KR20090009796A

KR20090009796A - 키메라 쿠니츠 도메인 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20090009796A
Application number: KR1020087024613A
Authority: KR
Inventors: 펠릭스 외메; 하이너 아펠러; 프란크 디트머; 위르겐 프란츠; 악셀 하렌가; 미카엘 스페르첼; 시몬 그레펜; 위르겐 렌츠
Original assignee: 바이엘 헬스케어 아게
Priority date: 2006-03-08
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2009-01-23
Also published as: AR059789A1; EP1994153A2; CN101395274A; JP2009528831A; WO2007101602A2; WO2007101602A9; WO2007101602A3; DOP2007000046A; AU2007222621A1; BRPI0708687A2; CA2644255A1; MX2008011350A; US20090170766A1; PE20071314A1; RU2008139632A; TW200813085A; UY30198A1

Abstract

본 발명은 천연 및 비-천연 쿠니츠 도메인을 갖는 인간 조직 인자 저해제 도메인 1의 키메라, 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

천연 쿠니츠 도메인, 비-천연 쿠니츠 도메인, 인간 조직 인자 저해제 도메인 1

Description

키메라 쿠니츠 도메인 및 그의 용도{CHIMERIC KUNITZ DOMAINS AND THEIR USE}

본 발명은 천연 및 비-천연 쿠니츠(Kunitz) 도메인을 갖는 인간 조직 인자 저해제 도메인 1의 키메라, 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

쿠니츠 도메인은 효능이 다양한 수개의 세린 프로테아제를 저해하는 폴리펩티드이다. 이는 단백질을 안정화시키고 그의 3차 구조를 결정짓는 3개의 이황화 브릿지를 포함한다. 각 세린 프로테아제와의 상호작용은 주로, 약 9개 아미노산 길이이고 쿠니츠 도메인의 N-말단 영역에 위치하는 루프를 통해 일어난다. 이러한 루프는 프로테아제의 촉매 중심에 결합하여 적절한 프로테아제 기질의 절단을 방해한다 (문헌 [Laskowski and Kato [1980]]; [Bode and Huber [1992]]).

아프로티닌 (BPTI; 도 1; 서열 번호: 6)이 쿠니츠 도메인의 원형인 것으로 간주된다 (문헌 [Fritz and Wunderer [1983]]). 이는 소의 다양한 기관 (특히, 췌장, 폐, 간 및 심장)으로부터 단리될 수 있는, 58개 아미노산 길이의 염기성 단백질이다. 아프로티닌은 3개의 이황화 브릿지 (Cys5-Cys55; Cys14-Cys38; Cys30-Cys51)에 의해 안정화되며, 특히, 트립신, 플라스민 및 혈장 칼리크레인의 강력한 저해제이다.

아프로티닌과 소 트립신 사이의 복합체에 대한 X선 구조 분석에 의해 상기 프로테아제 촉매 중심과 아프로티닌의 접촉 영역이 본질적으로 아미노산 11 내지 19로 구성된 루프에 의해 형성됨을 나타낼 수 있었다 (문헌 [Bode and Huber [1992]] 및 그에 열거되어 있는 참고 문헌 참조). 아미노산 Lys15는 아프로티닌의 저해 효과에 중추적으로 중요하며, 특히 프로테아제의 촉매적 활성 세린 잔기와 가까이에서 접촉한다. 그러므로, 아미노산 Lys15는 정의상 P1 잔기로서 지칭된다 (문헌 [Schechter and Berger [1967]]). P2, P3 잔기 등은 Lys15의 N-말단쪽에 위치하며, Lys15로부터 C-말단 쪽에 위치하는 아미노산은 P1', P2' 등으로 지칭된다. Lys15는 아프로티닌의 두번째 시스테인 잔기 바로 옆 C-말단 쪽에 위치하기 때문에 다른 쿠니츠 도메인에서 상기 위치의 상응하는 아미노산이 유사하게 P1 잔기로서 지칭된다. 아프로티닌의 저해 효과는 잔기 11 내지 잔기 19의 영역에서 표적화된 아미노산 교환에 의해 변형될 수 있다고 앞서 밝혀진 바 있다(문헌 [Otlewski et al. [2001]], [Apeler et al. [2004]], [Krowarsch et al. [2005]]). 아미노산 36-39는 아프로티닌의 활성에 추가적으로 중요한 것이다 ([Fritz and Wunder [1983]], [Krowarsch et al. [2005]]).

임상 연구 결과 아프로티닌을 사용한 치료가 심장 수술에서 수혈 필요성을 현저히 감소시킴으로써 2차 출혈도 감소시키는 것으로 나타난 바 (문헌 [Royston [1992]]), 아프로티닌은 현재 주로 심장 수술에서 트라실롤(Trasylol)이라는 특허 상표명하에 사용되고 있다. 그의 임상 효과는 혈액의 내인성 응고의 저해 (접촉 활성화), 섬유소용해의 저해 및 트롬빈 형성 감소에 기인하는 것이다 (문헌 [Blauhut et al. [1991]], [Dietrich et al. [1995]]). 따라서, 플라스민 및 혈장 칼리크레인 둘 모두의 저해가 아프로티닌의 지혈 효과에 중요하다.

소 단백질인 아프로티닌은 인간에서 항체 형성을 유도한다. 트라실롤을 반복 투여할 경우, 중증의 알레르기 반응 (과민성 쇼크)을 일으킬 수 있다. 이러한 위험은 2.8％에 달하며, 따라서, 아프로티닌의 다중 사용의 가능성은 매우 제한된다 (문헌 [Dietrich et al. [2001]], [Beierlein et al. [2005]]). 따라서, 아프로티닌과 유사하거나 그보다 우수한 임상 효과를 지니며, 알레르기 반응은 현저히 덜 일으키는 활성 성분들이 의학적으로 크게 요구되고 있다.

외인성 경로에 의한 혈액 응고의 활성화 (예컨대, 조직 손상에서)는 내피 세포로부터의 조직 인자 방출에 의해 개시된다 (문헌 [Lindahl [1997]], [Lwaleed and Bass [2005]]). 조직 인자가 혈액 내로 진입하였을 때, 이는 인자 VIIa에 결합한다. 이로써 형성된 복합체는 인자 X (혈액의 외인성 응고) 및 인자 IX (혈액의 내인성 응고) 둘 모두를 활성화시킨다. 생리 조건하에서, 조직 인자는 조직 인자 저해제 (TFPI)에 의해 저해된다. 인간 조직 인자 저해제 (hTFPI)는 276개 아미노산 길이의 단백질로서 분자량은 약 42 kDa이다. 이는 먼저 인자 Xa를 저해한 후, 인자 VIIa/조직 인자 복합체에 결합한다. TFPI는 3개의 쿠니츠 도메인으로 구성되는데, 혈장에서는 주로 지질단백질에 결합한다. 그러므로, "지질단백질-결합 응고 저해제" (LACI)로도 지칭된다. TFPI는 최초로 인간 HepG2 세포로부터의 상등액으로부터 정제되었고 (문헌 [Broze et al. [1987]]), 얼마 후에 인간 혈장으로부터 정제되었다 (문헌 [Novotny et al. [1989]]). hTFPI의 cDNA는 1988년 클로닝되 었다 (문헌 [Wun et al. [1988]]). 스프레쳐(Sprecher) 등은 조직 인자 저해제의 추가적인 이소폼의 클로닝과 특징화에 대하여 기술하였다 (hTFPI2; 문헌 [Sprecher et al. [1994]]).

hTFPI의 각각의 쿠니츠 도메인의 P1 위치에 있는 아미노산의 표적화된 교환에 의해서, 쿠니츠 도메인 2 (D2)는 인자 Xa의 저해의 원인이 되는 반면, 쿠니츠 도메인 1 (D1) 및 2는 인자 VIIa/조직 인자 복합체에 결합하기 위해 필요하다는 것을 보여줄 수 있었다 (문헌 [Girard et al. [1989]]). hTFPI의 개별적으로 발현되는 쿠니츠 도메인을 사용하여 조사한 결과, 인자 Xa는 오직 쿠니츠 도메인 2에 의해서만 저해될 수 있는 반면, 쿠니츠 도메인 1은 또한 플라스민도 저해한다는 것이 밝혀졌다 (문헌 [Petersen et al. [1996]]). 마크랜드(Markland) 등은 파지 디스플레이를 수단으로 하여 hTFPI D1의 변이에 의한 단백질 라이브러리 제조에 대해 기술하였다. 아미노산 10 내지 21 및 31 내지 39의 영역에서의 돌연변이를 통해 그로부터 생성된 쿠니츠 도메인이 고도로 효능이 있는 선택성의 플라스민 저해제가 되도록 하거나 (문헌 [Markland et al. [1996a]]), 또는 고도로 효능이 있는 선택성의 혈장 칼리크레인의 저해제가 되도록 하는 (문헌 [Markland et al. [1996b]]) 방식으로 hTFPI D1의 성질을 변형시킬 수 있었다. 바자(Baja) 등은 hTFPI D1의 저해 활성에 대한 아미노산 8 내지 20 및 31 내지 39의 중요성에 관해 논의하였다 (문헌 [Bajaj et al. [2001]]).

고도로 효능이 있고 특이적인, 플라스민을 저해하는 쿠니츠 도메인의 변이체는 US 6,010,880; EP 0 737 207; US 6,071,723 및 US 6,953,674에 기재되어 있다. US 5,795,865; EP 0 739 355 및 US2004/0038893에는 고도로 효능이 있고 특이적인, 혈장 칼리크레인을 저해하는 쿠니츠 도메인의 변이체가 기재되어 있다. US 6,783,960에는 hTFPI1 및/또는 hTFPI2의 다양한 쿠니츠 도메인으로 구성된 키메라 단백질이 기재되어 있다. 쿠니츠 유형의 혈장 칼리크레인 저해제는 US 5,786,328; US 5,780,265 및 EP 0 832 232에 개시되어 있다.

본 발명의 요약

본 발명의 목적은 아프로티닌의 활성과 유사하거나, 그보다 우수한 활성을 갖고 있고, 동시에 면역원성은 현저히 더 작은 인간 조직 인자 저해제 1 도메인 1 (hTFPI D1)의 변이체를 제조하는 것이다. 목적하는 성질은 hTFPI D1의 활성 중심에 있는 아미노산을 다른 천연 또는 비-천연 쿠니츠 도메인의 활성 중심으로부터의 상응하는 아미노산으로 교환함으로써 달성된다. 그렇게 생성된 키메라는 고도로 효과적으로 플라스민 및 혈장 칼리크레인 둘 모두를 저해한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명과 관련하여 쿠니츠 도메인은 6개의 시스테인 잔기와 3개의 이황화 브릿지를 포함하는, 55 내지 62개의 아미노산을 갖는 아프로티닌 동족체이다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 아프로티닌의 58개의 아미노산에 의거해 번호 매김한다. 따라서, Cys1은 아미노산 5이고, Cys6은 아미노산 55이다. 표 1에서, "x"는 임의의 아미노산을 의미하며, "X"는 각 경우에서 상세하게 명시된 아미노산들 중 하나를 의미한다. 이황화 브릿지는 각 경우, Cys5-Cys55; Cys14-Cys38 및 Cys30-Cys51 위치 사이에서 형성된다.

쿠니츠 저해제는 현재까지 특히, 다양한 척추동물 (예컨대, 인간, 소), 및 몇몇 무척추동물 (민달팽이, 말미잘)에서 발견되었다 (문헌 [Laskowski and Kato [1980]] 및 그에 인용되어 있는 참고 문헌). 그러한 천연적으로 발생된 쿠니츠 도메인을 본 출원에서는 "천연 쿠니츠 도메인"으로 지칭한다. 천연 쿠니츠 도메인의 예는 특히, 아프로티닌, 인간 태반 비쿠닌 도메인 1, 인간 태반 비쿠닌 도메인 2, 인간 아밀로이드 베타 A4 단백질 전구체의 쿠니츠 도메인 및 인간 엡핀 전구체의 쿠니츠 도메인이다. 몇몇 천연 쿠니츠 도메인의 서열을 표 2에 상술한다.

유전공학 방법을 수단으로 하여 하나 이상의 아미노산이 천연 쿠니츠 도메인과 상이한 쿠니츠 도메인의 재조합 변이체를 제조할 수 있다. 아미노산 교환으로부터 생성된 그러한 쿠니츠 도메인을 본 출원에서는 "비-천연 쿠니츠 도메인"으로 지칭한다. 다양한 비-천연 쿠니츠 도메인이 문헌에 기재되어 있다 (문헌 [Dennis et al. [1995]], [Markland et al. [1996a]], [Markland et al. [1996b]], [Apeler et al. [2004]], EP 0307592). 몇몇 비-천연 쿠니츠 도메인의 서열을 표 3에 나타낸다.

본 발명의 목적은 아프로티닌의 임상 효과와 유사하거나 그보다 우수한 임상 효과를 갖되, 아프로티닌보다는 인간에서 알레르기 반응을 현저히 덜 일으키는 쿠니츠 도메인을 제조하는 것이다. hTFPI D1은 서열

를 갖는 인간 쿠니츠 도메인이다.

인간 기원이기 때문에 인간에서 hTFPI D1을 사용할 경우 아프로티닌과 유사한 알레르기 반응은 예측되지 않는다.

아프로티닌은 그의 임상 효과가 혈액의 내인성 응고 (접촉 활성화), 섬유소용해의 저해 및 트롬빈 형성 감소에 기인하는 강력한 플라스민 및 혈장 칼리크레의 저해제이다 (표 4) (문헌 [Blauhut et al. [1991]], [Dietrich et al. [1995]]). 그와는 대조적으로, hTFPI D1은 상당히 더 약한 플라스민 저해제이며, 게다가, 혈장 칼리크레인에 대하여서는 저해 효과가 나타내지 않는다 (표 4). 그러므로, 본 발명의 목적은 고도로 효과적으로 플라스민 및 혈장 칼리크레인, 둘 모두를 추가로 저해하며, 최소의 면역원성 잠재능을 갖는 hTFPI D1의 변이체를 제조하는 것이다. 본 발명에 따라 바람직한 변이체는 < 100 nM의 IC₅₀으로, 보다 우수하게는 < 10 nM의 IC₅₀으로 플라스민을 저해한다. 혈장 칼리크레인은 본 발명에 따른 변이체에 의해 < 100 nM의 IC₅₀으로, 보다 우수하게는 < 10 nM의 IC₅₀으로 저해된다.

본 발명에 따른 hTFPI D1의 변이체는 hTFPI D1과 다른 천연 또는 비-천연 쿠니츠 도메인 사이의 키메라 형성에 의해 생산된다. hTFPI D1의 활성 중심에 있는 하나 이상의 아미노산을 다른 천연 또는 비-천연 쿠니츠 도메인의 활성 중심으로부터의 상응하는 아미노산으로 교환함으로써 키메라가 형성된다. 활성 중심은 상응하는 쿠니츠 도메인의 아미노산 10 내지 21 및 31 내지 39를 포함한다. 놀랍게도, 상기에 의해 생산된 hTFPI D1의 변이체는 아프로티닌의 성질과 유사할 뿐만 아니라, 몇몇 경우에는 명백히 더 우수한 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 예를 들면, 본 발명에 따른 TFPI 변이체가 혈장 칼리크레인에 대해 아프로티닌보다 실질적으로 더욱 강력한 저해 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (표 4). 추가로, 본 발명에 따른 TFPI 변이체는 아프로티닌과 비교하여 그와 유사하거나 명백히 개선된 항응고 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 3, 도 8). 인간 혈장에서의 섬유소용해는 본 발명에 따른 TFPI 변이체에 의해 아프로티닌의 것과 유사한 효능을 내며 저해되었다 (도 2, 도 7).

본 발명에 따른 TFPI 변이체의 지혈 효과는 다양한 동물 모델에서 시험되었다. 래트 출혈 모델에서 본 발명에 따른 TFPI 변이체는 아프로티닌과 유사한 효과를 나타내었다 (도 4, 도 9). 래트 장간막 출혈 시간은 아프로티닌과 본 발명에 따른 TFPI 변이체에 의해 유사한 효능을 내며 단축되었다 (도 11, 도 12).

본 발명에 따른 TFPI 변이체의 항혈전 효과는 래트 동정맥 단락 모델에서 조사하였다. 이러한 경우, 본 발명에 따른 TFPI 변이체는 아프로티닌과 유사한 항혈전 효과를 나타내었다 (도 10).

본 발명에 따른 TFPI 변이체가 심혈관계에 미칠 가능성이 있는 원치않는 효과를 마취된 래트에서 검사하였다. 본 발명에 따른 TFPI 변이체를 50 mg/kg 이하의 투여량으로 정맥 투여하였을 때에는 혈압과 ECG에 어떠한 영향도 미치지 않은 것으로 나타났다 (표 8).

외상, 재관류 및 체외 순환은 체액 및 세포 연속반응계의 활성화와 함께 복합 염증 과정의 원인이 된다. 이들은 특히, 부종 형성과 기관 손상과 같이 임상적으로 관찰가능한 부작용을 유발하는, 백혈구 및 혈소판의 활성화를 일으킨다 (문헌 [Hess PJ Jr. [2005]]). 다양한 연구에서 아프로티닌이 우회술 환자의 염증 상태에 미칠 수 있는 가능한 효과를 제시하였다 (문헌 [Asimakopoulos G. et al. [2000]]). 본 발명에 따른 TFPI 변이체가 염증 과정에 미칠 수 있는 가능한 영향을 다양한 세포 시험 시스템에서 시험하였다. 따라서, 본 발명에 따른 TFPI 변이체는 아프로티닌의 효능과 유사하거나 그보다 조금 더 우수한 효능을 나타내며, IL-8- 및 C5a-유도된 중성구의 주화성을 저해하였다 (도 13, 표 6). 유사하게, CAP-37-유도된 투과능 증가는, 아프로티닌의 효능과 유사하거나 그보다 조금 더 우수한 효능을 나타내며 본 발명에 따른 TFPI 변이체에 의해 저해되었다 (도 14, 표 7).

본 발명에 따른 hTFPI D1의 변이체는 하기 일반식

또는

을 갖는다.

상기에서, "X"는 표 1에 나타낸 것과 같은 번호 매김에 따른 쿠니츠 도메인의 아미노산이다. 이러한 아미노산은 hTFPI D1로부터, 또는 표 2 및 3에 상술되어 있는 또다른 천연 또는 비-천연 쿠니츠 도메인으로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따른 변이체는 hTFPI D1의 1개 이상의 아미노산을 상응하는 천연 또는 비-천연 쿠니츠 도메인의 또다른 아미노산으로 교환함으로써 생산된다. 바람직하게 hTFPI D1로부터의 상응하는 아미노산으로 교환될 수 있는, 천연 및 비-천연 쿠니츠 도메인으로부터의 아미노산은 표 5에 일례로 요약되어 있다.

하기의 hTFPI D1 변이체가 특히 바람직하다:

트립신, 플라스민 및 혈장 칼리크레인 저해에 관한, 본 발명에 따른 hTFPI D1 변이체 몇몇의 IC₅₀ 값은 표 4에 요약되어 있다.

추가의, 본 발명에 따른 hTFPI D1 변이체는 도 1에 제시되어 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 본 발명에 따른 hTFPI D1 변이체를 포함하는 의약에 관한 것이다.

기술된 신규한 쿠니츠 도메인은 하기 병리학적 상태: 출혈 위험이 증가된, 수술 관련 혈액 손실의 치료; 혈전색전성 용태 (예컨대, 수술 후, 사고 후), 쇼크, 다중외상, 패혈증, 파종 혈관내 응고 (DIC), 다발성 기관 부전, 불안정 협심증, 심근 경색증, 뇌졸중, 색전증, 심정맥 혈전증, 염증성 장애 (예컨대, 류마티스, 천식), 침윤성 종양 성장 및 전이의 요법, 동통 및 부종 (대뇌 부종, 척수 부종) 요법, 투석 치료법에서의 지혈 활성화 예방, 피부 노화 증상 (탄력섬유증, 위축, 주름형성, 혈관 변경, 색소 변경, 광선 각화증, 흑색면포, 낭종), 피부암 치료, 피부암 증상 (광선 각화증, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 악성 흑색종), 다발 경화증, 섬유증, 대뇌 출혈, 뇌 및 척수 염증, 뇌 감염 치료에 적합하다.

실시예 1

인간 조직 인자 저해제 도메인 1 ( hTFPI , 조직 인자 경로 저해제) 클로닝 및 TFPI 변이체 생성

상업적으로 이용가능한 E. 콜라이(E. coli)/S. 세레비시애(S. cerevisiae) 셔틀 벡터 pYES2 (인비트로겐(Invitrogen))를 변형시켰으며 (문헌 [Apeler [2005]] 참조), 이는 효모 분비 벡터 pIU10.10W 및 pIU3.12.M의 작제를 위한 출발 물질로서의 역할을 하였다.

pIU10 .10W

MFa1 프로모터 - MFa1 - Met1 - Arg2 ... 전서열 ... Ala17 - Leu18 - Ala19 │신호 펩티다제

pIU3 .12.M

MFa1 프로모터 - MFa1 - Met1 - Arg2 ... 전전구서열 ... Asp83 - Lys84 - Arg85 │KexII 프로테아제

천연적으로 발생된 인간 TFPI의 도메인 1 (hTFPI D1, acc. P10646, 아미노산 Met49 - Asp107, 본원에서: Met1 - Asp58)을 합성 유전자 (S. 세레비시애 코돈 선호도에 대해 최적화됨)로서 효모 분비 벡터 pIU10.10.W 중 Ala19에 (제한 절단 부위 BsaBI 및 XhoI를 통해) 또는 효모 분비 벡터 pIU3.12.M 중 Arg85에 (PCR 및 제한 절단 부위 HindIII 및 BamHI를 수단으로 하여) 융합시켰다.

hTFPI D1 의 효모 분비 벡터 pIU10 .10.W로의 클로닝

합성적으로 제조된 hTFPI D1에 대한 유전자 (서열 번호: 2)를, 제한 효소 BsaBI (5') 및 XhoI (3')에 의해 효모 분비 벡터 pIU10.10.W로 하위클로닝시키고 (도 5), 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석에 의해 조사하였다. pIU10.10.W의 형질전환에 의해 효모에서 hTFPI D1 변이체를 제조함으로써 N-말단 아미노산 서열 MHSF를 갖는 hTFPI D1 변이체의 발현을 유도하였다.

PCR 프라이머 4:

상응하는 아미노산을 교환시키는 뉴클레오티드 교환은 PCR 프라이머 3에서 회색 바탕에 굵은체로 표시되어 있다.

PCR 프라이머 3 및 4에 의해 증폭된 DNA 단편을, 제한 절단 부위 NsiI (5') 및 XhoI (3')를 통해 효모 분비 벡터 pIU10.10.W로 클로닝시켰다. TFPI mut1을 효모 분비 벡터 PIU3.12.M으로 하위클로닝시키기 위해 섹션 2에 기술된 PCR 프라이머 (PCR 프라이머 1 및 PCR 프라이머 2)를 사용하였다. 각 경우마다 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석에 의해 조사하였다.

변이체 2: TFPI mut3 (서열 번호: 4)

TFPI mut3은, hTFPI D1 및 TFPI mut1과 비교하여 추가의 아미노산 교환: D10E, D11T, K15R, I17A, M18H, K19P, F21W (서열 번호: 4)를 갖는다.

돌연변이유발 프라이머 1 및 2를 사용하여 TFPI mut1로부터 출발하여 시험관내 돌연변이유발 (스트라타진(Stratagene)으로부터 입수한 퀵-체인지(Quick- change) II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 사용)에 의해 TFPI mut3을 생성하였다.

돌연변이시키고자 하는 TFPI mut1 중의 초기 서열 (부분 서열)은

이다.

돌연변이유발 프라이머 1:

돌연변이유발 프라이머 1은 삼중항 GAT/D10 및 GAT/D11 대신 변형된 삼중항 GAA 및 ACT를 포함하며, 이로써, 아미노산 교환 D10E 및 D11T가 이루어진다.

돌연변이유발 프라이머 2:

PCR 프라이머 4:

PCR 프라이머 3 및 4로 증폭된 DNA 단편을, 제한 절단 부위 NsiI (5') 및 XhoI (3')를 통해 효모 분비 벡터 pIU10.10.W로 클로닝시켰다. TFPI mut1을 효모 분비 벡터 PIU3.12.M으로 하위클로닝시키기 위해 섹션 2에 기술된 PCR 프라이머 (PCR 프라이머 1 및 PCR 프라이머 2)를 사용하였다. 각 경우마다 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석에 의해 조사하였다.

변이체 2: TFPI mut3 (서열 번호: 4)

돌연변이유발 프라이머 1 및 2를 사용하여 TFPI mut1로부터 출발하여 시험관내 돌연변이유발 (스트라타진으로부터 입수한 퀵-체인지 II XL 부위-지정 돌연변이유발 키트 사용)에 의해 TFPI mut3을 생성하였다.

이다.

돌연변이유발 프라이머 1:

돌연변이유발 프라이머 1은 삼중항 GAT/D10 및 GAT/D11 대신 변형된 삼중항

를 포함하며, 이로써, 아미노산 교환 D10E 및 D11T가 이루어진다.

돌연변이유발 프라이머 2:

는 돌연변이유발 프라이머 1에 상보적이다.

제조사의 정보에 따라 돌연변이유발을 수행한 후, 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석에 의해 조사하였다.

실시예 2

사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae )의 형질전환

예컨대, 균주 JC34.4D인 효모 세포 (MAT□12, ura3-52, suc2)를 10 ml의 YEPD (2％ 포도당; 2％ 펩톤; 1％ 디프코(Difco) 효모 추출물)에서 배양하고, 0.6 내지 0.8의 OD_6OOnm에서 수거하였다. 세포를 5 ml의 용액 A (1 M 소르비톨; 10 mM 비신 pH 8.35; 3％ 에틸렌 글리콜)로 세척하고, 0.2 ml의 용액 A에 재현탁시키고, -70℃에서 저장하였다.

TFPI mut3EA를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA (5 ㎍)와 청어 정자 DNA의 캐리어 DNA (50 ㎍)를 냉동 세포에 가하였다. 이어서, 5분 동안 37℃에서 진탕시켜 세포를 해동시켰다. 1.5 ml의 용액 B (40％ PEG 1000; 20O mM 비신 pH 8.35)를 가한 후, 세포를 60분 동안 30℃에서 인큐베이션시키고, 펠릿화한 후, 1.5 ml의 용액 C (0.15 M NaCl; 10 mM 비신 pH 8.35)로 세척하고, 100 ㎕의 용액 C에 재현탁시켰다. 2％ 아가를 포함하는 선별 배지 상에 평판 배양시켰다. 3일 동안 30℃에서 인큐베이션시킨 후, 형질전환체를 수득하였다.

실시예 3

효모 세포의 발효에 의한 TFPI mut3EA 제조

영양액

효모 세포를 발효시켜 TFPI mut3EA를 발현시키기 위해서 하기 영양액을 사용하였다:

미량 원소 용액 4 ( SL4 용액):

SL4 용액의 성분들을 탈염수에 용해시키고, pH는 NaOH를 사용하여 pH 3-4로 조정하였다. 탈염수를 사용하여 영양액을 1000 ml으로 만들고, -20℃에서 분취량으로 저장하였다.

영양액 SD2 및 SC5의 성분들을 탈염수로 보충하고, pH를 pH 5.5로 조정하였다. 20분 동안 121℃에서 멸균시켰다. 포도당을 탈염수 중 필요 용적의 1/5에 용 해시키고, 개별적으로 멸균시키고, 냉각시킨 후, 잔여분의 영양액에 가하였다.

균주 스톡

1 ml 분취량의 예비배양물을 1 ml의 80％ 글리세롤 용액과 혼합하고, -140℃에서 저장하여 모든 효모 형질전환체의 균주 스톡을 셋업하였다.

예비배양물

각각 10 또는 100 ml의 SD2 영양액으로 충진된, 50 ml (소량의 주요 배양물용) 또는 1 ℓ (중간 용량의 주요 배양물용)의 진탕 플라스크에서 예비배양물을 발효시켰다. 균주 스톡 또는 SD2 아가 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하여 접종시켰다. 2-3일 동안 28-30℃에서 연속하여 진탕시키면서 (240 rpm) 배양물을 인큐베이션시켰다.

주요 배양물 발효

100 ml의 SC5 영양액으로 충진된 1 ℓ의 진탕 플라스크를 사용하여 소규모로 주요 배양물을 발효시켰다. 상기 기술된 3 ml의 예비배양물을 사용하여 통상적으로 접종시켰다. 이어서, 4일 동안 28-30℃에서 연속하여 진탕시키면서 (240 rpm) 배양물을 인큐베이션시켰다.

중간 규모로 주요 배양물을 발효시키는 경우, 웨이브 바이오테크(Wave Biotech) (스위스 타겔스바겐 소재)로부터 입수한 생물 반응기 시스템을 사용하였다. 구체적으로, 1000 ml의 SC5 배지에 30 ml의 예비배양물을 접종시키고, 4일 동안 32/분의 진동 속도로 웨이브백(Wavebag)에서 인큐베이션시켰다 (각도: 10°; 대기 공급: 0.25 ℓ/분). 1일째 내지 3일째 배양물의 pH를 모니터하고, 필요하다면, 5 M NaOH를 사용하여 pH 5-6로 조정하였다. 1일째 내지 3일째, 1 ml의 50％ 강도의 효모 추출물 용액 및 4 ml의 4 M 포도당 용액을 각각의 100 ml 배양물에 가하였다.

1000 ml 배양물의 경우, 적절히 10 또는 40 ml의 영양액을 하룻동안 연속하여 가하였다. 성장을 모니터하기 위하여 다양한 시점에 배양물의 OD_6O0nm을 측정하였다.

4일 후, 원심분리 (JA14 로터 중 6000 rpm에서 15분)에 의해 무세포 배양물을 수거하였다.

실시예 4

발현된 효모 세포의 상등액으로부터 TFPI mut3EA 정제

pH가 7.8이 될 때까지 주요 배양물 발효에서 제조된 TFPI mut3EA-함유 무세포 상등액에 1 M NaOH를 가하였다. 4℃하에 2000 rpm에서 원심분리하여 (15분; 벡크만-알레그라 6KR(Beckman-Allegra 6KR)) 상등액 중에 존재하는 현탁된 입자를 침전시켰다. 1 ml/분으로 상등액을 10 ml 트립신-아가로스 칼럼(시그마(Sigma)-T1763) 상에 로딩하였다. 이어서, 칼럼을 70 ml의 50 mM Tris pH 7.8, 250 mM NaCl로, 및 50 ml의 50 mM Tris pH 7.8, 600 mM NaCl로 세척하였다. 이어서, TFPI mut3EA를 180 ml의 50 mM KCl/10 mM HCl pH 2.0으로 용출시켰다. 중화시키기 위해 각각이 500 ㎕의 200 mM Tris pH 7.6, 2 M NaCl을 함유하는 튜브에 2 ml의 분획을 수집하였다. 하기 기술하는 분석법에서 트립신 저해를 통해 TFPI mut3EA-함유 분 획을 동정하였다.

트립신-저해 분획을 풀링하고, 매번 2 ℓ의 5O mM Tris pH 7.5에 대하여 2회에 걸쳐 1000 달톤 (스펙트라(Spectra)/POR6)의 컷오프를 사용하여 투석관에서 투석시켰다. 아미콘(Amicon) 8200 교반 세포 중 1000 달톤의 컷오프를 사용하여 한외여과막을 통해 투석액을 농축시켰다. 제조사가 제시한 바와 같이 쿠마시 플러스 시험 (피어스(Pierce), 23236)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 측정된 단백질 농도는 전형적으로 0.1 내지 6 mg/ml 사이였다.

별법으로, 트립신-아가로스 상에서 정제한 후, 트립신-저해 분획을 풀링시키고, 동량의 0.1％ TFA와 혼합하고, 소스(Source) 15 RPC 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 6 ml의 0.1％ TFA (HPLC-A 완충액)로 세척하고, TFPI mut3EA는 25 ml 구배를 사용하여 50％ HPLC-B 완충액 (0.1％ TFA, 60％ 아세토니트릴)으로, 추가로 5 ml 구배를 사용하여 100％ HPLC-B 완충액으로 용출시켰다. TFPI mut3EA-함유 용출액을 동결건조시키고, 분획당 250 ㎕의 50 mM Tris pH 7.5에 동결건조물을 용해시켰다.

실시예 5

트립신, 플라스민 및 혈장 칼리크레인에 대한 TFPI mut3EA 의 저해 효능 측정

백색의 384-웰 미세역가 플레이트 중 생화학 분석법으로 형광 기질의 도움을 통해 트립신, 플라스민 및 혈장 칼리크레인의 효소 활성에 미치는 TFPI mut3의 저해 효능을 측정하였다. 분석용 완충액은 50 mM Tris/Cl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 0.08％ (w/v) BSA로 구성되었다. 분석 조건은 구체적으로 하기와 같았다:

10 ㎕의 TFPI mut3EA의 일련의 희석액을 각 웰에 도입하고, 5분 동안 RT에서 20 ㎕의 효소와 함께 예비 인큐베이션시켰다. 이어서, 각각에 20 ㎕의 기질을 가하여 반응을 개시시켰다. 60-90분 후에, 테칸(Tecan) 판독기에서 360nm의 여기 파장 및 465nm의 방출 파장을 사용하여 측정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (버전 4.02)를 사용하여 투여량-활성 플롯과 1/2 최대 저해 상수 (IC₅₀ 값)를 측정하였다.

실시예 6

hTFPI D1 변이체에 의한 섬유소용해 저해

hTFPI D1 변이체의 효과를 시험관내 섬유소용해 모델에서 시험하고, 트라실 롤 (아프로티닌) 효과와 비교하였다. 인간 시트레이트 처리 혈장을 0.13 pM 조직 인자 (TF) 및 164 U/ml 조직 플라스미노겐 활성제 (tPA)와 함께, 및 다양한 농도 (0.06 μM 내지 15 μM)의 TFPI D1 변이체 또는 아프로티닌과 함께 혼합하고, 40분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 생리 식염수를 대조군으로서 사용하였다. TF에 의한 응괴 형성 및 그후 tPA에 의한 응괴 용해는 테칸 사파이어(Tecan Safire)를 사용하여 광학 밀도 (OD_405nm) 측정에 의해 측정하였다. 그로부터 형성된 곡선하 면적 (AUC)을 계산하고, 물질 농도에 대하여 플로팅하였다. AUC의 감소란 섬유소용해가 저해되었음을 의미한다. 추후 실험에서, 섬유소용해는 응괴 형성 이후 OD의 상대적인 감소로서 정의되었다. OD의 상대적인 감소 저해가 항섬유소용해 활성의 측도이다. TFPI mut3EA 및 TFPI mut4EA의 항섬유소용해 활성은 트라실롤의 것과 유사하였다.

실시예 7

hTFPI D1 변이체에 의한 응고 저해

hTFPI D1 변이체의 효과를 시험관내 응고 모델에서 시험하고, 트라실롤 (아프로티닌)의 효과와 비교하였다. 인간 시트레이트 처리 혈장을, 응고되도록 유도하기 위해 12 mM CaCl₂과, 다양한 농도의 (0.1 μM 내지 25 μM) hTFPI D1 변이체 또는 아프로티닌과 혼합하였다. 생리 식염수를 대조군으로서 사용하였다. 90분 동안 37℃에서 인큐베이션시키는 동안 응고의 척도로서 405nm에서의 OD를 측정하였다. 그로부터 1/2 최대 응고 시간을 계산하였다. 1/2 최대 응고 시간의 연장이란 응고가 저해되었음을 의미한다. 트라실롤의 항응고 활성과 비교하였을 때, TFPI mut3EA의 항응고 활성은 증가되었고, TFPI mut4EA의 것은 약간 증가되었다.

실시예 8

래트 출혈 모델에서 hTFPI D1 변이체의 지혈 효과

폴리에틸렌 카테터를 사용하여 마취된 래트의 목정맥 둘 모두에 캐뉼러를 삽입하였다. 정상적인 출혈 시간을 연장시키기 위하여 실험하는 동안 계속하여 래트에 tPA (조직 플라스민 활성제) (8 mg/kg/h)를 주입하였다. tPA를 주입하기 시작하여 10분이 경과한 후에, 주입에 의해 또는 조합된 볼루스 투여 그리고 이후 주입 유지에 의해 TFPI D1 변이체 또는 트라실롤 (아프로티닌)로 동물을 처리하였다. 첫번째 실험에서, TFPI mut3EA 또는 트라실롤을 연속 주입에 의해 6 mg/kg/h의 투여량으로 투여하였다. 두번째 시험에서는 5 mg/kg 및 10 mg/kg/h까지 1.5 mg/kg (볼루스) 및 3 mg/kg/h (주입액)의 투여량으로 TFPI mut4EA 또는 트라실롤을 사용하여 동물을 처리하였다. 두 실험 모두에서 생리 식염수를 대조군으로서 사용하였다. 주입을 시작하여 15분이 경과한 후에, 꼬리 (2 mm)를 가로로 절단하고, 꼬리 끝을 37℃ 생리 식염수에 침지시키고, 출혈 시간을 측정하였다. 출혈 시간은 가로절단시부터 육안상으로 출혈 종결시까지의 시간 간격으로서 정의하였다. 출혈 시간의 단축이 지혈 효과의 척도가 되었다. TFPI mut3EA 및 TFPI mut4EA의 지혈 효과는 트라실롤의 것과 유사하였다.

실시예 9

래트 동정맥 ( AV ) 단락 모델에서 TFPI mut4EA 의 항혈전 효과

TFPI mut4EA의 항혈전 효과는 래트 동정맥 단락 모델에서 조사하였다. 폴리에틸렌 카테터를 사용하여 마취된 래트의 목동맥 및 목정맥에 캐뉼러를 삽입하고, 카테터를 작은 관 조각 (단락)을 통해 함께 연결시켰다. 거칠어진 나일론 루프를 관 내로 도입시키고, 혈전형성 표면으로서 사용하였다. 15분 동안의 단락을 통한 혈액의 체외 순환 이후에 혈전이 형성되었다. 이어서, 생성된 혈전을 관으로부터 제거하고, 혈전 중량을 측정하였다. 볼루스 투여 이후에 주입을 유지시키면서 TFPI mut4EA 또는 트라실롤 (아프로티닌)로 래트를 처리하였다. 사용된 투여량은 5 mg/kg 및 10 mg/kg/h까지 0.15 mg/kg (볼루스) 및 0.3 mg/kg/h (주입액)였다. 생리 식염수를 대조군으로서 사용하였다. 혈전 중량의 감소가 항혈전 효과의 척도가 되었다. TFPI mut4EA는 트라실롤과 유사한 항혈전 효과를 나타내었다.

실시예 10

래트에서 트라실롤 및 TFPI mut4EA 가 상대적인 장간막 출혈 시간에 미치는 영향

위스타(Wistar) 래트 (250-300 g)를 복강으로 (티오펜탈 Na, 100 mg/kg)으로 마취시키고, 정맥 카테터를 제공하였다. 개복한 후, 소장 루프를 바깥으로 옮겨놓았다. 가온 식염수 용액으로 세척하면서, 입체 현미경하에서 미세가위를 사용하여 작은 장간막 동맥을 절단하였다. 물질 투여 이전의, 대조군 절단 조각 3개의 출혈 시간과, 시험 물질 투여 이후의 절단 조각 1개의 출혈 시간을 측정하였다. 물질로 처리한 이후의 출혈 시간은 개별적으로 각각의 동물에서 물질 투여 이전의 대조군 출혈 시간과 관련이 있었다.

트라실롤은 장간막 출혈 시간을 투여량에 의존하는 방식으로 단축시켰다 (도 11). 볼루스로서 1.5 mg/kg 트라실롤을 투여한 이후 계속 주입 (3 mg/kg/h)하였을 때 출혈 시간에는 유의적인 효과를 미치지 못했다. 볼루스로서 5 mg/kg의 더많은 투여량을 투여하고, 주입액으로서 10 또는 30 mg/kg/h를 투여한 결과 출혈 시간은 그에 상응하게 28.5 ± 7.4％ 및 42.7 ± 4.2％ 만큼 단축되었다.

TFPI mut4EA (도 12)는 트라실롤과 유사한 방식으로 장간막 출혈 시간을 단축시켰다. 볼루스로서 5 mg/kg TFPI mut4EA를 투여하고, 주입액으로서 10 mg/kg/h를 투여한 결과 출혈 시간은 23.6％ 만큼 단축되었다. TFPI mut4EA의 가장 큰 효과는 볼루스로서 5 mg/kg을 투여하고, 주입액으로서 30 mg/kg/h를 투여한 후에 관찰되었다. 이러한 투여량에서 TFPI mut4EA는 출혈 시간을 31.7％ 만큼 단축시켰다.

실시예 11

마취된 래트에서 hTFPI D1 변이체가 심혈관계에 미치는 효과 조사

래트를 펜토바비탈 Na으로 마취시켰다. 실험하는 동안 래트는 자발적으로 호흡하였고, 체온은 온열 매트로 일정하게 유지시켜 주었다. 압력 변환기 및 압력 측정 브릿지를 사용하여 목동맥에서 카테터를 통해 동맥 혈압을 측정하였다. ECG 증폭기를 수단으로 하여 3개의 표준 사지 유도로 ECG를 기록하였다. 측정된 신호는 소프트웨어에 의해 포착하고, 평가하고, 저장하였다. 혈압 신호로부터 수축기 혈압, 이완기 혈압, 및 평균 혈압, 및 심장박동수를 계산하였다. 실험한 후에 ECG를 추가로 평가하고, 수동으로 값을 구하였다. 혈압 및 ECG 신호에 관해 추가로 아날로그로 기록하였다.

카테터 설치 및 과정 단계 (일정 혈압 및 심장박동수) 이후에 볼루스 주사로서 또는 연속 주입으로서 TFPI mut3EA 또는 TFPI mut4EA를 i.v. 투여하였다. 고정된 관찰 기간 이후 마취제를 과잉투여하여 동물을 희생시킴으로써 실험을 종결하였다.

실시예 12

hTFPI D1 변이체에 의한 IL -8- 및 C5a -유도된 중성구의 주화성 저해

표준 방법에 의해 혈액으로부터 중성구를 단리시켰다. 중성구의 주화성은 2-챔버 시스템에서 수행되었다. 24시간 동안 HUVEC 단층을 사용된 막 (3-㎛ 공극 크기, 폴리카보네이트, 팔콘(Falcon)으로부터 입수)상에서 배양하였다.

앞서 형광 염료가 로딩된 RPMI 1640 배지 중 1 x 10⁵개의 중성구를 상부 챔버에 놓았다. 하부 챔버는 다양한 농도의 자극제 또는 일정 농도의 자극제 (IL-8: 5 nM 또는 C5a: 1O nM) 및 다양한 농도의 시험 물질 트라실롤 (아프로티닌), TFPI mut3EA 또는 TFPI mut4EA를 함유하였다. 조사하고자 하는 물질은 두개의 챔버 모두에 존재하였다. 시험 혼합물을 45분 동안 37℃ 및 5％ CO₂에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 하위 챔버로 이동하는 세포를 측정하였다 (형광 측정법, 계수법).

실시예 13

hTFPI D1 변이체에 의한 CAP -37-유도된 투과능 증가 저해

HUVEC의 융합 단층을 2-챔버 시스템 (팔콘) 중 삽입물 막 상에서 배양하였다. 이러한 목적을 위해 2 x 10⁵개의 세포를 삽입물마다 시딩하고, 18-20시간 동안 인큐베이션시켰다 (37℃/5％ CO₂). 실험 시작에 앞서 트리판 블루-접합된 알부민 용액을 이용해 단층의 연속성을 조사하였다. 이어서, CAP37 (5 μM)을 상부 챔버에 놓았다. 다양한 농도 (10 μM-0.01 μM)의 시험 물질 트라실롤 (아프로티닌), TFPI mut3EA 또는 TFPI mut4EA 존재하에 3시간 동안 투과능 변화를 측정하였다. 이 경우, 트리판 블루-접합된 알부민 용액의 용출량이 투과능 변화에 대한 지표물로서 사용되었다. OD는 590nm에서 측정하였다.

참고 문헌

약어

AUC 곡선하 면적(area under the curve)

BPTI 소의 췌장 트립신 저해제(bovine pancreatic trypsin inhibitor)

DIC 파종 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation)

DNA 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)

ECG 심전도(electrocardiogram)

HepG2 인간 간암 세포주(human hepatoma cell line)

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)

hTFPI 인간 조직 인자 경로 저해제 1(human tissue factor pathway inhibitor 1)

hTFPI D1 인간 조직 인자 경로 저해제 1 쿠니츠 도메인 1(human tissue factor pathway inhibitor 1 Kunitz domain 1)

HUVEC 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells)

IC₅₀ 효소 활성을 50％ 저해시키는 저해 농도

IL-8 인터루킨 8(interleukin 8)

i.v. 정맥내(intravenous)

kDa 킬로달톤(Kilodalton)

LACI 지질단백질-결합 응고 저해제(lipoprotein-associated coagulation inhibitor)

M 몰랄 (리터당 몰)

분(Min) 분

MOF 다발성 기관 부전(multiorgan failure)

OD 흡광

PEG 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)

PCR 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)

Rpm 분당 회전수(revolutions per minute)

TF 조직 인자(tissue factor)

TFA 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)

TPA 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator)

U 유니트 (효소 활성 단위)

도 1은 본 발명에 따른, hTFPI D1의 몇몇 바람직한 변이체의 아미노산 서열, 그리고 또한 아프로티닌 (BPTI) 및 hTFPI D1의 서열을 나타낸다.

도 2는 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 변이체, TFPI mut3EA (서열 번호: 19)이 인간 혈장 (시험관내)에서의 섬유소용해에 미치는 효과를 나타낸다.

도 3은 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 변이체, TFPI mut3EA (서열 번호: 19)이 인간 혈장 (시험관내)에서의 응고에 미치는 효과를 나타낸다.

도 4는 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 변이체, TFPI mut3EA (서 열 번호: 19)이 TPA의 존재하에 (생체내) 래트에서의 출혈 시간에 미치는 효과를 나타낸다.

도 5는 벡터 pIU10.10.W에서 클로닝된 합성 hTFPI D1 도메인의 뉴클레오티드 서열 및 유도된 서열 (hTFPI D1, 굵게 표시)을 나타낸다. 하위클로닝에 사용된 제한 효소 (BsaBI, XhoI)의 인식 서열은 밑줄로 표시되어 있다.

도 6은 벡터 pIU3.12.M에서 클로닝된 합성 hTFPI D1 도메인의 뉴클레오티드 서열 및 유도된 서열 (hTFPI D1, 굵게 표시)을 나타낸다. 하위클로닝에 사용된 제한 효소 (HindIII, BamHI)의 인식 서열은 밑줄로 표시되어 있고, 사용된 PCR 프라이머는 회색 바탕으로 표시되어 있다.

도 7은 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체 (서열 번호: 20)가 인간 혈장 (시험관내)에서의 섬유소용해에 미치는 효과를 나타낸다.

도 8은 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체 (서열 번호: 20)가 인간 혈장 (시험관내)에서의 응고에 미치는 효과를 나타낸다.

도 9는 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체 (서열 번호: 20)가 TPA의 존재하에 (생체내) 래트에서의 출혈 시간에 미치는 효과를 나타낸다.

도 10은 래트 동정맥 (AV) 단락 모델에서 트라실롤 (아프로티닌) 및 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체의 항혈전 효과를 나타낸다.

도 11은 래트에서 트라실롤이 상대 장간막 출혈 시간에 미치는 효과를 나타낸다. 시험 물질 투여 후의 출혈 시간을 상기 물질 투여 이전의 평균 대조군 출혈 시간과 관련하여 나타내었다. 값은 평균 ± SEM, n = 8로 나타내었다.

* 비히클과 유의적으로 상이, P < 0.05; *** 비히클과 유의적으로 상이, P < 0.001.

도 12는 래트에서 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체가 상대 장간막 출혈 시간에 미치는 효과를 나타낸다. 시험 물질 투여 후의 출혈 시간을 상기 물질 투여 이전의 평균 대조군 출혈 시간과 관련하여 나타내었다. 값은 평균 ± SEM, n = 8로 나타내었다.

도 13은 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체에 의한 IL-8-유도된 중성구의 주화성 저해를 나타낸다.

도 14는 본 발명에 따른 TFPI mut4EA 변이체에 의한 CAP-37-유도된 투과 증가 저해를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare <120> Chim?e Kunitz-Dom?en und ihre Verwendung <130> BHC 1 6 022 <150> EP06004693.5 <151> 2006-03-08 <160> 53 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 4 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 5 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala His Pro Arg Trp Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Bovine <400> 6 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg 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40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Phe Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 17 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala 1 5 10 15 Ala Met Lys Arg Phe Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 18 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 19 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 20 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 21 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 22 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 23 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 24 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Glu Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 25 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 26 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Ala Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 27 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 28 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Tyr Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 29 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ser Phe Pro Arg Trp Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 30 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Ser Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Lys Ala Arg Ile Ile Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 31 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Val Thr Gly Pro Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ala Met Lys Arg Phe Trp Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 32 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> X = natural amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (15)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 32 Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Xaa Xaa Gly Pro Cys Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu 20 25 30 Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu 35 40 45 Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 <210> 33 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> X = natural amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 33 Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Xaa Xaa Gly Pro Cys 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys 20 25 30 Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 50 55 60 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ggtaagcttg gataaaagag aagctatgca ttttttttgt gcttttaa 48 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tagtggatcc cgagcttgct tattaatctc tagtacacat t 41 <210> 36 <211> 88 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctatgcattc tttttgtgct tttaaagctg atgatggtcc atgtagagct gctcatccaa 60 gatggttttt caatattttt acaagaca 88 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tccctcgagt tattaatctc tagtacacat 30 <210> 38 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 tttgtgcttt taaagctgat gatggtccat gtagagctgc tc 42 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 tttgtgcttt taaagctgaa actggtccat gtagagctgc tc 42 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gagcagctct acatggacca gtttcagctt taaaagcaca aa 42 <210> 41 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 1 5 10 15 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 35 40 45 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala 50 55 <210> 42 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Arg Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Met Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 <210> 43 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Lys Gln Asp Val Cys Glu Met Pro Lys Glu Thr Gly Pro Cys Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Phe Leu His Trp Trp Tyr Asp Lys Lys Asp Asn Thr Cys Ser Met 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gln Ser Lys 35 40 45 Ala Asn Cys Leu Asn Thr Cys 50 55 <210> 44 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Phe Cys Leu Val Ser Lys Val Val Gly Arg Cys Arg Ala Ser Met 1 5 10 15 Pro Arg Trp Trp Tyr Asn Val Thr Asp Gly Ser Cys Gln Leu Phe Val 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Asp Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu Thr Lys Glu Glu 35 40 45 Cys Leu Lys Lys Cys 50 <210> 45 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Glu Tyr Cys Thr Ala Asn Ala Val Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ser Phe 1 5 10 15 Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Glu Arg Asn Ser Cys Asn Asn Phe Ile 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Ala 35 40 45 Cys Met Leu Arg Cys 50 <210> 46 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys Arg Ala Val Met Pro Arg 1 5 10 15 Trp Tyr Phe Asp Leu Ser Lys Gly Lys Cys Val Arg Phe Ile Tyr Gly 20 25 30 Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Asp Tyr Cys Met 35 40 45 Ala Val Cys 50 <210> 47 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Pro Leu Ala Ala Cys Ser Leu Pro Ala Leu Gln Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Tyr Ala Pro Arg Trp Ala Tyr Asn Ser Gln Thr Gly Gln Cys Gln Ser 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gly Asn Asn Phe Glu Ser Arg 35 40 45 Glu Ala Cys Glu Glu Ser Cys Pro Phe 50 55 <210> 48 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Ser Thr Gly Pro Cys Arg Ala Ala Ile 1 5 10 15 Ile Arg Tyr Phe Tyr Asp Ala Thr Ala Gly Leu Cys Glu Thr Phe Val 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Asn Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala Glu Asp 35 40 45 Cys Met Glu Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 <210> 49 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Glu Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 <210> 50 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Pro Pro Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala 1 5 10 15 Ala Ile Ile Arg Tyr Phe Tyr Asn Ala Lys Ala Gly Leu Cys Gln Thr 20 25 30 Phe Val Tyr Gly Gly Cys Arg Ala Lys Arg Asn Asn Phe Lys Ser Ala 35 40 45 Glu Asp Cys Glu Arg Thr Cys Gly Gly Ala 50 55 <210> 51 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Asp Gly His Cys Arg Ala Ala His 1 5 10 15 Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Val 20 25 30 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 35 40 45 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala 50 55 <210> 52 <211> 299 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 tcaaacaaga agattacaaa ctatcaattt catacacaat ataaacgatt aaaagaatga 60 gattcccatc tatttttact gctgttttgt ttgctgcttc ttctgctttg gctatgcatt 120 ctttttgtgc ttttaaagct gatgatggtc catgtaaagc tattatgaaa agattttttt 180 tcaatatttt tacaagacaa tgtgaagagt ttatctatgg tggttgtgaa ggtaatcaaa 240 atagatttga gtctttggaa gagtgtaaaa aaatgtgtac tagagattaa taactcgag 299 <210> 53 <211> 540 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 ttcaaacaag aagattacaa actatcaatt tcatacacaa tataaacgat taaaagaatg 60 agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agctgctcca 120 gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 180 tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 240 gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtaagc 300 ttggataaaa gagaagctat gcattctttt tgtgctttta aagctgatga tggtccatgt 360 aaagctatta tgaaaagatt ttttttcaat atttttacaa gacaatgtga agagtttatc 420 tatggtggtt gtgaaggtaa tcaaaataga tttgagtctt tggaagagtg taaaaaaatg 480 tgtactagag attaataagc aagctcggga tccactagta acggccgcca gtgtgctgga 540

Claims

천연 서열과 비교하여 X₁₀, X₁₁, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁ 및 X₂₂ 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 갖되, 단, 서열 번호: 1 (TFPI mut1) 서열의 펩티드는 제외한, 하기 일반식의 hTFPI D1 변이체:

여기서,

X₁₀이 아미노산 D, E, Y, V 또는 S이고,

X₁₁이 아미노산 D 또는 T이며,

X₁₅가 아미노산 K 또는 R이고,

X₁₆이 아미노산 A이며,

X₁₇이 아미노산 I, R, S 또는 A이고,

X₁₈이 아미노산 M, I, F 또는 H이며,

X₁₉가 아미노산 K, I 또는 P이고,

X_2O이 아미노산 R이며,

X₂₁이 아미노산 F 또는 W이고,

X₂₂가 아미노산 F 또는 W이다.
제1항에 있어서, N 말단에 아미노산 E 및 A를 추가로 포함하는 펩티드.
제1항에 있어서, 서열 번호: 3 (TFPI mut13), 서열 번호: 4 (TFPI mut3), 서열 번호: 5 (TFPI mut4), 서열 번호: 7 (TFPI mut2), 서열 번호: 8 (TFPI mut5), 서열 번호: 9 (TFPI mut6), 서열 번호: 10 (TFPI 랜덤), 서열 번호: 11 (TFPI mut7), 서열 번호: 12 (TFPI mut8), 서열 번호: 13 (TFPI mut9), 서열 번호: 14 (TFPI mut1O), 서열 번호: 15 (TFPI mut11), 및 서열 번호: 16 (TFPI mut12)을 포함하는 군으로부터 선택되는 펩티드.
제2항에 있어서, 서열 번호: 17 (TFPI mut15), 서열 번호: 18 (TFPI mut13EA), 서열 번호: 19 (TFPI mut3EA), 서열 번호: 20 (TFPI mut4EA), 서열 번호: 21 (TFPI mut2EA), 서열 번호: 22 (TFPI mut5EA), 서열 번호: 23 (TFPI mut6EA), 서열 번호: 24 (TFPI 랜덤EA), 서열 번호: 25 (TFPI mut7EA), 서열 번호: 26 (TFPI mut8EA), 서열 번호: 27 (TFPI mut9EA), 서열 번호: 28 (TFPI mut10EA), 서열 번호: 29 (TFPI mut11EA), 서열 번호: 30 (TFPI mut12EA), 및 서열 번호: 31 (TFPI mut15EA)을 포함하는 군으로부터 선택되는 펩티드.
제1항 내지 제4항에 따른 펩티드 중 하나를 코딩하는 DNA.
제5항에 따른 DNA를 포함하는 벡터.
제5항에 따른 DNA를 포함하는 미생물.
제5항에 따른 미생물의 발현에 의해 제1항 내지 제4항에 따른 펩티드를 제조하는 방법.
하나 이상의 제1항 내지 제4항에 따른 펩티드를 포함하는 의약.