分别以AscI和Nhe I双酶切κ链和λ链产物。酶切后的κ链和λ链产物与人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2连接(图1、图2)，随后电转入JM109感受态细胞中，构成轻链库。分别以Sfi I和Not I对轻链库及γ链PCR产物进行酶切修饰，连接反应后，电转导入大肠杆菌JM109中，构成9.8×10⁸的非依赖性克隆滴度的抗体库，取1ulDNA进行酶切电泳(图3)。

表1是人IgG轻重链可变区保守序列的上下游引物序列。

表1

κ轻链5′端引物
	Nhe IVK1： CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCCVK2a：CCGCTAGCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCCVK3a：CCGCTAGCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCCVK4： CCGCTAGCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC
κ轻链3′端引物：
	Asc IVKC：TTGGCGCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
λ轻链5′端引物
	Nhe IVL1a：CCGCTAGCCAGTCTGYSCTGACTCAGCCWVL1b：CCGCTAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGVL2a：CCGCTAGCMACKTTATAYTGACTCAACCGVL2b：CCGCTAGCCAGACTGTGGTAACYCAGGAGVL3a：CCGCTAGCTCCTATGWGCTGACTCAGCCAVL3b：CCGCTAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC
λ轻链3′端引物
	Asc IVLC：TTGGCGCGCCTGAAMATKCTGTAGSGGCCACTGT
γ重链5′端引物

Sfi IVH1a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGVH1b：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGGVH2a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGGVH3a：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGGVH3b：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGVH4c：AAGGCCCAACCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG
	γ重链3′端引物
Not IFDG1：CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGATTTFDG2：CCGCGGCCGCTTTGCGCTCAACTGTCTTGTCCACFDG3：CCGCGGCCGCTGTGTGAGTTGTGTCACCAAGTGGFDG4：CCGCGGCCGCTGGGGGACCATATTTGGACTCAAC

其中：引物方向为5′至3′，下划线部分表示酶切位点，符号M代表核苷酸A或C；Y代表C或T；W代表A或T；R代表A或G；H代表A或C或T；S代表C或G；K代表T或G。

实施例2：抗体库筛选

(1)ELISA鉴定：

从已构建抗体库中取1ul质粒转化100ul JM109感受态细胞，均匀涂于含氨苄青霉素100ug/ml的LB平板上，37℃静置培养12-16h，待其长出单克隆菌落。从LBA平板上分别挑取单克隆菌落及阴性对照(未插入重、轻链的pFab1-His2质粒转化JM109感受态细胞)菌落备份后接种在2ml的SBA(30g of tryptone，20g of yeastextract，10g of MOPS per liter，100ug/ml Ampicillin，pH 7.0)培养基中，备份板37℃培养过夜后，4℃保存。细菌培养至OD₆₀₀＝0.5~0.8后加入终浓度为0.1mM的IPTG 30℃诱导过夜。次日晨8000rpm×15min离心，弃上清，250ulPBS(含终浓度为1mM的PMSF)重悬，超声后4℃，14,000rpm×30min离心，取上清，留作ELISA测定。

TF抗原3ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜，PBST洗板3次×5min/次；次日晨加入含有3％BSA的PBS，37℃封闭1.5小时；同上洗板后加入100ul每孔的超声后的菌液上清，37℃，孵育1h；再次洗板后加入100ul/孔的HRP标记的Anti-Human Fab(1∶1000稀释)，37℃，孵育1h；洗板，每孔加入100ul显色液，静止数分钟待显色后，每孔加入50ul 2MH₂SO₄终止显色，OD₄₉₀读数分析。

(2)稀释凝血酶原时间(dPT)测定：

取ELISA鉴定阳性的克隆菌液上清10ul，与50倍稀释的PT试剂100ul混匀，孵育5min，加入到预热3min的50ul血浆中，凝血仪MC200计时。阴性对照为未插入重轻链的pFab-His2质粒转化JM109感受态细胞后，同样条件培养后超声处理所得的菌液上清，对比凝血时间延长情况。

(3)Dot blot

在硝酸纤维素膜上分别滴加不同浓度的TF各2ul，待风干后5％BSA TBST封闭2h；加入用5％BSA TBST 1∶10稀释的阳性克隆的菌液上清，室温下孵育1h；TBST洗膜3次×5min，加入HRP标记的羊抗人IgG Fab，室温孵育1h；同上洗膜，并在发光试剂中孵育2min，吸干膜上多余的发光试剂在暗室中曝光3min(图4)。

(4)酶切鉴定

从备份的LBA平板上挑取鉴定出的阳性单克隆菌落，接种至5mlLBA培液中37℃×250rpm，培养过夜，使BioDev B型质粒小样快速抽提试剂盒，按protocol提取质粒。分别使用Asc I、Nhe I和Sfi I、Not I进行重轻链酶切，并回收上述重、轻链目的片段(图5)，分别加入10×连接buffer和T4连接酶，以及测序载体CV1、CV2。在16℃，反应3h，进行连接，而后取1ul连接产物，转化JM109感受态细胞，涂板培养12h后，每板上随意挑取3个单克隆菌落，分别接种至5mlLBA培液中，震荡培养10h后取3ml进行质粒抽提，送Invirogene公司进行测序，

测序引物为M13：forward：(5’-CACGACGTTGTAAAAACGAC-3’)，

               reverse：(5’-GGATAACAATTTCACACAGG-3’)

(5)测序分析

根据测序结果(图6、7)，将筛选出的阳性克隆重、轻链可变区DNA序列在http://www.ncbi.nlm.nih.gov和http://www.expasy.ch网站上进行比对，证实其基因为编码IgG Fab的基因，且序列读码方式符合本发明目的要求，然后对其编码蛋白序列的FR进行同源性比较结果(表2)，证实其为人免疫球蛋白基因，并确定此阳性克隆，命名为hTFFab₁₄₈。表3，表4是其重链、轻链氨基酸序列。

表2是hTFFab₁₄₈编码蛋白序列的FR同源性比较结果。

表2

		Identities	Positives	Sequence NO.
					重链(H)	FR1	86％	93％	10
FR2	100％	100％	12
				FR3		70％	82％	14
FR4	100％	100％	16
				轻链(L)		FR1	91％	95％	26
FR2	100％	100％	28
					FR3	96％	100％	30
FR4	100％	100％	32

表3

                FR1            CDR1        FR2             CDR2

QVQLVQSGGGLVEPGRSLRLSCRTSGFKFG DHTII  WFRQAPGKGLEWVG FVRSKALGGTTENAAPLEG

               FR3                         CDR3          FR4

RFSVSRDDSTGIAYLEMETNRLKIEDTAVYYCSR  CAYTGALYFFDSWGPG  TLVTVSSASTK

表4

                FR1          CDR1          FR2         CDR2

DIELTQSPPSLSASVGDRVTITC  RASQFISKYVN  WYQQKPGKAPKLLIS VASSLQS

                FR3                 CDR3         FR4

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYC  QQSYTTPSF  GGGTRVEIKRT

实施例3 hTFFab₁₄₈的表达、纯化与鉴定

(1)hTFFab₁₄₈的表达和纯化

将hTFFab₁₄₈克隆质粒转化JM109感受态细胞后，均匀涂于LBA平板，培养过夜后，挑取单克隆菌落，接种于10mlSBA培液中37℃×250rpm震荡培养，至OD₆₀₀约1.0左右，按1∶100比例稀释至1000mlSBA培液中37℃×250rpm继续震荡培养至OD₆₀₀约1.0左右，接种于18L SBA培液在30L发酵罐中，37℃×350rpm，pH7.0，溶氧60％，继续培养至OD₆₀₀约1.0左右加入IPTG至终浓度0.5mM 30℃诱导表达8h(图8)，4000rpm×30min，4℃离心，收集细菌，冻存于-80℃。

根据细菌湿重以每克菌体加入5ml NPI-10(含终浓度为1mM的PMSF)比例重悬，400W，3s/5s，超声至液体澄清，4℃，14,000rpm×30min离心，取上清。按Ni-NTASuperflow Cartridge Handbook的操作步骤进行纯化，收集洗脱峰蛋白，PBS(pH 7.0)4℃透析24h，即得到纯化的hTFFab₁₄₈蛋白。

使用Ni-NTA Superflow对处理后的菌液上清进行纯化后，取10ul进行15％SDS-PAGE电泳分析(图9)，在26kb左右可见明显的两条带，分别为hTFFab₁₄₈重链和轻链，在70kb左右也可见一明显条带，分析可能为重链或轻链形成的三聚体。

(2)Western blot

将纯化后的hTFFab₁₄₈进行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，加入适量封闭液，室温轻轻振荡3h或4℃过夜。用封闭液按1∶3000比例将HRP标记anti-HumanFab Antibody稀释成工作液，加在硝酸纤维素膜上，室温2h，用TTBS洗膜3次，每次10min。配制发光试剂并将硝酸纤维素膜孵育2min，吸去印迹膜边缘或上多余的发光试剂，将印迹膜放入塑料袋中在暗室中使胶片曝光3min(图10)。

实施例4：hTFFab₁₄₈抗凝活性测定

(1)血浆凝固抑制活性测定体系

取纯化后的抗体(50ng/ml)10ul，与50倍稀释的PT试剂100ul混匀，孵育5min，加入到预热3min的50ul血浆中，该血浆为市售的正常人血浆(上海市血液中心)，凝血仪MC200计时，对比凝血时间延长情况，检测结果，可见有明显的抗凝活性(图11)。

(2)以因子Xa活性为指标的TF中和活性测定体系

采用Actichrome

TF kit(ADI，USA)检测纯化后hTFFab₁₄₈的剩余Xa因子活化率。在96孔板中，每孔依次加入25ul Assay Buffer(pH 8.4)，25ul脂化组织因子标准品(20pm)，25ul一定浓度的纯化后hTFFab₁₄₈，37℃孵育45min，加入25ul FVIIa，25ulFX，37℃孵育15min，加入25ul FXa发色底物Spectrozyme，37℃孵育45min，Wallac1420酶标仪检测A₄₀₅读数。利用这一方法可以测定抑制TF因子/Vlla复合物和因子X结合的抗体的活性，结果显示hTFFab₁₄₈浓度在100ng/ml-0.1ng/ml范围内都有较明显的抑制FXa的活性，并且随着hTFFab₁₄₈浓度的增高，抑制率也增加(图12)。

实施例5：动物实验

(1)hTFFab₁₄₈药效学实验

将20只SD大鼠随机分成4组，分别为阴性对照组(10％FeCl₃)、阳性对照组(10％FeCl₃+200u/kg肝素)、高剂量组(10％FeCl₃+hTFFab₁₄₈2mg/ml)、低剂量组(10％FeCl₃+hTFFab₁₄₈1mg/ml)，每组大鼠各5只。

各组大鼠均于实验前晚(8小时)开始禁食。实验开始时，应用3％戊巴比妥钠30mg/kg剂量腹腔注射，麻醉后立即通过尾静脉分别注射生理盐水、肝素和hTFFab₁₄₈(二个剂量)。分离左颈动脉1.5cm，其下置小片塑料薄膜(4cm×1.5cm)，避免FeCl₃刺激迷走神经，取2片10％FeCl₃饱和滤纸(1cm×1.2cm)敷于血管上下，2分钟后移去滤纸，以Vevo 770imaging system记录5，10，20，30，40分钟造模处血液流速变化以及血栓形成动态影像。通过血流变化观察血栓形成变化情况，P-Model超声图片可直观血栓最终情况，M-Model超声图片为血栓截面图，用于分析血栓占管腔的比例。

观察完毕后，取造模处动脉约1cm 4％甲醛固定，制作病理切片(图14)，以未经处理的正常SD大鼠相同部位的颈动脉做切片(图13)作为对照。心脏采血1.35ml(0.15ml 3.8％枸橼酸钠抗凝)后处死大鼠。

阴性对照组取样后肉眼观察，管腔外均有黄色FeCl₃残留，管腔内有红色或者暗红色栓塞物。光镜下所形成的血栓为混合型血栓。结构致密，由不规则聚集的血小板、纤维蛋白、白细胞和红细胞组成。其中染色略呈嗜酸性的部分为血小板聚集形成的小梁，呈网状或者颗粒状，其周边可见中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞包围。红染较深的部分主要为红细胞，其周边可见呈浅嗜酸性的丝状纤维蛋白结构；并可见血管内皮细胞连接点的断裂、内皮细胞走向紊乱、胞浆脱落。

Vevo 770 imaging system观察，阴性对照组颈动脉经10％FeCl₃作用后，5-8分钟可以观察到血流流速上升，超声图像显示12-20分钟逐渐形成血栓，血流流速稳步上升，20分钟血流速度达到高峰，30-40分钟血栓稳定，形成非梗阻性血栓。模型建立后造模处血管管腔内欠清晰，隐约可见附壁血栓回声，但轮廓不清晰，逐渐可见血栓形成，回声增强。实验中，观察到初次血栓形成后脱落，并可见第二次血栓形成，均为非梗阻性血栓。

阳性对照组以200u/Kg肝素为阳性对照，在20min时血流流速从0.8m/s上升到1.2m/s左右，30min时下降到1m/s，直到40min内血流流速无明显变化，无血栓形成。

hTFFab₁₄₈高剂量组(2mg/kg)血流流速在10min时从0.8m/s上升到1m/s左右，直到40min一直保持平稳，无血栓形成。

hTFFab₁₄₈低剂量组(1mg/kg)：血流流速在10min时从0.8m/s上升到1m/s左右，可见一血栓逐渐形成，20min观察小血栓已脱落，30min时隐约见又一血栓形成，血流流速1m/s，40min时血栓未再增大，血流流速下降到0.8m/s。

各组实验动物颈动脉经FeCl₃作用后的血流变化(图15)、B超血栓大小和病理血栓形成情况如表4所述。

表5不同治疗方法对血栓形成的影响

组别	血栓形成点最大流(cm/s)	B超血栓/管(％)	病理血栓/管(％)
				阴性对照组	180	86-90	60-70
阳性对照组	100	——	3-5
				hTFFab148低剂量组	120	40-60	20-25
hTFFab148高剂量组	80	——	——

(2)药代学实验

大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(30mg/kg)，按常规方法麻醉、预处理，静脉穿刺给药，剂量1mg/kg。

实验大鼠做颈总动脉插管。分别在给药前及给药后第1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分钟从颈总动脉插管中取血0.45mL，立即加入0.05mL109mmol/L枸橼酸钠溶液，充分混匀，离心4℃×4000rpm×15min，分离血浆，置4℃备用。

采用ELISA法检测血药浓度。取TF用包被液稀释至5ug/ml，加100ul至96孔酶标板，4℃包被过夜。加200ul洗涤液洗涤3次，每次3min，拍干。加200uL封闭液，37℃静置120min。加200uL洗涤液洗涤3次，每次3min，拍干。hTFFab₁₄₈从1∶20开始对比稀释11个梯度；每孔加hTFFab₁₄₈或者待测血浆100ul，37℃静置60min，阴性对照为正常SD大鼠血浆，PBS为空白对照。加200ul洗涤液洗涤3次，每次60min，拍干。取HRP标记的兔抗人Fab抗体，用稀释液1∶1000稀释，每孔加100μL，37℃静置60min。加200ul洗涤液洗涤3次，每次3min，拍干。新鲜配制OPD显色液，每孔加100ul，显色5-15min。每孔加50ul终止液(2mol/L H₂SO₄)，检测490nm吸光度。

依据血药浓度随时间变化曲线(图15)，采用二室模型(图16)，应用药代动力学软件3P87对相关数据进行非线性拟合，回归，计算半衰期等相关药代动力学参数。回归方程为：

            Concentration(Time)＝Ae^-α·Time+Be^-β·Time

结果显示随时间进展，药物在体内被不断代谢，血浆中残留药物浓度逐渐下降，应用药代动力学软件3p87，进行室间F检验，hTFFab₁₄₈符合二室模型。采用二室模型，对血药浓度随时间变化相关数据进行非线性拟合，回归，半衰期等相关药代动力学参数总结。表5是hTFFab₁₄₈药代动力学参数。

表6

参数(Parameter)	单位(Unit)	数值(Value)
			A	ug/ml	4.94703
alpha	1/min	0.39652
			B	Ug/ml	30.43637
beta	1/min	0.01095
			V(c)	(mg)/(ug/ml)	0.02826
T 1/2 alpha	min	1.74806
			T 1/2 beta	min	63.29302
K21	1/min	0.34262
			K10	1/min	0.01267
K12	1/min	0.05218
			AUC	(ug/ml)*min	2791.69850
CL(s)	mg/min/(ug/ml)	0.00036

其中，

A：经验常数(empirical constant)，

alpha：分布速率常数(distribution rate constant)，

B：经验常数(empirical constant)，

beta：消除速率常数(elimination rate constant)，

V(c)：周边室分布容积(distribution volume of periphery compartment)，

T 1/2 alpha：分布半衰期(the half life of alpha)，

T 1/2 beta：消除半衰期(the half life of beta)，

K21：药物由周边室返回中央室的速率常数(the transfer rate from the secondcompartment to the first compartment)，

K10：药物由中央室消除的速率常数(the elimination rate from the firstcompartment)，

K12：药物自中央室进入周边室的速率常数(the transfer rate to the secondcompartment)，

AUC：曲线下面积(the area under the curve)，

CL(s)：清除率(clearance)。

            SEQUENCE LISTING

Claims (10)

1.一种具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，包括重链V区和轻链V区，其特征是含有由序列1的核苷酸编码的序列2的氨基酸序列和由序列17的核苷酸编码的序列18的氨基酸序列。

2.按权利要求1所述的具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，其特征是所述的人源抗人组织因子Fab选自天然的人源抗体基因库。

3.按权利要求1所述的具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，其特征是所述的重链V区由互补决定区CDR和框架区FR构成，所述CDR含有序列4、6和8的氨基酸序列；所述的FR含有序列10、12、14和16的氨基酸序列。

4.按权利要求1所述的具有高效抗凝作用的人源抗人组织因子Fab，其特征是所述的轻链V区由互补决定区CDR和框架区FR构成，所述CDR含有序列：20、22和24的氨基酸序列；所述的FR含有序列26、28、30和32的氨基酸序列。

5.一种表达载体，其特征是同时含有编码权利要求1所述的重链V区氨基酸序列的DNA和轻链V区氨基酸序列的DNA。

6.按权利要求5所述的表达载体，其中所述的表达载体是一种质粒，选自pFab-His2。

7.一种含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

8.按权利要求7所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或真核细胞。

9.按权利要求8所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌JM109。

10.一种制备权利要求1的人源抗人组织因子Fab的方法，其特征是包括下述步骤：

通过构建人源抗体基因库并经过ELISA、稀释凝血酶原时间、测序分析从所构建的人源抗体基因库中筛选得到具有抗凝活性的人源抗人组织因子Fab后，进行表达纯化及抗凝活性测定。

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