TW202405178A - 與纖維蛋白結合的抗體及含有該抗體的纖維蛋白溶解性蛋白質以及含有該蛋白質的醫藥製劑 - Google Patents
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Abstract
本發明提供在無血清培養基中的蛋白質表現細胞中的產生量優良,抑制分解物等的雜質的產生的安定的纖維蛋白凝塊溶解性的蛋白質及含有該蛋白質的醫藥製劑、以及此等的製造方法。
Description
本發明是有關於結合於纖維蛋白的抗體及含有該抗體的纖維蛋白溶解性蛋白質及含有該蛋白質的醫藥製劑。本發明特別是有關於適合大量純化的纖維蛋白溶解性蛋白質及含有該蛋白質的醫藥製劑。再者,本發明是有關於使纖維蛋白溶解性蛋白質安定化的方法、及安定化的纖維蛋白溶解性蛋白質的製造方法。
正在開發對於纖維蛋白以相對於對纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體 (專利文獻1及2)。此等的專利文獻中,揭示該抗體使用於癌症的治療。對於纖維蛋白強力結合的抗體也能夠用於體內影像(in-vivo imaging) (專利文獻1及2)。
再者,正在開發對於纖維蛋白結合的抗體及與前尿激酶突變體的融合蛋白質,揭示具有血栓溶解作用 (專利文獻3)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] WO2014/133093
[專利文獻2] WO2018/203517
[專利文獻3] WO2021/200922
本發明提供結合於纖維蛋白的抗體及含有該抗體的纖維蛋白溶解性蛋白質及含有該蛋白質的醫藥製劑。具體而言,在WO2021/200922(專利文獻3)中,明白到大量製造時的問題點 (例如,在蛋白質產生細胞中生成量的增加產生了上限的問題、產生了生成蛋白質的分解物的問題、培養需要血清的問題、純化需要特定的添加物的問題、及不期望的活性化的問題等),本發明,在一態樣中,能夠減輕或解決上述問題點的任一者的1個以上。再者,專利文獻3所揭示的融合蛋白質雖然不能結合於小鼠尿激酶受體,但是顯示對於人類尿激酶受體的反應性。本發明、在一態樣中,能夠減低或消失對於人類尿激酶受體的反應性。
根據本發明,提供下述的發明。
[1] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段,及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶(pro-urokinase)之第156位至第411位的胺基酸序列之胺基酸序列的前尿激酶之催化域(catalytic domain),且前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域為直接地或經由連接子而連結之融合蛋白質,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸的上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
[2] 一種融合蛋白質,其為上述[1]所記載的融合蛋白質,前述苯丙胺酸被取代為異白胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或半胱胺酸。
[3] 一種融合蛋白質,其為上述[1]或[2]所記載的融合蛋白質,前述苯丙胺酸被取代為麩胺酸、或天冬胺酸。
[4] 一種融合蛋白質,其為上述[1]~[3]的任一項所記載的融合蛋白質,
對於選擇自由人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體所組成的群組的1以上的尿激酶受體的結合能比具有序列識別號1所記載的胺基酸序列的融合蛋白質更低。
[5] 一種融合蛋白質,其為請求項上述[1]~[4]的任一項所記載的融合蛋白質,
對於選擇自由人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體所組成的群組的1以上的尿激酶受體不顯示顯著地結合。
[6] 一種融合蛋白質,其為上述[1]~[3]的任一項所記載的融合蛋白質,
前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[7] 一種融合蛋白質,其為上述[1]~[4]的任一項所記載的融合蛋白質,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[8] 一種融合蛋白質,其為上述[1]~[4]的任一項所記載的融合蛋白質,
前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,且對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸至第28位的異白胺酸為止的胺基酸的上述類EGF結構域的胺基酸缺失。
[9] 一種醫藥製劑,包含上述[1]~[8]的任一項所記載的融合蛋白質。
[10] 一種方法,其為製造上述[1]~[8]的任一項所記載的融合蛋白質的方法,包含
培養具有能夠表現編碼前述融合蛋白質的核酸之蛋白質產生細胞,使融合蛋白質表現,及從獲得的培養物純化前述融合蛋白質。
[11] 一種方法,其為上述[10]所記載的方法,前述培養是在無血清條件下或5%以下的血清存在下進行。
[12] 一種方法,其為上述[10]或[11]所記載的方法,純化是在不存在L-精胺酸下進行。
[13](較佳為安定性優良)一種方法,其為製造融合蛋白質改變體或包含該改變體之醫藥組成物的方法,包含
融合蛋白質為包含
結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
前述抗體或抗原結合性片段為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區之物,
於前述融合蛋白質導入F157E或F157D突變,藉此賦予相較於前述改變前的融合蛋白質更優良的安定性。
[21] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,且前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[22] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[23] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列之前尿激酶的類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶的三環結構域(kringle domain)、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[24] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸的上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[25] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸至第28位的異白胺酸為止的胺基酸序列的上述類EGF結構域的胺基酸序列缺失,對人類尿激酶受體的結合能降低或較佳為喪失。
[26] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸至第28位的異白胺酸為止的胺基酸序列的上述類EGF結構域的胺基酸序列缺失,該缺失部位具有1~7胺基酸(不具有對人類尿激酶受體的結合親和性的胜肽,例如2胺基酸的胜肽,例如GG)的插入,對人類尿激酶受體的結合能降低或較佳為喪失。
[31A] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
[31B] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7~ 43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
[31C] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
[31D] 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
[32] 一種融合蛋白質,其為上述[31](亦即,上述[31A]~[31D]的任一項)所記載的融合蛋白質,前述苯丙胺酸被取代為異白胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或半胱胺酸。
[33] 一種融合蛋白質,其為上述[31]或[32]所記載的融合蛋白質,前述苯丙胺酸被取代為麩胺酸、或天冬胺酸。
[34] 一種融合蛋白質,其為上述[31]~[33]的任一項所記載的融合蛋白質,
前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[35] 一種融合蛋白質,其為上述[31]~[34]的任一項所記載的融合蛋白質,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[36] 一種融合蛋白質,其為上述[31]~[34]的任一項所記載的融合蛋白質,
述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸至第28位的異白胺酸為止的胺基酸序列的上述類EGF結構域的胺基酸序列缺失,(例如,於該缺失部位於該缺失部位具有1~7胺基酸(至少為不具有對人類尿激酶受體的結合親和性的胜肽,較佳為不具有對人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體的結合親和性的胜肽,例如2胺基酸的胜肽,例如GG)的插入),對人類尿激酶受體的結合能降低或較佳為喪失。
[37] 一種醫藥製劑,包含上述[31]~[36]的任一項所記載的融合蛋白質。
[38] 一種方法,其為製造上述[31]~[36]的任一項所記載的融合蛋白質的方法,包含:
培養具有能夠表現編碼前述融合蛋白質的核酸之蛋白質產生細胞,使融合蛋白質表現、及從獲得的培養物純化前述融合蛋白質。
[39] 一種方法,其為上述[38]所記載的方法,前述培養在無血清條件下或5%以下的血清存在下進行。
[40] 一種方法,其為上述[38]或[39]所記載的方法,純化在不存在L-精胺酸下進行。
[41] 一種融合蛋白質,融合蛋白質為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸的胺基酸序列的前尿激酶之類EGF結構域、對應於第49位至第131位的胺基酸的前尿激酶之三環結構域、及具有對應於第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
連接子為非開裂性連接子,
前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區,
對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸,
分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[42] 如上述[41]所記載的融合蛋白質,對應於第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為酪胺酸以外的胺基酸。
[43] 如上述[41]所記載的融合蛋白質,對應於第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為異白胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或半胱胺酸。
[44] 如上述[41]所記載的融合蛋白質,對應於第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸為麩胺酸、或天冬胺酸。
[45] 如上述[41]之融合蛋白質,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[46]如上述[42]融合蛋白質,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[47] 如上述[43]融合蛋白質,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[48] 如上述[44]融合蛋白質,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
[61] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段特異性地結合於不溶性纖維蛋白(特別是對於選擇自由纖維蛋白原(fibrinogen)、可溶性纖維蛋白、及纖維蛋白分解物所組成的群組之1種以上,較佳為全部,相較於對於不溶性纖維蛋白更弱或是不結合,特佳為不顯著地結合)。
[62] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段結合於序列識別號8所記載的胺基酸序列所形成的胜肽。
[63] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段具有分別對應於選擇自由WO2014/133093所揭示的10-102抗體、34-105抗體、及Fib-0355抗體所組成的群組的抗體的重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之CDR。
[64] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段包含:
含有具有序列識別號10所記載的胺基酸序列之重鏈CDR1及具有序列識別號11所記載的胺基酸序列之重鏈CDR2及具有序列識別號12所記載的胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區,及
含有具有序列識別號13所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR1及具有序列識別號14所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR2及具有序列識別號15所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區。
[65] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段包含:
具有序列識別號16所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈可變區,及
具有序列識別號17所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈可變區。
[66] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,包含:含有具有序列識別號18所記載的胺基酸序列之重鏈CDR1及具有序列識別號19所記載的胺基酸序列之重鏈CDR2及具有序列識別號20所記載的胺基酸序列之重鏈CDR3之重鏈可變區,及
含有具有序列識別號21所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR1及具有序列識別號22所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR2及具有序列識別號23所記載的胺基酸序列之輕鏈CDR3之輕鏈可變區。
[67] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段包含:
具有序列識別號24所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈可變區,及
具有序列識別號25所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈可變區。
[68] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段為與關於對於不溶性纖維蛋白結合之參照抗體進行競爭之物,參照抗體包含:
具有序列識別號16所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈可變區,及
具有序列識別號17所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈可變區。
[69] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段為與關於對於不溶性纖維蛋白結合之參照抗體進行競爭之物,參照抗體包含:
具有序列識別號24所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈可變區,及
具有序列識別號25所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈可變區。
[70] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,具有序列識別號107的胺基酸序列。
[71] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段具有10
-6M以下、10
-7M以下、或10
-8M以下的結合解離常數(KD)。
[72] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,抗體或其抗原結合性片段為Fab片段或Fab’片段{在此較佳為,前述片段的重鏈的C端與前尿激酶或其部分或其突變體的N端連結的融合蛋白質}。
[81] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,具有選擇自由(i) 對於不溶性纖維蛋白的結合特異性;(ii) 對於不溶性纖維蛋白的結合親和性;(iii) 對於起因於胞漿素原活化抑制蛋白(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的抑制之抵抗性;及(iv) 對血栓周圍組織的基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)活性的誘導性的降低所組成的群組之任一者的1以上、較佳為2以上、更佳為3以上、進而較佳為全部的特性。
[82] 如上述任一項所記載的融合蛋白質,其與顯像劑(imaging agent)連結。
[91] 一種醫藥製劑,包含如上述任一項所記載的融合蛋白質。
[92] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於血栓症的處置。
[93] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,使用於適合纖維蛋白凝塊(clot)的溶解之治療法的狀態或疾病的處置。
[94] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於伴隨有血栓形成的腦血管疾病及心血管疾病的處置。
[95] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置腦血管疾病及心血管疾病中、伴隨著血栓形成所產生的狀態或症狀。
[96] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀。
[97] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置缺血性腦血管疾病(ischemic cerebrovascular disease)。
[98] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置腦梗塞及暫時性大腦缺血(transient cerebral ischemia)發作的任一者。
[99] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置缺血性心血管疾病。
[100] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於處置狹心症及心肌梗塞的任一者。
[101] 如上述[91]~[100]的任一項所記載的醫藥製劑,用於使用於在急性期處置疾病。
[102] 如上述[91]所記載的醫藥製劑,用於使用於在具有纖維蛋白凝塊的對象中,溶解纖維蛋白凝塊。
[103] 一種包含如上述[82]所記載的融合蛋白質的醫藥製劑,其為用於使用於檢驗體內中的血栓之醫藥製劑。
[104] 如上述[103]所記載的醫藥製劑,同時用於上述[92]~[102]的任一項所界定的醫藥用途。
本說明書中,「對象」為哺乳動物,例如,可為犬、貓、牛、馬、豬、靈長類(例如,猴子、大猩猩、紅毛猩猩(orangutan)、倭黑猩猩(bonobo)、黑猩猩及人類),例如,可為人類。
本說明書中,「纖維蛋白」是指,藉由構成纖維蛋白原的3種類的多胜肽鏈(Aα鏈、Bβ鏈及γ鏈)的C端被切斷而形成的不溶性的凝固物。本說明書中,有將纖維蛋白稱為不溶性纖維蛋白之事項。更具體而言,藉由將纖維蛋白原的C端切斷,成為被稱為纖維蛋白單體的狀態,纖維蛋白單體經由鈣的作用而聚合形成難溶性的纖維蛋白聚合物。纖維蛋白聚合物經由凝血第XIII因子的作用、聚合物之間進行交聯,形成安定化纖維蛋白(本說明書所定義的不溶性纖維蛋白或纖維蛋白膠)。不溶性纖維蛋白藉由胞漿素(plasmin)而被分解。胞漿素是以前驅物之胞漿素原(plasminogen)而包含於血漿中。胞漿素原經由胞漿素原激活物(plasminogen activator)(例如,尿激酶、組織胞漿素原活化蛋白、及鏈激酶(streptokinase))等,分解胞漿素原的Arg-Val間的胜肽,而產生胞漿素。胞漿素經由被稱為胞漿素抑制蛋白的蛋白質所抑制,而限制其作用。
纖維蛋白原的Aα鏈可為人類纖維蛋白原的Aα鏈。作為人類纖維蛋白原的Aα鏈,能夠列舉具有以GenBank登錄編號:AAI01936.1所登錄的胺基酸序列的人類纖維蛋白原的Aα鏈、及具有對應於該胺基酸序列的胺基酸序列之人類纖維蛋白原的Aα鏈。
纖維蛋白原的Bβ鏈可為人類纖維蛋白原的Bβ鏈。作為人類纖維蛋白原的Bβ鏈,能夠列舉具有以NCBI參照編號:NP_005132.2所登錄的胺基酸序列的人類纖維蛋白原的β鏈、及具有對應於該胺基酸序列的胺基酸序列的人類纖維蛋白原的β鏈。
纖維蛋白原的γ鏈可為人類纖維蛋白原的γ鏈。作為人類纖維蛋白原的γ鏈,能夠列舉具有以GenBank登錄編號:AAH07044.1所登錄的胺基酸序列的人類纖維蛋白原的γ鏈、及具有對應於該胺基酸序列的胺基酸序列的人類纖維蛋白原的γ鏈。
本說明書中,「尿激酶」是被稱為尿激酶型胞漿素原活化蛋白(uPA)的絲胺酸蛋白酶之一 (例如,可為以EC 3.4.21.73登錄的酵素)。尿激酶由前驅物之前尿激酶所產生,其Lys158-Ile159之間的胜肽鍵被切斷,形成活性型的尿激酶(被切斷的鏈彼此間以雙硫鍵相互連結)。尿激酶具有類EGF結構域、三環結構域、及催化域的3個結構域。再者,Lys135-Lys136間被切斷,尿激酶成為低分子型尿激酶。又,前尿激酶的胺基酸編號是基於前尿激酶的訊息胜肽切斷後的胺基酸序列(例如,序列識別號6所記載的胺基酸序列)而規定。作為前尿激酶,能夠列舉例如,人類前尿激酶。作為人類前尿激酶,能夠列舉例如,具有以GenBank登錄編號:AAA61253.1登錄的胺基酸序列之人類前尿激酶及具有對應於該胺基酸序列的胺基酸序列之人類前尿激酶。在以GenBank登錄編號:AAA61253.1登錄的胺基酸序列中,第1~20位的胺基酸序列對應於訊息胜肽。類EGF結構域可具有對應於序列識別號6所記載的胺基酸序列的第7~43位之前尿激酶的序列,三環結構域可具有對應於序列識別號6所記載的胺基酸序列的第49~131位之前尿激酶的序列,催化域可具有對應於第136~403位之前尿激酶的序列。只要經由胞漿素、激肽釋放酶(kalliklein)作為雙鏈的激酶原 (prokinase)而被活性化,並具有分解胞漿素原變換為胞漿素的功能,能夠使用各式各樣的前尿激酶。
本說明書中,關於所謂「對應」的用語,當第2胺基酸序列與第1胺基酸序列具有90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上的序列相同性,且具有與含有第1胺基酸序列的胜肽相同功能(例如,尿激酶的情況時為分解胞漿素原轉變為胞漿素的能力)時,為具有對應於第1胺基酸序列的序列。
本說明書中,「抗體」是指免疫球蛋白。抗體可為各式各樣類型的抗體,例如,可為IgG。抗體較佳可為單株抗體。抗體可為人嵌合(human chimera)抗體、人源化抗體、或人類抗體。人嵌合抗體能夠藉由將非人類抗體的恆定區置換為人類抗體的恆定區而製作。人源化抗體能夠藉由將人類抗體的6個CDR置換為非人類抗體的6個對應的CDR而製作。人類抗體能夠使用免疫球蛋白的至少將重鏈可變區置換為對應人類基因座的區域的動物(例如,小鼠)而製作。恆定區為非人類的情況時,藉由將恆定區置換為人類的抗體的胺基酸序列能夠獲得人類抗體。本說明書中,抗體較佳可為人源化抗體。本說明書中,抗體較佳可為人類抗體。抗體在細胞內產生時具有訊息胜肽,在分泌至細胞外時,該訊息胜肽被切除。因此,作為醫藥投予的情況時,抗體不需要訊息胜肽。
本說明書中,「CDR」為存在於抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區的互補決定區。重鏈及輕鏈可變區分別存在3個,從N端起稱為CDR1、CDR2、及CDR3。CDR、例如基於Kabat等人的編號 (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH.)而決定。
本說明書中,「抗體的抗原結合性片段」是指抗體的片段,維持對於抗原的結合性的片段。作為抗原結合性片段,能夠列舉例如,Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv、scFv(單鏈Fv)、雙功能抗體(diabody)、sc(Fv)
2(單鏈(Fv)
2)。例如,將抗體以木瓜酶分解,則能夠獲得Fab。或者,將抗體以胃蛋白酶分解,則能夠獲得F(ab’)
2,將此等再進行還原,則能夠獲得Fab’。其他的抗體的抗原結合性片段也能夠以發明所屬技術領域具有通常知識者週知的方法製作。本發明能夠使用此種抗體的抗原結合性片段。
本說明書中,「融合蛋白質」是指,源自2個以上的相異蛋白質的胜肽以胜肽鍵所連結而成的蛋白質。本說明書中,只要不會顯著地降低發明的功能,第一胜肽與第二胜肽的融合蛋白質亦可更包含第三胜肽及更多胜肽,亦可僅包含第一胜肽及第二胜肽。本說明書中,只要不會顯著地降低發明的功能,第一胜肽與第二胜肽的融合蛋白質可為依序包含第一胜肽與第二胜肽的融合蛋白質、及將此等以不同順序包含的融合蛋白質的任一者,較佳為依序包含第一胜肽與第二胜肽的融合蛋白質。融合蛋白質中,只要不會顯著地降低發明的功能,源自2個以上的相異蛋白質的胜肽亦可經由連接子連結,亦可不經由連接子連結。經由連接子的情況時,連接子可為可撓式(flexible)連接子。
<本發明的融合蛋白質的改變體>
(A) 根據本發明,提供一種融合蛋白質,
包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6所記載的前尿激酶的第136位至第403位的胺基酸序列的胺基酸序列之前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結。在此,對應於序列識別號6所記載的前尿激酶的第136位至第403位的胺基酸序列的胺基酸序列,第135位的離胺酸及第136位的離胺酸的任一者或雙方(較佳為雙方)的胺基酸被取代為其他的胺基酸,藉此能夠抑制來自前尿激酶之催化域的切斷。在一較佳態樣中,對應於序列識別號6所記載的前尿激酶的第135位的離胺酸及第136位的離胺酸的胺基酸的雙方,共同被取代為甘胺酸。因此,特佳的態樣中,融合蛋白質的前尿激酶或其一部份,能夠具有對應於序列識別號7的前尿激酶的突變體的胺基酸序列的胺基酸序列或其一部份。
本發明的融合蛋白質在結合於不溶性纖維蛋白之前,前尿激酶部分為不活化,結合於不溶性纖維蛋白,則經由存在於附近的胞漿素切斷前尿激酶部分,產生兩條鏈尿激酶而活性化,切斷附近的胞漿素原而量產胞漿素。藉此,有效地溶解不溶性纖維蛋白。
根據本發明,融合蛋白質、前尿激酶能夠進一步具有三環結構域。前尿激酶能夠進一步具有類EGF結構域及三環結構域。較佳的態樣中,融合蛋白質依序具有類EGF結構域、三環結構域、及催化域。更佳的態樣中,融合蛋白質具有對應於序列識別號6或7所記載的胺基酸序列的第7~403位的前尿激酶的區域。最佳的態樣中,融合蛋白質包含具有對應於序列識別號6或7所記載的胺基酸序列的胺基酸序列之前尿激酶部分。
根據本發明,融合蛋白質包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段部分。結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段部分可包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段的重鏈可變區及輕鏈可變區。
根據本發明,融合蛋白質的結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段部分可為Fab片段或Fab’片段。在一態樣中,Fab片段或Fab’片段的重鏈可變區與上述般的前尿激酶或其一部份連結。在一態樣中,Fab片段或Fab’片段的輕鏈可變區與上述般的前尿激酶或其一部份連結。
本說明書中,使用於抗原結合性片段的情況時,用途「重鏈」及用語「輕鏈」是用於表示源自來源抗體中的「重鏈」及「輕鏈」的哪一者的用語,並非用於表示抗原結合性片段的分子量的大小。
本發明的較佳的態樣中,融合蛋白質中、對應於序列識別號6所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
(B) 因此,根據本發明,提供一種融合蛋白質,
其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第136位至第403位的胺基酸序列的胺基酸序列之前尿激酶之催化域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
(C) 在一較佳態樣中,根據本發明,提供一種融合蛋白質
其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第7位至第403位的胺基酸序列的胺基酸序列之前尿激酶之區域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。更佳的態樣中,前述前尿激酶之區域可包含具有對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第1位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之區域。
根據本發明,上述苯丙胺酸被取代為各種的胺基酸(例如,酪胺酸以外的胺基酸)。藉此,較佳為本發明的融合蛋白質能夠提升對於蛋白質分解酵素(例如,胞漿素)的切斷耐性。在一較佳態樣中,上述苯丙胺酸被取代為丙胺酸、離胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、異白胺酸、甘胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸。更佳的態樣中,上述苯丙胺酸被取代為異白胺酸、甘胺酸、麩胺酸、或天冬胺酸。藉此,能夠抑制融合蛋白質表現時、融合蛋白質純化時、及/或融合蛋白質保存時的融合蛋白質的分解及伴隨其之活性化。進而較佳的態樣中,上述苯丙胺酸被取代為麩胺酸、或天冬胺酸。經由此種方式,除了能夠抑制融合蛋白質表現時、融合蛋白質純化時、及/或融合蛋白質保存時的融合蛋白質的分解及伴隨其之活性化之外,在胞漿素存在下的活性化能夠發揮與上述苯丙胺酸未被取代的融合蛋白質同等的胞漿素原分解活性。再者,不具有上述苯丙胺酸的取代的融合蛋白質在使其從蛋白質表現細胞產生時,產生片段化的前述融合蛋白質。因此,經由將前述融合蛋白質中的上述苯丙胺酸取代為酪胺酸以外的胺基酸,較佳為取代成為麩胺酸、或天冬胺酸,即使將表現前述融合蛋白質的蛋白質表現細胞培養在低血清培養基(例如,僅含有5%以下的血清)或無血清培養基中,能夠不增加、或降低片段化的融合蛋白質的出現量。再者,不具有上述苯丙胺酸的取代的融合蛋白質在使其從蛋白質表現細胞產生時,5~7天融合蛋白質的產生量持續增加,但是超過上述,則不僅融合蛋白質的產生量不增加,並且產生的蛋白質中輕鏈佔有的比例增加。相對於此,經由將前述融合蛋白質中的上述苯丙胺酸取代為酪胺酸以外的胺基酸,較佳為取代為麩胺酸、或天冬胺酸,能夠減低產生的蛋白質中輕鏈佔有的比例。再者,經由將前述融合蛋白質中的上述苯丙胺酸取代為酪胺酸以外的胺基酸,較佳為、取代為麩胺酸、或天冬胺酸,即使超過7天、融合蛋白質的產生量持續地增大,因此,融合蛋白質的產生量比不具有取代的融合蛋白質顯著地增大 (例如,增大3~5倍)。能夠減低或避免血清的使用,則能夠抑制由於血清的品質的參差不齊導致的蛋白質產生的參差不齊,且由於降低培養的成本,是有益事項。
因此,融合蛋白質中,對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸,特別是被取代為麩胺酸、或天冬胺酸之事項,從製造上、產量增大、純度增加、及/或費用節省的觀點而言,具有重要的意義。
(D) 在本發明的一較佳態樣中,提供一種融合蛋白質,
其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第7位至第403位的胺基酸序列的胺基酸序列之前尿激酶之區域,前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質,
對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為麩胺酸或天冬胺酸。在一較佳態樣中,前尿激酶之區域具有對應於序列識別號7所記載的前尿激酶的第1位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列。
<本發明的融合蛋白質之進一步改變體>
根據本發明,提供對尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低之融合蛋白質的改變體。
具體而言,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質的任一者(例如,(A)~(D)的任一者)的胺基酸序列中,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第30位的色胺酸的上述類EGF結構域的胺基酸,被取代為其他的胺基酸(特別是精胺酸)。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
再者,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質的任一者(例如,(A)~(D)的任一者)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,被取代為其他的胺基酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質的任一者(例如,(A)~(D)的任一者)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質(A)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質(B)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質(C)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質(D)的胺基酸序列中,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸。藉此,本發明的進一步改變體,對於人類尿激酶受體的結合親和性比上述融合蛋白質更降低。
在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質的任一者(例如,(A)~(D)的任一者)的胺基酸序列中,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸起至第28位的異白胺酸為止的胺基酸序列之上述類EGF結構域的胺基酸序列缺失。藉此,認為改變體喪失對尿激酶受體的結合能。在一態樣中,本發明的進一步改變體中,上述融合蛋白質的任一者(例如,(A)~(D)的任一者)的胺基酸序列中,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸起至第28位的異白胺酸為止的胺基酸序列之上述類EGF結構域的胺基酸序列缺失,該缺失部位具有1~7胺基酸(至少為不具對人類尿激酶受體的結合親和性的胜肽,較佳為不具對人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體的結合親和性的胜肽,例如,2胺基酸胜肽,例如,GG)的插入。胺基酸序列的插入能夠為了減輕因缺失導致的蛋白質長度的縮短而進行。被插入的胺基酸序列不必發揮特別的活性,由G、S等的中性的胺基酸所形成,或可含有該胺基酸。藉此,本發明的進一步改變體不具有顯著地對人類尿激酶受體(特別是人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體)的結合親和性,或比上述融合蛋白質的對該受體的結合親和性更降低,較佳為、不具有顯著地對人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體的結合親和性。
對人類等的尿激酶受體的結合親和性,相較於序列識別號1所記載的融合蛋白質可為1/2以下、1/3以下、1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下、1/9以下、1/10以下、1/20以下、1/30以下、1/40以下、1/50以下、1/60以下、1/70以下、1/80以下、1/90以下、或1/100以下。結合親和性能夠經由測定對於將尿激酶受體固相化的盤上的融合蛋白質的結合量之ELISA分析而決定,扣除陰性對照(例如,因磷酸緩衝生理食鹽水(PBS))的值(背景值)而能夠求取。ELISA分析中,對尿激酶受體的融合蛋白質的結合量,能夠以酵素標記抗體而檢出。作為酵素標記抗體,能夠使用結合於融合蛋白質的抗體(例如,抗人類重鏈或輕鏈抗體),作為酵素,能夠使用例如,辣根過氧化物酶(HRP),作為基質,能夠使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺 (TMB)。
藉此,即使假設本發明的融合蛋白質漏出至血栓周圍,也不結合於周圍組織的尿激酶受體,抑制組織中的MMP酵素的產生,能夠防止組織傷害,藉此,認為能夠防止因結合於尿激酶受體導致的產生不期望的副作用。
本發明的融合蛋白質的改變體中,抗體或其抗原結合性片段部分結合於不溶性纖維蛋白。在一較佳態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體中,抗體或其抗原結合性片段部分特異性地結合於不溶性纖維蛋白。在此,「特異性地結合於不溶性纖維蛋白」是指,對於不溶性纖維蛋白結合,但是對於選擇自由纖維蛋白原、可溶性纖維蛋白、及纖維蛋白分解物所組成的群組的1種以上、較佳為全部,比對於不溶性纖維蛋白結合弱或不結合,特佳為不顯著地結合。
本發明中,結合於不溶性纖維蛋白的抗體為,相較於對於纖維蛋白原、對於不溶性纖維蛋白以更強的親和性結合的抗體(亦即,對於不溶性纖維蛋白,以比對於纖維蛋白原更低的解離常數K
D結合的抗體)。對於不溶性纖維蛋白,以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體可為例如,結合於由序列識別號8或9所記載的胺基酸序列所形成的胜肽的抗體 (參考WO2014/133093)。序列識別號8所記載的胺基酸序列對應於WO2014/133093的序列識別號1所記載的胺基酸序列,序列識別號9所記載的胺基酸序列對應於WO2014/133093的序列識別號2所記載的胺基酸序列。由序列識別號8或9所記載的胺基酸序列所形成的胜肽部分在纖維蛋白原中,不露出於蛋白質表面,僅在不溶性纖維蛋白中,於蛋白質表面能夠被抗體接近(access)地露出。因此,結合於由序列識別號8或9所記載的胺基酸序列所形成的胜肽的抗體,具有對於不溶性纖維蛋白的結合選擇性。
<抗體或其抗原結合性片段部分>
作為對於不溶性纖維蛋白、以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,能夠列舉不溶性纖維蛋白特異性抗體(例如,結合於不溶性纖維蛋白,實質上不結合於纖維蛋白原的抗體),能夠列舉例如,具有分別對應於選擇自由WO2014/133093所揭示的10-102抗體(含有具有序列識別號27~29分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號30~32分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)、34-105抗體(含有具有序列識別號33~35分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號36~38分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)、及Fib-0355抗體(含有具有序列識別號39~41分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號42~44分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)所組成的群組的抗體的重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3之CDR之抗體或其抗原結合性片段。
再者,作為對於不溶性纖維蛋白以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,能夠列舉例如,具有分別對應於選擇自由WO2018/203517所揭示的99抗體(含有具有序列識別號45~47分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號48~50分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)、1101抗體(含有具有序列識別號51~53分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號54~56分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)、及0211抗體(含有具有序列識別號57~59分別記載的重鏈CDR1~3之重鏈可變區與具有序列識別號60~62分別記載的輕鏈CDR1~3之輕鏈可變區)所組成的群組的抗體的重鏈CDR1~3及輕鏈CDR1~3的CDR的抗體或其抗原結合性片段。
作為對於不溶性纖維蛋白以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,進一步能夠列舉包含:
含有具有序列識別號10所記載的胺基酸序列的重鏈CDR1與具有序列識別號11所記載的胺基酸序列的重鏈CDR2與具有序列識別號12所記載的胺基酸序列的重鏈CDR3之重鏈可變區、及
含有具有序列識別號13所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR1與具有序列識別號14所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR2與具有序列識別號15所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR3之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合性片段。抗體可為人嵌合抗體或人源化抗體。根據本發明,亦提供具有上述重鏈可變區及輕鏈可變區之人源化抗體。
作為對於不溶性纖維蛋白以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,能夠列舉例如,包含:
具有序列識別號16所記載的胺基酸序列的胺基酸序列的重鏈可變區,及
具有序列識別號17所記載的胺基酸序列的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合性片段。抗體除了重鏈可變區之外,亦可更包含Fab片段內的重鏈恆定區或其一部份。抗體可為人嵌合抗體或人源化抗體。根據本發明,也提供具有上述重鏈可變區及輕鏈可變區的人源化抗體。
作為對於不溶性纖維蛋白以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,進一步能夠列舉包含:
含有具有序列識別號18所記載的胺基酸序列的重鏈CDR1與具有序列識別號19所記載的胺基酸序列的重鏈CDR2與具有序列識別號20所記載的胺基酸序列的重鏈CDR3之重鏈可變區,及
含有具有序列識別號21所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR1與具有序列識別號22所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR2與具有序列識別號23所記載的胺基酸序列的輕鏈CDR3之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合性片段。抗體可為人嵌合抗體或人源化抗體。根據本發明,也提供具有上述重鏈可變區及輕鏈可變區的人源化抗體。
作為對於不溶性纖維蛋白以比對於纖維蛋白原更強的親和性結合的抗體或其抗原結合性片段,能夠列舉例如,包含:
具有序列識別號24所記載的胺基酸序列的胺基酸序列的重鏈可變區,及
具有序列識別號25所記載的胺基酸序列的胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合性片段。抗體除了重鏈可變區之外,亦可更包含Fab片段內的重鏈恆定區或其一部份。抗體可為人嵌合抗體或人源化抗體。根據本發明,也提供具有上述重鏈可變區及輕鏈可變區的人源化抗體。
根據本發明,可提供與上述(3)所記載的抗體對於與不溶性纖維蛋白的結合進行競爭的抗體,較佳為相互進行競爭的抗體。在此,抗體較佳為人源化抗體。
根據本發明,可提供對於與上述(4)所記載的抗體與不溶性纖維蛋白的結合進行競爭的抗體,較佳為相互進行競爭的抗體。在此,抗體較佳為人源化抗體。
根據本發明,上述(1)所記載的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
根據本發明,上述(2)所記載的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
根據本發明,上述(3)所記載的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
根據本發明,上述(4)所記載的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
根據本發明,與上述(3)所記載的抗體對於與不溶性纖維蛋白的結合進行競爭的抗體,較佳為相互進行競爭的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
根據本發明,與上述(4)所記載的抗體對於與不溶性纖維蛋白的結合進行競爭的抗體,較佳為相互地進行競爭的抗體為人源化抗體,可為不溶性纖維蛋白特異性抗體。
本發明的抗體及其抗原結合性片段部分可結合於由序列識別號:8所記載的胺基酸序列形成的胜肽。在此本發明的抗體可為人源化抗體。
在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號1所記載的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號2所記載的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號3所記載的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號26的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號4所記載的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號5所記載的胺基酸序列。在一態樣中,本發明的融合蛋白質的改變體具有序列識別號63所記載的胺基酸序列。
<改變體的特性>
本發明的融合蛋白質的改變體具有選擇自由(i) 對於不溶性纖維蛋白的結合特異性;(ii) 對於不溶性纖維蛋白的結合親和性;(iii) 對於因胞漿素原活化抑制蛋白(PAI-1)導致的抑制的抵抗性;及(iv) 對血栓周圍組織的基質金屬蛋白酶(MMP)活性的誘導性的降低所組成的群組的任一者以上、較佳為2以上、更佳為3以上、進而較佳為全部的特性。藉此,能夠提供比至今為止的組織胞漿素原活化蛋白(tPA)療法更安全的有效的治療。再者,能夠提供對於利用尿激酶的血栓溶解療法新穎的技術的革新。特別是,顯示比WO2021/200922A揭示的融合蛋白質製造上顯著地優越性的同時,能夠達到副作用降低的效果。
<本發明的融合蛋白質的改變體的製造方法>
根據本發明,提供本發明的融合蛋白質的改變體的製造方法。本發明的融合蛋白質的改變體能夠由蛋白質產生細胞而生產。例如,於蛋白質產生細胞、暫時性地或是較佳為安定性地導入編碼上述改變體的基因,將蛋白質產生細胞以適合上述改變體的生產的條件下培養,藉此能夠從蛋白質產生細胞生產上述改變體。
因此,根據本發明,提供以能夠表現的方式含有編碼本發明的融合蛋白質的改變體的基因的蛋白質產生細胞。蛋白質產生細胞可包含於細胞冷凍保護液中,亦可為冷凍狀態。因此,根據本發明,提供包含蛋白質產生細胞的冷凍細胞庫(Freeze stock)、以及工作細胞庫(working cell bank)、主細胞庫(Master cell bank)、及研究細胞庫,其中蛋白質產生細胞以能夠表現的方式含有編碼本發明的融合蛋白質的改變體的基因。本發明的融合蛋白質的改變體特別是與調控序列以能夠作用的方式連結。藉此,成為能夠在蛋白質產生細胞中表現。
根據本發明,本發明的融合蛋白質能夠經由發明所屬技術領域具有通常知識者週知的方法而調製。例如,能夠使本發明的融合蛋白質表現於細胞(昆蟲細胞、鳥細胞、大腸桿菌、酵母菌、及哺乳動物細胞),較佳為哺乳動物細胞(例如,適合蛋白質表現的細胞,例如,中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)及293細胞以及此等的衍生的細胞等的人類細胞等的適合蛋白質表現的哺乳動物細胞)。作為蛋白質產生細胞,還能夠使用CHO細胞(例如,ExpiCHO
TM細胞、ExpiCHO-S
TM細胞、Free Style
TMCHO細胞等)。表現例如能夠使用表現載體(vector)而進行,其包含將在該表現細胞能夠驅動的啟動子(promoter)以能夠作用的方式連結的編碼本發明的融合蛋白質的核酸。融合蛋白質需要輕鏈的情況時,能夠使輕鏈於該表現細胞共表現。
本發明的融合蛋白質的改變體能夠成為對於在蛋白質產生細胞中、融合蛋白質的表現量減少的問題的解決方法。在以往類型的融合蛋白質,即使增加培養時間,融合蛋白質的產生量也不提升,甚至是增加片段的產生,相較於此,本發明的融合蛋白質的改變體,能夠增加培養時間而增大改變體的產生量。此外,在胞漿素存在下的胞漿素原分解活性與以往的融合蛋白質相同。
在一態樣中,提供一種方法,其為製造安定性優良的融合蛋白質改變體或包含該改變體的醫藥組成物的方法,包含於本發明的融合蛋白質導入F157E或F157D突變,藉此賦予相較於前述改變前的融合蛋白質更優良的安定性。在一態樣中,提供一種方法,其為提升融合蛋白質改變體的安定性的方法,包含在本發明的融合蛋白質導入F157E或F157D突變,藉此賦予相較於前述改變前的融合蛋白質更優良的安定性。
培養基能夠使用含血清培養基、低血清培養基(例如,血清濃度小於5%)、無血清培養基、無異種來源(Xeno-Free)培養基、或以化學定義的培養基。從雜質混入的觀點而言,能夠較佳使用無血清培養基、無異種來源培養基、或化學定義培養基。培養基可在培養中適當地更換。再者,從降低生產成本的觀點而言,能夠較佳使用無血清培養基、無異種來源培養基、或化學定義培養基等的無血清的培養基。由於本發明的融合蛋白質的改變體(含有F157的改變)、在血清不存在下時,抑制片段化,因此相較於非改變體具有製造上的優勢。
將融合蛋白質事先附加訊息胜肽,則能夠在細胞外產生融合蛋白質。因此,此種情況時,能夠回收細胞培養上清,從上清回收融合蛋白質。融合蛋白質能夠使用凝膠過濾、親和性純化等的發明所屬技術領域具有通常知識者週知的各種純化技術而進行純化。由於本發明的融合蛋白質的改變體(含有F157的改變)具有對於純化中的片段化的抵抗性,能夠使純化時的包含溫度條件及保存條件的條件管理成為容易。例如,以往的融合蛋白質需要在L-精胺酸存在下進行純化,但是上述改變體在L-精胺酸不存在下也能夠純化。再者,由於保存安定性高,製劑的組成也能夠彈性地設定。特別是,製劑不需包含L-精胺酸。
將所獲得的融合蛋白質的改變體固相化於盤底面,以胞漿素活性化後清洗胞漿素,能夠評價胞漿素原分解活性。例如,將經活性化的突變體對於經固相化的盤在胞漿素原存在下,與H-D-纈胺醯基-L-白胺醯基-L-離胺醯基-p-硝基苯胺二鹽酸鹽 (H-D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilide dihydrochloride)等的基質反應,進行伴隨著基質分解而呈色的p-硝基苯胺的比色定量,藉此能夠求取改變體的胞漿素原分解活性。
<組成物及醫藥製劑>
根據本發明,能夠提供包含本發明的融合蛋白質的改變體的組成物、或醫藥製劑。組成物及醫藥製劑除了本發明的融合蛋白質的改變體之外,亦可更包含藥學上許可的添加劑。作為添加劑,能夠列舉pH緩衝劑、等張劑、鹽、保存劑、及鎮痛劑等。醫藥製劑能夠調配為靜脈內投予用或動脈內投予用。在一態樣中,本發明的醫藥製劑可為經冷凍乾燥的醫藥製劑。在一態樣中,本發明提供包含經冷凍乾燥的醫藥製劑及注射用水的套組(亦即,事前調配(prior preparation)套組)。
醫藥製劑能夠用於溶解在體內形成的血栓。因此,醫藥製劑能夠使用於血栓症的處置。醫藥製劑也能夠使用於處置血栓引起的狀態或疾病。醫藥製劑亦可使用於適合纖維蛋白凝塊的溶解的治療法之狀態或疾病的處置。醫藥製劑也能夠使用於伴隨有血栓形成的腦血管疾病及心血管疾病的處置。醫藥製劑,能夠例如,處置腦血管疾病及心血管疾病中、伴隨血栓形成所產生的狀態或症狀,或藉此,處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀。處置包含治療性處置及預防性處置。治療性處置包含降低狀態、症狀的惡化的速度、降低惡化、停止惡化、或改善狀態、症狀,預防性處置包含,防止狀態、症狀的發病、或降低發病率。作為腦血管疾病,能夠列舉缺血性腦血管疾病。作為缺血性腦血管疾病,能夠列舉例如,腦梗塞及暫時性大腦缺血發作。腦梗塞是因為腦血栓或腦栓塞而產生。腦血栓是血栓阻塞腦血管的狀態,腦栓塞是腦以外的血管內所產生的血栓被運送到腦而阻塞腦的血管的狀態。作為心血管疾病,能夠列舉缺血性心臟病。作為缺血性心臟病,能夠列舉狹心症及心肌梗塞。醫藥製劑較佳使用在此等疾病的急性期。使用於急性期,是因為能夠避免因血栓、栓塞的形成導致的組織損傷。作為急性期,可為發病後1小時以內、2小時以內、3小時以內、4小時以內、4.5小時以內、5小時以內、6小時以內、12小時以內、或24小時以內等的急性期。例如,對於缺血性腦血管疾病,建議在發病起的4.5小時以內投予血栓溶解劑,對於缺血性心血管疾病,建議在發病起的6小時以內投予血栓溶解劑。本發明的醫藥製劑亦能夠同樣地使用。
根據本發明,本發明的融合蛋白質的改變體能夠溶解纖維蛋白凝塊。在一態樣中,纖維蛋白凝塊為血栓。
<顯像劑>
根據本發明,本發明的融合蛋白質的改變體亦可與顯像劑連結(包含共價鍵結)。改變體與顯像劑可經由連接子或不經由地直接連結。顯像劑與連結的改變體能夠顯影在生物體內的纖維蛋白凝塊(特別是血栓),例如,藉此能夠使用於觀察在生物體內的血栓。作為顯像劑能夠使用造影劑。造影劑可為核磁共振造影法(MRI)、電腦斷層造影(CT)、及正子斷層造影(PET)等的造影劑。因此,根據本發明,提供包含與顯像劑連結之本發明的融合蛋白質的改變體,用於使用於體內造影的製劑或組成物。
根據本發明,提供一種方法,其為在需要的對象中、處置血栓症的方法或溶解纖維蛋白凝塊的方法,包含對該對象投予治療上有效量的本發明的融合蛋白質的改變體。
根據本發明,提供一種醫藥製劑,其使用於在需要的對象中、處置血栓症的方法或溶解纖維蛋白凝塊的方法,包含治療上有效量的本發明的融合蛋白質的改變體。
根據本發明,提供一種本發明的融合蛋白質的改變體,其使用於在需要的對象中、處置血栓症的方法或溶解纖維蛋白凝塊的方法。
根據本發明,提供一種本發明的融合蛋白質的改變體用於製備用於在需要的對象中、處置血栓症的方法或溶解纖維蛋白凝塊的方法的醫藥之用途。
根據本發明,提供一種方法,其為在需要的對象中、處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀的方法,包含對該對象投予治療上有效量的本發明的融合蛋白質的改變體。
根據本發明,提供一種包含本發明的融合蛋白質的改變體之醫藥製劑,其使用於在需要的對象中、處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀的方法。
根據本發明,提供一種本發明的融合蛋白質的改變體,其使用於在需要的對象中、處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀的方法。
提供一種用於製造在需要的對象中,用於使用於處置腦血管疾病及心血管疾病的狀態或症狀的醫藥的製造之本發明的融合蛋白質的改變體的用途。
[實施例]
實施例1:溶解纖維蛋白凝塊的融合蛋白質的製備
WO2021/200922A中,合成包含顯示對不溶性纖維蛋白特異性結合性的抗體片段與前尿激酶的突變體之融合蛋白質(以下、稱為「AMU1114」)。AMU1114是將抗體的Fab區域與前尿激酶的突變體連結的融合蛋白質(重鏈)及抗體的輕鏈的複合體。
將AMU1114以中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)表現,則表現量在培養開始後的5~7天達到高峰,之後即使持續培養,AMU1114的表現量也不增加。更具體而言,如圖8A所示,AMU1114的產生量不增加,僅有輕鏈(L鏈)的回收量增加。
檢討培養條件,則如圖8A及8B所示的、以無血清培養基使AMU1114在上述CHO細胞表現,輕鏈的產量增加,AMU1114的產量減少,在20%胎牛血清(FBS)存在下於上述CHO細胞使AMU1114表現,則AMU1114的產量增加,輕鏈的產量減少。再者,從CHO細胞純化AMU1114時,必須在L-精胺酸存在下進行純化。純化後的AMU1114的回收量為25~35mg/L。
實施例2:融合蛋白質的改變體的製作
在本實施例,製造AMU1114的改變體。具體而言,對於AMU1114的重鏈的F396(對應於尿激酶的F157)、導入定點的(site specific)胺基酸取代的突變。胺基酸取代突變的導入,以編碼AMU1114的DNA為模板,藉由使用突變導入引子(primer)的PCR法進行。作為PCR酵素,使用PrimeStar HS DNA polymerase (Takara)。
對於組入至pcDNA3.4 (ThermFisher)的AMU1114以及各個PCR產物,遵照廠商步驟準則將XhoI (Takara)、NotI (Takara)反應2小時,進行1%瓊脂糖凝膠電泳後,使用FastGene Gel/PCR Extraction Kit (Nippon Genetics)進行純化。使用Competent High DH5α (toyobo)進行轉形(transformation),以LB培養基(50 μg/mL)盤培養16小時。從經轉形的大腸桿菌、使用FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics),萃取質體(plasmid),進行序列分析。藉此確認突變如目標般地被導入。
在CHO細胞表現AMU1114及各種突變體。具體而言,使用ExpiCHO Expression System (Thermo Fisher)、短暫性(transient)地表現AMU1114及各種突變體。7天的培養後,回收培養上清。於培養基中添加FBS成為20%。將短暫性表現的培養上清添加至經以PBS平衡化的CaptoL (Cytiva),以相同緩衝液清洗後,以100 mM 甘胺酸緩衝液pH3.0溶出,作為最終產物。
將各突變體以PBS調整為10 μg/mL,以100 μL/孔分注於96 孔盤,室溫靜置90分鐘,進行固相化。對於經固相化的盤,以300μL/孔分注1% BSA的TBS-T,室溫靜置60分鐘,將盤進行阻斷(blocking)。對於經阻斷的盤,以TBS-T清洗後,以150 μL/孔添加以PBS調整的5 μg/mL胞漿素原、15 μL/孔基質(TestTeamS PLG,Sekisui Medical)反應液,2小時中每5分鐘測量405 nm、505 nm的吸光度。
結果如圖1所示。如圖1所示,了解除了F157Y突變體,在全部的突變體中降低對於基質的反應性,在一些突變體(F157A、F157K、F157C、及F157S)中、大幅地降低對基質的反應性,還在一些突變體(F157I、F157G、F157D、及F157E)中、更大幅度地降低對基質的反應性。此事項能夠認為因為此等的突變體具有對於胞漿素的耐受性。
將各改變體以PBS調整為10 μg/mL,以100 μL/孔分注於96孔盤,室溫靜置90分鐘,進行固相化。對於經固相化的盤,以300μL/孔分注1% BSA的TBS-T,室溫靜置60分鐘,將盤進行阻斷。對於經阻斷的盤,以100 μL/孔添加調整為5 μg/mL的胞漿素溶液,37℃、使其反應60分鐘。以TBS-T清洗後,以150 μL/孔添加以PBS調整的5 μg/mL 胞漿素原、15 μL/孔基質(TestTeamS PLG Sekisui Medical)反應液,2小時中每5分鐘測量405 nm、505 nm的吸光度。
結果如圖2所示。如圖2所示,進行胞漿素處理的情況時,任一者的突變體顯示對基質的高反應性。特別是F157E及F157D突變體的活性與AMU1114相同。
將經純化的各F157的改變體以PBS調整為1 mg/mL,靜置於37℃,將0小時後(圖3A)、24小時後(圖3B)、120小時後(圖3C)的樣本以SDS-PAGE電泳確認。圖3A~3C中,各種突變體是以F157位置的取代後的胺基酸的單字母表記而表示。F157D突變體及F157E突變體顯示特別高的安定性。再者,F157E突變體及F157D突變體的產量為AMU1114的產量的3~5倍。
實施例3:關於對尿激酶受體的結合能
本實施例確認對人類尿激酶受體之AMU1114的結合性。由於確認到結合性,分別對於F157D突變體及F157E突變體進一步導入N22Y、N27S、H29R、W30R、及Q40E突變 (參照Miyake T, et al., J Biochem. 1988;104(4):643-647、Magdolen V, et al., Eur J Biochem. 1996;237(3):743-751、及Lin L, et al., J Biol Chem. 2010;285(14):10982-92)。
再者,經由定點突變導入法製作AMU1114突變體(N22G、K23G、Y24_I28del,F157E)。之後,將本突變體記載為AMU1114(Δ22-28,F157E)突變體。AMU1114(Δ22-28,F157E)突變體具有序列識別號63所記載的胺基酸序列。製作的突變體的胺基酸序列的多重比對(multiple alignment)顯示於圖9。產量在計算上為100mg/L。
作為尿激酶受體,使用具有序列識別號6所記載的胺基酸序列的人類尿激酶的突變體、及具有序列識別號7所記載的胺基酸序列的小鼠尿激酶受體。於各自的尿激酶的C端附加6×His標籤,進行親和性純化。
具體而言,對於pcDNA3.3(ThermFisher)及尿激酶受體的PCR產物,將EcoRI(Takara)、XhoI(Takara)遵照廠商步驟準則反應2小時,進行1%瓊脂糖凝膠電泳後,使用FastGene Gel/PCR Extraction Kit(Nippon Genetics)進行純化。使用Ligation High(takara) 30分鐘,使載體(pcDNA3.3)與插入體(insert)進行反應。使用Competent High DH5α(toyobo)進行轉形,將LB培養基(50 μg/mL)盤培養16小時。從經轉形的大腸桿菌使用FastGene Plasmid Mini Kit(Nippon Genetics)萃取質體,進行定序。使用ExpiCHO Expression System(Thermo Fisher)使尿激酶的突變體短暫性表現。培養進行12天回收培養上清。將短暫性表現的培養上清以50 mM Tris-HCl pH8.5、300 mM NaCl進行透析,添加於以相同緩衝液平衡化的Ni管柱(Cytiva),以相同緩衝液清洗後,以含有400 mM 咪唑(imidazole)的PBS溶出,作為最終產物。
進行改變體的純化。AMU1114(N22Y、N27S、H29R、W30R、Q40E、F157D)突變體、AMU1114(N22Y、N27S、H29R、W30R、Q40E、F157E)突變體、及AMU1114(Δ22-28,F157E)突變體,在無血清培養基中僅使用ExpiCHO Expression System(Thermo Fisher)使其短暫性表現。培養進行12天、回收培養上清。將短暫性表現的培養上清添加至經以PBS平衡化的CaptoL(Cytiva),以相同緩衝液清洗後,以100 mM甘胺酸緩衝液pH3.0溶出。將溶出的樣本以Superdex200pg (Cytiva)進行凝膠過濾純化,作為最終產物。
將各改變體以PBS調整為10 μg/mL,以100 μL/孔分注於96孔盤,室溫靜置90分鐘,進行固相化。對於經固相化的盤,以300μL/孔分注1% BSA的TBS-T,室溫靜置60分鐘,將盤進行阻斷。對於經阻斷的盤,以100 μL/孔添加調整為5 μg/mL的胞漿素溶液,37℃、使其反應60分鐘。以TBS-T清洗後,以150 μL/孔添加以PBS調整的5 μg/mL 胞漿素原、15 μL/孔基質(TestTeamS PLG Sekisui Medical)反應液,2小時中每5分鐘測量405 nm、505 nm的吸光度。
結果如圖4及10所示。如圖4及10所示,3個的突變體的任一者,在胞漿素存在下,顯示與AMU1114同等的反應性。
將人類及小鼠的尿激酶受體以PBS調整為1 μg/mL,以50 μL/孔分注於96孔盤,室溫靜置90分鐘,進行固相化。對於經固相化的盤,以300μL/孔分注含1% BSA的TBS-T,室溫靜置60分鐘,將盤進行阻斷。對於經阻斷的盤,將調整為1000 ng/mL、111.1 ng/mL、12.3 ng/mL的各樣本(突變體)以50 μL/孔添加,室溫使其反應60分鐘。以TBS-T清洗後,以50 μL/孔分注以含1% BSA的TBS-T稀釋1/50,000的HRP-共軛抗人類Kappa鏈(HRP-conjugated anti-human Kappa chain)抗體(Bethyl),室溫使其反應60分鐘。清洗後,以TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)呈色試劑反應15分鐘。以30 μL/孔的2N H
2SO
4停止反應,測定450 nm的吸光度。
結果如圖5所示。如圖5所示,初次明白AMU1114具有對於人類尿激酶受體的結合性。所以,試驗上述3個突變體的對人類尿激酶受體的結合性。如圖5及11所示,3個突變體喪失對人類尿激酶的突變體的結合性。再者,如圖11所示,與陰性對照之PBS相比即可明白,AMU1114(Δ22-28,F157E)突變體、不顯示與人類尿激酶受體的顯著地結合,也不顯示與小鼠尿激酶受體顯著地結合。並且製作具有F157E/D及W30R的AMU1114突變體,此突變體也極端地降低對人類尿激酶受體的結合性。
於C端附加His標籤的尿激酶以各包含5%、10%、20% FBS的ExpiCHO表現。將經培養12天之培養上清以50 mM Tris-HCl pH8.5, 300 mM NaCl透析,添加於以相同緩衝液平衡化的Ni管柱(Cytiva),以相同緩衝液清洗後,以包含400 mM 咪唑(imidazole)的PBS溶出。溶出的樣本以Superdex75pg(Cytiva)凝膠過濾,作為最終樣本。
結果如圖6A及6B所示。如圖6A及6B所示,將細胞培養在5%FBS存在下進行,則觀察到低分子量的uPA,將細胞培養在20FBS存在下進行則觀察到低分子量uPA的量的降低。因此,顯示在uPA表現時,細胞培養必須在FBS存在下進行。
將AMU1114以20%FBS存在下、或無血清條件下,同樣地以ExpiCHO表現。如同上述地純化AMU1114、進行電泳,在無血清下確認到各式各樣的片段的存在 (參照圖7A),而在20%FBS存在下則此等的片段的量大幅地減少(參照圖7A)。
接著,將AMU1114的改變體4種類同樣地在無血清條件下以ExpiCHO表現。如同上述地純化改變體、進行電泳,即使將此等的突變體在無血清條件下培養的情況時,也無片段化(圖7B參照)。
將AMU1114、及AMU1114改變體親合性純化後以凝膠過濾進行分析。結果如圖8A及8B所示。如圖8A及8B所示,在AMU1114中,對於AMU1114的峰,輕鏈的峰較強被辨認,相對於此,在AMU1114改變體中,抑制輕鏈的出現,AMU1114改變體的峰相對地增大。
由上述的結果,AMU1114的F157突變體,在胞漿素存在下顯示與AMU1114同等的生理活性,並且比AMU1114安定性高,由於游離輕鏈等的混入少而純度高,且生產量相較於AMU1114也高約3~5倍。
對於凝血酶(thrombin)血栓模式小鼠投予AMU1114(Δ22-28, F157E),與替奈普酶(Tenecteplase)投予群、及陰性對照群比對血栓溶解的程度。具體而言,將凝血酶600U/kg靜脈注射於Balb/c雌性小鼠,製作凝血酶血栓模式小鼠。靜脈注射30分鐘後,分別靜脈投予PBS(陰性對照)、替奈普酶(陽性對照)、及AMU1114(Δ22-28, F157E)。再過60分鐘後,在深麻醉下,從小鼠摘取肺,將血栓染色。染色是以標記抗不溶性纖維蛋白抗體(1101抗體)直接法進行。計算對應於血栓的訊號(咖啡色)的總面積。血栓溶解度越高,則總面積縮小。其結果,如圖12A及圖12B以及表1所示,陰性對照群中確認到極多數的血栓,相對於此,陽性對照群及AMU1114(Δ22-28, F157E)投予群則幾乎未找到血栓。
[表1]
序列表的內容
序列識別號1:AMU1114的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號2:AMU1114 F157D的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPRDKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號3:AMU1114 F157E的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPREKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號4:AMU1114 F157D,進一步修飾的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSYKYFSSIRRCNCPKKFGGEHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPRDKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號5:AMU1114 F157E,進一步修飾的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSYKYFSSIRRCNCPKKFGGEHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPREKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號6:前尿激酶的胺基酸序列
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLAL
序列識別號7:前尿激酶 K135G, K136G的胺基酸序列
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPRFKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLAL
序列識別號8:纖維蛋白原 Bbeta 231-246的胺基酸序列 CNIPVVSGKECEEIIR
序列識別號9:纖維蛋白原 gamma 232-246的胺基酸序列 KNWIQYKEGFGHLSP
序列識別號10:人源化1101 HCDR1的胺基酸序列 SYWMH
序列識別號11:人源化1101 HCDR2的胺基酸序列 AIYPGNSDTRYSPSFQG
序列識別號12:人源化1101 HCDR3的胺基酸序列 KAHYGNYGFAY
序列識別號13:人源化1101 LCDR1的胺基酸序列 RASQHINNWLA
序列識別號14:人源化1101 LCDR2的胺基酸序列 GATSLQS
序列識別號15:人源化1101 LCDR3的胺基酸序列 QQYWSTPLT
序列識別號16:人源化1101 VH的胺基酸序列
MGSTAILALLLAVLQGVCAEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
序列識別號17:人源化1101 VL的胺基酸序列
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHINNWLAWYQQKPGKAPKLLISGATSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列識別號18:人源化99 HCDR1的胺基酸序列 NYGMN
序列識別號19:人源化99 HCDR2的胺基酸序列 WINTKIGEPTYAQKFQG
序列識別號20:人源化99 HCDR3的胺基酸序列 LLDY
序列識別號21:人源化99 LCDR1的胺基酸序列 RASQSVLYSSNQKNYLA
序列識別號22:人源化99 LCDR2的胺基酸序列 WASSLQS
序列識別號23:人源化99 LCDR3的胺基酸序列 HQYLSSYT
序列識別號24:人源化99 VH的胺基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKIGEPTYAQKFQGRVTMTRDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLLDYWGQGTLVTVSS
序列識別號25:人源化99 VL的胺基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLIYWASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSYTFGQGTKVEIKR
序列識別號26:AMU1114 F157E/D,進一步修飾的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSYKYFSSIRRCNCPKKFGGEHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPRXKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
序列識別號27:10-102 HCDR1的胺基酸序列 FTNYGMN
序列識別號28:10-102 HCDR2的胺基酸序列 WINTYTGEATYA
序列識別號29:10-102 HCDR3的胺基酸序列 LMDY
序列識別號30:10-102 LCDR1的胺基酸序列 KASQDINKYIA
序列識別號31:10-102 LCDR2的胺基酸序列 YTSTLQP
序列識別號32:10-102 LCDR3的胺基酸序列 LQYDNLTW
序列識別號33:34-105 HCDR1的胺基酸序列 KSVSTSGYSY
序列識別號34:34-105 HCDR2的胺基酸序列 LVS
序列識別號35:34-105 HCDR3的胺基酸序列 QHIRELTR
序列識別號36:34-105 LCDR1的胺基酸序列 GFTFSSYA
序列識別號37:34-105 LCDR2的胺基酸序列 ISSGGTT
序列識別號38:34-105 LCDR3的胺基酸序列 VRGGTIGAY
序列識別號39:Fib-0355 HCDR1的胺基酸序列 QSVLYSSNQK
序列識別號40:Fib-0355 HCDR2的胺基酸序列 YWASTRES
序列識別號41:Fib-0355 HCDR3的胺基酸序列 YLSS
序列識別號42:Fib-0355 LCDR1的胺基酸序列 YTFTNYG
序列識別號43:Fib-0355 LCDR2的胺基酸序列 NTNTGE
序列識別號44:Fib-0355 LCDR3的胺基酸序列 RLLDY
序列識別號45:99 HCDR1的胺基酸序列 NYGMN
序列識別號46:99 HCDR2的胺基酸序列 WINTKIGEPTYAEEFKG
序列識別號47:99 HCDR3的胺基酸序列 LLDY
序列識別號48:99 LCDR1的胺基酸序列 RASESVDSYGNSFMH
序列識別號49:99 LCDR2的胺基酸序列 RASNLES
序列識別號50:99 LCDR3的胺基酸序列 QQSNEDPRT
序列識別號51:1101 HCDR1的胺基酸序列 SYWMH
序列識別號52:1101 HCDR2的胺基酸序列 AIYPGNSDTRNNQKFKG
序列識別號53:1101 HCDR3的胺基酸序列 KAHYGNYGFAY
序列識別號54:1101 LCDR1的胺基酸序列 KASDHINNWLA
序列識別號55:1101 LCDR2的胺基酸序列 GATSLET
序列識別號56:1101 LCDR3的胺基酸序列 QQYWSTPLT
序列識別號57:0211 HCDR1的胺基酸序列 SYAMS
序列識別號58:0211 HCDR2的胺基酸序列 AISSGGTTYYPDSVKG
序列識別號59:0211 HCDR3的胺基酸序列 GGTIGAYW
序列識別號60:0211 LCDR1的胺基酸序列 KSSQSVLYSSNQKNYLA
序列識別號61:0211 LCDR2的胺基酸序列 WASTRES
序列識別號62:0211 LCDR3的胺基酸序列 HQYLSSWT
序列識別號63:AMU1114 (Δ22-28, F157E)的胺基酸序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMHWVRQMPGKGLEWIGAIYPGNSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCTRKAHYGNYGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSGGGGSGGGGSGGSSSNELHQVPSNCDCLNGGTCVSGGHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGGGPSSPPEELKFQCGQKTLRPREKIIGGEFTTIENQPWFAAIYRRHRGGSVTYVCGGSLISPCWVISATHCFIDYPKKEDYIVYLGRSRLNSNTQGEMKFEVENLILHKDYSADTLAHHNDIALLKIRSKEGRCAQPSRTIQTICLPSMYNDPQFGTSCEITGFGKENSTDYLYPEQLKMTVVKLISHRECQQPHYYGSEVTTKMLCAADPQWKTDSCQGDSGGPLVCSLQGRMTLTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHTKEENGLALSAGGAS
[序列表]
[最終] 序列表PR15-9008WO.xml
無
[圖1]圖1顯示AMU1114改變體(特別是尿激酶部分的F157的改變體)的對基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖2]圖2顯示胞漿素處理後的AMU1114改變體(特別是尿激酶部分的F157的改變體)的對於基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖3A]圖3A為AMU1114改變體(特別是尿激酶部分的F157的改變體)的在37℃的PBS中培育0小時後的SDS-PAGE的泳動結果。
[圖3B]圖3B為AMU1114改變體(特別是尿激酶部分的F157的改變體)的在37℃的PBS中培育24小時後的SDS-PAGE的泳動結果。
[圖3C]圖3C為AMU1114改變體(特別是尿激酶部分的F157的改變體)的在37℃的PBS中培育120小時後的SDS-PAGE的泳動結果。
[圖4]圖4顯示胞漿素處理後的AMU1114改變體的對於基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖5]圖5顯示對於人類尿激酶受體或小鼠尿激酶受體之AMU1114改變體的對於基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖6A]圖6A顯示在各種濃度的胎牛血清(FBS)存在下,於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化之尿激酶的凝膠過濾層析圖。
[圖6B]圖6B顯示在各種濃度的胎牛血清(FBS)存在下,於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化的尿激酶的電泳結果。
[圖7A]圖7A顯示在20%FBS存在下或不存在下,於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化的AMU1114的電泳結果。
[圖7B]圖7B顯示在血清不存在下(無血清培養基中)於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化的AMU1114改變體的電泳結果。
[圖8A]圖8A顯示在血清不存在下(無血清培養基中),於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化的AMU1114的凝膠過濾層析圖。
[圖8B]圖8B顯示在血清不存在下(無血清培養基中),於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現、經純化的AMU1114改變體的凝膠過濾層析圖。
[圖9]圖9顯示AMU1114及其改變體的比對(alignment)。
[圖10]圖10顯示胞漿素處理後的AMU1114改變體的對於基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖11]圖11顯示對於人類尿激酶受體或小鼠尿激酶受體之AMU1114改變體的對於基質的反應性。縱軸顯示405nm的吸光度。
[圖12A]圖12A為接受PBS、AMU1114(Δ22-28, F157E)(0.08mg/kg體重或0.32mg/kg體重;分別記載為Amu0.08及Amu0.32)、或替奈普酶(0.05mg/kg體重或0.2mg/kg體重;分別記載為Tene0.05及Tene0.2)的投予之凝血酶血栓模式小鼠中的肺的組織染色影像。
[圖12B]圖12B為將對應於血栓的訊號總面積圖表化。
TW202405178A_112113105_SEQL.xml
Claims (13)
- 一種融合蛋白質,其為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,且前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質, 前述抗體或抗原結合性片段包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區, 對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第157位的苯丙胺酸之上述催化域的苯丙胺酸被取代為其他的胺基酸。
- 如請求項1所述之融合蛋白質,其中前述苯丙胺酸被取代為異白胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、或半胱胺酸。
- 如請求項1或2所述之融合蛋白質,其中前述苯丙胺酸被取代為麩胺酸、或天冬胺酸。
- 如請求項1~3中任一項所述之融合蛋白質,其對於選擇自由人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體所組成的群組的1種以上的尿激酶受體的結合能,比具有序列識別號1所記載之胺基酸序列之融合蛋白質更低。
- 如請求項1~4中任一項所述之融合蛋白質,其對於選擇自由人類尿激酶受體及小鼠尿激酶受體所組成的群組之的1種以上的尿激酶受體,不顯示顯著地結合。
- 如請求項1~3中任一項所述之融合蛋白質,其中前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為其他的胺基酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
- 如請求項1~4中任一項所述之融合蛋白質,其中前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,分別對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第22位的天冬醯胺酸、第27位的天冬醯胺酸、第29位的組胺酸、第30位的色胺酸、及第40位的麩醯胺酸之上述類EGF結構域的胺基酸,分別被取代為酪胺酸、絲胺酸、精胺酸、精胺酸、及麩胺酸,對人類尿激酶受體的結合能降低或喪失。
- 如請求項1~4中任一項所述之融合蛋白質,其中前述抗體或其抗原結合性片段部分與催化域部分之間,更包含具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第7位至第43位的胺基酸序列的胺基酸序列之類EGF結構域,對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的從第22位的天冬醯胺酸至第28位的異白胺酸為止的胺基酸之上述類EGF結構域的胺基酸缺失。
- 一種醫藥製劑,其包含如請求項1~8中任一項所述之融合蛋白質。
- 一種製造如請求項1~8中任一項所述之融合蛋白質的方法,包含: 培養具有能夠表現編碼前述融合蛋白質的核酸之蛋白質產生細胞,使融合蛋白質表現,及從獲得的培養物純化前述融合蛋白質。
- 如請求項10所述之方法,其中前述培養在無血清條件下或5%以下的血清存在下進行。
- 如請求項10或11所述之方法,其中純化在不存在L-精胺酸下進行。
- 一種製造安定性優良的融合蛋白質改變體或包含該改變體的醫藥組成物的方法,包含: 融合蛋白質為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體或其抗原結合性片段、及具有對應於序列識別號6或7所記載的前尿激酶的第156位至第411位的胺基酸序列的胺基酸序列的前尿激酶之催化域,且前述抗體或其抗原結合性片段與前述前尿激酶之催化域直接地或經由連接子連結之融合蛋白質, 前述抗體或抗原結合性片段為包含結合於不溶性纖維蛋白的抗體的重鏈可變區及輕鏈可變區之物, 於前述融合蛋白質導入F157E或F157D突變,藉此賦予比前述改變前的融合蛋白質優良的安定性。
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