JPH09124700A - 新規プロテアーゼインヒビターおよびその製造方法、エラスターゼが関与する疾患の治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 天然型尿性トリプシンインヒビターより強い
エラスターゼ阻害活性を有する新規プロテアーゼインヒ
ビター、並びにその遺伝子工学的手法による製造方法、
エラスターゼが関与する疾患の治療剤を提供する。 【解決手段】 少なくとも下記式Ｉのアミノ酸配列を有
することを特徴とする新規プロテアーゼインヒビター、
それをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するベクタ
ー、このベクターを含有する形質転換体及び新規プロテ
アーゼインヒビターの製造方法、新規プロテアーゼイン
ヒビター有効成分とするエラスターゼが関与する疾患の
治療剤。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、優れたプロテアー
ゼ阻害特性を有する新規プロテアーゼインヒビター、当
該プロテアーゼインヒビターをコードするＤＮＡ、当該
ＤＮＡを有するベクター、当該ベクターで形質転換され
た形質転換体および当該形質転換体を培養することを特
徴とする新規プロテアーゼインヒビターの製造方法に関
する。また本発明は、優れたプロテアーゼ阻害特性を有
し、かつ遺伝子工学的手法で大量に発現・産生し得る新
規プロテアーゼインヒビター及び該プロテアーゼインヒ
ビターの発現増強方法を提供するものである。

【０００２】

【従来技術・発明が解決しようとする課題】急性膵炎に
代表される炎症では、炎症局所組織の破壊や併発する細
菌感染によってインターロイキン−６、インターロイキ
ン−８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の各種サイトカイン
が誘導され、その結果として組織、臓器での好中球の遊
走・活性化が起こる。このような病態は播種性血管内凝
固症候群（ＤＩＣ）や多臓器不全（Multiple Organ Fai
lure：ＭＯＦ）を惹起し、重篤な症状を引き起こす。局
所での炎症の発生からＭＯＦやＤＩＣ等の全身病態への
移行で特徴的な点は(1) 局所から全身への病態の進行
が、短時間に急激に進行する事、(2) 最終的には、活性
化された好中球の放出するエラスターゼ(HNE) や膵臓細
胞の放出するエラスターゼ（HPE)等のプロテアーゼが関
与する事の二点にある。従って、膵炎等の治療では炎症
初期にその進行を抑制する事と、プロテアーゼの阻害の
二つのアプローチが考えられている。しかし前者のアプ
ローチでは複数の因子が関与している事や、進行が急激
である事などから有効な薬剤の開発が困難であり、現状
では新規開発も含めて後者のアプローチが有効と考えら
れている。

【０００３】かかる観点のもと、現在、膵炎に代表され
る炎症の治療では、低分子の合成プロテアーゼインヒビ
ターや、生体成分である蛋白性プロテアーゼインヒビタ
ーが使用されている。しかし、現行製剤中にはエラスタ
ーゼ阻害活性を示す製剤が殆どなく、エラスターゼ阻害
活性を有するプロテアーゼインヒビターの開発が望まれ
ている。主な蛋白性プロテアーゼインヒビターのうちエ
ラスターゼ阻害活性を有するものとして、α1-アンチト
リプシン (α1-ＡＴ) と尿性トリプシンインヒビター
（以下、ＵＴＩという）が挙げられる。これらは、いず
れも主として好中球エラスターゼを阻害する。α1-ＡＴ
は血液中に大量に存在するセリンプロテアーゼインヒビ
ターであり、好中球エラスターゼに対し強力な阻害活性
を示すが、活性酸素によって容易に失活することが知ら
れている。一方、ＵＴＩの好中球エラスターゼ阻害活性
はα1-ＡＴに比べて弱いことが知られている。また、Ｕ
ＴＩはヒト尿中より精製される蛋白質なので、大量に生
産する場合には原材料の確保が困難であり、また原材料
が不均一であるため成分の一定な製剤を製造することも
難しい。更には未知成分やヒト感染性ウイルスの混入と
いった生体成分由来の製剤一般に共通する問題も考慮し
なくてはならない。さらに、ＵＴＩおよびそのＫｕｎｉ
ｔｚ型ドメイン並びにそれらに関連する改変型ＵＴＩを
遺伝子工学的手法により大量に製造する報告はなく、す
なわち遺伝子工学的手法により大量に製造し得る改変型
ＵＴＩ分子は知られていなかった。

【０００４】このように現在医薬品として使用されてい
る蛋白性プロテアーゼインヒビターには、解決すべき問
題点が多数残されている。従って、生体内のプロテアー
ゼが関与する疾患の治療を可能にするためには、当該プ
ロテアーゼを阻害する有用な蛋白性プロテアーゼインヒ
ビターの大量製造法の確立、また更にプロテアーゼ阻害
活性に優れる新規物質の開発が必要である。

【０００５】本発明の目的は、優れたプロテアーゼ阻害
活性、なかんずく天然型ＵＴＩに比して強いエラスター
ゼ阻害活性を有する新規プロテアーゼインヒビター並び
にその遺伝子工学的手法による製造方法を提供すること
である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】ＵＴＩは当初、ヒト尿中
よりプロクシュ（Proksch)等の方法（Proksch G. J.
等、J. Lab.Clin. Med., 79 巻、p491-499、1972年) に
準じて分離・精製された蛋白性のプロテアーゼインヒビ
ターであり（須見等、日本生理誌、39巻、p53-58、1977
年) 、さらに Watcher, E 等の研究により図２に示す一
次構造を有することが知られている（ Watcher, E and
Hochstrasser, K., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Che
m.,362巻, p1351, 1981)。尚、図２に示すタンパクの一
次構造は、精製されたタンパクから直接求められたアミ
ノ酸配列である。

【０００７】当該ＵＴＩは、２つの構造的に関連するＫ
ｕｎｉｔｚ型ドメインから連続してなる。すなわち、図
２に示されるように、ＵＴＩにおいては、一方のＫｕｎ
ｉｔｚ型ドメイン１はＵＴＩのＮ末端側領域に位置し、
Ｎ末端から数えてアミノ酸残基２２〜７７として定義さ
れるものであり、他方のＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２はＵ
ＴＩのＣ末端側領域に位置し、Ｎ末端から数えてアミノ
酸残基７８〜１４３として定義されるものである（Hoch
strasser, K.等, Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem., 3
62, p1351, 1981) 。

【０００８】尚、ＤＮＡ組換え法（ｃＤＮＡ配列からア
ミノ酸配列を推定）によると、本発明でいうＵＴＩのＫ
ｕｎｉｔｚ型ドメイン１およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン
２はそれぞれ図３にて示されるアミノ酸配列を有するこ
とが報告されている〔J.F.Kaumeyer等，Nucl. Acids Re
s. 14(20), p7839-7850, 1986：アミノ酸番号86,87及
び138 位が精製されたタンパクから直接求められたアミ
ノ酸配列（図２）と相違する〕。本発明でいうＫｕｎｉ
ｔｚ型ドメイン１およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２と
は、実質的にこれらのドメインをそれぞれ意味する。ま
た、このＤＮＡ組換え法によれば、ＵＴＩ構造遺伝子は
４４１塩基からなり１４７アミノ酸をコードしている
が、天然型ＵＴＩにおいては１４７位のアミノ酸を末端
にもつ配列は報告されていない（Hochstrasser, K.等,
Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.,362, 1351, 198
1)。よって遺伝子工学的にＵＴＩの発現を行う場合、天
然に見られる配列にするのが望ましいと考えられること
から、本発明では、１４５位のアミノ酸をＫｕｎｉｔｚ
型ドメイン２のＣ末端アミノ酸とする。

【０００９】本発明者らは、すでにＵＴＩのｃＤＮＡを
クローニングし、ＵＴＩおよび上記各Ｋｕｎｉｔｚ型ド
メインをピキア属酵母を宿主細胞として発現、産生する
ことに成功し、それらの蛋白質を遺伝子工学的に製造す
る方法を確立している。今回、さらに天然型ＵＴＩの短
所である好中球エラスターゼ阻害活性の弱さを改善し、
より強い好中球エラスターゼ阻害活性を有する新規ポリ
ペプチドを作り出すことを目的とし、様々な検討を行っ
た。その結果、天然型ＵＴＩの一部のアミノ酸を置換し
てなる特定のアミノ酸置換型ＵＴＩ、および該アミノ酸
置換型ＵＴＩ中のドメイン１に含まれる活性部位を有す
るポリペプチドが強い好中球エラスターゼ阻害活性を有
すること、及びこれらのポリペプチドは特定のアミノ酸
配列をＮ末端に有することに起因して発現量が著しく増
加すること等を見出し、当該ポリペプチドを遺伝子工学
的に製造することに成功して本発明を完成した。

【００１０】即ち、本発明は、優れたプロテアーゼ阻害
特性を有する新規ポリペプチド、即ち少なくとも下記の
式Ｉまたは式IIで示されるアミノ酸配列を有することを
特徴とする新規プロテアーゼインヒビターに関する。

【００１１】

【化９】

【００１２】

【化１０】

【００１３】好ましくは、少なくとも上記の式Ｉまたは
式IIで示されるアミノ酸配列を有し、天然型ＵＴＩに比
して好中球エラスターゼに対する阻害活性が増強されて
なる新規プロテアーゼインヒビターである。

【００１４】更に本発明は、当該新規プロテアーゼイン
ヒビターをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、該ＤＮ
Ａを含有することを特徴とするベクターおよび該ベクタ
ーで形質転換された形質転換体に関する。また、本発明
は当該形質転換体を培養することを特徴とする本発明の
新規プロテアーゼインヒビターの製造方法に関する。

【００１５】また、本発明は、当該新規プロテアーゼイ
ンヒビターを有効成分とするエラスターゼが関与する疾
患の治療剤に関する。エラスターゼが関与する疾患とし
ては、肺障害、リウマチ、気道感染症、気道炎、肺出
血、成人呼吸困難症候群、血管透過性亢進による浮腫、
臓器障害および多臓器不全等が挙げられる。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書および図面において使用する略号（例え
ば、アミノ酸の三文字表記、一文字表記等）は、当該分
野における慣用略号に基づくものである。

【００１７】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、トリプシン、エラスターゼ等の膵酵素、好中球エラ
スターゼ等の炎症関連酵素、プラスミン、トロンビン、
ファクターＸａ、カリクレイン等の凝固線溶系酵素のう
ち少なくとも１つのプロテアーゼに対して阻害活性を有
することを特徴とする。本発明の新規プロテアーゼイン
ヒビターとして、好ましくは尿由来の天然型ＵＴＩが有
する好中球エラスターゼ阻害活性よりも強い好中球エラ
スターゼ阻害活性を有するもの、より好ましくは加えて
トリプシンに対する阻害活性をも有するものが挙げられ
る。

【００１８】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、その一次構造を規定するアミノ酸配列の少なくとも
一部として、次式（Ｉ）のアミノ酸配列を含有するもの
であれば、上記特徴を有する限り、いかなるアミノ酸配
列のポリペプチドであってもよい。

【００１９】

【化１１】

【００２０】すなわち本発明の新規プロテアーゼインヒ
ビターは、式Ｉで示されるアミノ酸配列そのもので規定
されるポリペプチドであってよいし、また式Ｉのアミノ
酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に任意の１以上の
アミノ酸が付加されたポリペプチドであってもよい。ま
た、式Ｉで示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１
１〜１３番目のアミノ酸配列Ile-Ala-Phe がVal-Ala-Me
t に置換されてなるアミノ酸配列を有するものも本発明
の新規プロテアーゼインヒビターの態様に含まれる。こ
れらのポリペプチドは、尿由来の天然型ＵＴＩに比して
好中球エラスターゼ阻害活性が極めて強いという点で有
用である。また、本発明の新規プロテアーゼインヒビタ
ーは、そのアミノ酸配列のＣ末端側領域に、次式IVで示
されるアミノ酸配列を有していてもよい。

【００２１】

【化１２】

【００２２】このようなポリペプチドは、強い好中球エ
ラスターゼ阻害活性を有するのみならず、トリプシン阻
害活性を有するという点で有用である。このようなポリ
ペプチドの例として、次式VIII、式IXのアミノ酸配列を
有するポリペプチドが挙げられる。

【００２３】

【化１３】

【００２４】

【化１４】

【００２５】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、そのＮ末端に次式Ｖ、式III 、式VIで示されるアミ
ノ酸配列を有していてもよい。

【００２６】

【化１５】

【００２７】

【化１６】

【００２８】

【化１７】

【００２９】Ｎ末端側に式III で示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドは、強い好中球エラスターゼ阻害
活性を有すると同時に、該アミノ酸配列を有することに
起因して該アミノ酸配列を持たないポリペプチドに比較
してその発現量が著しく多いため、組換えＤＮＡ技術に
よって大量に製造できるという点で有用である。このよ
うなポリペプチドの好ましい例は、次式VII のアミノ酸
配列を有するポリペプチドである。

【００３０】

【化１８】

【００３１】当該本発明の新規プロテアーゼインヒビタ
ーは、式VIII、式IX、式VII で示されるアミノ酸配列そ
のもので規定されるポリペプチドのみならず、式VIII、
式IX、式VII のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ
末端に任意の１以上のアミノ酸が付加されたポリペプチ
ドをも包含するものである。より好ましくは、式VIII、
式IX、式VII で示されるアミノ酸配列を有し、かつトリ
プシン阻害活性及び好中球エラスターゼ阻害活性を有す
るペプチドであり、その好中球エラスターゼ阻害活性が
尿由来の天然型ＵＴＩが有する当該阻害活性に比して、
顕著に増強されてなるものである。具体的には好中球エ
ラスターゼに対する阻害活性がＫｉ値で１０^-11 Ｍ以
下、より好しくはＫｉ値で１０^-12 Ｍ以下であるポリペ
プチドが例示される。

【００３２】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、極めて強い好中球エラスターゼ阻害活性を有すると
共に、組換えＤＮＡ技術を用いて大量に製造することが
できる。特に、Ｎ末端側に式III で示されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドは、発現量が極めて高いという
点で有用である。また、本発明の新規プロテアーゼイン
ヒビターは、天然型ＵＴＩと部分的に共通するアミノ酸
配列を有するため、ヒトに対して抗原性を示さないこと
が期待される。また、このようなポリペプチドは、α１
−アンチトリプシンと比べて低分子であるために組織浸
透性が高いことが期待される。さらに、本発明の新規プ
ロテアーゼインヒビターは、必要に応じてそのＮ末端お
よび／またはＣ末端に別の機能を有する他のポリペプチ
ドを融合させるなど、融合蛋白質を作製するための材料
としても有用である。

【００３３】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、糖鎖を有していてもよいし、有していなくてもよ
い。また、その取得の由来は特に制限されない。例え
ば、ペプチド合成機等を使用して化学的に合成されたも
のであってもよい。好ましくは、組換えＤＮＡ技術を使
用して作製されたポリペプチドである。より好ましくは
酵母または大腸菌を宿主とした組換えＤＮＡ技術により
産生されたポリペプチドである。当該酵母としてはピキ
ア属酵母が好ましい。また、当該ポリペプチドは、特定
の活性に実質的な低下を与えない限り、化学的な修飾
（例えば糖付加、アルキル化等）を受けていてもよい。
さらに薬理学上許容されうる酸または塩基との塩や、ポ
リエチレングリコール等のポリマーとの複合体を形成さ
せて得られる物質等も本発明の新規プロテアーゼインヒ
ビターの態様に含まれる。

【００３４】また、本発明は、上記新規プロテアーゼイ
ンヒビターをコードする塩基配列を有するＤＮＡに関す
る。当該ＤＮＡは、式Ｉで示されるアミノ酸配列、また
はそれらのアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端
に他のアミノ酸またはペプチド等（例えば式III,式Ｖ，
式VIまたは式IV等で示されるアミノ酸配列を有するも
の）を配してなるポリペプチド（例えば式II，式VIIIま
たは式VII 等で示されるアミノ酸配列を有するもの）の
アミノ酸配列に変化を生じさせない範囲であれば、いか
なる塩基配列であってもよい。

【００３５】具体的には、式Ｉで示されるポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列表配列番号１に示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡが例示される。式IIで示さ
れるポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列表
配列番号２に示される塩基配列を有するＤＮＡが例示さ
れる。また、式VIIIで示されるポリペプチドをコードす
るＤＮＡとしては、配列表配列番号３に示される塩基配
列を有するＤＮＡが、式VII で示されるポリペプチドを
コードするＤＮＡとしては、配列表配列番号４に示され
る塩基配列を有するＤＮＡが例示される。また、式III
で示されるポリペプチドをコードするＤＮＡとしては配
列表配列番号５に示される塩基配列を有するＤＮＡが、
式Ｖで示されるポリペプチドをコードするＤＮＡとして
は、配列表配列番号６に示される塩基配列を有するＤＮ
Ａが、また式IVで示されるポリペプチドをコードするＤ
ＮＡとしては、配列表配列番号７に示される塩基配列を
有するＤＮＡが、また式VIで示されるポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、配列表配列番号８に示される
塩基配列を有するＤＮＡが例示される。

【００３６】式Ｉで示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末
端から１１〜１３番目のアミノ酸配列Ile-Ala-Phe がVa
l-Ala-Met に置換されてなるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列表配列番号
１に示される塩基配列の５’末端から３１〜３９番目の
塩基が、 GTTGCTATG に置換された配列を有するＤＮＡが例示される。また、
式IIに示されるアミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５〜
１７番目のアミノ酸配列Ile-Ala-Phe がVal-Ala-Met に
置換されてなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡとしては、配列表配列番号２に示される
塩基配列の５’末端から４３〜５１番目の塩基が、 GTTGCTATG に置換された配列を有するＤＮＡが例示される。さら
に、式IXに示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡとしては、配列表配列番号３に示さ
れる塩基配列の５’末端から４３〜５１番目の塩基が、 GTTGCTATG に置換された配列を有するＤＮＡが例示される。

【００３７】また、１つのアミノ酸に対して複数のコド
ンが対応することを考慮し、本発明のＤＮＡには、それ
ぞれ配列番号１〜８に示される塩基配列のうち１以上の
塩基が他の塩基で置換された塩基配列を有するものも包
含される。また、本発明のＤＮＡは、配列表の上記配列
番号１〜４の記載から特定される塩基配列に加えてその
５’末端および／または３’末端に任意の一つ以上の塩
基が付加されたものであってもよい。付加される塩基
は、上記塩基配列に付加されることにより、付加される
側の塩基配列がコードするアミノ酸配列に変化を生じさ
せない範囲であれば、いかなる塩基、塩基配列であって
もよい。一例として、５’末端に付加される塩基配列と
しては、開始コドンである塩基配列ＡＴＧ等が例示さ
れ、また３’末端に付加される塩基配列としては、終止
コドンであるＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡ等が例示さ
れる。また、本発明のＤＮＡは、本発明の新規プロテア
ーゼインヒビターのアミノ酸配列をコードする塩基配列
の５’末端および／または３’末端に他のアミノ酸やポ
リペプチドをコードする塩基配列を有していてもよい。

【００３８】本発明のＤＮＡはいかなる方法で得られた
ものであってもよい。例えば、配列表配列番号１〜８に
示された塩基配列を参考にして化学的に合成する方法、
適当な染色体ＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリ
ー等を材料として、組換えＤＮＡの技術を用いて得る方
法がある。本発明のＤＮＡを化学合成するには、例えば
次のように行う。本発明の新規プロテアーゼインヒビタ
ーのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する所望の
ＤＮＡを設計し、必要があれば設計したＤＮＡを適当な
断片に分割して、各断片に相当するオリゴマーを全自動
ＤＮＡ合成機（例えば、３８１Ａ型、アプライドバイオ
システムズ社製）を用いて化学合成する。

【００３９】一方、組換えＤＮＡ技術を用いて本発明の
ＤＮＡを得る方法としては、適当なｃＤＮＡライブラリ
ー、染色体ＤＮＡライブラリー、または例えば式Ｉ、II
又はVII 等に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
等を材料に部位特異的突然変異法（以下、Site-directe
d mutagenesis という、Kramer. W 等、Nucleic AcidRe
s., 12 巻、p9441-9456、1984年およびKunkel, T.A.
等、Methods in Enzymology 、154 巻、p367-382、1987
年参照）やＰＣＲ法等の公知の方法で塩基配列の改変と
ＤＮＡの増幅を行う方法が例示される。

【００４０】本発明のベクターは、前述した本発明のＤ
ＮＡを含有することを特徴とする。当該ベクターは、上
記本発明のＤＮＡを含有するものであれば、その由来は
限定されない。例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵ
Ｃ１９等の各種プラスミドベクター、λｇｔ１０、λｇ
ｔ１１等のファージベクター等の適当な位置に本発明の
ＤＮＡが導入されたものが挙げられる。好ましくは、使
用する宿主細胞内で複製可能なベクターあるいは宿主染
色体に組込み可能なベクターであり、より好ましくは、
大腸菌または酵母、好ましくはピキア属酵母内で複製可
能な、もしくはそれらに組込み可能なベクターである。

【００４１】本発明のベクターは、本発明のＤＮＡに加
えて本発明の新規プロテアーゼインヒビターを宿主内で
発現させるための必要なプロモーター、ターミネータ
ー、相同領域、マーカー遺伝子や任意のリボゾーム結合
部位等の塩基配列を有することが好ましく、特に、本発
明のベクターが分泌発現用ベクターである場合には、さ
らに加えてシグナルペプチドをコードする塩基配列等を
有することが好ましい。上記プロモーター、リボゾーム
結合部位、シグナルペプチドをコードする塩基配列等
は、使用する宿主内で機能する配列であればよい。

【００４２】プロモーターとしては、ＡＯＸ１プロモー
ター（特開昭６３−３９５８４号公報）、ＤＡＳプロモ
ーター、変異型ＡＯＸ２プロモーター（特開平６−９０
７６８号公報）等を用いることができる。また、シグナ
ルペプチドとしては、酵母インベルターゼ（ＳＵＣ２）
（特開昭６０−４１４８８号公報）、α−ファクター
（特開昭５９−１９８９８０号公報のような酵母由来の
もの、ＨＳＡのシグナルペプチドまたはその誘導体（特
開平２−１６７０９５号公報）、人工的に創案したシグ
ナル配列（特開平１−２４０１９１号公報）等を用いる
ことができる。

【００４３】ターミネーターとしては、ＡＯＸ１ターミ
ネーター（特開昭６３−３９５８４号公報）等を用いる
ことができる。相同領域はＨＩＳ４（特開昭６１−１０
８３９１号公報）、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が
例示される。マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子や栄
養要求性相補遺伝子等が用いられる。抗生物質としては
シクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロラムフェニコー
ル、ブレオマイシン、ハイグロマイシン等が例示され
る。栄養要求性相補遺伝子としては、ＨＩＳ４、ＵＲＡ
３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が挙げられる。

【００４４】本発明のベクターは、簡便にはプロモータ
ー、リボゾーム結合部位、シグナルペプチドをコードす
る塩基配列等の本発明の新規プロテアーゼインヒビター
の発現や産生、好ましくは更に分泌に必要な塩基配列を
予め有するプラスミドベクターまたはファージベクター
等に、本発明のＤＮＡを常法（例えば、Molecular Clon
ing 、a laboratory manual 、Second edition、T.Mani
atis等編、Cold Spring Harbor Laboratory 、1989年）
に従って導入することにより作製することができる。ま
たは、発現に必要な塩基配列を化学的に合成し、本発明
のＤＮＡとともにプラスミドベクターまたはファージベ
クター等に導入すればよい。

【００４５】また、本発明は前述のベクターで形質転換
された形質転換体である。当該形質転換体は、塩化カル
シウム法、塩化ルビジウム法、ハナハン(Hanahan, D
著、Techniques for Transformation of E.coli. In: D
NA cloning vol 1, Glover, D.M. (ed.) p109-136、IRL
press 、1985年) 等の公知の方法に従って、適当な宿
主細胞を本発明のベクターで形質転換することにより得
られる。宿主細胞として酵母を用いる場合は、スフェロ
プラスト法（Hinnen A. 等、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 75, p1929-1933, 1978 年, Cregg J.T.等、Mol.Cel
l.Biol.5, p3376-3385, 1985 年) 、アルカリカチオン
法、（Itoh H. 等, J. Bacteriol. 153, p163-168, 198
3 年) 等の公知の方法を用いることができる。本発明の
形質転換体は、より好ましくは本発明の新規プロテアー
ゼインヒビターを産生し、かつ形質転換体外に分泌する
性質を有するものである。本発明の形質転換体が本発明
の新規プロテアーゼインヒビターを形質転換体外に分泌
させるものである場合は、導入されるベクターとしては
本発明のＤＮＡに加えてシグナルペプチドをコードする
塩基配列を有するものが好ましい。

【００４６】用いられる宿主細胞としては、本発明の新
規プロテアーゼインヒビターの発現・産生に適したもの
であれば、酵母等に代表される真核生物細胞であっても
大腸菌、枯草菌等に代表される原核生物細胞であっても
よい。好ましくは、大腸菌および酵母であり、より好ま
しくはピキア属酵母である。

【００４７】また本発明は、前述の形質転換体を培養
し、本発明の新規プロテアーゼインヒビターを産生さ
せ、得られる培養物から該プロテアーゼインヒビターを
採取することを特徴とする本発明の新規プロテアーゼイ
ンヒビターの製造方法である。当該製造方法は、下記
（ａ）〜（ｃ）の工程を行うことを特徴とする。 （ａ）本発明の新規プロテアーゼインヒビターのアミノ
酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを得る。 （ｂ）（ａ）で得られたＤＮＡを含有するベクターで宿
主細胞を形質転換させて形質転換体を得る。 （ｃ）該形質転換体を培養して、得られる培養物から本
発明の新規プロテアーゼインヒビターを採取する。

【００４８】形質転換体の培養は、微生物または動物細
胞を培養するのに用いられる一般的方法、すなわち「生
物化学工学」（合葉修一等著、１９７６年、東京大学出
版会）あるいは「組織培養」（中井準之助等編、１９７
６年、朝倉書店）などに記載された方法に準じて行うこ
とができる。形質転換体がピキア属酵母である場合は、
例えば特開平６−２２７８４号公報に記載された方法に
準ずることができる。

【００４９】具体的には、培地としては０．０１〜８％
メタノール含有ＹＮＢ液体番地〔０．７％ Yeast Nitro
gen Base w/o Amino Acids ( Difco社) 〕および０．０
１〜８％メタノール含有ＹＰ培地〔１％ Yeast Extract
（ Difco社）、２％ Peptone( Difco社）〕等が例示さ
れる。また、培養は、通常１５〜４３℃、好ましくは２
０〜３０℃で、２０〜３６０時間程度行い、必要により
通気や攪拌を加えることもできる。

【００５０】つづいて、当該培養物から、形質転換体に
よって産生された目的の蛋白質を採取する。産生された
蛋白質が形質転換体の体外に分泌されない場合は該形質
転換体から、分泌される場合はその培養上清から単離す
ることが好ましい。培養物から、目的の蛋白質を採取す
る方法は、通常蛋白質の精製に使用されている手段、例
えば「生化学実験講座１、タンパク質の化学」（日本生
化学会編、１９７６年、東京化学同人）等の多くの文献
等に記載されている方法を参照して実施することができ
る。

【００５１】得られた蛋白質は必要に応じてさらに精製
することもできる。精製方法としては、塩析法、限外濾
過膜法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、
吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー
等各種クロマトグラフィーなどが例示される。

【００５２】また、本発明は、プロテアーゼ阻害活性を
有するポリペプチドを、形質転換体で大量に発現させる
ための発現増強方法に関する。本発明者等は、上述した
ように、Ｎ末端側に式III で示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドは、Ｎ末端側に式III に示されるアミ
ノ酸配列をもたないポリペプチドよりも、酵母による発
現量が著しく多いことを見出した。従って、式Ｉ、式I
I、または式VIIIで示されるアミノ酸配列を有する本発
明の新規プロテアーゼインヒビター（これらの式中のア
ミノ酸配列Ile-Ala-Phe がVal-Ala-Met に置換されたポ
リペプチド、例えば、式IXで示されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドも含む）のＮ末端側に式III で示され
るアミノ酸配列を結合させて、該ポリペプチドを、Ｎ末
端側に式III で示されるアミノ酸配列が付加された形で
発現させることにより、該新規プロテアーゼインヒビタ
ーを多量に得ることができる。すなわち、該新規プロテ
アーゼインヒビターをコードする塩基配列の５’末端側
に、式III で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配
列を結合したベクターを作成し、このベクターを用いる
ことによって、該新規プロテアーゼインヒビターの形質
転換体における発現が増強され、多量のプロテアーゼイ
ンヒビターを得ることができる。プロテアーゼ阻害活性
部位を含むアミノ酸配列と式III のアミノ酸配列との間
に、１以上のアミノ酸が配される構成としてもよい。

【００５３】

【発明の効果】本発明は、一以上のプロテアーゼ阻害活
性を有し、かつ天然型ＵＴＩよりエラスターゼ阻害活性
の優れた有用な新規ポリペプチド、好ましくは優れたエ
ラスターゼ阻害活性を有し、かつ遺伝子工学的手法にお
いて発現量の高い有用な新規ポリペプチド、およびその
遺伝子工学的手法による該ポリペプチドの製造方法を提
供する。

【００５４】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、極めて強いエラスターゼ阻害活性を有すると共に、
組換えＤＮＡ技術を用いて大量に製造することができ
る。特に、Ｎ末端側に式III で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドは、発現量が極めて高いという点で
有用である。

【００５５】また、本発明の新規プロテアーゼインヒビ
ターは、天然型ＵＴＩと部分的に共通するアミノ酸配列
を有するために、ヒトに対して抗原性を示さないことが
期待できる。さらに、必要に応じてそのＮ末端および／
またはＣ末端に別の機能を有する他のポリペプチドを融
合させるなど、融合蛋白質を作製するための材料として
も有用である。本発明のプロテアーゼインヒビターの発
現増強方法によれば、プロテアーゼ阻害活性を有するポ
リペプチドの酵母による発現量を著しく増加させること
が可能である。

【００５６】本発明の新規プロテアーゼインヒビター
は、優れたエラスターゼ阻害活性、特に好中球エラスタ
ーゼ阻害活性を有することから、当該エラスターゼが関
与する疾患、例えば、肺障害（急性肺障害等）、リウマ
チ（慢性関節リウマチ等）、気道感染症（慢性気道感染
症等）、気道炎（慢性気道炎等）、肺出血、ＡＲＤＳ
（成人呼吸困難症候群）、血管透過性亢進による浮腫、
臓器障害、多臓器不全等の予防または治療に極めて有用
である。また、ＵＴＩが本来有するトリプシン阻害作用
等を併せもつことから、ＵＴＩの公知用途への適用も可
能である。例えば、膵炎、循環不全、ショック、腎障
害、浮腫、潰瘍性大腸炎等の予防または治療にも適用で
きる。投与方法としては、静脈内投与、点滴静注、気道
内投与等が例示される。投与量としては、０．０１ｍｇ
／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重程度が例示される
が、患者の体重、性別、症状等に応じて適宜変えること
ができる。製剤化は公知の手法により行うことができ
る。すなわち、各種添加剤（安定化剤、賦形剤等）の添
加、加熱処理、除菌濾過、小分け分注、凍結乾燥等の処
理を施すことができる。

【００５７】

【実施例】以下、本発明をより一層明確にするために実
施例をもって説明する。しかしこれらは、本発明の一態
様であり、これらにより本発明はなんら限定されるもの
ではない。また、以下に示す実施例中の諸操作は、下記
の雑誌、成書を参考として実施した。

【００５８】１．ラボマニュアル遺伝子工学、村松正實
著、1989年、丸善株式会社 ２．遺伝子操作実験法、高木康敬編著、1980年、講談社 ３．遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著、1982年、講
談社 ４．Molecular Cloning, a laboratory manual、Second
edition, T. Maniatis等編、1989年、コールドスプリ
ングハーバー・ラボラトリー ５．Methods in Enzymology 、65巻、L. Grossman 等
編、1980年、Academic Press ６．Methods in Enzymology 、68巻、R. Wu 編、1979
年、Academic Press

【００５９】実施例１ プロテアーゼインヒビター（Ｅ
ｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５）の作成 式VIIIに示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼインヒ
ビター〔ＵＴＩ（d21,K22R,E23P,S25F,M36I,G37A,M38F,
T39F,S40P,E52Q,Q55V)、以下Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ
−５２−５５という。図１の（２）〕を作成した。な
お、アミノ酸番号は図２および図３に示したＵＴＩのＮ
末端を１とした時の番号で示した。

【００６０】（１）Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−
５５遺伝子のカセット化 （ａ）ＵＴＩのｃＤＮＡのクローニング （i ）プローブの調製 J.F.Kaumeyer等により報告されたUTIcDNA の塩基配列
（J.F.Kaumeyer等，Nucl. Acids Res. 14(20),p7839-78
50, 1986) のうち、2 つのインヒビタードメインをコー
ドする領域に注目し、40塩基前後の長さでGC含量が50%
以上になるようプローブ１およびプローブ２を設計し
た。各プローブの領域を下記に示す。塩基番号は上記J.
F.Kaumeyer等の報告に従った。

【００６１】 796 837 ・プローブ１ GGTACATCCA TGGCCTGTGA GACTTTCCAG TACGGCGGCT GC 1048 1089 ・プローブ２ GAGTACTGCG GTGTCCCTGG TGATGGTGAT GAGGAGCTGC TG

【００６２】この配列を基にして０．２μＭ ＦＯＤカ
ラム（アプライドバイオシステムズ・ジャパン社製）を
用いて、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機（モデル３
９２、アプライドバイオシステムズ・ジャパン社製）で
合成した。合成されたオリゴヌクレオチドを、OPC カー
トリッジ（アプライドバイオシステムズ・ジャパン社
製）を用いて精製したものを7M尿素10% アクリルアミド
変性ゲルで泳動した結果、両プローブとも単一のバンド
が見られた。これらのオリゴヌクレオチドをγ- ³²P AT
P で末端標識した。標識は、100ngのオリゴヌクレオチ
ドと4.6MBqのγ- ³²P ATP を混合し（モル比で1:5)、T4
poly nucleotide kinase （宝酒造製) を用いて常法に
従って反応させることにより行った。

【００６３】（ii）スクリーニング 一次スクリーニング ヒト肝由来ｃＤＮＡλｇｔ１０ライブラリー（クローン
テック社製）のファージ液を4.2 ×10⁵ pfu/mlとなるよ
うにＳＭ緩衝液（100mM NaCl,10mM MgSO₄,50mMTris-HCl
(pH7.5), 0.001% ゼラチン) で希釈し、その100 μl
と希釈指示菌液とを混合した後、混合液をTB10 bottom
agarプレート（1.5% ager/TB10培地、φ15cm) に重層
し、37℃で約7 時間インキュベートした。

【００６４】なお、希釈指示菌液は次のようにして調製
した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００ｈｆｌ株を５ｍｌＬ培地
に植菌し、３７℃で９時間培養した。これを２Ｌコルベ
ンに分注した５００ｍｌ ＴＢ１０培地に全量植菌し、
３７℃で一晩培養した。培養液の６００ｎｍにおける濁
度を測定した後集菌し、得られた菌体を１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ₄ 水溶液で洗浄後２５ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄
水溶液に懸濁し（濁度ＯＤ₆₀₀ ＝３１．２）、さらに１
０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 水溶液でＯＤ₆₀₀ ＝２に希釈して使
用した。

【００６５】プラークが確認できるようになった時点で
培養を止め、マスタープレートとして4 ℃に保存した。
マスタープレート当たり2 枚のメンブレン（colony/pla
quescreen, デュポン社製）を調製した。得られたメン
ブレンをTB10 bottom agarプレート上で37℃一晩インキ
ュベートし、ファージの増幅を行った。これらのメンブ
レンを0.5N水酸化ナトリウム水溶液に5 分間浸たし、ア
ルカリ変性処理した。同様の操作を繰り返した後、濾紙
で菌体残渣を除去した。その後、1M Tris-HCl緩衝液(pH
7.5) に浸して中和し、2 ×SSC 緩衝液でリンスした。
これらを濾紙上で風乾した後、プレハイブリダイゼーシ
ョン溶液(2×SSC,2% SDS,5×Denhardt'ssoln., 500μg/
ml yeast tRNA)中で60℃4 時間インキュベートした。プ
レハイブリダイゼーション後、メンブレンを新たなバッ
グに移し換え、各プローブのハイブリダイゼーション溶
液（2 ×SSC,2% SDS,5×Denhardt's soln.,100 μg/ml
yeast tRNA , 末端標識された各プローブを含む溶液を
加熱急冷処理したもの) を加えた後、40℃一晩ハイブリ
ダイゼーションした。その後、メンブレンを2 ×SSC-2%
SDS水溶液で室温20分間,2×SSC-2% SDS水溶液で52℃20
分間, さらに1 ×SSC-2% SDS水溶液で45℃40分間洗浄し
た後、各メンブレンをサランラップ（登録商標）で被
い、−８０℃で一晩感光した。シグナルを確認した結
果、各メンブレンとも30〜40の特異的シグナルがあり、
全体で約400 個のシグナルが得られた。また、ほとんど
がプローブ1 及び2 で一致していた。

【００６６】二次スクリーニング 一次スクリーニングに使用したマスタープレートからプ
ローブ1 及び2 でシグナルが一致した10スポットのtop
agarose を剥がし取り、0.5ml ＳＭ緩衝液に入れ細かく
砕いた後、クロロホルムを1 滴を加え4 ℃に2.5 時間放
置してファージの溶出をおこなった。ファージ溶出液の
濃度を1 ×10⁷ pfu/mlと仮定して、ＳＭ緩衝液で5 ×10
³ , 1 ×10³ , 5 ×10² pfu/mlの3 段階に希釈した。こ
れらファージ希釈液100 μl と希釈指示菌液100 μl を
混合し、37℃20分間インキュベートした。3ml TB10 top
agaroseを加え、予め37℃に保温しておいたTB10 botto
magarプレート（φ9cm)に重層し、37℃一晩インキュベ
ートしたところ、5 ×10²pfu/mlに設定した希釈系でも1
0^3-4 pfu/mlのプラークが観察された。従って、次のメ
ンブレンの調製には、主に5 ×10² pfu/mlに設定した系
を使用した。

【００６７】一次スクリーニングと同様に、メンブレン
上で37℃6 時間ファージの増幅をおこない、4 ℃に保存
した。メンブレンをアルカリ変性, 中和処理, 及び2 ×
SSCリンスした後、プレハイブリダイゼーション溶液(2
×SSC,2% SDS,5×Denhardt'ssoln., 100 μg/ml yeast
tRNA)中で60℃6 時間インキュベートした。プレハイブ
リダイゼーション後、プローブ２を用いて一次スクリー
ニングと同様にハイブリダイゼーションした。各メンブ
レンを１×SSC-2% SDS水溶液で室温10分間の条件にて、
２回洗浄した。その後、各メンブレンをサランラップ
（登録商標）で被い、室温で6 時間感光した。これを現
像した結果、シグナルの観察されたスポットについて三
次スクリーニングに供した。

【００６８】三次スクリーニング 二次スクリーニングに使用した各マスタープレートから
シグナルに相当するプラークを爪楊枝で指示菌プレート
(100μl 希釈指示菌液と3ml TB10 top agaroseを混合
し、予め37℃に保温しておいたTB10 bottom agarプレー
トに重層したものに植菌した。これを37℃一晩インキュ
ベートした。メンブレン上で37℃3 時間ファージの増幅
をおこない、アルカリ変性, 中和処理, 及び2 ×SSC リ
ンスをおこなった後、プレハイブリダイゼーション溶液
を加え、６０℃で２．５時間インキュベートした。プレ
ハイブリダイゼーション後、プローブ１を用いて一次ス
クリーニングと同様にハイブリダイゼーションした。1
×SSC-2% SDS水溶液で室温10分間の洗浄後、各メンブレ
ンをサランラップ（登録商標）で被い、室温で6 時間、
増感用スクリーンを用いて感光した。現像の結果、純化
したと考えられるファージクローンを各スポットあたり
1 〜5 株得ることが出来た。

【００６９】サブクローニング 得られたファージクローン16株からファージDNA を調製
し、制限酵素EcoRI 消化後1%アガロースゲル電気泳動し
てインサートの確認をおこなった。ほとんどのファージ
クローンに0.5 〜2kb の大きさをもつインサートがひと
つないし二つ認められた。更に、プローブ２を用いたサ
ザンハイブリダイゼーションを行い、文献（J. F. Kaum
eyer等, Nucl. Acids Res. 14(20),p7839-7850, 1986）
に報告されている1.2 〜1.3kb のインサートをもつ6 ク
ローンからcDNAを切り出し、pUC19 のEcoRI 部位にサブ
クローニングした。制限酵素マッピングをおこない、得
られたプラスミドDNA を用いて塩基配列の確認をおこな
った。

【００７０】塩基配列の確認 [α-32p]dCTP を用いたダイデオキシ法によって塩基配
列を確認した。具体的にはSequenase ver.2(ファルマシ
ア製) および7-DEAZA Sequenceing kit ver.2（宝酒造
社製) を用いて、そのプロトコールに従って行った。そ
の結果、得られたUTIcDNA の塩基配列は、Kaumyer らの
報告している配列（J.F.Kaumeyer等, Nucl. Acids Res.
14(20), p7844-7845,1986）と全く同じであった（図４
〜図８）。以下、得られたサブクローニング株のうち、
ＵＴＩｃＤＮＡの全塩基配列が確認されたＮｏ．７株を
用いて操作を行った。

【００７１】（iii ）ＵＴＩｃＤＮＡのカセット化 上記(ii)で得られたUTIcDNA の塩基配列を検討したとこ
ろ、図４〜図８に示す塩基配列の塩基番号 660位のＧを
Ｃに置換することで新たに制限酵素Aoro51HIサイトが生
じることが判明した（塩基番号はKaumyer らの報告に従
った) 。Aoro51HIサイトが生じたことによって天然型UT
I のＮ末端に相当する部分で遺伝子を開裂でき、今後の
発現系構築において非常に有効であると考えられた。ま
た、UTI構造遺伝子は441 塩基からなり147 アミノ酸を
コードしている。一方、天然型UTI のＣ末端アミノ酸は
主にLeu143であり、Arg144またはPhe145をもつ配列の存
在も報告されているが (Hochstrasse K.等, Hoppe-Seyl
er's Z. Phisiol. Chem.365, p1123-1230, 1984)、Asn1
47をＣ末端にもつ配列は報告されていない。従って遺伝
子工学的にUTI の発現をおこなう場合、天然に見られる
配列にするのが望ましいと考えられることから、Phe145
をＣ末端アミノ酸にすることにした。以上の点に考慮し
てUTIcDNA のカセット化を行った。

【００７２】上記の改変に対応したＵＴＩ遺伝子の５’
末端および３’末端領域の合成ＤＮＡ（図９）をDNA 合
成機 (アプライドバイオシステムズ・ジャパン社製、 m
odel392) で作成した。合成DNA はアニール後両端が各
制限酵素接着末端になるように設計し、またＣ末端をコ
ードする領域に対応した合成DNA は、Ｃ末端の２アミノ
酸に対応した６塩基の欠失ならびに操作上の点から3'非
翻訳領域中の21塩基を欠失した配列にした。一方、サブ
クローニング株No.7のプラスミド♯７に含有されるＵＴ
ＩｃＤＮＡの塩基番号504 位にてBbeIで消化し平滑末端
に修復した後、更にEcoRI 消化して得られたUTIcDNA を
含むDNA 断片をpUC19 のSmaI-EcoRI領域にサブクローニ
ングした(#7/BbeI-ERI、図１０) 。この#7/BbeI-ERI を
もとに各合成DNA の組込みをおこなった。

【００７３】Ｎ末端をコードする領域（以下、Ｎ末コー
ド領域という）の置換をおこなうために、#7/BbeI-ERI
をBamHI およびEcoRI で消化し、UTIcDNA を含むDNA 断
片を回収した。これをＵＴＩｃＤＮＡの塩基番号686 位
のSau3AIで消化してSau3AI-EcoRI断片を回収した。ま
た、#7/BbeI-ERI をＵＴＩｃＤＮＡの塩基番号645 位の
AvaIおよびEcoRI で消化してベクター部分を回収した。
得られた両DNA 断片及び合成DNA を連結し、Ｎ末コード
領域が改変されたクローンpUTI-Nを得た（図１１）。Ｃ
末端をコードする領域（以下、Ｃ末コード領域という）
の置換をおこなうために、#7/BbeI-ERI をＵＴＩｃＤＮ
Ａの塩基番号877 位のPstIおよびEcoRI で消化してUTIc
DNA の後半部分を含むDNA 断片を回収した。これをＵＴ
ＩｃＤＮＡの塩基番号1089位のHhaIで消化してPstI-Hha
I 断片を回収した。また、#7/BbeI-ERI をPstIおよび塩
基番号1146位のSmaIで消化してベクター部分を回収し
た。得られた両DNA 断片及び合成DNA を連結し、Ｃ末コ
ード領域が改変されたクローンpUTI-Cを得た（図１
２）。次に、pUTI-NをPstI消化してpUC19 由来のPstIサ
イトとＵＴＩｃＤＮＡの塩基番号877 位のPstIサイトの
間のDNA 断片を回収した。これをpUTI-CのPstIサイトに
連結し、Ｎ末コード領域及びＣ末コード領域が改変され
たクローンpUTI N-Cを作成した（図１３) 。このプラス
ミドをAor51HI-SmaI消化することにより3'非翻訳領域の
ポリＡ配列が除去されたUTIcDNA を得ることができる。

【００７４】（ｂ）ピキア属酵母でのＵＴＩ発現プラス
ミドｐＨＨ３１０の作成（図１５） ピキア属酵母の発現用プラスミドであるｐＡＯ８０７Ｎ
（特開平２−１０４２９０号公報）は、クローニングサ
イトにＥｃｏＲＩ部位を持つ。これに対応させるため、
カセット化されたＵＴＩｃＤＮＡを担持するプラスミド
ｐＵＴＩ Ｎ−ＣをＳｍａＩ消化してＣＩＰ（calf int
estine alkaline phosphatase 、宝酒造社製）処理し、
ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造社製）を連結し、これでコ
ンピテントセルＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を常法により形
質転換してプラスミドｐＵＴＩＮ−Ｃ／ＥＲＩを作成し
た（図１４）。このプラスミドをＡｏｒ５１ＨＩおよび
ＥｃｏＲＩで消化することにより３’非翻訳領域のポリ
Ａ配列が除去されたＵＴＩｃＤＮＡを得ることが出来
る。

【００７５】ＵＴＩの発現系構築用に調製した酵母ＳＵ
Ｃ２シグナルペプチドに対応したＤＮＡ（Chang C. N.
等, Mol. Cell. Biol 6, p1812-1819, 1986）をアニー
リングした後、Ｔ４ｋｉｎａｓｅを用いてリン酸化し
た。このＤＮＡはその５’末端がＥｃｏＲＩ連結末端
に、３’末端が平滑末端になるように設計されており、
またピキア属酵母のcodon usage に従って一部の塩基配
列が改変されている（図１６参照）。次に、ｐＵＴＩ
Ｎ−Ｃ／ＥＲＩをＡｏｒ５１ＨＩ及びＥｃｏＲＩ消化
し、ＵＴＩ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を回
収した。因に、このＤＮＡ断片は、５’の末端が天然型
ＵＴＩのＮ末に対応し、ＳＵＣ２シグナルと直接連結で
きる。また、このＤＮＡ断片は、図９に示す改変に加え
て３’非翻訳領域のポリＡ配列が除去されている。以上
５’末端にＥｃｏＲＩ接合部位を有するように調製した
合成ＳＵＣ２シグナル遺伝子、ｐＵＴＩ Ｎ−Ｃ／ＥＲ
ＩをＡｏｒ５１ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られ
た約０．４ｋｂのＤＮＡ断片、ならびにＥｃｏＲＩ消化
ｐＡＯ８０７Ｎの３つのＤＮＡ断片を混合し、連結した
後、先と同様にコンピテントセルE.coliＨＢ１０１を形
質転換した。得られた形質転換体から常法によりプラス
ミドＤＮＡを調製し、制限酵素処理並びにＡＯＸ１プロ
モーター・ＳＵＣ２シグナル・ＵＴＩ遺伝子の連結領
域、及びＵＴＩ遺伝子・ＡＯＸ１ターミネーターの連結
領域の塩基配列を確認し、ピキア属酵母の発現ベクター
である当該プラスミドをｐＨＨ３１０と命名した（図１
５）。

【００７６】（ｃ）Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１およびＫ
ｕｎｉｔｚ型ドメイン２の遺伝子のカセット化 ＵＴＩを構成する２つのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン（図
３）各々をコードする遺伝子のカセット化をおこなっ
た。なお、本実施例においてＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１
は、本来のＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＮ末端に２１ア
ミノ酸からなるＵＴＩのＮ末ペプチドが付加されたポリ
ペプチド、すなわちＡｌａ１〜Ａｒｇ７７からなるポリ
ペプチド（以下、Ｎ末ペプチド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ドメ
イン１という）をコードする遺伝子を発現するようにカ
セット化した。

【００７７】（i ）合成ＤＮＡの調製 Ｎ末ペプチド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１、Ｋｕｎｉ
ｔｚ型ドメイン２各々の遺伝子をカセット化するため
に、まずＮ末ペプチド付加ドメイン１のＣ末コード領域
を補う合成ＤＮＡ（図１７）およびＫｕｎｉｔｚ型ドメ
イン２のＮ末コード領域を補う合成ＤＮＡ（図１８）を
調製した。Ｎ末ペプチド付加ドメイン１のＣ末コード領
域合成ＤＮＡの設計は、５’にＰｓｔＩ接合末端、３’
にＥｃｏＲＩ接合末端を持ち、途中に停止コドンを設け
た構造とした。Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン２のＮ末コード
領域合成ＤＮＡは、ＳＵＣ２シグナルと連結する５’を
平滑末端、３’にＡｐａＩ接合末端を持つ構造にした。
また、１塩基置換によりアミノ酸の変化なしに配列中に
制限酵素ＳｐｈＩ部位が創製されることから、ＵＴＩｃ
ＤＮＡの塩基番号９０２（図７参照）のＣをＡに変更し
た。この新たに設けたＳｐｈＩ部位は、Ｋｕｎｉｔｚ型
ドメイン１とＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２との再連結やＫ
ｕｎｉｔｚ型ドメイン２のＮ末コード領域を改変する場
合に有効である。これらの合成は、図１７および図１８
に記載の配列に基づいて、ＤＮＡ合成機（アプライドバ
イオシステムズ・ジャパン製、モデル３９２）で行っ
た。

【００７８】（ii）Ｎ末ペプチド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ド
メイン１遺伝子のカセット化（Ｎ末ペプチド付加Ｋｕｎ
ｉｔｚ型ドメイン１：ＵＴＩｃＤＮＡの塩基番号６６１
〜８９１、図４乃至図８参照） 上記（ｂ）で構築したｐＨＨ３１０を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｓｔＩ消化し、〔ＳＵＣ２シグナル＋Ｎ末ペプ
チド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１構造遺伝子〕を含む
断片を切り出した。これを図１７に示すＮ末ペプチド付
加Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＣ末コード領域に対応し
た合成ＤＮＡと共にｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に連結
し、分泌型Ｎ末ペプチド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１
遺伝子ユニット（図１９参照）を担持したプラスミドｐ
ＨＨ３０５を作成した（図２０）。

【００７９】（iii ）Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン２の遺伝
子のカセット化（Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン２：ＵＴＩｃ
ＤＮＡの塩基番号８９２〜１０９５、図４乃至図８参
照） 上記（ｂ）で構築したｐＵＴＩ Ｎ−Ｃ／ＥＲＩを制限
酵素ＡｐａＩ及びＥｃｏＲＩ消化し、Ｋｕｎｉｔｚ型ド
メイン２構造遺伝子ＤＮＡ断片を得た。これと図１8 に
示すＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２のＮ末コード領域に対応
した合成ＤＮＡならびに合成ＳＵＣ２シグナル遺伝子
（図１６）とをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に連結し、
分泌型Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン２遺伝子ユニット（図１
９参照）を担持したプラスミドｐＨＨ３０６を作成した
（図２２）。

【００８０】（ｄ）改変型ＵＴＩ（Ｅｐ１−ＵＴＩ）の
作成 （i ）Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１遺伝子の改変 ＵＴＩのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１のアミノ酸配列の一
部を改変した改変型ＵＴＩを作製した。改変は、Ｋｕｎ
ｉｔｚ型ドメイン１の活性部位を含む領域（Met-Gly-Me
t-Thr-Ser)を(Ile-Ala-Phe-Phe-Pro) に置換することに
よって行った。置換は、U.S.E.mutagenesis kit （ファ
ルマシア社製）を用いたsite directed mutagenesis 法
により行った。特に述べる以外はキットに添付されたプ
ロトコールに従って操作した。上記（ｃ）で作成したpH
H305上に含まれるＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１遺伝子はpU
C19 のlacZ遺伝子の転写方向と逆向きに挿入されてい
る。そこで、mutagenicprimerはキットのselection pri
merと同一鎖上に存在するように設計した。mutagenic p
rimerの配列を図２４に示す。調製したmutagenic prime
rの５’末端をT4kinaseでリン酸化し、キットのプロト
コールに従ってsite directed mutagenesis をおこなっ
た。なお、selection primerとしてSspI/StuI selectio
n primer（ファルマシア社製）を用いた。得られたクロ
ーンについて塩基配列を確認し、目的の改変が導入され
たＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１遺伝子を担持したプラスミ
ドをpTK325とした。

【００８１】（ii）Ｅｐ１−ＵＴＩ遺伝子のカセット化 得られたpTK325をEcoRI およびPstIで消化して３’領域
を欠いたＮ末ペプチド付加改変Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン
１遺伝子断片を回収した。次にpHH306をSphIおよびEcoR
I で消化して５’領域を欠いたＫｕｎｉｔｚ型ドメイン
２遺伝子断片を回収した。そしてＫｕｎｉｔｚ型ドメイ
ン１上のPstIサイトからＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２上の
SphIサイト間に相当する合成ＤＮＡを調製した（図２
５）。これら３者とEcoRI 消化したpUC19 とを連結し、
目的の改変UTI 遺伝子（Ep1-UTI 遺伝子）を担持したpT
K332を得た。図２６にＥｐ１−ＵＴＩ遺伝子の塩基配列
ならびにそれから推定されるアミノ酸配列（一文字表
記）を示した。

【００８２】上述のように構築されたＳＵＣシグナル遺
伝子／Ｅｐ１−ＵＴＩ遺伝子からなる分泌発現用にカセ
ット化されたＥｐ１−ＵＴＩ遺伝子を担持したｐＴＫ３
３２をもとに、ＵＴＩのＮ末２１アミノ酸を欠失しかつ
Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＮ末４アミノ酸（２２〜２
５位に相当）のうち３アミノ酸についてK22R,E23P,S25F
の置換が施された分泌発現用Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ
遺伝子のカセット化をおこなった。

【００８３】ｐＴＫ３３２をＳＵＣ２シグナル内にある
制限酵素サイトＨｉｎｄIII とＵＴＩドメイン１内にあ
るＥｃｏ５２Ｉで消化し、ＳＵＣ２シグナルの大部分と
ＵＴＩのＮ末アミノ酸およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１
のＮ末コード領域を欠いたＵＴＩ遺伝子を担持するベク
ターＤＮＡのＨｉｎｄIII −Ｅｃｏ５２Ｉ断片を回収し
た。次に、ＳＵＣ２シグナルＨｉｎｄIII サイトより
３’末側の領域ならびにＵＴＩＫｕｎｉｔｚ型ドメイン
１のＮ末端対応部からＥｃｏ５２Ｉまでの領域について
合成ＤＮＡを調製した（図２７）。その際、ＳＵＣ２シ
グナルのＣコード領域については塩基置換によりアミノ
酸変化なしにＥｃｏＲＶサイトが新たに設けられるよう
に設計し、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＮ末コード領域
に関しては先に示したアミノ酸置換を含み、且つ本来あ
ったＰｖｕIIサイトの変わりにＨｉｎｃIIサイトが出来
るように設計した（図３０）。これらを連結し、分泌発
現用Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ遺伝子を担持したプラス
ミドＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ／ｐＵＣを作成した（図
２８）。

【００８４】このＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ／ｐＵＣを
もとに５２位と５５位のアミノ酸についてE52Q,Q55V の
置換をおこなった。即ち、Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ／
ｐＵＣをＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１内にある制限酵素サ
イトＮｃｏＩとＰｓｔＩとで消化し、ＵＴＩの４８〜７
４位のアミノ酸に相当する領域を欠いたＤＮＡ断片を回
収した。次に、先に示したE52Q,Q55V のアミノ酸置換を
含むドメイン１のＮｃｏＩサイトとＰｓｔＩサイト間に
相当する領域の合成ＤＮＡを調製した（図２９）。その
際、塩基置換によりアミノ酸変化なしにＵＴＩの５８位
〜６０位のアミノ酸をコードする領域にＥｃｏＴ２２Ｉ
サイトが新たに設けられるように設計した。これらを連
結して分泌発現用Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５
５遺伝子（図３０）を担持したプラスミドｐＨＨ３３７
を作成した（図３１）。

【００８５】(２) ピキア属酵母発現プラスミドの作成 ｐＨＨ３３７をＥｃｏＲＩ消化し、得られた分泌発現用
Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子をピキア
属酵母の発現用プラスミドｐＡＯ８０７ＮのＥｃｏＲＩ
サイトに連結し、Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５
５発現プラスミドｐＨＨ３４０を作成した（図３２）。

【００８６】（３）発現株の作成および性状 ｐＨＨ３４０を選択マーカーであるＨＩＳ４上の制限酵
素ＳｔｕＩサイトで線状化した後、ピキア属酵母 Pichi
a pastoris ＧＴＳ１１５株のｈｉｓ４遺伝子座を標的
にスフェロプラスト法(Cregg J. T.等， Mol. Cell. Bi
o1. 5, p3376-3385, 1985 ）に従った挿入型組み込みに
より形質転換をおこなった。得られた形質転換体を２ｍ
ｌＹＮＢ培地（0.7% Yeast Nitrogen Base, 2% dextros
e ）に植菌し、３０℃で２日間培養した。これを２ｍｌ
３×ＹＰ−２％グリセロ─ル培地（3% Yeast Extrac
t, 6% Peptone, 2% glycerol ）に１０％植菌し、３０
℃で２日間培養後、終濃度４％になるようにメタノール
を添加し、さらに３０℃で５日間培養した。

【００８７】培養液を遠心し（10000rpm，５分，４
℃）、得られた培養上清中のＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ
−５２−５５発現量を抗ｒＵＴＩ抗体（後述の参考例１
に示す）によるＥＬＩＳＡ法で測定した。なお、発色酵
素にワサビペルオキシダーゼアビジンＤ（VECTOR LABOR
ATORIES 社製）、発色基質にペルオキシダーゼ用発色キ
ットＯ（住友ベークライト社製）を供給元の推奨に従っ
て使用した。一般的な手順は成書にしたがった。測定は
タイターテックマルチスキャンＭＣＣ／３４０ ＭＫII
（Flow Laboratories 社製）でおこない、デ─タの解析
にはΔＳＯＦＴ（Vers.2.12F, BioMetallics社製）を用
いた。その結果０．７ｍ／Ｌの発現が認められた。ま
た、得られた培養上清について、後述の参考例２および
参考例３に記載の方法に準じてトリプシン阻害活性およ
び好中球エラスターゼ阻害活性を測定した。その結果、
該培養上清はトリプシン阻害活性を示すと共に、顕著に
強い好中球エラスターゼ阻害活性を示した。

【００８８】実施例２ プロテアーゼインヒビター（Ｅ
ｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５）の作成 式VII に示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼインヒ
ビター〔ＵＴＩ（K22R,E23P,S25F,M36I,G37A,M38F,T39
F,S40P,E52Q,Q55V)、以下、Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ
−５２−５５という。図１の(4) 〕を作成した。なお、
アミノ酸番号は図３に示したＵＴＩのＮ末端を１とした
ときの番号で示した。

【００８９】（１）Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−
５５遺伝子のカセット化 実施例１の（１）（ｄ）で得られたｐＨＨ３３７をＥｃ
ｏＲＶとＨｉｎｃIIで消化し、ＳＵＣ２シグナルのＣ末
コード領域からＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＮ末コード
領域を欠いたＵＴＩ遺伝子を担持するベクターＤＮＡの
ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃII断片を回収した。次に、ＳＵＣ
２シグナル内のＥｃｏＲＶサイトからＵＴＩのＮ末２１
アミノ酸を含みＫｕｉｔｚ型ドメイン１内のＨｉｎｃII
サイトまでの領域に相当する合成ＤＮＡ（図３３）を調
製した。その際、ＵＴＩのＮ末ペプチド領域に、塩基置
換によりアミノ酸変化なしにＢａｌＩサイトとＢｓｔＥ
IIサイトを設けることができた。これらを連結して分泌
発現用Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子
（図３４）を担持したプラスミドｐＨＨ３５４を作成し
た（図３５）。

【００９０】（２）発現株の作成および性状 ｐＨＨ３５４をＥｃｏＲＩ消化し、得られた分泌発現用
Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子をピキア
属酵母の発現用プラスミドｐＡＯ８０７ＮのＥｃｏＲＩ
サイトに連結し、ピキア属酵母でのＥｐ１−ＵＴＩ−Ｒ
ＰＤＦ−５２−５５発現プラスミドｐＨＨ３５５を作成
した（図３６）。ｐＨＨ３５５を選択マーカーであるHI
S4上の制限酵素StuIサイトで線状化した後、ピキア属酵
母 Pichia pastoris GTS115株のhis4遺伝子座を標的に
スフェロプラスト法(Cregg J. T.等， Mol. Cell. Bio
1. 5, p3376-3385, 1985)に従った挿入型組込みにより
形質転換を行った。

【００９１】得られた形質転換体を２ｍｌのYNB 培地に
植菌し、30℃で２日間培養した。これを２ｍｌYP-2% グ
リセロール培地に10% 植菌後、30℃で２日間培養し、終
濃度４％になるようにメタノールを添加し、更に３０℃
で５日間培養した。培養液を遠心し、(10000rpm, 5分,
4 ℃) 、得られた培養上清中のＥｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤ
Ｆ−５２−５５の発現量を実施例１と同様に抗ｒＵＴＩ
抗体によるＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果１０ｍｇ
／Ｌの発現が認められた。

【００９２】また、得られた培養上清について後述の参
考例２および参考例３に記載の方法に準じてトリプシン
阻害活性および好中球エラスターゼ阻害活性を測定し
た。その結果、該培養上清はトリプシン阻害活性を示す
と共に、顕著に強い好中球エラスターゼ阻害活性を示し
た。

【００９３】実施例１で示したＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤ
Ｆ−５２−５５発現株の培養上清中には０．７ｍ／Ｌの
改変型ＵＴＩが検出されたのに対して、２１アミノ酸か
らなるＵＴＩのＮ末ペプチドを持つＥｐ１−ＵＴＩ−Ｒ
ＰＤＦ−５２−５５発現株の培養上清中には、１０ｍｇ
／Ｌの改変型ＵＴＩが検出された。即ち、２１アミノ酸
からなるＵＴＩのＮ末ペプチドの有無により、発現量に
１４倍強の差が認められた。また、表１に示すように両
改変型ＵＴＩの各酵素阻害活性は同等であることから、
２１アミノ酸からなるＵＴＩのＮ末ペプチドは酵素阻害
活性に影響することなく遺伝子工学的手法における発現
量の増大に寄与することが示唆された。

【００９４】

【表１】

【００９５】実施例３ プロテアーゼインヒビター（Ｅ
ｐ７−ｄ２１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５）の作成 式IXに示すアミノ酸配列を有するプロテアーゼインヒビ
ター〔ＵＴＩ（d21,K22R,E23P,S25F,M36V,G37A,T39F,S4
0P,E52Q,Q55V) 以下、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２
−５５という。図１の(3) 〕を作成した。なお、アミノ
酸番号はＵＴＩのＮ末端を１としたときの番号で示し
た。

【００９６】（１）Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−
５５遺伝子のカセット化 実施例１（１）（ｄ）で得られたｐＨＨ３３７をＥｃｏ
５２ＩとＢｌｎＩで消化し、ＵＴＩのＫｕｎｉｔｚ型ド
メイン１の結合中心領域を欠いたＵＴＩ遺伝子を担持し
たベクターＤＮＡのＥｃｏ５２Ｉ−ＢｌｎＩ断片を回収
した。次に、先に示したアミノ酸置換が含まれるように
Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＥｃｏ５２ＩサイトからＢ
ｌｎＩサイトまでの領域に相当する合成ＤＮＡ（図３
７）を調製した。その際、塩基置換によりアミノ酸変化
なしにＥｃｏ５２Ｉサイトのすぐ下流にＮａｅＩサイト
を設けることができた。これらを連結し、分泌発現用Ｅ
ｐ７−ｄ２１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ遺伝子（図３８）を担
持したプラスミドｐＨＨ３３８を作成した（図３９）。

【００９７】（２）発現株の作成および性状 ｐＨＨ３３８をＥｃｏＲＩ消化し、得られた分泌発現用
Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子をピキア
属酵母の発現用プラスミドｐＡＯ８０７ＮのＥｃｏＲＩ
サイトに連結し、ピキア属酵母でのＥｐ７−ｄ２１−Ｒ
ＰＤＦ−５２−５５発現プラスミドｐＨＨ３４１を作成
した（図４０）。このｐＨＨ３４１を選択マーカーであ
るHIS4上の制限酵素StuIサイトで線状化した後、ピキア
属酵母 Pichia pastoris GTS115株のhis4遺伝子座を標
的にスフェロプラスト法に従った挿入型組み込みにより
形質転換を行った。

【００９８】得られた形質転換体を２mlのYNB 培地に植
菌し、30℃で２日間培養した。これを２ml YP-2%グリセ
ロール培地に10% 植菌し、30℃で２日間培養し菌体を培
養後、終濃度４％になるようにメタノールを添加し、さ
らに３０℃で５日間培養した。培養液を遠心し(10000rp
m,５分, ４℃) 、得られた培養上清中のＥｐ７−ｄ２１
−ＲＰＤＦ−５２−５５の発現量を実施例１と同様に抗
ｒＵＴＩ抗体によるＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果
２mg/Lの発現が認められた。また、得られた培養上清に
ついて参考例２および参考例３記載の方法に準じてトリ
プシン阻害活性および好中球エラスターゼ阻害活性を測
定した。その結果、該培養上清はトリプシン阻害活性を
示すと共に、顕著に強い好中球エラスターゼ阻害活性を
示した。

【００９９】実験例１ 各改変型ＵＴＩの精製および性
状分析 （１）培養上清からの各改変型プロテアーゼインヒビタ
ーの精製 （ａ）Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５およびＥ
ｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５の精製 実施例１および実施例３で得られた各改変型ＵＴＩ発現
株を、実施例１の（３）および実施例３の（２）に準じ
て１００ｍｌＹＮＢ培地で培養後、２Ｌの３×ＹＰ−２
％グリセロ─ル培地に５％植菌し培養した。途中、終濃
度４％になるようにメタノールを添加して発現を誘導し
た。

【０１００】得られた培養液を４℃で7000rpm ，３０分
間遠心後、上清を０．４５μｍ膜（ＭＩＬＬＩＰＡＫ２
００^R ，ミリポア社製）で濾過し、更に１０ｋＤカット
の限外濾過膜（ＦＩＬＴＲＯＮ ＭＩＮＩＳＥＴＴ
Ｅ^TM，ＦＩＬＴＲＯＮ社製）を用いて 100ｍｌに濃縮し
た。該濃縮液を１０Ｌの結合用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ，２０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，ｐＨ８．０）を用いて透
析した。次に透析した該濃縮液をアンハイドロトリプシ
ン−アガロースカラム（φ2.0 ×2.2 ｃｍ）に自然落下
で通過させ、カラムを１５ｍｌの結合用緩衝液で洗浄
後、１５ｍｌの２５０ｍＭベンズアミジン含有結合用緩
衝液で洗浄した。更に１５ｍｌの結合用緩衝液で洗浄し
た後、溶出液I （0.02Ｎ ＨＣｌ，２０ｍＭ ＣａＣｌ
₂ ）を用いてカラムから吸着画分を溶出し、１ｍｌずつ
分取した。波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ピ
ーク画分を集め中和液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０）を溶出液の１／１０量添加して中和した。これ
を生理食塩水（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて透析
後、セントリプレップ１０で濃縮し、精製品とした。

【０１０１】得られた各改変型ＵＴＩ精製品の総ＵＴＩ
活性（参考例２）およびカラム添加力価に対する回収率
は、Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５が 370ユニ
ット，20.4％、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５
が1550ユニット，41.3％であった。また、精製品のＳＤ
Ｓ電気泳動パターンは、いずれの改変型ＵＴＩも１７．
７ｋＤに主バンドを示した。

【０１０２】（ｂ）Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−
５５の精製 実施例２で得られたＥｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−
５５発現株を、実施例２の（２）に準じて、３００ｍｌ
ＹＮＢ培地で培養後６Ｌの３×ＹＰ−２％グリセロ─ル
培地に５％埴菌し培養した。途中、終濃度４％になるよ
うにメタノールを添加して発現を誘導した。

【０１０３】得られた培養液を7000rpm ，３０分間遠心
後、得られた上清を０．４５μｍ膜（ＭＩＬＬＩＰＡＫ
２００^R ）で濾過し、得られた濾液を１０Ｌの上記結合
用緩衝液を用いて透析した。次に、透析した該濾液をト
リプシン−アガロースカラム（φ5.0 ×5.0 ｃｍ）に自
然落下で通過させ、カラムを 700ｍｌの結合用緩衝液で
洗浄した後、溶出液II（0.2 Ｍ Glycine −ＨＣｌ，２
０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，ｐＨ２．５）を用いてカラムから
吸着画分を溶出し、５０〜１００ｍｌずつ分取した。波
長２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、ピーク画分を集
め上記中和液を溶出液の１／１０量添加して中和した。
これをＴｒｉｓ緩衝液（１ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ
８．０）を用いて透析後、セントリプレップ１０で濃縮
し、精製品とした。

【０１０４】得られたＥｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２
−５５の精製品の総ＵＴＩ活性は 45800ユニットであ
り、カラム添加力価に対する回収率は４８．５％であっ
た。また、精製品のＳＤＳ電気泳動パターンは、２０ｋ
Ｄに主バンドを示した。

【０１０５】なお、以下の物性試験に用いられた各改変
型ＵＴＩは、本実験例で得られた精製品である。

【０１０６】（２）精製プロテアーゼインヒビターの酵
素阻害物質定数（Ｋｉ）の測定 実施例１〜実施例３で得られた各種精製プロテアーゼイ
ンヒビターの各種酵素〔ヒト好中球エラスターゼ（表
中、ＨＮＥと示す）、トリプシン（ウシ，ヒト）、プラ
スミン〕に対するＫｉ値を参考例３に記載する方法に従
って測定した。結果を、表１に天然型ＵＴＩ及び後述の
参考例４に記載された遺伝子工学的に作成された改変の
ない天然型ＵＴＩと同じアミノ酸配列を有するＵＴＩ
（以下、Intact-rUTI と呼ぶ。）の値と共に示す。表１
中、天然型ＵＴＩは、特開平５−９２００号公報に記載
の方法に従い調製した。

【０１０７】表１に示されるように、阻害活性がＵＴＩ
のＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２領域に起因すると言われる
トリプシンに対しては、天然型ＵＴＩ、Intact-rUTI と
ほぼ同様の値を示したのに対し、阻害活性がＵＴＩのＫ
ｕｎｉｔｚ型ドメイン１に起因すると言われる好中球エ
ラスターゼに対してはＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２
−５５に関しては、天然型ＵＴＩよりも３オーダー、In
tact-rUTI よりも６オーダーもＫｉ値が小さくなり阻害
能の著しい上昇が認められ、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ
−５２−５５についても、天然型ＵＴＩよりも ２オー
ダー、Intact-rUTI よりも５オーダーもＫｉ値が小さく
なり阻害能の著しい上昇が認められた。

【０１０８】（３）精製プロテアーゼインヒビターのヒ
ト好中球エラスターゼ阻害の反応速度（ｋｏｎ）の測定 各種プロテアーゼインヒビター（Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰ
ＤＦ−５２−５５、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−
５５、ヒト血漿由来のα１−ＡＴ）についてヒト好中球
エラスターゼに対するｋｏｎを求めた。緩衝液Ａ（0.1M
Tris, 10mM CaCl_2,0.1% TritonX-100,pH8) で10nMに希
釈したプロテアーゼインヒビター溶液250 μl に緩衝液
Ａを1000μl 、緩衝液Ｂ（10mMNaOAc，10mM CaCl₂，0.1
% TritonX-100, pH4.5 ）で10nMに希釈したヒト好中球
エラスターゼ（Elastin Product 社製）を250 μl を加
え速やかに混和した。25℃でインキュベートを開始し、
14分まで1 分〜2 分毎に62.5μM Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro
-Val-MCA/25% DMSO （ペプチド研究所) を1000μl 混和
し、25℃30秒間インキュベート後、20% 酢酸溶液を1000
μl 加えて反応を止め、励起波長380nm 、蛍光波長470n
m で蛍光強度を測定した。各インキュベート時間での蛍
光強度の０時間に対する比に酵素初濃度〔Ｅ₀ 〕を乗ず
ることで残存酵素濃度〔Ｅ〕を求め、下記の式に従った
プロットの直線の傾きからkon を求めた。

【０１０９】

【数１】

【０１１０】（式中、〔Ｅ₀ 〕は酵素初濃度、〔Ｅ〕は
各時間における酵素濃度、ｔは時間を意味する。） 結果を表２に示す。

【０１１１】

【表２】

【０１１２】この結果から、改変型ＵＴＩのα１−ＡＴ
に対するｋｏｎ値の比は１／８〜１／７と評価された。

【０１１３】（４）精製プロテアーゼインヒビターの酸
化感受性の評価 50ｍＭ リン酸緩衝液，ｐＨ７．０で５μＭに希釈した
各種プロテアーゼインヒビター（Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰ
ＤＦ−５２−５５、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−
５５）または天然型ＵＴＩ各２５μｌに、同緩衝液で2
0.0ｍＭから1.25μＭまで連続５倍希釈したクロラミン
Ｔ（ナカライテスク社製）を２５μｌ添加し、室温で２
０分間反応させた。次いで、水に溶解した 200ｍＭのＬ
−メチオニン（ナカライテスク社製）を５０μｌ添加し
て反応を停止した。つぎに反応後のインヒビターを緩衝
液Ａで９４ｎＭに希釈し、その４０μｌに緩衝液Ａを11
0 μｌ，緩衝液Ｂで 250ｎＭに溶解したエラスターゼを
２０μｌ添加して２５℃で３０分間反応させた。次に２
５％ＤＭＳＯに溶解した２ｍＭのS-2484（第一化学社
製) を５０μｌ添加し、反応初速度をＤＵ−７４００分
光光度計（Beckman 社製）により吸光度（４０５ｎｍ）
の経時的な変化を測定することにより求めた。また、比
較のため、上記α１−ＡＴについても同様にクロラミン
Ｔ酸化による影響を調べた。

【０１１４】図４０に、クロラミンＴ酸化のＥｐ１−ｄ
２１−ＲＰＤＦ−５２−５５、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤ
Ｆ−５２−５５、天然型ＵＴＩのエラスターゼ阻害に対
する影響を示す。図４１中の残存阻害率は、阻害率をイ
ンヒビター非添加時の反応初速度に対するインヒビター
添加時の反応初速度の減少割合（％）としたとき、クロ
ラミンＴ非酸化インヒビターの阻害率に対する、クロラ
ミンＴ酸化インヒビターの阻害率の割合（％）を示して
いる。図４１に示すように、Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ
−５２−５５やＥｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５
は、α１−ＡＴや天然型ＵＴＩが失活するような低濃度
域のクロラミンＴ酸化では全く失活せず、明らかに酸化
抵抗性の増大が認められた。

【０１１５】Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５、
Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５は、尿由来の天
然型ＵＴＩのＮ末端から３６位に相当するメチオニンが
イソロイシンまたはバリンに、更にＥｐ１−ｄ２１−Ｒ
ＰＤＦ−５２−５５では尿由来の天然型ＵＴＩのＮ末端
から３８位に相当するメチオニンもフェニルアラニンに
変換されており（図１参照）、酸化に対する耐性向上が
期待される。

【０１１６】クロラミンＴは、中性または弱アルカリ性
においてメチオニンをメチオニンスルホキシドに酸化す
ることが知られているが、図１０に示すようにＥｐ１−
ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５、Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰ
ＤＦ−５２−５５、Ｅｐ１−ＵＴＩのエラスターゼ阻害
活性は天然型ＵＴＩに比べてクロラミンＴ酸化に耐性と
なっていることが確認された。炎症の場において、好中
球はエラスターゼと共に、活性酸素も放出することが知
られているが、そのような場においても安定性の向上が
期待される。

【０１１７】（５） 好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）惹
起肺出血モデルにおける改変型ＵＴＩの効力 実施例２で得られた改変型ＵＴＩと天然型ＵＴＩとの効
力の相違を以下の方法によって比較した。ハムスター
（体重１００ｇ前後）をペントバルビタールナトリウム
（７０ｍｇ／kg体重、腹腔内投与）により麻酔し、背位
に固定した。気管を露出させて、小切開を施し、注射針
を気管分枝櫛の手前まで挿入し、被検薬を０．１W/V%の
ヒト血清アルブミン溶液に適宜溶解し、その１００μｌ
を気管内投与した。その５分後にＨＮＥ〔等張リン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた〕３０Ｕを気管内投与
した。ＨＮＥ投与１時間後に、動物を放血致死させ、肺
胞洗浄液（ＢＡＬ）を採取し、そのヘモグロビン濃度を
測定した。一群は７匹とした。結果を表３および表４に
示す。

【０１１８】

【表３】

【０１１９】

【表４】

【０１２０】この結果から、ＨＮＥ惹起肺出血に対し
て、本発明の新規プロテアーゼインヒビターである改変
型ＵＴＩは天然型ＵＴＩと比較して約６倍抑制効果が強
いことが判明した。

【０１２１】（６） モルモット皮膚血管透過性亢進モ
デルにおける改変型ＵＴＩの効力 実施例２で得られた改変型ＵＴＩと天然型ＵＴＩとのＨ
ＮＥにより惹起される血管透過性亢進に対する効力の相
違を以下の方法によって比較した。モルモット（体重３
００ｇ〜４００ｇ）に被検薬を静脈内投与した。その５
分後にＨＮＥ３Ｕを皮内投与し、２W/V%エバンスブルー
を静脈内投与した。ＨＮＥ投与３０分後に動物を屠殺
し、皮膚片を切り取った。皮膚片は１Ｎ−ＫＯＨ１ｍｌ
に浸して３７℃で１晩処理した。該処理液にさらにアセ
トン−リン酸液（１３：５V/V ）９ｍｌを添加後、上清
を分取してＡ₆₂₀ を測定した。一群は４匹とした。結果
を表５に示す。

【０１２２】

【表５】

【０１２３】この結果から、ＨＮＥ惹起モルモット皮膚
血管透過性亢進に対して、本発明の新規プロテアーゼイ
ンヒビターである改変型ＵＴＩは天然型ＵＴＩと比較し
て抑制効果が極めて強いことが判明した。

【０１２４】実施例４ 高密度フラスコ培養による発現
量の比較 実施例１の（３）および実施例２の（２）で実施した培
養（試験管培養）において、２１アミノ酸からなるＵＴ
ＩのＮ末ペプチドを持つＥｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５
２−５５は、それを持たないＥｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ
−５２−５５に比して遺伝子工学的に大量に発現される
ことが示唆された。これを確認するためにメタノール誘
導時の菌体密度を高めた形でのフラスコ培養（高密度フ
ラスコ培養）を行い、それぞれの発現量を比較した。

【０１２５】実施例１の（３）で得られたＥｐ１−ｄ２
１−ＲＰＤＦ−５２−５５発現株ならびに実施例２の
（２）で得られたＥｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５
５発現株を２ｍｌのＹＮＢ培地に植菌し、３０℃で２日
間培養した。これを 200ｍｌの３×ＹＰ−２グリセロー
ル培地（3% Yeast Extract,6% Peptone,2% glycerol ）
に１ｍｌずつ植菌し、３０℃で２日間培養した後、波長
５４０ｎｍにおける濁度（ＯＤ₅₄₀ ）を測定した。培養
液から集菌した後、それぞれのＯＤ₅₄₀ 値が２５０程度
になるように２×ＹＰ−４％メタノール培地（2% Yeast
Extract, 4% Peptone, 4% methanol）にに混濁した。
これらをバッフル付 300ｍｌ容三角フラスコに４０ｍｌ
ずつ入れ、150rpm ，６６時間培養した。培養温度は３
０℃とした。２４時間毎に培養液の濁度を測定し、また
発現量測定用の培養上清を回収して、−２０℃に凍結保
存した。培養終了後、凍結保存しておいた培養上清を室
温で自然融解し、各変異型ＵＴＩの発現量を実施例１の
（３）と同様にＥＬＩＳＡ法で測定した。各時間毎の濁
度および発現量を表６に示す。

【０１２６】

【表６】

【０１２７】Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５発
現株の培養終了時の培養上清中には34.4ｍｇ／Ｌ、Ｅｐ
１−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５発現株の培養終了時
の培養上清中には 1.7ｍｇ／Ｌの改変型ＵＴＩが検出さ
れた。即ち、実施例１および実施例２の試験管培養の結
果と同様に、２１アミノ酸からなるＵＴＩのＮ末ペプチ
ドがピキア属酵母発現系での発現量の増大に寄与するこ
とが示された。また、高密度培養においては、試験管培
養よりも当該発現量の増大は更に顕著になった。

【０１２８】参考例１ アフィニティー精製ポリクロー
ナル抗ｒＵＴＩ抗体の調製 天然型ＵＴＩで免疫したウサギ抗血清を硫安塩析し、Ｉ
ｇ画分を回収した。これを天然型ＵＴＩをＦＭＰ活性化
セルロファイン（生化学工業製）に固定したアフィニテ
ィーカラムに吸着させ、０．５Ｍ ＮａＣｌ−０．１Ｍ
トリス（ｐＨ７．０）で洗浄後、０．１Ｍグリシン塩
酸（ｐＨ２．５）で溶出した。また必要い応じて、常法
に従ってビオチン化を行った。

【０１２９】参考例２ ＵＴＩ力価（トリプシン阻害活
性）の測定方法 約50u/mlに希釈したＵＴＩ検体200 μl 、反応緩衝液
（0.1M Tris-HCl, 20mMCaCl₂ , 1.5mg/ml Gelatin, pH
8.0) 1.6ml、100 μg/mlに希釈したウシ・トリプシン20
0 μl を混和し5 分間静置後、5mg/mlの L-BApNA (N-α
-Bengoyl-L-Argine-p-Nitroanilide）1ml を混和し正確
に５分間反応させた。その後、２０％酢酸１ｍｌを混和
して反応を止め405nm の吸光度を測定した。ＵＴＩは上
記反応緩衝液で希釈し、トリプシンは20mM CaCl₂, 1.5m
g/ml Gelatin, pH3.0 で希釈した。

【０１３０】参考例３ Ｋｉ値の測定 種々の濃度のプロテアーゼインヒビター検体と酵素を25
℃で10分間反応後、基質を2 種の濃度で添加し４０５ｎ
ｍ吸光度を連続的に測定し、反応初速度を求めた。得ら
れた測定結果より、Easson-Stedmanプロット〔J.G.Biet
h Bull.europ.Physiopath.resp 1980, 16(suppl.) 183
-195〕、Dixon プロットまたはLineweaber-Burk の２次
プロットによりＫｉ値を求めた。反応系の緩衝液は緩衝
液Ａとし、基質は、トリプシンには S-2222 、好中球エ
ラスターゼにはS-2484、プラスミンにはS-2251、キモト
リプシンにはS-2586（以上、第一化学薬品社より購入）
を用いた。

【０１３１】反応条件は、下記の通りである。トリプシ
ンは２０ｍＭ ＣａＣｌ₂ ，０．１％トライトンＸ−１
００，ｐＨ３．０で６．３×１０^-9Ｍに希釈した。当該
トリプシン液２０μｌに、緩衝液Ａで１０^-8〜１０^-9Ｍ
に種々濃度希釈したＵＴＩ検体８０μｌを加え、更に緩
衝液Ａを２２０μｌまたは３１０μｌ加えた。２５℃で
１０分間反応後、各反応液に５ｍＭに蒸留水に溶解した
Ｓ−２２２２を１２０μｌまたは３０μｌ加え、４０５
ｎｍの吸光度を経時的に測定した。

【０１３２】好中球エラスターゼは、緩衝液Ｂで５×１
０^-8Ｍに希釈した。希釈したエラスターゼ液２０μｌ
に、緩衝液Ａを用いて１０^-5〜１０^-9Ｍに種々濃度に希
釈したＵＴＩ検体８０μｌを加え、更に緩衝液Ａを２４
０μｌまたは２９０μｌを加えた。この混合液を２５℃
で１０分間反応させた後、各反応液に４ｍＭに２５％Ｄ
ＭＳＯ／蒸留水に溶解したＳ−２４８４を１００μｌま
たは５０μｌを加え、４０５ｎｍの吸光度を経時的に測
定した。

【０１３３】プラスミンは、緩衝液Ｂで８×１０^-8Ｍに
希釈した。希釈したプラスミン液４０μｌに、緩衝液Ａ
で１０^-5〜１０^-8Ｍに種々濃度に希釈したＵＴＩ検体８
０μｌを加え、更に緩衝液Ａを１８０μｌ加えた。２５
℃で１０分間反応後、各反応液に５ｍＭまたは２．５ｍ
Ｍに蒸留水に溶解したＳ−２２５１を１００μｌ加え、
４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定した。

【０１３４】参考例４ Intact-rＵＴＩ発現株の作成お
よびその性状 実施例１（ｂ）で得られたpHH310を、選択マーカーであ
るHIS4上の制限酵素StuIサイトで線状化した後、ピキア
属酵母 Pichia pastoris GTS115株を、その染色体のhi
s4遺伝子座を標的にスフェロプラスト法(Cregg J. T.
等， Mol. Cell.Bio1. 5, p3376-3385, 1985)に従った
挿入型組み込みにより形質転換した。

【０１３５】得られた形質転換体を5ml のYNB 培地(0.7
% Yeast Nitrogen Base w/o AminoAcids, 2% dextrose)
に植菌し、30℃で２日間培養した。これを5ml 2 ×YP-
2%グリセロール培地(2% Yeast Extract, 4% Peptone, 2
% glycerol) に10% 植菌後、30℃で２日間培養し菌体を
増殖させた。これを遠心し(2000rpm, ５分, 常温)、得
られた菌体を5ml のYP-2% メタノール培地(1% Yeast Ex
tract, 2% Peptone,2% methanol) に懸濁し、更に30℃
で５日間培養した。培養液を遠心し(10000rpm, 5分, 4
℃) 、培養上清を回収した。得られた培養上清につい
て、トリプシン阻害活性及びヒト好中球エラスターゼ阻
害活性を参考例２、３記載の方法に従って測定した。そ
の結果、該上清は顕著なトリプシン阻害活性を示すと共
に、わずかながらヒト好中球エラスターゼ阻害活性を示
した。

【０１３６】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：153 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 TGTCAACTGG GCTACTCGGC CGGTCCCTGC ATCGCTTTCT TTCCTAGGTA TTTCTATAAT 60 GGTACATCCA TGGCCTGTCA GACTTTCGTG TACGGCGGAT GCATGGGCAA CGGTAACAAC 120 TTCGTCACAG AAAAGGAGTG TCTGCAGACC TGC 153

【０１３７】配列番号：2 配列の長さ：165 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 AGACCAGATT TCTGTCAACT GGGCTACTCG GCCGGTCCCT GCATCGCTTT CTTTCCTAGG 60 TATTTCTATA ATGGTACATC CATGGCCTGT CAGACTTTCG TGTACGGCGG ATGCATGGGC 120 AACGGTAACA ACTTCGTCAC AGAAAAGGAG TGTCTGCAGA CCTGC 165

【０１３８】配列番号：3 配列の長さ：372 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 AGACCAGATT TCTGTCAACT GGGCTACTCG GCCGGTCCCT GCATCGCTTT CTTTCCTAGG 60 TATTTCTATA ATGGTACATC CATGGCCTGT CAGACTTTCG TGTACGGCGG ATGCATGGGC 120 AACGGTAACA ACTTCGTCAC AGAAAAGGAG TGTCTGCAGA CCTGCCGAAC TGTGGCGGCA 180 TGCAATCTCC CCATAGTCCG GGGCCCCTGC CGAGCCTTCA TCCAGCTCTG GGCATTTGAT 240 GCTGTCAAGG GGAAGTGCGT CCTCTTCCCC TACGGGGGCT GCCAGGGCAA CGGGAACAAG 270 TTCTACTCAG AGAAGGAGTG CAGAGAGTAC TGCGGTGTCC CTGGTGATGG TGATGAGGAG 300 CTGCTGCGCT TC 372

【０１３９】配列番号：4 配列の長さ：435 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 GCTGTGCTAC CCCAAGAAGA GGAAGGATCA GGGGGTGGCC AACTGGTAAC CGAAGTCACC 60 AAGAGACCAG ATTTCTGTCA ACTGGGCTAC TCGGCCGGTC CCTGCATCGC TTTCTTTCCT 120 AGGTATTTCT ATAATGGTAC ATCCATGGCC TGTCAGACTT TCGTGTACGG CGGATGCATG 180 GGCAACGGTA ACAACTTCGT CACAGAAAAG GAGTGTCTGC AGACCTGCCG AACTGTGGCG 240 GCATGCAATC TCCCCATAGT CCGGGGCCCC TGCCGAGCCT TCATCCAGCT CTGGGCATTT 300 GATGCTGTCA AGGGGAAGTG CGTCCTCTTC CCCTACGGGG GCTGCCAGGG CAACGGGAAC 360 AAGTTCTACT CAGAGAAGGA GTGCAGAGAG TACTGCGGTG TCCCTGGTGA TGGTGATGAG 420 GAGCTGCTGC GCTTC 435

【０１４０】配列番号：5 配列の長さ： 63 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 GCTGTGCTAC CCCAAGAAGA GGAAGGATCA GGGGGTGGCC AACTGGTAAC CGAAGTCACC 60 AAG 63

【０１４１】配列番号：6 配列の長さ：12 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 AGACCAGATT TC 12

【０１４２】配列番号：7 配列の長さ：204 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 ACTGTGGCGG CATGCAATCT CCCCATAGTC CGGGGCCCCT GCCGAGCCTT CATCCAGCTC 60 TGGGCATTTG ATGCTGTCAA GGGGAAGTGC GTCCTCTTCC CCTACGGGGG CTGCCAGGGC 120 AACGGGAACA AGTTCTACTC AGAGAAGGAG TGCAGAGAGT ACTGCGGTGT CCCTGGTGAT 180 GGTGATGAGG AGCTGCTGCG CTTC 204

【０１４３】配列番号：8 配列の長さ：75 配列の型: 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー: 直鎖状 配列の種類: 他の核酸 配列 GCTGTGCTAC CCCAAGAAGA GGAAGGATCA GGGGGTGGCC AACTGGTAAC CGAAGTCACC 60 AAGAGACCAG ATTTC 75

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の新規プロテアーゼインヒビターの一次
構造の模式図を天然型ＵＴＩと対比して示した図であ
る。

【図２】尿中より単離されたＵＴＩの一次構造を示す図
である（ Watcher, E and Hochstrasser, K., Hoppe-Se
yler's Z. Physiol. Chem., 362, p1351, 1981) 。

【図３】ＵＴＩのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１およびＫｕ
ｎｉｔｚ型ドメイン２の一次構造を示す図である。

【図４】クローニングしたＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列
（−２０〜２４０）を示す図である。塩基番号は、J.F.
Kaumeyer等，Nucl. Acids Res. 14(20), p7839-7850 (1
986)の報告に従った。

【図５】クローニングしたＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列
（２４１〜５４０）を示す図である。塩基番号は、J.F.
Kaumeyer等, Nucl. Acids Res. 14(20), p7839-7850 (1
986)の報告に従った。なお、図中の制限酵素サイトは、
各実施例で使用したものを示した。

【図６】クローニングしたＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列
（５４１〜７８０）を示す図である。塩基番号は、J.F.
Kaumeyer等, Nucl. Acids Res. 14(20), p7839-7850 (1
986)の報告に従った。ＵＴＩのｃＤＮＡから求めたアミ
ノ酸配列を下段に示す。なお、図中の制限酵素サイト
は、各実施例で使用したものを示した。

【図７】クローニングしたＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列
（７８１〜１０２０）を示す図である。塩基番号は、J.
F.Kaumeyer等, Nucl. Acids Res. 14(20), p7839-7850
(1986)の報告に従った。ＵＴＩのｃＤＮＡから求めたア
ミノ酸配列を下段に示す。なお、図中の制限酵素サイト
は、各実施例で使用したものを示した。

【図８】クローニングしたＵＴＩｃＤＮＡの塩基配列
（１０２１〜１２３５）を示す図である。塩基番号は、
J.F.Kaumeyer等, Nucl. Acids Res. 14(20), p7839-785
0(1986)の報告に従った。ＵＴＩのｃＤＮＡから求めた
アミノ酸配列を下段に示す。なお、図中の制限酵素サイ
トは、各実施例で使用したものを示した。

【図９】ＵＴＩのＮ末端をコードする領域、Ｃ末端をコ
ードする領域の改変塩基配列を示す図である。

【図１０】＃７／ＢｂｅＩ−ＥＲＩの構築工程を示す図
である。

【図１１】＃７／ＢｂｅＩ−ＥＲＩからｐＵＴＩ−Ｎの
構築工程を示す図である。

【図１２】＃７／ＢｂｅＩ−ＥＲＩからｐＵＴＩ−Ｃの
構築工程を示す図である。

【図１３】ｐＵＴＩ Ｎ−Ｃの構築工程を示す図であ
る。

【図１４】ｐＵＴＩ Ｎ−Ｃ／ＥＲＩを構築する工程を
示す図である。

【図１５】ｐＵＴＩ Ｎ−ＣおよびｐＡＯ８０７Ｎの制
限酵素地図、およびｐＨＨ３１０の構築工程を示す図で
ある。

【図１６】ＳＵＣ２シグナルの塩基配列を示す図であ
る。

【図１７】ＵＴＩのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン１のＣ末端
をコードする領域を補う合成ＤＮＡの塩基配列を示す図
である。

【図１８】ＵＴＩのＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２のＮ末端
をコードする領域を補う合成ＤＮＡの塩基配列を示す図
である。

【図１９】ＵＴＩのＮ末ペプチド付加Ｋｕｎｉｔｚ型ド
メイン１およびＫｕｎｉｔｚ型ドメイン２の遺伝子ユニ
ットを示す図である。図中、各Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン
の領域はＵＴＩのアミノ酸番号で示した。

【図２０】ｐＨＨ３０５の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図２１】ｐＨＨ３１３の制限酵素地図を示す図であ
る。

【図２２】ｐＨＨ３０６の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図２３】ｐＨＨ３１４の制限酵素地図を示す図であ
る。

【図２４】mutagenic primerに用いた領域を示す図であ
る。

【図２５】Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン１のPstIサイトから
Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン２のSphIサイト間に相当する合
成ＤＮＡ（実施例１（１）（ｄ）（ii）参照）の塩基配
列を示す図である。

【図２６】図１(1) に示すＥｐ１−ＵＴＩのアミノ酸配
列（一文字表記）及びそれをコードする塩基配列を示す
図である。

【図２７】Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦのＮ末端合成ＤＮ
Ａ（実施例１（１）（ｄ）（ii）参照）の塩基配列を示
す図である。□で囲んだ部分は新たに制限酵素サイトを
設けるために置換した塩基を示す（但し、アミノ酸配列
の変化なし）。

【図２８】Ｅｐ１−ｄ２１−ＲＰＤＦ／ｐＵＣの構築工
程およびその制限酵素地図を示す図である。

【図２９】Ｅ５２Ｑ，Ｑ５５Ｖ置換を行うための合成Ｄ
ＮＡの塩基配列（実施例１（１）（ｄ）（ii）参照）の
塩基配列を示す図である。□で囲んだ部分は新たに制限
酵素サイトを設けるために置換した塩基を示す（但し、
アミノ酸配列の変化なし）。

【図３０】ｐＨＨ３３７に担持された分泌発現用Ｅｐ１
−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子の塩基配列及び
それによってコードされるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図３１】ｐＨＨ３３７の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図３２】ｐＨＨ３４０の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図３３】Ｅｐ１−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５／ｐ
ＵＣのＮ末端領域の合成ＤＮＡの塩基配列（実施例２
（１）参照）。□で囲んだ部分は新たに制限酵素サイト
を設けるために置換した塩基を示す（但し、アミノ酸配
列の変化なし）。

【図３４】ｐＨＨ３５４に担持された分泌発現用Ｅｐ１
−ＵＴＩ−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子の塩基配列及び
それによってコードされるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図３５】ｐＨＨ３５４の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図３６】ｐＨＨ３５５の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図３７】Ｅｐ７−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５／ｐ
ＵＣを作製するための合成ＤＮＡの塩基配列を示す図で
ある。□で囲んだ部分は新たに制限酵素サイトを設ける
ために置換した塩基を示す（但し、アミノ酸配列の変化
なし）。

【図３８】ｐＨＨ３３８に担持された分泌発現用Ｅｐ７
−ｄ２１−ＲＰＤＦ−５２−５５遺伝子の塩基配列及び
それによってコードされるアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図３９】ｐＨＨ３３８の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図４０】ｐＨＨ３４１の構築工程およびその制限酵素
地図を示す図である。

【図４１】各種プロテアーゼインヒビターのクロラミン
Ｔ酸化感受性を示す図である。横軸はクロラミンＴ処理
濃度、縦軸はクロラミンＴ酸化後に残存するエラスター
ゼに対する阻害活性を示す（クロラミンＴ非酸化インヒ
ビターの阻害率に対する、クロラミンＴ酸化インヒビタ
ーの阻害率の割合％で示す。）

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＪ Ｃ１２Ｎ 1/19 ＡＣＤ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＤ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 塚田 稔 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 新留 正和 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 土山 博美 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 松井 智彦 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 丸山 智之 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも下記式Ｉのアミノ酸配列を有
   することを特徴とする新規プロテアーゼインヒビター。 【化１】
2. 【請求項２】 少なくとも下記式IIのアミノ酸配列を有
   することを特徴とする請求項１記載の新規プロテアーゼ
   インヒビター。 【化２】
3. 【請求項３】 式Ｉまたは式II中のアミノ酸配列 Ile-A
   la-Pheが、 Val-Ala-Metに置換されたものである請求項
   １または２に記載の新規プロテアーゼインヒビター。
4. 【請求項４】 下記式IVのアミノ酸配列をＣ末端側領域
   に有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
   載の新規プロテアーゼインヒビター。 【化３】
5. 【請求項５】 下記式VIIIのアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする請求項１または２記載の新規プロテアーゼ
   インヒビター。 【化４】
6. 【請求項６】 下記式IXのアミノ酸配列を有することを
   特徴とする請求項３記載の新規プロテアーゼインヒビタ
   ー。 【化５】
7. 【請求項７】 下記式III のアミノ酸配列をＮ末端側に
   有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載
   の新規プロテアーゼインヒビター。 【化６】
8. 【請求項８】 下記式VII のアミノ酸配列を有すること
   を特徴とする請求項１記載の新規プロテアーゼインヒビ
   ター。 【化７】
9. 【請求項９】 天然型尿性トリプシンインヒビターに比
   して好中球エラスターゼに対する阻害活性が増強されて
   なる請求項１〜８のいずれかに記載の新規プロテアーゼ
   インヒビター。
10. 【請求項１０】 トリプシンに対する阻害活性を有し、
    かつ天然型尿性トリプシンインヒビターに比して好中球
    エラスターゼに対する阻害活性が増強されてなる請求項
    １〜８記載の新規プロテアーゼインヒビター。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれかに記載の新
    規プロテアーゼインヒビターをコードする塩基配列を有
    することを特徴とするＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載のＤＮＡを含有するこ
    とを特徴とするベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載のベクターで形質転換
    された形質転換体。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の形質転換体を培養し
    て、請求項１〜１０のいずれかに記載の新規プロテアー
    ゼインヒビターを産生させ、得られる培養物から当該プ
    ロテアーゼインヒビターを採取することを特徴とする請
    求項１〜９のいずれかに記載の新規プロテアーゼインヒ
    ビターの製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項１〜６記載のいずれかの新規プ
    ロテアーゼインヒビターをコードする塩基配列の５’末
    端側に、下記式（III ）のアミノ酸配列をコードする塩
    基配列が結合されたベクターにて形質転換された形質転
    換体を培養することを特徴とするプロテアーゼインヒビ
    ターの発現増強方法。 【化８】
16. 【請求項１６】 請求項１〜１０記載の新規プロテアー
    ゼインヒビターを有効成分とするエラスターゼが関与す
    る疾患の治療剤。