DE69735996T2 - Menschlicher bikunin - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung betreffen das Gebiet der Proteine, welche die Serin-Protease-Aktivität inhibieren. Die Erfindung betrifft auch das Gebiet der Nukleinsäure-Konstrukte, Vektoren und Wirtszellen für das Herstellen von Serin-Protease inhibierenden Proteinen, das Protein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen, und Verfahren für deren Verwendung.
  • Stand der Technik
  • Angesprochenes Problem
  • Blutverlust ist eine ernsthafte Komplikation bei größeren Operationen, wie Operationen am offenen Herzen und anderen komplizierten Operationen. Auf Kardiochirurgie-Patienten entfällt ein signifikanter Anteil des transfusionierten Donatorbluts. Die Bluttransfusion trägt die Risiken der Krankheitsübertragung und unerwünschter Reaktionen. Zusätzlich ist Donatorblut teuer und die Nachfrage übersteigt oft das Angebot. Pharmakologische Verfahren für das Reduzieren des Blutverlustes und der resultierende Bedarf für die Transfusion sind beschrieben worden (besprochen von Scott et al., Ann. Thorac. Surg. 50: 843–851, 1990).
  • Protein Serin-Protease-Inhibitoren
  • Aprotinin, ein boviner Serin-Protease Inhibitor der Kunitz-Familie, ist der aktive Wirkstoff des Medikaments Trasylol®. Es ist berichtet worden, dass Aprotinin (Trasylol®) beim Verringern des perioperativen Blutverlustes wirksam ist (Royston et al., Lancet ii: 1289–1291, 1987; Dietrich et al., Thorac. Cardiavasc. Surg. 37: 92–98, 1989; Fraedrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 89–91, 1989); W. van Oeveren et al. (1987), Ann Thorac Surg. 44, S. 640–645; Bistrup et al., (1988) Lancet I, 366–367), aber es sind unerwünschte Wirkungen, einschließlich Hypotension und Erröten (Bohrer et al., Anesthesia 45: 853–854, 1990) und allergische Reaktionen (Dietrich et al., supra) berichtet worden. Die Verwendung von Aprotinin in Patienten, die früher diesem ausgesetzt waren, ist nicht empfohlen (Dietrich et al., Supra). Trasylol® ist für die Behandlung von hyperfibrinolytischer Hämorrhagie und traumatischem hämorrhagischen Schock verwendet worden.
  • Aprotinin ist bekannt, mehrere Serin-Proteasen, einschließlich Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und Kallikrein zu inhibieren, und wird bei der Behandlung von akuter Pankreatitis, verschiedenen Stadien des Schocksyndroms, hyperfibrinolytischer Hämorrhagie und Myokardinfarkt therapeutisch verwendet (Trapnell et al., (1974) Brit J. Surg. 61:177; J. McMichan et al., (1982) Circulatory Shock 9:107; Auer et al., (1979) Acta Neurochir. 49:207; Sher (1977) Am J. Obstet. Gynecol. 129:164; Schneider (1976), Artzneim.-Firsch. 26: 1606). Es wird im Allgemeinen angenommen, dass Trasylol® den Blutverlust in vivo durch die Inhibierung von Kallikrein und Plasmin reduziert. Es ist festgestellt worden, dass Aprotinin (3–58, Arg 15, Ala 17, Ser 42) eine verbesserte Plasma-Kallikrein inhibitorische Wirksamkeit im Vergleich zu nativen Aprotinin selbst, zeigt (WO 89/10374).
  • Probleme mit Aprotinin
  • Da Aprotinin bovinen Ursprungs ist, gibt es ein begrenztes Risiko in menschlichen Patienten eine Anaphylaxie bei Reexposition zu diesem Arzneimittel auszulösen. Somit wäre ein humanes funktionelles Aquivalent zu Aprotinin, aufgrund des geringeren Risikos der Anaphylaxie, äußerst nützlich und wünschenswert zu haben.
  • Aprotinin ist auch in Nagetieren und Hunden nephrotoxisch, wenn es wiederholt bei hoher Dosis verabreicht wird (Bayer, Trasylol®, Inhibitor of Proteinase; Glaser et al., in „Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, München, 1972, S. 1612–1614). Eine Hypothese schreibt diese Wirkung der Akkumulation von Aprotinin in den negativ-geladenen proximalen Tubuli der Niere zu, aufgrund seiner hohen positiven Nettoladung (WO 93/14120).
  • Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung menschliche Proteine mit einer zu Aprotinin ähnlich funktionellen Aktivität zu identifizieren. Es war auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung humane Proteine zu identifizieren, die weniger geladen wären, dennoch die gleiche, eine sehr ähnliche, oder eine verbesserte Protease-Spezifitäten wie für Aprotinin gefunden wird, zeigen, insbesondere hinsichtlich der Wirksamkeit der Plasmin und Kallikrein-Inhibierung. Solche Inhibitioren könnten dann wiederholt als Medikamente in menschlichen Patienten mit verringertem Risiko von unerwünschten Immunreaktionen und reduzierter Nephrotoxizität verwendet werden.
  • Obwohl ein Protein mit inhibitorischer Aktiviät auf die Protease-Aktivität von Leberzellen-Wachstumfaktor-Aktivator in EP-A-0758682 offenbart wurde, ist die darin offenbarte Nukleotidsequenz mit der in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Sequenzen nicht identisch. Die in EP-A-0758682 offenbarten Sequenzen sind größer als die beanspruchten Sequenzen der vorliegenden Erfindung.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht einen gereinigten menschlichen Serin-Protease Inhibitor vor, welcher spezifisch Kallikrein inhibieren kann, welches aus menschlichem Plazenta-Gewebe mittels Affinitätchromatographie isoliert wurde.
  • Die vorliegen Erfindung stellt ein neu-identifiziertes menschliches Protein bereit, hierin menschliches plazentales Bikunin genannt, welches zwei Serin-Protease Inhibitordomänen der Kunitz-Klasse enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Proteine, pharmazeutische Zusammensetzungen, Nukleinsäuren, Vektoren, Verfahren und Verwendungen bereit, wie in den Ansprüchen dargelegt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein natives menschliches plazentales Bikunin-Protein vor, welches die Aminosäuresequenz aufweist:
    Figure 00030001
    oder
  • Figure 00030002
  • In einem Aspekt ist die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung, dass es an Trypsin, humane Plasma- und Gewebe Kallikreine, humanes Plasmin und Faktor XIIa binden, und deren biologische Aktivität inhibieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein natives humanes plazentales Bikunin-Protein in glycosylierter Form vor. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung natives humanes Bikunin-Protein, welches so gebildet wurde, dass es zumindest eine Cystein-Cystein-Disulfidbindung enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Protein zumindest eine intraketten Cystein-Cystein-Disulfidbindung, die zwischen einem Paar von Cysteinen gebildet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CY11-CYS61, CYS20-CYS44, CY36- CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139, und CYS131-CYS152, wobei die Cysteine entsprechend der Aminosäuresequenz des nativen humanen plazentalen Bikunins nummeriert sind. Der Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass das Protein der vorliegenden Erfindung in die richtige drei-dimensionale Konformation falten kann, so dass die biologische Aktivität des nativen humanen Bikunin aufrechterhalten wird, wo keine, eine oder mehrere, oder alle der nativen intraketten Cystein-Cystein-Disulfidbindungen vorhanden sind. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist das Protein der vorliegenden Erfindung richtig gefalten und ist mit allen der richtigen nativen Cystein-Cystein-Disulfidbindungen gebildet.
  • Ein aktives Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Reinigung aus menschlichem Gewebe, wie Plazenta, oder über synthetische Proteinchemie-Techniken, wie durch die Beispiele unten illustriert ist, erhalten werden. Es ist auch verständlich, dass das Protein der vorliegenden Erfindung unter Verwendung molekular-biologischer Techniken erhalten werden kann, wo selbst-replizierende Vektoren in der Lage sind, das Protein der vorliegenden Erfindung in transformierten Zellen zu exprimieren. Ein solches Protein kann als nicht-sezernierende, oder sezernierende Formen von transformierten Zellen hergestellt werden. Um die Sekretion aus transformierten Zellen zu fördern, um die funktionelle Stabilität des translatierten Proteins zu erhöhen, oder um die Faltung des Bikunin-Proteins zu unterstützen, können bestimmte Signalpeptid-Sequenzen dem NH2-terminal Abschnitt des nativen humanen Bikunin-Proteins hinzugefügt werden.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung somit das native humane Bikunin-Protein mit zumindest einem intakten Abschnitt der nativen Signalpeptid-Sequenz bereit. Somit stellt eine Ausführungsform der Erfindung ein natives humanes Bikunin bereit, welches zumindest einen Teil des Signalpeptids aufweist, mit der Aminosäuresequenz:
    Figure 00040001
  • In einem hierin verwendeten, bevorzugten Nummerierungssystem wird die mit +1 nummerierte Aminosäure dem NH2-Terminus der Aminosäuresequenz des nativen humanen plazentalem Bikunin zugewiesen. Man wird leicht erkennen, dass funktionelle Proteinfragmente von nativem humanen plazentalen Bikunin abgeleitet werden können, welche zumindest teilweise die biologische Aktivität von nativem menschlichem plazentalen Bikunin beibehalten und als Serin-Protein-Inhibitoren wirken.
  • In einer Ausführungsform weist das Protein der vorliegenden Erfindung ein Fragment des nativen humanen plazentalen Bikunins auf, welches zumindest eine funktionelle Kunitz-artige Domäne enthält, die die Aminosäuresequenz der nativen humanen plazentalen Bikunin-Aminosäuren 7–159 aufweist, nachstehend „Bikunin (7–159)" genannt. Somit enthält die vorliegende Erfindung ein Protein mit der Aminosäure-Sequenz:
    Figure 00050001
    wo die Aminosäure-Nummerierung der Aminosäure-Sequenz des nativen humanen plazentalen Bikunins entspricht. Eine andere funktionelle Variante dieser Ausführungsform kann das Fragment des nativen humanen plazentalen Bikunins sein, welches zumindest eine funktionelle Kunitz-artige Domäne enthält, die die Aminosäure-Sequenz von nativem humanen plazentalen Bikunin Aminosäuren 11–156 aufweist, Bikunin (11–156):
    Figure 00050002
  • Man kann erkennen, dass die einzelnen Kunitz-artigen Domänen ebenfalls Fragmente des nativen plazentalen Bikunins sind.
  • Der Durchschnittsfachman wird erkennen, dass Fragmente des nativen humanen Bikunin-Proteins hergestellt werden können, die zumindest einen Teil der biologischen Aktivität des nativen Proteins beibehalten. Solche Fragmente können auch in unterschiedlicher Orientierung, oder mehrere Kombinationen kombiniert werden, um alternative Proteine, welche einen Teil der die gleiche, oder eine höhere biologische Aktivität des nativen humanen Bikunin-Proteins beibehalten.
  • Man wird leicht erkennen, dass biologisch aktives Protein der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der vorliegenden Kunitz-artigen Domänen in Kombination mit zusätzlichen Kunitz-artigen Domänen aus anderen Quellen aufweisen kann. Biologisch aktives Protein der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere der vorliegenden Kunitz-artigen Domänen in Kombination mit zusätzlichen Proteindomänen aus anderen Quellen mit einer Vielzahl von biologischen Aktivitäten aufweisen. Die biologische Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung kann mit der von einem anderen bekannten Protein oder Proteinen kombiniert werden, um multifunktionelle Fusionsproteinen mit voraussagbarer biologischer Aktivität bereitzustellen.
  • In einer Ausführungsform, stellt die vorliegende Erfindung im Wesentlichen gereinigtes, oder rekombinant hergestelltes natives humanes Bikunin-Protein mit einem intakten Abschnitt der Leitsequenz, und zumindest einem intakten Abschnitt der nativen Transmembranregion bereit. Somit bietet eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung natives humanes Bikunin mit einer intakten Leitsequenz und mit zumindest einem Teil der Transmembran-Domäne (unterstrichen) bereit, welches eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus:
    Figure 00060001
    wobei Sequenz 1) EST abgeleitete Konsensus SEQ ID Nr: 45 ist, 2) PCR Klon SEQ ID Nr:47 ist, 3) Lambda cDNA Klon SEQ ID Nr: 49 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein Protein der vorliegenden Erfindung eine der Aminosäure-Sequenz der SEQ ID Nr: 45, 47 oder 49 auf, wobei das Protein in der Region zwischen dem Ende der letzten Kunitz-Domäne und der Transmembranregion gespalten wurde.
  • Die Protein-Aminosäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung lehren einen Fachmann eindeutig die dazugehörigen Nukleinsäuresequenzen, die in molekular-biologischen Techniken verwendet werden können, um die Protein der vorliegenden Erfindung herzustellen. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Konsensus Nukleinsäure-Sequenz der 4C (SEQ ID Nr: 51) bereit, welche eine Aminosäure-Sequenz der 4D (SEQ ID Nr. 45) kodiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure-Sequenz bereit, die natives humanes plazentales Bikunin mit der DNA Sequenz der 4F (SEQ ID Nr: 48) kodiert, welche die Protein-Sequenz der SEQ ID Nr: 49 kodiert. In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure-Sequenz der 4E (SEQ ID Nr: 46) bereit, welche eine Proteinsequenz der SEQ ID Nr: 47 kodiert.
  • Man kann leicht erkennen, dass bestimmte allelische Mutationen, und in der Nukleinsäure-Sequenz gemachte konservative Substitutionen durchgeführt werden können, die nach wie vor zu einer Protein-Aminosäure-Sequenz führen, die durch die vorliegende Erfindung umfasst ist. Der Fachmann wird erkennen, dass bestimmte natürliche allelische Mutationen des Proteins der vorliegenden Erfindung, und konservative Substitutionen von Aminosäuren im Protein der vorliegenden Erfindung die biologische Aktivität des Proteins nicht signifikant verändern wird, und durch die vorliegende Erfindung umfasst sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die humanes plazentales Bikunin und Fragmente davon enthalten, die für die Reduktion des perioperativen Blutverlustes in einem, sich einer Operation unterziehenden, Patienten nützlich sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen für das Verringern des perioperativen Blutverlustes in einem, sich einer Operation unterziehenden, Patienten bereit, wobei eine wirksame Menge der offenbarten humanen Serin-Protease-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung in einem biologisch-kompatiblen Vehikel dem Patienten verabreicht wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Varianten des plazentalen Bikunins und der oben beschriebenen spezifischen Kunitz-Domänen bereit, die Aminosäure-Substitutionen enthalten, die die Protease-Spezifität verändern. Die bevorzugten Substitionsstellen sind unten als Positionen Xaa1 bis Xaa32 in der Aminosäure-Sequenz des nativen plazentalen Bikunins angegeben. Die Substitutionen an Xaa1 bis Xaa16 sind für Varianten von Bikunin (7–64) auch bevorzugt, während Substitutionen von Xaa17 bis Xaa32 für die Varianten von Bikunin (102–159) bevorzugt sind.
  • Der Begriff „natürlich vorkommender Aminosäurerest" ist, in dem vorliegenden Inhalt beabsichtigt, auf eine beliebige der 20 im Allgemeinen vorkommenden Aminosäuren hinzuweisen, d.h. Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val.
  • Durch Substituieren einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren der oben angegebenen Positionen, kann es möglich sein, das Inhibitor-Spezifitätsprofil des nativen plazentalen Bikunin oder das der individuellen Kunitz-artigen Domänen, des Bikunins (7–64) oder des Bikunins (102–159) zu verändern, so dass es vorzugsweise andere Serin-Proteasen inhibiert, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, die Enzyme der Komplement-Kaskade, TF/FVIIa, FXa, Thrombin, neutrophile Elastase, Cathepsin G oder Proteinase-3.
  • Zu Beispielen von bevorzugten plazentalen Bikunin-Varianten zählen jene, in welchen Xaa1 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus His, Glu, Pro, Ala, Val oder Lys, insbesondere wobei Xaa1 His oder Pro ist; oder wobei Xaa2 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala, Lys, insbesondere wobei Xaa2 Val oder Thr ist; oder wobei Xaa3 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Pro, Ile, Leu, Thr, insbesondere wobei Xaa3 Arg oder Pro ist; oder wobei Xaa4 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys und Ser, Gln, insbesondere wobei Xaa4 Arg oder Lys ist; oder wobei Xaa5 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly, Asp, Thr, insbesondere wobei Xaa5 Ala ist; oder wobei Xaa6 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe, insbesondere wobei Xaa6 Ser oder Arg ist; oder wobei Xaa7 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr und Val, insbesondere wobei Xaa7 Met oder Ile ist; oder wobei Xaa8 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Lys, Thr, Gln, Asn, Leu, Ser oder Ile, insbesondere wobei Xaa8 Pro oder Ile ist; oder wobei Xaa9 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys oder Leu, insbesondere wobei Xaa9 Arg ist; oder wobei Xaa10 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gln, Leu und Thr, insbesondere wobei Xaa10 Val ist; oder wobei Xaa11 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly, Ser und Thr, insbesondere wobei Xaa11 Gly ist; oder wobei Xaa12 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asp, Arg, Glu, Leu, Gln, Gly, insbesondere wobei Xaa12 Asp oder Arg ist; oder wobei Xaa13 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly und Ala; oder wobei Xaa14 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asn oder Lys; oder wobei Xaa15 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val und Lys, insbesondere wobei Xaa15 Leu oder Lys ist; oder wobei Xaa16 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met, und Val, insbesondere wobei Xaa16 Val oder Ala ist; oder wobei Xaa17 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus His, Glu, Pro, Ala, Lys und Val, insbesondere wobei Xaa17 Glu oder Pro ist; oder wobei Xaa18 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala oder Lys, insbesondere wobei Xaa18 Thr ist; oder wobei Xaa19 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Pro, Ile, Leu oder Thr, insbesondere wobei Xaa19 Pro ist; oder wobei Xaa20 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys, Gln und Ser, insbesondere wobei Xaa20 Arg oder Lys ist; oder wobei Xaa21 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala, Asp, Thr oder Gly; insbesondere wobei Xaa21 Ala ist; oder wobei Xaa22 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ser, Ile, Thy, Asn, Leu, Val, Arg, oder Phe, insbesondere wobei Xaa22 Ser oder Arg ist; oder wobei Xaa23 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr und Val, insbesondere wobei Xaa23 Phe oder Ile ist; oder wobei Xaa24 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro Lys, Thr, Asn, Leu, Gln, Ser oder Ile, insbesondere wobei Xaa24 Pro oder Ile ist; oder wobei Xaa25 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys oder Leu, insbesondere wobei Xaa25 Arg ist; oder wobei Xaa26 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Ile, Lys, Leu, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp und Thr, insbesondere wobei Xaa26 Val oder Ile ist; oder wobei Xaa27 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly, Ser und Thr, insbesondere wobei Xaa27 Gly ist; oder wobei Xaa28 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asp, Arg, Glu, Leu, Gly oder Gln; insbesondere wobei Xaa28 Arg ist; oder wobei Xaa29 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly und Ala; oder wobei Xaa30 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asn oder Lys; oder wobei Xaa31 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val und Lys, insbesondere wobei Xaa31 Arg oder Lys ist; oder wobei Xaa32 ein Aminosäurerest ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met und Thr, insbesondere wobei Xaa32 Gln oder Ala ist.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wird durch die Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung und Ansprüche, in Verbindung mit den Zeichnungen besser verstanden werden, wobei
  • 1 die Nukleotidsequenz von EST R35464 (SEQ ID Nr: 12) und die Translation dieser DNA Sequenz (SEQ ID Nr:13) zeigt, welche einen offenen Leserahmen mit einer gewissen Sequenzähnlichkeit zu Aprotinin ergab. Das Translationsprodukt enthält 5 der 6 Cysteine im richtigen Abstand, der für Kunitz-artige Inhibitordomänen (in fett dargestellt) kennzeichnend ist. Die durch das verbleibende Cystein normalerweise besetze Position (bei Kodon 38) enthält stattdessen ein Phenylalanin (durch Stern gekennzeichnet).
  • 2 die Nukleotidsequenz von EST R74593 (SEQ ID Nr:14), und die Translation dieser DNA Sequenz (SEQ ID Nr:15) zeigt, welche einen offenen Leserahmen mit Homologie zu der Kunitz-Klasse von Serin-Protease-Inhibitordomänen ergab. Das Translationsprodukt enthielt 6 Cysteine im richtigen Abstand, was für Kunitz-artige Inhibitordomänen (in fett dargestellt) kennzeichnend ist. Dieser offene Leserahmen enthält jedoch Stoppkodons bei Kodon 3 und 23.
  • 3 zeigt eine abgeleitete, als „Konsensus" bezeichnete, Nukleinsäure-Sequenz des humanen plazentalen Bikunins (SEQ ID Nr:9), und abgeglichen mit der als „translatiert" bezeichneten Protein-Aminosäure-Sequenz (SEQ ID Nr: 10). Ebenfalls als Vergleich sind die Nukleinsäure-Sequenz von ESTs H94519 (SEQ ID Nr: 16), N39798 (SEQ ID Nr: 17), R74593 (SEQ ID Nr: 14) und R35464 (SEQ ID Nr: 12) gezeigt. Die unterstrichenen Nukleotide in der Konsensus-Sequenz entsprechen den in den Beispielen beschriebenen PCR-Primer Stellen. Die unterstrichenen Aminosäuren in der translatierten Konsensus-Sequenz sind Reste, deren Identität durch Aminosäure-Sequenzierung von gereinigtem nativen humanen plazentalen Bikunin bestätigt wurde. Der Nukleotid- und Aminosäure-Code sind der Standart-Einbuchstabencode, „N" in dem Nukleinsäure-Code weist auf eine unbestimmte Nukleinsäure hin, und „*" weist auf ein Stoppkodon in der Aminosäure-Sequenz hin.
  • 4A zeigt die ursprüngliche Überlappung einer Reihe von ESTs mit einer gewissen Nukleinsäure-Sequenzhomologie zu ESTs, die humanes plazentales Bikunin, oder Abschnitte davon kodieren. Für Vergleichszwecke sind die relativen Abschnitte von Bikunin (7–64) und Bikunin (102–159), die als KID1 bzw. KID2 bezeichnet sind, gezeigt.
  • 4B zeigt eine nachfolgende umfassendere EST Überlappung, die zusätzliche ESTs einbezieht. Die Zahlen auf der oberen X-Achse beziehen sich auf die Länge in Basenpaaren, beginnend mit der ersten Base von den meisten 5'EST-Sequenzen. Die Länge jedes Balkens ist in Proportion zu der Länge in Basenpaaren der individuellen ESTs, einschließlich von Spalten. Die EST Zugangsnummer sind rechts von ihren entsprechenden EST-Balken angegeben.
  • 4C zeigt die entsprechende Ausrichtung der Oligonukleotid-Sequenzen jeder der in 4B schematisch gezeigten überlappenden ESTs. Die obere, als Bikunin bezeichnete, Sequenz (SEQ ID Nr: 51) stellt die Konsensus Oligonukleotid-Sequenz dar, die von den überlappenden Nukleotide an jeder Position abgeleitet ist. Die Zahlen beziehen sich auf die Basenpaar-Position innerhalb der EST-Karte. Die Oligonukleotide in EST R74593, die fett unterstrichen sind (bei Kartenpositionen 994 und 1005) sind Basen-Insertionen, die in R74593 beobachtet werden, die in jeder der anderen überlappenden ESTs konsistent abwesend waren.
  • 4D zeigt die Aminosäure-Translation der Konsensus-Oligonukleotid-Sequenz für Bikunin, die in 4C gezeigt ist (SEQ ID Nr: 45).
  • 4E zeigt die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr: 46) und die entsprechende Aminosäure-Translation (SEQ ID Nr: 47) einer plazentales Bikunin kodierender Sequenz, die von einer humanen plazentalen cDNA-Bibliothek durch PCR-basierende Amplifikation abgeleitet wurde.
  • 4F zeigt die Nukleotid-Sequenz (SEQ ID Nr: 48) und die entsprechende Aminosäure-Translation (SEQ ID Nr: 49) eines humanen plazentalen Bikunin kodierenden Klons, der von einer humanen plazentalen-lambda-cDNA-Bibliothek durch Kolonie-Hybridisierung isoliert wurde.
  • 4G vergleicht die Ausrichtung der Aminosäure translatierten Oligonukleotid-Sequenzen für plazentales Bikunin, welches durch EST-Überlappung (SEQ ID Nr: 48), PCR-basierende Klonierung (SEQ ID Nr: 47), und konventionelle Lambda-Kolonie-Hybridisierung (SEQ ID Nr: 49) erhalten wurde.
  • 5 zeigt ein Diagramm der Reinigung von humanem plazentalem Bikunin aus plazentalem Gewebe nach Superdex 75 Gel-Filtration. Das Diagramm ist eine Überlappung des bei OD 280 nm gemessenen Protein-Elutionsprofils (durchgezogene Linie), der Aktivität des eluierten Proteins in einer Trypsin-Inhibierungsuntersuchung (% Inhibierung, gezeigt durch Kreise), und der Aktivität des eluierten Proteins in einer Kallikrein-Inhibierungsuntersuchung (% Inhibierung, gezeigt durch Quadrate).
  • 6 zeigt ein Digramm, welches die Reinigung des humanen plazentalen Bikunins aus plazentalmen Gewebe unter Verwendung der C18-Umkehrphasen-Chromatographie graphisch darstellt. Das Diagramm ist eine Überlagerung des bei OD 215 nm gemessenen Protein-Elutionsprofils (durchgezogene Linie), der Aktivität des eluierten Proteins in einer Trypsin-Inhibierungsuntersuchung (% Inhibierung, gezeigt durch Kreise), und der Aktivität des eluierten Proteins in einer Kallikrein-Inhibierungsuntersuchung (% Inhibierung, gezeigt durch Quadrate).
  • 7 zeigt ein Silber-gefärbtes SDS-PAGE Gel von hochgereinigtem plazentalem Bikunin (Bahn 2), und eine Reihe molekularer Größenmarkerproteine (Bahn 1) der angegebenen Größen in Kilodaltons. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten.
  • 8 zeigt die Menge an Trypsin-inhibierender Aktivität, die in der zellfreien Fermentationsbrühe von dem Wachstum der Hefestämme SC101 (Feld 8A) oder WHL341 (Feld 8B) vorhanden ist, die mit einem Plasmid (pS604) stabil transformiert wurden, das die Expression von plazentalem Bikunin (102–159) leitet.
  • 9 zeigt sowohl eine Silber-gefärbte SDS-PAGE (linkes Feld) als auch einen Western Blot mit anti-plazentalem Bikunin (102–159) pAb (rechtes Feld) einer zellfreien Fermentationsbrühe von dem Wachstum des Hefestamms SC101 (Rekombinante 2.4 und 2.5), der mit einem Plasmid, welches die Expression von entweder bovinem Aprotinin, oder plazentalem Bikunin (102–159) leitet, stabil transformiert wurde. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten.
  • 10 ist eine Photographie, die eine Silber-gefärbte SDS-PAGE von hochgereinigtem plazentalem Bikunin (102–159) (Bahn 2), und eine Reihe molekularer Größenmarkerproteine (Bahn 1) der angegebenen Größen in Kilodaltons zeigt. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten.
  • 11 ist eine Photographie, die die Ergebnisse von Northern Blots von mRNA aus verschiedenen menschlichen Geweben zeigt, die mit 32P markierten cDNA-Sonden hybridisiert wurden, die entweder plazentales Bikunin (102–159) (Feld 11A) oder plazentales Bikunin (1–213) (Feld 11B) kodieren. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten. Die Nummern rechts von jedem Blot beziehen sich auf die Größe in Kilobasen des benachbarten RNA Markers. Die Organe aus welchen die mRNA abgeleitet wurde, ist unter jeder Bahn des Blots beschrieben.
  • 12 zeigt ein Immunoblot von plazental-stammendem plazentalem Bikunin mit Kaninchen Antiserum, welches entweder gegen synthetisches reduziertes plazentales Bikunin (7–64) (Feld A) oder 120–159 (Feld B) gezüchtet wurde. Für jedes Feld waren die Inhalte: molekulare Größenmarker (Bahnen 1); aus humaner Plazenta isoliertes natives plazentales Bikunin (Bahnen 2), synthetisches plazentales Bikunin (7–64) (Bahnen 3) und synthetisches plazentales Bikunin (102–159) (Bahnen 4). Tricin 10–20% SDS-PAGE-Gels wurden geblottet und mit Protein A- gereinigtem primären polyklonalem Antikörper (8 ug IgG in 20 ml 0,1 % BSA/Tris-gepufferte Salzlösung (pH 7,5), gefolgt von alkalische Phosphatase-konjugierter Ziege Anti-Kaninchen sekundärem Antikörper entwickelt. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten.
  • 13 zeigt ein Coomassie Blue gefärbtes 10–20% Tricin SDS-PAGE-Gel von 3 Mikrogramm von hochgereinigtem plazentalem Bikunin (1–170), welches von einem Baculovirus/Sf9 Expressionssystem abgeleitet ist (Bahn 2). Bahn 1 enthält molekulare Größenmarker. Die Wanderung erfolgte von oben nach unten.
  • 14 zeigt einen Vergleich der Wirkung des Erhöhens der Konzentrationen von entweder Sf9-abgeleitetem humanem plazentalem Bikunin (1–170) (volle Kreise), synthetischem plazentalem Bikunin (102–159 (offene Kreise), oder Aprotinin (offene Quadrate) auf die aktivierte partielle Thromoplastinzeit von menschlichem Plasma. Die Gerinnung wurde mit CaCl2 ausgelöst. Die Konzentration von Proteinen wurde gegen die vielfache Verlängerung der Gerinnungszeit graphisch dargestellt. Die nicht-inhibierte Gerinnungszeit war 30,8 Sekunden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein neu-identifiziertes humanes Protein, welches hierin als humanes plazentales Bikunin bezeichnet wird, welches zwei Serin-Protease Inhibitor-Domänen der Kunitz-Klasse enthält. Die vorliegende Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die plazentales Bikunin und Fragmente davon enthalten, die für die Reduktion des perioperativen Blutverlustes in einem Patienten nützlich sind, der sich einer Operation unterzieht oder eine schwere Verletzung aufweist.
  • Eine bevorzugte Anwendung für plazentales Bikunin, isolierter Domänen, und anderer Variationen ist die Reduktion von Blutverlust, der von einer Verletzung oder Operation herrührt, die ein Verlustpotential von großen Blutvolumina haben. Diese Verfahren oder Zusammensetzungen reduzieren oder eliminieren den Bedarf an Donator-Vollblut oder an Blutprodukten, wodurch das Risiko von Infektionen und anderer unerwünschter Nebenwirkung, sowie die Operationskosten verringert werden. Die Proteine sind folglich für das Reduzieren des Blutverlustes in normalen Patienten nützlich, d.h. jene die nicht an angeborenen oder präoperativen Mängeln an Koagulationsfaktoren leiden. Die Reduktion des Blutverlustes kann als eine Reduktion des Blutverlustes während der Operation, als verringerte postoperative Drainage oder beides gesehen werden. Zu bevorzugten Verwendungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Verwendungen in Brust- und abdominalen Operationen, gesamte oder teilweise Hüftersatz-Operationen und Operationen, um einen Patient mit einer epithelialen Läsion des Auges zu behandeln. Zu bevorzugten thorakalen Verwendungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, aortokoronarer Venen-Bypass oder kardiales oder aortisches Aneurysma, Operation von Ösophagusvarizen, und aortokoronarer Bypass-Operation. Zu bevorzugten abdominale Verwendungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lebertransplantationen, radikale Prostatektomie, Divertikulitis des Kolons, Tumor-Debulking, an der abdominalen Aorta und Zwölffingerdarmgeschwür, und Wiederherstellung einer Leber- oder Milzverletzung. Zu bevorzugten Verwendungen für die Behandlung einer Verletzung zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung bei der Stabilisierung von schwerverletzten Patienten an der Unfallstelle, die z.B. an Gliedverlust oder schweren thorakalen/abdominalen Wunden leiden. Im Falle der Verwendung für die Reduktion des von der Operation resultierenden Blutverlustes wird es bevorzugt das plazentale Bikunin, die isolierten Domänen oder andere Varianten vor und während der Operation zu verabreichen, wohingegen im Falle der Verwendung bei Verletzungen die plazentale Bikunin-Variante, die isolierten Domänen oder andere Varianten so schnell wie möglich im Anschluss an die Verletzung verabreicht werden soll, und sollte in Notfallfahrzeugen, welche zu der Unfallstelle fahren, enthalten sein.
  • Faktor XII (auch als Hageman Faktor bekannt) ist eine Serin-Protease, die im Blutkreislauf in einer Zymogen-Form (80 kD) bei etwa 29–40 μg/ml gefunden wird (siehe Pixley, et al. (1993) Meth in Enz., 222, 51–54) und wird durch Gewebe und Plasma-Kallikrein aktiviert. Nach der Aktivierung beteiligt es sich an der intrinsischen Blutgerinnungskaskade, welche aktiviert wird, wenn Blut oder Plasma mit einer „fremden" oder anionischen Oberfläche in Kontakt tritt. Nach der Aktivierung, kann Faktor XIIa etliche andere Plasma-Proteasen spalten und aktivieren, einschließlich Faktor XI, Präkallikrein und C1 des Komplementsystems. Folglich kann Faktor XII beim Verursachen von hypotensiven Reaktionen eingebunden sein, da aktiviertes Kallikrein Kininogen spalten kann, dadurch wird Bradykinin freigesetzt (siehe Colman, (1984) J. Clin. Invest., 73, 1249).
  • Sepsis ist eine Krankheit, die von einer bakteriellen Infektion aufgrund von bakteriellem Endotoxin oder Lipopolysaccharid (LPS) herrührt. Die Exposition von Faktor XII zu LPS führt zu der Aktivierung von Faktor XII. Patienten mit Sepsis zeigen häufig Symptome der intravaskulären Gerinnung, welche auch aufgrund der Aktivierung von Faktor XII durch LPS sein kann. Septischer Schock kann von einer bakteriellen Infektion herrühren und ist mit Fieber, einem niederen systemischen Gefäßwiderstand, und einem niederen arteriellen Druck assoziiert. Es ist eine häufige Todesursache auf Intensivstationen in den Vereinigten Staaten, wo fünfundsiebzig Prozent der Patienten, die an septischem Schock sterben, eine durchgehende Hypotonie aufweisen (siehe Parillo, et al. (1989 Ann Rev. Med., 40, 469–485).
  • Atemnotsyndrom der Erwachsenen ist durch Lungenödem, Hypoxämie und verringerter Lungencompliance gekennzeichnet. Die Pathogenese der Krankheit ist derzeit unbekannt, trotzdem wird vermutet, dass proteolytische Gerinnungswege und Fibrinolyse eine Rolle spielen (siehe Carvalho et al., (1988) J. Lab Clin. Med., 112; 270–277).
  • Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind auch ein neuartiger humaner Kunitz-artiger Inhibitor von Kallikrein, einem Aktivator von Faktor XII. Somit wird ein auch ein Verfahren für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung von systemischen entzündlichen Reaktionen wie septischer Schock, Atemnotsyndrom der Erwachsenen (ARDS), Präeklampsie, mehrfaches Organversagen, und disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) beschrieben. Die therapeutische oder prophylaktische Verabreichung der Peptide der vorliegenden Erfindung würde zu der Modulation dieser entzündlichen Zustände führen und würde für den Patienten von Vorteil sein.
  • Plasmin spielt eine wichtige Rolle in der extrazellulären Matrixdegradation und der Aktivierung von Matix-Metalloprotease (MMP)-Kaskaden. Insgesamt vermitteln diese Proteasen die Migration und die Gewebsinvasion von sowohl Endothelzellen während der Aniogenese/Neovaskularisation, und Krebszellen während der Metastasierung. Die Neovaskularisation ist essentiell, um das Tumorwachstum zu unterstützen und die Metastasierung ist ein Vorgang, welcher die Verbreitung der Tumore vermittelt und welches mit einer extrem-schlechten Patientenprognose verbunden ist.
  • Mehrere präklinische Studien weisen darauf hin, dass Kunitz-artige Serin-Protease-Inhibitoren mit einer Protease-Spezifität ähnlich zu Aprotinin als Medikamente für Krebs nützlich sind. Zum Beispiel reduzierte Aprotinin das Tumorwachstum und die Invasion, mit erhöhter Tumornekrose, wenn es an Hamster, die ein äußerst invasives Fibrosarcom tragen oder an Mäuse, die ein ähnlich malignes Brustkarzinom tragen, verabreicht wird (Latner et al., (1974), Br. J. Cancer 30: 60–67; Latner and Turner, (1976), Br. J. Cancer (33: 535–538). Weiters reduzierte die Verabreichung von 200.000 KIU Aprotinin i.p. an männliche C57B1/6 Cr Mäuse an den Tagen 1 bis 14 nach der Inokulation mit Lewis-Lungenkarzinom-Zellen die Lungenmetastasierung um 50%, wenngleich es keine Wirkung auf die primäre Tumormasse hatte (Giraldi et al., (1977) Eur. J. Cancer, 13: 1321–1323). Auf ähnliche Weise inhibierte die Verabreichung von 10.000 KIU i.p. an jedem der Tage 13–16 nach der Inokulation von C57BL/6J Mäusen mit Lewis Tumorzellen die Lungenmetastasierung um 90%, ohne das primäre Tumorwachstum zu beeinflussen (Uetsuji et al, (1992), Jpn. J. Surg. 22: 429–442). In derselben Studie wurde argumentiert, dass die Verabreichung von Plasmin oder Kallikrein mit dem gleichen Dosierungsplan die Anzahl der Lungenmetastasen erhöht. Diese Ergebnisse veranlassten die Autoren darauf hinzuweisen, dass die perioperative Verabreicherung von Aprotintin an Krebspatienten die Wahrscheinlichkeit der Metastasierung reduzieren kann. Black und Steger (1976, Eur. J. Pharmacol., 38: 313–319) haben festgestellt, dass Aprotinin das Wachstum des eingepflanzten Nagetier Murphy-Strum Lymphosarkoms in Ratten inhibierte und wiesen darauf hin, dass die Wirkung, an der Inhibierung des Kinin-bildenden Enzymsystems beteiligt ist. Die zweimal tägliche i.p. Injektion von weiblichen ddY Mäusen mit 10.000 KIU Aprotinin für 7 Wochen an Mäuse, von welchen jede ein einzelnes autochtones Plattenzellenkarzinom trägt, welches von einer 3-Methylcholanthren-Behandlung resultierte, reduzierte die Tumorrate des primären Tumors um 90%. Bei einigen Tieren wurde eine Tumor-Regression beobachtet. Während alle Vehikel-behandelten Tiere innerhalb sieben Wochen gestorben sind, blieben alle der Aprotinin-Behandlungsgruppe am Leben. Das verringerte Tumorwachstum war mit Hyperkerastose assoziiert (Ohkoshi, Gann (1980), 71: 246–250).
  • Klinisch zeigten eine operativ geheilte Gruppe von 26 Patienten, die Aprotinin i.v. erhielten, eine 70% Überlebensrate zwei Jahre nach der Operation mit keiner Tumorwiederkehr, wohingegen eine Placebo-Gruppe von 26 Patienten zur selben Zeit nur eine 38% Überlebensrate mit einer signifikanten Rate an Tumorwiederkehr zeigten (Freeman et al. Br. Soc. Gastroenterol (1980) Supplement A: 902). In einer Fallstudie (Guthrie et al., Br. J. Clin. Pract (1981) 35: 330–332) verursachte die Verabreichung von Bromocriptin plus Aprotinin an einen Patienten mit fortgeschrittenem Zervix-Krebs Remission. Aprotinin wurde als ein 500,000 KIU i.p. Bolus alle acht Stunden gleichzeitig mit einer kontinuierlichen i.v. Infusion von Aprotinin mit einer Rate von 200.000 KIU pro 6 Stunden für insgesamt sieben Tage, einmal im Monat verabreicht. Die Behandlung wurde am Ende des vierten Monats aufgrund der Entwicklung einer allergischen Reaktion gegen Aprotinin beendet. Jüngere Beweise haben die Rolle von Plasmin als ein Ziel für diese Wirkungen von Aprotinin auf die Metastasierung weiter unterstrichen.
  • Der Mechanismus für diese Vorgänge könnte mit der Tatsache in Verbindung stehen, dass Aprotinin das invasive Potential von Krebs-Zelllinien blockiert (Liu G., et al., Int. J. Cancer (1995, 60: 501–506). Weiters, da die Proteine der vorliegenden Erfindung auch wirksame Inhibitioren von Plasmin und Kallikrein sind, werden sie für die Verwendung als Anti-Krebs-Mittel in Erwägung gezogen. Zum Beispiel werden sie für die Verwendung beim Blockieren des primären Tumorwachstums in Erwägung gezogen, indem die Neovaskularisierung und die primäre Tumor-Invasion beschränkt wird und durch Blockieren der Metastasierung durch Inhibierung der Gewebeinfiltartion. Die Verbindungen können lokal an Tumore oder systemisch verabreicht werden. In einer bevorzugten Behandlungsart würde das Protein perioperativ während dem Tumor-Debulking verabreicht werden, um das Risiko der Metastasierung zu minimieren. Bei einem solchen Behandlungsplan würden die blutsparenden Eigenschaften der Verbindung weiters von Vorteil sein, in dem sie einen klareren Operationssehbereich bereitstellen. Eine andere bevorzugte Verabreichungsart würde als eine Kombinationstherapie mit entweder MMP Inhibitoren oder Chemotherapie sein. Eine zusätzlich bevorzugte Verabreichungsart würde als eine lokal verabreichte Gentherapie sein, die so ausgelegt ist, um eine selektive Expression von plazentalem Bikunin innerhalb der Tumorzellen, oder ihrer assoziierten Stroma und den Gefäßbetten zu erreichen.
  • Bevorzugte Krebsarten auf die die Therapie gerichtet ist würden Gefäß-abhänigie solide Tumore wie Brust-, Kolon-, Lungen-, Prostata- und Eierstockkarzinome sein, welche ein hohes metastatisches Potential zeigen, und für welche eine lokale Abgabe einer hohen Konzentration des Proteins möglich ist wie Lungenkrebs durch die pulmonale Abgabe, Kolonkarzinome durch hepatische Abgabe an Lebermetastasen oder Hautkrebs wie Kopf- und Nackenkarzinome oder Melanome durch subkutane Abgabe. Da die Proteine der vorliegenden Verbindung menschlichen Ursprungs sind, würden sie weniger wahrscheinlich mit allergischen oder anaphylaktischen Reaktion der Art, die von Guthrie et al, supra, bei Wiederverwendung beobachtet wurden, in Verbindung gebracht.
  • Zusätzlich werden die Proteine der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Reduktion von thromboembolischen Komplikationen, die mit der Aktivierung der intrinsischen Gerinnungswege assoziert sind, in Erwägung gezogen. Diese würden die Verhinderung von pulmonaler Embolie in Spätstadium-Krebspatienten, einer häufigen Todesursache, einschließen (Donati MB., (1994), Haemostasis 24: 128–131).
  • Ödem des Hirns und des Rückenmarks ist eine Komplikation, die von traumatischen Hirn oder Rückenmarkverletzungen, Schlaganfall, zerebraler Ischämie, zerebraler und subarachnoidaler Hämhorrhagie, Operation (einschließlich Operation am offenen Herzen), Infektionskranheiten, wie Encephalitis und Meningitis, granulomatöse Krankheiten, wie Sarkoid und fokale oder diffuse Karzinome, und ist ein Mitwirkender für die hohen Morbiditäts und Todesniveaus im Anschluss an diese Vorgänge. Bradykinin ist bekannt dafür, die Blut-Hirn-Barriere experimentell zu unterbrechen (Greenwood J., (1991), Neuroradiology, 33: 95–100; Whittle et al., (1992) Acta Neurochir., 115: 53–59), und eine Bradykinin-Infusion in die interne Halsschlagader, löste ein Hirnödem in spontan hypertensiven Ratten (SHR), die einem gewöhnlichen Halsschlagader-Verschluss unterzogen wurde, aus (Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57: 180–191). Erhöhte Bradykinin-Konzentrationen werden in extrazellulären Flüssigkeiten im Anschluss an Trauma in einem Modell, in welches traumatisiertes Ratten-Rückenmark eingebunden war (Xu et al., (1991), J Neurochem, 57: 975–980), und im Plasma und im Gewebe von Ratten mit einem von einer zerebralen Ischämie resultierendem Hirnödem gefunden (Kamiya et al., (1993), Stroke, 24: 571–575). Bradykinin wird aus hochmolekularem Kininogen durch Serin-Proteasen, einschließlich Kallikrein freigesetzt (Coleman (1984) J. Clin. Invest, 73:1249), und es wurde festgestellt, dass der Serin-Protease-Inhibitor Aprotinin die Größenordung des Hirnödems blockiert, welches von einer zerebralen Ischämie in SHR Ratten (Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57: 180–191; Kamiya et al., (1993), Stroke, 24: 571–575) und Kaninchen, die einer kalten Läsion des Hirns unterzogen wurden (Unterberg et al., (1986), J. Neurosurgery, 64: 269–276) herrührt.
  • Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass Hirnödem von der proteolytischen Freisetzung von Kininen wie Bradykinin aus Kininogen mit hohem Molekulargewicht, gefolgt von der Bradykinin-induzierten Erhöhung der Blut-Hirn-Barriere-Permeabilität resultiert. Dementsprechend werden plazentales Bikunin und Fragmente davon als Medikamente für die Prävention von Ödemen in Patienten in Erwägung gezogen, die für diese Zustände gefährdet sind, insbesondere jene mit hohem Risiko an Mortalität oder Hirnverletzung. Dies würde Kopf- und Wirbelsäule-Trauma Patienten, Polytrauma Patienten, Patienten die einer Operation des Hirn oder Rückenmark und ihrer assoziierten Gefäße oder anderen allgemeinen Operationen unterzogen werden, wie Operation am offenen Herzen, Patienten, die an einem Schlaganfall, zerebraler oder sub-arachnoider Hämorrhage, infektiösen Erkrankung des Hirns, granulomatösen Erkrankung des Hirns oder diffusen oder fokalen Karzinomen und Tumoren des Hirn oder jedem beliebigen Zustand leiden, wie Multiple Sklerose, einschließlich des Zusammenbruchs der Blut-Hirn-Barriere oder Patienten, die an jeglichen anderen entzündlichen Prozessen des Hirns oder Rückenmarks leiden. Patienten würden eine Verabreichung von plazentalem Bikunin entweder als Infusion oder als Bolus-Injektion, intravenös oder intrakranial, bekommen. Zusätzliche Dosen an plazentalem Bikunin könnte intermittierend über die nächsten ein bis drei Wochen verabreicht werden. Die Dosiskonzentrationen würden so auslegt sein, um zirkulierende Konzentrationen zu erhalten, die höher sind, als jene, die notwendig sind, um die Erhöhungen in Plasmakonzentrationen oder Bradykinin und anderer vasoaktiver Peptide zu neutralisieren, die durch die Wirkung der Serinproteasen gebildet wurden, und ausreichend sind, um das Ödem zu reduzieren. Da das Protein menschlichen Ursprungs ist, würde die wiederholte Verabreichung im Verlauf der Therapie nicht zu der Entwicklung einer Immunreaktion gegen das Protein führen. Plazentales Bikunin und Fragmente davon, würden für die Monotherapie oder Prophylaxe sowie für die Verwendung in Kombinationen mit anderen Medikamenten, wie Neurotherapeutika und Neuroschutzhilfsmittel in Erwägung gezogen werden.
  • Jüngste Indizien (Dela Cadena R.A. et al., (1995), FASEB J. 9: 446–452) weisen darauf hin, dass der Kontaktaktivierungsweg zu der Pathogenese von Arthritis und Anämie beitragen kann, und dass Kallikrein-Inhibitoren von therapeutischem Nutzen sein können. Dementsprechend werden Protease-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, gemäß ihrer Fähigkeit humanes Kallikrein zu inhibieren, als Medikamente für die Behandlung von Arthritis und Anämie in Menschen in Erwägung gezogen.
  • Die Behandlung von männlichen nicht-Insulin diabetischen (NIDDM) Patienten mit Aprotinin verbesserte die Gesamtglucoseaufnahme signifikant und verringerte die metabolische Klärungsrate von Insulin (Laurenti et al., (1996), Diabetic Medicine 13: 642–645). Dementsprechend werden die humanen Proteine der vorliegenden Erfindung für die chronische Verwendung als Medikamente für die Behandlung von NIDDM in Erwägung gezogen.
  • Die tägliche Behandlung von Patienten, die in der Gefahr einer Frühgeburt sind, mit Urinary Trypsin Inhibitor für zwei Wochen reduzierte die wiederkehrenden Gebärmutterkontraktionen signifikant (Kanayama et al., (1996), Eur J. Obstet. Gynecol. & Reprod. Biol. 67: 133–138). Dementsprechend werden die menschlichen Proteine der vorliegenden Erfindung für die Verwendung in der Prävention von Frühgeburten in Erwägung gezogen.
  • Es wurde gezeigt, dass Aprotinin die Differenzierung von Maus-Myoblasten in Kulturen stimuliert (Wells and Strickland, Development, (1994), 120: 3639–3647)), einem Prozess der durch TGFb inhibiert wird. TGFb existiert als ein inaktives Pro-Polypeptid, welches durch limitierte Proteolyse aktivitert wird. Es ist vorgeschlagen worden, dass der Aprotinin-Wirkungsmechanismus die Inhibierung der Proteasen einschließt, welche Pro-TGFb in die reife aktive Form umwandeln. Es ist gezeigt worden, dass TGFb in verschiedenen fibrotischen Läsionen hinauf reguliert ist und es wird seit längerem als potentielles Ziel für anti-fibrotische Therapien angenommen. In einem Rattenmodell einer Lungenfibrose zum Beispiel verliefen die TGF-b-Konzentrationen parallel zum Ausmaß der Bleomycin-induzierten Entzündung. Weiters stimmten die Plasmin-Konzentrationen in dem alveolaren Makrophagen mit den reifen TGF-b Konzentrationen überein, und der Zusatz des Plasmin-Inhibitiors a-2-Antiplasmin hob die posttranslatorische Aktivierung von Pro-TGFb durch den Makrophagen auf (Khal et al., (1996), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 252–259). Die Daten weisen darauf hin, dass Plasmin zu der Bildung von aktivem TGFb durch alveolare Makrophagen beiträgt und dass dieser Prozess eine pathologische Rolle in der Bleomycin-induzierten Lungenentzündung spielt.
  • Angesichts dieser Beobachtungen werden plazentales Bikunin und Fragmente davon als Therapeutika für verschiedene fibrotische Erkrankungen, einschließlich pulmonale, hepatische, renale und dermale (Sklerodermie) Fibrose in Erwägung gezogen
  • Es wurde gezeigt, dass aerosolisiertes Aprotinin > 50% der mit letalen Dosen an entweder Influenza-Viren oder Paramyxovirus infizierten Mäuse schützt (Ovcharenko and Zhirnov, Antiviral Research, (1994), 23: 107–118). Eine Unterdrückung der Entwicklung von tödlicher hämorrhagischer Bronchopneumonie und eine Normalisierung des Körpergewichtzuwachses wurden auch bei einer aerosilisierter Aprotinin-Behandlung beobachtet. Angesichts dieser Beobachtungen werden plazentales Bikunin und Fragmente davon als Therapeutika für verschiedene respiratorischbezogene Influenza-artige Krankheiten in Erwägung gezogen.
  • Das humane plazentale Bikunin, isolierte Domänen und andere Varianten der Erfindung werden für die Verwendung in den medizinischen/therapeutischen Anwendungen in Erwägung gezogen, die für natives Aprotinin oder Aprotinin-Analoga mit anderen inhibitorischen Profilen vorgeschlagen wurden, insbesondere jene die die Verwendung von hohen Dosen erfordern. Diese würden Krankheiten einschließen, für welche die Verwendung des humanen Proteins aufgrund seiner Fähigkeit angezeigt ist, humane Serin-Proteasen, wie Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Elastase, Cathepsin G und Proteinase-3 zu inhibieren; zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein: akute Pankreatitis (pankreatische Elastase und Trypsin), Entzündung, Thrombozytopenie, Bewahrung der Blutplättchenfunktion, Organkonservierung, Wundheilung, verschiedene Arten von Schock, einschließlich Schocklunge, Endotoxinschock und postoperative Komplikationen; Störungen der Blutgerinnung, wie hyperfibrinolytische Hämorrhagie; akute und chronische entzündliche Reaktionen, insbesondere für die Therapie und Prophylaxe von Organläsionen, wie zum Beispiel Pankreatitis und Strahlen-induzierte Enteritis, Komplexvermittelte inflammatorische Reaktionen wie Immunvaskulitis, Glomerulonephritis, und Arten von Arthritis; Kollagenosen, insbesondere rheumatoide Arthritis; Arten von Arthritis, die durch stoffwechselbezogene Ablagerungen verursacht werden (zum Beispiel Gicht), Degeneration von elastischen Bestandteilen von Bindegewebeteilen von Organen, wie bei Artherosklerose (Serumelastase) oder pulmonales Emphysem (Neutrophil-Elastase); Atemnotsyndrom der Erwachsenen, entzündliche Darmkrankheiten, und Psoriasis.
  • Ein bedeutendes, unerwartetes Ergebnis war, dass die synthetischen Peptide, welche Bikunin (7–64) und Bikunin (102–159) kodieren, richtig in die korrekte drei-dimensionale Konformation mit aktiver Protease-Inhibitor-Bioaktivität falten können (Beispiele 2 bzw. 1). Bei der Faltung war jedes dieser Bikunin-Fragmente einer Reduktion der Masse um 6 Masseneinheiten ausgesetzt, in Einklang mit der Bildung in jedem Fall von drei Intraketten-Disulfidbindungen zwischen sechs Cysteinresten jedes Fragments. Ein anderes überraschendes Ergebnis ist, dass die synthetischen Peptide, welche Bikunin (7–64), Bikunin (102–159) und Bikunin (1–170) kodieren, stark inhibitorisch für Plasmin und sowohl Gewebe als auch Plasma-Kallikrein sind (Beispiel 4, 3, bzw. 10). Von der Inhibierung von Plasmin und Kallikrein durch Trasylol® wird vermutet, dass sie in den Mechanismus durch welchen Trasylol® den Blutverlust während einer Operation am offenen Herzen reduziert, eingebunden ist. Unsere unerwarteten Ergebnisse der Spezifizität der Kunitz-Domänen der vorliegenden Erfindungen machen diese zu geeigneten therapeutischen Mitteln, um Blut während der Operation oder Trauma, bei welcher es einen signifikanten Blutverlust gibt zu sparen, oder für jeden anderen Zustand, bei welchen die Inhibierung von Plasmin und/oder Kallikrein von Nutzen sein würde.
  • Weiters haben wir in dieser Offenbarung (Beispiel 10) gezeigt, dass plazentales Bikunin (1–170) ein wirksamer Inhibitor von Faktor XIa und ein mäßiger Inhibitor des Faktors Xa ist. Faktor XIa spielt eine wesentliche Rolle in intrinsischen Gerinnungswegen, welcher dazu dient, den inaktiven Faktor IX und den aktiven Faktor IXa ineinander umzuwandeln. Somit inhibiert plazentales Bikunin zwei Schlüsselenzyme des intrinsischen Weges, Kallikrein und Faktor XIa. Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen, zeigten wir auch, dass plazentales Bikunin (1–170) ein wirksamer Inhibitor der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit ist, welche ein Maß für die Geschwindigkeit der durch den intrinsischen Weg angetriebenen Gerinnung ist. Andererseits zeigten wir, dass plazentales Bikunin (1–170) ein sehr schwacher Inhibitor des Gewebefaktor VIIa-Komplexes ist, was darauf hinweist, dass es in der Regulierung der extrinsischen Gerinnungskaskade nicht wichtig ist. Auf diesen unerwarteten Ergebnissen basierend, wird plazentales Bikunin als ein Medikament für Krankheiten in Erwägung gezogen, bei welchen die Aktivierung der intrinsischen Gerinnungskaskade signifikant zu dem Krankheitsmechansimus beiträgt. Zu Beispielen von solchen Krankheiten würden der post-traumatische Schock und die disseminierte intravasale Koagulapathie zählen.
  • Ein wesentlicher Vorteil der Kunitz-Domänen der vorliegenden Erfindung ist, dass sie humane Proteine sind, und auch weniger positiv geladen sind als Trasylol® (Beispiel 1), wodurch das Risiko einer Nierenschädigung bei Verabreicherung hoher Dosen des Proteins reduziert wird. Da es menschlichen Ursprungs ist, kann das Protein der vorliegenden Erfindung somit an menschliche Patienten mit einem signifikant verringertem Risiko von unerwünschten immunologischen Reaktionen verabreicht werden, im Vergleich zu der Verabreichung ähnlicher Dosen an Trasylol®. Es wurde weiters gefunden, dass Bikunin (102–159), Bikunin (7–64), und Bikunin (1–170) signifikant wirksamere Inhibitoren von Plasma-Kallikrein sind, als Trasylol® in vitro (Beispiel 3, 4 und 10). Somit wird erwartet, dass Bikunin und Fragmente davon in vivo, beim Senken des Blutverlustes bei Patienten wirksamer sind.
  • Die Menge des verabreichten Serin-Protease-Inhibitors sollte ausreichend sind, um eine supra-normale Plasmakonzentration bereitzustellen. Für die prophylaktische Reduktion des Blutens während einer und im Anschluss an eine aortokoronare Venen-Bypass-Operation (CABG) können die Proteine der vorliegenden Erfindung anstelle von Trasylol® verwendet werden, solange die Wirksamkeitsunterschiede berücksichtigt werden. Die Verwendung von Trasylol® wird im Physicians Desk Reference (1995), Auflistung für Trasylol® Ergänzung A behandelt. Kurz gesagt, wird einem Patient in Rückenlage, die Loading dose an plazentalem Bikunin, isolierter Domänen oder anderer Varianten langsam über etwa 20 bis 30 Minuten nach der Induktion der Narkose, aber vor der Sternotomie, verabreicht. Im Allgemeinen wird eine Gesamtdosis zwischen etwa 2 × 106 KIU (Kallikrein-Inhibierungseinheiten) und 8 × 106 KIU, in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie das Patientengewicht und die Operationslänge, verwendet. Bevorzugte Loading doses sind jene, die insgesamt 1 bis 2 Millionen Kallikrein-Inhibierungseinheiten (KIU) enthalten. Wenn die Loading dose beendet ist, wird sie von einer konstanten Infusionsdosis gefolgt, die fortgesetzt wird, bis die Operation abgeschlossen ist und der Patient den Operationssaal verlässt. Bevorzugte konstante Infusionsdosen sind im Bereich von etwa 250.000 bis 500.000 KIU pro Stunde. Die Anfangsdosis der Primingflüssigkeit (pump prime dose) wird der Primingflüssigkeit des kardiopulmonalen Bypass-Kreislaufs durch Austausch eines Aliquots der Primingflüssigkeit vor der Einrichtung des kardiopulmonalen Bypasses hinzugefügt. Bevorzugte „Pump prime doses" sind jene, die insgesamt ein bis zwei Millionen KIU enthalten.
  • Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden in einer im Fach bekannten Art und Weise formulierten pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt. Solche Zusammensetzungen enthalten Wirkstoff(e) plus ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Bindemittel und andere Exzipienten, in Abhängigkeit von der in Erwägung gezogen Verabreichungsart und Dosierungsform. Zu Beispielen von therapeutisch inerten anorganischen oder organischen Trägern, die Fachleuten bekannt sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talkum, Pflanzenöle, Wachse, Fette, Polyole wie Polyethylenglycol, Wasser, Saccharose, Alkohole, Glycerin und dergleichen. Verschiedene Konservierungsmittel, Emulgatoren Dispergiermittel, Aromastoffe, Benetzungsmittel, Antioxidantien, Süßstoffe, Farbstoffe, Stabilisatoren, Salze, Puffersubstanzen und dergleichen können ebenfalls hinzugefügt werden, wie erforderlich ist, um bei der Stabilisierung der Formulierung zu assistieren oder um beim Erhöhen der Bioverfügbarkeit des(r) Wirkstoffe(s) zu helfen, oder um eine Formulierung eines annehmbaren Geschmackes oder Geruches im Falle einer oralen Dosierung zu ergeben. Der in einer solchen Zusammensetzung eingesetzte Inhibitor kann in Form der ursprünglichen Verbindung selbst, oder gegebenenfalls in der Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes sein. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können allein, oder in verschiedenen Kombinationen, und in Kombination mit anderen therapeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die so formulierten Zusammensetzungen werden, wie benötigt, für die Verabreichung des Inhibitors durch jede einem Fachmann bekannte, geeignete Art ausgewählt.
  • Zu parenteralen Verabreichungsarten zählen intravenöse (i.v.), subkutane (s.c), intraperitoneale (i.p.) und intramuskuläre (i.m) Wege. Intravenöse Verbreichung kann verwendet werden, um eine akute Regulation der Peak-Plasmakonzentrationen des Arzneimittels zu erhalten, wie es erforderlich sein kann. Alternativ kann das Arzneimittel mit einer gewünschten Rate kontinuierlich durch einen i.v. Katheter verabreicht werden. Zu geeigneten Vehikeln zählen sterile, nicht-pyrogene wässrige Verdünnungsmittel, wie steriles Wasser für die Injektion, steril-gepufferte Lösungen oder sterile Salzlösungen. Die resultierende Zusammensetzung wird dem Patienten vor und/oder während der Operation durch intravenöse Injektion oder Infusion verabreicht.
  • Verbesserte Halbwertszeit und Abziehlen des Wirkstoffes auf Phagosome, wie Neutrophile und Makrophagen, die in die Entzündung eingebunden sind, kann durch den Einbau des Wirkstoffs in Liposome unterstützt werden. Es sollte möglich sein, die Selektivität des liposomalen „Abziehlens" durch Einbau von Liganden in die Außenseite von Liposomen, die an für Zielorgane/Gewebe, wie GI-Trakt und Lungen, spezifische Makromoleküle binden, verbessert werden. Alternativ könne i.m. oder s.c Ablagerungsinjektion mit oder ohne Einkapselung des Wirkstoffs in abbaubare Mikrokugeln (z.B., Poly-DL-Lactid-co-Glycolid enthaltend) oder Kollagen enthaltende, schützende Formulierungen verwendet werden, um eine verlängerte, verzögerte Arzneimittelfreisetzung zu erhalten. Für eine verbesserte Annehmlichkeit der Dosierungsform ist es möglich ein i.p. implantiertes Reservoir und Septum, wie das Percuseal-System zu verwenden. Eine verbesserte Annehmlichkeit für und Zustimmung durch den Patienten kann auch erreicht werden, indem entweder Injektorstifte (z.B. der Novo Pin oder Q-pen) oder nadelfreie Jet-Injektoren (z.B., von Bioject, Mediject oder Becton Dickinson) verwendet werden. Eine präzis-kontrollierte Freisetzung kann auch unter Verwendung implantierbarer Pumpen mit Lieferung an die gewünschte Stelle über eine Kanüle erreicht werden. Zu Beispielen zählen subkutan implantierte osmotische Pumpen, die von ALZA erhältlich sind, wie die ALZET osmotische Pumpe.
  • Die nasale Abgabe kann durch Einbau des Arzneimittels in bioadhäsive partikuläre Träger (< 200 nm) erreicht werden, wie jene, die Celluose, Polyacrylat oder Polycarbophil in Verbindung mit geeigneten Absorptionsverstärkern, wie Phospholipide oder Acylcarnitine aufweisen. Kommerziell erhältliche Systeme beinhalten jede, die von Dan Biosys und Scios Nova entwickelt wurden.
  • Die pulmonale Abgabe stellt eine nicht-parenterale Verabreichungsart des Wirkstoffes an die Zirkulation dar. Die unteren Atemwegs-Epithelien sind für eine Vielzahl von Proteinen mit einem Molekulargewicht bis zu etwa 20 kDa höchst permeabel. Mikron-große Trockenpulver, die das Medikament in einem geeigneten Träger, wie Mannitol, Saccharaose oder Lactose enthalten können zu der distalen alveolaren Oberfläche unter Verwendung von Trockenpulver-Inhalatoren geliefert werden, wie jenen von InhaleTM, DuraTM, Fisons (SpinhalerTM), und Glaxo (RotahalerTM), oder dem Astra (TurbohalerTM) Treibgas-basierenden Inhalator für gemessene Dosis. Lösungsformulierung mit oder ohne Liposome können unter Verwendung von Ultraschallverneblern abgegeben werden.
  • Die orale Abgabe kann durch Einarbeiten des Wirkstoffs in Tabletten, überzoge Tabletten, Dragees, Hart- und Weichgelatinekapseln, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, oder enterischüberzogene Kapseln, die so ausgelegt sind, um das Arzneimittel in das Kolon freisetzen, wo digestive Proteaseaktivität niedrig ist. Zu Beispielen des letzteren zählen das OROS-CT/OsmetTM-System von ALZA, und das PULSINCAPTM System von Scherer Drug Delivery Systems. Andere Systeme verwenden Azo-vernetzte Polymere, die durch Darm-spezifische bakterielle Azoreduktasen abgebaut werden, oder pH sensitive Polyacrylate-Polymere, die durch den pH-Anstieg im Dickdarm aktiviert werden. Die obigen Systeme können in Verbindung mit einer Vielzahl von erhältlichen Absorptionsverstärkern verwendet werden. Die rektale Abgabe kann erreicht werden, indem das Arzneimittel in Suppositorien eingearbeitet wird.
  • In seiner bevorzugten medizinischen Anwendung, für die Reduktion des perioperativen Blutverlustes ist die bevorzugte Verabreichungsart von plazentalen Bikunin-Varianten der vorliegenden Erfindung parenteral, vorzugsweise durch i.v Wege durch eine zentrale Linie.
  • Die Menge der einzusetzenden pharmazeutischen Zusammensetzung hängt vom Empfänger und dem zu behandelnden Zustand ab. Die erforderliche Menge kann ohne unnötige Experimentierung mittels einem Fachmann bekannter Protokolle bestimmt werden. Alternativ kann die erforderliche Menge basierend auf der Bestimmung der Menge einer Zielprotease berechnet werden, wie Plasmin oder Kallikrein, die inhibiert werden muss, um den Zustand zu behandeln. Da die in dieser Erfindung betrachteten aktiven Materialien (Wirkstoffe) als nichttoxisch erachtet werden, beinhaltet die Behandlung vorzugsweise die Verabreicherung eines Überschusses der optimal-notwendigen Menge an aktiven Wirkstoff.
  • Zusätzlich können plazentales Bikunin, isolierte Domänen oder andere Varianten verwendet werden, um natürliche Substanzen wie ihre verwandten Proteasen aus humanem Material unter Verwendung affinitätsbasierender Trennverfahren zu isolieren, sowie um Antikörper gegen die Protease herauszulocken, die weiters verwendet werden können, um die Gewebsverteilung und nützliche Funktionen von plazentalem Bikunin zu erforschen.
  • Durchsuchen von humanen Sequenzdaten
  • Die Existenz eines eindeutigen humanen Proteins, welches eine homologe Funktion zu Aprotinin hat, wurde einer einzigartigen Analyse von Sequenzeinträgen in der Expressed-Sequenz-Tag-Datenbank (hiernach dbEST genannt) am NCBI (National Center for Biological Information, Maryland) folgend abgeleitet. Unter Verwendung des TBlastN-Algorithmus (BLAST, oder Basic Local Alignment Search Tool verwendet das Verfahren von Altschul et al., (1990) J. Mol Biol 215: 403–410, um auf Ähnlichkeiten zwischen einer Abfrage-Sequenz und allen Sequenzen in einer Datenbank, Protein oder Nukleinsäure in einer beliebigen Kombination zu durchsuchen), wurde die Datenbank auf Nukleotidsequenzen untersucht, die eine Homologie zu der Sequenz des bovinen Prä-Pro-Aprotinin, Trasylol® tragen. Diese Suche von zahlreichen Klonen wurde selektiv auf zwei bestimmte Klone eingegrenzt, welche möglicherweise eine abgeleitete Aminosäure-Sequenz kodieren könnten, welche einem menschlichen Protein entsprechen, das eine homologe Funktion zu Aprotinin hat. Die ausgewählten Nukleinsäuresequenzen waren R35464 (SEQ ID Nr: 12) und R74593 (SEQ ID Nr: 14), die aus einer humanen plazentalen Nukleinsäure-Bibliothek erzeugt wurden. Der translatierten Proteinsequenz fehlte im längsten offenen Leseraster für R35464 (SEQ ID Nr: 13) eines der 6 Cysteine, die für die Bildung der kovalenten-Kunitz-Domänstruktur kritisch ist, was bedeutet, dass die Nukleinsäure-Sequenz von R35464 keinen funktionellen Inhibitor ergeben konnte. Auf ähnliche Weise enthielt der längste translatierte offene Leserahmen des Klons R74596 (SEQ ID Nr: 15) ein Stoppkodon 5' zu der Region, die die Kunitz-artige Sequenz kodiert, was bedeutet, dass diese Sequenz nicht translatiert werden konnte, um eine funktionell-sezernierte Kunitz-Domäne zu ergeben. Die Signifikanz dieser Sequenzen alleine war unklar. Es war möglich, dass sie a) die Produkte von Pseudogenen, b) Regionen nicht translatierter mRNA, oder c) die Produkte von brauchbarer mRNA darstellen, die inkorrekt sequenziert wurden.
  • Entdeckung von humanem Bikunin
  • Um die aktuelle humane Sequenz spezifisch zu isolieren und zu bestimmen, wurden cDNA Primer konstruiert, die in der Lage sind an Sequenzen zu hybridisieren, die 5' und 3' zu den cDNA-Sequenzen liegen, die unsere vorgeschlagenen Kunitz-artigen Sequenzen kodieren, die innerhalb R35464 und R74593 gefunden werden. Die Primer, die verwendet wurden, um ein Fragment zu amplifizieren, das die Kunitz-artige Sequenz von R74593 kodieren, waren CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG (der 3' Primer mit einer HindIII Stelle; SEQ ID Nr: 33) und AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA (der 5' Primer mit einer Xba I Stelle; SEQ ID Nr: 34).
  • Diese Primer wurden verwendet, um ein 500 Basenpaar Produkt aus einer humanen plazentalen cDNA Bibliothek von Clontech (MATCHMAKER, Kat.Nr.: HL4003AB, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) mittels PCR (30 Zyklen) zu amplifizieren, welches in Bluescript-SK subkloniert wurde und mit dem T3 Primer mit einem SequenaseTM-Kit Version 2.0 sequenziert wurde. Überraschenderweise war die unter Verwendung unserer Primer erhaltene Sequenz des Fragments unterschiedlich zu der in der dbEST Datenbank für den Klon R74593 aufgelisteten Sequenz. Insbesondere enthielt unsere neue Sequenz eine zusätzliche Guanosin-Base, welche 3' zum mutmaßlichen Stoppkodon, aber 5' zu dem Segement eingefügt wurde, welches die Kunitz-artige Sequenz kodiert (3). Die Insertion eines zusätzlichen Gs verschob das Stoppkodon aus dem Leserahmen der Kunitz-artigen Domäne heraus (G bei Basenpaar 114 der korrigierten Sequenz für R74593; 3).
  • Eine nachfolgende Abfrage der dbEST für Sequenzen, die homolog zu der Kunitz-artigen Peptidsequenz von R74593 sind, ergab H94519, der aus der humanen Retina-Bibliothek und N39798 abgeleitet ist. Diese Sequenzen enthielten eine Kunitz-artige Sequenz, die beinahe identisch zu der in R35464 kodierten Kunitz-artigen Domäne war, mit Ausnahme dass es alle der sechs charakteristischen Cysteine enthielt. Die Überlappung von jeder der Nukleotidsequenzen mit der von R74593 (korrigiert durch die Insertion von G bei Basenpaar 114) und R35464 wurde verwendet, um eine Konsensus-Nukleotid-Sequenz für ein partielles humanes plazentales Bikunin (SEQ ID Nr: 9; 3) zu erhalten. Die translatierte Konsensus-Sequenz ergab einen offenen Leserahmen, der sich von den Resten –18 bis +179 erstreckt (3; volle Translation SEQ ID Nr: 10), welcher zwei vollständige Kunitz-artige Domänsequenzen, innerhalb der Region der Aminosäurereste 17–64 bzw. 102–159, enthielt.
  • Weitere Bemühungen wurden unternommen, um zusätzliche 5' Sequenzen durch Abfragen von dbEST mit der Sequenz von R35464 zu erhalten. Mögliche Übereinstimmungen von solchen Suchen, die zusätzliche 5' Sequenzen besitzen wurden dann wiederum verwendet, um die dbEST erneut abzufragen. Mit einer solchen iterativen Art und Weise wurde eine Reihe von überlappenden 5' Sequenzen identifiziert, welche die Klone H16866, T66058, R34808, R87894, N40851 und N39876 beinhaltet (4). Die Ausrichtung von einigen dieser Sequenzen wies auf das Vorhandensein eines 5' ATGs hin, welches als Startstelle für die Synthese der Konsensus translatierten Proteinsequenz dienen könnte. Von diesen ausgewählten Informationen war es möglich, auf Nukleinssäure- und Polypeptidsequenzen eines menschlichen Proteins mit einer homologen Funktion zu Aprotinin zu screenen und diese zu bestimmen.
  • Die erneute Abfrage von dbEST offenbarte etliche neue EST Einträge, die schematisch in 4B gezeigt sind. Die Überlappung mit diesen zusätzlichen ESTs erlaubte uns, eine viel längere Konsensus-Oligonukleotid-Sequenz zu konstruierten (4C), die sich sowohl über das 5' als auch das 3' Ende der in 3 dargestellten ursprünglichen Oligonukleotid-Sequenz erstreckt. Tatsächlich erstreckt sich die neue Sequenz mit einer Gesamtlänge von 1,6 Kilobasen über den gesamten Bereich bis zu dem 3' Poly-A-Schwanz. Die erhöhte Anzahl von überlappenden ESTs an jeder Basenpaar Position entlang der Sequenz verbesserte das Vertrauensniveau in bestimmten Regionen, wie die Sequenz, die mit dem 3' Ende von EST R74593 überlappt (3). Mehrere überlappende ESTs in dieser Region bestätigten zwei kritische Basen-Deletionen in Bezug auf R74593 (gefunden als fett-unterstrichen in 4C, Kartenpositionen 994 und 1005). Die Translation der neuen Konsensus-Sequenz (4D) in dem Bikunin-kodierenden Rahmen ergab eine Form des plazentalen Bikunin, die länger war (248 Aminosäure) als die reife Sequenz (179 Aminosäuren), welche von der ursprünglichen Konsensus (SEQ ID Nr: 1) kodiert wird, und wurde durch ein Stoppkodon im Rahmen innerhalb des Oligonukleotid-Konsensus beendet. Die Größenzunahme war infolge einer Rahmenverschiebung in der 3' kodierenden Region, welcher aus der Entfernung von zwei für EST R74593 einzigartige Baseninsertionen resultiert. Die Rahmenverschiebung verschob das Stoppkodon des ursprünglichen Konsensus (3) aus dem Rahmen hinaus, wodurch ermöglicht wird, dass in einen neuen Rahmen durchgelesen wird, der die zusätzliche Aminosäuresequenz kodiert. Das neue Translationsprodukt (4D) war identisch zu der ursprünglichen Proteinkonsensus-Sequenz (SEQ ID Nr: 1) zwischen den Resten +1 bis +175 (kodieren die Kunitz-Domänen), enthielten jedoch eine neue C-terminale Erweiterung, welche eine mutmaßliche 24 Reste lange Transmembran-Domäne (unterstrichen in 4D), gefolgt von einer kurzen cytoplasmatischen Domäne mit 31 Resten darstellt. Die genaue Sequenz um das Initiator-Methionin und Signalpeptid war aufgrund der beträchtlichen Heterogenität unter den überlappenden ESTs in dieser Region etwas provisorisch.
  • Die Analyse der Proteinsequenz durch GeneworksTM hob Asparagin-Reste an den Postionen 30 und 67 als Konsensusstellen für eine mutmaßliche N-gebundenen Glycosylierung hervor. Asparagin 30 wurde während der N-terminalen Sequenzierung des aus humaner Plazenta isolierten Proteins mit voller Länge nicht beobacht, was damit übereinstimmt, dass es glycosyliert ist.
  • Klonierung von humanem Bikunin
  • Die Existenz einer humanen mRNA, die der mutmaßlichen humanen Bikunin Nukleotidsequenz entspricht, die aus der Analyse der 3 entnommen wurde, wurde wie folgt bestätigt. Der Nukleinsäure-Primer, der 5' zu der Kunitz-kodierenden cDNA Sequenz von R35454 (b.p. 3–27 der Konsensus-Nukleotid-Sequenz in 3) hybridisiert: GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA (ein 5' Primer abgeleitet aus der R35464 Sequenz mit einer XbaI Stelle, SEQ ID Nr: 35) und der Nukleinsäure-Primer, der 3' zu der Kunitz-kodierenden Sequenz von R74593 (b.p. 680–700 der Konsensus-Nukleotid-Sequenz in 3) hybridisiert, wurde verwendet um, aus einer Clontech humanen plazentalen Bibliothek, ein Fragment der Größe (ca. 670 bp), die aus einer cDNA Konsensus Nukleotid-Sequenz, welche die plazentale Bikunin Sequenz der 3 kodiert, geschätzt wird, mittels PCR zu amplifizieren (in 4A schematisch gezeigt).
  • Unter Verwendung eines 5' Primers, der mit einer Sequenz in R87894 hybridisiert, die 126 bp 5' zu der oben diskutierten, mutmaßlichen ATG Startstelle ist (in 4A bei bp 110 schematisch gezeigt), plus des gleichen 3' Primers zu R74593 wie oben verwendet, war es möglich ein Fragment der erwarteten Größe (etwa 872 bp) aus der Clontech humanen plazentalen Bibliothek zu amplifizieren, wie durch eine EST Überlappung vorhergesagt wurde (in 4 schematisch gezeigt).
  • Die Sequenzierung des 872 bp Fragments zeigte, dass es ein Nukleotidsegment enthält, welches zu den bp 110 bis 218 des EST R87894 an seinem 5' Ende und den bp 310 bis 542 der Konsensus-Sequenz für plazentales Bikunin, welche aus der EST Überlappungsanalyse (der 3) abgeleitet wurde, an seinem 3' Ende entspricht. Diese 3' Nukleotidsequenz enthielt alle der Kunitz-artigen Domänen, die durch das plazentale Bikunin (102–159) kodiert sind.
  • Um eine cDNA zu erhalten, die die gesamte extrazelluläre Region des Proteins kodiert, wurde der folgende 5' PCR Primer:
    CACCTGATCGCGAGACCCC (SEQ ID Nr: 36)
    der so konstruiert ist, dass er mit einer Sequenz innerhalb von EST R34808 hybridisert, mit dem gleichen 3'Primer zu EST 74593 verwendet, um ein etwa 780 Basenpaar cDNA Produkt aus der humanen plazentalen cDNA Bibliothek zu amplifizieren (30 Zyklen). Dieses Produkt wurde Gel-gereinigt und in den TA Vektor (Invitrogen) kloniert, für die DNA Sequenzierung durch das Dideoxy-Verfahren (Sanger F., et al (1977) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 74: 5463–5467) mit folgenden Primer:
    Vektor spezifisch: GATTTAGGTGACACTATAG (SP6) (SEQ ID Nr: 37)
    TAATACGACTCACTATAGGG (T7) (SEQ ID Nr: 38)
    Gen spezifisch: TTACCTGACCAAGGAGGAGTGC (SEQ ID Nr: 39) AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG (SEQ ID Nr: 40) CAGTCACTGGGCCTTGCCGT (SEQ ID Nr: 41)
  • Die resultierende cDNA Sequenz ist in 4E zusammen mit ihrem Translationsprodukt dargestellt. Auf der Nukleotid-Ebene zeigte die Sequenz nur geringe Unterschiede zu der Konsensus EST-Sequenz (4D). Die Translation der Sequenz ergab eine kodierende Sequenz, die eine Initiator ATG-Stelle im Rahmen, ein Signalpeptid und die reife plazentale Bikunin-Sequenz und die Transmembran-Domäne enthält. Der translatierten Sequenz des PCR Produkts fehlten die letzten 12 Aminosäure-Reste der cytoplasmatischen Domäne als Folge der Wahl der Selektion des 3' Primers für die PCR Amplifikation. Diese Wahl des 3' PCR Primers (konstruiert, basierend auf der R74593 Sequenz) war auch für die Einführung einer künstlichen S nach F Mutation an der Aminosäure-Position 211 der translatierten PCR-abgeleiteten Sequenz verantwortlich. Das von der Translation des PCR Fragments abgeleitete Signalpeptid war zu jenem des EST Konsensus etwas verschieden.
  • Um eine plazentale Bikunin cDNA mit voller Länge zu erhalten, wurde das PCR abgeleitete Produkt (4E) Gel-gereinigt und verwendet, um ein nicht-PCR basierender Klon mit voller Länge, welcher die Bikunin-Sequenz darstellt, zu isolieren. Die PCR abgeleitete cDNA Sequenz wurde mit 32P-CTP durch High Prime (Boehringer Mannheim) markiert und verwendet, um eine plazentale cDNA Bibliothek (Stratagen, UnizapTM λ Bibliothek) unter Verwendung von Kolonie-Hybridisierungstechniken zu sondieren. Ungefähr 2 × 106 Phagenplaques waren 3 Screening- und Plaque-Reinigungsrunden ausgesetzt. Zwei Klone wurden als „mit voller Länge (~ 1,5 Kilobasen) erachtet, wie durch Restriktionenzym-Analyse und basierend auf Vergleich mit der Größe der EST Konsensus-Sequenz (siehe oben) bestimmt wurde. Die Sequenzierung von einem dieser Klone durch das Dideoxy-Verfahren ergab die in 4F abgebildete Oligonukleotid-Sequenz. Das Translationsprodukt von dieser Sequenz ergab ein Protein mit einem Initiator Methionin im Rahmen, einem Signalpeptid und einer reifen plazentalen Bikunin-Sequenz. Die reife plazentale Bikunin-Sequenz war identisch mit der Sequenz des reifen Proteins, welches durch die Translation der EST Konsensus abgeleitet ist, obwohl die Signalpeptid-Sequenzlängen und Sequenzen unterschiedlich waren. In Gegensatz zu dem PCR-abgeleiteten Produkt enthielt die durch die Koloniehybridiserung-abgeleitete cDNA die gesamte Ektodomäne, Transmembran-Domäne, cytoplasmatische Domäne und Stoppkodon im Rahmen. Tatsächlich erstreckte sich der Klon über den gesamten Bereich bis zu dem Poly-A-Schwanz. Das Initiator-Methionin wurde von einem hydrophoben Signalpeptid gefolgt, welches identisch zu dem Signalpeptid war, welches durch den PCR-abgeleiteten Klon kodiert wird. Im Anschluss daran exprimierten und reinigten wir ein lösliches Fragment des plazentalen Bikunins, Bikunin (1–170), aus Sf9 Zellen (Beispiel 9) und stellten fest, dass es ein funktioneller Protease-Inhibitor (Beispiel 10) ist. Weiters isolierten wir aus der menschlichen Plazenta ein lösliches Fragment des plazentalen Bikunin, welches ebenfalls ein aktiver Protease-Inhibitor (Beispiel 7) war. Sowohl das natürliche Protein als auch die in Sf9 Zellen exprimierte Proteinform sind wahrscheinlich am Asparagin-Rest bei Position 30 glycosyliert, basierend auf dem Wiedergewinnen der PTH-Aminosäuren während der N-terminalen Sequenzierung (Beispiele 7 und 9).
  • Basierend auf den obigen Beobachtungen scheint es, dass plazentales Bikunin mit voller Länge die Fähigkeit hat, als ein Transmembran-Protein an der Oberfläche von Zellen sowie als lösliches Protein zu bestehen. Andere Kunitz-Domänen enthaltende Transmembran-Proteine sind bekannt, dass sie einer proteolytischen Bearbeitung ausgesetzt sind, um eine Mischung aus löslichen und Membran-assoziierter Formen zu ergeben. Diese beinhalten zwei Formen des amyloiden Vorläufer Proteins, die APP751 (Esch F., et al., (1990) Science, 248: 1122–1124) und APP770 (Wang R., et al., (1991), J. Biol Chem, 266: 16960–16964) bezeichnet werden.
  • Die Kontaktaktivierung ist ein Prozess, welcher durch Exposition von geschädigten vaskulären Oberflächen mit Komponenten der Gerinnungskaskade aktiviert wird. Angiogenese ist ein Prozess, in welchen die lokale Aktivierung von Plasmin an endothelialen Oberflächen eingebunden ist. Die Spezifität des plazentalen Bikunins und seiner mutmaßlichen Fähigkeit an Zelloberflächen zu binden, weist darauf hin, dass die physiologischen Funktionen des transmembranen plazentalen Bikunins die Regulation der Kontaktaktivierung und Angiogenese beinhalten können.
  • Die Aminosäure-Sequenzen für plazentales Bikunin (7–64), Bikunin (102–159) und plazentals Bikunin mit voller Länge (4F) wurden gegen die PIR (Vers. 46.0) und PatchX (Vers. 46.0) Protein-Datenbanken sowie die GeneSeq (Vers. 20.0) Protein-Datenbank von patentierten Sequenzen unter Verwendung des Genetics Computer Group Programm FastA durchsucht. Unter Verwendung des Genetics Computer Group Programms TFastA (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444–2448), wurden diese Proteinsequenzen versus die sechs-Rahmen Translationen der GenBank (Vers 92.0 mit Updates 1/26/96) und EMBL (veränderte Vers 45.0) Nukleotid-Datenbanken sowie die GenSeq (Vers. 20.0) Nukleotid-Datenbanken von patentierten Sequenzen durchsucht. Die EST und STS Teilmengen der GenBank und EMBL wurden in diesen Suchsatz nicht eingebunden. Die beste Übereinstimmung, die von diesen Suchen resultierten, enthielten Sequenzen, die über die gesamte Länge nur etwa zu 50% identisch waren mit der 58-Aminosäure Proteinsequenz, die aus unserer Analyse der Klone R74593 und R35464 abgeleitet wurde.
  • Isolierung von menschlichem Bikunin
  • Wie oben erwähnt ist, könnten synthetische Peptide, die Bikunin (7–64) und Bikunin (102–159) entsprechen, wie aus der translatierten Konsensus-Sequenz für Bikunin (3) bestimmt wurde, rückgefalten werden (Beispiele 2 bzw. 1), um aktives Kallikrein Inhibitor Protein (Beispiel 4 bzw. 3) zu ergeben. Wir nutzten diese unerwartete Eigenschaft aus, um ein Reinigungsschema zu entwickeln, um natives plazentales Bikunin aus humanem Gewebe zu isolieren.
  • Unter Verwendung eines Reinigungsschemas, welches Kallikrein-Sepharose-Affinitätschromatograpie als einen ersten Schritt verwendet, wurde hochgereinigter, nativer, wirksamer Kallikrein-Inhibitor isoliert. Das isolierte native humane Bikunin hatte einen identischen N-Terminus (sequenziert für 50 Aminosäurereste) wie die durch die Translation der Konsensus-Nukleinsäure-Sequenz (3)-Aminosäure-Reste +1 bis +50 (Beispiel 7) vorhergesage Sequenz. Dies bestätigte zum ersten Mal die Existenz eines neuartigen, aus humaner Plazenta isolierten, Kallikrein-Inhibitors.
  • Bekannte Kunitz-artige Domänen sind unten aufgelistet. Reste von den angenommen wird, dass sie mit Zielproteasen in Kontakt treten sind markiert, da sie von speziellem Interesse sind (fett/unterstrichen). Diese besonderen Reste werden für spezifische Referenz mit Positionen Xaa1-16 bezeichnet, wie durch die Markierung Xaa unten gezeigt ist:
    Figure 00320001
    wobei Sequenznummer 1) Bikunin (7–64) ist (SEQ ID Nr: 4); Sequenz 2) ist Bikunin (102–159) (SEQ ID Nr: 6); Sequenz 3) ist Gewebefaktor Weg Inhibitor Vorläufer 1 (SEQ ID Nr: 18); Sequenz 4) ist Gewebefaktor Weg Inhibitor Vorläufer 1 (SEQ ID Nr. 19); Sequenz 5) ist Gewebefaktor Weg Inhibitor Vorläufer (SEQ ID Nr. 20); Sequenz 6) ist Gewebefaktor Weg Inhibitor Vorläufer 2 (SEQ ID Nr. 21); Sequenz 7) ist Gewebefaktor Weg Inhibitor Vorläufer 2 (SEQ ID Nr. 22); Sequenz 8) ist amyloider Vorläuferprotein-Homolog (SEQ ID Nr. 23); Sequenz 9) ist Aprotinin (SEQ ID Nr. 24); Sequenz 10) ist Inter-α-Trypsin-Inhibitor-Vorläufer (SEQ ID NR. 25); Sequenz 11) ist Inter-α-Trypsin-Inhibitor-Vorläufer (SEQ ID Nr. 26); Sequenz 12) ist amyloides Vorläuferprotein (SEQ ID Nr. 27); Sequenz 13) ist Kollagen α-3(VI) Vorläufer (SEQ ID Nr. 28); und Sequenz 14) ist HKI-B9 (SEQ ID Nr. 29).
  • Es kann gesehen werden, dass jedes der plazentalen Bikunine (7–64) und (102–159) die gleiche Anzahl (sechs) und Abstand der Cystein-Reste aufweist, wie bei den Mitgliedern der Kunitz-Klasse von Serin-Protease-Inhibitoren. Die genaue Bindung der Cystein-Reste, um die drei intraketten Disulfidbrücken zu bilden, ist bekannt und für die vorher-bekannten Kunitz-Familienmitglieder invariant (Laskowski, M et al., 1980, Ann. Rev. Biochem. 49: 593–626). Basierend auf diesem bekannten Bindungsmuster und der Tatsache, das die Faltung von plazentalem Bikunin (7–64) und (102–159) in aktive Protease-Inhibitoren, durch eine Massenreduktion begleitet wird, was mit der Bildung von drei intraketten-Disulfidbindungen (Beispiele 2 und 1) übereinstimmt, ist es höchst wahrscheinlich, dass die Disulfidbindungen innerhalb der Kunitz-Domänen von plazentalem Bikunin zwischen den Cystein-Resten: C11 und C61, C20 und C44; C36 und C57; C106 und C156; C115 und C139; C131 und C152 auftreten. Weiters ist dieses Disulfidbindungsmuster in größeren plazentalen Bikunin-Formen, die beide Kunitz-Domänen enthält, höchst wahrscheinlich, da solche Formen des Proteins ebenfalls aktive Serin-Protease-Inhibitoren sind und weil die N-terminale Sequenzierung (Beispiel 7) des nativen plazentalen Bikunins für 50 Zyklen eine Sequenz ergab, die an Positionen an welchen die Cystein-Reste erwartet werden, still war.
  • Das plazentale Bikunin, isolierte Domänen oder andere Varianten der vorliegenden Erfindung können durch Standard Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung von entweder der t-Boc Chemie, wie von Merrifield R. B. and Barany G., in: The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2, Gross E. et al., Hrsg. Academic Press (1980) Kapitel 1 beschrieben; oder mittels F-moc Chemie wie von Carpino L.A., and Han G.Y., (1970), J. Amer. Chem Soc., 92,5748–5749, beschrieben und in Beispiel 2 illustriert ist, hergestellt werden. Alternativ kann die Expression einer DNA, welche die plazentale Bikunin-Variant kodiert, verwendet werden, um rekombinante plazentale Bikunin-Varianten zu erzeugen.
  • Die Erfindung betrifft auch DNA Konstrukte, die die plazentalen Bikunin-Proteinvarianten der vorliegenden Erfindung kodieren. Diese Konstrukte können durch synthetische Verfahren, wie jene die beschrieben sind in Beaucage S.L. and Caruthers M.H., (1981) Tetrahedron Lett, 22, S. 1859–1862; Matteucci M.D. and Caruthers M.H., (1981), J. Am. Chem. Soc. 103, S. 3185; oder aus genomischer oder cDNA hergestellt werden, welche durch Screenen von genomischer oder cDNA Bibliotheken mit cDNA-Sonden erhalten werden können, die so konstruiert sind, dass sie mit plazentalem Bikunin kodierender DNA Sequenz hybridisieren. Die genomische oder cDNA Sequenz kann an einer oder mehrere Stellen modifiziert sein, um eine cDNA zu erhalten, die jede der in dieser Offenbarung beschriebenen Aminosäure-Substitutionen oder Deletionen kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren, welche das DNA Konstrukt enthalten, welches das plazentale Bikunin, isolierte Domänen oder andere Varianten der vorliegenden Erfindung kodiert, das für die Herstellung von rekombinanten plazentalen Bikunin-Varianten verwendet werden kann. Die cDNA sollte mit einer geeigneten Promotor-Sequenz verbunden sein, die eine transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigen, einen geeignenten Terminator und ein Poly-Adenylierungssignal besitzen. Die die plazentale Bikunin-Variante kodierende cDNA kann mit einem 5' Signalpeptid fusioniert werden, dass dazu führt, dass ein durch diese cDNA kodiertes Protein sezerniert wird. Das Signalpeptid kann eines sein, das durch den Wirtsorganismus erkannt wird. Im Falle von einer Säugetierwirtszelle kann das Signalpeptid das natürliche Signalpeptid sein, welches in plazentalem Bikunin mit voller Länge vorhanden ist. Die verwendeten Verfahren, um solche Vektoren für die Expression von plazentalen Bikunin-Varianten herzustellen, sind im Fach bekannt und sind zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989) beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch transformierte Zellen, die das DNA Konstrukt enthalten, welches das plazentale Bikunin, isolierte Domänen oder andere Varianten der vorliegenden Erfindung kodieren, die für die Herstellung von rekombinanten plazentalen Bikunin-Varianten verwendet werden können. Eine Vielzahl von Kombinationen an Expressionsvektoren und Wirtsorganismus existieren, die für die Herstellung von plazentalen Bikunin-Varianten verwendet werden können. Zu geeigneten Wirtszellen zählen Baculovirusinfizierte Sf9 Insektenzellen, Säugetierzellen, wie BHK, CHO, Hela und C-127, Bakterien wie E. coli, und Hefen wie Saccharomyces cervisiae. Die für die Verwendung von Säugetier-, Insekten und mikrobiellen Expressionssystemen benötigten Verfahren, um eine Expression von plazentalem Bikunin zu erreichen, sind mit Fach bekannt und sind zum Beispiel in Ausubel F. M. et al., Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons" (1995), Kapitel 16 beschrieben. Für Fragmente von plazentalem Bikunin, die eine einzelne Kunitz-Inhibitor-Domäne enthalten, wie Bikunin (7–64) und (102–159) werden Hefe- und E.coli Expressionssysteme bevorzugt, wobei Hefe-Systeme am meisten bevorzugt werden. Üblicherweise würde die Hefeexpression ausgeführt werden, wie im US Patent 5.164.482 für Aprotinin-Varianten beschrieben ist und im Beispiel 5 der vorliegenden Spezifikation für plazentales Bikunin (102–159) angepasst wurde. Die E. coli Expression könnte unter Verwendung der Verfahren, die im US Patent 5.032.573 beschrieben sind, ausgeführt werden. Die Verwendung von Säugetier- und Hefesystemen sind am meisten für die Expression von größeren plazentalen Bikunin-Varianten bevorzugt, die beide Inhibitordomänen enthalten, wie die Variante Bikunin (7–159).
  • DNA, die plazentale Bikunin-Varianten kodiert, die Aminosäuresubstitutionen der natürlichen Aminosäure-Sequenz besitzen, kann für die Expression von rekombinantem Protein unter Verwendung der Verfahren von Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 488–492 hergestellt werden. Kurz gesagt wird die zu mutagenisierende DNA in einen einzelsträngigen Bakteriophagenvektor, wie M13 kloniert. Ein Oligonukleotid, welches den zu verändernden Bereich umspannt, und die Substitutionen kodiert wird mit der einzelsträngigen DNA hybridisiert und durch Standard molekularbiologische Techniken doppelsträngig gemacht.
  • Diese DNA wird dann in einen geeigneten bakteriellen Wirt transformiert und durch Dideoxynukleotid-Sequenzierung verifiziert. Die korrekte DNA wird dann in das Expressionsplasmid kloniert. Alternativ kann die Ziel-DNA durch Standard-PCR-Techniken mutagenisiert werden, sequenziert und in das entsprechende Expressionsplasmid eingefügt werden.
  • Die folgenden bestimmten Beispiele sind für Illustrationszwecke, und nicht als Einschränkung bestimmter Aspekte und bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angeführt.
  • Beispiel 1 – Kein Beispiel der Erfindung
  • Herstellung von synthetischem plazentalem Bikunin (102–159)
  • Materialien und Verfahren/Verwendete Reagenzien: Das fluoregene Substrat Tos-Gly-Pro-Lys-AMC wurde von Bachem BioScience INc (King of Prussia, PA) gekauft. PNGB, Pro-Phe-Arg-AMC, Ala-Ala-Pro-Met-AMC, bovines Trypsin (Typ III), humanes Plasma Kallikrein, und humanes Plasmin wurden von Sigma (St. Louis, MO) gekauft.
  • Rekombinantes Aprotinin (Trasylol®) war von Bayer AG (Wuppertal, Germany). Vorgeladenes Gln-Wang-Harz war von Novabiochem (La Jolla, CA). Thioanisole, Ethandithiol und t-Butylmethylether war von Aldrich (Milwaukee, WI).
  • Quantifizierung von funktionellem plazentalem Bikunin (7–64) und (102–159) Die Menge an Trypsin-inhibitorischer Aktivität, die in der rückgefaltenen Probe bei verschiedenen Reinigungsstufen vorhanden war, wurde unter Verwendung von GPK-AMC als Substrat gemessen. Bovines Trypsin (200 pmol) wurde für 5 Minuten bei 37°C mit Bikunin (7–64) oder (102–159) von verschiedenen Reinigungsstufen, in Puffer A (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl2 und 0,01% Triton X-100) inkubiert. GPK-AMC wurde hinzgefügt (20 μM am Ende) und die Menge an erzeugtem Cumarin wurde durch Messen der Floureszenz (Ex = 370 nm, Em = 432 nm) auf einem Perkin-Elmer LS-50B Fluorimeter über eine Periode von 2 Minuten bestimmt. Für die zu testenden Proben wurde für jede Probe die % Inhibierung gemäß Gleichung 1 berechnet; wobei Ro die Rate der Fluoreszenzzunahme in Gegenwart des Inhibitors ist und R1 ist die Rate, die in Abwesenheit der hinzugefügten Probe bestimmt wurde. Eine Aktivitätseinheit des Inhibitors wird als die Menge definiert, die benötigt wird, um eine 50% Inhibierung in der Untersuchung unter Verwendung der beschriebenen Bedingungen, zu erreichen. % Inhibierung = 100 × [1 – Ro/R1] (1)
  • Synthese: Plazentales Bikunin (102–159) wurde auf einem Applied Biosystems Modell 420 A Peptidsynthetisierer unter Verwendung der NMP-HBTU Fmoc-Chemie synthetisiert. Das Peptid wurde auf einem vorgeladenen Gln-Harz mit einem 8-fachen Überschuss an Aminosäure für jede Kopplung synthetisiert. Spaltung und Schutzeliminierung wurde in 84,6% Trifluoressigsäure (TFA), 4,4% Thioanisol, 2,2% Ethandithiol, 4,4% verflüssigtes Phenol und 4,4% Wasser für 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Rohpeptid wurde ausgefällt, zentrifugiert und zweimal mit t-Butylmethylether gewaschen. Das Peptid wurde an einer Dynamax 60A C18 Umkehrphasen HPLC Säule mittels eines TFA/Acetonitril-Gradienten gereinigt. Die letzte Ausfällung (61,0 mg) ergab die korrekte Aminosäurezusammensetzung und Molekulargewicht mittels Elektronenspray-Massenspektroskopie (MH+ = 6836,1; berechnet = 6835,5) für die vorhergesagte Sequenz:
    YEEYCTANAV TGPCRASFPR WYFDVERNSC NNFIYGGCRG NKNSYRSEEA CMLRCFRQ (SEQ ID Nr. 6)
  • Reinigung: Die Rückfaltung des plazentalem Bikunins (102–159) wurde gemäß dem Verfahren von Tam et al., (J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 6657–62) durchgeführt. Ein Teil des gereinigten Peptids (15,2 mg) wurde in 4,0 ml 0,1 M Tris, pH 6,0 und 8 M Harnstoff aufgelöst. Die Oxidation der Disulfide wurde durch die tropfenweise Zugabe einer 23 % DMSO und 0,1 M Tris, pH 6,0 enthaltenden Lösung erreicht, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml Peptid in 20 % DMSO, 0,1 M Tris, pH 6,0 und 1 M Harnstoff zu erreichen. Der Lösung wurde erlaubt für 24 Stunden bei 25 °C zu rühren, nach welchem, die Lösung 1:10 in 50 mM Tris, pH 8,0 und 0,1 M NaCl enthaltendem Puffer verdünnt wurde. Das Material wurde unter Verwendung einer Kallikrein-Affinitätssäule gereinigt, welche durch kovalentes Binden von 30 mg bovinem pankreatischem Kallikrein (Bayer AG) an 3,5 ml CNBr aktivierte Sepharose (Pharmacia), gemäß den Herstellerangaben hergestellt wurde. Das rückgefaltete Material wurde auf die Affinitätssäule mit einer Flussrate von 1 ml/min geladen und mit 50 mM Tris, pH 8,0 und 0,1 M NaCl gewaschen, bis die Absorption der Waschung bei 280 nm nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Die Säule wurde mit 3 Volumina, jeweils von 0,2 M Essigsäure, pH 4,0 und 1,7 eluiert. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst (siehe unten) und der pH der Lösung wurde auf 2,5 eingestellt. Das Material wurde direkt auf eine Vydac C18 Umkehrphasen-Säule (5 Mikron, 0,46 × 25 cm) aufgetragen, die in 22,5% Acetonitril in 0,1 % TFA äquilibriert wurde. Die Trennung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 22,5 bis 40% Acetonitril in 0,1 % TFA bei 1,0 m/min über 40 Minuten erreicht. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst, lyophilisiert, erneut in 0,1 % TFA aufgelöst und bis zum Bedarf bei –20°C gelagert.
  • Ergebnisse: Synthetisches plazentales Bikunin (102–159) wurde unter Verwendung von 20% DMSO als Oxidationsmittel, wie oben beschrieben, rückgefaltet, und durch ein 2-stufiges Reinigungsverfahren, wie unten gezeigt, gereinigt, um einen aktiven Trypsin Inhibitor (Tabelle 1, unten) zu ergeben.
  • Tabelle 1 Reinigungstabelle für die Isolierung von synthetischem plazentalem Bikunin (102–159)
    Figure 00380001
    • a Protein bestimmt durch AAA.
    • b Protein bestimmt durch OD280 nm, unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten, welcher für das gereinigte Protein bestimmt wurde (1,7 × 104 Lmol–1 cm–1)
    • c Eine Einheit ist definiert als die Menge an Material, die erforderlich ist, um 50% der Trypsin-Aktivität in einer Standarduntersuchung zu inhibieren.
  • Chromatographie des rohen rückgefaltenen Materials über eine immobilisierte bovine pankreatische Kallikrein-Säule isolierte selektiv 6,0% des Proteins und 97 % der vorhandenen Trypsin inhibitorischen Aktivität. Eine nachfolgende Chromatographie unter Verwendung einer C18 Umkehrphase ergab eine weitere 2fache Reinigung, mit einer Gesamt-Ausbeute von 74%. Auf einer RPHPLC zeigte das reduzierte und rückgefaltete plazentale Bikunin (102–159) Elutionszeiten von 26,3 bzw. 20,1 Minuten. Die Massenspektroskopie-Analyse des gereinigten Materials offenbarte ein Molekulargewicht von 6829,8; einem Verlust von 6 Masseneinheiten des Ausgangsmaterials. Dies demonstriert die vollständige Bildung der 3 von der Peptidsequenz vorhergesagten Disulfide.
  • Die isoelektrischen Punkte des gereinigten, rückgefaltenen synthetischen plazentalen Bikunins (102–159) wurden unter Verwendung eines Multiphor II Elektrophorese-Systems (Pharmacia), welches gemäß den Herstellerangaben betrieben wurde, zusammen mit pI Standards, unter Verwendung eines vorgefertigten Ampholine® PAGplate (pH 3,5 bis 9,5) und 1,5 stündiger Fokussierung bestimmt. Nach dem Färben wurde die Migrationsdistanz von dem kathodischen Rand des Gels zu den unterschiedlichen Proteinbanden gemessen. Der pI jedes unbekannten Proteins wurde mittels einer Standardkurve bestimmt, die durch die graphische Darstellung der Migrationsdistanzen von Standards gegen die entsprechenden pIs erzeugt wurde. Mit dieser Technik wurde der pI des plazentalem Bikunins (102–159) mit 8,3 bestimmt, was in Übereinstimmung mit dem aus der Aminosäure-Sequenz vorhergesagten Wert ist. Dieser ist niedriger als der Wert von 10,5, der für Aprotinin festgelegte pI (Tenstad et al., 1994, Acta Physiol. Scand. 152: 33–50).
  • Beispiel 2 – kein Beispiel der Erfindung
  • Herstellung von synthetischem plazentalem Bikunin (7–64)
  • Plazentales Bikunin (7–64) wurde im Wesentlichen wie für plazentales Bikunin (102–159) beschrieben synthetisiert, rückgefaltet und gereinigt, jedoch mit folgenden Modifikationen: während dem Rückfalten wurde das synthetische Peptid für 30 Stunden als eine Lösung in 20% DMSO bei 25°C gerührt; Reinigung durch C18 RP-HPLC wurde mit einem linearen Gradient von 25 bis 45 % Acetonitril in 0,1 % TFA über 40 Minuten (1 ml/ml) erreicht. Die aktiven Fraktionen des ersten C18-Laufes wurden erneut auf die Säule aufgetragen und mit einem linearen Gradienten (60 min, 1 ml/min) von 20 bis 40% Acetonitril in 0,1 % TFA fraktioniert.
  • Ergebnisse: Das endgültige gereinigte, reduzierte Peptid zeigte eine MH+ = 6563, übereinstimmend mit der Sequenz:
    IHDFCLVSKV VGRCRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID Nr: 4)
  • Die Rückfaltung und Reinigung ergab eine funktionelle Kunitz-Domäne, die als Trypsin-Inhibitor aktiv war (Tabelle 2 unter).
  • Tabelle 2A Reinigungstabelle für die Isolierung von synthetischem plazentalem Bikunin (7–64)
    Figure 00400001
  • Das gereinigte rückgefaltete Protein zeigte einen MH+ = 6558, d.h. 5 ± 1 Masseneinheiten weniger als für das reduzierte Peptid. Dies demonstriert, dass die Rückfaltung die Bildung von zumindest einer entsprechenden Disulfidbindung hervorruft.
  • Der pI von plazentalem Bikunin (7–64) wurde unter Verwendung von Verfahren die für das Bestimmen des pIs von plazentalem Bikunin (102–159) eingesetzt wurden, bestimmt. Plazentales Bikunin (7–64) zeigte einen pI, der viel höher als der vorhergesagte Wert (pI = 7,9) war. Rückgefaltetes plazentales Bikunin (7–64) wanderte zu dem kathodischen Rand des Gels (pH 9,5) und ein genauer pI konnte unter diesen Bedingungen nicht bestimmt werden.
  • Kontinuierliche Herstellung von synthetischem plazentalem Bikunin (7–64).
  • Da das synthetische plazentale Bikunin (7–64) nicht einer vollständigen Schutzeliminierung vor der Reinigung und Rückfaltung unterzogen werden konnte, wurde die Rückfaltung unter Verwendung von Protein wiederholt, welches sicherlich vollständig schutzeliminiert war. Plazentales Bikunin (7–64) wurde im Wesentlichen wie für plazentales Bikunin (102–159) beschrieben, synthetisiert, rückgefaltet und gereinigt, jedoch mit den folgenden Modifikationen: während der Rückfaltung wurde das synthetische Peptid für 30 Stunden als eine Lösung in 20% DMSO bei 25°C gerührt; Reinigung durch C18 RP-HPLC wurde mit einem linearen Gradient von 22,5 bis 50% Acetonitril in 0,1 % TFA über 40 Minuten (1 ml/ml) erreicht.
  • Ergebnisse: Das endgültig gereinigte, reduzierte Peptid zeigte einen MH+ = 6567,5, welches übereinstimmt mit der Sequenz:
    IHDFCLVSKV VGRCRASMPRW WYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID Nr: 4)
  • Das Rückfalten und die Reinigung ergab eine funktionale Kunitz-Domäne, die gleich aktiv, wie ein Trypsin-Inhibitor war (Tabelle 2B, unten).
  • Tabelle 2B Reinigungstabelle für die Isolierung von synthetischem plazentalem Bikunin (7–64)
    Figure 00410001
  • Das gereinigte rückgefaltete Protein zeigte einen MH+ = 6561,2, d.h. 6,3 Masseneinheiten weniger als für das reduzierte Peptid. Dies demonstriert, dass die Rückfaltung die Bildung der erwarteten 3 Disulfidbindung hervorruft.
  • Der pI von rückgefaltetem, plazentalem Bikunin (7–64) wurde unter Verwendung der Verfahren die für das Bestimmen des pIs von plazentalem Bikunin (102–159) eingesetzt wurden, bestimmt. Rückgefaltetes, plazentales Bikunin (7–64) zeigte einen pI von 8,85, der etwas höher als der vorhergesagte Wert (pI = 7,9) war.
  • Beispiel 3 – Kein Beispiel der Erfindung
  • In vitro Spezifität von funktionellem plazentalem Bikunin-Fragment (102–159)
  • Proteasen: Bovines Trypsin, humanes Plasmin und bovine pankreatische Kallikrein-Quantifizierungen wurden durch Active-Site-Titration unter Verwendung von p-Nitrophenyl p'-guanidinobenzoat HCl, wie früher beschrieben (Chase, T., und Shaw, E., (1970) Methods Enzmol., 19: 20–27) durchgeführt. Humanes Kallikrein wurde durch Active-Site-Tritation mittels bovinem Aprotinin als ein Standard und PFR-AMC als ein Substrat, unter der Annahme einer 1:1 Komplexbildung, quantifiziert. Der Km für GPK-AMC mit Trypsin und Plasmin unter den für jedes Enzym verwendeten Bedingungen war 29 μM bzw. 726 μM; der Km für PFR-AMC mit humanem Plasma Kallikrein und bovinem pankreatischem Kallikrein war 457 μM bzw. 81,5 μM; der Km für AAPR-AMC mit Elastase war 1600 μM. Die Quantifizierung des humanen Gewebe-Kallikreins (Bayern, Deutschland) wurde durch Active-Site-Titration mittels p-Nitrophenyl p'-guanidinobenzoat HCl, wie früher beschrieben (Chase, T., und Shaw, E., (1970) Methods Enzmol., 19: 20–27) durchgeführt.
  • Inhibierungskinetiken: Die Inhibierung von Trypsin durch plazentales Bikunin (102–159) oder Aprotinin wurde durch Inkubieren von 50pM Trypsin mit plazentalem Bikunin (102–159) (0–2 nM) oder Aprotinin (0–3 nM) in Puffer A in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml gemessen. Nach 5 Minuten bei 37°C wurden 15 μl 2 mM GPK-AMC hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz (wie oben) wurde überwacht. Die Inhibierung von humanem Plasmin durch plazentales Bikunin (102–159) und Aprotinin wurde mit Plasmin (50 pM) und plazentalem Bikunin (102–159) (0–10nM) oder Aprotinin (0–4 nM) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, und 0,02% Triton X-100 enthaltendem Puffer bestimmt. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei 37°C wurden 25 μl 20 mM GPK-AMC hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz wurde überwacht. Die Inhibierung von humanem Plasma-Kallikrein durch plazentales Bikunin (102–159) und Aprotinin wurde unter Verwendung von Kallikrein (2,5 nM) und plazentalem Bikunin (102–159) (0–3 nM) oder Aprotinin (0–45 nM) in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, und 0,02% Triton X-100 enthaltendem Puffer bestimmt. Nach 5 Minuten bei 37°C wurden 15 μl 20 mM PFR-AMC hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz wurde überwacht. Die Inhibierung des bovinen pankreatischen Kallikreins durch plazentales Bikunin (102–159) und Aprotinin wurde auf ähnliche Weise mit Kallikrein (92 pm), plazentalem Bikunin (102–159) (0–1,6 nM) und Aprotinin (0–14 pM) und einer Substrat-Endkonzentration von 100 μM bestimmt. Die offensichtliche Inhibierungskonstante Ki* wurde unter Verwendung einer nicht-linearen Regression-Datenanalysenprogramm-Enzfitter-Software (Biosoft, Cambridge, UK) bestimmt: die kinetischen Daten von jedem Experiment wurde in Form der Gleichung für einen festbindenden Inhibitor analysiert: Vi/Vo = 1 – (Eo + Io + Ki* – [(Eo + Io + Ki*)2 – 4EoIo]1/2)2Eo (2)
  • Wobei Vi/Vo die fraktionale Enzymaktivität ist (inhibierte vs. nicht-inhibierte Rate), und Eo und Io sind die Gesamtkonzentrationen des Enzyms bzw. Inhibitors. Ki-Werte wurden durch Korrigieren für die Wirkung des Substrats gemäß der Gleichung: Ki = Ki*/(1 + [So]/Km) (3) erhalten (Boudier, C., and Bieth, J.G. (1989) Biochim Biophys Acta, 995: 36–41).
  • Für die Inhibierung der humanen neutrophilen Elastase durch plazentales Bikunin (102–159) und Aprotinin wurde Elastase (19 nM) mit plazentalem Bikunin (102–159) (150 nM) oder Aprotinin (0–7,5 μM) in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) und 0,05% Triton X-100) enthaltendem Puffer inkubiert. Nach 5 Minuten bei 37°C wurde AAPM-AMC (500 μM oder 1000 μM) hinzugefügt und die Fluoreszenz über eine zwei-minütige Periode gemessen. Ki-Werte wurden von Dixon-Plots der Form 1/V versus [I], durchgeführt bei zwei unterschiedlichen Substrat-Konzentrationen, bestimmt (Dixon et al., 1979).
  • Die Inhibierung des humanen Gewebe-Kallikreins durch Aprotinin, plazentales Bikunin Fragment (7–64) oder plazentales Bikunin Fragment (102–159) wurde durch die Inkubation von 0,35 nM humanes Gewebe-Kallikrein mit plazentalem Bikunin (7–64) (0–40 nM) oder plazentalem Bikunin (102–159) (0–2,5 nM) oder Aprotinin (0–0,5 nM) in einem 1 ml Reaktionsvolumen gemessen, welches 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 9,0, 80 mM NaCl, und 0,1 % Trition X-100 enthält. Nach 5 Minuten bei 37°C wurde 5μl 2 mM PFR-AMC hinzugefügt, um einer Endkonzentration von 10 nM zu erreichen, und die Änderung der Fluoreszenz wurde überwacht. Der Km für PFR-AMC mit humanem Gewebe-Kallikrein under den eingesetzten Bedingungen war 5,7 μM. Die Inhibierung des humanen Faktors Xa (American Diagnositica, Inc, Greenwich, CT) durch synthetisches plazentales Bikunin (102–159) rekombinantes plazentales Bikunin, und Aprotinin wurde durch die Inkubation von 0,87 nM humanem Faktor Xa mit steigenden Mengen an Inhibitor in 20 mm Tris (pH 7,5), 0,1 M NaCl und 0,1 % BSA enthaltendem Puffer gemessen. Nach 5 Minuten bei 37°C wurde 30 μl 20 mM LGR-AMC (Sigma) hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz überwacht. Die Inhibierung der humanen Urokinase (Sigma) durch Kunitz-Inibitoren wurde durch die Inkubation der Urokinase (2,7 ng) mit Inhibitoren in einem Gesamtvolumen von 1 ml Puffer, der 50 mM Tris-HCl (PH 8,0)), 50 mM NaCl, und 0,1 % Triton X-100 enthält, gemessen. Nach 5 Minuten bei 37°C wurden 35 μl 20 mM GGR-AMC (Sigma) hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz überwacht. Die Inhibierung von Faktor XIa (von Enzyme Research Labs, Southbend, IN) wurde durch Inkubieren von FXIa (0,1 nM) mit entweder 0 bis 800 nM plazentalem Bikunin (7–64), 0 bis 140 nM plazentalem Bikunin (102–159) oder 0 bis 40 μM Aprotinin in 50 mM Hepes pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,01% Trition X-100, und 1% BSA in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemessen. Nach 5 Minuten bei 37°C wurde 10 ul 40 mM Boc-Glu(OBzI)-Ala-Arg-AMC (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz überwacht.
  • Ergebnisse: Ein direkter Vergleich der Inhibierungsprofile von plazentalem Bikunin (102–159) und Aprotinin wurde durch Messen ihrer Inhibierungskonstanten mit verschiedenen Proteasen unter identischen Bedingungen durchgeführt. Die Ki-Werte sind in Tabelle 3, unten, aufgelistet.
  • Tabelle 3 Ki-Werte für die Inhibierung von verschiedenen Proteasen durch Bikunin (102–159)
    Figure 00440001
  • Plazentales Bikunin (102–159) und Aprotinin inhibieren bovines Trypsin und humanes Plamin unter den angewendeten Bedingungen zu einem vergleichbaren Ausmass. Aprotinin inhibierte Elastase mit einem Ki von 8,5 μM. Plazentales Bikunin (102–159) inhibierte Elastase mit einem Ki von 323 nM. Der Ki-Wert für die plazentale Bikunin (102–159) Inhibierung des bovinen pankreatischen Kallikreins war 20fach höher als der der Aprotinin-Inhibierung. Im Gegensatz dazu ist plazentales Bikunin (102–159) ein wirksamerer Inhibitor des humanen Plasma Kallikreins als Aprotinin und bindet mit einer 56fach höheren Affinität.
  • Da plazentales Bikunin (102–159) mehr als 50-mal wirksamer ist als Trasylol® als ein Inhibitor von Kallikrein ist, werden geringere Mengen an humanem plazentalem Bikunin, oder Fragmenten davon (d.h. plazentales Bikunin (102–159)) als Trasylol® benötigt, um die wirksame Patientendosis des Inhibitors in KIU aufrechtzuerhalten. Dies reduziert die Kosten pro Dosis des Arzneimittels und reduziert die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten nephrotoxischen Wirkungen bei Re-Exposition des Patienten mit dem Medikament. Weiters ist das Protein von Menschen abgeleitet, und somit in Menschen viel weniger immunogen als Aprotinin, welches von Kühen abgeleitet ist. Dies führt zu einer signifikanten Abnahme des Risikos des Zuziehens unerwünschter immunologischer Vorgänge bei der Re-Exposition des Patienten mit dem Medikament.
  • Beispiel 4 – Kein Beispiel der Erfindung
  • In vitro Spezifität von funktionellem humanen plazentalem Bikunin-Fragment (7–64)
  • Die in vitro Spezifität von funktionellem plazentalem Bikunin (7–64) wurde unter Verwendung der in den oberen Beispielen verwendeten Materialien und Verfahren bestimmt.
  • Ergebnisse: Die Tabelle unten zeigt die Wirksamkeit von plazentalem Bikunin (7–64) als ein Inhibitor von verschiedenen Serin-Proteasen in vitro. Die Daten werden im Vergleich zu Daten gezeigt, die für das Screenen der Inhibierung mit entweder plazentalem Bikunin (102–159) oder Aprotinin (Trasylol®) erhalten wurden.
  • Tabelle 4A Ki-Werte für die Inhibierung von verschiedenen Proteasen durch Bikunin (7–64)
    Figure 00450001
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die das plazentale Bikunin (7–64) kodierende Aminosäure-Sequenz rückgefaltet werden kann, um einen aktiven Serin-Protease-Inhibitor zu erhalten, der zumindest gegen vier Trypsin-artige Serin-Proteasen wirksam ist.
  • Tabelle 4B, unten, zeigt auch die Wirksamkeit des rückgefaltenen plazentalen Bikunins (7–64) als ein Inhibitor verschiedener Serin-Proteasen in vitro. Rückgefaltetes plazentales Bikunin (7–64) wurde aus Protein hergestellt, das sicherlich vor der Reinigung und Rückfaltung vollständig schutzeliminiert wurde. Die Daten werden im Vergleich zu Daten, die für das Screenen der Inhibierung mit entweder plazentalem Bikunin (102–159) oder Aprotinin (Trasylol®) erhalten wurden, gezeigt.
  • Tabelle 4B Ki-Werte für die Inhibierung von verschiedenen Proteasen durch rückgefaltenes Bikunin (7–64)
    Figure 00460001
  • Überraschenderweise, war plazentales Bikunin (7–64) wirksamer als Aprotinin bei der Inhibierung des humanen Plasma Kallikreins, und zumindest ähnlich wirksam wie ein Plasmin Inhibitor. Diese Daten zeigen, dass plazentales Bikunin (7–64) zumindest so wirksam ist wie Aprotinin unter Verwendung von in vitro Untersuchungen, und man könnte erwarten, dass die Wirksamkeit in vivo besser oder ähnlich ist.
  • Beispiel 5 – Kein Beispiel der Erfindung
  • Expression der plazentalem Bikunin-Variante (102–159) in Hefe
  • Die DNA Sequenz, welche das plazentale Bikunin (102–159) kodiert (SEQ ID Nr: 6) wurde unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide hergestellt. Das endgültige DNA Produkt bestand (5' zu 3') aus 15 Nukleotiden der Hefe α-Paarungsfaktor-Propeptid-Sequenz, welches mit der im-Rahmen cDNA-Sequenz fusioniert ist, die das plazentale Bikunin (102–159) kodiert, gefolgt von einem im-Rahmen Stoppkodon. Bei der Klonierung in einen Hefe-Expressionsvektor pS604 würde die cDNA die Expression eines Fusionsproteins steuern, welches ein N-terminales Hefe-α-Paarungsfaktor-Propeptid, das mit der 58 Aminosäure-Sequenz des plazentalen Bikunins (102–159) fusioniert ist, aufweist. Die Bearbeitung dieses Fusionsproteins an der KEX-2- Spaltstelle and der Verbindungsstelle zwischen dem α-Paarungsfaktor und der Kunitz-Domäne war so ausgelegt, das die Kunitz-Domäne an ihrem nativen N-Terminus freigesetzt wird.
  • Ein 5' Sinn-Oligonukleotid, welches eine HindIII-Stelle für das Klonieren enthält, der folgenden Sequenz wurde synthetisiert:
    Figure 00470001
  • Ein 3' Gegensinn-Oligonukleotid, welches sowohl eine BamHI-Stelle für das Klonieren als auch ein Stoppkodon enthält, der folgenden Sequenz wurde synthetisiert:
    Figure 00470002
  • Die Oligonukleotide wurden in 1 mM EDTA enthaltendem 10 mM Tris-Puffer pH 8,0 aufgelöst und 12 ug von jedem Oligo wurden vereinigt hinzugefügt und in 0,25 M NaCl eingebracht. Um zu hybridisieren, wurden die Oligonukleotide durch Kochen für 5 Minuten denaturiert und es wurde ihnen ermöglicht von 65°C auf Raumtemperatur über 2 Stunden abzukühlen. Die Überhänge wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments erweitert und mit HindIII und BamHI verdaut. Das resultierende, verdaute doppelsträngige Fragment wurde in pUC19 kloniert und die Sequenz bestätigt. Ein Klon, der das Fragment der korrekten Sequenz enthält wurde mit BamHI/HindIII verdaut, um das Bikunin enthaltende Fragment mit der folgenden +Strang-Sequenz freizusetzen:
    Figure 00470003
    welches dann Gel-gereinigt und in BamHI/HindIII geschnittenen pS604 ligiert wurde. Die Ligationsmischung wurde in Phenol/Chloroform extrahiert und über eine S-200 Minispin-Säule gereinigt. Das Ligationsprodukt wurde in die Hefestämme SC101 und WHL341 gerichtet transformiert und auf ura-Selektionsplatten ausplattiert. Zwölf Kolonien von jedem Stamm wurden auf ura-Dropout-Platten erneut ausgestrichen. Eine Einzelkolonie wurde in 2 ml ura DO-Medium inokuliert und über Nacht bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 14000 × g pelletiert und die Überstände auf ihren Inhalt an plazentalem Bikunin (102–159) evaluiert.
  • Nachweis der Expression von plazentalem Bikunin (102–159) in transformierter Hefe
  • Erstens wurden die Überstände (50 μl pro Untersuchung) auf ihre Fähigkeit evaluiert, die in vitro Aktivität von Trypsin unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Untersuchungsverfahren zu inhibieren (1 ml Untersuchungsvolumen). Eine reine unbenutzte Mediumprobe sowie ein Hefeklon, welcher eine inaktive Aprotinin-Variante exprimiert, dienten als Negativkontrollen. Ein Hefeklon, welcher natürliches Aprotinin exprimiert, diente als Positivkontrolle und wird für Vergleichszwecke gezeigt.
  • Das zweite Verfahren, um die plazentale Bikunin (102–159) Expression zu quantifizieren, nutzte die Verwendung von polyklonalen Antikörpern (pAbs) gegen das synthetische Peptid aus, um die Akkumulation des rekombinanten Peptids mittels Western-Blots zu überwachen. Diese Studien wurden nur mit Rekombinanten durchgeführt, die von Stamm SC101 abgeleitet sind, da diese eine höhere inhibitorische Aktivität als aus Stamm WHL341 abgeleitete Rekombinanten erzeugen.
  • Um die pAb herzustellen, wurde zwei 6–8 Wochen alte weiße weibliche Neuseeland-Kaninchen (Hazelton Research Labs, Denver, Pa) am Tag null mit 250 ug gereinigtem, reduziertem, synthetischem plazentalem Bikunin (102–159) in vollständigem Freund's-Adjuvans immunisiert, gefolgt von Auffrischungen an den Tagen 14, 35, und 56 und 77 mit jeweils 125 ug desselben Antigens in unvollständigem Freund's Adjuvans. Das in den vorliegenden Studien verwendete Antiserum wurde nach der dritten Auffrischung durch etablierte Verfahren gesammelt. Die polyklonalen Antikörper wurden aus dem Antiserum über Protein A gereinigt.
  • Die Kolonien 2.4 und 2.5 von der Hefe SC101-Transformation (8) sowie eine Aprotinin-Kontrolle wurden über Nacht in 50 ml ura-DO-Medium bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden pelletiert und der Überstand mittels eines Centriprep 3 (Amicon, Beverly, MA) Konzentrators 100fach konzentriert. Von jedem wurden Proben (30 μl) wurde einer SDS-PAGE auf 10–20% Tricin-gepufferten Gelen (Novex, San Diego, CA) unter Verwendung der Herstellerverfahren unterzogen. Duplikatgele wurden entweder mit einem Silberfärbungssatz (Integrated Separation Systems, Nantick, MA) entwickelt oder auf eine Nitrocellulose überführt und mit dem gereinigten polyklonalen Antikörper, welcher gegen synthetisches Bikunin (102–159) abgeleitet wurde, entwickelt. Alkalische Phosphatase konjugierter Ziegen Anti-Kaninchen Antikörper wurde als sekundärer Antikörper gemäß den Herstellervorschriften verwendet (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD).
  • Reinigung von plazentalem Bikunin (102–159) aus einem transformierten SC101-Stamm
  • Die Fermentationsbrühe einer 1L-Kultur des SC101 Stammes 2.4 wurde durch Zentrifugation (4.000g × 30 Minuten) geerntet, dann auf eine 1,0 ml Anhydrochymotrypsin-Sepharose-Säule (Takara Biochemical, Inc., CA) aufgetragen, die vorher mit 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl2 und 0,01 % (Vol.-%/Vol-%) Triton X-100) enthaltendem 50 mM Hepes-Puffer, pH 7,5, äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit demselben, jedoch 1,0 M NaCl enthaltenden Puffer gewaschen, bis die A280 nm auf Null abgefallen ist, woraufhin die Säule mit 0,1 M Ameisensäure, pH 2,5, eluiert wurde. Die eluierten Fraktion wurden zusammengefasst und auf eine C 18 Säule (Vydac, 5 um, 4,6 × 250 mm) aufgetragen, die vorher mit 0,1 % TFA äquilibriert wurde, und mit einem 50 minütigen, linearen Gradienten von 20 bis 80% Acetonitirl in 0,1 % TFA eluiert. Die das plazentale Bikunin (102–159) enthaltenden Fraktionen wurden zusammengefasst und auf einer C18 nochmals chromatographiert, wobei eine Elution mit einem linearen 22,5 bis 50% Acetonitril-Gradienten in 0,1 % TFA verwendet wurde.
  • Ergebnisse. 8 zeigt die prozentuelle Trypsin-Aktivität, die durch zwölf Kolonien inhibiert wurde, die von der Transformation von jedem der Stämme SC101 und WHL341 abgeleitet sind. Die Ergebnisse zeigen, dass alle zwölf Kolonien des Hefestamms SC101, der mit dem Trypsin-Inhibitor plazentalem Bikunin (102–159) transformiert sind, die Fähigkeit besaßen, eine beachtliche Menge der Trypsin inhibitorischen Aktivität zu erzeugen, im Vergleich zu den Negativkontrollen, von denen beide keine Fähigkeit zeigten, Trypsin zu inhibieren. Die Aktivität ist deshalb auf die Expression eines spezifischen Inhibitors in den plazentalen Bikunin-Variante (102–159) transformierten Zellen bezogen. Die Hefe WHL341-Proben enthielten eine minimale Trypsin inhibitorische Aktivität. Die kann mit dem für diesen Stamm, unter den angewendeten Bedingungen, beobachteten langsamen Wachstum korrelieren.
  • 9 zeigt die SDS-PAGE und Western-Analyse der Hefe SC101-Überstände. Silbergefärbte SDS-PAGE der Überstände, die aus rekombinanten, plazentales Bikunin (102–159) exprimierenden Hefen 2.4 und 2.5, sowie aus der Aprotinin-exprimierenden Hefe stammten, ergaben eine Proteinbande, welche bei ungefähr 6 kDa verläuft, welche der Größe entspricht, die für jede rekombinante Kunitz-Inhibitor-Domäne erwartet wird. Die Western- Analyse zeigte, dass die durch die Stämme 2.4 und 2.5 exprimierten 6 kDa-Banden mit dem pAb reagierten, der gegen das plazentale Bikunin (102–159) abgeleitet ist. Dieselbe 6 kDa Bande in der Aprotinin-Kontrolle reagierte nicht mit dem selben Antikörper, welches die Spezifität des Antikörpers für die plazentale Bikunin-Variante (102–159) demonstriert.
  • Die endgültige Zubereitung der plazentalen Bikunin-C-terminalen Domäne war durch silbergefärbte SDS-PAGE sehr rein (10). Die Gesamtausbeute der aus der Brüheabgeleiteten Trypsin inhibitorischen Aktivität in der letzten Zubereitung war 31 %. Die N-terminale Sequenzierung des gereinigten Inhibitors zeigte, dass 40% des Proteins richtig bearbeitet ist, um den korrekten N-Terminus für plazentales Bikunin (102–159) zu ergeben, während etwa 60% des Materials einen Teil des Hefe α-Paarungsfaktors enthielt. Das gereinigte Material wies einen aktiven Serin-Protease-Inhibitor auf, der einen scheinbaren Ki von 0,35 nM für die in vitro Inhibierung von Plasma Kallikrein zeigte.
  • Schließlich lieferte die Akkumulation sowohl einer Protease Inhibitor-Aktivität als auch eines Proteins, welches immunochemisch mit synthetischem Bikunin (102–159) verwandt ist, in der Fermentationsbrühe sowie die Isolierung eines plazentalen Bikunins (102-159) aus einer der transformierten Linien, Beweise für die Expression von plazentalem Bikunin in hierin beschriebenen, rekombinanten Hefestämmen, welches für das erste Mal die Nützlichkeit von Hefen für die Herstellung von plazentalen Bikunin-Fragmenten zeigt.
  • Zusätzliche Konstrukte wurden in einer Anstrengung hergestellt, um das Expressionsniveau der Kunitz-Domäne, die innerhalb des plazentalen Bikunins 102–159 enthalten ist, zu erhöhen, sowie die Ausbeute des Proteins mit dem korrekten N-Terminus zu erhöhen. Wir nahmen an, dass die N-terminalen Reste des plazentalen Bikunins 102–159 (YEEY-) eine Spaltungstelle darstellen können, die nur schlecht durch die Hefe KEX-2-Protease erkannt wird, die die Hefe-a-Faktor Proregion enzymatisch entfernt. Deshalb stellten wir Hefe-Expressionskonstrukte für die Herstellung von plazentalem Bikunins 103–159 (N-Terminus von EEY...), 101–159 (N-Terminus von NYEEY...) und 98–159 (DMFNYEEY...) her, um die P' Substellen, welche die KEX-2 Spaltstelle umgeben, zu modifizieren. Um die rekombinanten Proteinexpressionsniveaus zu erhöhen zu versuchen, verwendeten wir auch beim Herstellen von einigen der unten beschriebenen Konstrukte die von der Hefe bevorzugten Kodons, im Gegensatz zu den von Säugetieren bevorzugten Kodons. Die Konstrukte wurden im Wesentlichen wie oben für plazentales Bikunin 102–159 (definiert als Konstrukt Nr. 1) beschrieben hergestellt, jedoch mit den folgenden Modifikationen:
  • Konstrukt Nr. 2: plazentales Bikunin 103–159, Hefe-Kodon-Verwendung
  • Ein 5' Sinn Oligonukleotid
    Figure 00510001
    und ein 3' Antisense Oligonukleotid
    Figure 00510002
    wurden wie für die Herstellung eines Expressionskonstruktes (Konstrukt Nr. 1, oben) für die Expression von plazentalem Bikunin 102–159 manipuliert.
  • Konstrukt Nr. 3 plazentales Bikunin 101–159, Hefe-Kodon-Verwendung
  • Ein 5' Sinn Oligonukleotid
    Figure 00510003
    und das gleiche 3' Gegensinn-Oligonukleotid wie für Konstrukt Nr. 2 verwendet wurde, wurde wie für die Herstellung eines Expressionskonstrukts (Konstrukt Nr. 1, oben) für die Expression von plazentalem Bikunin 102–159 manipuliert.
  • Konstrukt Nr. 4 plazentales Bikunin 98–159, Hefe-Kodon-Verwendung
  • Ein 5' Sinn Oligonukleotid
    Figure 00510004
    und das gleiche 3' Gegensinn-Oligonukleotid wie für Konstrukt Nr. 2 verwendet wurde, wurde wie für die Herstellung eines Expressionskonstrukts (Konstrukt Nr. 1, oben) manipuliert.
  • Der Hefestamm SC101 (MATα, ura 3–52, suc2) wurde mit den Plasmiden transformiert, die jede der obigen cDNAs enthält, und Proteine wurden unter Verwendung der Verfahren exprimiert, die oben für die Herstellung von plazentalem Bikunin 102–159 mit humaner Kodon-Verwendung beschrieben wurden. Etwa 250 ml von jeder Hefe-Kultur wurden geerntet, und der Überstand aus der Zentrifugation (15 Minuten × 3000 Umdrehungen pro Minute) wurde einer getrennten Reinigung über 1 ml Kallikrein-Sepharose-Säulen, wie oben beschrieben, unterzogen. Die relative Menge an Trypsin-inhibitorische Aktivität im Aufzutragendem, die Menge an gewonnenem gereinigten Protein und die N-terminale Sequenz des gereinigten Proteins wurden bestimmt und sind in Tabelle 7 unten aufgelistet.
  • Tabelle 7 Relative Herstellungsniveaus von unterschiedlichen Proteinen, die die C-terminale Kunitz-Domäne des plazentalen Bikunins enthalten.
    Figure 00520001
  • Die Ergebnisse zeigen, dass plazentale Bikunin-Fragmente unterschiedlicher Länge, die die C-terminale Kunitz-Domäne enthalten, eine große Variation in der Kapazität funktionellsezerniertes Protein zu exprimieren zeigen. Konstrukte, die die Fragemente 101–159, und 103–159 exprimieren ergaben kaum eine oder eine geringe enzymatische Aktivität in den Überständen vor der Reinigung, und die N-terminale Sequenzierung von 0,05 ml Aliquoten jeder gereinigten Fraktion ergab nicht-nachweisbare Mengen an Inhibitor. Andererseits ergab die Expression entweder von plazentalem Bikunin 102–159 oder 98–159 signifikante Mengen an Protease Aktivität vor der Reinigung. Die N-terminale Sequenzierung zeigte jedoch, dass das aus der Expression von 102–159 gewonnene gereinigte Protein wieder größtenteils inkorrekt verarbeitet war, und zeigt einen N-Terminus der mit der Bearbeitung der Mehrheit des Präproteins an einer Stelle innerhalb der Hefe-α-Paarungsfaktor Pro-Sequenz übereinstimmt. Das gereinigte Protein, welches aus der Expression von plazentalem Bikunin 98–159 gewonnen wurde, war jedoch gänzlich an der korrekten Stelle bearbeitet, um den korrekten N-Terminus zu ergeben. Weiters wurde beinahe zweimal so viel Protein gewonnen, wie im Vergleich zu der Gewinnung von plazentalem Bikunin 102–159. Somit stellt plazentales Bikunin 98–159 eine bevorzugte Fragment-Länge für die Herstellung der C-terminalen Kunitz-Domäne des plazentalen Bikunins durch die α-Paarungsfaktor-Prä-Pro-Sequenz/KEX-2 Bearbeitungssystem von S. Cerevisiae dar.
  • Beispiel 6
  • Alternative Verfahren für die Hefe-Expression
  • Das 58 Aminosäure Peptid, welches aus dem R74593 Translationsprodukt abgeleitet ist, kann ebenfalls von entweder dem R87894-R74593 PCR Produkt, welches in den TA vectorTM (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert wurde nach der DNA Sequenzierung oder von der humanen plazentalen cDNA PCR amplifiziert werden. Das amplifizierte DNA Produkt wird aus 19 Nukleotiden der Hefe α-Paarungsfaktor Leitsequenz, welche mit der R74593 Sequenz gepaart ist, die für YEEY-CFRQ (58 Reste) kodiert, bestehen, so dass das Translationsprodukt im Rahmen ist, was ein α-Paarungsfaktor/Kunitz-Domäne Fusionsproteins erzeugt. Die Protein-Sequenz enthält auch eine Kex2-Spaltstelle, welche die Kunitz-Domäne an ihrem nativen N-Terminus freisetzt.
  • Das 5' Sinn-Oligonukleotid, welches eine HindIII-Stelle für das Klonieren enthält, wird die folgende Sequenz enthalten:
    GCCAAGCTTG GATAAAAGAT ATGAAGAAT ACTGCACCGC CAACGCA (SEQ ID Nr. 30)
  • Das 3' Gegensinn-Oligonukleotid enthält eine BamHI-Stelle für das Klonieren sowie ein Stoppkodon und besitzt die folgende Sequenz:
    GGGGATCCTC ACTGCTGGCG GAAGCAGCGG AGCAT (SEQ ID Nr. 31)
  • Die in den Hefe-Expressionsvektor zu klonierende, vollständige 260 Nukleotid-cDNA Sequenz besitzt die folgende Sequenz:
    Figure 00540001
  • Nach der PCR Amplifikation wird diese DNA mit HindIII, BamHI verdaut und in den Hefeexpressionsvektor pMT15 (siehe US Patent 5.164.482, zur Gänze durch Bezugnahme aufgenommen), ebenfalls mit HindIII und BamHI verdaut, kloniert. Der resultierende Plasmidvektor wird verwendet, um den Hefestamm SC 106 unter Verwendung der im US Patent 5.164.482 beschriebenen Verfahren zu transformieren. Die URA 3+ Hefe-Transformanten werden isoliert und unter induzierenden Bedingungen kultiviert. Die Ausbeute an rekombinanten plazentalen Bikunin-Varianten wird gemäß der Menge an Trypsin inhibitorischer Aktivität, die in den Kulturüberständen über die Zeit akkumulierten unter Verwendung des oben beschriebenen in vitro Untersuchungsverfahrens bestimmt. Die Fermentationsbrühen werden bei 9000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann durch einen 0,4, dann einen 0,2 μm Filter filtriert, auf eine Leitfähigkeit von 7,5 ms verdünnt und mit Zitronensäure auf pH 3 eingestellt. Die Probe wird dann chargenweise auf eine 200 ml S-Sepharose fast flow (Pharmacia) in 50 mM Natriumzitrat pH 3 absorbiert und für 60 Minuten gerührt. Das Gel wird im Anschluss daran nacheinander mit jeweils 2 L von: 50 mM Natriumzitrat pH 3,0; 50 mM Tris-HCl, pH 9,0; 20 mM HEPES pH 6,0 gewaschen. Das gewaschene Gel wird in eine geeignete Säule übertragen und mit einem linearen Gradient von 0 bis 1 M Natriumchlorid in 20 mM HEPES pH 6,0 eluiert. Eluierte, in vitro Trypsin inhibitorische Aktivität enthaltende Fraktionen werden dann zusammengefasst und weiters gereinigt durch entweder a) Chromatographie über eine Säule von immobilisierten Anhydrotrypsin (im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben); durch Chromatographie über eine Säule von immobilisierten bovinen Kallikrein; oder c) eine Kombination von herkömmlichen chromatographischen Schritten, einschließlich Gel-Filtration und/oder Anionenaustauch-Chromatographie.
  • Beispiel 7
  • Isolierung und Charakterisierung von nativem humanem plazentalem Bikunin aus Plazenta
  • Bikunin-Protein wurde zur scheinbaren Homogenität aus ganzer, gefrorenen Plazenta gereinigt (Analytical Biological Services, Inc, Wilmington, DE). Die Plazenta (740 g) wurde auf Raumtemperatur auftauen gelassen und in 0,5 bis 1,0 cm Stücke geschnitten, auf Eis platziert und mit 600 ml PBS Puffer gewaschen. Die Waschung wurde dekantiert und 240 ml Plazenta-Stücke wurden in einen Waring-Mixer platziert. Nach dem Hinzufügen von 300 ml Buffer, bestehend aus 0,1 M Tris (pH 8,0) und 0,1 M NaCl, wurde die Mischung bei hoher Geschwindigkeit für 2 Minuten gemixt, in ein 750,0 ml Zentrifügenröhrchen dekantiert und auf Eis gelegt. Dies Verfahren wurde wiederholt, bis das gesamte Material verarbeitet war. Der kombinierte Schlamm wurde bei 4500 × g für 60 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein Käsetuch filtriert und das plazentale Bikunin mittels einer Kallikrein Affinitätssäule, welche durch kovalentes Binden von 70 mg bovinen pankreatischen Kallikreins (Bayer AG) an 5,0 ml CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia) gemäß den Herstellerinstruktionen hergestellt wurde, gereinigt. Das Material wurde auf die Affinitätssäule bei einer Flussrate von 2 ml/min geladen und mit 0,1 M Tris (pH 8,0), 0,1 M NaCl gewaschen bis die Absorption bei 280 nm der Waschung nicht länger nachgewiesen werden konnte. Die Säule wurde weiters mit 0,1 M Tris (pH 8,0), 0,5 M NaCl gewaschen und mit 3 Volumina 0,2 M Essigsäure, pH 4,0 eluiert. Die Fraktionen, die Kallikrein und Trypsin inhibitorische Aktivität (siehe unten) enthalten wurden zusammengefasst, gefroren und lyophilisiert. Plazentales Bikunin wurde weiters durch Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung einer Superdex 75 10/30 (Pharmacia)-Säule, welche an ein Beckman System Gold HPLC-System angeschlossen ist, gereinigt. Kurz gesagt, die Säule wurde in 0,1 M Tris, 0,15 M NaCl, und 0,1 % Trition X-100 bei einer Flussrate von 0,5 ml/min äquilibriert. Die lyophiliserte Probe wurde in 1,0 ml 0,1 M Tris, pH 8,0 wieder hergestellt und auf die Gelfiltrationssäule in 200 μl Aliquoten injiziert. Die Fraktionen wurden gesammelt (0,5 ml) und auf Trypsin und Kallikrein inhibitorische Aktivität untersucht. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst und der pH der Lösung wurde durch Zugabe von TFA auf 2,5 eingestellt. Das Material wurde direkt auf eine Vydac C18 Umkehrphasen-Säule (5 Mikron, 0,46 × 25 cm) aufgetragen, die in 20% Acetonitril in 0,1 % TFA äquilibriert wurde. Die Trennung wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 20 bis 80% Acetonitril in 0,1 % TFA bei 1,0 ml/min über 50 Minuten, nach einer anfänglichen 20 minütigen Waschung mit 20 % Acetonitril in 0,1 %TFA erreicht. Fraktionen (1 ml) wurden gesammelt und auf Trypsin und Kallikrein inhibitorsche Aktivität untersucht. Inhibitorische Aktivität enthaltende Fraktionen wurde unter Verwendung eines speed-vac Konzentrators (Savant) konzentriert und einer N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen.
  • Funktionelle Untersuchungen für plazentales Bikunin
  • Die Identifizierung von funktionellem plazentalem Bikunin wurde durch Messen seiner Fähigkeit das bovine Trypsin und das humane Plasma Kallikrein zu inhibieren, erreicht. Die Trypsin inhibitorische Aktivität wurde in Untersuchungpuffer (50 mM Hepes, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2,0 mM CaCl2, 0,1 % Trition X-100) bei Raumtemperatur in einer 96-Kammer-Mikrotiterplaate (Perkin Elmer) mittels Gly-Pro-Lys-Aminomethylcumarin als Substrat durchgeführt. Die Menge an durch Trypsin produziertem Cumarin wurde durch Messen der Fluoreszenz (Ex = 370 nm, Em = 432 nm) auf einem Perkin-Elmer LS-50B Fluorimeter, mit einem Plattenleser ausgestattet, bestimmt. Trypsin (23 μg in 100 μl Puffer) wurde mit 20 μl der zu testenden Probe vermischt und für 10 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl des GPK-AMC Substrats (33 μM Ende) in Untersuchungspuffer gestartet. Die Fluoreszenz-Intensität wurde gemessen und die % Inhibierung für jede Fraktion wurde bestimmt durch: % Inhibierung = 100 × [1 – Fo/F1]wobei Fo die Fluoreszenz des Unbekannten ist und F1 ist die Fluoreszenz der nur Trypsin-Kontrolle. Die Kallikrein inhibitorische Aktivität der Fraktionen wurde auf ähnliche Weise unter Verwendung von 7,0 nM Kallikrein in Untersuchungspuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100) und 66,0 μM Pro-Phe-Arg-AMC als Substrat gemessen.
  • Bestimmung der in vitro Spezifität von plazentalem Bikunin
  • Die in vitro Spezifität von nativem humanem plazentalem Bikunin wurde unter Verwendung der in den vorangehenden Beispielen, oben, beschriebenen Materialien und Verfahren bestimmt. Plazentales Bikunin wurde durch Active-Site-Titration gegen eine bekannte Trypsin-Konzentration unter Verwendung von GPK-AMC als ein Substrat quantifiziert, um die Fraktion des ungebundenen Trypsins zu überwachen.
  • Protein-Sequenzierung
  • Die 1 ml Fraktion (C18-29 Delaria) wurde auf einer Speed-Vac auf 300 ml Volumen reduziert, um die Menge an organischem Lösungsmittel zu reduzieren. Die Probe wurde dann auf eine Hewlett-Packard Miniatur biphasische Reaktionsäule geladen und mit 1 ml 2% Trifluoressigsäure gewaschen. Die Probe wurde dann auf einem Hewlett-Packard Modell G1005A Protein-Sequenzierungssystem mittels Edman-Abbau sequenziert. Version 3.0 Sequenzierungsverfahren und alle Reagenzien wurde von Hewlett-Packard geliefert. Die Sequenz wurde für 50 Zyklen bestätigt.
  • Ergebnisse: Plazentales Bikunin wurde zur scheinbaren Homogenität der Reihe nach durch Kallikrein-Affinität, Gelfiltration und Unkehrphasen-Chromatographie gereinigt (siehe Reinigungstabelle unten)
  • Tabelle 5 Reinigungstabelle für natives plazentales Bikunin (1–179)
    Figure 00570001
    • a Eine Einheit ist definiert als die Menge, die 50 % der Trypsinaktivität in einer Standarduntersuchung inhibiert.
  • Die Mehrheit der Kallikrein und Trypsin inhibitorischen Aktivität eluierte von der Kallikrein-Affinitätssäule in der pH 4,0 Elution. Eine nachfolgende Gelfiltration-Chromatographie (5) ergab einen Peak der Kallikrein und Trypsin inhibitorischen Aktivität mit einem Molekulargewichtsbereich von 10 bis 40 kDa, wie durch eine Standardkurve beurteilt wurde, die erzeugt wurde, indem Molekulargewichtstandards unter identischen Bedingungen laufen gelassen wurden. Umkehrphasen C18 Chromatographie (6) ergab 4 inhibitorische Aktivitäts-Peaks, wobei die wirksamste bei etwa 30 % Acetonitril eluierte. Die Aktivität, die mit dem Peak assoziiert ist, der als erster von der C18 eluierte (Fraktion 29) zeigte eine Aminosäure-Sequenz, beginnend mit Aminosäure 1 der vorhergesagten Aminosäuresequenz für plazentales Bikunin (ADRER...; SEQ ID Nr: 1), und war identisch mit der vorhergesagten Sequenz für die 50 Sequenzierungszyklen (unterstrichene Aminosäuren in 3). Cystein-Reste innerhalb dieses Sequenzabschnittes waren still, wie für das Sequenzieren von oxidiertem Protein erwartet wird. Die Cystein-Reste an den Aminosäure-Positionen 11 und 20 des reifen plazentalen Bikunins wurden später durch Sequenzieren des S-pyridylethylierten Proteins identifiziert, woraufhin PTH-Pyridylethyl-Cystein bei Zyklen 11 und 20 gefunden wurde.
  • Interessanterweise war das Asparagin bei Aminosäure-Restnummer 30 der Sequenz (3) still, was zeigt, dass diese Stelle wahrscheinlich glykosyliert ist. Fraktion 29 ergab eine Hauptsequenz, welche der des plazentalen Bikunins entspricht, beginnend bei Rest Nr. 1 (27 pmol beim 1 Zyklus) und eine Nebensequenz (2 pmol), die auch von dem plazentalen Bikunin stammt, beginnend bei Rest 6 (SIHD...). Dies zeigt, das die endgültige Zubereitung, die in Fraktion 29 sequenziert wurde, hoch rein ist, und am wahrscheinlichsten für die Protease inhibitorische Aktivität verantwortlich sein, wird die mit dieser Fraktion assoziiert ist (6).
  • Dementsprechend war die endgültige Zubereitung von plazentalem Bikunin der C18 Chromatographie äußerst rein, basierend auf einer silbergefärbten SDS-PAGE-Analyse (7), in welcher das Protein mit einem scheinbaren Mr von 24 kDa auf einem 10 bis 20% Acrylamin-Tricin-Gel (Novex, San Diego, CA) wanderte, welches mit den folgenden Molekulargewicht Marker kalibriert wurde: Insulin (2,9 kDa); boviner Trypsin Inhibitor (5,8 kDa); Lysozym (14,7 kDa); β-Lactoglobulin (18,4 kDa), carbonische Anhydrase (29 kDa) und Ovalbumin (43 kDa). Die obige Größe des plazentalen Bikunins auf der SDS-PAGE ist übereinstimmend mit der von der Kodiersequenz mit voller Länge vorhergesagten (4F).
  • Wie basierend auf den oben beschriebenen N-terminalen Sequenzierungsergebnissen erwartet wird, reagiert das gereinigte Protein mit einem Antikörper, der von plazentalem Bikunin (7–64) stammt, um eine Bande mit demselben Mr (12A) zu ergeben, wie für die gereinigte Zubereitung beobachtet wird, wie auf Gelen durch Silberfärbung nachgewiesen wurde (7). Wenn jedoch dieselbe Zubereitung mit einem Antikörper reagiert wird, der gegen synthetisches plazentales Bikunin (102–159) abgeleitet ist, wurde keine Bande beobachtet, die dem Protein mit voller Länge entspricht. Stattdessen wurde ein Fragment von etwa 6 kDa, welches mit synthetischem Bikunin (102–159) mitwandert, beobachtet. Die einfachste Interpretation dieser Ergebnisse ist, dass die gereinigte Zubereitung in Anschluss an die Reinigung einen Abbau durchgemacht hat, um ein N-terminales Fragment zu ergeben, welches die N-terminale Domäne und eine die C-terminales Fragment, welches die C-terminale Domäne enthält, aufweist. Unter der Annahme, dass das Fragment, welches gegen Antiserum gegen plazentales Bikunin (7–64) reaktiv ist, frei von dem C-terminalen Ende des Proteins mit voller Länge ist, würde die Größe (24 kDa) auf einen hohen Glyosylierungszustand hinweisen.
  • Tabelle 6, unten, zeigt die Wirksamkeit der in vitro Inhibierung von verschiedenen Serin-Proteasen durch plazentales Bikunin. Die Daten werden mit jenen verglichen, die mit Aprotinin (Trasylol®) erhalten wurden.
  • Tabelle 6 Ki-Werte für die Inhibierung von verschiedenen Proteasen durch plazentales Bikunin
    Figure 00590001
  • Die Ergebnisse zeigen, dass aus natürlichen Quellen (humane Plazenta) isoliertes plazentales Bikunin ein wirksamer Inhibitor der Trypsin-artigen Serin-Proteasen ist.
  • Beispiel 8
  • Expressionsmuster von plazentalem Bikunin unter verschiedenen humanen Organen und Geweben
  • Ein Multiple Tissue Northern wurde von Clontech gekauft, welches 2 μg PolyA + RNA aus menschlichem Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, und Pankreas enthält. Zwei unterschiedliche cDNA Sonden wurden verwendet: 1) eine Gel-gereinigte cDNA, welche plazentales Bikunin (102–159) kodiert; 2) das 780 Basenpaar PCR-abgeleitete cDNA (4E), welche aus einem TA Klon durch Verdau mit EcoRI freigesetzt und Gel-gereinigt wurde. Jede Sonde wurde mittels 32P-dCTP markiert und ein Random-Priming-Labeling-Kit von Boehringer Mannheim Biochemicals (Indiana) wurde dann verwendet, um mit den Multiple Tissue Northern gemäß den Herstellerangaben zu hybridisieren. Autoradiogramme wurde unter Verwendung eines Biomax-Films mit einer 18 stündigen Belichtungszeit erzeugt, und mittels eines Umax-Scanners entwickelt und mittels Adobe Photoshop gescannt.
  • Ergebnisse: Das unter Verwendung einer plazentalen Bikunin (102–159) Sonde (11A) oder einer größeren Sonde, welche beide Kunitz-Domänen des placentalen Bikuin (11B) enthält, beobachtete Gewebeexpressionsmuster war im Wesentlichen das Gleiche wie man erwarten könnte. Die plazentale Bikunin mRNA war am meisten in Pankreas und Plazenta vorhanden. Signifikante Konzentrationen wurden auch in Lunge, Hirn und Nieren beobachtet, während niedere Konzentrationen in Herz und Leber beobachtet wurden, und die mRNA war im Skelettmuskel nicht nachweisbar. Die Transkriptgröße war in allen Fällen 1,95 Kilobasen, welches in enger Übereinstimmung mit der vorhergesagten Größe von plazentalem Bikunin war, welche sowohl von der EST Überlappung als auch der Klonierung von cDNA mit voller Länge, wie in vorangehenden Abschnitten beschrieben, gefolgert wurde.
  • Die ausgedehnte Gewebe-Verteilung der mRNA zeigt, dass plazentales Bikuin weitverbreitet exprimiert wird. Da das Protein auch eine Leitsequenz enthält würde es eine ausgiebige Exposition zu dem menschlichen Immunsystem haben, welches erfordert, dass es als Selbst-Protein erkannt wird. Zusätzliche Beweise für eine ausgedehnte Gewebsverteilung der plazentalen Bikunin mRNA-Expression wurde von der Tatsache abgeleitet, dass einige der EST Einträge mit Homologie zu plazentalem Bikunin (4B) von menschlichem Erwachsenen- und Kinderhirn, und menschlicher Retina, Brust, Eierstock, olfaktorischem Epithelium und Plazenta abgeleitet wurden. Es wird deshalb daraus geschlossen, dass es unwahrscheinlich sein würde, dass die Verabreichung des nativen humanen Proteins an humane Patienten, eine Immunreaktion auslöst.
  • Interessanterweise erinnerte das Expressionsmuster von plazentalem Bikunin ein wenig an jenes für das bovine Aprotinin, welches in hohen Konzentrationen in boviner Lunge und Pankreas gefunden wird. Um das Expressionsmuster des plazentalen Bikunins weiter aufzuklären, wurde die RT-PCR von der Gesamt-RNA aus den folgenden menschlichen Zellen bestimmt: nicht-stimulierte humane Nabelvenen Endothelzellen (HUVECs), HK-2 (Linie, die von proximalen Nierentubuli abstammt), TF-1 (Erythroleukämie-Line) und Phorbolester (PMA)-stimulierte humane periphere Blutleukozyten. Die verwendeten Sonden:
    CACCTGATCGCGAGACCCC (Sinn; SEQ ID Nr: 59);
    CTGGCGGAAGCAGCGGAGCATGC (Gegensinn; SEQ ID Nr: 60);
    wurden konstruiert, um ein 600 bp plazentales Bikunin kodierendes cDNA Fragment zu amplifizieren. Vergleiche wurden durch Einbeziehung von Actin-Primer normalisiert, um ein 800pb Actinfragment zu amplifzieren. Während das 800 bp Fragment, welches auf Agarose-Gelen mit Ethidiumbromid identifziert wurde, in allen Bahnen die gleiche Intensität hatte, war das 600 bp plazentale Bikunin-Fragment in den HUVECs abwesend, aber in jeder anderen Zelllinie in signifikanten Mengen vorhanden. Wir schließen daraus, dass plazentales Bikunin zumindest in einigen Endothelzellen nicht exprimiert wird, jedoch in einigen Leukozyt-Populationen exprimiert wird.
  • Beispiel 9
  • Reinigung und Eigenschaften von plazentalem Bikunin (1–170), welches aus einem Baculovirus/Sf9 Expressionsystem hoch gereinigt wurde.
  • Ein großes plazentales Bikunin-Fragment, welches beide Kunitz-Domänen (plazentales Bikunin 1–170) enthält, wurde in Sf9 Zellen wie folgt exprimiert. Plazentale Bikunin-cDNA, durch PCR erhalten (4E) und innerhalb eines TA-Vektors (sie voriges Beispiel) enthalten, wurde durch Verdau mit HindIII und Xba 1 freigestetzt, welcher ein Fragment ergab, welches durch eine 5' XbaI-Stelle und eine 3' HindIII-Stelle flankiert ist. Dieses Fragment wurde Gelgereinigt und dann in den M13mp19 Vektor (New England Biolabs, Beverly, MA) koniert. In vitro Mutagenese (Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488–492) wurde verwendet, um eine Pst1 Stelle 3' zu der XbaI Stelle am 5' Ende, aber 5' zu der Sequenz, welche die ATG Startstelle, das natürliche plazentale Bikunin-Signalpeptid und die reife plazentale Bikunin-Kodiersequenz kodiert, zu erzeugen. Das für die Mutagenese verwendete Oligonukleotid hatte die Sequenz:
    5' CGC GTC TCG GCT GAC CTG GCC CTG CAG ATG GCG CAC GTG TGC GGG 3' (SEQ ID Nr. 61)
  • Ein Stoppkodon (TAG) und BglII/XmaI Stelle wurde auf ähnliche Weise am 3' Ende der cDNA erzeugt, unter Verwendung des Oligonukleotids:
    5' CTG CCC CTT GGC TCA AAG TAG GAA GAT CTT CCC CCC GGG GGG GTG GTT CTG GCG GGG CTG 3' (SEQ ID Nr. 62)
  • Das Stoppkodon war im Rahmen mit der das plazentale Bikunin kodierenden Sequenz und verursachte die Termination unmittelbar nach dem Lysin beim Aminosäure-Rest 170, und kodiert somit ein verkürztes plazentales Bikunin-Fragment, welchem die mutaßliche Transmembrandomäne fehlt. Das Produkt der Verdauung mit Pst1 und BglII wurde isoliert und in den BacPac8 Vektor für die Expression des plazentalen Bikunin-Fragments (1–170) kloniert, welches beide Kunitz-Domänen enthält, aber welches unmittelbar N-termial zu dem mutmaßlichen Transmembransegment verkürzt ist.
  • Die Expression von Bikunin durch Sf-9 Insektenzellen war bei einer Infektionsdosis von 1 zu 1 optimal, wenn das Medium 72 Stunden nach der Infektion geerntet wurde. Nach der Ernte wurde er Baculovirus-Zellkultur-Überstand (2L) durch die Zugabe von Tris-HCl auf pH 8,0 eingestellt. Bikunin wurde durch Chromatographie mittels einer 5 ml bovinen pankreatischen Kallikrein-Affinitätssäule, wie vorher in Beispiel 7 für die Reinigung von nativem plazentalem Bikunin aus Plazenta beschrieben wurde, gereinigt. Eluiertes Material wurde mit TFA auf pH 2,5 eingestellt und einer Chromatographie auf einer C18 Umkehrphasen-Säule (1,0 × 25 cm), welche in 10 % Acetonitril in 0,1 % TFA bei einer Flussrate von 1 ml/min äquilibriert wurde, unterzogen. Das Bikunin wurde mit einem linearen Gradienten von 10 bis 80 % Acetonitril in 0,1 % TFA über 40 Minuten eluiert. Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst, lyophilisiert, in 50 mM Hepes (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl2 und 0,1% Trition X-100 wieder aufgelöst, und bei –20°C bis zum Gebrauch gelagert. Die Konzentration an rekombinanten Bikunin wurde durch Aminosäure-Analyse bestimmt.
  • Ergebnisse: Rekombinantes Bikunin wurde aus Baculovirus-Zellkultur-Überstand unter Verwendung eines 2-stufigen Reinigungsprotokolls, wie unten gezeigt, gereinigt, um einen aktiven Trypsin-Inhibitor zu ergeben (Tabelle 8 unten).
  • Tabelle 8 Reinigung von rekombinantem Bikunin aus transformierten Kultur-Überstand
    Figure 00620001
  • Chromatographie des Rohmaterials über eine immobilisierte bovine pankreatische Kallikrein-Affinitätssäule isolierte selektiv 0,013% des Proteins und 0,67% der vorhandenen Trypsin inhibitorischen Aktivität. Die Mehrheit der in Ausgangsüberstand vorhandenen Trypsin inhibitorischen Aktivität band nicht an das immobilisierte Kallikrein und ist nicht mit Bikunin verwandt (Ergebnisse nicht gezeigt). Die nachfolgende Chromatographie mittels einer C 18 Umkehrphase ergab eine weitere 5fache Reinigung, mit einer Ausbeute von 0,2%. Die endgültige Zubereitung war durch SDS-PAGE (13) äußerst rein, zeigte ein Mr von 21,3 kDa, und reagierte auf Immunoblots mit Kaninchen-Anti-plazentalem Bikunin 102–159 (nicht gezeigt). Die N-terminale Sequenzierung (26 Zyklen) ergab die erwartete Sequenz für reifes plazentales Bikunin (4F), beginnend bei Rest +1 (ADRER...), was zeigt, dass das Signalpeptid in Sf9 Zellen richtig bearbeitet wurde.
  • Gereinigtes plazentales Bikunin aus Sf9-Zellen (100 pmol) war pyridylethylalkyliert, CNBr verdaut, und dann ohne Auflösung der resuliertenden Fragmente sequenziert. Die Sequenzierung für 20 Zyklen ergab die folgenden N-Terminii:
    Figure 00630001
  • Somit wurden N-Termini gewonnen, die jedem der vier erwarteten Fragmente entsprechen. Dies bestätigt, dass das Sf9 exprimierte Protein, die gesamte Ektodomän-Sequenz von plazentalem Bikunin (1–170) enthielt. Die N-terminale Sequenzierung (50 Zyklen) einer zusätzlichen Probe von unverdautem plazentalem Bikunin (1–170) führte zu einer Aminosäure-Sequenz, die bei Zyklus 30 frei von jeglicher PTH-Aminosäure (PTH-Asparagin wurde erwartet) war. Ein ähnliches Ergebnis wurde bei der Sequenzierung des natürlichen Proteins aus humaner Plazenta (Beispiel 7) erhalten und ist damit übereinstimmend, dass dieser Rest glykosyliert ist, wie aus der Aminosäuresequenz vorhergesagt wurde, die diesen Asparagin-Rest umgibt. Weiters waren die Cysteinreste innerhalb dieser Region auch still, was übereinstimmend war mit ihrer Teilnahme an Disulfidbindungen.
  • Beispiel 10
  • Inhibierungsspezifität von aus Sf9 Zellen abgeleitetem, gereinigtem plazentalem Bikunin
  • Die in vitro Spezifität von rekombinantem Bikunin wurde unter Verwendung der in den Beispielen 3, 4 und 7 beschriebenen Materialien und Verfahren bestimmt. Zusätzlich wurde die Inhibierung von humanem Gewebekallikrein durch Bikunin durch die Inkubierung von 0,35 nM humanem Gewebekallikein mit rekombinantem Bikunin in 50 mM Tris (pH 9,0), 50 mM NaCl, und 0,01% Triton X-100 enthaltendem Puffer, gemessen. Nach 5 Minuten bei 37°C wurde 5μl 2 mM PFR-AMC hinzugefügt und die Änderung der Fluoreszenz überwacht.
  • Die Inhibierung von Gewebe Plasminogen-Aktivator (tPA) wurde auch bestimmt wie folgt: tPA (Einzelkettenform aus menschicher Melanom-Zellkultur von Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) wurde mit Inhibitor für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 150 mM NaCl, und 0,02% Natriumazid enthaltendem 20 mM Tris-Puffer, pH 7,2 vorinkubiert. Die Reaktionen wurde anschließend durch den Transfer in ein Reaktionssystem ausgelöst, welches die folgenden anfänglichen Komponentenkonzentrationen aufweist: tPA (7,5 nM), Inhibitor 0 bis 6,6 mM, DIle-Lpro-Larg-pNitroanilin (1 mM) in 28 mM Tris-Puffer, pH 8,5, der 0,004 % (Vol-%/Vol-%) Trition X-100 und 0,005 % (Vol-%/Vol-%) Natriumazid enthält. Die Bildung von p-Nitroanilin wurde im Anschluß an eine Inkubation für 2 Stunden bei 37°C durch Messen der A405nm bestimmt.
  • Die Tabelle, unten, zeigt die Wirksamkeit des rekombinanten Bikunins als ein Inhibitor von verschiedenen Serin-Proteasen in vitro. Die Daten werden im Vergleich zu Daten gezeigt, die für das Screenen der Inhibierung mit entweder rekombinantem Bikunin oder Aprotinin erhalten wurden.
  • Tabelle 9 Vergleich der Ki-Werte für die Inhibierung von verschiedenen Proteasen durch rekominantes plazentales Bikunin (1–170) oder Aprotintin
    Figure 00640001
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass rekombinantes Bikunin in Insektenzellen exprimiert werden kann, um einen aktiven Protease-Inhibitor zu ergeben, der wirksam gegen zumindest fünf unterschiedliche Serin-Protease-Inhibitoren ist. Rekombinantes Bikunin war wirksamer als Aprotinin gegenüber humanem Plasma-Kallikrein, Trypsin und Plasmin. Überraschenderweise war das rekombinante Bikunin wirksamer als die synthetisch hergeleiteten Bikunin-Fragmente (7–64) und (102–159) gegenüber allen getesteten Enyzmen. Diese Daten zeigen, dass rekombinantes Bikunin wirksamer ist als Aprotinin, unter Verwendung von in vitro Untersuchungen, und dass man eine besser in vivo Wirksamkeit erwarten würde.
  • Außer dem Messen der Wirksamkeiten gegen spezifische Proteasen, wurde die Kapazität von plazentalem Bikunin (1–170), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) zu verlängern, evaluiert und mit der mit Aprotinin-assoziierten Aktivität verglichen. Der Inhibitor wurde in 150 mM NaCl, und 0,02% Natriumazid enthaltendem 20 mM Tris-Puffer, pH 7,2 verdünnt und zu einer Küvette hinzugefügt (0,1 ml), welche innerhalb eines MLA ElectraR 800 automatischen Gerinnungsmesser-Koagulometers (Medical Laboratory Automation, Inc, Pleasantville, N.Y) enthalten ist. Das Instrument wurde auf den APTT-Modus mit einer Aktivierungszeit von 300s und den Duplikatmodus gestellt. Im Anschluß an die Zugabe von 0,1 ml Plasma (speziell untersuchtes Referenzplasma Los 1-6-5185, Helena Laboratories, Beaumont, TX), wurden das APTT Reagens (Automated APTT-Los 102345, von Organon Teknika Corp. Durhan, NC) und 25 mM CaCl2 automatisch verabreicht, um die Gerinnung auszulösen, und die Gerinnungszeit wurde automatisch überwacht. Die Ergebnisse (14) zeigten, dass eine Verdopplung der Gerinnungszeit etwa 2 μM Endkonzentration Aprotinin, jedoch nur 0,3 μM Sf9-abgeleitetes plazentales Bikunin erfordert. Diese Daten zeigen, dass plazentales Bikunin ein wirksames Antikoagulans ist, und als Medikament für Krankheiten nützlich ist, bei denen die pathologische Aktivierung der intrinischen Gerinnungskaskade eingebunden ist.
  • Obwohl bestimmte Ausführungsformen der Erfindung im Detail für Illustrationszwecke beschrieben wurden, ist es für den Fachman leicht erkennbar, das die hierin beschriebenen Verfahren und Formulierungen, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen, modifiziert werden können. Dementsprechend ist die Erfindung nicht beschränkt, außer durch die angeschlossenen Ansprüche.

Claims (14)

  1. Ein im Wesentlichen gereinigtes Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches folgende Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuren der besagten Sequenz in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00660001
  2. Ein im Wesentlichen gereinigtes Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuren der Sequenzen in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00660002
    Figure 00670001
    Figure 00680001
  3. Ein im Wesentlichen gereinigtes Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuren der Sequenzen in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00680002
    Figure 00690001
  4. Ein im Wesentlichen gereinigtes Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches folgende Aminosäuresequenz aufweist, wobei die Aminosäuren der besagten Sequenz in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00690002
  5. Protein gemäß einem der Ansprüche 1–4, worin das Protein glykosyliert ist, oder zumindest eine intra-ketten Cystein-Cystein Disulfidbindung enthält, oder ist sowohl glykoslyliert und enhält auch zumindest eine intra-ketten Cystein-Cystein Disulfidbindung.
  6. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Inhibierung der Serin Protease Aktivität, die das Protein gemäß einem der Ansprüche 1–5 und einem pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
  7. Eine isolierte Nukleinsäuresequenz die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1–4 kodiert.
  8. Ein selbst-replizierender Proteinexpressionsvektor der eine Nukleinsäuresequenz welche ein Protein kodiert und fähig ist ein Protein zu exprimieren gemäß einem der Ansprüche 1–5, beinhaltet.
  9. Ein in vitro Verfahren zur Inhibierung der Serin-Protease Aktivität welches das Kontaktieren der Serin Protease mit einer wirksamen Menge an zumindest einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1–5 aufweist.
  10. Protein gemäß einem der Ansprüche 1–5 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 für die Behandlung von Hirnödem, Rückenmarködem, Multiple Sklerose, Ischämie, Perioperativer Blutverlust, Sepsis, Septischer Schock, Fibrose, pathologische Blutkoagulation oder Gerinnung, Schlaganfall, zerebrale oder subarachnoidale Hämorrhagie, Entzündung des Gehirns, Entzündung des Rückenmarks, zerebrale Infektion, zerebrale Granulomatose, spinale Infektion, spinale Granulomatose, gastrischer Krebs, zervikaler Krebs oder zur Prävention von Metastasen.
  11. Ein im Wesentlichen gereinigtes Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuren der Sequenzen in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00710001
    für die Behandlung von Hirnödem, Rückenmarködem, Multiple Sklerose, Ischämie, Perioperativer Blutverlust, Sepsis, Septischer Schock, Fibrose, pathologische Blutkoagulation oder Gerinnung, Schlaganfall, zerebrale oder subarachnoidale Hämorrhagie, Entzündung des Gehirns, Entzündung des Rückenmarks, zerebrale Infektion, zerebrale Granulomatose, spinale Infektion, spinale Granulomatose, gastrischer Krebs, zervikaler Krebs oder zur Prävention von Metastasen.
  12. Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1–5 für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Hirnödem, Rückenmarködem, Multiple Sklerose, Ischämie, Perioperativer Blutverlust, Sepsis, Septischer Schock, Fibrose, pathologische Blutkoagulation oder Gerinnung, Schlaganfall, zerebrale oder subarachnoidale Hämorrhagie, Entzündung des Gehirns, Entzündung des Rückenmarks, zerebrale Infektion, zerebrale Granulomatose, spinale Infektion, spinale Granulomatose, gastrischer Krebs, zervikaler Krebs oder zur Prävention von Metastasen
  13. Verwendung eines im Wesentlichen gereinigten Serin-Protease inhibitorische Aktivität aufweisendes Protein, welches eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist, wobei die Aminosäuren der Sequenzen in Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz von nativem humanem plazentalem Bikunin, wie in 4F dargestellt numeriert sind, in welchem der N-terminale Rest durch Entfernen von Signalpeptid generiert wird, wird als Rest 1 bezeichnet:
    Figure 00720001
    Figure 00730001
    für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Hirnödem, Rückenmarködem, Multiple Sklerose, Ischämie, Perioperativer Blutverlust, Sepsis, Septischer Schock, Fibrose, pathologische Blutkoagulation oder Gerinnung, Schlaganfall, zerebrale oder subarachnoidale Hämorrhagie, Entzündung des Gehirns, Entzündung des Rückenmarks, zerebrale Infektion, zerebrale Granulomatose, spinale Infektion, spinale Granulomatose, gastrischer Krebs, zervikaler Krebs oder zur Prävention von Metastasen.
  14. Verfahren für die Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1–5 unter Verwendung rekombinanter DNA Technologie.
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