KR100356956B1 - 사람비쿠닌 - Google Patents

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KR100356956B1
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게리 데이비스
캐더린 에이. 델라리아
크리스토퍼 더블유. 말로어
다니엘 케이. 멀러
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베이어 코오포레이숀
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Abstract

본 발명은 사람 태반 비쿠닌, 세린 프로테아제 억제제 도메인, 및 이것의 단편의 단백질, 폴리펩티드, 핵산 서열, 구조, 발현 벡터, 숙주 세포, 약제 조성물, 및 사용 방법을 제공한다.

Description

사람 비쿠닌 {HUMAN BIKUNIN}
제기된 문제점
혈액 손실은 심장 절개 수술과 같은 위험한 수술 및 그 밖의 복잡한 수술의 심각한 합병증이다. 심장 수술 환자는 수혈된 혈액제공자 혈액의 상당한 비율을 차지한다. 수혈은 질병 전염 및 부반응의 위험을 수반한다. 또한, 혈액제공자의 혈액은 고가이고, 종종 수요량이 공급량을 초과한다. 혈액 손실을 줄이기 위한 약리학적 방법 및 수혈을 위한 결과적인 필요량이 기술되어 왔다 (참조: Scott et al., Ann. Thorac. Surg.50: 843-851, 1990).
단백질 세린 프로테아제 저해제
쿠니츠(Kunitz) 패밀리의 우혈청 프로테아제 저해제인 아프로티닌은 약제인 트라실롤[등록상표: Trasylol]의 활성 물질이다. 아프로티닌(트라실롤)은 수술기주위의 혈액 손실을 줄이는 데에 효과적인 것으로 보고되어 왔으나 [참고문헌:Royston et al., Lancet ii: 1289-1291, 1987; Dietrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 92-98, 1989; Fraedrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 89-91, 1989; W. van Oeveren et al. (1987), Ann Thorac. Surg. 44, pp 640-645; Bistrup et al., (1988) Lancet I, 366-367], 고혈압 및 조홍[참고문헌: Bohrer et al., Anesthesia 45: 853-854, 1990]과 알레르기성 반응[참고문헌: Dietrich et al., 상기 언급됨]을 포함하는 부작용이 보고되어 왔다. 아프로티닌에 사전 노출된 환자에서 아프로티닌을 사용하는 방법은 권장되어 있지 않다[참고문헌: Dietrich et al., 상기 언급됨]. 트라실롤??은 또한 과섬유소용해성 출혈 및 외상 출혈성 쇼크의 치료에 사용되어 왔다.
아프로티닌은 트립신, 키모트립신, 플라스민, 및 칼리크레인을 포함하는 여러 가지 세린 프로테아제를 저해하는 것으로 공지되어 있고, 급성 췌장염, 다양한 상태의 쇼크 증후군, 과섬유소용해성 출혈 및 심근 경색의 치료에 치료학적으로 사용된다 [참고문헌: Trapnell et al., (1974) Brit J.Surg. 61: 177; J.McMichan et al., (1982) Circulatory Shock 9: 107; Auer et al., (1979) Acta Neurochir. 49: 207; Sher (1977); Am J.Obstet. Gynecol. 129: 164; Schneider(1976), Artzneim.-Firsch. 26: 1606]. 트라실롤??이 칼리크레인 및 플라스민을 저해하여 생체내에서 혈액 손실을 감소시키는 것으로 일반적으로 생각된다. 아프로티닌(3-58, Arg15, Ala17, Ser42)이 천연 아프로티닌과 비교해 볼 때 개선된 혈장 칼리크레인 억제 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌다[참고문헌: 제 WO 89/10374 호].
아프로티닌과 관련된 문제점
아프로티닌이 소에서 유래되기 때문에, 약물에 재노출되는 경우 사람 환자 내에서 과민증을 유도시킬 한정된 위험이 존재한다. 따라서, 아프로티닌에 대한 인체 작용성 균등물을 제공하는 것이 보다 적은 과민증 위험으로 인하여 가장 유용하고 바람직할 것이다.
아프로티닌은 고용량으로 반복 투여되는 경우에 설치류 및 개과 동물에서 또한 신독성을 나타낸다 [참고문헌: Bayer, Trasylol(등록상표), Inhibitor of proteinase; Glasser et al., in "Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, Munchen, 1972 pp. 1612-1614]. 1가지 가설은 이러한 효과가 아프로티닌의 높은 순 양전하로 인해 아프로티닌이 음전기적으로 하전된 신장의 기부 세관에 축적되기 때문이라고 한다 [참고문헌: 제 WO 93/14120 호].
따라서, 본 발명의 목적은 아프로티닌과 유사한 기능적 활성을 갖는 인체 단백질을 확인하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 보다 덜 하전되어 있지만, 특히 플라스민 및 칼리크레인 저해 효능면에서, 아프로티닌에서 발견되는 프로테아제 특이성과 동일하거나 고도로 유사하거나, 프로테아제 특이성이 개선된 인체 단백질을 확인하는 것이다. 그런 다음, 이러한 저해제는 사람 환자에서 약제로서 반복 사용될 수 있으며, 이 경우, 불리한 면역 반응의 위험 및 신독성이 감소된다.
발명의 요약
본 발명은 칼리크레인을 특이적으로 저해할 수 있는 정제된 인체 세린 프로테아제 저해제를 제공하며, 이러한 저해제는 사람 태반 조직으로부터 친화성 크로마토그래피에 의해 단리된다.
본 발명은 신규하게 확인된 인체 단백질(본 명세서에서는 사람 태반 비쿠닌으로 명명됨)을 제공하며, 이러한 단백질은 쿠니츠 클래스에 속하는 2가지 세린 프로테아제 저해제를 함유한다. 1가지 특정한 구체예의 경우, 본 발명은 다음의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 구체화한다:
바람직한 구체예의 경우, 본 발명은 다음의 아미노산 서열을 갖는 천연 인체 태반 비쿠닌 단백질을 제공한다:
1가지 일면에서, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성은 트립신, 인체 혈장 및 조직 칼리크레인, 인체 플라스민 및 인자 XIIa와 결합할 수 있고, 이들의 생물학적 활성을 상당히 저해할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 천연 인체 태반 비쿠닌 단백질을 글리코실화된 형태로 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 함유하도록 형성된 천연 인체 비쿠닌 단백질을 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 단백질은 CYS11-CYS61, CYS20-CYS44, CYS36-CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139 및 CYS131-CYS152로 이루어진 군으로부터 선택된 한 쌍의 시스테인 사이에서 형성된 하나 이상의 내부 사슬 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 함유하며, 여기에서, 시스테인은 천연 인체 태반 비쿠닌의 아미노산 서열에 따라 번호가 매겨진다. 당업자는 본 발명의 단백질이 적절한 3차원 구조로 폴딩될 수 있어서, 천연 사람 비쿠닌의 생물학적 활성이 유지되고 여기서, 천연 내부 사슬 시스테인-시스테인 이황화물 결합은 하나도 없거나, 하나 이상이거나 모두 존재함을 인식할 것이다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 단백질은 적절하게 폴딩되고, 모든 적절한 천연 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 갖도록 형성된다.
본 발명의 활성 단백질은 태반과 같은 사람 조직으로부터 정제되거나 하기의 실시예에 의해 설명되는 바와 같이 합성 단백질 화학 방법에 의해 수득될 수 있다. 또한 본 발명의 단백질이 분자 생물학 방법을 이용하여 수득될 수 있는 것으로 이해되며, 이 경우, 자기 복제 벡터가 형질전환된 세포로부터 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있다. 이러한 단백질은 형질전환된 세포로부터 분비되지 않거나 분비되는 형태로서 제조될 수 있다. 형질전환된 세포로부터의 분비를 촉진하거나, 번역된 단백질의 기능적 안정성을 강화시키거나, 비쿠닌 단백질의 폴딩을 보조하기 위하여, 특정한 신호 펩티드 서열이 천연 사람 비쿠닌 단백질의 NH2-말단부에 첨가될 수 있다.
1가지 구체예에 있어서, 본 발명은 신호 펩티드의 일부 이상이 온전한 천연 사람 비쿠닌 단백질을 제공한다. 따라서, 본 발명의 1가지 구체예는 하기의 아미노산 서열을 가지며, 신호 펩티드 서열의 일부 이상을 갖는 천연 사람 비쿠닌을 제공한다:
1가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 온전한 리더 절편을 지닌 서열 52의 아미노산 서열을 갖는, 리더 서열의 일부가 온전한 천연 사람 태반 비쿠닌 단백질을 제공한다:
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 온전한 리더 서열을 지닌 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는, 리더 서열의 일부가 온전한 비쿠닌 단백질을 제공한다:
본 명세서에서 사용된 바람직한 번호화 시스템에 있어서, +1로 번호가 매겨진 아미노산은 천연 사람 태반 비쿠닌에 대한 아미노산 서열의 NH2-말단에 할당된다. 작용성 단백질 단편이 천연 사람 태반 비쿠닌으로부터 유도될 수 있으며, 이것은 일부 이상의 천연 사람 태반 비쿠닌의 생물학적 활성을 유지할 것이며 세린 프로테아제 저해제로서 작용할 것임은 용이하게 인식될 것이다.
1가지 구체예에 있어서, 본 발명의 단백질은 천연 사람 태반 비쿠닌의 단편을 포함하고, 이러한 단편은 하나 이상의 작용성 쿠니츠-유사 도메인을 함유하며, 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 7번 내지 159번 (이하, "비쿠닌(7-159)"라 함)를 갖는다. 따라서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 구체화한다:
상기 서열에서, 아미노산 번호매김은 천연 사람 태반 비쿠닌의 아미노산 서열의 번호매김에 상응한다. 이러한 구체예의 또 다른 기능적 변형체는 천연 사람 태반 비쿠닌의 단편일 수 있고, 이것은 하나 이상의 작용성 쿠니츠-유사 도메인을 함유하며 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 11번 내지 156번 즉, 비쿠닌(11-156)의 아미노산 서열을 갖는다:
개개의 쿠니츠-유사 도메인이 또한 천연 태반 비쿠닌의 단편임이 인식될 수있다. 특히, 본 발명은 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 7번 내지 64번(이하, "비쿠닌 (7-64)"라 함)의 아미노산 서열로 구성된 제 1 쿠니츠-유사 도메인의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다. 따라서, 1가지 구체예에서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 쿠니츠-유사 도메인을 함유하는 단백질을 포함한다:
상기 서열에서, 아미노산 번호매김은 천연 사람 태반 비쿠닌의 아미노산 서열의 번호매김에 상응한다. 본 발명의 단백질의 또 다른 형태는 하기의 아미노산 서열을 갖는 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 11번 내지 61번("비쿠닌 (11-61)")의 아미노산 서열로 구성된 제 1 쿠니츠-유사 도메인일 수 있다:
본 발명은 또한 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 102번 내지 159번(이하, "비쿠닌(102-159)라 명명됨")의 아미노산 서열로 구성된 쿠니츠-유사 도메인의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다. 따라서, 본 발명의 1가지 구체예는 하기의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 쿠니츠-유사 도메인을 함유하는 단백질을 포함한다:
상기 서열에서, 아미노산 번호매김은 천연 사람 태반 비쿠닌의 아미노산 서열의 번호매김에 상응한다. 이러한 도메인의 또 다른 형태는 아미노산 서열을 갖는 천연 사람 태반 비쿠닌 아미노산 106번 내지 156번 ("비쿠닌 (106-156)")의 아미노산 서열로 구성된 쿠니츠-유사 도메인일 수 있다:
따라서, 당업자라면 일부 이상의 천연 단백질의 생물학적 활성을 보유할 천연 사람 비쿠닌 단백질의 단편이 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 단편은 또한 다양한 배향 또는 다중 조합으로 조합될 수 있어서, 천연 사람 비쿠닌 단백질과 동일하거나 더욱 생물학적인 활성의 일부를 보유하는 대안적인 단백질을 제공한다.
본 발명의 생물학적으로 활성인 단백질이 그 밖의 공급원으로부터의 추가의 쿠니츠-유사 도메인과 조합하여 하나 이상의 본 발명의 쿠니츠-유사 도메인을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 본 발명의 생물학적으로 활성인 단백질은 다양한 생물학적 활성을 갖는 그 밖의 공급원으로부터의 추가의 단백질 도메인과 조합하여 하나 이상의 본 발명의 쿠니츠-유사 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질의 생물학적 활성은 그 밖의 공지된 단백질(들)의 생물학적 활성과 조합될 수 있어서, 예측가능한 생물학적 활성을 갖는 다작용성 융합 단백질이 제공된다. 따라서, 1가지 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 동일하거나 기능적으로 균등한 하나 이상의 아미노산 서열 절편을 함유하는 단백질을 포함한다.
초기 정지 코돈에서 종결되는 오픈 리딩 프레임은 작용성 단백질을 코딩할 수 있다. 본 발명은 이러한 대안적인 종결을 포함하며, 1가지 구체예에 있어서, 하기의 아미노산 서열의 단백질을 제공한다:
1가지 구체예에서, 본 발명은 리더 서열의 온전한 절편을 갖고 부분 이상의 천연 트랜스멤브레인 영역이 온전한, 실질적으로 정제되거나 재조합적으로 제조된 천연 사람 비쿠닌 단백질을 제공한다. 따라서, 본 발명의 1가지 구체예는 하기의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, 온전한 리더 서열 및 부분 이상의 트랜스멤브레인 도메인(밑줄 그어져 있음)을 갖는 천연 사람 비쿠닌을 제공한다:
상기 서열에서, 서열 1)은 EST 유래된 컨센서스(consensus)(서열번호 45)이고, 2)는 PCR 클론(서열번호 47)이고, 서열 3)은 람다 cDNA 클론(서열번호 49) 이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 45, 47 또는 49의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하며, 여기에서 단백질은 최종 쿠니츠 도메인의 말단과 트랜스멤브레인 영역 사이의 영역에서 절단된다.
본 발명은 또한 신호 펩티드가 결실된 단백질을 구체화한다. 따라서, 본 발명은 하기의 트랜스멤브레인 아미노산 서열에 연속된 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제공한다:
하기 트랜스멤브레인 아미노산 서열:
또는 하기 트랜스멤브레인 아미노산 서열:
본 발명의 단백질 아미노산 서열은 당업 분야의 숙련자에게 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 분자 생물학 기술에서 사용될 수 있는 적절한 핵산 서열을 교시한다. 따라서, 본 발명의 1가지 구체예는 도 3의 컨센서스 DNA 서열(서열번호 9)를 갖는 사람 비쿠닌을 엔코딩하는 핵산 서열을 제공하며, 이러한 핵산은 도 3의 천연 사람 태반 비쿠닌 서열(서열번호 10)에 대한 아미노산 서열로 번역된다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 도 4D의 아미노산 서열(서열번호 45)을 엔코딩하는 도 4C의 컨센서스 핵산 서열(서열번호 51)을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호 49의 단백질 서열을 엔코딩하는 도 4F의 DNA 서열(서열번호 48)을 갖는 천연 사람 태반 비쿠닌을 엔코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 서열번호 47의 단백질 서열을 엔코딩하는 도 4E의 핵산 서열(서열번호 46)을 제공한다.
본 발명에 의해 포함되는 단백질 아미노산 서열을 생성시키는, 핵산 서열에서 일어나는 특정한 대립유전자 돌연변이 및 보존적 치환이 이루어질 수 있다는 것이 용이하게 인식될 것이다. 당업 분야의 숙련자라면 본 발명의 단백질의 천연 대립유전자 돌연변이 및 본 발명의 단백질에서의 아미노산의 보존적 치환이 단백질의 생물학적 활성을 현저하게 변화시키지 않으며, 본 발명에 의해 포함된다는 것을 인식할 수 있다.
본 발명은 또한 수술 받는 환자에서 수술기주위의 혈액 손실을 감소시키는 데에 유용한 사람 태반 비쿠닌 및 이것의 단편을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 수술 받는 환자에서의 수술기주위의 혈액 손실을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 생물학적으로 적합성인 운반체 내의 유효량의 본 발명의 기술된 사람 혈청 프로테아제 억제물질이 환자에게 투여된다.
본 발명은 또한 프로테아제 특이성을 변화시키는 아미노산 치환을 함유하는, 태반 비쿠닌의 변형체 및 특이적인 쿠니츠 도메인을 제공한다. 치환되는 바람직한 부위는 천연 태반 비쿠닌에 대한 아미노산 서열 내의 위치 Xaa1내지 Xaa32로서 하기에 나타난다. Xaa1내지 Xaa16에서의 치환은 또한 비쿠닌(7-64)의 변형체에 대해 바람직한 반면에, Xaa17내지 Xaa32에서의 치환은 비쿠닌(102-159)의 변형체에 대해 바람직하다.
따라서, 본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 구현한다:
상기 서열에서, Xaa1내지 Xaa32는 각각 독립적으로 Cys를 제외한 자연 발생적인 아미노산 잔기를 나타내지만 단, 하나 이상의 아미노산 잔기 Xaa1내지 Xaa32는 상응하는 천연 서열의 아미노산 잔기와 상이하다.
본원에서, "자연 발생적인 아미노산 잔기"란 용어는 20개의 자연 발생적인 아미노산, 즉, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val 중의 임의의 하나를 나타내고자 한다.
상기에 나타난 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써, 천연 태반 비쿠닌 또는 개개의 쿠니츠-유사 도메인인 비쿠닌(7-64)이나비쿠닌(102-159)의 억제물질 특이성 프로필을 변화시킬 수 있어서, 이들에 제한되지는 않지만 보체 캐스캐이드의 효소인 TF/FVIIa, FVIIa, FXa, 트롬빈, 호중구 엘라스타아제, 카텝신 G 또는 프로테이나아제-3와 같은 그 밖의 혈청 단백질을 바람직하게 저해한다.
태반 비쿠닌의 바람직한 변형체의 예로는, Xaa1가 His, Glu, Pro, Ala, Val 또는 Lys로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa1가 His 또는 Pro인 것; 또는 Xaa2가 Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala, Lys로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa2가 Val 또는 Thr인 것; 또는 Xaa3가 Arg, Pro, Ile, Leu, Thr로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa3가 Arg 또는 Pro인 것; 또는 Xaa4가 Arg, Lys 및 Ser, Gln으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa4가 Arg 또는 Lys인 것; 또는 Xaa5가 Ala, Gly, Asp, Thr로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa5가 Ala인 것; 또는 Xaa6가 Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa6가 Ser 또는 Arg인 것; 또는 Xaa7가 Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa7가 Met 또는 Ile인 것; 또는 Xaa8가 Pro, Lys, Thr, Gln, Asn, Leu, Ser 또는 Ile로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa8가 Pro 또는 Ile 인 것; 또는 Xaa9가 Arg, Lys 또는 Leu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa9가 Arg 인 것; 또는 Xaa10가 Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gln, Leu 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa10가 Val 인 것; 또는 Xaa11가 Gly, Ser 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa11가 Gly 인 것; 또는 Xaa12가 Asp, Arg, Glu, Leu, Gln, Gly로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa12가 Asp 또는 Arg 인 것; 또는 Xaa13가 Gly 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것; 또는 Xaa14가 Asn 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것; 또는 Xaa15가 Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa15가 Leu 또는 Lys 인 것; 또는 Xaa16가 Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa16가 Val 또는 Ala 인 것; 또는 Xaa17가 His, Glu, Pro, Ala, Lys 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa17가 Glu 또는 Pro 인 것; 또는 Xaa18가 Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa18가 Thr 인 것; 또는 Xaa19가 Arg, Pro, Ile, Leu 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa19가 Pro 인 것; 또는 Xaa20가 Arg, Lys, Gln 및 Ser로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa20가 Arg 또는 Lys 인 것; 또는 Xaa21가 Ala, Asp, Thr 또는 Gly로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것; 또는 Xaa22가 Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg 또는 Phe로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa22가 Ser 또는 Arg 인 것; 또는 Xaa23가 Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa23가 Phe 또는 Ile 인 것; 또는 Xaa24가 Pro, Lys, Thr, Asn, Leu, Gln, Ser 또는 Ile로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa24가 Pro 또는 Ile 인 것; 또는 Xaa25가 Arg, Lys 또는 Leu로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa25가 Arg 인 것; 또는 Xaa26가 Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa26가 Val 또는 Ile 인 것; 또는 Xaa27가 Gly, Ser 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa27가 Gly 인 것; 또는 Xaa28가 Asp, Arg, Glu, Leu, Gly 또는 Gln로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa28가 Arg 인 것; 또는 Xaa29가 Gly 및 Ala로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것; 또는 Xaa30가 Asn 또는 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것; 또는 Xaa31가 Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa31가 Arg 또는 Lys 인 것; 또는 Xaa32가 Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met, 및 Thr로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기인 것, 특히, Xaa32가 Gln 또는 Ala 인 것;
본 발명의 조성물은 세린 프로타아제 활성을 저해하는 단백질의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세린 프로테아제 저해제 단백질을 제조하기 위한 핵산 구성물, 벡터 및 숙주 세포, 이러한 단백질을 함유하는 약제학적 조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 하기의 상세한 설명 및 청구의 범위를 다음의 도면과 함께 고려하여 더욱 잘 이해될 것이다:
도 1은 EST R35464의 누클레오티드 서열(서열번호 12) 및 아프로티닌과 일부의 서열 유사성을 갖는 오픈 리딩 프레임을 생성시키는 이 DNA 서열의 번역(서열번호 13)을 도시한다. 번역 생성물은 쿠니츠 유사 억제물질 도메인의 특징인 정확한 간격으로 6개의 시스테인 중의 5개를 함유한다 (진하게 표시되어 있음). 남아있는시스테인에 의해 일반적으로 점유되는 위치(코돈 38)에는 대신 페닐알라닌이 함유되어 있다(별표로 표시되어 있음).
도 2는 EST R74593의 누클레오티드 서열(서열번호 14), 및 혈청 프로테아제 억제물질 도메인의 쿠니츠 클래스와 상동인 오픈 리딩 프레임을 생성시키는 이 DNA 서열의 번역(서열번호 15)을 도시한다. 번역 생성물은 쿠니츠 유사 억제물질 도메인의 특징인 정확한 간격의 6개의 시스테인을 함유한다 (진하게 표시되어 있음). 그러나, 이러한 리딩 프레임 서열은 코돈 3 및 23에서 정지 코돈을 포함하고 있다.
도 3은 "번역된"이라 표지된 번역된 단백질 아미노산 서열(서열번호 10)과 합치되는, "컨센서스"라 표지된 사람 태반 비쿠닌의 추론된 핵산 서열(서열번호 9)를 도시한다. 또한, ESTs H94519(서열번호 16), N39798(서열번호 17), R74593(서열번호 14) 및 R35464(서열번호 12)에 대한 핵산 서열이 비교로서 도시되어 있다. 컨센서스 서열 중의 밑줄 그어진 누클레오티드는 실시예에 기술된 PCR 프라이머의 부위에 상응한다. 번역된 컨센서스 서열 중의 밑줄 그어진 아미노산은 정제된 천연 사람 태반 비쿠닌의 아미노산 서열화에 의해 동일성이 확인된 잔기이다. 누클레오티드 및 아미노산 코드는 표준 단일 문자 코드이고, 핵산 코드 중의 "N"은 미할당된 핵산을 나타내며, "*"는 아미노산 서열 중의 정지 코돈을 나타낸다.
도 4A는 사람 태반 비쿠닌, 또는 이것의 일부를 코드화하는 EST와 상동인 일부 핵산 서열을 갖는 일련의 EST의 본래 오버레이(overlay)를 도시한다. 참조를 위해 각각 KID1 및 KID2로 표지된 비쿠닌(7-64) 및 비쿠닌(102-159)의 상대적인 위치를 도시되어 있다.
도 4B는 추가의 ESTs를 포함하는 계속되는 보다 포괄적인 EST 오버레이를 도시한다. 상부 X축 상의 숫자는 최 5´EST 서열로부터의 첫번째 염기에서 출발하는, 염기쌍의 길이를 의미한다. 각각의 막대의 길이는 갭을 포함하는 개개의 ESTs의 염기쌍의 길이에 비례한다. EST 접근 숫자는 각각의 EST 막대의 우측에 표시되어 있다.
도 4C는 도 4B에 개략적으로 도시된 각각의 오버랩핑 ESTs의 올리고누클레오티드 서열의 대응하는 정렬을 도시한다. 비쿠닌이라 표지된 상부 서열(서열번호 51)은 각각의 위치에서 오버랩핑 누클레오티드로부터 유도된 컨센서스 올리고누클레오티드 서열을 나타낸다. 숫자는 EST 지도 내의 염기쌍 위치를 의미한다. 진하게 밑줄그어져 있는 EST R74593 중의 올리고누클레오티드(지도 위치 994 및 1005)는 그 밖의 오버랩핑 ESTs 각각에는 일관되게 없는 R74593 중에서 관찰된 염기 삽입이다.
도 4D는 도 4C에 도시된 비쿠닌에 대한 컨센서스 올리고누클레오티드 서열의 아미노산 번역(서열번호 45)을 도시한다.
도 4E는 PCR-기본 증폭에 의해 사람 태반 cDNA로부터 유도된 서열을 엔코딩하는 태반 비쿠닌의 누클레오티드 서열(서열번호 46) 및 상응하는 아미노산 번역(서열번호 47)을 도시한다.
도 4F는 콜로니 하이브리드 형성에 의해 사람 태반 람다 cDNA 라이브러리로부터 단리된 클론을 엔코딩하는 천연 사람 태반 비쿠닌의 누클레오티드 서열(서열번호 48) 및 상응하는 아미노산 번역(서열번호 49)를 도시한다.
도 4G는 EST 오버레이(서열번호 45), PCR-기초 클로닝(서열번호 47) 및 통상적인 람다 콜로니 하이브리드형성(서열번호 49)에 의해 수득된 태반 비쿠닌에 대한 아미노산 번역된 올리고누클레오티드 서열의 정렬을 비교한다.
도 5는 Superdex 75 겔-여과 후의 태반 조직으로부터의 사람 태반 비쿠닌의 정제의 그래프를 도시한다. 플롯은 OD 280nm(굵은 선)에 의해 측정된 바와 같은 단백질 용리 프로필, 트립신 억제 검정법에서의 용리된 단백질의 활성(원에 의해 나타나는 %억제), 및 칼리크레인 억제 검정법에서의 용리된 단백질의 활성(정사각형에 의해 나타나는 %억제)의 오버레이 이다.
도 6은 C18 역상 크로마토그래피를 이용하는 태반 조직으로부터의 사람 태반 비쿠닌의 정제를 플롯팅하는 그래프를 도시한다. 플롯은 OD 215nm에 의해 측정된 바와 같은 단백질 용리 프로필(굵은 선), 트립신 억제 검정법에서의 용리된 단백질의 활성(원에 의해 나타나는 %억제), 및 칼리크레인 억제 검정법에서의 용리된 단백질의 활성(정사각형에 의해 나타나는 %억제)의 오버레이 이다.
도 7은 고도로 정제된 태반 비쿠닌(레인 2)의 은 염색된 SDS-PAGE 겔, 및 킬로달톤으로 표시된 크기를 갖는 분자적 크기의 일련의 마커 단백질(레인 1)을 도시한다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다.
도 8은 태반 비쿠닌(102-159)의 발현을 유도하는 플라스미드(pS604)로 안정하게 형질전환시킨 효모 균주 SC101(패널 8A) 또는 WHL341(패널 8B)의 성장으로부터의 세포가 없는 발효 배양액 내에 존재하는 트립신 억제 활성의 양을 도시한다.
도 9는 소과동물 아프로티닌 또는 태반 비쿠닌(102-159) 중의 하나의 발현을 유도하는 플라스미드로 안정하게 형질전환시킨 효모 균주 SC101(재조합체 2.4 및 2.5)의 성장으로부터의 세포가 없는 발효 배양액의 항-태반 비쿠닌(102-159) pAb의 은 염색된 SDS-PAGE(좌측 패널) 및 웨스턴 블롯(우측 패널)을 도시한다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다.
도 10은 고도로 정제된 태반 비쿠닌(102-159)(레인 2) 및 킬로달톤으로 표시된 크기를 갖는 일련의 분자적 크기의 마커 단백질(레인 1)의 은 염색된 SDS-PAGE를 도시하는 사진이다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다.
도 11은 태반 비쿠닌(102-159)을 엔코딩하거나(패널 11A) 태반 비쿠닌(1-213)을 엔코딩하는(패널 11B)32P 표지된 cDNA 프로브와 하이브리드를 형성하는 다양한 사람 조직으로부터의 mRNA의 노던 블롯의 결과를 도시한다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다. 각각의 블롯의 우측에 있는 숫자는 인접한 RNA 마커의 크기(킬로달톤)를 의미한다. mRNA가 유도되는 기관은 블롯의 각각의 레인 아래에 기재되어 있다.
도 12는 합성된 감소된 태반 비쿠닌(7-64)(패널 A) 또는 비쿠닌(10-159)(패널 B)에 대하여 성장시킨 토끼 항혈청을 사용하는 태반 유도된 태반 비쿠닌의 면역블롯을 도시한다. 각각의 패널에 대하여, 함유물은 다음과 같다: 분자적 크기 마커(레인 1); 사람 태반으로부터 단리된 천연 태반 비쿠닌(레인 2); 합성 태반 비쿠닌(7-64)(레인 3) 및 합성 태반 비쿠닌(102-159)(레인 4). 트리신 10 내지 20%SDS-PAGE 겔이 블롯팅되고, 단백질 A-정제된 1차 폴리클론성 항체 (20ml 0.1% BSA/Tris-완충 식염(pH 7.5) 중의 8ug IgG)로 전개되고, 이어서 알칼리성 포스파타아제-컨쥬게이트된 염소 항토끼 2차 항체로 전개되었다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다.
도 13은 바쿨로바이러스/Sf9 발현 시스템(레인 2)로부터 유도된 3㎍의 고도로 정제된 태반 비쿠닌(1-170)의 쿠마시에 블루(Coomassie Blue) 염색된 10 내지 20% 트리신 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 레인 1은 분자적 크기 마커를 함유하였다. 이동은 상부에서 하부로 일어났다.
도 14는 사람 혈장의 활성화된 부분적 트롬보플라스틴시간에 대한 증가하는 농도의 Sf9-유도된 사람 태반 비쿠닌(1-170)(흑색 원), 합성 태반 비쿠닌(102-159)(흰색 원) 또는 아프로티닌(흰색 정사각형)의 효과의 비교를 도시한다. 응고는 CaCl2에 의해 개시되었다. 단백질의 농도는 응고 시간의 -배 연장에 대해 플롯팅되어 있다.
본 발명의 쿠니츠 클래스의 2개의 세린 프로테아제 억제물질을 함유하는 신규하게 확인된 사람 단백질(본 명세서에서는 사람 태반 비쿠닌이라 명명됨)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 수술을 받거나 큰 외상을 입은 환자에서의 수술기주위의 혈액 손실을 감소시키는 데에 유용한 태반 비쿠닌 및 이것의 단편을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 수술을 받거나 큰 외상으로 인한 환자에서의 혈액 손실을 경감시키는 방법을 제공하며 여기서, 생물학적으로 적합성인 운반체 중의 유효량의 본 발명의 사람 혈청 프로테아제 억제물질이 환자에게 투여된다.
태반 비쿠닌, 단리된 도메인 및 그 밖의 변형체에 대한 바람직한 응용은 대량의 혈액을 손실시킬 가능성을 갖는 외상 또는 수술로 인한 혈액 손실을 감소시키기 위한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 전체 공급 혈액 또는 혈액 생성물에 대한 필요성을 경감시키거나 제거시킴으로써, 수술 비용 뿐만 아니라 감염 및 그 밖의 유해한 부작용의 위험을 경감시킨다. 따라서, 본 발명의 방법은 보통 환자, 즉, 응고 인자의 선천적 또는 수술전 결핍증을 앓고 있지 않은 환자의 경우에 혈액 손실을 경감시키는 데에 유용하다. 혈액 손실의 감소는 수술 동안의 혈액 손실의 감소, 경감된 수술후 배액 또는 둘 모두로서 나타난다. 바람직한 수술 적용은 흉곽 및 복부 수술, 전체 및 부분적 둔부 대치 수술 및 안구의 상피 병변을 치료하기 위한 수술에서의 사용이지만, 이들에 제한되지는 않는다. 바람직한 흉곽 수술은 대동맥관상동맥바이패스, 심장류 및 대동맥류의 절제, 및 식도정맥류에 대한 수술, 및 관상동맥바이패스 수술을 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 바람직한 복부 수술은 간 이식조직편, 근치 전립선절제술, 결장게실염 수술, 종양 디벌킹(debulking), 복대동맥 수술 및 십이지장궤양 수술, 및 간이나 비장 손상의 치유를 포함하지만, 이들에 제한되지는 않는다. 외상 치료에 대한 바람직한 사용은 예를 들어, 사지 손실 또는 큰 흉곽/복부 손상을 입고 사고 지점에 있는 중상 환자를 안정시키는 데에 사용하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다. 수술로 인한혈액 손실의 감소를 위해 사용되는 경우에는 수술전 및 수술 동안에 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체를 투여하는 것이 바람직한 반면에, 외상에 사용되는 경우에는 태반 비쿠닌 변형체, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체가 상해후 가능한 한 신속하게 투여되어야 하고, 사고 지점으로 이동하면서 구급차에서 함유되어야 한다.
인자 XII(또한 헤게만(Hageman) 인자로 공지되어 있음)는 약 29 내지 40㎍/ml로 지모겐 형태(80kD)로 순환계에서 발견되고[참조: Pixley, et al.(1993)Meth, in Enz., 222, 51-64], 조직 및 원형질 칼리크레인에 의해 활성화되는 세린 프로테아제이다. 인자 XII가 활성화되면, 혈액 또는 원형질이 "외래" 또는 음이온성 표면과 접촉하는 경우에 활성화되는 고유의 혈액 응고 경로에 관여한다. 인자 XIIa는 활성화된후, 인자 XI, 칼리크레인 전구체, 및 보체계의 C1을 포함하는 다수의 그 밖의 원형질 프로테아제를 분해시켜 활성화시킬 수 있다. 따라서, 인자 XII는, 활성화된 칼리크레인이 브라디키닌을 방출시키는 키니노겐을 분해할 수 있기 때문에, 저혈압 반응을 유발시키는 데에 관여될 수 있다[참조: Colman, (1984)J.Clin. Invest., 73, 1249].
패혈증은 세균 내독소 또는 리포폴리사카라이드(LPS)로 인한 세균 감염으로부터 생기는 질병이다. 인자 XII가 LPS에 노출되면 인자 XII가 활성화된다. 패혈증에 걸린 환자는 종종 LPS에 의한 인자 XII의 활성화에 또한 기인될 수 있는 혈관내 응고의 증상을 나타낸다. 패혈증성 쇼크는 세균 감염으로부터 생길 수 있고, 발열, 낮은 전신 혈관 저항성, 및 낮은 동맥압과 관련되어 있다. 패혈증성 쇼크는미국내 집중적 의료 기관에서의 사망의 공통된 원인이며, 이곳에서 패혈증성 쇼크로 사망한 환자의 75%가 영속적인 저혈압을 갖는다 [참조: Parillo, et al. (1989) Ann Rev. Med., 40, 469-485].
성인성호흡곤란증후군은 폐부종, 저산소혈증, 및 감소된 폐 탄성을 특징으로 한다. 응고의 단백분해 경로 및 섬유소용해가 일정한 역할을 할 것으로 믿어지지만, 병인은 현재 알려져 있지 않다 [참조: Carvalho, et al. (1988)J.Lab Clin. Med., 112:270-277].
본 발명의 단백질은 또한 칼리크레인의 신규한 사람 쿠니츠 타입 억제물질이며, 인자 XII의 활성물질이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은, 패혈증성쇽, 성인성호흡곤란증후군(ARDS), 자간전증, 다발성 기관부전증 및 파종성혈관내응고병증과 같은 전신성 염증 반응의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위한 방법을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 펩티드의 치료학적 또는 예방학적 투여는 이러한 염증 질환을 변조시켜 환자에게는 이로울 것이다.
플라스민은 세포외 매트릭스 분해 및 매트릭스-메탈로 프로테아제(MMP) 캐스캐이드의 활성화에서 중요한 역할을 한다. 공동적으로 이들 프로테아제는 혈관형성/혈관신생 중의 상피세포와 전이 중의 암세포의 이동 및 이들 세포에 의한 조직 침입을 매개한다. 혈관신생은 종양 성장을 지속시키기 위해 필수적이며, 전이는 종양의 확산을 매개하고 극히 부족한 환자 예후와 관련되어 있는 과정이다.
일부의 전임상실험은 아프로티닌과 유사한 프로테아제 특이성을 지닌 쿠니츠 유사 세린 프로테아제 저해제가 암에 대한 약제로서 유용하다는 것을 암시한다.예를 들어, 아프로티닌이 고도로 침입성인 섬유성 육종을 갖는 햄스터 또는 유사하게 악성인 유방암을 갖는 마우스에 투여되는 경우, 종양 성장 및 침입이 감소되고, 종양 괴사가 증가된다 [참고문헌: Latner et al., (1974), Br. J. Cancer 30:60-67; Latner and Turner, (1976), Br.J.Cancer 33:535-538]. 또한, 루이스 폐암 세포로 후접종한지 1 내지 14일째에 C57B1/6 Cr 수컷 마우스에게 200,000 KIU의 아프로티닌을 복막내로 투여한 경우, 1차 종양 덩어리에 대한 효과는 없었지만 폐 전이가 50% 감소되었다 [참고문헌: Giraldi et al., (1977) Eur.J.Cancer, 13:1321-1323]. 유사하게, 루이스 종양 세포로 후접종한지 13 내지 16일 각각에 C57B1/6J 마우스에게 10,000 KIU의 아프로티닌을 복막내로 투여한 경우, 1차 종양 성장에 대한 효과 없이 폐 전이가 90% 감소되었다 [참고문헌: Uetsuji et al., (1992), Jpn. J.Surg. 22: 429-442]. 이러한 동일한 실험에서, 플라스민 또는 칼리크레인을 동일한 투여 계획으로 투여하는 것이 폐 전이의 수를 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 결과는 아프로티닌을 암환자에게 수술기주위에 투여하는 것이 전이의 가능성을 경감시킬 수 있음을 암시하게 하였다. 블랙과 스테거[Black and Steger, 1976, Eur.J.Pharmacol., 38:313-319]는 아프로티닌이 쥐에서 이식된 설치류 머피-스트럼(Murphy-Strum) 림프육종의 성장을 저해한다는 것을 발견하였다. 3-메틸콜란트렌 처리로부터 생성된 단일의 오토크토노스(autochtonous) 판상 세포 암종을 각각 지닌 암컷 ddY 마우스에 10,000 KIU의 아프로티닌을 7주 동안 1일 2회 복막내 주입한 경우에, 1차 종양의 성장 속도는 90% 감소되었다. 일부의 동물에서, 종양 퇴행이 관찰되었다. 비히클 처리된 모든 동물은 7주 내에 치사된 반면에, 아프로티닌 처리된 모든 그룹은 생존하였다. 감소된 종양 성장은 각질증식증과 관련이 있었다 [참고문헌: Ohkoshi, Gann (1980), 71:246-250].
임상적으로, 아프로티닌을 정맥 주사한 26명의 환자로 구성된 수술 치료 그룹은 종양의 재발 없이 수술후 2년째에 70%가 생존한 반면에, 동시에 26명의 환자로 구성된 위약 그룹은 유의 정도의 종양 재발생률을 보이면서 38%만이 생존하였다 [참고문헌: Freeman et al. Br. Soc. Gastroenterol. (1980) supplement A: 902]. 사례 실험[참고문헌: Guthrie et al., Br. J.Clin.Pract (1981) 35:330-332]에 있어서, 진척된 경부암을 갖는 환자에게 브로모크립틴 + 아프로티닌을 투여했을 때, 완화가 유도되었다. 아프로티닌은 1개월에 1회씩 전체 7일 동안 6시간 당 200,000 KIU의 속도로 아프로티닌이 연속 정맥 주입됨과 동시에 8시간째 마다 500,000 KIU로서 환괴의 형태로 복막내 투여되었다. 치료는 아프로티닌에 대한 알레르기 반응의 발달로 인해 4개월째의 말기에 종료되었다. 더욱 최근의 증거는 전이에 대한 이러한 아프로티닌의 효과에 대한 표적으로서의 플라스민의 역할을 추가로 명백히 나타내어 왔다.
이러한 결과에 대한 기전은 아프로티닌이 암세포계통의 침입성 잠재력을 차단한다는 사실에 관련될 수 있다 [참고문헌: Liu G., et al., Int J. Cancer (1995), 60: 501-506]. 또한, 본 발명의 단백질이 또한 플라스민 및 칼리크레인의 효능있는 저해제이기 때문에, 이들 단백질은 항암제로서의 사용이 예상된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 혈관신생을 제한함으로써 1차 종양 성장을 차단하고, 1차 종양 침입을 차단하고, 조직 침윤의 억제를 통한 전이를 차단시키는 데에 사용이 예상된다. 본 발명의 화합물은 종양에 국소적으로 투여되거나 전신적으로 투여될 수 있다. 치료의 바람직한 양식에 있어서, 본 발명의 단백질은 전이의 위험을 최소화시키기 위해 종양 디벌킹 동안에 수술기주위적으로 투여될 것이다. 이러한 섭생의 경우에, 본 발명의 화합물의 혈액 절약 특성은 보다 명확한 외과수술 분야 관점을 제공하는 데에 추가로 유리할 것이다. 투여의 또 다른 바람직한 양식은 MMP 저해제 또는 화학요법과의 조합성 치료일 것이다. 투여의 추가의 바람직한 양식은 종양 세포 또는 이들의 결합 지질, 및 혈관층 내에서 태반 비쿠닌의 선택적 발현을 달성시키도록 고안된, 국소적으로 투여되는 유전자 치료법으로서 일 것이다.
치료에 대해 표적화된 바람직한 유형의 암은 높은 전이 잠재력을 나타내는 유방, 결장, 폐, 전립선 및 난소 암종과 같은 혈관 의존성 고형 종양, 및 폐 전달을 통한 폐암, 간 전이로의 간 전달을 통한 결장 암종 또는 피하 전달을 통한 두부와 목 암종이나 흑색종과 같은 피부암과 같은 고농도의 단백질의 국소적 전달이 가능한 혈관 의존성 고형 종양일 것이다. 본 발명의 단백질이 사람 기원을 갖기 때문에, 재사용되는 경우, 구트리에 등[Guthrie et al., 상기 참조]에 의해 관찰된 종류의 알레르기 또는 과민증 반응과는 덜 관련되어 있을 것이다.
추가로, 본 발명의 단백질은 응고의 고유 경로의 활성화와 관련된 혈전색전증 합병증을 감소시키는 데에 사용이 예상된다. 이러한 사용은 말기 암환자에서의 사망의 빈번한 원인인 폐 색전증의 방지를 포함할 것이다 [참고문헌: Donati MB., (1994), Haemostasis 24: 128-131].
뇌와 척수의 부종은 외상성 뇌 또는 척수 손상, 졸중, 대뇌 허혈, 대뇌와 지주막하 출혈, 수술(심장 절개 수술을 포함함), 뇌염 및 뇌막염과 같은 감염성 질병, 유육종과 같은 육아종 질병 및 병소 또는 산재성 암종에 기인하는 합병증이며, 고수준의 이병률 및 이러한 질병의 발생후의 사망률에 기여한다. 브라디키닌은 실험적으로 혈액뇌장벽을 파괴하는 것으로 알려져 있고[참고문헌: Greenwood J., (1991), Neuroradiology, 33:95-100; Whittle et al., (1992), Acta Neurochir., 115: 53-59], 브라디키닌의 내부 경동맥으로의 주입은 보통의 경동맥 폐색을 앓고있는 자발적으로 고혈압성인 래트(SHR)에서 뇌 부종을 유도하였다 [참고문헌: Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57:180-191]. 증가된 수준의 브라디키닌은 외상을 입은 래트 척수를 포함하는 모델[참고문헌: Xu et al., (1991), J.Neurochem, 57:975-980], 및 대뇌 허혈에 기인하는 뇌 부종을 갖는 래트로부터의 원형질 및 조직[참고문헌: Kamiya et al., (1993), Stroke, 24: 571-575]에서의 외상 후에 세포외 체액에서 발견된다. 브라디키닌은 칼리크레인을 포함하는 혈청 프로테아제에 의해 고분자량 키니노겐으로부터 방출되고[참고문헌: Coleman (1984) J.Clin Invest., 73: 1249], 혈청 프로테아제 억제물질 아프로티닌은 SHR 래트[참고문헌: Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57: 180-191; Kamiya et al., (1993), Stroke, 24: 571-575] 및 뇌의 냉 병변을 앓는 토끼[참고문헌: Unterberg et al., (1986), J.Neurosurgery, 64: 269-276]에서의 대뇌허혈에 기인하는 뇌 부종의 크기를 폐색하는 것으로 발견되었다.
이러한 결과는 뇌 부종이 고분자량 키니노겐으로부터 브라디키닌과 같은 키닌의 국소적 단백분해성 방출 후의, 혈액뇌장벽 투과성의 브라디키닌 유도된 증가로 인해 생성된다는 것을 나타낸다. 따라서, 태반 비쿠닌 및 이것의 단편은 이러한 질환에 대해 위험한 상태에 있는 환자, 특히 사망 또는 뇌 손상의 위험성이 높은 환자에서의 부종의 방지를 위한 약제로서의 사용이 예상된다. 이러한 사용은 두부 및 척수 환자, 폴리트라우마(polytrauma) 환자, 뇌 또는 척수 수술 및 심장 절개 수술을 포함하는 이들과 결합된 혈관 또는 그 밖의 일반수술을 받은 환자, 졸중을 앓아왔던 환자, 대뇌 또는 지주막하 출혈, 뇌의 감염성 질병, 뇌의 육아종 질병 또는 산재성이거나 병소 암종 및 뇌의 종양 또는 혈액뇌장벽의 파괴를 포함하는 다발성경화증과 같은 임의의 질환에 걸린 환자 또는 뇌 또는 척수의 그 밖의 염증성 돌기를 앓는 환자를 포함할 것이다. 태반 비쿠닌은 환자에게 정맥내 또는 두개내로 주입 또는 환괴 주사로서 투여될 것이다. 추가 용량의 태반 비쿠닌이 계속하여 1주 내지 3주에 걸쳐 간헐적으로 투여될 수 있다. 용량 수준은 혈장 수준 또는 혈청 프로테아제의 작용을 통해 형성된 비쿠닌 및 그 밖의 혈관작용성 펩티드의 상승을 중화하는 데에 필요한 용량 및 부종을 감소시키기에 충분한 용량을 초과하는 순환계 농도를 달성하도록 계획될 것이다. 본 발명의 단백질이 사람 기원을 갖기 때문에, 이러한 치료 동안에 반복 투여되도 단백질에 대한 면역 반응을 발달시키기 않을 것이다. 본 발명의 태반 비쿠닌 및 이것의 단편은 신경치료제 및 신경예방보호제와 같은 그 밖의 약제와 조합되어 사용되는 것 뿐만 아니라 단일치료법 또는 예방법에서의 사용이 예상될 수 있다.
최근의 증거[참고문헌: Dela Cadena R.A. et al., (1995), FASEB J. 9:446-452]는 접촉 활성화 경로가 관절염 및 빈혈증의 병인론에 기여할 수 있고, 칼리크레인 억제물질이 치료학적 잇점을 지닐 수 있음을 나타내어 왔다. 따라서, 본 발명의 프로테아제 억제물질은 이들의 사람 칼리크레인 억제능에 따라 인체 관절염 및 빈혈증의 치료를 위한 약제로서 예상된다.
아프로티닌으로 남성 비인슐린-의존성 당뇨병(NIDDM) 환자를 치료하면 전체 글루코오스 섭취가 현저하게 개선되었고, 인슐린의 대사적 제거 속도가 현저하게 감소되었다 [참고문헌: Lauenti et al., (1996), Diabetic Medicine 13: 642-645]. 따라서, 본 발명의 사람 단백질은 NIDDM의 치료를 위한 약제로서 장기간 사용이 예상된다.
조기분만의 위험이 있는 환자를 뇨 트립신 저해제로 2주 동안 매일 치료한 경우 재발성 자궁수축이 현저하게 감소되었다 [참고문헌: Kanayama et al., (1996), Eur J. Obstet. Gynecol. & Reprod. Biol. 67: 133-138]. 따라서, 본 발명의 사람 단백질을 조기분만의 방지에 사용하는 것이 예상된다.
아프로티닌은 배양액 중에서 마우스 근원세포의 분화를 자극하는 것으로 밝혀졌고[참고문헌: Well and Strickland, Development, (1994), 120: 3639-3647], 이러한 과정은 TGFb에 의해 억제된다. TGFb는 제한된 단백분해에 의해 활성화되는 불활성 폴리펩티드 전구체로서 존재한다. 아프로티닌 작용의 기전은 TGFb 전구체를 성숙한 활성 형태로 만드는 프로테아제의 억제를 포함하는 것으로 제안되어 왔다. TGFb는 다양한 섬유증 병변에서 상향 조절되는 것으로 나타나 왔고, 오랫 동안 항-섬유증 치료에 대한 잠재적인 표적으로 생각되고 있다. 예를 들어, 폐 섬유증의 래트 모델의 경우, TGF-b 농도는 블레오마이신 유도된 염증의 크기와 유사하였다. 또한, 폐포 대식구의 플라스민 수준은 성숙한 TGF-b 수준과 일치하였고, 플라스민 저해제인 a-2-안티플라스민의 첨가는 대식구에 의한 TGFb 전구체의 후기 번역 활성화를 차단하였다 [참고문헌: Khal et al., (1996), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 252-259]. 데이터는 플라스민이 폐포 대식구에 의한 활성 TGFb의 형성에 기여하고, 이 과정이 블레오마이신 유도된 폐 염증에서 병리학적 역할을 한다는 것을 암시한다.
이러한 결과에 비추어 볼때, 태반 비쿠닌 및 이것의 단편은 폐, 간, 신장 및 피부(경피증) 섬유증을 포함하는 다양한 섬유증 질환에 대한 치료제로서 예상된다.
에어로솔화된 아프로티닌은 인플루엔자 바이러스 또는 파라믹소바이러스의 치사량으로 감염된 마우스의 50%를 초과하여 방어하는 것으로 나타났다 [참고문헌: Ovcharenko and Zhirnov, Antiviral Research, (1994), 23: 107-118]. 태아 출혈성 기관지폐렴의 발달의 억제 및 체중 증가의 정상화가 또한 에어로솔화된 아프로티닌 치료에서 인식되었다. 이러한 결과에 비추어 볼때, 태반 비쿠닌 및 이것의 단편은 다양한 호흡 관련된 인플루엔자-유사 질병에 대한 치료제로서 예상된다.
본 발명의 사람 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 및 그 밖의 변형체는 천연 아프로티닌 또는 그 밖의 저해 프로필을 지닌 아프로티닌 유사체에 대해 암시된 의료/치료 분야, 특히 대용량의 사용이 필요한 분야에서의 사용이 예상된다. 이러한 분야에는 사람 단백질의 사용이 트립신, 플라스민, 칼리크레인, 엘라스타아제, 카텝신 G 및 프로테이나아제-3와 같은 사람 세린 프로테아제를 저해하는 기능에 의해나타난 하기와 같은 질병이 있을 것이나 이에 제한되지는 않는다: 급성 췌장염(췌장 엘라스타아제 및 트립신), 염증, 혈소판감소증, 혈소판 기능 보존, 기관 보존, 창상 치료, 쇼크폐, 내독소 쇼크과 같은 다양한 형태의 쇼크, 및 수술후 합병증; 과섬유소용해성 출혈과 같은 혈액 응고 장애; 급성 및 만성 염증성 반응(특히, 예를 들어, 췌장염 및 방사선 유도된 장염과 같은 기관 병변의 치료 및 예방을 위한), 면역혈관염, 사구체신염 및 관절염 타입과 같은 복합체 매개된 염증성 반응; 특히 류마티스성 관절염에서의 교원질증; 대사 관련된 침착(예를 들어, 통풍)에 의해 유발된 관절염 타입; 동맥경화증(혈청 엘라스타아제) 또는 폐기종(호중구 엘라스타아제)에서와 같은 기관의 연결조직부의 탄성 요소의 퇴화; 성인성호흡곤란증후군, 염증성 장 질환, 및 건선.
주요한 예상밖의 결과는 비쿠닌(7-64) 및 비쿠닌(102-159)를 엔코딩하는 합성 펩티드가 활성 프로테아제 저해제 생활성을 갖는 정확한 3차원 구조로 적절하게 폴딩될 수 있다는 것이다 (각각 실시예 2 및 1). 폴딩되는 경우, 비쿠닌의 각각의 이들 단편은 각각의 단편의 6개 시스테인 잔기 사이의 3개의 사슬간 이황화물 결합인 6 덩어리 단위로 덩어리가 감소된다(각각의 경우에서의 생성과 일치함). 다른 놀라운 결과는 비쿠닌(7-64), 비쿠닌(102-159), 및 비쿠닌(1-170)을 엔코딩하는 합성 펩티드가 플라스민 및 조직과 혈장 칼리크레인 둘 모두를 고도로 저해한다는 것이다 (각각 실시예 4, 3 및 10). 트라실롤??에 의한 플라스민 및 칼리크레인의 억제는 트라실롤??이 심장 절개 수술 동안에 혈액 손실을 감소시키는 기전과 관련이있는 것으로 생각된다. 본 발명의 쿠니츠 도메인의 특이성의 예상밖의 발견은, 이러한 도메인을 현저하게 혈액이 손실되는 수술 또는 외상 동안에 혈액을 절약하기 위해 적당한 치료제, 또는 플라스민 및/또는 칼리크레인의 억제가 유리한 임의의 그 밖의 질환을 위한 적당한 치료제로 만든다.
또한, 본 발명자는 본 명세서에서(실시예 10) 태반 비쿠닌(1-170)이 인자 XIa의 효능있는 저해제이고, 인자 Xa의 중간정도의 저해제임을 밝혀내었다. 인자 XIa는 응고의 고유 경로에서 필수적인 역할을 하는데, 불활성 인자 IX를 활성 인자 IXa로 상호전환시킨다. 따라서, 태반 비쿠닌은 고유 경로의 2가지 중요한 효소인 칼리크레인 및 인자 XIa를 저해시킨다. 이러한 결과와 일관되게, 본 발명자는 또한 태반 비쿠닌(1-170)이 고유 경로에 의해 유도된 응고 속도의 척도인 활성화된 부분적 트로보플라스틴시간의 효능있는 저해제임을 밝혀내었다. 한편, 본 발명자는 태반 비쿠닌(1-170)이 조직 인자 VIIa 복합체의 극도로 약한 저해제임을 밝혀내었는데, 이는 조직 인자 VIIa가 외인성 응고 캐스캐이드의 조절에서 중요한 물질이 아님을 암시한다. 이러한 예상밖의 결과를 기초로 하여, 태반 비쿠닌은 응고의 고유 경로의 활성화가 질병 기전에 현저하게 기여하는 질병에 대한 약제로서의 사용이 예상된다. 이러한 질병의 예로는 외상후 쇼크 및 산재성 혈관내 응고가 있을 것이다.
본 발명의 쿠니츠 도메인의 현저한 잇점은 이들 도메인이 사람 단백질이고, 또한 트라실롤??보다 덜 양하전되어 있어서(실시예 1), 단백질의 고용량 투여시 신장 손상의 위험을 감소시킨다는 것이다. 본 발명의 단백질은 사람 기원을 갖기 때문에 유사한 용량의 트라실롤의 투여와 비교해 볼때 소망하지 않은 면역학적 반응의 위험이 현저히 감소된 상태로 사람 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 비쿠닌(102-159), 비쿠닌(7-64) 및 비쿠닌(1-170)이 체외에서 트라실롤 보다 혈장 칼리크레인의 더욱 효능있는 저해제임이 밝혀졌다(실시예 3, 4 및 10). 따라서, 비쿠닌 및 이것의 단편은 환자에서의 저하된 혈액 손실의 점에서 체내에서 더욱 효과적인 것으로 예측된다.
투여된 세린 프로테아제 저해제의 양은 상기한 정상 혈장 수준을 제공하기에 충분해야 한다. 관상대동맥 바이패스 수술(CABG) 동안 및 CABG 후의 출혈의 예방학적 감소를 위하여, 효능의 차이를 고려해 볼때 본 발명의 단백질은 트라실롤??대신 사용될 수 있다. 트라실롤??의 용도는, 트라실롤??부록 A에 대해 기재하고 있는 피지션스 데스크 레퍼런스(Physicians Desk Reference) (1995)에 약술되어 있다. 간략하게, 반듯이 누운 환자의 경우, 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체의 부하 용량이 마취 유도후 흉골절개전에 약 20 내지 30분에 걸쳐 서서히 투여된다. 일반적으로, 환자 체중 및 수술의 길이에 따라, 약 2x106KIU(칼리크레인 억제 단위) 에서 8x106KIU 사이의 전체 용량이 사용될 것이다. 바람직한 부하 용량은 전체 1 내지 2백만 칼리크레인 억제 단위(KIU)를 함유하는 용량이다. 부하 용량이 완결된 경우, 일정한 주입 용량이 계속 사용되며, 이는 수술이 완결되어 환자가 수술실을 나갈 때까지 계속된다. 바람직한 일정한 주입 용량은 시간 당 약 250,000 내지 500,000 KIU 이다. 펌프 초회량은, 심폐 바이패스의 설치 전에 초회 유체의 분액을 대체함으로써 심폐 바이패스 회로의 초회 유체에 첨가된다. 바람직한 펌프 초회량은 전체 약 1 내지 2백만 KIU를 함유하는 용량이다.
본 발명의 단백질은 당업 분야에 공지된 방식으로 제형화되는 약제학적 조성물에서 사용된다. 이러한 조성물은 투여 방식 및 예상되는 용량에 따라, 활성 성분(들) 이외에 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 필터, 결합제 및 그 밖의 부형제를 함유한다. 당업 분야의 숙련자에게 공지된 치료학적으로 불활성인 무기 또는 유기 담체의 예로는 락토오스, 옥수수 전분 또는 이것의 유도체, 탈컴, 식물성 오일, 왁스, 지방, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올, 수분, 자당, 알코올, 글리세린 등이 있다. 제형의 안정화를 보조하거나 활성 성분(들)의 생체유효성을 증가시키거나, 경구 투여의 경우 수용할 수 있는 풍미 또는 향기를 갖는 제형을 수득하기 위한 필요에 따라, 다양한 방부제, 에멀션화제, 분산제, 풍미제, 습윤제, 산화방지제, 감미제, 착색제, 안정제, 염, 완충제 등이 또한 첨가될 수 있다. 이러한 조성물에서 사용되는 저해제는 본래 화합물 그 자체의 형태일 수 있거나, 임의로 약제학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 본 발명의 단백질은 단독으로 또는 다양한 조합물로, 및 그 밖의 치료 조성물과 조합된 형태로 투여될 수 있다. 이렇게 제형화된 조성물은 당업자에게 공지된 적당한 방식에 의한 저해제의 투여에 대한 필요에 따라 선택된다.
비경구적인 투여 방식은 정맥내(i.v.), 피하(s.c.), 복막내(i.p.), 및근내(i.m.) 경로를 포함한다. 정맥내 투여는 필요에 따라 약제의 피크 혈장 농도의 예리한 조절을 수득하기 위해 이용될 수 있다. 다른 방법으로, 약제는 정맥내 카테테르에 의해 소망하는 속도로 연속 투여될 수 있다. 적당한 비히클로는 주사용 멸균수, 멸균-완충된 용액 또는 멸균 식염과 같은 멸균한 비-발열성 수성 희석제가 있다. 생성되는 조성물은 정맥 주사 또는 주입에 의해 수술전 및/또는 수술 동안에 환자에게 투여된다.
염증과 관련된 호중구 및 대식구와 같은 식포에 대한 약제의 개선된 반감기 및 표적화는 리포솜 중에 약제를 포획시킴으로써 보완될 수 있다. 위장관 및 폐와 같은 기관/조직을 표적화시키는데 특이적인 거대분자와 결합하는 리간드를 리포솜의 외부에 혼입시킴으로써, 리포솜 표적화의 선택도를 개선시킬 수 있어야 한다. 다른 방법으로, 약제를 분해성 미소구체(예를 들어, 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드) 또는 콜라겐을 함유하는 보호 제형 내로 캡슐화시키거나 캡슐화시킴이 없이, 근내 또는 피하 침착 주사가 장기적으로 지속되는 약제 방출을 수득하기 위하여 사용될 수 있다. 용량형의 개선된 편의를 위하여, 퍼큐실(percuseal) 시스템과 같은 복막내로 이식된 저장기 및 격막을 사용할 수 있다. 개선된 편의 및 환자 순응은 또한 주사기 펜(예를 들어, Novo Pin 또는 Q-pen) 또는 니들이 없는 제트 주사기(예를 들어, Bioject, Mediject 또는 Becton Dickinson)를 사용함으로써 달성될 수 있다. 정밀하게 조절되는 방출은 또한 캐뉼러를 통해 소망하는 부위에 전달시키는 이식성 펌프를 사용하여 달성될 수 있다. 예로는 ALZET 삼투 펌프와 같은 ALZA로부터 구입가능한 피하 이식되는 삼투 펌프가 있다.
비측 전달은, 인지질 또는 아실카르니틴과 같은 적당한 흡수 인핸서과 함께 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 폴리카르보필을 포함하는 담체와 같은 생체부
착성 미립자 담체(200 mm 미만) 내로 약제를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 시판되는 시스템으로는 댄 바이오시스(Dan Biosys)와 시오스 노바(Scios Nova)에 의해 개발된 시스템이 있다.
폐 전달은 순환계로의 약제의 비경구적 투여 방식을 나타낸다. 하부 기도 상피는 분자 크기가 약 20kDa 이하인 광범위한 단백질에 대해 고도로 투과성이다. 만니톨, 수크로오스 또는 락토오스와 같은 적당한 담체 중에 약제를 함유하는 미크론 크기의 건조 분말은, 인헤일[상표명: Inhale], 듀라[상표명: Dura], 피손스(Fisons)[SpinhalerTM], 및 글락소(Glaxo)[RotahalerTM], 또는 아스트라(Astra)[TurbohalerTM] 추진체를 기초로 계량되는 용량 흡입기와 같은 건조 분말 흡입기를 사용함으로써 말단 폐포 표면에 전달될 수 있다. 리포솜이 있거나 없는 용액 제형은 초음파 분무기를 사용하여 전달될 수 있다.
경구적 전달은 약제를 정제, 피복된 정제, 당의정, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 에멀션, 현탁액 또는 약제를 소화성 프로테아제 활성이 낮은 결장 내로 방출시키도록 고안된 장 피복된 캡슐 내로 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 후자의 예로는 ALZA의 OROS-CT/오스맷[상표명: Osmet], 및 스케러 드러그 딜리버리 시스템(Scherer Drug Delivery Systems)의 펄신캡[상표명: PULSINCAP]이 있다. 그 밖의 시스템은, 결장 특이성 세균 아조환원효소에 의해 분해되는 아조-교차결합된중합체, 또는 결장 내의 pH 상승에 의해 활성화되는 pH 민감성 폴리아크릴레이트 중합체를 사용한다. 상기 시스템은 광범위한 이용가능한 흡수 인핸서와 함께 사용될 수 있다. 직장 전달은 약제를 좌약에 혼입시킴으로써 달성될 수 있다.
바람직한 의료 적용에 있어서, 수술기주위의 혈액 손실의 감소를 위하여, 본 발명의 태반 비쿠닌 변형체의 바람직한 투여 방식은 비경구적으로, 바람직하게는 중심선을 통한 정맥내 경로에 의한다.
사용하려는 약제학적 조성물의 양은 치료하려는 환자 및 질환에 좌우될 것이다. 필요한 양은 당업 분야의 숙련자에게 공지된 프로토콜에 의해 과도한 실험 없이 결정될 수 있다. 다른 방법으로, 필요한 양은 질환을 치료하기 위해 억제되어야 할 플라스민 또는 칼리크레인과 같은 표적 프로테아제의 양의 결정을 기초로 하여 계산될 수 있다. 본 발명에서 사용하고자 하는 활성 물질이 비독성인 것으로 간주되기 때문에, 치료는 바람직하게는 최적 필요량의 활성제를 초과하는 투여를 포함한다.
추가로, 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체는, 친화성을 기초로 한 분리 방법을 이용하여 사람 물질로부터 이것의 동족 프로테아제와 같은 천연 물질을 분리시키고, 또한 태반 비쿠닌의 조직 분포 및 유용한 기능을 조사하는 데에 추가로 이용될 수 있는 프로테아제에 대한 항체를 유도시키기 위해 사용될 수 있다.
사람 서열 데이터의 조사
기능면에서 아프로티닌과 동종인 독특한 사람 단백질의 존재는 NCBI(National Center for Biological Information, Maryland)에 있는 발현된-서열-태그 데이터-베이스(이하, dbEST라 명명함)에 대해 서열 목록의 특유한 분석을 수행한 후에 추론되었다. TBlastN 알고리즘(BLAST, 또는 Basic Local Alignment Search Tool은 알츠출 등[Altschul et al., (1990) J.Mol Biol 215:403-410]의 방법을 이용하여 데이터베이스 내의 질문 서열 및 모든 서열(임의의 조합된 형태의 단백질 또는 핵산) 사이의 유사성을 조사함)을 이용하여, 데이터베이스는 소 프리-프로=아프로티닌인 트라실롤의 서열과 상동성을 갖는 누클레오티드 서열에 대해 조사되었다. 이러한 다수의 클론의 조사는, 기능면에서 아프로티닌과 동종인 사람 단백질에 상응하는 추론된 아미노산 서열을 가능하게 엔코딩할 수 있는 2개의 특수한 클론으로 선택적으로 좁혀졌다. 선택된 핵산 서열은 사람 태반 핵산 라이브러리로부터 생성된 R35464(서열번호 12) 및 R74593(서열번호 14) 이었다. R35464에 대한 최장 오픈 리딩 프레임에서 번역된 단백질 서열(서열번호 13)은 쿠니츠 도메인 공유결합 구조의 형성에 중요한 6개의 시스테인 중의 하나가 없었으며, 이는 R35464의 핵산 서열이 작용성 저해제를 생성할 수 없음을 의미한다. 유사하게, 클론 R74593으로부터의 최장 번역된 오픈 리딩 프레임(서열번호 15)에는 쿠니츠 유사 서열을 엔코딩하는 영역에 대해 정지 코돈 5´이 함유되어 있었는데, 이는 이러한 서열이 작용성 분비된 쿠니츠 도메인을 생성시키기 위해 번역될 수 없음을 의미한다. 이들 서열 단독으로는 중요성이 불명확했다. 이들 서열은 a) 가유전자의 생성물, b) 번역되지 않은 mRNA의 영역, 또는 c) 부정확하게 서열화된 생존가능한 mRNA의 생성물을 나타낼 수 있었다.
사람 비쿠닌의 발견
실제의 사람 서열을 특이적으로 단리시키고 결정하기 위하여, R35464 및 R74593에서 발견되는 본 발명자가 제안한 쿠니츠 유사 서열을 엔코딩하는 cDNA의 절편쪽으로 5´ 및 3´에 위치한 서열과 하이브리드를 형성할 수 있는 cDNA 프라이머가 고안되었다. R74593의 쿠니츠 유사 서열을 엔코딩하는 단편을 증폭시키는데 사용된 프라이머는 하기와 같다:
CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG(HindIII 부위를 갖는 3´프라이머; 서열번호 33) 및
AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA(XbaI 부위를 갖는 5´프라이머; 서열번호 34).
이들 프라이머는 PCR(30 사이클)에 의해 클론테크(Clontech, MATCHMAKER, Cat #HL4003AB, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA)로부터의 사람 태반 cDNA 라이브러리로부터의 500 염기쌍을 증폭시키기 위해 사용되었고, 이러한 염기쌍은 Bluescript-SK+ 내로 서브클로닝되고 시쿼나아제[상표명: Sequenase] 키트 버전 2.0에서 T3 프라이머에 의해 서열화되었다. 놀랍게도, 본 발명의 프라이머를 사용하여 수득된 단편의 서열은 클론 R74593에 대한 dbEST 데이터베이스에 기록된 서열과 상이하였다. 특히, 본 발명의 신규한 서열은 추정 정지 코돈쪽으로 3´에 삽입되지만, 쿠니츠 유사 서열을 엔코딩하는 절편쪽으로 5´에 삽입되는 추가의 구아노신 염기을 함유하였다 (도 3). 추가의 G의 삽입은 쿠니츠 유사 도메인에 대한 리딩 프레임 중의 정지 코돈을 시프트시켰다 (R74593에 대해 교정된 서열의 염기쌍 114에 있는G; 도 3).
R74593의 쿠니츠 유사 펩티드 서열과 상동인 서열에 대한 dbEST의 후속 연구로 사람 망막 라이브러리 및 N39798에서 유래된 H94519가 생성되었다. 이들 서열은 특성 시스테인을 6개 모두 함유하는 것을 제외하고는 R35464에서 엔코딩된 쿠니츠 유사 도메인과 거의 동일한 쿠니츠 유사 서열을 함유하였다. R74593(염기쌍 114에 있는 G의 삽입에 의해 교정된) 및 R35464의 누클레오티드와 각각의 누클레오티드 서열과의 오버레이는 부분적인 사람 태반 비쿠닌에 대한 컨센서스 누클레오티드 서열(서열번호 9; 도 3)을 수득하기 위해 사용되었다. 번역된 컨센서스 서열은 잔기 -18에서 +179로 신장하는 오픈 리딩 프레임(도 3; 온전한 번역 서열번호 10)을 생성시키며, 이러한 오픈 리딩 프레임은 각각 아미노산 잔기 17번 내지 64번 및 102번 내지 159번 내에 2개의 완전한 쿠니츠 유사 도메인 서열을 함유하였다.
R35464의 서열로 dbEST를 연구함으로써 추가의 5´서열을 수득하기 위한 추가의 시도가 있었다. 추가의 5´서열을 갖는 이러한 조사로부터의 가능한 매치가 dbEST를 재연구하기 위해 사용된다. 이러한 반복적 방식으로, 클론 H16866, T66058, R34808, R87894, N40851 및 N39876을 포함하는, 일련의 오버랩핑 5´ 서열이 확인되었다 (도 4). 이러한 서열 중의 일부의 정렬은 컨센서스 번역된 단백질 서열의 합성을 위한 개시 부위로서 작용할 수 있는 5´ATG의 존재를 암시한다. 이러한 선택된 정보로부터, 아프로티닌과 동종 기능을 갖는 사람 단백질의 핵산 및 폴리펩티드 서열을 선택적으로 스크리닝하고, 결정할 수 있다.
dbEST의 재연구는 도 4B에 개략적으로 도시된 다수의 신규한 EST 목록을 밝혀내었다. 이러한 추가의 EST에 의한 오버랩은 도 3에 도시된 본래 올리고누클레오티드 서열을 지나서 5´및 3´둘 모두로 신장하는 훨씬 긴 컨센서스 올리고누클레오티드 서열(도 4C)의 구성을 가능하게 한다. 실제로, 전체 길이가 1.6kb인 신규한 서열은 항상 3´폴리-A 테일쪽으로 신장하였다. 서열을 따라 각각의 염기쌍 위치에서의 오버랩핑하는 EST의 증가된 수는 EST R74593의 3´말단과 오버랩핑하는 서열과 같은 특정한 영역에서의 신뢰 수준을 향상시킨다 (도 3). 이러한 영역에서의 일부의 오버랩핑 EST는 R74593에 대한 2개의 중요한 염기 결실을 확증한다(도 4C에 진하게 밑줄그어진 곳에 위치함, 맵 위치 994 및 1005). 프레임을 엔코딩하는 비쿠닌에서의 신규한 컨센서스 서열(도 4D)이 번역되면 본래 컨센서스(서열번호 1)로부터 코드화된 성숙한 서열(179개 아미노산) 보다 크고(248개 아미노산), 올리고누클레오티드 컨센서스 내의 프레임내 정지 코돈에 의해 종결되는, 태반 비쿠닌의 형태가 수득된다. 크기 증가는 EST R74593에 대해 특유한 2개의 염기 삽입의 제거로부터 생성되는 3´코딩 영역에서의 프레임 시프트에 기인한다. 프레임 시프트는 전사번역통과가 가능한 프레임 중의 본래 단백질 컨센서스(도 3)의 정지 코돈을 추가의 아미노산 서열을 코드화하는 신규한 프레임으로 이동시킨다. 신규한 번역 생성물(도 4D)은 잔기 +1 내지 +175 사이의 본래 컨센서스 서열(서열번호 1)(쿠니츠 도메인을 엔코딩함)과 동일하지만, 추정 24 잔기 길이의 트랜스멤브레인 도메인(도 4D에 밑줄그어져 있음)과 이어서 짧은 31 잔기 세포질 도메인을 나타내는 신규한 C-말단 신장을 함유한다. 개시물질 메티오닌 및 신호 펩티드 주위의 정확한 서열은 이러한 영역에서의 오버랩핑 EST 중의 상당한 불균일로 인해 약간 불확실하다.
진웍스[상표명: Geneworks]에 의한 단백질 서열의 분석은 추정 N-결합된 글리코실화에 대한 컨센서스 부위로서 위치 30 및 67에 있는 아스파라긴 잔기를 강조한다. 아스파라긴 30은 사람 태반으로부터 단리된 전장 단백질의 N-말단 서열화 동안에 관찰되지 않았으며, 이는 이것이 글리코실화된 것과 일치한다.
사람 비쿠닌의 클로닝
도 3의 분석으로부터 추정된 추정 사람 비쿠닌 누클레오티드 서열과 상응하는 사람 mRNA의 존재는 다음과 같이 확인되었다. R35464(도 3에서의 컨센서스 누클레오티드의 염기쌍 3-27)의 쿠니츠-엔코딩 cDNA 서열에 대해 5´과 하이브리드를 형성하는 핵산 프라이머:
(XbaI 부위를 갖는 R35464로부터 유도된 5´프라이머; 서열번호 35), 및 R74593(도 3에서의 컨센서스 누클레오티드 서열의 염기쌍 680-700)의 쿠니츠 엔코딩 서열에 대해 3´과 하이브리드를 형성하는 핵산 프라이머가 클론테크 사람 태반 라이브러리로부터, 도 3의 태반 비쿠닌 서열을 엔코딩하는 cDNA 컨센서스 누클레오티드 서열로부터 예측되는 단편(크기는 약 670 염기쌍임)을 PCR 증폭시키기 위해 사용된다 (도 4A에 개략적으로 도시되어 있음).
상기 논의된 추정 ATG 개시 부위에 대한 5´에서의 126 염기쌍인 R87894 중의 서열과 하이브리드를 형성하는 5´프라이머 및 상기에 사용된 바와 같은 R74593에 대한 동일한 3´프라이머를 사용하는 경우, EST 오버레이(도 4에 개략적으로 도시되어 있음)에 의해 예측된 예상 크기(약 872 염기쌍)의 클론테크 사람 태반 라이브러리로부터의 단편을 증폭시킬 수 있다.
872 염기쌍 단편의 서열화는 이러한 단편이 이것의 5´말단에 EST R87894의 염기쌍 110 내지 218에 상응하는 누클레오티드 절편을 함유하고, 3´말단에 EST 오버레이 분석(도 3의)으로부터 추정되는 태반 비쿠닌에 대한 컨센서스 서열의 염기쌍 310 내지 542를 함유함을 나타내었다.
단백질의 전체 세포외 영역을 엔코딩하는 cDNA를 수득하기 위하여, EST R34808 내의 서열과 하이브리드를 형성하도록 고안된 하기의 5´PCR 프라이머가 사람 태반 cDNA 라이브러리로부터의 약 780 염기쌍 cDNA 생성물을 증폭(30 사이클)시키기 위한 EST 74593에 대한 동일한 3´프라이머와 함께 사용되었다:
이러한 생성물은 겔 정제되고, 하기의 프라이머를 사용하는 디데옥시법[참고문헌: Sanger F. et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 74: 5463-5467]에 의한 DNA 서열화를 위해 TA 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝된다:
벡터 특이성:
유전자 특이성:
생성되는 cDNA 서열은 이것의 번역 생성물과 함께 도 4E에 도시되어 있다. 누클레오티드 수준에서, 서열은 컨센서스 EST 서열과 단지 미미한 차이를 나타내었다(도 4D). 서열이 번역되면 프레임내 개시물질 ATG 부위, 신호 펩티드 및 성숙한 태반 비쿠닌 서열 및 트랜스멤브레인 도메인을 함유하는 코딩 서열이 생성되었다. PCR 생성물의 번역된 서열은 PCR 증폭에 대한 3´프라이머의 선택의 결과로써 세포질 도메인으로부터의 12개 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 있었다. 3´PCR 프라이머의 이러한 선택(R74593의 서열을 기초로 하여 고안됨)은 또한 인위구조적 S를 번역된 PCR 유도된 서열의 아미노산 위치 211에 있는 F 돌연변이로의 도입의 원인이 되었다. PCR 단편의 번역으로부터 추론된 신호 펩티드는 EST 컨센서스의 신호 펩티드와 약간 상이하였다.
전장 태반 비쿠닌 cDNA를 수득하기 위하여, PCR 유도된 생성물(도 4E)을 겔 정제시키고, 비쿠닌 서열을 나타내는 비-PCR 기본 온길이 클론을 단리시키기 위해 사용되었다. PCR 유도된 cDNA 서열을 하이 프라임(High Prime, Boehringer Mannheim)으로32P-CTP로 표지화시키고, 콜로니 하이브리드형성 기술을 이용하여 태반 cDNA 라이브러리(Stratagene, UnizapTMλ 라이브러리)를 프로빙하는데 사용했다. 약 2 X 106개의 파지 플라크가 3라운드의 스크리닝 및 플라크 정제를 받았다. 2개의 클론이, 제한 효소 분석에 의해 및 EST 컨센서스 서열의 크기와의 비교를 기초로 하여 측정한 바와 같이, 전장(1.5 kb 이하)인 것으로 간주되었다 (상기 참조). 디데옥시법으로 이들 클론 중의 하나가 서열화시켜 도 4F에 도시된 올리고누클레오티드서열이 수득하였다. 이러한 서열의 번역 생성물은 프레임내 개시물질인 메티오닌, 신호 펩티드 및 성숙한 태반 비쿠닌 서열을 갖는 단백질을 생성시켰다. 성숙한 태반 비쿠닌 서열은 신호 펩티드 서열 길이 및 서열이 상이하지만 EST 컨센서스의 번역에 의해 유도된 성숙한 단백질의 서열과 동일하였다. PCR 유도된 생성물과는 다르게, 콜로니 하이브리드형성에 의해 유도된 cDNA는 전체 엑토도메인(ectodomain), 트랜스멤브레인 도메인, 세포질 도메인, 및 프레임내 정지 코돈을 함유하였다. 실제로, 클론은 항상 폴리-A 테일쪽으로 신장하였다. 개시물질 메티오닌 다음에는 PCR 유도된 클론에서 엔코딩된 신호 펩티드와 동일한 소수성 신호 펩티드가 위치하였다. 계속하여, 본 발명자는 Sf9 세포로부터 태반 비쿠닌(비쿠닌(1-170))의 용해성 단편을 발현 및 정제하였고(실시예 9), 이러한 단편이 작용성 프로테아제 저해제임을 밝혀내었다(실시예 10) 또한, 본 발명자는 사람 태반으로부터 활성 프로테아제 저해제인 태반 비쿠닌의 용해성 단편을 단리하였다(실시예 7). 천연 단백질 및 Sf9 세포에서 발현된 형태의 단백질은 모두, N-말단 서열화 동안에 PTH-아미노산의 회복을 기초로 하여 위치 30에 있는 아스파라긴 잔기에서 글리코실화되어 있을 것이다(실시예 7 및 9).
상기 결과를 기초로 하여, 전장 태반 비쿠닌은 용해성 단백질 뿐만 아니라 세포의 표면상의 트랜스멤브레인 단백질로서 존재하는 기능을 가지는 것으로 보인다. 쿠니츠 도메인을 함유하는 그 밖의 트랜스멤브레인 단백질은 단백분해 프로세싱을 거쳐 용해성 및 막 관련된 형태의 혼합물을 생성시키는 것으로 공지되어 있다. 이들 단백질로는 APP751[참고문헌: Esch F., et al., (1990) Science, 248: 1122-1124] 및 APP 770[참고문헌: Wang R., et al., (1991), J.Biol Chem, 266: 16960-16964]이라 명명되는 2가지 형태의 아밀로이드 전구체 단백질이 있다.
접촉 활성화는 응고 캐스캐이드의 성분에 손상된 혈관 표면이 노출됨으로써 활성화되는 과정이다. 혈관형성은 상피 표면에 있는 플라스민의 국소적 활성화를 포함하는 과정이다. 태반 비쿠닌의 특이성 및 세포 표면에 앵커링하는 이것의 추정 기능은 트랜스멤브레인 태반 비쿠닌의 생리학적 기능이 접촉 활성화 및 혈관형성의 조절을 포함할 수 있음을 암시한다.
태반 비쿠닌(7-64), 비쿠닌(102-159), 및 전장 태반 비쿠닌에 대한 아미노산 서열(도 4F)은, 제네틱스 컴퓨터 그룹 프로그램 TFastA(Genetics Computer Group program TFastA)를 사용하는 특허된 서열의 GeneSeq(버전 20.0) 단백질 데이터베이스 뿐만 아니라 PIR(버전 46.0) 및 PatchX(버전 46.0) 단백질 데이터베이스에 대하여 조사되었다. 제네틱스 컴퓨터 그룹 프로그램 TFastA[참고문헌: Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448]을 사용하여, 이러한 동일한 단백질은 특허된 서열의 GeneSeq(버전 20.0) 누클레오티드 데이터베이스 뿐만 아니라 GenBank(버전 92.0, 96년 1월 26일에 업데이트됨) 및 EMBL(변형된 버전 45.0) 누클레오티드 데이터베이스에 대하여 조사되었다. GenBank 및 EMBL의 EST 및 STS 서브셋은 이러한 조사 세트에 포함되지 않았다. 이들 조사로부터 나온 최상의 매치는 본 발명의 클론 R74593 및 R35464의 분석으로부터 유도된 58 아미노산 단백질 서열에 대한 이들의 온길이에 걸쳐 약 50%만이 동일한 서열을 함유하였다.
사람 비쿠닌의 단리
상기에 언급한 바와 같이, 비쿠닌에 대한 번역된 컨센서스 서열로부터 결정된 바와 같이(도 3) 비쿠닌(7-64) 및 비쿠닌(102-159)에 상응하는 합성 펩티드는리폴딩되어(각각, 실시예 2 및 1) 활성 칼리크레인 저해제 단백질을 생성시킬 수 있다(각각, 실시예 4 및 3). 본 발명자는 이러한 예상밖의 특성을 사람 조직으로부터의 천연 태반 비쿠닌을 단리시키기 위한 정제도를 고안하기 위하여 이용하였다.
제 1단계로서 칼리크레인-세파로오스 친화성 크로마토그래피를 사용하는 정제도를 이용하여, 고도로 정제된 천연의 효능있는 칼리크레인 저해제가 단리되었다. 이렇게 단리된 천연 사람 비쿠닌은 컨센서스 핵산 서열(도 3) 아미노산 잔기 +1 내지 +50의 번역에 의해 예측되는 서열과 동일한 N-말단(50개 아미노산 잔기에 대해 서열화됨)을 갖는다(실시예 7). 이에 의해 사람 태반으로부터 단리된 신규한 천연 칼리크레인 저해제의 존재가 최초로 확인되었다.
공지된 쿠니츠 유사 도메인은 하기와 같다. 표적 프로테아제와 접촉하는 것으로 여겨지는 잔기는 특별히 강조되어 있다(진하게/밑줄). 이러한 특수한 잔기는 하기에서 표지 Xaa에 의해 나타나는 바와 같이 특정 기준에 대한 위치 Xaa1-16로 명명된다:
상기 서열에서, 서열 1)은 비쿠닌(7-64)(서열번호 4)이고; 서열 2)는 비쿠닌(102-159)(서열번호 6)이고; 서열 3)은 조직 인자 경로 저해제 전구체 1(서열번호 18)이고; 서열 4)은 조직 인자 경로 저해제 전구체 1(서열번호 19)이고; 서열 5)는 조직 인자 경로 저해제 전구체(서열번호 20)이고; 서열 6)은 조직 인자 경로 저해제 전구체 2(서열 21)이고; 서열 7)은 조직 인자 경로 저해제 전구체 2(서열번호 22); 서열 8)은 아밀로이드 전구체 단백질 동족체(서열번호 23)이고; 서열 9)는 아프로티닌(서열번호 24)이고; 서열 10)은 인터-α-트립신 저해제 전구체(서열번호 25)이고; 서열 11)는 인터-α-트립신 저해제 전구체(서열번호 26)이고; 서열 12)는 아밀로이드 전구체 단백질(서열번호 27)이고; 서열 13)은 콜라겐 α-3(VI) 전구체(서열번호 28)이고; 및 서열 14)는 HKI-B9(서열번호 29)이다.
태반 비쿠닌(7-64) 및 (102-159)는 각각 세린 프로테아제 저해제의 쿠니츠클래스의 멤버에서 발견되는 바와 같은 동일한 수(6개)의 시스테인 잔기 및 시스테인 잔기 간격을 가지는 것으로 밝혀졌다. 3개의 사슬중 이황화물 결합을 형성하기 위한 시스테인 잔기의 정확한 결합 및 공지된 모든 쿠니츠 패밀리 멤버에 대한 변형체가 공지되어 있다 [참고문헌: Laskowski, M et al., 1980, Ann. Rev. Biochem. 49:593-626]. 공지된 결합 패턴, 및 활성 프로테아제 저해제로의 태반 비쿠닌(7-64) 및 (102-159)의 폴딩이 3개의 사슬간 이황화물 결합의 형성과 일치하는 질량 감소를 수반한다는 사실을 기초로 하여(실시예 2 및 1), 태반 비쿠닌의 쿠니츠 도메인 내의 이황화물 결합이 시스테인 잔기: C11 내지 C61; C20 내지 C44; C36 내지 C57; C106 내지 C156; C115 내지 C139; C131 내지 C152 사이에서 일어날 가능성이 높다. 또한, 이러한 이황화물 결합의 패턴은 쿠니츠 도메인을 함유하는 태반 비쿠닌의 보다 큰 형태에서 매우 가능한데, 이는 이러한 형태의 단백질 또한 활성 세린 프로테아제 저해제이고, 50 사이클 동안의 천연 태반 비쿠닌의 N-말단 서열화(실시예 7)는 시스테인 잔기가 예측되는 위치에서 사일런트한 서열을 생성시키기 때문이다.
본 발명의 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체는 메리필드 알.비.(Merrifield R.B.) 및 바라니 지.(Barany G.)에 의해 기술된 바와 같은 t-Boc 화학을 이용하거나[참고문헌: The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2, Gross E. et al., Eds. Academic Press (1980) Chapter 1], 카르피노 엘.에이. 및 한 지.와이.[Carpino L.A., and Han G.Y., (1970) J. Amer Chem Soc., 92, 5748-5749]에 의해 기술된 바와 같은 F-moc 화학을 이용하는 표준 고체상 펩티드 합성법에 의해 생성될 수 있으며, 이들은 실시예 2에 설명되어 있다. 다른 방법으로, 태반 비쿠닌 변형체를 코드화하는 DNA의 발현은 재조합 태반 비쿠닌 변형체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 태반 비쿠닌 단백질 변형체를 코드화하는 DNA 구성물에 관한 것이다. 이들 구성물은 문헌[Beaucage S.L. and Caruthers M.H., (1981) Tetrahedron Lett, 22, pp1859-1862; Mattucci M.D and Caruthers M.H., (1981), J.Am. Chem. Soc. 103, p 3185]에 기술된 방법과 같은 합성법에 의해 제조될 수 있거나, DNA 서열을 코드화하는 태반 비쿠닌과 하이브리드를 형성하기 위해고안된 cDNA 프로브에 의한 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있는 게놈 또는 cDNA로부터 제조될 수 있다. 게놈 또는 cDNA 서열은 본 명세서에 기술된 임의의 아미노산 치환 또는 결실을 엔코딩하는 cDNA를 수득하기 위해 하나 이상의 부위에서 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 재조합 태반 비쿠닌 변형체의 제조에 사용될 수 있는, 본 발명의 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변형체를 엔코딩하는 DNA 구성물을 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다. cDNA는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내고, 적당한 종결인자 및 폴리 아데닐화 신호를 갖는, 적당한 프로모터 서열에 연결되어야 한다. 태반 비쿠닌 변형체를 엔코딩하는 cDNA는 분비시키기 위하여 cDNA에 의해 코드화되는 단백질을 생성시키는 5´신호 펩티드에 융합될 수 있다. 신호 펩티드는 숙주 생물체에 의해 인식되는 것 일 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 경우, 신호 펩티드는 또한 온길이 태반 비쿠닌 내에 존재하는 천연 신호 펩티드일 수 있다. 태반 비쿠닌 변형체의 발현을 위한 이러한 벡터의 제조에 사용되는 방법은 당업 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989)]에 기술되어 있다.
본 발명은 또한 재조합 태반 비쿠닌 변형체의 제조에 사용될 수 있는 본 발명의 태반 비쿠닌, 단리된 도메인 또는 그 밖의 변헝체를 엔코딩하는 DNA 구성물을 함유하는 형질전환된 세포에 관한 것이다. 태반 비쿠닌 변형체의 제조에 사용될 수 있는 다양한 조합의 발현 벡터 및 숙주 생물체가 존재한다. 적당한 숙주 세포로는 바쿨로바이러스 감염된 Sf9 곤충세포, BHK, CHO, Hela, 및 C-127과 같은 포유동물 세포, 대장균(E.coli)과 같은 세균, 및 사카로마이세스 세르비재(Saccharomyces cervisiae)와 같은 효모가 있다. 태반 비쿠닌을 발현시키는데 필요한 포유동물, 곤충 및 미생물 발현 시스템을 사용하기 위한 방법은 당업 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어, 문헌[Ausubel F.M et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995), Chapter 16]에 기술되어 있다. 비쿠닌(7-64) 및 (102-159)과 같은 단일 쿠니츠 저해제 도메인을 함유하는 태반 비쿠닌의 단편에 대하여, 효모 및 대장균 발현 시스템이 바람직하며, 효모 시스템이 가장 바람직하다. 전형적으로, 효모 발현은 아프로티닌 변형체에 대하여 미국 특허 제 5,164,482호에 기술된 바와 같이 수행될 것이고, 태반 비쿠닌(102-159)에 대하여 본 명세서의 실시예 5에서 적합될 것이다. 대장균의 발현은 미국 특허제 5,032,573호에 기술된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 포유동물 및 효모 시스템을 사용하는 것이 변형체 비쿠닌(7-159)과 같은 저해제 도메인을 모두 함유하는 보다 더 큰 태반 비쿠닌 변형체의 발현을 위해 가장 바람직하다.
천연 아미노 서열의 아미노산 치환을 갖는 태반 비쿠닌의 변형체를 엔코딩하는 DNA는 쿤켈 티.에이.[Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488-492]의 방법을 이용하는 재조합 단백질의 발현을 위해 제조될 수 있다. 간략하게, 돌연변이 유발시킬 DNA는 M13과 같은 1본쇄 박테리오파지 벡터내로 클로닝된다. 변화시킬 영역을 스패닝하고 치환을 엔코딩하는 올리고누클레오티드는 1본쇄 DNA와 하이브리드를 형성하고, 표준 분자생물학 기술에 의해 2본쇄가 된다. 그런 다음, 이러한 DNA는 적당한 세균 숙주 내로 형질전환되고, 디데옥시누클레오티드 서열화에 의해 확인된다. 다음, 정확한 DNA가 발현 플라스미드 내로 클로닝된다. 다른 방법으로, 표적 DNA는 표준 PCR 기술에 의해 돌연변이유발되고, 서열화되고, 적합한 발현 플라스미드에 삽입될 수 있다.
본 발명의 특정한 일면 및 바람직한 구체예를 나타내는 하기의 특수한 실시예는 설명을 위해 제공되며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
합성 태반 비쿠닌(102-159)의 제조
사용되는 재료 및 방법/시약 . 형광발생 기질인 Tos-Gly-Pro-Lys-AMC를 바켐 바이오사이언스 인코포레이티드(Bachem BioScience Inc)(King of Prussia, PA)로부터 구입했다. PNGB, Pro-Phe-Arg-AMC, Ala-Ala-Pro-Met-AMC, 소과동물 트립신(타입 III), 사람 태반 칼리크레인, 및 사람 플라스민을 시그마(Sigma)(St. Louis,MO)로부터 구입했다.
재조합 아프로티닌(트라실롤??)을 베이어 아게(Bayer AG)(Wuppertal, Germany)로부터 구입했다. 예비로딩시킨 Gln Wang 수지를 노바바이오켐(Novabiochem)(La Jolla, CA)로부터 구입했다. 티오아니솔, 에탄에디티올 및 t-부틸 메틸 에테르를 알드리히(Aldrich)(Milwaukee, WI)로부터 구입했다.
작용성 태반 비쿠닌(7-64) 및 (102-159)의 정량
정제의 다양한 단계에 있는 리폴딩된 샘플에 존재하는 트립신 억제 활성의 양을 기질로서 GPK-AMC를 사용하여 측정했다. 소과 동물 트립신(200pmoles)을 완충액 A(50mM Hepes, pH 7.5, 0.1M NaCl, 2mM CaCl2및 0.01% 트리톤 X-100) 중에서 다양한 정제 단계에 있는 비쿠닌(7-64) 또는 비쿠닌(102-159)와 함께 37℃에서 5분간 인큐베이션시켰다. GPK-AMC를 첨가하고(최종농도는 20μM), 생성된 코우마린의 양을, 2분동안 Perkin-Elmer LS-50B 형광계 상에서 형광도를 측정하여(ex = 370nm, em = 432nm) 결정하였다. 시험된 샘플에 대하여, 샘플 각각에 대한 % 억제율을 방정식 1에 따라 계산했으며, 여기서 R0는 저해제의 존재하에서의 형광도 증가 속도이고, R1은 첨가된 샘플이 없는 상태에서 결정된 속도이다. 저해제에 대한 하나의 단위는 기술된 바와 같은 조건을 사용하는 검정에서 50% 억제를 달성하는데에 필요한 양으로서 정의된다.
% 억제 = 100 x [1-R0/R1](1)
합성 . 태반 비쿠닌(102-159)을 NMP-HBTU Fmoc 화학을 이용하는 어플라이드 바이오시스템스 모델(Applied Biosystems model) 420A 에서 합성하였다. 펩티드를 각각의 커플링에 대한 아미노산이 8배 초과된 예비로딩시킨 Gln 수지 상에서 합성하였다. 분해 및 탈보호를 실온에서 2시간 동안 84.6% 트리플루오로아세트산 (TFA), 4.4% 티오아니솔, 2.2% 에탄디티올, 4.4% 액화 페놀, 및 4.4% H2O 중에서 수행하였다. 미정제 펩티드를 침전시키고, 원심분리시키고, t-부틸 메틸 에테르 중에서 2회 세척하였다. 펩티드를 TFA/아세토니트릴 구배를 사용하는 Dynamax 60A C18 역상 HPLC 칼럼 상에서 정제하였다. 최종 제조물(61.0mg)은 하기의 예측된 서열에 대하여 일렉트로스프레이 매스 분광법(MH+ = 6836.1; 계산치 = 6835.5)에 의한 정확한 아미노산 조성물 및 분자량을 생성시켰다:
정제 . 태반 비쿠닌(102-159)의 리폴딩을 탐 등[Tam et al., J.Am. Chem.Soc. 1991, 113:6657-62]의 방법에 따라 수행하였다. 일부의 정제된 펩티드(15.2mg)을 0.1M Tris(pH 6.0) 및 8M 요소의 4.0,ml 중에서 용해시켰다. 이황화물의 산화를 20% DMSO, 0.1M Tris(pH 6.0) 및 1M 요소 중의 0.5mg/ml 펩티드의 최종 농도를 수득하기 위해 23% DMSO, 및 0.1M Tris(pH 6.0)을 함유하는 용액을 한 방울씩 첨가함으로써 수행하였다. 용액을 24시간 동안 25℃에서 교반시킨후, 50mM Tris(pH 8.0) 및 0.1M NaCl을 함유하는 완충액 중에서 1:10으로 희석하였다. 재료를 제조업자 지시에 따라 30mg의 소과 동물 췌장 칼리크레인(Bayer AG)을 3.5ml의CNBr 활성화시킨 세파로오스(Pharmacia)를 공유결합시켜 제조한 칼리크레인 친화성 칼럼을 사용하여 정제시켰다. 리폴딩된 재료를 1ml/분의 유속으로 친화성 칼럼 상에 로딩시키고, 세척액의 280nm에서의 흡광도가 더 이상 검출되지 않을 때까지 50mM Tris(pH 8.0) 및 0.1M NaCl로 세척하였다. 칼럼을 0.2M 아세트산(pH 4.0 및 1.7)의 각각 3부피로 용리시켰다. 활성 단편을 푸울링시키고(하기 참조), 용액의 pH를 2.5로 조정하였다. 재료를, 0.1% TFA 중의 22.5% 아세토니트릴 중에서 평형시킨 Vydac C18 역상 칼럼(5마이크론, 0.46 x 25 cm)에 직접 적용시켰다. 분리는 40분에 걸쳐 1.0ml/분 으로 0.1% TFA 중의 22.5 내지 40% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 달성하였다. 활성 단편을 푸울링시키고, 동결건조시키고, 0.1% TFA 중에서 재용해시키고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
결과: 합성 태반 비쿠닌(102-159)를 상기에 기술된 바와 같이 산화제로서 20% DMSO를 사용하여 리폴딩시키고, 하기에 설명된 바와 같이 2단계 정제 프로토콜에 의해 정제시켜, 활성 트립신 저해제를 수득하였다(하기 표 1)
합성 태반 비쿠닌(102-159)의 단리를 위한 정제 표
정제 단계 Vol(ml) mg/ml mg 단위C(U) SpA(U/mg) 수율
8.0M 요소 4.0 3.75a 15.0 0 0 -
20% DMSO 32.0 0.47a 15.0 16,162 1,078 100
칼리크레인 친화력 9.8 0.009b 0.09 15,700 170,000 97
C18 3.0 0.013ab 0.04 11,964 300,000 74
aAAA에 의해 결정된 단백질b정제된 단백질에 대해 결정된 흡광 계수(1.7 x 104Lmol-1cm-1)를 이용하는OD280 nm에 의해 결정된 단백질하나의 단위는 표준 검정법에서 트립신 활성의 50%를 억제하는데 필요한재료의 양으로서 정의된다.
부동화된 소과 동물 췌장 칼리크레인 칼럼 상에서의 미정제 리폴딩된 재료의 크로마토그래피는 6.0%의 단백질 및 97%의 존재하는 트립신 억제 활성을 선택적으로 단리시켰다. C18 역상을 사용하는 후속 크로마토그래피는 2배의 추가 정제를 생성시켰고, 전체 회수율은 74% 이었다. RPHPLC의 경우, 감소된 및 리폴딩된 태반 비쿠닌(102-159)는 각각 26.3 및 20.1분의 용리 시간을 나타내었다. 정제된 재료의 질량 분광 분석은 6829.8의 분자량을 나타내었다(출발 재료로부터 6 질량 단위가 손실됨). 이는 펩티드 서열로부터 추정된 3개의 이황화물의 완전한 형성을 입증한다.
정제되고 리폴딩된 합성 태반 비쿠닌(102-159)의 등전점은, 미리만든 암폴린[등록상표: Ampholine] PAGplate(pH 3.5 내지 9.5)를 사용하고 1.5시간 동안포커싱된 PI 표준과 함께 제조업자 제안에 따라 수행되는 멀티포어 II 일렉트로포레시스 시스템(Multiphor II Electrophoresis System, Pharmacia)을 이용하여, 결정하였다. 염색후, 상이한 단백질 밴드에 대한 겔의 음극 에지로부터의 이동 거리를 측정하였다. 각각의 미지 PI를, 상응하는 PI에 대한 표준의 이동 거리를 플롯팅하여 생성시킨 표준 곡선을 사용함으로써 결정하였다. 이러한 기술에 의해, 태반 비쿠닌(102-159)의 PI는 8.3으로 결정되었고, 이는 아미노산 서열로부터 추정된 값과 일치한다. 이 값은 아프로티닌의 PI에 대해 확정된 값인 10.5 보다 낮다. [참고문헌: Tenstad et al., 1994, Acta Physiol. Scand. 152:33-50].
실시예 2
합성 태반 비쿠닌(7-64)의 제조
태반 비쿠닌(7-64)을 합성하고, 리폴딩시키고, 태반 비쿠닌(102-159)에 대해 기술된 바와 같이 본질적으로 정제하였지만 단, 다음과 같이 변형시켰다: 리폴딩 동안에, 합성 펩티드를 25℃에서 20% DMSO 중에서 용액으로서 30시간 동안 교반시키고; C18 RP-HPLC에 의한 정제를 40분에 걸쳐 0.1% TFA 중의 25 내지 45% 아세토니트릴의 선형 기울기(1ml/분)로 달성하였다. 제 1 C18 수행으로부터의 활성 단편을 칼럼에 재적용하고, 0.1% TFA 중의 20 내지 40% 아세토니트릴의 선형 기울기(60분, 1ml/분)로 단편화시켰다.
결과: 최종 정제된 감소된 펩티드는 MH+ = 6563을 나타내었고, 하기 서열과일치하였다:
리폴딩 및 정제하여 트립신의 저해제로서 활성인 작용성 쿠니츠 도메인을 수득했다 (하기 표 2).
합성 태반 비쿠닌(7-64)의 단리를 위한 정제 표
정제 단계 Vol(ml) mg/ml mg 단위(U) SpA(U/mg) 수율
8.0M 요소 8.0 2.5 20.0 0 0 -
20% DMSO 64.0 0.31 20.0 68,699 3,435 100
칼리크레인 친화력(pH 4.0) 11.7 0.10 1.16 43,333 36,110 62
칼리크레인 친화력(pH 1.7) 9.0 0.64 5.8 4972 857 7.2
C18-1 4.6 0.14 0.06 21,905 350,143 31.9
C18-2 1.0 0.08 0.02 7,937 466,882 11.5
정제되고 리폴딩된 단백질은 MH+ = 6558, 즉 감소된 펩티드에 대해서 보다 낮은 5±1 질량 단위를 나타내었다. 이는 리폴딩이 하나 이상의 적합한 이황화물 결합의 형성을 유발함을 입증한다.
태반 비쿠닌(7 내지 64)의 pI는 태반 비쿠닌(102-159)의 pI를 결정하기 위해 사용되는 방법을 이용하여 결정하였다. 태반 비쿠닌(7-64)는 예측된 값(pI = 7.9) 보다 훨씬 높은 pI를 나타내었다. 리폴딩된 태반 비쿠닌(7-64)는 겔의 음극 에지(pH 9.5)로 이동하였고, 정확한 pI를 이러한 조건하에서는 결정할 수 없었다.
합성 태반 비쿠닌(7-64)의 연속 제조
합성 태반 비쿠닌(7-64)가 정제 및 리폴딩 전에 완전한 탈보호를 받을 수 없기 때문에, 완전하게 탈보호되는 것이 확실한 단백질을 사용하여 리폴딩을 반복하였다. 태반 비쿠닌(7-64)을 합성하고, 리폴딩시키고, 태반 비쿠닌(102-159)에 대해 기술된 바와 같이 본질적으로 정제하였지만 단, 다음과 같이 변형시켰다: 리폴딩 동안에, 합성 펩티드(0.27mg/ml)를 25℃에서 20% DMSO 중에서 용액으로서 30시간 동안 교반시키고; C18 RP-HPLC에 의한 정제를 40분에 걸쳐 0.1% TFA 중의 22.5 내지 50% 아세토니트릴의 선형 기울기(1ml/분)로 달성하였다.
결과: 최종 정제된 감소된 펩티드는 MH+ = 6567.5를 나타내었고, 하기의 서열과 일치하였다:
리폴딩 및 정제하면 트립신의 억제물질과 같이 활성인 작용성 쿠니츠 도멘인이 수득되었다 (하기 표 2B).
합성 태반 비쿠닌(7-64)의 단리를 위한 정제 표
정제 단계 Vol(ml) mg/ml mg 단위(U) SpA(U/mg) 수율
8.0M 요소 4.9 2.1 10.5 0 0 -
20% DMSO 39.0 0.27 10.5 236,000 22,500 100
칼리크레인 친화력(pH 2) 14.5 0.3 0.43 120,000 279,070 50.9
C18 역상 0.2 1.2 0.24 70,676 294,483 30.0
정제되고 리폴딩된 단백질은 MH+ = 6561.2, 즉, 감소된 펩티드에 대해서 보다 낮은 6.3 질량 단위를 나타내었다. 이는 리폴딩이 예측되는 3개의 이황화물 결합의 형성을 유발함을 입증한다.
리폴딩딘 태반 비쿠닌(7-64)의 pI는 태반 비쿠닌(102-159)의 pI를 결정하기 위해 사용되는 방법을 이용하여 결정하였다. 리폴딩된 태반 비쿠닌(7-64)는 예측된 값(pI = 7.9)보다 약간 높은 8.85의 pI를 나타내었다.
실시예 3
작용성 태반 비쿠닌 단편(102-159)의 체외 특이성
프로테아제 . 소과동물 트립신, 사람 플라스민, 및 소과동물 췌장 칼리크레인 정량을 앞서 기술한 바와 같이 p-니트로페닐 p´-구아니디노벤조에이트 HCl을 사용하는 활성 부위 적정에 의해 수행하였다 [참고문헌: Chase, T., 및 Shaw, E., (1970) Methods Enzmol., 19: 20-27]. 사람 칼리크레인은 표준으로서 소과동물 아프로티닌 및 1:1 복합체 형성을 가정하는 기질로서 PFR-AMC를 사용하는 활성 부위 적정에 의해 정량하였다. 각각의 효소에 대해 사용된 조건하에서 트립신 및 플라스민에 의한 GPK-AMC에 대한 Km은 각각 29μM 및 726μM 이었고; 사람 혈장 칼리크레인 및 소과동물 췌장 칼리크레인에 의한 PFR-AMC에 대한 Km는 각각 457μM 및 81.5μM 이었고; 엘라스타아제에 의한 AAPR-AMC에 대한 Km는 1600μM 이었다. 사람 조직 칼리크레인(Bayer, Germany) 정량은 앞서 기술한 바와 같이 p´니트로페닐 p´-구아니디노벤조에이트 HCl를 사용하는 활성 부위 적정에 의해 수행하였다 [참고문헌: Chase, T., 및 Shaw, E., (1970) Methods Enzmol. 19:20-27].
억제 동력학 : 태반 비쿠닌(102-159) 또는 아프로티닌에의한 트립신 억제는 전체 1.0ml 부피 중의 완충액 A 중에서 태반 비쿠닌(102-159)(0-2nM) 또는 아프로티닌(0-3nM)와 함께 50 pM의 트립신을 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 15㎕의 2mM GPK-AMC를 첨가하고, 형광도(상기와 같은)의 변화를 모니터링하였다. 태반 비쿠닌(102-159) 및 아프로티닌에 의한 사람 플라스민의 억제를 50mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.1M NaCl, 및 0.02% 트리톤 x-100을 함유하는 완충액 중에서 플라스민(50pM) 및 태반 비쿠닌(102-159) (0-10 nM) 또는 아프로티닌(0-4 nM)을 사용하여 결정하였다. 37℃에서 인큐베이션시킨지 5분 후에, 25㎕의 20mM GPK-AMC를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다. 태반 비쿠닌(102-159) 또는 아프로티닌에 의한 사람 플라스마 칼리크레인의 억제는 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 및 0.02% 트리톤 x-100 중에서 칼리크레인(2.5nM) 및 태반 비쿠닌(102-159)(0-3nM) 또는 아프로티닌(0-45 nM)를 사용하여 결정하였다. 37℃에서 5분 후에, 15㎕의 20mM PFR-AMC를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다. 태반 비쿠닌(102-159) 및 아프로티닌에 의한 소과동물 췌장 칼리크레인의 억제를 칼리크레인(92pM), 태반 비쿠닌(102-159)(0-1.6nM) 및 아프로티닌(0-14pM) 및 100μM의 최종 기질 농도를 사용하여 유사한 방식으로 결정하였다. 겉보기 억제 상수 Ki*를 비선형 회귀 데이터 분석 프로그램 Enzifitter 소프트웨어(Biosoft, Cambridge, UK)를 이용하여 결정하였다: 각각의 실험으로부터의 동력학 데이터는 강한 결합 억제물질에 대한 하기 방정식(2)으로 분석되었다:
Vi/Vo= 1 - (Eo+ Io+ Ki *- [(Eo+ Io+ Ki *)2- 4EoIo]1/2)/2Eo(2)
상기식에서, Vi/Vo는 분수 효소 활성(억제 대 비억제의 비율)이고, Eo및 Io는 각각 효소 및 억제물질의 전체 농도이다. Ki값은 하기 방정식(3)에 따라 기질의 효과를 교정함으로써 수득되었다:
Ki= Ki */(1 + [So]/Km)(3)
[참고문헌: Boudier, C., 및 Bieth, J.G., (1989) Biochim Biophys Acta., 995:36-41]
태반 비쿠닌(102-159) 및 아프로티닌에 의한 사람 호중구 엘라스타아제의 저해에 대하여, 엘라스타아제(19nM)를 0.1M Tris-HCl(pH 8.0), 및 0.05% 트리톤 X-100을 함유하는 완충액 중에서 태반 비쿠닌(102-159)(150nM) 또는 아프로티닌(0-7.5μM)과 함께 인큐베이션시켰다. 37℃에서 5분 후에, AAPM-AMC(500μM 또는 1000μM)을 첨가하고, 형광도를 2분에 걸쳐 측정하였다. Ki값은 2가지 상이한 기질 농도에서 수행된 1/V 대 [I] 형의 Dixon 플롯으로부터 결정하였다 (Dixon et al., 1979).
아프로티닌, 태반 비쿠닌 단편(7-64) 또는 태반 비쿠닌 단편(102-159)에 의한 사람 조직 칼리크레인의 저해는 50mM Tris-HCl 완충액(pH 9.0), 50mM NaCl, 및 0.1% 트리톤 x-100을 함유하는 1ml 반응 부피 중에서 0.35nM 사람 칼리크레인을 태반 비쿠닌(7-64)(0-40nM) 또는 태반 비쿠닌(102-159)(0-2.5nM), 또는 아프로티닌(0-0.5nM)과 함께 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 5㎕의 2mM PFR-AMC를 첨가하여 10μM의 최종 농도를 달성하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다. 사용된 조건하에서 사람 조직 칼리크레인을 사용하는 PFR-AMC에 대한 Km은 5.7μM 이었다. 합성 태반 비쿠닌(102-159), 재조합 태반 비쿠닌, 및 아프로티닌에 의한 사람 인자 Xa의 억제(American Diagnostica, Inc, Greenwich, CT)는 20mM Tris(pH 7.5), 0.1M NaCl 및 0.1% BSA를 함유하는 완충액 중에서 0.87nM의 사람 인자 Xa를 증가량의 저해제와 함께 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 30㎕의 20mM LGR-AMC(Sigma)를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다. 쿠니츠 저해제에 의한 사람 유로키나아제(Sigma)의 저해는 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl 및 0.1% 트리톤 x-100을 함유하는 전체 부피 1ml의 완충액 중에서 유로키나아제(2.7ng)을 저해제와 함께 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 35㎕의 20mM GGR-AMC(Sigma)를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다. 인자 XIa(Enzyme Research Labs, Southbend, IN)의 저해는 전체 부피 1ml로 50mM Hepes(pH 7.5), 100mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.01% 트리톤 x-100 및 1% BSA를 함유하는 완충액 중에서 FXIa(0.1nM)를 0 내지 800nM의 태반 비쿠닌(7-64), 0 내지 140nM의 태반 비쿠닌(102-159) 또는 0 내지 40μM의 아프로티닌과 함께 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 10ul의 40mM Boc-Glu (OBzl)-Ala-Arg-AMC(Bachem Biosciences, King of Prussia, PA)를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다.
결과: 태반 비쿠닌(102-159) 및 아프로티닌의 억제 프로필의 직접적인 비교는 동일한 조건하에서 다양한 프로테아제에 대한 이들의 저해 상수를 측정함으로써이루어졌다. Ki값은 하기 표 3에 기재되어 있다.
비쿠닌(102-159)에 의한 다양한 프로테아제의 저해에 대한 Ki값
프로테아제(농도) 비쿠닌(102-159)Ki(nM) 아프로티닌Ki(nM) 기질(농도) Km(mM)
트립신(48.5pM) 0.4 0.8 GPK-AMC(0.03mM) 0.022
키모트립신(5nM) 0.24 0.86 AAPF-pNA(0.08mM) 0.027
소의 췌장 칼리크레인(92.0pM) 0.4 0.02 PFR-AMC(0.1mM) 0.08
사람 혈장 칼리크레인(2.5nM) 0.3 19.0 PFR-AMC(0.3mM) 0.46
사람 플라스민(50pM) 1.8 1.3 GPK-AMC(0.5mM) 0.73
사람 호중구 엘라스타아제(19nM) 323.0 8500.0 AAPM-AMC(1.0μM) 1.6
인자 XIIa >300.0 12,000.0 PFR-AMC(0.2μM) 0.35
사람 조직 칼리크레인(0.35nM) 0.13 0.004 PFR-AMC(10μM) 0.0057
인자 Xa(0.87nM) 274 N.I.(3μM에서) LGR-AMC(0.6mM) N.D.
유로키나아제 11000 4500 GGR-AMC(0.7mM) N.D,
인자 XIa(0.1nM) 15 288 E(OBz)AR-AMC(0.4mM) 0.46
태반 비쿠닌(102-159) 및 아프로티닌은 사용된 조건하에서 소과 동물 트립신 및 사람 플라스민을 유사한 정도로 저해했다. 아프로티닌은 8.5μM의 Ki로 엘라스타아제를 저해하였다. 태반 비쿠닌(102-159)은 323nM의 Ki로 엘라스타아제를 저해하였다. 소과 동물 췌장 칼리크레인의 태반 비쿠닌(102-159) 저해에 대한 Ki값은 아프로티닌 저해의 값보다 20배 높았다. 대조적으로, 태반 비쿠닌(102-159)은 아프로티닌 보다 사람 혈장 칼리크레인의 보다 효능있는 억제물질이며, 56배 높은 친화성으로 결합한다.
태반 비쿠닌(102-159)는 칼리크레인의 저해제로서 트라실롤??보다 50배를 초과하는 효능이 있기 때문에, KIU로 저해제의 유효한 환자 투여용량을 유지시키기 위해 트라실롤??보다 소량의 사람 태반 비쿠닌, 또는 이것의 단편(즉, 태반 비쿠닌(102-159)이 필요하게 된다. 이것은 약제의 용량당 비용을 절감시키고, 약제가 환자에게 재노출된 경우 유해한 신독성 효과의 가능성을 감소시킨다. 또한, 단백질이 사람 유래된 것이기 때문에, 소과동물에서 유래된 아프로티닌 보다 사람 체내에서 훨씬 덜 면역원성이다. 이는 약제가 환자에게 재노출된 경우 유해한 면역학적 반응의 발생 위험을 감소시킨다.
실시예 4
작용성 태반 비쿠닌 단편(7-64)의 체외 특이성
작용성 사람 태반 비쿠닌(7-64)의 체외 특이성을 상기 실시예에 기술된 바와 같은 재료 및 방법을 사용하여 측정하였다.
결과 : 하기의 표는 생체외에서 다양한 세린 프로테아제의 저해제로서 태반 비쿠닌(7-64)의 효율을 보여준다. 데이터는 태반 비쿠닌(7-64) 또는 아프로티닌(트라실롤??)을 사용한 스크리닝 저해에 대해 얻어진 데이터와 비교하였다.
비쿠닌(7-64)에 의한 다양한 프로테아제의 저해에 대한 Ki 값
표 4A
프로테아제 비쿠닌(7-64)아프로티닌 비쿠닌(102-159)(농도) Ki(nM) Ki(nM) Ki(nM)
트립신(48,5 pM) 0.1 0.8 0.4
소과동물 췌장 0.4 0.02 0.4칼리크레인(92.0 pM)
사람 혈장 2.4 19.0 0.3칼리크레인(2.5 nM)
사람 플라스민(50 pM) 3.1 1.3 1.8
소과동물 키모트립신 0.6 0.9 0.2(50 pM)
인자 XIIa >300 12000 >300
엘라스타아제 >100 8500 323
결과는 태반 비쿠닌(7-64)을 엔코딩하는 아미노산 서열이 리폴딩되어 4개 이상의 트립신형 세린 프로테아제에 대해 효과적인 활성 세린 프로테아제 저해제가 수득될 수 있음을 보여주었다.
하기의 표 4B는 또한 생체외에서, 다양한 세린 프로테아제의 저해제로서 리폴딩된 태반 비쿠닌(7-64)의 효율을 보여준다. 리폴딩된 태반 비쿠닌(7-64)은 정제 및 리폴딩 전에 완전히 확실히 탈보호된 단백질로부터 제조하였다. 데이터는 태반 비쿠닌(102-159) 또는 아프로티닌(트라실롤??)을 사용한 스크리닝 저해에 대해 얻어진 데이터와 비교하였다.
리폴딩된 비쿠닌(7-64)에 의한 다양한 프로테아제의 저해에 대한 Ki 값
표 4B
프로테아제 비쿠닌(7-64) 아프로티닌비쿠닌(102-159)(농도) Ki(nM) Ki(nM) Ki(nM)
트립신(50 pM) 0.7 0.8 0.3
사람 혈장 0.7 19.0 0.7칼리크레인(0.2 nM)
사람 플라스민(50 pM) 3.7 1.3 1.8
인자 XIIa 수행하지 않음 12000 4500
인자 XIIa(0.1nM) 200 288 15
사람 조직 칼리크레인 2.3 0.004 0.13
놀랍게도, 태반 비쿠닌(7-64)은 사람 혈장 칼리크레인을 저해하는 데에 아프로티닌보다 더 잠재성이 있으며, 효율에 있어서 최소한 플라스민 저해제과 유사하였다. 이들 데이터는 태반 비쿠닌(7-64)이 생체외 검정을 이용할 경우에 아프로티닌 만큼 효과적이며, 생체내에서 더 우수하거나 유사한 잠재성을 기재할 수 있음을 보여주었다.
실시예 5
효모에서의 태반 비쿠닌 변형물(102-159)의 발현
태반 비쿠닌(102-159)을 엔코딩시키는 DNA 서열(서열 번호 : 6)을 합성 올리고누클레오티드를 사용하여 생성시켰다. 최종 DNA 구성물은 태반 비쿠닌(102-159)를 엔코딩시키는 인-프레임 cDNA 서열과 융합시킨 후, 인-프레임 정지 코돈과 융합된 효모 α-메이팅 팩터 폴리펩티드 비쿠닌(102-159)으로부터의 15개의 누클레오티드로 구성시켰다 (5'에서 3'). 효모 발현 벡터 pS604 내로 클로닝될 때에, cDNA는 태반 비쿠닌(102-159)의 58개의 아미노산 서열과 융합된 N-말단 효모 α-메이팅 팩터 프로펩티드를 포함하는 융합 단백질의 발현을 검출한다. α-메이팅 팩터와 쿠니츠 도메인 사이의 접합부에서 KEX-2 분열 부위에서의 융합 단백질의 처리는 천연 N-말단에서 쿠니츠 도메인을 유리시키도록 디자인했다.
클로닝에 대한 HindIII 부위를 함유하는 하기 서열의 5' 센스 올리고누클레오티드를 합성하였다 :
클로닝에 대한 BamHI 부위 및 정지 코돈 둘 모두를 함유하는 하기 서열의 3'안티센스 올리고누클레오티드를 합성하였다 :
올리고누클레오티드를 1mM EDTA를 함유하는 pH 8.0의 10mM 트리스 완충액 중에 용해시키고, 12ug의 각각의 올리고를 배합 첨가하여, 0.25M NaCl이 되게 하였다. 혼성시키기 위해, 올리고누클레오티드를 5분 동안 비등시켜서 변성시키고, 2시간에 걸쳐 실온으로 냉각시켰다. 오버랩을 클레노우 단편을 사용하여 확대시키고, HindIII 및 BamHI를 사용하여 절단시켰다. 절단된 2본쇄 단편을 pUC19 내로 클로닝시키고, 서열을 확인하였다. 교정된 서열의 단편을 함유하는 클론을 BamHI/ HindIII을 사용하여 절단시켜서, 하기의 표준 서열을 갖는 단편을 함유하는 비쿠닌을 유리시킨 후, 겔 정제시키고 BamHI/HindIII 컷 pS604 내로 결찰시켰다 :
결찰 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출시키고, S-200 미니스핀 칼럼 위에서 정제하였다. 결찰 생성물을 효모 균주 SC101 및 WHL341로 형질전환시키고, 우라(ura) 분비판 위에 플레이팅시켰다. 각각의 균주로부터의 12개의 콜로니를 판 밖으로의 우라 방울 상에 재스트리킹시켰다. 단일 콜로니를 2㎖의 우라 DO 배지 내로 접종시키고, 30℃에서 밤새 성장시켰다. 세포를 2분 동안 14000x g으로 펠릿화시키고, 상등액을 태반 비쿠닌(102-159)의 함량에 대해 평가하였다.
형질전환된 효모에서의 태반 비쿠닌(102-159)의 발현의 검출
첫 번째로, 상등액(검정 1회당 50 ul)을 실시예 1에 기술된 검정 방법(1㎖ 검정 부피)을 사용하여 트립신의 생체외 활성을 억제하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. 아프로티닌의 비활성 변형물을 발현시키는 효모 클론 뿐만 아니라 유일한 샘플인 사용되지 않은 배지를 네가티브 대조군으로서 사용하였다. 천연 아프로티닌을 발현시키는 효모 클론을 포지티브 대조군으로서 사용하고, 비교를 위해 나타내었다.
태반 비쿠닌(102-159) 발현을 정량시키기 위한 제 2 방법은 웨스턴 블롯을 사용하여 재조합 펩티드의 축적을 모니터하기 위해 합성 펩티드에 대한 폴리클론성 항체(pAb)의 사용하였다. 이들 연구는 균주 SC101로부터 유도된 재조합체만을 사용하여 수행하였는 데, 그 이유는 이들이 균주 WHL341로부터 유도된 재조합체보다 큰 억제 활성을 발생시키기 때문이다.
pAb를 생성시키기 위해, 생후 6-8주된 뉴질랜드 화이트 토끼 암컷(Hazelton Research Labs, Denver, Pa)를 0일째에 완전 프로인트 보조제 중에서 250 ug의 정제되고 환원된 합성 태반 비쿠닌(102-159)으로 면역시킨 후, 14일, 35일, 56일 및 77일 째에 각각 불완전 프로인트 보조제 중에서 125 ug의 동일한 항원으로 면역시켰다. 본 연구에 사용되는 항혈청을 수립된 공정에 의해 제 3 부스트 후에 수집하였다. 폴리클론성 항체를 단백질 A에 대해 항혈청으로부터 정제하였다.
효모 SC101의 형질전환으로부터의 콜로니 2.4 및 2.5 (도 8 참조) 뿐만 아니라 아프로티닌 대조군을 30℃에서 50㎖의 우라 DO 배지 중에서 밤새 성장시켰다. 세포를 펠릿화시키고, 상등액을 센트리프레프 3(Centriprep) [메사츄세츠 비버리의 아미콘(Amicon)] 농축기를 사용하여 100배 농축시켰다. 각각의 샘플(30㎕)을 제조업자의 공정을 사용하여 10-20% 트리신 완충 겔[캘리포니아 샌디에고의 노벡스(Novex)] 상에서 SDS-PAGE 처리하였다. 중복 겔을 실버 스테인 킷[메사츄세츠 낸트릭의 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템즈(Integrated Separation Systems)]를 사용하여 전개시키거나, 니트로셀룰로오스로 옮기고 합성 비쿠닌(102-159)으로 유도된 정제된 폴리클론성 항체를 사용하여 전개시켰다. 알칼리 포스파타아제 콘쥬게이트 염소 항-토끼 항체를 제조업자[미들랜드 게이터스버그의 키르케가아드 앤드 페리(Kirkegaard and Perry)]의 추천에 따라 2차 항체로서 사용하였다
SC101의 형질전환된 균주로부터의 태반 비쿠닌(102-159)의 정제
SC101 균주 2.4의 1L 배양액으로부터의 발효 브로쓰를 원심분리(4,000g x 30분)시킨 후, 0.1M NaCl, 2mM CaCl2및 0.01%(v/v) 트리톤 X-100을 함유하는 pH 7.5의 50mM 헤페스 완충액으로 정확하게 평형화시킨 안하이드로키모트립신-세파로오스의 1.0㎖ 칼럼[캘리포니아의 타카라 바이오케미칼 인코포레이티드(Takara Biochemical Inc.)]에 가함으로써 수득하였다. 칼럼을 A280nm가 0으로 내려갈 때까지 동일하지만 1.0M NaCl을 함유하는 완충액으로 세척하면서, 칼럼을 0.1M 포름산(pH 2.5)로 용리시켰다. 용리된 분획을 푸울링시키고, 0.1% TFA로 정확하게 평형화시킨 C18 칼럼(Vydac, 5um, 4.6 x 250mm)에 가하고, 0.1% TFA 중의 20 내지80% 아세토니트릴의 50분 선형 기울기로 용리시켰다. 태반 비쿠닌(102-159)를 함유하는 분획을 푸울링시키고, 0.1% TFA 중의 선형 22.5 내지 50% 아세토니트릴 기울기에 의한 용리를 사용하여 C18 상에서 재크로마토그래피하였다.
결과: 도 8은 균주 SC101 및 WHL341 각각의 형질전환으로부터 유도된 12개의 콜로니에 의해 억제되는 트립신 활성(%)을 도시한 것이다. 결과는 트립신 억제물질 태반 비쿠닌(102-159)에 의해 형질전환시킨 효모 균주 SC101의 12개의 콜로니 모두가 트립신을 억제하는 능력을 나타내지 않는 네가티브 대조군과 비교하여 현저한 양의 트립신 억제 활성을 생성시키는 능력을 가짐을 보여준다. 따라서, 활성은 태반 비쿠닌 변형체(102-159) 형질전환 세포에서의 특이적 억제물질의 발현과 관련된 것이다. 효모 WHL341 샘플은 최소 트립신 억제 활성을 함유한다. 이것은 사용되는 조건하에서 상기 균주를 사용하여 관찰한 느린 성장에 상관할 수 있다.
도 9는 효모 SC101 상등액의 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석을 도시한 것이다. 재조합 효모 2.4 및 2.5 발현 태반 비쿠닌(102-159) 뿐만 아니라 효모 발현 아프로티닌으로부터 유도된 상등액의 은 염색된 SDS-PAGE는 각각의 재조합 쿠니츠 억제물질 도메인에 대해 기대되는 크기에 상응하는 약 6 kDa에서 작동하는 단백질 밴드를 제공하였다. 웨스턴 분석은 스테인 2.4 및 2.5에 의해 발현된 6kDa가 태반 비쿠닌(102-159)로 유도되는 pAb와 반응함을 보여준다. 아프로티닌 대조군 중의 동일한 6kDa 밴드는 동일한 항체와 반응하지 않으며, 이는 태반 비쿠닌 변형체(102-159)에 대한 항체의 특이성을 나타내는 것이다.
태반 비쿠닌 C-말단 도메인의 최종 제조물은 은 염색된 SDS-PAGE에의 매우순수하다 (도 10). 최종 제조물에서 브로쓰 유도 트립신 억제 활성의 전체 수율은 31%이다. 정제된 억제물질의 N-말단 서열은 단백질의 40%가 태반 비쿠닌(102-159)에 대한 교정된 N-말단이 수득되도록 교정 처리되는 반면, 약 60%는 효모 α-메이팅 팩터의 일부를 함유한다. 정제된 물질은 혈장 칼리크레인의 생체외 억제에 대해 0.35nM의 겉보기 Ki를 나타내는 활성 혈청 프로테아제 억제물질을 포함한다.
결론적으로, 프로테아제 억제물질 활성 및 단백질 둘 모두의 축적은 발효 브로쓰 중의 합성 비쿠닌(102-159)에 관련될 뿐만 아니라, 형질전환체 중 하나로부터의 태반 비쿠닌(102-159)의 단리는 본원에 기술된 재조합 효모 균주에서의 태반 비쿠닌의 발현의 증거를 제공하여, 제 1 기간 동안 태반 비쿠닌 단편의 생성에 대한 효모의 단일성을 나타낸다.
태반 비쿠닌(102-159) 내에 함유된 쿠니츠 도메인의 발현 수준을 입증하고, 교정된 N-말단을 갖는 단백질의 수율을 증가시키기 위한 노력으로 추가의 구성물이 제조되었다. 본 발명자들은 태반 비쿠닌(102-159)의 N-말단 잔기(YEEY--)가 효모 a-팩터 프로 영역을 효소적으로 제거하는 효모 KEX-2에 의해 단지 불량하게 인식되는 분열 부위를 제공할 수 있다는 가정을 하였다. 따라서, 본 발명자들은 KEX-2 분열 부위를 둘러싸는 P' 서브사이트를 개질시키기 위해, 태반 비쿠닌 103-159(EEY...의 N-말단), 101-159(NYEEY...의 N-말단) 및 98-159(DMFNYEEY...)의 생성을 위한 효모 발현 구성물을 제조하였다. 재조합 단백질 발현의 수준을 입증하기 위한 시도로, 본 발명자들은 또한 하기에 기술되는 구성물의 일부를 제조하는 데에 포유동물 우선 코돈보다는 효모 우선 코돈을 사용하였다. 구성물은 태반 비쿠닌 102-159(구성물 #1로 정의됨)에 대해 상기 기술된 바에 따라, 그러나 하기의 변형에 따라 제조하였다 :
구성물 #2태반 비쿠닌 103-159, 효모 코돈 사용
하기의 5' 센스 올리고누클레오티드 및 하기의 3' 안티센스 올리고누클레오티드를 태반 비쿠닌 102-159의 발현을 위해 발현 구성물(상기 구성물 #1)의 생성을 위해 기술된 바와 같이 조작하였다 :
5' 센스 올리고누클레오티드
3' 안티센스 올리고누클레오티드
구성물 #3태반 비쿠닌 101-159, 효모 코돈 사용
하기의 5' 센스 올리고누클레오티드 및 구성물 #2에 대해 사용된 것과 동일한 3' 안티센스 올리고누클레오티드를 태반 비쿠닌 102-159의 발현을 위해 발현 구성물(상기 구성물 #1)의 생성을 위해 기술된 바와 같이 조작하였다 :
5' 센스 올리고누클레오티드
구성물 #4태반 비쿠닌 98-159, 효모 코돈 사용
하기의 5' 센스 올리고누클레오티드 및 구성물 #2에 대해 사용된 것과 동일한 3' 안티센스 올리고누클레오티드를 발현 구성물 (상기 구성물 #1)의 생성을 위해 기술된 바와 같이 조작하였다 :
5' 센스 올리고누클레오티드
효모 균주 SC101(MATα, 우라 3-52, suc 2)를 상기 cDNA를 각각 함유하는 플라스미드를 사용하여 형질전환시키고, 단백질을 사람 코돈 사용에 의한 태반 비쿠닌 102-159의 제조를 위해 상기 기술된 방법을 사용하여 발현시켰다. 약 250㎖의 각각의 효모 배양액을 수득하고, 원심분리(15분 x 3000 RPM)로부터의 상등액을 따로따로 상기 기술된 바와 같이 칼리크레인-세파로오스의 1㎖ 칼럼 상에서 정제하였다. 어플리세이트(Applysate) 중의 트립신 억제 활성의 상대적 양, 회수되는 정제된 단백질의 양 및 정제된 단백질의 N-말단 서열을 측정하고, 하기의 표 7에 기재하였다 :
태반-비쿠닌의 C-말단 쿠니츠 도메인을 함유하는 다양한 단백질의 상대적 생성 수준
구성물 어플리세이트 중의 N-말단 서열화코멘트저해제의 상대적 양(pmol) 서열
#2 103-159비검출 비검출 비검출비발현
#3 101-15925% 억제 비검출 비검출저발현
#4 98-15993% 억제 910 DMFNYE- 양호발현 교정 생성물
#1 102-15982% 억제 480 AKEEGV- 활성 비교정처리 단백질의 발현
결과는 C-말단 쿠니츠 도메인을 함유하는 상이한 길이의 태반 비쿠닌 단편이 작용성 분비 단백질을 발현시키기 위한 능력이 다양하게 변화됨을 보여준다. 단편 (101-159) 및 (103-159)를 발현시키는 구성물은 정제 전에 상등액 중에서 효소 활성을 거의 제공하지 않고, 각각의 정제된 분획의 0.05㎖ 분취량의 N-말단 서열화는 검출되지 않는 양의 저해제를 제공하였다. 다른 한편으로는, 태반 비쿠닌(102-159) 또는 (98-159)의 발현은 정제 전에 현저한 양의 프로테아제 활성을 제공하였다. 그러나, N-말단 서열화는 비쿠닌(102-159)의 발현으로부터 회수된 정제된 단백질이 다시 한번 대부분 비교정 처리되어, 효모 α-메이팅 팩터 프로-서열 내의 부위에서 프리 단백질의 대부분의 처리와 일치하는 N-말단을 나타냈다. 그러나, 태반 비쿠닌(98-159)의 발현으로부터 회수되는 정제된 단백질은 교정 부위에서 전체적으로 처리되어, 교정된 N-말단을 제공했다. 또한, 태반 비쿠닌(102-159)의 회수량과 비교하여 거의 2배의 단백질이 회수??다. 태반 비쿠닌(98-159)은 사카로마이세스 세레비재의 α-메이팅 팩터 프리-프로 서열/KEX-2 처리 시스템에 의해 태반 비쿠닌의 C-말단 쿠니츠 도메인의 생성을 위한 바람직한 단편 길이를 나타냈다.
실시예 6
효모 발현에 대한 대안적 공정
R74593 번역 생생물로부터 유도된 58개의 아미노산 펩티드를 또한, DNA 서열화 후에 TA 벡터(상표명)[캘리포니아 샌디에고의 인비트로겐(Invitrogen)] 내로 클로닝시킨 R87894-R74593 PCR로부터 또는 사람 태반 cDNA로부터 PCR 증폭시켰다. 증폭된 DNA 생성물은 α-메이팅 팩터/쿠니츠 도메인 융합 단백질을 구성하는 골격내 번역 생성물을 제조하도록 YEEY--CFRQ(58개의 잔기)를 코드화시키는 R74593 서열에 메이팅된 효모 α-메이팅 팩터 리더 서열로부터의 19개의 누클레오티드로 구성될 것이다. 단백질 서열은 또한 천연 N-말단에서 쿠니츠 도메인을 유리시킬 KEX-2 절단 부위를 함유한다.
클로닝을 위한 HindIII 부위를 함유하는 5' 센스 올리고누클레오티드는 하기의 서열을 함유할 것이다 :
3' 안티센스 올리고누클레오티드는 클로닝을 위한 BamHI 뿐만 아니라 정지 코돈을 함유하고, 하기의 서열을 갖는다 :
효모 발현 인자 내로 클로닝시키려는 온전한 206개의 누클레오티드 cDNA는 하기의 서열을 갖는다 :
PCR 증폭 후에, 상기 DNA는 HindIII 및 BamHI로 절단되고, 또한 HindIII 및 BamHI로 절단시킨 효모 발현 인자 pMT15 내로 클로닝될 것이다 (본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제 5,164,482호 참조). 생성된 플라스미드 인자를 사용하여, 미국 특허 제 5,164,482호에 기술된 방법을 사용하여 효모 균주 SC106을 형질전환시켰다. URA 3+ 효모 형질전환체를 또한 단리시키고, 유발 조건하에서 배양시켰다. 재조합 태반 비쿠닌 변형체의 수율을 상기 기술된 생체외 검정법을 사용하여 시간에 따라 배양 상등액 중에 축적되는 트립신 억제 활성의 양에 따라 측정하였다. 발효 브로쓰를 30분 동안 9000 rpm으로 원심분리시켰다. 상등액을 0.4㎛필터를 통해, 그 다음 0.2㎛ 필터를 통해 여과시키고, 전도도가 7.5 ms가 될 때까지 희석시키고, 시트르산에 의해 pH를 3으로 조절하였다. 샘플은 pH 3의 50 mM 시트르산 나트륨 중의 200㎖의 S-세파로오스 패스트 플로우(파마시아) 상에 흡수되고 60분 동안 교반된 브로쓰이다. 그 다음, 겔을 각각 2L의 50mM 시트르산 나트륨(pH 3.0), 50 mM 트리스-HCl(pH 9.0) 및 20 mM HEPES(pH 6.0)으로 순차적으로 세척하였다. 세척된 겔을 적당한 칼럼 내로 옮기고, 20mM HEPES(pH 6.0) 중의 0 내지 1M 염화나트륨의 구배로 용리시켰다. 생체외 트립신 저해 활성을 갖는 용리된 분획을 푸울링시키고, a) 고정화시킨 안하이드로트립신의 칼럼 상의 크로마토그래피(본질적으로 실시예 2에 기술된 바와 같음)에 의해; b) 고정화시킨 소과동물 칼리크레인의 칼럼 상의 크로마토그래피에 의해; 또는 c) 겔 여과를 포함하는 통상적인 크로마토그래피 단계 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피의 조합에 의해 추가로 정제시켰다.
실시예 7
태반로부터의 천연 사람 태반 비쿠닌의 단리 및 특징화
비쿠닌 단백질을 온전한 동결 태반[델라웨어, 윌밍톤의 어날리티칼 바이올로지칼 서비시스, 인코포레이티드(Analytical Biological Services, Inc)]로부터 겉보기에 균일해질 때까지 정제하였다. 태반(740g)을 실온으로 해동시키고, 600㎖ PBS 완충액으로 세척하였다. 세척물을 따라내고, 240㎖의 태반 조각을 워링(Waring) 블렌더 내에 넣었다. 0.1M 트리스(pH 8.0) 및 0.1M NaCl로 구성된 300㎖의 완충액을 첨가한 후, 혼합물을 2분 동안 고속으로 배합시키고, 750.0㎖ 원심분리관 내로 따라내고, 얼음위에 위치시켰다. 상기 과정을 모든 재료가 처리될 때까지 반복하였다. 모아진 슬러리를 4℃에서 60분 동안 4500 x g로 원심분리시켰다. 상등액을 치이즈 클로쓰를 통해 여과시키고, 제조업자의 지시에 따라 5.0㎖의 CNBr 활성화 세파로오스(파마시아)에 70㎎의 소과동물 췌장 칼리크레인(바이어 AG)을 공유 결합시킴으로써 제조한 칼리크레인 친화성 칼럼을 사용하여 태반 비쿠닌을 정제하였다. 물질을 2.0㎖/분의 유속으로 친화성 칼럼 상에 로딩시키고, 280nm에서 세척물 존재가 더 이상 검출되지 않을 때까지 0.1M 트리스(pH 8.0), 0.1M NaCl로 세척하였다. 칼럼을 0.1M 트리스(pH 8.0), 0.5M NaCl로 추가로 세척한 후, 3부피의 0.2M 아세트산(pH 4.0)으로 용리시켰다. 칼리크레인 및 트립신 억제 활성(하기 참조)을 함유하는 분획을 푸울링시키고, 동결시키고, 동결건조시켰다. 태반 비쿠닌을 벡크만 시스템 골드(Gold) HPLC 시스템에 부착시킨 슈퍼덱스 75 10/30(파마시아) 칼럼을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 간단하게, 칼럼을 0.5ml/분의 유속으로 0.1M Tris, 0.15M NaCl, 및 0.1% 트리톤 x-100 중에서 평형시킨다. 동결건조시킨 샘플을 1.0㎖의 0.1M 트리스(pH 8.0) 중에서 재구성하고, 200㎕ 분취량에서의 겔 여과 칼럼 상에 주입시켰다. 분획을 수집하고(0.5㎖), 트립신 및 칼리크레인 저해 활성에 대해 검정하였다. 활성 분획을 푸울링시키고, 용액의 pH를 TFA의 첨가에 의해 2.5로 조절하였다. 물질을 0.1% TFA 중의 20% 아세토니트릴 중에서 평형화시킨 Vydac C18 역상 칼럼(5 미크론, 0.46 x 25cm)에 직접 가하였다. 분리는 0.1% TFA 중의 20% 아세토니트릴에 초기 20분 세척 후에 50분에 걸쳐 1.0㎖]/분으로 0.1% TFA 중의 20 내지 80% 아세토니트릴의 선형 기울기를 사용하여 달성하였다. 분획(1㎖)을 수집하고, 트립신 및 칼리크레인 저해 활성에 대해 검정하였다. 저해 활성을 함유하는 분획을 스피드-vac 농축기[사반트(Savant)]를 사용하여 농축시키고, N-말단 서열 분석을 하였다.
태반 비쿠닌에 대한 작용성 검정
작용성 태반 비쿠닌의 확인을 소과동물 트립신 및 사람 혈장 칼리크레인을 억제하기 위한 능력을 측정함으로써 달성하였다. 트립신 저해 활성의 확인은 기질로서 Gly-Pro-Lys-아미노메틸쿠마린을 사용하여 96-웰 마이크로역가플레이트[페르킨 엘머(Perkin Elmer)]에서 실온에서 검정 완충액(50mM Hepes, pH 7.5, 0.1M NaCl, 2.0mM CaCL2, 0.1% Triton x 100) 중에서 수행하였다. 트립신에 의해 생성된 쿠마린의 양은 플레이트 리더가 장착된 페르키-엘머 LS-50B 형광계 상에서 형광도(ex=370nm, em=432nm)를 측정함으로써 측정하였다. 트립신(100㎕ 완충액 중의 23㎍)을 시험하려는 20㎕의 샘플과 혼합시키고, 25℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 검정 완충액 중의 50㎕의 기질 GPK-AMC(최종 33μM)의 첨가에 의해 개시하였다. 형광 세기를 측정하고, 각각의 분획에 대한 저해 %를 하기의 방정식에 의해 측정하였다 :
% 억제 = 100 x [1 - Fo/F1]
상기식에서,
Fo는 미지의 형광도이고, F1은 유일한 대조군으로서 트립신의 형광도이다.
분획의 칼리크레인 저해 활성은 검정 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 50mM NaCl, 0.1% 트리톤 x 100) 및 기질로서의 66.0μM Pro-Phe-Arg-AMC 중의 7.0nM을 사용하여 유사하게 측정하였다.
태반 비쿠닌의 체외 특이성의 측정
천연 태반 비쿠닌의 생체외 특이성을 상기 실시예에 기술된 바와 같은 재료 및 방법을 사용하여 측정하였다. 태반 비쿠닌을 기질로서 GPK-AMC를 사용하여 트립신의 공지된 농도에 대한 활성 부위 적정에 의해 정량화시켜서 비결합 트립신의 분율을 모니터링하였다.
단백질 서열화
1㎖ 분획[C18-29 델라리아(Delaria)]를 스피드 Vac 상에서 부피를 300㎖로 감소시켜서, 유기 용매의 양을 감소시켰다. 그다음, 샘플을 휴렛-패커드 소형 이상 반응 칼럼 상에 로딩시키고, 1㎖의 2% 트리플루오로아세트산으로 세척하였다. 샘플을 엘머 분해를 이용하여 휴렛-패커드 모델 G1005A 단백질 서열화 시스템 상에서 서열화시켰다. 버전 3.0 서열화 방법 및 모든 시약을 휴렛-패커드에 의해 공급받았다. 서열을 50 사이클로 확인하였다.
결과: 태반 비쿠닌을 순차적 칼리크레인 친화성, 겔 여과 및 역상 크로마토그래피에 의해 겉보기에 균일해질 때 까지 정제하였다(하기의 정제 표 참조) :
천연 태반 비쿠닌(1-179)에 대한 정제 표
단계부피 OD 280 OD 280단위a단위/OD 280(㎖) (/㎖) (U)
태반 상등액 1800.00 41.7 75.060 3,000,00040.0
칼리크레인 친화성 20.0 0.17 3.3616,0004,880(pH 4.0)
칼리크레인 친화성 10.2 0.45 4.5612,0002,630(pH 1.7)
슈퍼덱스(Superdex) 75 15.0 0.0085 0.133,19124,546
a 1 유닛은 표준 검정에서 트립신 활성의 50%를 저해하는 양으로서 정의된다.
칼리크레인 및 트립신 저해 활성의 대부분을 pH 4.0 용리액 중에서 칼리크레인 친화성 칼럼으로부터 용리시켰다. 상등액 겔 여과 크로마토그래피(도 5)로, 동일 조건하에 분자량 표준물질을 작용시킴으로써 발생되는 표준 곡선에 의해 판단하여 10 내지 40 kDa의 분자량을 갖는 칼리크레인 및 트립신 저해 활성의 피크를 얻었다. 역상 C18 크로마토그래피(도 6)로, 약 30% 아세토니트릴에서 가장 가능한 용리 작용을 하는 저해 활성의 4개의 피크를 얻었다. C18로부터 용리시키기 위해 제 1 피크와 관련한 활성(분획 29)은 태반 비쿠닌의 예측된 아미노산 서열의 아미노산 1로 출발하는 아미노산 서열(ADRER..., SEQ ID NO:1)을 나타내고, 서열의 50 사이클에 대한 예측된 서열과 동일하였다 (도 3에서 밑줄친 아미노산). 상기 서열 스트레치 내의 시스테인 잔기는 산화된 단백질의 서열화에 대해 기대되는 바와 같이 사일런트하였다. 성숙 태반 비쿠닌의 아미노산 위치 11 및 20에서의 시스테인 잔기는 나중에 S-피리딜에틸화 단백질의 서열화호부터 확인되는 반면, PTH-피리딜에틸-시스테인은 사이클 11 및 20에서 회수되었다.
흥미롭게도, 서열의 아니노산 잔기 번호 30에 있는 아스파라긴(도 3)은 사일런트하며, 이는 상기 부위가 글리코실화되게 됨을 나타내는 것이다. 분획 29는 잔기 #1에서 출발하는 태반의 서열에 상응하는 하나의 주서열(사이클 1에서 27pmol) 및 또한 잔기 6(SIHD...)에서 출발하는 태반 비쿠닌으로부터 유도되는 부서열(2pmol)을 제공했다. 이는, 분획 29에서 서열화된 최종 제조물이 매우 순수하고, 대부분 상기 분획과 관련된 프로테아제 억제 활성에 반응성임을 보여주는 것이다(도 6).
따라서, C18 크로마토그래피로부터의 태반 비쿠닌의 최종 제조물은 실버 스테인 SDS-PAGE 분석에 근거하여 매우 순수하며(도 7), 여기에서 단백질은 분자량 마아커, 즉 인슐린(2.9kDa); 소과동물 트립신 저해제(5.8kDa); 리소자임(14.7kDa); β-락타글로불린(18.4kDa); 탄산 안히드라아제(29kDa) 오발부민(43kDa)으로 보정된 10 내지 20% 아크릴아드 트리신 겔(캘리포니아 샌디에고의 노벡스) 상에서 24kDa의 겉보기 분자량으로 이행했다. SDS-PAGE 상의 태반 비쿠닌의 상기 크기는 전장 엔코딩 서열로부터 예측되는 것과 일치했다 (도 4F).
상기 기술된 N-말단 서열화 결과에 근거하여 예측되는 바와 같이, 정제된 단백질은 태반 비쿠닌(7-64)로 유도된 항체와 반응하여 실버 스테인에 의해 겔 상에서 검출되는 정제된 제조물에 대해 관찰된 바와 같이(도 7), 동일한 분자량을 갖는밴드를 수득했다(도 12A). 그러나, 동일한 제조물이 합성 태반 비쿠닌(102-159)로 유도된 항체와 반응하는 경우, 약 6kDa의 합성 비쿠닌(102-159)와 동시 이행하는 단편이 관찰되었다. 이러한 결과의 가장 간단한 해석은 정제된 제조물이 정제에 이어 분해를 일으켜서 N-말단 도메인을 포함하는 N-말단 단편 및 C-말단 도메인을 포함하는 C-말단 단편을 수득한다는 것이다. 태반 비쿠닌(7-64)에 대한 항혈청에 대해 반응성인 단편이 완전 길이 단백질의 C-말단을 함유하지 않는다는 가정하에, 크기(24kDa)는 높은 글리코실화 상태를 제시했다.
표 6은 태반 비쿠닌에 의한 다양한 세린 프로테아제의 생체외 저해 가능성을 제시한다. 데이터를 아프로티닌[트라실롤??]을 사용하여 관찰한 데이터와 비교하였다.
태반 비쿠닌에 의한 다양한 프로테아제의 저해에 대한 Ki 값
프로테아제 (농도)태반 비쿠닌 Ki(nM)아프로티닌 Ki(nM)
트립신 (48.5 pM)0.130.8
사람 플라스민 (50 pM)1.91.3
결과는 천연 공급원(사람 태반)으로부터 단리한 태반 비쿠닌이 트립신형 센스 프로테아제의 가능성있는 저해제임을 보여주었다.
실시예 8
다양한 기관 및 조직에 대한 태반 비쿠닌의 발현 패턴
노던을 사람 심장, 뇌, 태반, 허파, 간, 골격근, 신장 및 췌장으로부터의 2㎍의 폴리A+RNA를 함유하는 다중 조직 노던을 클로테크로부터 입수하였다. 2개의상이한 cDNA 프로브, 즉 1) 겔 정제된 cDNA 코드화 태반 비쿠닌(102-159), 및 2) EcoRI에 의한 절단에 의해 TA 클론으로부터 유리시키고 겔 정제된 78개의 염기쌍 PCR- 유도된 cDNA(도 4E)를 사용하였다. 각각의 프로브를32P-dCTP ALC 뵈링거 만하임 바이오케미칼스(인디애나)의 제품인 랜덤 프라이밍 라벨링 킷으로 표지시킨 후, 제조업자의 설명서에 따라 다중 조직 노던에 혼성시키기 위해 사용하였다. 18시간의 노출 시간으로 바이오맥스(Biomax) 필름을 사용하여 자동 방사선 사진을 찌고, 유맥스(Umax) 스캐너를 사용하여 현상하고, 오도브 포토삽(Aodbe Photoshop)을 사용하여 스캐닝하였다.
결과: 태반 비쿠닌(102-159) 프로브(도 11A) 또는 태반 비쿠닌(도 11B)의 쿠니츠 도메인을 함유하는 보다 큰 프로브를 사용하여 관찰된 조직 발현의 패턴은 본질적으로 예측될 수 있는 패턴과 일치하였다. 태반 비쿠닌 mRNA는 췌장 및 태반에서 가장 풍부하게 존재하였다. 유의 수준은 또한 폐, 뇌 및 신장에서 관찰된 반면에, 낮은 수준은 심장 및 간에서 관찰되었고, mRNA는 골격근에서는 검출이 불가능하였다. 전사체 크기는 모든 경우 1.95kb 이었고, 이는 앞 절에 기술된 EST 오버레이 및 전장 cDNA의 클로닝 모두로부터 추론된 태반 비쿠닌의 예측된 크기와 거의 일치하는 것이다.
mRNA의 광범한 조직 분포는 태반 비쿠닌이 광범위하게 발현된다는 것을 보여준다. 단백질이 또한 리더 서열을 함유하기 때문에, 사람 면역계에 충분히 노출될 것이며, 이는 자체 단백질로서 인식될 것이 필요하다. 태반 비쿠닌 mRNA 발현의광범한 조직 분포에 대한 추가의 증거는, 태반 비쿠닌과 상동인 일부 EST 목록(도 4B)이 성인 및 소아 뇌, 및 사람 망막, 유방, 난소, 후각 상피 및 태반으로부터 유도된다는 사실로부터 유도되었다. 따라서, 사람 환자에게 천연 사람 단백질을 투여하는 것은 면역 반응을 유도하지 않을 것으로 결론이 내려진다.
흥미롭게도, 태반 비쿠닌의 발현 패턴은 소과동물 폐 및 췌장에서 고수준으로 발현되는 소과동물 아프로티닌에 대한 패턴을 다소 상기시킨다. 태반 비쿠닌의 발현 패턴을 더 밝혀내기 위하여, 다음의 사람 세포로부터 전체 RNA의 RT-PCR이 결정되었다: 자극되지 않은 사람 배꼽 정맥 상피 세포(HUVECs), HK-2(신장 기부 세관으로부터 유도된 계열), TF-1(적백혈병 계열) 및 포르볼레스터(PMA)-자극된 사람 말초혈 백혈구. cDNA 단편을 코드화하는 600 b.p 태반 비쿠닌을 증폭시키도록 고안된 하기의 프로브가 사용되었다:
비교는 800 b.p. 액틴 단편을 증폭시키는 액틴 프라이머를 봉입시킴으로써 표준화하였다. 브롬화 에티듐을 사용하는 아가로오스 겔 상에서 확인된 800 b.p 단편은 모든 레인에서 동일한 세기를 갖는 반면에, 600 b.p 태반 비쿠닌단편은 HUVECs에는 없었고, 그 밖의 각각의 세포계열에서는 유의량으로 존재하였다. 본 발명자는 태반 비쿠닌이 일부 이상의 상피 세포에서는 발현되지 않지만, 일부의 백혈구 개체군에서는 발현된다고 결론지었다.
실시예 9
바쿨로바이러스/Sf9 발현 시스템으로부터 고도로 정제된 태반 비쿠닌(1-170)의 정제 및 특성
쿠니츠 도메인을 함유하는 태반 비쿠닌의 커다란 단편(태반 비쿠닌 1-170)을 하기와 같이 Sf9 세포 내에서 발현시켰다. PCR(도 4E)에 의해 수득되고, TA 벡터 내에 함유된(앞의 실시예 참조) 태반 비쿠닌 cDNA를 HindIII 및 Xba1로 소화시켜 유리시킴으로써, 5´XbaI 부위 및 3´HindIII 부위에 의해 플랭킹된 단편을 수득하였다. 이 단편을 겔 정제시킨 다음, M13mp19 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA) 내로 클로닝시켰다. 체외 돌연변이유발법[참고문헌: Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492]을 이용하여 5´말단에서 XbaI 부위쪽으로 PstI 부위 3´를 생성시키고, ATG 개시 부위, 천연 태반 비쿠닌 서열 펩티드 및 성숙한 태반 비쿠닌 코딩 서열을 코드화하는 서열쪽으로 5´을 생성시켰다. 돌연변이유발을 위해 사용된 올리고누클레오티드는 하기의 서열을 갖는다:
정지 코돈(TAG) 및 BglII/XmaI 부위는 하기의 올리고누클레오티드를 사용하여 cDNA의 3´말단에서 유사하게 조작되었다:
정지 코돈은 태반 비쿠닌을 코드화하는 서열을 갖는 프레임 내에 존재하며, 아미노산 잔기 170에 있는 리신 바로 다음에서 종결을 유도시킴으로써, 추정 트랜스멤브레인 도메인이 결여된 절단된 태반 비쿠닌 단편을 엔코딩했다. PstI 및 BglII에 의해 소화된 생성물을 단리시키고, 쿠니츠 도메인을 함유하지만 추정 트랜스멤브레인 절편쪽의 N-말단이 바로 절단된 태반 비쿠닌 단편(1-170)의 발현을 위한 BacPac8 벡터 내로 클로닝시켰다.
Sf-9 곤충 세포에 의한 비쿠닌의 발현은 배지가 감염후 72시간 째에 채취되는 경우 1:1의 다수의 감염에서 최적이었다. 채취후, 바쿨로바이러스 세포 배양물 상등액(2L)에 Tris-HCl을 첨가하여 pH 8.0으로 조정하였다. 비쿠닌은 태반으로부터의 천연 태반 비쿠닌의 정제를 위해 앞서 실시예 7에 기술된 바와 같이 5ml 소과동물 췌장 칼리크레인 친화성 칼럼을 사용하는 크로마토그래피을 사용하여 정제하였다. 용리시킨 물질을 TFA로 pH 2.5로 조정하고, 1ml/분의 유속으로 0.1% TFA 중의 10% 아세토니트릴 중에서 평형시킨 C18 역상 칼럼(1.0 x 25 cm) 상에서 크로마토그래피로 정제했다. 비쿠닌을 40분에 걸쳐 0.1% TFA 중의 10 내지 80% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. 활성 분획을 푸울링시키고, 동결건조시키고, 50mM Hepes(pH 7.5), 0.1M NaCl, 2mM CaCl 및 0.1% 트리톤 x-100 중에서 재용해시키고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 재조합 비쿠닌의 농도는 아미노산 분석에 의해 결정하였다.
결과: 재조합 비쿠닌을 하기에 나타난 바와 같이 2단계 정제 프로토콜을 이용하여 바쿨로바이러스 세포 배양액으로부터 정제함으로써, 활성 트립신 저해제를수득하였다 (하기 표 8).
형질전환된 배양액 상등액으로부터의 재조합 비쿠닌의 정제
정제 단계 부피(ml) OD 280/ml OD 280(전체) 단위(U) 비활성(U/OD)
상등액 2300.0 9.0 20,700 6,150,000 297
칼리크레인 친화성 23.0 0.12 2.76 40,700 14,746
C18 역상 0.4 3.84 1.54 11,111 72,150
고정화시킨 소과동물 췌장 칼리크레인 친화성 칼럼 상에서 미정제 물질의 크로마토그래피는, 0.013%의 단백질 및 0.67%의 존재하는 트립신 저해 활성을 선택적으로 단리시켰다. 출발 상등액에 존재하는 대부분의 트립신 저해 활성은 고정화시킨 칼리크레인과 결합하지 않으며, 비쿠닌과 관련이 없었다(결과는 도시되지 않음). C18 역상을 사용하는 후속 크로마토그래피로 0.2%의 회수율로 5배의 추가 정제를 수득했다. 최종 제조물은 SDS-PAGE에 의해 고도로 순수해지며(도 13) (21.3kDa의 Mr을 나타냄), 토끼 항-태반 비쿠닌 102-159에 대한 면역블롯 상에서 반응하였다(도시되지 않음). N-말단 서열화(26사이클)로 잔기 +1에서 출발하는 성숙한 태반 비쿠닌에 대해 예측된 서열(도 4F)을 수득했으며, 이는 신호 펩티드가 Sf9 세포에서 정확하게 프로세싱됨을 나타냈다.
Sf9 세포로부터의 정제된 태반 비쿠닌(100pmol)을 피리미딜에틸알킬화시키고, CNBr 소화시킨 다음, 생성되는 단편의 재용해 없이 서열화하였다. 20 사이클 동안 서열화하여 하기의 N-말단을 수득하였다:
이렇게 하여 예측된 각각의 4개의 단편에 상응하는 N-말단을 회복하였다. 이것은 Sf9 발현된 단백질이 태반 비쿠닌(1-170)의 온전한 엑토도메인 서열을 함유함을 확인시켰다. 소화되지 않은 태반 비쿠닌(1-170)의 N-말단 서열화(50 사이클)는 30 사이클 째에 PTH-아미노산(PTH-아스파라긴이 예측됨)이 결핍된 아미노산 서열을 생성시켰다. 유사한 결과가 사람 태반으로부터의 천연 단백질을 서열화(실시예 7)한 경우에 수득되었고, 이는 이 아스파라긴 잔기를 둘러싸는 아미노산 서열로부터 예측된 바와 같이 이 잔기가 글리코실화되는 것과 일치했다. 또한, 이러한 영역 내의 시스테인 잔기는 또한 이황화물 결합 에서의 이들의 침전과 일관되게 사일런트 하였다.
실시예 10
Sf9 세포로부터 유도된 정제된 태반 비쿠닌의 억제 특이성.
재조합 비쿠닌의 체외 특이성을 실시예 3, 4 및 7에 기술된 바와 같은 재료 및 방법을 사용하여 결정하였다. 또한, 비쿠닌에 의한 사람 조직 칼리크레인의 억제는 50mM Tris(pH 9.0), 50mM NaCl 및 0.01% 트리톤 x-100을 함유하는 완충액 중에서 0.35nM의 사람 조직 칼리크레인 재조합 비쿠닌을 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 37℃에서 5분 후에, 5㎕의 2mM PFR-AMC를 첨가하고, 형광도의 변화를 모니터링하였다.
조직 플라스미노겐 활성물질(tPA)의 저해는 또한 다음과 같이 결정하였다: tPA(시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co, St Louis, MO)으로부터의 사람 흑색종으로부터의 단일 사슬 형태)를 150mM NaCl 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 7.2) 중에서 실온에서 2시간 동안 저해제와 함께 예비인큐베이션시켰다. 이어서 반응을 하기의 개시 성분 농도를 포함하는 반응 시스템으로 이동시킴으로써 개시시켰다: tPA(7.5nM), 0 내지 6.6μM의 저해제, 0.004%(v/v) 트리톤 x-100 및 0.005%(v/v) 나트륨 아지드를 함유하는 28mM Tris 완충액(pH 8.5) 중의 DIle-Lpro-p니트로아닐린(1mM). p-니트로아닐린의 생성을 2시간 동안 37℃로 인큐베이션시킨 후에 A405nm로부터 결정했다.
하기의 표는 체외에서의 다양한 세린 프로테아제의 저해제로서 재조합 비쿠닌의 효능을 나타냈다. 데이터는 재조합 비쿠닌 또는 아프로티닌을 사용하는 스크리닝 저해에 대해 수득한 데이터와 비교 제시되었다.
재조합 태반 비쿠닌(1-170) 또는 아프로티닌에 의한 다양한 프로테아제의 저해에 대한 Ki 값의 비교
프로테아제(농도) 재조합 비쿠닌 Ki(nM) 아프로티닌 Ki(nM)
트립신 (48.5pM) 0.064 0.8
사람 태반 칼리크레인(2.5nM) 0.18 19.0
사람 조직 칼리크레인(0.35nM) 0.04 0.004
소과동물 췌장 칼리크레인(100pM) 0.12 0.02
사람 플라스민(50pM) 0.23 1.3
인자 Xa(0.87nM) 180 5% 억제(31μM에서)
인자 XIa(0.1nM) 3.0 288
조직 플라스미노겐 활성물질(7.5nM) <60 억제 없음(6.6μM에서)
조직 인자 VIIa 800 억제 없음(1μM에서)
결과는 재조합 비쿠닌이 곤충 세포에서 발현되어 5가지 이상의 상이한 세린 프로테아제 저해제에 대하여 유효한 활성 프로테아제 저해제를 생성시킬 수 있음을 나타낸다. 재조합 비쿠닌은 사람 혈장 칼리크레인, 트립신, 및 플라스민에 대하여아프로티닌 보다 더 효능이 있었다. 놀랍게도, 재조합 비쿠닌은 시험된 모든 효소에 대하여 합성적으로 유도된 비쿠닌 단편(7-64) 및 (102-159) 보다 더 효능이 있었다. 이들 데이터는 제조합 비쿠닌이 체외 검정법을 사용하는 경우 아프로티닌 보다 더 유효하여, 체내 효능도 더 나을 것이라고 예측됨을 나타냈다.
특정 프로테아제에 대한 효능을 측정하는 것 이외에, 활성화된 부분적 트롬보플라스틴시간(APTT)을 연장시키는 태반 비쿠닌(1-170)의 기능을 평가하였고, 아프로티닌과 관련된 활성과 비교하였다. 저해제를 150mM NaCl 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 20mM Tris 완충액(pH 7.2) 중에서 희석하고, MLA 엘렉트라(ElectraR) 800 오토매틱 응고 타이머 응고계(Automatic Coagulation Timer coagulator)(Medical Laboratory Automation, Inc., Pleasantville, N.Y.) 내에 함유된 쿠베트에 첨가하였다. 기구를 300초 활성화 시간 및 반복 모드를 갖는 APTT 모드로 설정하였다. 0.1ml의 혈장(스페셜티 어세이드 레퍼런스 플라스마 롯(Specialty Assayed Reference Plasma lot) 1-6-5185, Helena Laboratories, Beaumont, TX), APTT 시약(Automated APTT-lot 102345, 오르가논 테크니카 코포레이션(Organon Teknika Corp., Durhan, NC)로부터 구입됨) 및 25mM CaCl2을 응고를 개시시키기 위해 자동 분산시키고, 응고 시간을 자동 모니터링하였다. 결과(도 14)는 응고 시간이 2배가 되는데 약 2μM 최종 아프로티닌이 필요한 반면에, Sf9 유도된 태반 비쿠닌은 단지 0.3μM이 필요함을 나타냈다. 이들 데이터는 태반 비쿠닌이 유효한 항응고제이며, 응고의 본래 경로의 병리학적 활성화를 포함하는 질병에 대한 약제로서 유용함을 나타냈다. 본 발명의 특정 구체예가 예시를 위해 상세히 기술되었지만, 당업 분야의 숙련자에게는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 기재된 방법 및 제형이 변형될 수 있음이 용이하게 자명해질 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한될 뿐이다.

Claims (9)

  1. 각각 하기의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 물질들로 구성된 단백질 군으로부터 선택되며, 세린 프로테아제 저해 활성을 갖는 정제된 단백질로서, 상기 서열의 아미노산은 신호 펩티드의 제거에 의해 생성되는 N-말단 잔기가 잔기 1로서 표시되는 도 4F에 도시된 천연 사람 태반 비쿠닌의 아미노산 서열에 따라 번호화된 단백질:
  2. 제 1항에 있어서, 단백질이 글리코실화되거나, 하나 이상의 사슬간 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 함유하거나, 글리코실화되고 하나 이상의 사슬간 시스테인-시스테인 이황화물 결합을 함유함을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 세린 프로테아제 활성을 저해하기 위한 약제학적 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질을 코딩하고 발현시킬 수 있는 핵산 서열을 함유하는 자기복제성 단백질 발현 벡터.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질을 포함하는, 뇌 부종, 척수 부종, 다발성 경화증, 국소빈혈, 수술기주위의 혈액 손실, 패혈증, 패혈증성 쇼크, 섬유증, 병리학적 혈액 응고 또는 엉김과 관련된 질병, 폴리트라우마, 졸중, 뇌 또는 지주막하 출혈, 뇌염, 척수염, 뇌 감염, 뇌 육아종증, 척수 감염, 척수 육아종증, 심장 절개 수술, 위암, 경부암의 치료용, 또는 전이 장애의 치료용 약제 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 뇌 부종, 척수 부종, 다발성 경화증, 국소빈혈, 수술기주위의 혈액 손실, 패혈증, 패혈증성 쇼크, 섬유증, 병리학적 혈액 응고 또는 엉김과 관련된 질병, 졸중, 뇌 또는 지주막하 출혈, 뇌염, 척수염, 뇌 감염, 뇌 육아종증, 척수 감염, 척수 육아종증의 치료용, 또는 심장 절개 수술용임을 특징으로 하는 약제 조성물.
  8. 제 6항에 있어서, 위암, 경부암, 또는 전이 장애의 치료용임을 특징으로 하는 약제 조성물.
  9. 재조합 DNA 기술을 이용하여 제 1항 또는 제 2항에 따른 단백질을 제조하는 방법.
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