JP2002503958A

JP2002503958A - 改良された特性をもつアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニン

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Publication number: JP2002503958A
Application number: JP50147199A
Authority: JP
Inventors: シユレダー，ベルナー; アペラー，ハイナー
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2002-02-05
Also published as: DE19725014A1; AU8108998A; EP1002083A1; WO1998056916A1

Abstract

(57)【要約】本発明はｐＨ７で＋３ないし−３の正味の電荷をもつアプロチニン変異体に関する。結合部位において、アミノ酸基１０はＳｅｒであり、アミノ酸基１３はＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸基１５はＡｒｇであり、アミノ酸基１７はＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｒｇであり、そしてアミノ酸基１９はＴｈｒもしくはＬｙｓである。本発明は、いくつかのアミノ酸基をもつスペーサーにより連結される２個のアプロチニン変異体を含んで成るビクニンにもまた関する。前記アプロチニン変異体の一方は、ａ）アミノ酸基１３がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸基１５がＡｒｇ、ＶａｌもしくはＬｅｕであり、アミノ酸基１７がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｌａであり、アミノ酸基１９がＴｈｒもしくはＬｙｓであり、アミノ酸基３９がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、そしてアミノ酸基４６がＬｅｕもしくはＬｙｓであるアプロチニン変異体；またはｂ）上で定義されたような発明のアプロチニン変異体である。本発明はまた、前記アプロチニン変異体もしくはビクニンの１もしくは数種を含有する医薬、前記アプロチニン変異体もしくはビクニンの１種のコーディング(coding)を与えるＤＮＡ配列、この型のＤＮＡ配列を含有する微生物、ならびに、微生物を使用する前記アプロチニン変異体およびビクニンの製造方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】改良された特性をもつアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニン本発明は、改良された酵素阻害、免疫学的および薬物動態の特性を有するアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニン（bikunin）、ならびにそれらの製造法に関する。ウシ膵トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）ともまた呼ばれるアプロチニンは、クニッツ(Kunitz)型のセリンプロテアーゼインヒビターのファミリーに属する。阻害可能なセリンプロテアーゼのスペクトルは、例えば、トリプシン、キモトリプシン、プラスミンおよび血漿カリクレインを包含する（ゲブハルト(W．Gebh ard)、チェシェ(H．Tschesche)とフリッツ(H．Fritz)、Proteinaase Inhibitors 、バレット(Barret)とサルヴェセン(Salvesen)（編）、エルゼビアサイエンスパブリッシング(Elsevier Science Publ.)BV 375-387、1986）。アプロチニンは以下の配列すなわちＡｒｇＰｒｏＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＴｙｒＴｈｒＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＡｒｇＩｌｅＩｌｅＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡｌａＬｙｓＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＧｌｎＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＬｙｓＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＡｒｇＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａを有する58アミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。当該タンパク質の三次元構造は、Ｘ線構造解析およびＮＭＲ分光学の助けを借りて解明された（ヴロダヴァー(Wlodawer)ら、J．Mol．Biol.198(3)、469-480、 1987；ワグナー(Wagner)ら、J．Mol．Biol．196(1)、227-231、1987；ベルント( Berndt)ら、Biochemistry 32(17)、4564-4570、1993）。トラシロール［Trasylol］（商標）の商品名で、天然のアプロチニンは、もともと膵炎の治療に使用された。トラシロール(Trasylol)は今日心臓外科手術で使用される。なぜなら、臨床試験が、アプロチニンでの治療がこの型の手術での輸血の必要性を有意に低下させそして続発性出血の低下につながることを示したからである（ロイストン(D．Royston)、J．Cardiothorac．Vasc．Anesth．6;76-10 0、1992）。阻害特異性を固定する位置１５のアミノ酸の置換が改良された阻害特性を有する有用なアプロチニン変異体につながることが示された（ＤＥ特許３３３９６９３）。こうして、導入されたアミノ酸に依存して、例えば膵もしくは白血球からのエラスターゼを阻害する強力な阻害剤を生じさせることが可能である。アプロチニン、および位置１５の置換により生じたその変異体の阻害特性はまた、阻害されるべき標的プロテアーゼと阻害剤分子との間の接触領域中の他のアミノ酸残基によっても決定されることがさらに示され得た。これらはとりわけ、位置１４、１６、１７、１８、１９、３４、３８および３９のさらなるアミノ酸残基を包含する。接触領域(region)の一定区域(area)中のこれらのアミノ酸残基の１個もしくはそれ以上の置換の結果として改良された特性を有するアプロチニン変異体は、とりわけ、以下の特許出願すなわちＷＯ８９／０１９８６８、ＷＯ８９／１０３７４、ＥＰ３０７５９２、ＥＰ６８３２２９、ＤＥ１９６２９９８．２、ＷＯ９４／０１４６１に記述された。興味深いことに、物質の物理化学的特性を決定するアミノ酸の置換によりアプロチニンおよびその変異体の薬物動態特性を改良することが可能であった。こうして、分子の正の正味の電荷を低下させることにより、腎結合を有意に低下させることが可能であった。こうした変異体は特許出願ＷＯ９２／０６１１１に記述された。より良好な工業的製造可能性(preparability)の理由上、ある場合には、阻害剤分子のＮ末端で改変を実施することが便宜的である。こうした改変は、１個もしくはそれ以上のアミノ酸のＮ末端の短縮もしくは伸長または欠失であり得る。Ｎ末端が改変されたアプロチニン変異体は特許出願ＥＰ４１９８７８に記述された。ビクニンは、例えばインター−α−トリプシンインヒビターのプロテアーゼ阻害剤であり、これらは２個もしくはそれ以上のアミノ酸のスペーサーにより分離される２個のクニッツ(Kunitz)ドメインを含有する（サリエル(J.-P．Salier)、 TIBS 15;435-439、1990）。概して、しかしながら、２個のクニッツ(Kunitz)ドメインの１個のみがここで阻害剤活性を有する。本発明のアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニン本特許出願で特許請求されるアプロチニン変異体およびビクニンは以下の特徴により区別される。すなわち１．活性の特性を改良するための当該分子の活性中心の１個もしくは多数のアミノ酸の置換（ＥＰ３０７５９２）。２．免疫学的および薬物動態の特性を改良させるという目的で正の正味の電荷を低下させるためのアミノ酸の置換（ＷＯ９２／０６１１１）。３．工業的製造可能性の理由上のＮ末端アミノ酸配列の改変（ＥＰ４１９８７８）。４．特異性を変えるための当該分子の活性中心の１個もしくは多数のアミノ酸の置換。５．連結されたクニッツ(Kunitz)ドメインによる、阻害スペクトルの幅を広げるための、アミノ酸から構成されるスペーサーを使用する多様な特異性および活性の特性を有するアプロチニン変異体の連結。６．個々のドメインがプロテアーゼによるスペーサー領域での切断後に活性のクニッツ(Kunitz)阻害剤として放出されるような、プロドラッグとしてのビクニンの使用。７．インビボ半減期が、活性化されたポリエチレングリコールとの結合(conjuga tion)後に延長される、アプロチニン変異体およびビクニン。各場合において、挙げられた特徴の一を含有するにすぎないアプロチニン変異体が、上で引用された特許出願中に記述された。アプロチニン変異体は、今や、それらの分子構造中で前述の特徴の２もしくは３個を組み合わせるか、または多数のクニッツ(Kunitz)ドメインのプロテアーゼ阻害剤である。そのアミノ酸配列が、いくつかの変異体もしくはビクニンの例として図１および２に示される。本発明のアプロチニン変異体は、しかしながら、図１および２に挙げられる例に制限されない。本発明のアプロチニン変異体は、Ｎ末端伸長Ａｌａ（−２）− Ｇｌｎ（−１）、位置２の天然のアミノ酸残基プロリン、正の電荷を運搬する他のアミノ酸の中性もしくは負に荷電したアミノ酸残基による置換、または負に荷電したアミノ酸残基による他の中性アミノ酸の置換、および離れたクニッツ(Kunitz)ドメインの個々の活性を保証するスペーサー中のアミノ酸置換を伴う変異体、ならびにリーダー中のケックス(K ex)プロテアーゼの切断により形成される化合物もまた包含する。アプロチニン変異体中のアミノ酸残基の置換の選択は、ここで、生理学的ｐＨで好ましくは＋２から−２までの範囲の低下された正の正味の電荷を有する物質を生じさせるという原則に従う。Ｎ末端の伸長もしくは短縮または欠失を包含する挙げられたアミノ酸配列中の変化は、相互にいずれかの所望の組み合わせで利用され得る。本発明のアプロチニン変異体は、従って、前述の特徴の組み合わせを表わしかつ生理学的ｐＨで低下される正の正味の電荷を有する全化合物を包含する。スペーサー中のアミノ酸は、これらが個々に活性であるように離れたドメインの配置を保証する天然のアミノ酸の組み合わせであり得る。連結のためのアプロチニン変異体は、とりわけ、ＥＰ３０７５９２、ＷＯ９２／０６１１１、ＥＰ４１９８７８、ＷＯ８９／０１９６８、ＷＯ８９／１０３７４、ＥＰ０３０７５９２、ＥＰ６８３２２９、ＤＥ１９６２９９８２に記述される。驚くべきことに、挙げられた特徴の２もしくは３個の組み合わせは、以前に記述された変異体に比較して、個々の特徴の表現の保持のみならずしかしいくつかの場合には強化もしくは改変にさえつながることがみられた。さらに、例えば免疫学的、薬物動態および表面結合の特性に関する重要な新たな物質特性を生じさせることが可能であった。新たな個々の変異体は、アプロチニンを使用して生じたポリクローナルヒトおよびウサギ抗血清との顕著に低下された反応を示す。これらの新たな変異体がアプロチニンに比較して低下された免疫原性挙動を有することがさらに見出された。分子の本体での多数の変化にもかかわらず、当該酵素の速度論的阻害定数（Ｋ_i値）が当該分子の以前の変異体に比較して驚くほど改良されたか、もしくは、特異性が改変された。ビクニンの場合には、驚くべきことに、離れたドメインの個々の活性を観察することが可能であり、その阻害定数は、離れたドメインに比較して、検討された酵素に関してわずかに減少された。スペーサー中での酵素的切断後に、産生されたクニッツ(Kunitz)阻害剤は、再度、それらの完全な活性を表わすか、もしくは、それらの活性は予期しないことに増大される。本発明はｐＨ７で＋３ないし−３の正味の電荷を有するアプロチニン変異体に関し、ここで、結合領域中で、アミノ酸残基１０がセリンであり、アミノ酸残基１３がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１５がＡｒｇであり、アミノ酸残基１７がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｒｇであり、そしてアミノ酸残基１９がＴｈｒもしくはＬｙｓである。好ましいアプロチニン変異体は、＋２ないし−２の正味の電荷を有するもの、とりわけ好ましくは＋１ないし−１の正味の電荷を有するものである。アプロチニン変異体は改変されたＮ末端および／もしくはＣ末端配列を有し得る。従って、Ｎ末端の伸長もしくは短縮を有する、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有するアプロチニン変異体が意図される。好ましいアプロチニン変異体は、式ＡｒｇＸ² ＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＳｅｒＴｈｒＧｌｙＸ¹³ ＣｙｓＡｒｇＡｌａＸ¹⁷ ＩｌｅＴｈｒＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ²⁴ ＡｌａＴｈｒＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ³¹ ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ³⁹ ＡｌａＡｓｎＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＸ⁴⁶ ＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＧｌｕＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａ、ここで、Ｘ²がＰｒｏもしくは結合であり、Ｘ¹³がＩｌｅ、ＰｒｏもしくはＬｅｕであり、Ｘ¹⁷がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｒｇであり、Ｘ²⁴がＡｓｐもしくはＡｓｎであり、Ｘ³¹がＧｌｕもしくはＧｌｎであり、Ｘ³⁹がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁴⁶がＬｙｓもしくはＬｅｕである、を有するもの、またはそのプロピレングリコール誘導体である。とりわけ好ましいアプロチニン変異体は、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇ１ｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３ −Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１ −Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｐｈｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２ −Ｓｅｒ１０−Ｌｅｕ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５ −Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３ −アプロチニン、ＰＥＧ−デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５ −Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３ −アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ーＴｈｒ２６−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンである。これらのとりわけ好ましいアプロチニン変異体は位置２にアミノ酸プロリンもまた運搬し得る。前述のアプロチニン変異体は血漿カリクレイン、プラスミンおよび第Xa因子の阻害に適する。本発明は、さらに、いくつかのアミノ酸残基を含有するスペーサーにより連結された２個のアプロチニン変異体を含んで成るビクニンに関し、ここで、アプロチニン変異体の一方がａ）ァミノ酸残基１３がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１５がＡｒｇ、ＶａｌもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１７がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｌａであり、アミノ酸残基１９がＴｈｒもしくはＬｙｓであり、アミノ酸残基３９がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、そしてアミノ酸残基４６がＬｅｕもしくはＬｙｓであるアプロチニン変異体であるか、またはｂ）上で定義された本発明のアプロチニン変異体である。スペーサーは、好ましくは10ないし40個、とりわけ10ないし20個のアミノ酸残基を有する。とりわけ好ましいスペーサーは、13アミノ酸残基、とりわけ以下の配列、すなわちＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ＧｌｕおよびＧｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕを有する配列をもつものである。加えて、これらのビクニンは改変されたＮ末端配列を有し得る。Ｎ末端の伸長もしくは短縮、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有するビクニンが従って意図される。これらのビクニンは、さらに、好ましいスペーサー配列の置換および伸長もしくは欠失を含有し得る。好ましいビクニンは、式ＡｒｇＸ² ＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＸ¹ ⁰ ＴｈｒＧｌｙＸ¹³ ＣｙｓＸ¹⁵ ＡｌａＸ¹⁷ ＩｌｅＸ¹⁹ ＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ²⁴ ＡｌａＸ²⁶ ＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ³¹ ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ³⁹ ＡｌａＸ⁴¹ ＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＸ⁴⁶ ＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＸ⁵³ ＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａＡｓｎＡｌａＡｓｎＡｒｇＸ⁶³ Ｘ⁶⁴ ＬｙｓＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｎＧｌｎＧｌｕＸ⁷² ＰｒｏＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＸ⁸¹ ＴｈｒＧｌｙＸ⁸⁴ ＣｙｓＡｒｇＡｌａＸ⁸⁸ ＩｌｅＸ⁹⁰ ＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ⁹⁵ ＡｌａＸ⁹⁷ ＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ¹⁰² ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ¹¹⁰ ＡｌａＸ¹¹² ＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＬｙｓＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＸ¹²⁴ ＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａ、ここで、Ｘ²がＰｒｏもしくは結合であり、Ｘ¹⁰がＳｅｒもしくはＴｙｒであり、Ｘ¹³がＩｌｅもしくはＰｒｏであり、Ｘ¹⁵がＡｒｇ、ＶａｌもしくはＬｙｓであり、Ｘ¹⁷がＴｙｒ、ＡｒｇもしくはＡｌａであり、Ｘ¹⁹がＴｈｒもしくはＩｌｅであり、Ｘ²⁴がＡｓｐもしくはＡｓｎであり、Ｘ²⁶がＴｈｒもしくはＬｙｓであり、Ｘ³¹がＧｌｕもしくはＧｌｎであり、Ｘ³⁹がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁴¹がＡｓｎもしくはＬｙｓであり、Ｘ⁴⁶がＬｙｓもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁵³ がＧｌｕもしくはＡｒｇであり、Ｘ⁶³およびＸ⁶⁴がそれぞれＩｌｅもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁷²がＡｒｇもしくはＬｙｓであり、Ｘ⁸¹がＴｙｒもしくはＳｅｒであり、Ｘ⁸⁴がＰｒｏもしくはＩｌｅであり、Ｘ⁸⁸がＡｌａもしくはＴｙｒであり、Ｘ⁹⁰がＩｌｅもしくはＴｈｒであり、Ｘ⁹⁵がＡｓｎもしくはＡｓｐであり、Ｘ⁹⁷がＬｙｓもしくはＴｈｒであり、Ｘ¹⁰²がＧｌｎもしくはＧｌｕであり、Ｘ¹ ¹⁰ がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ¹¹²がＬｙｓもしくはＡｓｎであり、そしてＸ¹²⁴がＡｒｇもしくはＧｌｕである、を有する群からのものである。とりわけ好ましいビクニンは、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅｌ３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ｓｅｒ８１−Ｉｌｅ８４−Ａｒｇ８６−Ｔｙｒ８８−Ｔｈｒ９０−Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇｌｕ１０２−Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ｓｅｒ８１−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇｌｕ１０２−Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｖａｌ１５−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ｓｅｒ８１−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇｌｕ１０２−Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニンである。これらのとりわけ好ましいビクニンは位置２にアミノ酸プロリンもまた運搬し得る。当該ビクニンは、血漿カリクレイン、第Xa因子、プラスミンおよびエラスターゼの阻害に適する。本発明はまた、これらのアプロチニン変異体もしくはビクニンの１種もしくはそれ以上を含んで成る医薬にも関する。記述される新規プロテアーゼ阻害剤は、例えば心臓外科手術もしくは関節置換、または移植医学、人工臓器でのような複雑な外科的処置の結果としてもまた、血漿酵素系の活性化が延長されたもしくは集中的な外来表面接触および／または血液の細胞性構成要素により発生する疾患状態の治療に適する。当該阻害剤は、出血の増大された危険を伴う手術（例えば、心臓手術、骨および関節の外科手術）での血液喪失を抑制する。それらは、さらに、例えば手術後、血液の過凝固可能(hypercoagulable)状態で、事故後、もしくは血栓溶解治療後に発生し得るような血栓塞栓性疾患状態の治療に使用され得る。それらは、ショック、多発外傷(polytrauma)、敗血症、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、多臓器不全（ＭＯＦ）、不安定狭心症、心梗塞、卒中、塞栓症および深在静脈血栓症での治療に、再閉塞、灌流の損傷、血栓症および血栓溶解後の出血を予防するのに適する。それらは、リウマチ性関節疾患および喘息のようなカリクレイン系の関与を伴う炎症性疾患で使用され得る。それらは、線維素溶解の阻害により侵襲性の腫瘍の成長および転移を予防する。それらは、組織および血漿のカリクレインの阻害により例えば頭蓋脳外傷の痛みおよび浮腫の治療にもまた適する。内因性および外因性の血液凝固経路の阻害のために、それらは、透析治療の間のうっ血の活性化を予防するのに使用され得る。本発明は、さらに、本発明のアプロチニン変異体もしくはビクニンの１種をコードするＤＮＡ配列、こうしたＤＮＡ配列を含有する微生物、ならびに微生物を使用する本発明のアプロチニン変異体およびビクニンの製造方法に関する。図面の説明図１および２は、本発明の好ましいアプロチニン変異体およびアプロチニン変異体のビクニンを示す。太字にされた(emboldend)アミノ酸残基は天然のアプロチニンの突然変異を表わす。□は欠失されたアミノ酸残基を表わす。ビクニンのスペーサーはアミノ酸残基59ないし71である。本発明のアプロチニン変異体の製造本発明のアプロチニン変異体およびビクニンの製造に遺伝子工学の方法を使用することが便宜的である。これのため、通例の分子生物学的方法を使用して、遺伝情報、すなわち本発明のアプロチニン変異体およびビクニンをコードする適切なＤＮＡ配列が、考慮される各場合でアプロチニン変異体の合成のために適する微生物発現生物体に導入される。組換え微生物が発酵され；異種遺伝情報が適する条件の選択により発現される。発現されたアプロチニン変異体もしくはビクニンがその後培養液(culture broth)から回収される。本発明のアプロチニン変異体およびビクニンの産生のための適する宿主生物体は細菌、酵母もしくは真菌であり得る。この発現は細胞内でもしくは適する分泌系を使用して細胞外で実施され得る。アプロチニン変異体もしくはビクニンは、正しくプロセシングされ得るか、またはペプチドもしくはタンパク質に融合され得る。アプロチニン変異体の発現のための適する系は、特許出願ＥＰ６８３２２９、ＷＯ８９／０２４６３、ＷＯ９０／１００７５、および上で既に挙げられた特許出願の多様な他者に記述された。本発明の実施方法酵素：使用される酵素（制限エンドヌクレアーゼ、仔ウシ小腸からのアルカリホスファターゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ）は、ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim)およびギブコ／ＢＲＬ(GIBC O/BRL)から得、そして製造元の説明書に従って使用した。分子生物学技術：例えば、大腸菌(E．coli)からのプラスミドＤＮＡの単離（いわゆるミニプレップ(miniprep))およびプラスミドＤＮＡを使用する大腸菌(E．coli)の形質転換のような慣例のクローニング研究は、サンブルック(Sambrook)ら（Molecular Cloning）コールドスプリングハーバー、1989）に従って実施した。形質転換に使用された宿主生物体は大腸菌(E．coli )株ＤＨ５α（ギブコ／ＢＲＬ(GIBCO/BRL)）であった。より大量のプラスミドＤＮＡの単離のために、キアジェン(Qiagen)チップ（キアジェン(Qiagen)）を使用した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出は、ジェットソルブ(Jetsorb)の助けを借りて、製造元（ジェノメッド(Genomed)）の説明書に従って実施した。「部位特異的突然変異誘発」実験のためのオリゴヌクレオチドならびにＰＣＲおよび配列決定反応のためのプライマーは、アプライドバイオシステムズ(App lied Biosystems)からの「３８０ＡＤＮＡ合成機」を使用して調製した。突然変異誘発実験は、ファルマシアバイオテック(Pharmacia Biotech)からのキット（「唯一部位排除突然変異誘発(Unique Site Elimination Mutagenesis)」）を使用して、デング(Deng)とニコロフ(Nickoloff)(デング(Deng)ら、Anal．Bioc hem．200、81-88、1992)の手順に従って実施した。全ベクター構築物および突然変異誘発実験を、「ＡＢＩ３７３Ａ配列決定機」（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)）での蛍光標識ターミネーターを使用するＴａｑ周期ＤＮＡ配列決定(Taq cycle DNA sequencing)により確認した。サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の形質転換：例えば株ＪＣ３４．４Ｄ（ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｓｕｃ２）の酵母細胞を10mlのＹＥＰＤ（２％ブドウ糖；２％ペプトン；１％ディフコ(Difco)酵母抽出物）中で成長させ、そして0.6ないし0.8のＯ．Ｄ．_600nmで収穫した。細胞を５mlの溶液Ａ（１Mソルビトール；10mMビシンｐＨ8.35；３％エチレングリコール）で洗浄し、0.2mlの溶液Ａに再懸濁し、そして−70℃で保存した。プラスミドＤＮＡ（５μg）および担体ＤＮＡ（ニシン精子からのＤＮＡ50μg ）を凍結された細胞に添加した。細胞をその後、５分間振とうすることにより37 ℃で融解した。1.5mlの溶液Ｂ（40％ＰＥＧ１０００；200mMビシンｐＨ8.35）の添加後に、細胞を30℃で60分間インキュベーションし、1.5mlの溶液Ｃ（0.15MＮａＣｌ；10mMビシンｐＨ8.35）で洗浄し、そして100μlの溶液Ｃに再懸濁した。平板に広げること(plating-out)を、２％アガーを含有する選択培地上で実施した。形質転換体を30℃で３日インキュベーション後に得た。発酵のための栄養培地 1. SD2培地：バクト(Bacto)酵母窒素基剤 6.7g/l ブドウ糖^* 20g/l KH₂PO₄ 6.7g/l pH6.0 2. SC5培地：ブドウ糖^* 20g/l ディフコ(Difco)酵母抽出物 20g/l KH₂PO₄ 6.7g/l (NH₄)₂SO₄ 2.0g/l MgSO₄×7H₂O 1.0g/l 微量元素溶液SL4 1.0ml/l pH6.0 微量元素溶液SL4:タイトリプレックス(Titriplex)III 5g/l FeSO₄×7H₂O 2g/l ZnSO₄×7H₂O 0.1g/l MnCl₂×4H₂O 0.03g/l H₃BO₃ 0.3g/l CoCl₂×6H₂O 0.2g/l CuCl₂×2H₂O 0.01g/l NiCl₂×6H₂O 0.02g/l Na₂MoO₄×2H₂O 0.03g/l^* =別個にオートクレーブ3. 発酵槽培地: ブドウ糖^* 20g/l ダイズペプトン 25.0g/l KH₂PO₄ 1.4g/l MgSO₄×7H₂O 1.0g/l 塩化チアミン 5.1mg/l イノシトール 20mg/l 微量元素溶液 3ml/l ビタミン溶液 3ml/l (NH₄)₂SO₄ 3.8g/l pH5.5 供給溶液: ブドウ糖^* 530g/l (NH₄)₂SO₄ 5.0g/l KH₂PO₄ 2.9g/l MgSO₄×7H₂O 3.8g/l 塩化チアミン 13mg/l イノシトール 70mg/l 微量元素溶液 6.8ml/l ビタミン溶液 6.8ml/l 微量元素溶液: FcCl₃×6H₂O 13.5g/l ZnCl₂×4H₂O 2.0g/l H₃BO₃ 0.5g/l CoCl₂×6H₂O 2.0g/l CUSO₄×5H₂O 1.9g/l Na₂MoO₄×2H₂O 2.0g/l CaCl₂×2H₂O 1.0g/l 濃HCl 100ml/l ^*=別個にオートクレーブビタミン溶液:リボフラビン 0.42g/l パントテン酸カルシウム 5.9 g/l ニコチン酸 6.1g/l 塩酸ピリドキシン 1.7g/l ビオチン 0.06g/l 葉酸 0.04g/l 作業保存物(conserves)の調製ストック保存物を使用して、200mlのＳＤ２培地を１l三角フラスコ中に１％濃度で接種した。培養物を振とう器（260rpm）上28℃で72時間インキュベーションした。各２mlをその後保存容器中に分注しかつ液体窒素中で凍結した。、振とうフラスコでの発酵前培養物(preculture)として、200mlのＳＤ２培地を、作業保存物を使用して１％濃度で１lフラスコに接種し、そして振とう器（260rpm）上28℃で72時間発酵した。前培養物を使用して、主培養物（１lフラスコ中200mlのSC培地）に１％濃度で接種し、そして振とう器上28℃で72〜96時間インキュベーションした。 10lバイオリアクターでの発酵前培養物として、200mlのＳＤ２培地を、作業保存物を使用して１％濃度で１l フラスコに接種し、そして振とう器（260rpm）上28℃で72時間発酵した。10l発酵槽での主培養を、96時間の間にわたって供給バッチ発酵(fed-batch fermentat ion)として実施した。使用された栄養培地は発酵槽培地であり、また、開始体積は７１であった。発酵槽に200mlの前培養物を接種した。発酵条件：温度：28℃ 攪拌機速度：500rpm 通気：10l／分ｐＨ：5.5 頭隙圧：200mbar ７時間の発酵時間の後に供給を開始した。供給速度を呼吸商（ＲＱ）（ＲＱ＝形成されたＣＯ₂／消費された酸素）によって制御した。ＲＱが＞1.15の値に上った場合に供給速度を低下させ、それが＜1.05の値に落下した場合に供給速度を増大させた。規則的間隔でサンプルを発酵槽から取り、そして細胞の成長を700nmでの光学濃度の測定により測定した。加えて、上清中のプロテアーゼ阻害剤の濃度を活性測定により測定した。発酵の終了時に、ｐＨを、50％（ｗ／ｖ）クエン酸の添加により3.0に低下させ、そして発酵槽を70℃で10分間加熱した。細胞をその後7500×ｇでの遠心分離により分離し、そして上清をタンパク質精製に供給した。タンパク質の化学分析法のための材料配列分析は、アプライドバイオシステムズ(AppliedBiosystems)(米国、フォスターシティ）からのタンパク質配列決定器モデル４７３Ａを使用して実施した。標準的配列決定プログラムを使用した。配列決定器、多様な配列決定プログラムおよびＰＴＨ検出系は操作の手引き（使用者マニュアル、タンパク質配列決定系モデル４７３Ａ（1989）アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスターシティ、カリフォルニア州９４４０４、米国）に詳細に記述される。配列決定器の操作のための試薬およびＰＴＨ検出のためのＨＰＬＣカラムはアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)から得た。ＨＰＬＣ分析は、ヒューレットパッカード(Hewlett Packard)(ドイツ、ヴァルトブロン)からのＨＰ１０９０ＨＰＬＣ系を使用して実施した。バッカーボンド(Backerbond)(ドイツ、グロースゲナウ)からのＲＰ−１８−ＨＰＬＣカラム（ 250mm×4.6mm、５μ材料、30nm（300オングストローム）孔径）を分離に使用した。キャピラリー電気泳動モデル２７０Ａ−ＨＴはアプライドバイオシステムズ (Applied Biosystems)(フォスターシティ、カリフォルニア州９４４０４、米国) からであった。概して、サンプルは多様な時間間隔にわたって流体力学的に(hyd rodynamically)注入した。使用されたキャピラリーカラム（50μm×72cm）はアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)からであった。アミノ酸分析は、エッペンドルフビオトロニク(Eppendorf Biotronik)(ドイツ、マインタル)からのアミノ酸分析機ＬＣ３０００を使用して実施した。ビオトロニク(Biotronik)からのわずかに改変された標準的分離プログラムを使用した。分離プログラムおよび分析機の機能は装置の手引きに詳細に記述される。分子量は、クラトス／シマズ(Kratos/Shimadzu)(ドイツ、ジュイスブルク)からのＭＡＬＤＩＩ系を使用して測定した。ＳＤＳ電気泳動はファルマシア(Pha rmacia)(ドイツ、フライブルク)からの電気泳動系を使用して実施した。速度論的データの測定は、ＳＬＴ（ドイツ、クライルスハイム）からのマイクロタイタープレート読取り器を使用して実施した。マイクロタイタープレートの洗浄は、ダイナテック(Dynatec)(ドイツ、デンケンドルフ)からの洗浄装置を使用して実施した。酵素および基質はカルバイオケム(Calbiochem)(ドイツ、バードゾーデン)からであった。全部の他の化学物質および試薬はメルク(Merck)（ドイツ、ダルムシュタット）もしくはシグマ(Sigma)(ドイツ、ダイゼンホーフェン)からであった。96穴プレートはグライナー(Greiner)から得た。ポリクローナルウサギ抗アプロチニン抗体を、アプロチニンでの免疫によりウサギで生じさせた。ヒトポリクローナル抗アプロチニン抗体はアプロチニンで治療された患者から源を発する。タンパク質の化学分析法Ｎ末端配列分析：水に溶解された１〜３nmolのプロテアーゼ阻害剤を配列決定器シート上に負荷し、これをポリブレン［Polybren］（商標）とともに前インキュベーションした。タンパク質を、迅速正常配列決定器周期を使用して配列決定した。ＰＴＨアミノ酸を、50pmolのＰＴＨ標準品の助けを借りてオンラインＨＰＬＣによって同定した。アミノ酸分析：200μgのタンパク質を200μlの６N塩酸に溶解し、そして166℃ で１時間加水分解した。約１nmolのサンプルをアミノ酸分析機に添加した。アミノ酸の量を５nmolの標準品によって決定した。システインは、上述されたとおり、タンパク質の過ギ酸酸化（ヒルス(C.H.W．Hirs)、Methods Enzymol．11．59-6 2）により決定した。ＳＤＳゲル電気泳動：ＳＤＳゲル電気泳動はレムリ(Laemmli)(レムリ(U.K．La emmli)、Nature 227,680-685(1970)およびメリル(C.R．Merril)、デュナウ(M.L ．Dunau)、ゴールドマン(D．Goldman)、Anal．Biochem．110:201-207(1981)）の条件に従って実施した。10μgのプロテアーゼ阻害剤を、10〜20％濃度のＳＤＳゲルを使用して分析し、そして銀染色（メリル(Merril)ら）によって目に見えるようにした。キャピラリー電気泳動：８ngのプロテアーゼ阻害剤を、ガラスカラム（長さ72 cm、内径50μm）でのキャピラリー電気泳動によって検討した。条件：電流強さ65μA、カラム温度30℃、100mMリン酸緩衝液ｐＨ3.0、検出210nm 、加圧下負荷１s。逆相クロマトグラフィー：5nmolのプロテアーゼ阻害剤を、ベイカーボンド(Ba kerbond)ＲＰ−１８ＨＰＬＣカラム（５μ材料、4.6mm×250mm、30nm（300オングストローム）孔径）でクロマトグラフィー分離した。使用された溶離液はアセトニトリル／ＴＦＡ勾配であった。条件：流速0.7ml/分、カラム温度40℃、検出 210nm、溶媒Ａ：0.1％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：0.1％ＴＦＡ／60％アセトニトリル；勾配：０分０％Ｂ、10分０％Ｂ、70分100％Ｂ、80分０％Ｂ。分子量測定：１μｇのプロテアーゼ阻害剤をＭＡＬＤＩ技術を使用して分析した。使用さたマトリックスはシナピン酸であった。質量較正のための標準タンパク質は、メリチン(2847Da)、ウシインスリン（5734Da）、チトクロームC（12327Da）およびミオグロビン（16951Da）であった。タンパク質含有量：サンプルのタンパク質含有量は、アミノ酸分析を使用して、もしくはＯＤ_280nmの測定により測定した。トリプシン阻害試験（滴定法による）：発酵培養液中のプロテアーゼ阻害剤のトリプシン阻害活性を、Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）のトリプシンに触媒される加水分解によって測定した。アルカリ滴定により決定される反応中に遊離されるカルボキシル基の数が当該阻害剤のトリプシン阻害活性の尺度である。ポリクローナルウサギもしくはヒト抗アプロチニン抗体とのプロテアーゼ阻害剤の交差反応の測定：結合緩衝液(coupling buffer)に溶解された0.5〜10ngのプロテアーゼ阻害剤もしくはアプロチニンを４℃で一夜マイクロタイタープレートに結合させた。ウェルを各回300μlの洗浄緩衝液で４回洗浄し、そして100μlのブロッキング溶液をその後添加した。プレートを覆い、そして37℃で１時間インキュベーションした。上述されたとおり洗浄した後に、ポリクローナルウサギ抗アプロチニン抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡ中0.2μg/ml）もしくはポリクローナルヒト抗体（ＰＢＳ緩衝液中１％ＨＳＡ中20μg/ml）を添加した。プレートを覆い、37℃で１時間インキュベーションし、そしてその後上述されたとおり洗浄した。100μlのビオチニル化抗ウサギもしくは抗ヒト抗体(25μl＋10mlのＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡもしくは１％ＨＳＡ）をその後添加し、そして混合物を37 ℃で１時間インキュベーションした。プレートを上述されたとおり洗浄し、そして100μlのストレプトアビジン −ペルオキシダーゼ複合体（50μl＋10m1のＰＢＳ緩衝液中１％ＢＳＡもしくは１％ＨＳＡ）をその後各ウェルに添加した。プレートを覆い、そして37℃で１時間インキュベーションし、そしてその後上述されたとおり洗浄した。基質反応を、ＴＭＢ基質＋ペルオキシダーゼ溶液（１＋１；ウェルあたり100 μl）を使用して実施した。反応を、100μl／ウェルの２Mリン酸を使用して10分後に停止し、そして吸収を450nmで測定した（対照570nm）。溶液：１．結合緩衝液：15mMＮａ₂ＣＯ₃、35mMＮａＨＣＯ₃、ｐＨ9.6 ２．サンプル緩衝液：サンプルを、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７中１％ＢＳＡもしくはＨＳＡ中に適する濃度で溶解した。３．洗浄溶液：ＰＢＳ中0.1％（ｖ／ｖ）トゥイーン［Tween］（商標）２０。４．ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡもしくはＨＳＡ。阻害定数の測定：多様な酵素での阻害定数の測定はビート(Bieth)(ビート(J.G ．Bieth)Methods in Enzymology 248:59-84(1985))に従って実施した。基質は、プラスミンについてクロモチム(Chromozym)ＰＬ、第XI因子についてＨＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、トリプシンについてＳ−２４４４、キモトリプシンについてＳｕｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、第Xa因子についてＢｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、尿カリクレインについてＨＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ− ｐＮＡ、およびＨＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡであった。実施例実施例１：組換えＳｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇ１ｕ５３−アプロチニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４ −Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子の調製に使用された出発原料は、改変されたｐＹＥＳ２ベクター（ｐＩＵ２８．１１．Ｌ）中のＳｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子であった。ベクターｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(Invitrogen)）に存在するＧＡＬ１プロモーターおよびｆｌｏｒｉがこのベクター中でＭＦα１プロモーターにより置き換えられる。当該アプロチニン変異体の３’端の「マルチクローニング部位(Multiple Cloning Site)」中のＸｈｏＩ切断部位の除去のため、ベクターｐＩＵ２８．１１．ＬをＥｃｏＲＩおよび部分的にＸｂａＩで分解させ、そしてその後クレノウボリメラーゼおよびｄＮＴＰで満たした。このクローニングから生じるベクター（ｐＩＵ１７．４．Ｍ）を、Ｕ．Ｓ．Ｅ．の方法（ファルマシアバイオテック (Pharmacia Biotech)）に従って突然変異誘発プライマーＡを用いて二本鎖突然変異誘発反応にかけ、ＸｈｏＩでの制限を実施することが可能である。なぜならアプロチニン遺伝子中の唯一のＸｈｏＩ切断部位がこの突然変異誘発により除去されるからである。突然変異誘発プライマーＡは以下の配列すなわち５’ＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＡＣＡＴＴＡＣＴＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＴ３’ を有した。このプライマーは、Ｓｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子中に突然変異Ｉｌｅ１３、Ｔｙｒ１７およびＴｈｒ１９を生じさせる。クローンの分析を、酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの制限消化により実施した。所望の配列を、クローンｐＩＵ２．７．ＭのＤＮＡ配列決定により付加的に確認した。酵母細胞（ＪＣ３４．４Ｄ）をベクターｐＩＵ２．７．Ｍを使用して形質転換した。発現ベクターｐＩＵ２．７．Ｍはもはやいかなるα因子のプロ配列も含有せず、その結果、Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンのプロセシングがシグナルペプチダーゼにより独占的に実施され、そしてＫｅｘII プロテアーゼによる切断に独立である。実施例２：組換えＳｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４ −Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子の調製に使用された出発原料は、ベクターｐＩＵ１７．４．Ｍ中のＳｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子であった（実施例１を参照）。ベクターｐＩＵ１７．４．Ｍを、Ｕ．Ｓ．Ｅ．の方法（ファルマシアバイオテック(Pharmacia Biotech)）に従って突然変異誘発プライマーＡ（実施例１を参照）およびＢを使用して二本鎖突然変異誘発反応にかけ、ＸｈｏＩを使用して制限を実施することが可能である。なぜならアプロチニン遺伝子中の唯一のＸｈｏＩ切断部位がプライマーＡでの突然変異誘発により除去されるからである。突然変異誘発プライマーＢは以下の配列すなわち５’ＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＡＡＣＣＧＴＡＡＣ３’ を有した。プライマーＡは、Ｓｅｒ１０−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ａｓｐ２４ −Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン遺伝子中の突然変異Ｉｌｅ１３、Ｔｙｒ１７およびＴｈｒ１９を、そしてプライマーＢは突然変異Ｌｅｕ３９を生じさせる。クローンの分析を、酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩでの制限消化により実施した。所望の配列を、クローンｐＥＳ８．４．ＯのＤＮＡ配列決定により付加的に確認した。酵母細胞（ＪＣ３４．４Ｄ）をベクターｐＥＳ８．４．Ｏを使用して形質転換した。実施例３：天然のＮ末端配列「Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ」を有する組換えＩｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製天然のＮ末端配列「Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ」を有するＩｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニンの分泌を可能にする酵母発現ベクターの調製のため、ＭＦα１プロモーターを最初にＰＣＲによって増幅し、そしてα因子のプレ配列およびアプロチニン遺伝子の５’端（制限酵素ＸｈｏＩの認識配列まで）とともにクローニングした。使用されたプライマーは以下の配列すなわちプライマーＣ（ＥｃｏＲＶ認識配列が下線をつけられる）：５’ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧ３’。プライマーＤ（ＸｈｏＩ認識配列が下線をつけられる）：５’ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＴＡＴＴ３’ を有した。ＰＣＲバッチは、総体積50μl中に200ngのｐＡ２０２プラスミドＤＮＡ、0.2 μMプライマーＣ、0.2μMプライマーＤ、200μMｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ反応緩衝液１１（ストラタジーン(Stratagene)、オプティプライム［Opti-Prime］（商標 )）および2.5UのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin Elm er)）を含有した。「周期(cycle)」条件は：94℃で１分、各場合94℃で１分、50 ℃で１分および72℃で２分の30周期、そして72℃でその後５分のインキュベーションであった。ＰＣＲバッチを５倍に希釈し、そしてベクターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を使用して連結した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５α細胞を、連結バッチを使用して形質転換した。陽性のクローンを、酵素ＥｃｏＲＩでの制限消化後に同定し、そしていくつかのクローンを配列決定した。クローンｐＩＵ２０．１１．Ｌをさらなる研究に使用した。大腸菌(E．coli)／酵母シャトルベクターｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン(In vitrogen)）を酵母分泌ベクターの構築に使用し、ここでＩＩｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン配列を酵母のα因子のプレ配列に直接結合する。ベクターｐＹＥＳ２を最初に制限酵素ＳｓｐｌおよびＢａｍＨＩを使用して切断し、脱リン酸化し、そしてゲル精製した。ベクターｐＹＥＳ２に存在するＧＡＬ１プロモーターおよびｆｌｏｒｉがここで除去される。大きさおよそ1030bpのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩを使用してベクターｐＩＵ２０．１１．Ｌから切り出し(exc ised)、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そして、ベクターｐＥＭ２４．３．Ｌからの大きさ約180bpのＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ断片と一緒に、ＳｓｐＩおよびＢａｍＨＩを使用して切断されたベクターｐＹＥＳ２にクローニングした。大腸菌(E．coli)ＤＨ５α細胞をこの連結バッチを使用して形質転換した。陽性のクローンを同定し、そして酵素ＸｈｏＩでの制限消化の後に配列決定した。酵母細胞（ＪＣ３４．４Ｄ）を、このクローニングから生じるベクターｐＥＭ１．４．Ｌを使用して形質転換した。実施例４：組換えデスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンの分泌のための酵母発現ベクターの調製組換えデスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニン遺伝子の調製に使用された出発原料は、デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６遺伝子、Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７遺伝子およびスペーサーを生じさせる２種のオリゴヌクレオチドであった。各アプロチニン変異体遺伝子を、ＰＣＲ反応によってスペーサーオリゴヌクレオチドの一方に結合し、そしてＰＣＲクローニングベクターに連結した。スペーサーオリゴヌクレオチド１：５’ＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＧＣＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＧＴＴＡＧＣＧＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＡＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＣＧＣ３’ スペーサーオリゴヌクレオチド２：５’ＧＧＡＡＧＡＴＴＧＴＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣ３’ ＰＣＲバッチは、100μlの総体積中に、570ngのｐＥＭ３０．３．ＬプラスミドＤＮＡ（デスＰｒｏ（２）−Ｉｌｅ（１３）−Ａｒｇ（１５）−Ｔｙｒ（１７）−Ｔｈｒ（１９）−Ｌｅｕ（３９）−Ｌｅｕ（４６）−アプロチニンをコードする）、20pmolのプライマーＥ（プライマーＥはα因子のリーダー中で結合し、そして以下の配列すなわち５’ＡＡＣＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡ３’を有する）、60pmolのスペーサーオリゴヌクレオチド１、200μMｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ反応緩衝液II（パーキンエルマー(Perkin Elmer)）、2mMＭｇＣｌ₂および2. 5UのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin Elmer)）を含有した。「周期」条件は：95℃で３分、各場合94℃で１分、55℃で１分および72 ℃で１分の25周期、そして72℃でその後５分のインキュベーションであった。ＰＣＲバッチを５倍に希釈し、そしてベクターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を使用して連結した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５ α細胞を、この連結バッチを使用して形質転換した。陽性のクローンを「青色・白色スクリーニング(blue-white screening)」によって、また、酵素ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを使用する制限消化の後に同定した。クローンｐＦ：Ｍ２２．５．Ｌが所望の配列を含有し、そしてさらなる研究に使用した。スペーサーオリゴヌクレオチド２のＡｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンとの結合がプライマー伸長反応に先行した。それは、100μlの総体積中に、60pmol のスペーサーオリゴヌクレオチド２、200μMｄＮＴＰ、２Uのクレノウ断片、20n gのｐＥＭ６．６．ＬプラスミドＤＮＡ、および２mMＭｇＣｌ₂を含有した。反応条件：95℃で３分間のクレノウ断片を含まない試験バッチを加熱する。クレノウ断片の添加後に、混合物を室温で30分間インキュベーションした。それを 70℃に加熱し、そして、2.5UのＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび20pmolの逆プライマーＭ１３を添加した。「周期」条件は：95℃で３分、各場合で94℃で１分、45℃で１分および72℃で１分の30周期、そして72℃でその後の５分のインキュベーションであった。約15 0ngのＰＣＲ断片を、ベクターｐＣＲII（インヴィトロジェン(Invitrogen)）を使用して連結した。大腸菌(E．coli)ＤＨ５α細胞をこの連結バッチを使用して形質転換した。陽性のクローンを同定し、そして酵素ＥｃｏＲＩを使用する制限消化後に配列決定した。クローンｐＥＭ１２．６．Ｌが所望の配列を含有し、そしてさらなる研究に使用した。大きさ182bpのＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄIIIおよびＢｓｐＭＩを使用してベクターｐＥＭ２２．５．Ｌから切り出し、また、大きさ240bpのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＭＩを使用してベクターｐＥＭ１２．６．Ｌから切り出し、アガロースゲル電気泳動によって精製し、そしてＴ４−ＤＮＡリガーゼで一夜連結した。ライゲーション生成物を、制限切断部位ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩによってベクターｐＵＣ１９にクローニングした。生じるクローン（ｐＥＭ１６．６．Ｌ）は所望の配列を有した。大腸菌(E．coli)／酵母シャトルベクターｐＡ２０２を酵母分泌ベクターの構築に使用し、ここで、デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５一Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニン配列を酵母のα因子のプレプロ配列に結合する。ベクターｐＡ２０２は、アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）ならびに大腸菌(E．coli)および酵母の選択可能なマーカー遺伝子としてＵＲＡ３を運搬する。当該ベクターの他の不可欠の要素は、ＣｏｌＥ１および２μ複製開始点（ｏｒｉ）である。ＲＥＰ３遺伝子座が同様にこの領域に配置される。大きさ1200bp のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片が、ＭＦα１プロモーターおよび酵母のα因子前駆体タンパク質のＮ末端のプレプロ配列（クルジャン(Kurjan)とヘルスコヴィッツ(Herskowitz)、Cell 30、933-943、1982）を運搬する。酵母ベクターのクローニング：大きさ422bpの断片を、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩを使用してクローンｐＥＭ１６．６．Ｌから切り出した。これをアガロースゲルによって精製し、そして同様にベクターｐＡ２０２にクローニングし、これをＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩを使用して切断する。これから生じるクローンｐＥＭ２１．６．Ｌを酵母細胞（ＪＣ３４．４Ｄ）の形質転換に使用する。例えば、構成的ＧＡＰＤＨもしくは誘導可能なＧＡＬ１０プロモーターのような多様なプロモーターを有する他の大腸菌(E．coli)／酵母シャトルベクターが、類似の様式で調製され得、そして同様にデスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンの分泌につながる。加えて、例えば染色体で自律的に複製する区分（ａｒｓ）のような他の酵母の複製開始点をもつシャトルベクターを使用することもまたもちろん可能である。ＵＲＡ３遺伝子に加えて、適する選択可能なマーカー遺伝子は、栄養要求酵母突然変異体が例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ３もしくはＴＲＰＩ遺伝子のような原栄養性(prototrophy)を達成するのを助ける遺伝子である。さらに、その産物が例えばアミノグリコシドＧ４１８のような多様な抗生物質に対する耐性を媒介する遺伝子を使用することもまたもちろん可能である。例えばメチル栄養性酵母ピキアパストリス(Pichia pastoris)もしくはハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)のような他の酵母が、適するベクターでの形質転換後に、デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７− Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７− ビクニンを産生することが同様に可能である。実施例５：サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の発酵組換えサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)発現株を発酵に使用した（参照：本発明の実施方法）。実施例６：中性のｐＨで正味の電荷をもたないアプロチニン変異体およびビクニンの精製Ｉ．適する精製方法の調査発酵後に、細胞を遠心分離により分離し、そして残存する上清を、残存する細胞を除去するために濾過する。細胞を含まない上清を、濃クエン酸の添加によりｐＨ３に調節する。この溶液は、８mS/cm未満の伝導率を確立するために精製水で適して希釈しなければならない。これの後に、この溶液を、酸性緩衝液で以前に平衡化してある陽イオン交換カラムに適用する。結合されない物質を、開始緩衝液での徹底的な洗浄により除去する。生成物を塩勾配の助けを借りて溶出する。得られる画分を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、およびプロテアーゼ阻害を測定する生物学的活性試験の助けを借りてぞれらの生成物含有量について検討する。生成物を含有する画分を合わせ、そして調製的ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに直接適用する。カラムは以前に酸性緩衝液で平衡化した。結合されないタンパク質を、開始緩衝液でカラムを洗浄することにより除去する。生成物を有機溶媒勾配の助けを借りて溶出する。既に上述されたとおり、画分を再度生成物含有量について検討し、そして生成物を含有する画分を合わせる。達成される生成物の純度に依存して、合わせられた画分を第二のＲＰ−ＨＰＬＣカラムにより精製することがおそらく必要であることができる。その条件は既に記述されたと本質的に同一である。得られる生成物の溶液を、注入の目的上水で希釈し、そして適する部分で分注しかつ凍結乾燥する。上述された方法と組み合わせられ得る、中性のｐＨで正味の電荷をもたないアプロチニン誘導体の精製のための他の方法は、セファロース［Sepharose］（商標）に固定されたトリプシンでのアフィニティクロマトグラフィー、およびゲル浸透クロマトグラフィーである。 II．Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇ１ｕ５３−アプロチニンの精製 10l発酵からの材料を以下の方法により精製した。発酵が完了した後に、発酵槽の内容物を濃クエン酸を使用してｐＨ３に調節し、そして70℃で10分間加熱した。細胞をその後遠心分離（15分、7500×g、ヘラエウスツェントリフージ(Her aeus Zentrifuge)）により除去し、そして得られた上清を濾過した（８μｍないし0.2μm、ミリポア(Millipore)、ドイツ）。この段階で、上清は−18℃で凍結させることによりさらなる使用まで保存し得る。溶液をその後、精製水の添加により８mS/cm未満の伝導率に希釈し、そしてＳＰ−セファロース［Sepharose］（商標）ＦＦカラム（ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）に適用した。カラムは50mMクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ３で以前に平衡化されていた。結合されないタンパク質を同一緩衝液での集中的洗浄により除去した。生成物をその後塩勾配（１MＮａＣｌ）の助けを借りて溶出した。得られた画分を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ４）の助けを借りて、およびプロテアーゼ阻害活性を試験することにより、生成物含有量について検討した。所望の生成物を含有する画分を合わせた。生成物の溶液をその後、最初にＲＰ −ＨＰＬＣカラム（ソース(Source)１５ＲＰＣ、ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）に直接適用した。これは以前に0.1％トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていた。結合されないタンパク質を同一緩衝液での集中的洗浄により除去した。生成物を、直線アセトニトリル勾配（０−70％）の助けを借りて溶出した。得られた画分を、再度、上述された方法を使用して生成物含有量について検討し、そして、生成物を含有したものを合わせかつ凍結乾燥した。最終精製のために、タンパク質を150mMＮａＣｌ／50mMリン酸緩衝液ｐＨ7.3に溶解し、そしてスーパーデックス(Superdex)３０カラムでクロマトグラフィー分離した。得られた画分を、再度、上述された方法を使用して生成物含有量について検討し、そして生成物を含有したものを合わせた。 III．デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンの精製 10l発酵からの材料を以下の方法により精製した。発酵が完了した後に、発酵槽の内容物を濃クエン酸を使用してｐＨ３に調節し、そして70℃で10分間加熱した。細胞をその後遠心分離（15分、7500×g、ヘラエウスツェントリフージ(Hera eus Zentrifuge)）により除去し、そして得られた上清を濾過した（８μmないし 0.2μm、ミリポア(Millipore)、ドイツ）。この段階で、上清は−18℃で凍結させることによりさらなる使用まで保存し得る。この溶液をその後、精製水の添加により８mS/cm未満の伝導率に希釈し、そしてＳＰ−セファロース［Sepharose］（商標）ＦＦカラム（ファルマシア(Pharmacia)、スウエーデン）に適用した。カラムは50mMクエン酸−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ３で以前に平衡化されていた。結合されないタンパク質を同一緩衝液での集中的洗浄により除去した。生成物をその後塩勾配（１MＮａＣｌ）の助けを借りて溶出した。得られた画分を、８mS/ cm未満に調節した後に、セファロース［Sepharose］（商標）ＨＰカラムを使用してクロマトグラフィー分離した。このカラムは以前に20mMＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ６で平衡化されていた。結合されないタンパク質を同一緩衝液での集中的洗浄により除去した。生成物をその後塩勾配（１MＮａＣｌ）の助けを借りて溶出した。得られた画分を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ４）の助けを借りて、および、プロテアーゼ阻害活性を試験することにより、生成物含有量について検討した。所望の生成物を含有した画分を合わせた。生成物の溶液をその後、最初にＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ソース(Source)１５、ＲＰＣ、ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン）に直接適用した。これは以前に0.1％トリフルオロ酢酸／水で平衡化されていた。結合されないタンパク質を同一緩衝液を使用する集中的洗浄により除去した。生成物を、直線アセトニトリル勾配（０−70％）の助けを借りて溶出した。得られた画分を、再度、上述された方法を使用して生成物含有量について検討し、そして、生成物を含有したものを合わせかつ凍結乾燥した。最終精製のために、タンパク質を、Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ勾配ｐＨ６を使用するソース(Source)Ｓ３０カラムでクロマトグラフィー分離した。得られた画分を、上述された方法を使用して生成物含有量について再度検討し、そして生成物を含有したものを合わせかつ凍結乾燥した。実施例７：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇ１ｕ５３−アプロチニンを使用するヒトプラスミンのＫ_i値の測定１Uのヒトプラスミンを緩衝液（0.2Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.01MＣａＣｌ₂、0.05％トゥイーン［Tween］（商標）２０；ｐＨ８；１ml のベンジルアルコール／l）で16mlに希釈した。この酵素溶液200μlを、減少する体積の試験緩衝液（250、240、230、220、200、180、170、150、100、50μl）で処理し、そしてその後、アッセイ緩衝液中の増加する量の阻害剤を添加した（ 10、20、30、50、70、80、100、150、200および250μl；濃度0.6μg/μl)。酵素／阻害剤溶液を室温で４時間前インキュベーションし、その後180μlの各溶液をマイクロタイタープレートのウェルに添加し、そして20μlの基質溶液と混合した。吸収の変化を405nmで10分間測定した。酵素反応の速度を測定し、そしてＫ_i値をビート(Bieth)(Biochemical Medicine 32:387-97(1984)もしくはMet h．In Enzym．238:59-84(1995))の方法に従ってそれから算出した。基質ストック溶液：ＤＭＳＯ中0.1M 基質溶液：アッセイ緩衝液中１×10^-3Mクロモチム (Chromozym)ＰＬアッセイ緩衝液： 0.2Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.01MＣａＣｌ₂、0.05％トゥイーン[Tween](商標)２０；ｐＨ８；１mlのベンジルアルコール／１。酵素カリクレイン、第Xa因子、トリプシンおよびキモトリプシンとの複合体形成の速度論定数(kinetic constant)を同一手順により測定した。基質は、血漿カリクレインについてＨＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、トリプシンについてＳ−２４４４、キモトリプシンについてＳｕｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｐｈｅ−ｐＮＡおよび第Xa因子についてＢｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −ｐＮＡであった。ビクニン、ビクニンの離れたドメインおよびＰＥＧ結合体(conjugate)の速度論定数を同一の方法により測定した。実施例８：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンのタンパク質化学的特徴づけの結果プロテアーゼ阻害剤Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンを、遺伝子的に改変された酵母生物体による分泌により製造した。それを、多様なクロマトグラフィー方法により酵母上清から均一まで精製した。以下のタンパク質分析的検討はクローニングされた配列を有する阻害剤の正体(ident ity)を示す。Ｎ末端配列分析：このプロテアーゼ阻害剤を58段階の間にわたって完全に配列決定した。以下の一覧は決定されたタンパク質配列を示し、これはクローニングされた配列と同一である。すなわちアミノ酸分析：アミノ酸分析はタンパク質の特徴づけの重要な定量的パラメータである。タンパク質含有量に加え、個々のアミノ酸の数が、一次構造が既知である場合に決定される。Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンのアミノ酸分析は一次構造からの理論値と良好な一致にある（表１）。逆相クロマトグラフィー：化学的に結合された逆相でのタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラフィーで、使用される相への結合が、タンパク質の疎水性相互作用を介して起こる。タンパク質は固定相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）によりはずされる。この理由から、この方法はタンパク質の純度の評価の良好な規準である。プロテアーゼ阻害剤Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンはＲＰ−１８相から１本の細いピークとして溶出する。ＣＥクロマトグラフィー：キャピラリー電気泳動は、電場でのそれらの電荷のためにペプチドおよびタンパク質の分離を可能にする。分離の質は、ここでは、使用される緩衝液、ｐＨ、温度および添加物に依存する。使用されるキャピラリーは、50ないし100μｍの内径を有するいわゆる「溶融シリカ」カラムである。プロテアーゼ阻害剤Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンは電場中で「溶融シリカ」カラム上で分離された。電気泳動図は１本の細いピークを示す。分子量測定：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ −Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンの分子量を、ＭＡＬＤＩ技術を使用して6425ダルトンであると測定した。測定された分子量は、当該測定方法の正確さの状況で、6408ダルトンという理論値とここで良好な一致にある。シナピン酸をマトリックスとして使用した。ＳＤＳゲル電気泳動：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンをＳＤＳ電気泳動によって還元および非還元条件下で分析した。ゲルは約6.5kDの範囲に１個のバンドを示す。実施例９：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンと酵素の複合体形成のＫ_i値の測定Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４ −Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンの阻害定数を多様な酵素について測定した。Ｋ_i値を表２に示す。実施例１０：ポリクローナルウサギもしくはヒト抗アプロチニン抗体との当該プロテアーゼ阻害剤の相互作用組換え的に製造されたプロテアーゼ阻害剤を、ポリクローナルウサギもしくはヒト抗アプロチニン抗体とのそれらの交差反応性について検討した。多様なプロテアーゼ阻害剤の変異体は、使用されたポリクローナルウサギもしくはヒト抗アプロチニン抗体に対する非常に弱い交差反応性を示すのみであることが見出された。実施例１１：デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ −Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンを使用するヒト尿カリクレインのＫ_i値の測定ヒト尿カリクレインを使用するＫ_i値の測定を、実施例７に記述されたとおり実施した。使用された阻害剤濃度は1.1μg/μlであった。基質ストック溶液：ＤＭＳＯ中0.1M 基質溶液：アッセイ緩衝液中１×10^-3MＨＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡアッセイ緩衝液： 0.05Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、0.1MＮａＣｌ、0.05％トゥイーン[Tween](商標)２０；pH7.5；1mlのベンジルアルコール／l。酵素カリクレイン、第Xa因子、キモトリプシンおよびプラスミンとの複合体形成の速度論定数を同一の手順に従って測定した。基質は、血漿カリクレインについてＨＤ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、キモトリプシンについてＳｕｃ− Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、第Xa因子についてＢｚ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ、およびプラスミンについてクロモチム(Chromozym)ＰＬであった。実施例１２：デスＰｒｏ２−ＩＩｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ −Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンのタンパク質化学的特徴づけの結果プロテアーゼ阻害剤デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンを、遺伝子的に改変された酵母生物体による分泌により製造した。それを多様なクロマトグラフィーの方法により酵母上清から均一まで精製した。以下のタンパク質分析的検討は、クローニングされた配列をもつ阻害剤の正体を示す。配列分析：当該プロテアーゼ阻害剤を完全に配列決定した。配列決定を、培養上清から単離したビクニンの断片によって、および臭化シアンペプチドによってＮ末端で実施した。以下の一覧は、当該断片の決定されたタンパク質配列、すなわち、Ｎ末端配列決定（下線を付けられる）、酵母発酵の培養上清からのビクニンの断片（太字）、臭化シアン断片（斜体）を示す。決定された配列はクローニングされた配列に同一である。アミノ酸分析：アミノ酸分析はタンパク質の特徴づけの重要な定量的パラメータである。タンパク質含有量に加え、個々のアミノ酸の数が、一次構造が既知である場合に決定される。デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７− Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７− ビクニンのアミノ酸分析は一次構造からの理論値と良好な一致にある（表３）。逆相クロマトグラフィー：化学的に結合された逆相でのタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラフィーで、使用される相への結合が、タンパク質の疎水性相互作用によって起こる。タンパク質は固定相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）によりはずされる。この理由から、この方法はタンパク質の純度の評価の良好な規準である。デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７− Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７− ビクニンはＲＰ−１８相から１本の比較的不純物を含まない(clean)ピークとして溶出する。分子量測定：デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンの分子量を、ＭＡＬＤＩ技術を使用して14314ダルトンであると測定し，た。測定された分子量は、当該測定方法の正確さの状況で、14313ダルトンという理論値とここで良好な一致にある。シナピン酸をマトリックスとして使用した。ＳＤＳゲル電気泳動：デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７− Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇｌ５−Ａｌａ１７− ビクニンをＳＤＳ電気泳動によって非還元条件下で分析した。ゲルは約14kDの範囲に１個のバンドを示す。実施例１３：デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ −Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンと酵素の複合体形成のＫ_i値の測定デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−スペーサー−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−ビクニンの阻害定数を多様な酵素について測定した。Ｋ_i値を表４に示す。実施例１４：Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇｌ−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンのタンパク質化学的特徴づけの結果プロテアーゼ阻害剤Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンが、多様なクロマトグラフィー処置により、ビクニンの他の切断生成物に加えて酵母上清から単離された。当該プロテアーゼ阻害剤はビクニンの後方部分に対応する。それは第２のクニッツ(Kunitz)ドメインを含有する。それを均一まで精製した。以下のタンパク質分析的検討はビクニンとの関連を示す。配列分析：配列決定を60段階を越えてＮ末端で実施した。それは第２のビクニンドメインとの同一性(identity)を示す。逆相クロマトグラフィー：化学的に結合された逆相でのタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラフィーで、使用される相への結合が、タンパク質の疎水性相互作用を介して起こる。タンパク質は固定相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）によりはずされる。この理由から、この方法はタンパク質の純度の評価の良好な規準である。Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンはＲＰ−１８相から１本の比較的不純物のないピークとして溶出する。分子量測定：Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンの分子量を、ＭＡＬＤＩ技術を使用してＮａ⁺イオンとして7154ダルトンであると測定した。測定された分子量は、当該測定方法の正確さの状況で、7150ダルトンというＮａ⁺イオンの理論値とここで良好な一致にある。シナピン酸をマトリックスとして使用した。ＳＤＳゲル電気泳動：Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１−Ａｒｇ１５−Ａ１ａ１７−アプロチニンをＳＤＳ電気泳動によって還元および非還元条件下で分析した。ゲルは約７kDの範囲に１個のバンドを示す。実施例１５：Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンと酵素の複合体形成のＫ_i値の測定Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−デスＡｒｇ１− Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−アプロチニンの阻害定数を多様な酵素について測定した。Ｋ_i値を表５に示す。実施例１６：Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２）−Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２ −Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６ −アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１のタンパク質化学的特徴づけの結果プロテアーゼ阻害剤Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２）−Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１が、多様なクロマトグラフィーの方法により、ビクニンの他の切断生成物に加えて酵母上清から単離された。当該プロテアーゼ阻害剤はビクニンの前方部分に対応する。それは第１のクニッツ(Kunitz)ドメインを含有する。それを均一まで精製した。以下のタンパク質分析的検討はビクニンとの関連を示す。配列分析：配列決定を21段階を越えてＮ末端で実施した。それは第１のビクニンドメインとの同一性を示す。逆相クロマトグラフィー：化学的に結合された逆相でのタンパク質のＨＰＬＣクロマトグラフィーで、使用される相への結合が、タンパク質の疎水性相互作用を介して起こる。タンパク質は固定相へのそれらの結合の強さに従って有機溶媒（移動相）によりはずされる。この理由から、この方法はタンパク質の純度の評価の良好な規準である。プロテアーゼ阻害剤Ａｓｐ（−−３）−Ｌｙｓ（−２） −Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０− Ａｓｎ６１は、ＲＰ−１８相から１本の比較的不純物のないピークとして溶出する。分子量測定：Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２）−Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１の分子量を、ＭＡＬＤＩ技術を使用してＮａ⁺イオンとして7118ダルトンであると測定した。測定された分子量は、当該測定方法の正確さの状況で、7117ダルトンというＮａ⁺イオンの理論値とここで良好な一致にある。シナピン酸をマトリックスとして使用した。キャピラリー電気泳動：プロテアーゼ阻害剤Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２） −Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１を還元条件下でキャピラリー電気泳動によって分析した。当該阻害剤は約12分に１本の細いピークを示す。実施例１７：Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２）−Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２ −Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６ −アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１と酵素の複合体形成のＫ_i 値の測定Ａｓｐ（−３）−Ｌｙｓ（−２）−Ａｒｇ（−１）−デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９−Ｌｅｕ４６−アプロチニン−Ａｓｎ５９−Ａｌａ６０−Ａｓｎ６１の阻害定数を多様な酵素について測定した。Ｋ_i値を表６に示す。実施例１８：Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９− Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン −ＰＥＧ５０００の合成および精製Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４ −Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンをＰＥＧ５０００と反応させ、これは、穏やかに振とうしながら0.2Mホウ酸緩衝液ｐＨ8.3 中37℃で１時間、遊離ＮＨ₂基と特異的に反応する。反応されない阻害剤もしくはＳＣ−ＰＥＧ５０００を、50mMリン酸ナトリウム／150mMＮａＣｌｐＨ7.2を使用するスーパーデックス(Superdex)３０カラムでのゲル濾過によって除去した。ＳＣ−ＰＥＧ５０００（スクシンイミジルカーボネートポリエチレングリコールモノメチルエーテル５０００；平均分子量５kD）はカルバイオケム(Calbioche m)、ドイツ、バードゾーデンから得た。実施例１９：ＰＥＧ−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンのタンパク質化学的特徴づけの結果プロテアーゼ阻害剤ＰＥＧ−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンを、反応後にゲル濾過により出発生成物から分離し、そして特徴づけに使用した。配列分析：配列決定を21段階を越えてＮ末端で実施した。それは使用された阻害剤の正体を示す。ＳＤＳゲル電気泳動：ＰＥＧ−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンを還元条件下でＳＤＳ電気泳動によって分析した。ゲルは約 12kDの範囲に１個のバンドを示す。実施例２０：ＰＥＧ−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンと酵素の複合体形成のＫ_i値の測定ＰＥＧ−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンの阻害定数を多様な酵素について決定した。Ｋ_i値を表７に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．ｐＨ７で＋３ないし−３の正味の電荷を有するアプロチニン変異体であって、ここで、結合領域において、アミノ酸残基１０がＳｅｒであり、アミノ酸残基１３がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１５がＡｒｇであり、アミノ酸残基１７がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｒｇであり、そしてアミノ酸残基１９がＴｈｒもしくはＬｙｓであるアプロチニン変異体。２．改変されたＮ末端および／もしくはＣ末端配列、とりわけ、Ｎ末端の伸長もしくは短縮、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有する、請求の範囲１に記載のアプロチニン変異体。３．式ＡｒｇＸ² ＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＳｅｒＴｈｒＧｌｙＸ¹³ ＣｙｓＡｒｇＡｌａＸ¹⁷ ＩｌｅＴｈｒＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ²⁴ ＡｌａＴｈｒＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ³¹ ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ³⁹ ＡｌａＡｓｎＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＸ⁴⁶ ＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＧｌｕＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａ、ここで、Ｘ²がＰｒｏもしくは結合であり、Ｘ¹³がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、Ｘ¹⁷がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｒｇであり、Ｘ²⁴ がＡｓｐもしくはＡｓｎであり、Ｘ³¹がＧｌｕもしくはＧｌｎであり、Ｘ³⁹がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁴⁶がＬｙｓもしくはＬｅｕである、を有する請求の範囲１もしくは２に記載のアプロチニン変異体、またはそのポリエチレングリコール誘導体。４．デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−ＩＩｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９ −Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３ −アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ｌｅｕ３９−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｐｈｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｌｅｕ１３−Ａｒｇ１５ −Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１ −Ｇ１ｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ａｓｎ４１−ＧＩｕ５３−アプロチニン、ＰＥＧ−デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｔｈｒ２６−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−アプロチニンから選択される、請求の範囲３に記載のアプロチニン変異体。５．位置２のアミノ酸がプロリンである、請求の範囲４に記載のアプロチニン変異体。６．いくつかのアミノ酸残基を有するスペーサーにより連結された２個のアプロチニン変異体を含んで成るビクニンであって、ここで、アプロチニン変異体の少なくとも一方がａ）アミノ酸残基１３がＩｌｅ、ＰｈｅもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１５がＡｒｇ、ＶａｌもしくはＬｅｕであり、アミノ酸残基１７がＴｙｒ、ＬｅｕもしくはＡｌａであり、アミノ酸残基１９がＴｈｒもしくはＬｙｓであり、アミノ酸残基３９がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、そしてアミノ酸残基４６がＬｅｕもしくはＬｙｓであるアプロチニン変異体であるか、またはｂ）請求の範囲１ないし５に記載のアプロチニン変異体であるビクニン。７．スペーサーが10ないし40個、とりわけ10ないし20個のアミノ酸残基を含有する、請求の範囲６に記載のビクニン。８．スペーサーが、配列、すなわちＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、Ｇｌｎ− Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ、およびそれらの断片から選択される、請求の範囲７に記載のビクニン。９．Ｎ末端の伸長もしくは短縮、またはＮ末端に欠失されたアミノ酸を有する、請求の範囲６ないし８の１個もしくはそれ以上に記載のビクニン。１０．式ＡｒｇＸ² ＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＸ¹ ⁰ ＴｈｒＧｌｙＸ¹³ ＣｙｓＸ¹⁵ ＡｌａＸ¹⁷ ＩｌｅＸ¹⁹ ＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ²⁴ ＡｌａＸ²⁶ＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ³¹ ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ³⁹ ＡｌａＸ⁴¹ ＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＸ46 ＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＸ⁵³ ＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａＡｓｎＡｌａＡｓｎＡｒｇＸ⁶³ Ｘ⁶⁴ ＬｙｓＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｎＧｌｎＧｌｕＸ⁷² ＰｒｏＡｓｐＰｈｅＣｙｓＬｅｕＧｌｕＰｒｏＰｒｏＸ⁸¹ ＴｈｒＧｌｙＸ⁸⁴ ＣｙｓＡｒｇＡｌａＸ⁸⁸ ＩｌｅＸ⁹⁰ ＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＸ⁹⁵ ＡｌａＸ⁹⁷ ＡｌａＧｌｙＬｅｕＣｙｓＸ¹⁰² ＴｈｒＰｈｅＶａｌＴｙｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓＸ¹¹⁰ＡｌａＸ¹¹² ＡｒｇＡｓｎＡｓｎＰｈｅＬｙｓＳｅｒＡｌａＧｌｕＡｓｐＣｙｓＭｅｔＸ¹²⁴ ＴｈｒＣｙｓＧｌｙＧｌｙＡｌａ、ここで、Ｘ²がＰｒｏもしくは結合であり、Ｘ¹⁰がＳｅｒもしくはＴｙｒであり、Ｘ¹³がＩｌｅもしくはＰｒｏであり、Ｘ¹⁵がＡｒｇ、ＶａｌもしくはＬｙｓであり、Ｘ¹⁷がＴｙｒ、ＡｒｇもしくはＡｌａであり、Ｘ¹⁹がＴｈｒもしくはＩｌｅであり、Ｘ²⁴がＡｓｐもしくはＡｓｎであり、Ｘ²⁶がＴｈｒもしくはＬｙｓであり、Ｘ³¹がＧｌｕもしくはＧｌｎであり、Ｘ³⁹がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁴¹がＡｓｎもしくはＬｙｓであり、Ｘ⁴⁶がＬｙｓもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁵³ がＧｌｕもしくはＡｒｇであり、Ｘ⁶³およびＸ⁶⁴がそれぞれＩｌｅもしくはＬｅｕであり、Ｘ⁷² がＡｒｇもしくはＬｙｓであり、Ｘ⁸¹がＴｙｒもしくはＳｅｒであり、Ｘ⁸⁴がＰｒｏもしくはＩｌｅであり、Ｘ⁸⁸がＡｌａもしくはＴｙｒでぁり、Ｘ⁹⁰がＩｌｅもしくはＴｈｒであり、Ｘ⁹⁵がＡｓｎもしくはＡｓｐであり、Ｘ⁹⁷がＬｙｓもしくはＴｈｒであり、Ｘ¹⁰²がＧｌｎもしくはＧｌｕであり、Ｘ¹¹⁰がＡｒｇもしくはＬｅｕであり、Ｘ¹¹²がＬｙｓもしくはＡｓｎであり、そしてＸ¹²⁴がＡｒｇもしくはＧｌｕである、を有する、請求の範囲６ないし９の１個もしくはそれ以上に記載のビクニン。１１．デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ａｒｇ１５−Ａｌａ１７−Ｓｅｒ８１−Ｉｌｅ８４−Ａｒｇ８６−Ｔｙｒ８８−Ｔｈｒ９０−Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇ１ｕ１０２−Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ｌｅｕ３９ −Ｌｅｕ４６−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０ −Ｉｌｅ１３−Ａｒｇ１５−Ｔｙｒ１７−Ｔｈｒ１９−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６ −Ｇ１ｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇｌｕ５３−Ｓｅｒ８１−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８ −Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇｌｕ１０２−Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニン、デスＰｒｏ２−Ｓｅｒ１０− Ｖａｌ１５−Ａｓｐ２４−Ｔｈｒ２６−Ｇｌｕ３１−Ａｓｎ４１−Ｇ１ｕ５３− Ｓｅｒ８１−Ａｒｇ８６−Ａｌａ８８−Ａｓｐ９５−Ｔｈｒ９７−Ｇｌｕ１０２ −Ａｓｎ１１２−Ｇｌｕ１２４−ビクニンから選択される、請求の範囲１０に記載のビクニン。１２．位置２のアミノ酸がプロリンである、請求の範囲１１に記載のビクニン。１３．請求の範囲１ないし５に記載の１種もしくはそれ以上のアプロチニン変異体、および／または請求の範囲６ないし１２に記載の１種もしくはそれ以上のビクニンを含んで成る医薬。１４．外科手術での使用および血栓塞栓性疾患状態の治療のための医薬の製造のための、請求の範囲１ないし５に記載のアプロチニン変異体および請求の範囲６ないし１２に記載のビクニンの使用。１５．請求の範囲１ないし５の１個もしくはそれ以上に記載のアプロチニン変異体、または請求の範囲６ないし１２の１個もしくはそれ以上に記載のビクニンをコードするＤＮＡ配列。１６．請求の範囲１５に記載のＤＮＡ配列を含んで成る微生物。１７．請求の範囲１６に記載の微生物を培養することを含んで成る、請求の範囲１ないし５の１個もしくはそれ以上に記載のアプロチニン変異体、または請求の範囲６ないし１２の１個もしくはそれ以上に記載のビクニンの製造方法。