JP2017511133A - 新規の方法、ポリペプチド、及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のための方法、このような方法によって得ることができるポリペプチド、ならびに医薬品、化粧品、及び産業における該ポリペプチドの使用を提供する。具体的に、本発明は、大西洋タラからのトリプシンＩの組換えにより発現された変異体を提供し、これらの変異体は、タラから精製された野生型トリプシンに対して向上した安定性及び／または触媒性を呈する。【選択図】図２

Description

本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のための方法、このような方法によって得ることができるポリペプチド、ならびに医薬品、化粧品、及び産業における該ポリペプチドの使用に関する。

タンパク質内のペプチド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、またはタンパク質分解酵素としても知られ［１］（非特許文献１）、反応の活性化エネルギーを低下させることによって、特定の生体反応の速度を加速するように機能する［２］（非特許文献２）。プロテアーゼは、多くの場合、消化に関連するプロセスに関与するだけであると想定されるが、ヒトゲノムの２％超が、プロテアーゼ遺伝子をコードするという事実は、それらが消化のみよりも複雑な機能を行うことを示唆する［３］（非特許文献３）。実際に、プロテアーゼは、増殖因子から受容体まで多くの細胞成分の調節、ならびに免疫、補体カスケード、及び血液凝固を含むプロセスに関与することが示されている［３］（非特許文献３）。恒常プロセスにおける関与に加えて、プロテアーゼの活性の増加または調節不全は、腫瘍増殖及び侵襲とのその関係によって癌に関与している［４］（非特許文献４）。

簡潔に言えば、プロテアーゼは、最初に不活性前駆体またはチモーゲンとして生成され、特定の臓器または場所に分散され、それらがタンパク質分解切断によって活性化されるまで、触媒能力をほとんど有しない［５］（非特許文献５）。更に、プロテアーゼの活性を制御する翻訳後機構としては、ホスホリル化、共因子結合、ならびに小胞または顆粒中の酵素及び／または基質の分離が挙げられる。加えて、有効濃度の活性酵素を、プロテアーゼ阻害剤によって厳密に制御することもでき、プロテアーゼとの複合体を形成することによって機能効能を低減し、タンパク質分解活性を効果的に「均衡させる」ことができる。

プロテアーゼは、数十年間にわたって医療に使用されており、確立された十分に耐用性のあるクラスの治療薬である［３］（非特許文献３）。公開された文献において早くに記されたプロテアーゼの使用は、１００年以上前に出現した［７〜９］（非特許文献６〜８）。一般に、プロテアーゼは、４つの分野、すなわち、経口投与薬による胃腸障害の管理、抗炎症薬として、血栓塞栓性疾患のための血栓溶解薬として、及び創傷清拭のための局所投与薬として使用されている［１０］（非特許文献９）。１９７８年のプロテアーゼ薬（ウロキナーゼ、血栓及びカテーテル清掃のために指示されるセリンプロテアーゼ）の最初の承認以降、更に１１の薬物が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって治療用途のために承認された［３］（非特許文献３）。これらの大半は、血液障害の治療のために指示され、血栓溶解薬（アルテプラーゼ、レテプラーゼ、及びテネクテプラーゼ）ならびに凝血原（第ＩＸ因子、第ＶＩＩａ因子、トロンビン、及びバンデージ中の外用トロンビン）が挙げられる。他の承認されたプロテアーゼ治療薬は、消化（パンクレリパーゼ）、筋痙攣のため、及び薬用化粧品（薬効または薬物様利益を有することが意図された生物学的活性成分を有する化粧品、ボツリヌス毒素Ａ及びボツリヌス毒素Ｂ）として示される［３］（非特許文献３）。

米国ＦＤＡによってこれまでに承認されたプロテアーゼは、存在する、または適温に順応した一連の哺乳動物または細菌、すなわち、中温生物を起源としている。より有効かつより柔軟なプロテアーゼの追及において、寒冷環境からの生物から誘導された分子の治療可能性が検討されている。寒冷環境で繁殖する３つの生物域からのそのような生物（細菌、古細菌、真核生物）（すなわち、好冷生物）は、概して高い比活性、低い基質親和性、ならびに低温及び中温での高い触媒速度を有する酵素を発達させている［１８〜２０］（非特許文献１０〜１２）。一般に、中温異型と比較したとき、好冷性酵素におけるより優れた柔軟性の特性は、プロテアーゼが、より低いエネルギー費で基質と相互作用し、形質転換するのを可能にする。好冷性プロテアーゼの触媒部位は、基質により容易に適応することができるため、比較的容易な相互作用が可能である［２０］（非特許文献１２）。しかしながら、この増加した柔軟性は、多くの場合、安定性のトレードオフを伴う［２１］（非特許文献１３）。したがって、哺乳類類似体とは対照的に、好冷性プロテアーゼは、熱、低ｐＨ、及び自己分解による不活性化により敏感である［１８、１９、２１〜２５］（非特許文献１０、１１、１３〜１７）。

好冷性プロテアーゼは、大西洋タラ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）またはナンキョクオキアミ（Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ）などの生物源から得られているが、好適な量の同種冷順応プロテアーゼの大規模生成は、組換え技術を使用して得ることができる。多様な魚酵素及びプロテアーゼが、既に微生物において特定、クローン化及び発現されている［３６］。治療目的の他のプロテアーゼの生成において、非ヒト起源または生成宿主が好ましく、それにより汚染の可能性を回避することができる。したがって、承認された哺乳類（組換え）治療タンパク質、例えば、血栓因子（組換えチャイニーズハムスターの卵巣またはベビーハムスター腎臓細胞から）、血栓溶解薬（大腸菌から）、またはボツリヌス毒素（クロストリジウム・ボツリヌム）を生成するために、組換え技術が広く用いられている［３］（非特許文献３）。したがって、組換え技術を通じて冷順応プロテアーゼを生成する可能性を探求することが望ましいと考えられる。これを研究室で行ういくつかの試みが、ある程度成功している。しかしながら、組換え冷順応酵素の大規模生成は、いくつかの複雑な因子、例えば、短い半減期及び冷順応酵素の自己分解活性と関連し、これがより標準化した産業条件及び温度下での生成を困難にする。

本発明は、冷順応トリプシンなどの、大規模生成に適している組換えセリンプロテアーゼポリペプチドの生成のための方法を提供することによって、これらの問題の克服に努める。

本発明は更に、天然起源から精製されたセリンプロテアーゼと比較して、安定性及び触媒活性などの向上した特性を有する変異体セリンプロテアーゼポリペプチドを提供することを目的とする。

Ｋｕｄｄｕｓ Ｍ，Ｒａｍｔｅｋｅ ＰＷ．Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２；３８：３３０−８． Ｆｅｉｎ Ｈ，Ｍａｙｔｉｎ ＥＶ，Ｍｕｔａｓｉｍ ＤＦ，Ｂａｉｌｉｎ ＰＬ．Ｔｏｐｉｃａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ａｂｌａｔｉｏｎ：ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｕｒｇ．２００５；３１：１３９−４７． Ｃｒａｉｋ ＣＳ，Ｐａｇｅ ＭＪ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＥＬ．Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２０１１；４３５：１−１６． Ｄｕｆｆｙ ＭＪ，ＭｃＧｏｗａｎ ＰＭ，Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＷＭ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｃｈａｎｇｉｎｇ ｖｉｅｗｓ．Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００８；２１４：２８３−９３． Ｓｃｏｔｔ ＣＪ，Ｔａｇｇａｒｔ ＣＣ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．２０１０；９２：１６８１−８． Ｍｏｒｒｉｓ ＲＴ．Ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｐｅｐｓｉｎ ｕｐｏｎ ｓｌｏｕｇｈｓ，ｃｏａｇｕｌａ，ａｎｄ ｍｕｃｏｐｕｓ．ＮＹ Ｍｅｄ Ｊ．１８９１；５３：４２４−６． Ｍｏｒａｎｉ ＡＤ．Ｔｒｙｐｓｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｕｌｃｅｒｓ．Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ．１９５３；１１：３７２−９． Ｒａｐｏｐｏｒｔ Ｃ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓｌｙｍｐｈａｄｅｎｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ ｆｉｓｔｕｌａｅ．Ｄｉｓ Ｃｈｅｓｔ．１９５８；３４：１５４−６１． Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ Ａ，Ｐａｌｓｄｏｔｔｉｒ ＨＭ．Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｏｄ ｔｒｙｐｓｉｎｓ：ｆｒｏｍ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；７：７７−８８． Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ＫＳ，Ｃａｖｉｃｃｈｉｏｌｉ Ｒ．Ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６；７５：４０３−３３． Ｌｏｎｈｉｅｎｎｅ Ｔ，Ｇｅｒｄａｙ Ｃ，Ｆｅｌｌｅｒ Ｇ．Ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｙ ｅｘｐｌａｉｎ ｌｏｃａｌ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０００；１５４３：１−１０． Ａｇｈａｊａｒｉ Ｎ，Ｖａｎ Ｐｅｔｅｇｅｍ Ｆ，Ｖｉｌｌｅｒｅｔ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ ｒｅｖｅａｌ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２００３；５０：６３６−４７． Ｇｅｒｄａｙ Ｃ，Ａｉｔｔａｌｅｂ Ｍ，Ｂｅｎｔａｈｉｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄｅｎｚｙｍｅｓ：ｆｒｏｍ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｔｏ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８：１０３−７． Ａｓｇｅｉｒｓｓｏｎ Ｂ，Ｆｏｘ ＪＷ，Ｂｊａｒｎａｓｏｎ ＪＢ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｏｉｋｉｌｏｔｈｅｒｍ Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ．Ｅｕｒ ＪＢｉｏｃｈｅｍ．１９８９；１８０：８５−９４． Ｏｓｎｅｓ ＫＫ，Ｍｏｈｒ Ｖ．Ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｎｉｏｎｉｃ，ｓｅｒｉｎｅ−ｔｙｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｋｒｉｌｌ，Ｅｕｐｈａｕｓｉａ ｓｕｐｅｒｂａ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ．１９８５；８２：６０７−１９． Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ Ｂ，Ｈｅｌｇａｄｏｔｔｉｒ Ｌ，Ｏｌａｆｓｄｏｔｔｉｒ Ｓ，Ｇｕｄｍｕｎｄｓｄｏｔｔｉｒ Ａ，Ｂｊａｒｎａｓｏｎ ＪＢ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｏｄ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉ−ｋｉｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ａｕｔｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０；１５５：１８６−９４． Ｌｅｉｒｏｓ ＨＫ，Ｗｉｌｌａｓｓｅｎ ＮＰ，Ｓｍａｌａｓ ＡＯ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｔｒｙｐｓｉｎｓ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；２６７：１０３９−４９．

本発明の第１の態様は、セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のための方法であって、
（ａ）微生物宿主細胞またはその集団を、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドのＮ末端に融合された活性化ペプチドを含むチモーゲンポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換することであって、
チモーゲンポリペプチドが、シグナル配列を欠失する、形質転換することと、
（ｂ）該チモーゲンポリペプチドを、宿主細胞（複数可）内で封入体として発現させることと、
（ｃ）チモーゲンポリペプチドを、宿主細胞（複数可）から精製することと、
（ｄ）チモーゲンポリペプチドを、トリプシンなどのプロテアーゼへの曝露によって活性化することと、を含み、
ステップ（ｃ）が、チモーゲンポリペプチドを封入体から可溶化することと、ポリペプチドを生物活性形態にリフォールディングすることと、を含む、方法を提供する。

ひいては、本発明は、セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のためのインビトロ方法を提供する。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドとは、セリンがポリペプチドの活性部位において求核性アミノ酸として機能する（ＥＣ番号３．４．２１に従い定義されるとおり）、タンパク質中のペプチド結合を切断することができる、天然に存在する触媒ポリペプチド及び非天然に存在する触媒ポリペプチドの両方を含む。セリンプロテアーゼ活性は、キモトリプシン様（すなわち、トリプシン、キモトリプシン、及びエラスターゼ）またはスブチリシン様であってもよい。

一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、トリプシン活性を呈する。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物もしくは原核生物起源のいずれかの天然に存在するトリプシン、またはこのようなトリプシンの変異バージョンであってもよい。具体的には、冷順応トリプシン、例えば、大西洋タラ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）、大西洋及び太平洋サケ（例えば、タイセイヨウサケ及びタイヘイヨウサケの種）、及びスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）からのトリプシン、ならびにその変異形態が挙げられる（下で詳述されるとおり）。

トリプシンの３つの主要なイソ酵素は、大西洋タラから特性化され、トリプシンＩ、ＩＩ、及びＩＩＩと指定されている（Aｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０：８５−９４を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＯ９０３９７を参照されたい。

加えて、大西洋タラは、キモトリプシンＡ及びＢと指定される、キモトリプシンの２つの主要なイソ酵素を発現する（Aｓｇｅｉｒｓｓｏｎ ＆ Ｂｊａｒｎａｓｏｎ，１９９１，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂ ９９８：３２７−３３５を参照されたい。この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ５５２４２．１を参照されたい。

一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、大西洋タラ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）からのトリプシンＩのアミノ酸配列、すなわち、配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

［配列番号１］

（アミノ酸配列及びナングバリングは、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う）。

多くのプロテアーゼと同様に、大西洋タラからのトリプシンＩは、不活性前駆体またはチモーゲンとして生成され、切断されて成熟活性トリプシンを生成するプロペプチド（または「活性化」）配列を含む。トリプシンの初期発現生成物はまた、発現後に除去されるシグナル配列を含む。

シグナル配列を含む大西洋タラからのトリプシンのチモーゲン配列は、配列番号２として下に示される（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受入番号Ｐ１６０４９−１に対応する）。

［配列番号２］

シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、標準２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸、及びそれらの対応する「Ｄ」形態の立体異性体（天然「Ｌ」形態と比較して）、ω−アミノ酸及び他の天然に存在するアミノ酸、非定型的アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、ならびに化学的に誘導体化されたアミノ酸を含む（下記を参照されたい）。

アミノ酸が、「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」などと具体的に列挙されているとき、この用語は、特に明白に記述されない限り、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指す。他の非定型的アミノ酸はまた、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、本発明のポリペプチドに適した成分であってもよい。示されるポリペプチドの場合、各コードされたアミノ酸残基は、適切な場合、従来のアミノ酸の慣用名に対応する単一文字の名称によって表される。

慣例に従い、本明細書で開示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端方向に提供される。

典型的に、本発明の組成物に使用されるポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含む、またはそれからなる。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。

したがって、一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。

しかしながら、ポリペプチドは、代替として、配列番号１の変異体または異型であるアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。「異型」とは、ポリペプチドが、配列番号１と１００％のアミノ酸配列同一性を共有しないことを意味し、すなわち、配列番号１の１つ以上のアミノ酸が変異されなければならない。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性、より好ましくは、該配列と少なくとも６０％、７０％、もしくは８０％、もしくは８５％、もしくは９０％の同一性、最も好ましくは、該アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。したがって、指定位置でのアミノ酸は、欠失、置換されてもよく、または１つ以上のアミノ酸の挿入／付加の部位であってもよい。置換が保存的または非保存的であってもよいことは、当業者によって理解されるであろう。

同一性のパーセントは、例えば、ＬＡＬＩＧＮプログラム（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）によって、Ｅｘｐａｓｙ施設サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）において、パラメータとしてグローバルアラインメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップペナルティ−１４、伸長ギャップペナルティ−４を使用して決定され得る。代替として、２つのポリペプチド間の配列同一性のパーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューティンググループのＧＡＰプログラムを使用して決定されてもよく、同一性のパーセントは、それらの配列が最適に整列されたポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。

この整列は、代替として、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用して実行されてもよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されるとおり、参照により本明細書に組み込まれる）。使用されるパラメータは、以下のとおりであってもよい。
−ファストペアワイズ整列パラメータ：Ｋ−タプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナルの数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
−多重整列パラメータ：ギャップ開始ペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
−スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。

代替として、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して、ローカル配列アラインメントを決定することができる。

したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１の異型であり得る。

一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下のアミノ酸位置からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号１または２の異型である（同じ変異部位が２つの代替ナンバリングシステムを参照して定義され得る）。
タンパク質データバンク［ＰＤＢ］エントリー２ＥＥＫ！（配列番号１）を参照して定義される：
Ｅ２１、Ｈ２５、Ｈ２９、Ｖ４７、Ｋ４９、Ｄ５０、Ｌ６３、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｒ７４、Ｎ７６、Ｔ７９、Ｙ８２、Ｓ８５、Ｓ８７、Ｎ９８、Ｉ９９、Ｖ１２１、Ｍ１３５、Ｖ１３８、Ｍ１４５、Ｖ１４８、Ｄ１５０、Ｋ１５４、Ｌ１６０、Ｍ１７５、Ｓ１７９、Ａ１８３、Ｌ１８５、Ｖ２１２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ａ２２９、Ｖ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３８、Ｍ２４２、Ｎ２４４、及び／またはＹ２４５。
ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ１６０４９−１ ９（配列番号２）を参照して定義される：
Ｅ２５、Ｈ２９、Ｈ３３、Ｖ４９、Ｋ５１、Ｄ５２、Ｌ６５、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｒ７５、Ｎ７７、Ｔ８０、Ｙ８３、Ｓ８６、Ｓ８８、Ｎ９９、Ｉ１００、Ｖ１２２、Ｍ１３４、Ｖ１３７、Ｍ１４４、Ｖ１４７、Ｄ１４９、Ｋ１５２、Ｌ１５８、Ｍ１７３、Ｓ１７７、Ａ１８１、Ｌ１８４、Ｖ２０８、Ｙ２１３、Ｐ２２１、Ａ２２５、Ｖ２２９、Ｌ２３０、Ｖ２３４、Ｍ２３８、Ｎ２４０、及び／またはＹ２４１。

したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む配列番号１の異型であってもよい。
タンパク質データバンク［ＰＤＢ］エントリー２ＥＥＫ！（配列番号１）を参照して定義される：
Ｅ２１Ｔ、Ｈ２５Ｙ、Ｈ２９（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４７Ｉ、Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｌ６３Ｉ、Ｈ７１Ｄ、Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７６（Ｔ／Ｌ）、Ｔ７９（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８２Ｆ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８７（Ｋ／Ｒ）、Ｓ８９Ｒ、Ｎ９８Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｍ１３５Ｑ、Ｖ１３８Ｉ、Ｍ１４５（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４８Ｇ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１６０（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７５（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７９Ｎ、Ａ１８３Ｖ、Ｌ１８５Ｇ、Ｖ２１２Ｉ、Ｙ２１７（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２９Ｖ、Ｖ２３３Ｎ、Ｌ２３４Ｙ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ、Ｎ２４４Ｓ、及び／またはＹ２４５Ｎ。
ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ１６０４９−１及び（配列番号２）を参照して定義される：
Ｅ２５Ｔ、Ｈ２９Ｙ、Ｈ３３（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４９Ｉ、Ｋ５１Ｅ、Ｄ５２Ｑ、Ｌ６５Ｉ、Ｈ７２Ｄ、Ｈ７３Ｎ、Ｒ７５（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７７（Ｔ／Ｌ）、Ｔ８０（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８３Ｆ、Ｓ８６Ａ、Ｓ８８（Ｋ／Ｒ）、Ｎ９９Ｔ、Ｉ１００Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｍ１３４Ｑ、Ｖ１３７Ｉ、Ｍ１４４（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４７Ｇ、Ｄ１４９Ｓ、Ｋ１５２（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１５８（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７３（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７７Ｎ、Ａ１８１Ｖ、Ｌ１８４Ｇ、Ｖ２０８Ｉ、Ｙ２１３（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２１Ｙ、Ａ２２５Ｖ、Ｖ２２９Ｎ、Ｌ２３０Ｙ、Ｖ２３４Ｉ、Ｍ２３８Ｉ、Ｎ２４０Ｓ、及び／またはＹ２４１Ｎ。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下の定義された変異またはそれらの組み合わせ（表１）のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。

同様に、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下の定義された変異またはそれらの組み合わせ（表２）を有する配列番号１のアミノ酸を含み得る、またはそれからなり得る。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが配列番号２（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１６０４９−１）における変異（複数可）を参照して定義される上記表１及び２において、成熟プロテアーゼが、そのＮ末端アミノ酸としてＩ２０で始まる。しかしながら、典型的に、そのＮ末端に活性化配列を有するチモーゲンポリペプチドとして最初に発現される（下記を参照されたい）。

好ましい一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、２５位にヒスチジンを含まない配列番号１のアミノ酸配列の異型である。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る（表１の「ＥＺＡ−０１６」、Ｈ２５Ｎ変異を含む。下記の配列内のボックスを参照されたい）。

［配列番号３］

好ましい代替実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、１６０位にリジンを含まない配列番号１のアミノ酸配列の異型である。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る（表１の「ＥＺＡ−０３４」、Ｌ１６０Ｉ変異を含む。下記の配列内のボックスを参照されたい）。

［配列番号４］

上記の特定された変異（大西洋タラのトリプシンＩのアミノ酸配列、配列番号１を参照して定義される）はまた、他の種からのトリプシン中で作製され得る。例えば、配列番号３及び４で強調表示される特定の変異は（それぞれ、配列番号１及びＰＤＢ ２ＥＥＫ！を参照してＨ２５Ｎ及びＬ１６０Ｉ）、スケトウダラからのトリプシン中で作製され得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ７０４７６．３を参照されたい。活性トリプシンのアミノ酸配列は、Ｉ２０位で始まり、それによりＨ２５は、ＢＡＨ７０４７６．３のＨ２９などに対応する）。

代替実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、天然に存在するセリンプロテアーゼのアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物または原核生物起源のいずれかの天然に存在するトリプシンのアミノ酸配列からなり得る。具体的に、冷順応したトリプシン、例えば、大西洋タラ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）、大西洋及び太平洋サケ（例えば、タイセイヨウサケ及びタイヘイヨウサケの種）、及びスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）からのトリプシンが挙げられる。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１（すなわち、タンパク質構造データバンクエントリー２ＥＥＫ！に示される）のアミノ酸を含み得る、またはそれからなり得る。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドはまた、上で定義されたアミノ酸配列のうちのいずれかの断片を含み得る、またはそれからなり得、この断片が、抗微生物（例えば、抗細菌）活性を呈することは、当業者によって理解されるであろう。

「断片」とは、限定されないが、配列番号１、２、３または４などの上記アミノ酸配列のうちのいずれかの少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む。例えば、断片は、上記アミノ酸配列のうちのいずれかの、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００個以上の連続したアミノ酸を含み得る。

抗微生物（例えば、抗細菌）活性を保持する、上で定義されたセリンプロテアーゼポリペプチドの断片を特定する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、一連の異なる断片は、本発明の発現方法を使用し、既知の組換え方法論によって生成され、次に代表的な微生物（例えば、細菌株、ウイルス及び／または真菌株）にインビトロで曝露して、どの断片が該微生物の成長及び／または増殖を（部分的または全体的に）阻害するかを決定することができる。

例えば、大西洋タラからのトリプシンＩ（配列番号１）において、下記の強調表示された領域は、親タンパク質の抗細菌特性を保持すると考えられる。

［配列番号１］

抗細菌活性を呈する対応する領域は、本明細書に記載される他のアミノ酸配列のうちのいずれかにおいて特定されてもよい。

本発明の方法の開発は、長期間（１８ヶ月）にわたる広範囲の努力の結果であり、組換え手段によってトリプシン様酵素を生成する際の困難を克服した。わずか数回の試行の失敗の後、発明者らは、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、シグナルペプチドのない封入体としての発現、及び活性ポリペプチドの後次リフォールディングによって生成される、本方法論を考案した。

本発明の方法の特徴的特色は、微生物宿主細胞において、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドのＮ末端に融合された活性化ペプチドを含むチモーゲンポリペプチドを発現させるステップである（チモーゲンポリペプチドは、シグナル配列を欠失する）。

「チモーゲンポリペプチド」とは、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの不活性前駆体形態（「プロ酵素」）を意味し、後次に、タンパク質分解的に切断されて、活性セリンプロテアーゼポリペプチドを切断することができる。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドがトリプシンである場合、チモーゲンポリペプチドは、トリプシノーゲンである。

「活性化ペプチド」とは、短いペプチド（典型的に、４個または５個のアミノ酸長）を意味し、トリプシンなどのプロテアーゼへの曝露によって、チモーゲンの活性化時に放出される（Ｃｈｅｎ，Ｊｉａｎ−Ｍｉｎ，ｅｔ ａｌ．″Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０．１１（２００３）：１７６７−１７７７を参照されたい。その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。活性化ペプチドは、天然に存在する活性化ペプチドまたはその変異バージョンであってもよいことが理解されるであろう。

一実施形態では、活性化ペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。

チモーゲンポリペプチドをコードする核酸分子は、選択された宿主細胞型における組換えタンパク質の発現に適切な発現ベクターに挿入される（下記を参照されたい）。

微生物宿主細胞における使用に適した発現ベクターは、広く市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔなどの会社から）。

一実施形態では、トリプシノーゲンポリペプチドをコードする核酸分子は、大腸菌における使用に適した発現ベクター、例えば発現ベクターＥ３内にある（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡ）から入手可能）。

本発明の方法は、宿主細胞、例えば、細菌細胞、真菌細胞及び酵母細胞として任意の好適な微生物細胞を使用して行われてもよいことが当業者によって理解されるであろう。

好ましい一実施形態では、ステップ（ａ）の宿主細胞は、細菌宿主細胞（大腸菌及びシュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）など）である。例えば、ステップ（ａ）の宿主細胞は、大腸菌宿主細胞（ＢＬ２１（Ｅ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、及びＨＭＳ１７４細胞など）であってもよい。

代替実施形態では、ステップ（ａ）の宿主細胞は、酵母宿主細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）など）である。

発現ベクターで形質転換されると、宿主細胞は、チモーゲンポリペプチドの発現を誘導するのに適した条件下で培養される。異なる型の微生物細胞のための培養条件及び培地は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。文書が参照により本明細書に組み込まれる関連開示）。

したがって、ステップ（ｂ）において、宿主細胞は、少なくとも１８℃、例えば、１８℃、２２℃、２８℃、または３７℃の温度で培養されてもよい。

発現ステップ（ｂ）の期間は、少なくとも６時間、例えば、８時間、１６時間、２４時間、またはそれ以上であってもよい。

ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）などの宿主細胞が利用される場合、発現は、ＩＰＴＧなどの薬剤によって（例えば、１ｍＭで）誘導され得る。

本発明の方法のステップ（ｃ）において、発現したチモーゲンポリペプチドは、封入体ポリペプチドを可溶化及びリフォールディングすることによって精製される。再度、このような精製に適した方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｐａｎｄａ，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９９（４）：３０３−１０及びＢｕｒｇｅｓｓ，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６３：２５９−８２を参照されたい。文書が参照により本明細書に組み込まれる関連開示）。

一実施形態では、ポリペプチドをリフォールディングすることは、ポリペプチドをＰＢＳ／グリセロール緩衝液（例えば、１倍ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）と接触させることを含む。

本発明の方法は、それらが可溶化及びリフォールディングステップ中に、自己タンパク質分解の阻害剤（ベンズアミジンなど）の包含を必要としないという点で有利である。これは、一実施形態では、自己タンパク質分解の阻害剤は、ステップ（ｃ）に存在しない。

可溶化及びリフォールディングに続いて、精製チモーゲンポリペプチドは、トリプシン（活性化ペプチドを切断して、活性セリンプロテアーゼポリペプチドを明らかにする）への曝露によってタンパク質分解的に活性化される。

一実施形態では、大西洋タラからのトリプシンを使用して、チモーゲンポリペプチドをステップ（ｄ）で活性化する。

本発明の方法は、高い比活性を有する組換えセリンプロテアーゼポリペプチドを生成することができる。例えば、ステップ（ｄ）で生成された活性化ポリペプチドの比活性は、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、または少なくとも６０Ｕ／ｍｇであり得る。

本発明の方法は、組換えセリンプロテアーゼポリペプチドの良好な収率をもたらすことができる。例えば、ステップ（ｄ）で生成された活性化ポリペプチドの量は、少なくとも０．１ｍｇ、例えば、少なくとも０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、または１０ｍｇであり得る。

本発明の第２の態様は、本発明の方法によって（上で詳述されるとおり）得ることができるセリンプロテアーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供する。

「単離」とは、ポリペプチドが、細胞内に位置していない、または他の方法で提供されることを意味する。したがって、ポリペプチドは、細胞を含まない調製物として提供されてもよい。

本発明のポリペプチドの好ましい実施形態は、本発明の方法に関して上述される。したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、トリプシン活性を呈することができる。

例えば、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列（例えば、配列番号３及び４）を含み得る、またはそれからなり得る。

一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下のアミノ酸位置からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む、配列番号１または２の異型である（同じ変異部位が２つの代替ナンバリングシステムを参照して定義される）。
タンパク質データバンク［ＰＤＢ］エントリー２ＥＥＫ！を参照して定義される：
Ｅ２１、Ｈ２５、Ｈ２９、Ｖ４７、Ｋ４９、Ｄ５０、Ｌ６３、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｒ７４、Ｎ７６、Ｔ７９、Ｙ８２、Ｓ８５、Ｓ８７、Ｎ９８、Ｉ９９、Ｖ１２１、Ｍ１３５、Ｖ１３８、Ｍ１４５、Ｖ１４８、Ｄ１５０、Ｋ１５４、Ｌ１６０、Ｍ１７５、Ｓ１７９、Ａ１８３、Ｌ１８５、Ｖ２１２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ａ２２９、Ｖ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３８、Ｍ２４２、Ｎ２４４、及び／またはＹ２４５。
ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ１６０４９−１ ９及び配列番号２を参照して定義される：
Ｅ２５、Ｈ２９、Ｈ３３、Ｖ４９、Ｋ５１、Ｄ５２、Ｌ６５、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｒ７５、Ｎ７７、Ｔ８０、Ｙ８３、Ｓ８６、Ｓ８８、Ｎ９９、Ｉ１００、Ｖ１２２、Ｍ１３４、Ｖ１３７、Ｍ１４４、Ｖ１４７、Ｄ１４９、Ｋ１５２、Ｌ１５８、Ｍ１７３、Ｓ１７７、Ａ１８１、Ｌ１８４、Ｖ２０８、Ｙ２１３、Ｐ２２１、Ａ２２５、Ｖ２２９、Ｌ２３０、Ｖ２３４、Ｍ２３８、Ｎ２４０、及び／またはＹ２４１。

したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸変異を含む、配列番号１の異型であってもよい。
タンパク質データバンク［ＰＤＢ］エントリー２ＥＥＫ！を参照して定義される：
Ｅ２１Ｔ、Ｈ２５Ｙ、Ｈ２９（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４７Ｉ、Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｌ６３Ｉ、Ｈ７１Ｄ、Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７６（Ｔ／Ｌ）、Ｔ７９（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８２Ｆ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８７（Ｋ／Ｒ）、Ｓ８９Ｒ、Ｎ９８Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｍ１３５Ｑ、Ｖ１３８Ｉ、Ｍ１４５（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４８Ｇ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１６０（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７５（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７９Ｎ、Ａ１８３Ｖ、Ｌ１８５Ｇ、Ｖ２１２Ｉ、Ｙ２１７（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２９Ｖ、Ｖ２３３Ｎ、Ｌ２３４Ｙ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ、Ｎ２４４Ｓ、及び／またはＹ２４５Ｎ。
ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ１６０４９−１及び配列番号２を参照して定義される：
Ｅ２５Ｔ、Ｈ２９Ｙ、Ｈ３３（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４９Ｉ、Ｋ５１Ｅ、Ｄ５２Ｑ、Ｌ６５Ｉ、Ｈ７２Ｄ、Ｈ７３Ｎ、Ｒ７５（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７７（Ｔ／Ｌ）、Ｔ８０（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８３Ｆ、Ｓ８６Ａ、Ｓ８８（Ｋ／Ｒ）、Ｎ９９Ｔ、Ｉ１００Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｍ１３４Ｑ、Ｖ１３７Ｉ、Ｍ１４４（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４７Ｇ、Ｄ１４９Ｓ、Ｋ１５２（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１５８（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７３（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７７Ｎ、Ａ１８１Ｖ、Ｌ１８４Ｇ、Ｖ２０８Ｉ、Ｙ２１３（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２１Ｙ、Ａ２２５Ｖ、Ｖ２２９Ｎ、Ｌ２３０Ｙ、Ｖ２３４Ｉ、Ｍ２３８Ｉ、Ｎ２４０Ｓ、及び／またはＹ２４１Ｎ。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下に定義される変異またはその組み合わせ（表１）を有する配列番号１のアミノ酸配列を含み得る、またはそれからなり得る。

同様に、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、以下の定義された変異またはそれらの組み合わせ（表２）を有する配列番号１のアミノ酸を含み得る、またはそれからなり得る。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１６０４９−１）における変異（複数可）を参照して定義される上記表１及び２において、成熟プロテアーゼが、そのＮ末端アミノ酸としてＩ２０で始まることが理解されるであろう。しかしながら、典型的に、そのＮ末端に活性化配列を有するチモーゲンポリペプチドとして発現される（上記を参照されたい）。

上記の特定された変異（大西洋タラのトリプシンＩのアミノ酸配列、配列番号１を参照して定義される）はまた、他の種からのトリプシン中で作製され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、配列番号３及び４において強調表示される特定の変異（Ｈ２５Ｎ及びＬ１６０Ｉ、それぞれ配列番号１及びＰＤＢ ２ＥＥＫ！を参照する）は、スケトウダラからのトリプシン中で作製され得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ７０４７６．３を参照されたい。活性トリプシンのアミノ酸配列は、Ｉ２０で始まり、それによりＨ２５は、ＢＡＨ７０４７６．３のＨ２９などに対応する）。

代替実施形態では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、天然に存在するセリンプロテアーゼのアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。したがって、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、真核生物または原核生物起源のいずれかの天然に存在するトリプシンのアミノ酸配列からなり得る。具体的に、冷順応したトリプシン、例えば、大西洋タラ（Ｇａｄｕｓ ｍｏｒｈｕａ）、大西洋及び太平洋サケ（例えば、タイセイヨウサケ及びタイヘイヨウサケの種）、及びスケトウダラ（Ｔｈｅｒａｇｒａ ｃｈａｌｃｏｇｒａｍｍａ）からのトリプシンが挙げられる。例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸を含み得る、またはそれからなり得る。

しかしながら、本発明のこのような天然に存在するセリンプロテアーゼポリペプチドが、それらが自然界で見出されるものとは異なる形態で提供されなければならないことは、当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のポリペプチドは、天然に存在する真核生物トリプシンのアミノ酸配列からなり得るが、それが自然界で発現されるとき、タンパク質上に存在するグリコシル化部分を欠失する。

セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、上で定義されたアミノ酸配列のうちのいずれかの断片も含み得る、またはそれからなり得、この断片が、抗微生物活性を呈することも、当業者によって理解されるであろう（本発明の第１の態様に関して上述のとおり）。

有利に、本発明の第２の態様の組換えポリペプチドは、天然に存在するセリンプロテアーゼに対して１つ以上の向上した、または他の方法で有益な特性を呈する。

したがって、一実施形態では、ポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した安定性を呈する（すなわち、タラから精製され、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸配列を有する、これは、Ｚｙｍｅｔｅｃｈ ＬｔｄからＰｅｎｚｙｍｅ（登録商標）として市販されている。欧州特許第１２０２７４３Ｂ号も参照されたい。この関連開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩのトリプシンポリペプチドに対して向上した熱安定性を呈することができる。「熱安定性」とは、ポリペプチドが高温に曝されたときに、セリンプロテアーゼ活性を保持する能力を意味する。熱安定性は、ポリペプチドが６０℃で３．５時間保管されたときに、セリンプロテアーゼ活性の保持を決定することによって評価されてもよい（下記の実施例を参照されたい）。

向上した熱安定性を有する本発明の例示的なポリペプチドは、以下の定義された変異（表１を参照されたい）のうちの１つを有する、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸を含む、またはそれからなるそれらのポリペプチドを含み、

（ａ）Ｋ１５４Ｅ（「ＥＺＡ−００６」）、
（ｂ）Ｎ９８Ｔ（「ＥＺＡ−００７」）、
（ｃ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
（ｄ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
（ｅ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
（ｆ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
（ｇ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
（ｈ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
（ｉ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
（ｊ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
（ｋ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
（ｌ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
（ｍ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
（ｎ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
（ｏ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
（ｐ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
（ｑ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
（ｒ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
（ｓ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
（ｔ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
（ｕ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
（ｖ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
（ｗ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、
（ｘ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、及び
（ｙ）Ｌ２３４Ｙ（「ＥＺＡ−０３９」）

変異位置は、ＰＤＢエントリー番号２ＥＥＫ！におけるアミノ酸ナンバリングを参照して特定される。

代替として、または追加として、本発明のポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した自己タンパク質分解安定性を呈することができる。

「自己タンパク質分解安定性」とは、ポリペプチドが、それ自体のポリペプチド触媒タンパク質分解切断に起因して生じる不活性化なしに、セリンプロテアーゼ活性を保持する能力を意味する。自己タンパク質分解安定性は、ポリペプチドが２５℃で８時間保管されたときに、セリンプロテアーゼ活性の保持を決定することによって評価されてもよい（下記の実施例を参照されたい）。

向上した自己タンパク質分解安定性を有する本発明の例示的なポリペプチドは、以下の定義された変異（表１を参照されたい）のうちの１つを有する、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸を含む、またはそれからなるそれらのポリペプチドを含み、

（ａ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
（ｂ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
（ｃ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
（ｄ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
（ｅ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
（ｆ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
（ｇ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
（ｈ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
（ｉ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
（ｊ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
（ｋ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
（ｌ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
（ｍ）Ｔ７９Ｓ（「ＥＺＡ−００２４」）、
（ｎ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
（ｏ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
（ｐ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
（ｑ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
（ｒ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
（ｓ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
（ｔ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
（ｕ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
（ｖ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
（ｗ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
（ｘ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、及び
（ｙ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）

変異位置は、ＰＤＢエントリー番号２ＥＥＫ！におけるアミノ酸ナンバリングを参照して特定される。

本発明のポリペプチドが、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した触媒活性を呈し得ることは、当業者によって理解されるであろう（すなわち、タラから精製され、配列番号１のアミノ酸配列を有する。Ｐｅｎｚｙｍｅ（登録商標）として市販されている）。

例えば、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した（すなわち、上昇した）Ｋｃａｔを呈することができる。

向上したＫｃａｔを有する本発明の例示的なポリペプチドは、以下の定義された変異（表１を参照されたい）のうちの１つを有する、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸を含む、またはそれからなるそれらのポリペプチドを含み、

（ａ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
（ｂ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
（ｃ）Ｈ７１Ｄ（「ＥＺＡ−０１８」）、
（ｄ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
（ｅ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
（ｆ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
（ｇ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
（ｈ）Ｍ１７５Ｑ（「ＥＺＡ−０３２」）、
（ｉ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
（ｊ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
（ｋ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
（ｌ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、及び
（ｍ）Ｖ２３８Ｉ（「ＥＺＡ−０３８」）

変異位置は、ＰＤＢエントリー番号２ＥＥＫ！におけるアミノ酸ナンバリングを参照して特定される。

代替として、または追加として、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した（すなわち、低下した）Ｋｍを呈することができる。

向上したＫｍを有する本発明の例示的なポリペプチドは、以下の定義された変異（表１を参照されたい）のうちの１つを有する、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸を含む、またはそれからなるそれらのポリペプチドを含み、

（ａ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
（ｂ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
（ｃ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
（ｄ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
（ｅ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
（ｆ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
（ｇ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
（ｈ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
（ｉ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、及び
（ｊ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）

変異位置は、ＰＤＢエントリー番号２ＥＥＫ！におけるアミノ酸ナンバリングを参照して特定される。

最後に、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した（すなわち、上昇した）比定数（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を呈することができる。

向上したＫｃａｔ／Ｋｍを有する本発明の例示的なポリペプチドは、以下の定義された変異（表１を参照されたい）のうちの１つを有する、配列番号１（ＰＤＢ ２ＥＥＫ！）のアミノ酸を含む、またはそれからなるそれらのポリペプチドを含み、

（ａ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
（ｂ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
（ｃ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
（ｄ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、及び
（ｅ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、

変異位置は、ＰＤＢエントリー番号２ＥＥＫ！におけるアミノ酸ナンバリングを参照して特定される。

本発明のポリペプチドが、宿主細胞によって翻訳後修飾を受け得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、組換えにより発現されたポリペプチドのグリコシル化が望ましい場合、酵母菌宿主細胞が使用されてもよい（ピキア・パストリスなど）。

しかしながら、細菌宿主細胞（大腸菌など）は、ポリペプチドのグリコシル化を許さない。したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されない。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、標準２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸及び「Ｄ」形態の（天然の「Ｌ」形態と比較して）それらの対応する立体異性体、ω−アミノ酸、他の天然に存在するアミノ酸、非定型的アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など）、及び化学的に誘導体化したアミノ酸（下記を参照）を含む。

アミノ酸が、「アラニン」または「Ａｌａ」または「Ａ」などと具体的に列挙されるとき、この用語は、別途明示的に述べられない限り、Ｌ−アラニン及びＤ−アラニンの両方を指す。他の非定型的アミノ酸もまた、所望の機能特性がポリペプチドによって保持される限り、本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。示されるペプチドの場合、各コードアミノ酸残基は、適切な場合、従来のアミノ酸の慣用名に対応する、単一文字の名称によって表される。

一実施形態では、本明細書に定義されるポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含む、またはそれからなる。

本発明のポリペプチドが、修飾または誘導体化された１つ以上のアミノ酸を含み得る、またはそれからなり得ることは、当業者によって理解されるであろう。

１つ以上のアミノ酸の化学誘導体は、官能側基との反応によって達成されてもよい。このような誘導体化分子としては、例えば、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボキシベンズオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはホルミル基を形成するように誘導体化された分子が挙げられる。遊離カルボキシル基は、塩、メチル、及びエチルエステルまたは他の型のエステル及びヒドラジドを形成するように誘導体化されてもよい。遊離ヒドロキシル基は、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化されてもよい。化学誘導体として、２０個の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンに置換され得、５−ヒドロキシリジンは、リジンに置換され得、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンに置換され得、ホモセリンはセリンに、オルニチンはリジンに置換され得る。誘導体は、必要な活性が維持される限り、１つ以上の付加または欠失を含有するペプチドも含む。他の修飾としては、アミド化、アミノ末端アシル化（例えば、アセチル化またはチオグリコール酸アミド化）、末端カルボキシアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンとの）、及び同様の末端修飾が挙げられる。

ペプチド模倣化合物も有用であり得ることは、当業者によって更に理解されるであろう。「ペプチド模倣」という用語は、治療薬として特定のペプチドの構造及び所望の特徴を模倣する化合物を指す。

例えば、該ポリペプチドは、アミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）結合によって接合される分子だけでなく、ペプチド結合が反転される分子も含む。このようなレトロ−インベルソペプチド模倣体は、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，３２３０−３２３７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの、当該技術分野において既知の方法を使用して作製され得る。この手法は、側鎖の配向ではなく、骨格に関与する変化を含む偽ペプチドを作製することを必要とする。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロ−インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してはるかに耐性が強い。代替として、該ポリペプチドは、アミノ酸残基のうちの１つ以上が、従来のアミド結合の代わりに−ｙ（ＣＨ_２ＮＨ）−結合によって結合されるペプチド模倣化合物であってもよい。

更なる代替において、アミノ酸残基の炭素原子間の空間を保持する適切なリンカー部分が使用されることを条件として、ペプチド結合が一緒に分配されてもよい。リンカー部分がペプチド結合と実質的に同じ変化分布及び実質的に同じ平面性を有することが有利であり得る。

該ポリペプチドが、エキソタンパク質分解消化に対する感受性を低減するのを助けるように、そのＮ末端またはＣ末端で便宜的に遮断され得ることも理解されるであろう。

また、Ｄ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの様々な非コードまたは未修飾アミノ酸を使用して、哺乳類ペプチドを修飾した。加えて、推定される生物活性構造は、環化などの二価修飾によって、またはラクタムもしくは他の型のブリッジの組込みによって安定化されてもよく、例えば、Ｖｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：２６３６ ａｎｄ Ｔｈｕｒｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１１１：１６６（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

本発明が、上記のポリペプチドの薬学的に許容される酸または塩基付加塩も含むことは、当業者によって理解されるであろう。本発明において有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用される酸は、特に、非毒性酸付加塩、すなわち、薬学的に許容されるアニオンを含有する塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、クエン酸、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカラート、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、及びパモ酸塩［すなわち、１，１′−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエ酸）］塩を形成するものである。

薬学的に許容される塩基付加塩を使用して、ポリペプチドの薬学的に許容される塩形態を生成することもできる。自然界において酸性である、本化合物の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、このような化合物と共に非毒性塩基塩を形成するものである。このような非毒性塩基塩としては、特に、アルカリ金属カチオン（例えば、カリウム及びナトリウム）及びアルカリ土類金属カチオン（例えば、カルシウム及びマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩（Ｎ−メチルグルカミン−（メグルミン）など）、ならびに低級アルカノールアンモニウム及び薬学的に許容される有機アミンの他の塩基塩などのこのような薬学的に許容されるカチオンから誘導されたものが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のポリペプチドが、保管のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体中で再構成され得ることが更に理解されるであろう。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）及び／または再構成技法を用いることができる。凍結乾燥及び再構成が、異なる程度の活性喪失につながり得ること、及び使用レベルを上方調整して補償する必要があり得ることは、当業者によって理解されるであろう。好ましくは、凍結乾燥した（冷凍乾燥した）ポリペプチドは、再水和したときに、その活性の（凍結乾燥前の）約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を喪失した。

本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様による、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。「核酸分子」とは、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたは相補性ＤＮＡ）及びｍＲＮＡ分子を含み、一本鎖または二本鎖であってもよい。「単離した」とは、核酸分子が、細胞内に位置しない、または他の方法で提供されることを意味する。一実施形態では、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子である。
以下もまた、本発明の範囲内に含まれる。
（ａ）本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様による核酸分子を含むベクター（発現ベクターなど）を提供する。
（ｂ）本発明の第５の態様は、本発明の第３の態様による核酸分子、または本発明の第４の態様によるベクターを含む宿主細胞（微生物または哺乳類細胞など）を提供する。

本発明の第６の態様は、薬学的に有効な量の、本発明の第２の態様によるポリペプチド、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、補助剤、または賦形剤を含む治療組成物を提供する。

追加の化合物が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、またはグルタチオンなどのキレート化剤を含む組成物に含まれてもよい。抗細菌／治療組成物は、十分に保管安定性であり、ヒト及び動物への投与に適している、当該技術分野において既知の方法で調製されてもよい。治療組成物は、例えば、冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却を通して、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用を通して凍結乾燥されてもよい。

「薬学的に許容される」とは、本発明のポリペプチドのトリプシン活性の有効性を減少させない非毒性材料を意味する。このような薬学的に許容される緩衝液、担体、または賦形剤は、当該技術分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）及び医薬品添加物ハンドブック第３版、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。

「緩衝液」という用語は、ｐＨを安定させる目的で、酸−塩基混合物を含有する水性溶液を意味することが意図される。緩衝液の実施例は、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸塩、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸塩、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール酢酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、及びＴＥＳである。

「希釈剤」という用語は、治療調製物中のペプチドを希釈することを目的とした水性または非水性溶液を意味することが意図される。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、または油（ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、またはゴマ油）のうちの１つ以上であってもよい。

「補助剤」という用語は、本発明のポリペプチドの生物学的作用を増加させるように製剤に添加される任意の化合物を意味することが意図される。補助剤は、異なるアニオンを有する亜鉛、銅、または銀塩のうちの１つ以上であってもよく、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアネート、亜硫酸塩、塩酸塩、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及び異なるアシル組成物の酢酸塩であるが、これらに限定されない。補助剤はまた、カチオン性ポリマー、例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー、カチオン性合成ポリマー（ポリ（ビニルイミダゾール）など）、及びカチオン性ポリペプチド（ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、及びこれらのアミノ酸を含有するペプチド）であってもよい。

賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質、及び鉱物のうちの１つ以上であってもよい。炭水化物の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、及びシクロデキストリンが挙げられ、これらは例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加される。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギニン酸塩、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニル酢酸塩、及びポリビニルピロリドンであり、全て異なる分子量で、例えば、粘度制御のため、生物接着を達成するため、または脂質を化学分解及びタンパク質分解から保護するために組成物に添加される。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノ−、ジ−、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質及び糖脂質であり、全て異なるアシル鎖長及び飽和の卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵及び大豆レシチンが、ポリマーの場合と同様の理由で組成物に添加される。鉱物の例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛及び酸化チタンであり、これらは、液体蓄積の低減などの利益、または有利な色素特性を得るために、組成物に添加される。

一実施形態では、ポリペプチドは、塩化カルシウムなどの安定剤と一緒に提供されてもよい。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチド剤の送達に適するように、当該技術分野において既知の任意の種類の治療組成物に製剤化され得る。

一実施形態では、ポリペプチドは単に、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、もしくは油（ベニバナ油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、もしくはゴマ油など）、トラガカントガム及び／または様々な緩衝液に溶解されてもよい。例えば、ポリペプチドが経口投与（マウススプレーなど）に製剤される場合、治療組成物は、水、グリセロール及びメタノールに溶解されたポリペプチドを含むことができる。例示的なマウススプレー製剤は、ＣｏｌｄＺｙｍｅ（登録商標）として（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａ ＡＢ、Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎによって）スカンジナビア内で市販されている。

好ましい実施形態では、本発明は、浸透圧活性溶液中で上記のプロテアーゼポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、グリセロールまたはグリセリン中で製剤されてもよい。理論に拘束されるものではないが、このような浸透圧活性溶液は、微生物細胞内から細胞外環境への流体の移動を促進すると考えられる。これは次に、例えば、中咽頭の宿主上皮細胞によって、細菌及びウイルスなどの微生物細胞の取込みを（少なくとも部分的に）阻害する薄い活性障壁を作成することによって、本発明のポリペプチドの治療効果を促進すると考えられる。

更なる実施形態では、本発明の治療組成物は、リポソームの形態をとることができ、ポリペプチドは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単層及び液体結晶として凝集形態で存在する、脂質などの両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質としては、限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。好適な脂質はまた、血流循環時間を延長するために水溶性頭部中のポリ（エチレングリコール）によって上で修飾された脂質を含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号において見出すことができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の治療組成物は、生分解性微小球の形態であってもよい。脂肪族ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡ及びＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、またはポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びポリ無水物は、微小球の生成において生分解性ポリマーとして広く使用されている。このような微小球の調製は、米国特許第５，８５１，４５１号及び欧州特許第０２１３３０３号において見出すことができ、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

更なる実施形態では、本発明の治療組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギニン酸塩、カラゲナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、異なる程度の加水分解のポリビニルアルコール／ポリビニル酢酸塩、ならびにポリビニルピロリドンなどのポリマーは、ペプチドを含有する溶液の増粘に使用される。ポリマーは、ゼラチンまたはコラーゲンを含んでもよい。

本発明の治療組成物が、ポリペプチドの作用の増強のためのイオン及び定義されたｐＨを含み得ることが理解されるであろう。追加として、組成物は、滅菌などの従来の治療処置に供され得る、及び／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの従来の補助剤を含むことができる。

好ましい一実施形態では、治療組成物は、Ｔｒｉｓまたはリン酸緩衝液中のポリペプチドを、ＥＤＴＡ、キシリトール、ソルビトール、プロピレングリコール、及びグリセロールのうちの１つ以上と一緒に含む。

本発明による治療組成物は、当業者に既知の任意の好適な経路を介して投与されてもよい。したがって、可能な投与経路としては、経口、頬、非経口（静脈内、皮下、髄腔内及び筋肉内）、局所、眼、鼻、肺、非経口、膣、及び直腸が挙げられる。移植片からの投与も可能である。

代替実施形態では、治療組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳室内、関節内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下的に投与され得る、またはそれらは、点滴技法によって投与されてもよい。それらは、滅菌水性溶液の形態で便宜的に使用され、他の物質、例えば、血液と等張の溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含有してもよい。水性溶液は、必要な場合、好適に（好ましくは３〜９のｐＨに）緩衝化されるべきである。滅菌条件下で好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準薬学的技法によって容易に達成される。

非経口投与に適した製剤は、水性及び非水性滅菌注入溶液を含み、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び溶質、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含有してもよい。製剤は、単位用量または多用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアル内で提供されてもよく、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とする冷凍乾燥（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射溶液及び懸濁液は、前述される種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製されてもよい。

代替として、治療組成物は、鼻腔内または吸入によって投与されてもよい（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロ−メタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素または他の好適なガスなどの推進剤の使用と共に、加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提供の形態で）。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計測量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えば、エタノール及び推進剤の混合物を溶媒として使用し、活性ポリペプチドの溶液または懸濁液を含有してもよく、追加として、潤滑剤、例えば、ソルビタントリオレエートを含有してもよい。吸入器または注入器内で使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから作製される）は、本発明の化合物及びラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末ベースの粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。

有利に、ポリペプチドは、口及び／または中咽頭の粘膜への送達に適した形態で提供される。例えば、ポリペプチドは、マウススプレー、舐剤、トローチ、チューイングガムまたは液体で提供され得る。

治療組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与される。「治療上有効な量」または「有効量」または「治療上有効な」とは、本明細書で使用される場合、所与の条件及び投与計画に治療効果をもたらす量を指す。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわち、担体または投与媒体と関連した所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性材料である。更に、宿主の活性、機能及び反応における臨床的に有意な欠陥を低減する、及び最も好ましくは予防するのに十分な量を意味することが意図される。代替として、治療上有効な量は、宿主において臨床的に有意な状態の改善を引き起こすのに十分である。当業者によって理解されるとおり、化合物の量は、その比活性に依存して異なり得る。好適な投薬量は、必要な希釈剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性組成物を含有することができる。本発明の組成物の製造のための方法及び使用において、治療上有効な量の活性化合物が提供される。治療上有効な量は、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などの患者の特徴に基づいて、熟練した医療または獣医学従事者によって、当該技術分野において周知のとおり決定され得る。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位または他のいくつかの少量単位の形態での単一投与によって、及び特定間隔で細分用量の複数回投与によって実行され得る。代替として、用量は、連続注入として長期間にわたって提供されてもよい。

ポリペプチドは、使用される化合物の効能／毒性に依存して、様々な濃度で製剤化され得る。好ましくは、製剤は、０．１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１μＭ〜５００μＭ、５００μＭ〜１ｍＭ、３００μＭ〜７００μＭ、１μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、２００μＭ〜３００μＭ、３００μＭ〜４００μＭ、４００μＭ〜５００μＭ、及び最も好ましくは約５００μＭの濃度の活性剤を含む。

したがって、治療製剤は、対象への投与後に、ウイルス、細菌及び酵母菌などの微生物を死滅させる、または増殖を遅らせるのに十分な量のポリペプチドを含むことができる。

本発明の第７の態様は、医療における使用のための本発明の第２による、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。

本発明の第８の関連態様は、微生物感染、炎症、及び創傷からなる群から選択される障害または病態の治療または予防のための薬剤の調製において、上に定義されるポリペプチドを提供する。

「微生物感染」とは、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染、及び酵母菌感染を含む。

例えば、本発明のポリペプチドは、歯周病などの細菌感染（生物膜形成を伴う、または伴わない）と関連した障害または病態の治療または予防における使用のためのものであり得る。

代替として、本発明のポリペプチドは、感冒及びインフルエンザなどのウイルス感染と関連した障害または病態の治療または予防における使用のためのものであり得る。例えば、ウイルス感染は、腸内ウイルス（ヒトライノウイルスまたはコクサッキーＡウイルスなど）によって、または単純ヘルペスウイルスによって引き起こされ得る。

追加として、本発明のポリペプチドは、足白癬（水虫）及びカンジダ症（鵞口瘡）などの真菌感染と関連した障害または病態の治療または予防における使用のためのものであり得る。

本発明のポリペプチドは、免疫不全を有する、またはそれに罹患しやすい対象における訴えに特に適している。

「免疫不全」とは、対象の免疫疾患が、全体的または部分的に易感染性である病態を意味する。免疫不全は、後天的または続発性であり得る、例えば、免疫抑制療法による治療に続く、または原発性、例えば、本対の免疫系の一部が欠失しているか、または正常に機能しない、天然に存在する障害であり得る。したがって、一実施形態では、免疫不全は、続発性または後天的免疫不全である。

例えば、対象における免疫不全は、免疫抑制剤療法による治療（例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、イムノフィリンに作用する薬物、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸塩及び放射線療法）を受けることから生じ得る。

免疫抑制剤療法は、医療において、例えば、以下のために一般に使用される。
（ａ）移植された臓器及び組織（例えば、骨髄、心臓、腎臓、肝臓）の拒絶反応を予防する、
（ｂ）自己免疫起源の自己免疫疾患（複数可）を治療する（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、巣状分節状糸球体硬化症、クローン病、ベーチェット病、天疱瘡及び潰瘍性結腸炎）、及び
（ｃ）他の非自己免疫炎症性疾患を治療する（例えば、長期アレルギー性喘息の制御）。

更なる実施形態では、免疫不全は、天然に存在する免疫不全である。例えば、免疫不全は、原発性免疫不全（下記を参照されたい）、癌（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）、慢性感染症（後天性免疫不全症候群、すなわちＡＩＤＳなど）、栄養失調及び／または加齢に起因し得る。

原発性免疫不全は、患者をより感染し易くする様々な障害を含む。未治療で放置される場合、これらの感染は致死的であり得る。一般的な原発性免疫不全としては、体液免疫の障害（Ｂ細胞分化または抗体生成に影響する）、Ｔ細胞欠陥及び複合Ｂ及びＴ細胞欠陥、食細胞障害、ならびに補体欠損症が挙げられる。これらの障害の主な症状は、積極的治療にかかわらない多重感染、異常または日和見生物による感染、増殖の失敗または成長不良及び陽性家族歴が挙げられる。早期認識及び診断は、原発性免疫不全の経過を著しく改変することができ、患者の転帰に対して陽性効果を有する。

したがって、本発明のポリペプチドは、口及び／または中咽頭の二次感染の治療または予防における使用のためのものである。例えば、ポリペプチドは、鼻漏及び／または口腔の真菌感染及び／または歯肉の疼痛の治療または予防に使用されてもよい。

本発明のポリペプチドは、定期的な感染エピソード（例えば、少なくとも年に５回の微生物感染、例えば、少なくとも年に１０回、１５回、２０回、３０回またはそれ以上の微生物感染）に罹患するＰＩ患者における微生物感染の治療または予防に特に有用である。

本発明のポリペプチドはまた、運動選手、特にプロの運動選手または他のパフォーマンスの高い運動選手における微生物感染の治療または予防において特に有用である。このような個人における過剰なトレーニング及び／または長期の労作は、免疫機能の一次的な減損につながり得、これは数時間から数日継続することがあり、その期間中に微生物感染を受け易くする（特に、感冒及びインフルエンザ）。

したがって、一実施形態では、本発明のポリペプチドは、マラソン走者における微生物感染の治療または予防に使用するためのものである。ポリペプチドは、イベント当日のマラソンの直前（例えば、イベントの１日もしくは２日以上前）及び／またはマラソンの直後（例えば、イベント後１日もしくは２日もしくは３日もしくは４日もしくは５日もしくは６日もしくは７日以上にわたって）投与されてもよい。

代替実施形態では、本発明のポリペプチドは、炎症と関連した障害または病態の治療または予防に使用するためのものである。

例えば、炎症障害または病態は、疼痛、急性炎症、慢性炎症、関節炎、炎症した関節、滑液包炎、骨関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、静脈炎、腱炎、発疹、乾癬、座瘡、湿疹、顔面脂漏性湿疹、及び手、顔、または首の湿疹からなる群から選択され得る。

更なる実施形態では、本発明のポリペプチドは、急性外傷（火傷を含む）、局所潰瘍、瘢痕、ケロイド、腫れ物及びいぼなどの創傷の治療または予防における使用のためのものであり得る。

したがって、本発明のポリペプチドは、創傷ケア製品の形態で（すなわち、創傷ケア材料との組み合わせで）提供されてもよい。

「創傷ケア材料」とは、創傷ケアにおける使用に適した実質的に非毒性の材料を含み、アルギニン酸塩、非晶質ヒドロゲル、シートヒドロゲル、ハイドロファイバー、及びそれらの混合物を含む。

創傷ケア製品は、使用される構成材料及びその製品の意図される目的に依存して、いくつかの異なる形態をとり得る。しかしながら、典型的に、製品は、乾燥不織布シート、冷凍乾燥シート、固体ゲルシート、リボン、ロープ及び粘性ゲルの形態で提供され、これらはバンデージもしくはドレッシング中で、またはバンデージもしくはドレッシングとして使用されてもよい。

使用前に、創傷ケア製品は、滅菌であり、微生物不透過性容器内に入れる必要がある。例えば、創傷ケア製品は、管または他の好適な滅菌アプリケータ内で保管されてもよい。

典型的に、創傷ケア製品は、創傷の表面に直接適用される。任意に、二次的な従来のドレッシングを、創傷ケア製品の上を覆うように適用されてもよい。更に、場合によって、透過性抗接着ドレッシングが、創傷と創傷ケア製品との間に適用されてもよい。

ポリペプチドは、特に創傷清拭（すなわち、感染した、死滅した、または剥離した皮膚を、その他の点では健常な皮膚から除去する）及びフィブリン塊の除去に適している。

本発明のセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、１つ以上の追加の活性剤と組み合わせて使用するためのものであり得ることは、当業者によって理解されるであろう。

例えば、追加の活性剤は、抗微生物薬（抗生物質、抗ウイルス薬及び抗真菌薬を含む）、抗炎症薬（ステロイド及び非ステロイド抗炎症薬を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択される。

代替として、または追加として、本発明のセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、グリコシダーゼなどの１つ以上の追加の酵素と組み合わせて使用するためのものであり得る。

本発明の第９の態様は、微生物感染、炎症及び創傷（本発明の第８の態様に関して上で詳述されるものなど）からなる群から選択される障害または病態の治療または予防における使用のための医薬品の調製において、本発明の第２の態様によるポリペプチドの使用を提供する。

本発明の第１０の態様は、微生物感染、炎症及び創傷（本発明の第８の態様に関して上で詳述されるものなど）からなる群から選択される障害または病態の対象における治療または予防のための方法を提供し、この方法は、本発明の第２の態様による、有効量のポリペプチドを投与することを含む。

多くの医療適用に加えて、本発明のセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、化粧品適用においても効用を有する。

したがって、本発明の第１１の態様は、対象における化粧療法としての、本発明の第２の対応によるポリペプチドの使用を提供する。

本発明の第１３の態様は、本発明の第２の態様による、有効量のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における化粧療法の方法を提供する。

上記態様の一実施形態では、化粧療法は、以下の作用のうちの１つ以上を対象にもたらす：
（ａ）皮膚の角質除去（死滅及び／剥離した皮膚細胞の除去）、
（ｂ）皮膚のコラーゲン及びエラスチンの破壊に対する保護、
（ｃ）面疱溶解（ｃｏｍｅｄｏｌｙｔｉｃ）作用、
（ｄ）眉間（しかめっ面）しわ線の低減もしくは予防、及び／または
（ｅ）発毛の促進。

本発明のセリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、産業用薬剤としての効用も有する。

したがって、本発明の第１４の態様は、本発明の第２の態様によるポリペプチドの、産業用としての使用を提供する。

例えば、ポリペプチドは、以下のうちの１つ以上として使用されてもよい：
（ａ）織物処理剤、
（ｂ）生体触媒（例えば、医薬品の有機合成における）、
（ｃ）洗浄／衛生剤（例えば、洗剤）、
（ｄ）環境バイオレメディエーション剤（例えば、汚染を低減するための）、
（ｅ）分子生物学剤、及び
（ｆ）食品処理剤（例えば、乳製品製造における）。

本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータに対する選好及びオプションは、別途文脈が示さない限り、本発明の全ての他の態様、特徴及びパラメータに対する任意及び全ての選好及びオプションとの組み合わせで開示されているものと見なされるべきである。例えば、一実施形態では、本発明は、細菌またはウイルス感染の治療または予防における使用のための配列番号３または４のアミノ酸配列を有するトリプシンポリペプチドを含むマウススプレーを提供する。

本明細書における明らかに先行公開の文書の列挙または考察は、必ずしもその文書が最新技術の一部である、または共通の一般知識であるとして認識されるべきではない。

「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、特許請求の範囲及び／または明細書において「含む」という用語と併せて使用される場合、「１つ」を意味するが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたは複数」の意味とも一致する。

本発明のこれらの、及び他の実施形態は、上記の説明及び添付の図面と併せて考慮されるとき、より良く認識及び理解されるであろう。しかしながら、上記説明は、本発明の様々な実施形態及びその多くの特定詳細を示す一方で、単なる例証として付与され、制限するものではない。多くの置換、修飾、付加及び／または再配置は、その趣旨から逸脱することなく本発明の範囲内で行われてもよく、本発明は、このような置換、修飾、付加及び／または再配置の全てを含む。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を更に明示するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態に関する詳細な説明と併せてこれを参照することによってより良く理解され得る。

組換えトリプシンの活性化及び安定性試験の概略説明。 ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）宿主細胞中のＥＺＡ−０３４の発現の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＥＺＡ−０３４の発現最適化を、１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導で、４ｍＬ ＬＢ培地中、４つの条件、３７℃で６時間、２８℃で８時間、２２℃で１６時間、または１８℃で１６時間にてそれぞれ行った。 ＥＺＡ−０３４の発現の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＥＺＡ−０３４の発現最適化を、５０ｍＬ振とうフラスコ内で、２つの株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）を使用し、３つの培地、すなわち、ＴＢ、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ＋０．５％グルコース−グリセロールを用いて、１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導で、４つの条件、３７℃で６時間、２８℃で８時間、２２℃で１６時間または１８℃で１６時間にてそれぞれ行った。 ５Ｌ発酵における、３つの異なる培地中（ＴＢ＋０．５％グリセロール、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導）の２つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）におけるＥＺＡ−０３４の発現最適化において、ＥＺＡ−０３４の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。 ５Ｌ発酵における、３つの異なる培地中（ＴＢ＋０．５％グリセロール、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導）の２つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）におけるＥＺＡ−０３４の発現最適化において、総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％のチャート表示（％は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを走査することによって定量化した）である。 ５Ｌ発酵における、３つの異なる培地中（ＴＢ＋０．５％グリセロール、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導）の２つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）におけるＥＺＡ−０３４の発現最適化において、試験した条件の湿細胞重量のチャート表示である。 ５Ｌ発酵における、３つの異なる培地中（ＴＢ＋０．５％グリセロール、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導）の２つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）におけるＥＺＡ−０３４の発現最適化において、試験した条件におけるＥＺＡ−０３４の計算発現レベルのチャート表示である。 ５Ｌ発酵における、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導による、ＴＢフィードグリセロール、ＴＢフィードグルコース、またはフィードなしの２倍ＴＢそれぞれにおける、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株中のＥＺＡ−０３４の発現最適化において、ＥＺＡ−０３４の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す。 ５Ｌ発酵における、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導による、ＴＢフィードグリセロール、ＴＢフィードグルコース、またはフィードなしの２倍ＴＢそれぞれにおける、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株中のＥＺＡ−０３４の発現最適化において、総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％を表示するチャートである（％は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを走査することによって定量化した。）。 ５Ｌ発酵における、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導による、ＴＢフィードグリセロール、ＴＢフィードグルコース、またはフィードなしの２倍ＴＢそれぞれにおける、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株中のＥＺＡ−０３４の発現最適化において、試験した条件の湿細胞重量を表示するチャートである。 ５Ｌ発酵における、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導による、ＴＢフィードグリセロール、ＴＢフィードグルコース、またはフィードなしの２倍ＴＢそれぞれにおける、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株中のＥＺＡ−０３４の発現最適化において、試験した条件におけるＥＺＡ−０３４の計算発現レベルを表示するチャートである。低いまたは高いＯＤは、ＩＰＴＧ誘導での細胞密度を指し、グリセロールフィードの高いＯＤは、グルコースフィードのＯＤに等しい。 ４つの異なる活性化ペプチドを使用する、大西洋タラからの野生型トリプシンの組換え発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。

実施例Ａ−組換えセリンプロテアーゼポリペプチドの生成
クローニング
権利対象のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードする合成遺伝子を、いかなるタグもなしに大腸菌発現Ｅ３ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にクローン化した。

大西洋タラ由来の野生型トリプシンＩをコードする核酸を、下記の配列番号１１に示す（ｐＵＣ５７中）。

［配列番号１１］

大西洋タラ由来のトリプシンＩの変異バージョンをコードするいくつかの核酸分子を、従来技術、すなわち、ＰＣＲによる定方向突然変異誘発によって合成した。

トリプシンのリフォールディング及び精製
化学的に有能な大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、標準手順、すなわち、熱衝撃形質転換を使用して、権利対象のセリンプロテアーゼポリペプチド（トリプシン）をコードするヌクレオチド配列を含むＥ３ベクターで形質転換した。

チモーゲンポリペプチド（トリプシノーゲン）を過剰発現させ、宿主細胞の細胞質中に封入体を形成した。

誘導後の細胞を採取し、音波処理によって溶解させた。遠心分離後、封入体を緩衝液中で洗浄し（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、８Ｍ 尿素、ｐＨ８．０に溶解した後、１倍ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４中、４℃で終夜透析した。

リフォールディングからの発現チモーゲンポリペプチドの純度は、９０％より高い純度を呈し、他の精製が必要であるとは考えられなかった。

次に、組換えチモーゲンポリペプチドを、大西洋タラ（０．２Ｕ／ｍＬ）から精製された野生型トリプシンＩを添加すること、及び室温で２４時間インキュベートすることによって活性化した（実施例Ｂを参照されたい）。

例示的なポリペプチド
以下のポリペプチドを入手または生成した。
（ａ）大西洋タラから精製された野生型トリプシンＩ（「ＷＴ−Ｔｒｙｐ」または「野生型」）、
（ｂ）大西洋タラの組換えにより発現された野生型トリプシンＩ（配列番号１、「Ｒ−ｔｒｙｐ」）、及び
（ｃ）大西洋タラのトリプシンＩの３８の異なる変異バージョン（すなわち、配列番号１の変異配列）。

タラトリプシンＩの３８の異なる変異バージョンの配列変異を表１に示す（上記）。

例示的なトリプシンポリペプチドを、Ｎ末端に融合された活性化ペプチドＭＥＥＤＫ（配列番号５）を用いて、チモーゲンポリペプチドとして最初に発現させた。

実施例Ｂ：組換えにより発現された大西洋タラのトリプシンＩの野生型及び変異形態の安定性
この実施例は、大腸菌中で発現された３９の組換えトリプシン変異体の活性化からの結果を要約する。組換えトリプシンポリペプチド（Ｒ−Ｔｒｙｐ）の活性を、２４時間のインキュベーション後に大西洋タラから精製された野生型トリプシン（ＷＴ−Ｔｒｙｐ）によって活性化した。

材料及び方法
組換えトリプシンの発現
実施例Ａを参照されたい。
安定性の評価
組換え試料の活性化及び安定性分析のために設計された実験を、以下のとおり行った（図１を参照されたい）。

１日目：組換えトリプシンの活性化
組換え酵素（０．２Ｕ／ｍＬ）を、野生型トリプシン（０．２Ｕ／ｍＬ）によって室温で２４時間、マイクロタイタープレート内で活性化した。試料を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０％グリセロール、ｐＨ７．６と最終量２００μＬになるまで混合した。

２日目：活性及び安定性の測定
活性化した組換え酵素を、新たなマイクロタイタープレート（ＩＩ）に移し、氷上で保持して、酵素を安定した状態で保持し、活性化プロセスを停止させた。

（ａ）初期活性Ａ０の決定
活性化酵素の活性（Ａ０）を、アッセイ緩衝液中２４５μＬのＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを、マイクロタイタープレート（ＩＩ）からの５μＬの組換え酵素と混合することによって、新たなマイクロタイタープレート（ＩＩＩ）において決定した。４１０ｎｍでの吸光度を追跡し、活性を以下の式に従って計算した。

ｓｌｏｐｅは、３０℃で２００秒間のトリプシン活性の反応速度測定からの線形回帰の傾斜であり、ｄｆは、希釈因子であり、６０は、分に対する秒変換であり、εは、８８００Ｍ^−１ｃｍ^−１に等しい伸び率であり、ｌは、０．７１０９ｃｍに等しい光路の長さであり、１０^３は、μｍｏｌ／ｍＬに対するｍｏｌ／Ｌ変換である。

（ｂ）温度不活性化
１００μＬの活性化酵素を、マイクロタイタープレート（ＩＩ）から新たなマイクロタイタープレート（ＩＶ）に移し、２００μＬに希釈して、最終濃度５０％のグリセロール、ｐＨ７．６にした。プレート（ＩＶ）を、６０℃で３．５時間インキュベートした（ＷＴ−Ｔｒｙｐは、初期活性の９０％を喪失した）。残留活性を（ａ）下と同様に決定した。

３日目：自己触媒
１００μＬの活性化酵素を、マイクロタイタープレート（ＩＩ）から、２５％グリセロール及びアッセイ緩衝液、ｐＨ７．６中１００μＬの０．１Ｕ／ｍＬトリプシンを含有する新たなマイクロタイタープレート（Ｖ）に移した。プレートを２５℃で８時間インキュベートした（ＷＴ−Ｔｒｙｐは、初期活性の９０％を喪失した）。活性（Ａ_ＡＸ）を（ａ）下と同様に決定した。

結果
３９の例示的なセリンプロテアーゼポリペプチドの活性、熱安定性及び自己触媒を、表３に報告する（組換え野生型タラトリプシン、ＥＺＡ−００１、及び３８のその変異体）。変異体間で著しい活性の差がある。いくつかの変異体は、わずか５％の残留活性を有した野生型トリプシンと比較して向上した温度安定性を示し、いくつかの変異体は、野生型トリプシンと比較して実質的に向上した自己触媒安定性を示した。

実施例Ｃ：タラトリプシンＩの組換え変異形態の活性測定
材料及び方法
組換えポリペプチドの発現
大西洋タラからのトリプシンＩの野生型アミノ酸配列に対応するポリペプチド、及び３８のその変異バージョンを、実施例Ａに記載の方法を使用して生成した。

活性化
組換え酵素（約０．０１ｍｇ／ｍＬ）の活性化を、野生型トリプシン（０．２Ｕ／ｍＬ）を室温で添加することによって達成し、２４時間インキュベートした。混合物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、５０％グリセロール、ｐＨ８．０中で作製して、最終量２００μＬにした。

反応速度定数を決定する活性アッセイ
基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を、１％ ＤＭＳＯを含有するアッセイ緩衝液中０．００５〜０．１５ｍＭの濃度で使用した。２４５μＬの基質溶液を、９６ウェルプレートにピペットで分注する。５μＬの試料混合物（上記）を添加することによって反応を開始させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーにおいて４１０ｎｍで監視した。反応速度測定を、連続１５分の実行において毎分行った。

結果
結果を下記の表４に示す。

実施例Ｄ：大腸菌中のＥＺＡ−０３４発現の株選択及び振とうフラスコ最適化
株選択
方法
例示的な変異体トリプシンＥＺＡ−０３４（表１を参照、配列番号４）を使用して発現最適化を行い、Ｎ末端に融合された活性化ペプチドＭＥＥＤＫ（配列番号５）を用いて、チモーゲンポリペプチドとして発現させた。

コードする核酸は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含んでいた。

［配列番号１２］

４ｍＬ ＬＢ培地中で４つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、及びＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を使用して、４つの条件、３７℃で６時間、２８℃で８時間、２２℃で１６時間、または１８℃で１６時間での１ｍＭ ＩＰＴＧそれぞれによる誘導で実験を行った。

結果及び結論
図２は、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）宿主細胞中のＥＺＡ−０３４の発現の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

下記の表５は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを操作することによって定量される、総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％を示す。

ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株は、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いた２８℃で８時間の誘導で、ＥＺＡ−０３４の最高の単位発現を呈した（細胞当たりの標的タンパク質の発現）。

発現最適化
方法
ＥＺＡ−０３４の発現最適化を、５０ｍＬの振とうフラスコ内で、２つの株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）を使用して行った。

３つの培地、すなわち、ＴＢ、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ＋０．５％グルコース−グリセロールを、１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導で、４つの条件（３７℃で６時間、２８℃で８時間、２２℃で１６時間、または１８℃で１６時間）のうちの１つで研究した。

結果及び結論
図３は、ＥＺＡ−０３４の発現の例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

下記の表６は、総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％を示す。％は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを走査することによって定量化した。

下記の表７は、試験した条件の湿細胞重量を示す。

下記の表８は、試験した条件のＥＺＡ−０３４の計算発現レベルを示す。

１ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導でのＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株及び１ｍＭ ＩＰＴＧによる１８℃で１６時間の誘導でのＢＬ２１（ＤＥ３）は、最高のＥＺＡ−０３４の発現を呈することが見出された。

最良の２つの培地は、ＴＢ及びＴＢ＋０．５％グルコースであった。

実施例Ｅ：５ＬスケールでのＥＺＡ−０３４の発酵最適化
培地及び株選択
方法
５Ｌ発酵におけるＥＺＡ−０３４の発現の最適化を、２つの大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）を使用して、３つの異なる培地中（ＴＢ＋０．５％グリセロール、ＴＢ＋０．５％グルコース、及びＴＢ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導）で行った。

結果及び結論
図４は、（Ａ）ＥＺＡ−０３４の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、（Ｂ）総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％のチャート表示（％は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを走査することによって定量化した）、（Ｃ）試験した条件の湿細胞重量のチャート表示、及び（Ｄ）試験した条件におけるＥＺＡ−０３４の計算発現レベルのチャート表示を示す。

０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導でのＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株を、ＥＺＡ−０３４の発現のためのフィード培養発酵に対して選択した。

５Ｌ発酵におけるフィード培養選択
方法
５Ｌ発酵におけるＥＺＡ−０３４の発現の最適化を、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株を使用し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる２２℃で１６時間の誘導で、ＴＢフィードグリセロール、ＴＢフィードグルコースまたはフィードなしの２倍ＴＢ中それぞれにおいて行った。種培養は３％であった。ｐＨを、３０％ ＮＨ_４ＯＨを添加することによって、またはフィード培養を添加することによって約６．８に制御した。溶解された酸素レベルに従い、気流を３Ｌ／分〜９Ｌ／分に制御した。

図５は、（Ａ）ＥＺＡ−０３４の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、（Ｂ）総細胞溶解物中のＥＺＡ−０３４の％のチャート表示（％は、対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥを走査することによって定量化した）、（Ｃ）試験した条件の湿細胞重量のチャート表示、及び（Ｄ）試験した条件におけるＥＺＡ−０３４の計算発現レベルのチャート表示を示す。

グリセロールのフィード培養は、最高の単位発現レベルをもたらし、誘導時のＯＤが同じとき、グリセロールフィード中のＥＺＡ−０３４の最終発現レベルは、グルコースフィードよりも高く、約１．９ｇ／Ｌである。

再現性試験は、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）中のＥＺＡ−０３４の発現レベルが、９回の再生成後も一定であることを示した（データ図示せず）。したがって、大規模生成及び長期保管に適している。

実施例Ｆ：ＥＺＡ−０３４の精製、内毒素除去、及びリフォールディング
封入体の洗浄
８，０００ｇの遠心分離により、４℃で２０分間細胞を収集し、湿潤ペレットを計量した。総１０ｇ／管の湿潤ペレットを再懸濁し、音波処理によって溶解緩衝液中にフルパワーの５０％で３秒間、氷上で６秒間、合計３０分間溶解した。封入体を、１３，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、以下のように洗浄した。

簡潔に言えば、洗浄緩衝液により４℃で撹拌することによって封入体を再懸濁し、フルパワーの５０％で３秒間、氷上で６秒間、合計１０分間の音波処理によって均質化し、１３，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。最後に、封入体を、４０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０中に可溶化し、３０分間室温でインキュベートした。試料を、４４，０００ｒｐｍで３０分間、１５℃で回転させた。そしてこの上清を更なる精製に使用した。

イオン交換カラムによる精製
精製樹脂及び樹脂の体積の最適化を行った。２０ｍＬの可溶化タンパク質（Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定されるとおり、９ｍｇ／ｍＬ）を、１ｍＬ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによって精製し、フロースルーを、１ｍＬ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによって精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、精製プロセスを分析した。

５ｍＬの可溶化タンパク質を、１ｍＬ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによって精製し、５ｍＬを、１ｍＬ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗによってそれぞれ精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、精製プロセスを分析した。

イオン交換Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用して、純度を向上させた。標的タンパク質はカラムに結合し、２０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの結合能力は、１ミリリットル当たり約２０ｍｇ ＥＺＡ−０３４であった。

ＥＺＡ−０３４のスケールアップ精製
合計４５ｇの湿潤ペレット（１リットルの発現から）を凍結させ、最適化条件を使用して封入体を洗浄し、可溶化した。合計１００ｍＬの可溶化タンパク質（９．０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（体積約５０ｍＬ）により、３．５ｍＬ／分の流量で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、４ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０（非ピロゲン）を、走行緩衝液として用いて精製し、１．８ｍＬの分画を収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、精製プロセスを分析する。

ＥＺＡ−０３４のリフォールディング最適化
精製したＥＺＡ−０３４（１０．０ｍｇ／ｍＬ、純度９５％、保管緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、３０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ ８．０であった）を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ７．６中でリフォールディングし、ＥＺＡ−０３４の濃度は、３ｍｇ／ｍＬに到達し得た。

ＥＺＡ−０３４のリフォールディングは、１倍ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４中でも可能である。

リフォールディング後のＥＺＡ−０３４の内毒素レベルは、ＬＡＬ方法によって決定して５〜１０ＥＵ／ｍｇの間であった。リフォールディング後のＥＺＡ−０３４の収率は、約５００ｍｇ／Ｌであり、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定して９５％より高かった。

実施例Ｇ：代替活性化ペプチドの評価
上記実施例では、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｎ末端に融合された活性化ペプチドＭＥＥＤＫ（配列番号５）を有するチモーゲンポリペプチドとして発現される。

この研究では、４つの異なる活性化ペプチドの作用を、大西洋タラの野生型トリプシン１のＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中の発現及びリフォールディングに関して試験した（下記の配列番号２を参照されたい）。

［配列番号２］

シグナルペプチド＝アミノ酸１〜１３（下線）
プロペプチド＝アミノ酸１４〜１９（太字斜体）
成熟トリプシン＝アミノ酸２０〜２４１

発現試験した、及び試験した４つの異型活性化ペプチドは以下のとおりであった。
（ａ）異型１

［配列番号１３］

（ｂ）異型２

［配列番号１４］

（ｃ）異型３

［配列番号１５］

（ｄ）異型４

［配列番号１６］

本研究では、以下の２つの活性化配列も対照として使用した。
（ｉ）ＦＡＥＤＤＫ…［配列番号１８］（「ｎＴｒｙｐｓｉｎ」、すなわちシグナル配列内の配列番号２）、及び
（ｉｉ）ＭＲＰＬＶＦＬＶＬＬＧＡＡ ＦＡＥＤＤＫ…［配列番号１７］（「ＡＮＣＨ」、アンチョビプレ−トリプシノーゲンから誘導された配列）
シグナルペプチド＝下線
プロペプチド＝太字斜体
…＝ＩＶＧＧで始まる成熟トリプシン配列

発現及びリフォールディングを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価し、各活性化ペプチドについて重複で行った（図６を参照されたい）。
参照文献
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Claims (111)

1. セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のための方法であって、
   （ａ）微生物宿主細胞またはその集団を、セリンプロテアーゼ活性を有するポリペプチドのＮ末端に融合された活性化ペプチドを含むチモーゲンポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換することであって、
   前記チモーゲンポリペプチドが、シグナル配列を欠失する、形質転換をすることと、
   （ｂ）前記チモーゲンポリペプチドを、前記宿主細胞（複数可）内で封入体として発現させることと、
   （ｃ）前記チモーゲンポリペプチドを、前記宿主細胞（複数可）から精製することと、
   （ｄ）前記チモーゲンポリペプチドを、トリプシンなどのプロテアーゼへの曝露によって活性化することと、を含み、
   ステップ（ｃ）が、前記チモーゲンポリペプチドを前記封入体から可溶化することと、前記ポリペプチドを生物活性形態にリフォールディングすることと、を含む、方法。
2. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、トリプシン活性を呈する、請求項１に記載の方法。
3. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列
   ［配列番号１］
   または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。
4. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、２５位にヒスチジンを含まない、請求項３に記載の方法。
5. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列
   
   ［配列番号３］
   または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項４に記載の方法。
6. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、１６０位にリジンを含まない、請求項３に記載の方法。
7. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列
   
   ［配列番号４］
   または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項６に記載の方法。
8. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、アミノ酸位置、
   Ｅ２１、Ｈ２５、Ｈ２９、Ｖ４７、Ｋ４９、Ｄ５０、Ｌ６３、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｒ７４、Ｎ７６、Ｔ７９、Ｙ８２、Ｓ８５、Ｓ８７、Ｎ９８、Ｉ９９、Ｖ１２１、Ｍ１３５、Ｖ１３８、Ｍ１４５、Ｖ１４８、Ｄ１５０、Ｋ１５４、Ｌ１６０、Ｍ１７５、Ｓ１７９、Ａ１８３、Ｌ１８５、Ｖ２１２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ａ２２９、Ｖ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３８、Ｍ２４２、Ｎ２４４、及び／または２４５からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸、
   または抗微生物活性を呈するその断片を含む配列番号１の異型であり、
   前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
   Ｅ２１Ｔ、Ｈ２５Ｙ、Ｈ２９（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４７Ｉ、Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｌ６３Ｉ、Ｈ７１Ｄ、Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７６（Ｔ／Ｌ）、Ｔ７９（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８２Ｆ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８７（Ｋ／Ｒ）、Ｓ８９Ｒ、Ｎ９８Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｍ１３５Ｑ、Ｖ１３８Ｉ、Ｍ１４５（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４８Ｇ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１６０（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７５（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７９Ｎ、Ａ１８３Ｖ、Ｌ１８５Ｇ、Ｖ２１２Ｉ、Ｙ２１７（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２９Ｖ、Ｖ２３３Ｎ、Ｌ２３４Ｙ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ、Ｎ２４４Ｓ、及び／またはＹ２４５Ｎからなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸、
   または抗微生物活性を呈するその断片を含む配列番号１の異型であり、
   前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項８に記載の方法。
10. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、アミノ酸位置、
    Ｅ２５、Ｈ２９、Ｈ３３、Ｖ４９、Ｋ５１、Ｄ５２、Ｌ６５、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｒ７５、Ｎ７７、Ｔ８０、Ｙ８３、Ｓ８６、Ｓ８８、Ｎ９９、Ｉ１００、Ｖ１２２、Ｍ１３４、Ｖ１３７、Ｍ１４４、Ｖ１４７、Ｄ１４９、Ｋ１５２、Ｌ１５８、Ｍ１７３、Ｓ１７７、Ａ１８１、Ｌ１８４、Ｖ２０８、Ｙ２１３、Ｐ２２１、Ａ２２５、Ｖ２２９、Ｌ２３０、Ｖ２３４、Ｍ２３８、Ｎ２４０、及び／またはＹ２４１からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号２の異型である、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
11. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
    Ｅ２５Ｔ、Ｈ２９Ｙ、Ｈ３３（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４９Ｉ、Ｋ５１Ｅ、Ｄ５２Ｑ、Ｌ６５Ｉ、Ｈ７２Ｄ、Ｈ７３Ｎ、Ｒ７５（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７７（Ｔ／Ｌ）、Ｔ８０（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８３Ｆ、Ｓ８６Ａ、Ｓ８８（Ｋ／Ｒ）、Ｎ９９Ｔ、Ｉ１００Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｍ１３４Ｑ、Ｖ１３７Ｉ、Ｍ１４４（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４７Ｇ、Ｄ１４９Ｓ、Ｋ１５２（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１５８（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７３（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７７Ｎ、Ａ１８１Ｖ、Ｌ１８４Ｇ、Ｖ２０８Ｉ、Ｙ２１３（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２１Ｙ、Ａ２２５Ｖ、Ｖ２２９Ｎ、Ｌ２３０Ｙ、Ｖ２３４Ｉ、Ｍ２３８Ｉ Ｎ２４０Ｓ、及び／またはＹ２４１Ｎからなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号２の異型である、請求項１０に記載の方法。
12. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、表１または２に定義されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、以下の定義された変異、
    （ａ）Ｎ２４４Ｓ、Ｙ２４５Ｎ、Ｓ８７Ｋ（「ＥＺＡ−００２」）、
    （ｂ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
    （ｃ）Ｋ１５４Ｌ（「ＥＺＡ−００４」）、
    （ｄ）Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−００５」）、
    （ｅ）Ｋ１５４Ｅ（「ＥＺＡ−００６」）、
    （ｆ）Ｎ９８Ｔ（「ＥＺＡ−００７」）、
    （ｇ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
    （ｈ）Ｌ１８５Ｇ、Ｐ２２５Ｙ（「ＥＺＡ−００９」）、
    （ｉ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
    （ｊ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｋ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
    （ｌ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
    （ｍ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
    （ｎ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
    （ｏ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
    （ｐ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
    （ｑ）Ｈ７１Ｄ（「ＥＺＡ−０１８」）、
    （ｒ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
    （ｓ）Ｒ７４Ｋ（「ＥＺＡ−０２０」）、
    （ｔ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
    （ｕ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
    （ｖ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
    （ｗ）Ｔ７９Ｓ（「ＥＺＡ−００２４」）、
    （ｘ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
    （ｙ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
    （ｚ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
    （ａａ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
    （ｂｂ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
    （ｃｃ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
    （ｄｄ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
    （ｅｅ）Ｍ１７５Ｑ（「ＥＺＡ−０３２」）、
    （ｆｆ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
    （ｇｇ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
    （ｈｈ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
    （ｉｉ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、
    （ｊｊ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、
    （ｋｋ）Ｖ２３８Ｉ（「ＥＺＡ−０３８」）、及び
    （ｌｌ）Ｌ２３４Ｙ（「ＥＺＡ−０３９」）
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、以下の定義された変異、
    （ａ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ
    （ｂ）Ｈ２５Ｎ、Ｈ２９Ｙ
    （ｃ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｄ）Ｈ２９Ｙ、Ｔ７９Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｅ）Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ、Ｙ２１７Ｈ
    （ｆ）Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ
    （ｇ）Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４Ｅ、Ｓ８７Ｋ
    （ｈ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ、Ｙ２１７Ｈ
    （ｉ）Ｔ７９Ｎ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ２１２Ｉ
    （ｊ）Ｈ２９Ｙ、Ｎ７６Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｋ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
    （ｌ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
    （ｍ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ８７Ｋ、Ｋ１５４Ｔ
    （ｎ）Ｈ２５Ｑ
    （ｏ）Ｈ２５Ｄ
    （ｐ）Ｈ２５Ｓ
    （ｑ）Ｋ２４Ｅ、Ｈ２５Ｎ
    （ｒ）Ｙ９７Ｎ
    （ｓ）Ｎ１００Ｄ
    （ｔ）Ａ１２０Ｓ、Ａ１２２Ｓ
    （ｕ）Ｍ１３５Ｅ
    （ｖ）Ｖ２０４Ｑ、Ａ１２２Ｓ
    （ｗ）Ｔ７９Ｄ
    （ｘ）Ｒ７４Ｄ
    （ｙ）Ｋ４９Ｅ
    （ｚ）Ｋ４９Ｓ、Ｄ５０Ｑ
    （ａａ）Ｄ５０Ｑ
    （ｂｂ）Ｑ１７８Ｄ
    （ｃｃ）Ｓ８７Ｒ
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、天然に存在するセリンプロテアーゼのアミノ酸を含む、またはそれからなる、請求項１に記載の方法。
16. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸を含む、またはそれからなる、請求項１５に記載の方法。
17. 前記活性化ペプチドが、以下の群、
    から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ステップ（ａ）において、トリプシノーゲンポリペプチドをコードする前記核酸分子が、大腸菌中での使用に適した発現ベクター内にある、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記発現ベクターが、Ｅ３である、請求項１８に記載の方法。
20. ステップ（ａ）における前記宿主細胞が、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌及びシュードアルテロモナス・ハロプランクティス）である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ステップ（ａ）における前記宿主細胞が、大腸菌宿主細胞（例えば、ＢＬ２１（Ｅ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、及びＨＭＳ１７４細胞）である、請求項２０に記載の方法。
22. ステップ（ａ）における前記宿主細胞が、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株の大腸菌宿主細胞である、請求項２０に記載の方法。
23. ステップ（ａ）における前記宿主細胞が、酵母菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
24. ステップ（ｃ）において、前記ポリペプチドを生物活性形態にリフォールディングすることが、前記ポリペプチドをＰＢＳ／グリセロール緩衝液と接触させることを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ＰＢＳ／グリセロール緩衝液が、１倍ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４である、請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ｃ）において、自己タンパク質分解の阻害剤（例えば、ベンズアミジン）が存在しない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ステップ（ｄ）において、大西洋タラトリプシンを使用して、前記チモーゲンポリペプチドを活性化する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ステップ（ｄ）において生成される前記活性化ポリペプチドの比活性が、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、または少なくとも６０Ｕ／ｍｇである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. ステップ（ｄ）において生成される前記活性化ポリペプチドの量が、少なくとも０．１ｍｇ、例えば、少なくとも０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、５ｍｇ、または１０ｍｇである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、セリンプロテアーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
31. 前記ポリペプチドが、トリプシン活性を呈する、請求項３０に記載の単離ポリペプチド。
32. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列、または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項３０または３１に記載の単離ポリペプチド。
33. 前記ポリペプチドが、２５位にヒスチジンを含まない、請求項３２に記載の単離ポリペプチド。
34. 配列番号２のアミノ酸配列、または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
35. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、１６０位にリジンを含まない、請求項３２に記載の単離ポリペプチド。
36. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列、または抗微生物活性を呈するその断片を含む、またはそれからなる、請求項３５に記載の単離ポリペプチド。
37. 前記ポリペプチドが、アミノ酸位置、
    Ｅ２１、Ｈ２５、Ｈ２９、Ｖ４７、Ｋ４９、Ｄ５０、Ｌ６３、Ｈ７１、Ｈ７２、Ｒ７４、Ｎ７６、Ｔ７９、Ｙ８２、Ｓ８５、Ｓ８７、Ｓ８９、Ｎ９８、Ｉ９９、Ｖ１２１、Ｍ１３５、Ｖ１３８、Ｍ１４５、Ｖ１４８、Ｄ１５０、Ｋ１５４、Ｌ１６０、Ｍ１７５、Ｓ１７９、Ａ１８３、Ｌ１８５、Ｖ２１２、Ｙ２１７、Ｐ２２５、Ａ２２９、Ｖ２３３、Ｌ２３４、Ｖ２３８、Ｍ２４２、Ｎ２４４、及び／またはＹ２４５からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含む配列番号１の異型であり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
38. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
    Ｅ２１Ｔ、Ｈ２５Ｙ、Ｈ２９（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４７Ｉ、Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｌ６３Ｉ、Ｈ７１Ｄ、Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７６（Ｔ／Ｌ）、Ｔ７９（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８２Ｆ、Ｓ８５Ａ、Ｓ８７（Ｋ／Ｒ）、Ｓ８９Ｒ、Ｎ９８Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｍ１３５Ｑ、Ｖ１３８Ｉ、Ｍ１４５（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４８Ｇ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１６０（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７５（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７９Ｎ、Ａ１８３Ｖ、Ｌ１８５Ｇ、Ｖ２１２Ｉ、Ｙ２１７（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２５Ｙ、Ａ２２９Ｖ、Ｖ２３３Ｎ、Ｌ２３４Ｙ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ、Ｎ２４４Ｓ、及び／またはＹ２４５Ｎからなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含む配列番号１の異型であり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項３７に記載の単離ポリペプチド。
39. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、アミノ酸位置、
    Ｅ２５、Ｈ２９、Ｈ３３、Ｖ４９、Ｋ５１、Ｄ５２、Ｌ６５、Ｈ７２、Ｈ７３、Ｒ７５、Ｎ７７、Ｔ８０、Ｙ８３、Ｓ８６、Ｓ８８、Ｎ９９、Ｉ１００、Ｖ１２２、Ｍ１３４、Ｖ１３７、Ｍ１４４、Ｖ１４７、Ｄ１４９、Ｋ１５２、Ｌ１５８、Ｍ１７３、Ｓ１７７、Ａ１８１、Ｌ１８４、Ｖ２０８、Ｙ２１３、Ｐ２２１、Ａ２２５、Ｖ２２９、Ｌ２３０、Ｖ２３４、Ｍ２３８、Ｎ２４０、及び／またはＹ２４１からなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号２の異型である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
40. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、
    Ｅ２５Ｔ、Ｈ２９Ｙ、Ｈ３３（Ｙ／Ｎ）、Ｖ４９Ｉ、Ｋ５１Ｅ、Ｄ５２Ｑ、Ｌ６５Ｉ、Ｈ７２Ｄ、Ｈ７３Ｎ、Ｒ７５（Ｋ／Ｅ）、Ｎ７７（Ｔ／Ｌ）、Ｔ８０（Ｓ／Ｎ）、Ｙ８３Ｆ、Ｓ８６Ａ、Ｓ８８（Ｋ／Ｒ）、Ｎ９９Ｔ、Ｉ１００Ｌ、Ｖ１２２Ｉ、Ｍ１３４Ｑ、Ｖ１３７Ｉ、Ｍ１４４（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｅ／Ｋ）、Ｖ１４７Ｇ、Ｄ１４９Ｓ、Ｋ１５２（Ｔ／Ｖ）、Ｌ１５８（Ｉ／Ａ）、Ｍ１７３（Ｋ／Ｑ）、Ｓ１７７Ｎ、Ａ１８１Ｖ、Ｌ１８４Ｇ、Ｖ２０８Ｉ、Ｙ２１３（Ｄ／Ｈ／Ｓ）、Ｐ２２１Ｙ、Ａ２２５Ｖ、Ｖ２２９Ｎ、Ｌ２３０Ｙ、Ｖ２３４Ｉ、Ｍ２３８Ｉ、Ｎ２４０Ｓ、及び／またはＹ２４１Ｎからなる群から選択される１つ以上の変異アミノ酸を含む配列番号２の異型である、請求項３９に記載の単離ポリペプチド。
41. セリンプロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、表１または２に定義されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
42. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｎ２４４Ｓ、Ｙ２４５Ｎ、Ｓ８７Ｋ（「ＥＺＡ−００２」）、
    （ｂ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
    （ｃ）Ｋ１５４Ｌ（「ＥＺＡ−００４」）、
    （ｄ）Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−００５」）、
    （ｅ）Ｋ１５４Ｅ（「ＥＺＡ−００６」）、
    （ｆ）Ｎ９８Ｔ（「ＥＺＡ−００７」）、
    （ｇ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
    （ｈ）Ｌ１８５Ｇ、Ｐ２２５Ｙ（「ＥＺＡ−００９」）、
    （ｉ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
    （ｊ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｋ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
    （ｌ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
    （ｍ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
    （ｎ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
    （ｏ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
    （ｐ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
    （ｑ）Ｈ７１Ｄ（「ＥＺＡ−０１８」）、
    （ｒ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
    （ｓ）Ｒ７４Ｋ（「ＥＺＡ−０２０」）、
    （ｔ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
    （ｕ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
    （ｖ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
    （ｗ）Ｔ７９Ｓ（「ＥＺＡ−００２４」）、
    （ｘ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
    （ｙ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
    （ｚ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
    （ａａ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
    （ｂｂ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
    （ｃｃ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
    （ｄｄ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
    （ｅｅ）Ｍ１７５Ｑ（「ＥＺＡ−０３２」）、
    （ｆｆ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
    （ｇｇ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
    （ｈｈ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
    （ｉｉ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、
    （ｊｊ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、
    （ｋｋ）Ｖ２３８Ｉ（「ＥＺＡ−０３８」）、及び
    （ｌｌ）Ｌ２３４Ｙ（「ＥＺＡ−０３９」）
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
43. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ
    （ｂ）Ｈ２５Ｎ、Ｈ２９Ｙ
    （ｃ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｄ）Ｈ２９Ｙ、Ｔ７９Ｎ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｅ）Ｉ９９Ｌ、Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ、Ｙ２１７Ｈ
    （ｆ）Ｖ１２１Ｉ、Ｌ１６０Ｉ
    （ｇ）Ｈ７２Ｎ、Ｒ７４Ｅ、Ｓ８７Ｋ
    （ｈ）Ｈ２５Ｎ、Ｍ１３５Ｑ、Ｙ２１７Ｈ
    （ｉ）Ｔ７９Ｎ、Ｖ１２１Ｉ、Ｖ２１２Ｉ
    （ｊ）Ｈ２９Ｙ、Ｎ７６Ｔ、Ｉ９９Ｌ、Ｍ１３５Ｑ
    （ｋ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
    （ｌ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ、Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ、Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ
    （ｍ）Ｈ２５Ｎ、Ｎ７６Ｔ、Ｓ８７Ｋ、Ｋ１５４Ｔ
    （ｎ）Ｈ２５Ｑ
    （ｏ）Ｈ２５Ｄ
    （ｐ）Ｈ２５Ｓ
    （ｑ）Ｋ２４Ｅ、Ｈ２５Ｎ
    （ｒ）Ｙ９７Ｎ
    （ｓ）Ｎ１００Ｄ
    （ｔ）Ａ１２０Ｓ、Ａ１２２Ｓ
    （ｕ）Ｍ１３５Ｅ
    （ｖ）Ｖ２０４Ｑ、Ａ１２２Ｓ
    （ｗ）Ｔ７９Ｄ
    （ｘ）Ｒ７４Ｄ
    （ｙ）Ｋ４９Ｅ
    （ｚ）Ｋ４９Ｓ，Ｄ５０Ｑ
    （ａａ）Ｄ５０Ｑ
    （ｂｂ）Ｑ１７８Ｄ
    （ｃｃ）Ｓ８７Ｒ
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項３０〜４２のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
44. 前記ポリペプチドが、天然に存在するセリンプロテアーゼのアミノ酸を含む、またはそれからなる、請求項３０に記載の単離ポリペプチド。
45. 前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸を含む、またはそれからなる、請求項４４に記載の単離ポリペプチド。
46. 大西洋タラ（Gadus morhua）から単離されたトリプシンＩに対して向上した安定性を呈する、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
47. 大西洋タラから単離された前記トリプシンＩが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項４６に記載の単離ポリペプチド。
48. 大西洋タラから単離されたトリプシンＩのトリプシンポリペプチドに対して向上した熱安定性を呈する、請求項４６または４７に記載の単離ポリペプチド。
49. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｋ１５４Ｅ（「ＥＺＡ−００６」）、
    （ｂ）Ｎ９８Ｔ（「ＥＺＡ−００７」）、
    （ｃ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
    （ｄ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
    （ｅ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｆ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
    （ｇ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
    （ｈ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
    （ｉ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
    （ｊ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
    （ｋ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
    （ｌ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
    （ｍ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
    （ｎ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
    （ｏ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
    （ｐ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
    （ｑ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
    （ｒ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
    （ｓ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
    （ｔ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
    （ｕ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
    （ｖ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
    （ｗ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、
    （ｘ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、及び
    （ｙ）Ｌ２３４Ｙ（「ＥＺＡ−０３９」）
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項４８に記載の単離ポリペプチド。
50. 大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した自己タンパク質分解安定性を呈する、請求項３０〜４９のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
51. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
    （ｂ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
    （ｃ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｄ）Ｙ２１７Ｈ（「ＥＺＡ−０１２」）、
    （ｅ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
    （ｆ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
    （ｇ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
    （ｈ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
    （ｉ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
    （ｊ）Ｒ７４Ｅ（「ＥＺＡ−０２１」）、
    （ｋ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
    （ｌ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
    （ｍ）Ｔ７９Ｓ（「ＥＺＡ−００２４」）、
    （ｎ）Ｔ７９Ｎ（「ＥＺＡ−０２５」）、
    （ｏ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
    （ｐ）Ｓ８７Ｒ（「ＥＺＡ−０２７」）、
    （ｑ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、
    （ｒ）Ｓ１７９Ｎ、Ｖ２３３Ｎ（「ＥＺＡ−０２９」）、
    （ｓ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
    （ｔ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
    （ｕ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
    （ｖ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
    （ｗ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
    （ｘ）Ｖ１２１Ｉ（「ＥＺＡ−０３６」）、及び
    （ｙ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項５０に記載の単離ポリペプチド。
52. 大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上したＫｃａｔを呈する、請求項３０〜５１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
53. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｈ２５Ｎ（「ＥＺＡ−０１６」）、
    （ｂ）Ｈ２９Ｙ（「ＥＺＡ−０１７」）、
    （ｃ）Ｈ７１Ｄ（「ＥＺＡ−０１８」）、
    （ｄ）Ｈ７２Ｎ（「ＥＺＡ−０１９」）、
    （ｅ）Ｎ７６Ｔ（「ＥＺＡ−０２２」）、
    （ｆ）Ｎ７６Ｌ、Ｙ８２Ｆ（「ＥＺＡ−０２３」）、
    （ｇ）Ｍ１４５Ｋ、Ｖ１４８Ｇ（「ＥＺＡ−０３１」）、
    （ｈ）Ｍ１７５Ｑ（「ＥＺＡ−０３２」）、
    （ｉ）Ｌ６３Ｉ、Ｓ８５Ａ（「ＥＺＡ−０３３」）、
    （ｊ）Ｌ１６０Ｉ（「ＥＺＡ−０３４」）、
    （ｋ）Ｖ１３８Ｉ、Ｌ１６０Ａ、Ａ１８３Ｖ（「ＥＺＡ−０３５」）、
    （ｌ）Ｖ４７Ｉ、Ｖ２３８Ｉ、Ｍ２４２Ｉ（「ＥＺＡ−０３７」）、及び
    （ｍ）Ｖ２３８Ｉ（「ＥＺＡ−０３８」）、
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項５２に記載の単離ポリペプチド。
54. 大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上したＫｍを呈する、請求項３０〜５３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
55. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
    （ｂ）Ｉ９９Ｌ（「ＥＺＡ−００８」）、
    （ｃ）Ｖ２１２Ｉ（「ＥＺＡ−００１０」）、
    （ｄ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｅ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
    （ｆ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、
    （ｇ）Ｈ２５Ｙ（「ＥＺＡ−０１５」）、
    （ｈ）Ｋ４９Ｅ、Ｄ５０Ｑ（「ＥＺＡ−０２６」）、
    （ｉ）Ｅ２１Ｔ、Ｈ７１Ｄ、Ｄ１５０Ｓ、Ｋ１５４Ｖ（「ＥＺＡ−０２８」）、及び
    （ｊ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項５４に記載の単離ポリペプチド。
56. 大西洋タラから単離されたトリプシンＩに対して向上した特異性定数（Ｋｃａｔ／Ｋｍ）を呈する、請求項３０〜５５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
57. 以下の定義された変異、
    （ａ）Ｋ１５４Ｔ（「ＥＺＡ−００３」）、
    （ｂ）Ｙ２１７Ｄ、Ｍ１７５Ｋ（「ＥＺＡ−０１１」）、
    （ｃ）Ｙ２１７Ｓ（「ＥＺＡ−０１３」）、
    （ｄ）Ａ２２９Ｖ（「ＥＺＡ−０１４」）、及び
    （ｅ）Ｍ１３５Ｑ（「ＥＺＡ−０３０」）、
    のうちの１つを有する配列番号１のアミノ酸、
    または抗微生物活性を呈するその断片を含み、またはそれからなり、
    前記アミノ酸ナンバリングが、タンパク質構造データバンク［ＰＤＢ］エントリー「２ＥＥＫ！」に従う、請求項５６に記載の単離ポリペプチド。
58. グリコシル化されていない、請求項３０〜５７のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
59. Ｌ−アミノ酸を含む、またはそれからなる、請求項３０〜５８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
60. 修飾または誘導体化された１つ以上のアミノ酸を含む、請求項３０〜５９のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
61. １つ以上のアミノ酸が、ＰＥＧ化、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、及び／またはアルキル化によって修飾または誘導体化される、請求項６０に記載の単離ポリペプチド。
62. 請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
63. 請求項６２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
64. 大腸菌中での使用に適している、請求項６３に記載の発現ベクター。
65. 請求項６２に記載の核酸分子または請求項６３もしくは６４に記載の発現ベクターを含む、微生物宿主細胞。
66. 前記宿主細胞が、細菌宿主細胞（例えば、大腸菌及びシュードアルテロモナス・ハロプランクティス）である、請求項６５に記載の宿主細胞。
67. 前記宿主細胞が、大腸菌宿主細胞（例えば、ＢＬ２１（Ｅ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）、及びＨＭＳ１７４細胞）である、請求項５９に記載の宿主細胞。
68. ステップ（ａ）における前記宿主細胞が、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株の大腸菌宿主細胞である、請求項６７に記載の宿主細胞。
69. 前記宿主細胞が、酵母菌宿主細胞（例えば、ピキア・パストリス）である、請求項６５に記載の宿主細胞。
70. 薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、緩衝液、または補助剤と一緒に、請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、治療組成物。
71. 口腔、鼻、肺、頬、局所、目、非経口（静脈内、皮下、髄腔内、及び筋肉内）、膣、及び直腸からなる群から選択される経路を介した投与に適している、請求項７０に記載の治療組成物。
72. 前記ポリペプチドが、口及び／または中咽頭の粘膜への送達に適した形態で提供される、請求項７０または７１に記載の治療組成物。
73. 前記ポリペプチドが、マウススプレー、舐剤、トローチ、チューイングガム、または液体で提供される、請求項７２に記載の治療組成物。
74. 前記ポリペプチドが、マウススプレーで提供される、請求項７３に記載の治療組成物。
75. 薬剤中で使用するための、請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
76. 微生物感染、炎症、及び創傷からなる群から選択される障害または病態の対象における治療または予防に使用するための、請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
77. 前記障害または病態が、微生物感染である、請求項７６に記載の使用のためのポリペプチド。
78. 前記微生物感染が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、寄生虫感染、及び酵母菌感染からなる群から選択される、請求項７７に記載の使用のためのポリペプチド。
79. 前記微生物感染が、細菌感染である、請求項７８に記載の使用のためのポリペプチド。
80. 前記微生物感染が、生物膜の形成を含む、請求項７９に記載の使用のためのポリペプチド。
81. 前記微生物感染が、歯周病である、請求項７９または８０に記載の使用のためのポリペプチド。
82. 前記微生物感染が、ウイルス感染である、請求項７７に記載の使用のためのポリペプチド。
83. 前記ウイルス感染が、感冒及びインフルエンザからなる群から選択される、請求項８２に記載の使用のためのポリペプチド。
84. 前記ウイルス感染が、腸内ウイルス（例えば、ヒトライノウイルスまたはコクサッキーＡウイルス）によって引き起こされる、請求項８２に記載の使用のためのポリペプチド。
85. 前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルスによって引き起こされる、請求項８２に記載の使用のためのポリペプチド。
86. 前記微生物感染が、真菌感染である、請求項７７に記載の使用のためのポリペプチド。
87. 前記真菌感染が、足白癬（水虫）及びカンジダ症（鵞口瘡）からなる群から選択される、請求項８６に記載の使用のためのポリペプチド。
88. 前記対象が、免疫不全を有する、またはそれに罹患しやすい、請求項７６〜８７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
89. 前記免疫不全が、続発性または後天性免疫不全であり、例えば、前記対象が、免疫抑制剤療法による治療を受けている、請求項８８に記載の使用のためのポリペプチド。
90. 前記免疫不全が、天然に存在し、例えば、前記免疫不全が、原発性免疫不全、癌（例えば、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫）、慢性感染症（例えば、後天性免疫不全症候群、すなわちＡＩＤＳ）、栄養失調、及び／または加齢に起因する、請求項８９に記載の使用のためのポリペプチド。
91. 前記微生物感染が、口及び／または中咽頭の感染である、請求項７６〜９０のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
92. 前記対象が、運動選手（例えば、マラソン走者）である、請求項７６〜８７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
93. 前記障害または病態が、炎症性障害または病態である、請求項７６に記載の使用のためのポリペプチド。
94. 前記炎症性障害または病態が、疼痛、急性炎症、慢性炎症、関節炎、炎症関節、滑液包炎、骨関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、敗血症性関節炎、線維筋痛、全身性エリテマトーデス、静脈炎、腱炎、発疹、乾癬、座瘡、湿疹、顔面脂漏性湿疹、及び手、顔、または首の湿疹からなる群から選択される、請求項９３に記載の使用のためのポリペプチド。
95. 前記障害または病態が、創傷である、請求項７６に記載の使用のためのポリペプチド。
96. 前記創傷が、急性外傷（火傷を含む）、局所潰瘍、瘢痕、ケロイド、腫れ物、及びいぼから選択される、請求項９５に記載の使用のためのポリペプチド。
97. 前記ポリペプチドが、創面切除（すなわち、感染、死滅、または剥離した皮膚をその他の点では健常な皮膚から除去する）及び／またはフィブリン塊の除去のためのものである、請求項９５または９６に記載の使用のためのポリペプチド。
98. 前記ポリペプチドが、１つ以上の追加の活性剤との併用のためのものである、請求項７６〜９７のいずれか一項に記載の使用のためのポリペプチド。
99. 前記追加の活性剤が、抗微生物剤（抗生物質、抗ウイルス薬、及び抗真菌薬を含む）、抗炎症薬（ステロイド及び非ステロイド抗炎症薬を含む）、ならびに防腐剤からなる群から選択される、請求項９８に記載の使用のためのポリペプチド。
100. 微生物感染、炎症、及び創傷からなる群から選択される障害または病態の対象における前記治療または予防のための薬剤の調製における、請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
101. 微生物感染、炎症、及び創傷からなる群から選択される障害または病態の対象における前記治療または予防のための方法であって、有効量の請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
102. 請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドの、対象における化粧療法としての使用。
103. 前記化粧療法が、以下の作用、
     （ａ）皮膚の角質除去（死細胞及び／または剥離皮膚細胞の除去）、
     （ｂ）皮膚のコラーゲン及びエラスチンの分解に対する保護、
     （ｃ）面疱溶解（ｃｏｍｅｄｏｌｙｔｉｃ）作用、
     （ｄ）眉間（しかめっ面）しわ線の低減もしくは予防、及び／または
     （ｅ）発毛の促進、のうちの１つ以上を前記対象に提供する、請求項１０２に記載の使用。
104. 有効量の請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象における化粧療法の方法。
105. 前記化粧療法が、以下の作用、
     （ａ）皮膚の角質除去（死細胞及び／または剥離皮膚細胞の除去）、
     （ｂ）皮膚のコラーゲン及びエラスチンの分解に対する保護、
     （ｃ）面疱溶解作用、
     （ｄ）眉間（しかめっ面）しわ線の低減もしくは予防、及び／または
     （ｅ）発毛の促進、のうちの１つ以上を前記対象に提供する、請求項１０４に記載の方法。
106. 請求項３０〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチドの、産業用薬剤としての使用。
107. 前記産業用薬剤が、
     （ａ）織物処理剤、
     （ｂ）生体触媒（例えば、医薬品の有機合成における）、
     （ｃ）洗浄／衛生剤（例えば、洗剤）、
     （ｄ）環境バイオレメディエーション剤（例えば、汚染を低減するための）、
     （ｅ）分子生物学剤、及び
     （ｆ）食品処理剤（例えば、乳製品製造における）である、請求項１０６に記載の使用。
108. 実質的に前記説明を参照して本書に定義されるとおりの、セリンプロテアーゼ活性を有する組換えポリペプチドの生成のための方法。
109. 実質的に前記説明を参照して本書に定義されるとおりの、単離ポリペプチド。
110. 実質的に前記説明を参照して本書に定義されるとおりの、医薬品における使用のためのポリペプチド。
111. 実質的に前記説明を参照して本書に定義されるとおりの、ポリペプチドの使用。