CN115515616A

CN115515616A - 乌司他丁多肽

Info

Publication number: CN115515616A
Application number: CN202180032829.8A
Authority: CN
Inventors: 里克·保尔斯; 托德·维多恩; 卡尔·弗兰克·约翰逊; 格雷戈里·托马斯·布莱克
Original assignee: On Behalf Of Amedica America Co ltd
Current assignee: On Behalf Of Amedica America Co ltd
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-12-23
Also published as: US11725043B2; US20240002472A1; BR112022017718A2; WO2021178843A1; TW202142562A; CA3174478A1; JP2023516422A; EP4114428A1; US20210277090A1

Abstract

提供了乌司他丁糖型、乌司他丁融合多肽以及相关的组合物、混合物和使用方法，包含重组产生乌司他丁多肽和治疗疾病的方法。

Description

乌司他丁多肽

相关技术说明

乌司他丁(也被称为尿胰蛋白酶抑制剂)是源自人尿液的糖蛋白蛋白酶抑制剂，所述糖蛋白蛋白酶抑制剂抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、乳酸盐、脂肪酶、透明质酸酶和各种胰酶的活性。高度纯化的乌司他丁已在临床上用于治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、烧伤、脓毒性休克、中毒性表皮坏死松解症(TEN)和其它疾病。

乌司他丁被批准用于人类治疗多种病状，包含胰腺炎。然而，需要大量的乌司他丁，因为所述乌司他丁是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，即有效的蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂与蛋白酶的活性位点不可逆地反应并且因此通常以与其靶标1:1的化学计量消耗。这种特性加上全身给药后实现的相对低的体内暴露对由天然乌司他丁蛋白产生治疗剂提出了挑战。

因此，本领域需要乌司他丁多肽以及产生重组乌司他丁多肽的相关方法，所述乌司他丁多肽具有与其重组产生和/或治疗效用相关的经改进的特性。

发明内容

本公开的实施例包含分离的成熟乌司他丁多肽，所述分离的成熟乌司他丁多肽包括：(i)在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化；(ii)在残基N45处的N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的O-连接聚糖，所述残基由SEQ ID NO:2或4定义，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

在一些实施例中，所述分离的成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)所述经修饰的O-连接糖基化位点；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。在一些实施例中，所述分离的成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)SEQ IDNO:2的S10A取代；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。在具体实施例中，所述分离的成熟乌司他丁多肽包括SEQ ID NO:2、由其组成或基本上由其组成，并且包括在残基N45处的所述N-连接聚糖和在残基T17处的所述O-连接聚糖。

在一些实施例中，所述至少一种乌司他丁活性选自蛋白酶抑制剂活性、抗炎活性和抗转移活性中的一种或多种。在一些实施例中，所述乌司他丁多肽的特异性活性为约或至少约1000-3000U/mg、或约或至少约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000U/mg，其中一个单位(U)是所述乌司他丁多肽将2μg胰蛋白酶活性抑制50％的量。

还包含治疗组合物，所述治疗组合物包括本文所描述的分离的成熟乌司他丁多肽以及药学上可接受的载体。一些组合物包括以下的混合物：(a)本文所描述的分离的成熟乌司他丁多肽；以及(b)第二成熟乌司他丁多肽，所述第二成熟乌司他丁多肽包括在残基N45处的N-连接聚糖并且不包括在残基T17处的O-连接聚糖，其中(a)和(b)具有至少一种乌司他丁活性。在一些实施例中，(b)的所述成熟乌司他丁多肽包括在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化，并且具有至少一种乌司他丁活性。在一些实施例中，(b)的所述成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，包括或保留所述经修饰的O-连接糖基化位点和在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。在一些实施例中，(b)的所述成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，包括或保留SEQ ID NO:2的S10A取代和在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。在具体实施例中，(b)的所述成熟乌司他丁多肽包括SEQ ID NO:2、由其组成或基本上由其组成，包括在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。

在一些实施例中，(a):(b)的所述成熟乌司他丁多肽以范围为约20:1至约1:20，任选地约20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15或1:20的比率存在于所述组合物中。

某些治疗组合物基本上不含乌司他丁的其它糖基化异构体(糖型)。某些治疗组合物的内毒素水平小于约1EU/mg蛋白质，宿主细胞蛋白质小于约100ng/mg总蛋白质，宿主细胞DNA小于约10pg/mg总蛋白质和/或基本上不含聚集体。

某些实施例包含乌司他丁融合多肽，所述乌司他丁融合多肽在N-末端至C-末端朝向上包括牛α-乳清蛋白信号肽和乌司他丁多肽，例如其中所述乌司他丁多肽包括在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化，并且其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

在某些实施例中，所述牛α-乳清蛋白信号肽包括与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在某些实施例中，所述乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:1-4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性，并且任选地其中所述乌司他丁多肽具有或保留如由成熟人乌司他丁的序列定义的S10A取代。

在某些实施例中，所述乌司他丁融合多肽包括相对于SEQ ID NO:6或7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性，并且任选地其中所述乌司他丁多肽具有或保留如由成熟人乌司他丁的序列定义的S10A取代。一些实施例包含在所述牛α-乳清蛋白信号肽与所述乌司他丁多肽之间的肽连接子，任选地其中所述肽连接子的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个氨基酸。在某些实施例中，所述肽连接子包括蛋白酶切割位点。

一些乌司他丁融合多肽包括SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。一些乌司他丁融合多肽包括SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在某些实施例中，所述至少一种乌司他丁活性选自蛋白酶抑制剂活性、抗炎活性和抗转移活性中的一种或多种。在某些实施例中，所述乌司他丁多肽的特异性活性为约或至少约1000-3000U/mg、或约或至少约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000U/mg，其中一个单位(U)是所述乌司他丁多肽将2μg胰蛋白酶活性抑制50％的量。

还包含编码本文所描述的乌司他丁融合多肽的多核苷酸。在某些实施例中，所述多核苷酸包括相对于SEQ ID NO:8或9至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列、由其组成或基本上由其组成。

还包含表达载体，所述表达载体包括本文所描述的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子元件可操作地连接。在某些实施例中，所述表达载体是逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：在5'至3'朝向上的5'长末端重复序列(LTR)、包装区、启动子区、编码所述乌司他丁融合多肽的所述多核苷酸、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以及3'LTR。

还包含重组哺乳动物宿主细胞，所述重组哺乳动物宿主细胞包括本文所描述的多核苷酸或表达载体。某些重组哺乳动物宿主细胞选自HEK293细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、例如GPEx CHO(GCHO)细胞。在某些实施例中，所述HEK293细胞组成型地表达gag、pro和pol蛋白(任选地来自鼠类白血病病毒(MLV))和单独转染的env蛋白，并且分泌编码所述乌司他丁融合多肽的无复制能力的逆转录病毒颗粒。在某些实施例中，所述CHO细胞表达所述乌司他丁融合多肽，并且表达或过表达弗林多肽(furin polypeptide)，任选地外源性弗林多肽。

一些实施例包含用于重组产生乌司他丁多肽的方法，所述方法包括：

(a)在本文所描述的重组哺乳动物宿主细胞，任选地所述CHO细胞或GCHO中表达所述乌司他丁融合多肽；以及

(b)从所述宿主细胞或含有所述宿主细胞的培养基中分离所述乌司他丁多肽，

由此重组产生所述乌司他丁融合多肽。

某些实施例包含从所述乌司他丁多肽切割所述牛α-乳清蛋白信号肽，以产生重组乌司他丁多肽，所述重组乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:1-4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。在一些情况下，所述乌司他丁多肽具有或保留如由成熟人乌司他丁的序列定义的S10A取代。在一些情况下，所述乌司他丁多肽是成熟乌司他丁多肽，如本文所描述的。

一些实施例包含在生理条件，任选地温度、盐度和/或pH下测量所述乌司他丁多肽的至少一种乌司他丁活性。一些实施例包含制备包括所述乌司他丁多肽的治疗组合物，其中在蛋白质基础上或在重量-重量基础上，所述组合物的纯度为至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％，并且其中所述组合物基本上不含聚集体并且基本上不含内毒素。

如上所述，还包含治疗组合物，所述治疗组合物包括本文所描述的乌司他丁多肽，所述乌司他丁多肽包含本文所描述的成熟乌司他丁多肽、其混合物(例如，包括不同乌司他丁糖型的混合物)以及根据本文所描述的方法制备的治疗组合物。一些组合物用于治疗有需要的受试者的疾病，例如，其中所述疾病为炎性疾病或癌症。

还包含治疗有需要的受试者的炎性疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的治疗组合物，由此在所述受试者中治疗所述炎性疾病或病状。在一些实施例中，所述炎性疾病或病状选自以下中的一种或多种：胰腺炎(例如，急性胰腺炎、慢性胰腺炎、内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)诱导的胰腺炎、全身性炎症、结肠炎、自身免疫性脑脊髓炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、关节炎、肾衰竭、烧伤、脓毒症/脓毒性休克，包含严重脓毒症和相关的促炎性/继发性病状(例如，器官衰竭)，全身性炎性应答综合征(SIRS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)、川崎病(Kawasaki disease)、肾病(例如，急性肾衰竭、慢性肾病)、缺血病状(例如，肝、肾、心脏、肺、脑的缺血再灌注损伤)、肺部炎症和炎性肺部病状(例如，肺部感染、肺炎，包含与混合结缔组织病相关的感染性间质性肺炎，、肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征)、肝炎症，包含肝炎，过敏反应、术后或手术后并发症(例如，肾功能、心脏手术、肺手术、认知功能障碍、肝移植)、脂多糖(LPS)诱导的炎症或组织损伤(例如，肺、肝、脑)、继发于糖尿病的炎症或功能障碍(例如，糖尿病诱导的心脏功能障碍)、烧伤、中暑、炎性或神经性疼痛、急性中毒、高脂血症相关炎症、自身免疫相关炎症、同种异体移植或输血相关炎症、神经炎症和癌症相关炎症。

在一些实施例中，施用经修饰的乌司他丁多肽减少所述受试者中的蛋白酶活性、内皮活化/损害、促炎性细胞因子和趋化因子产生/释放(任选地，IL-1β、MIP-1α、MCP-1和/或CXCL1)、纤维蛋白原合成、嗜中性粒细胞募集到器官中和/或器官损伤中的一种或多种。

还包含治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的治疗组合物，由此治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展。在一些实施例中，所述癌症选自以下中的一种或多种：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。

在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症，任选地其中施用经修饰的乌司他丁多肽减少癌细胞侵袭和/或血管生成。在一些实施例中，所述转移性癌症选自以下中的一种或多种：

(a)已经转移到骨、肝和/或肺的膀胱癌；

(b)已经转移到骨、脑、肝和/或肺的乳腺癌；

(c)已经转移到肝、肺和/或腹膜的结直肠癌；

(d)已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或肺的肾癌；

(e)已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或其它肺部位的肺癌；

(f)已经转移到骨、脑、肝、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；

(g)已经转移到肝、肺和/或腹膜的卵巢癌；

(h)已经转移到肝、肺和/或腹膜的胰腺癌；

(i)已经转移到肾上腺、骨、肝和/或肺的前列腺癌；

(j)已经转移到肝、肺和/或腹膜的胃癌；

(l)已经转移到骨、肝和/或肺的甲状腺癌；以及

(m)已经转移到骨、肝、肺、阴道和/或腹膜的子宫癌。

附图说明

图1示出了编码以下的pFCS-DM300FL-WPRE-SIN(新起点)，GDDDA01.0002的载体图：全长乌司他丁融合多肽；SEQ ID NO:6(多肽)；以及SEQ ID NO:8(核酸)。

图2示出了编码以下的pFCS-DM300DCS-WPRE-SIN(新起点)，GDDDA02.0002的载体图：成熟乌司他丁融合多肽；SEQ ID NO:7(多肽)；以及SEQ ID NO:9(核酸)。

图3示出了表达的乌司他丁融合多肽的还原SDS-PAGE凝胶分析。泳道4：NovexSharp预染色标准品。泳道5：来自尿液的对照乌司他丁。泳道6：来自培养第4天的培养基(全长乌司他丁融合)。泳道7：来自培养第8天的培养基(全长乌司他丁融合)。泳道8：来自培养第12天的培养基(全长乌司他丁融合)。泳道9：来自培养第4天的培养基(成熟乌司他丁融合)。泳道10：来自培养第8天的培养基(成熟乌司他丁融合)。泳道11：来自培养第12天的培养基(成熟乌司他丁融合)。

图4示出了表达的乌司他丁融合多肽的还原SDS-PAGE凝胶分析。泳道1：NovexSharp预染色标准品。通道2：空。泳道3：来自尿液的对照乌司他丁。泳道4：来自尿液的对照乌司他丁(经PNGase处理的)。通道5：空。泳道6：全长乌司他丁。泳道7：全长乌司他丁(经PNGase处理的)。通道8：空。泳道9：成熟乌司他丁。泳道10：成熟乌司他丁(经PNGase处理的)。

图5示出了重组乌司他丁多肽(T17)体外抑制胰蛋白酶。胰蛋白酶的完全抑制示出在稀释因子(DF)200和4000。胰蛋白酶抑制活性随着乌司他丁稀释因子的增加而降低，证明了对胰蛋白酶的特异性抑制剂活性。

图6A-6B示出了在脓毒症小鼠模型中，单剂量的重组乌司他丁多肽(T17)以剂量依赖性方式减少了死亡。

图7示出了重组乌司他丁对急性胰腺炎小鼠模型中的血清α-淀粉酶水平的影响(降低32％)。

图8示出了重组乌司他丁对急性胰腺炎小鼠模型中的血清脂肪酶水平的影响(降低25％)。

图9示出了重组乌司他丁对急性胰腺炎小鼠模型中的炎症和氧化应激遗传标志物的影响。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管可以在实践或测试本公开的主题时使用与本文所描述的任何方法、材料、组合物、试剂、细胞类似或等同类似或等同的方法、材料、组合物、试剂、细胞，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用整体并入本文，如同明确且单独地指示每个单独的出版物或参考文献都如完全阐述一样通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文针对出版物和参考文献所描述的方式通过引用整体并入本文。

除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中许多方法在下文中出于说明的目的而描述。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如，《当代蛋白质科学实验指南(CurrentProtocols in Protein Science)》、《当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》或《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》,约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons),纽约,纽约州(New York,N.Y.),(2009)；Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,第3版,威利父子公司(Wiley&Sons),1995；Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》(第3版,2001)；Maniatis等人《分子克隆：实验室手册》(1982)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第I&II卷(D.Glover编辑)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames&S.Higgins编辑,1985)；《转录和翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames&S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal,《分子克隆实用指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。

可以将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域中通常实现或如本文所描述的来执行。这些技术和程序以及相关技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述那样执行。除非提供具体的定义，否则与本文所描述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合使用的命名以及所述分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知和常用的命名和实验室程序和技术。可以将标准技术用于重组技术、分子生物合成、微生物合成、化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者治疗。

出于本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”来指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法宾语。举例来说，“元件”意指一个/种元件或多于一个/种元件。

“约”意指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所使用的，术语“氨基酸”旨在意指天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。例如，天然存在的氨基酸包含在蛋白质生物合成期间使用的20种(L)-氨基酸以及其它氨基酸，如4-羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素、异锁链素、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包含本领域技术人员已知的例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等。氨基酸类似物包含天然和非天然存在的氨基酸的经修饰形式。此类修饰可以包含例如氨基酸上的化学基团和部分的取代或替代，或氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包含例如表现出参考氨基酸的如电荷和电荷间隔特性等功能上类似的特性的有机结构。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有定位于类似分子空间中并且迁移度与天然存在的Arg氨基酸的侧链的e-氨基的迁移度相同的正电荷部分。模拟物还包含受约束的结构，以便维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间隔和电荷相互作用。本领域的技术人员已知或可以确定哪些结构构成功能上等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

“生物相容的”是指通常不会对生物功能造成损害并且不会导致任何程度的不可接受的毒性(包含过敏和疾病状态)的材料或化合物。

“编码序列”是指有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不直接有助于基因的多肽产物的编码的任何核酸序列。

贯穿本公开，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。

“由…组成”意指包含并限于短语“由…组成”之后的任何内容。因此，短语“由…组成”表示所列元件是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元件。“基本上由…组成”意指包含在所述短语之后列出的任何元件，并且限于不干扰或促进本公开中对所列元件指定的活动或动作的其它元件。因此，短语“基本上由…组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但是其它元件是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列元件的活动或动作。

术语“不含内毒素”或“基本上不含内毒素”总体上是指组合物、溶剂和/或血管至多含有痕量(例如，对受试者没有临床不良生理作用的量)的内毒素并且优选地含有无法检测到的量的内毒素。内毒素是与某些微生物，如细菌(通常为革兰氏阴性细菌)相关的毒素，但是可以在如单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)等革兰氏阳性细菌中发现内毒素。最普遍的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外膜中发现的并且表示这些细菌在引起疾病的能力方面的中心致病特征的脂多糖(LPS)或脂低聚糖(LOS)。人体中的少量内毒素可能引起发热、血压降低以及炎症和凝结活化以及其它不良生理作用。

因此，在药物生产中，通常令人期望的是，从药品和/或药物容器中去除大部分或全部痕量的内毒素，因为即使少量也可能对人类产生不良作用。可以将去热原烘箱用于此目的，因为分解大多数内毒素通常需要超过300℃的温度。例如，基于如注射器或小瓶等初级包装材料，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合通常足以实现内毒素水平的3对数减少。设想了去除内毒素的其它方法，包含例如如本文所描述的和本领域中已知的色谱法和过滤法。

可以使用本领域中已知的常规技术来检测内毒素。例如，利用来自马蹄蟹的血液的鲎变形细胞裂解物(Limulus Amoebocyte Lysate)测定是用于检测内毒素存在的非常灵敏的测定。在这个测试中，非常低水平的LPS就可以引起鲎裂解物的可检测到的凝血，这是由于强大的酶级联放大了这一反应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量。为了基本上不含内毒素，内毒素水平可以低于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg活性化合物。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。

多肽的“半衰期”可以指多肽相对于在施用于生物体的血清或组织时的此类活性、或相对于任何其它定义的时间点丧失其药理学、生理学或其它活性的一半所花费的时间。“半衰期”还可以指多肽的量或浓度在施用于生物体的血清或组织时相对于施用于生物体的血清或组织中的量或浓度或相对于任何其它定义的时间点减少起始量的一半所花费的时间。可以在血清和/或任何一种或多种所选组织中测量半衰期。

术语“调节”和“改变”包含相对于对照物通常以统计学上显著或生理学上显著的量或程度“增加”、“增强”或“刺激”以及“降低”或“减少”。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，并且可以包含1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含其间所有整数和范围，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含相对于在无组合物(例如，不存在药剂)的情况下或在对照组合物的情况下产生的量减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含其间所有整数和范围)。本文描述了比较和“统计学上显著的”量的实例。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸的聚合物。术语“酶”包含多肽或蛋白质催化剂，并且关于乌司他丁与蛋白质、多肽或肽可互换使用。所述术语包含如豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失等修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一条或多条氨基酸链，其中每条链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括通过肽键非共价和/或共价连接在一起的具有由天然蛋白质(即，由天然存在的细胞，特别是非重组细胞、或基因工程化的细胞或重组细胞产生的蛋白质)构成的序列的多条链，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖本文所描述的乌司他丁蛋白质，或具有乌司他丁蛋白质的一种或多种氨基酸缺失、添加和/或取代的序列。在某些实施例中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，所述重组细胞包括一个或多个重组DNA分子，所述重组DNA分子通常由在细胞中无法以其它方式找到的异源多核苷酸序列或多核苷酸序列的组合制成。

本文提及的术语“分离的”多肽或蛋白质意味着受试蛋白质：(1)不含所述受试蛋白质在自然界通常与其一起被发现的至少一些其它蛋白质；(2)基本上不含来自同一来源，例如，来自同一物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；(4)已与所述受试蛋白质在自然接种与其缔合的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其它材料中至少约50％分离；(5)不与“分离的蛋白质”在自然界中与其缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)与所述受试蛋白质在自然界中不与其缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存在。此类分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中发现的会干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。

在某些实施例中，组合物中任何给定药剂(例如，乌司他丁多肽)的“纯度”可以被具体定义。例如，某些组合物可以包括纯度为至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(例如，在蛋白质基础上)的药剂，包含其间所有小数的范围，例如通过高效液相色谱法(HPLC)测量的，高效液相色谱法是在生物化学和分析化学中常用的用来分离、鉴定和定量化合物的公知形式柱色谱法。

术语“参考序列”通常是指另一序列与之进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所描述的所有多肽和多核苷酸序列都作为参考序列而包含，包含通过名称描述的序列和在表和序列表中描述的序列。

如本文所使用的术语“序列同一性”或例如，包括“与其50％相同的序列”是指在比较窗口内，在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经过最佳比对的序列，测定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实施方式(美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学电脑集团(Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,Wis.,USA)的威斯康星州遗传学软件包7.0版本中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通过检验各种所选方法中的任何方法产生的最佳比对(即，导致比较窗口内的最高百分比同源性)。还可以参考例如由Altschul等人,《核酸研究》25:3389,1997所公开的BLAST程序家族。

术语“溶解度”是指本文提供药剂(例如，乌司他丁多肽)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的特性。溶解度通常表示为浓度，或者溶质质量/单位体积溶剂(克溶质/千克溶剂数、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩尔浓度、质量摩尔浓度、摩尔分数或者其它类似的浓度描述。单位量的溶剂可以溶解的溶质的最大均衡量是所述溶质在包含温度、压力、pH和溶剂性质的指定条件下在所述溶剂中的溶解度。在某些实施例中，在生理pH或其它pH，例如，pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8、或pH 8.0(例如，约pH 5-8)下测量溶解度。在某些实施例中，在水或如PBS或NaCl(有或无NaP)的生理缓冲液中测量溶解度。在具体实施例中，在相对较低的pH(例如，pH 6.0)和相对较高的盐(例如,500mM NaCl和10mM NaP)下测量溶解度。在某些实施例中，在如血液或血清等生物流体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施例中，温度可以约为室温(例如，约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或约为体温(37℃)。在某些实施例中，药剂在室温或37℃下具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml的溶解度。

“受试者”或“有需要的受试者”或“患者”或“有需要的患者”包含如人类受试者等哺乳动物受试者。

“基本上”或“实质上”意指几乎完全或彻底，例如，一些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更高。

“统计学上显著的”意味着结果不可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性量度包含p-值，如果零假设为真，则p值是观察到的事件会发生的频率或概率。如果获得的p-值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平限定于0.05或更小的p值下。

“治疗反应”是指基于一种或多种治疗剂的施用症状改善(无论是否持续)。

如本文所使用的，对受试者(例如，哺乳动物，如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然病程的任何类型的干预。治疗包含但不限于施用药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。还包含“预防性”治疗，其可以旨在降低所治疗的疾病或病状的进展速率、延迟所述疾病或病状的发作或降低其发作的严重程度。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病状或其相关症状。

术语“野生型”是指在群体中最常观察到的基因或基因产物(例如，多肽)，并且因此被任意地设计为基因的“正常”或“野生型”形式。

除非另外明确地说明，否则本说明书中的每个实施例在进行必要的修改后适用于所有其它实施例。

乌司他丁糖型和融合多肽

本公开的某些实施例总体上涉及人乌司他丁的替代糖型，所述人乌司他丁包含具有在残基苏氨酸17(T17)处的非预期的O-连接聚糖的成熟人乌司他丁多肽，所述残基苏氨酸包含其活性或功能变体和片段。一些实施例涉及包括“牛α-乳清蛋白信号肽”的“乌司他丁融合多肽”和包含其活性或其它功能变体和片段的“乌司他丁多肽”。

“乌司他丁”(也被称为尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、HI-30、ASPI或二库宁肽(bikunin))是通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子量为约30kDa的酸性糖蛋白。野生型成熟人乌司他丁是在人尿液和血液中发现的多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且由包含两个Kunitz型结构域的147个氨基酸残基组成(参见表U1)。所述野生型成熟人乌司他丁由肝细胞作为全长前体产生(参见表U1)，其中乌司他丁与α1-微球蛋白连接。在肝细胞中，不同类型的含有乌司他丁的蛋白质通过乌司他丁与三个进化相关的重链(HC)1、HC 2和HC 3中的一个或两个通过硫酸软骨素链组装形成；这些蛋白质包括α间抑制剂(IαI)家族成员，包含IαI、前α抑制剂(PαI)、α间抑制剂(IαLI)和游离乌司他丁。IαI、pαI和IαLI分别由HC1+HC2+UTI、HC3+UTI和HC2+UTI组成。

在炎症过程中，乌司他丁通过外周循环或在炎症部位处的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水解切割从IαI家族蛋白中切割，并且在严重的炎症条件下改变血浆乌司他丁水平和基因表达。因此，血浆乌司他丁被视为急性期反应之一。进一步地，当感染发生时，乌司他丁迅速释放到尿液中并且是极好的炎症标志物，构成了尿中抗胰蛋白酶活性的大部分。如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶、凝血酶等各种丝氨酸蛋白酶以及因子IXa、Xa、XIa和XlIa被乌司他丁抑制。此外，乌司他丁可以通过抑制蛋白激酶C(PKC)来抑制尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达。乌司他丁似乎通过抑制这些蛋白酶的活性来防止器官损伤。

除了上述对炎性蛋白酶的抑制作用，乌司他丁还表现出抗炎活性并抑制嗜中性粒细胞的浸润以及弹性蛋白酶和化学介质的释放。同样，乌司他丁体外抑制LPS刺激的人单核细胞中的肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1的产生，以及LPS-或嗜中性粒细胞弹性蛋白酶刺激的HL60细胞或支气管上皮细胞中的IL-8基因表达。还表明至少部分地通过抑制如ERK1/2、JNK和p38等丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路来抑制LPS诱导的TNF-α和随后巨噬细胞诱导的IL-1β和IL-6。乌司他丁还在体外抑制嗜中性粒细胞介导的内皮细胞损伤，这表明其可以直接/间接作用于嗜中性粒细胞并抑制其产生和分泌活化的弹性蛋白酶。此外，乌司他丁在体外下调如血栓烷B2等受刺激的花生四烯酸代谢的产生，这在脓毒症的发病机制中起作用。

在特定实施例中，乌司他丁多肽是人乌司他丁多肽或其变体或片段。下表U1中提供了示例性人乌司他丁多肽的氨基酸序列。

因此，在一些实施例中，成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，并且具有或保留在如由SEQ ID NO:2或4定义的残基T17处的O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。另外，在某些实施例中，乌司他丁融合多肽的所述乌司他丁多肽部分包括与选自表U1的序列(SEQ:1-4)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

某些乌司他丁多肽具有经修饰的O-连接糖基化位点。此处，丝氨酸10具有附着在高度保守的Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)O-连接糖基化位点处的硫酸软骨素(CS)链。CS链相对较短(Mwt约8000)，具有12-18个二糖重复(GlcUA 1,3-GalNac1,4-)和常规连接区(GlcUA 1–3Gal 1–3Gal 1–4Xyl 1)-O-Ser。约30％的GalNAc通常是那些在连接区附近的GalNAc，在C-4羟基处硫酸化。在炎症期间合成的CS链更短，具有减少的硫酸化。因此，在一些情况下，乌司他丁多肽包括在成熟乌司他丁的一个或多个Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)残基处的至少一个取代和/或缺失，这降低了在O-连接糖基化位点处的糖基化。在具体实施例中，乌司他丁多肽包括在位置S10处的取代或缺失，例如S10A取代，如由成熟乌司他丁序列所定义的。另外，在某些实施例中，乌司他丁多肽具有在残基天冬酰胺45处天然存在的N-连接聚糖(N45)。

因此，某些实施例包含分离的成熟乌司他丁多肽，所述分离的成熟乌司他丁多肽包括：(i)在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化；(ii)在残基N45处的N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的O-连接聚糖，所述残基由SEQ ID NO:2或4定义，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。在一些实施例中，成熟乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)所述经修饰的O-连接糖基化位点；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。成熟乌司他丁多肽的具体实例包括与SEQ ID NO:2至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)SEQ IDNO:2的S10A取代；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

在一些实施例中，乌司他丁多肽具有至少一种“乌司他丁活性”。术语“乌司他丁活性”包含：(a)蛋白酶抑制剂活性，所述蛋白酶抑制剂活性包含降低胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶、凝血酶和/或因子IXa、Xa、XIa和XlIa中的一种或多种的蛋白酶活性；(b)抗炎活性，所述抗炎活性包含减少炎症和/或依赖细胞因子的信号传导通路，例如，减少严重炎症期间的器官损伤；以及(c)抗转移活性，所述抗转移活性包含减少肿瘤侵袭和转移，例如，通过减少组织蛋白酶B活性和/或减少CD44二聚化，至少后者抑制MAP激酶信号传导级联并减少细胞外基质(ECM)降解、肿瘤细胞侵袭和/或血管生成。

在某些实施例中，乌司他丁多肽的“特异性活性”为约或至少约500-5000U/mg、或约或至少约500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900或5000U/mg，其中一个单位(U)是所述乌司他丁多肽将2μg胰蛋白酶活性抑制50％的量。

如上所述，本文所描述的乌司他丁融合多肽包括牛α-乳清蛋白信号肽或其变体或片段。下表S1中提供了示例性信号肽的序列。

因此，在某些实施例中，所述乌司他丁融合多肽的所述牛α-乳清蛋白信号肽部分包括与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

下表U2中提供了示例性乌司他丁融合多肽的氨基酸序列。

因此，在一些实施例中，乌司他丁融合多肽或其变体或片段包括与选自表U2的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，并且其具有至少一种乌司他丁活性。在某些实施例中，来自表U2的融合多肽的乌司他丁部分包括或保留在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化，如在位置S10处的取代或缺失，例如S10A取代。

“变体”序列是指通过一个或多个取代、缺失(例如，截短)、添加和/或插入而与参考序列不同的多肽或多核苷酸序列。因此，某些变体包含本文所描述的参考序列的片段。变体多肽具有生物学活性，即，其继续具有参考多肽的酶促或结合活性。此类变体可以由例如遗传多态性和/或人为操纵产生。

在一些情况下，变体包括一个或多个“保守”变化或取代。“保守取代”是氨基酸取代具有相似特性的另一种氨基酸，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本上不变的取代。如上文所描述的修饰可以在本公开的多核苷酸和多肽的结构进行，并且仍然获得编码具有期望特性的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生本文所描述的多肽的等同物或甚至改进的变体或部分时，本领域技术人员通常会改变编码DNA序列的一个或多个密码子。

例如，某些氨基酸可以取代蛋白质结构中的其它氨基酸，而不会明显丧失与如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，当然，也可以在其基础DNA编码序列中进行，并且仍然可以获得具有类似特性的蛋白质。因此预期可以对所公开组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列进行各种改变而不会明显丧失其效用。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性是本领域公知的(Kyte和Doolittle,1982，通过引用并入本文)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这又定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。基于氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即，仍获得生物功能等同蛋白质。在进行此类改变时，优选亲水指数在±2内的氨基酸取代，特别优选在±1内的氨基酸取代，并且甚至更加特别优选在±0.5内的氨基酸取代。

在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(特别通过引用以其整体并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中详细描述的，已经为氨基酸残基指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并且仍然获得生物学上等同的，并且特别是免疫学上等同的蛋白质。在此类改变中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代并且甚至更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。

如上文所概述的，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特性的示例性取代是本领域技术人员众所周知的，并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

氨基酸取代可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进一步进行。例如，带负电荷的氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包含赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的不带电荷极性头部基团的氨基酸包含亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以表示保守变化的其它氨基酸基团包含：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。

变体还可以或可替代地含有非保守变化。在一些实施例中，变体多肽与天然或参考序列的差异在于取代、缺失或添加约或少于约10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个氨基酸或甚至1个氨基酸。变体还可以(或可替代地)通过例如对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性和/或亲水性质影响最小的氨基酸的缺失或添加进行修饰。

在某些实施例中，多肽序列的长度为约、至少约、或至多约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、或140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个或更多个连续氨基酸，包含其间所有整数并且其可以包括参考序列的全部或一部分(参见例如表U1、表S1、表U2、序列表)。

在一些实施例中，多肽序列由约或不超过约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个或更多个连续氨基酸组成，包含其间所有整数并且其可以包括参考序列的全部或一部分(参见例如表U1、表S1、表U2、序列表)。

在某些实施例中，多肽序列为约10-1000个、10-900个、10-800个、10-700个、10-600个、10-500个、10-400个、10-300个、10-200个、10-100个、10-50个、10-40个、10-30个、10-20个、20-1000个、20-900个、20-800个、20-700个、20-600个、20-500个、20-400个、20-300个、20-200个、20-100个、20-50个、20-40个、20-30个、50-1000个、50-900个、50-800个、50-700个、50-600个、50-500个、50-400个、50-300个、50-200个、50-100个、100-1000个、100-900个、100-800个、100-700个、100-600个、100-500个、100-400个、100-300个、100-200个、200-1000个、200-900个、200-800个、200-700个、200-600个、200-500个、200-400个或200-300个连续氨基酸，包含其间所有范围，并且包括参考序列的全部或一部分(参见例如表U1、表S1、表U2、序列表)。在某些实施例中，任何参考多肽的C末端或N末端区可被截短约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个或更多个氨基酸，或约10-50个、20-50个、50-100个或更多个氨基酸，包含其间所有整数和范围(例如，101、102、103、104、105)，只要截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性(参见例如表U1、表S1、表U2、序列表)。通常，生物活性片段具有不少于从其所衍生的生物活性参考多肽的活性的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。

通常，变体将显示与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的相似性或序列同一性或序列同源性(参见例如表U1、表U2、序列表)。此外，设想序列与天然或亲本序列的差异在于添加(例如，C末端添加、N末端添加、两者)、缺失、截短、插入或取代(例如，保守取代)了约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、或100个氨基酸(包含其间所有整数和范围)，但保留了亲本或参考多肽序列的特性或活性(参见例如表U1、表S1、表U2、序列表)。

在一些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少一个但少于50个、40个、30个、20个、15个、10个、8个、6个、5个、4个、3个或2个氨基酸残基。在某些实施例中，变体多肽与参考序列的差异在于至少1％但少于20％、15％、10％或5％的残基。(如果此比较要求比对，则应比对序列以获得最大相似性。缺失或插入或错配的“环”出(looped out)序列被视为差异。)

序列之间的序列相似性或序列同一性的计算(这些术语在本文中可互换使用)如下进行。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，对序列进行比对以用于最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以用于最佳比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)。在某些实施例中，出于比较目的比对的参考序列长度是参考序列长度的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％、以及甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在所述位置处是相同的。

两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的考虑了空位的数量以及每个空位的长度的函数，需要引入所述函数以进行两个序列的最佳比对。

序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法实现。在优选实施例中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是使用已经并入到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch,(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:444-453,1970)算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和以及空位权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5或6确定的。在又另一优选实施例中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6确定的。一组特别优选的参数(以及除非另有说明，否则应使用的参数)是Blossum 62评分矩阵，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。

两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入到ALIGN程序(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Cabios)》4:11-17,1989)的算法，使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4来确定。

本文所描述的序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如，标识其它家族成员或相关序列。此类搜索可以使用Altschul等人,(1990,《分子生物学杂志》,215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来执行。可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所描述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本文所描述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如在Altschul等人,(《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402,1997)中所描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在一些实施例中，如上所述，可以使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列区段组成，每个序列中的一个序列被比较。对Smith-Waterman或Sellers算法的修正将找到所有不能通过扩展或修剪来改善评分的称为高评分区段对(HSP)的区段对。BLAST比对的结果包含统计学量度，以指示仅偶然可以预期BLAST评分的可能性。

根据与每个所比对序列相关联的空位和取代的数量计算原始评分S，其中较高的相似性评分表示更显著的比对。取代评分由查找表给出(参见PAM，BLOSUM)。

空位评分通常被计算为G(空位开放罚分)和L(空位延伸罚分)之和。对于长度为n的空位，空位成本将为G+Ln。空位成本G和L的选择是经验性的，但习惯上选择G的高值(10-15)，例如11，以及L的低值(1-2)，例如1。

比特评分S'源自原始比对评分S，其中已经考虑了所使用的评分系统的统计特性。比特评分相对于评分系统归一化，因此其可以用于比较来自不同搜索的比对评分。术语“比特评分”和“相似性评分”可互换使用。比特评分表明比对好的程度；评分越高，比对越好。

E值或预期值描述了具有相似评分的序列偶然出现在数据库中的可能性。E值或预期值是预测在数据库搜索中偶然出现的具有等同于或优于S的评分的不同比对数量的预测。E值越小，比对越显著。例如，E值为e^-117的比对意味着具有相似评分的序列很不可能只是偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期评分要求是负的，否则长比对将倾向于具有高评分而不管与比对的区段是否相关。另外，BLAST算法使用适当的取代矩阵、核苷酸或氨基酸，并且对于空位比对，使用空位产生和延伸罚分。例如，BLAST比对和多肽序列的比较通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行。

在一些实施例中，从使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1进行的BLAST分析中报告序列相似性评分。

在一个特定实施例中，本文提供的序列同一性/相似性评分是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，圣地亚哥，加利福尼亚)使用以下参数获得的值：使用GAP权重50、长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的同一性百分比和相似性百分比；使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵(Henikoff和Henikoff，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》,89:10915-10919,1992)的氨基酸序列的同一性百分比和相似性百分比。GAP使用Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》,48:443-453,1970)的算法来找到两个完整序列的比对，所述比对将匹配数最大化并将空位数最小化。

在特定实施例中，变体多肽包括可以与参考多肽序列最佳比对的氨基酸序列(参见例如表U1、表U2、序列表)，以产生至少约50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多的BLAST比特评分或序列相似性评分，包含其间所有整数和范围，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11以及空位延伸罚分1。

如上所述，参考多肽可以以各种方式改变，包含氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。用于此类操纵的方法是本领域公知的。例如，参考多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的。参见例如Kunkel(《美国国家科学院院刊》82:488-492,1985)；Kunkel等人,(《酶学方法(Methods inEnzymol)》154:367-382,1987)；美国专利第4,873,192号；Watson,J.D.等人,(《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,第四版,本杰明-卡明斯公司(Benjamin/Cummings),门洛帕克(Menlo Park),加利福尼亚,1987)以及本文引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导可以在Dayhoff等人,(1978),《蛋白质序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)》(美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区(Washington,D.C.))的模型中找到。

用于筛选通过此类修饰制备的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选特性的基因产物的cDNA文库的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选通过参考多肽的组合诱变产生的基因文库。作为一个实例，递归总体诱变(REM)——一种增强文库中功能性突变体频率的技术，可以与筛选试验组合使用以鉴定多肽变体(Arkin和Yourvan,《美国国家科学院院刊》,89:7811-7815,1992；Delgrave等人,《蛋白质工程(ProteinEngineering)》6:327-331,1993)。

在某些实施例中，肽连接子序列可以用于将牛α-乳清蛋白信号肽和乌司他丁多肽分离一段距离，所述距离足以确保每个多肽折叠成其期望的二级结构和三级结构，和/或促进信号肽根据需要从乌司他丁多肽上切割。此类肽连接子序列可以使用本领域众所周知的标准技术并入到融合多肽中。

某些肽连接子序列可以基于以下示例性因素而选择：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；(3)其生理稳定性；以及(4)缺乏可以与多肽功能性表位或其它特征反应的疏水残基或带电残基。参见例如George和Heringa,J,《蛋白质工程(Protein Eng.)》15:871-879,2002。

连接子序列的长度可以通常为1至约200个氨基酸。特定连接子的总氨基酸长度可以为约1-200个氨基酸、1-150个氨基酸、1-100个氨基酸、1-90个氨基酸、1-80个氨基酸、1-70个氨基酸、1-60个氨基酸、1-50个氨基酸、1-40个氨基酸、1-30个氨基酸、1-20个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-4个氨基酸、1-3个氨基酸或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个氨基酸。

肽连接子可以采用如本文其它地方描述的并且本领域已知的任何一种或多种天然存在的氨基酸、一种或多种非天然存在的氨基酸、氨基酸类似物和/或氨基酸模拟物。可以有效地用作连接子的某些氨基酸序列包含以下中公开的那些：Maratea等人,《基因(Gene)》40:39-46,1985；Murphy等人,《美国国家科学院院刊》83:8258-8262,1986；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号。特定肽连接子序列含有Gly残基、Ser残基和/或Asn残基。如果需要，肽连接子序列中还可以采用其它近中性氨基酸，如Thr和Ala。

某些示例性连接子包含如下的含Gly、Ser和/或Asn的连接子：[G]_x、[S]_x、[N]_x、[GS]_x、[GGS]_x、[GSS]_x、[GSGS]_x(SEQ ID NO:11)、[GGSG]_x(SEQ ID NO:10)、[GGGS]_x(SEQ IDNO:12)、[GGGGS]_x(SEQ ID NO:13)、[GN]_x、[GGN]_x、[GNN]_x、[GNGN]_x(SEQ ID NO:14)、[GGNG]_x(SEQ ID NO:15)、[GGGN]_x(SEQ ID NO:16)、[GGGGN]_x(SEQ ID NO:17)连接子，其中_x为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多。这些和相关氨基酸的其它组合对本领域的技术人员而言将是明显的。

连接子肽的另外的实例包含但不限于以下氨基酸序列：Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:18)；Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ IDNO:19)；Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ ID NO:20)；Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Asp-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala-Lys-(SEQ ID NO:21)；以及Asn-Val-Asp-His-Lys-Pro-Ser-Asn-Thr-Lys-Val-Asp-Lys-Arg-(SEQ ID NO:22)。

连接子肽的另外的非限制性实例包含DGGGS(SEQ ID NO:23)；TGEKP(SEQ ID NO:24)(参见例如Liu等人,《美国国家科学院院刊》94:5525-5530,1997)；GGRR(SEQ ID NO:25)(Pomerantz等人1995)；(GGGGS)_n(SEQ ID NO:13)(Kim等人,《美国国家科学院院刊》93:1156-1160,1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:26)(Chaudhary等人,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070,1990)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:27)(Bird等人,《科学(Science)》242:423-426,1988)；GGRRGGGS(SEQ ID NO:28)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:29)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:30)；LRQKd(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO:31)。在特定实施例中，连接子序列包括Gly3连接子序列，所述连接子序列包含三个甘氨酸残基。在特定实施例中，柔性连接子可以使用能够对DNA结合位点和肽本身建模的计算机程序(Desjarlais和Berg,《美国国家科学院院刊》90:2256-2260,1993；以及《美国国家科学院院刊》91:11099-11103,1994)或通过噬菌体展示方法进行合理设计。

在特定实施例中，连接子肽包括自催化或自切割肽切割位点。在特定实施例中，自切割肽包含从马铃薯Y病毒(potyvirus)和心脏病毒2A肽、FMDV(口蹄疫病毒)、马A型鼻炎病毒、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)和猪捷申病毒获得的那些多肽序列。在某些实施例中，自切割多肽位点包括2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》82:1027-1041,2001)。示例性2A位点包含以下序列：LLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:32)；TLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:33)；LLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:34)；NFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:35)；QLLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:36)；APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:37)；VTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPTEARHKQKIVAPVKQT(SEQ ID NO:38)；LNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQID NO:39)；LLAIHPTEARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:40)；以及EARHKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:41)。在一些实施例中，自催化肽切割位点包括翻译2A信号序列，例如，口疮病毒属(aphthovirus)口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白的2A区，其为18个氨基酸的序列。可以使用的2A样序列的另外的实例包含昆虫病毒多蛋白、C型轮状病毒的NS34蛋白和锥体虫属(Trypanosoma spp.)中的重复序列，如Donnelly等人,《普通病毒学杂志(Journal of General Virology)》82:1027-1041,2001中所描述的。

合适的蛋白酶切割位点和自切割肽对于本领域技术人员而言是已知的(参见例如Ryan等人,《普通病毒学杂志(J.Gener.Virol.)》78:699-722,1997；以及Scymczak等人,《自然生物技术(Nature Biotech.)》5:589-594,2004)。示例性蛋白酶切割位点包含但不限于马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如，烟草蚀刻病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、副病毒NIa蛋白酶、副病毒RNA-2编码蛋白酶、口疮病毒L蛋白酶、肠病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、核糖酸3C蛋白酶、豇豆花叶病毒24K蛋白酶、线虫传多面体病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形病毒)3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风草黄斑病毒)3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa以及肠激酶的切割位点。由于其高切割严格性，在一些实施例中包含TEV(烟草蚀斑病毒)蛋白酶切割位点，例如EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO:42)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:43)以及ENLYFQS(SEQ ID NO:44)，其中X表示任何氨基酸(在Q与G之间或Q与S之间发生TEV切割)。

适用于特定实施例的可酶促降解的连接子的另外的实例包含但不限于：由如凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶或枯草杆菌蛋白酶等丝氨酸蛋白酶切割的氨基酸序列。凝血酶可切割氨基酸序列的说明性实例包含但不限于：-Gly-Arg-Gly-Asp-(SEQ ID NO:45)、-Gly-Gly-Arg-、-Gly-Arg-Gly-Asp-Asn-Pro-(SEQ ID NO:46)、-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-(SEQ ID NO:47)、-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-(SEQ ID NO:48)、-Gly-Pro-Arg-、-Val-Pro-Arg-，以及-Phe-Val-Arg-。弹性蛋白酶可切割氨基酸的说明性实例包含但不限于：-Ala-Ala-Ala-、-Ala-Ala-Pro-Val-(SEQ ID NO:49)、-Ala-Ala-Pro-Leu-(SEQ ID NO:50)、-Ala-Ala-Pro-Phe-(SEQ ID NO:51)、-Ala-Ala-Pro-Ala-(SEQID NO:52)以及-Ala-Tyr-Leu-Val-(SEQ ID NO:53)。

可酶促降解的连接子还包含可以由如胶原酶、溶基质素和明胶酶等基质金属蛋白酶切割的氨基酸序列。基质金属蛋白酶可切割氨基酸序列的说明性实例包含但不限于：-Gly-Pro-Y-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:54)、-Gly-Pro-、Leu-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:55)、-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Z-(SEQ ID NO:56)以及-Ala-Pro-Gly-Leu-Z-(SEQ ID NO:57)，其中Y和Z为氨基酸。胶原酶可切割氨基酸的说明性实例包含但不限于：-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-Z-(SEQ ID NO:58)、-Pro-Leu-Gly-Leu-Leu-Gly-Z-(SEQ ID NO:59)、-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Trp-(SEQ ID NO:60)、-Pro-Leu-Gly-Cys(Me)-His-(SEQ ID NO:61)、-Pro-Leu-Gly-Leu-Tyr-Ala-(SEQ ID NO:62)、-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:63)以及-Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-(SEQ ID NO:64)，其中Z为氨基酸。溶基质素可切割氨基酸序列的说明性实例为-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Met-Arg-(SEQ ID NO:65)；明胶酶可切割氨基酸序列的实例为-Pro-Leu-Gly-Met-Tyr-Ser-Arg-(SEQ ID NO:66)。

适用于特定实施例的可酶促降解的连接子包含可以由血管紧张素转换酶切割的氨基酸序列，例如-Asp-Lys-Pro-、-Gly-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:67)以及-Gly-Ser-Asp-Lys-Pro-(SEQ ID NO:68)。

适用于特定实施例的可酶促降解的连接子包含可以被组织蛋白酶B降解的氨基酸序列，例如Val-Cit、Ala-Leu-Ala-Leu-(SEQ ID NO:69)、Gly-Phe-Leu-Gly-(SEQ ID NO:70)以及Phe-Lys。

然而，在某些实施例中，肽连接子中的任一个或多个肽连接子是任选的。例如，当第一多肽和第二多肽具有可以用于将功能性结构域分开并防止空间干扰的非必需N末端和/或C末端氨基酸区时，可以不需要连接子序列。

乌司他丁融合多肽可以用于本文所描述的任何组合物、方法和/或试剂盒中。

多核苷酸、表达载体和宿主细胞

某些实施例涉及编码乌司他丁融合多肽的多核苷酸，如本文所描述的。因此，某些实施例包含编码表U1或表U2中的任何一种或多种单个乌司他丁融合多肽的多核苷酸，包含其变体和/或片段。例如，某些多核苷酸编码乌司他丁融合多肽，所述乌司他丁融合多肽包括与选自表U1或表U2的参考氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

下表U3中提供了示例性核酸编码序列。

因此，某些实施例包含多核苷酸，例如编码乌司他丁融合多肽的分离的多肽，其中所述多核苷酸包括相对于来自表U3的核酸序列(例如，SEQ ID NO:8或9)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列、由其组成或基本上由其组成。

除其它用途外，这些和相关实施例可以用于在宿主细胞中重组产生乌司他丁多肽。本领域的普通技术人员应理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文所描述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些多核苷酸与任何天然基因的核苷酸序列可以具有最小的同源性。尽管如此，具体设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人、酵母或细菌密码子选择而优化的多核苷酸。

如本领域技术人员认识到的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。多核苷酸可以包含天然序列或可以包含变体或此类序列的生物功能等同物。如本文所描述的，多核苷酸变体可以含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地使得变体多肽的活性相对于未经修饰的多肽不显著减少。

另外的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支撑材料连接。因此，无论编码序列本身的长度如何，多核苷酸都可以与其它DNA或RNA序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等组合，使得其总长度可以改变很大。

多核苷酸序列还可以是混合基因组cDNA、RNA的序列以及合成来源的序列。例如，编码前导肽的基因组或cDNA序列可以加入到编码多肽的基因组或cDNA序列，之后可以根据众所周知的方法步骤通过插入编码用于同源重组的期望的氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选地使用合适的寡核苷酸通过PCR产生期望的序列而在位点处修饰DNA或RNA序列。在一些实施例中，信号序列可以包含在编码序列之前。这个序列将信号肽N末端编码到编码序列，所述编码序列与宿主细胞连通以将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到培养基中。通常，信号肽在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞修剪掉(clipped off)。信号肽可以在原核生物和真核生物中的各种蛋白质中发现。

一个或多个多核苷酸可以编码本文所描述的乌司他丁多肽。此外，多核苷酸序列可以出于各种原因操纵。实例包含但不限于并入用于增强多核苷酸在各种生物体中的表达的优选密码子(一般参见Nakamura等人,《核酸研究》28:292,2000)。

还包含包括多核苷酸的表达载体，以及包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。乌司他丁多肽可以通过众所周知的技术在合适的宿主细胞中通过表达编码多肽的DNA或RNA序列来产生。术语“宿主细胞”用于指在其中已经引入或能够引入编码本文所描述的多肽中的一种或多种多肽的核酸序列，并且进一步表达或能够表达所关注多肽，如编码任何本文所描述的多肽的多核苷酸的细胞。所述术语包含亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态上或遗传构成上是否相同，只要存在所选基因即可。

在一些情况下，多核苷酸或表达载体包括另外的非编码序列。例如，表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的非翻译区，包含增强子、启动子，5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元件的强度和特异性可以不同。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包含组成型和诱导型启动子。

各种表达载体/宿主系统是已知的，并且可以利用以含有和表达多核苷酸序列。这些包含但不限于：微生物，如用表达载体(例如重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体)转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包含哺乳动物细胞以及更具体地用病毒、质粒、附加型、整合或表达载体转化的人细胞系统。因此，某些实施例包含包括编码本文所描述的多肽，例如乌司他丁融合多肽的多核苷酸序列的表达载体。在特定实施例中，表达载体是逆转录病毒载体(或逆转录载体)，例如图2-3和表E1-E2所示。

还包含包括多核苷酸和/或表达载体的宿主细胞。在哺乳动物宿主细胞中，许多表达系统在本领域是众所周知的并且可商购获得。示例性哺乳动物宿主细胞和系统包含例如HEK293细胞、CHO细胞，包含

中国仓鼠卵巢(GCHO)细胞系、HeLa细胞和其它细胞。哺乳动物表达系统可以利用附着的细胞系，例如，在T-烧瓶、滚瓶、摇瓶(例如，2.8L)、和/或细胞工厂，或悬浮培养物中，例如，在本领域已知的1L和5L旋转瓶，5L、14L、40L、100L和200L搅拌槽生物反应器中，或20/50L和100/200L WAVE生物反应器等中。因此，某些实施例包含重组宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞包括编码如本文所描述的乌司他丁融合多肽的多核苷酸。在具体实施例中，宿主细胞表达或过表达蛋白酶，例如弗林多肽，所述弗林多肽切割全长乌司他丁以产生成熟乌司他丁。某些宿主细胞(例如，HEK293细胞)可以用于产生无复制能力的高滴度逆转录载体颗粒，并且某些宿主细胞(CHO、GCHO)可以用逆转录载体颗粒转导以产生表达乌司他丁的细胞。

还包含用于重组产生如本文所描述的乌司他丁多肽的方法。在一些实施例中，将编码乌司他丁融合多肽的多核苷酸或表达载体直接引入宿主细胞中，并在足以诱导已编码的蛋白质的表达的条件下温育细胞。因此，某些实施例涉及用于重组产生乌司他丁多肽的方法，所述方法包括：(a)在本文所描述的重组哺乳动物宿主细胞，任选地所述CHO细胞或GCHO中表达所述乌司他丁融合多肽；以及(b)从所述宿主细胞或含有所述宿主细胞的培养基中分离所述乌司他丁多肽，由此重组产生所述乌司他丁多肽。乌司他丁多肽在宿主细胞中的表达可以通过在适当条件下培养含有多核苷酸的重组宿主细胞来实现(参见例如实例1)。在通过表达产生乌司他丁多肽后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化所述乌司他丁多肽，并且然后根据需要使用。另外，在表达成熟乌司他丁融合多肽之后，某些实施例包括例如用蛋白酶切割信号肽的步骤。

可以根据本领域已知的多种技术纯化和表征由重组宿主细胞产生的乌司他丁多肽。用于进行蛋白质纯化和分析蛋白质纯度的示例性系统包含快速蛋白质液相色谱法(FPLC)(例如，AKTA和Bio-Rad FPLC系统)、高效液相色谱法(HPLC)(例如，Beckman和WatersHPLC)。用于纯化的示例性化学反应包含本领域已知的离子交换色谱法(例如，Q、S)、尺寸排阻色谱法、盐梯度、亲和纯化(例如，Ni、Co、FLAG、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白质A/G)、凝胶过滤、反相、陶瓷

离子交换色谱法和疏水相互作用柱(HIC)等。还参见实例。

还包含在生理条件下，任选地在温度和pH下评估或测量所产生和纯化的乌司他丁多肽的活性的方法，其中乌司他丁多肽在生理条件下具有活性。在一些实施例中，在相当的生理条件下，相对于SEQ ID NO:2的乌司他丁多肽(成熟人乌司他丁)，乌司他丁多肽的活性为至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。

某些方面进一步包括制备包括乌司他丁多肽的组合物，例如其中在蛋白质基础上或在重量-重量基础上，所述组合物的纯度为至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％，并且其中所述组合物基本上不含聚集体并且基本上不含内毒素。

组合物和使用方法

某些实施例包含包括乌司他丁多肽(例如，根据本文所描述的方法产生的乌司他丁多肽)的治疗组合物，以及用于使用所述治疗组合物来治疗各种疾病的方法。

一些实施例包含组合物，例如治疗组合物或药物组合物，所述组合物包括本文所描述的成熟乌司他丁多肽，所述成熟乌司他丁多肽包含根据本文所描述的方法制备或产生的乌司他丁多肽，以及药学上可接受的载体。例如，某些组合物包括具有T17-O-连接聚糖的成熟乌司他丁多肽，所述成熟乌司他丁多肽包括：(i)在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化；(ii)在残基N45处的N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的O-连接聚糖，所述残基由SEQ ID NO:2或4定义，如本文所描述的，以及药学上可接受的载体。本文描述了成熟乌司他丁多肽及其活性变体和片段的具体实例(参见例如表U1和相关公开)。

某些组合物包括乌司他丁糖型的混合物。例如，某些组合物包括：(a)包括T17-O-连接聚糖的第一成熟乌司他丁多肽，如本文所描述的，以及(b)包括在残基N45处的N-连接聚糖且不包括在残基T17处的O-连接聚糖的第二成熟乌司他丁多肽。在一些实施例中，所述第二成熟乌司他丁多肽具有在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，如本文所描述的，例如S10A取代，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化。在一些实施例中，(b)的所述第二成熟乌司他丁多肽包括与SEQID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，包括或保留所述经修饰的O-连接糖基化位点(例如，S10A取代)和在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。

在蛋白质基础上或在重量基础上，某些组合物基本上是纯的。例如，如上所述，在蛋白质基础上或在重量基础上，某些组合物的纯度为至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％，并且基本上不含聚集体，例如小于约10％、9％、8％、7％、6％或5％的聚集体。某些组合物基本上不含内毒素，如本文所描述的。

组合物可以通过制药领域中众所周知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的组合物可以通过将包括如本文所描述的乌司他丁多肽的组合物以及任选地缓冲液或赋形剂中的一种或多种任选地与无菌蒸馏水组合从而形成溶液来制备。某些组合物包括生理盐水溶液(例如，0.9％生理盐水)或葡萄糖(例如，约1-10％葡萄糖，或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％葡萄糖)。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与组合物中的乌司他丁多肽非共价相互作用的化合物，以促进多肽在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。

某些组合物处于药学上可接受的pH。例如，在某些实施例中，药学上可接受的pH为约5.0至约8.0(±0.01至±0.1)，或约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0(±0.01至±0.1)，包含其间所有整数和范围。

在某些实施例中，乌司他丁多肽在接近人血生理pH的pH下具有至少一种乌司他丁活性。因此，在一些实施例中，乌司他丁多肽在约4至约10.8、或约6至约8或约6.5至约7.5的pH下具有至少一种乌司他丁活性。在某些实施例中，乌司他丁多肽在约7.4的pH下具有有效的乌司他丁活性。

在具体实施例中，组合物具有以下纯度确定中的一种或多种：小于约1EU内毒素/mg蛋白、小于约100ng宿主细胞蛋白/mg蛋白、小于约10pg宿主细胞DNA/mg蛋白和/或基本上不含聚集体。

还包含治疗、改善有需要的受试者的疾病的症状或抑制疾病的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括根据本文所描述的方法产生的至少一种乌司他丁多肽的组合物。

本文所描述的方法和组合物可以用于治疗任何种类的疾病或病状。例如，某些实施例包含治疗有需要的受试者的炎性疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的治疗组合物。

示例性炎性疾病或病状包含：胰腺炎(例如，急性胰腺炎、慢性胰腺炎、内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)诱导的胰腺炎、全身性炎症、结肠炎、自身免疫性脑脊髓炎、史蒂文斯-约翰逊综合征、关节炎、肾衰竭、烧伤、脓毒症/脓毒性休克，包含严重脓毒症和相关的促炎性/继发性病状(例如，器官衰竭)，全身性炎性应答综合征(SIRS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)、川崎病、肾病(例如，急性肾衰竭、慢性肾病)、缺血病状(例如，肝、肾、心脏、肺、脑的缺血再灌注损伤)、肺部炎症和炎性肺部病状(例如，肺部感染、肺炎，包含与混合结缔组织病相关的感染性间质性肺炎，、肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征)、肝炎症，包含肝炎，过敏反应、术后或手术后并发症(例如，肾功能、心脏手术、肺手术、认知功能障碍、肝移植)、脂多糖(LPS)诱导的炎症或组织损伤(例如，肺、肝、脑)、继发于糖尿病的炎症或功能障碍(例如，糖尿病诱导的心脏功能障碍)、烧伤、中暑、炎性或神经性疼痛、急性中毒、高脂血症相关炎症、自身免疫相关炎症、同种异体移植或输血相关炎症和神经炎症。

还包含治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的治疗组合物。本文所描述的方法和治疗组合物可以用于治疗任何种类的癌症或肿瘤。在一些实施例中，癌症为原发性癌症，即，在肿瘤进展开始并产生癌块的解剖部位生长的癌症。在一些实施例中，癌症为二级癌症或转移性癌症，即，已经从原始的初级部位或组织扩散到一个或多个不同的部位或组织的癌症。在一些实施例中，所述受试者患有选自以下中的一种或多种的癌症：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。

在一些实施例中，如上所述，癌症或肿瘤是转移性癌症。进一步地对于以上癌症，示例性转移性癌症包含但不限于：已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的膀胱癌；已经转移到骨骼、大脑、肝脏和/或肺的乳腺癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的结直肠癌；已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或肺的肾癌；已经转移到肾上腺、骨骼、大脑、肝脏和/或其它肺部位的肺癌；已经转移到骨骼、大脑、肝脏、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的卵巢癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胰腺癌；已经转移到肾上腺、骨骼、肝脏和/或肺的前列腺癌；已经转移到肝脏、肺和/或腹膜的胃癌；已经转移到骨骼、肝脏和/或肺的甲状腺癌；以及已经转移到骨骼、肝脏、肺、腹膜和/或阴道的子宫癌；等。

在一些情况下，治疗组合物的施用减少了受试者的炎症或一种或多种炎症反应。例如，在一些情况下，施用治疗组合物减少所述受试者中的内皮活化/损害、促炎性细胞因子和趋化因子产生/释放(例如，IL-1β、MIP-1α、MCP-1和CXCL1)、纤维蛋白原合成、嗜中性粒细胞募集到器官和/或器官损伤中的一种或多种。

在一些实施例中，本文所描述的方法或组合物将患者的中位生存时间增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长时间。在某些实施例中，本文所描述的方法或组合物将患者的中位生存时间增加1年、2年、3年或更长时间。

在某些实施例中，例如在癌症治疗中，施用的组合物足以使肿瘤消退，如肿瘤存活量的统计学显著降低所示，例如，肿瘤质量降低至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，或如改变的(例如，具有统计显著性的降低)扫描尺寸所示。在某些实施例中，施用的组合物足以导致稳定的疾病。在某些实施例中，施用的组合物足以导致熟练的临床医生已知的特定疾病适应症的症状的稳定或临床相关性的减轻。

用于标识患有本文所描述的疾病或病状中的一种或多种的受试者的方法是本领域已知的。

可以通过多种不同的途径实现施用。施用方式取决于待治疗或预防的病状的性质。例如，组合物可以口服、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴内、肿瘤内、肌内、间质内、肠内、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、跨上皮和/或透皮施用。特定实施例包含通过IV输注施用。

精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断来确定。也可以执行受控的临床试验。剂量还可以随着待缓解的病状的严重程度而变化。通常调配和施用药物组合物以发挥治疗有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量以每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可以根据个体需要随时间调整具体剂量方案。

在一些实施例中，本文所描述的组合物的治疗有效量或治疗剂量是有效减轻受试者的炎症或炎性反应的量。在某些情况下，以小剂量开始治疗，可以小幅增加所述小剂量，直到达到这种情况下的最佳效果。

在一些实施例中，剂量从约每天施用一次到约每两周或三周施用一次。例如，在某些实施例中，剂量为约每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用一次，或约每周施用一次，或约每周两次，或约每周三次，或约每两周或三周一次。

某些实施例包括以约1×10⁴U至约1×10⁵U至约100×10⁵U、或约1×10⁴U、2×10⁴U、3×10⁴U、4×10⁴U、5×10⁴U、6×10⁴U、7×10⁴U、8×10⁴U、9×10⁴U、1×10⁵U、2×10⁵U、3×10⁵U、4×10⁵U、5×10⁵U、6×10⁵U、7×10⁵U、8×10⁵U、9×10⁵U、10×10⁵U、11×10⁵U、12×10⁵U、15×10⁵U、20×10⁵U、30×10⁵U、40×10⁵U、50×10⁵U、60×10⁵U、70×10⁵U、80×10⁵U或100×10⁵U的剂量(例如，每日剂量)施用乌司他丁多肽，包含其间所有范围和整数)。某些实施例包括以约、至少约或不超过约50,000U/kg、125,000U/kg、250,000U/kg、500,000U/kg、750,000U/kg或1,000,000U/kg；或范围为约50,000-1,000,000U/kg、约125,000-1,000,000U/kg、约250,000-1,000,000U/kg、约500,000-1,000,000U/kg、约750,000-1,000,000U/kg或约50,000-750,000U/kg、约125,000-750,000U/kg、约250,000-750,000U/kg、约500,000-750,000U/kg、约50,000-500,000U/kg、约125,000-500,000U/kg、约250,000-500,000U/kg、约50,000-250,000U/kg、约125,000-250,000U/kg或约50,000-125,000U/kg的剂量(例如，每日剂量)施用乌司他丁多肽。

某些实施例包括施用皮下剂量。一些实施例包含例如通过在约1、2或3小时时间段内静脉内输注每日剂量来施用静脉内剂量。特定实施例包括在约1、2或3小时时间段内，任选地每天约1、2或3次，以及任选地连续输注每日剂量约2、3、4、5、6或7天或更多天。

还包含包括根据本文所描述的方法产生的一种或多种组合物或乌司他丁多肽的患者护理试剂盒。某些试剂盒还包括如水(例如，无菌水)或盐水等一种或多种药学上可接受的稀释剂或溶剂。在一些实施例中，组合物或乌司他丁多肽储存在小瓶、盒、双室注射器和/或预填充混合系统中。

本文的试剂盒还可以包含一种或多种另外的治疗剂或适合于或期望用于所治疗适应症或用于期望诊断应用的其它组分。本文的试剂盒还可以包含一个或多个注射器或促进预期递送模式所需或期望的其它组分(例如，支架、可植入贮库等)。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和经发布专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或经发布专利具体地且单独地指示通过引用并入一样。

尽管上文所描述的发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细描述，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言应当容易了解到，可以在不偏离随附权利要求书的精神或范围的情况下对本发明进行某些改变和修改。以下实例仅通过说明的方式而非限制的方式提供。本领域的技术人员将容易认识到可以被改变或修改以产生本质上类似的结果的各种非关键参数。

实例

实例1

乌司他丁融合多肽的制备和表达

制备两种融合构建体以获得中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的最佳乌司他丁表达。将牛α-乳清蛋白信号肽融合到全长人乌司他丁的N-末端，并且也融合到成熟形式的人乌司他丁。修饰每个乌司他丁序列以将丝氨酸并入在成熟乌司他丁序列的残基十(S10A)处的丙氨酸突变中，以防止糖胺聚糖在所述残基处的附着。全长乌司他丁融合多肽需要在CHO细胞中进行酶切割(弗林)来产生成熟乌司他丁。成熟乌司他丁融合多肽仅需要切割牛α-乳清蛋白信号肽来产生成熟乌司他丁。表U2中示出了融合多肽的氨基酸序列，并且表U3中示出了核酸编码序列。通过DNA测序确认了DNA序列。

逆转录病毒载体产生。

将上文所概述的融合蛋白构建体引入逆转录病毒载体中，如图2(FL乌司他丁)和图3(成熟乌司他丁)所示。下表E1和表E2中提供了载体组分的细节。

将逆转录载体转染到组成型地产生MLV gag、pro和pol蛋白的HEK293细胞系中。含包膜的表达质粒也与两个逆转录载体构建体中的每一个共转染。这两种共转染导致通过超离心浓缩并且用于细胞转导的两个基因构建体中的每一个的无复制能力的高滴度逆转录载体的产生(参见Bleck,快速产生稳定、高表达的哺乳动物细胞系的替代性方法(Analternative method for the rapid generation of stable,high-expressingmammalian cell lines),《生物加工杂志(Bioprocessing J.)》9月/10月第1-7页,2005年；以及Bleck,

——用于快速生成稳定、高表达的抗体产生哺乳动物细胞系的灵活方法(A Flexible Method for the Rapid Generation of Stable,High Expressing,Antibody Producing Mammalian Cell Lines)第4章,《单克隆抗体开发和制造的当前趋势(Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing)》,《生物技术：制药方面(Biotechnology:Pharmaceutical Aspects)》,编辑：S.J.Mearni等人

2010美国药物科学家协会(American Association of Pharmaceutical Scientists),DOI10.1007/978-0-387-76643-0_4)。

通过用无复制能力的高滴度逆转录载体对

中国仓鼠卵巢(GCHO)亲本细胞系进行三个周期的细胞转导来产生每个逆转录病毒构建体的汇集的细胞系。将全长乌司他丁逆转录载体转导到过量表达弗林蛋白酶的GCHO细胞系中，所述弗林蛋白酶消化全长分子产生成熟乌司他丁。将成熟乌司他丁逆转录载体转导到正常GCHO细胞中。

转导后，将两个构建体各自汇集的细胞系按比例放大，用于在2.8L摇瓶中的进料批次研究中产生。将每个摇瓶在G12.1培养基(欧文科技公司(Irvine Scientific))中以每mL 300,000个活细胞接种，并在湿润(70-80％)的摇动温育箱中以80rpm、5％ CO₂和37℃的温度温育。在产生运行期间，使用两种不同的进料补充剂对培养物进行了七次进料。在培养的第5天，培养温度从37℃降到34℃。当存活率≤80％时，终止培养。

通过还原SDS-PAGE凝胶分析来确定蛋白质产生的确认，如图3所示。来自尿液的乌司他丁对照含有N-连接糖基化和糖胺聚糖(GAG)分子。全长和成熟乌司他丁融合构建体应该仅具有N-连接糖基化，因为GAG分子的附着位点被突变。全长乌司他丁样品似乎已经被细胞系中添加的弗林蛋白酶完全切割。凝胶示出了切割的蛋白质的大片段(186个氨基酸和2个N-连接糖基化位点(上部条带))和成熟乌司他丁片段(147个氨基酸和一个N-连接糖基化位点(下部条带))。

成熟乌司他丁样品仅含有较小尺寸的成熟乌司他丁片段。当在还原SDS-PAGE凝胶上运行时，较低分子量的成熟乌司他丁产物似乎由两条带组成。在全长样品中没有观察到这种双联体(参见图3，比较泳道6和泳道9)。

为了研究在图3的泳道9中观察到的成熟乌司他丁样品的两条带，首先检查材料以确定第二条带是否是由于N-连接糖基化。在此处，将尿液衍生的乌司他丁、全长乌司他丁和成熟乌司他丁的样品用PNGase消化以去除任何潜在的N-连接聚糖，并且然后在凝胶上运行。如果双联体由N-连接糖基化引起，则PNGase消化预期将导致还原性SDS-PAGE凝胶上的单个条带。然而，如图4所示，PNGase消化没有改变在成熟乌司他丁样品中观察到的双联体(参见泳道10)。相反，去除N-连接聚糖，导致分子量的偏移(比较图4中的泳道9和10)，但维持了双联体，表明另外的N-连接糖基化不会导致第二条带。此外，全长乌司他丁的PNGase处理证实了双联体修饰仅发生在成熟乌司他丁样品中而非全长乌司他丁样品中。

对成熟乌司他丁样品进行肽映射以确定双联体是否由变体蛋白质序列或蛋白质结构的另一种修饰引起。分析不仅证实了成熟乌司他丁序列没有修饰，而且令人惊讶地示出了成熟乌司他丁样品中的上部条带由在苏氨酸17(T17)处的非天然O-连接糖基化引起。这种O-连接糖基化不存在于全长乌司他丁/牛α-乳清蛋白信号肽融合蛋白制剂中，即使在原位酶(弗林)切割全长乌司他丁以产生成熟形式的乌司他丁之后。所述O-连接糖基化仅出现在成熟乌司他丁/牛α-乳清蛋白信号肽融合蛋白制剂中。测试了包括具有在T17处的N-连接糖基化和非预期O-连接糖基化的成熟乌司他丁的材料，并且发现所述材料体外抑制胰蛋白酶(参见图5)。此处，使用来自BioVision^TM的胰蛋白酶活性试剂盒分析胰蛋白酶抑制活性。用含有约5000U/mg重组乌司他丁(T17)的样品以DF2000、DF4000、DF8000、DF16000和DF32000的稀释因子(DF)进行稀释。

实例2

重组乌司他丁在脓毒症小鼠模型中的活性

进行研究以评估重组乌司他丁(参见实例1；在T17处的O-连接糖基化)在脓毒症小鼠模型中的功效。雄性C57BL|6小鼠接受盲肠结扎和穿孔(CLP)手术以诱导轻度-中度等级脓毒症。表E3中示出了研究时间安排。

手术后三十(30)分钟，从第0天至第4天每天通过静脉内(IV)注射向小鼠施用乌司他丁测试制品、阴性对照(磷酸盐缓冲盐水，PBS)，或者从第0天至第4天每天通过皮下(SC)注射施用阳性对照亚胺培南两次。在CLP手术后6天内跟踪动物存活率，并且通过比较测试制品与阴性对照之间的存活率来确定测试制品的功效。

图6A-6B中示出了数据。总之，数据表明使用22号针进行盲肠结扎和穿刺导致雄性C57BL/6小鼠出现脓毒性感染。PBS媒剂CLP组出现死亡率为40％的中度-轻度等级脓毒症，并且亚胺培南治疗的小鼠死亡率为0％，这在先前研究中观察到的范围内。在重组乌司他丁治疗组中观察到剂量反应，其中最低浓度(50,000U/kg)的死亡率为50％，并且测试的较高浓度(125,000和250,000U/kg)的死亡率仅为20％。

实例3

重组乌司他丁在急性胰腺炎小鼠模型中的活性

在雨蛙素(caerulein)诱导的小鼠急性胰腺炎模型中进行实验以评价三个剂量水平的重组乌司他丁(T17)的活性。

通过腹膜内(IP)注射雨蛙素(100μg/kg)三次，以两小时间隔诱导雄性ICR小鼠的急性胰腺炎。在每次雨蛙素激发之后一小时(共3个剂量)，静脉内(IV)施用测试制品或媒剂(无菌PBS)。在每次雨蛙素激发之后一小时，口服(PO)施用参考化合物地伐西匹(Devazepide)。在首次雨蛙素激发之后九小时处死小鼠。采集血液，并且通过自动分析仪(日本东芝TBA-120FR)检测血清α-淀粉酶和脂肪酶。

下图7-8和表E4中总结了结果。

与正常对照组相比，血清α-淀粉酶和脂肪酶(急性胰腺炎的指标)在重复雨蛙素激发下显著增加(p<0.05)，表明在首次雨蛙素注射之后九小时，媒剂组成功诱导了急性胰腺炎。当与媒剂组相比时，口服施用0.1mg/kg×3的阳性对照地伐西匹在首次雨蛙素注射之后九小时显著(p<0.05)降低了血清α-淀粉酶和脂肪酶的水平。

当与媒剂组相比时，以16.5mg/kg×3(83,333U/kg×3＝250,000U/kg总计)和33mg/kg×3(166,667U/kg×3＝500,000U/kg总计)口服管饲给予的测试制品(重组乌司他丁；T17)示出了在首次雨蛙素注射之后九小时，血清α-淀粉酶水平显著降低(p<0.05)。与媒剂组相比，所有3个剂量水平的重组乌司他丁对血清脂肪酶的影响较小。

在研究结束时，随后在RNA中采集所有动物的胰腺样品。在胰腺样品中进行定量实时PCR生物标志物分析。在美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)7900HT实时PCR系统上一式三份地进行每个测定，并且使用比较CT方法，以GAPDH作为内源对照并且以样品“1-1”作为校准品来得出表达变化倍数。最终结果被表示为基因表达的n倍差异或相对定量(RQ)，并且对照样品的RQ总是等于1。

如图9所示，当与正常对照组相比时，炎症的遗传标志物(IL-6)和氧化应激(HMOX1)mRNA水平通过重复雨蛙素激发而显著增加(p<0.05)。当与媒剂组相比时，以0.1mg/kg×3口服施用的地伐西匹中度减弱了IL-6mRNA表达并且显著(p<0.05)减弱了HMOX1 mRNA表达。当与媒剂组相比时，以16.5mg/kg×3PO(83,333U/kg×3＝250,000U/kg总计)和33mg/kg×3PO(166,667U/kg×3＝500,000U/kg总计)给予的重组乌司他丁(T17)减弱了IL-6mRNA表达。与媒剂组相比，以3.3mg/kg×3PO(16,667U/kg×3＝50,000U/kg)、16.5mg/kg×3PO(83,333U/kg×3＝250,000U/kg总计)和33mg/kg×3PO(166,667U/kg×3＝500,000U/kg总计)给予的重组乌司他丁在HMOX1 mRNA表达中示出了相反的剂量反应。通过用重组乌司他丁治疗，胶原蛋白I水平也恢复到正常对照水平。

总体上，在小鼠急性胰腺炎模型中，以16.5mg/kg×3PO(83,333U/kg×3＝250,000U/kg总计)和33mg/kg×3PO(166,667U/kg×3＝500,000U/kg总计)给予的重组乌司他丁在首次雨蛙素注射之后九小时显著降低了血清α-淀粉酶水平，并且对血清脂肪酶水平、IL-6mRNA表达以及恢复胶原蛋白I水平具有显著作用。

序列表

<110> 代阿麦迪卡美国股份有限公司（DiaMedica USA Inc.）

里克·保尔斯(Pauls, Rick)

托德·维多恩(Verdoorn, Todd)

卡尔·弗兰克·约翰逊(Johnson, Karl Frank)

格雷戈里·托马斯·布莱克(Bleck, Gregory Thomas)

<120> 乌司他丁多肽

<130> DIAM-039/03WO 316251-2196

<150> US 62/985,499

<151> 2020-03-05

<150> US 63/021,938

<151> 2020-05-08

<150> US 63/108,773

<151> 2020-05-08

<160> 70

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 333

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

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1 5 10 15

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20 25 30

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<211> 147

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

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<210> 3

<211> 333

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

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1 5 10 15

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325 330

<210> 4

<211> 147

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

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<212> PRT

<213> 家牛（Bos Taurus）

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - FL人乌司他丁S10A突变与信号序列融合多肽

<400> 6

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1 5 10 15

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Leu Leu Gln Asp Phe Arg Val Val Ala Gln Gly Val Gly Ile Pro Glu

165 170 175

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180 185 190

Gln Glu Pro Glu Pro Ile Leu Ile Pro Arg Val Arg Arg Ala Val Leu

195 200 205

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<210> 7

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 成熟人乌司他丁S10A突变与信号序列融合多肽

<400> 7

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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Leu Leu Arg Phe Ser Asn

165

<210> 8

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - FL人乌司他丁S10A突变与信号序列编码多核苷酸

<400> 8

atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccggc 60

cctgtgccag ctccgcccga caacatccaa gtgcaggaaa acttcaatat ctctcggatc 120

tatgggaagt ggtacaacct ggccatcggt tccacctgcc cctggctgaa gaagatcatg 180

gacaggatga cagtgagcac gctggtgctg ggagagggcg ctacagaggc ggagatcagc 240

atgacaagca ctcgttggcg gaaaggtgtc tgtgaggaga cgtctggagc ttatgagaaa 300

acagatactg acgggaagtt tctctatcac aaatccaaat ggaatataac catggagtcc 360

tatgtggtcc acaccaacta tgatgagtat gccattttcc tgacaaagaa attcagccgc 420

catcacggac ccaccattac tgccaagctc tacgggcggg cgccgcagct gagggaaact 480

ctcctgcagg acttcagagt ggttgcccag ggtgtgggca tccctgagga ctccatcttc 540

accatggctg accgaggcga atgtgtccca ggggagcagg aaccagagcc catcttaatc 600

ccgagagtcc ggagggctgt gctaccccaa gaagaggaag gagctggggg tgggcaactg 660

gtaactgaag tcaccaagaa agaagattcc tgccagctgg gctactcggc cggtccctgt 720

atgggaatga ccagcagata tttctataat ggaacatcca tggcctgtga gactttccag 780

tacggcggct gcatgggaaa cggcaacaac ttcgtcacag aaaaggagtg tctgcagacc 840

tgccgaactg tggcggcctg caatctcccc atcgtccggg gcccctgccg agccttcatc 900

cagctctggg catttgatgc tgtcaagggg aagtgcgtcc tcttccccta cgggggctgc 960

cagggcaacg ggaacaagtt ctactcagag aaggagtgca gagagtactg cggtgtccct 1020

ggtgatggtg atgaggagct gctgcgcttc tccaactga 1059

<210> 9

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 成熟人乌司他丁S10A突变与信号序列编码多核苷酸

<400> 9

atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggccgct 60

gtgctacccc aagaagagga aggagctggg ggtgggcaac tggtaactga agtcaccaag 120

aaagaagatt cctgccagct gggctactcg gccggtccct gtatgggaat gaccagcaga 180

tatttctata atggaacatc catggcctgt gagactttcc agtacggcgg ctgcatggga 240

aacggcaaca acttcgtcac agaaaaggag tgtctgcaga cctgccgaac tgtggcggcc 300

tgcaatctcc ccatcgtccg gggcccctgc cgagccttca tccagctctg ggcatttgat 360

gctgtcaagg ggaagtgcgt cctcttcccc tacgggggct gccagggcaa cgggaacaag 420

ttctactcag agaaggagtg cagagagtac tgcggtgtcc ctggtgatgg tgatgaggag 480

ctgctgcgct tctccaactg a 501

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 连接子序列

<400> 10

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 11

Gly Ser Gly Ser

1

<210> 12

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 12

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 14

Gly Asn Gly Asn

1

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 15

Gly Gly Asn Gly

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 16

Gly Gly Gly Asn

1

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 17

Gly Gly Gly Gly Asn

1 5

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 18

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 19

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20

<210> 20

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 21

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 21

Asp Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Arg Glu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Arg Asp Ala Ala Ala Lys

20 25

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 22

Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg

1 5 10

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 23

Asp Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 24

Thr Gly Glu Lys Pro

1 5

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 25

Gly Gly Arg Arg

1

<210> 26

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 26

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1 5 10

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 27

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 28

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 29

Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro

1 5

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 30

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 不可切割肽连接子

<400> 31

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10 15

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 32

Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 33

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 33

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 34

Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

1 5 10

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 35

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

1 5 10 15

Pro

<210> 36

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 36

Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 37

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 37

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

1 5 10 15

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 38

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 38

Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro

1 5 10 15

Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys

20 25 30

Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr

35 40

<210> 39

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 39

Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 40

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 40

Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val

1 5 10 15

Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly

20 25 30

Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

35 40

<210> 41

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 自切割多肽位点

<400> 41

Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu

1 5 10 15

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

20 25 30

Pro

<210> 42

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TEV蛋白酶切割序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa为任何氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa为任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = Gly或Ser

<400> 42

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TEV蛋白酶切割序列

<400> 43

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TEV蛋白酶切割序列

<400> 44

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5

<210> 45

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 45

Gly Arg Gly Asp

1

<210> 46

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 46

Gly Arg Gly Asp Asn Pro

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 47

Gly Arg Gly Asp Ser

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 48

Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys

1 5

<210> 49

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 49

Ala Ala Pro Val

1

<210> 50

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 50

Ala Ala Pro Leu

1

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 51

Ala Ala Pro Phe

1

<210> 52

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 52

Ala Ala Pro Ala

1

<210> 53

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 53

Ala Tyr Leu Val

1

<210> 54

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> X = 任何氨基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 54

Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa

1 5

<210> 55

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 55

Leu Gly Pro Xaa

1

<210> 56

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 56

Gly Pro Ile Gly Pro Xaa

1 5

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 57

Ala Pro Gly Leu Xaa

1 5

<210> 58

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 58

Pro Leu Gly Pro Asp Arg Xaa

1 5

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> X = 任何氨基酸

<400> 59

Pro Leu Gly Leu Leu Gly Xaa

1 5

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 60

Pro Gln Gly Ile Ala Gly Trp

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 61

Pro Leu Gly Cys His

1 5

<210> 62

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 62

Pro Leu Gly Leu Tyr Ala

1 5

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 63

Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg

1 5

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 64

Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg

1 5

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 65

Pro Tyr Ala Tyr Tyr Met Arg

1 5

<210> 66

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 66

Pro Leu Gly Met Tyr Ser Arg

1 5

<210> 67

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 67

Gly Asp Lys Pro

1

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 68

Gly Ser Asp Lys Pro

1 5

<210> 69

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 69

Ala Leu Ala Leu

1

<210> 70

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 在实验室中制备 - 可切割肽连接子

<400> 70

Gly Phe Leu Gly

1

Claims

1.一种分离的成熟乌司他丁多肽，其包括：(i)在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化；(ii)在残基N45处的N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的O-连接聚糖，所述残基由SEQ ID NO:2或4定义，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

2.根据权利要求1所述的分离的成熟乌司他丁多肽，其包括与SEQ IDNO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)所述经修饰的O-连接糖基化位点；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

3.根据权利要求2所述的分离的成熟乌司他丁多肽，其包括与SEQ IDNO:2至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽包括或保留：(i)SEQ ID NO:2的S10A取代；(ii)在残基N45处的所述N-连接聚糖；以及(iii)在残基T17处的所述O-连接聚糖，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

4.根据权利要求2所述的分离的成熟乌司他丁多肽，其包括SEQ ID NO:2、由其组成或基本上由其组成，并且包括在残基N45处的所述N-连接聚糖和在残基T17处的所述O-连接聚糖。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的成熟乌司他丁多肽，其中所述至少一种乌司他丁活性选自蛋白酶抑制剂活性、抗炎活性和抗转移活性中的一种或多种。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的成熟乌司他丁多肽，其中所述乌司他丁多肽的特异性活性为约或至少约1000-3000U/mg、或约或至少约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000U/mg，其中一个单位(U)是所述乌司他丁多肽将2μg胰蛋白酶活性抑制50％的量。

7.一种治疗组合物，其包括根据权利要求1至6中任一项所述的分离的成熟乌司他丁多肽以及药学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的治疗组合物，其包括以下的混合物：(a)根据权利要求1至6中任一项所述的分离的成熟乌司他丁多肽；以及(b)第二成熟乌司他丁多肽，所述第二成熟乌司他丁多肽包括在残基N45处的N-连接聚糖并且不包括在残基T17处的O-连接聚糖，其中(a)和(b)具有至少一种乌司他丁活性。

9.根据权利要求8所述的治疗剂，其中(b)包括在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化，并且具有至少一种乌司他丁活性。

10.根据权利要求9所述的治疗组合物，其中(b)包括与SEQ ID NO:2或4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，包括或保留所述经修饰的O-连接糖基化位点和在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。

11.根据权利要求10所述的治疗组合物，其中(b)包括与SEQ ID NO:2至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，包括或保留SEQ ID NO:2的S10A取代和在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。

12.根据权利要求11所述的治疗组合物，其中(b)包括SEQ ID NO:2、由其组成或基本上由其组成，包括在残基N45处的所述N-连接聚糖，不包括在残基T17处的所述O-连接聚糖，并且具有至少一种乌司他丁活性。

13.根据权利要求7至12中任一项所述的治疗组合物，其中(a):(b)以范围为约20:1至约1:20，任选地约20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15或1:20的比率存在于所述组合物中。

14.根据权利要求7至13中任一项所述的治疗组合物，其基本上不含乌司他丁的其它糖基化异构体(糖型)。

15.根据权利要求7至14中任一项所述的治疗组合物，其内毒素水平小于约1EU/mg蛋白质，宿主细胞蛋白质小于约100ng/mg总蛋白质，宿主细胞DNA小于约10pg/mg总蛋白质和/或基本上不含聚集体。

16.一种乌司他丁融合多肽，其在N-末端至C-末端朝向上包括牛α-乳清蛋白信号肽和乌司他丁多肽，任选地其中所述乌司他丁多肽包括在残基Glu-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO:10)处的经修饰的O-连接糖基化位点，所述经修饰的O-连接糖基化位点减少在O-连接糖基化位点处的糖基化，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

17.根据权利要求16所述的乌司他丁融合多肽，其中所述牛α-乳清蛋白信号肽包括与SEQ ID NO:5至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

18.根据权利要求16或17所述的乌司他丁融合多肽，其中所述乌司他丁多肽包括与SEQID NO:1-4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性，并且任选地其中所述乌司他丁多肽具有或保留如由成熟人乌司他丁的序列定义的S10A取代。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其中所述乌司他丁融合多肽包括相对于SEQ ID NO:6或7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性，并且任选地其中所述乌司他丁多肽具有或保留如由成熟人乌司他丁的序列定义的S10A取代。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其包括在所述牛α-乳清蛋白信号肽与所述乌司他丁多肽之间的肽连接子，任选地其中所述肽连接子的长度为约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个氨基酸。

21.根据权利要求20所述的乌司他丁融合多肽，其中所述肽连接子包括蛋白酶切割位点。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其包括SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

23.根据权利要求16至22中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其包括SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。

24.根据权利要求16至23中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其中所述至少一种乌司他丁活性选自蛋白酶抑制剂活性、抗炎活性和抗转移活性中的一种或多种。

25.根据权利要求16至24中任一项所述的乌司他丁融合多肽，其中所述乌司他丁多肽的特异性活性为约或至少约1000-3000U/mg、或约或至少约1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000U/mg，其中一个单位(U)是所述乌司他丁多肽将2μg胰蛋白酶活性抑制50％的量。

26.一种多核苷酸，其编码根据权利要求16至25中任一项所述的乌司他丁融合多肽。

27.根据权利要求26所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括相对于SEQ ID NO:8或9至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸序列、由其组成或基本上由其组成。

28.一种表达载体，其包括根据权利要求26或27所述的多核苷酸，所述多核苷酸与启动子元件可操作地连接。

29.根据权利要求28所述的表达载体，其中所述表达载体是逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：在5'至3'朝向上的5'长末端重复序列(LTR)、包装区、启动子区、编码所述乌司他丁融合多肽的所述多核苷酸、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)以及3'LTR。

30.一种重组哺乳动物宿主细胞，其包括根据权利要求26或27所述的多核苷酸或根据权利要求28或29所述的表达载体。

31.根据权利要求30所述的重组哺乳动物宿主细胞，其选自HEK293细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，任选地GPEx CHO(GCHO)细胞。

32.根据权利要求31所述的重组哺乳动物宿主细胞，其中所述HEK293细胞组成型地表达gag、pro和pol蛋白(任选地来自鼠类白血病病毒(MLV))和单独转染的env蛋白，并且分泌编码所述乌司他丁融合多肽的无复制能力的逆转录病毒颗粒。

33.根据权利要求31所述的哺乳动物宿主细胞，其中所述CHO细胞表达所述乌司他丁融合多肽，并且表达或过表达弗林多肽(furin polypeptide)，任选地外源性弗林多肽。

34.一种用于重组产生乌司他丁多肽的方法，所述方法包括：

(a)在根据权利要求30至33中任一项所述的重组哺乳动物宿主细胞，任选地所述CHO细胞或GCHO中表达所述乌司他丁融合多肽；以及

由此重组产生所述乌司他丁融合多肽。

35.根据权利要求34所述的方法，其包括从所述乌司他丁多肽切割所述牛α-乳清蛋白信号肽，以产生重组乌司他丁多肽，所述重组乌司他丁多肽包括与SEQ ID NO:1-4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述乌司他丁多肽具有至少一种乌司他丁活性。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述乌司他丁多肽是根据权利要求1至6中任一项所述的成熟乌司他丁多肽。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其包括在生理条件，任选地温度、盐度和/或pH下测量所述乌司他丁多肽的至少一种乌司他丁活性。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其包括制备包括所述乌司他丁多肽的治疗组合物，其中在蛋白质基础上或在重量-重量基础上，所述组合物的纯度为至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％，并且其中所述组合物基本上不含聚集体并且基本上不含内毒素。

39.根据权利要求7至15中任一项所述的治疗组合物或根据权利要求38所述的方法制备的治疗组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病，任选地其中所述疾病为炎性疾病或癌症。

40.一种治疗有需要的受试者的炎性疾病或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求7至15中任一项所述的治疗组合物或根据权利要求38所述的方法制备的治疗组合物，由此治疗所述受试者的所述炎性疾病或病状。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述炎性疾病或病状选自以下中的一种或多种：胰腺炎(例如，急性胰腺炎、慢性胰腺炎、内窥镜逆行胰胆管造影(ERCP)诱导的胰腺炎、全身性炎症、结肠炎、自身免疫性脑脊髓炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、关节炎、肾衰竭、烧伤、脓毒症/脓毒性休克，包含严重脓毒症和相关的促炎性/继发性病状(例如，器官衰竭)，全身性炎性应答综合征(SIRS)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)、川崎病(Kawasaki disease)、肾病(例如，急性肾衰竭、慢性肾病)、缺血病状(例如，肝、肾、心脏、肺、脑的缺血再灌注损伤)、肺部炎症和炎性肺部病状(例如，肺部感染、肺炎，包含与混合结缔组织病相关的感染性间质性肺炎，肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征)、肝炎症，包含肝炎，过敏反应、术后或手术后并发症(例如，肾功能、心脏手术、肺手术、认知功能障碍、肝移植)、脂多糖(LPS)诱导的炎症或组织损伤(例如，肺、肝、脑)、继发于糖尿病的炎症或功能障碍(例如，糖尿病诱导的心脏功能障碍)、烧伤、中暑、炎性或神经性疼痛、急性中毒、高脂血症相关炎症、自身免疫相关炎症、同种异体移植或输血相关炎症、神经炎症和癌症相关炎症。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中施用经修饰的乌司他丁多肽减少所述受试者中的蛋白酶活性、内皮活化/损害、促炎性细胞因子和趋化因子产生/释放(任选地，IL-1β、MIP-1α、MCP-1和/或CXCL1)、纤维蛋白原合成、嗜中性粒细胞募集到器官中和/或器官损伤中的一种或多种。

43.一种治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求7至15中任一项所述的治疗组合物或根据权利要求38所述的方法制备的治疗组合物，由此治疗、改善有需要的受试者的癌症的症状或抑制癌症的进展。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症选自以下中的一种或多种：黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、白血病(例如，淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、复发性急性髓性白血病)、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、B细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性CNS淋巴瘤、原始神经外胚层瘤(成神经管细胞瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症，任选地其中施用经修饰的乌司他丁多肽减少癌细胞侵袭和/或血管生成。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述转移性癌症选自以下中的一种或多种：

(a)已经转移到骨、肝和/或肺的膀胱癌；

(b)已经转移到骨、脑、肝和/或肺的乳腺癌；

(c)已经转移到肝、肺和/或腹膜的结直肠癌；

(d)已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或肺的肾癌；

(e)已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或其它肺部位的肺癌；

(f)已经转移到骨、脑、肝、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；

(g)已经转移到肝、肺和/或腹膜的卵巢癌；

(h)已经转移到肝、肺和/或腹膜的胰腺癌；

(i)已经转移到肾上腺、骨、肝和/或肺的前列腺癌；

(j)已经转移到肝、肺和/或腹膜的胃癌；

(l)已经转移到骨、肝和/或肺的甲状腺癌；以及

(m)已经转移到骨、肝、肺、阴道和/或腹膜的子宫癌。