ES2384134T3 - Uso de productos proteínicos secretados para prevención y tratamiento de enfermedades pancreáticas y/u obesidad y/o síndrome metabólico - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 y/o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32, siendo preferiblemente la molécula de ácido nucleico una molécula de DNA, más preferiblemente una molécula de cDNA o DNA genómico, y opcionalmente portadores, diluyentes, y/o aditivos farmacéuticamente aceptables para la preparación de un agente para detección de enfermedades o disfunciones seleccionadas del grupo constituido por diabetes, obesidad, y/o síndrome metabólico.

Description

Uso de productos proteínicos secretados para prevención y tratamiento de enfermedades pancreáticas y/u obesidad y/o síndrome metabólico.

Esta invención se refiere al uso de proteínas SF06 secretadas, y al uso de polinucleótidos que codifican las mismas, en el diagnóstico y estudio de diabetes, obesidad y/o síndrome metabólico.

Muchas proteínas humanas sirven como compuestos farmacéuticamente activos. Varias clases de proteínas humanas que sirven como tales compuestos activos incluyen hormonas, citoquinas, factores de crecimiento celular, y factores de diferenciación celular. La mayoría de las proteínas que pueden utilizarse como compuestos farmacéuticamente activos caen dentro de la familia de las proteínas secretadas. Las proteínas secretadas se producen generalmente en el interior de las células del retículo endoplasmático rugoso, se exportan luego al complejo de Golgi, y se desplazan después a vesículas o gránulos secretores, donde aquéllas se secretan al exterior de la célula por exocitosis. Ejemplos de proteínas secretadas utilizadas comercialmente son insulina humana, agentes trombolíticos, interferones, interleuquinas, factores estimulantes de colonias, hormona del crecimiento humano, factor beta del crecimiento transformante, activador de plasminógeno tisular, eritropoyetina, y diversas otras proteínas. Los receptores de proteínas secretadas, que son proteínas fijadas a la membrana, tienen también potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Por consiguiente, es importante para el desarrollo de nuevos compuestos farmacéuticos identificar proteínas secretadas que puedan ser testadas en cuanto a actividad en una diversidad de modelos animales. Así, teniendo en cuenta el papel dominante de las proteínas secretadas en la fisiología humana, existe necesidad de identificar y caracterizar nuevas funciones para las proteínas humanas secretadas y los genes que las codifican. Este conocimiento permitirá detectar, tratar, y prevenir enfermedades, trastornos, y/o afecciones médicas por utilización de proteínas secretadas o los genes que codifican las mismas.

El páncreas es un órgano esencial que posee a la vez una función exocrina implicada en el suministro de enzimas al tracto digestivo y una función endocrina por la cual diversas hormonas son secretadas al torrente sanguíneo. La función exocrina está asegurada por células acinares y centroacinares que producen diversas enzimas digestivas y conductos intercalados que transportan estas enzimas en solución alcalina al duodeno. La unidad funcional del páncreas endocrino es el islote de Langerhans. Los islotes están dispersos por toda la porción exocrina del páncreas y están compuestos de cuatro tipos de células: células alfa, beta, delta y PP, revisadas por ejemplo en Kim S.K. y Hebrok M., (2001) Genes Dev. 15:111-127. Las células beta producen insulina, representan la mayor parte de las células endocrinas y forman el núcleo de los islotes, mientras que las células alfa secretan glucagón y están localizadas en la periferia. Las células delta y las células PP son menos numerosas y secretan somatostatina y polipéptido pancreático, respectivamente.

El desarrollo pancreático inicial ha sido bien estudiado en diferentes especies, que incluyen pollos, pez cebra, y ratones (para una revisión detallada véase Kim & Hebrok, 2001, supra). El páncreas se desarrolla a partir de primordios distintos dorsales y ventrales. El desarrollo del páncreas requiere la especificación de los primordios pancreáticos a lo largo de ambos ejes anterior-posterior y dorsal-ventral. Diversos factores, que son críticos para el desarrollo pancreático apropiado han sido identificados (véase Kim & Hebrok, 2001, supra; Wilson M.E. et al., (2003) Mech Dev. 120:65-80).

En los humanos post-natales/adultos, las células acinares y ductales retienen una capacidad proliferativa importante que puede asegurar la renovación y el crecimiento de las células, mientras que las células de los islotes se vuelven en su mayoría mitóticamente inactivas. Esto está en contraste con los roedores, en los cuales la replicación de las células beta es un mecanismo importante en la generación de células beta nuevas. Se ha sugerido que, durante el desarrollo del embrión, los islotes pancreáticos de Langerhans se originan por la diferenciación de las células ductales u otras células con morfología epitelial (Bonner-Weir S. y Sharma A., (2002) J Pathol. 197: 519-526; Gu G. et al., (2003) Mech Dev. 120: 35-43). En los humanos adultos, células beta nuevas surgen en la vecindad de los conductos (Butler A.E. et al., (2003) Diabetes 52: 102-110; Bouwens L. y Pipeleers D.G., (1998) Diabetologia 41: 629-633). Sin embargo, se ha sugerido también una localización intra-islotes o un origen en la médula ósea para las células precursoras de las células beta adultas (Zulewski H. et al., (2001) Diabetes 50: 521-533; lanus A. et al., (2003) J Clin Invest. 111: 843-850). Zulewski H. et al. (2001) Diabetes 50: 521-533; lanus A. et al., (2003) J Clin Invest. 111: 843850). El crecimiento de los islotes pancreáticos es dinámico y responde a cambios en la demanda de insulina, tal como ocurre durante el embarazo o durante el aumento de la masa corporal que tiene lugar durante la infancia. En los adultos, existe una buena correlación entre masa corporal y masa de los islotes (Yoon K.H. et al., (2003) J. Clin. Endocrinol Metab. 88:2300-2308).

Las células beta pancreáticas secretan insulina, que es estimulada por niveles elevados de glucosa en sangre. La insulina, entre otras hormonas, juega un papel fundamental en la regulación del metabolismo del combustible. La insulina conduce al almacenamiento de glucógeno y triglicéridos y a la síntesis de proteínas. La entrada de glucosa en los músculos y las células adiposas está estimulada por la insulina. En los pacientes que sufren diabetes mellitus, la cantidad de insulina producida por las células de los islotes pancreáticos es demasiado baja, dando como resultado niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia). En la diabetes tipo I, las células beta se pierden debido a destrucción autoinmune. En los pacientes diabéticos tipo II, las células del hígado y las musculares pierden su capacidad para responder a los niveles normales de insulina en sangre (resistencia a la insulina). Los niveles de glucosa

en sangre elevados (y también los niveles elevados de lípidos en sangre) conducen a un deterioro de la función de las células beta y a un aumento en la apoptosis de las células beta. Es interesante observar que la tasa de neogénesis de células beta no parece cambiar en los diabéticos tipo II (Butler et al., 2003 supra), causando así una reducción en la masa total de células beta a lo largo del tiempo. Finalmente, la aplicación de insulina exógena llega a hacerse necesaria en los diabéticos tipo II.

La mejora de los parámetros metabólicos tales como azúcar en sangre y niveles de lípidos en sangre (v.g. por cambios dietéticos, ejercicio, medicación o combinaciones de los mismos) antes que la masa de células beta haya caído por debajo de un umbral crítico conduce a un restablecimiento relativamente rápido de la función de las células beta. Sin embargo, después de dicho tratamiento la función pancreática endocrina se mantendría deteriorada debido a la sólo ligeramente incrementada tasa de regeneración.

En los diabéticos tipo I, la duración de vida de los islotes pancreáticos está espectacularmente acortada debido a destrucción autoinmune. Se han ideado tratamientos que modulan el sistema inmunitario y pueden ser capaces de detener o reducir acusadamente la destrucción de los islotes (Raz I. et al., (2001) Lancet 358: 1749-1753; Chatenoud L. et al., (2003) Nat Rey Immunol. 3: 123-132). Sin embargo, debido a la regeneración relativamente lenta de las células beta humanas, dichos tratamientos podrían ser completamente satisfactorios sólo para mejorar la afección diabética si se combinan con un agente que pueda estimular la regeneración de las células beta.

Así pues, tanto para la diabetes tipo I como para la del tipo II (fases temprana y tardía) hay necesidad de descubrir nuevos agentes que estimulen la regeneración de las células beta.

La diabetes es una enfermedad muy incapacitante, dado que las medicaciones no controlan los niveles de azúcar en sangre suficientemente bien para prevenir la fluctuación entre los niveles de azúcar en sangre altos y bajos. Los pacientes diabéticos corren el riesgo de complicaciones importantes, que incluyen cetoacidosis diabética, enfermedad renal de etapa final, retinopatía diabética y amputación. Existe también una multitud de afecciones afines, tales como el síndrome metabólico, obesidad, hipertensión, enfermedad cardiaca, enfermedad vascular periférica, e infecciones, para las cuales las personas con diabetes corren un riesgo sustancialmente incrementado. El tratamiento de estas complicaciones contribuye en un grado considerable al enorme coste que impone la diabetes sobre los sistemas de atención sanitaria en todo el mundo.

La obesidad es uno de los trastornos metabólicos más prevalecientes en el mundo. Es todavía una enfermedad humana deficientemente comprendida que se ha convertido en un problema de salud importante cada vez más relevante para la sociedad occidental. La obesidad se define como un peso corporal mayor que 20% en exceso sobre el peso corporal ideal, que da frecuentemente como resultado un deterioro importante de la salud. La obesidad puede medirse por el índice de masa corporal, un indicador de adiposidad y gordura. Parámetros adicionales para definir la obesidad son las circunferencias de cintura, el grosor de los pliegues de piel y la bioimpedancia. La misma está asociada con un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, hipertensión, diabetes mellitus tipo II, hiperlipidemia y una tasa de mortalidad incrementada. La obesidad está influenciada por factores genéticos, metabólicos, bioquímicos, psicológicos, y conductuales y puede estar causada por diferentes razones tales como diabetes no dependiente de insulina, aumento de triglicéridos, aumento en la energía ligada a los carbohidratos y bajo consumo de energía (Kopelman, P.G., (2000) Nature 404: 635-643).

El concepto de 'síndrome metabólico' (síndrome x, síndrome de resistencia a la insulina, cuarteto mortal) fue descrito por primera vez en 1966 por Camus e reintroducido en 1988 por Reaven (Camus J.P., (1966) Rev Rhum Mal Osteoartic 33: 10-14; Reaven G.M., (1988), Diabetes 37: 1595-1607). Hoy en día, el síndrome metabólico se define comúnmente como aglomeración de factores de riesgo cardiovasculares tales como hipertensión, obesidad abdominal, niveles elevados de triglicéridos en sangre y glucosa en ayunas, así como niveles bajos de HDL colesterol en sangre. La resistencia a la insulina aumenta notablemente el riesgo de desarrollo del síndrome metabólico (Reaven G., (2002) Circulation 106:286-288). El síndrome metabólico precede a menudo al desarrollo de diabetes tipo II y enfermedad cardiovascular (Lakka H.M. et al., (2002) JAMA 288:2709-2716). El control de los niveles de lípidos en sangre y niveles de glucosa en sangre es esencial para el tratamiento del síndrome metabólico (véase, por ejemplo, Santomauro A.T. et al., (1999) Diabetes, 48:1836-1841).

Los factores moleculares que regulan la ingesta de alimentos y el balance de peso corporal están incompletamente comprendidos. Aun cuando se han descrito varios genes candidatos que se supone influyen en el o los sistemas homeostáticos que regulan la masa/peso corporal, como leptina o el co-activador del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas, los distintos mecanismos moleculares y/o moléculas que influyen en la obesidad o las regulaciones peso corporal/masa corporal no se conocen.

Existe una necesidad en la técnica anterior de la identificación de genes candidato que se expresen específicamente en el desarrollo inicial en ciertos tejidos pancreáticos. Estos genes y las proteínas codificadas por ellos pueden proporcionar herramientas para el diagnóstico y tratamiento de trastornos pancreáticos graves y enfermedades afines. Por esta razón, esta memoria descriptiva describe proteínas secretadas que se expresan específicamente en los tejidos pancreáticos en las fases iniciales del desarrollo. Se describe adicionalmente el uso de estos genes y proteínas en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de disfunciones pancreáticas, tales como la diabetes, y otras

enfermedades afines tales como obesidad y/o síndrome metabólico. Estas proteínas y genes son especialmente útiles en procesos de regeneración, tales como la regeneración de las células del páncreas.

En esta memoria se describen factores secretados a los que se hace referencia como SF01-SF13, que están implicados en el desarrollo y la regeneración del páncreas, y en la regulación de la homeostasis de la energía. SF01-SF13 corresponden a proteínas de mamífero como se describe en la Tabla 1.

La invención se identifica en la reivindicación 1. Adicionalmente, la invención se refiere a la identificación de un (poli)péptido implicado en la regulación de la homeostasis de la energía y/o el metabolismo de un mamífero y al cribado de un agente, que modula/afecta a la actividad de un polipéptido SF06. Cualquier información acerca de otras proteínas SF01-05 y SF07-13 se proporciona para el propósito de comparación únicamente.

La función de SF01, una molécula afín al TNF, se desconocía con anterioridad. Homólogos de SF01 existen en humanos, ratones y Danio rerio (pez cebra). La SF01 humana se expresa en el cerebro, el hipocampo, y los islotes de Langerhans. En los peces, SF01 se expresa en el cerebro.

SF02 está conservada desde Drosophila a los humanos. SF02 es una proteína vital regulada por el desarrollo. Los mutantes de SF02 de Drosophila mueren por defectos del sistema neural. En el ratón, SF02 parece estar enriquecida en el endodermo y el embrión, y parece ser que está presente en el páncreas. En los humanos, SF02 está presente en páncreas, hígado, timo, y bazo.

Los glipicanos son una familia de proteoglicanos de sulfato de heparano (HSPGs) de la superficie de las células anclados a glicosilfosfatidilinositol (GPI). SF03 es un miembro de la familia glipicanos de proteoglicanos de sulfato de heparano, que se fija a la membrana celular por un anclaje GPI. SF03 está mutado en el síndrome de Simpson-Golabi-Behmel (SGBS). El SGBS se caracteriza por crecimiento excesivo pre- y post-natal y es una afección recesiva ligada al cromosoma X. SF03 se expresa en el pulmón mesodérmico embrionario, los tejidos de hígado y riñón y se cree que interacciona con diversos factores de crecimiento para regular el crecimiento de tejidos y órganos.

El gen SF04 es un precursor compartido para alfa-microglobulina y bikunina. La alfa-microglobulina es una lipocalina con propiedades inmunosupresoras, y la bikunina es un inhibidor de la proteinasa plasmática. El mRNA de SF04 está fuertemente transcrito en el parénquima hepático, el páncreas, y el epitelio intestinal. Ambas proteínas codificadas están presentes, de acuerdo con ello, en los hepatocitos, el páncreas, el riñón y el intestino en desarrollo. La bikunina funciona como supresor de tumores.

SF05 es un inhibidor de la serina-proteasa específica neural, que se expresa en el CNS en desarrollo completo en el ratón. SF05 inhibe el activador de plasminógeno de tipo tisular de la proteasa extracelular y la plasmina, pero no la trombina. Los ratones deficientes en SF05 son/eran viables y sanos, excepto por defectos de comportamiento. La proteína SF05 mutante se agrega y causa demencia familiar en los humanos.

SF06 es secretada por el cerebro, la corteza adrenal y los tumores adrenocorticales. SF06 está implicada en la regulación de la secreción de hormonas esteroidales y la proliferación de células adrenocorticales como factor autocrino y/o paracrino.

SF07 es un supuesto gen supresor de tumores, que está desactivado en los hepatocarcinomas, el cáncer colorrectal y cánceres de pulmón no microcíticos.

SF08 es una carboxipeptidasa que no tiene actividad enzimática conocida. SF08 se expresa en los huesos y cartílagos en desarrollo.

La proteína SF09 tiene una longitud de 145 aminoácidos y contiene motivos EF-Hand que fijan el ion calcio. De acuerdo con el ensamblaje expresado de etiquetas de secuencia (EST), SF09 se expresa en muchos tejidos con inclusión del páncreas.

El homólogo de ratón de la SF10 humana es una proteína de la matriz extracelular fijadora de integrina. Las mutaciones de SF10 son frecuentes en pacientes con el síndrome de Smith-Magenis (SMS), un síndrome de anomalía congénita/retardo mental múltiple clínicamente reconocible.

SF11 es un inhibidor de la cisteína-proteinasa para las catepsinas B y L, que está bien caracterizado. La expresión de SF11 está controlada por TGF-beta y EGF en cultivos deciduales y por TGF-beta en los precursores de astrocitos. Una forma glicosilada de SF11 es necesaria para una proliferación celular del tallo neural sensible a FGF-2. La aportación combinada de FGF-2 y SF11 al giro dentado adulto estimulaba la neurogénesis. Los ratones deficientes en SF11 exhibían crecimiento tumoral reducido.

SF12 es una glicoproteína de la matriz extracelular y del plasma. La expresión de SF12 en el islote pancreático adulto está confinada en su mayor parte a los vasos sanguíneos.

SF13 es una peptidil-prolil-cis-trans-isomerasa citosólica expresada ubicuamente, que es inhibida por el fármaco inmunosupresor ciclosporina. SF13 es un factor pro-inflamatorio para los linfocitos T. SF13 envía señales a través

del receptor CD147 (basigina) y se expresa en las células acinares pero no en las membranas de los islotes o las células MIN-6.

De acuerdo con ello, la presente memoria descriptiva describe proteínas secretadas con funciones en el metabolismo humano, la regeneración, y los procesos del desarrollo pancreático. Se describen genes específicos y proteínas codificadas por ellos así como efectores/moduladores de los mismos implicados en la regulación de la función y el metabolismo pancreáticos, especialmente en enfermedades del páncreas tales como diabetes mellitus, v.g., diabetes mellitus dependiente de insulina y/o diabetes mellitus no dependiente de insulina, y/o síndrome metabólico, obesidad, y/o trastornos afines tales como enfermedad cardiaca coronaria, trastornos de la comida, caquexia, hipertensión, hipercolesterolemia (dislipidemia), fibrosis hepática, y/o cálculos biliares. Adicionalmente, se describen genes específicos y proteínas codificadas por ellos así como efectores/moduladores de los mismos implicados en la regeneración de las células o tejidos pancreáticos, v.g. células que tienen funciones exocrinas tales como células acinares, células centroacinares y/o células ductales y/o células que tienen funciones endocrinas, particularmente las células de los islotes de Langerhans tales como las células alfa, beta, delta y/o PP, más particularmente las células beta.

En esta memoria descriptiva, se utilizó una criba para factores secretados expresados en el páncreas de mamífero (ratón) en desarrollo, como se describe con mayor detalle en la sección de Ejemplos (véase el Ejemplo 1). Esta criba identificó SF01-SF13 como factores secretados expresados en el páncreas del ratón en desarrollo. Las proteínas SF01-SF13 de mamífero y los polinucleótidos que codifican éstas, en particular SF01-SF13 humanas, están implicados en las afecciones y procesos mencionados anteriormente.

Las proteínas homólogas a SF01-SF13 y moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas pueden obtenerse a partir de especies de vertebrados. Para uso en la presente invención, se prefieren particularmente ácidos nucleicos que codifican la proteína SF06 humana, como se caracterizan por SEQ ID Nos: 30 ó 32, en donde dicha molécula de ácido nucleico es como se define en la reivindicación 4.

La función de SF01-SF13 de mamífero en el metabolismo de los mamíferos se validó por análisis de la expresión de los transcritos en diferentes tejidos y por análisis del papel en la diferenciación de los adipocitos (véanse los Ejemplos 3 y 4 para mayor detalle).

Estudios de determinación del perfil de expresión (véanse los Ejemplos para mayor detalle) confirman la relevancia particular de SF02-SF04 como reguladores del metabolismo de la energía en los mamíferos.

Las microrredes son instrumentos analíticos utilizados rutinariamente en bioanálisis. Una microrred tiene moléculas distribuidas por toda la superficie de un soporte sólido, y asociadas de manera estable con dicha superficie. El término "microrred" hace referencia a una disposición de una pluralidad de polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, u otros compuestos químicos en un sustrato. Se han desarrollado microrredes de polipéptidos, polinucleótidos, y/o anticuerpos y encuentran uso en una diversidad de aplicaciones, tales como monitorización de la expresión génica, descubrimiento de fármacos, secuenciación de genes, mapeado de genes, identificación de bacterias, y química combinatoria. Un área en particular en la que encuentran aplicación las microrredes es el análisis de la expresión génica (véase el Ejemplo 4). La tecnología de redes puede utilizarse para explorar la expresión de un solo gen polimórfico o el perfil de expresión de un gran número de genes afines o no afines. Cuando se examina la expresión de un solo gen, se emplean redes para detectar la expresión de un gen específico o sus variantes. Cuando se examina un perfil de expresión, las redes proporcionan una plataforma para identificar genes que son específicos de tejido, se ven afectados por una sustancia que se somete a test en un ensayo de toxicología, forman parte de una cascada de señalización, llevan a cabo funciones internas, o están relacionadas específicamente con una predisposición, afección, enfermedad, o trastorno genético particular.

Las microrredes pueden prepararse, utilizarse, y analizarse utilizando métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Brennan T.M., (1995) Patente U.S. No. 5,474,796; Schena M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619; Baldeschwieler J.D. et al., (1995) solicitud PCT WO 95/251116; Shalon T.D. y Brown P.O., (1995) solicitud PCT WO 95/35505; Heller R.A. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155; Heller, M.J. y Tu E., (1997) Patente U.S. No. 5,605,662). Diversos tipos de microrredes son bien conocidos y se describen detalladamente en Schena M., ed. (1999); DNA Microarrays, A Practical Approach, Oxford University Press, Londres).

Los oligonucleótidos o fragmentos más largos derivados de cualquiera de los polinucleótidos descritos en esta memoria pueden utilizarse como elementos en una microrred. La microrred puede utilizarse en técnicas de obtención de imágenes de transcritos, que monitorizan los niveles relativos de expresión de grandes números de genes simultáneamente como se describe más adelante. La microrred puede utilizarse también para identificar variantes genéticas, mutaciones, y polimorfismos. Esta información puede utilizarse para determinar la función de los genes, para comprender la base genética de un trastorno, para diagnosticar un trastorno, para monitorizar la progresión/regresión de una enfermedad en función de la expresión génica, y para desarrollar y monitorizar las actividades de agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades. En particular, esta información puede utilizarse para desarrollar un perfil farmacogenómico de un paciente a fin de seleccionar el régimen de tratamiento más apropiado y eficaz para dicho paciente. Por ejemplo, pueden seleccionarse agentes terapéuticos que son sumamente eficaces y

exhiben el número mínimo de efectos secundarios para un paciente, basándose en el perfil farmacogenómico de él o de ella.

Como se ha determinado por análisis de microrredes, SF02, SF03 y SF13 exhiben expresión diferencial en los adipocitos primarios humanos. Se observa una fuerte regulación creciente concerniente a la expresión de SF02 y SF03 durante la diferenciación de los adipocitos humanos (véase Fig. 3 y 5) en tanto que se observa una regulación fuertemente decreciente concerniente a la expresión de SF13 durante la diferenciación de los adipocitos humanos (véase Fig. 9). Las proteínas SF02 y SF03 en los preadipocitos tienen el potencial de intensificar la diferenciación de los adipocitos, y la proteína SF13 en los preadipocitos tiene el potencial de intensificar la diferenciación de los adipocitos en una etapa muy temprana. Por esta razón, las proteínas SF02, SF03, y SF13 podrían jugar un papel esencial en la adipogénesis. Los resultados sugieren un papel de SF02, SF03, y SF13 en la regulación del metabolismo humano, por ejemplo, como efectores/moduladores (por ejemplo, intensificadores o inhibidores) de la adipogénesis. Así, SF02, SF03, y SF13 son candidatos fuertes para la fabricación de composiciones farmacéuticas y medicamentos para el tratamiento de afecciones relacionadas con el metabolismo humano, tales como diabetes, obesidad, y/o el síndrome metabólico.

Adicionalmente, se muestran hibridaciones in situ de montaje entero y seccionales (véanse los Ejemplos y las Figuras 1, 7, y 8). La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SF01 del ratón se expresa en la región del páncreas ventral. La secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas de ratón SF05 y SF06 se expresan en el tejido pancreático (véase Fig. 7 y 8).

Las condiciones de hibridación están basadas en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de fijación de ácido nucleico o sonda, como se describe en Wahl G.M. et al., (1987; Methods Enzymol, 152: 399-407) y Kimmel A.R. (1987; Methods Enzymol. 152: 507-511), y pueden utilizarse a una severidad definida. Preferiblemente, la hibridación en condiciones severas significa que después de lavado durante una hora con 1 x SSC y 0,1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 62ºC y muy preferiblemente a 65ºC, particularmente durante una hora en 0,2 x SSC y 0,1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 62ºC y muy preferiblemente a 65ºC, se observa una señal de hibridación positiva.

Con objeto de expresar una proteína biológicamente activa, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas o equivalentes funcionales, pueden insertarse en vectores de expresión apropiados, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Pueden utilizarse métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica, para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican las proteínas y los elementos de control de transcripción y traducción apropiados. Los elementos reguladores incluyen por ejemplo un promotor, un codón de iniciación, un codón de parada, un elemento regulador de la estabilidad del mRNA, y una señal de poliadenilación. La expresión de un polinucleótido puede asegurarse por (i) promotores constitutivos tales como la región promotora/intensificadora del Citomegalovirus (CMV), (ii) promotores específicos de tejidos tales como el promotor de insulina (véase, Soria B. et al., (2000), Diabetes 49:157-162), el promotor del gen SOX2 (véase Li M. et al., (1998) Curr. Biol. 8:971-974). El promotor Msi-1 (véase Sakaklbara S. and Okano H., (1997) J. Neuroscience 17: 8300-8312), promotor de la cadena pesada de la alfa-cardia-miosina o el promotor del factor natriurético atrial humano (Klug M.G. et al., (1996) J. Clin. Invest 98: 216224; Wu J. et al., (1989) J. Biol. Chem. 264: 6472-8479) o (iii) promotores inducibles tales como el sistema inducible por tetraciclina. Vectores de expresión pueden contener también un agente de selección o gen marcador que confiere resistencia a antibióticos tales como los genes de resistencia a neomicina, higromicina, o puromicina. Estos métodos incluyen técnicas in vitro de DNA recombinante, técnicas de síntesis, y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook J. et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y Ausubel F.M. et al., (1989) Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.

En una realización adicional de la invención, secuencias de ácido nucleico naturales, modificadas o recombinantes que codifican las proteínas SF06 pueden ligarse a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión.

Pueden utilizarse una diversidad de vectores de expresión/sistemas hospedadores conocidos en la técnica que contienen y expresan secuencias que codifican las proteínas o proteínas de fusión. Estos incluyen, pero sin carácter limitante, micro-organismos tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de DNA de plásmidos o cósmidos; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus (v.g., baculovirus, adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus, retrovirus); sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (v..g., el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (v.g., los plásmidos Ti o PBR322); o sistemas de células animales.

La presencia de secuencias de polinucleótidos en una muestra puede detectarse por hibridación y/o amplificación de DNA-DNA o DNA-RNA utilizando sondas o porciones o fragmentos de dichos polinucleótidos. Los ensayos basados en amplificación de ácido nucleico implican el uso de oligonucleótidos u oligómeros basados en las secuencias específicas para el gen a fin de detectar transformantes que contengan DNA o RNA codificante de la proteína correspondiente. Como se utiliza en esta memoria, los términos 'oligonucleótidos' u 'oligómeros' se refieren a una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y que puede contener tantos como

aproximadamente 60 nucleótidos, con preferencia aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, y de modo más preferible aproximadamente 20-25 nucleótidos, que pueden utilizarse como una sonda o amplímero.

Una diversidad de etiquetas y técnicas de conjugación son conocidas por los expertos en la técnica y pueden utilizarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Medios para producir hibridación etiquetada o sondas PCR para detección de secuencias de polinucleótidos incluyen oligo-marcación, traslación de la mella, marcación en los extremos de sondas de RNA, amplificación por PCR utilizando un nucleótido marcado, o síntesis enzimática. Estos procedimientos pueden conducirse utilizando una diversidad de kits disponibles comercialmente (Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, Mich.); Promega (Madison Wis.); y U.S.Biochemical Corp., (Cleveland, Ohio).

La presencia de SF01-SF13 en una muestra puede determinarse por métodos inmunológicos o medida de actividad. Una diversidad de protocolos para detección y medida de la expresión de proteínas, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína o reactivos para determinar la actividad de las proteínas se conocen en la técnica. Ejemplos incluyen el ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos para dos epítopes no interferentes en la proteína, pero puede emplearse un ensayo de fijación competitivo. Estos y otros ensayos se describen, entre otros lugares, en Hampton R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn.) y Maddox D.E. et al. (1983; J. Exp. Med, 158: 1211-1226).

Moléculas o etiquetas informadoras adecuadas que pueden utilizarse, incluyen radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromógenos así como sustratos, co-factores, inhibidores, partículas magnéticas, y análogos. Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas SF06 pueden utilizarse para generar modificaciones en animales transgénicos no humanos o genes específicos del sitio en líneas de células. Pueden producirse animales transgénicos no humanos por recombinación homóloga, en la cual se altera el locus normal de los genes que codifican las proteínas de la invención. Alternativamente, un constructo de ácido nucleico se integra aleatoriamente en el genoma. Vectores para integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YACs, y análogos. Las células o animales modificados son útiles en el estudio de la función y regulación de las proteínas SF06. Por ejemplo, puede hacerse una serie de pequeñas deleciones y/o sustituciones en los genes que codifican las proteínas a fin de determinar el papel de dominios particulares de la proteína, funciones en la diferenciación pancreática, etc.

Constructos específicos de interés incluyen moléculas antisentido, que bloquearán la expresión de las proteínas SF06, o la expresión de mutaciones dominantes negativas. Un marcador detectable, tal como por ejemplo lac-Z, pueden introducirse en el locus de los genes, donde la regulación creciente de la expresión de los genes dará como resultado un cambio fácilmente detectado en el fenotipo.

Puede proporcionarse también la expresión de los genes en células o tejidos en los que no se expresan normalmente o en momentos anormales del desarrollo. Adicionalmente, por proporcionar la expresión de las proteínas SF06 en células en las cuales las mismas no se producen normalmente, es posible inducir cambios en el comportamiento celular.

Los constructos de DNA para recombinación homóloga comprenderán al menos porciones de los genes con la modificación genética deseada, e incluirán regiones de homología en el locus diana. Los constructos de DNA para integración aleatoria no precisan incluir regiones de homología para mediar la recombinación. Convenientemente, se inducen marcadores para selección positiva y/o negativa. Métodos para generación de células que tienen modificaciones direccionadas en genes por recombinación homóloga se conocen en la técnica. Para las células del tallo embrionario (ES) no humanas, puede emplearse una línea de células ES, o pueden obtenerse células embrionarias recientemente de un hospedador, v.g., ratón, rata, cobayo, etc. Dichas células se dejan crecer en una capa apropiada de fibroblastos-alimentadores o se cultivan en presencia del factor inhibidor de la leucemia (LIF).

Los datos descritos en esta memoria demuestran que los ácidos nucleicos y proteínas SF06 son útiles en aplicaciones de diagnóstico concernientes a diabetes (tales como diabetes mellitus dependiente de insulina y/o diabetes mellitus no dependiente de insulina), obesidad, y/o síndrome metabólico. Por tanto, los usos diagnósticos para los ácidos nucleicos y proteínas son, por ejemplo pero sin carácter limitante, los siguientes: (i) diagnóstico de dianas de anticuerpos, (ii) marcador de diagnóstico y/o pronóstico, y/o (iii) herramientas de investigación.

Los ácidos nucleicos y proteínas SF06 son útiles en aplicaciones de diagnóstico implicadas en diversas realizaciones como se describe más adelante.

Los ácidos nucleicos pueden ser útiles adicionalmente en aplicaciones de diagnóstico, en donde debe evaluarse la presencia o cantidad de los ácidos nucleicos o las proteínas, seleccionados de diabetes, obesidad y síndrome metabólico.

Una diversidad de protocolos que incluyen ELISA, RIA, y FACS para determinación de proteínas se conocen en la técnica y proporcionan una base para el diagnóstico de niveles alterados o anormales de expresión génica. Los valores normales o estándar para la expresión génica se establecen por combinación de fluidos corporales o extrac

tos de células tomados de individuos mamíferos normales, preferiblemente humanos, con anticuerpos para la proteína en condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación de complejo estándar puede cuantificarse por diversos métodos, pero preferiblemente por medios fotométricos. Las cantidades de proteína expresadas en las muestras de control y de la enfermedad, v.g. de tejidos sometidos a biopsia se comparan con los valores estándar. La desviación entre los valores estándar y los correspondientes a los individuos establece los parámetros para diagnóstico de la enfermedad.

En otra realización de la invención, los polinucleótidos específicos para las proteínas SF06 pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico. Los polinucleótidos que pueden utilizarse, incluyen secuencias oligonucleotídicas, moléculas de RNA y DNA antisentido, y PNAs. Los polinucleótidos pueden utilizarse para detectar y cuantificar la expresión génica en tejidos sometidos a biopsia en los cuales la expresión de los genes puede correlacionarse con la enfermedad. El ensayo de diagnóstico puede utilizarse para distinguir entre ausencia, presencia, y exceso de expresión génica, y para monitorizar la regulación de los niveles de proteínas durante una intervención terapéutica.

En un aspecto, la hibridación con sondas que son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, con inclusión de secuencias genómicas, que codifican las proteínas SF06, puede utilizarse para identificar secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína respectiva. Las sondas de hibridación pueden ser DNA o RNA y se derivan preferiblemente de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido codificante de las proteínas SF06 o de una secuencia genómica que incluye promotor, elementos intensificadores, e intrones del gen existente naturalmente. Las sondas de hibridación pueden estar marcadas por una densidad de grupos informadores, por ejemplo, radionucleidos tales como 32P o 35S o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda por sistemas de acoplamiento avidina/biotina, y análogos.

Secuencias de polinucleótidos específicas para las proteínas SF06 pueden utilizarse para el diagnóstico de afecciones o enfermedades, que están asociadas con la expresión de las proteínas, seleccionadas de diabetes, obesidad y síndrome metabólico. También pueden utilizarse secuencias polinucleotídicas específicas para proteínas SF06 para monitorizar el progreso de pacientes que reciben tratamiento por diabetes, obesidad, y/o síndrome metabólico. Las secuencias de polinucleótidos pueden utilizarse en ensayos cualitativos o cuantitativos, v.g. en análisis Southern o Northern, transferencia de mancha u otras tecnologías basadas en membranas; en tecnologías PCR; o en ensayos con varillas de inmersión, husillos, ELISA o chips que utilizan fluidos o tejidos de biopsias de pacientes para detectar la expresión génica alterada.

En un aspecto particular, las secuencias de nucleótidos SF06 pueden ser útiles en ensayos que detectan la activación o inducción de las enfermedades o disfunciones metabólicas anteriores. Las secuencias de nucleótidos pueden marcarse por métodos estándar, y añadirse a un fluido o muestra de tejido de un paciente en condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación adecuado, la muestra se lava y la señal se cuantifica y se compara con un valor estándar. La presencia de niveles alterados de secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas SF06 en la muestra indica la presencia de una enfermedad asociada. Tales ensayos pueden utilizarse también para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios con animales, en pruebas clínicas o en monitorización del tratamiento de un paciente individual.

Con objeto de proporcionar una base para el diagnóstico de una enfermedad asociada con la expresión de las proteínas SF06, se establece un perfil normal o estándar para la expresión. Esto puede realizarse por combinación de fluidos corporales o extractos celulares tomados de individuos normales, sean animales o humanos, con una secuencia o un fragmento de la misma, que es específico(a) para los ácidos nucleicos que codifican las proteínas SF06, en condiciones adecuadas para hibridación o amplificación. La hibridación estándar puede cuantificarse por comparación de los valores obtenidos de individuos normales con los procedentes de un experimento en el que se utiliza una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores estándar obtenidos de muestras normales pueden compararse con los valores obtenidos de muestras de pacientes que presentan síntomas de enfermedad. La desviación entre los valores estándar y los del individuo de que se trata se utiliza para establecer la presencia de enfermedad. Una vez establecida la enfermedad e iniciado un protocolo de tratamiento, pueden repetirse ensayos de hibridación sobre una base regular para evaluar si el nivel de expresión en el paciente comienza a aproximarse al que se observa en el paciente normal. Los resultados obtenidos de ensayos sucesivos pueden utilizarse para demostrar la eficacia del tratamiento a lo largo de un periodo comprendido entre varios días y meses.

Con respecto a diabetes, obesidad, y/o síndrome metabólico, la presencia de una cantidad inusual de transcrito en el tejido procedente de biopsia de un individuo puede indicar una predisposición para el desarrollo de la enfermedad, o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales sanitarios emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo más pronto, previniendo con ello el desarrollo o la progresión ulterior de las enfermedades y trastornos metabólicos.

Usos diagnósticos adicionales para oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias que codifican las proteínas SF06 pueden implicar el uso de PCR. Tales oligómeros pueden sintetizarse químicamente, generarse por medios enzimáticos o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros estarán constituidos preferiblemente por dos secuencias nucleotídicas, una con orientación sentido (5prima.fwdarw.3prima) y otra con orientación anti

sentido (3prima,rarw.5prima), empleadas en condiciones optimizadas para identificación de un gen o condición específico. Los dos mismos oligómeros, conjuntos de oligómeros anidados o incluso una agrupación degenerada de oligómeros pueden emplearse en condiciones menos severas para detección y/o cuantificación de secuencias estrechamente afines de DNA o RNA.

Las secuencias de ácido nucleico pueden utilizarse también para generar sondas de hibridación, que son útiles para mapeado de la secuencia genómica existente naturalmente. Las secuencias pueden mapearse a un cromosoma particular o a una región específica del cromosoma utilizando técnicas bien conocidas. Dichas técnicas incluyen FISH, FACS o construcciones de cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, construcciones bacterianas P1 o genotecas de cDNA de cromosomas simples como ha sido revisado en Price C.M., (1993) Blood Rev. 7: 127-134, y Trask B.J., (1991) Trends Genet. 7: 149-154. FISH (como se describe en Verma R.S. y Babu A., (1989) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York, N.Y.). Los resultados pueden correlacionarse con otras técnicas físicas de mapeado de cromosomas y datos de mapas genéticos. Ejemplos de datos de mapas genéticos pueden encontrarse en el 1994 Genome Issue of Science (265:1981f). La correlación entre la localización del gen que codifica las proteínas SF06 en un mapa cromosómico físico y una enfermedad o predisposición específica para una enfermedad específica, puede ayudar a delimitar la región del DNA asociada con dicha enfermedad genética.

Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse para detectar diferencias en secuencias de genes entre individuos normales, portadores o afectados. Puede realizarse un análisis de polimorfismos, v.g. polimorfismos de nucleótidos simples. Adicionalmente, pueden utilizarse la hibridación in situ de preparaciones cromosómicas y técnicas físicas de mapeado tales como el análisis de enlaces utilizando marcadores cromosómicos establecidos para extensión de mapas genéticos. A menudo, la ubicación de un gen en el cromosoma de otra especie de mamífero, tal como un ratón, puede revelar marcadores asociados incluso si el número o la rama de un cromosoma humano particular no se conocen. Pueden asignarse nuevas secuencias a ramas cromosómicas o parte de las mismas, por mapeado físico. Esto proporciona información valiosa para los investigadores que buscan genes de enfermedades utilizando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o el síndrome ha sido localizado aproximadamente por enlaces genéticos a una región genómica particular, por ejemplo AT a 11q22-23 (Gatti R.A. et al., (1988) Nature 336:577-580), cualesquiera secuencias que mapeen a dicha área pueden representar genes asociados o reguladores para investigación ulterior. Las secuencias de nucleótidos pueden utilizarse también para detectar diferencias en la localización cromosómica debidas a translocación, inversión, etc. entre individuos normales, portadores o afectados.

En otra realización de la invención, las proteínas SF06 pueden utilizarse para cribado de bibliotecas de compuestos en cualquiera de una diversidad de técnicas de cribado de fármacos. Es posible identificar efectores, v.g. receptores, enzimas, proteínas, ligandos, o sustratos que se fijan a, modulan o mimetizan la acción de una o más de las proteínas SF06. La proteína o fragmento de la misma empleada(o) en dicho cribado puede estar libre en solución, fijada a un soporte sólido, soportada sobre una superficie celular, o localizada intracelularmente. Puede medirse la formación de complejos de fijación, entre las proteínas SF06 y el agente testado. Los agentes podrían influir también, directa o indirectamente, en la actividad de las proteínas SF06.

Adicionalmente, la actividad de las proteínas SF06 contra su o sus sustratos fisiológicos o derivados de los mismos podría medirse en ensayos basados en células o exentos de células. Los agentes pueden interferir también con las modificaciones posteriores a la traducción de la proteína, tales como fosforilación y desfosforilación, farnesilación, palmitoilación, acetilación, alquilación, ubiquitinación, procesamiento proteolítico, localización subcelular y degradación. Además, los agentes podrían influir en la dimerización u oligomerización de las proteínas SF06 o bien, de una manera heteróloga, de las proteínas SF06 con otras proteínas, por ejemplo, pero no exclusivamente, proteínas de acoplamiento, enzimas, receptores, o factores de traducción. Los agentes podrían actuar también sobre la interacción física de las proteínas SF06 con otras proteínas, que se requieren para la función proteínica, por ejemplo, pero no exclusivamente, su señalización aguas abajo.

Los métodos para determinación de la interacción proteína-proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la fijación de un péptido marcado fluorescentemente derivado de la proteína de interacción a la proteína SF06, o viceversa, podría detectarse por un cambio de polarización. En el caso de que ambos miembros de la pareja de fijación, que pueden ser las proteínas de longitud total así como un miembro de la pareja de fijación como la proteína de longitud total y el otro representado justamente como un péptido estén marcados fluorescentemente, la fijación podría detectarse por transferencia de energía de fluorescencia (FRET) de un fluoróforo al otro. Adicionalmente, una diversidad de principios de ensayo disponibles comercialmente, adecuados para detección de la interacción proteína-proteína son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, pero no exclusivamente, los Ensayos Alpha Screen (Perkin Elmer) o de centelleo por proximidad (SPA) por Amersham. Alternativamente, la interacción de las proteínas SF06 con proteínas celulares podría ser la base para un ensayo de cribado basado en células, en el cual ambas proteínas están marcadas fluorescentemente y la interacción de ambas proteínas se detecta por análisis de la cotranslocación de ambas proteínas con un lector de formación de imágenes celulares, como ha sido desarrollado por ejemplo, pero no exclusivamente, por Cellomics o EvotecOAI. En todos los casos, los dos o más miembros de la pareja de fijación pueden ser proteínas diferentes, siendo una la proteína SF06, o en el caso de dimerización y/u oligomerización la proteína SF06 propiamente dicha.

De interés particular son ensayos de cribado para agentes que tienen una baja toxicidad para las células de mamífero. El término "agente", tal como se utiliza en esta memoria, describe cualquier molécula, v.g. proteína o compuesto farmacéutico, con la capacidad de alterar o mimetizar la función fisiológica de una o más de las proteínas SF06. Agentes candidato abarcan numerosas clases de productos químicos, aunque típicamente los mismos son moléculas orgánicas, preferiblemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular mayor que 50 y menor que aproximadamente 2500 Daltons. Los agentes candidato comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, e incluyen típicamente al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidato comprenden a menudo estructuras carbocíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas constituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores.

Agentes candidato se encuentran también entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos y derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Los agentes candidato se obtienen de una gran diversidad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para síntesis aleatoria y dirigida de una gran diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, con inclusión de la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales, o se producen fácilmente. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos naturales o producidos por síntesis se modifican fácilmente por medios convencionales químicos, físicos y bioquímicos, y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc. para producir análogos estructurales. En los casos en que el ensayo de cribado es un ensayo de fijación, una o más de las moléculas pueden unirse a un marcador, donde el marcador puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable.

Otra técnica que puede utilizarse para cribado de fármacos proporciona cribado de alta capacidad de compuestos que tienen afinidad de fijación adecuada para la proteína de interés, como se describe en la solicitud PCT publicada WO 84/03564. En este método, como se aplica a las proteínas SF06, grandes números de compuestos de test pequeños diferentes, v.g., aptámeros, péptidos, compuestos de peso molecular bajo etc., se proporcionan o sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como husillos de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de test se hacen reaccionar con las proteínas o fragmentos de las mismas, y se lavan. Las proteínas fijadas se detectan luego por métodos bien conocidos en la técnica. Las proteínas purificadas pueden aplicarse también directamente como recubrimiento sobre placas para uso en las técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Como alternativa, pueden utilizarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido. Pueden utilizarse ensayos de cribado competitivo de fármacos en los cuales anticuerpos neutralizantes capaces de fijar la proteína compiten específicamente con un compuesto de test para fijación de la proteína. De esta manera, los anticuerpos pueden utilizarse para detectar la presencia de cualquier péptido, que comparta uno o más determinantes antigénicos con la proteína. Compuestos que fijan proteínas SF06, v.g. anticuerpos, son útiles para la identificación o enriquecimiento de células, que son positivas para la expresión de las proteínas SF06, a partir de mixturas complejas de células. Tales poblaciones de células son útiles en trasplante, para evaluación experimental, y como fuente de productos específicos de linajes y células, con inclusión de especies de mRNA útiles en la identificación de genes expresados específicamente en estas células, y como diana para la identificación de factores de moléculas que pueden afectarlos. Las células que expresan la proteína SF06 o que han sido tratadas con la proteína SF06 son útiles en trasplante para proporcionar un receptor con células de los islotes pancreáticos, con inclusión de las células beta productoras de insulina; para cribado de fármacos; modelos experimentales de diferenciación e interacción de los islotes con otros tipos de células; ensayos de cribado in vitro que definen factores de crecimiento y diferenciación, y para caracterizar adicionalmente genes implicados en el desarrollo y la regulación de los islotes; y análogos. Para estos propósitos pueden utilizarse las células nativas, o bien pueden modificarse genéticamente las mismas para proporcionar capacidades alteradas. Pueden utilizarse como población de partida células procedentes de un páncreas en regeneración, del intestino anterior, estómago y duodeno embrionarios, o de otras fuentes de células pancreáticas progenitoras. Las células progenitoras pueden obtenerse de cualquier especie de mamífero, v.g. equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, roedores, v.g. ratones, ratas, hámster, primates, etc., en particular de la especie humana.

En otra realización, en un método de cribado de alta potencia, las células se transfectan con un constructo de DNA,

v.g. un vector viral o no viral que contiene un gen informador, v.g. el gen lacZ o el gen GFP, bajo control regulador de un promotor de un gen implicado en, por ejemplo, la diferenciación de las células beta, v.g. un promotor de un gen que estimula la diferenciación de las células beta, preferiblemente un promotor Pax4. Las células transfectadas se dividen en partes alícuotas y cada parte alícuota se pone en contacto con una sustancia de test, v.g., candidato 1, candidato 2 y candidato 3. La actividad del gen informador corresponde a la capacidad del compuesto de test para inducir la diferenciación de las células beta.

En una realización adicional, que puede combinarse con el cribado de alta potencia que se ha descrito arriba, se realiza una validación de potencia del medio. En ella, el compuesto de test se añade a las células madre que se cultivan y se determina la producción de insulina. Después de un ensayo inicial de alta potencia, tal como el ensayo basado en células reseñado anteriormente en el que por ejemplo se utiliza un promotor Pax4 como marcador para la

regeneración de las células beta, se testa la actividad de las moléculas candidato para inducir la diferenciación de las células beta en un ensayo de validación que comprende añadir dichos compuestos al medio de cultivo de los cuerpos embrioides. La diferenciación en células productoras de insulina se evalúa luego, v.g. por comparación con células de tipo salvaje y/o células ES que expresan Pax4 para evaluar la eficacia de un compuesto.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas SF06 pueden utilizarse para generar líneas de células y animales no humanos transgénicos. Estos animales transgénicos no humanos son útiles en el estudio de la función y regulación de las proteínas SF06 in vivo. Animales transgénicos no humanos, particularmente animales mamíferos transgénicos, pueden servir como sistema modelo para la investigación de muchos procesos del desarrollo y procesos celulares comunes a los humanos. Una diversidad de modelos no humanos de trastornos metabólicos pueden utilizarse para testar moduladores de la proteína SF06. La expresión incorrecta (por ejemplo, sobre-expresión o falta de expresión) de la proteína SF06, particularmente las condiciones de alimentación, y/o la administración de compuestos biológicamente activos pueden crear modelos de trastornos metabólicos.

En una realización de la invención, tales ensayos utilizan modelos de ratón de resistencia a la insulina y/o diabetes, tales como ratones portadores de silenciaciones de genes en el camino de la leptina (por ejemplo, ratones ob (leptina) o db (receptor de leptina)), como se ha descrito arriba. Además de testar la expresión de las proteínas SF06 en tales variedades de ratón (véanse los Ejemplos), estos ratones podrían utilizarse para testar si la administración de un modulador candidato altera por ejemplo la acumulación de lípidos en el hígado, en plasma o en los tejidos adiposos utilizando ensayos estándar bien conocidos en la técnica, tales como FPLC, ensayos colorimétricos, tests del nivel de glucosa en sangre, test de tolerancia a la insulina, y otros.

Pueden producirse animales transgénicos no humanos por recombinación homóloga en células madre embrionarias, donde el locus normal del gen que codifica la proteína SF06 está mutado. Alternativamente, un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína se inyecta en oocitos y se integra aleatoriamente en el genoma. Es posible expresar también los genes en tejidos en los que los mismos no se expresan normalmente o en momentos anormales del desarrollo. Adicionalmente, variantes de los genes como constructos específicos que expresan moléculas antisentido o expresión de mutaciones negativas dominantes, que bloquearán o alterarán la expresión de las proteínas SF06 pueden integrarse aleatoriamente en el genoma. Un marcador detectable, tal como lacZ o luciferasa puede introducirse en el locus de los genes, donde la regulación creciente de expresión de los genes dará como resultado un cambio fácilmente detectable en el fenotipo. Vectores para integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, cromosomas artificiales de levadura (YACs) y análogos. Los constructos de DNA para recombinación homóloga contendrán al menos porciones de los genes con la modificación genética deseada, e incluirán regiones de homología para el locus diana. Convenientemente, se incluyen marcadores para selección positiva y negativa. Los constructos de DNA para integración aleatoria no precisan contener regiones de homología para mediar la recombinación. Los constructos de DNA para integración aleatoria estarán constituidos por los ácidos nucleicos que codifican las proteínas, un elemento regulador (promotor), un intrón y una señal de poli-adenilación. Los métodos para generación de células que tienen modificaciones génicas direccionadas por recombinación homóloga se conocen en el campo. Para células madre embrionarias (ES), puede emplearse una línea de células ES, o pueden obtenerse células embrionarias recientemente de un hospedador, v.g., ratón, rata, cobayo, etc. Dichas células se cultivan sobre una capa apropiada fibroblastos-alimentador y se dejan crecer en presencia de factor inhibidor de la leucemia (LIF). Las células ES o embrionarias pueden transfectarse y utilizarse luego para producir animales transgénicos. Después de la transfección, las células ES se extienden en placas sobre una capa alimentadora en un medio apropiado. Las células que contienen el constructo pueden seleccionarse empleando un medio de selección. Después de un tiempo suficiente para que crezcan las colonias, las mismas se seleccionan y se analizan respecto a la existencia de recombinación homóloga. Las colonias que son positivas pueden utilizarse luego para manipulación de embriones y agregación de la mórula. Resumidamente, se obtienen mórulas de hembras superovuladas de 4 a 6 semanas de edad, se separa la Zona Pelúcida y se colocan las mórulas en pequeñas depresiones de una cápsula de cultivo de tejidos. Las células ES se tripsinizan, y las células modificadas se colocan en la depresión muy cerca de la mórula. Al día siguiente, los agregados se transfieren a las trompas uterinas de hembras pseudopreñadas. Las hembras se dejan llegar luego a término. Los descendientes quiméricos pueden detectarse fácilmente por un cambio en el color de la capa y se someten posteriormente a cribado respecto a la transmisión de la mutación a la generación siguiente (generación F1). La descendencia de la generación F1 se somete a cribado en cuanto a la presencia del gen modificado y los machos y hembras que presentan la modificación se aparean para producir progenie homocigótica. Si las alteraciones génicas causan letalidad en algún momento del desarrollo, los tejidos u órganos pueden mantenerse como injertos o trasplantes halogénicos o congénicos, o como cultivo in vitro. Los animales transgénicos pueden ser cualquier mamífero no humano, tal como un animal de laboratorio, animales domésticos, etc., por ejemplo, ratón, rata, cobayo, oveja, vaca, cerdo, y otros. Los animales transgénicos pueden utilizarse en estudios funcionales, cribado de fármacos, y otras aplicaciones y son útiles en el estudio de la función y regulación de las proteínas SF06 in vivo.

Las figuras muestran:

Fig. 1 muestra los resultados de hibridación in situ para la proteína FS01.

Fig. 1A muestra una hibridación in situ de montaje entero de páncreas embrionarios de ratón el día E11.5 (vista lateral).

Fig. 1B muestra un montaje completo de hibridación in situ de páncreas embrionario de ratón el día E11.5 (vista ventral; después de extirpación del hígado; aumento mayor de la región teñida).

Fig. 2 muestra la expresión de SF02 en tejidos de mamífero (ratón).

Fig. 2A muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF02 en tejidos de ratón de tipo salvaje (a los que se hace referencia como ratones wt) y con dieta de control (a la que se hace referencia como controldiet) tejidos.

Fig. 2B muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF02 en ratones genéticamente obesos (a los que se hace referencia como ratones ob/ob) comparados con ratones de tipo salvaje y en ratones alimentados con una dieta rica en grasa (a los que se hace referencia como ratones HFD) comparados con ratones alimentados con la dieta de control.

Fig. 3 muestra el análisis de microrredes de la expresión de SF02 en células adipocitos abdominales humanas, durante la diferenciación de preadipocitos en adipocitos maduros.

Fig. 4 muestra la expresión de SF03 en tejidos de mamífero (ratón).

Fig. 4A muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF03 en tejidos de tipo salvaje de ratón (a los que se hace referencia como ratones wt) y con dieta de control (a la que se hace referencia como controldiet).

Fig. 4B muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF03 en ratones genéticamente obesos (a los que se hace referencia como ratones ob/ob) comparados con ratones de tipo salvaje y ratones alimentados con una dieta rica en grasa (a los que se hace referencia como ratones HFD) comparados con ratones alimentados con una dieta de control.

Fig. 5 muestra el análisis de microrredes de la expresión de SF03 en células adipocito abdominales humanas durante la diferenciación de preadipocitos a adipocitos maduros.

Fig. 6 muestra la expresión de SF04 en tejidos de mamífero (ratón).

Fig. 6A muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF04 en tejidos de ratones de tipo salvaje (a los que se hace referencia como ratones wt) y con dieta de control (a los que se hace referencia como controldiet) (con inclusión del hígado).

Fig. 6B muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF04 en tejidos de ratón de tipo salvaje y tejidos con dieta de control (sin hígado).

Fig. 6C muestra el análisis PCR en tiempo real de la expresión de SF04 en ratones genéticamente obesos (a los que se hace referencia como ratones ob/ob) comparados con ratones de tipo salvaje y con ratones alimentados con una dieta rica en grasa (a los que se hace referencia como ratones HFD) comparados con ratones alimentados con una dieta de control.

Fig. 7 muestra los resultados de hibridación in situ para la proteína SF05.

Fig. 7A muestra una criosección de páncreas embrionario de ratón el día E17.5.

Fig. 7B muestra la criosección de páncreas embrionario de ratón el día E17.5 con un aumento mayor.

Fig. 8 muestra los resultados de hibridación in situ para la proteína SF06. Se muestra la criosección de páncreas embrionario de ratón el día E17.5.

Fig. 9 muestra el análisis de microrredes de la expresión de SF13 en adipocitos humanos durante la diferenciación de preadipocitos a adipocitos maduros.

Fig. 9A muestra el análisis de microrredes de la expresión de SF13 en adipocitos abdominales primarios humanos durante la diferenciación de preadipocitos en adipocitos maduros.

Fig. 9B muestra el análisis de microrredes de la expresión de SF13 en células humanas SGBS durante la diferenciación de preadipocitos en adipocitos maduros.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Identificación de factores secretados expresados en páncreas

Se llevó a cabo un cribado para factores secretados expresados en páncreas de ratón en desarrollo de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Pera E.M. y De Robertis E.M., (2000) Mech Dev 96(2): 183-195) con varias modificaciones.

Biblioteca de expresión de cDNA:

Durante la organogénesis, el primordio pancreático está rodeado e influenciado por el mesénquima asociado (véase, por ejemplo, Madsen O.D. et al., (1996) Eur. J. Biochem. 242: 435-445 y Slack, J.M., (1995) Development 121: 1569-1580). Recientemente, se ha sugerido que los adipocitos blancos se originan directamente de células mesenquimáticas (Atanossova P.K., (2003) Folia Med. 45:41-45). Durante la embriogénesis, pueden observarse la inervación y vascularización del páncreas. Por tanto, el tejido utilizado en el cribado podría haber contenido además de células pancreáticas algunos precursores de adipocitos, vasos sanguíneos, así como células neuronales.

Se preparó una biblioteca de primordios pancreáticos de ratón en la fase embrionaria 9.5-15 en un vector pCMVSPORT-6 utilizando el Sistema de Plásmido SUPERSCRIPT de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La biblioteca no amplificada se sometió a electroporación en células MaxEff DH10B (Invitrogen).

Clonación de la secreción

Se seleccionaron clones bacterianos con mondadientes estériles a partir de placas de agar y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos profundos en ampicilina LB (véase Sambrook et al., supra). Se agruparon partes alícuotas de 8 cultivos, y se aisló el DNA plasmídico utilizando el aparato BioRobot_9600 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen; Kit BioRobot Turbo QIAprep(r)). Se cultivaron células de cultivo 293 humanas en matraces de cultivo de tejidos de 75 ml en DMEM y suero de ternero fetal al 10%. Cuando se alcanzó el 90-99% de la confluencia, las células se dividieron en una ratio 1:3 y se extendieron sobre placas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (Sigma). Las células se transfectaron con 100-500 ng de plásmido utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). Después de 6 horas, se cambio el medio por medio completo de crecimiento reciente. 24 horas después de la transfección, se lavaron dos veces las células con DMEM sin cisteína y metionina (Invitrogen), suplementado con suero bovino dializado al 1% (Sigma) con 50 microgramos por ml de heparina (Sigma) y glutamina. Las células se marcaron radiactivamente ('S35 Met-Label', de Hartman Analytic GmbH). Después de 12 horas, se cosecharon partes alícuotas de los sobrenadantes en placas PCR de 96 pocillos y se sometieron a electroforesis en gel de SDS en geles Criterion prefundidos en gradiente de poliacrilamida 4020% (Biorad) en condiciones reductoras, utilizando una cámara de ejecución en gel Criterion Dodeca Cell (Biorad). Los geles se fijaron en 10% de ácido acético, 25% isopropanol durante 30 min, se impregnaron durante 15-30 min en reactivo AMPLIFY (Amersham), se secaron y se expusieron a film X-OMAT (AR) (Kodak). Los clones positivos se identificaron y dejaron crecer nuevamente en placas de 96 pocillos. El DNA de clones individuales se preparó y se utilizó para transfección como se ha descrito arriba. Si uno de los clones producía proteínas del mismo tamaño que el de la agrupación original, se identificó un clon positivo. Los clones positivos se secuenciaron parcialmente desde el extremo 5' (SEQLAB, Goettingen).

Ejemplo 2: Identificación de las secuencias humanas homólogas de ácido nucleico y proteínas

La expresión "polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en el número de Acceso a GenBank" se refiere al gen expresable de las secuencias de nucleótidos depositadas bajo el número de Acceso a GenBank correspondiente. La expresión "número de Acceso a GenBank" se refiere a las entradas en la base de datos NCBI GenBank (ref.: Benson D.A. et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:15-18).

Se identificaron secuencias homólogas a las secuencias de ratón utilizando el programa disponible públicamente BLASTP 2.2.3 de la base de datos de proteínas no redundante del National Center por Biotechnology Information (NCBI) (véase, Altschul S.F. et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402).

Las proteínas SF01-SF13 y moléculas de ácido nucleico que codifican las mismas pueden obtenerse de especies de insecto o de vertebrado, v.g. mamíferos o peces. Se prefieren particularmente moléculas de ácido nucleico y proteínas codificadas por ellas que comprenden secuencias SF01-SF13 humanas y SF01-SF13 de ratón identificadas en el "cribado de factores secretados", como se describe en la Tabla 2.

13 Tabla 2: Genes y proteínas de mamífero de la invención (SF01-SF13)

Nombre

Números de Acceso a Genbank

Genes y proteínas de Mus musculus

Genes y proteínas de Homo sapiens

cDNA

Proteína cDNA Proteína 5

20 Ejemplo 3: Análisis de la expresión de los ácidos nucleicos descritos en tejidos de mamífero (ratón)

Para analizar la expresión de los mRNAs descritos en esta memoria descriptiva en tejidos de mamífero, varias variedades de ratón (preferiblemente las variedades de ratón C57BI/6J, C57BI/6 ob/ob, C57BI/KS db/db, y los ratones No-Obesos-Diabéticos (NOD), que son sistemas modelo estándar en investigación de obesidad y diabetes) se adquirieron de Harlan Winkelmann (33178 Borchen, Alemania) y Taconic M&B (Germantown, NY 12526, EE.UU.), 25 respectivamente, y se mantuvieron a temperatura constante (preferiblemente 22ºC), 40% de humedad y un ciclo luz/oscuridad de, preferiblemente, 14/10 horas. Los ratones se alimentaron con una comida estándar (por ejemplo, de Ssniff Spezialitäten GmbH, número de pedido Ssniff M-Z V1126-000). En un experimento ulterior, se alimentaron ratones de tipo salvaje (wt) con una dieta de control (preferiblemente Altromin C1057 mod control, 4,5% de grasa bruta) o dieta rica en grasa (preferiblemente Altromin C1057 mod. rica en grasa, 23,5% grasa bruta). Los animales

30 se sacrificaron a la edad de 6 a 8 semanas. Los tejidos animales se aislaron de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica, se congelaron bruscamente en nitrógeno líquido y guardaron a -80ºC hasta que fueron necesarios.

Para analizar el papel de las proteínas descritas en la diferenciación in vitro de células de cultivo de células de mamífero para la conversión de preadipocitos en adipocitos, se obtuvieron células fibroblastos de mamífero (3T3-L1) 35 (v.g., Green H. y Kehinde O., (1974) Cell 1:113-116) de la Colección Americana de Cultivo de Tejidos (ATCC), Hanassas, VA, EE.UU.; ATCC-CL 173). Las células 3T3-L1 se mantuvieron como fibroblastos y se diferenciaron en adipocitos como se describe en la técnica anterior (v.g. Qlu Z. et al., (2001) J. Biol. Chem. 276: 11988-11995; Slleker

L.J. et al., (1998) BBRC 251: 225-229). Resumidamente, las células se extendieron en DMEM/10% FCS (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) a 50.000 células/pocillo por duplicado en cápsulas de plástico de 6 pocillos y se cultivaron en 40 una atmósfera humidificada de 5% CO2 a 37ºC. En la confluencia (definida como día 0: d0) se transfirieron las células a medio exento de suero (SF), que contenía DMEM/Ham F12 (3:1; Invitrogen), fetuina (300 !g/ml; Sigma, Múnich, Alemania), transferrina (2 !g/ml; Sigma), pantotenato (17 !M; Sigma), biotina (1 !M; Sigma), y EGF (0,8 nM; Hoffmann-La Roche, Basilea, Suiza). La diferenciación se indujo por adición de dexametasona (DEX; 1 !M; Sigma), 3-metil-isobutil-1-metilxantina (MIX; 0,5 mM, Sigma), e insulina de bovino (5 !g/ml; Invitrogen). Cuatro días después

45 de la confluencia (d4), se mantuvieron las células en medio SF, que contenía insulina de bovino (5 !g/ml) hasta que se completó la diferenciación. En diversos momentos del procedimiento de diferenciación, comenzando el día 0 (día de la confluencia) y el día 2 (adición de hormonas; por ejemplo, dexametasona y 3-isobutil-1-metilxantina), hasta 10 días de la diferenciación, se tomaron partes alícuotas de las células cada 2 días.

Se aisló el RNA de tejidos de ratón o células de cultivo de células utilizando el Reactivo Trizol (por ejemplo, de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se purificaron ulteriormente con el Kit RNAeasy (por ejemplo, de Qiagen, Alemania) en combinación con un tratamiento de DNasa de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y como es conocido por los expertos en la técnica. El RNA total se sometió a transcripción inversa (utilizando preferiblemente Transcriptasa Inversa RNasa H- SuperScript II, de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se sometieron a análisis Taqman, utilizando preferiblemente la Mixtura Master Taqman 2 x PCR (de Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania; la Mixtura contiene de acuerdo con el fabricante, por ejemplo DNA-polimerasa Gold AmpliTaq, AmpErase UNG, dNTPs con dUTP, la referencia pasiva Rox y componentes tampón optimizados) en un Sistema de Detección de Secuencias GeneAmp 5700 (de Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania).

Se utilizaron las parejas iniciador/sonda siguientes para el análisis Taqman (Número de Acceso a GenBank NM_178644 (ratón) para la secuencia SF02 de ratón):

Cebador directo SF02 de ratón (Seq ID NO:1): 5'- CGG ACA GCA TCA GCC TTG A -3'; cebador inverso SF02 de ratón (Seq ID NO:2): 5'- CCG CGA TGA AGG AGA TGA GA -3'; sonda Taqman SF02 de ratón (Seq ID NO:3): (5/6-FAM)- CTG CGC AAA CCC GAC GGC A -(5/6-TAMRA).

Se utilizaron las parejas iniciador/sonda siguientes para el análisis Taqman (Número de Acceso a GenBank NM_016697 (ratón) para la secuencia SF03 de ratón):

Cebador directo SF03 de ratón (Seq ID NO:4): 5'- GTT GTT CGC CAT GCC AAG A -3'; cebador inverso SF03 de ratón (Seq ID NO:5): 5'- CAA AAG CTT GTG GAG TCA GGC T -3'; sonda Taqman SF03 de ratón (Seq ID NO:6): (5/6-FAM)- ACA CCA ACG CCA TGT TCA AGA ATA ACT ACC C -(5/6-TAMRA).

Se utilizaron las parejas iniciador/sonda siguientes para el análisis Taqman (Número de Acceso a GenBank NM_007443 (ratón) para la secuencia SF04 de ratón):

Cebador directo SF04 de ratón (Seq ID NO:7): 5'- GGT ACA ACC TGG CGG TGG -3'; cebador inverso SF04 de ratón (Seq ID NO:8): 5'- GCT CAC GCT CAT CTT GTC CTT AA -3'; sonda Taqman SF04 de ratón (Seq ID NO:9): (5/6-FAM)- TGC CCG TGG CTG AGC CGC -(5/6-TAMRA).

La función de las SF02, SF03, y SF04 de mamífero en el metabolismo se validó ulteriormente por análisis de la expresión de los transcritos en diferentes tejidos.

En Fig. 2, 4, y 6, se muestra la expresión relativa de RNA en el eje Y. En Fig. 2, 4, y 6, los tejidos testados se indican en el eje X. "WAT" hace referencia a tejido adiposo blanco. En Fig. 2, 4, y 6, el panel de los tejidos de ratón de tipo salvaje comprende hígado, páncreas, músculo, intestino delgado, WAT, hipotálamo, y corazón, y el panel de los tejidos de ratón con dieta de control comprende hígado, músculo, intestino delgado, Wat, cerebro, y corazón.

La función de las proteínas SF02, SF03, y SF04 en el metabolismo se validó ulteriormente por análisis de la expresión de los transcritos en tejidos diferentes. Se utilizaron modelos de ratón de resistencia a la insulina y/o diabetes, tales como ratones portadores de genes silenciados en el camino de la leptina (por ejemplo, ratones ob/ob (leptina)

o ratones db/db (receptor de leptina/ligando)) para estudiar la expresión de las proteínas. Tales ratones desarrollan síntomas típicos de diabetes, exhiben acumulación de lípidos en el hígado y tienen frecuentemente niveles elevados de lípidos en plasma (véase Bruning J.C. et al. (1998) Mol. Cell. 2:559-569).

La expresión de los mRNAs que codifican las proteínas descritas se examinó también en ratones susceptibles de tipo salvaje (por ejemplo, C57BI/6) que presentan síntomas de diabetes, acumulación de lípidos, y niveles elevados de lípidos en plasma, si se alimentan con una dieta rica en grasa. Los estudios de determinación del perfil de expresión confirman la relevancia particular de las proteínas como reguladores del metabolismo de la energía en los mamíferos.

Estudios de determinación del perfil de expresión confirman la relevancia particular de SF02, SF03, y SF04 como reguladores del metabolismo de la energía en los mamíferos.

El análisis Taqman reveló que SF02 se expresa en varios tejidos de mamífero, exhibiendo un nivel máximo de expresión en el hígado, y niveles relativamente altos en otros tejidos, v.g. WAT, intestino delgado, corazón, cerebro, y músculo. Adicionalmente, SF02 se expresa a niveles menores pero todavía importantes en el hipotálamo y el páncreas como se representa en Fig. 2A. Los autores de la presente invención encontraron, por ejemplo, que la expresión de SF02 está regulada en sentido creciente en el músculo de los ratones ob/ob comparados con ratones de tipo salvaje (véase Fig. 2B). En ratones de tipo salvaje alimentados con una dieta rica en grasa, la expresión de SF02 está regulada en sentido creciente en el músculo y regulada en sentido decreciente en WAT comparada con los ratones alimentados con una dieta de control. La expresión elevada de SF02 en tejidos metabólicos activos (v.g. hígado y WAT) y la regulación de la expresión génica en diferentes modelos de ratón utilizados para estudiar los trastornos metabólicos como se ha descrito arriba, sugiere que la misma juega un papel en la regulación de la homeostasis de la energía.

El análisis Taqman reveló que SF03 se expresa en varios tejidos de mamífero, exhibiendo el nivel máximo de expresión en WAT e hipotálamo, y niveles relativamente altos en tejidos adicionales, v.g. cerebro y corazón. Adicionalmente, SF03 expresa a niveles menores pero todavía importantes en páncreas, músculo, intestino delgado, e hígado como se representa en Fig. 4A. Los autores de la presente invención encontraron, por ejemplo, que la expresión de SF03 está regulada en sentido creciente en músculo, hígado, e intestino delgado y regulada en sentido decrecimiento en el páncreas de los ratones ob/ob comparados con ratones de tipo salvaje (véase Fig. 4B). En ratones de tipo salvaje alimentados con una dieta rica en grasa, la expresión de SF03 no está regulada. La alta expresión de SF03 en WAT y en el hipotálamo, que se sabe está implicado en el control del apetito, así como la regulación de la expresión génica en el modelo de ratón para el síndrome metabólico como se ha descrito arriba, sugiere que la misma juega un papel en la regulación de la homeostasis de la energía.

El análisis Taqman reveló que SF04 se expresa en varios tejidos de mamífero, mostrando el nivel de expresión máximo en el hígado (Fig. 6A), y niveles menores pero todavía importantes en otros tejidos, v.g., intestino delgado, corazón, músculo, páncreas, WAT, cerebro, pero no en el hipotálamo, como se muestra en Fig. 6B. Los inventores encontraron, por ejemplo, que la expresión de SF04 está fuertemente regulada en sentido creciente en el hipotálamo y regulada en sentido decreciente en el corazón, músculo, y WAT de ratones ob/ob comparados con ratones de tipo salvaje (véase Fig. 6C). En ratones de tipo salvaje alimentados con una dieta rica en grasa, la expresión de SF04 está regulada en sentido creciente en el WAT y regulada en sentido decreciente en músculo, corazón, y cerebro cuando se compara con ratones sometidos a una dieta de control. Los altos niveles de expresión de SF04 en el hígado sugieren que la misma juega un papel esencial en el metabolismo. La regulación de la expresión génica en diferentes modelos de ratón utilizados para estudiar trastornos metabólicos como se han descrito arriba, sugiere que la misma juega también un papel en la regulación de la homeostasis de la energía.

Ejemplo 4: Análisis de la expresión diferencial de transcritos de las proteínas descritas en tejidos humanos

La preparación de RNA a partir de tejidos adiposos primarios humanos se realizó como se ha descrito en el Ejemplo

3. La preparación, hibridación, y escaneo de la diana se realizaron como se describe en el manual de los fabricantes (véase Affymetrix Technical Manual, 2002, obtenido de Affymetrix, Santa Clara, EE.UU.).

En Fig. 3, 5, y 9, el eje Y representa intensidad de fluorescencia y el eje X representa el eje de los tiempos. "d0" hace referencia al día 0 (comienzo del experimento), "d12" hace referencia al día 12 de diferenciación de los adipocitos.

El análisis de expresión (utilizando Affymetrix GeneChips) de los genes que utilizan diferenciación de adipocitos abdominales humanos primarios demuestra claramente la expresión diferencial de los genes humanos SF02, SF03 y SF13 en los adipocitos. Se realizaron varios experimentos independientes. Los experimentos demuestran que los transcritos SF02 y SF03 son más abundantes el día 12 comparado con el día 0 durante la diferenciación (véase Fig. 3 y 5) y que el transcrito SF13 es muy abundante el día 0 comparado con el día 12 durante la diferenciación (véase Fig. 9). Así pues, las proteínas SF02 y SF03 tienen que incrementarse, y las proteínas SF13 tienen que reducirse a fin de que los preadipocitos se diferencien en adipocitos maduros. Las proteínas SF02 y SF03 en los preadipocitos tiene el potencial de mejorar la diferenciación adiposa, y la proteína SF13 en los preadipocitos tienen el potencial de inhibir la diferenciación adiposa. Por consiguiente, las proteínas SF02, SF03, y SF13 jugaban un papel esencial en la regulación del metabolismo humano, en particular en la regulación de la adipogénesis y por consiguiente ello podría ser un papel esencial en enfermedades pancreáticas (v.g. diabetes), obesidad, y/o síndrome metabólico.

Ejemplo 5: Hibridaciones in situ

Se analizaron hibridaciones de montaje entero y seccional in situ de acuerdo con protocolos estándar que son conocidos por los expertos en la técnica y como se ha descrito previamente (por ejemplo, Pelton, R.W. et al., (1990) Development 110, 609-620, Belo, J.A. et al., (1997) Mech. Dev. 68, 45-57).

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína SF01 de ratón se expresa en el páncreas ventral (véase Fig. 1). Las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas SF05 de ratón (véase Fig. 7) y SF06 de ratón (véase Fig. 8) se expresan en el páncreas.

Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debe considerarse indebidamente limitada a tales realizaciones específicas. De hecho, diversas modificaciones de los modos descritos para realización de la invención que son obvias para los expertos en biología molecular o campos afines, debe considerarse que están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

16 LISTADO DE SECUENCIAS

Proteína: NP_114115

Proteína: NP_848759

Proteína: NP_848602

Proteína: NP_057906

Proteína: NP_004475

Proteína: NP_031469

Proteína: NP_001624

Proteína: NP_033276

Proteína: NP_005016

Proteína: NP_766221

Proteína: NP_872317

Proteína: NP_081116

Proteína: NP_006198

Proteína: NP_062670

Proteína: NP_062555

Proteína: NP_647456

Proteína: NP_644808

Proteína: NP_083844

Proteína: NP_002395

Proteína: NP_034106 Proteína: NP_000090

Proteína: NP_034310

Proteína: NP_006477

Proteína: NP_035279

Proteína: NP_000933

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de una composición que comprende una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 y/o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32, siendo preferiblemente la molécula de ácido nucleico una molécula de DNA, más preferiblemente una molécula de cDNA o DNA genómico, y opcionalmente portadores, diluyentes, y/o aditivos farmacéuticamente aceptables para la preparación de un agente para detección de enfermedades o disfunciones seleccionadas del grupo constituido por diabetes, obesidad, y/o síndrome metabólico.

2. 2.

   Uso de una composición que comprende una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 y/o una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32, siendo dicha molécula de ácido nucleico preferiblemente una molécula de DNA, más preferiblemente una molécula de cDNA o DNA genómico, y opcionalmente portadores, diluyentes, y/o aditivos farmacéuticamente aceptables para la preparación de un medicamento para el tratamiento, alivio y/o prevención de enfermedades o disfunciones seleccionadas del grupo constituido por diabetes, obesidad, y/o síndrome metabólico.

3. 3.

   Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico SF06 de mamífero como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32, que codifica particularmente el polipéptido humano SF06 como se caracteriza por SEQ ID NO: 32 y/o una molécula de ácido nucleico, que es complementaria al mismo.

4. 4.

   Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo constituido por

   (a)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, teniendo el polipéptido una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32, o una isoforma del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32;

   (b)

   una molécula de ácido nucleico que comprende o es la molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32;

   (c)

   una molécula de ácido nucleico que está degenerada, como resultado del código genético, con las secuencias de ácido nucleico que se definen en (a) o (b);

   (d)

   una molécula de ácido nucleico que se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 x SSC y 0,1% SDS a una molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación 3 o como se define en (a) a (c) y/o una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la misma;

   (e)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y hasta 99,6% idéntico al SF06 humano como se define en la reivindicación 3 o a un polipéptido como se define en (a).

5. 5.

   Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico recombinante y/o un vector, particularmente un vector de expresión y/o una sonda de hibridación, un cebador o un oligonucleótido antisentido.

6. 6.

   Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el polipéptido es un polipéptido recombinante y/o un polipéptido de fusión.

7. 7.

   Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para monoterapia o terapia de combinación junto con al menos un agente farmacéutico adicional, seleccionándose el al menos un agente farmacéutico adicional del grupo constituido por derivados de 2-amino-1,3-propanodiol, hidrocloruro de 2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]propano-1,3-diol, 40-O(2-hidroxietil)-rapamicina, SDZ-RAD, Everolimus, 6-(3-dimetil-aminopropionil)-forskolina, 6mercaptopurina (6-MP), A-420983, ABX-CBL (CBL-1), Alefacept, inhibidor ICAM-1 antisentido (ISIS 2302), Enlimomab, BIRR1, Alicaforsén, Inmunoglobulina antitimocitos (ATGAM), Azatioprina, Baohuosido-1, basiliximab, BMS279700, BTI-322, Cladribina, CP- 690550, Ciclofosfamida (CTX), Ciclosporina (ciclosporina A, ciclosporina), Daclizumab, HAT (Anti-Tac humanizado), Anti-Tac SMART, anti-CD25, receptor anti-IL2 humanizado, Dexametasona (Decadrón, Dexona, Dexasona), DIAPEP-277, dipéptido de ácido borónico (DPBA), ácido docosahexaenoico (DHA), efalizumab, Efomicina M, FTY720 (derivado de miriocina oral), Glatiramer acetato (copolímero-1), proteína ácida Glial Fibrilar (GFAP), Gusperimus (15-desoxiespergualina), péptido HLA-B2702, hu1124 (anti-CD11a), hOKT31y (Ala-Ala), Infliximab, Interferón, ISAtx247, isotretinoína, L-683,742, Leflunomida (ARAVA), Medi-500 (T10B9), Medi507, Metotrexato, Mitoxantrona, micofenolato-mofetil, OKT4A, Muromonab-CD3, Prednisolona, Psora-4, Rifampicina, Rituximab, S100�, Sirolimus, Rapamicina, Tacrolimus (Prograf; FK-506), o Triptolida.

8. 8.

   Método de identificación de un (poli)péptido implicado en la regulación de la homeostasis de la energía y/o el metabolismo en un mamífero, que comprende los pasos de

   (a)

   poner en contacto una colección de (poli)péptidos con un polipéptido SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 o una proteína SF06 codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

   (i)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, teniendo el polipéptido una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 30 ó SEQ ID NO: 32, o una isoforma del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 30 ó SEQ ID NO: 32;

   (ii)

   una molécula de ácido nucleico que comprende o es la molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 30 ó SEQ ID NO: 32;

   (iii) una molécula de ácido nucleico que está degenerada, como resultado del código genético, con las secuencias de ácido nucleico como se definen en (i) o (ii);

   (iv)

   una molécula de ácido nucleico que se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 x SSC y 0,1% de SDS a un ácido nucleico SF06 de mamífero como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 o como se defina en (i) a (iii) y/o una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la misma;

   (v)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y hasta 99,6% idéntico al SF06 humano como se caracteriza por SEQ ID NO: 32 o a un polipéptido como se defina en (i) en condiciones que permiten la fijación de dicho o dichos (poli)péptidos;

   (b)

   retirar los (poli)péptidos que no se fijan y

   (c)

   identificar los (poli)péptidos que se fijan a dicho polipéptido SF06 como se caracteriza por SEQ ID Nos: 30 ó 32 o a dicha proteína SF06 codificada por un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por

   (i)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, teniendo el polipéptido una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32, o una isoforma del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32;

   (ii)

   una molécula de ácido nucleico que comprende o es la molécula de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 32;

   (iii) una molécula de ácido nucleico que está degenerada, como resultado del código genético, con las secuencias de ácido nucleico que se definen en (i) o (ii);

   (iv)

   una molécula de ácido nucleico que se hibrida a 50ºC en una solución que contiene 1 x SSC y 0,1% SDS a un ácido nucleico SF06 de mamífero como se caracteriza por SEQ ID NOs: 30 ó 32 o como se defina en (i) a (iii) y/o una molécula de ácido nucleico que es complementaria de la misma;

   (v)

   una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 85%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98% y hasta 99,6% idéntica a la SF06 humana como se caracteriza por SEQ ID NO: 32 o a un polipéptido como se defina en (i) en condiciones que permiten la fijación de dicho o dichos (poli)péptidos.

9. 9.

   Método para cribado de un agente, que afecta/modula la actividad de un polipéptido SF06 como se caracteriza por SEQ ID NOs: 30 ó 32, que comprende los pasos de

   (a) incubar una mixtura que comprende

   (aa) un polipéptido SF06 como se caracteriza por SEQ ID NO: 30 ó 32; y

   (ab) un agente candidato

   en condiciones en las cuales dicho polipéptido SF06 o fragmento del mismo exhibe una actividad de referencia,

   (b)

   detectar la actividad de dicho polipéptido SF06 para determinar una actividad para el agente; y

   (c)

   determinar una diferencia entre la actividad para el agente y la actividad de referencia.

   parte del lóbulo hepático

   Región del páncreas ventral

   intestino Región del páncreas ventral