JPS63160581A - ハイブリッドタンパク質 - Google Patents

ハイブリッドタンパク質

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JPS63160581A
JPS63160581A JP62306016A JP30601687A JPS63160581A JP S63160581 A JPS63160581 A JP S63160581A JP 62306016 A JP62306016 A JP 62306016A JP 30601687 A JP30601687 A JP 30601687A JP S63160581 A JPS63160581 A JP S63160581A
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ジャン　バン　オーストルム
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    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハイブリッドプラスミノ−ｒンアクチペータ、
その様なハイブリッドプラスミノ−ｒンアクチペータ全
コードするＤＮＡ、その様なりＮＡを含有するハイブリ
ッドベクター、その様なハイブリッドベクターによシ形
質転換された宿主、その様なハイブリッドプラスミノー
ゲンアクチベータ、ＤＮＡ、ハイブリッドベクター及び
宿主の製造方法、及びその様なハイブリッドプラスミノ
ーゲンアクチベータを含有する医薬組成物に関する。
〔従来の技術〕
血餅は発展し次世界におるヒトの根病及び死亡の主たる
原因である。血餅は＃：累累日ロンビン作用によシその
可溶性前駆体フィブリノ−ダンから形成されるフィブリ
ンによシ構成される。一連の酵素及びその他の物質は血
餅はそれらが血液の損失を防止する時に必要とされる際
及び場においてのみ正常に形成されることを確実にして
いる。
哺乳動物の血漿は血餅を溶解することのできる酵素糸フ
ィブリン分解系を含んでいる。フィブリン分解系の一成
分はプラスミノ−ダン（プラスミンの不活性プロ酵素形
態）をタンノ４り質分解酵素プラスミンに転換するグラ
スミノ−ｒンアクチベータと称される一群の酵素である
。プラスミンは次いで血餅のフィブリンネットワークを
劣化させて可溶性生成物を形成する。体の血栓溶解能力
が血管内血栓を除去するのに不十分である場合、例えは
血栓塞栓往或いは手術後合併症に悩む患者において外因
的に投与された血栓浴鱗剤を用いることが不可欠なこと
がある。
二つのタイプのプラスミノーグンアクテペータ（以下”
ＰＡ”と称する）をヒト体液或いは細胞から単離するこ
とができる。即ち、例えばヒトの尿及び腎臓細胞に存在
するセリ／プロテアーゼであるウロキナーゼ或いはウロ
キナーゼタイププラスミノーゲンアクチベータ（以下″
ｕ−ＰＡ”　と称する）及び内皮細胞により産生され数
多くの内分泌組織に見られる組織タイププラスミノーグ
ンアクデベータ（以下”　ｔ　−ＰＡ″と称する）であ
る。
ｔ　−ＰＡ及びｕ−ＰＡは共に二つの分子形態即ち一本
鎖形態（しばしはそれぞれ“５ｃ−ｔ−ＰＡ″及び″”
ｍｅ−ｕ−ＰＡ”と命名される）及び二本鎖（ｔｃ）形
態で存在する。一本鎖即ちプロ酵素形態はポリペグチド
配列の良く規定された位置におけるタン・母り質分解酵
素の作用により二本鎖形態に転換される。加工されたＰ
Ａタンノ９り貴の得られた二本の鎖はイオウ−イオウ架
橋によシ相互に結合して残る。カル？キシ末端断片即ち
Ｂ−鎖はＰＡの酵素活性を媒介するのに対し、アミノ末
端Ａ−頌はフィブリン結合部位などの制御単位を含有す
る。不活性５ｅ−ＰＡのフィブリンなどの崩餅の成分に
対する特異的結合に引続きその部位に存在する触媒蓋の
タンノ母り質分解酵素による活性ｔｃ−ＰＡへの転換の
結果有効な部位−特異的物質が得られる。
二つの異った遺伝子によりコード化される１−ＰＡ及び
ｕ　−ＰＡは免疫学的及び酵素的に区別され、阻害剤、
刺戟剤及び賦活剤に対して異ったグロフィールの応答を
有する。この様に、ｔ−ＰＡのみがエリトリナ・ラチシ
Ｗ　（Ｅｒｙｔｒｉｎａ　１ｍｔｉｓａｉｍａ）（ＤＥ
−３）からのグロテアーゼ阻害剤によシ強く阻害される
。ｔ−ＰＡ活性はフィブリン及びフィブリン断片により
大きく刺戟されるのに対し、ｕ−ＰＡ活性はフィブリン
及びその断片による刺戟に対して感応しない。これらの
二つのＰ　Ａ　＃　Ｘ　を区別するもう一つの性質はｔ
ｃ−ｔ−ＰＡがフィブリン及びフィブリン断片に対して
高い親和性を有するのに対し、ｔｃ−ｕ−ＰＡは余りフ
ィブリン親和性を有しないことである。
〔発明が解決しようとする問題点〕
注射されたｔ　−ＰＡの不満足な血清安定性、ｔｃ−ｕ
−ＰＡのフィブリンに対する低い親和性、及びａｃ−ｕ
−ＰＡのフィブリン親和性が間接的であること、即ち、
追加の血液因子を必貴とすると考えられている（　Ｄ、
　Ｊ、　Ｂｉｎｎ＠ｍａ　ｅｔ　ａｌ　、　８ｔｈ　Ｉ
ｎｔ。
Ｃｏｎｇｒｅ＋ｍ＠ｏｆ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｍｌｍ　
、ウィーン。
１９８６　’）’に考慮すると、フィブリンに対する高
い親和性、刺戟剤に対するよシ好ましい応答、阻害剤に
よる減少された不活性化、及び血液循環におけるよυ長
い有効な半減期を有する改良されたプラスミノーゲンア
クチベータの必要性が継続している。
従って、本発明の目的は親醇累の望ましくない特性を欠
きながらｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの好ましい性ｉｔ保持す
る新規ハイブリッドグラミノーグンアクチペータを提供
することである。
驚くべきことに、血栓症その他の状態の治療の九めに、
グラスミノーダン活性化を介してフィブリン分解をもた
らしたい場合には一本餉ハイブリッドＰＡタンパク質が
一本鎖ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡと対比した場合により優れ
た生物学的特性を示すことが発見された。具体的には、
生来のＰＡｆｉに対比して本発明による新規ＰＡ分子の
血餅ｆ　ｉｎ　ｖｉｖｏで溶解するのに必要とされる童
がより少ないことである。本発明による一本鎮ハイブリ
ッドＰＡ分子は組換えＤＮＡ技術により多量に製造する
ことができ、患者に注射時に溶解されるべき血餅の部位
においてのみフィブリンの影響の下にそれらの二本鎖形
態に転換される。二本鎖ハイブリッドＰＡ分子は文献に
記載されているが（ヨーロッパ特許用３３１５５．３８
７号明細書、Ｋ、　Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ　、　８ｔｈＩ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒ＠ａｓ　ｏｆ　
Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｍ　。
ウィーン、１９８６）、しかし、ハイブリッドＰＡ分子
のより好ましい一本鎖形態は引用した文献に開示される
ようにタンパク質レベルで＃：ｔ！１１！遺されず、組
換えＤＮＡ技術によってのみ多量に且つ工業規模で製造
することができる。
〔間組点を解決するための手段〕
従って、本発明の吏なる目的は該−重鎮ｕ−Ｐｊ１７ｔ
−ＰＡハイブリッドタンパク質の製造手段及び方法を提
供することである。その様な手段は該Ｕ−ＰＡ／１−ｐ
Ａハイブリッドタンノ９り質をコードするＤＮＡ、該ｔ
）ＮＡ　’ｉ金含有るハイブリッドベクター及び該ハイ
ブリッドベクターで形質転換され次宿主を包含する。又
、−重鎖ｕ　−ＰＡ　／　ｉ　−ＰＡ　／％イブリッド
タンパク實、該ＤＮＡ、該ノーイブリッドベクター及び
該宿主ｔ−製造するための方法も提供される。
本発明は又、組換えＤＮＡの一本鎖生成物が１ｎＶｌｔ
ｒｏで適当なタンノ母り質分ｐ＃＃索例えはプラスミン
によシ切断することができるので二本鎖ノ・イブリッド
ＰＡ分子のよりコスト有効的製造方法も提供する。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は特にアミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ−
ＦＡ及びヒトｕ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも
２個の部分配列によシ構属されるアミノ酸配列を有する
一本鎮ハイブリッドＰＡに関する。
血液のフィブリン分解及び凝固系に含まれるその他のセ
リンプロテアーゼ類と同様にｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡは触
媒作用ドメイン（鎖Ｂ）に結合して鎖Ａ内に大きな非触
媒作用セグメン）１有する。このｔ−ＰＡ″の非−触媒
作用Ａ−鎖は個々のフィンガー即ち「フィンガー」ドメ
イン、「成長因子」ドメイン及び二つの「クリングル」
構造に部分分割することができるのに対し、ｕ−ＰＡの
Ａ−鎖は「成長因子」ドメイン及び１個の「クリングル
」構造により構成される。〔例えは、Ｌ、　Ｐａｔｔｈ
ｙ　。
Ｃｅ１ｌ　４１．６５７−６６３（１９８５）参照〕。
Ｂ−鎖の触媒作用部位はそれぞれ３２２．３７１及び４
７８（ｔ−ＰＡ）及び２０４．２５５及び３５６（ｕ−
ＰＡ）におけるＨｉｓ　％Ａｓｐ、　Ｓｅｒ残基によシ
形成されており、フィブリン分解活性に必須である。
タンパク質ドメインは全タンノ譬り質の全体栴遺内にお
ける構造的及び／又は機能的存在である。
例えはｔ　−ＰＡの八−鎖では四つのドメイン（フィン
ガー、成長因子−及び二つのクリングルドメイン）が−
続きに配列されている。これらのドメインの境界は対応
するＤＮＡ配列におけるエキソンーイントロン結合の位
置にニジ最も良く規定される（上記、Ｌ、　Ｐａｔｔｈ
ｙ　）。しかしながら、実用的理由のために各ドメイン
の最小の大きさはＳ−８架橋形成に−４するものと思わ
れる各ドメイン内の最初及び最後のシスティン残基間の
アミノ酸配列によシ定義されてきた。隣接領域からのこ
れらのシスティン残基の前及び後のアミノ酸は結合配列
（Ｊ）と定義される。エキソンーイントロン結合（上記
参照）の位置はこれらのＪ領域内にある。
即ち一重鎖ｔ−ＰＡは次式により表わすことかできる。
Ｔ−Ｆ−Ｊ、−Ｇ−Ｊ２−に、−Ｊ、−に２−Ｊ４−Ｔ
ＰＡ”式中、Ｔはアミノ酸１〜５よりなるＮ−末端部分
ｔ−表わし、Ｆはアミノ酸６〜４３よシなるフィンガー
ドメインであシ、Ｇはアミノ酸５１〜８４よシなる成長
因子ドメインであυ、に、はアミノ酸９２〜１７３よシ
なるクリングル１構造であシ、Ｋ２はアミノ酸１８０〜
２６１よシなるクリングル２構造であシ、ＴＰＡ”はア
ミノ酸３０７〜５２７よりなる触媒作用セリンプロテア
ーゼドメインであり、セしてＪ、（アミノ酸４４〜５０
）、Ｊ２（アミノＩＮ！８５〜９１）、Ｊ、（アミノ酸
１７４〜１７９）及びＪ４（アミノ酸２６２〜３０６）
はドメインセグメントヲ結合する結合配列である。
−重鎖ｕ　−ＦＡは次式によシ表わすことができる。
Ｔ’−Ｕ−Ｊ　−に−Ｊ６−ＵＰＡ” 式中、Ｔ′はアミノ酸１〜１２よシなるＮ−末端部分を
表わし、Ｕはアミノ酸１３〜４２よシなる成長因子ドメ
インであシ、Ｋはアミノ［５０〜１３１よりなるクリン
グル構造であシ、ＵＰＡＢはアミノ［１８９〜４１１よ
りなる触媒作用セリンプロテアーゼドメインでアシ、セ
してＪ５（アミノ＃１４３〜４９）及びＪ６（アミノ［
１３２〜１８８）はドメインセグメントヲ結合する結合
配列である。
結合配列Ｊ４及びＪ６は各々活性化（プロセシング）部
位、及びそれへのＮ−末端に、触媒作用（Ｂ−ａ）領域
へのイオウ−イオウ架橋に関与するシスティン残基金包
含する。
鴬＜へきことに、一つのＰ　Ａ　（ＴＰＡＢ或いはＵＰ
ＡＢ）のｐＢＡ媒作用セリンプロテアーゼ領域を他のＰ
Ａの全ての又は個別の八−鎖ドメイン或いは両省のＰＡ
の個別のドメインを含有するアミノ酸配列に結合してな
る一重鎖ハイブリッドＰＡが貢ｌな薬学的性’ｊｌ’に
示すことが発見された。
従って、本発明はヒトｕ−ＰＡの全ての又は個別のＡ−
鎖ドメイン或いはヒトｕ−ＰＡ及びヒト１−一続きに結
合してなる一重鎖ハイブリッドＰＡ、及びヒトｔ−ＰＡ
の全ての又は個別のＡ−鎖ドメイン或いはヒトｔ−ＰＡ
及びｕ−ＰＡの個別のＡ−鎖ド鎖ハイブリッドＰＡに関
する。
Ｊを含む。
特に、本発明はヒトｔ−ＰＡの全てのＡ−ａドメインを
含有するアミノ酸配列、ヒトｔ−ＰＡの個別のＡ−鎖ド
メイン例えはヒトｔ−ＰＡのフィンガードメイン或いは
クリングル特にクリングル２ドメインなどを含■するア
ミノ酸配列、及びヒトｔ−ＰＡ及び／又はヒトｕ−ＰＡ
の２個、３（１５又は４個のＡ−鎮ドメイン特にヒトｔ
−ＰＡの２個又は３個のドメイン或いはヒトｕ−ＰＡ及
びヒトｔ−ＰＡの２個又は３個のドメイン例えばヒトｔ
−ＰＡのフィンガー、成長因子、クリングル２ドメイン
、ヒトｔ−ＰＡのフィンガー及びクリングル２ドメイン
或いはＵ−ＰＡ成長因子及びｔ−ＰＡクリングル２ドメ
インなどを含有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸
ＰＡ、及びｕ−ＰＡ成長因子及びｔ−ＰＡクリングル２
ドメインを含有するアミノ酸配列を含有し、そ好ましく
は、このハイブリッドＰＡアミノ酸配列はｔ−ＰＡ（Ｔ
、アミノ酸１〜５）或いはｕ　−ＰＡ（Ｔ／、アミノ酸
１〜１２）のＮ−末端配列ニジスタートし、或いはハイ
ブリッドＰＡの第１ドメインに自然にＮ−末端結合し友
任意の結合配列、或いはその断片が少なくとも５個のア
ミノ酸残基を有するその様な結合配列の断片でスタート
するのがよい。
本発明によるハイブリッドＰＡにおいて人−鎖ドメイン
は天然結合配列（例、Ｊｌ、　Ｊ２、Ｊ、及びＪ５）、
融合結合配列、或いはノ１イブリッド結合配列或いはそ
の断片を介して連結されている。即ち、第１ドメインは
該第１ドメインのＣ−末端に自然に存在する結合配列に
よυ、第２ドメインのＮ−末端に自然に存在する結合配
列により、該結合配列によシ構成される融合結合配列に
より、或いはそれらの断片によシ、第２のドメインに結
合されアーゼドメイン（ＴＰＡ”或いはＵＰＡ”）に、
ヒトを−ＰＡにおいてＡ−鎖をＢ−鋲に結合する紹合配
夕１ｊＪ４、ヒトｕ　−ＰＡにおいてＡ−Ｍ−Ｂ−ｍに
＃ｉｋする結合配列Ｊ６、及び該結合配列の部分比クリ
エ９構成されるハイブリッド配夕１ｊよシなる群から遇
はれた結合配列によシ結合されておシ、該精合配夕１」
はグラスミンにより切断されることのできるプロセシン
グ部位、及びそれに対してＮ−末端にある、触媒作用Ｂ
−鎖領領域のイオウ−イオウ架橋に参加することのでき
るシスティン残基を含み、この結合配列は好ましくは少
なくとも４０１固〜６０個までのアミノ酸残：４を七す
る。
最も好ましいのは、対応するＤＮＡ上のエキソノーイン
トロン結合により規定される位置におけるドメインの結
合である。Ａ−鎮対Ｂ−鎖の結合は。
敢も好１しくに活性化部位にある。
特に、本発明は、ｕＰＡｃ７）Ａ−鎮又はｕＰＡ成長因
子ドメインとｔ−ＰＡクリングルドメイン２とから本質
的に成るＡ−鎖がｔ−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ−鎖）と
−絖１に結合したものｔ言んで成るノーイブリツドグラ
スミノーデンアクチペーク；並びにｔ−ＰＡのＡ−知、
本＊市にｔ−ＰＡのフィンガ−ドメインよυなるＡ−鎮
、本質的にＵ−ＰＡ＆長因子ドメインとｔ−ＰＡクリン
グル２ドメインとからなるＡ−鎖、本質的にｔ−ＰＡフ
イ／ｇ−ドメインとクリングル２ドメインとからなるＡ
−知、或いは本質的にｔ−ＰＡフィンガードメインと成
長因子ドメインとタリノｔ′Ｌでいるものヲ冨んでなる
グラスミノ−ｒンアクチペータよりなる肝から選はれる
一重鎖ノ１イプリツドオラスミノーグンアクチペータで
あって、Ａ−ｆｅｔが、宿性化部位及びＢ−鎖へのイオ
ウ−イオウ結合を形成することのできるシスティン残基
金言んでなる結合自己クリ全弁してＢ−鎖に結合してい
るものに関する。
特に、本発明は同様に活性化部位においてｕ−ＰＡの触
媒作用領域（Ｂ−８）に結合した、ｔ−ＰＡクリングル
２ドメインより本質的になるＡ−鎖に％んでなる一重鎖
ハイブリッドグラスミノーグンアクテペータに関する。
特に好ましいのは、ｔ　−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ−鎮
）に−続きに結合した、ｕ−ＰＡ成長因ナドメイントｔ
−ＰＡクリングル２ドメインとから本ＪＪＡＬ的になる
Ａ−頼に含んでなるハイブリッドプラスミノーグンアク
チペーメ、並びにｕ−ＰＡの触媒作用領域（Ｂ−鋲）に
−続きに結合した、ｔ−ＰＡタリングル２ドメインから
本質的になるＡ−知或いは１−ＰＡフィンガードメイン
とクリングル２ドメインから本質的になるＡ−鎖全言ん
でなるハイブリッドプラスミノーグンアクテベータ、刀
・らなる８＋Ｌ９：ｉ！ｉはれた一重鎖ハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベータにおいて、Ａ−鎮顎域及び
Ｂ−鎖間の結合が活性化部位にあるものである。
本発明による好ましいノ・イブリッドＰＡはＩＪＰＡＡ
ＴＰＡＢ（ＢＣ）＝［ｕＰＡ（１−１５８）−ｔＰＡ（
２７６−５２７））　。
ＵＰＡＡＴＰＡＢ（ＢＲ）＝［ｕＰＡ（１−１３１）−
ｔＰＡ（２６３−５２７））　。
ＴＰＡＡＵＰＡＢ（ＢＣ）＝　ＩＩｔＰＡ（１−２７５
）−ｕＰＡ（１５９−４１１））　。
ＴＰＡＡＵＰＡＢ（ＢＲ）＝［ｔＰＡ（１−２６２）−
ｕＰＡ（１３２−４１１）］　。
ＩＪＦＣ２ＵＰＡ　Ｂ（ＢＲ）＝ＣｕＰ　Ａ　（１−４
４）−ｔ　ＰＡ　（１７６−２６１）−ｕＰＡ（１３４
−４１１））　。
ＦＵＰＡＢ（ＢＣ）　　＝〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰ
Ａ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）］　
。
ＦＵＰＡＢ（ＢＲ）　　＝ＬｔＰＡ（１−４９Ｊ−ｕＰ
Ａ（１３４−４１１）、ｌ　。
ＦＫ２ＬＩＰＡＢ（ＨＣ）＝［ｔＰＡ（１−４９）−ｔ
ＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１））
　。
ＦＫ２ＵＰＡＢ（ＢＲ）＝［ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰ
Ａ（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）］　
。
ＵＫ２ＴＰＡ　（Ｂｅ　）＝ＣｕＰＡ　（１−４４）−
ｔＰＡ（１７６−５２７）　）　。
Ｋ２ＵＰＡＢ（ＢＣ）＝　（ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ
（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）］　。
ＦＧＫ２ＵＰＡＢ（ＢＣ）−（ｔＰＡ（１−８６）−ｔ
ＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（工５９−４１１）〕
及び ＦＧＫ２ＵＰＡＢ（ＢＲ）＝［ｔＰＡ（１−８６）−ｔ
ＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）］
　。
弦に、　ＵＰＡＡＶｉｕ　−ＰＡのＡ−鎖マユ・あシ、
ＴＰＡＡはｔ　−ＰＡＯＡ−鎖であり、ＵＰＡＢはｕ　
−ＰＡのＢ−鎖であシ、ＴＰＡＢはｔ　−ＰＡのＢ−鎖
であシ、ＵはＵ−ＰＡの成長因子ドメインを示し、Ｋ２
はｔ−ＰＡのクリングル２ドメインを示し、Ｆｉｓｔ−
ＰＡのフィンガードメインを示し、Ｇはｔ−ＰＡの成長
因子ドメインを示し、（ＢＣ）はＡ−鎖ドメイン及びＢ
−銅量の結合が活性化部位にあることを示し、セして（
ＢＲ）はＡ−鎖ドメインが、活性化部位及びそれに対し
てＮ−末端にＢ−鎖へのイオウ−イオウ架橋に関与する
システィン残基全室むＢ−鎖に自然に結合した連結配列
を介して、Ｂ−鎖に結合していることを示す。数字はそ
れぞれｕ−ＰＡ及び１−ＰＡからとられたアミノ酸配列
を示す。例えばＵＫ２　ＵＰＡ”　（ＢＲ）＝ＣｕＰＡ
（１−４４）−ｔＰＡ　（１７６−２６１）　−ｕＰＡ
（１３４−４１１）：］はｕ−ＰＡのアミノ１ｌｌｉｌ
−４４（成長因子ドメイン、Ｕ）及びｔ　−ＰＡのアミ
ノ酸１７６−２６１（クリングル２ドメイン、Ｋ２）が
ｕ−ＰＡのアミノ酸１３４−４１１（Ｂ−鎖、ＵＰＡＢ
）に線状に結合してなる一重鎖ハイブリッドプラスミノ
ーゲンアクチベータを示す。
特に好ましいのはハイブリッドプラスミノーダンアクチ
ベータＴＰＡ”ＵＰＡＢ（ＢＣ）、ＦＵＰＡＢ（ＢＣ）
、ＦＧＫ２ＵＰＡ　Ｂ（ＢＣ）、特にＵＫ２ＴＰＡＢ（
ＢＣ）、ＦＫ２プ（ＢＣ）及びに２ＵＰＡ”（ＢＣ）で
ある。
本発明は史にＮ−グリコシル化部位の少なくとも一つ好
ましくは全てがグリコシル化がこの（これら）の部位に
おいて生ずることができないように変形されている不発
明によるハイブリッドＦＡの変異体に関する。
咄乳動物細胞におけるＮ−結合グリコシル化の前提条件
はトリ被プチド配列−Ａｓｎ−Ｌ−８ｅｒ（或いはＴｈ
ｒ　）　−（Ａｓｎはアクセプターであり、そしてＬは
、グリコシル化を防止するプロリン或いはアスパラギン
［−除く２０個の遺伝的にコード化されたアミノ酸の任
意のものであり得る）の存在であることが良く錐立され
ている。ｔ−ＰＡ分子内にはＮ−グリコシド結合のため
の３個の部位がある（数字はｔ　−ＰＡのアミノ酸配列
中のＡｓｎの位置を指す第１図参照）。部ち、−Ａｉｎ
　　−８ｅｒ−８ｅｒ−（クリングル１中に存在）、Ａ
ｓｎ　　−Ｇｌｙ−８ｅｒ（クリングル２中に存在）、
及びＡａｎ　　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ　（ｔ−ＰＡ　Ｂ−鎖
中に存在）である。ｕ−ＰＡのこの唯一のＮ−結合グリ
コシル化部位はＢ−鎖中にある（　Ａｓｎ　　−８ｅｒ
−Ｔｈｒ、第３図参照）。ｔ−ＰＡクリングル１、ｔ−
ＰＡクリングル２、ｔ−ＰＡのＢ−鎖及び／又はｕ−Ｐ
ＡのＢ−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡが又それぞれ
のＮ−結合グリコシル化部位を含むことは明らかである
。
個々の（１個以上の）Ｎ−グリコシル化部位におけるグ
リコシル化を予防するためにＮ　−ｆ　ＩＪ　：１シル
化のためのシグナルとして１１＆されているトリペプチ
ド配列が変更されなけれはならない。上記トリペプチド
配列内のＡｓｎ及び／又はＳｅｒ　（又はＴｈｒ）残基
の任意のその他のアミノ岐による置換はこれらの部位に
おけるグリコシド結合の形成を廃止する。便宜釣には、
Ｎ−グリコシル化部位ノ変更はタンパク負レベルにおい
てはなされない。
その代り、このハイブリッドＰＡをコードする遺伝子を
、骸修Ｓ遺伝子の佃主による発現の際に１個以上のＮ−
グリコシル化部位がグリコシル化がこれらの部位におい
て起こらないように変更されている突然変異ハイブリッ
ドＰＡが生成されるように変更するのが有利である。本
発明によれは、ハイグリッドＰＡ中に存在する全てのＮ
−グリコシル化部位を変更するのが好ましい。
特に、アスパラギンがバリン、ロイシン、イソロイシン
、アラニン或いは特にグルタミンで置換され、及びセリ
ン及びスレオニンがバリン、メチオニン或いは特にアラ
ニンで置換される。
特に好ましいのは下記の修飾されたハイグリッドＰＡで
ある： ＦｕＰＡＢ（Ｇ１ｎ３０２）（ＢＣ）　＝（ｔＰＡ（１
−４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９
−３０１，Ｇｌｎ、３０３−４１１）］　。
ＦＫ２（Ａｌａ１８６）ＵＰＡ”（Ｇ１ｎ３０２）（Ｂ
Ｃ）＝［ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−１８５
，Ａｌｔ、１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１
、Ｇｌｎ、３０３−４１１）］　。
ＵＫ２　（Ａ　ｌ　ａ　１８６　）ＴＰＡ　”　（Ａ　
１　＆　４５０　）　（ＢＣ）　＝〔ｕ　ＰＡ　（１−
４４）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌｍ、１８７−４
４９．Ａｌｍ、４５１−５２７）〕。
Ｋ２　（Ａ　ｌ　ａ　１８６　）ＵＰＡＢ（Ｇ　ｌ　ｎ
　３０２　）　（ＢＣ）　＝［ｔ”Ａ（１−３）　−ｔ
ＰＡ（１７６−１８５，Ａｌｔ、　１８７−２７５）−
ｕＰＡ（１５９−３０１、Ｇｌｎ、３０３−４１１））
　。
ＦＧＫ　２　（Ａ　ｌ　ａ　１８６　）ＵＰＡＢ（Ｇ　
ｌ　ｎ　３０２　）　（ＢＣ）　＝〔ｔ　ＰＡ　（１−
８６）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌｍ、１８７−２
７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌｎ、３０３−４
１１）］　＝及び更に ＦＫ　２　ＵＰＡ”　（Ｇ　１　ｎ　３０２　）　（Ｂ
　Ｃ）＝（ｔ　ＰＡ　（１−４９）　−ｔ　Ｐ　Ａ（１
７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１、Ｇｌ　ｎ　
、　３０３−４１１））　。
Ｋ　２ＵＰＡ　”　（Ｇ　ｌ　ｎ　３０２　）　（Ｂ　
Ｃ）＝Ｃｔ　ＰＡ　（１−３）　−ｔ”Ａ（１７６−２
７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１、Ｇｉｎ　、　３０３
−４１１）　Ｊ　。
ＵＫ２ＴＰＡＢ（Ａｌａ４５０）（ＢＣ）＝（ｕＰＡ（
１−４４）−ｔＰＡ（１７６−４４９，Ａｌｍ、４５１
−５２７）、ｌ　、及びＦＧＫ２ＵＰＡ　’　（Ｇ　１
　ｎ　３０２　）　（Ｂ　Ｃ）＝Ｃｔ　ＰＡ　（１−８
６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３
０１、Ｇｌｎ、３０３−４１１）］。
本発明のハイブリッドＰＡ及びその突然変異体は、例え
ばハイブリッドＰＡタンパク質或いはその突然変異体を
発現する形質転換宿主をその発現を許す条件下に培簀し
、そしてハイブリッドＰＡタンパク質及び突然変異ハイ
ブリッドＰＡタンパク３ｉ［をそれぞれ単離することよ
りなる組換えＤＮＡ技術により製造することができる。
より具体的には、目的化合物は、 ａ）ハイブリッドＰＡタン、＋ｅり質或いはその突然変
異体上コードするＤＮＡを用意し、或いはその様なりＮ
Ａ金化学的に合成し、 ｂ）このＤＮＡを過当な発現ベクター中に導入し、Ｃ）
得られたハイブリッドベクターを受容宿主中に移し、 ｄ）形質転換宿主を未形質転換宿主から例えは形質転換
された宿主のみが生残る条件下に培養することにより選
択し、 ｅ）形質転換宿主をハイブリッドＰＡタンパク質の発ｍ
ｔ許す条件下に培養し、そしてｆ）ハイブリッドＰＡタ
ンパク質及びその突然変異体全単離する、 ことによシ灸遺される。
組換えＤＮＡ技術によるハイブリッドＰＡタンパク負の
製造に宮まれる工程を以下にニジ詳細に説明する。
ハイブリッドＰＡり／バク質をコード化するＤＮＡ本発
明はアミノ酸の同一性及び数において、と）ｕ−ＰＡ及
びヒトｔ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも２個の
部分配夕１ｊにより構成されるノ・イブリッドＰＡをコ
ードする或いはその突然変異体をコード化する配夕ＩＪ
’に有するＤＮＡに関する。特に、本発明は前記好まし
いものとして述べたハイブリッドＰＡタン／４’り質及
びその突然変異体の任意のものをコード化する配列金有
するＤＮＡＫ［する。
好ましくは本発明によるＤＮＡはそれらの宋鴻に隣接配
列（ｆｔａｎｋｉｎｇ　ａｅｑｕｅｎｃｅ　）　ｆ有す
る。物に、これらの隣接配夕１４　（ｆｌａｎｋｉｎｇ
　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）には、ＤＮＡ　’ｉ適当なベク
ター中に組みこむのに適轟な制限部位が富まれる。
更に、本発明のＤＮＡは成熟ハイブリッドＰＡコード配
列の第１コドンに顔合したｕ　−ＰＡ或いは１−ＰＡの
シグナル配列′ｊｋ含む。あるいは、酵母細胞内で発現
される場合に、本発明のこれらのＤＮＡは用いられる酵
母グロモーメーに自然に連結しているシグナル配列特に
ＰＩ（０５或いはインベルターゼシグナル配列などの酵
母シグナル配列を宮んでよい。
好ましくは、ＤＮＡ部分配列のヌクレオチド配列はそれ
ぞれｕ　−ＰＡｃ　ＤＮＡ及びｔ−ＰＡｅＤＮＡに見ら
れるヌクレオチド配列と同一であるのがよい。しかしな
がら、遺伝子コドンの扁ｌにより得られるアミノ酸部分
配夕１」が未変化で貿どまるならはヌクレオチド配列が
異なってよい。突然変異体ハイブリッドＰＡＹ（コード
するＤＮＡにおいては、ハイブリッドＰＡタンパク負の
Ｎ−グリコシル化に必須のアミノ酸ヲコードする少なく
とも１１廂のコドンがＮ−グリコシル化の認識部位を廃
止する異ったアミノ酸をコードする他のコドンによりｍ
換される。
ｕ　−ＰＡｃＤＮＡ及びｔ　−ＰＡ　ｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列は公知である［　Ｗ、Ｅ、Ｈｏ１ｍ５ｓ　ａ
ｔ　ｍｌ、　ｒＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ３　、９２
３−９２９（１９８５）３Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ　＠ｔ　
ａｌｅ　、　Ｎａｔｕｒｅ３０１　、２１４−２２１（
１９８３）参照〕。更に、全てのイントロン及びエクソ
ンを含むゲノムｕ−ＰＡ及ヒｔ−ＰＡ遺伝子の完全なヌ
クレオチド配列が確立されている［　Ａ、　Ｒｌｃｃｉ
ｏ　ａｔ　ａｌ、　、　Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ
ｍ。
１３．２７５９−２７７１（１９８５）；Ｓ、Ｊ。
Ｆｒｌｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇｅｎ　＠Ｌ　ａｌ、、　Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈ＠ｍ。
２６１．６９７２−６９８５（１９８６）参照〕。
ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡのｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列
を知っていれは、本発明によるＤＮＡｆｌ公知の方法に
よシ作ることができる。これらのＤＮＡの作製方法とし
ては、これらのＤＮＡ　ｉ化学的に合成するか、或いは
ｕ　−ＰＡ　ｅ　ＤＮＡ及びｔ　−ＰＡ　ｃ　Ｉ）ＮＡ
のポリヌクレオチド部分配列をコードする断片ヲ調製し
、そしてそれらを所定順序で再連結し、任意に１以上例
えは２或いは３の突然変異工程を含む方法が挙けられる
。
本発明の突然変異ハイブリ２２２人をコードするＤＮＡ
は公知の方法によシ裏遺することができる。
これらのＤＮＡの製造方法は栽ハイグリッドＰＡ逼伝子
から不ＰＪｒ望のアミノ僚残基に対するコドン↓シなる
ＤＮＡ部分を切出し、そしてそれを該コドンがハ［望ア
ミノ酸残基金コードするデオキシリボヌクレオチドトリ
プレットで置換はれｆｃＤＮＡセグメントとｆｉｌｌ換
するか、或いはデオキシリボヌクレオチド置換１部位−
指向突然変異誘発によシ違属することを含む。
ＤＮＡの化学合成は良く知られており、通常の技術を利
用するものである。過当な技術はＳ、Ａ。
Ｎａｒａｎｇ　［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９　＋　
３　（１９８３）〕により輸果されている。特に、ヨー
ロッパ特許出願１４６．７８５号明細書に記載されてい
る方法が用いられ、剋に準用する。
本発明によるＤＮＡの合成のもう一つの牛法はＵ−ＰＡ
及びｔ−ＰＡのポリヌクレオチド部分配列全コード化す
る適当な制限断片をｕ　−ＰＡ　ｃＤＮＡ及び１−ＰＡ
　ｃＤＮＡ　（或いはｒツムｕ　−ＰＡＤＮＡ　＊いは
ｔ−ＰＡＤＮＡ　）から切出し、そしてこれらの〜■片
を全体ハイブリッドＰＡ構造遺伝子の製造に用いること
にある。二つのストラテジーを適用することができる。
いづれのストラテジーを用いるにせよ、断片の融合がド
メインを無傷に保つためにドメイン間の部位において行
われるように注意が払われなけれはならない。第１のス
トラテジーは適当な制限部位を利用するものである。過
当な制限部位がｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡＤＮＡ両省におい
て利用可能である場合には、これらのＤＮＡを対応する
制限酵素で消化し、断片を平滑末端或いはジグザグ末端
（選ばれた制限＃素に応じて）連結により結合する。或
いは又、有用な制限部位は例えば、部位−指向突然変異
誘発ＣＭ、　Ｊ、　Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ　、　、
　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｌｏｏ、４６８（１
９８３）参照〕にょシ突然変異されたＤＮＡが変異され
たアミン数配列を生じないように注意を払いながら導入
することができる。
特に好ましい天然の或いは人工的に導入される制限部位
Ｆｉ、Ａ−及びＢ−＠’ｅコードするＤＮＡ　或いはｈ
−鋲ＶＣ含有される個別のドメイン全コードｔ、６ＤＮ
Ａｉ分離するものである。この様にして、Ａ−鎖ドメイ
ンと触媒作用セリングロテアーゼ領域間に所望の結合を
有するハイブリッドＰＡ’）コードするハイブリッドＤ
ＮＡ　’ｉ生成することができる。
第２１１目のストラテジーは、ドメイン境界が、ゲノム
ＤＮＡにおけるエキソンーイントロン結合部［Ｌ、Ｐａ
ｔｔｈｙ、Ｃ＠ｌｌ　４１　、６５７−６６３（１９８
５）参照］の位置、即ちイントロンがそこでスプライス
されるｃＤＮＡＫおける位置にょシ最良に規定されると
いう仮定よ誘発するものである。これらの位ｉは制限部
位とは稀にしか一致しないので、任意の新しい造成のた
めに用いることのできる方式が採用される。即ち、第一
工程においては、特定のドメイン全コードするが、しか
し、又予想される融合点を越える追加のＤＮＡ配列（数
百個の塩基対まで）を官有する便利な制限断片がバクテ
リオファージｍ１３　　に連結されその中サブクローン
化される。第二工程においては、過ｇｓＪＤＮＡ配列が
１ｎｖｉｔｒｏの突然変異９発によりループアウトされ
る［　Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、上記］。この操作は
、任意の所定ヌクレオチド位置における正確なイン−フ
レーム融合を可能にするので好ましい。
突然変異体ハイブリッドＰＡの製造のためには、成熟ハ
イブリッドＤＮＡの一部の切取りは制限ｖＰ索を用いて
行われる。この方法の前提条件は変更されるべきコドン
の近傍の適当な制限部位が利用可能なことでおる。不９
ｒ望のアミノ酸のコドンを官有する小さい制限断片がエ
ンドヌクレアーゼ切断により除去される。対応する二本
鎖ＤＮＡ配列は例えは所望アミノ酸全コードするトリグ
レクトが用いられる化学合成によシ調裏される。ＤＮＡ
断片は残存する大断片と適当な方向に連結されて突然変
異体ハイブリッドをコードする二本鎖ＤＮＡ配列が得ら
れる。便宜上及びハイブリッド遺伝子の取扱いを容易に
するために、後右はセグメントの挿入及びクローニング
をクローニングベクター中で行うことを可能にする適当
なリンカ−ｆ、勺するよυ大きなりＮＡ上セグメント中
含まれるのが有利である。　　　　゛ 本発明の好ましい実２７１！１態様においては、突然変
異体ハイブリッドＰＡをコードするＤＮＡの調製は部位
−指向突然変異誘発により行われる。この方法は、クロ
ーン化されたＤＮＡの領域内のある規定部位が変更され
ることのできるｉｎ　ｖｉｔｒｏの突然変異誘発操作で
ある（　Ｍ、　Ｊ、　Ｚｏｌｌｓｒ及びＭ。
Ｓｍ１ｔｈの総説文献、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、　１００゜４６８　（１９８３）　；Ｄ、　Ｂｏ
ｔｓｔｅｉｎ及びＤ−５ｈｏｒｔｌｅ＋５ｃｉｅｎｃｅ
　２２９．１１９３（１９８５）参照〕。突然変異９発
は完全ハイブリッドＰＡ遺伝子或いは不所望アミノ酸の
コドンを官有するその機能的匍分のいづれについても行
うことができる。突然変異誘発後、突然変異された機能
的部分をハイブリッドＰＡのその他の部分と結合させて
突然変異体ハイブリッドＰＡｉ与える。
ハイブリッドＰＡ遺伝子或いはその機能的部分の突然変
異方法は、−重鎖遺伝予成いはＰＡ遺伝子又はその部分
全台んでなる一本鎖ＤＮＡが、突然変異全指令するミス
マツチ以外は突然変異されるべきハイブリッド遺伝子の
領域に相補的であるオリゴデオキシリ？ヌクレオチドプ
ライマーにハイブリダイズされ、このハイブリダイズさ
れたオリゴデオキシリがヌクレオチド全プライマーとし
て用いて相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し、得られ几（部分
的）二本鎖ＤＮＡを受容体微生物菌株中に形質転換し、
この微生物菌株全培養し、そして変更されたハイブリッ
ドＰＡ遺伝子（変異体）を有するＤＮＡ全官有する形質
転換棒金選択することを特徴とする。
ハイブリッドＰＡＤＮＡ全含有するハイブリッドベクタ
一本発明はアミノ酸の同一性及び数においてヒトｕ　−
ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも
２個の部分配列より構成されるハイブリッドＰＡをコー
ドする或いはその突然変異体をコードするＤＮＡ　’ｉ
含んでなるハイブリッドベクター及びその製造方法に関
する。
ベクターは形質転換のために予定される宿主細胞に応じ
て選択される。原理的には、不発明に従うｂ［望ポリペ
グチド遺伝子を選はれ′ｆｃ宿主内でし製し、そして発
現する全てのベクターが適当である。適当な宿主の具体
例は制限＃木酸いは修飾酵素のない或いは乏しい真核生
物例えは酵母、例えばサツカロミセス・セレビジアエ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒａｖｉｓｌａｅ　）
、例えはＳ、セレビジアエＧＲＦ１８などがあシ、更に
咄乳動ｖＩＪ細胞特に確立され九ヒト或いは動物細胞系
統、例えはミエローマ細胞、ヒト胚Ｊｆｌｉ繊維芽細胞
Ｌ−１３２、ＣＯ８細胞、ＬＴＫ細胞、ヒト悪性メラノ
ーマＢｏｗａｓ細胞、ＨａＬａ細胞、アフリカミトリ狽
Ｃ０８−７のＳＶ　−４０ウィルス形質転換腎臓細胞或
いはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）細胞及びそ
れらの変種などがある。
上記咄乳動物細胞及びサツカロミセス・セレピジアエの
菌株、例えばＳ、セレビジアエＧＲＦ１８が宿生微生物
として好ましい。
ａ、酵母用ベクター 酵母中における複製及び発現のために適したベクターは
酵母複製開始点及び酵母用選択的遺伝子マーカーを含有
する。酵母複製開始点全含有するハイブリッドベクター
例えは染色体自己ｖＩ製上セグメント　ａｒｍ　）は形
質転換後、酵母細胞内に染色外的に保持され、自己複製
される。更に、酵母２μプラスミドＤＮＡに相同な配列
全含有するベクターを使用することができる。その様な
ハイブリッドベクターは既に細胞内に存在する２μプラ
スミド中に組換により一体化されるか、装いは、自己複
製する。２μ配列は高形質転換頻度を有するプラスミド
には特に適しておシ、高コピー数を可能にする。
酵母用に適当なマーカー遺伝子は特に宿主に坑生物）ｉ
Ｌ耐性全付与するものであり、或いは、栄養要求性酵母
突然変異体の場合には、宿主の欠陥を補完する遺伝子で
おる。対応する遺伝子は、例えば抗生物質Ｇ４１８に対
する耐性を付与し、或いは栄養要求性酵母突然変異体例
えｉｊ　ＵＲＡ　３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３或いはＴＲＰ
　１遺伝子内に原栄養性を与えるものである。酵母ハイ
ブリッドベクターは更に好ましくはハイブリッドベクタ
ー及びそれらの中間体の造成及びクローニングが細藺宿
主内で行われるように細角宿主符にＥ、ｃｏｌｉのため
の複製開始点及びマーカー遺伝子ヲ官有するのが好まし
い。
酵母内で発現するのに遇しに見境制御配列は例えは良く
発現される酵素遺伝子のものである。即ち、ＴＲＰＩ遺
伝子、ＡＤＨＩ或いはＡＤＨＩＩ道伝子、遺伝スファタ
ーゼ（ＰＨ０３或いはＰＨ０５）ｍ伝子、インーチトク
ローム遺伝子のプロモーター、或いは解糖系遺伝子のプ
ロモーター、例えはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３
−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ　）　、ヘキソ
キナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラ
クトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメ７
−セ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキ
ナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ、インベルターゼ及ヒクルコキナ
ーゼ遺伝子のプロモーターを用いることができる。本発
明の好ましいベクターは転写制御を封するプロモーター
例えは生１を乗件の変化によりオン或いはオフにするこ
とのできるＰＨ０５及びＡＤＨｎ遺伝子のプロモーター
などを含有する。例えは、ＰＨ０５プロモーターは率に
培地中の無機リン酸塩の線度を増大成いは減少すること
によって抑制装いは抑制解除することができる。
好ましくは、本発明の酵母ハイブリッドベクターは又転
写停止及びポリアデニル化に通しｆｃ適当なシグナルを
含有する酵母遺伝子の３′隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ
　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）も又含んでなる。適当な３′隣
接配列は例えは用いられるプロモーターに自然に結合し
た遺伝子のもの１例えは酵素ＰＨ０５遺伝子の３′ｖ４
猛配列である。
ｂ、哺乳動物細胞用ベクター 哺乳動物細胞において複製及び発現するためのベクター
はしばしばウィルス起源例えはシミアンウィルス４０（
ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ　）　、アデ
ノウィルス２、ウシパビロマウィルス（ＢＰＶ　）　、
パボパウィルスＢＫ突然変異体（ＢＫＶ）、或いはマウ
ス或いはヒトサイトメガロウィルス（それぞれＭＣＭＶ
及びＨＣＭＶ）からのＤＮＡを備えるものである。
踊乳動物用に適し九発現制御配列は特にＳＶ４０の初期
及び後期プロモーター、アデノウィルスの主要後期（ｍ
ａｊｏｒ　１ａｔｅ　）プロモーター、ネノミメタロチ
オネイン遺伝子のプロモーター及びマウス或いはヒトサ
イトメガロウィルスの主要即時−初期（ｉｍｍｅｄｋａ
ｔｅ−ｅａｒｌｙ　）遺伝子のエンハンサー−プロモー
ター領域、ヒトイムノグロブリンエンハンサ−−プロモ
ーター領域、任慧にＳＶ４０工／ハンサーと組合わされ
たヒトα−グロビンプロモーター及びヒートショック遺
伝子から得られたプロモーターなどが挙けられる。
哺乳動物細胞に適したマーカー遺伝子は例えば抗生物ｉ
Ｇ　４１８及びプレオマイシン−タイプ抗生物質に耐性
を与えるトランスボリンＴｎ５からのそれぞれｎｅｏ及
びｂｌｅ遺伝子、ハイグロマイシン−Ｂ耐性のためのＥ
、　ｃｏｌ　ｎ遺伝子、ＤＨＦＲ″″細胞の表現型ｋＤ
ＨＦＲ細胞に変化させるかそして／又はメトトレキセー
トに耐性を与える囃乳動物細胞或いはＥ、ｃｏｌｉから
のジヒドロ葉酸還元陣索遺伝子（ｄｈｆｒ　）及びＴＫ
−細胞全表現型的にＴＫ＋細胞にする単純ヘルペスウィ
ルスのチミジンキナーゼ遺伝子などである。
好ましくは、唾乳ｗＪ物細胞のためのハイグリッドベク
ターは適当な転写停止及びポリアデニル化のためのシグ
ナル例えはβ−グロビン遺伝子の３′隣接領域（ｆｌａ
ｎｋｉｎｇ　ａｓｑｕａｎｃｅ　）　ｆ　官有する補乳
動物逼伝子０３′非翻訳領域金言有する。ポリペプチド
コード領域に１ｌＡｉｎする領域がそれらの末端におい
て過当なスプライシングシグナル含有する１個以上の生
来のイントロンを含むのが有利である。ｅＤＮＡ及び上
記選択遺伝子の様な原核生物ＤＮＡは一般的にその様な
転写及びプロセッシングシグナルに欠けるので、その様
な付加が必要であると認められる。
好ましくは、その様なベクターはＩｉ：、ｃｏｌｉ中の
増加のための複製開始点及び抗生物質動性遺伝子金含有
する。咽乳動物の複製開始点はベクターの造成中にＳＶ
４０或いは他のウィルス源から得られｆｃ様な真核生物
開始点を富ませるか或いはベクターを宿主細胞染色体中
に一体化しｆｃ際に個主ａ＆！１染色体により与えられ
る。
咽乳動物細胞用の好ましいハイブリッドベクターは、そ
の上流側がネノミサイトメガロウイルスの主要即時−初
期（ｍａｊｏｒ　ｉｍｍｅｄｉａｔ＠−ｅａｒｌｙ）遺
伝子エンハンサーーグロモーターに、そして下流側がそ
の適当なスズライシ／グシグナル及びポリアデニル化配
列を有する第二イントロンヲ富むウサギβ−グロビン遺
伝子の３′末端に作用可能に隣接されているハイブリッ
ドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡ　ｅＤＮＡ　
’に含んでなる。史に、それらはトランスポソンＴｎ５
或いは場合によってはＴｎ９からのネオマイシン耐性遺
伝子をコードする配列又はハイクロロマイシンホスホト
ランスフェラーガをコードする配列を宮有し、これらは
その上流側において逐次ＳＶ４０の複製開始点及びＴｎ
５ｎｅ。遺伝子の天然プロモーターも含むＳＶ４０ウィ
ルスからの初期プロモーターによシ隣接され、そしてそ
の下流側において小を一抗原スゾライシング及びポリア
デニル化シグナルｔ−ｆむＳＶ４０初期遍伝子のセグメ
ントによりｒｓ做されている。全体造成物は、プラスミ
ド複製起源及びアンピシリン耐性遺伝子を含むが、しか
し、鴫乳動物細胞における５Ｖ４０−モードＤＮＡ複製
を抑制する所論毎性配列に欠けるＥ、ｃｏｌｌプラスミ
ドｐＢＲ３２２の断片中にクローン化される。任意にジ
ヒドロ葉酸還元６１Ｘ　（ＤＨＰＲ）　’ｅコードする
遺伝子がベクター中に官まれ、好ましく　ｆ＠　Ｒ，Ｊ
、　Ｋａｕｆｍａｎ　ａｔ　ａＬ。
（Ｍｏｌ　、　ＣａＩ２　、　Ｂｉｏｌ、　２．１３０
４−１３１９　（１９８２））により説明されたモジュ
ールＤＨＦＲ適伝子が用いられる。このモジュールＤＨ
ＦＲａ伝子は逐次アデノウィルスタイｆ２の主要彼期プ
ロモーター、イムノグロブリン遺伝子の断片、　ウｆ　
Ａ”　ＤＨＦＲｃＤＮＡのコード部分及びＳＶ４０の初
期アデニル化部位によ多構成される。
咽乳動物用の新規の好ましいハイブリッドベクターは当
業界における進歩′ｆＩ：構成するものである。
それらはマウスサイトメガロウィルス即時−初期ブロモ
−ター／エンハンサ−中成ヒヘーターグロピンスプライ
シング／ポリアデニル化配列中に位置するクローン化さ
れたｃ　ＤＮＡのための強い発現シグナル？極めて広範
囲のを椎動物細胞タイプにおいて高レベルの発現を可能
にする職境内に含む点においてこれ迄知られたベクター
に比軟してよシ優れたものである。よシ具体的には、こ
れらのベクターは（ａ）通常の、即ち５Ｖ４０−形質転
換されない組織培養細胞糸において、ｃＤＮＡを一時的
に発現するために、（ｂ）シかし更に良好には５Ｖ４０
Ｔ−抗原を発現する霊長類細胞中でよシ高いコピー数に
おいてベクターをその５ｖ４ｏ′ｔＪＬ製開始Ａｋ介し
て複製させるために、しかし、又、（Ｃ）ベクターが宿
主細胞染色体中に一体化することができる場合には通常
の組ｗ１．培養細胞系において安定にその様なりローン
化され７ｔ　６ＤＮＡを発現する九めに、及び（ｄ）ベ
クターがエピゾームとして複製することができる５Ｖ４
０Ｔ−抗原産生霊長類細胞糸にベクターを導入する場合
には、よシ高いコピー数の九めに更により良好に用いる
ことができる。
ＭＣＭＶのエンハンサーープロモーター領域は、例えは
、ＭＣＭＶの主要即時−初期遺伝子のクレオチド−８３
５〜−４４３において開始し、そして５′慣域のヌクレ
オチド＋５０（ｍｌαＡ開始からカウント）において終
了するＤＮＡ　ｌ含んでなる。好ましいＭＣＭＶの工ン
ハンサーークロモーター領域はヌクレオチド−５４２〜
＋５０を含んでなる。
ウサギβ−グロビン遺伝子の３’ｋｉ顎域は、第２エキ
ソン中で、好ましくはＢａｍＨＩ　ｆＭｓ位において開
始し、従って、その隣接配列においてスゲライジングの
几めのシグナルを有する第２イントロンｔ−ｔみ、そし
てポリアデニル化シグナルの背後で、好ましくは上記Ｂ
ａｍＨＩ部位の後１，２ｋｂに位置するＢｇｌ　１部位
で終了する。ウサギβ−グロビン遺伝子の２番目の半分
よシなるＣ　Ｐ、Ｄｌｅｒｋｓ　＠ｔｉｆ、、Ｐｒｏｅ
、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ　７８．１４１
１〜１４１５（１９８１）；Ａ、ｖａｎ　０ｏｙｅｎ　
　＠ｔ　　ａｌ、。
Ｓｃｉ＠ｎｃｖ　　２０６，３３７−３４４（１９７９
））。
ＳＶ４０の複製開始点は例えばウィルスＤＮＡのＨｌｎ
ｄｌｌｌ−８ｐｈ　［断片に含まれている〔ヌクレオチ
ド５１７１〜１２８、開始点＝位置１　；　Ｔｏｏｚｓ
　Ｊ。
Ｃｔｏ者）　ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ＠ｓ　、
　Ｐａｒｔ　２　、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、　＝、−ヨーク、１９８
２〕。
しかしながら、好ましい実施態様は複製開始点に加えて
、さらにベクターの選択遺伝子の転写を促進するのに有
用なウィルスの初期エンノ翫ンサー／プロモーターをも
含有するＨｌｎｄｌｌｌ−Ｈｐａｌｌ断片（ヌクレオチ
ド５１７１〜３４６）である。
ネオマイシン遺伝子は組歇培餐細胞において活性なプロ
モーター、好ましくは上記Ｈｐａ　ｎ　−Ｈ１ｎｄ■断
片上に位置するＳＶ４０の初期プロモーターの後にクロ
ーニングされる。ネオマイシンのコード配列は例えばト
ランスボソンＴｎ５からのＢｇｌ■−８ｍａ　ｌ断片上
に含まれる（　Ｅ、　ＢｅＣｋ　ａｔ　ａｌ、　。
Ｇａｎｅ１９．３２７−３３６（１９８２）；Ｐ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎｅｔ　　ｍｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、
Ｇｅｎ＠ｔ、１．３２７−３４１（１９８２）；Ｆ、Ｃ
ｏ１ｂａｒａ　−Ｇａｒａｐｌｎ　ａｔ　　ａｌ、。
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５０．１−１４（１９８１）
］。ネオマイシン遺伝子は且、ｃｏｌｉにおける転写も
又可能にする第二プロモーター′ｆＩ：４１ｋえるのが
好ましい。
例えば、Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｂｇｌ　１［断片上に好まし
く含まれるＴｎ５ネオマイシン遺伝子の天然プロモータ
ーｔｎｅｏコード配列の前で真核生物プロモーターの後
に置くことができ（５ｏｕｔｈｅｒｎ　＠ｔ　ａｌ、上
記）、或いは更に上流で実根生物プロモーターの前に置
くことができる（　Ｃｏ１ｂｅｒｅ　−Ｇａｒａｐｌｎ
　ａｔ　ａｌ。
上記）。組織培養細胞内で発現されるためには。
細ｍｎｅｏ遺伝子に続いてポリアデニル化シグナル、好
ましくは、スプライシングシグナルをさらに含有するＳ
Ｖ４０を抗原遺伝子の部分が存在しなけれはならない。
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、特に上記Ｔｎ
５断片のＢｇｌ　ｌ　−Ｓｍａ　１部分は又、ハイグロ
マイシンＢホスホトランスフェ２−ゼのコード配列によ
シ、好ましくＦｉ７′ｙｐスミトｐＬＧ８９の１３ａｍ
ＨＩ断片の形態（：　Ｌ、　Ｇｒｉｔｚ　ａｔａｌ、Ｇ
ｓｎａ２５．１７９−１８８（１９８３））　で置換さ
れることもでき、このプラスミドＶｉ最も便利にはＢｇ
ｌ［リンカ−がベクターのＳｍａ　１部位に導入されて
いるｐｓＶ２９１１ｎ＠ｏの訪導体であるｐｓＶｄ（Ｌ
ｕｅｄｌｎ　ａｔ　ａｌ、　、　ＥＭＢＯ−Ｊ、　６．
１０９−１４４（１９８７）、ｌ中に便利に挿入するこ
とのできる。
もう一つの好ましい選択遺伝子は、ｐ　ＳＶ２　ｄｈ　
ｆ　ｒ（ＡＴＣＣ３７１４５）におけるような酵素ジヒ
ドロ来酸還元酵素のコード化配列を用い、これは、形質
転換細胞の選択のみならず、プラスミド付随ＤＮＡ配列
の増幅もしばしば本発明によるグラスミド−コード化タ
ンパク負の比例しｆｃ酋生の増大を伴って可能にする。
ヱｌユｕｆラスミドｐＢＲ３２２から得られる断片はｐ
ＢＲ３２２のａＲ開始点及びアンピシリン耐性遺伝子を
含む。この断片は好ましくはベクターのＳＶ４０　を抗
原−駆動板Ｉ！ｌを阻害する７ｙｒ他毒性配列が除去さ
れているｐｓＶＯｄ　（Ｐ、　Ｍ＠１ｌｏｎ　＠ｔ　ａ
ｌ、。
Ｃｍ　１１ヱ７，２７９〜２８８（１９８１））などの
ｐＢＲ３２２ｗＮ導体からとられるのがよい。
好ましい実施態様において、本発明はプロモーター及び
ハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡｔ
−コード化するＤＮＡ　を含んでなる、真核生物宿主１
株内において複製及び表：ｍｍ選択を行うことのできる
ハイブリッドベクターに胸し、該ＤＮＡは、形質転換さ
れ友宿王内においてそれが発現されてタンパク質が差止
されるように、該プロモーターの制御下に転写開始及び
終了シグナル並びに翻訳開始及び停止シグナルと共に該
ハイブリッドベクター内に配置されている。
不発明のハイブリッドベクターは、例えはプロそ一ター
、ハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡ
コード化領域、３′陶黴配列、及びベクターＤＮＡ　ｉ
含有するＤＮＡセグメントを連結することによシ公知の
方法によシｐ４表される。
ＤＮＡセグメントｉｉｎ　ｖｉｔｒｏで連結するために
、各鴇技術が使用される。ある糧の制限＃素に工り生成
され几平滑末端（完全に塩基対形成された■仏二不知）
は［接にＴｄＤＮＡＩＪガーゼで連結されてよい。ニジ
晋通には、ＤＮＡセグメントはそれらの一重鎖粘漕末為
によ多連結され、ＤＮＡ　ｖガーゼ、例えばＴ　４　Ｄ
ＮＡ　！ｊガーゼによシ共有結合的に閉じられる。その
様な一本鎖「粘着末端」は、）徨ヲジグザグ末端（ＤＮ
Ａ二本鎖の二本の鎖が幾つかのヌクレオチドだけ離れた
点で切断される）を生成するもう一つのクラスのエンド
ヌクレアーゼによｐＩｌｌＮＡを切断することにより形
成される。−軍餉は又、末端トランスフェラーゼを用い
て平滑末端或いはジグデグ末端にヌクレオチド金付加す
ることによって（「ホモポリマーテーリング」）、或い
は単に平滑末端ＤＮＡセグメントの一本ｆＩｉＬｔａ当
なエキンヌクＬ／　７−−ｋ”　例えは人工キソヌクレ
アーゼテテユーパックすることによっても形成すること
ができる。ソグデグ末錫の生成への史に一つの手法は、
平滑末端ＤＮＡセグメントにジグザグ末湘形成エンドヌ
クレアーゼの誌臓部位を含有する化学的に合胞されたリ
ンカ−ＤＮＡを連結し、そして得られたＤＮＡを対応す
るエンドヌクレアーゼで消化することにめる。本発明に
よるハイブリッドベクターの成分は過当な憬舵を確実に
するためにｂ［定順序で一軸に結付される。
以下余臼 ハイブリッドＰＡ　ＤＮＡを含有するハイブリッドベク
ターで形質転換された宿主 本発明のもう一つの面はアミノ酸の同一性及び数におい
てヒ１−ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡの部分配列に対応する少
なくとも２個の部分配列により構成されるハイブリッド
ＰＡをコードする或いはその突然変異体とコードするＤ
ＮＡを含んでなるハイブリッドベクターで形質転換され
た真核生物宿主生物、及びその宿主の突然変異体、及び
それらの製法を含むものである。
適当な真核生物宿主の具体例は上記のものであり、特に
酵母及び哺乳動物細胞株である。形質転換イｄ主生物体
の突然変異体は特にハイブリッドＰＡ或いは突然変異体
ハイブリッドＰＡを分解するグロテアーゼに乏しくそれ
ぞれハイブリッドＰＡ及び突然変異体ハイブリッドＰＡ
のより高い収率を与える突然変異体が挙げられる。
形質転換体真核生物宿主の製造方法は、発現制御配列に
より制御される本発明のＤＮＡを含んでなる発現ベクタ
ーで真核生物宿主を形質転換即ちトランスフエクション
することを特徴とする。
真核生物宿主細胞の形質転換は公知の方法により達成さ
れる。例えば、酵母の形質転換はＨｌｎｎｅｎｅｔ　ａ
ｔ、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　ＵＳＡ　７５゜１９１９（１９７８）　）により説
明されている方法に従って達成される。この方法は次の
三工程に分けることができる： （１）酵母細胞壁或いはその部分の除去。
（２）「裸」の酵母細胞（スペログラスト）のＰＥＧ（
＄リエチレ／グリコール〕及ヒＣａ２＋イオンの存在下
における形質転換ＤＮＡによる処理。
（３）寒天の固体層中における細胞壁の再生及び形質転
換細胞の選択。
好ましい方法： 工程１：酵母細胞壁は、各種グルコシダーゼの調製物、
例えばカタツムリ胃液（例、　Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ■或
いはＨｅ１ｉｅａｓｅ■）或いは微生物から得られた酵
素混合物（例、　Ｚｙｍｏｌｙａｓａ■）により、浸透
圧的に安定化された溶液（例、ＩＭ　　ソルビトール）
中において酵素的に除去される。
工程２　：　ＰＥＧの存在下で酵母スフェロプラストが
凝集し、そして細胞質膜の局所的融合が誘発される。「
噛合様」条件の生成が重要であり、多くの形質転換酵母
細胞は形質転換の過程において２倍体或いは３倍体にさ
えもなる。融合したスフェロプラストの選択を可能にす
る操作を用いて形質転換体を濃縮することができる。即
ち、形質転換された細胞は予備選択された融合生成物中
から容易にスクリーニングすることができる。
工程３：細胞壁のない酵母細胞は分裂しないので細胞壁
は再生されなければならない。この再生はスフェロプラ
ストを寒天中に包埋することによりなされるのが匣利で
ある。例えば、溶融寒天（約５０℃）をスフェロプラス
トと混合する。溶液を酵母生育温度（約３０℃〕まで冷
却すると、固体層が得られる。この寒天層はスフェロプ
ラストからの必須巨大分子の迅速的な拡散及び損失を防
止して細胞壁の再生を容易にする。しかしながら、細胞
壁再生は又（より低い効率であるが）スフェロプラスト
を予備形成された寒天層の表面上にプレート培養するこ
とによっても得られる。
好ましくは、再生寒天は形質転換細胞の再生及び選択を
同時に行うようにして調製される。アミノ酸生合成経路
の酵素をコードする酵母遺伝子が一般的に選択マーカー
（上記）として用いられるので、再生は好ましくは酵母
最小培地寒天内で行われる。極めて高い再生効率が必要
とされる場合には、次の二つの工程操作が有利である：
（１）富んだ複合培地内における細胞壁の再生、及び（
２）細胞層の選択寒天プレート上へのレグリカグレーテ
ィングによる形質転換細胞の選択。
ハイブリッドベクターの哨乳動物細胞中への導入はヘル
パー化合物例えはソエチルアミノエチルデキストラン、
ツメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレング
リコールなど、或いは共沈殿としてのベクターＤＮＡ及
びリン酸カルシウムの存在下におけるトランスフェクシ
−１７によりなされる。更に適当な方法としては、ベク
ターＤＮＡの細胞核中への直接マイクロインノエクン−
Ｉ／及びエレクトロＩレージ９ノ即ち細胞膜の透過性を
増太する短い電気パルスによるＤＮＡの導入などが挙ケ
ラれる。トランスフェクシヨンされた細胞の引続く選択
は、発現ベクターに共有結合により一体化されるか或い
は別の存在として添加される選択マーカーを用いて行う
ことができる。選択マーカーとしては抗生物質に対する
耐性を与える遺伝子或いは宿主細胞の遺伝的欠陥を補完
する遺伝子が挙げられる（上記〕。
一つの好ましい選択系は外因的ＤＩ（ＦＲ遺伝子が供給
されなければ成長に絶対にチミノ／、グリシン及びプリ
ン類を必要とするジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＲＦ−）
に欠ける細胞、例えばＣＨＯ細胞を利用する。ハイブリ
ッドＰＡ遺伝子を官有するベクター及びこれに加えてＤ
ＨＦＲ遺伝子を適当なりＨＦＲ細胞例えばＣＨＯ細胞に
導入すると、形質転換細胞は抗−葉酸剤メトトレキセー
トの濃度を培地中において増大することにより選択され
る。
特に、好ましいのは適当な哺乳動物細胞例えばＣＨＯ細
胞がハイブリッドＰＡ遺伝子及び抗生物質耐性例えばＧ
−４１８に対する耐性をコードする遺伝子を含有するベ
クターＤＮＡと、リン酸カルシウムとの共沈殿により処
理される選択方法である。形質転換された細胞は対応す
る抗生物質例えばＧ−４１８中で培養し、セして／又は
ハイブリッドＰＡ発現についてスクリーニングすること
により選択される。
本発明の形質転換された宿主生物体は公知の突然変異及
び選択適用方法によりハイブリッドＰＡ或いは突然変異
体ハイブリッドＰＡの産生について改良される。この突
然変異は例えば紫外線照射或いは適当な化学薬品により
行うことができる。
特に好ましいのは、産生されたハイグリッドＰＡ及び突
然変異体ハイブリッドＰＡのタンパク質分解的破壊をそ
れぞれ回避するためのグロテアーゼー欠陥突然変異体、
特に酵母突然変異体の製造である。
本発明は更にアミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ−
ＰＡ及びヒトｕ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも
２個の部分配列により構成されるアミノ酸配列を有する
一重鎖ノ＼イブＩＪ　ツドＰＡ或いはその突然変異体の
製造方法であって、適当な栄養条件下において該ノ・イ
ブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡをコー
ド化するＤＮＡ配列を含有する形質転換真核生物宿主を
培養し、そして該ハイブリッドＰＡ或いはその突然変異
体を単離することを特徴とする方法に関する。
形質転換された宿主細胞は同化可能な炭素源、窒素源及
び無機塩類を含有する液体培地中において公知の方法に
より培養される。
本発明の形質転換された酵母細胞の培養のためには、各
種炭素源を用いることができる。好ましい炭素源の具体
例は同化可能な炭水化物、例えばグルコース、マルトー
ス、マンニトール或いはラクトース或いはアセテートで
あり、これらはそれ自体或いは適当な混合物として用い
ることができる。適当な窒素源の具体例としては、アミ
ノ酸、例えばカブミノ酸、イグチド類及びタンパク質及
びそれらの劣化生成物例えばトリノトン、ペゾトン或い
は肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、及び又アンモニ
ウム塩例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、或
いは硝酸アンモニウムがどでおり、それらはそれ自体或
いは適当な混合物として用いることができる。更に使用
することのできる無機塩類はナトリウム、カリウム、マ
グネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
、及び炭酸塩である。
培地は更に例えば成長促進物質、例えば微量元素例えば
鉄、亜鉛、マンガンなど、及び好ましくは選択圧力を働
かせて発現グラスミドを失った細胞の成長を防止する物
質を含有する。即ち、例えば、必須アミノ酸中で栄養素
要求性である酵母菌株が宿主微生物として用いられる場
曾に、！ラスミドはこの宿主の欠陥を補完する酵素をコ
ード化する遺伝子を含有するのが好ましい。この酵母菌
株の培養は該アミノ酸に欠ける最小培地中において行わ
れる。
培養は公知の方法により行われる。培養条件例えば温度
、培地の一値、及び発酵時間は本発明のＰＡタンパク質
の最大力価が得られるように選ばれる。即ち、酵母菌株
は通気条件下に浸透或いは攪拌しながら液内培養により
約２０〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度、５〜８の
一値好ましくは約Ｐ１″１７において約４〜３０時間、
好ましくは本発明のタンパク質の最大収電に達するまで
培養されるのが好ましい。
哺乳動物細胞は任意に成長促進物質及び／又は哺乳動物
血清を補給された市販の培地を用いて組織培養条件下に
生育される。細胞は固体支持体例えばマイクロキャリヤ
ー或いは多孔性ガラス繊維に付着するか或いは適当な培
養容器内で自由浮遊されて生育される。培養培地は選択
圧力が働いて遺伝子マーカーを営むハイブリッドベクタ
ーＤＮＡを尚含有する細胞のみが生残るようにして選択
される。即ち、例えば、ハイブリッドベクターが対応す
る抗生物質耐性遺伝子を含む場合に抗生物質が培地に添
加される。
細胞密度が十分な値に到達した時点で培養を中断し、タ
ンパク質を単離する。哺乳動物細胞を用いる場合には、
ハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ハイブリッドＰＡタ
ンノぞり質は通常培地中に分泌される。この生成物を含
有する培地を細胞から分離し、この細胞に新たな培地を
与えられて連続製造に用いることができる。酵母細胞が
用いられる場合には、夕／・母り質は又細胞内、特にベ
リグラズム空間にも蓄積することができる。後者の場合
、ＰＡり／ノ９り質の回収のための第１工程はタンパク
質を細胞内部から放出することにある。殆んどの操作に
おいて、細胞壁を先ずグルコシターゼ類（上記）による
細胞壁の酵素消化により除去する。或いは又、細胞壁を
化学薬品例えばチオール試薬或いはＥＤＴＡなどによる
処理により除去するが、これは細胞壁に傷を生せしめ、
産生されたノ・イブＩＪ　ノドＰＡ或いはその変異体を
放出させる。
得られた混合物は通常の手段に例えばポリエチレンイミ
ンを用いる処理による殆んどの非タンパク質物質の除去
、硫酸アンモニウムを用いるタンパク質の沈澱、ゲル電
気泳動、透析、クロマトグラフィ、例えばイオン交換ク
ロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ＨＰＬ
Ｃ或いは逆相ＨＰＬＣ１適当な５ｓｐｈａｄａｘ■カラ
ム上における分子サイジングなどにかけてノ・イブリッ
ドＰＡ或いはその変異体の濃縮を行う。この予備軸装さ
れた生成物の最終精製は、例えばアフィニティクロマト
グラフィ例えば抗体アフィニティクロマトグラフィ、特
に公知の方法で不溶性マトリックス上に固定されたモノ
クローナル抗−ｔ−ＰＡ或いは抗−ｕ−ＦＡ抗体を用い
るモノクローナル抗体アフイニテイクロマトグラフイ或
いｒｔｔ−ＰＡの触媒作用Ｂ−鎖を含有するハイブリッ
ドＰＡの場合には、ＤＥ−３アフイニテイクロマトグラ
フイ（ＤＥ−３はＥｒｙｔｒｉｎａｔａｔｉｓｓｌｍａ
から単離されたグロテアーゼ阻害剤である）などにより
達成される。
ｔ−ＰＡ或いはｕ−ＰＡの特異的ドメインに向けられた
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系統
及び該モノクローナル抗体は又本発明の目的でめる。
二本鎖形態を実質的伴わない一本鎖形態のノ・イグリノ
ドＰＡ或いは突然変異体ノ・イブリッドＰＡの１更利な
製造のためには、培養培地中に存在し、一本形態の二本
鎖形態への（部分的）転換を引起こすことのある微量の
グロテアーゼを阻害するために、グロテアーゼ阻害剤例
えばアプロチニン（Ｔｒａａｙｌｏｌ■〕或いは塩基性
膵臓トリプクン阻害剤を精製操作時に含ませるのが有利
である。最終精製は、次いで、選択的アフィニティ試薬
を含有するカラム上でのクロマトグラフィにより達成さ
れる。
５、医薬組成物 本発明によって得ることのできる新規−重鎖ハイブリッ
ドＰＡタン・！り質及びその突然変異体は貴重な薬学的
性質を示す。それらはグラスミノ−ダン活性の機構を介
して局所的フィブリン分解或いはタンノやり質分解活性
をもたらしたい場合の血栓症その他の状態例えばアテロ
ーム性動脈硬化症、心筋及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓
塞栓症、手術後血栓症、血栓静脈炎及び糖尿性血管症な
どの予防或いは治療のためにヒトにおける公知のプラス
ミノーデ／アクチペータと同様に用いることができる。
驚くべきことに、本発明による新規ノ・イブリッドＰＡ
タンパク質及びその突然変異体は天然１−ＰＡ及びｕ−
ＰＡの有益な性質を合わせ持つことが判明した。即ち、
新規ハイブリッドＰＡタン・臂り質及びその突然変異体
は繊維素分解活性含有する。
この独特なフィブリン−指向特性即ちフィブリ／の存在
下において優先的にグラスミノ−ｒン活性化する能力が
保持されている。更に新規タン・ンク質は真性のｔ−Ｐ
Ａに比較して長時間のｉｌ　ｖｉｖ。
安定性を有する。
本発明は又治療的に有効量の有効成分（ハイブリッドＰ
Ａ或いはその突然変異体〕を非経口的、即ち筋肉内、皮
下或いは腹腔内投与に適し、有効成分と悪い相互作用を
行わない有機或いは無機の固体或いは液体の薬学的に許
容可能な担体と共に含んでなる医薬組成物にも関する。
適当な注入溶液、好ましくは水溶性或いは水性分散液が
あり、これらは使用前に例えば有効成分単独、或いはマ
ンニトール、ラクトース、グルコース、アルブミンなど
の担体と共に含有する凍結乾燥調剤から１１１１するこ
とが可能である。この医薬組成物は殺閑され及び必要に
応じて補助剤例えば防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤
、緩衝剤及び／又は浸透圧を制御するための塩類などと
混合される。殺菌は小孔径（０，４５μｍ直径以下）の
フィルターを通す殺菌濾過により達成することができ、
その後組成＠を必要に応じて凍結することができる。殺
菌性を保存するのが助ける次めに抗生物質も又添加され
てよい。
本発明による医薬組成物は単位投与形態、例えば単位投
与当り１〜２０００１１１９の薬学的に許容可能な担体
及び単位投与当り約１〜２００ｒｎｇ、好壕しくは約５
〜１００〜の有効成分を含んでなるアンプルとして調剤
される。
病気のタイグ及び患者の年令、状態に応じて、約７０ゆ
の体重の患者の治療に投与される毎日の投与量は２４時
間当シ３〜１００ｒｎＱ、好ましくは５〜５０ｍ９であ
る。心筋梗塞の場合には、好ましくは約３０〜８０〜が
６０〜１２０分以内に、好１しくけ約９０分以内に３回
分けて投与される。
ハイブリッドＰＡ或いは突然変異体ノ１イグリット・Ｐ
Ａの全量は又ざ−ラス注射としても投与することができ
る。
本発明は又本発明により生物学的に活性なタン・ぐり質
が薬学的に許容可能な担体と混合されることを特徴とす
る医薬組成物の製造方法も樽供する。
新規タン・ぐり質の人体の予防的及び治療的治療の使用
も又本発明の目的である。
本発明は特に実施例において説明されたＤＮＡ類。
ハイブリット９ベクター、形質転換された宿主菌株、ハ
イプリッｌ−″ＰＡタンツク質、突然変異体ハイブリッ
ＰＰＡタンパク質、ハイプリドーマ細胞系統、モノクロ
ナール抗体及びそれらの製造方法に関する。
実験の部 部位の導入 ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ両者のドメインを含有するキメラ
或いはハイブリッド分子を造成するために用いられる一
つの手法は、各々のクローンから得られた目的制限断片
を調製し、それらを溶液中において再編成し、次いで得
られた造成物をクローン化することＫある。クローン化
後、キメラ分子の構造は制限マツピング及びＤＮＡ配列
分析により検証される。
ハイブリッド分子を得るためには、ｔ−ＰＡ及びｕ　−
ＰＡ　ｃ　ＤＮＡの両者を各々のクリングル構造及び酵
素ドメイ／の間の連結部において切断する。これはｕ−
ＰＡＫついては、非−触媒作用ドメインを酵素ドメイン
及びその３′末端における関連配列と分離する制限酵素
Ｍａｔｌによる部分的消化を行うことにより達成される
。ｔ−ＰＡ中にはこれに匹敵し得る有用な潜在的切断部
位が存在しないので従って、これを以下の様にして導入
する。
５図参照） この造成において、ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡのヌクレオチド
位［９４０−９４５における非反復Ｓｅａ　１都立（Ａ
ＧＴＡＣＴ）を破壊し、（ＡＧＴＡＣＴ→ＡＧＴＡ工Ｔ
）及びもう一つのＳｅｔ　１部位乞クリ／グル２０３′
末端におけるヌクレオチド位置９６３−９６８　（ＴＣ
ＣＡＣＣ→ＡＧＴＡＣＴ　）において導入する（第１図
及び第２図参照〕。これらの変化によってはいづれのア
ミノ酸のコードも影響を及ぼされない。
全ての制限消化は製造元（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｌｏｌａｂｓ。
Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）の指
示事項に従つって行われ、得られた消化物は３．５％ぼ
りアクリルアミドグル上の電気泳動により分析された。
グルはエチノウムプロマイド（１，０μｆ／ｍｌ　）で
染色し、紫外線で可視化された。適当なバンドを切出し
、０．５ｘＴＢＥ（ｔＸＴ’ＢＥ＝９０ｍＭ　Ｔｒｉｍ
−ホウ酸塩、−８，３，２，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中で
電気溶出された。電気溶出された物質をＥｌｕｔｔｐ−
ｄカラム（５ｃｈｌａｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ
ｌ　）にかけ、結合ＤＮＡを高塩中に浴出させ、エタノ
ールを添加して沈澱した。イレットをエタノールで洗浄
し、乾燥し、水に溶解した。
ヒトｔ−ＰＡ　　ｃＤＮＡ（ＨｓＬａＳ　３細胞から単
離したｍＲＮＡから合成したグラスミドｐＢＲ３２２の
Ｐｓｔ１部位中にクローン化したもの）を含有するゲラ
スミ　ドＰＷ３４９Ｆ（ヨーロツノや特許出願１４３，
０８１号明細棗）をＥｅ　ｏＲＩで消化し、４７０塩基
対（ｂｐ）断片（第２図参照）を単離した。４７０　ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ断片を５ｅａｌ及びＨａｅｌｌでそれぞ
れ消化することＫより、１５０　ｂｐ　ＥｅｏＲ（−８
ｅａｌ及び２９０　ｂｐＥｃｏＲｌ−Ｈａｅ［［断片を
得た。ＤＮＡをＤＭＳ　Ｏ緩衝液（３０％ＤＭＳ０．１
ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％キシレンシアツール、０．０
５％ブロムフェノールブルー）中において変性し、そし
て０．５ＸＴＢＥ中において５％ポリアクリルアミドゲ
ル中で８Ｍル）　／　ｃｒｓにおいて電気泳動すること
により、４７０　ｂｐ　ＥｅｏＲＩ断片の二本の鎖を分
離した。（Ｍａｎｉａｔｌｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ　ｌ
＠ｃｕｌａｒＣＩｏｎｌｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ二１９８２　）、分離され
た鎖は、電気溶出及びそれに続くエタノール沈殿により
回収した。ホスホトリエステル法を用いて３１−マーデ
オキシオリゴヌクレオチド（５個の目的ヌクレオチド変
化を含む、第５図参照）が合成された。５０ｐモルの３
１−マーを、１×キナーゼ緩衝液（１０×キナーゼ緩衝
液＝　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ）１７．５．
０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２５０ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭスペ
ルミジン、１ｍＭＥＤＴＡ）、３０μＣｉ［α３２Ｐ〕
ＡＴＰ　（Ａｍｅ　ｒ　ａ　ｈ　ａｍ、約３０００Ｃ１
／ｍモル）及び１０単位のＴ、　、ｔ？リヌクレオチド
キナーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａｌｓｓｅａｒｅｈ　Ｌａｂ
＋、）　ｔｌ−含有する２０μｌ反応液中において５′
末端において　Ｐ−標識化した。反応成金３７℃で３０
分間インキュベート後、１μｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ、１
０単位のＴ４キナーゼを添加し、史に３２０で３０分間
インキエペートした。反応は６８℃において１０分間加
熱することにより終了させた。その配列が非転写鎖のそ
れである標識化された３１−マーをトンドブロット分析
におけるグローブとして使用して［Ｚｏｌｌ＠ｒ　ａｎ
ｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｎｕａｌ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　１０．６４８７−６５００　
（１９８２）に従って行った：但しグリハイブリグイゼ
ーション及びハイブリグイゼー７０ノは５０℃において
行われ、洗浄は６０℃において行われた］、二本鎖のい
づれかそｎにハイブリダイズするか即ち転写された鎖を
表わすか全決定した。四つのＤＮＡを０．３ｐモルの転
写類、各２ｐモルの１５０’ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１−８ｅ
ａ　ｌ断片及び２９０ｂｐ　Ｅｅｏ　ＲＩ−ＨａｅＩ［
ｌ断片、２５ｐモルのホスホリル化３１−マー及びｌ×
アニーリノグ緩衝液（５×アニーリング緩衝液＝０．５
Ｍ　ＮａＣ６１３２−５ｍＭＴｒｉ＠・ＨＣ６ｐＨ７，
５，４０ｍＭ　Ｍｇ　ｌ：ｔ２及び５ｍＭβ−メルカグ
トエタノール）よりなる２０μｌのアニーリング反応液
において一緒に混合した。この混合物と１００℃で３分
間、３０℃で３０分間、４℃で３０分間インキエペート
した後、１０分間氷上で冷却後４００単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　）
　ｆ添加し、反応液ｉ１２．５℃で一昼夜インキエペー
トした。４７０ｂｐのアニーリングされた断片を上記の
如く３．５％ポリアクリルアミドゲルから回収し、１２
℃における一昼夜のインキ−ページ、７により、　５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ６ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇｃ
ｚ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ、　１　ｍ！ｉｌｌ　ＡＴＰ、
　１ｍＲＬＸペルミジン、０．１ｍ９／ｄウシ血清アル
ブミン中において、Ｅｃｏ　ＲＩ消化された脱ホスホリ
ル化ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ　）に連結した。５０．ａＰ／ｄのアンビ
ンリフ全含有するＬ−９天上でアンピシリン耐性コロニ
ーを選択し、４７０　ｂｐ断片を含有するコロニーを３
１−マーをグローブとして用いるコロニーハイプリダイ
ゼーシランにより確認した〔Ｄ。
Ｗｏｏｄｓ、　Ｆｏｃｕｓ　６．１−３（１９８４）］
。グラスミドＤＮＡを幾つかの陽性にハイブリダイズす
るコロニーから小規模に単離し［Ｈｏ　１ｍｅ　ｓ　ｅ
　ｔ　ａｔ、＋　Ａｎａｌｙｔ。
Ｂｉｏｃｈａｍ、　　１１４，１９３１９７（１９８１
）］、そして新しいＳｅａ　１部位の生成ｔＥｃｏＲＩ
及びＳｃａ　ｌ消化の組合せにより検証した。純度を確
実にするために、ＩｓＩコロニーからのプラスミドＤＮ
ＡをＥ、　ｃａｌ　ｉ　ＨＢｌｏｌの第２ラウンドの形
質転換に用いた。大規模プラスミド調製はその櫟な第二
世代陽性コロニーから行われ［Ｋａｔｚ　ａｔ　ａｌ、
、Ｊ、Ｂａｅｔｅｒｉｏｔ、ｌＩＣ５７７−５９１（１
９７３）：　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６．１６７
７−１６８３　（１９７７）］、そして元の５ｅａｌｉ
位の破壊及び新しいＳｃａ　Ｉ部位の生成はＭａｘａｍ
　、ＦｌびＧ１１ｂｅｒｔの方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ
ｎｚｙｍ、６５．４９９−５６０（１９８０，）］を用
いるＤＮＡ配列分析により検証された。このグラスミド
１ｋｐＦＪｃｏ　Ｏ，４７ΔＳｅａ　ｌと命名する。
この造成においては野性型ヒト　ｔ−ＰＡ上に存在する
４７０ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩ断片を変異体Ｓｃａ　１部位
を含有する４７０ｂｐ　Ｅａｏ　ＲＩ断片と交換した。
ヒトｔ−ＰＡｃＤＮＡを含有するグラスミドＰＷ３４９
Ｆ（上記参照）をＣ１ａ　■で消化し、得られた粘着末
端を各々５０　μｍのｄＣＴＰ％ｄＧＴＰ及び１０単位
のＤＮＡ　ｙｊｅリメラーゼ１１クレノウ断片（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ　。
Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）を添加することにより、平滑化し
た。
反応液を室温で３０分間インキュベート後、フェノール
及びエーテル抽出及びエタノール沈澱を行った。４レツ
トを水に溶解し、Ｅｅｏ　ＲＩ及び５ｅａＩで消化し、
そして１．５　ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ１−８ｅａ　Ｉ断片及
び４ｙ３ｓｃｂ　Ｃ１ａ　Ｉ　　（平滑末端）　−Ｅｃ
ｏ　ＲＩ断片を単離した。これらの二つの断片を、Ｅｃ
ｏ　ＲＩ消化後にプラスミドｐＥｃｏ　Ｏ，４７ΔＳｅ
ａ　ｌから回収した４７０ｂｐ断片と混合し、上記の如
く一昼夜１２℃において連結させた。コンビテン）Ｅ、
ｅｏｌｉＨＢ１０１細胞を連結ミックスで形質転換し、
テトラサイクリン耐性コロニーを１２．５μｆ／ｄテト
ラサイクリンを含有するＬ−寒天上で選択した。４７０
ｂｐ突然変異体断片を含有するコロニーを前記３１−−
ｒ−ｆ　ニア’　ｏ−フ（！：　Ｌ　テ用いるコロニー
ハイフリダイゼーシ町ンにより確認した。幾つかの陽性
にハイブリダイズするコロニーのミニ溶解物からＤＮＡ
を調整し、適当な制限消化を行うことにより造成物の正
確な性質を検証した。所望の変化を起こしたその様な一
つのプラスミドをｐｈ−ｔＰＡΔ５ｅａＩと称する。
この造成はｕ−ＰＡの非触媒作用ドメイン（５′非コー
ド化領域、シグナル、成長因子及びクリングル配列を含
有する）とヒトｔ−ＰＡの触媒作用即ち酵素ドメイン間
のハイブリッドである。
ウロキナーゼｃ　ＤＮＡをヒトＨｏｐ　３細胞から得ら
れるｍＲＮＡから調製した［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ａｔ　ａｔ−＋Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
（１９８２）、ｐ、１８８−２４６参照］。ｕ−ＰＡ　
ｃＤＮＡ　１．３　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ−Ｂａｍ　ＨＩ断
片及び１　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ−Ｆ２ｃｏ　ＲＩ断片１
ｐＵＮ１２１のＳｍａ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒｒ部位中にクロ
ーン化し［Ｂ。
Ｎｉ１ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、ＩＬ８０１９−８０３０（１９８３）　
］、グラスミドｐｃＵＫ　１７６を得た。ヒト　ｕ−Ｐ
Ａ　ｃＤＮＡインサートの制限酵素地図を第４図に示す
。ｕ　−ＰＡインサートのヌクレオチド配列及び推定ア
ミノ酸配列を第３図に示す。
グラスミドｐｃＵＫ１７６をＸｍａ　ｌ　（第４図参照
、Ｘｍａ　ｌはＳｍｍ　ｌのアイソシゾマーである）及
びＭｓｔｌで消化し、５２１ｂｐ断片を単離した。制限
を示す）を認識し、消化時に平滑末端を生成する。
この酵素は従ってｕ　−ＰＡ　ｃＤＮＡをヌクレオチド
５２０−５２５　Ｋオいて、即ち最後のシスティン残基
（アミノ酸残基１３１）直後のクリングルよりなるとこ
ろで切断し［Ｈｏｌｍｅｓ　ｓｔ　＊Ｌ、　、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ旦、９２３−９２９　（１９８５
）］、従って非触媒作用ドメイン及び触媒ドメインのた
めのコード配列を明確に分離する。
！ラスミドｐｌｒｔＰＡΔＳｅａ　ｌをＳｅａ　ｌ及び
Ｈｌ　ｎｄｍ　（Ｈｌｎｄ　［１はベクター中に存在す
る〕で消化し、１．８ｋｂ　　断片を回収した。制限酵
素Ｓｅａ　ｌはＤＮＡ又消化時に平滑末端を生ずる。Ｓ
ｅａ　ｌはｐｈ−ｔＰＡΔＳｅａ　Ｉ　ＤＮＡをセリン
残基２６２の後で切断する〔クリングル２の最後のシス
ティンを過ぎた１アミノ酸：　Ｐｅｎｎ１ｅｓ　ａｔ　
ｈＬ、　、　Ｎａｔｕｒ＠３０１　＋　２１４−２２１
（１９８３））、従って、非触媒作用ドメイン及び触媒
作用ドメインを分離する。
これらの二つの断片を混合し、Ｘｍａ　Ｉ　、　Ｈ１ｎ
ｄｎｌ切断ｐＵｃ１ＢベクターＤＮＡに連結した。Ｅ、
ｃｏＬ％ＨＢ　１０１の形質転換後、正しいインサート
を有するコロニーをヒトｔ−ＰＡの２．０　ｋｂ　Ｂｇ
ｔ　ＩＩ断片（第２図参照）をプローブとして用いるコ
ロニーノ・イブリダイゼーシ、ンによシ確認した〔この
プローブはランダムプライミング法により標識化された
：Ｆ’ｅｌｎｂ＠ｒｇ　ａｔ　ａＬ、、　Ａｎａｔｙｔ
、　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ＋１３２＋６−１３（１９８３））
。ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ断片の連結部におけるＤＮＡ配
列ｄ　ＤＮＡ配列分析により検証された。一つの正しい
クローンをｐＵＮＣ−ｔ　ｃと命名する。
この造成物は、ｐｈ−ｔＰＡΔＳｅａ　Ｉの非触媒作用
、トメイアＣ５′非コード化領域、リーダー、フィンが
−、成長因子、クリングル１及びクリングル２ドメイン
を含有する）がヒト　ｕ−ＰＡの触媒作用ドメインに融
合している点くおいて正にｐＵＮＣ−ｔ　ｃの逆である
。シラスミドｐｈ−ｔＰＡΔＳｅａ　ＩをＳａｃ　Ｉ及
び５ｃａＩ（第８図参照）で消化し、約１．Ｏｋｂ断片
を単離した。プラスミドｐｃＵＫ　１７６を先ずＢａｍ
ＩＩで消化し、次いでＭｓｔＩで部分的に切断し、約８
００ｂｐの断片を回収した。次いでＢａｍＨＩ消化物を
ＥｃｏＲＩで切断し、約１．０ｋｂの断片を単離した。
これらの三つの断片を５ａａＩ　、ＥｅｏＲＩで消化さ
れたｐＵＣ１９ベクターと混合し、連結した。
Ｅ、　ｅｏｔｌ　ＨＢＩＯＩをこの連結ミックスで形質
転換し、正しいインサートを有するコロニーを上記と同
一の２．０　ｋｂ　ＢｇＪＩＩを用いるコロニーハイプ
リダイゼーシ、ンにより確認した。ｔ−ＰＡ及びｕ　−
ＰＡＤＮＡの連結部におけるＤＮＡ配列はＤＮＡ配列分
析によシ検証した。一つの正しいクローンヲｐ　ｔＮＣ
−ＵＣと称する。
これけ五工程によシ達成される（第９図）。
シラスミド１）Ｗ３４９Ｆ（コーロッ／中特許出願１４
３．０８１号明細書）を、プラスミドの二次的切断を抑
制するために１０μｍ／／Ｍｌのエチジウムブロマイド
を補給された以外は製造元（Ｂａｔｈ＠５ｄａＲｅｓ＠
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ＠ｓ）Ｋより推薦され
た緩衝液中において、１２Ｕ／ｄの酵素によシ３７℃で
１時間、２０μ、９／ｍＤＮＡのインキエペーシ。
ンにより制限酵素）（ｇｉＡｌで部分的に切断した。線
形化された！ラスミドＤＮＡ　を次いでＴＢＥ緩衝液（
ＴＢＥ　：　１　ｍＭＥＤＴＡを含有する８９ｍＭＴｒ
ｉｓホウ酸塩、ｐＨ８，９）中の０，８４アがロースグ
ルにかけ。
同一緩衝液内で電気泳動的に溶出させ、フェノールで２
回抽出し、クロロホルムで２回抽出し、最後に０．１容
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｕ（５，２）を添加後に一２０
℃でアルコールで沈澱させた。ペレット化されたＤＮＡ
を０．２■／ｄでＴＥ（ＴＥ：１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｌｓ　
−ＨＣＬ　ｐＨ７，２及び０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）
中において溶解した。
６３μｔの線形化され九ＤＮＡを次いでリガーゼ緩衝液
（３３ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸塩（ｐＨ７，９）、６６ｍ
Ｒｔ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、Ｑ、５
ｍＭゾチオスレイトール及び０．　Ｉ　Ｊｎ９／ｍウシ
血清アルブミン〕中１５ＵのＴ４ＤＮＡポリメラーゼで
３７℃において３０分間インキエペート後６０℃におい
て１０分間加熱することによシ酵素を不活性化した。こ
のインキエペーションの目的ｕＴ４ポリメラーゼのエキ
ソヌクレオチド分解活性を用いてＨｇ１ＡＩで消化後桟
された突出する４個のヌクレオチドを除去して平滑末端
ＤＮＡ分子を得ることである。
）ｉｌｎｄ　ｍリンカ−（ＣＡＡＧＣＴＴＧ　）をブラ
ンド（平滑）末端ＤＮＡに連結するために６μ１（３０
０ｎＪＦ）のキナーゼ化リンカ−を４μノの１０　ｍＭ
　ＡＴＰ及び３μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎａｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｌｏｌａｂｓ、　４００　ｕ／ｌ１ｌ）
と共に上記溶液に添加した後１６℃で１６時間インキエ
ペートした。混合物を６８℃で１０分間加熱することに
より停止し連結をその後ＤＮＡをＨｌｎｄＩ［Ｉ及びＢ
ｇｔ　ｆｌで消化した。即ち、１５μｌ　（１３５Ｕ）
Ｈｉｎｄ［をＬ５μｍ４　ＭＮａＣＬ、　　０．２μｌ
　Ｉ　Ｍ　Ｍ＠ＣＬ２及び１１μｌ１ｍ９７ｄウシ血清
アルブミンと共に添加し、１時間３７℃でインキエペー
ト後４０ＵＢｇｔＩＩを添加して更に３７℃で１時間イ
ンキエベートした。得られた１７７塩基対の断片をＴＢ
Ｅ中で６％ポリアクリルアミドｒグルにおいて精製し、
　ＴＮＥ（ＴＮＥ：１００　ｍＭ　ＮａＣＬ及び１　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＦＩＬＬ　
、　Ｐ＆（８，８）中で溶出し、Ｉ）ＥＡＥセルローｘ
　（Ｗｈａｔｍａｎ　ＤＥ５２　）に吸着させ、　ＴＮ
Ｅ中ＩＭＮａＣＡで溶出し、４容の水で稀釈し、２．５
容のエタノール添加後−２０℃で沈澱させ最後に１７μ
！ＴＥ　（ＴＥ　：　１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する１
０ｍＭＴｒｉａ−ＨＯ２，ｐ）１８．０　）中に溶解し
た。
プラスミドｐＲ８Ｖｎｓｏは、５Ｖ４０−由来Ｐｖｕｌ
ｌ−Ｈ１ｎｄＩｕ断片が、ｐＲ８Ｖｃ　ａ　ｔがｐＳＶ
２ｃａｔから造成された（　Ｃ，Ｍ、Ｇｏｒｍａｎ　ｓ
ｔ　＆ｔ、＋　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔムＡｃａｄ、Ｓｅｊ
、ＵＳＡ　７９．６７７７−６７８１（１９８２））　
と同様にして、ラウス肉腫ウィルスからのＬＴＲプロモ
ーターを含有するＰｖｕ　ＩＩ−Ｈｌｎｄ　ｍで置換さ
れたグラスミド１）ＳＶ２ｎａｏの誘導体である（　Ｐ
、Ｊ、　５ｏｕｔｈａｒｎａｎｄ　　Ｐ、Ｂ＠ｒｇ、Ｊ
、ＭｏＬ、ＡｐｐＬ、Ｇｅｎａｔ、１　＋　３２７−３
４１（１９８２））。５μＩのこのプラスミドを製造元
の指示事項に従って２４　Ｕ　Ｒｇｔｌで５０μｇ容量
に切断した。３７℃で１時間インキエペーション＆　４
０　Ｕ　Ｈｌｎｄ　Ｉｎを添加し、インキユベーション
を１．５時間継続し、その後大きい５．４ｋｂ断片を上
記の如く精製した。
１７ａｌの精製１７７ｂｐ断片を２μｍ（２０ｎｌｌ）
のｐＲ８Ｖｎ＠ｏ断片と、０．２５μＡ！（１００Ｕ）
Ｔ４リガーゼを用いて全容量２２μ！すｆ−ゼ緩衝液中
において１６℃で１８時間連結させ、その後シラスミド
ＤＮＡを用いて、Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ　（Ｊ、ＭｏＬ、
　Ｂｉｏｔ。
１６６．５５７−５８０（１９８３））に従ってＴ２．
　ｃｏｔｉを形質転換した。得られたアンピシリン耐性
菌株から、制限分析によシ証明された１　７７　ｋｂ　
Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ−Ｂｇｌ断片を有するｐｔＰＡＬと称
するプラスミドを含有するものが選択された。０，１μ
ｇのプラスミドを製造者によシ推薦されるように１６　
Ｕ　ＢｇｔｆＪで６０μｌ中において３７℃で１．５時
間切断した。この溶液に次いｆ２０Ｕの仔つシ腸アルカ
リホスファターゼ（Ｂｏｓｈｒｉｎｇａｒ　Ｍａｎｎｈ
ａｌｍ　）を添加し、インキユベーションを３０分間継
続し、その後ＤＮＡを２度フェノール、２度クロロホル
ムで抽出し、０．１　容の３．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｊ（５，２）及び０．６容のイソブロックノールを添加
後沈澱させ、ＴＥに溶解し、更に上記の如くアガロース
ゲル電気泳動により精製し、フェノールで２度、クロロ
ホルムで２度抽出し、２．５容のエタノール及び０．１
容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ５，２）を添加後−２０
℃で沈澱させ、最後に３０μｌ　ＴＥに溶解した。次い
で２゜ｌｋｂｔＰＡＢｇｔＩＩ断片を、２００ＢｇｔＩ
Ｉを用いて２５μｌ反応溶液中において３７Ｃにおいて
２時間５μｇのｐｗ　３４９　Ｆから切出し、０．８係
アガロースゲル上で精製し、上記の如く電気泳動的に溶
出させ、フェノールで２度、クロロホルムで２度抽出し
、２．５容のエタノール及び０．１容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，２）を添加後、−２０℃で沈澱させ、そ
して８ｎｉ／μｌの濃度でＴＥ中に溶解した。１μｌの
このｔ−ＰＡ析片を次いで１０μｌの反応液中において
１００ＵＴ４リガーゼ（Ｂｌｏｌｍｂｍ　）を用いて１
６Ｃにおいて１７時間７．５　ｎｇＢｇｔＩＩ切断ベク
ターＤＮＡに連結させ、引続いてＥ、　ｃｏｔｉ中に形
質転換させた。ｐＤＯ２と命名された得られたクローン
の一つは、プラスミドがヒト　ｔ−ＰＡの連続的オープ
ンリーディングフレームを含有するように挿入されたｔ
−ＰＡ　Ｂｇｔ　ｎ断片を含有する。
Ｂ）　ｔ−ＰＡｅＤＮＡとベータグロビン断片との結合
プラスミド＋）ＤＯＩＯ（第１０図）を、次の３個のＤ
ＮＡ断片を共連結することにより造成した：（Ｉ）全ｔ
−ＰＡコード配列を含有するＢｉｎｄ　Ｉ１１部位で開
始し、ＢｇＡ１１部位で終了する２、ｌｋｂ断片を、Ｂ
ｇｔｌｌで部分的に及びＨｌ　ｎｄｌｌｌで完全に切断
した１０μわｐ００２　ＤＮＡを負荷したアガロースゲ
ルから単離した。（ＩＩ）　ｐＵＢ　ｆｌ　、グラスミ
ドｐＵＣ９［Ｊ、　Ｖｉａｌｒａａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　Ｇ＠ｎｅ　１９．２５９−２６８（１９８２
）：同１９，２６９−２７６（１９８２））のＢａｍＨ
Ｉ部位中にＢｇｔ　ｎ部分消化物としてサブクローン化
されたウサギベータグロビン遺伝子を含有するプラスミ
ドである（　Ａ、Ｖａｎ　Ｏｏｙ＠ｎ　ｅｔ　＆ｔ、ｌ
　５ｃｉｅｎｃｅ　２０６＋３３７（１９７９））。こ
のプラスミドから第２イントロン及びポリアデニル化部
位を含有する１、２ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｈｌｎｄ　
ｍ断片を切出し、アガロースゲル電気泳動により精製し
た。（ｉｉｉ）ベクターｐＩ）Ｑ　１は、複製の起点を
含むｐＢＲ３２２のＨｉｎｄｌ［［−Ａｃｅｌ　粕のＨ
ｌｎｄ［部位（第１０図）から左過りの順序で、合成ｘ
ｂａ１部位で終了するヒトサイトメガロウィルス（ＨＣ
ＭＶ　）のエンハンサを含有する０、３ｋｂ断片合成Ｈ
１ｎｄ　ｍ部位において終了する相同プロモーターに付
着したこのエンハンサ−の第２番目のコピーから構成さ
れている。このベクターＤＮＡをＨｉｎｄｎ［で切断し
、６．３ｋｂ線状プラスミドをアガロースゲル電気泳動
によシ精製した。
ｐＳＰ６２Ｐｓｔ３３　（第１１図）は、ウィルスの即
時初Ｍ（ＩＥ）７’ロモーターを含むマウスサイトメガ
ロウィルス（ＭＣＭＶ）ＤＮＡの２．１　ｋｂ　Ｐｓｔ
Ｉ　ｆｆｒ片を、図示したプラスミドｐＳＰ６２　（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈａｔｍ）のＰｓｔＩ部
位に挿入して含有するプラスミドである。ｐｓＰ６２Ｐ
ｓｔ３３のこのＨ１ｎｄｌ１１部位中にはｐＤＯｌｏか
らのＨｉｎｄｌ１部位が挿入される。ｔ−ＰＡコード配
列がＭＣＭＶ　ＩＦＪグロモーターからの「センス」方
向に転写されることができるように挿入されているプラ
スミドｐＣＧＡ２６が選択される。
プラスミドｐｓＶ２９１１ｎｅｏ　（Ｆ、　Ａｓｓｓｌ
ｂｅｒｇｓ　ａｔ　ａｔ、　。
Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｊ、　１８９．４０１−４１１　
（１９８６））はＳＶ４０発現カセット内にトランスポ
ソンＴＮ５からのネオマイシン（ｎｅｏ）ホスホトラン
スフェラーゼを含有する（第１２図）。
即ち、それは補乳動物組織培養細胞中に導入された際に
ネオマイシン及びカナマイシンに耐性を付与する。ｐｓ
Ｖ２９１１ｎｅｏ　ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、仔つ
シ腸アルカリホスファターゼで処理し、フェノールで２
回、クロロホルムで２回抽出し、アルコールで沈澱され
最後にＴＥ中に浴解してクローン化の準備をする。プラ
スミドｐＣＧＡ２６　ｉｆ　、　ＭＣＭＶエンハンサ−
／プロモーター領域中の位置３４５における配列ＧＴ／
ＡＣＡＣ［Ｋ、　Ｄｏａｒａｃｈ−Ｈａｓａｓｌｅｒ　
ｅｔ　ａＡ、　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｊ。
Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８２．８３２５−８３
２９（１９８５）’Ｊ及びグロビン部分の後の配列ＧＴ
／ＣＧＡＣ（又５ａｔＩで切断することもできる）を切
断する制限酵素ＡｃｃＩで切断される。切断後に生ずる
この二つの塩基突出部をＥ、　ｃｏｔｔ　（大断片）Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩによりフィルインし、この平滑化さ
れた末端をＢａｍＨＩ　’）ンカー（ＣＧＧＡＴＣＣＧ
　）に連結し、これらをＢａｍＨＩ酵素で切断する。こ
のＢａｍＨＩ末端を有するＭＣＭＶ／ｌＰＡ／グロビン
を担持する３、８ｋｂ断片をアガロースゲルにより精製
し、次いで上記の如く調製したｐｓＶ２９１１　ｎｅＯ
ＤＮＡに連結して発現プラスミドｐＣＧＡ２８を得た一
Ｅ）　ｐＣＧＡ２８から得られる発現ベクターｐＣＧＡ
４８　ｎ　、ｎｅｏコード配列（ＢｇｔＴ；ｉ部位及び
Ｓａｍ１部位間）がハイグロマイシン耐性遺伝子のコー
ド配列により置換されたｐＣＧＡ２８の誘導体である。
これは、グラスミドｐｓＶ２９１１ｎｅｏをその非反復
Ｓａｍ１部位において切断し、　ＢｇＬｍ　ＩＪンカー
（ＣＡＧＡＴＣＴＧ　）をＤＮＡに連結後Ｂ　ｇＬＭで
切断することにより達成される（第１３図）。得られた
ベクターマイナスｎｅｏコード化配列よりなる大ＤＮＡ
断片をアガロースダル上で精製し、同様にアガロースゲ
ルで精製されたプラスミドｐＬＧ８９［：Ｌ、Ｇｒｉｔ
ｚ　ａｔ　ａｔ、、Ｇａｎｅ２５　、１７９−１８８（
１９８３））からの小ＢａｍＨＩ断片に連結し、ハイグ
ロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子をセンス及
びアンチセンス方向にそれぞれ含有する。
！ラスミドｐＣＧＡ２５　ｅ及びｐＣＧＡ２５ｄに導い
た。標準条件においてＣＨＯＤＵＫＸＢＩ細胞中にトラ
ンスフェクシ。
ンした際に（実施例１６参照）、ｐｃＧＡ２５１！は、
ハイグロマイシン耐性をコードしないプラスミド例えば
ｐＣＧＡ２８を含有するＣＨＯ細胞を殺す濃度の０．２
μＶゴハイグロマイシンＢに耐性の６０コロニー／μ、
ｉｉｌ　ＤＮＡ　ヲ与える。ｐＣＧＡ２５ｅ中で、ハイ
グロマイシン−Ｂ耐性をコードする配列はＥ、ｃｏｔｔ
中においてそれらがＴｎ５プロモーター（トランスポソ
ンＴｎ５においてカナマイシン耐性遺伝子を転写する）
から転写されるように配置されている。このように、Ｅ
、　ｃａｄｉ　ＤＨＩ細菌の一夜培讐物すなわち飽和培
養物（５０ｍ９／１アンピシリン選択下に生育）０．０
５ｍ／を接種された４０１ｎ９／ｌ”イクロマシンーＢ
ｉ含有するＬｕｒｉａプロス（ＬＢ）の２．５ｄ培養液
は３７℃における３時間の通気培養後に少なくとも１０
倍高い細菌密度に到達し、次いでＥ、ｃｏｌｉ中で機能
するハイグロマイシン遺伝子を含有しないグラスミド例
えばｐＣＧＡ２５ｄ、　ｐＣＧＡ２８或いはｐＡＴ１５
３を有する細Ｊ　（Ａ、Ｊ、　Ｔｗｌｎｇ　ａｔ　ａｔ
、　。
Ｎａｔｕｒｅ　２８３．２１６−２１８（１９８０））
を試験した。動物組織培養細胞及びＥ、ｃｏｔｉの両者
におけるハイグロマイシン−Ｂ耐性の機能性はプラスミ
ドｐＣＧＡ２５（！及びその誘導体の使用を極めて容易
にする。次いで、プラスミドｐ　ＣＧＡ４２を、ＭＣＭ
Ｖ／ｌ　−ＰＡＪ’＜　−ター　ｆ　ｏ　ヒフカセット
を含有するｐＣＧＡ２８からのＢ　ａｍＨｌ断片をｐＣ
ＧＡ２５ｅ中に挿入することにより造成した。その使用
はダネティシン耐性に形質転換することのできない或い
は既にダネティシン耐性である細胞中にｔ−ＰＡ発現遺
伝子を転移するためである。父、ｐＣＧＡ４２は、Ｅ、
ｃｏｔｌにおいてこのハイグロマイシン遺伝子を発現す
ることができ、ｐＣＧＡ４２を含有するＥ、　ｃａｔｉ
ＤＨＩを、上記の如く試験された際に例えばｐＣＧＡ２
８を含有するＬｃｏｔｌ　よりも少なくとも１０倍よシ
高い密度に成長させる。
グラスミドｐＣＧＡ２８は２個の５ａｃＩ部位を有し、
一つは元々ＭＣＭＶプロモーターの直ぐ後のリンカ−の
一部であり、他方はｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ中にあるもので
ある。
これらのＳａｃ　Ｉ部位間の配列は、先ず制限酵素で切
断し、大断片をアガロースゲルにより精製し、そしてこ
の線状ＤＮＡをＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて環化させて
プラスミドｐＣＧＡ４４　（第１２図）を形成すること
により削除される。ｐＣＧＡ４４のこの様に唯一のもの
となったＳａｃ　Ｉ部位中へ適当な方向でクローン化さ
れた任意のｃＤＮＡは、ｐＣＧＡ２８中のｔ−ＰＡコー
ド配列を有効に置換し、そして効率的に発現される。
ｐＣＧＡ４２ｄけ、　１．４　ｋｂ　Ｓａｃ　ｌ断片を
削除することによυｐＣＧＡ４２から得られる（第１３
図参照）。
この様に唯一の本のとなったＳａｃ　Ｉ部位にはｔ−Ｐ
Ａ以外のｃＤＮＡを挿入することができ、組織培養細胞
中で高割合で発現することができる。
この造成において、プラスミドｐｈ−ｔＰＡＡｓｃａｌ
からのｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ断片がｐＣＧＡ２８に挿入さ
れた。
この造成１ｓｅａ１部位の再構成時に偶然に生じるかも
しれないなんらかの変化のための対照として動くように
必要であるものと思われる。この１．４ｋｂ　Ｓａｃ　
ｌ断片はＳｃａ　ｌ消化後にプラスミドｐｈ・ｔＰＡ△
Ｓｅａ　ｌから回収された。この発現ベクターｐＣＧＡ
２８ばＳａｃ　ｌで切断され、８．２ｋｂベクタ一断片
が単離され、そして０．１　ｍＭＴｒｌ　ｓ　ｐＨ８，
０，０，１％ＳＤＳ及び０．０２単位の細菌アルカリ性
ホスファターゼを含有する１００μ！反応液中において
脱ホスホリル化される。６０℃において３０分間のイン
キュベーション後１反応液を２回フェノール及びエーテ
ルで抽出し、次いでエタノール沈澱させる。
ベレットを水に溶解し、そのアリコートをｐｈ−ｔＰＡ
Ｓｃａ　ｌからの１．４　ｋｂ　Ｓａｃ　ｌ断片との連
結に用いた。
この連結ミックスを用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩを
形質転換させそしてアンピシリン−耐性コロニーカラ造
成されたミニ細胞溶解物ＤＮＡを適当な制限酵素で消化
してＳａｃ　ｌインサートが所望方向にあるかどうかを
検証した。所望方向を有するプラスミドをｐＢＲＩＡと
称する。反対方向にあるＳａｃ　［断片を有するプラス
ミドをｐＢＲＩＢと称する。
図参照） この造成においては、グラスミドｐＵＮＣ、ｔ　ｃから
のハイブリッドＵＰＡＡＴＰＡ”ｃＤＮＡ　’４７１片
を発現ベクター　ｐＣＧＡ２８に挿入した。ｐＵＮｃ、
ｔｃ　ＤＮＡをＳｍａ　■（第７図参照）で消化し、１
．２４　ｋｂ断片を単離し、そしてＳａｃ　ｌ消化、脱
ホスホリル化８．２ｋｂｐＣＧＡ２８ベクターＤＮＡに
連結した。Ｅ、ｃｏｌＩＨＢＩＯＩ細胞を連結ミックス
で形質転換し、Ｓａｃ　１インサートを所望方向に含有
するコロニーをミニ細胞溶解物ＤＮＡ上で制限消化を行
うことにより確認した。所望方向にｐＵＮＣ、ｔ　ｃ　
ＤＮＡインサートを有するプラスミドをｐ　ＢＲ２Ａと
命名し、そして反対方向のものをｐＢＲ２Ｂと命名する
。
Ｃ）　ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの挿入（第１７図参照）この
造成において、ヒト　ｕ−ＰＡ　ＤＮＡを発現ベクター
ｐＣＧＡ２８中に挿入した。ｐＢＲｌと共にこのプラス
ミドは親グラスミド対照として動き、ｐＣＧＡ２８−タ
イプベクターの有用性が確認される。ゾラスミドｐｃＵ
Ｋ１７６をＳｍｍ　ｌ　、及びＡｈａ　ＩＩＩ　（第４
図参照）で消化し、２．２５ｋｂ断片を単離し、上記の
如くホスホリル化Ｓａｃ　ｌリンカ−に連結した。
Ｓａｃ　ｌ消化後、２．２５ｋｂ断片を回収し、Ｓａｃ
　ｌ消化、脱ホスホリル化８．２　ｋｂ　ｐＣＧＡ２８
　ＤＮＡ断片に連結した。Ｅ、ｃｏｌＩ　ＨＢＩＯＩを
形質転換し、制限酵素でミニ細胞溶解物ＤＮＡを消化す
ることにより所望プラスミドを有するコロニーを確認し
た。正しい方向にヒト　ｕ−ＰＡ　ＤＮＡを有するプラ
スミドをｐＢＲ２３Ａと命名し、そして反対方向のもの
をｐＢＲ３Ｂと命名する。
の挿入 弦で、プラスミドｐｔＮＣ，ＵＣからのハイブリッドＴ
ＰＡＡＵＰＡＢｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＧＡ２８中
に挿入した。２．７５　ｋｂ　Ｓｍａ　ｌ　（ベクター
中に存在）−Ａ１１ａ　ｌＩ［ｉｆｒ片をｐｔＮＣ，Ｕ
ＣＤＮＡから単離し、ホスホリル化Ｓａｃ　■リンカー
に連結し、リンカ一連結２．７５ｋｂ断片を回収し、Ｓ
ａｃ　ｌ消化、脱ホスホリル化ベクターＤＮＡに連結し
、そして所望コロニーを上記の如く確認した。正しい方
向にｐｔＮＣ，υＣＤＮＡインサートを有するプラスミ
ドをｐＢＲ４Ａと称する。
四つのオリゴデオキシリボヌクレオチド：■−１、Ｉ−
２、Ｉ−３、Ｉ−４をＤＮＡシンセサイザー（モデル３
８０　ＢＡｐｐＨｅｄ　Ｂｉｏｍｙａｔｅｍｓ　）によ
シ合成した。脱保護後１合成断片を８Ｍ尿素を含有する
１２係ポリアクリルアミドゲル上で精製した。塩のない
純粋オリゴデオキシリボヌクレオチドをＳｅｐ、Ｐａｋ
　（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅａ　）を用いて
得た。これらの断片は、しばしば用いられる酵母コドン
ヲ有スるインベルターゼシグナル配列ヲコードする二本
鎖を構成する。
以下金白 −へ　　ｃＱ寸 Ｂ）　　インベルターゼシグナル配列のプラスミド１．
５μＩの９３１　Ｒ／８ｇ−ＴＰＡ　　２　（ヨーロツ
ノ譬特許出願１４３，０８１号明細書）を５０／ＪＡ’
の１０ｍＭＴｒｉｍ　−ＨＣＡ　ｐＨ７，５，６ｒｎＭ
　ＭｇＣ２２，１００ｍＭ　ＮａＣ２゜６−メルカプト
エタノール中においてＩＯＵのＥｃｏ　ＲＩ　（Ｂｏｅ
ｈｒｌｎｇａｒ　）で３７℃において１時間消化した。
１μ！の２．５Ｍ　ＮａＣＬの添加後、ＩＯＵのＸｈｏ
　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）を添加し、３７℃で
１時間インキュベートした。４．２ｋｂベクターを０．
８ｑｂ調製アガロースゲル上で単離した。このグルスラ
イスをＭｌｃｒｏ　Ｃｏ１１ｏｉｄｏｒチユーブ（Ｓａ
ｒｔｏｒｉｕｇＧｍｂＨ）に移し、２００μノのＴＥで
被覆し、及び電気溶出させた（９０ｍＡで５０分間電気
泳動）。このＴＥ浴溶液集め、０．１容のｌ０ＸＴＮＥ
の添加後２．５容の無水エタノール中で沈澱させた。Ｄ
ＮＡ　−ｅレフトを冷８０係エタノールで洗浄し、真空
乾燥させた。このＤＮＡを６μＡ！ＴＥ（４０ｐモル／
μｌ）中に再懸濁させた。
ｂ）　　オリがデオキシリボヌクレオチド（Ｉ−１、こ
れらの四つのデオキシリボヌクレオチドの各１０９モル
を１０　ｔｉｌの０．５　Ｍ　Ｔｒｉｍ　・ＨＣｌ　ｐ
Ｈ８中に含有する溶液を水浴上で５分間９５℃でインキ
エペートした。この水浴を３０℃でゆっく９５時間に亘
って冷却した。このアニーリングされた混合物に各２　
μｌの０．１　Ｍ　ＭｇＣｌ２．０．１　Ｍ　ＮａＣｔ
。
３０　ｍＭ　ＤＴＴ、４　ｍＭ　ＡＴＰ及び８Ｕ（１μ
ｌ）のポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏａｈｒｉｎｇｅ
ｒ）を添加した。
リン酸化は３７℃で１時間行った。このアニーリングさ
れた、リン酸化オリゴデオキシリボヌクレオチド及び６
０ｐモルのｐ３１Ｒ／ＳＳ　−ＴＰＡ　　２切断ベクタ
ー（１，５μｌ）を４００Ｕ（ｌμｌ）のＴ４　ＤＮＡ
リガーゼ（Ｂｌｏｌｍｂｇ　）で１４℃において１７時
間連結させた。６５℃で１０分間インキュベートして反
応を停止式せた。ｌＯμｌのこの連結混合物を用いてＥ
、　ｃｏｉｌ　ＨＢＩＯＩ　Ｃａ″細胞〔Ｍ。
Ｄａｇｅｒｔ　ａｎｄ　Ｓ、Ｄ、Ｅｈｒｌｌｃｈ、　Ｇ
ｅｎｅ　５６．２３−２８（１９７９））を形質転換さ
せた。２０　ａｍｐＲコロニーを拾い上げた。ＤＮＡを
迅速単離法により調製した（　Ｄ、　Ｓ、Ｈｏｌｍｅｓ
　ａｎｄ　Ｍ、Ｑｕｉｇｌ＊ｙ、Ａｎａｌ。
Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１１４　、１９３−１９７（１９８
１）］。
ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌで消化し、ＥｃｏＲＩ
末端において放射線標識し、放射線標識ｐＢＲ３２２Ｈ
ａｅＩＩＩ切断ＤＮＡをマーカーとして用いて８Ｍ尿素
を含有する６幅ポリアクリルアミドグル上で分析した。
正しい大きさのバンドが２０クローン全てから得られた
ＤＮＡについて観察された。一つのクローンをｌＯＯμ
Ｉ／−のアンピシリンを含有するＺｏｏｍＬＢ培地中に
おいて生育させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ｐ３１
ＢＩＴ−１２と称する。
参照） ３μｓのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８　（
ヨーロッ／ぐ特許出願１４３，０８１号明細書）をＩＯ
Ｕ（７）ＢａｍＨＩと共に５０μｌの１０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉａ−ＨＣｌＰＨ８，５，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００
　ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭメルカプトエタノール中にお
いて３７℃で１時間インキユペートシた。ＴＢＥ緩衝液
中において１％アガロースゲル上でアリコートをチェッ
クして完全な消化を確認した。この消化物を６５℃で１
０分間インキエベートした。次いで０．５μノの５ＭＮ
ａＣｔを添加した後１５ＵのＸｈｏ　Ｉ　（Ｂｏａｈｒ
ｉｎｇｅｒ）を添加した。
これを３７℃で１時間インキュベートした。６．８ｋｂ
ベクターを０．８係調製用アガロースゲル上で単離した
。ＤＮＡを電気溶出により抽出し、沈澱後ＴＥ中に溶解
した。
ｂ）　　ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８のＸｈｏｌ消化
３０μｉのｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８　（ヨーロ
ッノぐ特許出願１４３，０８１号明細書）を６０ＵのＸ
ｈｏＩ（１５Ｕ／μｌ）と共に２００μノの１０　ｍＭ
　Ｔｒｌｓ　・ＨＣｌＰＨ８，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１
５０　ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭメルカプトエタノール中
で３７℃において１時間インキユヘートシ、等容量のフ
ェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール中
で沈澱させた。
Ｐｓｔ　Ｉ消化 沈澱したＸｈｏｌ切断ｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８
　ＤＮＡを２５０μノの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣ２
ｐＨ７，５，６ｍＭＭｇＣ２２，５０ｍＭ　ＮａＣ２，
６−メルカプトエタノール、２．５１ｒＭｉエチ・ノウ
ムプロマイド中に再懸濁させ、２２．５ＵのＰｓｔｌと
共に３７℃で３５分間インキユベートシ、等モル容量の
フェノールで抽出した後、等容量のクロロホルム−イソ
アミルアルコール（５０：　１　）で抽出した。１．６
ｋｂ断片を１係調製用アガロースダル上で単離した。Ｄ
ＮＡを電気溶出によシ抽出し、沈澱させた〔インサート
ｌ〕。
３０μＩのｐ３１　ＲＩＴ−１２を６０Ｕの５ａｉｌ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌ　２　Ｕ／　μｌ　）及び６
０ＵのＸｈｏ（（１５Ｕ／μｌ）と共に２００μ／のｌ
ＯｒｒＬＭＴｒｉｌＩ・ＨＣＡｐ！（８，６ｒｎＰｉ’
！　ＭｇＣｌ２、ｌ　５０　ｍＭ　ＮａＣ６，６ｍＭメ
ルカゾトエタノール中で３７℃で１時間インキエベ　）
Ｌ％　ｌｋの７エノールークロロホルムで抽出し、エタ
ノール中で沈澱させた。８６９　ｂｐ断片を１．２係調
製アガロースｒル上で単離した。
ＤＮＡを電気溶出によシ抽出し、ＤＥ−５２上で脱塩し
、エタノール中で沈澱させた。
ｅ）　　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ切断ｐ３１　ＲＩＴ
−１２のＨｇａｌ消−ルー Ｓａｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ切断ｐ３１ＲＩＴ−１２を１
００．Ｊ！の６　ｍＭ　Ｔｒｉａ　−ＨＣＡ　ｐＨ７，
５、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ２２，５０ｍＭＮａＣ２，１ｍ
Ｍジチオスレイトール、１０ダクシ血清アルブミン中に
再悪濁させ、６ＵのＨｇａ　１（Ｂｉｏｌａｂａ、０．
５Ｕ／μＡ　）と共に３７℃で１時間インキュベートし
た。６００　ｂｐ断片ｔ−１，２％アガロースゲル上で
単離した。このＤＮＡを電気溶出により抽出し、エタノ
ール中で沈澱させた。
ｆ）リンカ−オリゴヌクレオチドのアニーリング９０ｐ
モルの下記配列を有する二つのオリゴデオキシリデヌク
レオチＰをシリコーン処理をしたＥｐｐｅｎｄｏｌｆ管
中においてｌＯμノの０．５　ｍＭ　Ｔｒｌｍ　・Ｈｃ
ｔ　ｐＨＢ内に悪濁させた： ３’　ＡＧＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣＴＡＧ　５’この溶液
を９５℃で５分間インキュベートし、次いで一昼夜ゆり
くシ室温まで冷却した。
ｇ）リンカ−のリン酸化 上記溶液に２μノの０．１　Ｍ　ＫＣｌ、２μｌの０．
１ＭＭｇＣＬ２．３ｔｔｌの３０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　
１　μＩの２００ｍＭＡＴＰ、８Ｕのポリヌクレオチド
（８Ｕ／μｌ）を添加した。これを３７℃で１時間イン
キュベートした。
キナーゼ処理されたリンカ−溶液を乾燥Ｈｇａ　１断片
を含有する管に移し、次いで４００ＵのＴ４ＤＮＡ　Ｉ
Ｊガーゼを添加した。この溶液を室温（２１Ｓ２２℃）
で９０分間インキュベートし、ＴＥで１００μノに稀釈
し、等容量のフェノール−クロロホルムで抽出した。０
．６容のイングロパノール及び０．１容の３Ｍ酢酸ナト
リウムを室温においてこの水溶液に添加することによシ
断片を沈澱させた。
上記乾燥ＤＮＡをＩＯＵのＢａｍＨＩ及びＩＯＵのＰｓ
ｔｌによ＃）２０μノの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
Ｌ　ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＭｇＣ２２，６ｍＭ　メ
ルカプトエタノール中で３７℃で１時間消化した。１０
０ＡＡ！に稀釈後、溶液を等容量の７エノールークロロ
ホルムで抽出し、水層をイソゾロパノール中で沈澱させ
た〔インサート２〕。
１００ｆモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１
８　ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ切断ベクター断片、２００ｆ
モルのその他の二つのインサート断片〔ｌ及び２〕の各
々を１０μノの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐ！
（７，５，１０ｍＭＭｇＣ１２、ｌ　ＯｍＭ　ＤＴＴ　
、　　２　ｍＭ　ＡＴＰ、　０．５μｌゼラチン中にお
いて４００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼで１５℃で１６時
間連結した。６５℃で１０分間インキュベーションする
ことによシ反応を停止した。
５μｌのこの連結混合物を用いてＥ、　ｃａｌｉＨＢ　
１０１ｃ　ａ＋＋細胞を形質転換した。１０　ａｍｐ　
　コロニーを拾い上げ、ＤＮＡを迅速単離法によシ調製
した。
ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ及びＢａｍＨＩ　−Ｈｉ　ｎｄ　
ＩＩＩで分析して正しい大きさの断片を観察した。一つ
のクローンヲ１００ｄのｌＯＯμｇ／−のアンピシリン
を含有するＬＢ培地中で生育させた。グラスミドＤＮＡ
　１単離し、ｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−１−ＴＰＡ
と称する。
７アージラムダのｃＩ遺伝子及びテトラサイクリン耐性
遺伝子の部分を含んでなるシラスミドｐＵＮ１２１の１
．５　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片（Ｂ、　Ｎ
１１ｍ５ｏｎｅｔ　ｍｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅａ、　１１　、８０１９−８０３０（１９８３）
）をｐＵｏ　１８　（Ｊ、　Ｎｏｒｒａｎｄａｒ　ｅｔ
ａｌ、、Ｇｅｎｅ　２６，１０１−１０６（１９８３）
）中にクローン化し、ＰｓｔＩ及びＢａｍ　ＨＩで切断
した。
得られたクローンをＰａｔｌで消化した。３′突出末端
をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いる反応で除去し、そ
じてＸｈｏｌ’Ｊンカーを平滑末端に連結した。
Ｘｈｏｌで消化後、分子を連結によシ再環化した。
連結混合物の７リコートを用いてＣａ　　処理Ｅ。
ｃｏｌｉＨＢ１０１細胞を形質転換した。個々のアンピ
シリン耐性、形質転換コロニーのＤＮＡを分析した。
幾つかの正しいコロニーの一つを選びｐｃｓ　ｌ　６と
称する。
Ｂ）プラスミドｐｃｓ　１６／ＵＰＡの造成（第２１図
参照）グラスミドｐｃＵＫ１７６（実施例２参照）内に
含まれるウロキナーゼｅＤＮＡをプラスミドｐｃｓｌＳ
中においてサブクローン化した。このサックローン化ｅ
ＤＮＡは５′非翻訳領域（第４図）中のＳｍａ　１部位
から３′非翻訳領域中のヌクレオチド位置１４３９−１
４４４（第３図による付番）におけるＰｖｕ　ＩＩ部位
に延びる。
Ｌ５ＡＩｊのプラスミドｐｃＵＫ１７６をＰｖｕ　Ｉｆ
で消化した。３７９ｂｐＰｖｕｌｌ断片をＴ山−ホウ酸
塩−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中において１．５係
アガロースゲル上で他の断片から単離した。このＤＮＡ
を電気溶出し、ＤＥ　５２　（Ｗｈａ　ｔｍａｎ　）イ
オン交換クロマトグラフィにより精製し、そしてエタノ
ールで沈澱させた。１．２μｌの一重鎖Ｘｈｏｌリンカ
ー（５’　−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’　）をそれらの５
′末端でホスホリル化し、７５℃で１０分間加熱し、室
温までの冷却時に自己アニーリングし、−２０℃で貯蔵
した。０．９μｓのキナーゼ処理された、二本鎖Ｘｈｏ
Ｉリンカ−を８０−倍モル過剰でｐ（！ＵＫ１７６（上
記参照）の３７９ｂｐＰｖｕＩ［断片の平滑末端に、２
０μ）の６０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７，５，１
０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ　、　３．５　
ｍＭ　ＡＴＰ及び４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｎ
ｔｏｘａｂｓ）中で１５℃で１６時間連結した。この混
合物を８５℃で１０分間加熱した。過剰リンカ−分子を
０．５４容のイソプロパツールで１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ
及び３００−の酢酸ナトリウムｐＨ６，０の存在下にお
いて室温で３０分間沈澱サセテ、除去した６ＤＮＡをＸ
ｈｏＩ及びＢａｍＨＩ　で消化した。ｌ　２１　ｂｐ　
ＢａｍＨＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片ｆ、Ｔｒｉａ−ホウ酸塩
−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中１．５係アガロース
ダル上で単離した。６μｙのグラスミドｐｅＵＫ１７６
をＳｍａ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消化した。Ｕ−ＰＡコー
ド配列の殆んどを含んでなる１、　３　ｋｂ　ＳｍａＩ
　−ＢａｍＨＩ断片を単離した。６μＩのプラスミドｐ
ｃｓ　ｌ　６をＳｍａ　Ｉ及びＸｈｏＩで消化した。２
．７　ｋｂベクター断片を単離した。ＤＮＡ断片をグル
から電気溶出し、エタノール沈澱させた。０．２ｐモル
の１．３　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片、０．
２ｐモルの１２１ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片
（両者の断片は一緒になって全ｕ　−ＰＡコーＰ化配列
を含む）及び０．１ｐモルの２．７ｋｂベクタ一断片を
ｌＯμノの６０ｍＭＴｒｉｍ　・ＨＣｌ　ｐＨ７，５，
１０ｒｎｋｌ　ｙｇｃｔ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ、３．５
ｍＭＡＴＰ及び４００単位のＴ４ＤＮＡすが−ゼ中で１
５℃において連結した。連結混合物の１μ！及び３μｌ
のアリコートを１００μｌのＣａ　　処理Ｅ、　ｃｏｌ
ｔＨＢＩＯＩ細胞に添加した。形質転換は記載されてい
るように行われた［　Ａ、Ｈｉｎｎｅｎ　ａｔ　ａｌ、
、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７５　、
１９２９（１９７８））。
１２個のアンピシリン耐性コロニーｔ−ｘＯ（１ｇ／ｌ
アンピシリンを含有するＬＢ培地中で生育させた。ＤＮ
ＡをＨｏｌｍａｍ等１：　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ
、ｌ１４＋１９３（１９８１））に従って単離し、Ｅｃ
ｏＲＩ、Ｐｖｕ　ｌ［及びＸｈｏｌ制限消化によシ分析
した。期待された制限断片を有する一つのクローンをＩ
）Ｃ８１６／ＵＰＡと称する。
ｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＵＰＡは、ＰＨ０
５プロモーター、インベルターゼシグナル配列、成熟ウ
ロキナーゼのコード配列及びＰＨ０５転写ターミネータ
−をタンデム列でｐＪＤＢ　２０７酵母発現ベクターに
クローン化して含有する。
２０μＩの！ラスミドｐｃｓ　１６／ＵＰＡを４０単位
のＥｃｏＲＩで完全に消化した。フェノール抽出及びエ
タノール沈澱後、Ｅｃｏ　ＲＩ消化ＤＮＡを更にＴａｑ
Ｉによシロ５℃で切断した。得られた断片を調製用１．
２係アガロースゲル上で分離した。４６２　ｂｐＴａｑ
　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をグルからの電気溶出及びエタノ
ール沈澱によシ単離した。
次式 ％式％ カーをＤＮＡ断片のＴａｑ１部位に連結した。このリン
カーハ成熟ｕ−ＰＡのコード配列（ヌクレオチド１３０
−１５４、第３図）の５′末端を回復し、インベルター
ゼシグナル配列とのインフレーム融合を確立する０この
リンカ−の５’　−ＣＴＧＣＡ配列はＨｇａＩ切断によ
り創出されるインベルターゼシグナル配列の対応する３
′陥凹末端を充たす。
各々３００ｐモルのオリゴデスオキシヌクレオチド■及
び■をホスホリル化し、アニーリングした。５．２５μ
ｙ（６ｏｏｐモル）のホスホリル化、二本鎖リンカ−Ｄ
ＮＡを１．７μＩＩ（５，６ｐモル）の４６２ｂｐ　Ｔ
亀ｑ　Ｉ　−Ｅｃｏ　ＲＩｌ断片上記参照）と１７５μ
ｌの６０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔｐ）１７．５、ｌＯ
ｍＭＭｇＣｔ２、ｌ闘ＡＴＰ、５　ｍＭ　ＤＴＴ及び８
００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ中において１５℃で１
６時間連結した。
Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを８５℃で１０分間不活性化させ
た。過剰のリンカ−を１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　３００
ｍＭ酢酸ナトリウムｐ）（６，０及び０．５４容のイソ
プロパツール中において沈澱させて除去した。このＤＮ
ＡをＰｓｔＩで消化した。ｕ−ＰＡをヌクレオチド４３
６までコードするＤＮＡ配列（Ｐ＠ｔ　１部位、第３図
参照）に結合したリンカ−を含有するユニーリ３１２ｂ
ｐ断片を単離した。このＤＮＡ断片を電気溶出及びエタ
ノールによる沈澱で精製した。
！ラスミドｐＣ８１６／ＵＰＡｅ　Ｘｈｏ　Ｉ及びＰａ
ｔｌで消化した。１００７　ｂｐ　Ｐａｔ　Ｉ　−Ｘｈ
ｏ　ｌ断片を単離し、精製した。この断片はウロキナー
ゼのコード配列の殆んどを含有する。
プラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２（実施例６Ｂ参照）をＳ
ａｌ　ｌ及びＸｈｏｉで消化した。８８２ｂｐＳａｌＩ
−Ｘｈｏｌ断片を電気溶出及びエタノール沈澱によりデ
ルから単離した。この断片を更にＢａｍＨＩ及びＨｇａ
ｌで消化した。ＰＨ０５７°ロモーター領域及びインベ
ルターゼシグナル配列を含有する５９１ｂｐ　ＢａｍＨ
Ｉ　−Ｈｇａ　ｌ断片を単離した。
シラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８　
（ヨーロッ／ＩＦ特許出願１４３，０８１号明細書参照
）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌで消化した。６．８ｋｂベ
クタ一断片をＴｒｉｍ−酢酸緩衝液メ１８，２中調製０
．６’Ｚアガロースゲル上で単離した。このＤＮＡを電
気溶出し、エタノールで沈澱させた。
全てのＤＮＡ断片を０．１ｐモル／μノの濃度で水中に
再懸濁した。０．２ｐモルの５９１　ｂｐ　Ｂａｎ　Ｈ
Ｉ−Ｈｇａ　ｌ断片、０．２ｐモルの３１２　ｂｐ　Ｈ
ｇａＩ−Ｐａｔ　１断片、０．２ｐモルの１００７ｂｐ
　Ｐａｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ断片及び０．１ｐモルの６
．８　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片を
１０μｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ　ｐＨ７，
５，１０ｍＭ　ＭｇＣ２２，５ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　
ＡＴＰ及び４００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ中で１５
℃で１５時間連結した。１μｌの連結混合物を用いてＥ
、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩＣ、＋＋細胞を形質転換した。
１２　ａｍｐ　　コロニーを拾い上げ、１００■／ｌの
アンピシリンを含有するＬＢ培地中において生育させた
。ＤＮＡは迅速単離法（Ｄ、Ｓ、Ｈｏ１ｍ５ａ　ａｔ　
ａｌ、、　Ａｎａｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍ。
１１４．１９３（１９８１）：！によ！ｌｌ調製した。
このシラスミド’　ＤＮＡをＨｉｎｄＩ［［及びＥｅｏ
ＲＩの制限消化した時に期待された制限断片が観察され
た。単一クローンのプラスミドＤＮＡを選択し、ｐ、ｙ
ｏＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡと称する。
ｔ−ＰＡのＡ−鎖及び所定位置のｕ−ＰＡのＢ−鎖をコ
ードする。ＤＮＡ配列のインフレーム融合の造成のため
のもう一つの手法は次の二段階よシなる。
先ず、便利なコード配列を有する制限断片を連結する。
ＤＮＡをＥ−ｃｏｌｉ中において調製し、Ｍｌａ中にサ
ブクローン化して一重鎖鋳聾を得る。第二段階において
、過剰ヌクレオチド配列を［１ｖｉｔｒ。
突然変異誘発により除去する。ｔ−ＰＡＡ−鎖及びｕ−
ＰＡＢ−鏡開の正確なインフレーム結合は活性化部位に
ある。変異体ＤＮＡを醇母及び哺乳動物細胞系のための
適当な発現ベクター内でサブクローン化する。
ａ）ｔ−ＦＡＡ−鎖をコードするＤＮＡ断片の単離１０
μｌのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰ
Ａ（実施例６参照）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕ　ＩＩで消
化した。１．７　ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｐｖｕ　ＩＩ
ｌ断片Ｔｒｉｍ−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，
３）中で０．８係アガロースｒル上で分離した。このＤ
ＮＡ断片はＰＨ０５プロモーター、インベルターゼシグ
ナル配列及（Ｊ　Ｐｖｕ　ＩＩ制限部位までの成熟ｔ　
−ＰＡのコード配列〔第１図参照、ヌクレオチド位置１
３０５−１３１０）を含有する。このＤＮＡを電気溶出
し、エタノール沈澱させ、０．１ｐモル／μｌの濃度で
Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた。
ｂ）ｕ−ＰＡＢ−鎖をコードするＤＮＡ断片の単離シラ
スミドｐｃｓ　１６／ＵＰＡ　（実施例７Ｂ参照）をＢ
ＩＬＩ　Ｉ　（第３図及び第４図参照、ヌクレオチド位
置５７３−５７８）及びＸｈｏＩで消化した。この８６
８ｂｐ　Ｂａｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を上記の如く単
離し、０．１ｐモル／μ！の濃度でＨ２Ｏ中に再懸濁し
た。
Ｃ）断片のベクター断片への連結 プラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８
　（ヨーロッパ特許出願１４３，０８１号明細書）をＢ
ａｎ　ＨＩ及びＸｈｏｌで消化した。６．７ｋｂベクタ
一断片をＴｒｉｓ−酢酸緩衝液Ｐ）１８．２中で０．８
４７ガロースダル上で単離した。このＤＮＡを電気溶出
し、エタノール沈澱させ、０．１ｐモル／μノの濃度で
Ｈ２Ｏ中に再懸濁した。
０．２ｐモルの１．７　ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ　−Ｐｖｕ
　Ｉｆ断片、０．２ｐモルの８６８　ｂｐ　Ｂａｌ　Ｉ
　−Ｘｈｏ　Ｉ断片及びＯ，ｌｐモルの６．７　ｋｂ　
Ｂａｎ　　ＨＩ　−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片をｘＯｐｌ
の６０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＡ　ｐＨ７，５，１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ、　３．５　ｍＭ　ＡＴ
Ｐ及び４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌｍｂ
ｇ　）中で１５℃で１６時間連結した。この連結混合物
の１μ！及び３μノのアリコートを１００μｌのＣ＆　
処理Ｅ。
ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１細胞に添加した。形質転換は常
法によシ行りた。
六つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニーを１
００■／ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地内で生育さ
せた。プラスミドＤＮＡをＨｏｌｍｅａａｔ　ａｌ、　
（ＡＩｌａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４　、１
９３（１９８１））の方法に従って調製し、ＢａｍＨＩ
及びＰｉｔｌを用いる制限消化によシ分析した。期待さ
れた制限断片を有する一つのクローン’ｉ　ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＴＰＡＡＵＰＡ”　　と称する
。
主たるハイブリッドＤＮＡ造成物は、ｇｃｈ　１部位（
位置９４０−９４５）からＫｈｏＩリンカ−を介して１
８００位に導入されたＸｈｏ１部位までのｔ−ＰＡヌク
レオチド配列に連結された、Ｓｍａ　ｌからＥｃ。
ＲＩ部位までのｕ−ＰＡヌクレオチド配列（第４図参照
）を含んでなる。得られたハイブリッドＤＮＡ配列は過
剰のヌクレオチドを含有し、これはｔｎマｉ　ｔｒｏ突
然変異誘発によシ除去される。正確なｕ−ＦＡ　Ａ−鎖
及びｔ−ＰＡＢ−鏡開のインフレーム結合部は活性化部
位にある。
ａ）ｕ−ＦＡＡ−鎖をコード化するＤＮＡ断片の単離７
μｍのプラスミドｐｃｓ　ｌ　６／ＵＰＡ　ｔ−Ｅｃ　
ｏ　ＲＩで消化した。得られた三つの断片の粘着末端を
７．５単位のフレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を
用いる６　０　ｍＭ　Ｔｒｌａ　・ＨＣ２ｐＨ７，５，
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１ｍＭ　ｄＡＴＰ及び０．
１　ｍＭ　ｄＴＴＰＯ存在下における２５℃での３０分
間のフィルイン反応によシ平滑末端に転換した。反応は
ＥＤＴＡを１２．５　ｍＭの最終濃度まで添加すること
によシ停止した。このＤＮＡを更にＫｐｎｌで消化した
。６１９ｂｐＫｐｎｌ−平滑（Ｅｃｏ　ＲＩ）末端断片
をＴｒｉｇ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＩ（８，３）
中１．５係アガロースダル上で単離し、電気溶出し及び
エタノール沈澱させた。
６μＩのプラスミドｐＪＤＢ　２０７７ＰＨ０５−ＴＰ
Ａ　１８をＳｃａ　ｌ及びＸｈｏＩで消化した。８６０
　ｂｐ断片をＴｒｉｍ−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ８，
３中１．２係アガロースｒル上で単離し、電気溶出し、
エタノール沈澱させた。
ｃ）　　ＤＮＡ断片のｐＵｃ１８誘導ベクターへの連結
５μｇのシラスミドｐｃｓ　１６　／ＵＰＡ　（実施例
７参照）をＫｐｔ＋４及びＸｈｏｌで消化した。得られ
た２、７ｋｂ断片をＴｒｉｍ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液
ｐＨ８，３中０．８係アガロースｒル上で単離した。Ｄ
ＮＡを電気溶出し、エタノール沈澱させた。全てのＤＮ
Ａ断片を０．１ｐモル／μノの濃度でＨ２Ｏ中に再懸濁
させた。
０．２ｐモルの６１９　ｂｐ　Ｋｐｍ−平滑末端ｕ−Ｐ
Ａ断片、０．２ｐモルの８６０　ｂｐ　Ｓｅａ　Ｉ　−
Ｘｈｏ　Ｉ　ｔ−ＰＡ断片及び０．１ｐモルの２．７　
ｋｂ　Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片を上記の
如く連結した（実施例９）。
Ｃａ＋＋処理Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１細胞を形質
転換した。１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コ
ロニーをアンピシリン（１００ｒｎ９／Ｊ）を補給した
培養培地内で生育させた。ＤＮＡはＨｏｌｍｅｓ　ａｔ
　ａｌ、（上記）に従ってｖ４！Ｈシ、ＥｃｏＲＩ及び
Ｐ畠ｔＩを用いる制限消化によシ分析した。期待された
制限断片を有する単一クローンをｐＣ８１６／　ＵＰＡ
’　ＴＰＡ”と称する。
ウロキナーゼ「成長因子様」（Ｕ）−ドメイン、ｔ−Ｐ
Ａの第２クリングルドメイン（Ｋ２）及びｔ−ＰＡの触
媒作用Ｂ−鎖のＤＮＡ配列を含んでなるハイブリッドプ
ラスミノーゲンアクチベータ遺伝子を次の様にして造成
した。ｕ−ＰＡ成長因子ドメイン及びｔ　−ＰＡ　Ｋ２
クリングル及びＢ−鎖をそれぞれコード化する二つのＤ
ＮＡ制限断片を連結し、プラスミドｐｃｓ　ｌ　６中に
挿入した。得られたクローンをｐｃｓ　１６／ＵＫ２Ｔ
ＰＡ”と称する。ｕ−Ｐ４及びｔ−ＰＡコード化配列を
含有する断片をＭ１３中にサックローン化した。ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を一本鎖ＤＮＡ上に行いｕ　−
ＰＡ及びｔ−ＰＡ配列間の結合において過剰のＤＮＡ配
列を除去した。
５μｌのゲラスミｌ’　ｐｃｓ　ｌ　６／ＵＰＡをＮｅ
ｏ　ｌ　（ヌクレオチド位置３２６−３３１、第４図参
照）で消化した。この制限断片の粘着末端を反応におい
て５単位のクレノクＤＮＡ／リメラーゼＩ（ＢＲＬ）を
用いて５０μ！中各々０．１　ｍＭ　ｄＡＴＰ、　ｄＴ
ＴＰ、　ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰ　、　６０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＦＩＣＬ　ｐ
Ｈ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇｅｔ２の存在下において室温
で３０分間フィルインした。
反応はＥＤＴＡを１２．５ｍＭの最終濃度まで添加する
ことによシ停止した。このＤＮＡをエタノール沈澱させ
更にＸｈｏ（で消化した。３ｋｂＸｈｏ）−平滑末端（
Ｎｃｏｌ）断片をＴｒｉｍ−ホウ酸−ＥＤＴＡ　ｄ（８
，３中０．８４アガロースゲル上で単離し、電気溶出し
そしてエタノール沈澱させた。この断片はｐｃｓ　１６
ベクター及びｕ−ＰＡ成長因子ドメインのコード領域を
含有する。１０μｌのプラスミドＩ）ＪＤＢ　２０７／
ＰＨ０５−ＴＰＡ１８　（ヨーロッノ母特許出願１４３
，０８１号明細書）をＢｓｔＸＩ（ヌクレオチド位置５
７７−５８８　）で消化した。３′突出末端を有するこ
の線状ＤＮＡ断片を１００　ｐ’ｌの３３　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−酢酸声７．９．６６−酢酸カリウム、１０ｍＭ酢
酸マグネシウム、０．５　ｍＭ　ＤＴＴ及びＱ、１ｑ／
−のウシ血清アルブミン中の１０単位のＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ（ＢＲＬ）で３７℃において２．５分間インキ
ュベートした。次いでインキーベーションを全容量２０
０μノ中の各々０．１−のｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ、　ｄＴ
ＴＰ。
ｄＧＴＰの存在下において３７℃で３５分間継続した。
ＤＮＡをエタノール沈澱させ、更にＸｈｏｌで消化した
。１．２ｋｂ平滑末端（ＢｓｔＸＩ　）−ＸｈｏＩ断片
を０．８％アガロースゲル上で分離し、電気溶出し、エ
タノール沈澱させた。この断片はに２のコーＰ化領域及
びｔ　−ＰＡのＢ−鎖を含有する。
０．２ｐモルの１．２ｋｂｔ−ＰＡ断片及び０．１ｐモ
ルの３ｋｂｕ−ＰＡ／ベクター断片（上記参照）を上記
の如く連結した。この連結混合物のアリコートを用いて
コンビテン）　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１細胞を形
質転換した。アンピシリン耐性コロニー全１００ｒＲ９
／ｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択
した。ＤＮＡは個々の形質転換体から調製し、Ｓｅａ　
ｌ及びＳｍａ　ｌ制限消化によシ分析した。０．５ｋｂ
ｓｃａｌ及び１．５５　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ結合断片を含
有するクローンを選択し、ｐｃｓ１６／ＵＫ２ＴＰＡ”
と称する。
実施例１２：ｔ−ＰＡの第２クリングル及びｕ−ＰＡラ
ウロナーせ「成長因子様」（Ｕ）ドメイン、ｔ−ＰＡの
第２クリングル（Ｋ２）及びｕ−ＰＡの触媒作用Ｂ−鎖
のＤＮＡ配列を含んでなるハイブリッドゾラスミノーグ
ンアクチベータ遺伝子を実施例１１で説明した方法と同
様の方法により造成した。
５μｌのプラスミドｐｃｓ　１６／　ＵＰＡ　ｔ−Ｂｇ
ｌ　ｍ及びＮｅｏｌ（それぞれヌクレオチド位置３９１
−３９６及び３２６−３３１、第４図参照）で消化した
。これらの制限断片の粘着末端を上記の如く反応におい
てフレノウＤＮＡポリメラーゼｌ　（ＢＲＬ）を用いて
フィルインした。平滑末端を有する４、２　ｋｂ　ＤＮ
Ａ断片をＴｒｉｍ−酢酸緩衝液ｐＨ８，２中０．８％ア
ガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出し、エタ
ノール沈澱させた。この断片はベクター分子に連結した
ｕ−ＰＡＧ−領域及びｕ−ＰＡＢ−鎖を含有する。
ｌＯμｌのプラスミドｐ３１／ＰＨ０５−ＴＰＡ　１８
　（ヨ−ロッノ平特許出願１４３，０８１号明細書）を
Ａｌｕ　ｌで消化した。ｔ−ＰＡの全に２ドメインを含
有する４４７ｂｐＡ１ｕｌ断片をＴｒｉｍ−ホウ酸ＥＤ
ＴＡ緩衝液ＰＨ８，３中１．５ｑｂアがロースダル上で
単離した。このＤＮＡ断片を電気溶出し、エタノール沈
澱させた。
０．２ｐモルの４４７　ｂｐ断片及び０．１ｐモルの４
．２ｋｂ断片を連結した。この連結混合物のアリコート
を用いてコンピテントＥ、　ｃｏｉｌ　ＨＢ　１０１細
胞を形質転換した。形質転換された細胞を１００ｍ９／
１アンピシリンを有するＬＢ寒天グレート上で選択した
。ＤＮＡをアンピシリン耐性細胞から調製し、ＥｃｏＲ
Ｉ及びＳｅａ　ｌ消化により分析した。５５１　ｂｐＥ
ｅｏＲＩ断片及び４０３ｂｐＳｃａｌ断片を示す単一ク
ローンは正しい方向に挿入されたＡｌｕｌ断片を有する
。このクローンをｐＣ８１６／ＵＫ２ＵＰＡ！ｌと称す
る。
迅速ＤＮＡ調製から得られた１、５μｌのりＪＤＢ２０
７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＴＰＡＡＵＰＡ”　（実施例９参
照）を２０ｔｔｌのｌ　ＯｒｎＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣｔｐ
Ｈ７，５，６ｍＭｉ　ｂ１ｇｃｔ２．１００ｍＭ　Ｎａ
ＣＬ、　６　ｍＭメルカプトエタノール中において３７
℃で１時間９ＵのＢａｍＨＩ　（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ
）で消化した。１　ｐｉのＲＮａｓｅ　（５ｅｒｖａ、
１１ｎ９／−）を添加し、３７℃で１５分間インキュベ
ートし、そしてフェノール化後、２．５ｋｂインサート
を０．８Ｌ：Ｓ調製アガロースダル上で単離した。ＤＮ
Ａを電気溶出によシ抽出し沈澱させた。
ｌ　μｊ’ＯＭ１３ｍｐｌ　８　（ＲＦ）をＢａｍＨＩ
で切断し仔りシ腸アルカリホスファターゼで処理し、及
び７、３　ｋｂベクター断片を０．７係調製アガロース
ゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出し、沈澱させた。
１００ｐモルのＭ１３ｍｐ　１８ＢａｍＨＩ切断ベクタ
ー及び２００ｐモルのＢａｍＨＩ　ＴＰＡ　ＵＰＡ　イ
ンサートを１０μノの５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＡ　
ｐ）Ｉ　７．５．１０ｍＭＭｇＣ１２、ｌ　ＯｍＭ　Ｄ
ＴＴ、　２　ｍＭ　ＡＴＰ、０．５３ｇゼラチン中にお
いて４００ＵのＴ４ＤＮＡ　　リガーゼで１５℃で７時
間連結した。６５℃で１０分間インキュゝ−シ璽ン後、
５μノのこの連結混合物を用いてＡｍｅｒｓｈａｍよ誘
発行されたマニュアルｒＭ１３Ｃ１ｏｎｉｔ＋ｇ　ａｎ
ｄ　ａａｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｊに従
ってＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０１のコンピテント細胞を
形質転換した。３６個の無色ゾラークをつ＼き出し、一
本鎖及び複製形（ＲＦ　）　ＤＮＡｆ、調製した。ＲＦ
−ＤＮＡを分析すると、全てのクローンはＢａｍＨＩ消
化後に正しい大きさのインサートを示す。Ｅｃｏ　ＲＩ
及びＰｉｔＩ消化後の正しい大きさの断片は全てのクロ
ーンにおけるＤＮＡインサートが誤った方向にあること
を示した（−重鎖鋳ｆｉＤＮＡは非コード鎖であった）
。これらのクローンの一つをｍｐｌ　８／１３ａｍＨＩ
／ＴＰＡＡＵＰＡＢと称し、削除突然変異誘発に用いた
。
迅速ＤＮＡ調製から得られた１、５μｌのｐｃｓ　１６
／ＵＰＡＡＴＰＡ”　（実施例１０参照）を２０μｌの
ｌＯｍＭＴｒｉｓ　・ＨＣＬ　ｐＨ７，５，６ｍＭ　Ｍ
ｇＣｊ２．６ｍＭメルカプトエタノール中において３７
℃で１時間１２ＵのＫｐｎｌで消化した。１μＥの１Ｍ
Ｎａｃｔを添加後、ＤＮＡを１２ＵのＨｌｎｄｌｌ［で
３７℃で１時間消化した。
１．５ｋｂ断片ｔ−ｏ、　ｓ　％調製アガロースダル上
で単離した。ＤＮＡを電気溶出により抽出し沈澱させた
。
０．５μＩのＭｌ　３ｍｐ　１８　（ＲＦ）をＫｐｎ　
Ｉ及びＨｌｎｄ　ｍで消化した。７．３　ｋｂベクター
断片を０．７４ｉ１４製アガロースｒル上で単離した。
ＤＮＡを電気溶出し沈澱させた。
１００ｆモルのＭｌ　３ｍｐ　１８　Ｋｐｍ　Ｉ　−Ｈ
ｌｎｄ　ＩＩＩ切断ベクター及び２００　ｆモルのＫｐ
ｎ　１−Ｈｌｎｄ　ｍインサートをｌ　Ｏｔｔｌの５０
　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　・ＨＣＬ　ｐＨ７，５，１０ｒｎｈ
ｌ　Ｍｇ　ＣＺ２．１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、　２　ｍＭ
　ＡＴＰ　ＳＯ，５μｌゼラチン中において４００Ｕの
Ｔ４ＤＮＡりが−ゼを用いて１５℃で７時間連結した。
６５℃で１０分間インキュベーションして反応を停止し
た。この連結混合物５μノを用いてＥ、　ｃａｌｆ　Ｊ
Ｍ　１０１コンピテント細胞を形質転換した。１０個の
無色ゾラークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（ＲＦ）Ｄ
ＮＡを調製した。ＲＦ　−ＤＮＡ　ｉ分析すると、全て
のクローンは正しい大きさのインサート及び正しい大き
さの断片を示した。これらのクローンの一つをｍｐ１８
／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　Ｔｒｉ／　ＵＰＡＡＴＰＡ
”　と称し、削除突然変異誘発に用いた。
迅速ＤＮＡ調製から得られた１、５μｌのｐＣ８１６／
ＵＫ２ＴＰＡ”　（実施例１１参照）を２０μｌのｌＯ
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７，５，６ｒｎＭｉ　ＭｇＣ
ｌ２．６ｍＭメルカゾトエタノール中において３７℃で
１時間、１２ＵのＫｐｎ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ＠ｒ
）で消化した。ｌμｌのＩＭ　ＮａＣ１を添加後、ＤＮ
Ａを１２ＵのＨｌｎｄ　ｍで３７℃において１時間消化
した。１．５ｋｂ断片を０．８係調製アガロースｒル上
で単離した。ＤＮＡを電気溶出によシ抽出し、沈澱させ
た。
０．５μｆｉのＭｌ　３ｍｐ　１Ｂ　（ＲＦ）をＫｐｎ
ｌ及び）ｎｎｄ■で消化した。７．３　ｋｂベクター断
片を０．７９６調製アガロースダル上で単離した。この
ＤＮＡ　ｔ−電気溶出し沈澱させた。
１００ｆモルのＭｌ　３ｍｐ　１８　Ｋｐｎ　ｌ−Ｈ１
ｎｄｌｌｌｌ切断ベクター及び２００ｆモルのＫｐｎ　
ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩインサートをｌＯμｌの５０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ　ｐＨ７，５，１０ｒｎｋ／ｉ　
ＭｇＣ４２，１０ｍＭ　ＤＴＴ、　２　ｍＭ　ＡＴＰ、
　０．５　Ａｌｌゼラチン中で４００ＵのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて１５℃で７時間連結した。６５℃で１０
分間インキュベーションによシ反応を停止した。この連
結混合物５　ｔｔｌ　を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　
１０１の受容能力のある細胞を形質転換した。７つの無
色のプラークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（ＲＦ　）
　ＤＮ入を調製した。ＲＦ−ＤＮＡを分析すると、全て
のクローンは正しい大きさのインサート及び正しい大き
さの断片を示した。これらのクローンの一つをｍｐ　１
８／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ／　ＵＫ２ＴＰＡ”と
称し、削除突然変異誘発に用いた。
迅速ＤＮＡ調製から得られた１、５μＩのｐｃｓ　１６
／ＵＫ２ＵＰＡ”　（実施例１２参照）を１２ＵのＫｐ
ｎ）で２０μノのｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐＨ７
，５，６ｍＭＭｇＣ１２，６−メルカプトエタノール中
で３７℃で１時間消化した。ｌ　Ａｌのｌ　Ｍ　ＮａＣ
Ａを添加後ＤＮＡを１２ＵのＷｉｎｄｉｅｒで３７℃に
おいて１時間消化した。１．７　ｋｐ断片を０．８ｑｂ
調製アガロースゲル上で単離した。ＤＮＡを電気溶出に
より抽出し、沈澱させた。
０．５ｔＪのＭｌ　３ｍｐ　１８　（ＲＦ）をＫｐｔ＋
夏及びＨｉｎｄＩ［ｒで消化した。７．３　ｋｂ　　ベ
クター断片を０．７係調製アガロースｒル上で単離した
。ＤＮＡを電気溶出し沈澱させた。
１００ｆモルのＭｌ　３ｍｐ　１８Ｋｐｎ　■−Ｈ１ｎ
ｄ　ｍ切断ベクター及び２００ｆモルのＫｐｍ　Ｉ　−
Ｈｌｎｄ　ｍインサートを１０　ｔｔｌの５０　ｍＭ　
Ｔｒｉｍ　・ＨＣｔｐＨ７，５，１Ｏｒｒｄ’ｌ　Ｍｇ
ｃｔ２．１０　ｍＭＤＴＴ、　２　ｍＭ　ＡＴＰ、　０
．５μＩゼラチン中において４００ＵのＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて７時間１５℃で連結した。６５℃で１０分
間インキュベーションによシ反応を停止した。５μｌの
この連結混合物を用いてＥ、　ｃａｌｌ　ＪＭ　１０１
のコンピテント細胞を形質転換した。１０個の無色プラ
ークを拾い上げ、一本鎖及び複製形（ＲＦ）ＤＮＡを調
製した。ＲＦ−ＤＮＡを分析すると全てのクローンは正
しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片を示し
た。これらのクローンの一つをｍｐｌ　８／Ｋｐｎ　Ｉ
　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ／　ＵＫ２ＵＰＡ”と称し、削除
突然突然変異誘発のために、２００ｐモルの突然変異プ
ライマーを、８ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂ
ｏ＠ｈｒｌｎｇｅｒ＋　８　Ｕ／　ＡＩ　）を用いて２
０μｌの、ｌ　Ａｉのｌ　ＯｍＭ　ＡＴＰを含有する５
　０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ＰＨ７，５，１０ｒｎ
）ｊＥ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１　ｍ
Ｍス（ルミジン、０．１　ｍＭＥＤＴＡ中においてホス
ホリル化した。３７℃で１時間インキュベーション後、
６５℃で１０分間加熱することによシ反応を停止した。
ハイツリダイゼーションスクリーニングのために、２０
ｐモルの突然変異誘発プライマーを唯一のＡＴＰ源にお
いて３０μＣｔ　ｒ　３２Ｐ−ＡＴＰ　（３０００Ｃ１
／ｍモル：　Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ）を用いて上記の如くホスホリル化した。このプ
ライマーを３．５−・６　Ｘ　ＳＳＣで稀釈し、直接プ
ローブとして用いた。
０．２ｐモルの一本鎖鋳型を２０Ｐモルのホス“ホリル
化突然変異誘発オリゴデオキシリ？ヌクレオチドプライ
マー（１０Ｐモル／μｌ）及び１０Ｐモルのユニバーサ
ルＭ１３配列決定プライマーと共に１０μｌの２０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣ
ｔ２．５０　ｍＭ　ＮａＣ１，ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ中にお
いて９５℃で５分間インキ−ベートした。溶液をゆっく
シ室温まで３０分間に亘って冷却させた。
Ｃ）延長一連結反応 上記アニーリングされた混合物に１μノの緩衝液（０，
２ＭＴ山・Ｈｃｔ　（ＰＨ７，ｓ　）、Ｏ，ｌ　ＭｇＣ
ｌ２．０．１ＭＤＴＴ　：ｌ、４μノの２．５　ｍＭ　
ｄＮＴＰ混合物、１　ａｌの１０　ｍＭ　ＡＴＰ、０．
５μノＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂ　ｉｏｌｍｂｇ　＋４０
０Ｕ／μり、０．６７μ）のフレノウＤＮＡポリメラー
ゼ（ＢＲＬ、　２．９９　Ｕ／μｌｌ＞を含有する１０
μ）の酵素−ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ％ｄｃＴｐ、　ａＴ
ｒｐ、　ｄｃＴｐ）溶液を添加した。この混合物を１５
℃で１時間インキュベート後、８〜９℃で１６時間イン
キュベートした。６５℃で１０分間インキュベートする
ことによシ反応を停止した。
ｄ）連結混合物の形質転換 連結混合物をＴＥで１：２０及び１：２００に稀釈し、
これらの稀釈溶液のそ、れぞれ１μ！及び５μ！を用い
て０．２−のＥ、　ｃｏｉｌ　ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔ
Ｓの修復マイナス菌株（ＢＭＷ　７ｌ−１８（ΔＣ１ａ
ｃ−ｐｒ。
のコンピテント細胞を形質転換した。Ｅ、　ｃｏｌｌＢ
ＭＨ７１−１８ｍｕｔ　Ｓ　（ＢＭＨ７１−１８、ｍｕ
ｔｓ２１５：：　Ｔｎｉｏ）の造成はＫｒａｍｅｒ　＠
ｔ　ａｌ、（Ｃｅ１ｌ　　３８　＊８７９−８８７（１
９８４））により記載されている。
トランスフェクション後、修復マイナス株の変異表現型
へのファージの曝露を最少にするために、Ｅ、　ｃｏｌ
ｔ　ＪＭＩＯＩの修復＋菌株によシララン（ｌａｗｎ）
細胞を与えた（　Ｐ、　Ｃａｒｔｅｒ、　Ｈ，Ｂｅｄｏ
ｕｅｌｌｅ　ａｎｄ　Ｇ。
Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．
４４３１−４４４３（１９８５）］。
ｅ）ファージのスクリーニング トランスフェクションされたＤＮＡから得られた１００
個のプラークをＹＴプレート上にっま楊子で移し、感染
細菌のコロニーとして１５〜１８時間生育させた。コロ
ニープロッティングはＧｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎ
ｅｓｓ　（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Δｃａｄ、　Ｓｅｔ
。
ＵＳＡ７２．３９６１−３９６５（１９８５））から適
用された。ニトロセルロースフィルター（Ｍｌｌｌｉｐ
ｏｒｅＳ、Ａ、、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　ＨＡＷＰ　０９
０、孔径ｏ、４５μｍ）をコロニープレート上に室温で
１０分分間−た。
フィルターを０．５　Ｎ　ＮａＯＨで変性し、Ｉ　Ｍ　
Ｔｒｉｓ　・ＨＣｔｐＨ７，５で中和し、次いで高塩溶
液（０，５Ｍ　Ｔｒｌｓ　・ＨＣ２ｐＨ７，５＋　１．
５　Ｍ　ＮａＣｔ）で処理した。これらのフィルターを
８０℃で３０分間真空焼付けし、密封可能なグラスチッ
ク袋内で１ｏｏ１ｎｔのＩＯＸデンハＡ／ト溶液（Ｄ、
　Ｔ、　Ｄｅｎｈａｒｄｔ、　Ｂｉｏｃｈａｍ、Ｂｌｏ
ｐｈｙｉ。
Ｒｅｓ、Ｃｏｒｎｒｎｕｎ−２３、６４１−６４６）、
６ＸＳＳＣ及び０．２４ＳＤＳ中においてプリハイブリ
ダイズした。
ハイブリダイゼーションスクリーニングのために、ブリ
ハイブリダイズされたフィルターヲ５０−の６ｘｓｓｃ
中で１分間洗浄し、次いで５２Ｐ−標識化突然変異誘発
プライマーを含有する３、５−のプローブ内で３０分間
ハイブリダイズせしめた。
ハイブリダイズされたフィルターを１００＋ｎｔ６ｘＳ
ＳＣ中において室温で合計２分間３回洗浄し、次いてオ
ートラジオグラフにかけた。野性種と突然　　　　′変
異ファージ間の良好な区別が１００−の０．１×８８０
　＋　Ｏ，ｌ　％　ＳＤＳ中における６０℃での簡単な
洗浄（５分間）によシ得られた。
陽性クローンからのファージを１−の２ＸＹＴ中につま
楊子で移し、７０℃で２０分間加熱して細菌を殺し、次
いで１００μｌのこの７アージ懸濁液を１．５ｆ１１ｔ
の新たに生育するＥ、　ｃｏｌｔ　ＪＭＩＯＩ培養液（
ＯＤ６ｏｏ約６ｏｏ５）に接種した。培養液を３７℃で
４時間激しく振盪した（３００ｒｐｍ）。陽性クローン
からのファージ−ストック及び複製形ＤＮＡを調製した
（　Ｊ、　Ｍｅａａｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
１０１．２ｌ−７８（１９８３）：］。突然変異体（削
除突然変異誘発後）からのＤＮＡを適当な制限酵素で分
析し、野性８！（削除突然変異誘発前）　ＤＮＡの制限
断片と対比した。制限分析による確認後、一つの正しい
突然変異体からのＤＮＡをゾラーク精製した。突然変異
は更に制限分析及び鎖−ターミネータ−法を用いる配列
決定によシ検証した（Ｆ。
Ｓａｎｇｅｒ　、　Ｓ、　Ｎ１ｃｌｅｎ及びＡ、　Ｒ，
Ｃｏｕｌｇｏｎ、　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．　ＵＳＡ　７４．５４６
３−５４６７（１９７７））。
削除突然変異誘発は一般的実験方法で説明したようにし
て行った。ノ・イブリダイゼーションから得られた陽性
クローンは制限分析によシ確認された。３３３　ｂｐを
ＢａｍＨＩ断片から削除突然変異誘発により除去した。
ＢａｍＨＩを用いる制限分析で２１５０ｂｐ断片を確認
した。Ｅｃ　ｏ　ＲＩを用いる制限分析は野性種に見ら
れた６６０．４７２．４１６及び２８７断片の代シに突
然変異体上に６６０，４１６．２８７．２３０　ｂｐ断
片をもたらした。ＰａｔＩを用いる分析は突然変異体に
ついて６１１及び４１４ｂｐの大きさの二つの断片を示
した。野性種ＤＮＡは６２２．６１１及び４１４　ｂｐ
の三つの断片を示した。正しい構造を有する一つの変異
体クローンをｍｐ　１　ｓ／Ｒａｍ　ＨＩ　／　ＭＯＴ
ＰＡＡＵＰＡ”と称する。
ｔ−ＰＡＡ鎖及びｕ−ＰＡＢ鎖の間の結合におけるＤＮ
Ａ配列は５’ＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＴＧＣ３’
　の配列の配列プライマーを有する鎖ターミネーター配
列決定方法によシ検証した。このプライマーはｕ−ＰＡ
（６８２−６６６）のコーー化鎖に相補的である。
削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行った
。・・イブリダイゼーションから得られた陽性クローン
はＰｓｔｌを用いる制限分析によシ確認した。突然変異
体においては、５４４　ｂｐ断片をもたらす野性穏に対
比して、４６７　ｂｐバンドが観察された。正しい構造
を有する一つの変異体クローンをｍｐ　１８　／　Ｋｐ
ｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ／　ＭＯＵＰＡ’ＴＰＡ”　　
と称する。削除は５’　ＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣ
ＴＧＣ３’の配列の配列決定プライマーを用いる鎖−タ
ーミネータ−配列決定法によシ検証された。このプライ
マーはｔ−ＰＡ（１０６２−１０４６）のコーＰ化鎖に
相補的である。
削除突然変異誘発は一般的実験方法と同様にして行った
。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローンは
Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈ１ｔ＋ｄ　ｍ、ＥｃｏＲＩ及びＰ＋ｓ
ｔＩを用いる制限分析によシ確認された。得られた断片
は下記の通シである二 ＫＰＥＩ　ｌ−Ｈｌｎｄｎｌ　　ＥｃｏＲＩ　　　　　
Ｐｓｔ　１ｂｐ　　　　ｂｐ　　　　　ｂｐ　　　　ｂ
ｐ　　　　　ｂｐ　　パン所しｂｐ　　　ｂｐ 正しい大きさのインサート及び正しい大きさの断片が変
異体について観察された。正しい構造を有する一つの変
異体クローンをｍｐ　ｌ　８／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ
ｄ　ＩＩＩ　／ＭＯＵＫ２　ＴＰＡ”　　と称する。削
除は５’　ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧ
ＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧ　３’配列の配列決定プラ
イマーを用いる鎖−ターミネータ−配列決定法によシ検
証された。このプライマーはｔ−ＰＡ（８５３−８２１
）のコード鎖に相補的である。
除突然変異銹発（第２６図参照） ＵＫ２ＵＰＡ”の造成においては二つの別々の削除突然
変異が用いられた。第一の削除突然変異誘発は一般的実
験方法と同様にして行われた。ハイブリダイゼーション
から得られた陽性クローンはＥｃ。
ＲＩを用いる制限分析によシ確認された。変異体には５
４９，４５２，４１６ｂｐ断片をもたらす野性種に対比
して、５４９　ｓ　４１６．３５１　ｂｐバンドが観察
された。正しい構造を有する一つの変異体クローンをｍ
ｐ　ｌ　８／Ｋｐｎ　ｌ−Ｈ１ｔ＋ｄ　Ｉ［Ｉ／ＭＯＵ
Ｋ２ＵＰＡ”−１と称される。削除は ５’ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＴＴ
ＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧ　３’の配列の配列決定プライマ
ーを用いる鎖−ターミネータ−配列決定法によシ検証さ
れた。このプライマーはｔ−ＰＡ（８５３−８２１）の
コード化鎖に相補的である。
削除突然変異誘発の第二工程において、削除は点突然変
異の導入と共になされた。削除突然変異誘発は一般的実
験方法と同様にして行われた。ノ１イブリダイゼーシ、
ンから得られた陽性クローンはＥｃｏＲＩを用いる制限
分析によシ確認された。突然変異体において、５４９，
４１６及び３５１　ｂｐ断片をもたらす野性種に対比し
て、４１６．３５１．２５９　ｂｐパンＰが観察された
。正しい構造を有する一つの変異体クローンをｍｐ　１
８／Ｋｐｎ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［［／ＭＯＵＫ２ＵＰＡ
”と称する。この削除は配列５’　ＣＡＧＡＧＣＣＣＣ
ＣＣＣＧＧＴＧＣ３’の配列決定プライマーを用いる鎖
−ターミネータ−配列決定方法によシ検証された。この
プライマーはｕ−ＰＡ（６８２−６６６）のコード鎖に
相補的である。
実施例１５：ハイブリッドｔ　−ＰＡ／ｕ　−ＰＡ　ｃ
ＤＮＡ造成体の酵母発現ベクターｐＪＤＢ２０７中への
クローニングＡ）　　ＴＰＡＡＵＰＡ”ハイブリッド遺
伝子のｐＪＤＢ　２０７ＲＦ　−ＤＮＡを迅速ＤＮＡ単
離法によ’）　ｍｐ　１８／’ＢａｍＨＩ　／ＭＯＴＰ
Ａ’ＵＰＡ”について調製した（Ｄ、Ｓ。
Ｈａ　１ｍｅ　ａ及びＭ、　Ｑｕｉｎｇｌｅｙ、　Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ。
１１４．１９２−１９７（１９８１））。
ＲＦ−ＤＮＡ　（−１，５μｇ）を９ＵのＢａｍＨＩで
２０μｉのｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＡ　（ｐＨ７
，５）、６　ｒｎ）Ａ　ＭｇＣ２２，１００ｍＭ　Ｎａ
ＣＬ、６−メルカプトエタノール中において３７℃で１
時間消化した。ｌμＡ’０ＲＮａｓｅ（ＩＹ／ｄ）を添
加し、３７℃で１０分間インキュベート後、２．１ｋｂ
インサートを０．７係調製用アガロースゲル上で単離し
た。このＤＮＡインサートを電気溶出によシ抽出し、エ
タノール中で沈澱させた。
１．５μｌのｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＴＰ
ＡＡＵＰＡ”をＢａｎ　ＨＩで切断し、仔つ、シ腸アル
カリホスファターゼで処理し、そして６．７ｋｂベクタ
ーを単離した。
電気溶出後ベクターＤＮＡを沈澱させた。
１００ｆモルのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡ
ＡＵＰＡ”ＢａｍＨＩ切断ベクター、２００ｆモルのＴ
ＰＡ’ＵＰＡ”インサートを４００ＵのＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼで、１０μノの５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ　−ＨＣＬ
　ｐＨ７，５，１０ｒｎＭＩ　ＮａＣＬ２．１０或ＤＴ
Ｔ、　２ｍＭ　ＡＴＰ、　０．５μＩのゼラチン中にお
いて１５℃で８時間連結した。６５℃で１０分間インキ
ーペーションして反応を停止した。５μ！のこの連結混
合物を用いてＥ、　ｃｏｉｌ　ＨＢＩＯＩ　Ｃａ２＋細
胞（Ｍ、　Ｄａｇｅｒｔ及びＳ、Ｄ−Ｅｈｒｌｉｃｈｓ
　Ｇｏｎｅ　６　ｔ　２３−２８（１９７９））を形質
転換した。ｌ　２　ａｍｐ”コロニーを拾い上げ、迅速
単離方法によｆｉＤＮＡｆｉ−調製した。ＤＮＡを分析
すると、５個のクローンが共に正しい大きさのインサー
ト及び正しい方向を示した。一つのクローンを１０　ｏ
ｒｔｕ；）／ｌｔｔのアンピシリンを含有する１００−
のＬＢ培地中において生育せしめた。シラスミドＤＮＡ
を単離し、ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＭＯＴＰ
ＡＡＵＰＡ”　と称する。
−ニング ＲＦ−ＤＮＡを、迅速ＤＮＡ単離法により　、ｍｐ　１
８／Ｋｐｎ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　ｍ　／　ＭＯＵＰＡＡＴＰ
Ａ”、　ｍｐ　１８／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ／Ｍ
ＯＵＫ２ＴＰＡ”、ｍｐ　１８／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｉｎ
ｄ　Ｉ［／ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”について調製した。
これらの三つのＲＦ　−ＤＮＡ　（約１．５μＩｉ）を
それぞれ１２ＵのＫｐｎｌ及び１２ＵのＨｌｎｄＩ［［
で２０μ）の１０ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ　ｐ７．５
．６！ｕＭＭｇＣｔ２．６ｍＭメルカプトエタノール中
において３７℃で１時間消化した。１μｌのＩ　Ｍ　Ｎ
ａＣ２を添加し、これらのＤＮＡを更に１２ＵのＨｉｎ
ｄｌｌＩで消化した。１μｌのＲＮａ　ｓ　ｅ　（１１
１１９／ｌｄ　）を添加し、３７℃で１０分間インキュ
ベート後、１．４ｋｂインサートを各々０．８係調製ア
がロースグル上で単離した。これらのＤＮＡインサート
を電気溶出により抽出し、エタノール中で沈澱させた。
３　Ａｉのｐｃｓ　１６／ＵＰＡ　ｔ−Ｋｐｎ　Ｉ及び
ＨｌｎｄＩＩＩで消化し、２．７ｋｂベクタ一断片を単
離した。電気溶出後、ベクターＤＮＡをエタノール中で
沈澱させた。
１００ｆモルのｐＣ８１６Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ
切断ベクター、２００ｆモルのＫｐｍ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ
　ｍ切断インサート断片を１０ｔｔｌの５０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｍ−ＨＣｔｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣｌ２．１０
ｍＭ　ＤＴＴ、　２ｍＭ　ＡＴＰ、　０．５μＩゼラチ
ン中において４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼで１５℃に
おいて８時間連結した。６５℃で１０分間インキュペー
ジ、ンして反応を停止し、５μｌのこの連結混合物を用
いてＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩＯＩ　Ｃａ２＋細胞を形質
転換した。
これらの三つの連結の各々から６個のａｍｐＲコロニー
をつ＼き出した。ＤＮＡを迅速単離法によシ調製した。
ＤＮＡ　ｆ　Ｋｐｍ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで分析す
ると、正゛しい大きさのインサートバンドが観察された
。これらの三つの各々の連結体から一つのクローンを１
００μＥｌ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０〇−Ｌ
Ｂ培地中で生育させた。ｍｐ　１　Ｂ／Ｋｐｎ　ｌ−Ｈ
ｌｎｄ　ｍ／ＭＯＵＰＡＡＴＰＡ”　、　ｍｐ　１８／
Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ｍ／　ＭＯＵＫ２ＴＰＡ”及
びｍｐ　１８／Ｋｐ　ｎ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ／Ｍ
ＯＵＫ２ＵＰＡ”から誘導されたプラスミドＤＮＡを単
離し、それぞれＩ）Ｃ８１６／ＭＯＵＰＡＡＴＰＡ”、
ｐｃｓ１６／１の玉２ＴＰＡ”及びｐｃｓ　１６／ＭＯ
ＵＫ２ＵＰＡ”　　と称する。
５μＩのｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＵＰＡを１
５ＵのＳｅａ　ｌ及び５ＵのＸｈｏ　Ｉ　（Ｂｏ＠ｈｒ
ｉｎｇｅｒ）によ＃）１５μｌの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ
−ＨＣＬ（ｐＨ７，５）、６　ｒｎ）ｌ　ＮａＣＬ２．
１５０　ｍＭ　ＮａＣＬ、６−メルカプトエタノール中
で３７℃で１時間消化した。１μｌのＲＮａａ・（１■
／ゴ）を添加後、６．７ｋｂベクタ一断片を単離した。
電気溶出後、ベクターＤＮＡを沈澱させた。
各々１５μＩのｐｃｓ　１．６／ＭＯＵＰＡＡＴＰＡ”
　、　ｐｃｓ１６／ＭＯＵＫ２ＴＰＡ”、ｐｃｓ　ｌ　
６／ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”を３０ＵのＸｈ。
Ｉと共に２００の１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐ
ＨＢ、釦−ＭｇＣ１２，１５０ｍＭ　ＮａＣＡ、　６　
ｍＭメルカプトエタノール中において３７℃で１時間イ
ンキ−ベートし、等容ｆｃのフェノール−クロロホルム
で抽出シ、エタノール中で沈澱させた。沈澱したＸｂｏ
Ｉ切断ｐｃｓ　１６／ＭＯＵＰＡＡＴＰＡ”、ｐｃｓ　
ｌ　６／ＭＯＵＫ２ＴＰＡ”　、及ヒｐｃｓ　ｌ　６／
ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”　ＤＮＡ遺伝子を各々１５゜μノの
１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ　ｐＨ７，５，６ｍＭ
　ＮａＣＬ２．１５０　ｒｎｂｌ　ＮａＣＡ−２，６ｍ
Ｍメルカプトエタノール中に再懸濁させ、３７℃で４０
分間１２ＵのＳｅａ　１（部分消化物）とインキュベー
トし、等容量のフェノールで抽出した後、等容量のクロ
ロホルム−イソアミルアルコール（５０：１）で抽出し
た。
１．２ｋｂ断片を各々はｌ係調製アガロースグル上で単
離した。これらのＤＮＡを電気溶出によシ抽出し、沈澱
させた。
１００ｆモルのｐＪＤＢ２０７７ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡ
　５ｅａｌ−Ｘｈｏｌ切断ベクター及び２００ｆモルの
Ｘｈｏ−８ｅａ■切断ｐｃｓ　１６／ＭＯＵＰＡＡＴＰ
Ａ″、ｐｃｓ　ｌ　６／ＭＯＵＫ２ＴＰＡ”或いはｐｃ
ｓ　１６／ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”　１．２　ｋｂインサー
トを各々ｘＯｉｔｌの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣｔ
、　ｐＨ７，５、ｌ　ＯｍＭＭｇＣｔ２、ｌ　ＯｍＭ　
ＤＴＴ　、　２　ｍＭ　ＡＴＰ　、　０．５μｌのゼラ
チン中で、４００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５
℃で１６時間連結した。６５℃で１０分間インキュベー
ションすることによシ反応を停止した。
５μノのこの連結混合物を用いてＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ
　１０１Ｃａ２＋細胞を形質転換した。
６個のａｍｐ”コロニーをこれらの三つの連結体の各々
から拾い上げた。ＤＮＡを迅速単離法によシ調製した。
ＤＮＡの制限分析は正しい大きさのインサートパント９
を示す。これらの三つの連結体のそれぞれからの一つの
クローンを１００μＩｉ／ｌｄのアンピシリンを含有す
る１ｏｏａ！ＬＢ培地中で生育せしめた。ｐｃｓ　１６
／ＭＯＵＰＡ”ＴＰＡ”　、　ｐｃｓ　１６／ＭＯＵＫ
２ＴＰＡ”　、　ｐｃｓ　１６／ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”か
ら誘導されたプラスミドＤＮＡはそれぞれｐ　ＪＤＢ２
０７／’ＰＨ０５−Ｉ　−ＭＯＵＰＡ”ｒＰＡ”、ｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ２ＴＰＡ”及びｐ
ＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ２ＵＰＡ”と称
される。
シラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＴＦ！
ＡＡＵＰＡ”　。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＰＡ’ＴＰＡ”
、ＰＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ２ＴＰＡ　
　及びｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＭＯＵＫ２ＵＰ
Ａ”を各々Ｈ１ｎｎ＠ｎ　ａｔ　ａｌ、　（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ。
Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７旦、１９２９（１９
７８））によシ記載されている形質転換方法を用いてサ
ツカロミセス拳セレビジアエ（Ｓａａｃｈａｒｏｍｙｅ
ｅａ　ａａｒａｖＬａＬａｅ）菌株ＧＲＦ　ｌ　８中に
導入した。各々５μｇのプラスミドＤＮＡを１００μｌ
のスフェロプラスト懸濁液に添加し、混合物をポリエチ
レングリコールで処理した＠スフェロプラストを１０ｍ
再生寒天と混合し、酵素最少培地プレート上にロイシン
なしにブレーティングした。３０℃で３日間インキーベ
ーション後約２００個の形質転換細胞が得られた。
酵母転換体の各々から一つのコロニーをつ＼き出した。
これらの異ったコロニーを と称する。
酵母細胞を、３０℃において２０ｍ１の三−１７培地（
：８．４Ｎの酵母窒素ベース（ｏｉｒｃｏ）、ｌＯＩの
Ｌ−アメ／４’ラギン（Ｓｉｇｍａ）、１１のＬ−ヒス
チジン（Ｓｉｇｍａ）、４０−の５０係グルコース／１
１溶液〕中において５０−のエルレンマイヤーフラスコ
内で８−１０ＸＩＯ７細胞／−の密度に到達するまで２
４時間振盪しながら生育させた。細胞を遠心分離し、１
０ｖｔのＯ−９’Ｉｙ　Ｎａ　ＣＬ中に再懸濁させた。
２−の再懸濁細胞を用いて５０１ｎｔの低−Ｐ１最小培
地（ヨーロッパ特許出願１４３０８１号明細書記載のも
の）を接種し、これに１０９／ｌＬ−アスノクラギン（
Ｓｉｇｍａ　）、及び１０ｇ／ｌＬ−ヒスチジン（Ｓｉ
ｇｍｍ）’１２５０−のエルレンマイヤーフラスコ内で
添加した。インキュベーションは２５０　ｒｐｍにて３
０℃で行った。
１０ｍｊの低−Ｐ１最小培地からの細胞を４８時間後に
３０００ｒｐｍの１０分間の遠心分離によりＦａｌｃｏ
ｎ　２０７０チユーブ内に集めた。これらの細胞を一度
１０１Ｒ１の低−ｐｔ培地で洗浄し、遠心分離した。細
胞ペレットを溶解緩衝液（６６ｍＭ　’）ン酸カリウム
ｐＨ７，４，４ｍＭ　Ｚｍｔｔｓｒｇｅｎｔ（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ−）　：］中に浮遊させた。この細胞浮遊
液に８Ｉのガラスピーズ（０，５〜０．７５ｍ直径）及
び小ガラス棒を添加し、浮遊液をＶｏｒｔｅｘ　Ｍｌｘ
ｅｒ　（５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩ　ｎ＠ｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ　Ｉ　ｎ　ｅ　、　、　ＵＳＡ）上でフルスピードで
４Ｉ２分間氷上で２分間の間隔をもって振盪した。
これらの９０％を越える細胞はこの方法により破壊され
た。細胞破片及びガラスピーズを４℃で３０００ｒｐｍ
にて５分間遠心分離によシ沈澱させた。
上澄液をＰＡ活性の測定及びＰＡの精製及び単離に用い
た。
の挿入 ｍｐ　ｌ　８／Ｋｐ　ｎ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎｄ　ＩＩＩ／
ＭＯＵＰＡＡＴＰＡ”のＲＦ　ＤＮＡをコード配列の開
始の直ぐ上流に位置するＳｍａ　１部位において切断し
、Ｓａｃ　ｌリンカ−（ＣＧＡＧＣＴＣＧ）に連結した
。引続きこのグラスミドをＳａｃ　■で切断し、それは
りガントリンカ−の位置及びハイブリッドＰＡコード配
列のｔ−ＰＡ−由来部分における自然Ｓａｃ　１部位に
おいて切断した。ニーの得られた断片の小さい方をアガ
ロースダルによシ精製し、Ｓａｇ　ｌ切断ｐＣＧＡ４４
　（実施例４参照）に連結し、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＨＢＩ
ＯＩ中に形質転換し、そして候補クローンからのＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで試験した。期待された制限パターンを有
するクローンをｐｃＧｃＩ／ＵＰＡＡＴＰＡ”と称する
。
ｍｐ　１８／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ／ＭＯＵ
Ｋ２ＴＰＡ”のＲＦ　ＤＮＡを、コード配列の開始の直
ぐ上流に位置するＳｍａ１部位で切断し、上記の如（Ｓ
ａｃ　Ｉと連結した。
Ｓａｃ　ｌで切断後、得られた小断片を上記の如くＳａ
ｃ　Ｉ−切断ｐ　ＣＧＡ　４４中にクローニングし、そ
して期待された制限パターンを有するクローンをｐｃＧ
ｃ２／ＵＫ２ＴＰＡ”と称する。
ｍｐ　１　Ｂ／Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｈｌｎｄ　Ｉ［［／ＭＯ
ＵＫ２ＵＰＡ”のＲＦ　ＤＮＡをｕ−ＰＡ配列の上流の
Ｓｍａ　１部位及びコード配列下流のＸｈｏ１部位（ベ
クターＤＮＡ中の）において切断した。このＤＮＡ断片
の粘着末端をＥ、　ｃｏｉｌＤＮＡポリメラーゼエ（実
施例５Ｄ参照）を用いてフィルインした。Ｓ＆ｅ　ｌリ
ンカ−を平滑末端に連結し、ＤＮＡをＳａｃ　ｌで切断
し１．二つの得られた断片の小さい方をアガロースゲル
で精製し、Ｓａｃ　１−切断ｐＣＧＡ４４中にクローニ
ングした。期待されたＥｃｏ　ＲＩ制限パターンを有す
るクローンをｐＣＧＣ３／ＵＫ２ＵＰＡ”と称する。
工ａ　１　：　　ｍｐ　１８／Ｂａｎ　ＨＩ／ＭＯＴＰ
ＡＡＵＰＡＢのＲＦＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、小さ
い（約２．１ｋｂ）断片をＢａｍＨＩ切断ｐＪＤＢ２０
７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＴＰＡ’ＵＰＡ”（実施例９参照
）ベクター中にクローニングした。
正しい方向はＨｌｎｄｌｌ［による消化によシ選択され
、一つの正しいプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−１−ＭＯＴＰＡＡＵＰＡ”と称する。
工程２：　　ｐｔＮＣ−ＵＣからの約６００ｂｐのＳａ
ｃ　■−Ｎａｒ　ｌ断片（実施例３参照）及びｐＪＤＢ
２０７　／ＰＩ（０５−Ｉ　−ＴＰＡＡＵＰＡ”からの
約１３５０　ｂｐ　Ｎａｒ　１−Ｘｈｏｌ断片を単離し
、Ｓａｃ　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ切断ｐｃｓ１６（実施例７
参照）ベクター中にクローニングした。この約１．９ｋ
ｂインサートはＱａｃ　ｌ　−Ｘｈ。
■及びＥｃｏ　ＲＩによる消化によシ確認した。一つの
正しいプラスミドｔ−ｐｃｓ　１６／ＭＯＴＰＡＡＵＰ
Ａ、”と称する。
工程３ニ　プラスミドｐｃｓ　ｌ　６／ＭＯＴＰＡ　Ｕ
ＰＡ　ｔ−ｕ−ＰＡコード配列の下流に位置するＸｈｏ
Ｉ部位で切断し、粘着末端をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリ
メラーゼＩを用いてフィルインする。Ｓａｃ　Ｉリンカ
−を平滑末端に連結し、ＤＮＡをＳａｃ　ｌで切断した
。二つの断片の小さい方をアガロースダルにより精製し
、５ａｃｌ−切断ｐＢＲ４ｍ（実施例５参照）ベクター
断片中にクローニングした。正しい方向及び正しい大き
さのインサートはそれぞれＢａｍ　ＨＩ及び５ａｃｌに
よる消化により確認した。一つの正しいプラスミドをｐ
ＣＧＣ４ａ　／ＴＰＡＡＵＰＡ”と命名する。
、以下金白 挿入 へのクローニング ３μＩのｐＣＧ０４ａ／ＴＰＡ’ＵＰＡ”　（実施例１
７参照）を１２０の５ａｅｌ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
　）で２０ｐＬの１０　ｍＭ　Ｔｒｉ　ｍ　−ＨＣｌ　
ＩＩＪ４７．５．６ｍＭλＩｇＣ１２，６ｍＭメルカグ
トエタノール中において３７℃で１時間消化した。約１
．９　ｋｂの断片を０．７％調製アブロースグル上で単
離した。このＤＮＡを電気溶出によシ抽出し、沈澱させ
た。
０．５ｔｔｌ　ＯＭ１３ｍｐ１８（ＲＦ）をＳａｃ　Ｉ
で消化した。との７．３　ｋｂベクター断片を０．７　
ｑ６″ＦＪｌ製アガロースゲル上で単離した。このＤＮ
Ａ″Ｉｒｉ気溶出し、沈澱させた。
１００ｆモルのＭｌ　３ｍｐ　１８５ａｃＩ切断ベクタ
ー及び２００ｆモルのＳａｃ　ｌインサートを１０μＬ
の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬｐＨ７，５，１０ｍ
ＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　ＤＴＴ、２ｍＭ　ＡＴＰ、０
．５Ａｉのゼラチン中において４００ＵのＴ４ＤＮＡ　
　リガーゼで１５℃において７時間連結した。６５℃で
１０分間インキ−ベートして反応を停止した。５μＬの
この連結混合物を用いてΣ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩの；
ンピテント細胞を形質転換した。６飼の無色プラークを
拾い上げ、−重鎖及び複製形（ＲＦ）ＤＮＡを調製した
。ＲＦ−ＤＮＡを分析すると、４個のクローンは正しい
大きさのインサート及び正しい方向を示した。これらの
クローンの一つをｍｐ　１８／　５ａｅＩｌ　／ＴＰＡ
”ＵＰＡ”　（ＢＣ）と称する。
−ニング ｐＢＲ４ａ　（実施例５参照）ＳａｃｌＬｉ片をＭ１３
ｍｐ　１８中でクローン化した。正しい大きさのインサ
ート及び正しい方向を有するこれらのクローンの一つを
ｍｐｌ　８／Ｓａａ　Ｉ　／ＴＰＡ’ＵＰＡ”　（ＢＲ
）と称する。
突然変異誘発 １）　　Ｋ２ＵＰＡ”（ＢＣ）　（即ち、ｔＰＡ（１−
３）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
１１）］の造成 削除突然変異銹発を、ｍｐｌ　８／　５ａＣＩ／ＴＰＡ
ＡＵＰＡ”　（ＢＣ）　　について一般的尖験方法（実
施例１４参照）と同様にして行った。ハイブリダイゼー
ションから得られた陽性クローンはＳａｃ　１を用いる
制限分析によシ確認された。変異体においては、約１９
００　ｂｐ断片をもたらす野性種に対比して約１３８０
　ｂｐバンドが観察された。変異体を更（でＥｃｏＲＩ
消化によシ砧認した。正しい才をＹ造を有する−りの変
異体クローンはｍｐ　１８／５ａ６１　／に２ＵＰＡ”
（ＢＣ）と称する。削除は配列５’　　ＣＣＣＡＧＴＧ
ＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＧＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴ
Ｇ　　３’の配列決定プライマーを用いる鎖ターミネー
ター配列決定方法によシ検証された。
このプライマーは位置８３８（ｔ−ＰＡ）におけるミス
マツチを有するｔ−ＰＡ（８５３−８２１）のコード鎖
に相補的であった。
２）ＦＵＰＡ”（ＢＣ）　（即ちｔＰＡ（１−４９）−
ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）
）の造成削除突然変Ｊ４Ｒ発を、ｍｐ　ｉ　８／　Ｓａ
ｇ　Ｉ／ＴＰＡ’ＵＰＡ”（ＢＣ）Ｋついて一般的方法
（実施例１４参照）と同様にして行った。ハイブリダイ
ゼーションから得られた陽性クローンはＳａｃ　ｌを用
いる制限分析忙よシ確認された。変異体においては、約
１９００ｂｐ断片をもたらす野性椋纜対比して、約１２
００　ｂｐのバンドが観察された。変異体は更にＥｃｏ
　ＲＩ消化により確認された。正しい構造を有する一つ
の変異体クローンはｍｐ１８／Ｓａｃ　ｌ　／ＦＵＰＡ
”（ＢＣ）と称される。削除はＳ’　　ＣＡＧＡＧＣＣ
ＣＣＣＣＣＧＧＴＧＣ３’配列の配列決定プライマーを
用いる鎖ターミネーター配列決定法によシ検証された。
このプライマーは聾−ＰＡ（６６６−６８２）のコード
鎖に相補的である。
３）　　ＦＫ２ＵＰＡ”（ＢＣ）　［即ち、ｔＰＡ（１
−４９）−４ＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９
−４１１）　）の造成削除突然変異訴発をｍｐ　１８　
／　Ｓａｃ　Ｉ　／　ＴＰＡ’ＵＰＡ”（ＢＣ）につい
て一般的臭験方法（実だ１例１４参照）と同様たして行
った。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クロー
ンは５ａＣ７を用いる制限分析によシ確認された。変異
体においては、約１９００　ｂｐの断片をもたらす野性
種に対比して約１４７０　ｂｐのバンドが観察された。
変異体は更にＥｃｏＲＩ消化によシ確認された。正しい
構造を有する一つの変異体クローンはｍｐ　１８／Ｓａ
ｃ　Ｉ　／ＫＦ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）と称される。削除
は配列５’　　ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧ
ＧＧＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧ　　３’の配列決定ｆ
２イマーを用いる鎖ターミネーター配列決定方法によシ
検証された。
とのプライマーは位置８３８（ｔ−ＰＡ）におけるミス
マツチを伴ってｔ−ＰＡ（８５３−８２１）のコード化
銀に相補的である。
４）　ＦＧＫ２ＵＰＡ”（ＢＣ）　（即ちｔｐＡ（１−
８６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）　−ｕＰＡ（１５９
−４１１）　］の造成削除突然変異誘発はｍｐ　１８／
Ｓａｇ　ｌ　／　ＴＰＡ’ＵＰＡ”（ＢＣ）について一
般的実願方法（実施例１４参照）と同様釦して行われた
。ハイブリダイゼーションから得られた陽性クローンは
Ｓａｃ　■を用いる制限分析により確認された。変異体
においては、約１９００　ｂｐの断片をもたらす野性種
に対比して約１５８０　！バンドが確認された。変異体
は更にＥｅｏ　ＲＩ消化によシ確認された。正しい構造
を有する一つの変異体クローンはｍｐ　１８／５ａｃｌ
　／ＦＧＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）と称される。削除は配
列５’　　ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＧ
ＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧ　　３’の配列決定ｆ５イ
マーを用いる鎖ターミネーター配列決定方法によシ検証
された。
このプライマーは位置８３８（ｔ−ＰＡ）におけるぐス
マッチを伴ってｔ−ＰＡ（８５３−８２１）のコード鎖
に相補的である。
５）同様な削除突然変異誘発集験方法を用いてに２ＵＰ
Ａ”　（ＢＲ）　（ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６
−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）　） ＰＵＰＡ”　（ＢＲ）　（ｔＰＡ（１−４９）−ｕＰＡ
（１３４−４１１）　、ＩＦＫ、ＵＰＡ”（ＢＲ）（ｔ
ＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰＡ
（１３２−４１１））及び ＦＧＫ２ＵＰＡ”（ＢＲ）（ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰ
Ａ（１７６−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１））　
− を生成したー Ｄ）ハイブリッドＰＡコード配列の晴乳動物細胞１．　
　ＦＵＰＡ”（ＢＣ）　、　Ｋ２ＵＰＡＢ（ＢＣ）　、
　ＦＫ２ＵＰＡ”（ＢＣ）及びＦＧＫ２ＵＰＡＢ（ＢＣ
）の挿入 ｍｐ　１８／Ｓａｃ　Ｉ　／に２ＵＰＡ”（ＢＣ）　、
　ｍｐ１８／ｆｉａａＩ／ＦＵＰＡ”（ＢＣ）　、　ｍ
ｐｌＢ／５ａｃｒｚ々に２ＵＰＡ”　（ＢＣ）及びｍｐ
　１８／Ｓ　ａ　ｃ　Ｉ　／　ＦＧＴ（２ＵＰＡ″（ｎ
ｃ）からのＲＦ　ＤＮＡを各々Ｓａｃ　ｌで切断した。
二つの得られた断片の小さい方を単離し、５ａｃ７切断
ｐＢ１４ｍ　　（実施例５参照）ベクター断片に連結し
、Ｅ、ｃｏｌＩＨＢ１０１中に転移し、そして正しい方
向及び正しい大きさのインサートをそれぞれＢａｍＨＩ
及び５ａｃｌによる消化によシ確紹した。唇られたシラ
スミドをそレ−ｔＴＬ　ｐＣＧＣ５／に２ＵＰＡ”　、
　ｐＣＧＣ６／ＦＵＰＡ”　。
ｐ　ＣＧＣ７／ＦＫ２ＵＰＡ”　及ヒｐ　ＣＧＣ８／Ｆ
ＧＫ２ＵＰＡ　”　ト命名する。
２、同様に、　Ｋ２ＵＰＡ”（ＢＲ）　、　ＦｔＪＰＡ
”（ＢＲ）　。
ＦＫ２ＵＰＡ”　（ＢＲ）及びＦＧＫ２ＵＰＡ”　（Ｂ
Ｒ）　ＤＮＡ　（上記参照）を各々ｐＢ１４１中に挿入
した。イｏられたシラスミドをそれぞれｐＢＲ５，ｐＢ
Ｒ６，ｐＢＲ７及びｐＢＲ８と命名する。
発現ベクター プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ　（ＡＴＣＣ３７１４５）
は抗葉酸剤メトトレキセートを用いる選択或いはＤＨＦ
Ｒ”ＣＨＯ細胞のＤ）（ＰＲ＋形質転換体の選択によシ
ＤＨＦＲ″″含有細胞の形質転換体の選択を可能にする
グラスミドである［”ＤＵＫＸＢＩ細胞；Ｇ。
Ｕｒｌａｕｂ　、　Ｐｒｏｅ　、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ
　、　Ｓｃｉ　、Ｕ、Ｓ、Ａ。
７７．４２１６−４２２０（１９８０））。このプラス
ミドの単−Ｂ　ａｍＨＩ部位にモジュールｔ−ＰＡ遺伝
子を含有するｐＣＧＡ２８のＢａｍＨＩ断片をクローン
化するととができる。これらの二つの可能性のある方向
のいづれかを含有するプラスミドはｐｃＧＡ７００ａ／
ｌＰＡ及びｐｃＧＡ７００ｂ／ｌＰＡと命名される。両
者を用いてｔｉ織培＠細胞内にｔ−ＰＡを発現すること
ができるが、しかし、ｔ−ＰＡ遺伝子の転写がＤＨＦＲ
遺伝子のそれと同一方向であるｐｃＧＡ７００ａ／ｌＰ
Ａの方がしばしば収束的に転写されるプラスミドよシも
僅かによシ高い発現レベルに導くので好ましい。
同様にしてプラスミドｐＢＲ１ａ／ｌＰＡ、ｐＢＲ２ａ
／ＵＰＡ”ＴＰＡ”　、ｐｃＧｃ１／ＵＰＡＡＴＰＡ”
　、及びｐ　ＣＧ　Ｃ２／ＵＫ２　ＴＰＡ　”からのハ
イプリ、ドプラスミノーダンアクチペータ（下記）をコ
ードするモジュール遺伝子は、ＢａｍＨＩ断片として、
ｐｃＧＡ７００ａ／ｌＰＡのＤＨＦＲ遺伝子と組合わせ
て、モジュールプラスミノーグンアクチベータ遺板子が
ＤＨＦＲ遺伝子と同一方向に転写されるプラスミドｐＣ
Ｇ−４７０１ａ／ｌｐＡ、ｐｃＧＡ７０２ａ／’ＵＰＡ
’ＴＰＡ”。
ｐｃＧＡ７０５ａ／’ＵＰＡＡＴＰＡ”　、及びｐｃＧ
Ａ７０７ａ／ＵＫ２ＴＰＡ”　　からそれぞれ形成され
、そして両方の遺伝子が反対方向に転写されるｐｃＧＡ
７０１ｂ／ｌＰＡ　。
ｐｃＧＡ７０２ｂ／１ＪＰＡＡＴＰＡ”　、　ｐｃＧＡ
７０５ｂ／１ＪＰＡ’ＴＰＡ”　。
ｐｃＧＡ７０　’ｙｂＡＫ２ＴＰＡ”が形成される。ｕ
−ＰＡＢ−鎖をコードする部分におけるＢａｍＨＩ配列
の存在のために、モジュールプラスミノーゲンアクチベ
ータ遺伝子はｎｅｏＲ７’：５スミドの部分的切断（３
個のＢａｍＨＩ部位の２個）の後、アガロールグル電気
泳動によシ適当な断片を単離（図面参照）することによ
ってのみ単離することができる。この様にして、ｐＢＲ
３ａ／ｕＰＡ　、　ｐＢＲ４ｍ／′ｒＰＡ”ＵＰＡ”　
。
ｐＢＲ５／１（２ＵＰＡ”　、　ｐＢＲ６／′ＦＵＰＡ
”　、　ｐＢＲ７／１”Ｋ２ＵＰＡ”　。
ｐＢＲ８／ＦＧＫｚＵＰＡ”　、　ｐｃＧｃ３／１ＪＫ
ｚＵＰＡ”　＊　ｐＣＧＣ４ａ／ＴＰＡ”ＵＰＡ”　、
　ｐＣＧＣ５／に２ＵＰＡ”　、　ｐｃＧｃ６／ＦＴＪ
ＰＡ”　。
ｐＣＧＣ７／’１’に２ＵＰＡ”　、及びｐ　ＣＧＣ８
７’ｌ’ＧＫ２ＵＰＡ　”から、プラスミノーダンアク
チベータ遺伝子が全てＤＨＦＲ遺伝子と同方向に転写さ
れるｐｃＧＡ７０３ａ／ｕＰＡ　、　ｐｃＧＡ７０４ａ
／ＩＩ’ＰＡ’ＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７０５ａ／に２
ＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７０８ａ／１１’ＵＰＡ”　、
　ｐｃＧＡ７０６ａ／ＦＫ２ＵＰＡ”　ｓ　ｐｃＧＡ７
０７ｍ７′ＦＧＫ２ＵＰＡ”　＊　ｐｃＧＡ７０９ａ／
ＵＫ、ＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７１１ａ／’ｒＰＡ”Ｕ
ＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７１２ａ／に２ＵＰＡ”　、　ｐ
ｃＧＡ７１３＆／ＦＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７１４ａ／
ＦＫ２ＵＰＡ”及びｐｃＧＡ７１５ａ７乍ＧＫ２ＵＰＡ
”　、　　をそれぞれ造成するととができ、さらに更に
両方の遺伝子が非収束的に（１ｎｃｏｎｖ＊ｒｇ＠ｎｔ
ｌｙ　）転写されるｐｃＧＡ７０３ｂ／ｕＰＡ　、　ｐ
ｃＧＡ７０４ｂ／’ｒＰＡＡＵＰＡ”　。
ｐｃＧＡ７０８ｂ／）’ＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７０５
ｂ／に２ＵＰＡ”　、　ｐｃＧＡ７０６ｔｙ’ＦＫ２Ｕ
ＰＡ”　ｅ　ｐｃＧＡ７０７ｂ／／ＦＧＫ２ＵＰＡ”　
ｌ　ｐｃＧＡ７０９ｂ／ＵＴ（２ＵＰＡ”　＊　ｐｃＧ
Ａ７１１ｂ／／′ｒＰＡ’ＵＰＡ”　＊　ｐｃＧＡ７１
２ｂ／に２ＵＰＡ”　＊　ｐｃＧＡ７１３ｂ／′ＦＵＰ
Ａ”　ｓ　ＰＣＧＡ７１４ｂ／”Ｋ２ＵＰＡ”及びｐｃ
ＧＡ７１５ｂ／？ＧＫ２ＵＰＡ”　ｔを造成することが
できる。
夾施例２０：形質転換哺乳動物細胞によるハイッリッド
プラスミノーグンアクチベー タの製造 Ａ）組織培養細胞の維持及びＤＮＡ）ランス７エクシ冒
ン：一般的操作 ＤＮＡ造成体は酵素、ジヒド四葉酸還元酵素を欠乏ｔ−
るチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の変異体
であるＤＵＫＸＢｉ中で発現される〔Ｃ６Ｕｒｌａｕｂ
　＠ｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　、Ａｃａｄ　、
　Ｓｅｉ　、ＵＳＡ７７．４２１６−４２２０（１９８
０））。
ＤＵＫＸＢ１ｋｒ！ｒ胞は５％ウシ胎児血清を補給した
ヌクレオシドを含有するアルファーＭＥＭ培地（ＧＩＢ
ＣＯ）内で培養された。
細胞は６−ウェルマルチプレート（３，４ｃｒｎ直径）
内においてｉｏ、ｏｏｏ個／ｃｆＩＭの密度でプレート
培養され、４μｙのＤＮＡで形質転換された。ＤＮＡを
０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する１　０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｍ／１（Ｃ２ｐＨ７，０中ＩＫ５０Ａ１１／ｍｌで溶解
し、氷上で５分間冷却し、０．２５容量のＩ　Ｍ　Ｃａ
Ｃｌ２を添加し、そして氷上で１０分間インキュベート
した。この混合物を次いで等容量の２　Ｘ　ＨＥ８　（
５０ｍＭ　Ｈ＠ｐｅｓ　。
２８０　ｍＭ　ＮａＣ２，０，７５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ
４，０，７５ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ２、ｐＨ７，１２）と
混合した後更に１０分間氷上でインキュベートした。最
後に、このＤＮＡ−Ｃａ−ホスフェート共沈澱を培養培
地に添加し、細胞をＤＮＡと共に１６〜１８時間インキ
ユベートシ、その後グリセロールショックを与えた。
即ち細胞をＴＢＳ　（８０９／Ｌ　ＮａＣ２，３，８１
１／１ＫＣ２−１１７Ｌ　Ｎａ　２Ｉ（ＰＯａ　・２Ｈ
２０％０．１１４　Ｎ／ｌＣ＆ＣＬ２−２Ｈ２０，０，
１１Ｖｔ　ＭｇＣｌ２−６Ｈ２０，２５ｍＭ　Ｔｒ１ｓ
／ＨＣｔｐＨ７，５）で濯ぎ、ＴＢＳ中２０チ（マ／マ
）グリセルールで１分間インキ、ベートシ、再びＴＢ８
で濯ぎ、そして組織培養培地中で２４時間培養した。細
胞を次いでトリズシン処理し、そして細胞を８Ｉ０Ｍ直
径のベトリ皿に移した。
次の日、初期培養培地を選択剤なしに１号勺ジ１ネテイ
シンを含有する培地で置換えた。培地は３日月或いは４
日目毎に置換した。コロニーは約１４日月に見ることが
できた。個々のコロニーからの細胞をそれらをピペット
の先端でかき落すと共に同時にそれらをトリグシン溶液
を充填したチップ中に吹込み、そして各々をジェネテイ
シンを含有する培地を供給された２４ウエルマルチプレ
ートのウェルに移しながら単離した。コンフルエントに
なった時点でこれらの培養液を６ウエルマルテグレート
のウェル及び引続いて８ｃＩｒ１直径のベトリ皿に分割
した。
ロースプレートアッセイ これらのゾラスミノーグンアクチペータに対する高感度
アッセイはグラスミノ−ダン（プラスミノーゲンＳｉｇ
ｍｍＡ−６８７７を１ｒｖ／コにて１００容量の５０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／　ＨＣＬ　（ｐＨｓ、　Ｏ）中に溶
解し、そしてそれに対して２回透析することによシ調製
された原液）或いはカゼイン（非−脂肪ミルクとして添
加）、或いはフィブリン（フィブリノ−ダン＋トロン？
ンとして添加）が添加されたアガロースグルヲ使用する
。グラスミノーダンアクテベータを含有する試料を４ｎ
厚のアガロース層中に開けられた穴に適用し、モしてダ
ルを引続いて３７℃でインキニ−トする。次いで、酵素
活性は、グラスミノーグンアクチベータが試料ウェルか
ら放射状に拡散し、ダル内のプラスミノ−ダンをプラス
ミンに転換し、それが次いでカゼイン或いはフィブリン
を消化してすｙｆルウエルの周りの不透明なダル内に透
明なハローを生成することによシ検知される。ハローの
半径（試料ウェルの縁から測定）が活性化されたプラス
ミノ−ダン盆の目安である。このアッセイは酢加された
プラスミノーダンアクチペータの２に直線的応答を示さ
ない、低い分のグラスミノーダンアクチペータのアッセ
イのためにはインキ、ベージ、ンは数日間延長すること
ができる。カゼインアッセイの操作及び検量は２チ（ｔ
ｒ／マ）　ａａｒｎａＮｏｎ非−脂肪ミルク粉末の代り
にＭｉｇｒｏｍ　Ｃｏｒｐ　−（スイス）からの１２．
５チ（マ／マ）殺菌（ＵＩ（Ｔ　）無脂肪ミルクを用い
た他はＴａｎｇ　＠ｔ　ａｌ、　　（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、
Ａｃａｄ。
Ｓａｌ・４３４，５３６−５４０（１９８４）：ＩＫ記
載されたものと同様であった。フィブリン（Ｇｒａｎａ
　１１　ｌ　−Ｐｌｐｅｒｎｏ　ａｎｄ　Ｒ＊ｉｃｈ　
、　Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４８　。
２２３−２３４（１９７８））が基質として用いられた
場合には、０．２ｇアガロースが１５−の０、９　％　
ＮａＣｔに溶解され、４２℃に冷却された。この時点に
おいて、８０たりのウシフィブリノ−ダン（５１ｇｍｍ
　Ｆ−８６３０）を含有する５−の０．９　％？ＪａＣ
Ｌ、０．１−のゾラスミノーグン溶液（上記）及び０．
１−のｉ　ｏ　ｏ　ｒａｙ７−ナドリウムアジドが４２
℃で添加された。最後に、０．２−のウシ）ｏンビｙ（
Ｓｌｇｍａ　Ｔ−６６３４，１６，６ＮＩＨ単位／ｄで
０、９　％　ＮａＣ２中に溶解）を添加し、混合物を迅
速にベトリ皿（８ｃ！ｌＩ直径）中に注ぎ１時間で室温
に冷却した。得られたダルは約４隠厚であシ、４℃で数
日間貯蔵することができるか或いは上記カゼイン含有ダ
ルと同様に直ちに用いることがでケた。
Ｃ，ハムスター細胞におけるハイブリ、ドＰＡタン・９
り質の生産 ＣＨＯＤＵＫＸＢ１細胞を上記の如＜（５Ｐ、流側２０
Ａ）、それぞれグラスミドｐＢＲＩＡ　Ｉ　ｐＢＲＩＢ
　。
ｐＢＲ２Ａ　、　ｐＢＲ２Ｂ　、　ｐＢＲ３Ａ　、　ｐ
ＢＲ３Ｂ　、　ｐＢＲ４Ａ　。
ｐＢＲ５、ｐＢＲ７、ｐＢＲ８、ｐｃｃｃｉ　、　ｐＣ
ＧＣ２、ｐＣＧＣ３。
ｐＣＧＣ４ａ　、　ｐＣＧＣ５、ｐＣＧＣ６、ｐＣＧＣ
７及びｐＣＧＣ８ノＤＮＡで形質転換した。コμニーは
１０日日月に現われ、；四ニーを１５日日月上記の如く
拾い上げ２週間後に細胞数は上記の如（ＰＡを測定する
のに十分増加した。未形質転換細胞及び挿入Ｓａｃ　（
断片をアンチセンス方向に含有するｐＢＲＩＢ　。
ｐＢＲ２Ｂ　、　ｐＢＲ３Ｂで形質転換された細胞系統
は検出可能な量のＰＡを産生じ々かった。
における酊素活性 グラスミド形質転換及び対照ＣＨＯ細胞からの条件化培
地はヌクレオシド類及び５チラシ胎児血清を有するアル
ファーＭＥＭ中において２００，０００−５００，００
０細胞／ｌｕｔを２４時間培養することによシ調製され
、そして０．０３−をカゼイン或いはフィブリンを含有
するアガロースプレート上テ下記に示す時間インキ−ベ
ートした。フィブリンプレート上では、おそらく内在ハ
ムスターｔ−ＰＡによる最小のパックグラウンド活性が
ＤＵＫＸＢ　１条件化培地中に検出された。ハイプリ、
トタンバク質の試料が３μｔのウサギ抗−４ＰＡ抗体（
精製Ｂｏｗ＠ｓメラノーマｔ−ＰＡＫ対して産生）或い
は抗−ウロキナーゼ抗体（Ｓ＠ｒｏｎｅウロキナーゼに
対して産生）と混合された場合にはカゼインプレート上
にはハローが現われない。
抗−ｔＰＡ抗体はｕ−ＰＡ酵素を阻害せず、又抗ウロキ
ナーゼ抗体もｔ−ｐｈを有意な程度に阻害しない。これ
らの結果を表１にまとめて示す。
ＪｔＴ”余白 表１：ｎりたグラスミノーグンアクチベータの活性 形質転換プラスミド　　　　　　　ハロー直径１８噸］
３師浦１１９０分　３００分 １　ｐＢ８１ａ（ｔ−ＰＡ）　　　　２ｉｍ　　５ｍｍ
　　１　ｔｒｔｔｔ　　２　ｍｍ２　ｐＢＲ２ａ（ＵＰ
Ａ”ＴＰＡ”）　Ｏｙｚ　　０７ｔ、ｖ（ＯＥＨ：ｚ　
　１．５ｇ３　ｐＢＲ３ａ（ｕ−ＰＡ）　　　　５　ｒ
ｓｎ　１０１ｍ　　Ｏ，５；４７．　２５ＨＨ４ｐＢＲ
４ａ（ＴＰＡＡＵＰＡ”）　６　ｖｔｌｌｉｒ、　　２
　皿３　ｔｒｙ５　ｐＢＰ、６／１（２ＵＰＡ”　　　
　３　＋ｕ＋　　８７ｎ７ＬＪＩ）：出されずＧ　　ｐ
ＢＲ７／ＦＫ　２ＵＰＡ”　　　　　　４ｚｇ　　　９
ｍｒｘ　　　１　　＋、＋ｍ　　　２　　ｖｔｘ７　ｐ
ＢＲ８／’ＦＧＫ２ＵＰＡ”　　３．５．ｑｍ　　７皿
０８１Ｒｍ　　２　ｖｔｘ８　ｐｃＧｃ１／１ＪＰＡ”
ＴＰＡ”　　Ｏ！２ｒｎ　　６ｖｎｎ　　Ｏ：２ｍご２
　Ｆ？。
９　ｐＣＧＣ２／ＴＪＫ２ＵＰＡ　　　５＊１１０ｍ３
１　ｖ！Ｌ２５ｍｍ１０　ｐＣＧＣ３／１ＪＫ２ＴＰＡ
”　　３５ＩＩＩｒｉ　　５關１．５ｍｍ　　２５ｍｍ
１１　ｐＣＧＣ４ａ／’Ｉ’ＰＡ’ＵＰＡＢ２−５１１
１！！　　５ｍｔｓ　　０．５ｍｍ　　１５ｍｍ１２　
　ｐＣＧＣ５／１１（２ＵＰＡ”　　　　　６Ｅｏｒ、
　　１２ｘｅ　　　６　　ａｍ＞１０ｍｍ１３　ｐＣＧ
Ｃ６／Ｆ’ＵＰＡ”　　　　２　ｘｘ　　８ｇｍ　　Ｏ
ｘｘ　　１　ｔｎｒｎ１４　ｐＣＧＣ７／ＦＫ２ＵＰＡ
”　　２Ｓ＝ｙｖ　　５＋＋ｚｔ　　１　ｍ＋、ｚ　　
２　ｖｍ１５　ｐＣＧＣ８／１’ＧＫ２ＵＰＡ”　　２
ｋｚｔ　　６皿１　ｒａｙ　　２　ｖｔｘ１６　ｍｔＰ
Ａ１μＦ／ｄ　　　　　３　ｔｒｙ、　　７＋＋＋ｍ　
　１．Ｆｖｙｍ　　３　ｒｔｍ１７　ＤＵＫＸＢ１対照
例　　　Ｏｒ７１Ｏｖｘ　　Ｏｖｔｘ　　０．５ａｍ実
力ζ例２１：ハイツリドーマ細胞の詞製及びモノクロー
ナル抗体の単離 ａ）免疫原：推定純度〉９０チを有する準−精製天然ヒ
トの試料（メラノーマｔ−ＰＡ）。
ｂ）免疫感作実験方法：１０〜１４週令のＢＡＬＢ／ｃ
マウス（Ｔｉｅｒｆａｒｍ　５ｉｓｓｅｌｎ、　　スイ
ス）三つの群を完全フロインドアシュパン）　（Ｄｉｒ
ｃｅ　）中に乳化した１００μダのメラノーマｔ−ＦＡ
を二つの後足及び皮下に注射することによシ免疫感作し
た。引続いて第１群（Ｎｒ、４０５）には毎週６週間に
亘シ１０μ９の不完全アジ、パント中のｔ−ＰＡを投与
したのに対し、第２群（４０６）Ｋは同一量を２週間ご
とに投与した。第３群（４０７）には３週間間隔で２回
５０μＩのｔ−ＰＡを与えた。全ての動物を４週間目及
び８週間目に採血した。最後の注射ではＰＢＳ中１００
μ９が腹腔内に与えられ、そして４日後に＃臓細胞を標
準的操作によｉ）　Ｓ　Ｐ　２　／　ｏミエローマ系統
と融合せしめた。
高抗−ｔ−ＰＡ抗体力価を有するマウスのみを融合に用
いた。
Ｃ）細胞融合：全ての融合実験はＧ、Ｋｏｈｌｅｒ及び
Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ　２５６　、４
９５　（１９７５））Ｋ従って非分泌Ｓｐ　２１０−　
Ａｇ　１４ミエローマ系統（Ｍ、Ｓｈｕｌｍａｎ　、　
Ｃ，Ｄ、Ｗｉｌｄｅ及びＧ、Ｋｏｈｌｅｒ　。
Ｎａｔｕｒｅ２７６．２６９（１９７８））を用いて行
った。１０　個の膵臓細胞を１０　個のミエローマ細胞
と１−の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５０
０　、　Ｓ＊ｒｖａ　）の存在下において混合した。
洗浄後、紺胞を４８−の桓１準ダルペ、コ最小必碩培地
（Ｇｉｂｅｏ　４０４２２５０１）中に再浮遊させた。
融合当シ３　Ｘ　１０’個の正常マウス腹腔浸出液細胞
をフィーダー細胞として添加した。これらの細胞は４８
Ｘ１ｍコスターウェル中に分配され、４５週３回標準Ｈ
ＡＴ選択培地が３〜６週間に亘って供給された。ハイプ
リドーマ細胞の生育が目に見えるようになりた時点で、
上澄液を直接抗原結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び中和
（カゼイン）アッセイ（下記参照）の側方によシスクリ
ーニングした。
四つの融合実験の結果は次の通シである。接種した１９
２個のウェルのうち、１９２個のハイツリドーマが得ら
れた。それらのうち、２４個は抗−ｔ−ＰＡ抗体を産生
じた。２４個の陽性ハイプリドーマのうち１４個がクロ
ーニングされ、イ丑られた５７４個のクローンから３１
が抗−ｔ　−ＰＡｍＡｂを安定に産生することが判明し
た。これらの内、３個（クローン４０５Ｂ、３３．３，
４０６Ａ。
２３．７、及び４０７Ａ、１５．２７）をマウスに注射
し、腹水を更に研究するために生産した。
８〜１０週令のＢＡＬＢ　／　ｅ　クラス（Ｔｉｅｒｆ
ａｒｍＳｉｓｓｅｌｎ　、スイス）を０．３ｄ７°リス
タン（Ａｌｄ−ｒｉｃｈ）　　によシ腹腔内前処理した
。２〜３週間週間−２〜５１０’個のクローニングされ
たノ１イブリドーマ細胞４０５Ｂ、３３．３．４０６Ａ
、２３．７及び４０７Ａ、１５．２７、並びに０．２−
のプリスタンを腹腔内に接種した。８〜１０日後腹水を
集め、８００ｘｇで遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。
解凍された腹水を５００００ｘ、Ｐで６０分間遠心分寵
された。表面に浮かぶ脂肪層を注意深く取除きタンノや
り質濃度を１０〜１２ｍ９／−の湿度に駅整した。
粗製イムノグロブリンを０．９容景弊量の飽和硫酸アン
モニウムを０℃で滴加することによシ沈澱させ、次いで
２０　ｍＭ　Ｔｒ　１　ｓ　−ＨＣｔ／　５０　ｍＭＮ
ａｃＡ（…７．９）中に溶解し、同一緩衝液に対して透
析した。イムノグロブリン画分は２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣＬ／　２５−４００　ｍＭＮａｃＡ　（ｐＩ７
．９　）の紐衝液勾配系を用いてＤＥＡＥ−０５２セル
ロース（ｗｈａｔｍａｎ　）クロマトグラフィによう得
られた。
このイムノグロブリンを再び硫酸アンモニウムで沈澱さ
せ、ＰＢＳ中に１０η／−の濃度で溶解した。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドグル電気泳
動（８ＤＳ−ＰＡＧＥ）は９５％を越えるモノクローナ
ル抗体の純度を示す。
の決定 クローン化されたハイツリドーマ細胞によシ産生される
モノクローナル抗体のクラス及びサブクラスはクラス及
びサブクラス特異的ウサギ抗体（Ｂ１ｏｎ＠ｔｉｅｓ　
）を用いて０ｕｅｈｔ＠ｒｌｏｎｙの公知の免疫拡散技
術（卵天−ダル免疫拡散法）によル決定した。
ｍＡｂｓのサブクラスは下記の通シである：４０５Ｂ、
３３．３　　：　　ｒ、に ４０６Ａ、２３．７　　：　　ｒ２ｂＫ４０７Ａ、１５
．２７：　　ｒ２ｂに タイタープレートを、ウェル当シ０．５μｇの１００μ
ｔ　ＰＢＳ中ｔ−ＰＡ調製物（純度〉９５チ）で被覆し
た。このプレートの遊離結合能力を０．２ｑ６ＮＩＬＮ
３　（＝／ｖ　）　（ｐＩ！７．４　）を含有するＰＢ
Ｓ中０．２係ゼラチンの緩衝液で飽和した。それぞれモ
ノクローナル抗体４０５　Ｂ　、　３３．３　、４０６
　Ａ　、　２３．７及び４０７Ａ、１５．２７を含有す
る１００μｔのグローブをウェル内で３７℃で２時間イ
ンキ、ベートシた。プレートを０．０５襲Ｔｗ・＠ｎ　
２０を含有するＰＢＳで洗浄し、次いでホスファターゼ
Ｍ合つサギ抗−マウスイムノグロブリンＲ１製物と共に
３７℃で２時間インキュベートした。固定された酵素を
、酵素基質ｐ−二トロフェエルホスフェー）　（０，５
ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、
ｐＨ９，８を含有するジェタノールアミン緩衝液１゜チ
中１１ｎ１７／コ〕と共にインキ、ベート（３７℃、３
０〜６０分）することによ誘発色せしめ、モして４０５
　ｎｍにおける光学密度を測定した。
同じＥＬＩＳＡをウロキナーゼを用いて行ったＯｍＡｂ
のいづれもウロキナーゼに結合しなかった。
全てのｍＡｂはｔ−ＰＡ特異性であった。
ｍＡｂ類の阻害作用を求めるために、ｔ−ＰＡを先ずそ
れぞれｍＡｂ４０５Ｂ、３３．３，４０６Ｂ。
２３．７及び４０７Ａ、１５．２７と混合し、４℃で３
０〜６０分間インキ、ベートした後１通常のカゼイン／
プラスミノーゲン東天アッセイを行った（実施例２０Ｂ
参照）ｏ　ｍＡｂのいづれも、ｍＡｂ４０５Ｂ、３３．
３がカゼイン溶解において遅れ（６時間を越える）を引
起こす他は、ｔ−ＰＡ活性を阻害しなかった。
チベータの精製、一般的操作 形質転換された酵母細胞からの抽出液を実施例１６と同
様にして調製した。プラスミドによシ形質転換された哺
乳動物細胞例えばＣＨＯ細胞からの抽出液は下記の様に
して調製された。
ｆｌ＋胞を先ｆ７０〜８０ｑ６のコンフルエンスまで培
養した０次いで細胞単層を血清を省略する以外は上記と
同様に培地で濯ぎ、次いで細胞を更に５〜７日間培養し
た。培地を２４時間毎に採集し、同時に新しい培地を細
胞に供給した。この様にして得られた条件化培地を次い
で５ｏｏｏｘ、ｖで３０分間遠心分離し、０．４５μｍ
フィルターを通して濾過して望ましくない細胞破片を除
去してアフィニテイクロマトグラフィを行った。アフイ
ニテイマトリックスとしてはエリスリナ・ラテシマアー
ゼ阻害剤ＤＥ−３、或いはｕ−ＰＡ又はｔ−ＰＡに対す
る固定化抗体のいづれかが用いられた。
ｔ−ＰＡの触媒作用Ｂ−鎖を含有するハイブリッドＰＡ
を、上記の如く調製された条件化培地から或いはメラノ
ーマ細胞−条件化培地から、酵母細胞抽出液からのｔ−
ＰＡの精製のために元々開発された実験方法（Ｃ，Ｈ＠
ｕｓ＋ｓ＊ｎ　ａｔ　ａｌ　、　、Ｊ。
Ｂｌｏｌ、Ｃｈ＠ｒｎ、２５９，１１６３５−１１６３
８（１９８４）参照〕を用いて精製する。
全てのハイシリ、ドＰＡ類は、親ｕ−ＰＡ及びｔ−ｐム
酵素に対してウサギ或いはヤギ中で産生されたポリクロ
ーナル抗体を用いて、或いは親酵素に対して産生された
モノクローナル抗体（マウス起源）（これらが問題のハ
イツリ、ドＰＡ内に存在するエピトープを認識する場合
）を用いて精製された（実施例２１参照）１選択された
抗体はＡｆ　ｆ　ｉ　ｇ＠１或いは５ｓｐｈａｒｏｓｅ
　−４Ｂなどの不溶性マトリックス上に固定化された。
上記の如く調製された条件化培地或いは酵素細胞抽出液
を次いでアフィニティーマトリックスのカラムにかけ、
望ましくないタンノ母り質を連絡な緩衝液例えばダルベ
ツコのＰ　Ｂ　Ｓ　（０，Ｉ　Ｊ’　／　ｔ　ＣａＣｔ
２１　ｏ、　２１　／　ｌ　ＫＣｌ　。
０．２１　／　Ｚ　ＫＨ２ＰＯ４＊　Ｏ−０４７Ｊｉ’
　／　Ｌ　Ｍｔｒｃｔ２　＊８、ＯＩ　／　ｔ　ＮａＣ
２５１，１５ｇ／　ｌ−Ｎｌ１２）ＩＰＯ４：　Ｊ　−
Ｅｘｐ、Ｍａｄ、９９，１６７（１９５４）］　　を用
いて洗流し１次いでＰＡをカオトロピック（ｅｈａｏｔ
ｒｏ−ｐｉｃ　）剤チオシアン酸カリウム（Ｍ、Ｅｔｎ
ａｒｓｓｏｎａｔ　ａｌ、　、Ｅｉｏｅｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ　、Ａｃｔａ８３０　。
１−１０（１９８５）］或いは低−緩衝液例えば０．１
−０．２Ｍグリシン−ＨＣＬ（ｐＨ２，１）を用いてカ
ラムから溶出した。
モノクローナル抗体を用いる精製の後、ノ１イブリッド
ＰＡ類は９０％を越える純度を有する。
＊、　　Ｄ　Ｅ　−３５ｅｐｈａｒｏｓ＠■カラムの調
製シアノーグンプロマイド活性化Ｓ・ｐｈａｒｏ−・４
Ｂ■（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に、−当シ５■のエリス
リナ・ラテイシ−ｒ　（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　ｌａｔｉ
ｍｓｉｍｍ　）からの精製された阻害剤（Ｆ、Ｊ＊Ｊｏ
ｕｂ＠ｒｔ　＠ｔ　ａｌ　、　。
ＨＯＰＰ＠　−Ｓ＠ｙｌｅｒ’　ｓ　Ｚａｉｔｓｃｈｒ
　＠Ｐｈｙｓｉｏｌ　、Ｃｈ＠ｍ。
３０２．５３１　（１９８１））を製造元の指示事項に
従ってカップリングさせた。マトリックスを０、２　ｒ
ｗｌ　ＮａＣｔ、　０．１　ｑ６Ｓｙｎｐ＠ｒｏｎｉ　
ａ■及び０．０２　’％ナトリウムアンドを含有する０
、２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液声７．０で平衡化させた
。
ｂ、＋　　Ｄ　Ｅ　−３Ｓ＠ｐｈａｒｏｓ＠４Ｂ■上で
のＵＫ２ＴＰＡ”　（ＢＣ）のクロマトグラフ精製に対
して０．１％とし、次いでＤ　Ｉ　−３Ｓ＠ｐｈａｒｏ
ａｅ■にかけた。４℃で１時間ゆっくり攪拌後、ＤＥ−
３８ｅｐｈａｒｏｇ＠４　Ｂ■をカラムに注ぎ２８０　
ｎｍにおけるＵＶ吸光度が溶出液中のタンパク質の不存
在を示すベースラインレベルに到達するまで０．２ｍＭ
　ＮａＣＬ　、　０．１％５ｙｎｐｅｒｏｎｌｏで洗浄
した。洗浄を次いで０．２　Ｍチオシアン酸アンモニウ
ム及び０．１％５ｙｎｐ＠ｒｏｎ１ｅを含有する０、２
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて継続
した。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度が溶出液中のタン
ノ臂り質の不存在を示した後、カラムを１．６Ｍチオシ
アン酸アンモニウム及び０．１　％　５ｙｎｐ＠ｒｏｎ
ｉｅ■を含有する０、　２　Ｍ酢酸アンモニウムＩｔ！
衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。Ｃｂ＊　−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣｔ−基質として用いる（　Ｍ、Ｚ
ｉｍｍ＊ｒｍａｎ　ａｔ　ａｌ　ｍ　、Ｐｒｏｅ　。
Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓａｌ、ＵＳＡ、７５，７５０（
１９７８））螢光定量アッセイを用いて測定した最高の
アミド分解活性を有する画分をプールした。ＤＩ−３Ｓ
ｓｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ■物質〈適用された活性の少なく
とも８０チが―−ピーク内に回収された。
プールされた活性画分を、０．１　％　５ｙｎｐ＠ｒｏ
ｎｌｅ■を含有する０、　２　Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液に対して透析し、内在ｔ−ＰＡを除去するために、１
−ＰＡの第１クリングル領域に向けられたモノクローナ
ル抗体であって、５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ■にカップリ
ングされ、モしてｏ、ｉ％５ｙｎｐｅｒｏｎｉｅ■を含
有する０、２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中（ｐＨ７，０
）で平衡化されたモノクローナル抗体４０７Ａ、１５．
２７を含有するカラムにかけた。　ＵＫ２ＴＰＡ”　（
ＢＣ）を含有する抽出液を集めた。
寸法４Ｘ１１０７１１１１を有するＮｕｅｌｅｏａ１１
■３００−５−Ｃ１８カラム上での諸ｆｆ　ＵＫ２ＴＰ
Ａ”　（］’ＩＣ）の逆相ＨＰＬＣは、０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含有する水よシなる溶液Ａ７０％及びＯ，
ＯＳ　＊のトリフルオロ酢戯を含有するアセトニトリル
よシなる溶液Ｂ３（ｌから出発し、そして４０％Ａ及び
６０ａ６Ｂで終る３０分間に亘る腺形勾配による溶出で
単−一一りを示す、この精製タンノ９り質はつ初の１０
個のアミノ酸残基のＮ−末端配列分析をした際に配列５
ＮＥＬＨＱＶＰＳＮを示し、これはこの分子をコードす
るＤＮＡ配列から期待された配列と同一であった。
実施例２４　：　ＦＫ２ＵＰＡ”（ＢＣ）及びに２ＵＰ
Ａ”　（ＢＣ）の精製 ａ、抗体アフィニテイカラムの調製 ウサギ抗−ｕＰＡ血清から精製したウサイ抗−ｕＰＡ抗
体、並びにモノクローナル抗体４０５Ｂ。
３３．３及び４０６人、２３．７を、活性化されたＳ＠
ｐｈａｒｏｓ＠ｍｌ尚Ｊ）　６１ｖの抗体を用いて、製
造者の指示事項に従ってシアノ−ダンブロマイド活性化
８＠ｐｈａｒｏｓ＠４　Ｂ■（Ｐｈａｒｍａｅｌｍ　）
に力、プリングした。ダルマトリックスは０．１％５ｙ
ｎｐｅｒｏｎｌｅ■及びＯ，ｊ、　ｑ６のナトリウムア
シドを含有するＰＢＳで平衡化した。
ｂ、抗体Ｓ＠ｐｈａｒｏｓ＠４　Ｂ上のＦＫ２ＵＰＡ”
（ＢＣ）及び条件化培地（実施例２２参照）を５ｙｎｐ
＠ｒｏｎｉｃＯ！りに関して０．１チとし、抗−ｕＰＡ
　Ｓｅｐｈａｒｏｍｓ　−４８或いは４０５Ｂ、３３．
３或いは４０６Ａ、２３．７Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　
Ｂにかけた。後者の二つの抗体はｔ−ＰＡの第２クリン
グルドメインに向けられたものであった。４℃において
２時間ゆりくｂ攪拌後、抗体Ｓ＠ｐｈａｒｏｓ＠をカラ
ム内に注ぎ、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度が溶出液に
おけるタンパク質の不存在を示すまでＩＭＮａＣｔ及び
０．１チ５ｙｎｐｅｒｏｎｉｅ■を含有するＰＢＳで洗
浄した。カラムを次いで０．２Ｍグリシン−ＨＣＬ緩衝
Ｙ１．（、ａｔ　２．５　）で溶出した０画分を中和量
のＩＭＴｒｉｍを含有する管内に集めた。Ｃｂｚ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを基質として用いる螢光定
量アッセイ（Ｍ、Ｚｉｍｍ＊ｒｍａｎｎａｔ　ａｌ　、
　、Ｐｒｏｅ　、Ｎａｔｌ　−Ａｅａｄ　、Ｓａｉ　＊
Ｕ（ｉＡ、　７５　。
７５０（１９７８））で測定した高度アミド分解活性を
含有する両分をプールした。
寸法４Ｘ１１０ｍを有するＮｕｅｌ＠ｏａｔｌ■３００
−５−Ｃ１８カラム上での精製ＦＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ
）及びに２ＵＰＡ　（ＢＣ）の逆相Ｈ，ＰＬＣは、０．
１チドリフルオロ酢酸を含有する水よシなる溶液Ａ７０
％及び０．０８％のトリフルオロ酢酸を含有するアセト
ニトリルよシなる溶液Ｂ３０％から出発し、そして４０
％人及び６０％Ｂで終る３０分間にわたる直線勾配によ
る溶出で単一ピークを示す、精製タンパク質の最初の５
個の残基のＮ−末端配列分析の結果、Ｋ２ＵＰＡ”　（
ＢＣ）について配列５ＹＱＧＮ、及びＦＫ２ＵＰＡ”　
（ＢＣ）について配列５ＹＱＶＩ−ｉ＝＋ｑられ。
これらは各分子のＤＮＡ配列から期待される配列に同一
であった。
ラスミノ−ｒンアクチベータの活性 測定 プラスミノーゲンアクチベータによるプラスミノ−ダン
のシラスミノへの転換、及びこれに続くプラスミンと発
色プラスミン基５１Ｈ−Ｄ−パリルーＬ−ロイシル−Ｌ
−ロイシン−ｐ−ニトロアニリンニ塩酸塩との反応に基
づき、　Ｖａｒｈ＠ｙｅｎ　ａｔａｌ、　（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、Ｈａ＊ｍｏｓｔ、　４８　、２６６　（１９８２）
）Ｋより記載されている二′Ｍ速度ア、セイを用いた。
このアッセイは９６個のウェルを有するマイクロタイタ
ープレート中にお込てＴｉｔ＠ｒｔ＠に■マイクロタイ
、タープレート読取器を用いて行った。とれらのウェル
は、０．１％Ｔｖ＠＠ｎ８０を含有する０、１モル／　
ｔＴｒ　ｉ　ｓ　／　ＨＣＬ　Ｈ街液（ｐ）１７．５　
＞　１２０−Ｘμｔ、上記Ｔｒｉｍ緩衝液中１．３μモ
ル／ＬのＧｌｕ−シラスミノ−ダン２０　Ａｔ　、　Ｔ
ｒｉｍ緩衝液中０．７ｍモル／ｌのシラスミノ基質１０
０　Ａｔ　、公知濃度の試料（Ｘはそれぞれ１０，２０
．４０及び６０μＬに対応する）Ｘμを或いは国際単位
で表わされた規定された活性のウロキナーゼ標準Ｘ、ｌ
、及び蒸留水中３η／−の刺戟剤（フィブリノ−ダン断
片）　１０　Ａｔ或いは実験が刺戟剤なしに行われる場
合ｊてはＩＱＡｔの蒸留水、を含有する。インキ、ペー
ジ、ン時間の平方で除された光吸収の増加は、既知アク
チベータ濃度におけるプラスミノ−ｒンアクチベータ活
性に比例し１国際単位で表わされる０国Ｗ単位で表わさ
れる定仁された活性を有する高分子量つｐキナーゼ（Ａ
ｍ＠ｒｉｃａｎＤｌａｇｎｏａｔｉｃｍ　）が標準とし
て用いられた。各プラスミノーゲンアクチベータはそれ
ぞれフィブリノ−ダン断片の不存在下或いは存在下にお
いて同一条件下で分析された。これらの条件下において
得られた活性の差異はフィツリノーダン断片によるプラ
スミノ−ｒンアクチペータの刺戟の目安となる０表２は
分析結果を示し、それはウロキナーゼの触媒作用ドメイ
ンを含有する新規グラスミノーダンアクチペータ分子に
対してフィツリノーダン断片によシ及ぼされる刺戟とは
対照的に、ウロキナーゼ標準に対する刺戟の不存在を示
す０組織プラスミノーダンアクチペータの１個以上の非
触媒作用ドメインＰ　、　Ｇ　、　Ｋｌ、或いはに２の
不存在の如何に拘らず全ての試験されたハイプリ、ド分
子に対してフイノリノーダン断片による刺戟が観察され
た。
以下奈白 表　　２ プラスミノ〒ダンアクチベータ　　１．Ｕ、刺戟／１．
Ｕ、非刺戟ｕ−ＰＡ標準　　　　　　　　　　　　　１
．０ＦＧＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）　　　　　　　　　５
．０Ｆ’に２ＵＰＡ”　（ＢＣ）　　　　　　　　　１
０．０に２ＵＰＡ″　　　　　　　　　　　６，０ＦＵ
ＰＡ”　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．６・
りの血餅溶解活性 血餅溶解活性はＲ，Ｄ、Ｐｈ１ｌｏ及びＰ、Ｊ。
Ｇｉｆｆｎ＠ｙ（Ｔｈｒｏｍｂ、）（ａａｍｏｓｔ、４
５　、１０７−１０９（１９８１））によシ記載された
アッセイを用いて求めた。溶解時間対グ２スミノーダン
アクチペータ濃度の対数プロットの結果、直かが得られ
た。
デラスミノーダンアクチベータの比活性は組織プラスミ
ノーダンアクチペータ或いはウロキナーゼの標準調製物
から得られた曲線と対比することによシ得られた。
測定された全てのアクテペータの曲線は血餅溶解に必要
とされた時間とそれらの比活性の直接の関係を許容する
ほぼ同一の傾斜を有した。異りたグラスミノーダンアク
チベータは同一分子量を有しないので、異りた分子の効
率に対して意味のある標準を得るためには、通常の重ｆ
ｉ濃度の代シに比活性なモル濃度で表わさなければなら
ない。
ＵＫ２ＴＰＡ”　（ＢＣ）は少なくとも標準ｔ−ＰＡと
同程度に活性であることが判明したのに対し、ＦＧＫ２
ＵＰＡ”　（ＢＣ）及びＦＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）け殆
んどｔ−ＰＡに等しいが、しかし、ｕ−ＰＡ積標準シは
相当に高い活性を示した。　Ｋ２ＵＰＡ”（ＢＣ）はｕ
−ＰＡ標単と殆んど同一の活性を有することが判明した
。
分析活性を表３にまとめて示す。
以下余白 表３ ｔ−ＰＡ積標準　　　　　　　　２３．６［２ＴＰＡ（
ＢＣ）　　　　　　　　　　２８．６ｕ−ＰＡｆｉ準　
　　　　　　　　１３．２ＦＧＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）
　　　　　　　　２４．３ＦＫ２ＵＰ人”（ＢＣ）　　
　　　　　　　　　　　２０．７に２ＵＰＡ”（ＢＣ）
　　　　　　　　　１０．４貫ＴＰＡ”（ＢＣ）　　　
　　２．７ ４ｋｍ餅溶解単位はそのアミノ酸配列に基づくｔ−ＰＡ
の分子量及び４００，０００血餅溶解単位／ダの比活性
を用いてピコモルｔ−ＰＡで表わされる。
アランス １、標識化 全ての変異体分子をヨードグン法（Ｐ、Ｊ。
Ｆｒａｋ＠ｒ　　ａｔ　　ａｌ　＠、Ｂ１ｏｇｈｓｍ、
Ｂｌｏｐｈｙ＊＊Ｒｅｇ。
Ｃｏｍｍａｎ、８０，８４９−８５７（１９７８））　
　を用いて１２５Ｉで放射紡標職化した。
過剰の遊離　　Ｉを除去するために、変異体分子を実施
例３（ｔ−ＰＡ　　Ｂ−鎖を有するＰＡ）に記載される
方法或いは実赫例２４（ｔｌ−ＰＡＢ−鎖を有するＰＡ
）に記載される方法のいづれかを用いてアフィニテイ精
製した。
２−２０μＣ１／μ９　タン／臂り質の比放射性活性が
通常得られた。標識化された分子の均質性はＢＤＢ電気
泳動に引続き、Ｘ−線オートラジオグラフィを行って推
定した。全ての問合において、変異体分子は非還元化条
件下において単一バンドとして移動し、モしてＭｒは非
標識化タンパク質と同一でありた。
２、クリアランス研究 実験は１．８〜２．４　ｋｌＦの体重のニューシーラン
ト白色ウサギにおいて行りた。これらの動物はｘ７ｓＯ
ｑ／ｍのＵｒ＠ｔｈａｎ■（Ｍｓｒｅｋ　、　Ｄａｌｔ
ａｄｔ　。
百ドイツ）を用いて皮下投与麻酔した。気管切開を行い
、グラスチックチ、−ｆを外部頚静脈及び共通頚動脈に
挿入した。変異体ＰＡ約３００〜５００　ｎＪＦ　を含
有する０６５−リン酸緩衝塩溶液を！Ｆｉ￥静脈中に注
射し、そして逐次血液試料（各２−）を頚動脈を介して
６０分間に亘って逐次獲得した。
血液試料をクエン酸塩上に集め、直ちに３０００ｒｐｍ
で１５分間遠心分離し、血漿な傾瀉分離した。
アリコートを１０％トリクロロ酢酸中で沈澱させベレッ
トをｒ−カウンター中でカウントした。
Ｂｏｖｅｓメラノーマ細胞系統から単離したｔ−ＰＡに
対比して、変異体分子は循環系における次の様な半減期
を示す。
表４ ハイブリッドＰＡ　　　　循ｍ′ｆ、！ｒスミノーダン
アクチベータの半減期　（分） ｔ−ｐ人　　　　　　　　　　　　　　２ＵＫ２ＴＰＡ
”　（ＢＣ）　　　　　　　２０ＦＧＫ２ＵＰＡ　（Ｂ
Ｃ）　　　　　　　　　１０ＦＫ２ＵＰＡ”　（ＢＣ）
　　　　　　　１０Ｋ　２ＵＰＡ”（ＢＣ）　　　　　
　３Ｏ−４０ｔ−ＰＡのクリアランスノターンは典を的
に極めて迅速なα−期に引続きよシ遅いβ−期クリアラ
ンスを伴い、典型的に二次指数的である。
ＵＫ２ＴＰＡ”　（ＢＣ）及びに２ＵＰＡ”　（ＢＣ）
のクリアランスは殆んど単相的であシ、第二コンパート
メントへの分布が抑制されていることを示唆する。
３、器官分布 ウサギは上記の如く処理した。ヨード化変異体分子の注
射の２０分後にウサギを殺し、主たる器官を取出し重量
を測定し、均質化後のアリコートをｒ−カウンター中で
カウントした。
表５ 肝臓　　　４０　　　　１０　　　　　　７心臓　　＜
ｉ　　　　　＜　１＜　ｉ 肺　　　　＜１　　　　　　＜１　　　　　　　＜１肺
臓　　＜１　　　　　＜１　　　　　　＜１腎臓　　　
１．６　　　　　２　　　　　　　４変異体ＰＡは、放
射性活性分子の大部分がなお循環系（上記）に残存する
ことを示し、はるかに減少した肝臓−クリアランスと一
致する。肝ｆｆ１Ｋよる減少した摂取は従って、変異体
分子特にＵＫ２ＴＰＡ”　（ＢＣ）及びに２ＵＰＡ”（
ＢＣ）の延長された半減期及び単相クリアランスノ臂タ
ーンに対する説明となる。
実施例２８〜３４においては、プラスミドｐｃＧｃ５　
／に２ＵＰＡ”　、　ｐＣＧＣ６／　ＦＵＰＡ”　、　
ｐＣＧＣ７／ＦＫ２ＵＰＡ”及びｐＣＧＣ８／ＦＧＫ２
ＵＰＡ”　　（実話例１８参照）を用いて酵母発現シラ
スミドを造成した。
酵母インベルターゼシグナル配列を異るコード化配列に
インフレーム融合した。それらは誘導性ＰＨ０５プロモ
ーターの制御下に発見された。ある造成体においては、
グリコシル化部位を変異させた。
ｐ　ＥＭＢ　Ｌ系のプラスミド（Ｄｅｎｔｓ　＠ｔ　ａ
ｌ　、　。
はＤＮＡ複製及び形態形成に対する全てのシス−作用要
素を与えるファージＦＩＪ−”ツムの領域を含有スル。
ファージＦ１（ヘルル→ニよるスーパー４７７８２７．
７時にのみ多量の一重鎖プラスミドＤＮＡが培地中に排
出される。
プラスミドＰＥＭＢＬ　１９　（＋）をＳｃａ　ｌ及び
ＥｃｏＲＩで消化した。ＰＢＲ３２２（Ｓｅａ　Ｉ部位
）のアンピシリン耐性遺伝子の部分、Ｆ１遺伝子間領域
及びポリリンカー領域（ＥｅｏＲＩ部位）までのβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子の部分を含有する２、２ｋｂ断片
を単離した。
グラスミドｐＪＤＢ　２０７をＨｐａＩで切断すること
によシ線状化した。１０μＩの線状化されたプラスミド
を０．１１１４７艷のエチジウムブロマイドの存在下に
おいて３７℃において２４０分間７．５単位のＥｃｏＲ
Ｉで部分的に消化した。反応は１０ｍＭＥＤＴ人を添加
するととによシ停止した。１．８ｋｂのＥｅｏＲＩ　−
Ｈｐａ　Ｉ断片をＨ’ｌＪ　Ｏ，Ｂ　％アガロースゲル
上で単離した。
消化した。４．８　ｋｂの大Ｈｐａ　ｌ　−Ｓｃａ　ｌ
断片を単離した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル″；Ｐｅ
Ｉツクから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィ及び
エタノール沈澱によシＭｍした。
各々０．２ｐモルの２．２　ｋｂｓｃａ　ｌ−１１ｃｏ
ＲＩ断片及び１．８　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｐａ　ｌ
断片、並びに０．１μモルのＨｐａ　ｌ　−Ｓｃａ　ｌ
ベクター断片を連結した。この連結混合物を用いてコン
ピテントＥ、ｃｏｌｌＨＢ１０１Ｃａ　　細胞を形質転
換した。
１２個のアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡ
をＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ二重消化によシ分析した。正し
い制限断片を有する単一クローンのＤＮＡを選択し、　
ｐＪＤＢ２０７Ｆ１１ａｅと称する。
実施例２９ニブラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−
Ｉ　−プラスミドｐＣＧＣ７／ＦＫ２ＵＰＡ”に存在す
るＦＫ２ＵＰＡ”　　のコード配列を、酵母インベルタ
ーゼシグナル配列を融合し、そしてこの遺伝子をＰＨ０
５グロモーターの制御下に発現することによシ酵母内で
発現するよう適応させた。
プラスミドｐＣＧＣ７／　ＦＫ２ＵＰＡ”　　（実施例
１８Ｄ参照）をＰｓｔｌ及びＢａｍＨＩで消化した。こ
の１１４７　ｂｐＰｓｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片はｔ−Ｐ
Ａのヌクレオチド位置１９９におけるＰｓｔ　１部位（
８１図）からｕ−ＰＡの位置１３２２におけるＢａｍＨ
Ｉ部位（第３図）までのＦＫ２ＵＰＡ”コード配列を含
有する。
プラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡ　
（実施例６Ｃ参照）をＳａｌ　ｌ及びＰｓｔｌで切断し
た。
８９１　ｂｐ断片を単離した。それはＰＨ０５プロモー
ター、インベルターゼシグナル配列及びｔ−ＰＡの１９
塩基（Ｐａｔ　１部位）を含有する。
プラスミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＵＰＡ
　（実施例８参照）をＳａｌ　ｌ及びＢａｍＨＩで消化
した。
６．６ｋｂベクタ一断片はヌクレオチド位ｆＲ１３２３
（第３図）Ｋ＞けるＢａｍＨＩ部位から位置１４４１（
付加したＸｈｏＩリンカ−のＰｖｕ　ｆ１部位）及びＰ
Ｈ０５転写停止シグナルまでのｕ−ＰＡ遺伝子の３′部
分を含有する。
各々０．２ｐモルの８９１　ｂｐｓａｌ　Ｉ−Ｐｓｔ　
ｌ断片及び１１４７　ｂｐ　Ｐｉｔ　ｌ−ＢａｍＨＩ断
片及び０．１μモルの６．６　ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨｌベクター断片を連結し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｌｌ
Ｂ１０１Ｃａ２＋細胞の形質転換に用いた。
８アンピシリン耐性＝ロニーをアンピシリン（１００ｎ
ｇ／ｌ　）を含有するＬＢ培地中において生育せしめた
。プラスミドＤＮＡを単離し、　Ｅｃ。
ＲＩ及びＨｌｎｄｌ［ｒ制限消化によ）分析した０期待
された制限断片を有する一つのプラスミドを選びｐＪＤ
Ｂ　２０７／Ｐ）ＩＯ５−Ｉ　−ＦＫ２ＵＰＡ”と称す
る。
シラスミドｐｃｃｃ　６／ＦＵＰＡ”及びｐｃｃｃ８／
ＦＧＫ２ＵＰＡ”をｐＣＧＣ７／ＦＫ２ＵＰＡ”と同様
にして使用することができる。得られた酵母発現シラス
ミドをそれぞれｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−Ｐ
ＵＰＡ”及びｐＪＤＢ　２０７／Ｐ　Ｈｏ　５−　Ｉ　
−ＦＧＫ２ＵＰＡ　　と称する。
実施例３０：ウロキナーゼ遺伝子の（Ａｓｎ　３０２）
におけるグリコシル部位の突然変異 ａ）ｕ−ＦＡのＰｓｔ　ｌ−ＢａｍＨＩ！Ｅｆｒ片のＭ
ｌ　３ｍｐ　１８中へのクローニングニ ア°２スミドｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−ＵＰ
Ａ　（実施例８Ｄ照）はウロキナーゼの完全コード領域
を含有する。このＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢａｍＨＩで切
断した。ウロキナーゼ遺伝子からの８８６ｂｐＰｓｔｌ
−ＢａｍＨＩ断片はヌクレオチド位置１０３３−１０４
１にグリコシル部位（Ａｓｎ３０２）　を含有する。同
様な大きさのもう一つの断片を更にＢｉｔＥ］ｌによシ
切断した。この８８６　ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ
断片を調製０．８１アガロースゲル上で単離した。
Ｍ１３ｍｐ１８　　ＲＦ−ＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢａｍ
ＨＩで切断した。との７．３μｔ断片を調製用０．８チ
アガロースグル上で単離した。ＤＮＡ断片をアガロース
ゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフィ及びエ
タノール沈澱によシ精製した。
０．１μモルの７．３　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨ
Ｉ切断ベクター及び０．２ｐモルの８８６　ｂｐ　Ｐｓ
ｔ　■−ＢａｍＨＩｕ−ＰＡ断片を連結した。この連結
混合物の１μを及び３μｔを用いてＡｍ＠ｒｓｈａｍに
よ誘発行されたマニュアル＠Ｍ１３　　ｅｌｏｎｉｎｇ
　ａｎｄ　ｓ＠ｑｕｅｎｃｉｎｇｈａｎｄｂｏｏｋ　’
に従ってＥ、　ｃｏｌ　ＪＭ１０９Ｃａ　　細胞の形質
転換を行った。１２個の無色プラークを拾い上げ、一本
鎖ＤＮＡを調製した（　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ。
Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　１ｍ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０１
　、２ｌ−７８（１９８３））。この一本鎖ＤＮＡを用
いてＭ１３万能！ライマーをクレノウデリメラーゼでア
ニーリングし、延長することによシ部分的に二本鎖ＤＮ
Ａを調製した。反応生成物をフェノール／クロロホルム
上抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。このＤＮ
ＡをＰｓｔ　ｌ及びＢａｍＨＩで切断した。
８８６　ｂｐ断片はｕ−ＰＡ断片がＭ１３ｍｐ１８ベク
ターにクローン化されたことを示す。一つのクローンを
更に分析し、正しいインサートが配列決定によシ確認さ
れた。このクローンをＭ１３ｍｐ１８／ＵＰＡと称する
。
ｂ）　Ａｓｎ　３０２におけるグリコシル化部位の突然
変異： 以下全白 唖　　　　　　　　　　の 突然変異誘発及び配列決定プライマーはホスホルアミダ
イト法（Ｍ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈ＠ｒｓ　、　ｌｎ　：Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｅ　５ｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆＧｏｎｅ　Ｆｒａｇｍ＠ｎｔｓ　（
＠者Ｈ，Ｇ、Ｇａ５５＊ｎ　ａｎｄＡルａｎｇ　）　Ｖ
＊ｒｌａｇ　Ｃｈ＠ｍＩ＊　、　Ｗｅｌｎｈ＠ｉｍ　、
　　ドイツ連邦共和国〕を用いてＡｐｐｌｉ＠ｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔ＠ｍＭｏｄ＠ｌ　３８０　Ｂシンセサイザー
上で合成した。
以下金白 一本釦鋳型ＤＮＡ上でのＩｎ　ｖｌｔｒｏ突然変異誘発
はＴ、Ａ、　Ｋｕｎｋｅｌ　（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。
ＵＳＡ８２．４８８−４９２（１９８５））により記載
されるようにして行った。ウラシル含有−重鎖鋳型ＤＮ
ＡをＥ、　ｃｏｌｔ菌株ＲＺ　１０３２（ｄｕｔ−、ｕ
ｎｇ−）の１サイクルの増殖により生産した。
１００ｐ％ルの突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライ
マーＷを２０μｔの５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｔｐＨ
７，５，１０ｒｎＮｉ　ＭｇＣｌ２．５　ｍＭ　ＤＴＴ
　、　０．５　ｍＭＡＴＰ及び２０ＵのＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｉｌｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　）中でホス
ホリル化した。３７℃で３０分後、反応ｔ−７０℃で１
０分間加熱することにより停止した。
０．３ｐ−Ｔニルのウラシル含有Ｍ　１３ｍｐ　１８／
ＵＰＡ鋳型ＤＮＡを１０ｐモルのホスホリル化突然変異
誘発オリゴデスオキシリ？ヌクレオチドグライマーＷ及
び１０９モルのＭ１３万能万能法定プライマーと３０μ
ｔの１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔｐｈｓ、ｏ、１０ｍ
ＭＭｇＣｔ２　　中でインキュベートした。試料を８０
℃に加熱し、小さな水浴中において室温１で冷却した。
Ｃ）延長一連結反応： 上記アニーリングされた試料に１０μｔの１ｍＭｄＮＴ
Ｐ　、、１０　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ２ｐＨ８，Ｏ
ｌｌ　０　ｍＭ　ＭｇＣｔｚ、２０緬ＤＴＴ１１蘭ＡＴ
Ｔ、４００　　単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌｍｂ
ｍ　、　４００　Ｕ／　ｆｉｌ　）及び６単位のフレノ
ウＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇａｒ　＋６Ｕ
／μｔ）を含有する酵素−ｄＮＴＰ混合物を添加した。
インキュベーションは１５℃で一昼夜行われた。
ｄ）　　Ｅ、　ｅｏｌｉ　ＢＭＨ７１細胞の形個転換：
この連結混合物をＴＥで２００μＬＶＣ稀釈した。
この延長一連結混合物の０．１μｔ、１μを及び１０μ
ｔをコンピテントＥ、　ｃａｌｌ　ＢＭＨ７１Ｃａ　　
細胞（Ｋｕｎｋｅｌ　ｒ上記）に添加した。氷上で３０
分後軸胞を４２℃において３分間ヒートショックを与え
、次いで氷上に保った。細胞を上層寒天及びＥ。
ｃｏｌｌＪＭ１０１インジケーター細胞と共にグレート
し念。
６個のグラークを拾い上げＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９
を感染させた。ファージをＰＥＧ沈澱により上澄液から
単離した。一本ＭＤＮＡをフェノールによる抽出及びエ
タノールによる沈澱によジ１４ｉした。＃１型ＤＮＡを
ＴＥ中に再懸濁した。
ＡＡＴ　：Ｉトン（Ａｓｎ３０２）からＣＡＡコドン（
Ｇ１ｎ３０２）への突然変異は一つのクローンに対して
鎖ターミネシ、ン法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　＠ｔ　ａｌ
、＋Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ７４．５４６３−６７（１９７７））を用いて上記
配列決定ブライマーによるＤＮＡ配列決定により卵重さ
れた。この突然変異の結果、ｕ−ＰＡのアミ２１ｗ６１
位１に３０２においてＡｓｎ−＋Ｇｌｎｆｉ化が生じて
ウロキナーゼにおける単一グリコシル化部位が除去され
る。Ｗｉｄ　ｕ−ＰＡ　Ｂ−釦におけるグリコシル化部
位の突然変異を示す（Ａｓｎ　３０２−＋Ｇｌｎ　３０
２　）。陽性クローンはＭ　１３　ｒｎｐ　１８　／　
ＵＰＡ−Ｗと称される。
ドへの転移 グラスミドｐＪＤＤ　２０７／ＰＨ０５−１−ＦＫ２Ｕ
ＰＡＢ　　をＳａｌ　ｌ及びＸｈｏ　ｌで消化した。こ
の２．２ｋｂＳａｔ　　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ断片を単離し
、アガロースダルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグ
ラフィで精製しそしてエタノール中で沈澱させた。この
ＤＮＡ断片はＰＨ０５プロモーター及びｕ−ＰＡ配列に
おいて２個のＭｓｔ１部位を含有する。３μｇの２．２
ｋｂＳａｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ断片を３単位のＲｈｔｌ
で３７℃において１０分間消化した。反応生成物を調製
用０．８１１アガロースゲル上で分離し、１６５１　ｂ
ｐＳａｌ　Ｉ　−Ｍａｔ　ｌ断片を単離し、そしてグル
から１電気溶出した。このＤＮＡ断片はｐＢｌ＜　３２
２のＳａｔ　１−ＢａｍＨＩ配列、ＰＨ０５グロモータ
ー、インベルターゼシグナル配列及びヌクレオチド位置
９３５におけるｕ−ＰＡ部のＭｓｔ１部位までのＦＫ２
ＵＰＡＢコード配列を含有する。
ＲＦ−ＤＮＡをＭ　１３　ｍｐ　１８　／　ＵＰＡ−Ｗ
　（実施例３０参照）について迅速ＤＮＡ単離法（Ｄ、
　Ｓ、　Ｈｏ１ｍ５ｓｅｔ　ａｌ、　Ａｎａｌｙｔ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４．１９３−９７（１９８１）
）により調製し九。５μｇのＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＭ
ｓｔｌに消化した。２μｇのＲＮａｓｅ（Ｓ＠ｒｖａ　
）を添加し、３７℃で５分間インキュベート後、３８７
ｂｐ　Ｍｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を調製０．８チア
ガロースダル上で単離した。このＤＮＡ断片を電気溶出
し、エタノール中で沈澱させた。この断片はウロキナー
ゼロー鎖におけるヌクレオチド位［１０３３−１０３５
（Ａｓｎ３０２−＋Ｇｌｎ）においてＡＡＴ−＋ＣＡＡ
の突然変異を含む。
ゲラスミ）”　ｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｉ　−Ｕ
ＰＡ　ｔｌ−Ｓａｌ　ｌ及びＢａｍＨＩで切断した。こ
の６．６ｋｂのベクター断片（実施例２９＃照）を単離
した。０．２ｐモルの１６５１ｂｐ　Ｓａｌ　ｌ　−Ｍ
ａｔ　ｌ断片、０．２ｐモルの３８７ｂｐ　Ｍｓｔ　Ｉ
　−ＢａｍＨＩ断片及び０．１ｐモルの６．６　ｋｂ　
Ｓａｌ　ｌ　−ＢａｍＨｌベクター断片を連結した。コ
ンピテントＥ、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１Ｃ＆２“細胞
を形質転換し次。
１２個のアンピシリン耐性形質転換体を生育せしめた。
プラスミドＤＮＡを単動し、ＥｃｏＲＩ及びＨｌｎｄ　
ＩＩＩ制限切断により分析した。グリコシル化部位にお
ける突然変異（Ｗ）はヌクレオチド位置１０３２−１０
３７におけるＥｃｏＲＩ　部位を破壊した。突然変異の
存在ＦｉＤＮＡ配列決定により確虻された。ｕ−ＰＡＢ
−釦内に突然変異を有する一つのシラスミ）’　ＤＮＡ
はｐＪＤＢ　２０７／ＰＨ０５−Ｔ　−ＦＫ２ＵＰＡＢ
−Ｗと称される。このプラスミドはクリングルに２にお
いて無傷のグリコシル化部位を有するが、しかしｕ−Ｐ
Ａ　Ｂ−鎖においては突然変異部位Ｗ（ＡｓＨ３０２−
＋Ｇｌｎ　）を有した。
プラスミドｐＪＤＢ　２０７　／ＰＨ０５−Ｉ　−Ｆｔ
ＪＰＡ　−Ｗ及び１）ＪＤＢ　２６７　／ＰＨ０５−Ｉ
　−ＦＧＫ２ＵＰＡ　−Ｗを対応する未突然変異グラス
ミド（′ｊ！施例流側参照）から出発して同様にして造
成し次。
ｐＪＤＢ　２０７／理姪−Ｉ−ＦＫ２ＵＰＡ−Ｗの４．
８ｋｂＳａｌ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉベクタ一部分ｔ”　ｐ
ＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ（実施例２８参照）の６．２　
ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉベクター断片により＆
換した。この６．２ｋｂ断片は、ｐＪＤＢ２０７の４．
８ｋｂ訂１片中にクローニングされたｐＥＭＢＬ　１９
の１．４　ｋｂ　Ｆ　Ｉ　Ｌａｅインサートを有した。
連結の後、形質転換しそして新しい造成物を分析してＦ
ＩＬａｅインサー）ｆ有する一つの正しいプラスミドｔ
ｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｅ／ＰＨ０５−Ｉ−ＦＫ２ＵＰ
Ａ　−Ｗと称する。
プラスミドｐＪＤ８２０７ＦＩＬａａ／１’ＨＯ５−１
−ＦＧＫ２ＵＰＡ”−Ｗを同様にして得た。
同様にして、ｐＪＤＩ３２０７カＨＯ５−１−ＭＯＵ−
に２ＴＰＡＢ（実施例１５Ｃ参照）の４．８　ｋｂ　Ｓ
ａｌ　ｌ　−Ｈｐａ　！ベクタ一部分をｐＪＤ８２０７
ＦＩＬａｃの６．２　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ−ＨｐａＩベク
ター断片により置換した。得られたグラスミドをｐＪＤ
８２０７ＦＩＬａｃ／ＰＨ０５−Ｉ　−ＵＫ２ＴＰＡＢ
と称する。グラスミドｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／ｉ’
ＨＯ５−Ｉ　−ＵＫ２ＵＰＡ”ＸｐＪＤＢ２０７ＦＩＬ
ａｃ／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡ’ＵＰＡ’及びｐＪＤ８２
０７ＦＩＬａｅ／１）ＨＯ５−Ｉ−ＵＰＡＡＴＰＡＢｎ
ＦＩＬａＣベクター断片なしにこれらのグラスミドから
同様にして得られ九。
＆）−重鎖鋳型の調製 プラスミドｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｃ／１）ＨＯ５−Ｉ
−ＦＫ２ＵＰＡＢ−Ｗを用いてコンピテントＥ、　ｃｏ
ｉｌ　ＲＺ　１０３２Ｃａ”細胞（Ｔ、　Ａ、　Ｋｕｎ
ｋｅｌ、上記〕を形質転換した。
一つのアンピシリン耐性コロニーｔ−１００μｇ　／Ｎ
（Ｑアンピシリン、２０μｇ／ｙｉｌのチミジン及び２
０μｇ／ｍｌのデスオキシアデノシンを補給したＬＢ培
地中において生育せしめた。ｌ・１０個／μの細胞密度
において、細胞を集め、ＬＢ培地中で洗浄し、そして１
００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び０．２５μｇ／ｍ
のウリジンを含有するＬＢ培地中に再浮遊させた。０．
３のＯＤ　　においてヘルパーファージＲ４０８（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ−ＰＬ　Ｂｉｏｅｈｅｍｌｃａｌｓ＋Ｉ
ｎｃ、）を２０　ｍ、ｏ、１．において添加した。この
培養液を３７℃において５時間徴しく振盪した。この培
地中ウラシル含有−重鎖ＤＮＡをＴ、Ａ、　Ｋｕｎｋｅ
ｌ（上記）により説明されるのと同様にして単離した。
ｐＥＩＩ／ＩＢＬ　１９　（＋）　（実施例２８参照）
から出発して・Ｆ１領域を左廻ジ方同にｐＪＤＢ２０７
中にクローン化した。単離一本Ｑ　ＤＮＡは発現グラス
ミド内のＦＫ２０ＰＡ　　インサートのセンス知で１＞
−ｚた。
ｂ）　　ｔ−ＰＡのクリングルに２のＡｓｎ１８４にお
けるグリコシル化部位の突然変異； この突然変異はグリコシル化のコンセンサスアミノ酸認
識配列の第３位置に関する。５ｅｒ１８６がＡｌｍによ
り置換された。
８８　ＤＮＡ　： Ａｓｎ　Ｇｌｙ　２ ５′−・・・ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＴＣＡ　ＧＣＣ
ＴＡＣＣＧＴ・・・−３′突然質異訪発グライ１−Ｙ： ３ｔＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＣＧＴ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　　　
　　−５’突然変異センス鎖： ５乙・・・ＧＧＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＴ
ＡＣＣＧＴ・・・−３′Ａａｎ　Ｇｌｙ　２ 配列決定ゾライマー： 突然変異実験方法は実施例３０と同様であった。
Ｍ１３ユニバーサル配列決定プライマーの代りに式５’
−ＡＧＴＣＣＡＧＧＴＴＡＧＴＡＴＧＧＣ−３’のＰＨ
０５オリゴヌクレオチドプライマーを用いたところ、そ
れはＰＨ０５プロモーターにおけるＡＴＧからのヌクレ
オチド−６０〜−７７にハイブリダイズした。延長及び
連結反応の後、コンビテン）　Ｅ、　ｃｏｉｌ　ＢＭＨ
７１Ｃ１２＋細胞（Ｋｕｎｋｓｌ　上記〕を形質転換し
た。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、１００■／
ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中において生育せ
しめた。プラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定に
より突然変異の存在を分析した。ＴＣＡコドンのＧＣＡ
への突然変異の結果、ｔ−ＰＡのアミノ酸位置１８６に
おいて５ｅｔ−＋Ａ１ｍの変化が生じた。
コンセンサス配列の第３位置における突然変異はグリコ
シル化部位を除去した。突然変異ＤＮＡを有する一つの
クローンｆ　ｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｃ／１）ＨＯ５−
Ｉ−ＦＫ２ＵＰＡＢ−ＷＹと称する。
ＹＶｉｔ−ＰＡのに２におけるＡｓｎ　１８４のグリコ
シル化部位の突然変異を示し、Ｗはｕ−ＰＡＢ−鎖内の
Ａｓｎ　３０２における突然変異を示す。得られた非グ
リコシル化ＦＫ２ＵＰＡ　　ハイプリ、ドタンノ母り質
は次の二つのアミノ酸変化即ちｔ−ＰＡクリング／ｌ／
に２におけるＳｅｒ　１８６−＋　Ａｌａ及びｕ−ＰＡ
Ｂ−鎖におけるＡｓｎ　３０２−＋Ｇｌｎを有する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｆ　ＩＬａｃ／ＰＨ０５−１
−ＦＧＫ２ＵＰＡ’−Ｗ（実施例３１参照）の同様な突
然変異は非グリコシル化ＦＧＫ２ＵＰＡ　　ハイブリッ
ドタンノ卆り質全コードするプラスミドｐＪＤ８２０７
ＦＩＬａｃ／′ＰＨ０５−１−ＦＫ２ＵＰＡ　−ＷＹを
導く。
実施例３３ニブラスミドｐＪＤＢ２０７７’ＰＨ０５−
１−に２ＵＰｋＢ−ｗｙの造成 アミノ酸配列ｔＰＡ（Ｓｓｒｌ−Ｇ１ｎ３）（Ｇ１ｙ１
７６−Ａｒｇ２７５）−ｕＰＡ（Ｉｌｅ１５９−Ｌｅｕ
４１］）により定義されるハイブリッドに２ＵＰＡ”タ
ンノ平り贋をコードするヌクレオチド配列はプラスミド
ｐＣＧＣ５Ａ２ＵＰＡＢ中に含有された。酵母内での発
現のために、誘導性朋匹グロモーターを用いインベルタ
ーゼシグナル配列をに２ＵＰＡＢコード化領域にインフ
レーム融合した。
グラスミドｐｃＧｃ５／１（２ＵＰＡＢ？：　Ｂｇｌ　
ｎ及びＡｃｅｌで切断した。４８７　ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ　−Ａｃｅ　Ｉ　Ｗｈ片を単にシ次。それはｔ−ＰＡ
のＢｇｌ　１部位（ヌクレオチド位置１７８）からｕ−
ＰＡ内のＡｅｅ１部位（ヌクレオチド位［７７９）１で
のコード領域を含有した。この断片をＨｐｈｌで切断し
たところ４個の断片が得られた。
次式で表わされる二つのオリゴデスオキシリゲヌクレオ
チド （１）　　５’−ＣＴＧＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡ
ＡＡＣＡＧＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡａｎ　　区ｎ ＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧＴ
ＧＧＣＡＣＧ−３’（ＩＩ）　　３’−ＡＧＡＡＴＧＧ
ＴＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣ
ＣＴＴＡＣＣＣＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧ　
　−５’をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏａｙｓｔａｍ　Ｍｏ
ｄｅｌ　３８０Ｂ　　シンセサイｆ−上でホスホルアミ
ダイト法を用いて合成した。オリゴ０ヌクレオチド類■
及び■は二本鎖ＤＮＡリンカ−を形成した。ジグザグ状
５′末端の５個のヌクレオチドは酵母インベルターゼシ
グナル配列の部分であり、これに続いてヌクレオチド位
置７５２における第１のＨｐｈ　ｌ切断部位へのｔ−Ｐ
Ａコード配列（Ｓｓｒｌ−Ｇ１ｎ３）（Ｇｌｙ　１７６
−Ｔｈｒ　１９１　）がある。位［７２９−７３７（Ａ
ａｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　）におけるグリコシル化部位は
ＴＣＡ（Ｓｅｒ）　〜ＧＣＡ（Ａｌｍ）までの合成配列
において突然変異され、グリコシル化認識配列が除去さ
れる。ｔ−ＰＡのアミノ部位＃１８４−１８６における
グリコシル化部位（例えば、真性ｔ−ＰＡにおける第２
番目のグリコシル化部位）の突然変異はＹによジ示され
る。
オリゴヌクレオチドＩ及び■はこれらの５′末端におい
てホスホリル化され、８５℃で１０分間加熱され、室温
に冷却される際にアニーリングされた。１０，５μｇ（
２７０９モル）のキナーゼ処理された二本鎖リンカ−Ｄ
ＮＡを実施例８Ｂに記載したように３０倍モル過剰にて
Ｈｐｈ　Ｉ切断ＤＮＡ断片（上記参照）に連結した。過
４１リンカー分子をイングロ・臂ノールによる沈澱によ
り除去した。このＤＮＡを更にＳｃａ　ｌで消化した。
この２５２　ｂｐ断片を調製用１．５％アガロースゲル
で単離し、電気隘出し、そしてエタノール中で沈澱させ
た。
グラスミドＰ３１ＲＩＴ−１２（実施例６Ｂ参照）全３
ａｌ　ｌ及びＸｈｏｌで消化した。単離された断片を更
にＨｇａｌ（実施例６Ｃ参照）及びＢａｍＨＩで消化し
た。得られた５　９１　ｂｐ　Ｂａｎ　ＨＩ　−Ｈｇａ
　Ｔ　断片を単離した。それはＰＨ０５グロモーター及
びインベルターゼシグナル配列を含有し九。
プラスミドｐ、ｙＤＢ２ｏ７，４蔗止−Ｉ−ＦＫ２ＵＰ
Ａ　−Ｗ　　をＢａｍＨＩで消化し次。５μｇのこの線
状ＤＮＡを１０単位のＳｃａ　ｌで１０分間部分的に消
化した。１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　　を添加することにより
反応を停止した。
７．７　ｋｂ　Ｂａｍ）ＩＩ　−８ｅａ　Ｉベクター断
片を単離し、電気溶出しそしてエタノール中で沈澱させ
た。これはｔ−ＰＡにおけるＳｅａ　１部位（位［９５
３）からｕ−ＰＡＢ−鎖の末端（Ｘｈｏｌ　　リンカ−
が添加された位［１４４１におけるＰｖｕ　１１部位）
までのコード化領域の３′部分、ＰＨ０５ターミネータ
−及びｐＪＤＢ　２０７ベクタ一配列を含む。各々０．
２ｐモルの５９１　ｂｐ　Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｈｇａ　ｌ
断片及び２５２　ｂｐ粘着末端（リンカ−）　−Ｓｃａ
　ｌ断片及び０．１ｐモルの７．７ｋｂベクタ一断片を
連結した。Ｅ、　ｃｏｉｌＨＢｌｏｌＣａ　　　細胞を
形質転換後、１２個のアンピシリン耐性コロニーを生育
させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ及びＨ
ｌｎｄ　ｍ　　消化により分析した。突然変異の存在は
ＤＮＡ配列決定により検肛した。一つの正しいクローン
を選びｐＪＤＢ２０７／に萱匹−１−に２ＵＰＡ”−宵
と称する。ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡＢ−鎖におけるクリン
グルに２のグリコシル化部位は共に突然変異された（そ
れぞれＹ及びＷ）。
得られた未グリコシル化に２ＵＰＡＢハイブリツドタン
ノｔり質は二つのアミノ酸変化（ｔ−ＰＡ　Ｋ２　領域
におけるＳ＠ｒ　１８６−＋Ａ１ｍ及びｕ−ＰＡ　Ｂ−
鎖におけるＡａｎ　３０２−＋Ｇ１ｎ　）を有した。
プラスミドｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／ＰＨ０５−Ｉ　
−ＵＫ２ＴＰＡ”（実施例３１参照）のウラシル含有−
重鎖鋳型（Ｔ、Ａ、　Ｋｕｎｋ＠１　＋上記〕　を実施
例３ｏと同様にしてＨａした。Ａｍｎ１８４　　におけ
るグリコシル化部位の突然変異方式は実施例３２に説明
し九のと同様でおった。Ａｓｎ　４４３におけるグリコ
シル化部位の突然変異の結果Ｔｈｒ　４５０→Ａ１ｍ　
アミノ酸変化が生じた。
、以下金白 一本鎖ＤＮＡ （センサ鎖） Ａａｎ　Ａｒｇ巨司 ５′−・・・ＣＴＴ　ＡＡＣＡＧＡ　ＡＣＡ　ＧＴＣＡ
ＣＣＧＡＣＡ・・・−３′突然変異誘発プライマー２： ３′−・・・ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＣＴ　ＣＧＴ　ＣＡＧ
　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ｔ・・・−５′突然変異センス鎖： ５′−・・・ＣＴＴ　ＡＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣＡ
ＣＣＧＡＣＡ・・・−３′Ａｓｎ　Ａｒｇ囚国 配列決定ブライマー： 突然変異実験方法は実施例３０において説明したと同様
であった。ホスホリル化された突然変異誘発ブライマー
Ｙ及び２を共に ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／１）ＨＯ５−Ｉ−ＵＫ２Ｔ
ＰＡＢのウラシル含有−重鎖鋳型にアニーリングした。
ＰＨ０５オリゴヌクレオチドプライマー（実施例３２参
照）の追加の使用は任意である。
延長及び連結反応の後、コンビテン）　Ｅ、　ｃｏｉｌ
ＢＭＨ７１Ｃａ　　　ｌｔＩ胞を形質転換した。アンピ
シリン耐性形質転換体のグラスミドＤＮＡを調製し、示
された配列決定ブライマーにより両方の突然変異の存在
を分析した。
両方の突然変異を有する一つのクローンのプラスミドＤ
ＮＡ　’ｋ　ｐＪＤ８２０７ＦＩｎ、ａ　ｃ／ＰＨ０５
−１−ＵＫ２ＴＰＡＢ−ＹＺと称する。ＹはＡｓｎ１８
４　におけるグリコシル化部位の突然変異を示し、及び
２はＡａｎ　４４８における突然変異を示す。この非グ
リコシル化ＵＫ２ＴＰＡ　　ハイブリッドタンノ母り質
は次の二つのアミノ酸変化、即ちｔ−ＰＡのに２クリン
グルにおけるＳｅｒ　１８６−＋Ａ１ａ及びｔ−ＰＡＢ
−銭におけるＴｈｒ　４５０−＋Ａ１ａ　′！！−有し
た。
この突然変異実験方法は又、 ｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｃ／ＰＨ０５−１−ＵＫ２ＵＰ
Ａ”　。
ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡＡＵ
ＰＡ”及びｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｃ／ＰＨ旦５−　Ｉ
　−ＵＰＡ’ＴＰＡ”　（実施例３１参照）の門型にも
適用可能であり、この場合、ｕ−ＰＡＢ−鎖におけるグ
リコシル化部位の突然変異のための突然変異誘発ブライ
マーＷ及び／又は突然変異訪発プライマーＹ及びｚｌ並
びにｔ−ＰＡＫおけるグリコシル化部位の突然変異の九
めにヨー口。
パ特許出願２２５２８６号明細書に記載されているその
他のものが使用される。
のＦＷｌＩＡ プラスミド ｐ　ＪＤＢ２０７７’ＰＨ０５−１−ＦＫ２ＵＰＡ”　
。
ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／Ｉ’ＨＯ５−Ｉ　−ＦＫ２
ＵＰＡ”　−Ｗ。
ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｅ／ＰＨ０５−Ｉ−ＦＫ２ＵＰ
Ａ　−ＷＹ。
ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｃ／′ＰＨ０５−Ｉ−ＵＫ２Ｔ
ＰＡＢ。
ｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｅ／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＫ２ＴＰ
Ａ　−ＹＺ。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ（リー１−に２ＵＰＡ　−Ｗちｐ
ＪＤＢ２０７７ＰＨ０５−Ｉ−ＦＵＰＡ”。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＦＵＰＡ　−Ｗ。
ｐＪＤＢ２０７／Ｔ萱些−Ｉ　−ＦＧＫ２ＵＰＡ”　。
ｐＪＤｎ２０７／）凹亙−Ｉ−ＦＧＫ２ＵＰＡ　−Ｗ。
ｐＪＤＢ２０７ＦＩＬａｅイ’ＰＨ０５−Ｉ　−ＦＧＫ
２０ＰＡ”　−Ｗ及びｐＪＤ８２０７ＦＩＬａｅ／ＰＨ
０５−Ｉ−ＦＧＫ２ＵＰＡ”−ＷＹをす、カロミセス・
セレピゾアエ（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃ＠ｓｃｅｒｅｖ
１ｍ１ｍｓ　）菌株ＧＲＦ’　１８　（ＤＳＭ　３６６
５　）中に形質転換した。形質転換、細胞の生育及び紀
胞抽出液の調製は実施例１６に記載されている。
得られたハイプリ、ドプラスミノーゲンアクチベータは
実施例２２〜２４に説明された方法と同様にして精製す
ることができる。
実施例２２〜２４のいづれかで得られた峙液を更に下記
の如く精製しそして凍結乾燥した。
溶液を１０容の０．１Ｍ酢酸アンモニウム（Ｆ’１５．
Ｏ＞（全容量８０ｍｇ）で稀釈し、５１のＣＭ−３ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｌ
ｍ　）　　′Ｉｔ含有するカラムに室温で２５＋ａＪ／
ｈの流速で適用した（カラムは０．１Ｍ酢酸アンモニウ
ムで予備平衡化された）。生成物を含有しない濾過ｇを
廃棄した。
カラムを１５１＋１１ｊＯ０，ＩＭ酢ｆｆ７／−１−ニ
ラＡ　（ＰＨ５，０＞及び１０μｔの酢酸アンモニウム
（Ｆ’１７．０）で洗浄した。次いで、吸着ハイブリッ
ドＰＡの溶出を１　Ｍ酢酸アンモニウムｐｔ４８．６に
より室温で行った（流速５ｔ／／ｈ）。カラム上でのガ
ス形成を防止するために、溶出は１〜１．５パールの過
剰圧力にて行った。溶出液のハイプリ、ドＰＡ含量はＵ
Ｖモニター（２８０ｎｍ）により測定した。溶出ハイプ
リ、ドＰＡの約９０％を含有する画分を集め、凍結乾燥
に付した。固体ハイプリ、ドＰＡ凍結乾燥物の純度はＩ
（ＰＬＯにより判断して約９５チを越えるものであった
。生成物には洗剤が含まれなかった。
上記の如く得られた純粋ｕＰＡ　（１−４４）−ｔＰＡ
（１７６−５２７）　ｔ−含有する溶液を０．０１　Ｔ
ｏ　Ｔｗｅｅｎ８０■を含有する０、３モル濃度の塩化
ナトリウムに対して透析し、−８０℃で貯蔵した。投与
前に温度を７５μｇ／ゴの全ＰＡ及び０．３　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１に調整した。溶液を０．２２μｍ膜フィルターを通
過させるｐ過により殺菌した。
上記ＰＡの代りに同一量の前記実施例において説明し九
異り九ＰＡ、例えば ｕＰＡ（１−１５８）−ｔＰＡ（２７６−５２７）。
ｕＰＡ（１−１３１）−ｔＰＡ（２６３−５２７）。
ｔＰＡ（１−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）。
ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−２６１）−ｕＰ
Ａ（１３４−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｕＰＡ（１３４−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰ
Ａ（１３２−４１１）。
ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ
（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）或いは ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰ
Ａ（１３２−４１１）。
或いは変異体ハイプリ、ドＰＡ、例えばｔＰＡ（１−４
９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３
０１。
Ｇｉｎ、　３０３−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＲＡ（１７６−１８５，Ａｉｍ
、　１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌ
ｎ、３０３−４１１）。
ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌｍ
、　１８７−４４９゜Ａｌｍ、４５１−５２７）。
ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌｍ、
１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌｎ、
３０３−４１１）或いはｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（
１７６−１８５，Ａｉｍ、１８７−２７５）−ｕＰＡ（
１５９−３０１，Ｇｌｎ、３０３−４１１）　。
などを用いることも可能である。
１６９．３１ｎ９の大豆レシチン（大豆ホスファチドＮ
Ｃ９５Ｓ製造者：　Ｎａｔｔｅｒｍａｎｎ　Ｎ　Ｃｏｌ
ｏｇｎｅ　ｚ西ドイツ；純度９０〜９６チ；脂肪酸組成
：リノール酸６１〜７１チ、リルン酸４〜７係、オレイ
ン酸６〜１３チ、パルミチン酸１０〜１５幅、ステアリ
ン＃１１．　ｓ　〜３．５％）、及び９２．７１ｎ９（
７）純粋ナトリウムグリコレートを７５２．５ｄの殺菌
水中に溶解した。溶液をＩ　Ｎ　ＮａＯＲで−７，４に
ｖ！４整した。１０ｒｎ９の凍結乾燥し＊　ｕＰＡ（１
−４４）−ｔＰＡ（１７６−５２７）を添加した。浴液
ｔ　Ｏ，２２ｐｍ膜フィルターを通過させる濾過により
殺菌し、アンプル中に充填した。
上記ＰＡの代りに、同一量の前記実施例に説明した異っ
たＰＡ、例えば ｕＰＡ（１−１５８）−ｔＰＡ（２７６−５２７）。
ｕＰＡ（１−１３１）−ｔＰＡ（２６３−５２７）。
ｕＰＡ（１−２７５）−ｕＰＡ（１５９〜４１１）。
ｔＰＡ（１−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）。
ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−２６１）−ｕＰ
Ａ（１３４−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｕＰＡ（１３４−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰ
Ａ（１３２−４１１）。
ＬＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ
（１５９−４１１）。
ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−４１１）又は ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（１７６−２６２）−ｕＰ
Ａ（１３２−４１１）。
或いは変異体ハイブリッドＰＡ、例えはｔＰＡ（１−４
９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３
０１。
Ｇｌｎ、３０３−４１１）。
ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ
、　１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌ
ｎ、３０３，４１１）。
ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ
、１８７−４４９゜Ａｌａ、４５１−５２７）。
ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ、
　１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌｎ
、３０３−４１１）又はｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（
１７６−１８５，ＡＬａ、１８７−２７５）−ｕＰＡ（
１５９−３０１，Ｇｌｎ、３０３〜４１１）　。
などを用いることも可能である。
１００〜の実施例３７及び３８で述べたようなハイブリ
ッドプラスミノーゲンアクチベータ或いは変異体ハイブ
リッドプラスミノ−ｒンアクチペータを０．７％ＮａＣ
ｔを含有する１００彪の５０峰！グルタミン酸／グルタ
ミン酸ナトリウム、Ｐｌ（４，５中に溶解した。この浴
液をアングルに充填したが、これを静脈内（〆−ラス）
注入に使用することができる。
微生物の寄託 次の菌株はＤｅｕｔａｃｈｓ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｕ
ｒＭｌｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）、　Ｇｒ
１ｇｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｓ８、　Ｄ−３０００Ｇｏ
ｔｔｉｎｇｅｎに１９８７年１０月２３日に寄託された
。
受入番号 Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐＷ３４９Ｆ　　　　　Ｄ
ＳＭ　４２９１Ｅ、ｃｏｌｌ　ＨＢＩＯＩ／ｐｃｓ１６
　　　　　　ＤＳＭ　４２９４Ｅ、ｃｏｌｌ　ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐｃＵＫ１７６　　　　　ＤＳＭ　４２９０Ｅ、ｅ
ｏｌｌ　ＨＢＩＯＩ／ｐＣＧＡ２６　　　　　ＤＳＭ　
４２９６Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ／ｐｓＶ２９１１ｎ
ｓｏ、　　ＤＳＭ　４２９２次のハイブリドーマ細胞系
統はＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎａｌｓ　ｄｏ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅａ　ｄｅ　Ｍｌｅｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓ’。
Ｉｎ５ｔｌｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ、　Ｐａｒｉｓ（Ｃ
ＮＣＭ）に１９８７年１１月２０日に寄託された。
４０５Ｂ、３３．３　　　　　　　Ｉ　−７１５４０６
Ａ、２３．７　　　　　　　Ｉ　−７１６４０７Ａ、１
５．２７　　　　　　Ｉ　−７１７
【図面の簡単な説明】
第１−１図〜第３−３図はそれぞれヒトｔ−ＰＡｅ　Ｄ
ＮＡ及びヒト　ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列
及び推定アミノ酸配列を図示する。成熟タン・母り質の
第１アミノ酸には下線が付されている。 第２図及び第４図はそれぞれと）　ｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ
及びヒト　ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの制限酵素地図である。 第５図はプラスミドｐＥｃｏ　Ｏ，４７ΔＳｃａ　ｌ　
　を造成するために用いられる技術の概略図である。 第６図は突然変異されたｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡを含有する
プラスミドｐｈ−ｔＰＡΔＳｅａ　ｌの造成の概略図で
ある。 第７図はｕ−ＰＡのＡ−鎖領或及びｔ−ＰＡのＢ−鎖を
含んでなるｅＤＮＡインサートを含有するプラスミドｐ
［ＪＮＣ−ｔｅ　　造成の概略図である。 第８図はｔ−ＰＡのＡ−鎖飴域及びｕ（’ＡのＢ−鎖を
含んでなるｃＤＮＡインサート全含有するプラスミドｐ
ｔＮＣ−ＵＣの造成の概略図である。 第９図はプラスミドｐＤＯ２の造成の概略図である。 第１０図はｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　ｆベータグロビン断片
と組合わせて含有するプラスミドｐＤｏ　１０の造成の
概略図である。 第１１図はＭＣＭＶ　ＩＥ　ｆロモーターの制御下のｔ
−ＰＡ　ｃＤＮＡ及びベータグロビン断片を含有するプ
ラスミドｐＣＧＡ２６の造成の概略図である。 第１２図は共にネオマイシン耐性遺伝子を含むｔ−ＰＡ
発現プラスミドｐＣＧＡ　２８及びユニバーサル発現プ
ラスミドｐｃＧＡ　４４の造成の概略図である。 第１３図は共にハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｔ−
ＰＡ発現グラスミドｐＣＧＡ４２　及Ｕユニバーサル発
現プラスミドｐＣＧＡ　４２　ｄの造成の概略玄である
。 第１４図はネオマイシン耐性遺伝子及びＤＨＦＲ遺伝子
を含むｔ−ＰＡ発現グラスミドｐＣＧＡ　４８の造成の
概略図である。 第１５図はグラスミドｐｈ−ｔＰＡΔＳｅａ　ｌ　　の
突然変異されたｔ−ＰＡｃＤＮＡ　　インサートを含有
する発現プラスミドｐＢＲ１１の造成の概略図でおる。 第１６図はｕ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｔ−ＰＡのＢ
−鎖を含んでなるハイプリ、ドＰＡ　ｃＤＮＡ　　イン
サートを含有する発現グラスミドｐＢＲ２ｍ　　の造成
の概略図である。 第１７図はｕ−ＰＡ発現プラスミドｐＢＲＢ＆の造成の
概略図である。 第１８図は、ｔ−ＰＡのＡ−１）ｊドメイン及びｕ−Ｐ
ＡのＢ−［−含んでなるハイブリッドＰＡ　　ｅＤＮＡ
インサートを含有する発現グラスミドｐＢＲ４ａの造成
の概略図である。 第１９ｔｗｎ、ＰＨ０５ｒロモーター、インベルターゼ
シグナル配列及びｔ−ＰＡ　ｅＤＮＡを含有する酵母発
現ベクターｐＪＤＢ２０７７ＰＨ０５−Ｉ−ＴＰＡの造
成の概略図である。 第２０図はプラスミドｐｃｓ　１６　の造成の概略図で
ある。 第２１図はｕ−ＰＡｃＤＮＡ　？！’含んでなるグラス
ミドｐｃｓ　１６／ＵＰＡの造成の概略図である。 第２２図はプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ　
−ＵＰＡの造成の概略図である。 イプリ、ドＰＡ造成物を、これらの領域の結合か活性化
部位及び／又は天然エキソンーイントロン結合部位にあ
る最終造成物に転換するために用いられる技術の概略図
である。 第２３図はｔ−ＰＡのＡ−鎖ドメイン及びｕ−ＰＡのＢ
−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡｋコードする遺伝子
の造成を示す。 第２４図はｕ−ＰＡの八−鎖ドメイン及びｔ−ＰＡのＢ
−鎖を含んでなるハイブリッドＰＡｋコードする遺伝子
の造成を示す。 第２５図はｕ−ＰＡ成長因子ドメイン、ｔ−ＰＡのクリ
ングル２ドメイン及びｔ−ＰＡのＢ−［１んでなるハイ
ブリッドＰＡをコードする遺伝子の造成を示す。 第２６図はｕ−ＰＡ成長因子ドメイン、ｔ−ＰＡのクリ
ングル２ドメイン及びｕ−ＰＡ（７）Ｂ−鎖を含んでな
るハイプリ、ドＰＡをコード化する遺伝子の造成を示す
。 第２７−１図〜第２７−３図は実験の部に例示されるハ
イブリッドＰＡと変異体ハイプリ、ドＰＡの集成である
。 添付図面に用いられ次記号は下記意味を有する：ＡＭＰ
、ＡＩＴＩｐ”　　アンピシリン耐性遺伝子（ペーター
ラクタマーゼ） ＴＥＴ　ＳＴｏ　ｔＲテトラサイクリン耐性遺伝子ＮＥ
ＯＴｎ５ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ ＴＮ５ＰＲ）ランスポソンＴＮ５の細菌クロモ−ター ＨＰＨハイグロマイン／ホスホトランスフェラーゼ 抑制的であるｐＢＲ３２２配列 ＳＶ４０　ｏｒｉ　　　ＳＶ４０の複製開始点、初期及
び後期ブロモ−ターと一致 ５Ｖ４０ａｎｈ　　　７２　ｂｐエンハンサ−１ＳＶ４
０初期８Ｖ４°”　　　　７’　０　％　−ｚ　−ｏ部
分、ＨＣＭＶＥ　　　　　とトサイトメガロウィルス（
ＨＣＭＶ）の主要即時初期遺伝子の二ンノ・ン サ− ＭＣＭＶＰ　　　　　マウスサイトメガロウィルス（Ｍ
ＣＭＶ）の主要即時初期遺伝子の ブロモ−ター／　ｍＲＮＡスタート部 位 Ｒ８Ｖ　　　　　　ラウス肉層ウィルスＬＴＲ（ブロモ
−ター） ＣＡＰ　　　　　　真核性ｍＲＮＡの５’ｍ７Ｇｐゝｅ
＆ｐ　’の位置 ｐｏｌｙＡ　　　　　ｍＲＮＡのボリア７”＝ル化部位
５ＰＬＤ　　　　　スプライスドナ一部位、イントロン
の５′末端 ５ＰＬＡ　　　　　スプライスアクセプタ一部位、イン
トロンの３′末端 ＢＡＰ　　　　　　ＭＪＪ菌アルカリ性ホスファターゼ
ＣＩＰ　　　　　　仔つシ腸ホスファターゼ（ＢａｍＨ
１／１３ｇ１２）　　ＢａｍＨｌ及びＢｇｌ■　部位を
共連結することから生ずるＳａｕ　３　ｍ部位 ５ｃａｌ（ｄｅｌ）　　変異された５ｃａｌｆｔＢ位ｘ
＜ｙ　　　　　ｙから布石りに位置する制限酵素部位Ｘ ｐ　　　　　　　ブロモ−ター ｉｎｖ、ｓｓ　　　　インベルターゼシグナル配列ｔ　
　　　　　　転与ターミネータ− Ｌ　　　　　　リンカ−ＤＮＡ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸の同一性及び数においてヒトｔ−ＰＡ及び
    ヒトｕ−ＰＡの部分配列に対応する少なくとも２個の部
    分配列により構成されるアミノ酸配列を有する一本鎖ハ
    イブリッドプラスミノーゲンアクチベータ、及びＮ−グ
    リコシル化部位の少なくとも１個がグリコシル化がそれ
    らの部位において起こらないように変形されているその
    変異体。 ２、ヒトｔ−ＰＡの触媒作用領域にヒトｕ−ＰＡの全て
    の又は個別のＡ−鎖ドメイン或いはヒトｕ−ＰＡ及びヒ
    トｔ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを一続きに結合して
    含有するアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項記
    載のプラスミノーゲンアクチベータ。 ３、特許請求の範囲第２項記載のｕＰＡ（１−４４）−
    ｔＰＡ（１７６−５２７）。 ４、ヒトｕ−ＰＡの触媒作用領域にヒトｔ−ＰＡの全て
    の又は個別のＡ−鎖ドメイン或いはヒトｔ−ＰＡ及びヒ
    トｕ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを一続きに結合して
    含有するアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項記
    載のプラスミノーゲンアクチベータ。 ５、ヒトｔ−ＰＡの１個、２個或いは３個の個別のＡ−
    鎖ドメインを含有するアミノ酸配列を有し、そのアミノ
    酸配列がヒトｕ−ＰＡの触媒作用領域に一続きに結合さ
    れている特許請求の範囲第４項記載のプラスミノーゲン
    アクチベータ。 ６、ヒトｔ−ＰＡのフィンガードメインを含有するアミ
    ノ酸配列をヒトｕ−ＰＡの触媒作用領域に一続きに結合
    して有する特許請求の範囲第５項記載のプラスミノーゲ
    ンアクチベータ。 ７、ヒトｔ−ＰＡのクリングル２ドメインを含有するア
    ミノ酸配列をヒトｕ−ＰＡの触媒作用領域に一続きに結
    合して有する特許請求の範囲第５項記載のプラスミノー
    ゲンアクチベータ。 ８、特許請求の範囲第７項記載のｔＰＡ（１−３）−ｔ
    ＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）。 ９、ヒトｔ−ＰＡのフィンガー及びクリングル２ドメイ
    ンを含有するアミノ酸配列をヒトｕ−ＰＡの触媒作用領
    域に一続きに結合して有する特許請求の範囲第４項記載
    のプラスミノーゲンアクチベータ。 １０、特許請求の範囲第９項記載のｔＰＡ（１−４９）
    −ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１
    ）。 １１、ヒトｔ−ＰＡのフィンガー、成長因子及びクリン
    グル２ドメインを含有するアミノ酸配列をヒトｕ−ＰＡ
    の触媒作用領域に一続きに結合して有する特許請求の範
    囲第５項記載のプラスミノーゲンアクチベータ。 １２、ヒトｕ−ＰＡの成長因子及びヒトｔ−ＰＡのクリ
    ングル２ドメインを含有するアミノ酸配列をヒトｕ−Ｐ
    Ａの触媒作用領域に一続きに結合して有する特許請求の
    範囲第４項記載のプラスミノーゲンアクチベータ。 １３、全てのグリコシル化部位が変形されている特許請
    求の範囲第１項記載の変異体プラスミノーゲンアクチベ
    ータ。 １４、下記のものよりなる群から選ばれる特許請求の範
    囲第１項記載の変異体プラスミノーゲンアクチベータ： 【アミノ酸配列があります】及び 【アミノ酸配列があります】。 １５、特許請求の範囲第１項記載のハイブリッドプラス
    ミノーゲンアクチベータ或いはその変異体をコードする
    配列を有するＤＮＡ。 １６、特許請求の範囲第１項記載のハイブリッドプラス
    ミノーゲンアクチベータ或いはその変異体をコード化す
    る配列を有するＤＮＡを含んでなることを特徴とする真
    核宿主生物用ハイブリッドベクター。 １７、特許請求の範囲第１項記載のハイブリッドプラス
    ミノーゲンアクチベータ或いはその変異体をコード化す
    る配列を有するＤＮＡを含んでなるハイブリッドベクタ
    ーで形質転換された真核宿主細胞。 １８、特許請求の範囲第１項記載の一本鎖ハイブリッド
    プラスミノーゲンアクチベータ或いはその突然変異体と
    共に薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的組成物
    。 １９、哺乳動物におけるプラスミノーゲン活性化の機構
    により局所的フィブリン溶解或いはタンパク質分解活性
    をもたらしたい場合の血栓症その他の状態の治療方法で
    あって、該哺乳動物に治療的に有効量の特許請求の範囲
    第１項記載の化合物を投与することを特徴とする方法。
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