JPH04503450A - 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 組換えハイブリッド免疫グロブリン分子および使用方法関連特許出願に関するク ロスリファレンス本願は、１９８６年１１月１２日に出願した米国特許出願番号 第９２９．５８１号の一部継続出願である１９８７年１１月１２日に出願したＰ ＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２９６８の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子の活性部分、特に一本鎖ウロキナーゼか らなる第２蛋白に結合したフィブリンに対して特異的な抗原結合部位を存する組 換えハイブリッド免疫グロブリン分子に関するものである。また、本発明は、こ れら新規なハイブリッド免疫グロブリン分子のクローニングおよび産生に関する ものでもある。さらに、本発明は、免疫診断的および免疫治療的方法においてこ れらハイブリッド免疫グロブリン分子を使用する方法に関するものでもある。

発明の背景 はとんどの心筋梗塞は、冠状動脈血栓症によって生じる（デウノドら（ＤｅＷｏ ｏｄ　ｅｔ　ａｌ、）、二ニー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン （Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、Ｍｅｄ、）、３０３　：　８９７　（１９８３乃。心筋 梗塞の原因となる冠状動脈血栓症は、血栓溶解剤によって溶解され得る。

これら血栓溶解剤は、プラスミノーゲンのフィブリン溶解酵素プラスミンへの転 換を活性化するプラスミノーゲン活性化因子である。

次に、プラスミンは、血栓中に存在するフィブリンを溶解するであろう。プラス ミノーゲン活性化因子によるこの治療は、副作用を伴わない。プラスミンは、非 選択的に作用し、したがって、血栓中のフィブリンを溶解するだけではなく、フ ィブリノーゲンおよび凝固因子をも攻撃し、しばしば、重篤な出血素因となる。

ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼ） 、および組織型プラスミ／−ゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、効果的に血栓を溶解 する公知のプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）である。これら活性化因子は 、心筋梗塞のような急性心臓血管疾病、発作、肺動脈塞栓症、深静脈血栓症、末 梢動脈閉塞、および他の静脈血栓症に関する治療について示されている。

研究によって、症状の始まりから最初の１時間以内にプラスミノーゲン活性化因 子を投与した場合に最適結果が得られることが分かっている。すなわち、迅速な 治療決定に関して必要なことは、完全な診断をよく妨害し、高い危険性の患者の 場合にプラスミノーゲン活性化因子が自己投与されるかまたはパラメディカルの 人々によって行われるかいずれかであることが要求される（ノベルら（Ｓｏｂｅ ｌ　ｅｔａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ）、多ヱ：　４２５８〜４２６２（１９８５））。

ある診断を伴わないかまたは親密な医療監督がない状態で投与されるこのような 薬剤は、できる限り効果的であり、かつ危険な副反応を生じないものであるべき である。しかしながら、プラスミンはフィブリノーゲン、凝固因子Ｖおよび■な らびにフィブリンを減成するので、現在利用可能なプラスミノーゲン活性化因子 、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、および組織プラスミノーゲン活性化因子 （ｔＰＡ）の投与は、出血の有意な影響を伴う。

血栓に対して血栓溶解剤の特異性を増加させるために、フィブリン−特異性抗体 にウロキナーゼを共有結合させると、フィブリン溶解力および特異性が顕著に強 化されることがわかった。ボードら（Ｂｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（ Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２ドア６５−７６７（１９８５）。

あろゆる抗体分子の１つの機能特徴は、抗原決定基への特異的結合である。ｉｎ 　ｖｉｖｏにおける抗体は、２価であり、かつ単一特異性であり、２つの同一抗 原結合部位を含む。抗体分子による抗原の特異的結合は、重および軽鎖の両方の 可変領域（Ｆａｂ）の抗体の構造によって決定される。

２重の特異性を有する抗体は、様々な特異性を有する抗体を、２つの軽鎖を一緒 に結合するジスルフィド架橋を選択的に開裂させることによって調製されてきた 。次いで、抗体半分子を中性ｐＨ下で結合させて、２重の特異性を有するハイブ リッド抗体を調製する。

ニソンホノフら（Ｎｉｓｏｎｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（ロンドン ）ａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・した 継続中の米国特許出願番号第８５１，５５４号参照。

二特異性抗体は、ハイブリドーマからも調製されてきた。抗体産生ハイブリドー マ細胞の融合による二特異性モノクローナル抗体の調製は、ミルスタイン・アン ド・キュエ０（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｃｕｅｌｌｏ）ネイチャー（ロンド ン）（Ｎ　ａｔｕｒｅ（Ｌ　ｏｄｏｎ））、３０５　：　５３７（１９８３）お よび国際出願ＰＣＴ出願公開ＷＯ３３１０３６７９に開示されている。

抗体は、組換えＤＮＡ技術によってクローンおよび産生されてきた。重および軽 鎖に関する遺伝子は、適切な宿主中に導入され、発現され、次いで、機能性抗体 分子中にこれら個々の鎖を再凝集していた（例えば、ムンロ（Ｍｕｎｒｏ）、ネ イチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３１２　：　５９７（１９８４）　；モリソン 、ニス・エル（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ　、　Ｌ　、　）、サイエンス可変領域 は、外来宿主においてクローンおよび発現され、それらの結合能力を維持する（ ムーア（Ｍｏｏｒｅ　ａｔ　ａｌ、）、欧州特許出願公開００８８９９４（１９ ８３年９月２１日に公開された乃。

キメラまたはハイブリッド抗体は、組換えＤＮＡ技術によっても調製されてきた 。オイ・アンド・モリソン（Ｏｉ　ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、バイオチク３ クス（Ｂ　ｉｏＴ　ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、４　：　２１４（１９８６）には、 キメラ抗体を産生ずるストラテジーが開示されている。第２１８頁〜第２２０頁 には、キメテコヒトＩｇＧ抗−Ｌｅｕ３抗体が開示されている。著者は、キメラ マウス：ヒト抗−ダンシル抗体が作られると述べている。この文献は、詳細に述 べることなく、Ｌｅｕ３結合特異性および抗−ダンシル結合特異性が単一の免疫 グロブリン分子中に一緒にクローンされることを示している。

モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９　：　 １２０２（＋９８５）の第１表には、可変軽または可変重鎮領域が非−Ｔ、配列 に結合して、融合蛋白を生じることができる。この文献は、融合蛋白に関する可 能な使用が３つあることを述べている。（１）検定において使用するために酵素 に抗体特異性を結合すること；（２）抗原カラムによって非−１ｇ蛋白を単離す ること：および（３）毒性薬物を特異的に導出すること。特定のキメラ免疫グロ ブ９ン分子に関しては、この文献には全く開示されていない。

ノイバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー　（Ｎ　ａ ｔｕｒｅ）、廷４　：　２６８（１９８５）には、重鎮が、ハブテン、４−ヒド ロキシ−３−ニトロフェニル−アセチルに関して特異的であるマウス可変領域に 融合されたヒト恒常部領域であるキメラ抗体が開示されている。

欧州特許出願第１２０，６９４号には、イー・コ゛す（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主細胞 において発現する免疫グロブリンの可変および恒常部領域の遺伝子工学が開示さ れている。該明細書第１０頁には、免疫グロブリン分子が恒常部ドメインの１つ に結合したもう１つのペプチド部分と一緒に宿主細胞によって合成され得ること が開示されている。このペプチド部分は、細胞毒性または酵素的のいずれかとし て開示されている。第１０頁には、免疫グロブリン分子が治療薬からもなり得る と開示されている。該明細書および実施例における説明には、４−ヒドロキシ− ３−二トロフェニルアセタール（ＮＰ）ハプテンにＰ合するモノクローナル抗体 から誘導されるラムダ様鎖の使用が開示されている。

欧州特許出願第１２５，０２３号は、キメラであるかまたは他の修飾された免疫 グロブリン分子を製造するための組換えＤＮＡ技術の使用に関するものである。

これら免疫グロブリン分子について第３頁〜第４頁に開示されている使用の１つ は、患者に、特異的な標的疾病組織に指向させる抗体を注入することによる全身 診断および治療の使用である。疾病の存在が抗体に適切な標識を結合させること によって測定され得るか、または疾病組織が抗体によって適切な薬物を運ぶこと によって攻撃され得る。該明細書には、“変性された抗体”として薬物の特異的 な導出を助けるために処理された抗体が開示されている。

国際出願ＰＣＴ出願公開ＷＯ３３１０３９７１は、抗体−酵素的活性毒素からな るハイブリッド蛋白に関するものである。

国際出願ＰＣＴ出願公開ＷＯ３３１０１２３３には、第５頁に、酵素の活性蛋白 からなり得る第２蛋白の一部分に結合した免疫グロブリン分子の可変領域を有す るキメラ抗体が開示されている。

ボウリアンら（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕ ｒｅ）、　３１２：　６４３（１９８４）では、ハブテントリニトロフェノール に関して特異的なマウス可変領域をコードしているＤＮＡセグメントが、ヒトミ ューおよび力、バ恒常部領域をコードしているセグメントに結合している免疫グ ロブリン遺伝子を構築した。これらのキメラ遺伝子は、機能性ＴＮＰ−結合キメ ラＩｇＭとして表された。

モリソンら（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディンゲス・オブ・ ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐ　ｒｏｃ。

Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８１　：　６８５１（１９８４）で は、いずれかのヒトカッパ軽鎖遺伝子のエキソンに結合した抗−ホスホリルコリ ン骨髄蛋白遺伝子の重鎖可変領域エキソンを利用するキメラ分子を生じた。該遺 伝子は、マウス骨髄細胞株中にトランスフェクトされ、抗原結合機能を有するキ メラマウス−ヒトＩｇＧを産生する形質転換細胞を生じる。

シャロンら（Ｓｈａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、不イチ（−−（Ｎ　ａｔｕｒｅ） 、３０９　：　６０４（１９８４）は、マウスカッパ軽鎖恒常部領域遺伝子と、 アゾフェニルアルソン酸塩に対して特異的なマウス軽鎖可変領域をコードしてい る遺伝子とを融合させた。この構築の結果、適切な骨髄細胞株中に導入される場 合、対応する■、−カノパボリベブチド鎖と二量体化したポリペプチド鎖となる 。Ｖ　Ｈｋａｐｐａ　Ｖ　ｔ、ｃ　ｋａｐｐａ分子はアゾフェニルアルソン酸塩 ハブテンに結合された。

ノイバーガーら（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、不イチ＋　（Ｎ　ａｔ ｕｒｅ）、旺２　：　６０４（１９８４）は、小球菌ヌクレアーゼの合成を特異 化する遺伝子にハブテン−特異性抗体の重鎮可変領域遺伝子を結合し、抗原結合 および酵素釣菌活性を有するバイブ肝、ド分子を得た。

ロビング（Ｒｏｂｂｉｎｓ）および共同研究者は、ウロキナーゼの触媒化ドメイ ンを有するプラスミノーゲン重鎖のフィブリン結合と共有結合している共有結合 ハイブリッドブスミノーゲン活性化因子を開示した（ロビングら（Ｒｏｂｂｉｎ ｓ　ｅｔ　ａｌ、）、バイオケミストリー（旦山とに直接結合しないがフィブリ ン特異性である５ｃｕＰＡの短い形態が開示されている。安定性を提供するため に、部位指向性突然変異体（不ルズ：）（Ｎｅｌｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャ ーナル・オブ・／＜イオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｎ、　Ｃｈ ｅｍ、　）、２６２　：　１０８５５−１０８６２（１９８７））、または５ｃ ｕＰＡのＬＭＷ形態とｔＰＡのフィブリン結合重鎖とを結合させる組換え分子を 生じることによってフィブリン親和性を直接授けること（ネルズら（Ｎｅｌｌｅ ｓ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ、　）、２６２　：　５６ｇ２−５６８９（１９８７））のいずれ かによってこの分子のフィブリン特異性をさらに改良する試みは、あてはずれで あった。

フィブリノーゲンに関連するフィブリンに対する高い親和性および特異性によっ て特徴付けふれ、フィブリン含有血栓の直接の環境下でのみプラスミノーゲンの 活性化因子を効果的にする選択的なプラスミノーゲン活性化因子を有することが 望まれるであろう。

発明の概要 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子の活性蛋白からなる第２蛋白、−重鎖ウ ロキナーゼに結合したフィブリンに対して特異的な抗原結合部位を有する組換え ノ・イブリ／ド免疫グロブリン分子に関するものである。本発明は、また、これ らの新規なノ＼イブｌルノド免疫グロブリン分子のクローニングおよび産生に関 するものでもある。

本発明は、さらに、免疫診断および免疫治療方法においてこれら組換えハイブリ ッド免疫グロブリン分子を使用する方法に関するものでもある。

本発明は、ハイブリッド免疫グロブリン分子をコードしている遺伝子配列、この ような遺伝子配列を含有しているクローニングおよび発現ベクター、このような ベクターによって形質転換された宿主、およびこのような宿主における基礎的な 遺伝子配列の発現によるこのようなハイブリッド分子の製造方法からなるもので もある。

本発明の特別な具体例は、フィブリン特異性抗体および一重鎖ウロキナーゼの活 性フラグメントからなる組換えハイブリッド免疫グロブリンに関するものである 。この組換えハイブリッド分子は、約１６０ｋＤの分子量を有しており、フィブ リンに結合し、そして−重鎖ウロキナーゼに対して固有の特性を持っている。

図面の説明 第１図・発現プラスミドｐＤ８ｃＨ２ＵＫ、抗体５９Ｄ８の重鎖およびＬ　ＭＷ 　ｓｃｕ　Ｐ　ＡをコードしているＤＮＡを含有するこのプラスミドの構築が示 される。暗号配列は、円の外側で標識化され、制限部位は円の内側であり、５９ Ｄ８のＣＨＩ、ヒンジおよびＣＨ２領域ならびにウロキナーゼのドメイン（ロー マ数字）が示される。

第２図：５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブｏ　７ト（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌ ｏｔ）。分子量標準、組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８（ＲＰ）、５９Ｄ８、および マウス腹水（これから組換え５ｃｕＰＡ　５９Ｄ８を精製した）を１０％５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲルによって電気泳動にかけた。Ａは、ゲルのクマシー染 色を示す。２つのゲルを電気泳動的にニトロセルロースに移動させ　ｒｘｓ（− 標識ヤギ抗−マウスＩｇＧと一緒にインキュベートし、オートラジオグラフィー を行った。Ｂはオートラジオグラムである。

３１ｊ３１１：２本鎖ウロキナーゼ、組換え５ｃｕＰ　Ａ　−５９Ｄ　８　（Ｌ ＭＷｓｃｕＰＡ　５９Ｄ８）およびＨＭＷ　ｓｃｕ　Ｐ　Ａのプラスミンによる 活性化。２本鎖ウロキナーゼ、組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８およびＨＭＷｓｃｕ ＰＡ（材料および方法において記載するような）の等価活性を、プラスミンと一 緒の予備インキュベーションの前および後で５−２４４４検定において比較した 。該反応は、５０％氷酢酸１００μｇの添加によって停止する。４０５　ｎｍの 吸光度を示す。各線（ｂａｒ）は、３つの試料の平均を表す。

第４図：同一分子における抗フィブゾン抗体および５ｃｕＰＡ活性を示す。多工 程ラジオイムノアッセイを使用して、単一分子中の抗体および５ｃｕＰＡドメイ ンの両方の存在を示した。フィブリンモノマーでプラスチックプレートを塗布し た。次いで、それらを組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８、ＬＭＷ−ＵＫと抗体５９Ｄ ８との開の化学的フンシュゲート体、抗体５９Ｄ８または５ｃｕＰＡのいずれか と一緒にインキュベートした。洗浄して非特異的結合を除去した後、ウェルを、 ５ｃｕＰＡおよび２重鎖ＵＫと結合する１２５−Ｔ−標識抗−ＵＫ抗体と一緒に インキュベートした。最終洗浄工程の後、結合数を測定し、示す。

鼻旦界、増強されたフィブリン溶解性。組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８．５ｃｕＰ Ａ、ＬＭＷ−ＵＫと抗体５９Ｄ８との間の化学的コンジニゲート体およびｔＪＫ のフィブリン溶解性を、フィブリンモノマーセファロース検定で比較した。各々 、２つの測定値の平均を表す。

発明の詳細な説明 本発明は、抗原結合および酵素活性の両方を有するハイブリッド免疫グロブリン 分子に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、プラスミノーゲン活性化 因子の活性部分、−重鎖ウロキナーゼからなる第２蛋白に結合したフィブリンに 対して特異的な抗原結合部位を有する組換えハイブリッド免疫グロブリン分子に 関するものである。本発明は、これら新規なハイブリッド免疫グロブリン分子の クローニングおよび産生に関するものでもある。

本明細書の全体を通して、“ハイブリッド免疫グロブリン分子”という用語は、 フィブリン特異性抗体の全部または一部およびプラスミノーゲン活性化因子、特 に−重鎖ウロキナーゼの全部または一部からなる組換えＤＮＡ技術によって産生 された単一分子を示すのに用いる。異種三機能性抗体、異種抗体、二重特異性抗 体、異種結紮抗体、二重抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｕｐｌｅｘ）、およびヘテ ロダイマーは、二重特異性、すなわち、１つの分子中に２つの抗体結合部位を有 する抗体にさらに詳細に関する全ての用語である。

本明細書で使用するフィブリン特異性は、フィブリンに対して生じる抗体に関す るものである。血液が血管から漏れる場合“に、血餅中、酵素反応の複雑なカス ケードがフィブリノーゲンをフィブリン、構造蛋白に変換する。フィブリノーゲ ン自体は、血漿蛋白の最少の可溶性である。３４０．ＯＯＯｋｄＭＷに関して、 八−アルファ、Ｂ−ベータおよびガンマと呼ばれる３組の非同−ポリベブチド鎖 から生じる２回対称（ｔｗｏ（ｏｌｄ　ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を何する。血栓の部 位で、凝集カスケードが活性化され、トロンビンを生じ、極性ペプチドを酵素的 に開裂しくＡ−アルファからフィブリノペプチドＡおよびＢ−ベータからフィブ リノペプチドＢ）、結果、フィブリンモノマー形成が生じる。非常に僅かしか溶 解しないフィブリンモノマーは、ゲルネットワーク（ｇｅｌ　ｎｅｔｗｏｒｋ） 中に同時に重合される。重合の後、フィブリンクロットは、共有分子開鎖ｅ−（ ｇ−グルタミル）リジン結合を導＜Ｘ］ＩＩａ因子によって安定化される。フィ ブリノーゲンおよびフィブリンは、それらの構造の９８％以上が同一であり、２ つの新しく暴露されたフィブリンアルファおよびベータ鎖のアミン末端において のみ異なる。これらのフィブリンアミノ末端のアミノ酸配列は公知である。トウ ーリットル、アール・エフ（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ。

Ｆ、）、プノトナム、エフ・ダブリ二（Ｐｕｔｎａｍ　Ｆ、Ｗ、）編の“フィブ リノーゲン・アンド・フィブリン（Ｆ　ｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ａｎｄ　Ｆ　１ｂ ｒｉｎ）”、ザ・プラズマ・プロテインズ：ストラクチャー・ファンクション・ アンド・ゼ不ティノク・コントロール（Ｔｈｅ　Ｐ　ｌａｓｍａ　Ｐ　ｒｏｔｅ ｉｎｓ　：巻、ニ二−ヨーク：アカデミノク・プレス、１９７５　；　１０９− １５６゜本発明で使用し得るフィブリンエピトープは、フィブリンベータ鎖のア ミノ末端、フィブリンアルファ鎖のアミン末端、カルホキ／末端からプラスミン 開裂部位までであるベータ（４３〜４９）アミノ酸配列、およびガンマ鎖架橋部 位を含む。

フィブリンに対する特異性を有する抗体はヒュイら（Ｈｕｉ　ｅｔ　ａｌ、）の サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２２　：　１１２９（１９８３）に開示さ れている。さらに一般譲渡された１９８６年１月３０日に出願された“フィブリ ン−スペシフィック・モノクローナル・アンチボディズ・ラッキング・フィブリ ノーゲン・クロスーリアクティビティ（Ｆ　１ｂｒｉｎ　−Ｓ　ｐｅ−ｃｉｆｉ ｃ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｌａｃｋｉｎｇ　Ｆ　ｉｂ ｒｉｎｏｇｅｎ　Ｃｒｏｓｓ　−Ｒｅａｃｔ　ｉｖｉ　ｔｙ）”に関する継続中 の米国出願番号第８２４．２２８号には、同一クイズの抗体の開示をみつけるこ とができる。一般譲渡された１９８６年４月１４日に出願された継続中の米国特 許出願番号第８５１，５１４号には、本質的にフィブリノーゲン交差反応性を持 っていないフィブリン特異性モノクローナル抗体も開示されている。フィブリン に対する特異性を有する抗体の他の例は、クドリイ（Ｃａｌ　Ｉｅｗａｅｒｔ） の“サイト・セレクティブ・プラスミノーゲン・アクティベーター・アンド・メ ソッド・オブ・メイキング・アンド・ユージング・セイム（Ｓ　ｉｔｅ　Ｓ　ｅ ｌｅｃｔｉｖｅ　Ｐ　ｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒａｎｄ　Ｍｅ ｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｍａｋｉｎｇ　ａｎｄ　Ｕｓｉｎｇ　Ｓ　ａｆｆｌｅ）″に関 する欧州特許出願筒１４６，０５０号、およびブンデセンら（Ｂｕｎｄｅｓｅｎ 　ｅｔ　ａｌ、）の“モノクローナル・アンチボディズ・クイズ・スペシフィン ティ・フォー・クロスリンクド・フィブリン・アンド・ゼア・ダイアグノスティ ック・ユージズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　５ ｐｅｃｉｆｉ−ｃｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　Ｆ　１ｂｒｉｎ　 ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｕｓｅｓ）″に関するオーストラ リア特許出願ＡＶ−Ａ−２５３８７／８４を含む。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を調製するに際し、無傷のフィブリン −特異性抗体は、クローン化され、ハイブリッド分子の一部分からなり得る。し かしながら、ハイブリッド免疫グロブリン分子の大きさを減少させ、抗原性を減 少させるために、フィブリンを認識して結合する抗体の領域だけを使用するのが 好ましい。

フィブリン−特異性抗体のこの領域をクローニングするには、抗体の構築および 機能の理解が必要である。すなわち、抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２ つの同一の重（Ｈ）鎖からなる四分割の免疫グロブリンである。各蛋白路は、２ つの主領域二Ｎ−末端可変（Ｖ）領域およびＣ−末端恒常部（Ｃ）領域からなる 。可変性軽（ＶＬ）および可変性型（Ｖ）Ｉ）鎖は、可変領域ドメインを形成す る。可変ドメインは、特定の抗原に対する認識および特異性を決定する。軽鎖の 恒常部類域ドメイン（ＣＬ）および重鎮の恒常部類域ドメイン（Ｃ，）は、免疫 応答を実施するのに責任のある因子機能を仲介する。抗体分子のヒンジ領域は、 該抗体のＦ。フラグメントにＦａｂフラグメントを接続する。

抗体の可変ドメイン、蛋白構築定義は、軽および重鎖のＶＬおよびＶＨ上セグメ ントらなる。６つの高変異性領域、軽鎖中に３つおよび重鎮中に３つを含有する 。遺伝子レベルにおいて、３つのエキソンは、特異的なＶＨを特異的にすること およびそのフレームワーク（ｆ　ｒａｍｅｔｖｏｒｋ）および高変異性領域を含 むことに関して責任があり、２つのエキソンはＶＬを特異化する。ＶＬおよびＶ Ｈの両方の最初の２つの高変異性領域は、各々、軽および重鎖のＶ遺伝子エキソ ンによって特異化される。軽鎖の３番目の高変異性領域は、２つのエキソン、Ｖ ＬおよびＪＬによって特異化される。重鎮の３番目の高変異性領域は、３つのエ キソンＶＨ，ＤおよびＪＨによって特異化される。

免疫グロブリン遺伝子発現は、Ｂリンパ球における体細胞組換えによるＶ遺伝子 のＣ遺伝子への結合を介して生じる。これらの遺伝子は、結合して、完全な免疫 グロブリンを形成する。次いで、再配列し、結合した遺伝子セグメントは、完全 な免疫グロブリンまたは軽および重可変鎖の抗原結合ドメインをコードする。

化学的および同一構造型特性によって特徴付けられる重鎮の５つの主なりラスが ある。これらの重鎮クラスは、ミュー、ガンマ、デルタ、アルファおよびイプシ ロンと称される。また、軽鎖の２つの主なりラス：カッパおよびラムダがある。

本発明において、フィブリンに関して特異的な抗体は、ノ＼イブリッド免疫グロ ブリン分子の一部分としてクローン化される。好ましくは、フィブリン抗体の可 変領域だけがクローン化される。可変軽もしくは可変重鎮のいずれか、または両 方は、ハイブリッド分子の一部分からなる。さらに、フィブリン−特異性抗体の ヒンジ領域がクローン化され得る。可変領域と結合したフィブリン特異性抗体の Ｆａｂ部分の恒常部ドメインもクローン化され得る。

好ましい具体例において、構築の抗体部分は、ちょうどＦｖ領領域免疫グロブリ ンの可変領域ドメインに減少される。抗体の完全な機能性抗原−結合フラグメン トは、可変ドメインを使用することによって構築され得る。したがって、分子の 小さい部分だけを発現させることが可能であり、機能的に活性であることができ る。例えば、スケラら（Ｓ　ｋｅｒｒａ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓ　ｃ ｉｅｎｃｅ）、２４０：１０１０３８−１０４１（１９８゜ ハイブリッド免疫グロブリン分子においてクローン化および使用されたフィブリ ン−特異性抗体の可変および恒常部領域は、哺乳動物源から誘導され得、好まし い供給源はヒトからである。他方、可変領域は哺乳動物源由来であり、恒常部領 域はヒト源由来である。

本発明において使用され得るプラスミノーゲン活性化因子は、ストレプトキナー ゼ、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子 を含む。プラスミノーゲンが活性化因子によってプラスミン、血漿の活性フィブ リン溶解酵素に変換される場合、その基質、フイブリノに対して顕著な親和性を 呈する。

したがって、“プラスミノーゲン活性化因子”という用語は、血栓溶解剤であり 、本明細書において、利用される任意の薬物を含むことを意味する。他の用語は 、フィブリン溶解を含む血栓の溶解に関する当技術分野において公知である。最 も一般的なプラスミノーゲン活性化因子は、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ 、プロウロキナーゼ（−重鎖ウロキナーゼ）、および組織型プラスミノーゲン活 性化因子であるが、本発明において、他のプラスミノーゲン活性化因子または血 栓溶解剤を使用し得る。

ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼは、プラスミノーゲン活性化因子の第１ 世代を構成する。ストレプトキナーゼ、細菌性蛋白は、最初に同定されたプラス ミノーゲン活性化因子であった。プラスミノーゲンとの１：１化学量論的複合物 が形成され、これによって、その活性形態、プラスミンに変換する。冠状動脈閉 塞症の４時間以内に投与すると、ストレプトキナーゼは、多くの任意の試験にお いて、心筋梗塞の後の死亡率を減少させることが分かった。エム・エル・シムー ンズら（Ｍ、　Ｌ、　Ｓ　ｉｍｏｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・ アメリカン・カリッジ・オブ・カージオロジ−（Ｊ　、　Ａ＋Ｉ１．　Ｃｏ１１ ゜Ｃａｒｄｉｏｌ、　）、７：７１７（１９８６）およびノ１−トマンら（Ｈａ ｒｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、）、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａｍ、　Ｈｅ ａｒｔ　Ｊ　、）、１１１：１０３０（１９８６）。しかしながら、前述したよ うに、この薬物の使用は、過剰のプラスミンの発生によって生じた顕著なフィブ リノーゲンの除去によつて不変的に行われる。

ウロキナーゼは、一つの特異的なＡｒｇ　５６０−Ｖａｌペプチド結合の制限さ れた蛋白分解によってプラスミノーゲンを活性化させる２本鎖トリプシン様セリ ンプロテアーゼである。バイオランドら（Ｖｉｏｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、２５１：３９０６−３９１２（１９７６）。ウロキナーゼによって得られた結 果は、小規模の臨床学的試験におけると同様であった。マテイら（Ｍａｔｈｅｙ 　ｅｔ　ａｌ、）、アメリカン・ジャーナル・オブ・カージオロジ−（Ａ　ｍ、 　Ｊ　、　Ｃａｒｄｉｏｌ、　）、５５：８７８（１９８５）。

プラスミノーゲン活性化因子の第２世代は、組織型プラスミノーゲン活性化因子 （ｔＰＡ）および−水路ウロキナーゼ様プラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕＰ Ａ）を含む。ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼと非類似的に、ｔＰＡおよ び５ｃｕＰＡは、フィブリン−選択性プラスミノーゲン活性化を呈する。ｔＰＡ の選択性は、分子上のフィブリン結合部位の存在によって誘導される。ｔＰＡは 、０．１６Ｍ＋７）Ｋ、を有するフィブリンを結合する：結合すると、そのプラ スミノーゲン活性化に関するに、Ｂは、８３Ｍから０．１８Ｍまで減少し、その ｋ　ｅａｔは、０．０７から０．２８秒−１まで増加し、結果、触媒化効率が約 １０００倍増加する。おそらく、５ｃｕＰＡはフィブリンに直接結合しないけれ ども、血漿プラスミノーゲンよりも非常に容ＪＡにフィブリン−結合プラスミノ ーゲンを活性化する。そのフィブリン選択性をｔＰＡのそれと比較する（コレン ら（Ｃｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）、スロンボウシス・アンド−ヘモスタシス（ Ｔ　ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、　）、遁：２７（１９８４））。

ｔＰＡおよび５ｃｕＰＡは、内皮および他の細胞がそれらを循環中に分泌するの で、天然のプラスミノーゲン活性化因子も考慮される。

ｔＰＡおよび５ｃｕＰＡの最初の研究は、培養された細胞株：ｔＰＡに関しては ボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞株および５ｃｕＰＡに関しては形質転換さ れたヒト腎臓細胞から精製された蛋白に関して導かれた。その後、両薬物は組換 えＤＮＡ法によって製造された。ペン二カら（Ｐｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、） 、ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、陳↓：２１４（１９８３）　：ホウムズら （Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）、バイオテクノロジー（Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）、；！、二９２３（１９８５）。

５ｃｕＰＡは、アミノ酸Ｌｙｓ１５８および１１ｅ１５９の間でプラスミンによ って開裂される。得られた高分子量の二本鎖ウロキナーゼは、５ｃｕＰＡの触媒 活性を有しているが、フィブリン選択性およびその一本鎖前駆体のプラスミノー ゲン活性化因子抑制因子Ｉに対する耐性を有しない。低分子量の二本鎖ウロキナ ーゼは、第１世代形態である。５ｃｕＰＡの充分な長さ、高分子量形態は、天然 のプラスミノーゲン活性化因子であり、第２世代ブラスミ／−ゲン活性化因子と して臨床的に研究されている形態である。

５ｃｕＰＡの軽鎖（アミノ末端）は、表皮成長因子様ドメインに加えて、５ｃｕ ＰＡがフィブリンを結合しないと、甲われないという事実を除いて、ｔＰＡのク リングルとかなり均質であることを示す一重鎖りリンゲル領域を含む。ｔＰＡと ５ｃｕＰＡを区別するもう１°っの特性は、プラスミノーゲン活性化因子抑制因 子■ならびに他のプラスミノーゲン活性化因子抑制因子による不可逆的抑制に対 する５ｃｕＰＡの耐性である。このために、ｔＰＡと非類似的に、５ｃｕＰＡは 、期間中、ヒト血漿中で安定である。例えば、プラスミノーゲン活性化因子抑制 因子■は５ｃｕＰＡに可逆的に結合する：　５ｃｕＰ　Ａがフィブリンおよびプ ラスミノーゲンと三成分複合物を形成する場合、プラスミノーゲン活性化因子抑 制因子Ｉが置換される。触媒化部位が不可逆的抑制に影響され易くなるのは、プ ラスミンが残基Ｌｙｓ１５８とＩ］ｅ１５９との間で５ｃｕＰＡを開裂し、高分 子量の二本鎖ウロキナーゼを形成した後になって初めてである。低分子量の二本 鎖ウロキナーゼは、Ｌｙｓｌ　３６−Ｌｙｓｌ　３７ペプチド結合の開裂によっ て誘導され、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子Ｉによって容易に抑制される 。

スタンプら（Ｓ　ｔｕｍｐ　ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナル・オプ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２６１：１７１２ ０（１９８６）には、残基ＧＩｕ１４３とＬｅｕ１４４との間での精製による蛋 白分解開裂から得られる５ｃｕＰＡの短縮形態が開示されている。５ｃｕＰＡは 、おそら（、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、この形態では存在しない。組換えＤＮＡ 法（ネルズら（Ｎｅｌｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２６２：１０８ ５５（１９８７））によって発現された低分子１ｓｃｕＰＡは、アミノ末端クリ ングルを含んでいない。

低分子量の二本鎖ウロキナーゼよりも１４アミノ酸だけ長いが、低分子量の５ｃ ｕＰＡは、天然のものと同一のフィブリン選択性を明示し、高分子量５ｃｕＰＡ は、フィブリン選択性における役割からクリングルを明らかに排除する。低分子 量（３２−ｋＤ）の５ｃｕＰＡは、天然（５４−ｋＤ）の５ｃｕＰＡのもう１つ の重要な特性−一すなわちそのプラスミノーゲン活性化因子抑制因子Ｉに対する 耐性も維持している。

本明細書において使用する場合、“５ｃｕＰＡ”という用語は、５ｃｕＰＡの高 分子量形態および５ｃｕＰＡの低分子量形態の両方を含むことを意味する。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を製造する方法において、無傷のプラ スミノーゲン活性化因子は、ハイブリッド分子の一部分としてクローン化および 発現され得る。さらに、ＬＭＷまたはＨＭＷ　５ｃｕＰＡのいずれかの活性部分 は、ハイブリッド分子の一部分としてクローン化および発現される。５ｅｕＰＡ 上の活性部位または触媒化部位は、ルーチンスクリーニングによって決定され得 る。

構築物のプラスミノーゲン活性化因子部分は、ヒト蛋白に関するＤＮＡ配列を含 み；抗体（または抗体フラグメント）のフレームワークは、代表的には天然のネ ズミである。構築物の抗原性を減少させるために、抗体または抗体フラグメント に修飾を行うことができる。

上記Ｆｖ領領域けをクローニングすることに加えて、抗体のネズミ構造的フレー ムワークのほとんどは、ヒトフレームワークと置換され得る。このマウス抗体ま たはその一部分の“ヒト化”は、複合物の抗原性を減少させるであろう。これら の修飾は、他の動物抗体についても行うことができる。

本発明のハイブリッド免疫グロブリン分子を得るための方法は、フィブリン−特 異性抗体およびプラスミノーゲン活性化因子のクローニングおよびこれらのＤＮ Ａ配列の一重鎖ハイブリッド分子への発現を必要とする。

ハイブリッド免疫グロブリン分子の製造に使用されるフィブリン−特異性抗体お よびプラスミノーゲン活性化因子のＤＮＡ配列は、種々の供給源から誘導され得 る。これらの供給源は、ゲノムＤＮＡ。

ｃＤＮＡ、合成りＮＡ、およびこれらの組換え体を含む。ゲノムＤＮＡは、自然 に生じるイントロンを含んでいても含まなくてもよい。

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから得られたＤＮＡは、種々の方法で得られる。所 望の配列をコードしている細胞を単離し、好都合には１つまたはそれ以上の制限 エンドヌクレアーゼによって、ゲノムＤＮＡをフラグメント化し、得られたフラ グメントを、フィブリン−特異性またはプラスミノーゲン活性化因子をコードし ているＤＮＡ配列の存在についてプローブを用いてクローン化およびスクリーン することができる。

フィブリン−特異性抗体の可変領域に関して、ＤＮＡをコードしている再配列重 鎖は、Ｖ、ＤおよびＪ領域を含み得る。ＤＮＡをコードしている再配列生殖細胞 系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）軽鎖は、■およびＪ領域を含み得る。所望のフィブリン −特異性ＤＮＡ配列結合部位を含むクローン化フィブリンを同定した後、このフ ラグメントを、さらに操作して、過剰のＤＮＡを除去し、１つまたは両方の末端 を修飾し、介在する配列（イントロン）の全てもしくは一部分またはそれに類す るものを除去することができる。

種々のフラグメントの結合は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端 （ｓｔａｇｇｅｒｅｄ−ｅｎｄｅｄ　ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端に供給する ための制限酵素消化、適当な付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）に埋める こと、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適 切なりガーゼによるライゲーションを用いて、慣用技術に従って行われる。

ｃＤＮＡに関して、ｃＤＮＡをクローン化し、得られたクローンを、所望の可変 または恒常部類域をフードしているｃＤＮＡに関して、適当なプローブを用いて スクリーンし得る。所望のクローンを単離した後、ｃＤＮＡを、実質的にゲノム ＤＮＡと同一の方法で操作し得る。しかしながら、ｃＤＮＡに関して、イントロ ンまたは介在配列が全くない。

また、フィブリン−特異性抗体の遺伝子およびプラスミノーゲン活性化因子の遺 伝子は、周知の方法に従って合成することができ、ハイブリッド免疫グロブリン 分子を製造するのに使用するためにクローン化することができる。

ハイブリッド免疫グロブリン分子を発現させるために、適当な宿主によって認識 された転写および翻訳シグナルが必要である。真核宿主は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで 培養することができる哺乳動物細胞、詳しくは白血球、さらに詳しくは骨髄細胞 、または他の形質転換されたもしくは腫瘍形成リンパ球、例えばＥＢＶ形質転換 細胞である。他方、細菌、真菌、例えば酵母、糸状菌類またはそれに類するもの のような非補乳動物細胞を使用し得る。

フィブリン−特異性可変領域をコードしているＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡ由来 のプロモーター領域に関連して得ることができる。

宿主細胞が可変領域に関連する転写調節および翻訳開始シグナルを認識する限り 、可変領域暗号配列の領域５°は保持され、転写および翻訳開始調節のために使 用され得る。

可変領域に隣接する非暗号領域５°は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング 配列、ＣＡＡＴ配列およびそれに類するもののような転写および翻訳の開始を含 むこれらの配列を含む。通常、５°−非−暗号配列は、少なくとも１５０　ｂｐ 、さらに通常には少なくとも２００ｂｐであり、通常には約２　ｋｂｐを越えず に、さらに通常には約１ｋｂｐを越えないであろう。

フィブリン特異性可変領域に対する非−暗号領域３′は、停止およびポリアデニ ル化のような、その転写停止調節配列に関して維持され得る。さらに、暗号領域 に対する非−暗号領域３°は、免疫グロブリン遺伝子中に重要なエンハンサ−を 含有する。すなわち、恒常部類域をコードしているＤＮＡ配列に天然に隣接する ３′−領域を維持することによって、転写停止シグナルが得られる。転写停止シ グナルは、発現宿主細胞において充分に機能的でなく、宿主細胞において機能的 である３′非翻訳領域は、非常に転写された蛋白の３′領域と置換され得る。こ の方法では、置換された３°領域に関する蛋白の選択は、製造に関して選択され た細胞システムに依存するであろう。さらに、商業的に実施できるまで製造レベ ルを増加させるための付加的方法は、当業者には公知であろう。

フィブリン−特異性抗体およびプラスミノーゲン活性化因子に関する構築物は、 −緒に結合して一重鎖ＤＮＡセグメントを形成するか、またはそれ自体によっで あるいはベクターと結合してセグメントを分離するように維持され得る。

構築物は、選択させる遺伝子と結合して形質転換によって細胞中に導入され得、 ここで、該構築物は宿主ゲノムに組み込まれるであろう。通常、構築物は、宿主 細胞によって認識される複製システムを有するベクターの一部分であろう。

本発明の分子の製造のための発現ビヒクルは、プラスミドまたは他のベクターを 含む。一般に、宿主細胞に適合する種から誘導されるレプリコンおよび制御配列 を含有しているこのようなベクターを宿主に関連して使用する。ベクターは、通 常、レブリフン部位ならびに形質転換細胞における表現型選択を提供することが できる特異性遺伝子を担持している。例えば、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、 ｐＢＲて容易に形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサ イクリン耐性に関する遺伝子を含有しており、形質転換細胞を同定する簡単な手 段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物のプラスミドは、それ 自体の蛋白の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含むか、 またはそれを含むように修飾されなければならない。組換えＤＮＡ構築において ほとんど一般的に使用されるこれらのプロモーターは、ベータラクタマーゼ、ラ クトースプロモーターシステム、ラムダファージプロモーターおよびトリプトフ ァンプロモーターシステムを含む。これらは、はとんど一般的に使用されるもの であるが、他の微生物プロモーターが見いだされ、これを使用し得る。

例えば、バクテリオファージラムダの左方同プロモーターの抑制下に、ハイブリ ッド免疫グロブリン分子に関する遺伝子構築は、バクテリオファージラムダの左 方向プロモーターの抑制下で行うことができる。抑制はラムダリプレッサーによ って加えられ、隣接する制限部位が知られている。

バイブＩル、ド免疫グロブリン分子の発現は、その非形質転換状態で微生物と均 質であり得る池の調節配列の抑制下で行うこともできる。例えば、イー・コリ（ Ｅ、ｃｏｌｉ）染色体ＤＮＡ依存ラクトースは、ラクトースまたは酵素ベーター ガラクトシダーゼを加工することによってラクトース利用性を仲介するｌａｃオ ペロンからなる。摩抑制因子は、バクテリオファージラムダｐｌａｃ５から得ら れ、これはイー・コ１バＥ　、　ｃｏｌ　ｉ）に関して感染しやすい。摩プロモ ーターーオペレーター／ステムは、ＩＰＴＧによって誘発され得る。

他のプロモーター／オペシーターンステムまたはその一部分も同様に使用し得る 。例えば、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカリホスファターゼ、トリプトフ ァン、キシロース、ｔａｘ、およびそれに類するものを使用し得る。

好ましい宿主は、組織培養物においてｉｌ　ｖｉｔｒｏで、または動物中でｉｎ 　ｖｉｖｏで増殖される哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、正しい折りたた みまたは正しい部位でのグリコジル化を含む免疫グロブリン蛋白分子への翻訳的 修飾の後に得られる。

宿主として有用である哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯもしくはＣＨＯ−Ｋｌのような 繊維芽細胞起源の細胞、またはハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧ１４もしくはミ ニｏ−７Ｐ　３Ｘ６３３ｇ８のようなリンパ球起源の細胞およびそれらの誘導体 を含む。好ましい哺乳動物宿主細胞は、Ｓ　Ｐ　２１０およびＪ　５５８Ｌを含 む。いくつかの細胞株は、ウロキナーゼを分泌し、培養された腎臓癌細胞（フェ ライボロら（Ｆ　ｅｒｒａｉｖｏｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナル・オブ＊ セルーラーーフイシオロジ−（Ｊ　、　Ｃｅｌ　］、　Ｐ　ｈｙｓｉｏｌ、　） 、１２１：３６３（１９８４乃および３Ｔ３細胞（ベリンら（Ｂｅｌｉｎ　ｅｔ 　ａｌ、）、ＥＭＢＯ（ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニ ゼーシコン）ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、３：１９０（１９８４））のような トランスフェクションに使用され得る。

哺乳動物宿主に関して、ハイブリッド免疫グロブリン分子の発現に関して、いく つかの可能なベクターシステムが利用可能である。

あるクラスのベクターは、ウシ乳頭腫ウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウ ィルスまたは５Ｖ４Ｑウイルスのような動物ウィルスから誘導される自律的に複 製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ因子を利用する。第２のクラスのベ クターは、宿主細胞染色体中への所望の遺伝子配列の組み込みに頼る。誘導され たＤ　Ｎ　Ａをそれらの染色体に安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含有 する宿主細胞を選択させる１またはそれ以上のマーカーを導入することによって も選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主、殺菌耐性、例えば抗体、または 銅のような重金属、またはそれに類するものに原栄養性を与える。選択可能なマ ーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合され得るか、また はコートランスフェク／コンによって同一の細胞中に導入され得る。追加の因子 は、−重鎖結合蛋白ｍＲＮＡの最適な合成に関して必要とされ得る。これらの因 子は、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンスおよび停止 シグナルを含む。このような因子と一体化されているｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ発現ベクタ ーは、オカヤマ、エイチ（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，）のモレキュラー・アンド・ セルーラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅｌ旦胆シ）、３：　２８０（１９１ １１３）に開示′されたものおよびその他のものを含む。

宿主の性質によって、広範に種々転写および翻訳調節配列が使用され得る。転写 および翻訳調節シグナルは、アデノウィルス、つ／乳頭腫ウィルス、７ミアン（ Ｓ　１ｍ１ａｎ）ウィルスまたはそれに類するもののようなウィルス性供給源か ら誘導され得、ここで、該調節シグナルは、高いレベルの発現を有する特定の遺 伝子と関連している。

他方、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどのような哺乳動物発現産生物由来の プロモーターを使用してもよい。発現または活性化させる転写開始調節／グナル を選択してもよく、遺伝子の発現は、転形させることができる。温度を変化させ ることによって発現を抑制もしくは開始することができるような温度感受性であ るか、または化学的調節、例えば代謝を受け易い調節シグナルが興味深い。

もう１つの好ましい宿主は酵母である。酵母は、グリコジル化を含む翻訳ペプチ ド修飾後に行うこともできるという実質的に優れた点を持っている。酵母中で所 望の蛋白の製造に利用され得る強いプ１：ｌ　％　−ター配列および高いコピー 数のプラスミドを利用する多くの組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は 、クローン化哺乳動物遺伝子産生物上のリーダー配列を認識し、ペプチドベアリ ングリ−ダー配列（すなわち、プレーペプチド）を分泌する。

グルコースが豊富な培地中で酵母を増殖すると多量に産生される解糖性酵素をフ ードしている活性に発現された遺伝子由来のプロモーターおよび停止因子を一体 化している一連の酵母遺伝子発現システムを利用することができる。公知の解糖 遺伝子は、非常に効果的な転写抑制／グナルも提供する。例えば、ホスホグリセ リン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターおよび停止シグナルを利用することができ る。

構築物を含有しているベクターまたはＤＮＡ配列を発現に関して調製した後、Ｄ ＮＡ構築物を適当な宿主中に導入し得る。プロトプラスト融合法、リン酸カルシ ウム−沈降法、電気泳動法または他の慣用技術のような種々の技術を用い得る。

融合の後、細胞は、選択培地中で増殖され、ここで非形質転換細胞は殺され、Ｄ ＮＡ構築物によって形質転換された細胞だけが残る。遺伝子の発現の結果、アッ センブリーになり、ハイブリッド免疫グロブリン分子を形成する。

宿主細胞は、はとんど、細胞、特に染色体またはリンパ球細胞を不滅にさせるで あろう。これらの細胞は、培養フラスコ中において、適当な栄養培地中で増殖さ れるか、あるいはン不ルシエニノク宿主（ｓｙｎｅｒｇｅｎｉｃ　ｈｏｓｔ）、 例えばマウスもしくはラット、または免疫欠乏宿主もしくは宿主部位、例えばヌ ードマウスもしくはハムスター嚢中に注射する。特に、該細胞を腹水の製造のた めの腹腔中に導入し、キメラレセプターを回収し得る。他方、該細胞を皮下注射 し、宿主の血液かろ抗体を回収し得る。ハイブリドーマ細胞と同様の方法で、該 細胞を使用し得る。ダイアモンドら（Ｄｉａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）、ン（Ｍ ｃＫｅａｒｎ）およびベクトール（Ｂ　ｅｃｈｔｏｌ）　（編集）、モノクロー ナル・アンチボディス゛：ハイブリドーマス′−ア・二ニー・ディメンジョブレ ナム、１９８０参照。これらは、本明細書に資料として引用する。

ハイブリッド免疫グロブリン分子は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、親和性 クロマトグラフィー、電気泳動、またはそれに類するもののような慣用条件に従 って、単離および精製され得る。好ましい方法は、ハイブリ、ド分子を選択的に 単離するためのフィブリンベータ鎖のアミノ末端へブタペプチド（抗フィブリン に結合）またはベンズアミジン（ブラスミ／−ケン活性化因子触媒化部位に結合 ）のいずれかによる親和性クロマトグラフィーである。

本発明は、ハイブリッド免疫グロブリン分子を用いる免疫治療および免疫診断の ための方法を提供するものでもある。免疫治療および免疫診断用途において、ハ イブリッド免疫グロブリン分子を患者に投与し、ハイブリッド分子のフィブリン −特異性結合部位を介して血栓の部位で局在化させる。ハイブリッド分子のプラ スミノーゲン活性化因子部分の酵素活性によって血栓を溶解する。当業者によっ て明らかであるように、フィブリン特異性−ブラスミノ−ケン活性化因子ハイブ リッド分子の特異性は、血栓に選択的に付着して溶解し、出血のような重篤な副 作用の危険を減少する。

を含む免疫診断用途においても使用され得る。この用途において、ハイブリッド 分子は、放射性核種を使用して検出可能に襟識する。

放射性核種は、与えられた装置のタイプに関して検出可能である崩壊のタイプの ものなければなるない。また、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断に関する放射性核種は、最大 摂取時に検出可能であるほど充分に長いが、診断の後に望ましくない放射線を患 者に残さないほど充分に短い半減期を有する。蛋白への、したがってハイブリッ ド分子への放射性核種の結合は、当業者に公知であり、しばしば、中間の官能基 を用いて直接的にまたは間接的に行われる。ｉｎ　ｖｉｖｏ診断のためにしよう し得る放射性同位元素の例は、”Ｔ　ｃ、１２３■、１３１　■、ＩＩＪｎ、９ ７Ｒｕ、　”Ｃｕ、　”Ｇａ、　”Ａｓ、５ａＺｒおよび”’ＴＩである。

本発明の方法において、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断の目的のための常磁性同位元素も使 用され得る。磁気共鳴エネルギー技術において使用するのに特に有用である元素 の例は、’　”’　Ｇ　ｄｓ　”Ｍ　１％　’　＠”　Ｄ　ｙ　％　”　Ｃｒお よび５８Ｆｅである。

また、ハイブリッド免疫グロブリン分子は医薬的に許容される担体を有する医薬 組成物からなる。これらの担体は当業者に周知であり、食塩水および緩衝化媒質 を含む水溶液または溶媒エマルションまたは懸濁液を含み得る。例えば、レミン トンズ・ファーマシニーティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）（第１６版、１９８０）に開 示されているような医薬技術。

ハイブソノド免疫グロブリン分子の投与に関する投与範囲は、血栓の存在を検出 するのに充分に大きいものである。投与量は、発疹またはアナフィラキ／−ショ ックのような過敏症反応の如き不利な副作用を生じるほど大きくするべきではな い。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性および疾病の程度によって変化す るであろう。

計数器指標は、過敏症および他の変化するものを含むことができ、個々の医師に よって調節され得る。投与量は、体重１に９あたり０゜０１ｍ９〜５００ｔ９、 好ましくは０．０　Ｉｎ　〜２００ｘ９の範囲であり得る。ハイブリッド免疫グ ロブリン分子は、注射または時間をかけた漸次的潅流によって非経口投与され得 る。それらは、皮下、腹腔内、筋肉内または経皮的にも投与され得る。

本発明を一般的に記載したが、同じものが説明だけのために本明細書に含まれる 特別な例に関する資料によってさらに容易に理解されるであろうし、他に特記し ない限り制限するものではない。

実施例 ５９Ｄ８の重鎮および一重鎖つロ牛ナーゼ様ブラスミ／−ゲン活性化因子（ｓｃ ｕＰＡ）の低分子量形態をコードしている発現プラスミド、ｐＤ８’ＣＨ２ＵＫ を設計およびクローン化した。得られたハイブリッドプラスミド活性化因子（組 換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８）は、約１６０ｋＤの分子量を有しており、フィブリ ンに結合し、−重鎮ウロキナーゼに対して独特の性質を持っている（Ｓ−２４４ ４およびＳ−２２５１検定において試験したとおり）。組換え５ｃｕＰ　Ａ　５ ９Ｄ８は、フィブリンモノマーおよび抗−ウロキナーゼモノクローナル抗体の両 方を結合しており、同一の精製された分子上に画部分の存在を同時にあいまいに 示す。フィブリン溶解に関する検定において５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８を天然５ｃｕ ＰＡと比較すると、約５００倍以上の効力がある。これは、抗フィブリンモノク ローナル抗体に二本鎖ウロキナーゼを化学的に結合させることによって得られる 効力の１００倍増加に匹敵し、予想された効果よりもかなり大きく示され、二本 鎖、ＬＭＷウロキナーゼ（アポキナーゼ）をアボット・ラボラトリーズ（Ａ　ｂ ｂｏｔ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。高分子量（ＨＭＷ）およ び低分子ｉｔ　（Ｌ　ＭＷ）ｓｃｕ　Ｐ　Ａは、ドクター・ディザイヤー・コレ ン（Ｄｒ、　Ｄｅｓｉｒｅ　Ｃｏ１１ｅｎ）の好意の贈り物であった。ピアス・ ケミカル（Ｐ　１ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から３−（２−ピリジルジチオ ）プロパン酸Ｎ−スクシンイミジ／）（ＳＰＤＰ）および２−イミノチオランを 得、ファルマ／ア・ビー−エル・バイオケミカルズ（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ −Ｌ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からセファ０−ス（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ ）　４　Ｂ　−ＣＬを得た。＋ｔｓｌ−標識フィブリノーゲンは、アマ−ジャム （Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ）から入手し、血漿は地方の血液銀行から入手した。色素 基質Ｈ−Ｄ〜インロイシル−し一ポリーＬ−アルギニンーｐ−ニトロアニリド・ 二塩酸塩（Ｓ−２２８８）、Ｌ−ピログルタミル−グリシル−し−アルギニン− ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２４４）、およびＨ−Ｄ−バリル−し−ロイシル− し−リシン−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩（Ｓ−２２５１）は、ヘレナ・ラボ ラトリーズ（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。ヒト 胎盤因子Ｘ■は、グリーン・クロス（ＧｒｅｅｎＣｒｏｓｓ）（日本国大阪）か ら入手し、高速蛋白液体クロマトグラフィー用スペロース（Ｓ　ｕｐｅｒｏｓｅ ）　１　’２樹脂は、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手した。Ｌ− グルタミン、ゲンタマイシンおよびウシ胎児血清を含有するダルベツコ最小必要 培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）は、ギブコ・ラボラトリーズ（Ｇ　１ｂｃｏ　Ｌ　ａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、二ニートリトーマ（Ｎ　ｕｔｒｉｄｏｍａ ）　−Ｎ　Ｓ　（血清不含培地）は、ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ａ）から入手した。他の全ての化学物質はシグマ（ Ｓ　ｉｇｍａ）から入手した。

レム１バＬ　ａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（ロンドン）（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ ｄｏｎ））、マン−・ブリリアント・ブルーＲを用いて、または放射性標識した 場合は一７０’Ｃで２４〜７２時間、オートラジオグラフィーによって肉眼で観 察した。

５９Ｄ８Ｈ鎖遺伝子のクローニング クワ−ターマウスら（Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル壷 オブ曹イムノロジー（Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　）、１２８：２６８７−２ ６９０（１９８７）に従前に開示されているとおり、５９Ｄ８ハイブリトーマ細 胞から高分子量ゲノムＤＮＡを作成した。５９Ｄ８ハイブリド一マ株に対して特 異的な配列された重鎮免疫グロブリン遺伝子を同定するために、ＥｃｏＲｌ−１ 肖化ゲノムＤＮＡおよび１．７−キロベース（ｋｂ）　Ｅｃｏ　Ｒ１／Ｐｓｔｌ ゲノム結合領域プローブを用いて、従前の開示のとおり、サザーンブロノト分析 を行った（サザーン、イー・エム（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ　。

Ｍ、）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏｌ。

合相手または生殖細胞系Ｂａ１ｂ／ＣＤＮ、Ａ中に見いだせなかったという点で 同一であった。結果、ゲノムＤＮＡＩＱをＥｃｏＲｌで消化し、調製用アガロー スゲル上でサイズ分別した。サザーン、イー（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ　、　 ）、メリンス・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅ　ｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ）、編集：つ、アール（Ｗｕ、Ｒ，）（アカデミツク・プレス、ニュー ヨーク）第６８巻、第１５２頁〜第１７６頁。結合領域プローブへのハイブリダ イゼーションによって、２つの再配列フラグメントの各々を含有している画分を 同定した。これらの画分を濃縮し、ラムダｇｔｌｏにライゲートした。構築され た２つのサブゲノムライブラリーを結合領域プローブでスクリーンし、各ライブ ラリーからいくつかの有効なりローンを単離した。（マニアテイスら（Ｍａｎｉ ａｔｉｓｅｔａｌ、）、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ Ｉｏｎｉｎｇ）、１９８２（コールド・スプリング・ハーバ−１二ニーヨーク） ）。５９Ｄ８抗原結合部位をコードしている再配列フラグメントを含有するクロ ーンの選択は、５９Ｄ８　Ｈ鎖ｍＲＮＡの配列に基づいて構築された２０−塩基 対オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって行った。ＲＮＡ単離 および配列、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるオリゴヌクレオチドの３！Ｐ 標識、ならびにハイブリダイゼーションは、従前に開示された技術に従って行っ た。（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・ク ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ０４（１９８５）　；サッグスら（Ｓ　ｕｇｇ ｓ　ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシズ・ニーニスニー（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔ’　１．　Ａ　ｃ ａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）、７８：６６１３−６６１７（１９８１） ）。

フィブリン−特異性抗体／５ｃｕＰＡ遺伝子構築物可変および結合領域を含有し ているクローン化制限フラグメントならびに５９Ｄ８遺伝子のエンノーンサー配 列を、正しい配向で、マウスガンマ２ＢＨ鎖恒常部領域配列のプラスミド５゛に 挿入した。

恒常部領域配列を含有するこのブスミド（ＰＳＶ　ＧＴＰ／ガンマ２Ｂ）は、ｐ Ｂ　Ｒ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子およびＳＶ４０ウィルスプロモーター の抑制下でのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子を含 有する。これは、ドクター・リチャード・二一ア（Ｄｒ、　Ｒ１ｃｈａｒｄ　Ｎ ｅｅｒ）からの贈り物として得た。この構築物を、アンピシソン耐性遺伝子を介 してイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１中で増殖し、真核生物におけるＧ ＰＴ遺伝子の発現キサンチン、ヒボキサンチン、およびミコフェノリン酸の存在 下で選択された。次いで、重鎮恒常部類域のカルボキシ末端をコードしている配 列のバルクを除去した（抗体ゲノム重鎖の最小のアミノ酸１〜２３６を用いて） 。５ｃｕＰＡのＬＭＷ形態をコードしているｓｃｕ　ＰＡのアミノ酸１４４〜４ １１をコードしているＤ　Ｎ　Ａフラグメントと置換した。重鎮恒常部領域遺伝 子のいずれか１つからの第３エキソンを５ｃｕＰＡ遺伝子に“イン・フレーム（ ｉｌｌ　ｆｒａｍｅ）”結合し、その結果、通常のアミノ酸配列を産生じ、複合 蛋白を得た。この最終構築物を、電気泳動を介して、通常の重鎮の産生を停止し た適切な５９Ｄ８ハイブリドーマ変形物にトランスフェクトした。これらのトラ ンスフェクトントは、トランケイトされた重鎖の最終末端にプラスミノーゲン活 性化因子部分を有する、フィブリン特異性を有する抗体分子を製造する。

モノクローナル抗体および消失変異体（ｌｏｓｓ　ｖａｒｉａｎｔｓ）の選択（ １９８３）において従前に開示されたとおり、フィブリンベータ鎖のアミノ末端 配列に基づく合成へブタペプチドによる免疫化によって、フィブリン特異性モノ クローナル抗体５９Ｄ８を生起させる。完全培地：４．５ｘ９／ｘｃグルコース 、１２％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、５０９／１１（ｌ硫酸ゲンタマイシン、およ び０．６ｍ９／ｘＱＬ、−グルタミンを含有するＤＭＥＭ中に、ハイブリドーマ 細胞および消失変異体を維持した。重鎮消失変異体の選択のために、軟質アガロ ース中で細胞を増殖させた。完全培地に０．２％アガロースおよびさらなる８％ ＦＣ３を加えたもの５１を組織培養皿（６０ｘｍ）に添加し、室温で３〜５分間 固化させた。鎖消失のために選択される細胞（１〜２×１０３）をアガロースの 上に重ねた。細胞のクラスターを形成するまで（２〜４日）、６％ＣＯ，中、３ ７℃で、該プレートをインキュベートした。重鎮消失変異体を検出するために、 細胞クラスターに、０゜２％アガロースおよび５〜１０％ウサギもしくはヤギ抗 マウス重鎮を有する完全培地を含有している抗血清溶液１　、０　ｍ１２を塗っ た。重鎮を分泌する細胞クラスターは、沈降素ハロ（ｐｒｅｃｉｐｉｔｏｎ　ｈ ａｌｏ）を発生する。キャピラリーピペットによって軟質アガロースから沈降素 ハロを持っていないクラスターを拾い揚げ、次いで、さらなる８％ＦＣ３を有す る完全培地を含有する９６ウエルプレート中に運搬した。エンザイムリンクドイ ムノアブソルベントシアソセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスターンブノテイング によって、重および軽鎖の存在に関して、個々のサブクローンを検査した。

組換え蛋白の構築および発現 フィブリン特異性モノクローナル抗体５９Ｄ８およびプラスミノーゲン活性化因 子としてのＬ　ＭＷ　ｓｃｕ　Ｐ　Ａからなる組換え免疫グロブリンを構築し、 発現させた。ｕＰＡのゲノムラムダファージクローンは、ドクター・エフ・ブラ シ（Ｄ　ｒ、　Ｆ　、　Ｂ　１ａｓｉ）によって親切に提供された（リッシオ（ Ｒｉｃｃｉｏ）、グリマルデイ（Ｇ　ｒｉｍａｌｄｉ）、フエルデ（Ｖｅｒｄｅ ）、セバスチオ（Ｓ　ｅｂａｓｔ　ｉｏ）、ボースト（Ｂ　ｏａｓｔ）、ブラシ （Ｂ　１ａｓｉ）　；ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、１３：２７５９（１９８５））。このクローンか ら単離されたＥｃ。

Ｒ，フラグメントをｐＧ　ｅｍ中にライゲートして、Ｌ　ＭＷ　ｓｃｕ　Ｐ　、 Ａをコードしている配列を再構築した。合成オリゴヌクレオチドを用いて、該配 列の５プライム部分を再構築し、適切な制限部位を得た。この配列を担持してい るフラグメント、Ｘ　ｈｏｌ／　Ｓ　ｏｌは、ｐＧＥＭによって影響され、発現 プラスミドｐＳＵＤ８ｔβ中でｔＰＡ（Ｂ）ｃＤＮＡ配列と交換した。その結果 、ＬＭＷ　５ｃｕＰＡと同一のペプチド（ｕＰＡアミノ酸］ｅｕ１４４−→］ｅ ｕ４１１）は、免疫グロブリン蛋白のヒンジ領域でインフレーム結合されるであ ろう。固有のＸｈｏＩ部位中に免疫グロブリン恒常部領域のＣＨ，ドメインをフ ードしているエキフンを挿入することによって、この発現ベクターｐＤ　８ＵＫ をさらに修飾した。合成オリゴヌクレオチドによって、フラグメントの正しい暗 号フレームおよび適切なりローニング端部を再度得た。

次いで、発現プラスミドｐＤ　８　ＣＨ２Ｕ　Ｋを５９Ｄ８Ｈ鎖消失変異体ハイ ブリドーマ細胞にトランスフェクトした。最初に、２０％ウシ胎児血清を含有し ているＤＭＥＭ中で細胞を増殖させた。フンフルエンスに増殖した後、培養上澄 み液を、２０％ニュートリドーマ−ＮＳ（血清不含培地）および２ＫＩＵアブロ トニン／πＱを含有しているＤＭＥＭと代え、成長力に関して細胞をモニターし た。セファ０−ス（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）−コンジュゲートβペプチド上で蛋 白（組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８）を精製した。多量の組換え５ｃｕＰＡ　５９ Ｄ８の精製に関しては、寝ている（ｒｅｔｉｒｅｄ）　Ｂ　ａｌｂ／　Ｃブリー ダーマウスにブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ）を下塗りし、７日後にマウス１匹当 たりＩＸ　Ｉ　０８ｐＤ８ＣＨ２ＵＫ−含有ノ１イプリドーマ細胞を注射した。

腹水を回収した後、セファロース−コンジュゲートβペプチドカラム上で組換え ５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８を精製した。

トランスフェクションおよび選択 ボタ−ら（Ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ−）、プロシーディンゲス・サブ・ナショ ナル・アカデミ−・サブ・サイエンシズ・ニーニスニー（Ｐ　ｒｏｅ。

Ｎａｔ’　Ｉ　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８１　ニア１６１ｌ６ １−７１６５（１９に開示されているとおり、Ｉ　ｓｃｏ電力供給源を用いて、 電気泳動によって、構築物ｐＤ　８　ＣＨ２ＴＪ　Ｋを消失変異体細胞にトラン スフェクトした。最適のトランスフエクンヨン条件は、リン酸塩緩衝化食塩水０ ．８ｘＱ中への２０００ボルト放電であった。ミコフェノール酸、キサンチンお よびヒボキサンチン中での増殖によって形質転換株を選択した。

トランスフェクションおよび発現の確認は、ヒ）ｔ−ＰＡ鎖の３“部分をフード している２ｋｂｃＤＮＡプローブを用いて、ノーザーン・プロット分析によって 得た。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・ク ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ）、上記。標準技術に従って 、トランスフェクト細胞株をサブクローン化した。

ハイブリッド免疫グロブリン分子の特徴付はハイブリッド分子を、還元および非 還元の両条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理した。ゲルをクマシーブルーで染色する か、または結合前に１２５工でプラスミノーゲン活性化因子を襟識してオートラ ジオグラフィー処理した。

ペプチダーゼ活性に関する色素基質検査法ハイブリッド分子の機能的特性を検査 するために、まず、非選択的基’Ｊｔ、Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル− し−アルギニン−ｐ−ニトロアナリド・二塩酸塩（Ｓ−２２８８）に関して、そ のペプチド溶解特性を試験した。Ｓ−２２８８検査は、３Ｘ１０’Ｍの基質濃度 を有する０、０５Ｍ　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＱ、０，１０ＭＮａＣｃｌ（ｐ Ｈ８，５）の合計量１．０Ｊ１１２で行う。２０℃で、１０秒毎に４０５ｎｍで の吸光度を測定した。

５ｃｕＰＡおよび組換え５ｃｕＰ、Ａ　５９Ｄ８の活性５ｃｕＰＡは、プラスミ ンによる活性化の前にＳ−２４４４検査方でわずかな活性を含有する。スタンプ ら（Ｓ　ｔｕｍｐ　ｅｔ　ａｌ、　）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、）、２６：１７１２０−１７１２６ （１９８６）に開示されているとおり、Ｓ−’２４４４検査法における前−およ び後−活性化（プラスミンによる）活性度を測定した。

フィブリンモノマー−セファロース検査法Ｓ−２２８８色素基質検査法によって 測定して、ｔＰＡ、ウロキナーゼ（アポキナーゼ（Ａ　ｂｂｏｋ　１ｎａｓｅ） 、アボット（Ａ　ｂｂｏｔ）ロット＃８２−０８７−ＡＦ）、ウロキナーゼ−５ ９Ｄ８化学的コンジユゲ一ト体および組換え５ｃｕＰＡ−３９Ｄ８のプラスミノ −ケン活性化力を、等価のペプチダーゼ活性と比較した。臭化ンアンー活性化セ ファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　−Ｃ１に共有結合した＋ｔｓ■ −標識フィブリンモ／マーの溶解性を測定することによって、相対的なフィブリ ン溶解性力を定量化した（ホードら（Ｂｏｄｅ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（ Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２２９ニア６５−７６７（１９８５））。プラスミノ−ケ ン活性化因子のみによるフィブリン溶解と、抗体５９Ｄ８に化学的に結合した、 組換え蛋白の一部分としてのプラスミノーゲン活性化因子によるフィブリン溶解 との直接的な統計学的比較を促進するために、各々の検査から得たデータにフィ ツト−ファンクションプログラムを適用し、を試験によって曲線を比較した。

フィブリノーゲン検査・ ２つの方法でクエン酸化ヒト血漿またはクエン酸化ウサギ血漿の試料のフィブリ ノーゲン含有量を測定した。クラウス（Ｃ１ａｕｓｓ）、アクタ・チルアジ力・ スカンディナビ力・インクル（Ａｃｔａ　Ｃｈｉｒ。

ンを測定し、亜硫酸ナトリウム沈降法によって合計フィブリノーゲンを測定した 。

血漿凝固検査法 以下の変形を伴って、リニエンら（Ｌｉｊｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）、スロンボウ シス・ヘモスタシス（Ｔ　ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　）、５２：３ ０８（１９８４）の方法を用いた。ドナーから得たヒトの新鮮な凍結した血漿を 溜め、アリコートし、再度凍結させた。各実験の直前に、５ｃｕＰＡおよびハイ ブリッド免疫グロブリン分子の活性をＳ−２２８８検査法を用いて測定した（す なわち、プラスミノーゲン活性化因子およびハイブリッド分子のペプチダーゼ活 性を測定し、ペプチダーゼ活性（ユニット／Ｉｃ）が各試料に関して同一である ように適切な希釈液を調製した）。

新鮮な凍結した血漿に以下ものニトロンビン、ｇＮＩＨユニット／ｘ（１：　０ ．５Ｍ　ＣａＣＱｔ、１００　ｕＱ／ｘＱ　；および１１ｓｉ　！Ｍ識ヒトフィ ブリノーゲン（ＩＢＲＩＮ）、４０．０００ｃｐｍ／ｘＱを各々添加して血漿ク ロットを調製した。直後に、該溶液をシラスティック管材料（Ｓ　ｉ　１ａｓｔ ｉｃ　ｔｕｂｉｎｇＸＩ　、　Ｄ、　＝　４　ｘｉ）中に吸引し、３７°Ｃで３ ０分間インキュベートした。凝固した新鮮な凍結した血漿を含有しているンラス ティノク管材料を１．５ｃｚ切片に切断し、０．２ｙＱのクロットを得た。次い で、使用前に、これらを０．１５Ｍ　ＮａＣＱ中で洗浄した。各クロットをプラ スチック管中に入れ、計数し、１ｍ（ｌの新鮮な凍結した血漿（同一プールから ）中に懸濁させた。ブラスミ／−ゲン活性化因子（またはプラスミノーゲン活性 化因子および抗体のハイブリッド分子）の添加によって実験を開始した。３０分 間隔で、計数のために新鮮な凍結した血漿のアリコートを容管から取り出した。

フィブリノーゲンレベルの測定のために実験の最後に試料をセーブした。

ｉｌ　ｖｉｖｏ血栓崩壊 コレンら（Ｃｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・クリニカル・イ ンベスティゲーシヲン（Ｊ　、　ＣＩｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、　）、７１：３ ６８（１９８３）のウサギ頚静脈モデルを使用する。アセトプロマシンおよびケ タミンによるウサギの鎮静の後、右下顎骨から右鎖骨の上部まで傍正中切開を行 う。解剖によって外顎静脈を単離する。毛糸のセグメントを用いて、クロットを 吊す。出血を止めた後、この外顎静脈のセグメントを単離するように血管クラン プを装着し、クロットの成分を単離した血管セグメント中に導入した。これらの 成分は、１″Ｉ−標識化ヒトフィブリノーゲン約５００．　ＯＯＯｃｐｍ（使用 前に、各試料を計数する）、充填されたヒト赤血球細胞１１００ｕ、ヒトの新鮮 な凍結した血漿１００ｕ１２．’　０．５Ｍ　ＣａＣＱｔｌ　０ｕ＋！およびウ シトロンビン（８ＮＩＨユニツト）１０ｕ１２からなる。３０分後、血管クラン プを取り外し、血液流を回復させる。クランプを外した直後に血液試料を採取し 、血栓の中に一体化されていない放射活性を測定する。測定されたプラスミノー ゲン活性化因子の量を２５！Ｑに希釈し、注入ポンプによって、４時間かけて、 対側性耳辺縁静脈を介して運搬する。

シリンジ、ガーゼスポンジおよび管材料を計数することによって損失数を測定す る。注入の開始の６時間後、全静脈セグメントを単離し、取り出し、計数する。

開始時点での正味の数を超える実験の停止時に残存している数の割合として溶解 割合を測定する。

定量的なフィブリン溶解性検定は、セファロースにフィブリンモノマーを結合す る。リシン−セファロースを通過させることによってプラスミン汚染物について フィブリノーゲンを精製し、痕跡量の標識＋！Ｊ−フィブリノーゲンと混合する 。次いで、臭化シアン活性化セファロースＣ１−４Ｂに結合させる。１００ｉ１ ００ｉρ、の存在下、ヒトトロンビンの添加によって固定したフィブリノーゲン をフィブリンに転換する。

それらの相対的なフィブリン溶解活性を検査するために、量が増加したハイブリ 、ド分子および５ｃｕＰＡを１２６■−フィブリン−セフ１０−スと一緒に４時 間インキュベートする。その後、該樹脂を精製プラスミノーゲンと一緒にインキ ュベートする。２．５および１５時間間隔の後、該混合物を遠心分離し、上澄み 液の放射活性を測定する。抑制コンジュゲート体を用いて、この方法を繰り返す 。

結果 第１図は、発現プラスミドｐＤ　８　ＣＨ２０Ｋを示す。該プラスミドを、上記 Ｈ鎖消失変位体５９Ｄ８ハイブリドーマ細胞にトランスフェクトした。βペプチ ド−セファロース上でクロマトグラフィーによって上澄み液および腹水から組換 え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８を精製し、還元および非還元条件下で５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動によって試料を分析した。第２図Ａは、分子量標準、抗 体５９Ｄ８、および腹水から精製した組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８を用いて、非 還元条件下でのクマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。精製した組 換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８に関して２つの帯が見られる。約１６０ｋＤのものは 、この分子の予想されるサイズと一致する。２番目のＨＭＷ帯も存在した。ｔｔ ｓＩ−標識化ヤギ抗マウスＦａｂプローブを用いてウェスターンブロッティング を行った場合、両方の帯が見られた。腹水から精製した組換え５ｃｕＰＡ−５９ Ｄ８は、＋′ｌ−標識化ヤギ抗マウスＦａｂを結合した、約１６０ｋＤの帯を示 した。抗体５９Ｄ８も見られた。還元条件下、組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８のお よその分子量は、８０ｋＤであった（データは示されない）。

ウロキナーゼ活性に関して検査するために、Ｓ−２４４４検査法において、二本 鎖ウロキナーゼ、組換え５ｃｕＰ、Ａ−５９Ｄ８およびＨＭＷ　ｓｃｕ　Ｐ　Ａ を比較した。二本鎖ウロキナーゼは、Ｓ−２４４４において活性であるが、精製 した５ｃｕＰＡは、僅かな活性を示す。

各標本は、若干のウロキナーゼ活性を含んだ。さらに、プラスミント−緒にイン キユベートした後（結果として、−重鎮ウロキナーゼの二本鎖ウロキナーゼへの 転換を生じる）、組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８の活性は、約６〜８倍に増加する （第３図）。比較において、二本鎖ウロキナーゼは、プラスミンと一緒にブレイ ンキュベートすることによって活性化されず、ＨＭＷ−重鎮５ｃｕＰＡの活性は 、プラスミンと一緒にブレインキュベートすることによって１０〜１２倍に活性 化された。これは、該構築物においてＬＭＷ　５ｃｕｐＡ活性が部分的に保護さ れることを示唆している。

第４図のデータは、実際に、抗体部分および５ｃｕＰＡ部分の両方が精製された １つの分子上に存在することを示す。その結果、発現または精製の間に２つの分 離は生じない。修飾されたプラスミノーゲン活性化因子の最終試験は、増強され たフィブリン溶解性を示すかどうかである。

比較試験において、フィブリンモノマーセファロース検査法で組換え５ｃｕＰＡ −５９Ｄ８、天然５ｃｕＰＡ、二本鎖ＵＫと抗体５９Ｄ８との化学的フンシュゲ ート体およびＵＫを比較した。この検査法において、ＵＫと抗体５９Ｄ８との化 学的コンジュゲート体は、ＵＫだけよりも１００倍多く効力があり、ｔＰＡより も１０倍多く効力があり、ｔＰＡと抗体５９Ｄ８との化学的コンジュゲート体と 同等の効力があることを示した。ここで、組換え５ｃｕＰＡ−５９Ｄ８構築物は 、ＵＫ−５９Ｄ８フンシユゲ一ト体よりも少なくとも５０倍多い効力であり、天 然５ｃｕＰＡよりも約５００倍多い効力である。

このフィブリン溶解性に関する検査法において増強された効力を示す分子が、ヒ ト血漿クロットモデルおよびウサギ頚静脈モデルにおいても増強された効力を示 すということは予め示した。ヒト血漿クロットモデルおよびウサギ頚静脈モデル を用いる比較試験において、フィブリンモノマーセファロース検査法で組換え５ ｃｕＰ　Ａ　−５９Ｄ８、天然５ｃｕＰＡ、二本鎖ＵＫと抗体５９Ｄ８との化学 的フンシュゲート体およびＵＫを比較する。これらの比較検査は、組換え５ｃｕ ＰＡ−５９Ｄ８が天然５ｃｕＰＡ、ＵＫ−５９Ｄ８コンジユゲ一ト体および天然 ｔＪＫよりもフィブリン溶解性に関する効力を増強したこ組換え５ｃｕＰＡ　５ ９Ｄ８の特性は、非常に顕著であることを証明した。抗体５９Ｄ８と等しい親和 性（５Ｘ１０−”のに、、データは示さなかった）を有するフィブリンに結合し 、該標本におけるほうが精製した５ｃｕＰＡの標本におけるよりも多くの二本鎖 ウロキナーゼ活性が存在するけれども、証拠は、精製した組換え５ｃｕＰＡ−５ ９Ｄ８の一部分が一本鎖形態で存在することを示す（第３図）。その結果、５ｃ ｕＰＡの固有の特性を利用することによって、我々は、その抗体５９Ｄ８ドメイ ンによってプラスミノーゲン活性化因子部分をフィブリンと近接にさせ得、プラ スミノーゲン活性化因子は抗体に付着したままであるがプラスミンを開裂させ得 る分子を設計、クローニングおよび発現する際に成功した。結果は、意図された 全ての特性を有する充分に活性な組換え蛋白である。

これらの記載は、例であり、具体例は、説明の目的のみであり、本発明の意図お よび範囲ならびに添付した請求の範囲の範囲内で、種々の変形は示唆されるだろ う。

ＵＫ　ＬＭＷ　５ｃｕＰＡ−ＨＭＷ　５ｃｕＰＡ５９Ｄ８ ＦＩＧＬＩＲＥ　３ プラスミンによる活性化 ＦＩＧＵＲＥ　４ ｒ−ｓ　ｃｕＰＡ−５９Ｄ８によるフィブリン溶解性ＦＪＧＬＩＩ’ｌＥ　５ 国際調査報告 ｍｍｒ内・・時Ｍ１＾−夛１ｃａｌ＋・勇Ｎ・ｐｃ〒／ＩＩＪＱ＃１ＩＲＦ１７ １１１嗜−−１１−１・個−一−−せ＾帥Ｉ−Ｉ引−ｙｍ−ｐｃ：Ｔｚレ−１９ １０３５８７

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）フィブリンに特異的な抗原結合部位を有する抗体可変領域および一本鎖ウ ロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子からなるフィブリン溶解酵素活性領域を 有することを特徴とするキメラ免疫グロブリン分子。
2. （２）フィブリン溶解酵素活性領域が低分子量一本鎖ウロキナーゼプラスミノー ゲン活性化因子からなる請求項（１）記載のキメラ免疫グロブリン分子。
3. （３）フィブリン溶解酵素活性領域が高分子量一本鎖ウロキナーゼプラスミノー ゲン活性化因子からなる請求項（１）記載のキメラ免疫グロブリン分子。
4. （４）一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子の活性フラグメントがフ ィブリン溶解酵素活性領域からなる請求項（２）または（３）のいずれか１項記 載のキメラ免疫グロブリン分子。
5. （５）請求項（１）記載のいずれかのキメラ免疫グロブリンおよび医薬的に許容 される担体からなることを特徴とする医薬組成物。
6. （６）血栓症の患者に、請求項（５）記載の医薬組成物の有効量を投与すること を特徴とする血栓溶解方法。
7. （７）（ａ）放射性標識されている請求項（１）記載のキメラ免疫グロブリン分 子を宿主に投与し、 （ｂ）血栓の存在を検出する ことを特徴とする血栓検出方法。
8. （８）フィブリンに対して特異的な抗原結合部位を有する抗体可変領域をコード している遺伝子および一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子をコード している遺伝子からなることを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
9. （９）請求項（８）記載の組換えＤＮＡ分子および該遺伝子をは発現するための 調節配列からなることを特徴とするベクター。
10. （１０）ｐＤ９ＣＨ２ＵＫからなる請求項（９）記載のベクター。
11. （１１）請求項（９）または（１０）のいずれか１項記載のベクターによって形 質転換された宿主細胞。