ES2263174T3 - Bikunina humana. - Google Patents

Bikunina humana.

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ES2263174T3
ES2263174T3 ES97915029T ES97915029T ES2263174T3 ES 2263174 T3 ES2263174 T3 ES 2263174T3 ES 97915029 T ES97915029 T ES 97915029T ES 97915029 T ES97915029 T ES 97915029T ES 2263174 T3 ES2263174 T3 ES 2263174T3
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bikunin
placental bikunin
amino acid
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Paul P. Tamburini
Gary Davis
Katherine A. Delaria
Christopher W. Marlor
Daniel K. Muller
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Bayer Corp
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA PROTEINAS, POLIPEPTIDOS, SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO, CONSTRUCCIONES, VECTORES DE EXPRESION, CELULAS HUESPEDES, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS DE, Y PROCEDIMIENTOS PARA, EL USO DE LA BICUNINA PLACENTARIA HUMANA, CAMPOS INDIVIDUALES DE LA PROTEASA DE LA SERINA Y SUS FRAGMENTOS.

Description

Bikunina humana.
Campo de la invención
Las composiciones de la invención se relacionan con el campo de las proteínas las que inhiben la actividad de proteasa de serina. La invención también se relaciona con el campo de las construcciones ácido nucleico, vectores y células huésped para la producción de las proteínas que inhiben la proteasa de serina, composiciones farmacéuticas que contienen la proteína, y los métodos para su uso.
Antecedentes de la invención Problema Dirigido
La pérdida de sangre es una seria complicación de cirugía mayor tal como cirugía de corazón abierto y otros procedimientos complicados. Los pacientes de cirugía cardiaca justifican una proporción significante de transfusión de donante de sangre. La transfusión de sangre lleva riesgos de transmisión de enfermedades y de reacciones adversas. Además, la donación de sangre es costosa y la demanda generalmente excede las existencias. Métodos farmacológicos para reducir la pérdida de sangre y la necesidad resultante para la transfusión ha sido descrita en (revisión por Scott et al., Ann. Thorac. Surg. 50: 843-851, 1990).
Proteína Inhibidora de Proteasa de Serina
La aprotinina, un inhibidor de proteasa de serina bovina de la familia Kunitz es la sustancia activa en el medicamento Trasylol®. La aprotinina (Trasylol®) ha sido reportada por ser eficiente en la reducción de pérdida de sangre perioperativa (Royston et al., Lancet II: 1289-1291,1987; Dietrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 92-98, 1989; Fraedrich et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 37: 89-91,1989); W. van Oeveren et al. (1987), Ann Thorac. Surg. 44, pp 640-645; Bistrup et al., (1988) Lancet I, 366-367), pero efectos adversos, que incluyen hipotensión y sofoco (Bohrer et al., Anesthesia 45: 853-854,1990) y han sido reportadas, reacciones alérgicas (Dietrich et al., Supra). La utilización de aprotinina en pacientes previamente expuestos a este no se recomienda (Dietrich et al., Supra). Trasylol® también se ha empleado para el tratamiento de hemorragia hiperfibrinolítica y choque hemorrágico traumático.
La aprotinina es conocida por inhibir varias proteasas de serina que incluyen tripsina, quimotripsina, plasmina y Kalicreína, y se usa terapéuticamente en el tratamiento de pancreatitis aguda, varios estados de síndrome de choque, hemorragia hiperfibrinolítica e infarto del miocardio (Trapnell et al., (1974) Brit J. Surg. 61: 177; J. McMichan et al., (1982) Choque circulatorio 9:107; Auer et al., (1979) Acta Neurochir. 49: 207; Sher (1977) Am J. Obstet. Gynecol. 129: 164; Schneider (1976), Artzneim.-Firsch. 26:1606). Se piensa generalmente que Trasylol® reduce la pérdida de sangre in vivo a través de la inhibición de Kalicreína y plasmina. Se ha encontrado que la aprotinina (3-58, rg15, Ala17, Ser42) muestra potencia inhibidora de Kalicreína en plasma, mejorada en comparación con la aprotinina natural por si misma (WO 89/10374).
Problemas con aprotinina
Puesto que la aprotinina es de origen bovino, hay un riesgo limitado de inducir la anafilaxis en pacientes humanos sobre expuestos al medicamento. De esta manera, un equivalente funcional a la aprotinina, en virtud de un riesgo bajo de anafilaxis, sería más útil y deseable para tener.
La aprotinina también es nefrotóxica en roedores y perros cuando se administra repetidamente a altas dosis (Bayer, Trasylol®, Inhibidor de proteinasa; Glasser et al., in "Verhandlungen der Deutschen Gesellschaft fur Innere Medizin, 78. Kongress", Bergmann, Munchen, 1972 pp. 1612-1614). Una hipótesis atribuye este efecto a la acumalación de aprotinina en los túbulos proximales del riñón cargados negativamente, debido a su alta carga positiva neta (WO 93/14120).
Consecuentemente, un propósito de la presente invención es identificar las proteínas humanas con actividad funcional similar a la aprotinina. También fue un objeto de la invención instantánea identificar las proteínas humanas, que estarían menos cargadas, pero muestran la misma especificidad de la proteasa, altamente similar, o mejorada como la encontrada para la aprotinina, especialmente con respecto a la potencia de la inhibición plasmina y Kalicreína. Luego, tales inhibidores podrían usarse como medicamentos en pacientes humanos con riesgos reducidos de la respuesta inmune adversa y la nefrotoxicidad reducida.
A pesar de que una proteína que tiene actividad inhibitoria sobre la actividad de la proteasa del activador del factor de crecimiento de hepatocito se reveló en EP-A-0758682, la secuencia del nucleótido revelada en esta, no es idéntica a las secuencias reivindicadas en la presente invención. Las secuencias reveladas en EP-A-0758682 son más largas que las secuencias reivindicadas en la presente invención.
Breve resumen de la invención
La invención instantánea provee para un inhibidor de proteasa de serina humana purificada, el que puede específicamente inhibir la Kalicreína, que ha sido aislada a partir de tejido de placenta humana por cromatografía de afinidad.
La invención instantánea provee una proteína humana identificada recientemente, llamada en esta, bikunina placentaria humana que contiene dos dominantes de inhibidores de proteasa de serina de la clase Kunitz.
La invención instantánea provee proteínas, composiciones farmacéuticas, ácidos nucleicos, vectores, métodos y aplicaciones según las precisiones en las reivindicaciones.
En una modalidad preferida la invención instantánea proporciona a la proteína bikunina placentaria humana que tiene la secuencia del aminoácido:
1
En un aspecto, la actividad biológica de la proteína de la invención instantánea, es que esta puede unir y sustancialmente inhibir la actividad biológica de la tripsina, plasma humano y tejido de kalicreínas, plasmina humana y Factor XIIa. En una modalidad preferida, la presente invención provee para una proteína de la bikunina placentaria humana nativa, en forma glicosolada. En una modalidad adicional, la invención instantánea abarca una proteína bikunina humana nativa que ha sido formada de tal manera que contenga al menos un enlace disulfuro cisteina-cisteina. En una modalidad preferida, la proteína contiene al menos un enlace disulfuro cisteina-cisteina intra-cadena formado entre un par de cisteinas seleccionadas del grupo que consiste de CYS11-CYS61, CYS20-CYS44, CYS36-CYS57, CYS106-CYS156, CYS115-CYS139, y CYS131-CYS152, en donde las cisteinas son numeradas de acuerdo con la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa. Alguien de ordinaria habilidad reconocería que la proteína de la invención instantánea puede doblar en la conformación tri-dimensional apropiada, tal que la actividad biológica de la bikunina humana nativa se mantiene, donde ningún, uno o más, o todos los enlaces de cisteina-disulfuro de cisteina intracadena nativos, están presentes. En una modalidad más preferida, la proteína de la invención instantánea está doblada apropiadamente y se forma con todos los enlaces de disulfuro cisteina-cisteina nativos apropiados.
La proteína activa de la invención instantánea puede obtenerse por purificación a partir de tejido humano, tal como placenta, o por técnicas químicas de proteínas sintéticas, como se ilustra por los Ejemplos de abajo. También se entiende que la proteína de la invención instantánea puede obtenerse empleando técnicas de biología molecular, donde los vectores auto replicantes son capaces de expresar la proteína de la invención instantánea a partir de células transformadas. Tal proteína pude hacerse como formas no-secretadas, o secretadas a partir de células transformadas. Con el fin de facilitar la secreción a partir de las células transformadas, para incrementar la estabilidad funcional de la proteína traducida, o para ayudar al doblamiento de la proteína bikunina, ciertas secuencias de péptidos señal pueden adicionarse a la porción NH_{2}-Terminal de la proteína bikunina humana nativa.
En una modalidad, la invención instantánea proporciona así, a la proteína bikunina humana nativa con al menos una porción de la secuencia de péptido señal nativa intacta. Así una modalidad de la invención provee a la bikunina humana nativa al menos parte del péptido señal, que tiene la secuencia de aminoácido:
2
En un sistema de numeración preferida empleado en esta, el aminoácido numerado +1 se asigna al NH_{2}-Terminal de la secuencia de aminoácido para la bikunina placentaria humana nativa. Se reconocerá fácilmente que los fragmentos de proteína funcional pueden derivarse a partir de la bikunina placentaria humana nativa, la cual mantendrá al menos parte de la actividad biológica de la bikunina placentaria humana nativa, y actúa como inhibidores de proteasa de serina.
En una modalidad, la proteína de la invención instantánea comprende un fragmento de la bikunina placentaria humana nativa, que consiste de al menos un dominio funcional similar a Kunitz, que tiene la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa 7-159, a partir de ahora llamada "bikunina (7-159)". De esta manera la invención instantánea contiene una proteína que tiene la secuencia de aminoácido:
3
donde la numeración de aminoácido es propia de que la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa. Otra variante funcional de esta modalidad puede ser el fragmento de la bikunina placentaria humana nativa, el que contiene al menos un dominio funcional similar a Kunitz, que tiene la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa 11-156, bikunina (11-156)
4
Se puede reconocer que los dominios individuales similares a Kunitz también son fragmentos de la bikunina placentaria nativa.
Alguien de habilidad ordinaria reconocerá que pueden hacerse los fragmentos de la proteína bikunina humana nativa, los que retendrán al menos algo de la actividad biológica de la proteína nativa. Tales fragmentos también pueden combinarse en diferentes orientaciones o combinaciones múltiples para proporcionar a las proteínas alternativas que retienen algo de, la misma, o más actividad biológica de la proteína bikunina humana nativa.
Se reconocerá fácilmente que la proteína activa biológicamente de la invención instantánea puede comprender uno o más de los dominios similares a Kunitz en combinación con dominios similares a Kunitz adicionales a partir de otras fuentes. La proteína activa biológicamente de la invención instantánea puede comprender uno o más de los dominios similares a Kunitz instantáneos en combinación con dominios de proteína adicional a partir de otras fuentes con una variedad de actividades biológicas. La actividad biológica de la proteína de la invención instantánea puede combinarse con la de otra proteína o proteínas conocidas para proveer las proteínas de fusión multifuncional que tienen actividad biológica predecible.
En una modalidad, la invención instantánea provee a la proteína bikunina humana nativa purificada sustancialmente, o producida recombinantemente con un segmento intacto de la secuencia líder, y al menos una porción de la región transmembrana nativa intacta. Así una modalidad de la invención proporciona al bikunina humana nativa, con una secuencia líder intacta, y con al menos parte del dominio transmembrana (subrayado), que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir de:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
donde secuencia 1) es SEQ ID NO: 45 consenso derivado EST, 2) es SEQ ID NO: 47 clon de PCR, y 3) es SEQ ID NO: 49 clon de cADN lambda. En una modalidad preferida una proteína de la invención instantánea comprende una de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 45, 47 o 49 en donde la proteína ha sido dividida en la región entre el final del último dominio Kunitz y la región transmembrana.
Las secuencias de aminoácidos de la proteína de la invención instantánea enseñan claramente a alguien del oficio, las secuencias de ácido nucleico apropiadas que pueden ser empleadas en técnicas de biología molecular para producir las proteínas de la invención instantánea. En una modalidad, la invención instantánea provee un consenso de la secuencia de ácido nucleico de la Figura 4C (SEQ ID NO: 51) que codifica a una secuencia de aminoácido de la Figura 4D (SEQ ID NO: 45).
En una modalidad preferida, la invención instantánea provee a una secuencia de ácido nucleico que codifica a la bikunina placentaria humana nativa que tiene la secuencia de ADN de la Figura 4F (SEQ ID NO: 48) que codifica a la secuencia de proteína de SEQ ID NO: 49. En otra modalidad, la invención instantánea provee a una secuencia de ácido nucleico de la Figura 4E (SEQ ID NO: 46) que codifica a una secuencia de la proteína de SEQ ID NO: 47.
Se puede reconocer fácilmente que ciertas mutaciones alélicas, y sustituciones conservadoras hechas en la secuencia de ácido nucleico pueden hacerse, lo cual resultará en una secuencia de aminoácido de proteína comprendida por la invención instantánea. Expertos en el oficio pueden reconocer que ciertas mutaciones alélicas naturales de la proteína de la invención instantánea, y sustituciones conservadoras de aminoácidos en la proteína de la invención instantánea no alterarán significantemente la actividad biológica de la proteína, y son comprendidas por la invención instantánea.
También la invención instantánea provee composiciones farmacéuticas que contienen la bikunina placentaria humana y los fragmentos de esta, que son útiles para la reducción de la pérdida de sangre perioperativa en un paciente que se hace una cirugía.
También la presente invención provee composiciones farmacéuticas para reducir la pérdida de sangre perioperativa en un paciente que se hace una cirugía, en donde una cantidad efectiva de los inhibidores de proteasa de serina humana revelados de la presente invención en un vehículo compatible biológicamente, se administra al paciente.
La presente invención también provee las variantes de la bikunina placentaria, y los dominios de Kunitz específicos descritos anteriormente, que contienen sustituciones de aminoácidos que alteran la especificidad de la proteasa. Los sitios preferidos de sustitución son indicados abajo como posiciones Xaa^{1} a través de Xaa^{32} en la secuencia de aminoácido para la bikunina placentaria nativa. También son preferidas, sustituciones en Xaa^{1} a través de Xaa^{16} por variantes de bikunina (7-64), mientras son preferidas, las sustituciones de Xaa^{17} a través de Xaa^{32} por variantes de bikunina (102-159).
En el contexto actual, el término "residuo del aminoácido que ocurre naturalmente" tiene la intención de indicar cualquiera de los 20 aminoácidos que se dan comúnmente, i.e., Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
Sustituyendo uno o más aminoácidos en una o más de las posiciones indicadas anteriormente, pude ser posible cambiar el perfil de la especificidad inhibitoria de la bikunina placentaria nativa o aquel del dominio similar a Kunitz individual, bikunina (7-64) o bikunina (102-159) así que este inhibe preferencialmente otras proteasas de serina tal como, pero no limita a, las enzimas de la cascada complemento, TF/FVIIa, FXa, trombina, elastasa del neutrófilo, catepsina G o proteinasa-3.
Ejemplos de variantes preferidas de la bikunina placentaria incluyen aquellas en donde Xaa^{1} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de His, Glu, Pro, Ala, Val o Lys, en particular en donde Xaa^{1} es His o Pro; o en donde Xaa^{2} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala, Lys, en particular en donde Xaa^{2} es Val o Thr; o en donde Xaa^{3} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Pro, Ile, Leu, Thr, en particular en donde Xaa^{3} es Arg o Pro; o en donde Xaa^{4} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Lys y Ser, Gln, en particular en donde Xaa^{4} es Arg o Lys; o en donde Xaa^{5} es un residuo del aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Ala, Gly, Asp, Thr, en particular en donde Xaa^{5} es Ala; o en donde Xaa^{6} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg, Phe, en particular en donde Xaa^{6} es Ser o Arg ; o en donde Xaa^{7} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular en donde Xaa^{7} es Met o Ile; o en donde Xaa^{8} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Pro, Lys, Thr, Gln, Asn, Leu, Ser o Ile, en particular en donde Xaa^{8} es Pro o Ile; o en donde Xaa^{9} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Lys o Leu, en particular en donde Xaa^{9} es Arg: o en donde Xaa^{10} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Ile, Lys, Ala, Pro, Phe, Trp, Gln, Leu y Thr, en particular en donde Xaa^{10} es Val; o en donde Xaa^{11} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly, Ser y Thr, en particular en donde Xaa^{11} es Gly; o en donde Xaa^{12} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Asp, Arg, Glu, Leu, Gln, Gly, en particular en donde Xaa^{12} es Asp o Arg; o en donde Xaa^{13} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly y Ala; o en donde Xaa^{14} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Asn o Lys; o en donde Xaa^{15} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val, y Lys, en particular en donde Xaa15 es Leu o Lys; o en donde Xaa^{16} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Gln, Asp, Gly, IIe, Ala, Met, y Val, en particular en donde Xaa^{16} es Val o Ala; o en donde Xaa^{17} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de His, Glu, Pro, Ala, Lys y Val, en particular en donde Xaa^{17} es Glu o Pro; o en donde Xaa^{18} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Thr, Asp, Pro, Arg, Tyr, Glu, Ala o Lys, en particular en donde Xaa^{18} es Thr; o en donde Xaa^{19} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Pro, Ile, Leu o Thr, en particular en donde Xaa^{19} es Pro; o en donde Xaa^{20} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Lys, Gln y Ser, en particular en donde Xaa^{20} es Arg o Lys; o en donde Xaa^{21} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Ala, Asp, Thr o Gly; en particular en donde Xaa^{21} es Ala; o en donde Xaa^{22} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Ser, Ile, Tyr, Asn, Leu, Val, Arg o Phe, en particular en donde Xaa^{22} es Ser o Arg; o en donde Xaa^{23} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Met, Phe, Ile, Glu, Leu, Thr y Val, en particular en donde Xaa^{23} es Phe o Ile; o en donde Xaa^{24} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Pro, Lys, Thr, Asn, Leu, Gln, Ser o Ile, en particular en donde Xaa^{24} es Pro o Ile; o en donde Xaa^{25} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Arg, Lys o Leu, en particular en donde Xaa^{25} es Arg: o en donde Xaa^{26} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Ile, Lys, Leu, Ala, Pro, Phe, Gln, Trp y Thr, en particular en donde Xaa^{26} es Val o Ile; o en donde Xaa^{27} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly, Ser y Thr, en particular en donde Xaa^{27} es Gly; o en donde Xaa^{28} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Asp, Arg, Glu, Leu, Gly o Gln, en particular en donde Xaa^{28} es Arg; o en donde Xaa^{29} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly y Ala; o en donde Xaa^{30} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Asn o Lys; o en donde Xaa^{31} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Gly, Asp, Leu, Arg, Glu, Thr, Tyr, Val, y Lys, en particular en donde Xaa^{31} es Arg o Lys; o en donde Xaa^{32} es un residuo del aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de Val, Gln, Asp, Gly, Ile, Ala, Met, y Thr, en particular en donde Xaa^{32} es Gln o Ala.
Descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor a partir de una consideración de la siguiente descripción y reivindicaciones, tomadas en conjunción con los dibujos, en los cuales:
Figura 1 representa la secuencia del nucleótido de EST R35464 (SEQ ID NO: 12) y la traducción de esta secuencia de ADN (SEQ ID NO: 13) que produce un marco de lectura abierta con alguna similaridad a la secuencia de la aprotinina. El producto de traducción contiene 5 de las 6 cisteinas en el correcto espaciamiento que es característico para el dominio inhibidor similar a Kunitz (indicado en negrilla). La posición normalmente ocupada por la cisteina remanente (en el codón 38) contenido en lugar de una fenilalanina (indicado por un asterisco).
Figura 2 representa la secuencia del nucleótido de EST R74593 (SEQ ID NO: 14), y la traducción de esta secuencia de ADN (SEQ ID NO: 15) la cual produce un marco de lectura abierta con homología a la clase de Kunitz del dominio inhibidor de proteasa de serina. El producto de la traducción contiene 6 cisteinas en el correcto espaciamiento que es característico para los dominios inhibidores similares a Kunitz (indicado en negrilla). Sin embargo, esta secuencia del marco de lectura incluye detener los codones en el codón 3 y 23.
Figura 3 representa una secuencia de ácido nucleico deducida de la bikunina placentaria humana (SEQ ID NO: 9) marcada "consenso" y corresponde con la secuencia de aminoácido de proteína traducida marcada "traducida" (SEQ ID NO: 10). También como comparación se muestra la secuencia de ácido nucleico para ESTs H94519 (SEQ ID NO: 16), N39798 (SEQ ID NO: 17), R74593 (SEQ ID NO: 14) y R35464 (SEQ ID NO: 12). Los nucleótidos subrayados en la secuencia de consenso corresponden con el sitio de los cebadores PCR descritos en los Ejemplos. Los aminoácidos subrayados en la secuencia de consenso traducida son residuos cuya identidad ha sido confirmada por la secuenciación de aminoácidos de la bikunina placentaria humana nativa purificada. Los códigos del nucleótido y del aminoácido son códigos de letras solas estándar, "N" en el código de ácido nucleico indica un ácido nucleico en disponibilidad, y "*" indica un codón detenido en la secuencia de aminoácido.
Figura 4A representa la cubierta original de una serie de ESTs con alguna homología de la secuencia de ácido nucleico para la codificación ESTs de la bikunina placentaria humana, o porciones de esta. Mostrando por referencia estas las posiciones relativas de bikunina (7-64) y bikunina (102-159), marcadas KID1 y KID2 respecti-
vamente.
Figura 4B representa una cubierta EST subsecuentemente más comprensiva que incorpora ESTs adicional. Los números sobre el eje de X superior refieren a la longitud en pares base, iniciando en la primera base de la mayoría de las secuencias 5' EST. La longitud de cada corte esta en proporción a la longitud en pares de base de la ESTs individual que incluye aberturas Los números de acceso EST se indican a la derecha de su corte EST respec-
tivo.
Figura 4C representa la correspondiente alineación de las secuencias de oligonucleótidos de cada uno de los ESTs superpuestos, mostrada esquemáticamente en la Figura 4B. La secuencia superior (SEQ ID NO: 51) marcada de la bikunina representa la secuencia del oligonucleótido del consenso derivado a partir de los nucleótidos superpuestos en cada posición. Los números se refieren a las posiciones de par de bases entre el mapa de EST. Los oligonucleótidos en EST R74593 que están subrayados en negrilla (posiciones en el mapa 994 y 1005) son inserciones de base observadas en R74593 que estuvieron ausentes consistentemente en cada una de las otras ESTs superpuestas.
Figura 4D representa la traducción del aminoácido de la secuencia del oligonucleótido del consenso para bikunina representado en la Figura 4C (SEQ ID NO: 45).
Figura 4E representa la secuencia del nucleótido (SEQ ID NO: 46) y la correspondiente traducción del aminoácido (SEQ ID NO: 47) de una secuencia codificando la bikunina placentaria que se derivó a partir de una librería de cADN de placenta humana por amplificación de PCR-basada.
Figura 4F representa la secuencia del nucleótido (SEQ ID NO: 48) y la correspondiente traducción del aminoácido (SEQ ID NO: 49) de un clon codificando la bikunina placentaria humana nativa que se aisló a partir de una librería de cADN lambda de placenta humana mediante hibridación de colonias.
Figura 4G compara la alineación de las secuencias de oligonucleótidos de aminoácido traducidas para bikunina placentaria obtenida por cubierta de EST (SEQ ID NO: 45), clonación basada en PCR (SEQ ID NO: 47), e hibridación de colonias lambda convencionales (SEQ ID NO: 49).
Figura 5 muestra una gráfica de purificación de la bikunina placentaria humana a partir de tejido de placenta después de Gel-Filtración con Superdex 75. El registro es una cubierta del perfil de elusión de la proteína medida por OD 280 nm (línea sólida), la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de tripsina (% de inhibición mostrado por círculos), y la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de kalicreína (% de inhibición mostrado por cuadrados).
Figura 6 muestra una gráfica la cual registra la purificación de la bikunina placentaria humana a partir de tejido de placenta empleando cromatografía de Fase Reversa C18. El registro es una cubierta del perfil de elusión de la proteína medida por OD 215 nm (línea sólida), la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de tripsina (% de inhibición mostrado por círculos), y la actividad de la proteína eluida en un ensayo de inhibición de kalicreína (% de inhibición mostrado por cuadrados).
Figura 7 representa un gel SDS-PAGE teñido con plata de la bikunina placentaria altamente purificada (senda 2), y una serie de proteínas marcadoras de tamaño molecular (senda 1) de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración fue de arriba a abajo.
Figura 8 muestra la cantidad de actividad inhibitoria de tripsina presente en el caldo de fermentación de célula-libre a partir del crecimiento de cepas de levadura SC101 (panel 8A) o WHL341 (panel 8B) que se transformaron establemente con un plásmido (pS604) que orienta la expresión de la bikunina placentaria (102-159).
Figura 9 muestra ambos un SDS-PAGE teñido con plata (panel izquierdo) y un Western blot con anti-bikunina placentaria (102-159) pAb (panel derecho) de caldo de fermentación de célula-libre a partir de cepas de levadura SC101 (recombinantes 2.4 y 2.5) que se transformó establemente con un plásmido orientando la expresión de cualquiera aprotinina bovina, o bikunina placentaria (102-159). La migración fue de arriba a abajo.
Figura 10 es una fotografía que muestra un SDS-PAGE teñido de plata de bikunina placentaria altamente purificada (102-159) (senda 2) y una serie de proteínas marcadoras de tamaño molecular (senda 1) de los tamaños indicados en kilodaltons. La migración fue de arriba a abajo.
Figura 11 es una fotografía que muestra los resultados de Northern blots de mARN a partir de varios tejidos humanos que se hibridizaron a un tejido marcador que se hibridizó a una sonda de cADN marcada con 32P, codificando ya sea bikunina placentaria (102-159) (panel 11A) o codificando bikunina placentaria (1-213) (panel 11B). La migración fue de arriba a abajo. Los números a la derecha de cada mancha se refieren al tamaño en kilo bases de los marcadores de RNA. Los órganos a partir de los cuales el mARN se derivó se describen bajo cada senda de la mancha.
Figura 12 representa una inmunotransferencia de placenta derivada de bikunina placentaria con antisuero de conejo cultivado contra ya sea bikunina placentaria reducida sintética (7-64) (panel A) o 102.159 (panel B). Para cada panel, los contenidos fueron: marcadores de tamaño molecular (senda 1); la bikunina placentaria nativa aislada a partir de placenta humana (senda 2); la bikunina placentaria sintética (7-64) (senda 3) y la bikunina placentaria sintética (102-159) (senda 4). Geles SDS-PAGE de Tricina al 10-20% se mancharon y se desarrollaron con proteína A-purificada del anticuerpo policlonal primario (8 ug IgG en 20 ml 0.1% BSA/Tris-solución salina reguladora (pH 7.5)), seguido por anticuerpo secundario anti-conejo de cabra fosfatasa-conjugado alcalino. La migración fue de arriba a abajo.
Figura 13 representa un gel SDS-PAGE de tricina al 10-20% teñido de azul Coomassie de 3 microgramos de bikunina placentaria altamente purificado (1-170) derivado a partir de un sistema de báculo virus/expresión Sf9 (senda 2). La senda 1 contiene los marcadores de tamaño molecular. La migración fue de arriba a abajo.
Figura 14 representa una comparación del efecto del incremento de concentraciones de ya sea bikunina placentaria humana Sf9-derivada (1-170) (círculos rellenos), bikunina placentaria sintética (102-159) (círculos abiertos), o aprotinina (cuadrados abiertos) sobre la actividad parcial del tiempo de tromboplastina de plasma humano. La coagulación se inicio con CaCl_{2}. La concentración de proteínas se registró frente a la doble prolongación en el tiempo de coagulación. El tiempo de coagulación sin inhibición fue de 30.8 segundos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención abarca una proteína humana identificada recientemente, llamada bikunina placentaria humana que contiene dos dominios inhibidores de proteasa de serina de la clase Kunitz. La invención instantánea también abarca composiciones farmacéuticas que contienen bikunina placentaria y fragmentos de esta que son útiles para la reducción de pérdida de sangre perioperativa en un paciente que se hace una cirugía, o con un trauma mayor.
Una aplicación preferida para bikunina placentaria, dominios aislados, y otras variantes, es para la reducción de pérdida de sangre que resulta de trauma o cirugía que tiene el potencial para la pérdida de grandes volúmenes de sangre. Estos métodos y composiciones reducen o eliminan la necesidad para la totalidad del donante de sangre o los productos de sangre, por esta razón la reducción del riesgo a la infección y otros efectos colaterales adversos, así como el costo de cirugía. Las proteínas son útiles en la reducción de pérdida de sangre en pacientes normales, i.e., aquellos que no sufren de deficiencias de nacimiento u otras deficiencias preoperativas en factores de coagulación. La reducción en la pérdida de sangre se ha visto como una reducción en la pérdida de sangre durante la cirugía, como drenaje post quirúrgico reducido o ambos. Usos preferidos incluyen pero no limitan a, uso en cirugía torácica y abdominal, cirugías de reemplazo de cadera parcial y total y cirugías para tratar un paciente que tiene una lesión epitelial del ojo. Usos torácicos preferidos, incluyen pero no limitan a, derivación aortocoronaria, escisión de aneurismas cardiacos y aórticos, y cirugía para varices esofágicas, y cirugía de derivación de arteria coronaria. Usos abdominales preferidos, incluyen pero no limitan a, transplantes de hígado, protatectomía radical, resección de tumor sobre la aorta abdominal para úlceras duodenales, y reparación del hígado o trauma del bazo. Usos preferidos para el tratamiento de trauma incluyen pero no limitan al uso en estabilización de pacientes heridos gravemente en sitos de accidente que sufren a partir de, por ejemplo, pérdida de extremidad o heridas torácica/abdominal mayores. En caso del uso para la reducción de pérdida de sangre resultante de cirugía se prefiere para administrar la bikunina placentaria, dominios aislados, u otras variantes previas y durante la cirugía, mientras en caso del uso, en ajustes del trauma, la variante de bikunina placentaria, dominio aislado u otra variante para ser administrada tan rápido como sea posible después de la herida, y sería contenido en vehículos de emergencia que viajan a los sitios de los accidentes.
El Factor XII (también conocido como Factor Hageman) es una proteasa de serina que se encuentra en la circulación en una forma zimógeno (80 kD) a aproximadamente 29-40P g/ml (ver Pixley, et al. (1993) Meth. in Enz., 222, 51-64) y se activa por Kalicreína en tejido y plasma. Una vez activado, participa en la senda intrínseca de la coagulación de la sangre la cual se activa cuando la sangre o el plasma contacta una superficie "extraña" o aniónica. Una vez activada, el Factor XIIa luego puede partirse y activar un número de otras proteasas del plasma que incluyen Factor XI, prekalicreína, y C1 del sistema complementario. De esta manera el Factor XII puede involucrarse en la causa de reacciones hipotensivas desde que se activa la Kalicreína puede partir el kininógeno liberando bradicinina (ver Colman, (1984) J. Clin. Invest., 73, 1249).
La septicemia es una enfermedad que resulta de infección bacteriana debida a una bacteria endotóxica o lipopolisacárido (LPS). La exposición del Factor XII a los resultados LPS en la activación del Factor XII. Los pacientes con septicemia frecuentemente tienen síntomas de coagulación intravascular que también puede ser debida a la activación del Factor XII por LPS. El choque séptico puede resultar a partir de la infección bacteriana y se asocia con fiebre, resistencia vascular sistémica baja, y presión arterial baja. Esto es una causa común de muerte en la unidad de cuidados intensivos en los Estados Unidos, donde setenteta y cinco por ciento de los pacientes que mueren de choque séptico tienen una hipotensión persistente (ver Parillo, et al. (1989) Ann Rev. Med., 40,469-485). Síndrome de dificultad respiratoria del adulto se caracteriza por edema pulmonar, hipoxemia, y disminución de la adaptabilidad pulmonar. La patogénesis de la enfermedad es desconocida actualmente aunque se considera que la senda proteolítica de coagulación y la fibrinólisis juegan un papel (ver Carvalho, et al. (1988) J. Lab. Clin. Med., 112:270-277).
Las proteínas de la invención instantánea también son un novedoso inhibidor de Kalicreína tipo Kunitz humano, un activador del Factor XII. De tal manera que también se describe, un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico de las reacciones inflamatorias sistémicas tales como choque séptico, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS), preeclampsia, falla orgánica múltiple y coagulación intravascular diseminada (DIC). La administración terapéutica o profiláctica de los péptidos de la invención instantánea resultaría en la modulación de estas condiciones inflamatorias y ser benéficas al paciente.
La plasmina juega un papel importante en la degradación de matriz extracelular y la activación de las cascadas de proteasa matriz-metalo (MMP). Colectivamente estas proteasas mediadas por migración de e invasión de tejido por ambos células endoteliales durante angiogénesis/neovascularización, y células de cáncer durante la metástasis. La neovascularización es esencial para el apoyo del crecimiento del tumor y la metástasis es un proceso que media la diseminación de los tumores y que es asociado con el pronóstico del paciente extremadamente pobre.
Muchos estudios preclínicos sugieren que los inhibidores de proteasa de serina similares a Kunitz con una especificidad de la proteasa similar a la aprotinina son útiles como medicamentos para cáncer. Por ejemplo, la aprotinina reduce el crecimiento la invasión del tumor y, con incremento de necrosis del tumor cuando se administra a hámsteres que padecen de un fibrosarcoma altamente invasivo o a ratones que padecen de un carcinoma mamario maligno de manera similar (Latner et al., (1974), Br. J. Cancer 30: 60-67; Latner y Turner, (1976), Br. J. Cancer 33: 535-538). Adicionalmente, la administración de 200,000 KIU de aprotinina i.p. a ratones macho C57B1/6 Cr en los días 1 a 14 post-inoculación con células de carcinoma de pulmón de Lewis, metástasis pulmonar reducida por el 50% aunque no tiene efecto sobre masa de tumor primario (Giraldi et al., (1977) Eur. J. Cancer, 13:1321-1323). Similarmente, la administración de 10,000 KIU i.p. en cada uno de los días 13-16 de post-inoculación de ratones C57BL/6J con células de tumor Lewis se inhibió la metástasis pulmonar en el 90% sin afectar el crecimiento del tumor primario (Uetsuji et al., (1992), Jpn. J. Surg. 22: 429-442).
En este mismo estudio, la administración de plasmina o Kalicreína con el mismo horario de dosificación se discutió el incremento del número de metástasis pulmonar. Estos resultados impulsaron a los autores a sugerir que la administración perioperativa de aprotinina a pacientes con cáncer puede reducir la probabilidad de metástasis. Black y Steger (1976, Eur. J. Pharmacol., 38: 313-319) encontraron que la aprotinina inhibe el crecimiento del linfosarcoma en ratas de roedores Murphy-Strum transplantados y sugerir que el efecto involucra la inhibición del sistema de enzima que sintetiza la cinina. Inyecciones i.p., diariamente dos veces de hembras de ratón ddY con 10,000 KIU de aprotinina por 7 semanas para cada ratón llevando un solo carcinoma de células escamosas autóctonas que resultan a partir del tratamiento con 3-metilcolantreno reduce el índice de crecimiento de los tumores primarios en el 90%. En algunos animales se observó la regresión del tumor. Mientras que todos los animales tratados con el vehículo habían muerto dentro de las siete semanas, todo el grupo del tratamiento con aprotinina sobrevivió. La reducción del crecimiento del tumor se asoció con la hiperqueratosis (Ohkoshi, Gann (1980), 71: 246-250).
Clínicamente, un grupo curado quirúrgicamente de 26 pacientes quienes recibieron aprotinina i.v. exhibieron un 70% de supervivencia dos años post-cirugía sin recurrencia de tumores mientras que un grupo del placebo de 26 pacientes al mismo tiempo exhibieron únicamente un 38% de supervivencia con un índice significante de recurrencia del tumor (Freeman et al. Br. Soc. Gastroenterol. (1980) supplement A: 902). En un estudio del caso (Guthrie et al., Br. J. Clin. Pract (1981) 35: 330-332), la administración de aprotinina más bromocriptina a un paciente con cáncer avanzado del cuello de útero causó remisión. La aprotinina se administró a ambos como un bolus i.p. 500,000 KIU cada ocho horas al mismo tiempo con una infusión i.v. continua de aprotinina a una rata de 200,000 KIU por 6 horas para un total de siete días una vez al mes. El tratamiento se terminó al final del cuarto mes debido al desarrollo de una reacción alérgica a la aprotinina. Evidencias más recientes han acentuado adicionalmente un papel de la plasmina como un objetivo para estos efectos de efectos de aprotinina sobre la metástasis.
El mecanismo para estos eventos podría relacionarse con el hecho que la aprotinina bloquea el potencial invasivo de las líneas celulares del cáncer (Liu G., et al., Int J. Cancer (1995), 60: 501-506). Adicionalmente, dado que las proteínas de la invención instantánea también son potentes inhibidores de plasmina y kallikrien, ellas están contempladas para usar como agentes anti-cáncer. Por ejemplo ellas están contempladas para usar en el bloqueo de crecimiento del tumor primario por restricción de la neovascularización, invasión del tumor primario y en el bloqueo de metástasis a través de la inhibición de infiltración tisular. Los compuestos pueden ser administrados localmente a tumores o sistémicamente. En un modo preferido del tratamiento, la proteína sería administrada perioperativamente durante la resección del tumor para minimizar el riesgo de metástasis. En tal régimen, las propiedades tradicionales de la sangre del compuesto serían adicionalmente ventajosas en el suministro de un campo visual quirúrgico más claro. Otro modo preferido de administración sería una terapia de combinación con ya sea inhibidores MMP o quimioterapia. Un modo preferido adicional de administración sería terapia génica administrada localmente, designada a lograr la expresión selectiva de la bikunina placentaria dentro de las células del tumor, o sus lechos vasculares y estromas asociados.
Tipos preferidos de cánceres blanco para la terapia serían tumores sólidos vasular-dependiente tales como carcinomas de seno, colon, pulmón, próstata y ovarios los cuales muestran un potencial metástico alto, y aquellos para los cuales la entrega local de una alta concentración de la proteína es factible tales como cánceres de pulmón a través de una entrega pulmonar, carcinomas de colon a través de una entrega hepática para metástasis de hígado, o cánceres de piel tales como carcinomas de cabeza y cuello o melanomas a través de entregas subcutáneas. Dado que las proteínas de la presente invención son de origen humano serían probablemente menos asociadas con reacciones alérgicas o anafilácticas de la clase observada por Guthrie et al., supra, sobre la reutilización.
Adicionalmente, las proteínas de la presente invención se contemplan para utilizar en la reducción de complicaciones tromboembólicas asociadas con la activación del sistema intrínseco de coagulación. Esto incluiría la prevención de embolia pulmonar en pacientes de cáncer en fase avanzada, una causa de muerte frecuente (Donati MB., (1994), Haemostasis 24:128-131).
Edema cerebral y de médula espinal es una complicación que resulta de lesión traumática del cerebro o médula espinal, accidente cerebrovascular, isquemia cerebral, hemorragia subaracnoidea y cerebral, cirugía (que incluye cirugía de corazón abierto), enfermedades infecciosas tales como encefalitis y meningitis, enfermedad granulomatosa tal como Sarcoide y carcinomas difusos o focales, y es un contribuyente a alto nivel de la morbilidad y muerte que siguen de estos eventos. La bradicinina se conoce por desestabilizar la barrera hematoencefálica experimentalmente (Greenwood J., (1991), Neuroradiology, 33: 95-100; Whittle et al., (1992), Acta Neurochir., 115:53-59), y la infusión de bradicinina en la arteria carótida interna induce edema en el cerebro espontáneamente en ratas hipertensas (SHR) sujetas a oclusión común de la arteria carótida (Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57:180-191). Niveles elevados de bradicinina se encuentran en los fluidos extracelulares que siguen del trauma en un modelo que involucra traumatizar la médula espinal de la rata (Xu et al., (1991), J. Neurochem, 57: 975-980), y en plasma y tejido a partir de ratas con edema cerebral resultante de isquemia cerebral (Kamiya et al., (1993), Accidente cerebrovascular, 24: 571-575). La bradicinina se libera a partir del kininógeno de alto peso molecular por proteasas de serina que incluyen Kalicreína (Coleman (1984) J. Clin Invest., 73: 1249), y la aprotinina inhibidora de la proteasa de serina se encontró al bloquear la magnitud del edema cerebral resultante de la isquemia cerebral en ratas SHR (Kamiya, (1990), Nippon Ika Daigaku Zasshi. 57:180-191; Kamiya et al., (1993), Accidente cerebrovascular, 24: 571-575) y conejos sujetos a una lesión fría del cerebro (Unterberg et al., (1986), J. Neurosurgery, 64: 269-276).
Estas observaciones indican que el edema cerebral resulta a partir de la liberación proteolítica local de cininas tales como bradicinina a partir de kininógeno de alto peso molecular, seguido por incrementos de bradicinina-inducida en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Consecuentemente, la bikunina placentaria y los fragmentos de estos son contemplados como medicamentos para la prevención de edema en pacientes en riesgo para esta condición, particularmente aquellos de alto riesgo de mortalidad o lesión cerebral. Este incluiría pacientes de trauma espinal y de cabeza, politrauma, pacientes que se hacen una cirugía del cerebro o de la médula espinal y sus vasos asociados u otras cirugías generales que incluyen cirugía de corazón abierto, pacientes que han sufrido de un accidente cerebrovascular, hemorragia subaracnoidea o cerebral, enfermedades infecciosas del cerebro, enfermedad granulomatosa del cerebro o carcinomas difusos o focales y tumores del cerebro o cualquier condición tal como esclerosis múltiple que involucran falla de la barrera hematoencefálica o pacientes que sufren de cualquier otro proceso inflamatorio del cerebro o médula espinal. Los pacientes recibirían una administración de bikunina placentaria ya sea como una infusión o inyección de bolus, vía intravenosa o intracraneal. Adicionalmente las dosis de bikunina placentaria podrían ser administradas intermitentemente durante las siguientes tres semanas. Los niveles de dosis serían designados para alcanzar concentraciones de circulación en exceso de aquellos requeridos para neutralizar elevaciones en niveles de plasma o bradicinina y otros péptidos vaso activos formados a través de la acción de proteasas de serina, y suficiente para reducir el edema. Dado que la proteína es de origen humano, la administración repetida en este curso de la terapia no coincidiría con el desarrollo de una reacción inmune a la proteína. La bikunina placentaria y los fragmentos de ella serían contemplados para monoterapia o profilaxis así como para su uso en combinación con otros medicamentos tales como neuroterapéuticos y neuroprotectores.
Evidencias recientes (De la Cadena R. A. et al., (1995), FASEB J. 9: 446-452) han indicado que la senda de activación de contacto puede contribuir a la patogénesis de artritis y anemia, y que los inhibidores de la Kalicreína pueden tener beneficio terapéutico. Por consiguiente, los inhibidores de proteasa de la presente invención se contemplan de acuerdo con su capacidad para inhibir la Kalicreína humana, como medicamentos para el tratamiento de artritis y anemia en humanos.
El tratamiento de pacientes machos diabéticos no-insulino dependientes (NIDDM) con aprotinina mejora significantemente la absorción de glucosa total y disminuye el índice de separación metabólica de insulina (Laurenti et al., (1996), Diabetic Medicine 13: 642-645). En conformidad, las proteínas humanas de la presente invención se contemplan para uso crónico como medicamentos para el tratamiento de NIDDM.
El tratamiento diario de pacientes en riesgo de alumbramiento prematuro con inhibidor de tripsina urinaria por dos semanas reduciendo significantemente las concentraciones uterinas recurrentes (Kanayama et al., (1996), Eur J. Obstet. Gynecol. & Reprod. Biol. 67: 133-138). En conformidad, las proteínas humanas de la presente invención se contemplan por el uso en la prevención del alumbramiento prematuro.
La aprotinina ha sido mostrada para estimular la diferenciación de mioblastos de ratón en cultivo (Wells y Strickland, Development, (1994), 120:3639-3647)), un proceso que se inhibe por TGFb. El TGFb existe como un pro-polipéptido inactivo el cual se activa por proteolisis limitada. El mecanismo de la acción de la aprotinina ha sido propuesto para involucrar la inhibición de proteasas que procesan pro-TGFb a la forma activa madura. El TGFb ha sido mostrado para ser sobre regulado en varias lesiones fibróticas y se ha pensado mucho por ser un potencial blanco para terapias anti-fibróticas. En un modelo de rata de fibrosis pulmonar por ejemplo, las concentraciones TGF-b paralelizan la magnitud de inflamación inducida por bleomicina. Adicionalmente, los niveles de plasmina en el macrófago alveolar coinciden con niveles de TGF-b maduro, y la adición del inhibidor de plasmina a-2-antiplasmina invalida la activación postraduccional del pro-TGFb por el macrófago (Khal et al., (1996), Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15: 252-259.). Los datos sugieren que la plasmina contribuye a la formación del TGFb activo por el macrófago alveolar, y que este proceso juega un papel patológico en la inflamación de pulmón inducida por bleomicina.
A la luz de estas observaciones, la bikunina placentaria y los fragmentos de ella se contemplan como terapéuticos para varios desórdenes fibróticos, que incluyen fibrosis pulmonar, hepática, renal y dérmica (escleroderma).
La aprotinina en forma de aerosol se exhibió para proteger >50% de ratones infectados con dosis letal de ya sea el virus de la influenza virus o paramixovirus (Ovcharenko y Zhirnov, Antiviral Research, (1994), 23:107-118). También se noto una supresión del desarrollo de bronconeumonía hemorrágica fatal y una normalización de ganancia de peso corporal con el tratamiento de aprotinina en forma de aerosol. A la luz de estas observaciones, la bikunina placentaria y los fragmentos de ella se contemplan como terapéuticos para varias enfermedades respiratorias relacionadas similares a la influenza.
La bikunina placentaria humana, dominios aislados, y otras variantes de la invención se contemplan para utilizar en las aplicaciones medicas/terapéuticas sugeridas para aprotinina nativa o análogos de aprotinina con otros perfiles inhibitorios, en particular aquellos que necesitan utilizar una alta dosis. Estas incluirían enfermedades por las cuales se emplea de la proteína humana indicada por virtud de su habilidad para inhibir proteasas de serina humana tal como tripsina, plasmina, Kalicreína, elastasa, catepsina G y proteinasa-3, que incluyen y no están limitados a: pancreatitis aguda (elastasa pancreática y tripsina), inflamación, trombopenia, preservación de la función plaquetaría, preservación del órgano, cicatrización de herida, varias formas de choque, que incluyen choque pulmonar, choque endotóxico y complicaciones post operativas; disturbios de coagulación sanguínea tal como hemorragia hiperfibrinolítica; reacciones inflamatorias agudas y crónicas, en particular para la terapia y la profilaxis de lesiones de órganos, tales como por ejemplo pancreatitis y enteritis inducida por radiación, reacciones inflamatorias complejo-mediado tales como inmunovasculitis, glomerulonefritis y tipos de artritis; colagenósis en particular artritis reumatoide; tipos de artritis causado por depósitos relacionados con el metabolismo (por ejemplo gota); degeneración de los componentes elásticos de las partes de tejido conjuntivo de órganos, tales como en arteriosclerosis (elastasa de suero) o enfisema pulmonar (elastasa del neutrófilo); síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad inflamatoria del intestino, y
psoriasis.
Un descubrimiento mayor inesperado fue que los péptidos sintéticos codifican la bikunina (7-64), y bikunina (102-159), podrían replicarse apropiadamente en la conformación tri-dimensional correcta que tiene la bioactividad inhibidora activa de la proteasa (Ejemplos 2 y 1, respectivamente). Sobre la réplica, cada uno de estos fragmentos de la Bikunina experimenta reducción en masa de 6 unidades de masa, consistente con la formación de cada caso, de tres enlaces disulfuro intracadenas entre residuos de seis cisteinas de cada fragmento. Otro descubrimiento sorprendente es que los péptidos sintéticos que codifican bikunina (7-64), bikunina (102-159), y bikunina (1-170) son altamente inhibidores de plasmina y ambos Kalicreína en plasma y tejido (Ejemplo 4, 3, y 10 respectivamente). La inhibición de plasmina y Kalicreína por Trasylol® se propone para ser implicado en el mecanismo por el cual Trasylol® reduce la pérdida de sangre durante cirugía de corazón abierto. Nuestros descubrimientos inesperados de la especificidad de los dominios de Kunitz de la presente invención hace de ellos agentes terapéuticos apropiados para el ahorro de sangre durante la cirugía o trauma donde existe pérdida de sangre significante, o para cualquier otra condición donde la inhibición de plasmina y/o Kalicreína sería beneficiosa.
Adicionalmente, nosotros demostramos en esta revelación (Ejemplo 10) que la bikunina placentaria (1-170) es una potente inhibidor del factor XIa y un moderado inhibidor del factor Xa. El Factor XIa juega un papel esencial en el sistema intrínseco de coagulación, sirviendo para inter-convertir el factor IX inactivo en el factor IXa activo. De esta manera, la bikunina placentaria inhibe dos enzimas claves del sistema intrínseco, la Kalicreína y el factor XIa. Consistente con estas observaciones, nosotros también demostramos que la bikunina placentaria (1-170) es un potente inhibidor del tiempo parcial tromboplastina activado, el cual es una medida de la velocidad de coagulación manejada por el sistema intrínseco. Por otra parte, nosotros demostramos que la bikunina placentaria (1-170) es un inhibidor extremadamente débil del complejo factor VIIa tisular, sugiriendo que no es importante en la regulación de la cascada de coagulación extrínseca. Basados en estos descubrimientos inesperados, la bikunina placentaria se contempla como un medicamento para enfermedades en las cuales la activación del sistema intrínseco de coagulación contribuye significantemente al mecanismo de la enfermedad. Ejemplos de tales enfermedades podrían incluir choque post-traumático y coagulación intravascular diseminada.
Una ventaja significante de los dominios de Kunitz de la presente invención es que ellos tienen proteínas humanas, y también están menos cargados positivamente que el Trasylol® (Ejemplo 1), por consiguiente la reducción del riesgo de daño en el riñón en la administración de grandes dosis de las proteínas. Siendo de origen humano, la proteína de la invención instantánea puede de ese modo ser administrada en pacientes humanos con un riesgo significantemente reducido de indeseadas reacciones inmunológicas en comparación con la administración de dosis similares de Trasylol®. Adicionalmente, se encontró que la bikunina (102-159), bikunina (7-64), y bikunina (1-170) son significantemente más potentes inhibidores de Kalicreína en plasma que el Trasylol® in vitro (Ejemplo 3, 4 y 10). De esta manera se espera que, la bikunina y los fragmentos de ella sean más efectivas en bajar la pérdida de sangre en pacientes in vivo.
La cantidad del inhibidor de proteasa de serina administrada debería ser suficiente para proveer un nivel de plasma supra normal. Para la reducción profiláctica de sangrado durante y después de una cirugía mediante bypass de la arteria coronaria (CABG), las proteínas de la invención instantánea pueden utilizarse en lugar de Trasylol® mientras que se tome en cuenta la diferencias en potencia. La utilización de Trasylol® es delineada en el Physicians Desk Reference, (1995), enumerado por el suplemento A Trasylol®. Brevemente, con el paciente en una posición indolente, la dosis de ataque de bikunina placentaria, el dominio aislado u otras variantes se dan lentamente durante aproximadamente 20 a 30 minutos, después de la inducción con anestesia pero previamente esternotomía. En general, una dosis total de aproximadamente 2x106 KIU (unidades inhibitorias de Kalicreína) y se utilizaran 8 X106 KIU, dependiendo de tales factores como el peso del paciente y la duración de la cirugía. Cargas de dosis preferidas son aquellas que contienen un total de 1 a 2 millones de unidades inhibitorias de Kalicreína (KIU). Cuando la dosis de ataque se completa, se continúa con una dosis de infusión, la cual se continúa hasta que la cirugía se termina y el paciente deja la sala de cirugía. Preferidas dosis de infusión constante están en el rango desde aproximadamente 250,000 a 500,000 KIU por hora. El bombeo de la primera dosis se adiciona al primer fluido del circuito bypass cardiopulmonar, mediante el reemplazo de una alícuota del primer fluido previo a la institución del bypass cardiopulmonar. Dosis primeras bombeadas preferidas son aquellas que contienen un total aproximadamente de uno a dos millones de KIU.
Las proteínas de la invención instantánea se emplearon en composiciones farmacéuticas formuladas de manera conocida en el oficio. Tales composiciones contienen ingrediente(s) activo(s) más uno o más vehículos farmacéuticamente activos, diluentes, rellenos, ligadores, y otros excipientes, dependiendo del modo de administración y la forma de dosificación contemplada. Ejemplos de vehículos orgánicos o inorgánicos inertes terapéuticamente conocidos por expertos en el oficio incluyen, pero no limitan a, lactosa, almidón de maíz o derivados de estos, talco, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles tales como polietilen glicol, agua, sacarosa, alcoholes, glicerina y similares. También pueden ser adicionados varios preservativos, emulsificantes, dispersantes, aromatizantes, agentes humectantes, antioxidantes, edulcorantes, colorantes, estabilizadores, sales, soluciones reguladoras y similares, como requisito para ayudar a la estabilización de la formulación o para ayudar al incremento de la biodisponibilidad del ingrediente(s) activo(s) o para producir una formulación de aceptable sabor o aroma en el caso de una dosificación oral. El inhibidor empleado en tales composiciones puede estar en la forma del compuesto original por si mismo, u opcionalmente, en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las proteínas de la invención instantánea pueden ser administradas solas, o en varias combinaciones, y en combinación con otras composiciones terapéuticas. Las composiciones así formuladas se seleccionan según la necesidad para la administración del inhibidor mediante un modo apropiado por aquellos de habilidad conocida en el oficio.
Medios de administración parenteral incluyen vías intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), e intramuscular (i.m.). La administración intravenosa puede emplearse para obtener una regulación aguda de concentraciones pico en plasma del fármaco como podría necesitarse. Alternativamente, el fármaco puede administrarse a un índice deseado continuamente mediante catéter i.v. Vehículos apropiados incluyen diluentes acuosos no-pirogénicos estériles, tales como agua estéril para inyección, soluciones reguladoras estériles o soluciones salinas estériles. Las compo-
siciones resultantes se administran al paciente antes de y/o durante la cirugía por inyección intravenosa o infusión.
La vida media y el reconocimiento del fármaco mejorado para fagosomas tales como neutrófilos y macrófagos involucrados en la inflamación pueden ser ayudados atrapando el fármaco en liposomas. Debería ser posible mejorar la selectividad del reconocimiento liposomal por incorporación en el exterior de los ligandos de liposomas que ligan a una macromolécula específica los órganos/tejidos marcados tales como los pulmones y el tracto GI. Alternativamente, inyección depósito i.m. o s.c. con o sin encapsulación del fármaco en microesferas degradables (por ejemplo, que comprenden poli-DL-láctido-co-glicólido) o formulaciones protectoras que contienen colágeno pueden ser empleados para obtener fármacos de liberación controlada prolongada. Para mejorar la conveniencia de la forma de dosificación es posible utilizar un depósito implantado i.p. y un septo tal como el sistema percuseal. Para mejorar la conveniencia y la conformidad del paciente también se puede conseguir por el empleo de ya sea plumas de inyector (por ejemplo, el Novo Pin o Q-pen) o inyectores de compresión de jeringa libre (por ejemplo, de Bioject, Mediject o Becton Dickinson). Precisamente la liberación controlada también puede ser lograda empleando bombas implante con entrega al sitio deseado vía una cánula. Ejemplos incluyen las bombas osmóticas implantadas subcutáneamente disponibles de ALZA tal como la bomba osmótica ALZET.
La entrega nasal puede ser lograda mediante la incorporación del fármaco en vehículos particulados bioadhesivos (<200 mm) tal como aquellos que comprenden celulosa, poliacrilato o policarbofilo, en conjunción con mejoramientos de absorción apropiados tales como fosfolípidos o acilcarnaitinas. Comercialmente sistemas disponibles incluyen aquellos desarrollados por Dan Biosys y Scios Nova.
La entrega pulmonar representa un medio de administración noparenteral del fármaco a la circulación. Las vías inferiores son altamente permeables para un amplio rango de proteínas de tamaños moleculares hasta aproximadamente 20 kDa. Polvos secos tamaño-Micron que contiene el medicamento en un vehículo apropiado tal como manitol, sucrosa o lactosa pueden ser entregados a la superficie alveolar distal empleando inhaladores de polvo seco tales como aquellos de propulsores Inhale™, Dura™, Fisons (Spinhaler™), y Glaxo (Rotahaler™), o Astra (Turbohaler™) basados en inhaladores de dosis medidas. Formulaciones en solución con o sin liposomas pueden ser administradas empleando nebulizadores ultrasónicos.
La entrega oral puede ser lograda por incorporación del fármaco en tabletas, tabletas cubiertas, grageas, cápsulas de gelatina blanda y dura, soluciones, emulsiones, suspensiones o cápsulas con cubierta entérica para liberar el fármaco en el colon donde la actividad de la proteasa digestiva es baja. Ejemplos de lo último incluyen el sistema OROS-CT/Osmet™ de ALZA, y el sistema PULSINCAP™ de Sistemas de Entrega del Medicamento Scherer. Otros sistemas emplean polímeros azo-entre cruzados que son degradados por azoreductasas bacterianas específicas del colon, o polímeros de poliacrilato sensibles al pH que se activan por el enjuague en el PH del colon. Los sistemas anteriores pueden ser empleados en conjunción con un amplio rango de mejoradores de absorción disponibles. Sistema de entrega rectal pueden lograrse por incorporación del fármaco en supositorios.
En esta aplicación médica, para la reducción de la pérdida de sangre perioperativa, el medio preferido de administración de las variantes de la bikunina placentaria de la presente invención es por vía parenteral, preferiblemente por vía i.v. a través de la línea central.
La cantidad de la composición farmacéutica para ser empleada dependerá del recipiente y la condición para ser tratada. La cantidad necesaria se puede determinar sin experimentación excesiva mediante protocolos conocidos por aquellos de habilidad en el oficio. Alternativamente, la cantidad necesaria se puede calcular, basados en una determinación de la cantidad de proteasa blanco tal como plasmina o Kalicreína las cuales deben ser inhibidas con el fin de tratar la condición. Como los materiales activos contemplados en esta invención son estimados por ser no-tóxicos, el tratamiento preferiblemente involucra la administración de un exceso de la cantidad requerida del agente activo opcionalmente.
Adicionalmente, la bikunina placentaria, dominios aislados u otras variantes pueden emplearse para aislar sustancias naturales tales como proteasas consanguíneas a partir del material humano empleando métodos de separación basados en afinidad, así como para producir anticuerpos a la proteasa que pueden ser empleados adicionalmente para explorar la distribución tisular y las funciones útiles de la bikunina placentaria.
Búsqueda de Datos de la Secuencia Humana
La existencia de una proteína humana homóloga distinta en función a la aprotinina, se deduce siguiendo un análisis único de entrada a la secuencia para la base de datos de la etiqueta-secuencia-expresada (llamada de ahora en adelante dbEST) en la NCBI (National Center for Biological Information, Maryland). Utilizando el algoritmo TBlastN (BLAST, o Basic Local Alignment Search Tool emplea el método de Altschul et al., (1990) J. Mol Biol 215: 403-410, para buscar similaridad entre una secuencia rastreo y todas las secuencias en una base de datos, proteína o ácido nucleico en cualquier combinación), la base de datos se examinó para las secuencias de nucleótidos que conllevan homología a la secuencia de pre-pro-aprotinina bovina, Trasylol®. Esta investigación de numerosos clones fue selectivamente limitada a dos clones particulares los cuales posiblemente podrían codificar para una secuencia de aminoácido deducido que correspondería a una proteína humana homóloga en función a la aprotinina. Las secuencias de ácido nucleico seleccionadas fueron R35464 (SEQ ID NO: 12) y R74593 (SEQ ID NO: 14) que se generaron a partir de una librería de ácido nucleico de placenta humana. Las secuencias de proteína traducidas en el marco de lectura abierta alargadas para R35464 (SEQ ID NO: 13) se perdió una de las 6 cisteinas que son críticas para la formación de la estructura covalente del dominio-Kunitz, el significado de la secuencia de ácido nucleico de R35464 no podría producir un inhibidor funcional. Del mismo modo, el marco de lectura abierta traducido alargado a partir del clon R74593 (SEQ ID NO: 15) que contiene un codón 5' bloqueado para la región que codifica la secuencia similar a Kunitz, significando que esta secuencia, no podría ser traducida para producir un dominio Kunitz secretado funcional. El significado de estas secuencias solas fue poco evidente. Era posible que ellas representaran a) los productos de pseudogenes, b) regiones de mARN no traducidas, o c) los productos de mARN viable que han sido secuenciados incorrectamente.
Descubrimiento de Bikunina Humano
Para aislar y determinar específicamente la secuencia humana actual, los cebadores del cADN se designaron por ser capaces de la hibridación de secuencias localizadas en 5' y 3' para el segmento de cADN que codifican nuestras secuencias similares a Kunitz propuestas encontradas dentro de R35464 y R74593. Los cebadores empleados para amplificar un fragmento que codifica la secuencia similar a Kunitz de R74593 fueron CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG (el cebador 3' con un sitio HindIII; SEQ ID NO: 33) y AGGATCTAGACAATAATTACCTGACCAAGGA (el cebador 5' con un sitio XbaI; SEQ ID NO: 34).
Estos cebadores se emplearon para amplificar por PCR (30 ciclos) un producto de par de base 500 a partir de una librería de cADN de placenta humana a partir de Clontech (MATCHMAKER, Cat #HL4003AB, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), que se subclonó en Bluescript-SK+ y secuenciado con el cebador T3 con un kit Sequenase™ versión 2.0. Sorpresivamente, la secuencia del fragmento obtenida empleando nuestros cebadores fue diferente de la secuencia listada en la base de datos dbEST para el clon R74593. En particular, nuestra nueva secuencia contiene una base de guanosina adicional insertada en 3' para el codón de terminación putativo, pero 5' para el segmento codificando la secuencia similar a Kunitz (Figura 3). La inserción de un G adicional cambió el codón de terminación fuera del marco de lectura para el dominio similar a Kunitz (Figura 3; G en el par de base 114 de la secuencia corregida para R74593).
Subsiguiente rastreo de la dbEST para las secuencias homólogas en la secuencia del péptido similar a Kunitz de R74593 produce H94519 derivado a partir de la librería de retina humana y N39798. Estas secuencias contienen una secuencia similar a Kunitz que fue casi idéntica al dominio similar a Kunitz codificado en R35464 excepto que este contiene todas las seis cisteinas características. La cubierta de cada una de las secuencias del nucleótido con aquella de R74593 (corregida por la inserción de G a b,p, 114) y R35464 se empleo para obtener una secuencia del nucleótido de consenso para una bikunina placentaria humana parcial (SEQ ID NO: 9; Figura 3). Las secuencias de consenso traducidas producidas en un marco de lectura abierta que se extienden a partir del residuo -18 a +179 (Figura 3; traducción completa SEQ ID NO: 10) que contiene dos secuencias de dominio similares a Kunitz completas, dentro de la región de residuos de aminoácidos 17-64 y 102-159 respectivamente.
Adicionalmente esfuerzos frustrados para obtener la secuencia 5'adicional preguntando el dbEST con la secuencia de R35464. Posibles correspondencias a partir de tales investigaciones, que posee la secuencia 5' adicional luego fueron empleadas a su vez para re-rastreo al dbEST. En un modelo iterativo una serie de secuencias 5' superpuestas fueron identificadas lo que incluye los clones H16866, T66058, R34808, R87894, N40851 y N39876 (Figura 4). La alineación de algunas de estas secuencias sugiere la presencia de un ATG 5' que puede servir como un sitio inicial para la síntesis de la secuencia de proteína de consenso traducida. De esta información seleccionada, era posible ahora detectar selectivamente, y determinar las secuencias del ácido nucleico y polipéptido de una proteína humana con función homóloga para aprotinina.
El Re-rastreo de la dbEST revela un número de entradas nuevas EST mostradas esquemáticamente en la Figura 4B. La superposición con estas ESTs adicionales nos permitirán construir una secuencia del oligonucleótido de consenso mucho más grande (Figura 4C) que se extiende en ambos 5' y 3' además de la secuencia original de oligonucleótido representada en la Figura 3. De hecho, la nueva secuencia de una longitud total de 1.6 kilobases extendida hasta el final en la cola poli-A 3'. El número incrementado de ESTs superpuesta en cada posición del par de base a lo largo de la secuencia mejorando el nivel de confianza en ciertas regiones tales como la secuencia superpuesta con el extremo 3' de EST R74593 (Figura 3). Muchas ESTs superpuestas en esta región corroboran dos deleciones base críticas relativas a R74593 (localizada como negrilla subrayada en la Figura 4C, las posiciones en el mapa 994 y 1005). La traducción de la secuencia de consenso nueva (Figura 4D) en la bikunina que codifica el marco produce una forma de bikunina placentaria que fue más grande (248 aminoácidos) que la secuencia madura (179 aminoácidos) codificada a partir del consenso original (SEQ ID NO: 1), y se terminó por un codón de terminación en-marco dentro del oligonucleótido de consenso. El incremento de tamaño se debió a un cambio de marco en la región codificada 3' resultando de la extracción de las dos únicas inserciones base en EST R74593. El cambio de marco mueve el codón de terminación del consenso original (Figura 3) fuera del marco permitiendo leer a través en un nuevo marco que codifica la secuencia de aminoácido adicional. El nuevo producto de traducción (Figura 4D) fue idéntico a la secuencia de consenso de la proteína original (SEQ ID NO: 1) entre los residuos +1 a +175 (codificando los dominios de Kunitz), pero contienen una nueva extensión C-Terminal que muestra un domino transmembrana largo del residuo 24 putativo (subrayado en la Figura 4D) seguido por un dominio citoplasmático residuo 31 corto. La secuencia precisa alrededor del iniciador metionina y el péptido señal fue un poco tentativa debido a la heterogeneidad considerable entre la ESTs superpuesta en esta región.
Análisis de la secuencia de proteína por Geneworks™, los residuos de esparagina realzada en las posiciones 30 y 67 como sitios de consenso para glicosilación N-ligado putativo. La esparagina 30 no se observó durante la secuenciación N-terminal de la proteína de longitud total aislada de la placenta humana, consistente con esta siendo glicosolada.
Clonación de Bikunina Humana
La existencia de un mARN humano que corresponde a la secuencia de nucleótido de bikunina humano putativo deducida del análisis de la Figura 3, se confirmó como sigue. La hibridación del primer de ácido nucleico en el 5' para la secuencia de cADN que codifica a Kunitz de R35464 (b.p. 3-27 de la secuencia de nucleótido de consenso en la Figura 3): GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTTCTCGCCTGGCTGGGA (un cebador 5' derivado de la secuencia R35464 con un sitio XbaI; SEQ ID NO: 35), y la hibridación del cebador de ácido nucleico en el 3' para la secuencia que codifica Kunitz de R74593 (b.p. 680-700 de la secuencia de nucleótido de consenso en la Figura 3), se empleo para amplificar el PCR, a partir de una librería de placenta humana Clontech, un fragmento del tamaño esperado (ca. 670 b.p) a partir de una secuencia nucleótido de consenso cADN codificando la secuencia de bikunina placentaria de la Figura 3 (Mostrado esquemáticamente en la Figura 4A).
Utilizando un cebador 5' que hibridaza a una secuencia en R87894 es decir 126 b.p 5' en el sitio inicial ATG putativo discutido anteriormente, (mostrado esquemáticamente en la Figura 4A a b.p. 110) más el mismo cebador 3' en R74593 como se utilizó arriba, fue posible amplificar un fragmento a partir de una librería de placenta humana Clontech del tamaño esperado (aproximadamente 872 b.p) predecido por la cubierta EST (Mostrado esquemáticamente en la Figura 4).
La secuenciación del fragmento 872 b.p. mostró contener un segmento del nucleótido que corresponde a b.p. 110 a 218 del EST R87894 a su terminal 5' y b.p. 310 a 542 de la secuencia de consenso para bikunina placentaria deducida del análisis de la cubierta EST (de la Figura 3), en su terminal 3'. Esta secuencia del nucleótido 3' contiene todos los dominios similares a Kunitz codificado por la bikunina placentaria (102-159).
Para obtener un cADN que codifica la región extracelular entera de la proteína, el siguiente cebador 5'PCR: CACCTGATCGCGAGACCCC (SEQ ID NO: 36)
designado para hibridizar a una secuencia dentro de EST R34808 se empleo con el mismo cebador 3' en EST 74593 para amplificar (30 ciclos) un producto de cADN de 780 par de base aproximadamente a partir de la librería de cADN de placenta humana. Este producto fue purificado por gel, y clonado en el vector TA (Invitrogen) para la secuenciación de ADN por el método de didesoxi (Sanger F., et al., (1977) Proc. Natl. Acad Sci (USA), 74: 5463-5467) con los siguientes cebadores:
Vector Específico:
GATTTAGGTGACACTATAG (SP6) (SEQ ID NO: 37)
\quad
TAATACGACTCACTATAGGG (T7) (SEQ ID NO: 38)
Gen Específico:
TTACCTGACCAAGGAGGAGTGC (SEQ ID NO: 39)
\quad
AATCCGCTGCATTCCTGCTGGTG (SEQ ID NO: 40)
\quad
CAGTCACTGGGCCTTGCCGT (SEQ ID NO: 41)
La secuencia de cADN resultante se representa en la Figura 4E junto con su producto de traducción. Al nivel del nucleótido, la secuencia muestra únicamente la menor diferencia a partir de la secuencia EST de consenso (Figura 4D). La traducción de la secuencia produce una secuencia que contiene un sitio ATG iniciador de en-marco, el péptido señal y la secuencia bikunina placentaria humana madura y el domino transmembrana. La secuencia traducida del producto PCR fue perdiendo los residuos de los últimos 12 aminoácidos a partir del dominio citoplasmático como una consecuencia de la elección de selección del primer 3' para la amplificación PCR. Esta elección del cebador PCR 3' (diseñado con base en la secuencia de R74593) también fue responsable por la introducción de una mutación S a F artificial artifactual en la posición del aminoácido 211 de la secuencia PCR-derivada traducida. El péptido señal deducido de la traducción del fragmento PCR fue algo diferente para aquel del consenso EST.
Para obtener un cADN de bikunina placentaria de longitud total, el producto de PCR derivado (Figura 4E) fue purificado por gel y empleado para aislar un clon de longitud total basado en no-PCR que representa la secuencia de bikunina. La secuencia del cADN derivada del PCR se marco con ^{32}P-CTP por High Prime (Boehringer Mannheim) y se empleo para probar una Librería de cADN de placenta (Stratagene, Unizap™ \lambda library) empleando técnicas de hibridación de colonias. Aproximadamente 2 X 10^{6} placas fago experimentan 3 rondas de filtrado y purificación de placa. Dos clones fueron estimados de longitud total (\sim1.5 kilobases) como se determina por análisis de restricción de enzimas y basado en comparación con el tamaño de la secuencia de consenso EST (ver arriba). La secuenciación de uno de estos clones por el método didesoxi produciendo la secuencia de oligonucleótido representada en la Figura 4F. El producto de traducción a partir de esta secuencia produce una proteína con iniciador de metionina en marco, péptido señal y secuencia bikunina placentaria madura. La secuencia de bikunina placentaria madura de la proteína madura derivada por traducción del consenso EST a pesar de la longitud de la secuencia del péptido señal y las secuencias difieren. Diferente el producto de PCR derivado, el cADN derivado por hibridación de colonias contenido en el ectodominio completo, dominio transmembrana, dominio citoplásmico y codón de terminación en-marco. De hecho, el clon extendido hasta el final de la cola poli-A. El iniciador de metionina fue seguido por un péptido señal hidrofóbico el que fue idéntico al péptido señal que codifica el clon PCR derivado. Posteriormente nosotros expresamos y purificamos un fragmento soluble de bikunina placentaria, bikunina (1-170), de células Sf9 (Ejemplo 9), y encontrado por ser un inhibidor funcional de la proteasa (Ejemplo 10). Adicionalmente aislado de la placenta humana un fragmento soluble de bikunina placentaria el cual también fue un inhibidor de proteasa activo (Ejemplo 7). Ambas la proteína natural y la forma de la proteína expresada en células Sf9 probablemente son glicosoladas en el residuo de esparagina en la posición 30 basadas en la recuperación de PTH-aminoácidos durante la secuenciación N-terminal (Ejemplos 7 y 9).
Basados en las observaciones de arriba, parece que la bikunina placentaria de longitud total tiene la capacidad de existir como una proteína transmembrana en la superficie de las células así como una proteína soluble. Otras proteínas transmembrana que contienen dominios Kunitz son conocidos por experimentar el procedimiento proteolítico para producir mezclas de formas asociadas de membrana y solubles. Estos incluyen dos formas de la proteína Precursor Amyloid llamada APP751 (Esch F., et al., (1990) Science, 248: 1122-1124) y APP 770 (Wang R., et al., (1991), J. Biol Chem, 266:16960-16964).
La activación de contacto es un proceso el cual se activa por exposición de superficies vasculares dañadas a componentes de la cascada de coagulación. La angiogénesis es un proceso que involucra la activación local de plasmina en la superficie endotelial. La especificidad de la bikunina placentaria y su capacidad putativa para sujetar a la superficie celular, sugieren que las funciones fisiológicas de la bikunina placentaria transmembrana puede incluir la regularización de la activación de contacto y la angiogénesis.
Las secuencias de aminoácidos para la bikunina placentaria (7-64), bikunina (102-159), y bikunina placentaria longitud total (Figura 4F) se investigaron contra el PIR (Vers. 46.0) y las bases de datos de proteína PatchX (Vers. 46.0) así como la base de datos de la proteína GeneSeq (Vers. 20.0) de las secuencias patentadas empleando el programa FastA Grupo de Computador Genético. Empleando el programa TFastA Grupo de Computador Genético (Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448), estas mismas secuencias de proteína se investigaron contra las traducciones seis-marco del GenBank (Vers. 92.0 con actualizaciones en 1/26/96) y bases de datos de nucleótido EMBL (modificado Vers. 45.0) así como la base de datos de nucleótidos GeneSeq (Vers. 20.0) de secuencias patentadas. Los subconjuntos EST y STS del GenBank y EMBL no fueron incluidos en este conjunto de investigaciones. Las mejores equivalencias resultaron a partir de estas investigaciones conteniendo secuencias las que fueron aproximadamente solo el 50% idénticos sobre su longitud total en la secuencia de proteína de 58-aminoácidos derivada a partir de nuestro análisis de clones R74593 y R35464.
Aislamiento de Bikunina humana
Como se mencionó arriba, los péptidos sintéticos que corresponden a bikunina (7-64) y bikunina (102-159) como se determinó de la secuencia de consenso traducida para bikunina (Figura 3), podría ser replegada (Ejemplos 2 y 1, respectivamente) para producir la proteína inhibidor de Kalicreína activa (Ejemplo 4 y 3, respectivamente). Nosotros explotamos esta propiedad inesperada para inventar un esquema de purificación para aislar la bikunina placentaria nativa del tejido humano.
Utilizando un esquema de purificación el cual empleo como un primer paso la cromatografía de afinidad Kalicreína-sepharosa, se aisló un inhibidor de Kalicreína nativa altamente purificada. El aislamiento de la bikunina humana nativa tiene un N-terminal idéntico (secuenciado por residuos de 50 aminoácidos) como la secuencia predicha mediante la traducción de la secuencia de ácido nucleico de consenso (Figura 3) residuos de aminoácido +1 a +50 (Ejemplo 7). Está confirmada por la primera vez la existencia de un inhibidor de Kalicreína nativa novedosa aislada de la placenta humana.
Dominios conocidos similares a Kunitz son listados abajo. Los residuos considerados por hacer contacto con las proteasa blanco están destacados como de especial interés (negrilla/subrayado). Estos residuos particulares son las posiciones denominadas Xaa^{1-16} por referencia específica como muestra por la marca Xaa abajo:
6
Donde la secuencia número 1) es Bikunina (7-64) (SEQ ID NO: 4); secuencia 2) es Bikunina (102-159) (SEQ ID NO: 6); secuencia 3) es el precursor 1 inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO: 18); secuencia 4) es el precursor 1 inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO: 19); secuencia 5) es el precursor inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO: 20); secuencia 6) es el precursor 2 inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO: 21); secuencia 7) es el precursor 2 inhibidor de la vía del factor tisular (SEQ ID NO: 22); secuencia 8) es el homólogo de la proteína precursor Amyloid (SEQ ID NO: 23); secuencia 9) es aprotinina (SEQ ID NO: 24); secuencia 10) es el precursor inhibidor de Inter-\alpha-tripsina (SEQ ID NOs: 25); secuencia 11) es el precursor inhibidor de Inter-\alpha-tripsina (SEQ ID NOs: 26); secuencia 12) es la proteína precursor Amyloid (SEQ ID NO: 27); secuencia 13) es el precursor \alpha-3(VI) Colágeno (SEQ ID NO: 28); y secuencia 14) es HKI-B9 (SEQ ID NO: 29).
Puede verse que la bikunina placentaria (7-64) y (102-159) cada una tiene el mismo número (seis) y espaciamiento de residuos de cisteina como se encontró en los miembros de la clase Kunitz de inhibidores de proteasa de serina. La precisión de enlace de los residuos de cisteina para formar los tres enlaces disulfuro intracadena se conoce y fija para todos los miembros de la familia Kunitz conocidos previamente (Laskowski, M et al., 1980, Ann. Rev. Biochem. 49:593-626). Basados en este patrón de enlace y el hecho de que el plegado de bikunina placentaria (7-64) y (102-159) en los inhibidores de proteasa activa está acompañado por una reducción de masa consistente con la formación de los enlaces disulfuro de tres intracadenas (Ejemplos 2 y 1), es altamente probable que el enlace disulfuro entre los dominios de Kunitz de bikunina placentaria ocurra entre los residuos de cisteina: C11 y C61; C20 y C44; C36 y C57; C106 y C156; C115 y C139; C131 y C152. Adicionalmente, este patrón del enlace disulfuro es altamente probable en formas más largas de bikunina placentaria que contienen ambos dominios Kunitz dados que tales formas de la proteína también son inhibidores activos de la proteasa de serina y puesto que la secuenciación N-terminal (Ejemplo 7) de bikunina placentaria nativa por 50 ciclos produce una secuencia que fue silenciada en las posiciones donde los residuos de cisteina fueron esperados.
La bikunina placentaria, dominios aislados u otras variantes de la presente invención pueden producirse por síntesis de péptidos de fase sólida estándar utilizando ya sea química t-Boc como se describe por Merrifield R.B. y Barany G., en: The peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 2, Gross E. et al., Eds. Academic Press (1980) Chapter 1; o empleando química F-moc como se describe por Carpino L.A., y Han G.Y., (1970) J. Amer Chem Soc., 92, 5748-5749, y se ilustra en el Ejemplo 2. Alternativamente, la expresión de un ADN codificando la variante de la bikunina placentaria puede ser empleada para producir las variantes de bikunina placentaria recombinante.
La invención también se relaciona con la construcción del ADN que codifica las variantes de la proteína bikunina placentaria de la presente invención. Estas construcciones pueden prepararse por métodos sintéticos tales como aquellos descritos en Beaucage S.L. y Caruthers M.H., (1981) Tetrahedron Lett, 22, pp1859-1862; Matteucci M.D y Caruthers M.H., (1981), J. Am. Chem. Soc. 103, p 3185; o a partir del genómico o cADN el cual puede haber sido obtenido por selección genómica o librerías de cADN con sondas de cADN designadas para hibridizar con bikunina placentaria que codifica la secuencia de ADN. La secuencia genómica o cADN puede ser modificada en uno o más sitios para obtener el cADN codificando cualquiera de las sustituciones o deleciones de aminoácidos descritas en este descubrimiento.
La invención instantánea también se relaciona con los vectores de expresión que contienen la construcción de ADN que codifica la bikunina placentaria, dominios aislados u otras variantes de la presente invención que pueden ser utilizados para la producción de las variantes de la bikunina placentaria recombinante. El cADN debería ser conectado por una secuencia promotor apropiada la cual muestra actividad transcripcional en la célula huésped de elección, posee un adecuado terminador y una señal de poliadenilaión. El cADN codifica la variante de la bikunina placentaria puede ser combinada con el péptido señal 5' que resultará en la proteína codificada por el cADN para experimentar secreción. El péptido señal puede ser uno que es reconocido por el organismo huésped. En el caso de una célula huésped mamífero, el péptido señal también puede ser el péptido señal natural presente en la bikunina placentaria de longitud total. Los procedimientos utilizados para preparar tales vectores para expresión de las variantes de la bikunina placentaria son conocidos en el oficio y son por ejemplo descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, (1989).
La invención instantánea también se relaciona con las células transformadas que contienen las construcciones del ADN que codifican la bikunina placentaria, dominios aislados u otras variantes de la presente invención que pueden ser empleadas para la producción de las variantes de la bikunina placentaria recombinante. Existe una variedad de combinaciones del vector de expresión y el organismo huésped, que pueden se utilizadas para la producción de variantes de la bikunina placentaria. Apropiadas células huésped incluyen células de insecto Sf9 infectadas con báculo virus, células de mamífero tales como BHK, CHO, Hela y C-127, bacterias tales como E. coli, y levaduras tales como Saccharomyces cervisiae. Los métodos para emplear los sistemas de expresión de mamífero, insectos y microbios necesitados para lograr la expresión de la bikunina placentaria son conocidos en el oficio y se describen, por ejemplo, en Ausubel F.M et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995), Chapter 16. Se prefieren los fragmentos de bikunina placentaria que contienen un inhibidor del dominio Kunitz, tales como sistemas de expresión de bikunina (7-64) y (102-159), levaduras y E. coli, siendo más preferido con sistemas de levadura. Típicamente, la expresión de levaduras se llevaría acabo como se describe en la patente US 5,164,482 para las variantes de aprotinina y adaptada en el Ejemplo 5 de la presente especificación para bikunina placentaria (102-159). La expresión E. coli se podría realizar empleando los métodos descritos en la patente US 5,032,573. Se prefiere más el uso de sistemas de mamífero y levadura para la expresión de las variantes de la bikunina placentaria más grande que contiene ambos dominios inhibidores tales como la variante de la bikunina (7-159).
El ADN que codifica las variantes de la bikunina placentaria, ese que posee sustitución de aminoácido de la secuencia amino natural se puede preparar por expresión de la proteína recombinante utilizando los métodos de Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492. Briefly, el ADN para ser mutagenizado se clonó en un vector bacteriófago de cadena sencilla tal como M13. Un oligonucleótido que abarca la región para ser cambiada y que codifica la sustitución se hibridiza al ADN de cadena sencilla y se hace doble cadena por técnicas estándar de biología molecular. Este ADN luego se transforma en un huésped bacteriano apropiado y verificado por la secuenciación del dideoxinucleótido, El ADN correcto luego se clona en el plásmido de expresión. Alternativamente, el ADN objetivo puede ser mutagenizado por técnicas estándar PCR, secuenciado, e insertado en el apropiado plásmido de expresión.
Los siguientes ejemplos específicos se ofrecen a modo de ilustración, y no de limitación, de ciertos aspectos y modalidades preferidas de la invención instantánea.
Ejemplo 1
No un ejemplo de la invención
Preparación de la bikunina placentaria sintética (102-159)
Materiales y métodos/Reactivos utilizados. El sustrato fluorogénico Tos-Gly-Pro-Lys-AMC se adquirió de Bachem BioScience Inc (King of Prussia, PA). PNGB, Pro-Phe-Arg-AMC, Ala-Ala-Pro-Met-AMC, la tripsina de bovino (tipo III), la Kalicreína en plasma humano, y la plasmina humana se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO).
La aprotinina recombinante (Trasylol®) fue de Bayer AG (Wuppertal, Germany). La resina Wang Gln Pre-cargada fue de Novabiochem (La Jolla, CA). Tioanisol, etanoditiol y t-butil metil éter fueron de Aldrich (Milwaukee, WI).
Cuantificación de la bikunina placentaria funcional (7-64) y (102-159)
La cantidad de la actividad inhibitoria de tripsina presente en la muestra replegada en varios etapas de purificación se midió empleando GPK-AMC como un sustrato. Tripsina de bovino (200 pmoles) se incubó por 5 min. a 37ºC con bikunina (7-64) o (102-159), a partir de varios etapas de purificación, en solución reguladora A (50 mM Hepes, pH 7.5, NaCl 0.1 M , CaCl_{2} 2 mM y 0.01% de triton X-100). Se adicionó GPK-AMC (20 PM final) y la cantidad de cumarina producida se determinó midiendo la fluorescencia (ex = 370 nm, em = 432 nm) en un fluorímetro Perkin-Elmer LS-50B sobre un periodo de 2 min. Para las muestras que eran probadas el % de inhibición para cada uno fue calculado según la ecuación 1; donde R_{o} es el índice del aumento de fluorescencia en la presencia del inhibidor y R_{1} es el índice determinado en la ausencia de la muestra adicionada. Una unidad de actividad para el inhibidor se define como la cantidad necesaria para alcanzar el 50% de inhibición en el ensayo empleando las condiciones descritas.
(1)% de inhibición = 100 x [1 - R_{0}/R_{1}]
Síntesis. La bikunina placentaria (102-159) se sintetizó en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems model 420A empleando la química NMP-HBTU Fmoc. El péptido se sintetizó en una resina Gln pre-cargada con un exceso de 8 veces del aminoácido para cada acoplamiento. La división y desprotección se realizó en ácido trifluoroacético (TFA) al 84.6%, tioanisol al 4.4%, etanoditiol al 2.2% , 4.4% de fenol licuado, y H_{2}O 4.4% por 2 horas a temperatura ambiente. El péptido crudo se precipitó, centrifugó y lavo dos veces en t-butil metil éter. El péptido se purificó en un HPLC Dynamax 60A, columna de fase reversa C18 utilizando un gradiente de TFA/acetonitrilo. La preparación final (61.0 mg) produjo la composición del aminoácido correcta y la masa molecular por Espectroscopia de masas electro spray (MH+ =6836.1; Calc. = 6835.5) para la secuencia predecible:
YEEYCTANAV TGPCRASFPR WYFDVERNSC NNFIYGGCRG NKNSYRSEEA CMLRCFRQ (SEQ ID NO: 6)
Purificación. El replegado de la bikunina placentaria (102-159) se realizó de acuerdo con el método de Tam et al., (J. Am. Chem. Soc. 1991, 113: 6657-62). Una porción del péptido purificado (15.2 mg) se disolvió en 4.0 ml de Tris 0.1 M, pH 6.0, y urea 8 M. La oxidación de los disulfuros se logró mediante la adición gota a gota de una solución que contiene 23% de DMSO, y Tris 0.1 M , pH 6.0 para obtener una concentración final de 0.5 mg/ml del péptido en 20% de DMSO, Tris 0.1 M, pH 6.0, y urea 1 M. La solución se dejo agitando por 24 horas a 25ºC después de lo cual se diluyó 1:10 en solución reguladora que contiene Tris 50 mM , pH 8.0, y NaCl 0.1 M. El material se purificó empleando una columna de afinidad de Kalicreína hecha por adhesión covalente de 30 mg de Kalicreína pancreática de bovino (Bayer AG) en 3.5 ml de Sepharose activada con CNBr (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El material replegado se cargó en la columna de afinidad a una rata de flujo de 1 ml/min y se lavó con Tris 50 mM , pH 8.0, y NaCl 0.1 M hasta que la absorbancia a 280 nm del lavado no se detecto más. La columna se eluyó con 3 volúmenes cada uno de ácido acético 0.2 M, pH 4.0 y 1.7. Las fracciones activas se combinaron (ver abajo) y el pH de la solución se ajustó a 2.5. El material se aplicó directamente a una columna de fase reversa C18 Vydac (5 micron, 0.46 x 25 cm) la que ha sido equilibrada con acetonitrilo 22.5% en TFA 0.1%. La separación se logró empleando un gradiente lineal de 22.5 a 40% de acetonitrilo en TFA 0.1% a 1.0 ml/min durante 40 min. La fracciones activas se combinaron, liofilizaron, se redisolvieron en TFA 0.1% , y se almacenaron a -20ºC hasta ser necesitadas.
Resultados. La bikunina placentaria sintética (102-159) se replegó empleando DMSO al 20% como agente de oxidación como se describió anteriormente, y se purificó por un protocolo de purificación de 2-etapas como se muestra abajo, para producir un inhibidor de tripsina activo (Tabla 1 abajo).
TABLA 1 Tabla de purificación para el aislamiento de la bikunina placentaria sintética (102-159)
Paso de Purificación Vol (ml) mg/ml mg Unidades^{c} (U) SpA (U/mg) Producción
Urea 8.0 M 4.0 3.75^{a} 15.0 0 0 -
DMSO 20% 32.0 0.47^{a} 15.0 16,162 1,078 100
Afinidad de kalicreína 9.8 0.009^{b} 0.09 15,700 170,000 97
C18 3.0 0.013^{ab} 0.04 11,964 300,000 74
^{a} proteína determinada por AAA.
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} proteína determinada por OD280 nm utilizando la extinción del coeficiente determinada por la proteína purificada (1.7 x 10^{4} Lmol^{-1} cm^{-1}). \end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm} Una Unidad se define como la cantidad de material requerido para inhibir el 50% de actividad de tripsina en una ensayo estándar.\end{minipage}
La cromatografía del material replegado crudo sobre una columna Kalicreína pancreática de bovino inmovilizada aísla selectivamente el 6.0% de la proteína y el 97% de la actividad inhibitoria de tripsina presente. Subsiguiente la cromatografía que uso una fase reversa C18 produce una purificación posterior de 2-veces, con una recuperación completada del 74%. Sobre RPHPLC, la bikunina placentaria reducida y replegada (102-159), muestra tiempos de elusión de 26.3 y 20.1 minutos, respectivamente. Análisis de espectroscopia de masas del material purificado revelan una masa molecular de 6829.8; una pérdida de 6 unidades de masa a partir del material inicial. Esto demuestra la formación completa de los 3 disulfuros predecibles de la secuencia del péptido.
Los puntos isoeléctricos de la bikunina placentaria purificada, sintética replegada (102-159) se determinó utilizando un Sistema de Electroforesis (Pharmacia) que funciona de acuerdo con las sugerencias del fabricante, juntos con estándares pI, utilizando un precast Ampholine® PAGplate (pH 3.5 a 9.5) y centrado por 1.5 horas. Después del teñido, se mide, la distancia de migración a partir del borde catódico del gel para las diferentes bandas de proteína. El pI de cada desconocido se determinó empleando una curva de estándares generada por un registro de la distancia de migración de los estándares contra el correspondiente pI. Con esta técnica, el pI de la bikunina placentaria (102-159) se determinó en 8.3, en concordancia con el valor predecible a partir de la secuencia de aminoácido. Este es un valor más bajo que el de 10.5 establecido por el pI de aprotinina. (Tenstad et al., 1994, Acta Physiol. Scand. 152:33-50).
Ejemplo 2
No un ejemplo de la invención
Preparación de bikunina placentaria sintético (7-64)
La bikunina placentaria (7-64) se sintetizó, se replegó y purifico esencialmente como se describe para la bikunina placentaria (102-159) pero con las siguientes modificaciones: durante la replegación, el péptido sintético se agitó por 30 h. con una solución en DMSO al 20% a 25ºC; la purificación por HPLC-RPC18 se logró con un gradiente lineal de 25 a 45% de acetonitrilo en TFA 0.1% durante 40 min (1ml/min). Las fracciones activas de la primera corrida por C18 se vuelven a aplicar en la columna y se separan con un gradiente lineal (60 min, 1 ml/min) de 20 a 40% de acetonitrilo en TFA 0.1%.
Resultados. El péptido reducido purificado final muestra un MH+ = 6563, consistente con la secuencia:
IHDFCLVSKV VGRCRASMPR WWYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID NO: 4)
El repliegue y la purificación producen un dominio Kunitz funcional que se activó como un inhibidor de tripsina (Tabla 2 abajo).
TABLA 2A Tabla de purificación para el aislamiento de la bikunina placentaria sintética (7-64)
Paso de Purificación Vol (ml) mg/ml mg Unidades (U) SpA (U/mg) Producción
Urea 8.0 M 8.0 2.5 20.0 0 0 -
20% DMSO 64.0 0.31 20.0 68,699 3,435 100
Afinidad Kall pH 4.0 11.7 0.10 1.16 43,333 36,110 62
Afinidad Kall pH 1.7 9.0 0.64 5.8 4972 857 7.2
C18-1 4.6 0.14 0.06 21,905 350,143 31.9
C18-2 1.0 0.08 0.02 7,937 466,882 115
La proteína replegada purificada exhibe un MH+ = 6558, i.e. 5\pm1 unidades de masa menos que para el péptido reducido. Esto demuestra que el repliegue causa la formación de al menos un enlace disulfuro apropiado.
El pI de la bikunina placentaria (7-64) se determinó utilizando los métodos empleados para determinar el pI de la bikunina placentaria (102-159). La bikunina placentaria (7-64) exhibe un pI que fue mucho más alto que el valor predecible (pI = 7.9). La bikunina placentaria repliegue (7-64) migró al borde catódico del gel (pH 9.5) y no se podría determinar un pI exacto bajo estas condiciones.
Preparación Continua de la bikunina placentaria sintética (7-64)
Dado que la bikunina placentaria sintética (7-64) no pudo haber experimentado desprotección completa antes de la purificación y el repliegue se repitió utilizando una proteína la cual fue confirmada para estar completamente desprotegida. La bikunina placentaria (7-64) se sintetizó, se replegó y se purificó esencialmente como se describe para la bikunina placentaria (102-159) pero con las siguientes modificaciones: durante el repliegue, el péptido sintético (0.27 mg/ml) se agito por 30 horas con una solución en DMSO 20% a 25ºC; La purificación por HPLC-RPC18 se logró con un gradiente lineal de 22.5 a 50% de acetonitrilo en TFA 0.1% durante 40 min (1 ml/min).
Resultados. El péptido reducido purificado final exhibe un MH+ = 6567.5, consistente con la secuencia:
IHDFCLVSKV VGRCRASMPRW WYNVTDGSC QLFVYGGCDG NSNNYLTKEE CLKKCATV (SEQ ID NO: 4)
El repliegue y la purificación produce un dominio Kunitz funcional es decir activo como un inhibidor de tripsina (Tabla 2B abajo).
TABLA 2B Tabla de purificación para el aislamiento del bikunina placentaria sintética (7-64)
Paso de Purificación Vol (ml) mg/ml mg Unidades (U) SpA (U/mg) Producción
Urea 8.0 M 4.9 2.1 10.5 0 0
DMSO 20% 39.0 0.27 105 236,000 22,500 100
Kalicreína 14.5 0.3 0.43 120,000 279,070 50.9
Afinidad (pH 2) Fase 02 1.2 0.24 70,676 294,483 30.0
Reversa C18
La proteína replegada purificada exhibe un MH+ = 6561.2, i.e. 63 unidades de masa menos que para el péptido reducido. Esto demuestra que el repliegue causa la formación de los tres enlaces disulfuro esperados.
El pI del repliegue de la bikunina placentaria (7-64) se determinó utilizando los métodos empleados para determinar el pI de la bikunina placentaria (102-159). El repliegue de la bikunina placentaria (7-64) exhibe un pI de 8.85, ligeramente más alto que el valor predecible (pI = 7.9).
Ejemplo 3
No un ejemplo de la invención
Especificidad in vitro del fragmento de la bikunina placentaria funcional (102-159)
Proteasas. La cuantificación de Tripsina Bovina, plasmina humana, y Kalicreína pancreática de bovino se realizó por titulación del sitio de activación empleando p-nitrofenil p'-guanidinobenzoato HCl como se describió previamente (Chase, T., y Shaw, E., (1970) métodos Enzmol., 19: 20-27). La Kalicreína Humana se cuantificó por titulación del sitio activo utilizando aprotinina bovina como un estándar y PFR-AMC como un sustrato que asume una formación compleja 1:1. El K_{m} para GPK-AMC con tripsina y plasmina bajo las condiciones empleadas para cada enzima fue 29 \muM y 726 \muM, respectivamente; el K_{m} para PFR-AMC con Kalicreína en plasma humano y Kalicreína pancreática de bovino fue 457 \muM y 81.5 \muM, respectivamente; el K_{m} para AAPR-AMC con elastasa fue 1600 \muM. La cuantificación de Kalicreína tisular humana (Bayer, Germany) se realizó por titulación del sitio activo empleando p'nitrofenil p'-guanidinobenzoato HCl como se describió previamente (Chase, T., y Shaw, E., (1970) methods Enzmol. 19:20-27).
Cinética de inhibición: La inhibición de tripsina por bikunina placentaria (102-159) o aprotinina se midió por incubación de 50 pM de tripsina con bikunina placentaria (102-159) (0-2 nM) o aprotinina (0-3 nM) en solución reguladora A en un volumen total de 1.0 ml. Después de 5 min. a 37ºC, 15 \mul de GPK-AMC 2 mM se adicionó y se monitoreó el cambio en fluorescencia (según arriba). La inhibición de plasmina humana por bikunina placentaria (102-159) y aprotinina se determinó con plasmina (50 pM) y bikunina placentaria (102-159) (0-10 nM) o aprotinina (0-4 nM) en solución reguladora que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 7.5), NaCl 0.1 M, y 0.02% de triton x-100. Después de 5 minutos de incubación a 37ºC, se adicionaron 25 \mul de GPK-AMC 20 mM y se monitoreó el cambio en fluorescencia. La inhibición de Kalicreína en plasma humano por bikunina placentaria (102-159) o aprotinina se determinó utilizando Kalicreína (2.5 nM) y bikunina placentaria (102-159) (0-3 nM) o aprotinina (0-45 nM) en Tris- HCl 50 mM (pH 8.0), NaCl 50 mM, y 0.02% de triton x-100. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionaron 15 \mul de PFR-AMC 20 mM y se monitoreó el cambio en fluorescencia. La inhibición de Kalicreína pancreática de bovino por bikunina placentaria (102-159) y aprotinina se determinó de una manera similar con Kalicreína (92 pM), bikunina placentaria (102-159) (0-1.6 nM) y aprotinina (0-14 pM) y una concentración final del sustrato de 100 \muM. La constante de inhibición aparente K_{i}* se determinó utilizando el programa de análisis de datos de regresión no lineal Enzfitter software (Biosoft, Cambridge, UK): Los datos cinéticos de cada experimento se analizaron en términos de la ecuación para un inhibidor de enlace fuerte:
(2)V_{i}/V_{0} = 1 - (E_{ O} + I_{0} + K_{i}\text{*} - [(E_{0} +I_{0} + K_{i}\text{*})^{2} - 4E_{0} +I_{0}]^{1/2}) 2E_{0}
donde V_{i}/V_{o} es la actividad de la enzima fraccional (inhibido vs. índice no inhibido), y E_{o} y I_{o} son las concentraciones totales de enzima e inhibidor, respectivamente. Los valores de K_{i} se obtuvieron por la corrección para el efecto del sustrato de acuerdo con la ecuación:
(3)K_{i} = K_{i}\text{*}/(1 + [S_{0}]/K_{m}
(Boudier, C., y Bieth, J. G., (1989) Biochim Biophys Acta., 995: 36-41)
Para la inhibición de elastasa humana del neutrófilo por bikunina placentaria (102-159) y aprotinina, se incubó elastasa (19 nM) con bikunina placentaria (102-159) (150 nM) o aprotinina (0-7.5 PM) en solución reguladora que contiene Tris 0.1 M-HCl (pH 8.0), y 0.05% de triton X-100. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionaron AAPM-AMC (500 \muM o 1000 \muM) y la fluorescencia se midió sobre un periodo de dos-minutos. Se determinaron los valores de K_{i} a partir de registros Dixon de la forma 1/V contra [I] realizado a dos concentraciones diferentes (Dixon et al, 1979).
La inhibición de Kalicreína tisular humana por aprotinina, del fragmento de la bikunina placentaria (7-64) o del fragmento de la bikunina placentaria (102-159) se midió por la incubación de Kalicreína tisular humana 0.35 nM con bikunina placentaria (7-64) (0-40 nM) o bikunina placentaria (102-159) (0-2.5 nM), o aprotinina (0-0.5 nM) en un volumen de reacción de 1 ml que contiene solución reguladora Tris-HCl 50 mM pH 9.0, NaCl 50 mM, y 0.1% de triton x-100. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionaron 5 \mul de PFR-AMC obteniendo 10 \muM final y se monitoreo el cambio de fluorescencia. El Km para PFR-AMC con Kalicreína tisular humana bajo las condiciones empleadas fue de 5.7 \muM. La inhibición del factor humano Xa (American Diagnostica, Inc, Greenwich, CT) por bikunina placentaria sintético (102-159), bikunina placentaria recombinante, y aprotinina se midió por la incubación de factor humano Xa 0.87 nM con incremento de las cantidades del inhibidor en solución reguladora que contiene Tris 20 mM (pH 7.5), NaCl 0.1 M, y 0.1% de BSA. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionaron 30 \mul de LGR-AMC 20 mM (Sigma) y se monitoreó el cambio en fluorescencia. La inhibición de urokinasa humana (Sigma) por inhibidores de Kunitz se midió por la incubación de urokinasa (2.7 ng) con inhibidor en un volumen total de 1 ml de solución reguladora que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8.0), NaCl 50 mM, y 0.1% de Triton x-100. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionaron 35 \mul de GGR-AMC 20 mM (Sigma) y se monitoreó el cambio en fluorescencia. La inhibición del Factor XIa (de Enzyme Research Labs, Southbend, IN) se midió por incubación del FXIa (0.1 nM) con ya sea 0 a 800 nM de bikunina placentaria (7-64), 0 a 140 nM de bikunina placentaria (102-159) o 0 a 40 \muM de aprotinina en solución reguladora que contiene Hepes 50 mM pH 7.5, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 2 mM, 0.01% de triton x-100, y 1% de BSA en un volumen total de 1 ml. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionó 10 \mul de Boc-Glu (OBzl)-Ala-Arg-AMC 40 mM (Bachem Biosciences, King of Prussia, PA) y se monitoreó el cambio en fluorescencia.
Resultados: Una comparación directa de los perfiles de inhibición de bikunina placentaria (102-159) y aprotinina se hizo midiendo sus constantes de inhibición con varias proteasas bajo condiciones idénticas. Los valores Ki son incluidos abajo en una lista de la Tabla 3.
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TABLA 3 Valores Ki para la inhibición de varias proteasas por bikunina (102-159)
Proteasa Bikunina Aprotinina Ki Sustrato Km
(concentración) (102-159) (nM) (concentración) (mM)
Ki (nM)
Tripsina (48.5 pM) 0.4 0.8 GPK-AMC (003 mM) 0.022
quimotripsina (5 nM) 0.24 0.86 AAPF-pNA (0.08 mM) 0.027
Kalicreína Pancreática 0.4 0.02 PFR-AMC (0.1 mM) 0.08
Bovina (92.0 pM)
Kalicreína Plasma 03 19.0 PFR-AMC (03 mM) 0.46
Humano(2.5 nM)
plasmina humana 1.8 1.3 GPK-AMC (0.5 mM) 0.73
(50 pM)
Elastasa Neutrófila 323.0 8500.0 AAPM-AMC (1.0 PM) 1.6
Humana (19 nM)
Factor XIIa >300.0 12,000.0 PFR-AMC (0.2 PM) 0.35
Kalicreína tisular 0.13 0.004 PFR-AMC (10 PM) 0.0057
humana (0.35 nM)
factor Xa (0.87 nM) 274 N.I. at 3 \muM LGR-AMC (0.6 mM) N.D
Urokinasa 11000 4500 GGR-AMC (0.7 mM) N.D
factor XIa (0.1 nM) 15 288 E(OBz)AR-AMC 0.46
(0.4 mM)
La bikunina placentaria (102-159) y la tripsina bovina que inhibe la aprotinina y la plasmina humana a una extensión comparable bajo las condiciones empleada. La aprotinina inhibe la elastasa con un Ki de 8.5 \muM. La bikunina placentaria (102-159) inhibió la elastasa con un Ki de 323 nM. El valor de Ki para la inhibición de la bikunina placentaria (102-159) de Kalicreína pancreática de bovino fue 20-veces más alto que ese de la inhibición de la aprotinina. En contraste, la bikunina placentaria (102-159) es un inhibidor más potente de Kalicreína en plasma humano que la aprotinina y une con una afinidad 56-veces más alta.
Puesto que la bikunina placentaria (102-159) es más grande que el 50 veces más potente que el Trasylol® como un inhibidor de Kalicreína, cantidades más pequeñas de bikunina placentaria humano, o los fragmentos de esta (i.e. bikunina placentaria (102-159)) son necesarias que el Trasylol® con el fin de mantener la dosis efectiva del inhibidor en KIU para el paciente. Esto reduce el costo por dosis del medicamento y reduce la probabilidad de efectos nefrotóxicos adversos bajo re-exposición del medicamento en pacientes. Adicionalmente, la proteína es derivada de humano, y de esa manera mucho menos inmunogénica en el hombre que la aprotinina la cual se derivada de vacas. Esto da a lugar en reducciones significantes en el riesgo de incurrir eventos inmunológicos adversos sobre nuevas exposiciones del medicamento a los pacientes.
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Ejemplo 4
No un ejemplo de la invención
Especificidad In vitro del fragmento de la bikunina placentaria funcional (7-64)
La especificidad in vitro de la bikunina placentaria humana funcional (7-64) se determinó utilizando los materiales y métodos según lo descrito en los Ejemplos arriba.
Resultados: La tabla abajo muestra la eficacia de la bikunina placentaria (7-64) como un inhibidor de varias proteasas de serina in vitro. Los datos se muestran comparados contra los datos obtenidos por selección de inhibición utilizando bikunina placentaria (102-159), o aprotinina (Trasylol®)
TABLA 4A Valores de Ki para la inhibición de varias proteasas por bikunina (7-64)
Proteasa (concentración) bikunina(7-64) Ki (nM) Aprotinina Ki (nM) bikunina (102-159)
Ki (nM)
Tripsina (485 pM) 0.17 0.8 0.4
Kalicreína Pancreática Bovina 0.4 0.02 0.4
(92.0 pM)
Kalicreína en plasma humano 2.4 19.0 0.3
(2.5 nM)
Plasmina humana (50 pM) 3.1 13 1.8
Quimotripsina Bovina (5 nM) 0.6 09 02
Factor XIIa >300 12000 >300
Elastasa >100 8500 323
Los resultados muestran que la secuencia de aminoácido que codifica la bikunina placentaria (7-64) puede ser replegada para obtener una proteasa de serina inhibidora activa que es efectiva frente al menos de cuatro proteasas de serina similares a tripsina.
La tabla 4B abajo también muestra la eficacia de la bikunina placentaria replegada (7-64) como un inhibidor de varias proteasas de serina. La bikunina placentaria replegada (7-64) se preparó a partir de la proteína que fue confirmada para ser desprotegida completamente antes de la purificación y el repliegue se muestra comparado contra los datos obtenidos por selección de inhibición utilizando bikunina placentaria (102-159), o aprotinina (Trasylol®).
TABLA 4B Valores Ki para la inhibición de varias proteasas por bikunina replegado (7-64)
Proteasa (concentración) bikunina(7-64) Ki (nM) Aprotinina Ki (nM) bikunina (102-159)
Ki (nM)
Tripsina (50 pM) 0.2 0.8 03
Kalicreína en plasma humano 0.7 19.0 0.7
(0.2 nM)
Plasmina humana (50 pM) 3.7 1.3 1.8
Factor XIIa No se hizo 12,000 4,500
Factor XIa (0.1 nM) 200 288 15
Kalicreína tisular humana 23 0.004 0.13
Sorprendentemente, la bikunina placentaria (7-64) fue más potente que la aprotinina en inhibir la Kalicreína en plasma humano, y al menos similar en eficacia como un inhibidor de plasmina. Estos datos muestran que la bikunina placentaria (7-64) es al menos tan efectivo como la aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que uno podría esperar mejor o similar potencia in vivo.
Ejemplo 5
No un ejemplo de la invención
Expresión de la variante bikunina placentaria (102-159) en levadura
La secuencia de ADN que codifica la bikunina placentaria 102-159 (SEQ ID NO: 6) se generó empleando oligonucleótidos sintéticos. El producto de ADN final consiste de 15 nucleótidos (5' a 3') a partir de la secuencia del pro péptido del factor de acoplamiento \alpha de levadura combinado con la secuencia de cADN dentro del marco que codifica la bikunina placentaria (102-159), seguido por un codón de terminación dentro del marco. Sobre la clonación en un vector de expresión para levadura p5604, el cADN conduciría la expresión de una proteína de fusión que comprende un pro péptido del factor de acoplamiento \alpha de levadura N-Terminal combinada con la secuencia de aminoácido 58 de la bikunina placentaria (102-159). El procedimiento de esta proteína de fusión en un sitio de división KEX-2 en el empalme entre el factor de acoplamiento y el dominio Kunitz se diseño para liberar el dominio Kunitz a su N-Terminal nativa.
Se sintetizó un oligonucleótido sentido 5' de la siguiente secuencia y que contiene un sitio HindIII para la clonación:
100
Se sintetizó un oligonucleótido antisentido 3' de la siguiente secuencia y que contiene ambos un sitio BamHI para la clonación y un codón de terminación:
101
Los oligonucleótidos se disolvieron en solución reguladora Tris 10 mM pH 8.0 que contiene EDTA 1 mM, y se adicionaron combinados 12 \mug de cada oligo y se mezclaron con NaCl 0.25 M. Para hibridizar, los oligonucleótidos se desnaturalizaron mediante ebullición por 5 minutos y se dejaron enfriar de 65ºC a temperatura ambiente durante 2 horas. Las superposiciones se extendieron utilizando el fragmento de Klenow y se digirieron con HindIII y BamHI. El fragmento de doble cadena digerido resultante se clonó en pUC19 y se confirmó la secuencia. Un clon que contiene el fragmento de la secuencia correcta se digirió con BamHI/HindIII para liberar la bikunina que contiene el fragmento con la siguiente + cadena de secuencia:
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7
la cual luego se purificó por gel y se ligó en BamHI/HindIII corte pS604. La mezcla del ligando se extrajo en fenol/cloroformo y se purificó sobre una columna S-200. El producto del ligando se transformó en cepas de levadura SC101 y WHL341 y se enchapo sobre placas de selección ura. Doce colonias de cada cepa se replicaron sobre placas ura separadas. Una sola colonia se inoculó en 2 ml de medio DO ura y creció durante la noche a 30ºC. Las células se granularon por 2 minutos a 14000x g y los sobrenadantes se evaluaron por su contenido de bikunina placentaria (102-159).
Detección de la expresión de bikunina placentaria (102-159) en levaduras transformadas
En primer lugar, los sobrenadantes (50 \mul por ensayo) se evaluaron por su capacidad para inhibir la actividad in vitro de la tripsina utilizando los métodos de ensayo según lo descrito en el Ejemplo 1 (1 ml de volumen de ensayo). Un medio no-usado únicamente así como un clon de levadura que expresa una variante inactiva de aprotinina sirvió como control negativo. Una levadura hecha expresando una aprotinina natural sirvió como un control positivo y se muestra para comparación.
El segundo método para cuantificar la expresión de la bikunina placentaria (102-159) explotó el uso de anticuerpos policlonales (pAbs) contra el péptido sintético para monitorear la acumulación del péptido recombinante utilizando Western blots. Estos estudios se realizaron únicamente con recombinantes derivados de la cepa SC101, dado que estos producen una actividad inhibitoria más grande que los recombinantes derivados de la cepa WHL341.
Para producir el pAb, dos conejos hembras Nueva Zelandia de 6-8 semanas de edad (Hazelton Research Labs, Denver, Pa) se inmunizaron en el día cero con 250 \mug de bikunina placentaria sintético reducido purificado (102-159), en adyuvante de Freund Completo, seguido por estímulos en los días 14, 35 y 56 y 77 cada uno con 125 \mug del mismo antígeno en Adyuvante de Freund Incompleto. El antisuero utilizado en los presentes estudios se recolectó después del tercer estímulo por procedimientos establecidos. Los anticuerpos policlonales se purificaron del antisuero sobre la proteína A.
Las colonias 2.4 y 2.5 de la transformación de la levadura SC101 (Figura 8) así como una aprotinina control se cultivó durante la noche en 50 ml de medio DO ura a 30ºC. Las células se granularon y el sobrenadante se concentró 100-veces utilizando un concentrador Centriprep 3 (Amicon, Beverly, MA). Las muestras de cada una (30 \mul) fueron sujetas a SDS-PAGE sobre geles de solución reguladora tricina al 10-20% (Novex, San Diego, CA) utilizando los procedimientos de fabricación. Geles duplicados se desarrollaron ya sea con un kit de tinción de plata (Integrated Separation Systems, Nantick, MA) o transferidos en nitrocelulosa y desarrollados con el anticuerpo policlonal purificado producido en bikunina sintético (102-159). Alcalina-fosfatasa conjugada del anticuerpo anti-conejo de cabra se utilizó como el anticuerpo secundario de acuerdo con las orientaciones de los fabricantes (Kirkegaard y Perry, Gaithersburg, MD).
Purificación de bikunina placentaria (102-159) a partir de una cepa transformada de SC101
El caldo de fermentación a partir de 1 L de cultivo de la cepa 2.4 SC101 se cosechó por centrifugación (4,000 g x 30 min.) luego se aplicó 1.0 ml en una columna de anhidroquimotripsina-sepharose (Takara Biochemical Inc., CA), que fue previamente equilibrada con solución reguladora Hepes 50 mM pH 7.5 que contiene NaCl 0.1 M, CaCl_{2} 2 mM y 0.01% (v/v) de triton X-100. La columna se lavó con la misma solución reguladora pero que contiene NaCl 1.0 M hasta que la A280 nm declina a cero, entonces la columna se eluye con ácido fórmico 0.1 M pH 2.5. Las fracciones eluidas se combinaron y se aplicaron a una columna C18 (Vydac, 5 um, 4.6 x 250 mm) previamente equilibrada con TFA 0.1%, y eluidas con un gradiente lineal de 20 a 80% acetonitrilo en TFA 0.1% durante 50 min. Las fracciones que contienen bikunina placentaria (102-159) se combinaron y se volvió a hacer la cromatografía en C18 empleando una elusión con gradiente lineal 22.5 a 50% de acetonitrilo en TFA 0.1%.
Resultados. La Figura 8 muestra el porcentaje de la actividad inhibida de tripsina por doce colonias derivadas de la transformación de cada una de las cepas SC101 y WHL341. Los resultados muestran que todas las doce colonias de cepas de levadura SC101 transformadas con la bikunina placentaria inhibidora de tripsina (102-159) tienen la habilidad de producir una cantidad sustancial de actividad inhibitoria de tripsina comparada con los controles negativos ambos de los cuales no muestran habilidad para inhibir la tripsina. La actividad es por consiguiente relacionada con la expresión de un inhibidor específico en las células transformadas de la variante de bikunina placentaria (102-159). Las muestras de levadura WHL341 contenían la mínima actividad inhibitoria de tripsina. Este puede ser correlacionado con el crecimiento lento observado con esta cepa bajo las condiciones empleadas.
La Figura 9 muestra los análisis SDS-PAGE y western de los sobrenadantes de levadura SC101. La Tinción de plata SDSPAGE de los sobrenadantes derivados a partir de levaduras recombinantes 2.4 y 2.5 expresando la bikunina placentaria (102-159) así como a partir de la levadura expresando la aprotinina produciendo una banda de proteína corriendo a aproximadamente 6 kDa, que corresponden al tamaño esperado para cada dominio inhibidor de Kunitz recombinante. El análisis Western mostró que las bandas 6 kDa expresadas por tinción 2.4. y 2.5 reaccionan con el pAb producido en la bikunina placentaria (102-159). La misma banda 6 kDa en la aprotinina control no reacciona con el mismo anticuerpo, demostrando la especificidad del anticuerpo para la variante de la bikunina placentaria (102-159).
La preparación final del dominio C-Terminal bikunina placentaria fue altamente puro por tinción de plata SDS-PAGE (Figura 10). La recuperación total de la actividad inhibitoria de tripsina derivada del caldo en la preparación final fue del 31%. La secuenciación N-Terminal del inhibidor purificado indica que el 40% de la proteína se proceso correctamente para producir el N-Terminal correcto para la bikunina placentaria (102-159) mientras aproximadamente el 60% del material contiene una porción del factor de acoplamiento \alpha de levadura. El material purificado comprende un inhibidor de proteasa de serina activa que exhibe un Ki aparente de 0.35 nM para la inhibición in vitro de Kalicreína en plasma.
En conclusión, la acumulación de una actividad del inhibidor de proteasa y una proteína inmunoquímicamente relacionada con la bikunina sintética (102-159) en el caldo de fermentación así como el aislamiento de la bikunina placentaria (102-159) a partir de una de las líneas transformadas proporcionó la prueba de expresión de la bikunina placentaria en las cepas de levadura recombinante descritas en esta, demostrando por primera vez la utilidad de las levaduras para la producción de los fragmentos de la bikunina placentaria.
Adicionales construcciones se prepararon en un esfuerzo por aumentar el nivel de expresión del dominio Kunitz contenido dentro de la bikunina placentaria 102-159, así como el incremento de la producción de la proteína con el N-Terminal correcto. Nosotros hicimos la hipótesis que los residuos N-Terminal de la bikunina placentaria 102-159 (YEEY-) pueden haber presentado un sitio de división que únicamente se reconoce pobremente a la proteasa KEX-2 de levadura que enzimáticamente remueve la a-factor pro-región de levadura. Por consecuencia, nosotros preparamos la construcción de la expresión de levadura para la producción de bikunina placentaria 103-159 (N-Terminal of EEY...), 101-159 (N-Terminal of NYEEY...) y 98-159 (DMFNYEEY.) con el fin de modificar los subsitios P' circundantes al sitio de división KEX-2. Para intentar aumentar los niveles de expresión de la proteína recombinante, también nosotros utilizamos la levadura preferida de los codones más bien que los codones preferidos del mamífero en la preparación de alguno de las construcciones descritas abajo. Las construcciones esencialmente se prepararon como se describió arriba para la bikunina placentaria 102-159 (definido según la construcción #1) pero con las siguientes modificaciones:
Construcción # 2 de la bikunina placentaria 103-159, usando el codón de levadura
Un oligonucleótido sentido 5'
102
y un oligonucleótido antisentido 3'
103
se manipularon como se describe para la producción de una construcción de expresión (construcción # 1 arriba) para la expresión de bikunina placentaria 102-159
Construcción # 3 de la bikunina placentaria 101-159, usando el codón de levadura
Un oligonucleótido sentido 5'
104
y el mismo oligonucleótido antisentido 3' como se uso para la construcción # 2, se manipularon como se describe para la producción de una construcción de expresión (construcción # 1 arriba) para la expresión de bikunina placentaria 102-159. La construcción # 4 de la bikunina placentaria 98-159, usando el codón de levadura
Un oligonucleótido sentido 5'
105
y el mismo oligonucleótido antisentido 3' como se uso para la construcción # 2, se manipularon como se describe para la producción de una construcción de expresión (construcción # 1 arriba)
La cepa de levadura SC101 (MAT\alpha, ura 3-52, suc 2) se transformó con los plásmidos que contienen cada uno de los cDNAs citados anteriormente, y las proteínas se expresaron utilizando los métodos que se describieron arriba para la producción de bikunina placentaria 102-159 con el uso del codón humano. Aproximadamente 250 ml de cada cultivo de levadura se cosecharon, y el sobrenadante a partir de la centrifugación (15 min. x 3000 RPM) separadamente son sometidas a purificación en columnas de 1 ml de Kalicreína-sepharose como se describe arriba. La cantidad relativa de la actividad inhibitoria de tripsina en el aplicado la cantidad de la proteína recuperada purificada y la secuencia N-Terminal de la proteína purificada se determinó y se listó abajo en la Tabla 7.
TABLA 7 Niveles de Producción Relativos de diferentes proteínas que contienen el dominio Kunitz C-terminal de la bikunina placentaria
Construcción Conc. relativa de secuenciación N-terminal Comentarios
inhibidor en applysate cantidad(pmol) secuencia
#2 108-159 ninguno detectado ninguno ninguno no expresión
#3 101-159 25% inhibición ninguno ninguno Baja expresión
#4 98-159 93% inhibición 910 DMFNYE- buena expresión
producto correcto
#1 102-159 82% inhibición 480 AKEEGV- expresión de proteína
procesada incorrectamente
activa 
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Los resultados muestran que los fragmentos de la bikunina placentaria de diferentes longitudes que contienen el domino Kunitz C-terminal muestra una variación amplia en capacidad para expresar la proteína segregada funcional. La construcción de los fragmentos de expresión 101-159 y 103-159 produjo una actividad enzimática pequeña o baja en los sobrenadantes antes de la purificación, y la secuenciación N-terminal de alícuotas de 0.05 ml de cada fracción purificada produjo cantidades indetectables del inhibidor. Por otra parte la expresión ya sea de la bikunina placentaria 102-159 o de la 98-159 produce cantidades significantes de la actividad de proteasa antes de la purificación. La secuenciación N-terminal sin embargo mostró que la proteína purificada recuperada de la expresión de 102-159 fue procesada de nuevo en gran parte incorrectamente, exhibiendo un N-terminal consistente con el procedimiento de la mayoría de las pre-proteínas en un sitio dentro de la pro-secuencia del factor de acoplamiento \alpha de la levadura. La proteína purificada recuperada de la expresión de bikunina placentaria 98-159 sin embargo se proceso en su totalidad en el correcto sitio para producir el N-terminal correcto. Adicionalmente, casi el doble de la proteína se recuperó como comparación con la recuperación de la bikunina placentaria 102-159. De este modo, la bikunina placentaria 98-159 representa un tramo de fragmento preferido para la producción del dominio Kunitz C-terminal de la bikunina placentaria por el pre-pro secuencia factor de acoplamiento \alpha/KEX-2 procedimiento del sistema de
S. cerevisiae,
Ejemplo 6 Procedimiento alternativo para la expresión de levadura
El péptido del aminoácido 58 derivado a partir del producto de traducción R74593 también puede ser PCR amplificado a partir ya sea del producto PCR R87894-R74593 clonado dentro del TA vector™ (Invitrogen, San Diego, CA) después de la secuenciación de ADN o del cADN de placenta humana. El producto de ADN amplificado consiste de 19 nucleótidos a partir de la secuencia líder del factor de acoplamiento \alpha de levadura acoplado a la secuencia R74593 la cual codifica para la YEEY-CFRQ (58 residuos) así como para hacer el producto de traducción en marco, la construcción de una proteína de fusión factor de acoplamiento \alpha/dominio Kunitz. La secuencia de proteína también contiene una división 2 kex la cual libera el dominio Kunitz a su N-Terminal nativo.
El oligonucleótido sentido 5' que contiene un sitio HindIII para la clonación contendrá la siguiente secuencia:
GCCAAGCTTG GATAAAAGAT ATGAAGAAT ACTGCACCGC CAACGCA (SEQ ID NO: 30)
El oligonucleótido antisentido 3' contiene un sitio BamHI para la clonación, así como un codón de terminación y es de la siguiente secuencia:
GGGGATCCTC ACTGCTGGCG GAAGCAGCGG AGCAT (SEQ ID NO: 32)
La secuencia de cADN de 206 nucleótidos total para ser clonada en el vector de expresión de levadura es de la siguiente secuencia:
8
Después de la amplificación PCR, este ADN se digerirá con HindIII, BamHI y se clonó dentro del vector de expresión de levadura pMT15 (ver patente US 5, 164,482, incorporado por referencia en su totalidad) también se digirió con HindIII y BamHI. El vector plásmido resultante se usa para transformar la cepa de levadura SC 106 utilizando los métodos descritos en la patente US 5, 164,482. Las transformadas levaduras URA 3+ son aisladas y cultivadas bajo condiciones inducidas. La producción de las variantes de bikunina placentaria recombinante se determina de acuerdo con la cantidad de actividad inhibitoria de tripsina que se acumula en el cultivo de sobrenadantes sobre el tiempo utilizando el método de ensayo in vitro descrito arriba. Los caldos de fermentación son centrifugados a 9000 rpm por 30 minutos. Luego el sobrenadante es filtrado a través de un filtro 0.4 luego un 0.2 \mum, diluido a una conductividad de 7.5 ms, y se ajustó a pH 3 con ácido cítrico. Luego la muestra se absorbe sobre 200 ml de S-sepharose de flujo rápido (Pharmacia) en citrato de sodio 50 mM pH 3 y se agitó por 60 min. Posteriormente el gel se lavo secuencialmente con 2 L de de cada uno de: citrato de sodio 50 mM pH 3.0; Tris-HCL 50 mM pH 9.0; HEPES 20 mM pH 6.0. El gel lavado se transfirió a una columna apropiada y se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio 0 a 1 M en HEPES 20 mM pH 6.0. Las fracciones eluidas que contienen actividad inhibitoria de tripsina in vitro luego se combinan y además se purifican por cualquiera de estos métodos a) cromatografía sobre una columna de anhidrotripsina inmovilizada (esencialmente según lo descrito en el Ejemplo 2); b) por cromatografía sobre una columna de Kalicreína bovina inmovilizada; o c) una combinación de los pasos cromatográficos convencionales que incluyen filtración por gel y/o cromatografía de intercambio-aniónico.
Ejemplo 7 Aislamiento y caracterización de bikunina placentaria humana nativa a partir de placenta
La proteína Bikunina se purificó para aparentar homogeneidad a partir de toda la placenta congelada (Analytical Biological Services, Inc, Wilmington, DE). La placenta (740 gm) se descongeló a temperatura ambiente y se corto en piezas de 0.5 a 1.0 cm., se colocó en hielo y se lavó con 600 ml de solución reguladora PBS. El lavado se decantó y 240 ml de las piezas de placenta se colocaron en un mezclador Waring. Después de la adición de 300 ml de la solución reguladora que consiste de Tris 0.1 M (pH 8.0), y NaCl 0.1 M, la mezcla se homogeneizó a alta velocidad por 2 min., se decantó en tubos de centrífuga de 750.0 ml, y se colocaron en hielo. Este procedimiento se repitió hasta que todo el material se procesó. La suspensión combinada se centrifugó a 4500 x g por 60 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtró a través de tela para fabricar queso y la bikunina placentaria purificada utilizando una columna de afinidad de Kalicreína hecha por adhesión covalente de 70 mg de Kalicreína pancreática de bovino (Bayer AG) en 5.0 ml de CNBr Sepharose activada (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El material se cargó dentro de la columna de afinidad a una rata de flujo de 2.0 ml/min. y se lavó con Tris 0.1 M (pH 8.0), NaCl 0.1 M hasta que la absorbancia a 280 nm del lavado no podría ser detectada más. Además la columna se lavo con Tris 0.1 M (pH 8.0), NaCl 0.5 M y luego se eluyó con 3 volúmenes de ácido acético 0.2 M, pH 4.0. Las fracciones que contienen actividad inhibitoria de Kalicreína y tripsina (ver abajo) se combinaron, congelaron, y liofilizaron. Además la bikunina placentaria se purificó adicionalmente por cromatografía de gel-filtración empleando una columna Superdex 75 10/30 (Pharmacia) conectada a un sistema HPLC Beckman System Gold. Concretamente, la columna se equilibró en Tris 0.1 M, NaCl .15 M, y 0.1% de Triton X-100 a una rata de flujo de 0.5 ml/min. La muestra de liofilizada se reconstituyó en 1.0 ml de Tris 0.1 M, pH 8.0 y se inyecto dentro de la columna de gel-filtración en alícuotas de 200 \mul. Las fracciones se colectaron (0.5 ml) y se analizaron para la actividad inhibitoria de tripsina y Kalicreína. Las fracciones activas se combinaron, y el pH de la solución se ajustó a 2.5 por adición de TFA. El material se aplicó directamente a una columna de fase-reversa C18 (5 micron, 0.46 x 25 cm.) la cual ha sido equilibrada en 20% de acetonitrilo en 0.1% de TFA. La separación se logró utilizando un gradiente lineal de 20 a 80% de acetonitrilo en 0.1% TFA a 1.0 ml/min. durante 50 minutos después de un lavado inicial de 20 minutos con 20% de acetonitrilo en 0.1% de TFA. Las fracciones (1ml) se colectaron y se analizaron para la actividad inhibitoria de tripsina y Kalicreína. Las fracciones que contienen actividad inhibitoria se concentraron utilizando un concentrador speed-vac (Savant) y se sometieron a un análisis de la secuencia N-Terminal.
Ensayos funcionales para bikunina placentaria
La identificación de la bikunina placentaria funcional se logró midiendo su habilidad para inhibir la tripsina bovina y la Kalicreína en plasma humano. La actividad inhibitoria de tripsina se realizó en una solución reguladora ensayo (50 mM Hepes, pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2.0 mM CaCl_{2}, 0.1% de Triton x-100) a temperatura ambiente en una placa de microtitulación de 96-pozos (Perkin Elmer) utilizando como sustrato Gly-Pro-Lys-Aminometilcumarina. La cantidad de cumarina producida por la tripsina se determinó midiendo la fluorescencia (ex = 370 nm, em = 432 nm) en un fluorímetro Perkin-Elmer LS-50B equipado con un lector de placa. La tripsina (23 \mug en 100 \mul de solución reguladora) se mezcló con 20 \mul de la muestra para ser analizada e incubada por 10 minutos a 25ºC. La reacción se inició por la adición de 50 Pl del sustrato GPK-AMC (33 \muM final) en solución reguladora ensayo. La intensidad de fluorescencia se midió y el % de inhibición para cada fracción se determinó por:
% de inhibición = 100 x [1 - F_{0}/F_{1}]
donde F_{0} es la fluorescencia del desconocido y F_{1} es la fluorescencia del control solo de tripsina. La actividad inhibitoria de Kalicreína de las fracciones fue medida del mismo modo utilizando Kalicreína 7.0 nM en solución reguladora ensayo (Tris50 mM, pH 8.0, NaCl 50 mM, 0.1% de triton x-100) y 66.0 PM Pro-Phe-Arg-AMC como sustrato.
Determinación de la especificidad in vitro de bikunina placentaria
La especificidad in vitro de bikunina placentaria humano nativa se determinó utilizando los materiales y métodos según lo descrito en los ejemplos precedentes arriba. La bikunina placentaria se cuantificó por titulación del sitio activo contra una concentración conocida de tripsina utilizando GPK-AMC como un sustrato para monitorear la fracción de tripsina sin enlace.
Secuenciación de Proteínas
1 ml de la fracción (Delaria C18-29) se redujo a un volumen de 300 ml, en un Speed Vac, para reducir la cantidad de solvente orgánico. La muestra luego se cargó dentro de una columna de reacción bifásica miniatura Hewlett-Packard, y se lavo con 1 ml de ácido trifluoroacético al 2%. La muestra se secuenció en un sistema de secuenciación de proteínas Hewlett-Packard Modelo G1005A utilizando la degradación de Edman. Los métodos de secuenciación versión 3.0 y todos los reactivos se suministraron por Hewlett-Packard. La secuencia se confirmó para 50 ciclos.
Resultados. La bikunina placentaria se purificó por visible homogeneidad mediante afinidad de Kalicreína secuencial, gel-filtración, y cromatografía de fase reversa (ver purificación en la tabla abajo):
TABLA 5 Tabla de Purificación para bikunina placentaria nativa (1-179)
Paso Vol (ml) OD 280 (/ml) OD 280 Unidades^{a} (U) Unidades/OD 280
Sobrenadante 1800.0 41.7 75,060 3,000,000 40.0
de placenta
Afinidad de 20.0 0.17 3.36 16,000 4,880
Kalicreína pH 4.0
Afinidad de 10.2 0.45 4.56 12,000 2,630
Kalicreína pH 1.7
Superdex 75 15.0 0.0085 0.13 3,191 24,546
^{a} Una unidad se define como esa cantidad la cual inhibe el 50% de la actividad de tripsina en un ensayo estándar.
La mayoría de la actividad inhibitoria de Kalicreína y tripsina eluye de la columna de afinidad de Kalicreína en la elusión con pH 4.0. La siguiente cromatografía gel-filtración (Figura 5) produce un pico de la actividad inhibitoria de Kalicreína y tripsina con un peso molecular que oscila de 10 a 40 kDa como se discriminó por una curva estándar por corridas de estándares de peso molecular bajo las mismas condiciones. La cromatografía de fase reversa C18 (Figura 6) produjo 4 picos de la actividad inhibitoria con el más potente eluyendo a aproximadamente 30% de acetonitrilo. La actividad asociada con el primer pico de elusión desde C18 (fracción 29) exhibe una secuencia de aminoácido inicial con el 1 aminoácido de la predecible secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria (ADRER...; SEQ ID NO: 1), y fue idéntica a la predecible secuencia para los 50 ciclos de secuenciación (aminoácidos subrayados en la Figura 3). Los residuos de cisteina dentro de este tramo de la secuencia se silenciaron como se esperaba para la secuenciación de la proteína oxidada. Los residuos de cisteina en las posiciones del aminoácido 11 y 20 de la bikunina placentaria maduro se identificaron después a partir de la secuenciación de la proteína S-piridiletilada con lo cual la PTH-piridiletil-cisteina se recuperó en los ciclos 11 y 20.
Interesantemente, la esparagina en el residuo de aminoácido número 30 de la secuencia (Figura 3) se silencio mostrando que este sitio es propenso a ser glicosolado. La fracción 29 produjo una secuencia mayor que corresponde a esa de la bikunina placentaria iniciando en el residuo # 1 (27 pmol en el ciclo 1) más una secuencia menor (2 pmol) también derivada a partir de la bikunina placentaria iniciando en el residuo 6 (SIHD...). Esto muestra que la preparación final secuenciada en la fracción 29 es altamente pura, y más probablemente responsable por la actividad inhibitoria asociada con ésta fracción (Figura 6).
Por consiguiente, la preparación final de la bikunina placentaria a partir de la cromatografía C18 fue altamente pura basado en un análisis de tinción de plata SDS-PAGE (Figura 7), donde la proteína migró con un Mr aparente de 24 kDa en un gel de tricina acrilamida del 10 al 20% (Novex, San Diego, CA) calibrando los siguientes marcadores de peso molecular: insulina (2.9 kDa); inhibidor de la tripsina bovina (5.8 kDa); lisozima (14.7 kDa); \beta-lactoglobulina (18.4 kDa); anhidrasa carbónica (29 kDa); y ovalbumina (43 kDa). El tamaño anterior de la bikunina placentaria en SDS-PAGE es consistente con aquel predecible de la secuencia codificada de longitud total (Figura 4F).
Como lo esperado en base a los resultados descritos arriba de la secuenciación N-Terminal, la proteína purificada reacciona con un anticuerpo producido por la bikunina placentaria (7-64) para producir una banda con la misma Mr (Figura 12A) como se observó para la preparación purificada detectada en los geles por tinción con plata (Figura 7). Sin embargo, cuando la preparación de la muestra se hace reaccionar con un anticuerpo producido por la bikunina placentaria sintética (102-159), una banda que corresponde a la proteína de longitud total no se observó. Más bien, se observó un fragmento que co-migró con la bikunina sintético (102-159) de aproximadamente 6 kDa. La interpretación más simple de estos resultados es que la preparación purificada ha experimentada una degradación subsiguiente a la purificación para producir un fragmento N-Terminal fragmento que comprende el dominio N-Terminal y un fragmento C-Terminal que comprende el dominio C-Terminal. Dado que el fragmento reactivo contra el antisuero de la bikunina placentaria (7-64) se debe al final del C-Terminal de la proteína de longitud completa, el tamaño (24 kDa) sugeriría un alto estado de glicosilación.
La Tabla 6. abajo muestra la potencia de inhibición in vitro de varias proteasas de serina por la bikunina placentaria. Los datos son comparados con aquellos obtenidos con la aprotinina (Trasylol®).
TABLA 6 Ki valores para la inhibición de varias proteasas por bikunina placentaria
Proteasa (concentración) bikunina placentaria Ki (nM) Aprotinina Ki (nM)
Tripsina (48.5 pM) 0.13 0.8
Plasmina humana (50 pM) 1.9 13
Los resultados muestran que la bikunina placentaria aislada de una fuente natural (placenta humana) es un potente inhibidor de tripsina-similar a las proteasas de serina.
Ejemplo 8 Expresión patrón de la bikunina placentaria entre los diferentes tejidos y órganos humanos
Un tejido northern múltiple se adquirió de Clontech el cual contiene 2 \mug de polyA+RNA a partir de corazón humano, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas. Dos diferentes sondas de cADN se utilizaron: 1) un gel purificado de cADN codificando la bikunina placentaria (102-159); 2) el cADN PCR-derivado de 780 pares de base (Figura 4E) liberado a partir de un clon TA por digestión con EcoRI y purificación con gel. Cada sonda se marcó utilizando el ^{32}P-dCTP y un kit marcador cebador aleatorio de Boehringer Mannheim Biochemicals (Indiana), luego se empleo para hibridizar los múltiples tejidos northern de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. Autoradiografías se generaron utilizando película Biomax con un tiempo de exposición de 18 horas, y desarrollados utilizando un Scanner Umax y escaneado empleando un Adobe Photoshop.
Resultados. El patrón de expresión tisular observado utilizando una sonda de bikunina placentaria (102-159) (Figura 11A) o una sonda más larga que contiene los dominios kunitz de la bikunina placentaria (Figura 11B) fue esencialmente el mismo como podría ser esperado. El mARN de la bikunina placentaria fue más abundante en páncreas y placenta. También se observaron niveles significantes en pulmón, cerebro y riñón mientras se conservaron niveles más bajos en hígado y corazón, y el mARN no se detectaron en el músculo esquelético. El tamaño trascrito fue de 1.95 kilo bases en todos los casos, en cercano acuerdo con el tamaño predecible de bikunina placentaria deducido de la cubierta EST y la clonación del cADN de longitud total descrito en las secciones precedentes.
La amplia distribución del tejido celular del mARN muestra que la bikunina placentaria es ampliamente expresada. Dado que la proteína también contiene una secuencia líder, esta tendría una amplia exposición al sistema inmunitario humano, requiriendo que esta proteína individual. La adicional evidencia para una distribución tisular amplia de la expresión del mARN de la bikunina placentaria se derivó a partir del hecho de que algunos de los accesos EST con homología a la bikunina placentaria (Figura 4B) se derivaron de un adulto humano y cerebro infantil, y retina humana, pecho, ovario, epitelio olfativo, y placenta. Se concluye por consiguiente que la administración de la proteína humana nativa en pacientes humanos sería improbablemente para producir una respuesta inmune.
Interesantemente, el patrón de expresión de la bikunina placentaria es un poco reminiscente de aquella para aprotinina de bovino la cual se encuentra en altos niveles en pulmón y páncreas bovino. Adicionalmente para clarificar la expresión patrón de la bikunina placentaria, RT-PCR del RNA total de las siguientes células humanas se determinó: células endoteliales de vena umbilical no-estimuladas (HUVECs), HK-2 (línea derivada del túbulo proximal del riñón), TF-1 (línea eritroleucemia) y leucocitos de sangre periferal éster forbólico (PMA)-estimulados. Las sondas usadas:
CACC'TGATCGCGAGACCCC (sentido; SEQ ID NO: 59);
CTGGCGGAAGCAGCGGAGCATGC (antisentido; SEQ ID NO: 60),
se designaron para amplificar una bikunina placentaria de 600 b.p codificando el fragmento de cADN. Las compariciones se normalizaron por inclusión de cebadores para la actina para amplificar el fragmento de actina de 800 b.p... Mientras que el fragmento 800 b.p identificado en geles de agarosa con bromuro de etidio fue de igual intensidad en todas la sendas, el fragmento 600 b.p. de la bikunina placentaria esta ausente del HUVECs pero presente en cantidades significantes en cada una de las otras líneas celulares. Nosotros concluimos que la bikunina placentaria no es expresada en al menos alguna célula endotelial pero se expresa en alguna población de leucocitos.
Ejemplo 9 Purificación y propiedades de la bikunina placentaria (1-170) altamente purificado a partir de un sistema de Baculovirus/expresión Sf9
Un gran fragmento de bikunina placentaria que contiene ambos dominios Kunitz (bikunina placentaria 1-170) se expresó en las células Sf9 como sigue. El cADN de la bikunina placentaria obtenido por PCR (Figura 4E) y contenido dentro de un vector TA (ver los Ejemplos previos) se liberó por digestión con HindIII y XbaI produciendo un fragmento flanqueado por un sitio 5' XbaI u un sitio 3' HindIII. Este fragmento se purificó por gel y luego se clonó dentro del vector 19 M13mp (New England Biolabs, Beverly, MA). La mutagénesis in vitro (Kunkel T.A., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492) se utilizó para generar un sitio PstI 3' para el sitio XbaI 5' final, pero el 5' en la secuencia que codifica el sitio inicial ATG, el péptido señal de la bikunina placentaria natural y la secuencia que codifica la bikunina placentaria madura. El oligonucleótido utilizado para la mutagénesis tiene la secuencia:
5' CGC GTC TCG GCT GAC CTG GCC CTG CAG ATG GCG CAC GTG TGC GGG 3' (SEQ ID NO: 61)
Un codón de terminación (TAG) y el sitio BglII /XmaI se sometió a ingeniería del mismo modo en el terminal 3' del cADN empleando el oligonucleótido:
5' CTG CCC CTT GGC TCA AAG TAG GAA GAT CTT CCC CCC GGG GGG GTG GTT CTG GCT GGG CTG 3' (SEQ ID NO: 62).
El codón de terminación se enmarcó con la secuencia codificando la bikunina placentaria y causó la terminación inmediatamente siguiendo la Lisina en el residuo del aminoácido 170, de esta manera la codificación de un fragmento truncado de la bikunina placentaria carente del dominio transmembrana putativo. El producto de la digestión con PstI y BglII se aisló en el vector BacPac8 para la expresión del fragmento de la bikunina placentaria (1-170) que contiene ambos dominios Kunitz pero el cual trunca inmediatamente el N-terminal en el segmento transmembrana putativo.
La expresión de la bikunina por las células de insecto Sf-9 fue óptima en una multiplicidad de infecciones de 1 a 1 cuando el medio se cosechó a 72 h post infección. Después del cultivo, el sobrenadante del cultivo celular de báculo virus (2L) se ajustó a pH 8.0 mediante la adición del Tris-HCl. La bikunina se purificó por cromatografía utilizando una columna de afinidad de 5 ml de Kalicreína pancreática de bovino como previamente se describe en el Ejemplo 7 para la purificación de la bikunina placentaria nativa a partir de la placenta. El material eluido se ajustó a pH 2.5 con TFA y se sometió a cromatografía en una columna de fase reversa C18 (1.0 x 25 cm) equilibrada en acetonitrilo 10% en 0.1% de TFA a una rata de flujo de 1 ml/min. La bikunina se eluyó con un gradiente lineal de 10 a 80% de acetonitrilo en 0.1% de TFA durante 40 min. Las fracciones activas se combinaron, liofilizaron, se redisolvieron en Hepes 50 mM (pH 7.5), NaCl 0.1 M, CaCl2 2 mM, y 0.1% de triton x-100, y almacenadas a -20ºC hasta que se necesiten. La concentración de la bikunina recombinante se determinó por un análisis de aminoácidos.
Resultados. La bikunina recombinante se purificó a partir del sobrenadante del cultivo celular de báculo virus utilizando un protocolo de purificación de 2-etapas como se muestra abajo, para producir un inhibidor de tripsina activo (Tabla 8 abajo).
TABLA 8 Purificación de la bikunina recombinante a partir del cultivo sobrenadante transformado
Paso de Purificación Vol (ml) OD 280/ml OD 280 total Unidades (U) Actividad específica
(U/OD)
Sobrenadante 2300.0 9.0 20,700 6,150,000 297
Afinidad Kalicreína 23.0 0.12 2.76 40,700 14,746
Fase Reversa C18 0.4 3.84 1.54 11,111 72,150
La cromatografía del material crudo sobre una columna de afinidad de Kalicreína pancreática de bovino inmovilizada selectivamente aislada un 0.013 % de la proteína y un 0.67 % de la actividad inhibitoria de tripsina presente. La mayoría de la actividad inhibitoria de tripsina presente en sobrenadante inicial no se unió a la Kalicreína inmovilizada y no está relacionada con la bikunina (no se mostraron los resultados). La cromatografía subsiguiente que utiliza fase reversa C18 produjo una purificación adicional de 5-veces, con una recuperación del 0.2%. La preparación final fue altamente pura por SDS-PAGE (Figura 13), exhibiendo un Mr de 21.3 kDa, y reacciona sobre las inmunotransferencias en la anti-bikunina placentaria de conejo 102-159 (no se muestra). La secuenciación N-terminal (26 ciclos) produjo la secuencia esperada para la bikunina placentaria madura (Figura 4F) iniciando en el residuo +1 (ADRER....), mostrando que el péptido señal se proceso correctamente en las células Sf9.
La bikunina placentaria purificada de las células Sf9 (100 pmol) fue piridiletil-alkilada, digerida con CNBr y luego secuenciada sin la resolución de los fragmentos resultantes. La secuenciación para 20 ciclos produjo el siguiente
N-terminii:
Secuencia
Cantidad # de residuo de bikunina placentaria
LRCFrQQENPP-PLG- - - - -
21 pmol 154-168 (SEQ ID NO: 63)
ADRERSIHDFCLVSKVVGRC
20 pmol 1-20 (SEQ ID NO: 64)
FNYeEYCTANAVTGPCRASF
16 pmol 100-119 (SEQ ID NO: 65)
Pr-Y-V-dGS-Q-F-Y-G
6 pmol 25-43 (SEQ ID NO: 66)
De esta manera los N-terminii que corresponde a cada uno de los cuatro fragmentos esperados se recuperaron. Esto confirma que la proteína expresada Sf9 contiene la secuencia ectodominio total de la bikunina placentaria (1-170). La secuenciación N-terminal (50 ciclos) de una muestra adicional de la bikunina placentaria no digerida (1-170) que resulto en una secuencia de aminoácido que en el ciclo 30 esta falto de cualquier PTH-aminoácido (PTH-esparagina se esperó). Un resultado similar se obtuvo bajo la secuenciación de la proteína natural a partir de la placenta humana (Ejemplo 7) y es consistente con este residuo siendo glicosolada como de predice desde la secuencia de aminoácido circundante de este residuo de esparagina. Adicionalmente, los residuos de cisteina dentro de esta región también se silenciaron consistente con su participación en el enlace disulfuro.
Ejemplo 10 Inhibición de la especificidad de la bikunina placentaria purificado derivada de las células Sf9
La especificidad in vitro de la bikunina recombinante se determinó utilizando los materiales y métodos como se describe en los Ejemplos 3, 4 y 7. Además, la inhibición de Kalicreína tisular humana por bikunina se midió mediante la incubación de la bikunina recombinante de Kalicreína tisular humana 0.35 nM en solución reguladora que contiene Tris 50 mM (pH 9.0), NaCl 50 mM, y 0.01% de triton x-100. Después de 5 min. a 37ºC, se adicionó 5 \mul de PFR-AMC 2 mM y el cambio de fluorescencia se monitoreó.
La inhibición del activador plasminógeno tisular (tPA) también se determinó como sigue: tPA (forma de cadena sola a partir de cultivo celular de melanoma humano de Sigma Chemical Co, St Louis, MO) se pre-incubo con un inhibidor por 2 horas a temperatura ambiente en solución reguladora Tris 20 mM pH 7.2 que contiene NaCl 50 mM, y 0.02% de azida de sodio. Las reacciones se iniciaron subsiguientemente por transferencia a un sistema de reacción que comprende las siguientes concentraciones del componente inicial: tPA (7.5 nM), inhibidor 0 a 6.6 mM, DIle-Lpro-Larg-pNitroanilina (1 mM) en solución reguladora Tris 28 mM pH 8.5 que contiene 0.004% (v/v) de triton x-100 y 0.005% (v/v) de azida de sodio. La formación de p-Nitroanilina se determinó a partir de la medida A405nm siguiendo la incubación a 37ºC por 2 horas.
\newpage
La tabla de abajo muestra la eficacia de la bikunina recombinante como un inhibidor de varias proteasas de serina in vitro. Los datos se muestran comparados contra los datos obtenidos para la selección de la inhibición utilizando cualquiera el bikunina recombinante, o la aprotinina.
TABLA 9 Comparaciones de valores Ki para la inhibición de varias proteasas por bikunina placentaria recombinante (1-170) o aprotinina
Proteasa (concentración) Bikunina Recombinante Aprotinina Ki (nM)
Ki (nM)
Tripsina (48.5 pM) 0.064 0.8
Kalicreína en plasma humano (2.5 nM) 0.18 19.0
Kalicreína tisular humana (0.35 nM) 0.04 0.004
Kalicreína Pancreática Bovina (100 pM) 0.12 0.02
Plasmina humana (50 pM) 0.23 13
Factor Xa (0.87 nM) 180 5% inhibición a 31 \muM
Factor XIa (0.1 nM) 3.0 288
Activator plasminógeno tisular (7.5 nM) < 60 sin inhibición a 6.6 \muM
Factor VIIa Tisular 800 sin inhibición a 1 \muM
Los resultados muestran que la bikunina recombinante puede ser expresada en células de insecto para producir un inhibidor de proteasa activo que es efectivo contra al menos cinco diferentes inhibidores de proteasa de serina. La bikunina recombinante fue más potente que la aprotinina contra la Kalicreína en plasma humano, tripsina y plasmina. Sorprendentemente, la bikunina recombinante fue más potente que los fragmentos de bikunina derivados sintéticamente (7-64) y (102-159) contra todas las enzimas probadas. Estos datos muestran que la bikunina recombinante es más efectiva que la aprotinina, utilizando ensayos in vitro, y que uno esperaría mejorar la potencia in vivo.
Adicionalmente la medida de las potencias contra proteasas específicas, la capacidad de la bikunina placentaria (1-170) para prolongar el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTR) se evaluó y se comparó con la actividad asociada con la aprotinina. El inhibidor se diluyó en solución reguladora Tris en 20 mM pH 7.2 que contiene NaCl 150 mM y 0.02% de azida de sodio y se adiciona (0.1 ml) a una cubeta contenida dentro de un Automatic Coagulation Timer coagulometer MLA ElectraR 800 (Medical Laboratory Automation, Inc., Pleasantville, N.Y.). El instrumento se ajustó a un modo APTT con un tiempo de activación de 300 seg. Y el modo duplicado. Siguiendo la adición de 0.1 ml de plasma (Specialty Assayed Reference Plasma lot 1-6-5185, Helena Laboratories, Beaumont, TX), el reactivo APTT (Automated APTT-lot 102345, from Organon Teknika Corp., Durhan, NC) y CaCl_{2} 25 mM se dispensó automáticamente para la coagulación inicial, y el tiempo de coagulación se monitoreó automáticamente. Los resultados (Figura 14) mostraron que una duplicación del tiempo de coagulación requiere aproximadamente 2 \muM de aprotinina final, pero únicamente 0.3 \muM de bikunina placentaria derivada de Sf9. Estos datos muestran que la bikunina placentaria es un efectivo anticoagulante, y útil como un medicamento para enfermedades que involucran activación patológica del sistema intrínseco de coagulación.
A pesar de que ciertas modalidades de la invención han sido descritas en detalle para el propósito de la ilustración, será fácilmente visible para aquellos de habilidad en el oficio que los métodos y formulaciones descritas en esta pueden ser modificados sin retirarse del espíritu y alcance de la invención. Consecuentemente, la invención no se limita a menos que con las anexas reivindicaciones.

Claims (12)

1. Una proteína sustancialmente purificada, que tiene una actividad inhibitoria de la proteasa de serina, que comprende la siguiente secuencia de aminoácido, los aminoácidos de dicha secuencia son numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa mostrada en la figura 4F en la cual el residuo N-terminal generado por la eliminación del péptido señal se designa como residuo 1:
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2. Una proteína sustancialmente purificada, que tiene una actividad inhibitoria de proteasa de serina, que comprende uno de las siguientes secuencias de aminoácidos, los aminoácidos de dichas secuencias son numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa mostrado en la figura 4F en la cual el residuo N-terminal generado por la eliminación del péptido señal se designa como residuo 1:
10
11
3. Una proteína sustancialmente purificada, que tiene una actividad inhibitoria de proteasa de serina, que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos, los aminoácidos de dichas secuencias son numeradas de acuerdo con la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa mostrada en la figura 4F en la cual el residuo N-terminal generado por la eliminación del péptido señal se designa como residuo 1:
12
4. Una proteína sustancialmente purificada, que tiene una actividad inhibitoria de la proteasa de serina, comprende la siguiente secuencia de aminoácido, los aminoácidos de dicha secuencia son numerados de acuerdo con la secuencia de aminoácido de la bikunina placentaria humana nativa mostrada en la figura 4F en la cual el residuo N-terminal generado por la eliminación del péptido señal se designa como residuo 1:
13
5. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha proteína es glicosolada, o contiene al menos un enlace disulfuro cisteina-cisteina intra-cadena, o es glicosolada y contiene al menos un enlace disulfuro cisteina-cisteina intra-cadena.
6. Una composición farmacéutica para la inhibición de la actividad de proteasa de serina, que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 más un excipiente farmacéuticamente aceptable.
\newpage
7. Una secuencia de ácido nucleico aislada que se codifica por una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
8. Un vector de expresión de una proteína autoreplicable que contiene una secuencia de ácido nucleico que se codifica por una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y es capaz de expresar esta proteína.
9. Un método in vitro para inhibir la actividad de proteasa de serina que comprende el contacto de la proteasa de serina con una cantidad efectiva de al menos una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para el tratamiento de un edema cerebral, edema de médula espinal, esclerosis múltiple, isquemia, pérdida de sangre perioperativa, septicemia, choque séptico, fibrosis, coagulación patológica de sangre o coagulación, accidente cerebrovascular, hemorragia cerebral o subaracnoidea, inflamación del cerebro, inflamación de la médula espinal, infección cerebral, granulomatosis cerebral, infección espinal, granulomatosis espinal, cáncer gástrico, cáncer cervical o prevención de metástasis.
11. Utilización de una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de edema cerebral, edema de médula espinal, esclerosis múltiple, isquemia, pérdida de sangre perioperativa, septicemia, choque séptico, fibrosis, coagulación patológica de sangre o coagulación, accidente cerebrovascular, hemorragia cerebral o subaracnoidea, inflamación del cerebro, inflamación de la médula espinal, infección cerebral, granulomatosis cerebral, infección espinal, granulomatosis espinal, cáncer gástrico, cáncer cervical, o prevención de metástasis.
12. Un método para preparar una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 utilizando tecnología de ADN recombinante.
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