JP5353111B2 - Sars3clプロテアーゼの組換えタンパク質 - Google Patents
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Description
(1)天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、又は
前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
(2)前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である、上記(1)に記載の組換えタンパク質。
(3)前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸がイソロイシンである、上記(2)に記載の組換えタンパク質。
(4)以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質
(5)上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(7)上記(5)又は(6)に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
(8)上記(7)に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(9)上記(1)〜(4)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
(10)(1)〜(4)のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
(11)CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも1つの化合物またはその塩を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤。
(12)CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも1つの化合物またはその塩を含む、SARS治療用医薬組成物。
(13)CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも1つの化合物またはその塩を用いる、SARS 3CLプロテアーゼの阻害方法。
(14)CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも1つの化合物またはその塩を患者に投与することを含む、SARSの治療方法。
SARS CoVのSARS 3CLプロテアーゼは、SARS CoVの増殖のための主要酵素である。したがって、SARS 3CLプロテアーゼを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制することができ、結果としてSARSの治療につながると考えられる。このため、SARSの治療につながるようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質が求められていた。しかし、現在までに、SARSの治療につながるような有効な阻害物質は見つかっていない。SARS 3CLプロテアーゼに対する有効な阻害物質が見つからない原因は、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法がないことにあると考えられた。そこで、本発明者は、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を開発すべく検討を重ねた。
2.1.組換えタンパク質
本発明の組換えタンパク質は、天然型のSARS 3CLプロテアーゼと異なり、発現から比較的長時間の間分解がほとんど生じない変異型SARS 3CLプロテアーゼ(安定型SARS 3CLプロテアーゼ)である。この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いることで、例えば、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができる。SARS 3CLプロテアーゼは、SARS CoVの増殖に重要な役割を果たす。このため、SARS 3CLプロテアーゼの働きを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARS患者の治療につながる。したがって、SARS 3CLプロテアーゼに対する有効な阻害物質のスクリーニングは、SARSに対する有効な治療薬を開発につながる。
具体的には、本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質である。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン; B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸; C群:アスパラギン、グルタミン; D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸; E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン; F群:セリン、スレオニン、ホモセリン; G群:フェニルアラニン、チロシン。
他の基質切断反応の分析方法としては、たとえばquenched-FRET assayと呼ばれる方法がある(例えば、J.E.Blanchard et.al., Chemistry and Biology 11, 2004, 1445-1453.、C.J.Kuo et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 2004, 862-867.、及びY.C.Liu et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 2005,194-199.参照。)。この方法では、3CLプロテアーゼの基質ペプチドのN末端に蛍光化合物を、C末端に消光化合物を結合させたものを用いる。通常の状態でこのペプチド化合物にある一定波長の蛍光を照射しても、C末端に結合された消光化合物の影響によりN末端の蛍光化合物からの蛍光は観測されない。しかし、3CLプロテアーゼを作用させると基質ペプチド配列で切断が生じるため、蛍光化合物と消光化合物が離れてしまい、消光化合物の影響がなくなる。したがって、基質ペプチドの切断とともに蛍光が観測されるようになるので、この蛍光を測定することによって基質の切断を間接的に測定することができる。蛍光化合物としては、例えばanthranilate化合物などが、消光化合物としては、例えばnitorotyrosine化合物などを用いることができる。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
上述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが、以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることができる。
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明の組換えタンパク質を発現させるためには、発現ベクターに、上述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド(必要に応じ、当該ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーターやSD配列(宿主が原核細胞の場合)やKozak配列(宿主が真核細胞の場合)を、下流にターミネーターを、PCR等により付加しておく)が含まれるように挿入して構築される、組換えベクターが用いられる。上記転写プロモーター等、タンパク質の発現に必要な各要素は、当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、発現ベクターにもともと含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。発現ベクターに当該ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用する。
発現ベクターとしては、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保持し得るものであれば、限定はされず、それぞれの宿主細胞に適したベクターを適宜選択して使用することができる。
本発明の組換えタンパク質の発現は、上記組換えベクターを宿主となる細胞に導入して形質転換体を得、これを培養等することにより行うことができる。
宿主細胞としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の組換えタンパク質を発現し得るものであればよく、限定はされないが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細胞、各種植物細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ等が挙げられる。宿主細胞は、好ましくは、大腸菌である。
本発明の組換えタンパク質は、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを用いて製造することができる。
具体的には、まず、遺伝子組換え法の常法に従い、前述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むようにした組換えベクターを新たに調製するか、あるいは本発明の組換えタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むようにした組換えベクターを新たに調製する。後者の場合、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他のベクターに組み込んで発現させるようにしたものであってもよいし、宿主細胞のゲノムにコードされていて発現し得るものであってもよく、限定されない。
無細胞タンパク質合成によって産生された本発明の組換えタンパク質は、前述したようにクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
3.1.スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の組換えタンパク質に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害活性を有するものである。SARS 3CLプロテアーゼを阻害することでSARS CoVの増殖を抑制することができるので、本発明のスクリーニング方法によって得られる阻害物質は、SARSに対する治療に利用することができる。
ここで「接触」とは、本発明の組換えタンパク質と候補物質とを同一の反応系又は培養系に存在させることを意味する。接触には、例えば、本発明の組換えタンパク質が含まれる溶液と候補物質とを混合すること、本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換体の培養容器に候補物質を添加すること、及び本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換体を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。
ここでIC50値とは、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を50%阻害する候補物質の濃度を意味する。候補物質のIC50値は、本発明の組換えタンパク質と基質を接触させて基質を切断させる際に、そこに異なる濃度の候補物質を添加して、各添加濃度(用量)での本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性(反応)を算出し、用量-反応曲線を作成して、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を50%阻害する候補物質の添加濃度を算出することによって決定できる。
また、他の測定方法としては、例えば、先に説明したquenched-FRET assayがある。
(b)Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
(c)Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
(d)Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
(e)Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
(f)Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2))-CHO
(g)Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
(h)Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
ここで、上記(a)〜(h)のアミノ酸配列中、N末端側のAc-は、N末端がアセチル化していることを示す。また、C末端側の-CHOおよび-CH2OHは、それぞれ、C末端にアルデヒドおよびヒドロキシメチルを有することを示す。さらに、C末端側の-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOおよび-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OHは、それぞれ、-Gln(Me2)-CHOおよび-Gln(Me2)-CH2OH(Meはメチルを表す)と表記することができる。尚、上記(a)〜(h)の化合物は、実施例に記載の方法またはそれと同様の方法で合成することができる。
スクリーニング方法としては、例えば、上記それぞれの候補物質を混合物のままスクリーニングする方法がある。また、それぞれの候補物質(例えば化合物)の一部のみの構造が異なる混合物群を調製し、そのままスクリーニングする方法もある。後者の方法を使い、候補物質(例えば化合物)の基本骨格の中で構造の異なる部位を少しずつずらした混合物群のスクリーニング結果を比較することで、基本骨格のどの部分が最も阻害活性に寄与するかをすばやく見積もることができる。
本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明の組換えタンパク質を含む、前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットである。キットには、さらに、必要に応じて、緩衝液、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセサリー及び説明書からなる群から選択される少なくとも1つが含まれて良い。
キットに含まれる「緩衝液」には、「反応緩衝液」のほかに「洗浄液」も含まれる。「洗浄液」には、「反応緩衝液」と同じ溶媒、又はその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示することができる。
これらのキットを構成する各成分は、別個に用意しても良く、あるいは、支障がない限り共存させても良い。
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩(本明細書中で、本発明の化合物と呼ぶ場合がある。)を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤(本明細書中で、本発明の阻害剤と呼ぶ場合がある)を提供する。すなわち、本発明の阻害剤に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選ばれる少なくとも1つの化合物またはその塩である。本発明の1つの態様の阻害剤に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOまたはその塩である。本発明の阻害剤は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害することができる。本発明の1つの態様に係る阻害剤は、SARS CoVの増殖を阻害することができる。
本発明は、前記化合物またはその塩(本発明の化合物)を含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選ばれる少なくとも1つの化合物またはその塩である。本発明の1つの態様の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、またはその塩である。本発明の化合物における塩は、医薬的に許容される塩である。医薬的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩などの無機酸付加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしくは蓚酸塩などの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩などの塩が挙げられる。本発明の1つの態様によれば、医薬組成物は、SARSを治療するためのものである。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することができる。
前記剤形は常法にしたがって製剤化することができ、本発明のペプチドの他、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤形により投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤形、座剤等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静脈内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これに適当な添加剤(ヒト血清アルブミン等)を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与量は、例えば成人(60kg)の場合、1日当たり0.01〜1000mg、好ましくは0.1〜100mg、より好ましくは1〜30mgである。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投与は、例えば1日当たり、1回または2〜4回に分けてもよい。
また、本発明は、前記化合物またはその塩(本発明の化合物)を患者に投与することを含む、SARSの治療方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のSARS治療用医薬組成物を製造するための、前記化合物またはその塩(本発明の化合物)の使用を提供する。SARSの治療方法における、本発明の化合物の投与方法などは、上記医薬組成物で説明したのと同様である。また、本発明の化合物の使用における、医薬組成物の製造方法なども、上記医薬組成物で説明したのと同様である。
1.1 プラスミドおよび核酸の操作
pMAL-c2X(NEB BioLabs)をベースとした発現ベクターpMAL‐3CLを、山本典生先生(東京医科歯科大学)より供与していただいた。pMAL-3CLは、N末端側のマルトース結合タンパク質、6個のヒスチジンタグ及びFlagタグ(MBP-His-Flag)と完全長SARS 3CLプロテアーゼとを含む75kDaの融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターである。この融合タンパク質をエンテロキナーゼで処理することによって、融合タンパク質のN末端側のMBP-His FlagがSARS 3CLプロテアーゼから切り離され、MBP-His FlagのないSARS 3CLプロテアーゼが得られる。
尚、発現ベクターpMAL‐3CLは、例えば以下のようにして作製することができる。SARS CoV感染細胞からRNAを抽出し、RT-PCRで3CL protease コード領域をクローニングするが、その時にセンスプライマーにはBamH1認識配列、Hisタグ配列、Flag配列を5’側に付加し、アンチセンスプライマーにはSalI認識配列を付加しておく。PCR産物をBamH1 とSalIで切断し、pMAL-c2XのBamH1とSalIクローニング部位にリガーゼで組み込ませる。これにより、発現ベクターpMAL‐3CLを作製できる。
先ずpMAL-3CLから、次のプライマーを用いて完全長SARS 3CLプロテアーゼをコードする配列をPCR法により増幅した。
NheI部位を有するプライマー:5’- ccggctagcGGTTTTAGGAAAATGGCATTCC(配列番号5)
XhoI部位を有するプライマー:5’- ccgctcgagTTGGAAGGTAACACCAGAG(配列番号6)
すなわち、qET-3CLは、pET-21a(+)(ノバゲン)のNheI/XhoI部位にpGEM-3CLのSARS 3CLプロテアーゼをコードする断片に対応するNheI-XhoI断片を挿入することによって作製した。pET-3CLは、N末端側の3種類のアミノ酸(Met-Ala-Ser)と、C末端側の2種類のアミノ酸(Leu-Glu)及びHisタグと、完全長3CLプロテアーゼとを含む34kDaの融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターである。
3CL-R188Iプロテアーゼを構成するため、Stemmerらによって記述された逆PCR法によって、部位特異的変異誘発を行った(Stemmer et al. (1992) Enzymatic Inverse PCR: A Restriction Site Independent, Single-Fragment Method for High-Efficiency, Site-Directed Mutagenesis. BioTechniques 13, 214-220.)。点変異を生じさせるのに使用した鋳型はpGEM-3CLであり、使用したプライマーは次のものである。尚、下記プライマー中、下線を引いたヌクレオチドが変異を受けたものである。
5’- atctctCGTCTCCATACAAACTGCACAGGCTG(配列番号7)
5’- atctctCGTCTCTGTATGTCAACAAATGGACC(配列番号8)
PCR実施後、直線状の完全長プラスミドの両末端をBsmBI(CGTCTCN’NNNN)で消化した。これにより、直線状プラスミドの両末端には、オーバーハングが生じた。そして、このNNNNオーバーハングを利用して、直線状のプラスミドの両末端を連結し、pGEM-3CL-R188Iを得た。このライゲーションステップは直線状プラスミドの両末端に生じたNNNNオーバーハングを利用したものであるので、pGEM-3CL-R188Iには余分な配列が付加されない。このため、pGEM-3CL-R188Iの配列は、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番目〜第564番目のアルギニンに対応するコドンが、イソロイシンに対応するコドンに変わっていることを除きpGEM-3CLと同じである。
すなわち、pMAL-3CLの短いSphI-StyI断片およびpET-3CLの短いNheI-XhoI断片を、各々に対応するpGEM-3CL-R188Iの断片に置換することにより、発現ベクターpMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iを構成した。
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iで、大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)pLysをそれぞれ形質転換した。
形質転換した大腸菌株を、50μg ml-1のアンピシリンを含有する10mlのLB培地内で37℃で一晩増殖させ、ペレット化し、100mlの新鮮培地で2時間増殖させた。さらに、この大腸菌株に0.5mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて28℃で2時間振とうし、組換えタンパク質(3CL-R188Iプロテアーゼ)の発現を誘発した。この時、pMAL-3CL-R188Iで形質転換した大腸菌からは、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMBP-His-Flagが付加した融合タンパク質として発現し、pET-3CL-R188Iで形質転換した大腸菌からは、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMet-Ala-Serが付加し、そのC末端側にLeu-GluとHisタグが付加した融合タンパク質として発現した。
3CLプロテアーゼの分解について検討するため、C末端側にHis-タグを付加した3CLプロテアーゼのMetal Affinity Resinで処理した画分を基質として使用した。画分(約4μgのタンパク質)を0.05Uのエンテロキナーゼまたは0.5μgの精製した3CL-R188Lプロテアーゼとともに室温で14時間インキュベートした後、溶液を15% SDS-PAGEゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜にエレクトロブロットした。His-タグ付加3CLプロテアーゼおよびその切断された産物を、抗-His-タグのモノクローナル抗体(ノバゲン)、ビオチン化抗-マウスIgG(ベクター)、および増幅されたアルカリホスファターゼImmun-Blotアッセイキット(バイオ・ラッド)を使用して視覚化した。
Rinkアミド樹脂(4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノメチル)-フェノキシ樹脂) (Rink, H. (1987) Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin. Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790.)から出発するFmoc型固相ペプチド合成法(SPPS)( Atherton, E et al. (2004) Synthesis of Peptides and Peptidemimetics E22a, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp740-754.)に従い、以下の基質ペプチド(SO1, SO3, SR1)を合成した。
SO1; H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2(配列番号9)
SO3; H-Lys-Val-Ala-Thr-Val-Gln-Ser-Lys-Met-Ser-Asp-NH2(配列番号10)
SR1; H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-Gln-Thr-Ala-Gln-Ala-Ala-Gly-Thr-Asp-Thr-NH2(配列番号11)
上記各アミノ酸配列において、右端の-NH2は、これらのペプチドのC末端がアミドになっていることを示している。
SO3; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150 mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜20%)/30 分] 溶出時間8.58分、[M+H]+ 1192.288(計算値1192.637)。
SR1; HPLC [コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜50%)/30 分] 溶出時間11.07分、[M+H]+ 1633.758(計算値1633.794)。
分析HPLCを用いた基質ペプチドの切断アッセイにより、3CLプロテアーゼのタンパク質分解活性を検出した。具体的には、7mM DTTを含有する20mMトリス-HCl緩衝液 pH7.5中の各基質ペプチドを3CLプロテアーゼとともに37℃でインキュベートし、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いた分析HPLC(コスモシール製5C18逆相カラム、4.6×150mm)によって切断反応を監視した。各加水分解産物をMALDI-TOF MS分析によって同定した。
37℃での精製プロテアーゼ変異体による各基質の加水分解反応の初期速度測定値により、速度論的パラメータのKmおよびkcatを判定した。プロテアーゼを異なる最終濃度の各基質(0〜168μM)を含有する様々な溶液に添加することにより、各反応を開始した。異なる基質に対して切断活性が異なることから、酵素の最終濃度と消化時間は適宜変更した(変異型プロテアーゼで10〜170nM、反応時間15〜90分)。反応後、分析HPLC(コスモシール製5C18逆相カラム、4.6×150mm、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの10%〜20%直線勾配を使用)によって加水分解物を分析した。各基質のピーク面積の減少から初期消化速度を計算した。Kmを[S]/v対[S]([S]は基質の濃度、vは初期反応速度)のプロットから計算した。すべての反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
チオールプロテアーゼに対する代表的阻害物質E-64(Hanada, K. et al. (1978) Isolation and Characterization of E-64, a New Thiol Protease Inhibitor. Agric. Biol. Chem. 42, 523-528.)を(株)ペプチド研究所(大阪府箕面市、日本)から購入した。
尚、下記合成において、分取HPLC分析はELITE LaChrom system(OD, 220nm)(HITACHI)を用いて行った。このとき、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II (4.6x150 mm または10x250 mm)(Nacalai tesque)を用いた。
また、1H(300MHz)NMRおよび13C(75MHz)NMRのスペクトログラムをAM-300(Bruker)に記録した。化学シフトは、TMS(0ppm)またはCHCl3(1Hについては7.28ppm、また、13Cについては77.0ppm)に対するppmで表わした。
また、Autoflex-II(Bruker)により高分解能MALDI TOF-MSマススペクトルを測定した。 さらに、旋光度は、SEPA-300 polarimeter(HORIBA)を用いて、ナトリウムD線で測定した。
(1-1)Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Glu-OBut(1.28 g, 3 mmol)をCH2Cl2(10 ml)に溶解し、HN(Me)2塩酸塩(0.29 g, 3.56 mmol)、BOP(1.59 g, 3.56 mmol)、DIEA(1.91 ml, 12 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物をさらに精製することなくそのまま次のTFA処理を行った。目的物にanisole (0.65 ml, 6.0 mmol)とTFA (7.0 ml)を加え、室温で1時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣をヘキサンで洗浄した後減圧下で乾燥した。得られた残渣をDMF (10 ml)に溶解し、HN(OMe)Me塩酸塩(0.38 g, 3.90 mmol)、BOP(1.72 g, 3.90 mmol)、DIEA(1.70 ml, 11 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 1.13 g (85 %), [a]D 27 +46.7 (c 0.24, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 2.00 (m, 1H), 2.16 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.22 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.76 (br s, 1H), 5.91 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.31 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 7.75 (d, J=8.3 Hz, 2H); 13C NMR d; 27.72, 29.13, 32.29, 35.63, 37.24, 47.27, 51.04, 61.72, 67.09, 120.05, 125.23, 125.34, 127.15, 127.78, 141.37, 141.40, 143.89, 144.12, 156.39, 162.44, 171.99; MALDI TOF-MS; Calcd. 462.201 for C24H29N3O5Na, Found. 462.126 for [M+Na]+
Fmoc-Gln-N(OMe)Me (0.73 g, 1.66 mmol)をCH3CN (8 ml)に溶解し、Et2NH (8.6 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2(5 ml)に溶解し、Fmoc-Leu-OH (0.49 g, 1.39 mmol)、BOP(0.61 g, 1.39 mmol)、DIEA(0.44 ml, 2.77 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.60 g (91 %), [a]D 27 -27.6 (c 1.1, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.94 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 1H), 2.00 (br s, 1H), 2.14-2.21 (m, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.19-4.24 (m, 1H), 4.22 (d, J=6.9 Hz, 1H), 4.29-4.42 (m, 2H), 4.92 (br s, 1H), 5.40 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.32 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 22.06, 23.12, 24.77, 26.77, 29.18, 32.33, 35.70, 37.20, 42.19, 47.32, 49.64, 53.66, 61.71, 67.09, 120.06, 120.08, 125.22, 127.20, 127.82, 141.40, 143.97, 144.02, 156.19, 171.80, 172.36, 172.43; MALDI TOF-MS; Calcd. 575.285 for C30H40N4O6Na, Found. 575.174 for [M+Na]+
Fmoc-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 1.09 mmol)をCH3CN (6 ml)に溶解し、Et2NH (5.6 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2-DMF(2.5 ml-2.5 ml)に溶解し、Fmoc-Val-OH (0.44 g, 1.30 mmol)、BOP(0.58 g, 1.30 mmol)、DIEA(0.41 ml, 2.58 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.61 g (86 %), [a]D 27 -11.6 (c 1.0, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.86 (m, 12H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.97 (br s, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 2.37-2.39 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.03 (br t, J=7.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.31-4.53 (m, 3H), 4.92 (br s, 1H), 5.58 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 6.56 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 17.97, 19.38, 22.10, 23.03, 24.83, 29.20, 31.25, 35.73, 37.28, 41.79, 47.32, 49.56, 52.01, 60.61, 61.71, 67.24, 120.08, 125.22, 127.21, 127.84, 141.43, 144.05, 156.58, 171.32, 171.85, 172.36; MALDI TOF-MS; Calcd. 674.353 for C35H49N5O7Na, Found. 674.211 for [M+Na]+
Fmoc-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 0.92 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解し、Et2NH (4.8 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Ala-OH (0.34 g, 1.09 mmol)、BOP(0.49 g, 1.09 mmol)、DIEA(0.35 ml, 2.20 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.51 g (77 %), [a]D 27 -30.3 (c 0.90, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.87 (d, J=6.6 Hz, 6H), 0.93 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 3H), 1.51-1.67 (m, 3H), 1.95-2.14 (m, 3H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.88 (s, 6H), 3.17(s, 3H), 3.72 (s, 3H), 4.20 (t, J=7.2 Hz, 1H), 4.28-4.41 (m, 2H), 4.46 (br s, 1H), 4.57 (br s, 1H), 4.83 (br s, 1H), 5.08 (br s, 1H), 6.21 (br s, 1H), 7.24 (t, J=7.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.95 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.66, 19.42, 22.65, 22.88, 25.04, 27.92, 29.34, 31.51, 32.33, 35.58, 37.20, 42.06, 47.27, 49.01, 50.59, 51.76, 58.92, 61.79, 67.19, 120.06, 125.32, 127.17, 127.81, 141.39, 144.05, 162.49, 171.03, 172.07, 172.94; MALDI TOF-MS; Calcd. 745.390 for C38H54N6O8Na, Found. 745.199 for [M+Na]+
Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.56 g, 0.77 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解し、Et2NH (4.0 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Ser(But)-OH (0.36 g, 0.94 mmol)、BOP(0.41 g, 0.94 mmol)、DIEA(0.30 ml, 1.89 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.58 g (86 %), [a]D 27 -22.8 (c 0.15, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.84-0.92 (m, 12H), 1.15 (s, 9H), 1.34 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.55-1.63 (m, 3H), 1.89-1.99 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 2.36 (br s, 2H), 2.88 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.47 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.71 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.21 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.29-4.50 (m, 4H), 4.83 (br s, 1H), 4.94 (br s, 1H), 5.09 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 7.26 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 7.37 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (br d, J=6.9 Hz, 2H), 7.74 (br d, J=7.2 Hz, 2H), 7.83 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.51, 19.26, 22.36, 22.79, 24.95, 27.35, 27.90, 29.20, 31.57, 35.42, 37.09, 41.80, 47.15, 48.99, 51.67, 54.98, 58.70, 61.70, 62.20, 67.05, 119.89, 125.22, 127.02, 127.65, 141.26, 143.92, 162.34, 170.02, 171.00, 172.00; MALDI TOF-MS; Calcd. 888.041 for C45H66N7O10Na, Found. 888.253 for [M+Na]+
Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.57 g, 0.66 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解し、Et2NH (3.4 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Thr(But)-OH (0.33 g, 0.80 mmol)、BOP(0.35 g, 0.80 mmol)、DIEA(0.25 ml, 1.57 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2Oを加え、析出する沈殿を5%クエン酸水溶液、5%NaHCO3水溶液、水で洗浄した。DMF/Et2Oで再沈殿し、目的物(Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固形物として得た。収量 0.40 g (59 %), [a]D 27 -13.2 (c 0.68, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.93-0.95 (br s, 12H), 1.17 (s, 12H), 1.31 (s, 9H), 1.41 (br d, J=6.0 Hz, 3H), 1.67 (br s, 3H), 1.93 (br s, 1H), 2.13 (br s, 1H), 2.38 (br s, 3H), 2.92 (s, 3H), 2.97 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.51 (br s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.87 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 4.22 (br s, 4H), 4.42 (br s, 4H), 4.96 (br s, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.14-7.41 (m, 7H), 7.58 (br d, J=5.7 Hz, 2H), 7.77 (br d, J=6.3 Hz, 2H); 13C NMR d; 17.28, 17.35, 17.89, 19.33, 21.48, 23.24, 24.73, 27.45, 28.30, 29.08, 29.65, 35.51, 37.23, 40.50, 47.22, 49.11, 50.49, 51.89, 54.52, 59.07, 60.83, 61.58, 66.72, 67.19, 120.08, 124.98, 125.08, 127.12, 127.84, 141.39, 143.61, 143.75, 156.07, 162.36, 169.63, 171.05, 171.35, 171.94, 172.31; MALDI TOF-MS; Calcd. 1045.252 for C53H81N8O12Na, Found. 1045.426 for [M+Na]+
Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (78 mg, 75 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (1.5 ml-1.5 ml)に溶解し、Et2NH (0.59 ml)を加え、室温で60分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(3 ml)に溶解し、Ac2O(0.14 ml, 1.48 mmol)、DIEA(0.24 ml, 1.48 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2Oを加え、析出する沈殿をDMF/Et2Oで再沈殿し、目的物(Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固形物として得た。収量 40 mg (63 %), [a]D 27 -17.5 (c 0.20, DMF), 1H NMR (DMSO-d6) d;0.80-0.88 (m, 12H), 1.04 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H), 1.36-1.46 (m, 2H), 1.53-1.60 (m, 1H), 1.63-1.83 (m, 2H), 1.91 (s, 3H), 1.97 (m, 1H), 2.30 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 3.41-3.46 (m, 1H), 3.51-3.59 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.87-3.90 (m, 1H), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.30-4.39 (m, 4H), 4.71 (br s, 1H), 7.61-7.97 (m, 6H); 13C NMR d; 18.49, 18.92, 19.64, 21.94, 22.97, 23.54, 24.40, 27.57, 28.45, 30.75, 35.29, 37.01, 48.61, 53.60, 57.75, 58.10, 62.25, 67.50, 169.89, 170.98, 171.64, 172.23; MALDI TOF-MS; Calcd. 865.538 for C40H74N8O11Na, Found. 865.476 for [M+Na]+
Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (30 mg, 36 mmol)をDMF-THF (1.5 ml-1.5 ml)に溶解し、LiAlH4(30 mg)を加え、室温で90分撹拌した。反応液をセライトろ過し溶媒を減圧留去した。生成物をCosmosil 5C18 (10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 15% to 60% in 60 min) で精製した。目的物を含むピーク(42分に溶出)を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収量 5.2 mg (19 %) 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.82-0.93 (m, 12H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1.14 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 1.31-1.36 (m, 3H), 1.56-1.64 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.33 (m, 2H), 2.85 (br s, 3H), 2.97 (br s, 3H), 3.61-3.70 (m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.10-4.24 (m, 6H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 806.501 for C38H69N7O10Na, Found. 806.121 for [M+Na]+
得られた粉末 (7.1 mg, 9 mmol) にanisole (15 ml, 6.0 mmol)とTFA (0.5 ml)を加え、室温で2時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣にエーテル(5 ml)と0.1% aq.TFA (5 ml)を加えた。水層をエーテル(5 ml) で洗浄後、水層を凍結乾燥した。生成物をCosmosil 5C18 (10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 60 min) で精製した。目的物(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO)を含むピーク(25.6分に溶出)を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収量 1.8 mg (30 %), HPLC retention time, 14.36 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.84-0.94 (m, 12H), 1.14-1.17 (m, 3H), 1.33-1.37 (m, 3H), 1.56-1.63 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.32-2.35 (m, 2H), 2.84-2.87 (m, 3H), 2.94-2.99 (m, 3H), 3.74-3.76 (m, 1H), 3.81-3.85 (m, 1H), 4.17-4.33 (m, 6H), 4.77-4.82 (m, 1H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 694.375 for C30H53N7O10Na, Found. 694.337 for [M+Na]+
HPLC retention time, 18.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (CD3CN) d; 0.86-0.99 (m, 12H), 1.51-1.64 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.31-2.37 (m, 2H), 3.98 (br t, J=5.9 Hz, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.78-4.86 (m, 1H), 6.82 (br d, J=7.8 Hz, 2H), 6.96 (br d, J=8.7 Hz, 1H); MALDI TOF-MS; Calcd. 435.259 for C20H46N4O5Na, Found. 435.955 for [M+Na]+
HPLC retention time, 12.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (D2O) d; 0.86-0.94 (m, 12H), 1.33 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.57-1.67 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.00-2.22 (m, 3H), 2.45-2.49 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 4.08 (d, J=8.1 Hz, 1H), 4.28 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 2H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 506.296 for C23H41N5O6Na, Found. 506.216 for [M+Na]+
HPLC retention time, 14.38 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.85-0.92 (m, 12H), 1.36 (d, J=7.5 Hz, 3H), 1.56-1.66 (m, 3H), 1.98 (s, 3H), 2.07-2.10 (m, 1H), 2.30-2.35 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.64-3.69 (m, 1H), 3.77-3.83 (m, 1H), 4.00-4.02 (m, 1H), 4.19-4.30 (m, 23H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 593.328 for C26H46N6O8Na, Found. 593.258 for [M+Na]+
基質として前記合成ウンデカペプチドSO1を用い、阻害活性について検討した。上記のように、分析HPLCにより、様々な濃度の阻害物質の存在下における精製3CLプロテアーゼ変異体による基質の切断を監視した。阻害活性を、S字形用量-応答曲線から得られるIC50値を用いて評価した。反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
2.1.成熟3CLプロテアーゼの発現
本発明者は、大腸菌内で、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にMBP-His-Flagタグを結合した融合タンパク質を発現させた後、まず、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側のMBP-His-Flagタグを切断することによって、タグを結合していない3CLプロテアーゼ(成熟3CLプロテアーゼ)を得ようとした。
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、成熟3CLプロテアーゼとN末端側のMBP-His-Flagタグとからなる75kDaの融合タンパク質のエンテロキナーゼ消化(図2B)について注意深く検討した。金属アフィニティー樹脂処理後の試料では、融合タンパク質に対応する75kDaの産物が検出された(図2B、レーン1)。次に、前記画分を少量のエンテロキナーゼで15分間処理すると、目的の33kDaの産物がCoomassie染色でかすかに検出されるとともに、33kDaの産物の分解産物と考えられる産物として、20kDaおよび13kDaで2つのバンドも検出された(図2B、レーン2)。処理時間が30分、60分と経過すると33kDaのバンドは徐々に消失した(図2B、レーン3(30分)、レーン4(60分))。この新たに現れた13kDaのタンパク質は、免疫染色によって検出されるC末端側にHis-タグを付加した3CLプロテアーゼのタンパク質分解産物と同一であるように思われた(図4B、レーン2〜4)。13kDaのタンパク質をPVDFメンブランにブロッテングし、アミノ酸シークエンサーで解析したところ、産物のN末端側配列がGln-Thr-Ala-Gln-Alaであると判定された。この結果は、成熟3CLプロテアーゼが188Arg/189Gln部位で切断されることを示している。さらに、188Arg/189Gln部位を有するヘキサデカペプチドであるSR1基質を用いて、成熟3CLプロテアーゼが生成されるときにタンパク質分解活性が発現されるか検討した(図3B)。予想どおり、75kDaの融合タンパク質が通常のエンテロキナーゼ処理の間にヘキサデカペプチドを切断する一方(図3B; ピーク1、H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-OHの場合で[M+H]+ 690,282(計算値690.358))、同一条件下でエンテロキナーゼ単独によってSR1ペプチドを切断することができなかった。
ついで本発明者は、タンパク質分解に抵抗性を示す活性を持つ安定な3CLプロテアーゼを得るため、Arg-188が部位特異的変異誘発によりIleと置換された3CLプロテアーゼ変異体(3CL-R188I)を構築した。
3つの異なる基質(SO1、SO3、SR1)を用い、タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼ及びC末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼの触媒活性について検討した。その速度論的データを表1にまとめる。タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼは、SO1の消化を最も効率的に触媒した(Km=33.8μM、kcat=4753 s-1)。SO1基質におけるkcat/Kmと比較した場合、SO3およびSR1基質における相対効率はそれぞれ0.06および0.01であった。C末端側にHis-タグを有する3CL-R188Iのkcat/Km値は、kcat値が顕著な低下を示すことからタグが付加していない酵素の0.03倍である。一方、Km値における有意差は2種類のタンパク質間で全く認められなかった。この結果は、残基数個をC末端に付加すると3CLプロテアーゼの触媒効率が影響を受けることを示している。
タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼを用い、E-64および新規に合成した基質をベースとするアルデヒド型阻害物質の阻害効果を解析した。1.6mM E-64の存在下であっても、3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の分解は全く低下しなかった。それに対し、1.6mMのAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO(合成ペプチドアルデヒド1とも言う)は3CL-R188Iの活性をほぼ完全に阻害した。用量-応答曲線(図6)から、合成ペプチドアルデヒド1のIC50値が155μMであることが分かった。また、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO(それぞれ、合成ペプチドアルデヒド2〜4とも言う)も3CL-R188Iの活性を阻害する作用があることが分かった。図7の用量-応答曲線から、合成ペプチドアルデヒド2のIC50値が26μMであることが分かった。また、図8の用量-応答曲線から、合成ペプチドアルデヒド3のIC50値が〜6mMであることが分かった。さらに、図9の用量-応答曲線から、合成ペプチドアルデヒド4のIC50値が37μMであることが分かった。これらの結果を、下記表2にまとめる。
これまで成熟SARS CoV 3CLプロテアーゼタンパク質は大腸菌で発現することができ、その結晶構造も解析されていたが、今回、成熟3CLプロテアーゼがタンパク質分解による分解を受けやすいことが見いだされた。
エンテロキナーゼは本来の切断部位(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)のLys以外の塩基性残基でタンパク質を切断することが報告されているが、エンテロキナーゼが3CLプロテアーゼを分解することが明らかとなった(Collins-Racie, L.A. et al. (1995) Production of recombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the novel secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13, 982-987.)。
Claims (10)
- 配列番号4に示されるアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、又は
前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。 - 前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項1に記載の組換えタンパク質。
- 前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸がイソロイシンである、請求項2に記載の組換えタンパク質。
- 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 以下の(a)又は(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンであるタンパク質をコードするポリヌクレオチド - 請求項5又は6に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項7に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えタンパク質に候補物質を接触させ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の組換えタンパク質を含む、前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
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