CN103119063B

CN103119063B - 结合至血管内皮生长因子2（vegfr-2/kdr）上并阻断其活性的重组抗体结构

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Publication number: CN103119063B
Application number: CN201080069006.4A
Authority: CN
Inventors: 博塔恩·科拉伊·巴尔希欧格鲁; 巴哈德尔艾林·欧兹代米尔; 艾林·欧兹代米尔巴哈德尔; 艾丁·巴哈尔; 卡迈勒·巴伊萨尔; 穆热·塞尔哈特里; 奥默·卡察尔; 图尔克·基利克; 埃姆尔·阿克古恩; 阿卜杜勒卡迪尔·欧兹坎
Original assignee: Scientific and Technological Research Council of Turkey TUBITAK
Current assignee: Scientific and Technological Research Council of Turkey TUBITAK
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: KR20130132739A; KR102007045B1; US9193792B2; WO2012004631A3; US20140199301A1; WO2012004631A2; CN103119063A; EP2591002A2; JP2013540420A; CN103119063B8; BR112013000341A2

Abstract

开发了噬菌体展示重组抗体库并且对VEGFR-2筛选该库。筛选和ELISA实验后获得了显示对VEGFR-2的结合特性的两种重组抗体。通过DNA序列分析证明了这两种重组抗体与已经开发的重组抗体的差异。使用细胞测定证明了这两种重组抗体对内皮细胞增殖的抑制作用。因此，这些重组抗体可以用作VEGF相关的血管生成抑制剂。

Description

结合至血管内皮生长因子2（VEGFR-2/KDR）上并阻断其活性的重组抗体结构

技术领域

本发明的主要目的是获得可以作为抑制剂参与血管生成的重组单链可变区片段抗体，其通过与VEGFR2（细胞外结构域）相互作用，在肿瘤发展中并因而在与血管生成相关的疾病机制中起关键性作用。

背景技术

活组织的发育所需要的氧气和营养物质通过血管被运送到组织而废物质也通过血管被运出组织。虽然血管生成，从已经存在的血管中生长新血管，是胚胎发生、伤口愈合、和女性生殖系统的月经期间的生理现象，它病理性地出现在炎性疾病中，如关节炎、慢性炎症、炎症性肠道疾病、和牛皮癣以及各种组织的癌症如乳腺、膀胱、结肠、肺、神经母细胞瘤、黑色素瘤、肾、胰腺、子宫、子宫颈、和胶质母细胞瘤，以及眼科疾病如老年相关的黄斑变性。

血管生成在固体肿瘤的体内形成、发展和转移中的意义在1971年第一次被认定（FolkmanJ.,1971,NEngJMed.,285,1182-1186）。通过毛细血管内皮细胞的增殖出现血管生成（RisauW,1997,Nature,386,671-674）。与所有生物事件一样，生物体通过分泌血管生成抑制因子对血管生成刺激做出反应。在正常情况下血管生成促进因子和血管生成抑制因子处于平衡状态，并且当这个平衡针对血管生成抑制因子被破坏时，血管生成开始。在1989年Ferrara等人定义了血管内皮生长因子（VEGF）（FerraraandHenzel,1989BiochemBiophysResCommun161,851-858）。在血管生成中VEGF起着关键的作用（FerraraNetal.,1996,Nature,380:439-442）。在小鼠上的实验表明，由于严重的血管问题，仅缺失关于VEGF的等位基因导致早期胚胎死亡（CarmiletP.etal.,1996,Nature,380,435-439）。VEGF是重量为45kDa的以二硫键结合的结合肝素的同型二聚体碱性蛋白质。目前已经定义了其多个亚组，如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及VEGF-E。在哺乳动物中，VEGF-A具有多种亚型，如VEGF₁₂₁，、VEGF₁₆₅，VEGF₁₈₉，VEGF₂₀₆和VEGF₁₄₅（基于氨基酸数目）。在这些亚型中，VEGF₁₆₅是主要的种类（FerraraN.,etal.,2009,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,29,789-791）。

通过结合至细胞膜上的酪氨酸激酶受体，VEGF显示其细胞内作用。VEGF受体包含两部分。第一部分是包含酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。第二部分是包含5至7个免疫球蛋白样结构（其包含配体结合区域）的细胞外区域（FerraraN.etal.,2003,Nat.Med.9:669-676）。除了证明Flt-1（VEGFR-1），flk-1/KDR（VEGFR-2），和Flt-4（VEGFR-3）为VEGF受体外，最近已经定义了称为跨膜蛋白-1（neuropilin-1）和跨膜蛋白-2（neuropilin-2）（其在内皮细胞表面上表达并且对VEGF-A具有低结合特性）的受体结构。KDR（包含激酶插入结构域的受体）已于1991年被Terman等人通过专利号PCT/US92/01300定义（Termanetal.,1991,.Oncogene6:1677-1683）。在1991年通过测序方法揭示Flk-1的序列（MathhewsWetal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,88:9026-9030）。这些研究已经证明KDR是FLK-1受体的人类类似物。此外，KDR和FLK-1受体也被称为VEGFR2。

最重要的VEGF受体是KDR（VEGFR-2），其负责内皮细胞的增殖和趋化作用（FerraraNetal.,2003,NatMed.,9,669-676,）。在血管内皮细胞和造血细胞中VEGFR-2（激酶插入结构域受体/KDR）以高水平表达（AsaharaT.,etal.,1997,Science,275,964-967、ZieglerBl.etal.,1999,Science,285,1553-1558、PeichevM.,etal.,2000,Blood,95,952-958）。存在于KDR的细胞外部分中的7个免疫球蛋白样结构域使得来自环境的信号能够被转导到细胞的细胞质中。KDR的细胞内部分介导了细胞质内信号转导。因此，以抑制VEGF和KDR的相互作用为目标的任何分子应该靶向受体的1-7个免疫球蛋白样细胞外结构域（LUD.veark.,2000,JBC,275,14321-14330）。

目前进行的几项研究已经发现在许多类型的癌症中VEGF增加，如胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金病、和骨髓瘤（RanieriGetal.,2006,CurrMedChem.,13,1845-1857）。因此，在血管生成的抑制中VEGF和VEGF受体是优先的目标。通过从不同角度抑制由VEGF结合到具有针对VEGF和VEGF受体开发的结构，在内皮细胞上的跨膜酪氨酸激酶受体上所触发的信号通路，可以防止VEGF起作用。

虽然与VEGFR-2（KDR）相比，VEGF对VEGFR-1（Flt-1）的结合亲和力高50倍，由于其与KDR的关联，发生VEGF的血管生成特性、内皮细胞增殖以及其对趋化作用的影响（CrossM.etal.,2003,TrendsinBiochemicalSciences、28.488-494）。已经证明当将编码VEGFR2的质粒给予缺乏VEGFR2的猪主动脉内皮细胞时，这些细胞经历有丝分裂并参与趋化作用（ShibuyaMetal.,1990,Oncogene,8:519-524）。一些小鼠上的研究显示，在VEGFR2缺乏或缺陷表达方面这些动物缺乏有组织的血管。Shalaby等人展示由于内皮细胞和造血祖细胞的发育缺陷，在胚胎早期缺乏VEGFR2表达的小鼠胚胎死亡（ShalabyFetal.,1995,Nature.376(6535):62-6）。使用这个实验，已经证明阻断VEGF与KDR之间的联系在血管生成的抑制方面是很重要的。

1971年，J.Folkman认定，肿瘤的生长依赖于由位于肿瘤附近的血管发育的新生毛细血管带来的氧气和能源并宣称在防止癌症发展中，血管生成抑制的尝试可能是有效的方法。肿瘤生长与血管生成活性的密切结合导致研究血管生成药剂作为癌症治疗中的治疗的另外的选择。在体内开发的抗VEGF的抗体抑制肿瘤生长的事实的说明（KimKJetal.,1993,Nature362:841-844）已显示在治疗中VEGF拮抗剂可以作为肿瘤血管生成的抑制剂。现今，在血管生成的抑制中并因此在肿瘤学中，VEGF和VEGF受体是优先的目标（FerraraNandKerbelR.S.,2005,Nature.438:967-974）。

近年来已经开发了基于阻断VEGF/受体的关系的几种抗血管生成策略。在此框架内，这类多种结构，如防止VEGF/KDR相互作用和/或抑制KDR信号传输用于抑制血管生成和肿瘤的抗VEGF抗体（Kanaietal.,1998,J.Cancer77,933-936、Margolinetal.,2001,J.Clin.Oncol.19,851-856）；抗KDR抗体（Zhuetal.,1998,CancerRes.58,3209-3214、Zhuetal.,2003,Leukemia17,604-611、Prewettetal.,1999,CancerRes.59,5209-5218）；抗VEGF免疫毒素（Olsonetal.1997,Int.J.Cancer73,865-870）；核酶（Pavcoetal.,2000,Clin.CancerRes.6,2094-2103）；可溶性受体（Holashetal.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,11393-11398）；酪氨酸激酶抑制剂（Fongetal.,1999,CancerRes59,99-106、Woodetal.,2000,CancerRes60,2178-2189、Grosiosetal.,2004,Inflamm.Res.53(4):133-42）；抗VEGF反义（Forsteretal.2004,CancerLett.20;212(1):95-103）；和RNA干扰（Takeietal.2004,CancerRes.64(10):3365-70、Reichetal.,2003,MolVis9:210-6）。

已经增强了通过靶向VEGF和受体集中于抑制血管生成的研究。为此，已经开发了许多策略。rhuMabVEGF（贝伐珠单抗）（Bevacizumab），具有抗血管生成和抗肿瘤活性的重组人类单克隆VEGF抗体（MonkB.J.etal.,2005,GynecologicOncology,96,902-905,），和2006年由WuY等人针对VEGFR-l'e开发的单克隆人类抗体（WuY,etal.,2006Clin.CancerRes.,12(21),6573-84）是最重要的。结果显示，具有结合至人IgG1恒定区的VEGFR1和VEGFR2杂交结构的VEGF-Trap神经胶质瘤-动物模型可以用于治疗初期和晚期的肿瘤（Gomez-ManzanoC.etal.,2008,Neuro-Oncology,10,940.）。雷珠单抗（ranibizumab），48kDa，由抗-VEGF单克隆抗体的Fab（抗原结合）部分组成，比其从中衍生的单克隆抗体贝伐珠单抗（148kDa）更轻和更薄，并且因此，在玻璃体内应用中能够通过内膜并抑制所有VEGF亚型（GaudreaultJ.etal.,1999,AmAssocPharmSciPharmSciSuppl,1,2142）。现今，在雷珠单抗用于治疗老年相关的黄斑变性的用途中已获得了有前途的结果（RosenfeldP.J.,etal.,2006,NEnglJMed.,355,1419-1431）。

除了单克隆抗体结构，使用小分子（例如通过作为VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂起作用的VEGF拮抗剂）也是可能的。在由BainbridgeJ.W.B.等人在2003年进行的研究中，体外确定了通过从其中VEGF分子与KDR相互作用的外显子6区域中分开通过阻断VEGF与其受体相互作用抑制血管生成的7个氨基酸结构所产生的肽结构。最近，舒尼替尼和索拉非尼，两种小分子VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂已经开始用于癌症治疗（KOJ.Setal.,2009,Clin.CancerRes.,15(6),2148-2157,、JilaveanuL.etal.,2009,ClinicalCancerResearch,15,1076）。

近年来，随着基因工程的发展，已经可以形成模仿抗体分子的抗原识别的功能性重组抗体片段。作为抗体片段表达，单链可变区片段经由肽桥通过结合重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）而组成。这些抗体片段称为单链可变区片段（scFv）（美国专利号4,946778Landeretal.;W088/09344,Hustonetal.）。因为ScFv结构包含抗原结合可变区（Fv），它们具有以最小结构提供抗体分子的结合特征的特性。另一方面，单结构域抗体结构可以有效地结合到靶抗原结构上。

1993年，Jeffrey等指出在开发的抗地高辛抗体的地高辛结合中，重链是重要的（Jeffrey,P.D.etal.Proc.Nat.Acad.Sci.,USA1993,90:10310-103149）。在最近的研究中已证明由开发的抗表皮生长因子受体（EGFR）的抗体的重链可变区片段组成的“纳米体”（nanobody）结构阻止了表皮生长因子（EGF）结合到EGFR上（RooversR.etal.,2007,CancerImmunology15:303-317）。在噬菌体展示技术中，ScFv在丝状噬菌体的表面上出现（WO92/01047McCaffertyetal.）。使用该方法可能开发抗VEGFR的纳米抗体结构。然而，从约15KD的纳米抗体结构的循环中快速去除导致在治疗应用中的保留。然而，通过将它们重建为50kD的多价态，这些纳米抗体结构能够在循环中停留更长的时间以确保它们提供结合到白蛋白上的特征（TijinkBetal.2008,MolCancerTherapy.7(8):2288-2297）。

在噬菌体展示技术中丝状噬菌体的使用带来了多种优点。来自培养上清的噬菌体颗粒的易纯化性、遗传和序列数据的可接入性、以及使用“生物淘洗”（生物淘选，biopanning）”方法从众多抗原中选择可以识别靶抗原的少数噬菌体克隆的机会是这些优点的一部分。为了利用噬菌体展示技术中的这些便利，优选包含噬菌体复制起点和质粒复制起点的噬粒载体。这些噬粒载体中的多克隆位点（MCS）位于属于噬粒的鞘结构蛋白（如，gIII）的基因的起始位点处。因此，由于鞘蛋白的融合而获得的产物可以模仿位于在正常的环境中在免疫系统中存在的B-淋巴细胞的表面上的抗体。然而，这个过程取决于宿主细菌如何读取位于抗体基因和gIII之间的琥珀终止密码子。如果噬菌体supE生长于抑制性宿主（例如，大肠杆菌TG1）上，抗体片段融合至较小鞘蛋白上并停留在噬菌体表面上。噬菌体表面上的这种结构可以作为检测如B表面抗体的外来结构的受体。如果噬菌体生长于非抑制性（sup^-）大肠杆菌菌株（如HB2151）上，则琥珀密码子将被读取为终止密码子并且抗体颗粒将以可溶形式从细菌中分泌。这样，使用噬粒载体模拟从浆细胞合成的抗体成为可能。当溶解在非-抑制性细菌中时，在噬粒载体上由6个组氨酸组成的区域，在克隆基因片段至多克隆位点表达后，能够使用Zn⁺⁺、Ni⁺⁺或Co⁺⁺带电荷的亲和柱从环境中容易地纯化该重组蛋白（WeinerL.M,1996,J.Mol.Biol.,255(1),28-43）。

由于噬菌体展示技术的技术便利性，在许多学科中scFv结构带来了广泛的利用机会。与整个抗体分子的约150kDa的尺寸相对，抗体的scFv结构（其尺寸为约30kDa并且缺乏抗体的恒定区域和Fc部分），正在越来越多地用于致力于诊断和治疗的当代医学研究中（BradburyA.R.M.etal.,2004,JournalofImmunologicalMethods,290,29-49）。

本发明中提及的KDR1.3和2.6scFv抗体结构通过结合至细胞表面上的VEGFR-2的细胞外部分（1-7免疫球蛋白结构域）通过阻断VEGFR-2的细胞内信号传导活性以及通过抑制VEGF依赖性细胞增殖提供了抗血管生成特性。

本发明旨在解决的技术问题

1971年，J.Folkman指出肿瘤生长依赖于由位于肿瘤附近的血管发展的新毛细血管携带的氧气和能源，并且宣称在预防癌症发展方面阻止血管生成的尝试可能是有效的方法（FolkmanJ.,1971NEngJMed.,285,1182-6）。多项研究已经证明在癌症治疗中抗血管生成方法是有希望的（KimKJetal.,1993Nature362:841-844）。，癌症发展（由于高死亡率导致的最重要的病理现象）与血管生成活性的紧密联系特别地导致研究抗血管生成药剂作为癌症治疗中的新选项。

近年来，在血管生成中发挥了关键作用的VEGF和VEGF受体已经成为抗血管生成结构的开发的目标。显示开发的抗VEGF的结构可能在癌症治疗中有效的第一个标记是获自使用中和抗体创建的小鼠神经母细胞瘤模型（MordentiJ,1999ToxicolPathol.27(1):14-21）。此项研究表明，抗VEGF中和抗体结构阻断肿瘤生长。此研究的结果鼓励了旨在开发阻断VEGF及其受体的结构以阻止肿瘤生长的研究。这些研究有可能获得可用于抗癌症治疗活性的新结构，如抗-HIF（抗低氧诱导因子）药剂、VEGF反义寡核苷酸、VEGF核糖体、可溶性VEGF受体、抗VEGF受体抗体、和VEGFDNA疫苗（FerraraN.,etal..,2003,NatMed.,9,669-676）。

已经发现开发的抗VEGF抗体减缓肿瘤生长（Hicklinetal.,2001,DTT6:517-528）。虽然在临床实验室诊断中广泛使用小鼠单克隆抗体，在人类的治疗应用中它们的成功是有限的。主要的原因是在使用小鼠抗体治疗的约80%的患者中，在反复给药后激活了针对小鼠抗体发展的免疫应答。此外，在人类免疫系统中小鼠抗体的Fc部分不太有效并且与人类抗体相比在治疗应用中小鼠抗体具有更短的半寿期。这些原因限制了小鼠抗体用于治疗应用。

在2000年，GenetechInc推出了重组人源化抗VEGF单克隆抗体结构（贝伐珠单抗，美国专利号US6054297）。现在在结肠癌的治疗中使用此抗体结构并且正在其他类型的肿瘤细胞上进行试验。据估计，基于贝伐珠单抗的治疗带来每位患者42.800至55.000美元的额外治疗费用并且因此，仅在美国，对于晚期结肠癌治疗将产生15亿美元的额外支出。因此，需要开发新型抗血管生成结构作为替代物，如重组抗体，其成本较低地在细菌中大量生产并且因此，将降低治疗成本。

迄今为止进行的各种研究已经表明，在可以防止血管生成的新重组抗体结构的识别中，噬菌体展示技术可以是一种有效的方法。用通过人胎盘碱性磷酸酶融合生产的KDR（KDR-AP）的胞外结构域免疫BALB/c小鼠之后获得了单链可变区片段形式的抗体结构（WO00/44777,ZhuZ,2000）。使用噬菌体展示技术并使用人类抗体库，已开发了作为以Fab和嵌合抗体形式用于抗KDR抗血管生成应用的候选物的抗体结构（PCT/US03/06459,ZhuZ,2003.）。

与上文所述的针对抗血管生成应用开发的研究不同，在此提供的本专利中，不使用尺寸约150kDa的抗体，在从使用重组KDR（1-7）在BALB/cJ小鼠中诱导免疫后开发的重组抗体库中针对抗KDR（1-7）进行选择之后，采用噬菌体展示法获得尺寸为33kDa的重组单链可变区片段抗体。在这些抗体结构的开发中使用的抗原和在选择后获得的重组抗体的互补决定区（CDR）的序列与上面提到的研究以及专利中的不同。

附图说明

图1：产生的抗KDR的scFv的可变轻链和重链的琼脂糖凝胶电泳图。1-pUC19/HinfI消化；2-V_HPCR产物；3-V_LPCR产物

图2：通过将可变轻链和重链与编码(Gly₄Ser)₃的接头连接产生的单链可变区片段的琼脂糖凝胶电泳图。1-ScFv标记（marker）（750bp）；2-ScFv库；3-ScFv库

图3：通过用KDR1.3scFv的连接产物转化大肠杆菌TG1细菌获得的随机选择菌落的菌落PCR结果。1-pUC19/HinfI消化；2-ScFv标记（750bp）；3-对照ScFv的PCR；4-PCR的阴性对照；5-空；6-菌落PCR；7-菌落PCR；8-菌落PCR；9-菌落PCR；10-空；11-菌落PCR；12-菌落PCR；13-菌落PCR；14-菌落PCR（存在KDR1.3scFv）。

图4：通过用KDR2.6scFv的连接产物转化大肠杆菌TG1细菌得到的随机选择菌落的菌落PCR结果。1-pUC19/HinfI消化；2-ScFv标记（750bp）；3-PCR的阴性对照；4-对照ScFv的PCR；5-空；6-菌落PCR；7-菌落PCR；8-菌落PCR；9-菌落PCR；10-空；11-菌落PCR（存在KDR2.6scFv）；12-菌落PCR；13-菌落PCR；14-菌落PCR（存在KDR1.3scFv）。

图5：KDR1.3和KDR2.6scFv克隆的BstnI消化曲线。1-标记；2-KDR1.3scFv；3-BstnI消化的KDR1.3scFv；4-BstnI消化的KDR2.6scFv；5-KDR2.6scFv。

图6：KDR1.3scFv的DNA序列和由IMGT网站预测的CDR区域的位置。

图7：KDR2.6scFv的DNA序列和由IMGT网站预测的CDR区域的位置。

图8：KDR1.3重组抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析结果。A；纯化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。B；纯化的KDR1.3scFv的蛋白质印迹分析。对于两块凝胶上样顺序和上样量是相同的。1-标记（FermentasSM0441）；2-诱导4小时后的沉淀物，T₄；3-第一步纯化后的上清液；4-第二步纯化后的上清液；5-第三步纯化后的上清液；6-第四步纯化后的上清液；7-第五步纯化后的上清液；8-第六步纯化后的上清液；9-第六提取步骤后的沉淀物；10-对照ScFv（Lig7）。

图9：KDR2.6重组抗体的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析结果。A；纯化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。B；纯化的KDR2.6scFv的蛋白质印迹分析。两块凝胶的上样顺序和上样量是相同的。1-标记（FermentasSM0441）；2-诱导4小时后的沉淀物，T₄；3-第一步纯化后的上清液；4-第二步纯化后的上清液；5-第三步纯化后的上清液；6-第四步纯化后的上清液；7-第五步纯化后的上清液；8-第六步纯化后的上清液；9-第六提取步骤后的沉淀物；10-对照ScFv（Lig7）。

图10：TALON亲和柱纯化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析结果。A；TALON亲和柱纯化的KDR1.3scFv的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。B；TALON亲和柱纯化的KDR1.3scFv的蛋白质印迹分析。两块凝胶的上样顺序和上样量是相同的。1-标记（FermentasSM0441）；2-第六步纯化后透析的上清液；3-第一TALON亲和柱洗脱管；4-第二TALON亲和柱洗脱管；5-第三TALON亲和柱洗脱管；6-第四TALON亲和柱洗脱管；7-第五TALON亲和柱洗脱管；8-第六TALON亲和柱洗脱管；9-第七TALON亲和柱洗脱管；10-对照ScFv（Lig7）。

图11：TALON亲和柱纯化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析结果。A；TALON亲和柱纯化的KDR2.6scFv的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。B；TALON亲和柱纯化的KDR2.6scFv的蛋白质印迹分析。两块凝胶的上样顺序和上样量是相同的。1-标记（FermentasSM0441）；2-第六步纯化后透析的上清液；3-第一TALON亲和柱洗脱管；4-第二TALON亲和柱洗脱管；5-第三TALON亲和柱洗脱管；6-第四TALON亲和柱洗脱管；7-第五TALON亲和柱洗脱管；8-第六TALON亲和柱洗脱管；9-第七TALON亲和柱洗脱管；10-对照ScFv（Lig7）。

图12：TALON纯化的KDR1.3、2.6和Lig7（对照）scFv的ELISA结果。A；以黑色箭头显示用抗原涂覆过夜的孔。以红色箭头显示在抗原涂覆后添加抗体。B；A中提及的孔的ELISAOD405值。

图13：通过细胞增殖测定重组抗体对VEGF-HUVEC相互作用的影响。在含有2％FBS和两种不同浓度（0.1和1μg/ml）的多种抗体（如Ab293、KDR1.3、2.6和作为阴性对照scFv的Lig7）的培养基中培养来自第5代的HUVE细胞。

图14：角膜血管生成应用的示意图和照片图（KonyaD.etal,Neurosurgery,2005,Volume56,No:6,Junep:1339-1346）。

图15：在角膜血管生成模型上抗体的抗血管生成作用。在第3、5、7和9天重组抗体对移植在大鼠角膜中的动静脉畸形组织的血管生成抑制作用实验的大鼠角膜照片。

图16：抗体的抗血管生成作用之间的差异。在第3、5、7和9天重组抗体对移植在大鼠角膜中的动静脉畸形组织的血管生成抑制作用的实验期间内形成的血管数。

表1：用于选择和富集可结合至sKDRl-7的scFv的生物淘洗步骤。

具体实施方式

本发明提供了通过结合到细胞表面上的VEGFR2（1-7免疫球蛋白结构域）的细胞外部分上通过阻断VEGFR-2的细胞内信号传导活性以及通过抑制VEGF依赖性细胞增殖具有血管生成特性的重组抗体结构。

已经使用抗体阻断了血管生成。针对抗血管生成实践开发的市售抗VEGF抗体，由于其148kDa的分子量，不能进入视网膜并难以通过血管内皮。然而，具有低分子量的小重组抗体结构没有这些缺点。通过以上的研究已经证实，在抑制血管生成的定义的新抗体片段中噬菌体展示技术可能是有效的方法。然而，迄今为止，分离的抗血管生成抗体片段是例如人类抗VEGF重组抗体（ZhihuaetalApplBiochemBiotechnol(2008)144:15-26）、针对VEGFR2-Fc融合蛋白筛选的抗VEGFR2Fab片段、双特异性抗体（Shenetal:thejournalofbiologicalchemistryvol(2006).281,16:.10706-10714,）或使用KDR-AP免疫获得的单链小鼠抗体（Zhuetal,1998,CancerRes.58,3209-3214）。由于VEGF与KDR细胞外1-7结构域的关系产生VEGF的血管生成特征、内皮细胞增殖及其对细胞趋化的作用。在本发明中，VEGFR2的可溶性细胞外1-7结构域可用于免疫以及用于筛选噬菌体展示抗体库。因此，发现阻断VEGF活性的重组抗体、确定编码该抗体结构的核苷酸序列、定义编码这些序列的新噬菌体、开发通过消除VEGF与其受体之间的相互作用用于抑制内皮细胞增殖的抗体结构的血管生成的新方法，是本发明的目标。

术语“重组抗体”是指全抗体和任何抗原结合片段（即，“抗原结合部分”，“抗原结合多肽”或“免疫粘合剂”）或其单链。

术语“抗原结合”是指特异性地结合至抗原的能力。已经证明，抗体的抗原结合功能可以由以下各项完成：全长抗体的片段、由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段、（v）单个结构域或由VH结构域组成的dAb片段（Wardetal.,(1989)Nature341:544-546）、和（vi）分离的互补决定区（CDR）或（vii）可任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH，由单独的基因编码，它们可以使用重组方法通过使它们能够成为单个蛋白链的合成接头结合，其中VL和VH区配对以形成单价分子（称为单链Fv（scFv），参见例如，Birdetal.(1988)Science242:423-426；和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883）。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且使用与完整抗体相同的方式筛选片段以便使用。

本发明的范围内所用的术语抗体是指scFv抗体或结合选定抗原的抗体片段。因此，本发明的scFv抗体可以是包含VL和VH结构域的全scFv，它们由包含序列GGGSGGGGSGGGGSSGGGS（SEQIDNo:33）的接头的短连接肽连接。VL和VH的连接可以是任一方向，VL-接头-VH或VH-接头-VL。在本发明中，scFv结构是VH-接头-VL方向。

可以进一步将VH和VL区细分为高度可变区域，称为互补决定区（CDR），被更保守的、称为框架区（FR）的区域穿插其中。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，它们按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

本发明的多肽可以包含在一个或更多非必需氨基酸残基上的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中用具有类似侧链的氨基酸残基取代氨基酸残基的一种取代。现有技术中定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链（如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-支链的侧链（如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。因此，优选地使用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代多肽中的非必需氨基酸残基。在另一个实施方式中，可以使用顺序和/或组合不同的侧链家族成员的结构类似序列替换氨基酸序列。可替代地，在另一个实施方式中，可以沿免疫球蛋白编码序列的全部或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并且得到的突变体可以结合到本发明的多肽中并筛选其结合到所希望的目标上的能力。

在本发明的另一方面中，KDR1.3和KDR2.6scFv具有79％的对比得分。在本发明中提到的两个scFv的轻链可变结构域（VL）显示90％的对比得分并且重链可变结构域显示了60％的对比得分。

在KDR1.3和KDR2.6scFv以及Zhu等人于2000年取得专利权（WO00/44777）的scFv的CDR区之间比较了互补决定区（CDR）的序列。对于CDRL1区域，在KDR1.3和KDR2.6（SEQNo:4和SEQNo:20）之间发现完全比对，并且发现Zhu的scFv的CDRL1区域的一部分包含与SEQNo:4和SEQNo:20相同的序列。Zhu的scFv的CDRL2区域与KDR2.6CDRL2区域（SEQNo:21）具有75％的比对得分并且与KDR1.3CDRL2区域（SEQNo:5）具有66％的比对得分。对于CDRL2区域，KDR1.3和KDR2.6的scFv的比对得分为66％。KDR1.3和KDR2.6的CDRL3区域与Zhu的scFv的CDRL3区域比对，具有55％的得分但是对于KDR1.3和KDR2.6之间相同区域比对得分仅为22％。三个CDRL3区域具有全部9个氨基酸，并有共有序列（-Q-S---T），这可能意味着对于scFv与KDR的相互作用，谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸氨基酸是重要的。在KDR1.3与Zhu的scFv的CDRH3区域之间仅有50％的相似性。与用于识别KDR分子的重链可变区相比，这些结果表明轻链可变区和其CDR区的高度序列保守性。

本发明包括与公开的任何一种VL序列结合的公开的任何一种VH序列，只要保持目标结合特异性即可。

主要通过ELISA方法检测了结合至VEGFR-2的噬菌体，用来检查关于VEGF与在其表面上表达VEGF受体的人脐带内皮细胞（HUVEC）之间相互作用的阻断特性的它们的先前发现。作为ELISA的结果，定义了KDR1.3和KDR1.6，检测了它们对细胞增殖的影响，并且这两种重组体均显示对细胞增殖具有不利影响。

本发明的一个方面，提供了特异地结合VEGFR-2并在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖以及体内血管生成的重组抗体（KDR1.3和KDR2.6）。证实了在体内模型中在大鼠角膜上它们的抗血管生成作用。这种方法具有以下优点：新血管很容易被检测到，并且在正常的血管性角膜中基本上必须是新形成的血管。统计评价显示KDR1.3和KDR2.6抗体的抗血管生成活性是统计显著的（KDR1.3；P<0.05和KDR2.6；P<0.05）。但当使用KDR2.6抗体时发生大鼠死亡。体内实验表明，KDR1.3抗体是体内使用的最有效的抗血管生成的分子。

结论表明，两种重组抗体均具有对VEGF活性的拮抗剂作用，它们被认为是血管生成抑制剂。

实施例

实施例部分包括重组抗体的结构的产生、表达、质量控制和抗体结构对细胞增殖的作用检测以帮助理解本发明。实施例包括在本发明的过程中使用的常规的（已知的）方法如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因转移进入载体、重组载体转化导入宿主细菌。这些方法中已在多种出版物中描述（Samsbrook,J.,Fritsch,E.FandManiatis,T.(1989)MolecularCloning:2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress）并且为此目的将不在实施例部分中对其进行描述。

免疫

对于免疫研究，使用了3只7周龄雄性Balb/cJ小鼠。通过在每只小鼠的臂凹皮肤（腋窝皮肤，armpitskin）下注射300μ1含有150μ1的PBS和150μ1含有l0μgsKDRl-7（重组人（sVEGFR2）sKDRDL-7，ResearchDiagnosticsInc）的弗氏完全佐剂的溶液完成第一次注射。在第一次免疫后第三周，制备相同量的混合物，并通过使用弗氏不完全佐剂注射到小鼠体内。第二次免疫后的一个月休息期后两只小鼠经受从尾静脉注射150μ1含有l0μgsKDRDl-7的PBS溶液。四天后获取这些小鼠的脾脏以获得总RNA。

RNA提取

使用EZ-RNA总RNA提取试剂盒（BiologicalIndustries,Israel）用于从脾脏中分离总RNA。在1ml“变性溶液”中将小鼠脾脏均化（Janke&KunkelIkaWerkRW20）。匀浆组织在室温下孵育5分钟后，加入1ml“提取溶液”并且将样品充分混合15秒。此后将样品在室温下孵育10分钟然后将其在12000g、+4°C下离心15分钟。离心后将上清转移到新的试管中并且加入1ml异丙醇（Merck）并混合样品。将样品在室温下孵育10分钟后，样品在12000g、+4°C下离心8分钟。除去上清液并通过涡旋使用2ml的75％乙醇（Merck，目录号1009862500）洗涤RNA沉淀物（pellet）。含有RNA的试管在7500g、+4°C下离心5分钟并且将沉淀物放置在室温下干燥。添加100μlDEPC处理的dH₂O后，试管在55°C下孵育15分钟以溶解RNA。

VH和VL库构建

在用目标分子sKDR_1-7免疫后，获取Balbc/J小鼠的脾脏并分离总RNA。分光光度法检查RNA并且OD₂₆₀/OD₂₈₀比率计算为1.9。使用以六聚体引物为基础的标准方法（Samsbrook,ColdSpringHarborLaboratoryPress1989,secondedition）从获得的总RNA中产生cDNA。产生的cDNA用作模板用于通过PCR扩增免疫球蛋白重链（VH，340bp）和轻链（VL，325bp）可变区。

在含有5μ1Taq聚合酶缓冲液（10×）、3μ1MgCl₂（25mM）、1μldNTP/10mM（每种）、1μl重链引物1（AmershamPharmacia，27-1586-01）、1μl重链引物2（AmershamPharmacia，27-1586-01）、2μl模板cDNA、1μl的Taq聚合酶（1U/μl）（Fermentas）的50μ1总体积中进行重链（V_H）可变区扩增。

在包含5μ1Taq聚合酶缓冲液（10×）、3μ1MgCl₂（25mM）、1μldNTP/10mM（每种）、1μl轻链引物混合物（AmershamPharmacia，27-1583-01）、2μl模板cDNA、1μlTaq聚合酶（1U/μl）（Fermentas）的50μ1总体积中进行轻链（V_L）可变区扩增。

用于重链（V_H）和轻链（V_L）可变区扩增的PCR程序设定为在94°C下孵育5分钟并且进行30个循环，每个循环对应于在94°C下1min、在55°C下2min和在72°C下2min。通过在72°C下孵育10分钟完成PCR反应。在1.5％琼脂糖凝胶上检查PCR产物。使用BioRadGelDoc2000成像系统（图1）分析DNA降解或DNA断裂。

单链可变区片段（SCFV）库构建

为了获得，使用“罗氏琼脂糖凝胶DNA提取”试剂盒（ROCHEAGAROSEGELDNAExtractionΚIT,CATALOGNO:1696505）从琼脂糖凝胶进行条带分离从而获得340bp的V_H和325bp的V_L的纯PCR产物。通过两阶段PCR反应进行单链可变区片段（scFv）的构建。

第一阶段，在包含5μlTaq聚合酶缓冲液（10×）、3μlMgCl₂（25mM）、1μldNTP/10mM（每种）、3μlV_HPCR产物（100ng/μΙ）、3μlV_LPCR产物（100ng/μΙ）、4μl接头引物（AmershamPharmacia，27-1588-01）、1μlTaq聚合酶（1U/μl）（Fermentas）的总计50μl反应混合物中进行。将包含该反应混合物的试管放入BiometraTrioblock加热块设备中并应用7个循环的反应程序（94°C，1分钟，63°C，4分钟）。在第二阶段，在7个循环结束时将50μl的混合物（34μldH₂O、5μlTaq聚合酶缓冲液（10×）、3μl氯化镁（25mM）、1μldNTP/10mM（每种）、4μlRS引物混合物（AmershamPharmacia，27-1589-01），1μlTaq聚合酶（1U/μl）（Fermentas））添加至反应混合物中。然后应用25个循环（94°C下1min、55°C下2min、72°C下2min。）的反应程序。在1.2％琼脂糖凝胶（图2）中检测ScFvPCR产物。分别用SfiI和NotI消化ScFv结构和pDUCK载体并且随后彼此连接。

连接后，在70°C下孵育连接产物10分钟并转移到大肠杆菌TG1细菌中。

感染性噬菌体的生产

将含有scFv库的细菌接种至5mlLB培养基（对于1L2×TY：10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl）中并在37°C和220rpm（孵育摇床，Innova）下孵育过夜。第二天，以1:100的稀释系数将过夜培养物接种到50ml的2×TY/Amp培养基中并且在37°C和220rpm（孵育摇床，Innova）下孵育该培养物直到ΟD₆₀₀值达到0.5。当培养物ΟD₆₀₀值达到0.5时，将10ml的细菌培养转移到含有10¹¹cfuM13K07辅助噬菌体的新的50ml2×TY/Amp培养基中并且在37°C、不震荡下孵育该培养物45min然后在37°C、220rpm振荡下孵育45min。孵育后在室温下在3000g（SorvallRC5C+）下离心细菌培养物10min并弃去上清液。在30ml2×TY/Amp/Kan培养基（对于1升2×TY：100mg氨苄青霉素和50mg卡那霉素）中重新悬浮沉淀物，并在37°C、220rpm下孵育过夜。第二天在+4°C下在7000g（冷冻离心机，SorvallRC5C+）下离心细菌培养物10min。然后将上清液转移到新的离心管中并在相同条件下再次离心。将20ml的上清液转移到新的离心管中并加入5ml的PEG/NaCl（20%（w/v）聚乙二醇6000、2.5MNaCl）。在冰上孵育该混合物两小时用于噬菌体沉淀。然后在+4°C下在7000rpm（冷冻离心机，SorvallRC5C）下离心噬菌体45min并弃去上清液。用1ml的PBS（3.2mMNa₂HPO₄×2H₂O、1.4mMKH₂PO₄、2.7mMKC1、137mMNaCl）溶解沉淀物并转移至无菌微量离心管中。悬浮液与250μlPEG/NaCl（20％（w/v）聚乙二醇6000、2.5MNaCl）混合然后在冰上孵育30分钟。悬浮液在+4°C、7000rpm下（Microsantrifuge，Eppendorf，5415C）离心20分钟并弃去上清液。使用200μl的PBS（3.2mMNa₂HPO₄×2H₂O、1.4mMKH₂PO₄、2.7mMKC1、137mMNaCl）溶解沉淀物并进行噬菌体滴定用于测定噬菌体量。

噬菌体滴定

对于噬菌体滴定，首先制备基本平板。对于100ml的基本培养基：50ml的2×M9培养基（12gNa₂HPO₄.2H₂O、6gKH₂HPO₄、1gNaCl、2gNH₄Cl达到1升并在121°C下高压灭菌20分钟）与50ml融化的3％琼脂、200μl1MMgSO₄和10μlCaCl₂混合。当混合物冷却后，加入2ml过滤灭菌的（0.22μMTPP，目录号：99522）葡萄糖（20％）和100μl过滤灭菌的（0.22μMTPP，目录号：99522）硫胺（SigmaT4625，10mg/ml）并将培养基铺于培养皿（petridishes，皮氏培养皿）上。将F'雄性细菌（大肠杆菌TG1）铺涂在含有基本培养基的平板上并在37°C下孵育过夜。第二天，挑选一个F'雄性细菌（大肠杆菌TG1）菌落并接种到LB培养基中（对于1升：10g细菌用胰蛋白胨（BD，目录号：21705）、5克酵母提取物（BD，目录号：211929）、10gNaCl（Applichem，目录号：A2942）。在37°C下，在培养摇床（Innova，4230）中孵育细菌直到OD₆₀₀值达到0.5（SmartSpec^TM3000BioRad）。在等待步骤中，使用PBS（8mMNa₂HPO₄、1mMKH₂PO₄、2.7mMKC1和137mMNaCl）制备适当的噬菌体稀释液（10^-2、10^-4、10^-6、10^-8、10^-10）。当细菌的OD₆₀₀值达到0.5时（SmartSpec^TM3000BioRad），将100μl的细菌培养物转入无菌微离心管中。将10μl的每个稀释的噬菌体与细菌混合并在37°C下孵育30分钟。当孵育结束时，将感染的细菌铺涂在LB/Amp平板上（1升融化的LB/琼脂与100mg氨苄青霉素混合）并且在37°C下将平板上下倒置地放在培养箱（NuveEN500）中过夜。第二天对形成的细菌菌落的数量进行计数并确定原液的噬菌体浓度。

使用生物淘洗（BIOPANNING）选择对KDR具有特异性的重组噬菌体

根据Smithetal.1993(Smith,G.P.,andScott,J.K.1993,Librariesofpeptidesandproteinsdisplayedonfiamentousphage.InmethodsinEnzymology217:228-257)完成VEGFR-2结合重组抗体的选择。

在此工作中，将含有250ng的sKDR_1-7的500μ1的涂覆溶液（0.1MNaHCO₃，pH8.6）涂覆在生物淘洗管（75mm×12mm免疫管，Nunc，Maxisorb）中。一天后，弃去涂覆溶液并使用封闭缓冲液（PBS+1％BSA）封闭免疫管一小时。在孵育结束时，用TPBS（PBS+0.1％[v/v]Tween-20）溶液洗涤免疫管6次。然后加入在500μ1的TPBS（PBS+0.1％[v/v]Tween-20）中的10¹¹cfu的噬菌体展示scFv库）。在室温下孵育2小时后，通过使用TPBS（PBS+0.1％[v/v]Tween-20）洗涤30次随后使用PBS洗涤30次弃去未结合的噬菌体。在洗涤步骤之后，通过添加500μ1的洗脱溶液（甘氨酸（0,2MPH：2.2）、lmg/mlBSA）（Roche，目录号：735086）洗脱结合至目标分子的噬菌体。使用75μl的1MTris-HCl（pH9.1）中和含有噬菌体的洗脱溶液。通过洗脱的噬菌体的1μl、10μl和1/10μ1的滴定获得洗脱的噬菌体的量。扩增剩余的噬菌体用于第二生物淘洗步骤（表1）。

在第二生物淘洗步骤后没有观察到sKDR结合噬菌体的增加但是在第三步骤后观察到富集。在第三生物淘洗的洗脱步骤后，在37°C下孵育大肠杆菌TG1细菌30分钟并且将细菌铺涂在LB/Amp/琼脂平板上。第二天通过菌落PCR法检测在细菌菌落中scFv基因的存在。

菌落PCR

通过菌落PCR法检测细菌菌落中scFv基因的存在。将从菌落中挑选的细菌溶解在含有15μl蒸馏水的0.5mlEppendorf离心管中。在95°C下孵育离心管3分钟并离心，上层液体用作聚合酶链式反应的模板。分别使用引物458：5'ttttgtcgtctttecagacgtt3'和引物459：5'tatgaccatgattacgecaag3'作为正向和反向引物。PCR程序设定为在94°C下5分钟，然后94°C下1min、55°C下2min，72°C下2min进行30个循环，然后是在72°C下10分钟的延长步骤。PCR后，在1.2％琼脂糖凝胶中检查产物（图3和图4）并鉴定了两个scFv克隆（KDR1.3和KDR2.6）。通过使用BstnI酶消化scFvPCR产物通过DNA指纹法检查了两个克隆之间的差异并进行DNA指纹研究（图5）。

通过噬菌体ELISA法选择能够结合至VEGFR-2的噬菌体展示重组抗体

为了鉴定被确定为两个不同的克隆的KDR1.3和KDR2.6的结合特性进行噬菌体-ELISA。为了获得展示KDR1.3和KDR2.6的噬菌体，使用含有scFv基因的细菌以产生感染性噬菌体，在噬菌体ELISA试验中使用感染性噬菌体。在+4°C下使用含有500ng的sKDRl-7的100μl的涂覆缓冲液（0.1MNaHCO₃pH:8.6）涂覆96孔ELISA板的每个孔（Falcon，目录号：353912）过夜。第二天使用200μl的TPBS（％0.1Tween20，含有PBS（3.2mMNa₂HPO₄×2H₂O、1.4mMKH₂PO₄、2.7mMKC1、137mMNaCl；pH7.4））洗涤孔三次，将200μl的封闭缓冲液（1％BSA+TPBS）加入到孔中并且在室温下孵育板1小时。然后使用TPBS洗涤孔三次）并且加入含有展示VEGFR-2特异性重组抗体（10¹¹pfu）的噬菌体的100μl的封闭缓冲液（PBS+2％脱脂牛奶），并在室温下孵育2小时。孵育后，用TPBS洗涤孔6次，然后将含有1:1000稀释的抗-M13辣根过氧化物酶结合的抗体（Pharmacia）的100μl封闭缓冲液加入到各孔中。在室温下孵育1小时后使用TPBS洗涤孔6次。将100μl的ABTS（PharmaciaBiotech，目录号27-9402-01）底物溶液加入各孔用于酶的检测。在室温下孵育1小时后，使用ELISA酶标仪（Bio-TechELISA酶标仪）读取每个孔的OD405值。重组抗体的序列分析

根据BeckmanCoulterGenomeLabMethodsDevelopment试剂盒（608000）方案完成对KDR1.3和2.6scFv的DNA测序反应。分别使用引物459和458用于正向和反向读数。使用CEQ8800DyeTerminator循环测序自动测序系统CEQ8800分析测序反应。

使用Workbench“CLUSTALW-MultipleSequenceAligment”程序（http://workbench.sdsc.edu）相互比对属于KDR1.3和2.6克隆的DNA序列并且序列差异证实了BstnI酶的消化结果。在图6和图7中给出KDR1.3和KDR2.6的DNA序列。根据测序结果KDR1.3KDR2.6scFv分别为747bp和762bp的长度。

细菌中SCFV的生产、表达的SCFV的复性、折叠和纯化

在大肠杆菌细胞中重组抗体的生产

为了生产重组抗体，将在pDUCK噬粒载体中含有KDR1.3或2.6scFv克隆的每种大肠杆菌HB2151菌株接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml的2×TY中并在30°C下生长过夜。第二天，将过夜培养物接种（OD₆₀₀0.05）至含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的新鲜的500ml的2×YT培养基中。培养物在37°C、250rpm下生长直到OD₆₀₀达到0.5-0.6。然后将细菌在室温、3500rpm下离心10分钟。将得到的沉淀物溶解在含有1mMIPTG（异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）和氨苄青霉素（100g/ml）的500ml的新鲜2×TY培养基中并使其在30°C、250rpm下生长另外的4h（SANCHEZL,etal..JBiotechnol.,72(1-2),13-20,(1999)）。培养物在4000rpm下离心10min并弃去上清液。为了检测ScFv的生产，将在即将诱导前（T₀）的和诱导4小时后（T₄）获取的试样上样至SDS-PAGE上。从细菌培养物纯化重组抗体结构

诱导后，进行胞质提取（periplasmicextraction）用于蛋白质纯化（Sanchez,1999）。将细菌沉淀物重悬浮于5.3ml的TES（Tris-HCl和EDTA）中并在冰上孵育5min。然后加入6ml的胞质提取缓冲液的1/3稀释液并且在冰上偶尔摇动地孵育细菌20min。在+4°C下在14000rpm下离心细胞提取物10min。因为没有在上清液中观察到scFv，对沉淀物进行包涵体提取方案（DAS，2004）。首先，在5ml的含有0.2mg/ml的溶菌酶的裂解缓冲液（50mMTrispH8.0、200mMNaCl、1mMEDTA）中溶解沉淀物并在冰上孵育30分钟。在冰上对悬浮液进行超声处理6次持续10秒。然后在+4°C下在12,000rpm下离心细菌悬浮液15min。将第一上清液储存于+4°C。

将沉淀物重新悬浮在12ml的含有0.2mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液中。在室温下孵育15分钟后，进行第二超声处理（6次，10秒）。在+4°C下在12000rpm下离心细菌悬浮液30分钟。将第二上清液储存于4°C。

在12ml裂解缓冲液中重新悬浮沉淀物并在室温下孵育15分钟。然后超声处理细菌悬浮液6次，每次10秒。超声处理后加入SDS至1％的最终浓度并在室温下孵育悬浮液30分钟然后在+4°C下在12000rpm下离心30分钟。将第三上清液储存在+4°C。在12ml裂解缓冲液中重新悬浮沉淀物并在+4°C下在12000rpm下离心20分钟。将第四上清液储存在+4°C。在含有6M脲的50mMTris缓冲液pH8.0中重新悬浮沉淀物并在冰上孵育45分钟。然后在12000rpm下离心样品30分钟（DASAD.,etal.2004,JVirolMethods,117(2),169-77）。

通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测在该纯化过程中获得的所有上清液。KDR1.3scFv和KDR2.6的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析结果分别示于图8和图9中。

对于两个克隆（KDR1.3和KDR2.6），第六上清液含有最纯的scFv，因此选择这些上清液用于进一步的纯化步骤。在+4°C下这些上清液针对含有L-精氨酸的再折叠缓冲液透析两晚。然后这些上清液针对超声缓冲液透析另外两晚。透析后，使用金属亲和柱（TALON-BDBioscience）进行样品纯化。对于这项研究，在50ml试管中在1300rpm下离心树脂5分钟并除去上清液。使用10树脂体积的超声缓冲液平衡该树脂并在室温下在1300rpm下离心3分钟。弃去上清液，并在试管中加入透析样品。孵育混合物30分钟并随后在室温下在1300rpm下离心5分钟。弃去上清液并且使用10树脂体积的超声缓冲液洗涤树脂2次持续10分钟。然后使用1体积的超声缓冲液将树脂重新悬浮并将悬浮液转移到端盖柱（endcapcolumn）中。在滗析树脂后，用1树脂体积的超声缓冲液洗涤柱3次。然后使用5树脂体积的1×洗脱缓冲液从柱中洗脱重组抗体。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析洗脱样品。在图10和图11中示出KDR1.3和KDR2.6克隆的TALON纯化结果。

为了分析在VEGF相关的HUVE细胞增殖测定上KDR1.3和2.6重组抗体的作用，使用开发的抗B型肝炎病毒表面抗原的Lig7重组抗体作为阴性对照。

TALON纯化的KDR1.3和2.6scFv和Lig7洗脱样品的第二洗脱管针对PBS透析过夜并在细胞培养测定中以及过滤灭菌后使用。使用BCA法（Pierce23225）测定scFv浓度。

在500ml的培养基中重组抗体的诱导过程后，获得了500μ1TALON纯化的scFv。纯化的KDR1.3scFv的量在85ng/μl至156ng/μl之间变化并且具有120ng/μl的平均值并且对于KDR2.6，scFv的量在88ng/μl至125ng/μl之间变化并且具有105ng/μl的平均值。重组抗体纯化产品的量和活性之间的差异可能由于在纯化步骤期间抗体结构折叠的差异引起（Wulfing,C.AndPlunckthun,A.,1994,J.Mol.Biol.,242,655-669,）；DasaD.,etal.2004,JVirolMethods,117(2),169-77）。这些折叠的变化可能是由于序列的差异，这些序列差异还可能干扰宿主细胞的遗传稳定性（Knappik,A.,etal.1993,Bio/Technology,11,77-83）。

通过ELISA测定可溶性KDR1.3和KDR2.6SCFV相对于可溶性KDR的结合特性

通过ELISA法测定了KDR1.3和KDR2.6scFv的结合特性。在+4°C下使用100μl靶抗原（0.5μg）涂覆ELISA孔板的每个孔过夜。第二天使用200μl的TPBS（含有PBS的0.1％Tween20）洗涤孔三次，然后在室温下使用200μl的封闭缓冲液（PBS+1％BSA）封闭1小时。使用TPBS洗涤孔三次，然后将含有抗KDR重组抗体（～1μg）或没有重组抗体（作为阴性对照）的100μl封闭缓冲液加入到孔中并在室温下孵育2小时。孵育后使用TPBS洗涤孔6次，然后将含有1:5000抗Myc标记的辣根过氧化物酶结合抗体（Sigma）的100μl封闭缓冲液加入到各孔中并在室温下孵育1小时。使用TPBS洗涤6次后，将100μl的ABTS底物溶液（PharmaciaBiotech，目录号27-9402-01）加入各孔中。在室温下孵育一小时后，使用ELISA酶标仪（Bio-TechELISA酶标仪）检测各孔的OD₄₀₅值。在图12中给出ELISA的结果。当阴性对照的OD₄₀₅值为约0.09时，KDR1.3、KDR2.6和Lig7的第二洗脱管的OD₄₀₅值是0.250、0.512和0.605。因此可溶性表达的KDR1.3和KDR2.6scFv仍然结合至KDR并可以用于细胞培养实验。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离和体外培养

根据上面引用的描述获得的重组抗体的预期特性是通过阻断VEGFR-2的活性来抑制细胞增殖。为此目的，测定了对于抑制HUVEC增殖所必需的重组抗体浓度以及在体外细胞增殖试验中抑制的百分数。

使用Jaffeetal所描述的方法的修正形式（Jaffeetal.,JClinInvest.1973;52:2745-56）纯化和培养HUVE细胞。在用人类血浆纤连蛋白（40μg/ml）涂覆的组织培养板中，在含有20％胎牛血清、20mMHEPESpH7.4、盘尼西林（100μg/mL）、链霉素（100μg/mL）和肝素（5μ/mL）的M199内皮细胞生长培养基（BiologicalIndustries,Israel）中维持细胞。

HUVECBRBU增殖测定

为了检测重组抗体对细胞增殖的KDR阻断活性，使用了能够测量核苷酸类似物（BrdU）结合到复制的DNA中的试剂盒。

为此目的，使用RocheBRDU试剂盒（Roche，目录号1444611）。BrdU是在细胞分裂过程中结合到复制DNA中的核苷酸类似物。然后，通过荧光标记物结合的抗BrdU抗体测量进入细胞中的BrdU的摄入量。

对于BRDU测定，如上所述将HUVE细胞铺于96孔组织培养板上并进行培养。对于这些实验，以5000个细胞/孔的密度将HUVE细胞接种在用1％明胶涂覆的96孔组织培养板中。使细胞附着3h后，将培养基更换为含2％FBS的M199培养基并且培养细胞16小时。

在室温下将抗体稀释在含有5或10ng/ml的VEGF的培养基中并将此新鲜制备的抗体稀释液每天加入细胞培养物中持续两天。

在实验结束前的16小时，将BrdU添加到细胞中至10μΜ的终浓度。在实验结束时，洗涤并固定细胞。根据制造商的说明书进行BrdU标记。用分光光度法在405nm处读数测定各孔中BrdU结合量。对每个样品，从405nm处的吸光度值中减去490nm处的吸光度值。

在接下来的实验中，分析了在不同时间不同的KDR1.3和KDR2.6重组抗体浓度对HUVE细胞增殖的影响（图13）。根据四个不同增殖测定的平均值计算出对于1μg/毫升的重组抗体浓度HUVE细胞增殖的抑制百分比。

Ab293:%84±20.1

KDR1.3:%60±23.7

KDR2.6:%40±17.4

角膜血管生成模型中重组可溶性抗体的体内抗血管生成作用的研究

在马尔马拉大学神经科学研究所通过外科手术获得了在角膜血管生成模型中使用的动静脉畸形（AVM）组织，并且在这些模型中测试了KDR1.3、KDR2.6和LIG-7重组抗体。

角膜血管生成模型

角膜是无血管的组织，其通常不包括血管。当将血管生成活性组织放置在角膜表面上的微囊（micropocket）中时，在第3或第4周，角膜开始形成血管。角膜的这种特性为研究体内血管生成提供了途径（BarbelMetal,Inv.Ophthalmology&Vis.Sci.,1996,Vol:37,No:8p.1625-1632）。将有待接种到角膜中的每个组织样本（AVM在液氮中，在-187°C下）升至室温，使用二甲亚砜洗涤，并在显微镜下切成合适尺寸（约2至3mm直径）的块。

在这项研究中使用了10只Sprague-Dawley大鼠。由于感染，从研究中去除其中一只大鼠。通过按照先前发表的文献（PolveriniPJ,etal,Lab.Invest.,1984,51,635-642）完成角膜植入程序中的步骤，并在图14中示出。通过腹膜内注射氯胺酮来麻醉每只大鼠，并且所有的操作均在无菌条件下在显微镜下进行。使用外用0.5％propacaine麻醉每个动物的两个角膜，并且使用珠宝镊轻轻地脱出每个眼球。在手术显微镜下，使用蛛网膜刀片（arachnoidblade）进行近中心的基质内线性角膜切开术（paracentralintrastomallinearkera-totomy）（约4mm长并与角膜缘（limbus）成直角）。然后，使用微型钩以在角膜组织内形成微囊（micropocket）。在角膜的两个上皮层之间的微囊中植入均匀量的组织。将进行程序的日期记为第0天。大鼠角膜血管生成测定中重组抗体的抗血管生成作用的研究

所有实验使用了体重300至400克的Sprague-Dawley大鼠。9只大鼠被用于角膜血管生成测定。向角膜中携带AVM的大鼠体内每天同时静脉注射KDR1.3、KDR2.6和LIG-7抗体（25ng/μl）并在10天期间这些组按此操作。在这项研究中，LIG-7用作阴性对照，在第3、第5、第7和第9天拍照每个角膜并计算新形成的血管用于评估。在10天期间对观察的大鼠角膜拍照并且图片如图15所示。当用使用了KDR1.3的组与对照组相比时，可见血管形成的退化。在KDR2.6组中也可见血管形成的退化，但由于衰弱在第9天发生了大鼠死亡。

对于KDR1.3、KDR2.6和对照组进行了血管生成活性的测定并且随后使用SPSS15.0版进行了一般线性模式（GLM）、单变量变化分析测试用于统计地比较第3、第5、第7和第9天的血管数并且使用TukeyHSD和Student-Newman-Keuls检验进行事后比较（Post-hoccomparison）。统计评估显示，KDR1.3和KDR2.6抗体的抗血管生成活性是统计显著的（KDR1.3；P<0.05且KDR2.6；P<0.05）。但当使用KDR2.6抗体时发生大鼠死亡。体内实验表明，KDR1.3抗体是体内使用最有效的抗血管生成分子。

已经证明了本专利提及的两种重组抗体（KDR1.3和KDR2.6）对HUVE细胞增殖的阻断能力以及在体内模型中它们对大鼠角膜的抗血管生成作用。1998年，Zhu等人通过使用KDR-AP免疫小鼠生产了具有2.1mM亲和性的抗KDR的scFv（plC1l）并使用1μg/ml浓度KDR获得对HUVE细胞增殖48％的抑制（Zhuetal,1998,CancerRes.58,3209-3214）。此外，开发的抗Flkl大鼠单克隆抗体显示了对G55细胞的25％的抑制作用（KunkelPveark.2001,CancerResearch61,6624-6628）。开发的抗KDR免疫球蛋白结构域III（IgdomainIII）的单克隆抗体（YcomB3）在0.5mg/L的浓度下显示了对HUVE细胞的50％的抑制作用并且该抗体被提出作为抗血管形成应用的候选药物（LiRetal.2004;ActaPharmacolSin25(10):1292-1298）。

存在对于增加抗体结构亲和性的研究。1996年，Davies和Riechmann已说明重链可变区的突变涉及CDRL亲和性。抗体的亲和性从160nM下降至25nM（DavesandRechmann,1996Immunotechnology,2,169-79,(1996)）。Lippow等人在2007年说明，在抗溶菌酶的抗体的轻链区中4个氨基酸的改变，将亲和性增加了140倍（30pM）（LippowS.Metal.2007,Nat.Biotechnol.,25,1171-1176）。

现今，用于抑制血管生成的雷珠单抗，是贝伐珠单抗在可变区中5个氨基酸改变以及在恒定区中1个残基改变的衍生物。这些改变将抗VEGF抗体的亲和性增加上百倍（192pM）。总之，可以通过修改KDR1.3和2.6重组抗体结构的序列来增加它们的亲和性以及由此增加它们的抗血管生成的特性。

SEQUENCENO.1

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SEQUENCENO.2

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SEQUENCENO.3

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SEQUENCENO.30

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SEQUENCENO.31

SEQUENCENO.32

SEQUENCE.NO.33

GGGSGGGGSGGGGS

SEQUENCE.NO.34

ggaggcggttcaggcggaggtggctctggtggtggcggatcg

Claims

1.一种抗VEGFR-2重组抗体，所述重组抗体是单链Fv(scFv)，在7天的处理后，所述重组抗体在动静脉畸形组织移植的大鼠角膜分析中具有统计学显著的血管生成抑制作用，所述重组抗体包括：

-可变重链(VH)，由在SEQUENCENO.23中示出的氨基酸序列组成；和

-可变轻链(VL)，由在SEQUENCENO.24中示出的氨基酸序列组成。

2.一种DNA分子，所述DNA分子编码权利要求1所述的重组抗体，其包含：

-可变重链(VH)，由在SEQUENCENO.31中示出的核酸序列组成；和

-可变轻链(VL)，由在SEQUENCENO.32中示出的核酸序列组成。

3.包含在权利要求2中限定的核酸序列的重组载体。

4.包含权利要求3所述的载体或含有在权利要求1中限定的抗体的药用组合物。