JP5614477B2 - Ｓａｒｓ３ｃｌプロテアーゼの組換えタンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、SARS 3CLプロテアーゼの組換えタンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベク
ター、及び前記組換えタンパク質のSARS 3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリー
ニングする方法等に関する。
ター、及び前記組換えタンパク質のSARS 3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスクリー
ニングする方法等に関する。
重症急性呼吸器症候群（SARS)は、新型コロナウイルス（SARS CoV)の感染により発症す
る急性呼吸器疾患である（非特許文献1〜3）。2003年にSARS CoVの存在が確認されて以降
、SARS CoVを標的としたSARSの治療方法を開発すべく研究が進められているが、いまだSA
RSに対する有効な治療方法は確立されていない。
る急性呼吸器疾患である（非特許文献1〜3）。2003年にSARS CoVの存在が確認されて以降
、SARS CoVを標的としたSARSの治療方法を開発すべく研究が進められているが、いまだSA
RSに対する有効な治療方法は確立されていない。
SARS CoVは、ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルスであり、今日知られている中で最
大のウイルスRNAゲノムを有する（非特許文献４，５)。SARS CoVのゲノムRNAは、ポリタ
ンパク質1a(〜450kDa)および1ab(〜750kDa)という、重複配列を有する２種類の大きなタ
ンパク質をコードしている。ゲノムRNAがポリタンパク質1aおよび1abに翻訳され、さらに
、翻訳されたこの２種類のタンパク質が２種類もしくは３種類のウイルスプロテアーゼに
よって自己触媒的に切断されることで機能性ポリペプチドが生じる（非特許文献６）。こ
の切断は、主に、3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)と呼ばれる33kDaのプロテアーゼ
により行われる（非特許文献７，８）。3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)という名
前は、その基質特異性がピコルナウイルス3Cプロテアーゼのものに類似していることに由
来する。
大のウイルスRNAゲノムを有する（非特許文献４，５)。SARS CoVのゲノムRNAは、ポリタ
ンパク質1a(〜450kDa)および1ab(〜750kDa)という、重複配列を有する２種類の大きなタ
ンパク質をコードしている。ゲノムRNAがポリタンパク質1aおよび1abに翻訳され、さらに
、翻訳されたこの２種類のタンパク質が２種類もしくは３種類のウイルスプロテアーゼに
よって自己触媒的に切断されることで機能性ポリペプチドが生じる（非特許文献６）。こ
の切断は、主に、3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)と呼ばれる33kDaのプロテアーゼ
により行われる（非特許文献７，８）。3C-様プロテアーゼ（3CLプロテアーゼ)という名
前は、その基質特異性がピコルナウイルス3Cプロテアーゼのものに類似していることに由
来する。
天然型SARS 3CLプロテアーゼは、キモトリプシンフォールドを含むアミノ酸306残基か
らなるシステインプロテアーゼであり、ポリタンパク質1aおよび1abを、P1位置の保存さ
れたGlnやP1’位置の小さいアミノ酸（Ser、Ala又はGly)を含む１１個の保存部位で切断
する。活性型のSARS 3CLプロテアーゼはホモ二量体として存在し、各33kDaのプロトマー
は、２つの触媒残基(Cys−His)を含む活性部位を有する（図１）。
らなるシステインプロテアーゼであり、ポリタンパク質1aおよび1abを、P1位置の保存さ
れたGlnやP1’位置の小さいアミノ酸（Ser、Ala又はGly)を含む１１個の保存部位で切断
する。活性型のSARS 3CLプロテアーゼはホモ二量体として存在し、各33kDaのプロトマー
は、２つの触媒残基(Cys−His)を含む活性部位を有する（図１）。
このようにSARS 3CLプロテアーゼは、ウイルス生活環において機能的に重要な役割を果
たしており、SARS CoVの増殖に必須のタンパク質である。ウイルスの増殖に必須のSARS 3
CLプロテアーゼの働きを阻害することで、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARSの
治療にもつながると考えられる。このため、SARS 3CLプロテアーゼは、構造に基づいて行
うSARSに対する薬剤設計の魅力的な標的であり、これまでにいくつかのSARS 3CLプロテア
ーゼ阻害物質が報告されている（非特許文献９）。しかし、今日までSARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質は見つかっていない。
たしており、SARS CoVの増殖に必須のタンパク質である。ウイルスの増殖に必須のSARS 3
CLプロテアーゼの働きを阻害することで、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARSの
治療にもつながると考えられる。このため、SARS 3CLプロテアーゼは、構造に基づいて行
うSARSに対する薬剤設計の魅力的な標的であり、これまでにいくつかのSARS 3CLプロテア
ーゼ阻害物質が報告されている（非特許文献９）。しかし、今日までSARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質は見つかっていない。
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このような状況の下、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニン
グ方法が求められていた。
グ方法が求められていた。
本発明者は、SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を
開発すべく検討を重ねた。本発明者は、検討を重ねる中で、天然型のSARS 3CLプロテアー
ゼは、その発現と平行してその分解が進行していることを見出した。すなわち、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼは発現から比較的短時間で分解が進行する結果、安定なSARS 3CLプロ
テアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対
する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったことが分かった。本発明
者は、さらに検討を重ね、発現後比較的長時間の間分解がほとんど起こらない変異型SARS
3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。そして、本発明
者は、この開発した変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いてSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
をスクリーニングすることで、SARS 3CLプロテアーゼ阻害物質を効率的にスクリーニング
することができることを見出し、本発明を完成させた。
開発すべく検討を重ねた。本発明者は、検討を重ねる中で、天然型のSARS 3CLプロテアー
ゼは、その発現と平行してその分解が進行していることを見出した。すなわち、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼは発現から比較的短時間で分解が進行する結果、安定なSARS 3CLプロ
テアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対
する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったことが分かった。本発明
者は、さらに検討を重ね、発現後比較的長時間の間分解がほとんど起こらない変異型SARS
3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。そして、本発明
者は、この開発した変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いてSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
をスクリーニングすることで、SARS 3CLプロテアーゼ阻害物質を効率的にスクリーニング
することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、又は
前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテ
アーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
（２）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン
、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、ア
スパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である、上記（１）に記載
の組換えタンパク質。
（３）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸がイソロイシンである、上記
（２）に記載の組換えタンパク質。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド。
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７）上記（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（８）上記（７）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質に候補物質を接触さ
せ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をス
クリーニングする方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を含む、前記組換えタ
ンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
（１１）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤。
（１２）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS治療用医薬組成物。
（１３）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を用いる、SARS 3CLプロテアーゼの阻害方法。
（１４）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を患者に投与することを含む、SARSの治療方法。
（１）天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる、又は
前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテ
アーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
（２）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシン
、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、ア
スパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である、上記（１）に記載
の組換えタンパク質。
（３）前記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸がイソロイシンである、上記
（２）に記載の組換えタンパク質。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質
（５）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするポリヌ
クレオチド。
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（７）上記（５）又は（６）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（８）上記（７）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質に候補物質を接触さ
せ、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をス
クリーニングする方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を含む、前記組換えタ
ンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
（１１）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤。
（１２）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を含む、SARS治療用医薬組成物。
（１３）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を用いる、SARS 3CLプロテアーゼの阻害方法。
（１４）CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(
CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-S
er-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの
化合物またはその塩を患者に投与することを含む、SARSの治療方法。
本発明は、発現後比較的長時間の間分解がほとんど起こらない変異型SARS 3CLプロテア
ーゼ、及びその変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いて行うSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
の効率的なスクリーニング方法を提供する。
ーゼ、及びその変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いて行うSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質
の効率的なスクリーニング方法を提供する。
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ
とはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施
し得る。
とはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施
し得る。
１．概要
SARS CoVのSARS 3CLプロテアーゼは、SARS CoVの増殖のための主要酵素である。したが
って、SARS 3CLプロテアーゼを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制すること
ができ、結果としてSARSの治療につながると考えられる。このため、SARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質が求められていた。しかし、現在までに、SARSの
治療につながるような有効な阻害物質は見つかっていない。SARS 3CLプロテアーゼに対す
る有効な阻害物質が見つからない原因は、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物
質の効率的なスクリーニング方法がないことにあると考えられた。そこで、本発明者は、
SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を開発すべく検討
を重ねた。
SARS CoVのSARS 3CLプロテアーゼは、SARS CoVの増殖のための主要酵素である。したが
って、SARS 3CLプロテアーゼを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制すること
ができ、結果としてSARSの治療につながると考えられる。このため、SARSの治療につなが
るようなSARS 3CLプロテアーゼ阻害物質が求められていた。しかし、現在までに、SARSの
治療につながるような有効な阻害物質は見つかっていない。SARS 3CLプロテアーゼに対す
る有効な阻害物質が見つからない原因は、これまでSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物
質の効率的なスクリーニング方法がないことにあると考えられた。そこで、本発明者は、
SARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物質の効率的なスクリーニング方法を開発すべく検討
を重ねた。
本発明者は、天然型SARS 3CLプロテアーゼにMBP(マルトース結合タンパク質)−His（６
個のヒスチジン）−Flagタグを結合した融合タンパク質を用いた研究において、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼがその発現と平行して２つのタンパク質断片に分解され、その結果、
SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性が低下することを見出した。さらに、そのタンパク質断
片を用いた配列決定解析により、SARS 3CLプロテアーゼが第188番目のアミノ酸であるア
ルギニンと第189番目のアミノ酸であるグルタミンの間で分解を受けることが判明した。
すなわち、天然型SARS 3CLプロテアーゼの発現と平行してその分解が進行していた結果、
安定なSARS 3CLプロテアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3
CLプロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったと考
えられた。
個のヒスチジン）−Flagタグを結合した融合タンパク質を用いた研究において、天然型SA
RS 3CLプロテアーゼがその発現と平行して２つのタンパク質断片に分解され、その結果、
SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性が低下することを見出した。さらに、そのタンパク質断
片を用いた配列決定解析により、SARS 3CLプロテアーゼが第188番目のアミノ酸であるア
ルギニンと第189番目のアミノ酸であるグルタミンの間で分解を受けることが判明した。
すなわち、天然型SARS 3CLプロテアーゼの発現と平行してその分解が進行していた結果、
安定なSARS 3CLプロテアーゼを大量に調製することができず、このため、これまでSARS 3
CLプロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができなかったと考
えられた。
本発明者は、さらに検討を重ね、発現から比較的長時間分解がほとんど起こらない変異
型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。この本発
明の変異型SARS 3CLプロテアーゼは、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち
第188番目のアミノ酸がイソロイシン等の他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からな
る組換えタンパク質等である。天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目の位置のアルギ
ニンをイソロイシン等の他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時間の間分解
がほとんど起こらなくなり、SARS 3CLプロテアーゼの安定性が著しく向上した。後記の実
施例に示したように、天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目のアミノ酸をイソロイシ
ンに置換したアミノ酸配列からなる組換えタンパク質は、ウンデカペプチド基質SO1をＫm
＝33.8μMおよびkcat＝4753s−1の効率で消化することができた。
型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロテアーゼともいう）を開発した。この本発
明の変異型SARS 3CLプロテアーゼは、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち
第188番目のアミノ酸がイソロイシン等の他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からな
る組換えタンパク質等である。天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目の位置のアルギ
ニンをイソロイシン等の他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時間の間分解
がほとんど起こらなくなり、SARS 3CLプロテアーゼの安定性が著しく向上した。後記の実
施例に示したように、天然型SARS 3CLプロテアーゼの第188番目のアミノ酸をイソロイシ
ンに置換したアミノ酸配列からなる組換えタンパク質は、ウンデカペプチド基質SO1をＫm
＝33.8μMおよびkcat＝4753s−1の効率で消化することができた。
また、この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いてSARS 3CLプロテアーゼに対する阻害物
質のスクリーニングを行うことで、阻害物質を効率的にスクリーニングすることができた
。スクリーニングの結果、テトラペプチドアルデヒドAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH
3)2)-CHOがSARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を中程度に阻害する物質であること、及びシ
ステインプロテアーゼに対する代表的な阻害物質であるE−64がSARS 3CLプロテアーゼに
対する阻害活性をほとんど示さない物質であることが分かった。また、CH3CO-Thr-Ser-Al
a-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、お
よびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOも、SARS 3CLプロテアーゼの触
媒活性を阻害する物質であることが分かった。
質のスクリーニングを行うことで、阻害物質を効率的にスクリーニングすることができた
。スクリーニングの結果、テトラペプチドアルデヒドAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH
3)2)-CHOがSARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を中程度に阻害する物質であること、及びシ
ステインプロテアーゼに対する代表的な阻害物質であるE−64がSARS 3CLプロテアーゼに
対する阻害活性をほとんど示さない物質であることが分かった。また、CH3CO-Thr-Ser-Al
a-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、お
よびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOも、SARS 3CLプロテアーゼの触
媒活性を阻害する物質であることが分かった。
２．変異型SARS 3CLプロテアーゼ
２．１．組換えタンパク質
本発明の組換えタンパク質は、天然型のSARS 3CLプロテアーゼと異なり、発現から比較
的長時間の間分解がほとんど生じない変異型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロ
テアーゼ）である。この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いることで、例えば、SARS 3CL
プロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができる。SARS 3CLプ
ロテアーゼは、SARS CoVの増殖に重要な役割を果たす。このため、SARS 3CLプロテアーゼ
の働きを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARS患者の治
療につながる。したがって、SARS 3CLプロテアーゼに対する有効な阻害物質のスクリーニ
ングは、SARSに対する有効な治療薬を開発につながる。
２．１．組換えタンパク質
本発明の組換えタンパク質は、天然型のSARS 3CLプロテアーゼと異なり、発現から比較
的長時間の間分解がほとんど生じない変異型SARS 3CLプロテアーゼ（安定型SARS 3CLプロ
テアーゼ）である。この変異型SARS 3CLプロテアーゼを用いることで、例えば、SARS 3CL
プロテアーゼに対する阻害物質を効率的にスクリーニングすることができる。SARS 3CLプ
ロテアーゼは、SARS CoVの増殖に重要な役割を果たす。このため、SARS 3CLプロテアーゼ
の働きを阻害することができれば、SARS CoVの増殖を抑制することができ、SARS患者の治
療につながる。したがって、SARS 3CLプロテアーゼに対する有効な阻害物質のスクリーニ
ングは、SARSに対する有効な治療薬を開発につながる。
天然型のSARS 3CLプロテアーゼは、306アミノ酸残基からなるシステインプロテアーゼ
であり、活性型はホモ二量体を形成する。天然型SARS 3CLプロテアーゼをコードする遺伝
子のDNA配列を配列番号３（Accession No. AY345988）に、天然型SARS 3CLプロテアーゼ
のアミノ酸配列を配列番号４（Accession No.NP_828849）に示す。SARS 3CLプロテアーゼ
のＮ末端側にはキモトリプシン様触媒ドメイン（アミノ酸残基1〜184）があり、一方、Ｃ
末端側にはαへリックスドメイン（アミノ酸残基201〜303）がある。このうちＮ末端側の
キモトリプシン様触媒ドメインに関して、Ｎ末端側のキモトリプシン様触媒ドメインのみ
を発現した場合にSARS 3CLプロテアーゼの触媒効率が低下するということが報告されてい
る（Bacha, U. et al. (2004) Biochemistry 43, 4906-4912.）。また、Ｃ末端側のαへ
リックスドメインは、SARS 3CLプロテアーゼがホモ二量体を形成する時に、一方のプロト
マーのＮ末端が他方のプロトマーの活性部位と相互作用しうる位置にくるように２つのプ
ロトマーを導く役割を果たすと考えられている（Yang, H. et al. (2003) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.）。このようなＮ末端側のキモトリプシン様触媒ド
メインとＣ末端側のαへリックスドメインの間には、これらのドメインをつなぐ長いルー
プ領域（アミノ酸残基１８５〜２００）が存在する。天然型のSARS 3CLプロテアーゼでは
、その発現と平行して、自己触媒的作用によりこのループ領域で分解が生じる。天然型の
SARS 3CLプロテアーゼの切断箇所は、具体的には、第188番目のアミノ酸であるアルギニ
ン（Arg）と第189番目のアミノ酸であるグルタミン（Gln）の間であると考えられる。
であり、活性型はホモ二量体を形成する。天然型SARS 3CLプロテアーゼをコードする遺伝
子のDNA配列を配列番号３（Accession No. AY345988）に、天然型SARS 3CLプロテアーゼ
のアミノ酸配列を配列番号４（Accession No.NP_828849）に示す。SARS 3CLプロテアーゼ
のＮ末端側にはキモトリプシン様触媒ドメイン（アミノ酸残基1〜184）があり、一方、Ｃ
末端側にはαへリックスドメイン（アミノ酸残基201〜303）がある。このうちＮ末端側の
キモトリプシン様触媒ドメインに関して、Ｎ末端側のキモトリプシン様触媒ドメインのみ
を発現した場合にSARS 3CLプロテアーゼの触媒効率が低下するということが報告されてい
る（Bacha, U. et al. (2004) Biochemistry 43, 4906-4912.）。また、Ｃ末端側のαへ
リックスドメインは、SARS 3CLプロテアーゼがホモ二量体を形成する時に、一方のプロト
マーのＮ末端が他方のプロトマーの活性部位と相互作用しうる位置にくるように２つのプ
ロトマーを導く役割を果たすと考えられている（Yang, H. et al. (2003) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.）。このようなＮ末端側のキモトリプシン様触媒ド
メインとＣ末端側のαへリックスドメインの間には、これらのドメインをつなぐ長いルー
プ領域（アミノ酸残基１８５〜２００）が存在する。天然型のSARS 3CLプロテアーゼでは
、その発現と平行して、自己触媒的作用によりこのループ領域で分解が生じる。天然型の
SARS 3CLプロテアーゼの切断箇所は、具体的には、第188番目のアミノ酸であるアルギニ
ン（Arg）と第189番目のアミノ酸であるグルタミン（Gln）の間であると考えられる。
本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第18
8番目のアミノ酸（アルギニン）を他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時
間の間分解がほとんど生じないような安定型のSARS 3CLプロテアーゼとすることができた
ものである。
具体的には、本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配
列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は前記置換
されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性
を有する、組換えタンパク質である。
8番目のアミノ酸（アルギニン）を他のアミノ酸に置換することで、発現から比較的長時
間の間分解がほとんど生じないような安定型のSARS 3CLプロテアーゼとすることができた
ものである。
具体的には、本発明の組換えタンパク質は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配
列のうち第188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、又は前記置換
されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のアミノ酸が欠
失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ3CLプロテアーゼ活性
を有する、組換えタンパク質である。
上記第188番目のアミノ酸と置換される他のアミノ酸（以下、置換可能なアミノ酸とも
いう）としては、アルギニン以外のアミノ酸であれば特に限定されず、例えば、残りの１
９種の生体内のアミノ酸を挙げることができる。本発明の好ましい態様によれば、置換可
能なアミノ酸は他の酵素の認識部位になりにくいアミノ酸であり、そのようなアミノ酸と
しては、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ト
リプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択さ
れるアミノ酸を挙げることができる。置換可能なアミノ酸は、より好ましくは、イソロイ
シンである。
いう）としては、アルギニン以外のアミノ酸であれば特に限定されず、例えば、残りの１
９種の生体内のアミノ酸を挙げることができる。本発明の好ましい態様によれば、置換可
能なアミノ酸は他の酵素の認識部位になりにくいアミノ酸であり、そのようなアミノ酸と
しては、例えばイソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、メチオニン、ト
リプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択さ
れるアミノ酸を挙げることができる。置換可能なアミノ酸は、より好ましくは、イソロイ
シンである。
上記「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された」とは、
同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のア
ミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及
び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は
相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバ
リン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、
t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イ
ソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C
群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミ
ノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-
ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニ
ン、チロシン。
同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のア
ミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及
び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は
相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバ
リン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、
t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イ
ソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C
群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミ
ノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-
ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニ
ン、チロシン。
上記「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された」とは、
例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、
１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１
個若しくは１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたことを意味する
。「１〜数個」とは、例えば、１〜１０個、1〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、
１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個を意味する。
例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、
１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１
個若しくは１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたことを意味する
。「１〜数個」とは、例えば、１〜１０個、1〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、
１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個を意味する。
上記第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び
／又は付加されたアミノ酸配列は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第
188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と例えば８０％以上、８５
％以上、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９
５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などがあげられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
／又は付加されたアミノ酸配列は、天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第
188番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列と例えば８０％以上、８５
％以上、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９
５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有するアミノ酸
配列などがあげられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
ここで、「3CLプロテアーゼ活性を有する」とは、システインプロテアーゼとして働く
こと、例えば、SARS CoVのゲノムRNAがコードするポリタンパク質１ａやポリタンパク質
１ａｂ等の基質をプロセッシングすることができることを意味する。3CLプロテアーゼ活
性を有するか否かは、例えば次のようにして判断することができる。先ず、精製した組換
えタンパク質に基質を接触させ、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）などにより基質切
断反応の分析を行い、Michaelis定数（Km）、速度定数（ｋcat）及びｋcat/Kmを求める。
そして、前記天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質のｋcat/Kmを１とした
とき、前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個
のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパ
ク質のｋcat/Kmの相対比が、例えば0.2以上、より好ましくは0.4以上、0.6以上、0.8以上
、0.9以上、1.0以上、1.5以上、又は2.0以上である場合に、該欠失、置換、挿入及び／又
は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質が3CLプロテアーゼ活性を有すると
判断することができる。
他の基質切断反応の分析方法としては、たとえばquenched-FRET assayと呼ばれる方法
がある（例えば、J.E.Blanchard et.al., Chemistry and Biology 11, 2004, 1445-1453.
、C.J.Kuo et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 2004, 862-867.、及びY.C.L
iu et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 2005,194-199.参照。）。この方法
では、3CLプロテアーゼの基質ペプチドのN末端に蛍光化合物を、C末端に消光化合物を結
合させたものを用いる。通常の状態でこのペプチド化合物にある一定波長の蛍光を照射し
ても、C末端に結合された消光化合物の影響によりN末端の蛍光化合物からの蛍光は観測さ
れない。しかし、3CLプロテアーゼを作用させると基質ペプチド配列で切断が生じるため
、蛍光化合物と消光化合物が離れてしまい、消光化合物の影響がなくなる。したがって、
基質ペプチドの切断とともに蛍光が観測されるようになるので、この蛍光を測定すること
によって基質の切断を間接的に測定することができる。蛍光化合物としては、例えばanth
ranilate化合物などが、消光化合物としては、例えばnitorotyrosine化合物などを用いる
ことができる。
こと、例えば、SARS CoVのゲノムRNAがコードするポリタンパク質１ａやポリタンパク質
１ａｂ等の基質をプロセッシングすることができることを意味する。3CLプロテアーゼ活
性を有するか否かは、例えば次のようにして判断することができる。先ず、精製した組換
えタンパク質に基質を接触させ、HPLC（高速液体クロマトグラフィー）などにより基質切
断反応の分析を行い、Michaelis定数（Km）、速度定数（ｋcat）及びｋcat/Kmを求める。
そして、前記天然型SARS 3CLプロテアーゼのアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸が
他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質のｋcat/Kmを１とした
とき、前記置換されたアミノ酸配列のうち第188番目のアミノ酸を除く１若しくは複数個
のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパ
ク質のｋcat/Kmの相対比が、例えば0.2以上、より好ましくは0.4以上、0.6以上、0.8以上
、0.9以上、1.0以上、1.5以上、又は2.0以上である場合に、該欠失、置換、挿入及び／又
は付加されたアミノ酸配列からなる組換えタンパク質が3CLプロテアーゼ活性を有すると
判断することができる。
他の基質切断反応の分析方法としては、たとえばquenched-FRET assayと呼ばれる方法
がある（例えば、J.E.Blanchard et.al., Chemistry and Biology 11, 2004, 1445-1453.
、C.J.Kuo et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 318, 2004, 862-867.、及びY.C.L
iu et.al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 2005,194-199.参照。）。この方法
では、3CLプロテアーゼの基質ペプチドのN末端に蛍光化合物を、C末端に消光化合物を結
合させたものを用いる。通常の状態でこのペプチド化合物にある一定波長の蛍光を照射し
ても、C末端に結合された消光化合物の影響によりN末端の蛍光化合物からの蛍光は観測さ
れない。しかし、3CLプロテアーゼを作用させると基質ペプチド配列で切断が生じるため
、蛍光化合物と消光化合物が離れてしまい、消光化合物の影響がなくなる。したがって、
基質ペプチドの切断とともに蛍光が観測されるようになるので、この蛍光を測定すること
によって基質の切断を間接的に測定することができる。蛍光化合物としては、例えばanth
ranilate化合物などが、消光化合物としては、例えばnitorotyrosine化合物などを用いる
ことができる。
本発明の好ましい態様の組換えタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）の組換えタンパ
ク質である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
ク質である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において第188番目のアミノ酸を除く１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、か
つ3CLプロテアーゼ活性を有する、組換えタンパク質。
上記（ａ）のタンパク質は、配列番号２に示すように、天然型SARS 3CLプロテアーゼを
構成する３０６個のアミノ酸配列のうち、第188番目のアミノ酸であるアルギニン（Arg，
R）が、アルギニン以外のアミノ酸であるイソロイシン（Ile，I）に置換された組換えタ
ンパク質（R188I）である。
構成する３０６個のアミノ酸配列のうち、第188番目のアミノ酸であるアルギニン（Arg，
R）が、アルギニン以外のアミノ酸であるイソロイシン（Ile，I）に置換された組換えタ
ンパク質（R188I）である。
ここで、アミノ酸の表記は、一般に、３文字（「Arg」及び「Ile」等）又は１文字（「
R」及び「I」等）のアルファベットで表す。そして、例えば「R188I」と表示した場合、
数字「188」は置換されるアミノ酸の位置を表し、数字の前に表示したアルファベットは
置換前のアミノ酸を表し、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸を表す
。したがって、「Ｒ188Ｉ」は、第188番目のアルギニンをイソロイシンに置換したことを
意味する。
R」及び「I」等）のアルファベットで表す。そして、例えば「R188I」と表示した場合、
数字「188」は置換されるアミノ酸の位置を表し、数字の前に表示したアルファベットは
置換前のアミノ酸を表し、数字の後に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸を表す
。したがって、「Ｒ188Ｉ」は、第188番目のアルギニンをイソロイシンに置換したことを
意味する。
尚、上記（ｂ）のタンパク質における、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、
挿入及び／又は付加された」と「3CLプロテアーゼ活性を有する」に関しては、組換えタ
ンパク質に関する先の説明を同様に適用することができる。
挿入及び／又は付加された」と「3CLプロテアーゼ活性を有する」に関しては、組換えタ
ンパク質に関する先の説明を同様に適用することができる。
２．２．組換えポリヌクレオチド
上述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが
、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることがで
きる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上述した本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されないが
、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることがで
きる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列から
なるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドであって、3CLプロテアーゼ活性を有し、かつ、第188番目のアミノ酸がイソロイシンで
あるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
上記（ａ）のポリヌクレオチド（具体的にはDNA。以下、これらを単に「DNA」とも称す
る）は、配列番号１に示すように、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列のうち、
翻訳後に第188番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるように、塩基を置換変異させ
たものである。具体的には、第562番目〜第564番目の塩基について、イソロイシンのコド
ンに対応するように「aga」を「ata」に変異させたものである。第188番目のアミノ酸を
イソロイシンに置換する場合、「aga」を「ata」に変異させる他、「aga」を「atc」や「
att」に変異させるようにしても良い。
る）は、配列番号１に示すように、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列のうち、
翻訳後に第188番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるように、塩基を置換変異させ
たものである。具体的には、第562番目〜第564番目の塩基について、イソロイシンのコド
ンに対応するように「aga」を「ata」に変異させたものである。第188番目のアミノ酸を
イソロイシンに置換する場合、「aga」を「ata」に変異させる他、「aga」を「atc」や「
att」に変異させるようにしても良い。
上記（ａ）のDNAは、翻訳後に第188番目のアミノ酸がイソロイシンに置換されるように
塩基を置換変異させたものであるが、本発明はこれに限定されず、翻訳後に第188番目の
アミノ酸がアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されるように、塩基を置換変異させたも
のでも良い。アルギニンを除く他のアミノ酸としては、前述した例示が同様に適用できる
。そして第562番目〜第564番目の塩基について、アルギニンを除く他のアミノ酸のコドン
に対応するように、「aga」を変異させれば良い。
塩基を置換変異させたものであるが、本発明はこれに限定されず、翻訳後に第188番目の
アミノ酸がアルギニンを除く他のアミノ酸に置換されるように、塩基を置換変異させたも
のでも良い。アルギニンを除く他のアミノ酸としては、前述した例示が同様に適用できる
。そして第562番目〜第564番目の塩基について、アルギニンを除く他のアミノ酸のコドン
に対応するように、「aga」を変異させれば良い。
このような変異置換型DNAは、一般には、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2n
d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecula
r Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調
製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部
位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuickChangeTM Site-Direc
ted Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesi
s System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan
-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて調製することができる。
d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecula
r Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の部位特異的変位誘発法に準じて調
製することができる。具体的には、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部
位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuickChangeTM Site-Direc
ted Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesi
s System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan
-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて調製することができる。
また、後述する実施例に記載のPCRプライマーを用い、SARS 3CLプロテアーゼをコード
する塩基配列を含むDNA等を鋳型として適当な条件下PCRを行うことにより調製することも
できる。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、限定されないが、正確性の高いDNAポリメラー
ゼであることが好ましく、例えば、Pwo DNA（ポリメラーゼロシュ・ダイアグノスティッ
クス）、Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナPfx DNAポリメラーゼ（インビトロ
ジェン）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。PCRの反応条件は、用いるDNA
ポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等によって異なるが、９０〜９８℃
で５〜３０秒（熱変性）、５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）、６５〜８０℃で
３０〜１２００秒（伸長）のセットを1サイクルとして２０〜２００サイクル、特には２
０〜３５サイクル行うようにすることが好ましい。
する塩基配列を含むDNA等を鋳型として適当な条件下PCRを行うことにより調製することも
できる。PCRに用いるDNAポリメラーゼは、限定されないが、正確性の高いDNAポリメラー
ゼであることが好ましく、例えば、Pwo DNA（ポリメラーゼロシュ・ダイアグノスティッ
クス）、Pfu DNAポリメラーゼ（プロメガ）、プラチナPfx DNAポリメラーゼ（インビトロ
ジェン）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）等が好ましい。PCRの反応条件は、用いるDNA
ポリメラーゼの最適温度、合成するDNAの長さや種類等によって異なるが、９０〜９８℃
で５〜３０秒（熱変性）、５０〜６５℃で５〜３０秒（アニーリング）、６５〜８０℃で
３０〜１２００秒（伸長）のセットを1サイクルとして２０〜２００サイクル、特には２
０〜３５サイクル行うようにすることが好ましい。
上記（ｂ）のDNAは、上記（ａ）のDNA若しくはそれと相補的な塩基配列からなるDNA、
又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラー
クハイブリダイゼーション等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラ
リーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製さ
れたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用して
もよく、限定はされない。
又はこれらの断片をプローブとして用い、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラー
クハイブリダイゼーション等の公知のハイブリダイゼーション法を実施し、cDNAライブラ
リーやゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製さ
れたものを利用してもよいし、市販のcDNAライブラリーやゲノムライブラリーを利用して
もよく、限定はされない。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laborator
y Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照すること
ができる。
y Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等を適宜参照すること
ができる。
上記「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェント
な条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」
は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件で
ある。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0
.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例
えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。
これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られる
ことが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要
素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の
要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェン
シーを実現することが可能である。
な条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」
は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件で
ある。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0
.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例
えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。
これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られる
ことが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要
素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の
要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェン
シーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct
Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合
は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを
一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで
洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合
は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを
一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで
洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なDNAとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフト
ウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号１に示される
塩基配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以
上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以
上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以
上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以
上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7
％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
ウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号１に示される
塩基配列と約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以
上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以
上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以
上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以
上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7
％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。
２．３．組換えベクター
本発明の組換えタンパク質を発現させるためには、発現ベクターに、上述した本発明の
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（必要に応じ、当該ポリヌクレオチドの
上流に転写プロモーターやSD配列（宿主が原核細胞の場合）やKozak配列（宿主が真核細
胞の場合）を、下流にターミネーターを、PCR等により付加しておく）が含まれるように
挿入して構築される、組換えベクターが用いられる。上記転写プロモーター等、タンパク
質の発現に必要な各要素は、当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、発現ベクタ
ーにもともと含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。発現ベクター
に当該ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを
用いる方法等を利用する。
発現ベクターとしては、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保
持し得るものであれば、限定はされず、それぞれの宿主細胞に適したベクターを適宜選択
して使用することができる。
本発明の組換えタンパク質を発現させるためには、発現ベクターに、上述した本発明の
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（必要に応じ、当該ポリヌクレオチドの
上流に転写プロモーターやSD配列（宿主が原核細胞の場合）やKozak配列（宿主が真核細
胞の場合）を、下流にターミネーターを、PCR等により付加しておく）が含まれるように
挿入して構築される、組換えベクターが用いられる。上記転写プロモーター等、タンパク
質の発現に必要な各要素は、当該ポリヌクレオチドに含まれていてもよいし、発現ベクタ
ーにもともと含まれている場合はそれを利用してもよく、限定はされない。発現ベクター
に当該ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法や、トポイソメラーゼを
用いる方法等を利用する。
発現ベクターとしては、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保
持し得るものであれば、限定はされず、それぞれの宿主細胞に適したベクターを適宜選択
して使用することができる。
２．４．形質転換体
本発明の組換えタンパク質の発現は、上記組換えベクターを宿主となる細胞に導入して
形質転換体を得、これを培養等することにより行うことができる。
宿主細胞としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の組換えタンパク質を
発現し得るものであればよく、限定はされないが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細
胞、各種植物細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ等が挙げられる。宿主細胞は、好ましく
は、大腸菌である。
本発明の組換えタンパク質の発現は、上記組換えベクターを宿主となる細胞に導入して
形質転換体を得、これを培養等することにより行うことができる。
宿主細胞としては、上記組換えベクターが導入された後、本発明の組換えタンパク質を
発現し得るものであればよく、限定はされないが、例えば、ヒトやマウス等の各種動物細
胞、各種植物細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ等が挙げられる。宿主細胞は、好ましく
は、大腸菌である。
形質転換の方法は、限定はされず、宿主と発現ベクターの組み合わせを考慮し、適宜選
択し実施することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショッ
ク法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法等が好ましく挙げられる。
択し実施することができるが、例えば、電気穿孔法、リポフェクション法、ヒートショッ
ク法、PEG法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法等が好ましく挙げられる。
得られる形質転換体においては、実際に用いた宿主と、組換えベクターに含まれる組換
えタンパク質遺伝子のコドン型の宿主とが、一致していてもよいし、異なっていてもよく
、限定はされない。
えタンパク質遺伝子のコドン型の宿主とが、一致していてもよいし、異なっていてもよく
、限定はされない。
２．５．組換えタンパク質の製造方法
本発明の組換えタンパク質は、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現カセットを用いて製造することができる。
具体的には、まず、遺伝子組換え法の常法に従い、前述した本発明の組換えタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含むようにした組換えベクターを新たに調製するか、あ
るいは本発明の組換えタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含むようにした組換えベクターを新たに調製する。後者の場合、本発明の組換えタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他のベクターに組み込んで発現させるように
したものであってもよいし、宿主細胞のゲノムにコードされていて発現し得るものであっ
てもよく、限定されない。
本発明の組換えタンパク質は、本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現カセットを用いて製造することができる。
具体的には、まず、遺伝子組換え法の常法に従い、前述した本発明の組換えタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを含むようにした組換えベクターを新たに調製するか、あ
るいは本発明の組換えタンパク質の発現を誘導するタンパク質をコードするポリヌクレオ
チドを含むようにした組換えベクターを新たに調製する。後者の場合、本発明の組換えタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチドは、他のベクターに組み込んで発現させるように
したものであってもよいし、宿主細胞のゲノムにコードされていて発現し得るものであっ
てもよく、限定されない。
本発明では、本発明の組換えタンパク質のC末端とN末端の少なくとも一方の端に他のタ
ンパク質を１つ以上結合させて、本発明の組換えタンパク質と当該他のタンパク質を含む
融合タンパク質を発現させるようしても良い。当該他のタンパク質としては、例えば、マ
ルトース結合タンパク質（MBP）、ヒスチジン（His）タグ配列、及びFlagタグ等を有する
タンパク質を挙げることができる。好ましくは、本発明の組換えタンパク質を、そのN末
端側にMBPとHisタグ配列とFlagタグを有するタンパク質（MBP-His-Flag タグ）を結合し
た融合タンパク質として発現させる。当該融合タンパク質を発現させた後、例えばMBPを
結合したタンパク質を精製するための金属カラムあるいはアミロースカラムを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、MBP-His-Flagタグを結合した本発明の組換えタン
パク質を精製することができる。精製後、エンテロキナーゼ等の特異的消化酵素を用いた
処理を行うことで、本発明の組換えタンパク質からMBP-His-Flagタグを切断し、タグ等を
結合していない本発明の組換えタンパク質を得ることもできる。
ンパク質を１つ以上結合させて、本発明の組換えタンパク質と当該他のタンパク質を含む
融合タンパク質を発現させるようしても良い。当該他のタンパク質としては、例えば、マ
ルトース結合タンパク質（MBP）、ヒスチジン（His）タグ配列、及びFlagタグ等を有する
タンパク質を挙げることができる。好ましくは、本発明の組換えタンパク質を、そのN末
端側にMBPとHisタグ配列とFlagタグを有するタンパク質（MBP-His-Flag タグ）を結合し
た融合タンパク質として発現させる。当該融合タンパク質を発現させた後、例えばMBPを
結合したタンパク質を精製するための金属カラムあるいはアミロースカラムを用いたアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、MBP-His-Flagタグを結合した本発明の組換えタン
パク質を精製することができる。精製後、エンテロキナーゼ等の特異的消化酵素を用いた
処理を行うことで、本発明の組換えタンパク質からMBP-His-Flagタグを切断し、タグ等を
結合していない本発明の組換えタンパク質を得ることもできる。
次いで、調製した組換えベクターにより形質転換された細胞を培養し、得られる培養物
から本発明の組換えタンパク質を採取することができる。なお、宿主細胞や発現ベクター
の種類等については、前述したものと同様のものが適用できる。
から本発明の組換えタンパク質を採取することができる。なお、宿主細胞や発現ベクター
の種類等については、前述したものと同様のものが適用できる。
ここで、「培養物」とは、培養上清、培養細胞(菌体)、又は細胞(菌体)の破砕物のいず
れをも意味するものである。本発明の組換えタンパク質は、当該培養物中に蓄積される。
形質転換体の培養方法は、宿主の培養に採用される通常の方法に従って行うことができる
。
れをも意味するものである。本発明の組換えタンパク質は、当該培養物中に蓄積される。
形質転換体の培養方法は、宿主の培養に採用される通常の方法に従って行うことができる
。
形質転換体を培養する培地は、宿主細胞(宿主菌)が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩
類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であることが好ましく
、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース
、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物や、
酢酸、プロピオン酸等の有機酸や、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げ
られる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩や、
その他の含窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。その他に、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。
類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であることが好ましく
、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース
、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物や、
酢酸、プロピオン酸等の有機酸や、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げ
られる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩や、
その他の含窒素化合物が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第
二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。その他に、ペプトン、肉エキス、
コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。
培養は、一般には、振とう培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）などの好気
的条件下、10℃〜40℃（好ましくは25℃〜37℃）で1〜100時間行うことができる。pHの調
整は、適宜、無機酸、有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
的条件下、10℃〜40℃（好ましくは25℃〜37℃）で1〜100時間行うことができる。pHの調
整は、適宜、無機酸、有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。
本発明の組換えタンパク質の収率は、SDS-PAGE等の公知のタンパク質検出方法により確
認することができる。
認することができる。
培養後、本発明の組換えタンパク質が宿主細胞(菌体)内に生産される場合は、ホモジナ
イザー処理や超音波処理等により細胞を破砕する。また、溶菌により宿主細胞を破砕する
場合は、Lysozyme処理、凍結融解処理、低張液処理等を施すようにする。破砕後の液を遠
心分離した後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した本発明の組換えタンパ
ク質溶液として得ることができる。
イザー処理や超音波処理等により細胞を破砕する。また、溶菌により宿主細胞を破砕する
場合は、Lysozyme処理、凍結融解処理、低張液処理等を施すようにする。破砕後の液を遠
心分離した後の上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、粗精製した本発明の組換えタンパ
ク質溶液として得ることができる。
一方、培養後、本発明の組換えタンパク質が宿主細胞(菌体)外に生産される場合は、培
養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞(菌体)を除去する。
養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞(菌体)を除去する。
その後、硫安沈澱による抽出等により培養物中から本発明の組換えタンパク質を採取し
、必要に応じてさらに透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いて、本発明の組換えタンパク質
を単離精製することができる。
、必要に応じてさらに透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いて、本発明の組換えタンパク質
を単離精製することができる。
また、本発明の組換えタンパク質の製造に関しては、上述したような形質転換体を用い
たタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を採用して
行うこともできる。
たタンパク質合成系のほか、生細胞を全く使用しない無細胞タンパク質合成系を採用して
行うこともできる。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内で本発明の組
換えタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質
合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
換えタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質
合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、使用する細胞抽出液の由来は、前述の宿主細胞であることが好ましい。細胞
抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、小麦
胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの
抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮あるいは希釈された
ものであってもよいし、そのままであってもよく、限定はされない。
抽出液としては、例えば真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、より具体的には、小麦
胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの
抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は、濃縮あるいは希釈された
ものであってもよいし、そのままであってもよく、限定はされない。
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって
得ることができる。
得ることができる。
このような無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。例えば
、試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM
（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって産生された本発明の組換えタンパク質は、前述したよう
にクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
、試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM
（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって産生された本発明の組換えタンパク質は、前述したよう
にクロマトグラフィー等の手段を適宜選択して、精製することができる。
３．スクリーニング
３．１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の組換えタンパク質に候補物質を接触させ
、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスク
リーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、SARS
3CLプロテアーゼに対する阻害活性を有するものである。SARS 3CLプロテアーゼを阻害す
ることでSARS CoVの増殖を抑制することができるので、本発明のスクリーニング方法によ
って得られる阻害物質は、SARSに対する治療に利用することができる。
ここで「接触」とは、本発明の組換えタンパク質と候補物質とを同一の反応系又は培養
系に存在させることを意味する。接触には、例えば、本発明の組換えタンパク質が含まれ
る溶液と候補物質とを混合すること、本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換体の
培養容器に候補物質を添加すること、及び本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換
体を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。
３．１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、前記本発明の組換えタンパク質に候補物質を接触させ
、候補物質の中から前記組換えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質をスク
リーニングする方法である。本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、SARS
3CLプロテアーゼに対する阻害活性を有するものである。SARS 3CLプロテアーゼを阻害す
ることでSARS CoVの増殖を抑制することができるので、本発明のスクリーニング方法によ
って得られる阻害物質は、SARSに対する治療に利用することができる。
ここで「接触」とは、本発明の組換えタンパク質と候補物質とを同一の反応系又は培養
系に存在させることを意味する。接触には、例えば、本発明の組換えタンパク質が含まれ
る溶液と候補物質とを混合すること、本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換体の
培養容器に候補物質を添加すること、及び本発明の組換えタンパク質を発現する形質転換
体を候補物質の存在下で培養することなどが含まれる。
候補物質が、SARS 3CLプロテアーゼに対して阻害活性を有しているか否かは、例えば「
H. Naka, K. Teruya, J. K. Bang, S. Aimoto, T. Tatsumi, H. Konno, K. Nosaka, K. A
kaji; Evaluations of substrate specificity and inhibition at PR/p3 cleavage site
of HTLV-1 protease; Bioorg. Med. Chem. Lett., 16 (2006) 3761-3764.」に記載の方
法に従って判断する。具体的には、先ず、候補物質の存在下で本発明の組換えタンパク質
と基質を接触させ、HPLCなどにより組換えタンパク質が基質を切断する反応の分析を行い
、図６に示すような用量−応答曲線を引く。尚、図６中、縦軸の阻害（％）は、各濃度で
阻害剤が存在する条件下でプロテアーゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害
剤が存在していない条件下でプロテアーゼが基質を切断する量を100として相対的に切断
率を出し、これを100から引いて阻害率としたものである。そして、その用量−応答曲線
からIC50値を求めて、IC50値が例えば50mM以下、10mM以下、6mM以下、5mM以下、1mM以下
、または500μM以下、好ましくは200μM以下、より好ましくは100μM以下である場合に、
候補物質はSARS 3CLプロテアーゼに対して阻害活性を有していると判断することができる
。
ここでIC50値とは、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する
候補物質の濃度を意味する。候補物質のIC50値は、本発明の組換えタンパク質と基質を接
触させて基質を切断させる際に、そこに異なる濃度の候補物質を添加して、各添加濃度（
用量）での本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性（反応）を算出し、用量-反
応曲線を作成して、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する候
補物質の添加濃度を算出することによって決定できる。
また、他の測定方法としては、例えば、先に説明したquenched-FRET assayがある。
H. Naka, K. Teruya, J. K. Bang, S. Aimoto, T. Tatsumi, H. Konno, K. Nosaka, K. A
kaji; Evaluations of substrate specificity and inhibition at PR/p3 cleavage site
of HTLV-1 protease; Bioorg. Med. Chem. Lett., 16 (2006) 3761-3764.」に記載の方
法に従って判断する。具体的には、先ず、候補物質の存在下で本発明の組換えタンパク質
と基質を接触させ、HPLCなどにより組換えタンパク質が基質を切断する反応の分析を行い
、図６に示すような用量−応答曲線を引く。尚、図６中、縦軸の阻害（％）は、各濃度で
阻害剤が存在する条件下でプロテアーゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害
剤が存在していない条件下でプロテアーゼが基質を切断する量を100として相対的に切断
率を出し、これを100から引いて阻害率としたものである。そして、その用量−応答曲線
からIC50値を求めて、IC50値が例えば50mM以下、10mM以下、6mM以下、5mM以下、1mM以下
、または500μM以下、好ましくは200μM以下、より好ましくは100μM以下である場合に、
候補物質はSARS 3CLプロテアーゼに対して阻害活性を有していると判断することができる
。
ここでIC50値とは、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する
候補物質の濃度を意味する。候補物質のIC50値は、本発明の組換えタンパク質と基質を接
触させて基質を切断させる際に、そこに異なる濃度の候補物質を添加して、各添加濃度（
用量）での本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性（反応）を算出し、用量-反
応曲線を作成して、本発明の組換えタンパク質による基質の切断活性を５０％阻害する候
補物質の添加濃度を算出することによって決定できる。
また、他の測定方法としては、例えば、先に説明したquenched-FRET assayがある。
「候補物質」は、限定されないが、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合
物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、
植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど
）の組織抽出液、血漿などであり、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物
質であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生
理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）な
どとの塩が用いられる。候補物質としては、例えば、次の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの化
合物を挙げることができる。（ａ）Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｂ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｃ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｄ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｅ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｆ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2))-CHO
（ｇ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｈ）Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
ここで、上記（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸配列中、Ｎ末端側のAc-は、Ｎ末端がアセチル
化していることを示す。また、Ｃ末端側の-CHOおよび-CH2OHは、それぞれ、Ｃ末端にアル
デヒドおよびヒドロキシメチルを有することを示す。さらに、Ｃ末端側の-NHCH(CH2CH2CO
N(CH3)2)-CHOおよび-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OHは、それぞれ、-Gln(Me2)-CHOおよび-
Gln(Me2)-CH2OH（Ｍｅはメチルを表す）と表記することができる。尚、上記（ａ）〜（ｈ
）の化合物は、実施例に記載の方法またはそれと同様の方法で合成することができる。
スクリーニング方法としては、例えば、上記それぞれの候補物質を混合物のままスクリ
ーニングする方法がある。また、それぞれの候補物質（例えば化合物）の一部のみの構造
が異なる混合物群を調製し、そのままスクリーニングする方法もある。後者の方法を使い
、候補物質（例えば化合物）の基本骨格の中で構造の異なる部位を少しずつずらした混合
物群のスクリーニング結果を比較することで、基本骨格のどの部分が最も阻害活性に寄与
するかをすばやく見積もることができる。
物、合成化合物（高分子又は低分子化合物）、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、
植物抽出液、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど
）の組織抽出液、血漿などであり、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物
質であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩として、生
理学的に許容される酸（例えば、無機酸や有機酸など）や塩基（例えば、金属酸など）な
どとの塩が用いられる。候補物質としては、例えば、次の（ａ）〜（ｈ）のいずれかの化
合物を挙げることができる。（ａ）Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｂ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｃ）Ac-Ile-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｄ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
（ｅ）Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｆ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2))-CHO
（ｇ）Ac-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OH
（ｈ）Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
ここで、上記（ａ）〜（ｈ）のアミノ酸配列中、Ｎ末端側のAc-は、Ｎ末端がアセチル
化していることを示す。また、Ｃ末端側の-CHOおよび-CH2OHは、それぞれ、Ｃ末端にアル
デヒドおよびヒドロキシメチルを有することを示す。さらに、Ｃ末端側の-NHCH(CH2CH2CO
N(CH3)2)-CHOおよび-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH2OHは、それぞれ、-Gln(Me2)-CHOおよび-
Gln(Me2)-CH2OH（Ｍｅはメチルを表す）と表記することができる。尚、上記（ａ）〜（ｈ
）の化合物は、実施例に記載の方法またはそれと同様の方法で合成することができる。
スクリーニング方法としては、例えば、上記それぞれの候補物質を混合物のままスクリ
ーニングする方法がある。また、それぞれの候補物質（例えば化合物）の一部のみの構造
が異なる混合物群を調製し、そのままスクリーニングする方法もある。後者の方法を使い
、候補物質（例えば化合物）の基本骨格の中で構造の異なる部位を少しずつずらした混合
物群のスクリーニング結果を比較することで、基本骨格のどの部分が最も阻害活性に寄与
するかをすばやく見積もることができる。
３．２．スクリーニング用キット
本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明の組換えタンパク質を含む、前記組換
えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットである。
キットには、さらに、必要に応じて、緩衝液、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセ
サリー及び説明書からなる群から選択される少なくとも１つが含まれて良い。
キットに含まれる「緩衝液」には、「反応緩衝液」のほかに「洗浄液」も含まれる。「
洗浄液」には、「反応緩衝液」と同じ溶媒、又はその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液などを例示することができる。
これらのキットを構成する各成分は、別個に用意しても良く、あるいは、支障がない限
り共存させても良い。
本発明のスクリーニング用キットは、前記本発明の組換えタンパク質を含む、前記組換
えタンパク質の3CLプロテアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング用キットである。
キットには、さらに、必要に応じて、緩衝液、補助剤、専用容器、その他の必要なアクセ
サリー及び説明書からなる群から選択される少なくとも１つが含まれて良い。
キットに含まれる「緩衝液」には、「反応緩衝液」のほかに「洗浄液」も含まれる。「
洗浄液」には、「反応緩衝液」と同じ溶媒、又はその他の水溶性溶媒、リン酸緩衝液、ト
リス塩酸緩衝液などを例示することができる。
これらのキットを構成する各成分は、別個に用意しても良く、あるいは、支障がない限
り共存させても良い。
４．阻害剤
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩（本明細書
中で、本発明の化合物と呼ぶ場合がある。）を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤（本明
細書中で、本発明の阻害剤と呼ぶ場合がある）を提供する。すなわち、本発明の阻害剤に
含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3
)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選ば
れる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１つの態様の阻害剤に含まれ
る化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3
CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOまたはその塩である。本
発明の阻害剤は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害することができる。本発明の１
つの態様に係る阻害剤は、SARS CoVの増殖を阻害することができる。
本発明は、上記本発明のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩（本明細書
中で、本発明の化合物と呼ぶ場合がある。）を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤（本明
細書中で、本発明の阻害剤と呼ぶ場合がある）を提供する。すなわち、本発明の阻害剤に
含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3
)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選ば
れる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１つの態様の阻害剤に含まれ
る化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3
CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CH
O、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOまたはその塩である。本
発明の阻害剤は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害することができる。本発明の１
つの態様に係る阻害剤は、SARS CoVの増殖を阻害することができる。
ここで、本発明の阻害剤における塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩など
の無機酸付加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしく
は蓚酸塩などの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩など
の塩が挙げられる。本発明の１つの態様では、塩は、医薬的に許容される塩である。
の無機酸付加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしく
は蓚酸塩などの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩など
の塩が挙げられる。本発明の１つの態様では、塩は、医薬的に許容される塩である。
本発明の別の態様では、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoV増殖阻害
効果を高めることができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を使用する
。具体的には、候補化合物の存在下または非存在下、SARS CoV感染細胞に、本発明の阻害
剤を接触させて、細胞を所定時間培養し、SARS CoVのウイルス量を測定する。「接触」と
は、SARS CoV感染細胞と本発明の阻害剤とを同一の反応系または培養系に存在させること
を意味し、例えば、SARS CoV感染細胞を本発明の阻害剤の存在下で培養することなどが含
まれる。尚、このとき、様々な濃度の候補化合物の存在下で、SARS CoVのウイルス量を測
定するのが好ましい。そして、候補化合物の存在下でのSARS CoVのウイルス量が、非存在
下でのSARS CoVのウイルス量と比較して低い時に（例えば、20%以上、30%以上、40%以上
、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上、150%以上、または200%以
上低い時に）、候補化合物を、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoV増殖
阻害効果を高めることができる化合物として選択する。SARS CoVのウイルス量は、公知の
方法を用いて測定することができる。
効果を高めることができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を使用する
。具体的には、候補化合物の存在下または非存在下、SARS CoV感染細胞に、本発明の阻害
剤を接触させて、細胞を所定時間培養し、SARS CoVのウイルス量を測定する。「接触」と
は、SARS CoV感染細胞と本発明の阻害剤とを同一の反応系または培養系に存在させること
を意味し、例えば、SARS CoV感染細胞を本発明の阻害剤の存在下で培養することなどが含
まれる。尚、このとき、様々な濃度の候補化合物の存在下で、SARS CoVのウイルス量を測
定するのが好ましい。そして、候補化合物の存在下でのSARS CoVのウイルス量が、非存在
下でのSARS CoVのウイルス量と比較して低い時に（例えば、20%以上、30%以上、40%以上
、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、100%以上、150%以上、または200%以
上低い時に）、候補化合物を、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoV増殖
阻害効果を高めることができる化合物として選択する。SARS CoVのウイルス量は、公知の
方法を用いて測定することができる。
本発明の別の態様では、哺乳動物(例えば、ヒト、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット
など)のSARSを治療するために、経口または非経口で本発明の阻害剤を哺乳動物に適用す
る。本発明のある態様では、哺乳動物はヒトを除く哺乳動物である。
など)のSARSを治療するために、経口または非経口で本発明の阻害剤を哺乳動物に適用す
る。本発明のある態様では、哺乳動物はヒトを除く哺乳動物である。
また、本発明の阻害剤は、使用目的に応じ、本発明の化合物に加えて、担体や添加物を
含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラ
ーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセル
ロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチ
レングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソル
ビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。
含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、酢酸、有機溶剤、コラ
ーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセル
ロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチ
レングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフ
ィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソル
ビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられる。
本発明の阻害剤における本発明の化合物の使用量は、使用目的によって異なる。当業者
であれば、使用目的に応じて、本発明の化合物の使用量を適宜選択することができる。
であれば、使用目的に応じて、本発明の化合物の使用量を適宜選択することができる。
例えば、本発明の阻害剤と併用して本発明の阻害剤のSARS CoVの増殖阻害効果を高める
ことができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を用いる場合には、本発
明の化合物の使用量を変動させて細胞生存率を測定するのが好ましい。この場合、本発明
の化合物の使用量は、例えば、0.001mg〜100mg、好ましくは、0.01mg〜10mgである。
ことができる化合物をスクリーニングするために本発明の阻害剤を用いる場合には、本発
明の化合物の使用量を変動させて細胞生存率を測定するのが好ましい。この場合、本発明
の化合物の使用量は、例えば、0.001mg〜100mg、好ましくは、0.01mg〜10mgである。
哺乳動物のSARSを治療するために本発明の阻害剤を用いる場合には、本発明の化合物の
使用量は、10kｇの動物の場合、１日あたり、例えば、0.01mg〜1000mg、好ましくは、0.1
mg〜100mgである。
使用量は、10kｇの動物の場合、１日あたり、例えば、0.01mg〜1000mg、好ましくは、0.1
mg〜100mgである。
また、本発明は、SARS CoV増殖阻害用の前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を
提供する。本発明の化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
提供する。本発明の化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
また、本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を用いるSARS CoV増殖阻
害方法を提供する。ここで、「本発明の化合物を用いる」ことには、例えば、本発明の化
合物と併用して本発明の化合物のSARS CoVの増殖阻害効果を高めることができる化合物を
スクリーニングするために本発明の化合物を使用すること、および哺乳動物のSARS CoV感
染症を治療するために、経口または非経口で本発明の化合物を動物に適用すること、など
が含まれるが、これらに限定されない。本発明のSARS CoV増殖阻害方法における本発明の
化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
害方法を提供する。ここで、「本発明の化合物を用いる」ことには、例えば、本発明の化
合物と併用して本発明の化合物のSARS CoVの増殖阻害効果を高めることができる化合物を
スクリーニングするために本発明の化合物を使用すること、および哺乳動物のSARS CoV感
染症を治療するために、経口または非経口で本発明の化合物を動物に適用すること、など
が含まれるが、これらに限定されない。本発明のSARS CoV増殖阻害方法における本発明の
化合物の用法および用量は、前記阻害剤で説明したのと同様である。
さらに、本発明は、SARS CoV増殖阻害剤製造のための前記化合物またはその塩（本発明
の化合物）の使用を提供する。本発明の使用における本発明の化合物の用法および用量は
、前記SARS CoV増殖阻害剤で説明したのと同様である。
の化合物）の使用を提供する。本発明の使用における本発明の化合物の用法および用量は
、前記SARS CoV増殖阻害剤で説明したのと同様である。
５．医薬組成物
本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を含有する医薬組成物を提供す
る。本発明の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Va
l-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHOからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１
つの態様の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NH
CH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-
Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHO、またはその塩である。本発明の化合物における塩は、医薬的に許容される塩であ
る。医薬的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩などの無機酸付
加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしくは蓚酸塩な
どの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩などの塩が挙げ
られる。本発明の１つの態様によれば、医薬組成物は、SARSを治療するためのものである
。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することがで
きる。
前記剤形は常法にしたがって製剤化することができ、本発明のペプチドの他、医薬的に
許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、
水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアク
リル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスタ
ーチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、ア
ラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プ
ロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒ
ト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容さ
れる界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合
わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤
、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤形により投与が可能である。非経
口投与の場合は、注射剤形、座剤等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静
脈内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩
水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン等）
を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍
結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブ
ドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、
投与回数、剤形によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投
与量は、例えば成人(６０ｋｇ)の場合、1日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは
０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症
状により適宜選択する。投与は、例えば１日当たり、１回または２〜４回に分けてもよい
。
また、本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を患者に投与することを
含む、SARSの治療方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のSARS治療用医薬組成物を
製造するための、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）の使用を提供する。SARSの
治療方法における、本発明の化合物の投与方法などは、上記医薬組成物で説明したのと同
様である。また、本発明の化合物の使用における、医薬組成物の製造方法なども、上記医
薬組成物で説明したのと同様である。
本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を含有する医薬組成物を提供す
る。本発明の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Va
l-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHOからなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物またはその塩である。本発明の１
つの態様の医薬組成物に含まれる化合物またはその塩は、CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NH
CH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-
Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、もしくはCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)
2)-CHO、またはその塩である。本発明の化合物における塩は、医薬的に許容される塩であ
る。医薬的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩、もしくはリン酸塩などの無機酸付
加塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、もしくは蓚酸塩な
どの有機酸塩、またはナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩などの塩が挙げ
られる。本発明の１つの態様によれば、医薬組成物は、SARSを治療するためのものである
。
本発明の医薬組成物は、経口投与及び非経口投与のいずれの剤形をも採用することがで
きる。
前記剤形は常法にしたがって製剤化することができ、本発明のペプチドの他、医薬的に
許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、
水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアク
リル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスタ
ーチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、ア
ラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プ
ロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒ
ト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容さ
れる界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の医薬組成物の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合
わせて選ばれる。剤形としては、経口投与の場合は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤
、顆粒剤、液剤、シロップ剤等として、または適当な剤形により投与が可能である。非経
口投与の場合は、注射剤形、座剤等が挙げられる。注射剤形の場合は、例えば点滴等の静
脈内注射等により全身又は局部的に投与することができる。
例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明の医薬組成物を溶剤(例えば生理食塩
水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これに適当な添加剤（ヒト血清アルブミン等）
を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍
結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブ
ドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本発明の医薬組成物または本発明の化合物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、
投与回数、剤形によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。投
与量は、例えば成人(６０ｋｇ)の場合、1日当たり０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは
０．１〜１００ｍｇ、より好ましくは１〜３０ｍｇである。投与方法は、患者の年齢、症
状により適宜選択する。投与は、例えば１日当たり、１回または２〜４回に分けてもよい
。
また、本発明は、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）を患者に投与することを
含む、SARSの治療方法を提供する。さらに、本発明は、本発明のSARS治療用医薬組成物を
製造するための、前記化合物またはその塩（本発明の化合物）の使用を提供する。SARSの
治療方法における、本発明の化合物の投与方法などは、上記医薬組成物で説明したのと同
様である。また、本発明の化合物の使用における、医薬組成物の製造方法なども、上記医
薬組成物で説明したのと同様である。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報
、特許公報その他の特許文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。また
、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本特許出願、特願2007-219804の開示内容
を包含する。
、特許公報その他の特許文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。また
、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる日本特許出願、特願2007-219804の開示内容
を包含する。
以下実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に
限定されるものではない。
限定されるものではない。
１．材料および方法
１．１ プラスミドおよび核酸の操作
pMAL-c2X(NEB BioLabs)をベースとした発現ベクターpMAL‐3CLを、山本典生先生(東京
医科歯科大学)より供与していただいた。pMAL-3CLは、N末端側のマルトース結合タンパク
質、6個のヒスチジンタグ及びFlagタグ(MBP-His-Flag)と完全長SARS 3CLプロテアーゼと
を含む75kDaの融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターである。この融合タン
パク質をエンテロキナーゼで処理することによって、融合タンパク質のＮ末端側のMBP-Hi
s FlagがSARS 3CLプロテアーゼから切り離され、MBP-His FlagのないSARS 3CLプロテアー
ゼが得られる。
尚、発現ベクターpMAL‐3CLは、例えば以下のようにして作製することができる。SARS
CoV感染細胞からRNAを抽出し、RT-PCRで3CL protease コード領域をクローニングするが
、その時にセンスプライマーにはBamH1認識配列、Hisタグ配列、Flag配列を5’側に付加
し、アンチセンスプライマーにはSalI認識配列を付加しておく。PCR産物をBamH1 とSalI
で切断し、pMAL-c2XのBamH1とSalIクローニング部位にリガーゼで組み込ませる。これに
より、発現ベクターpMAL‐3CLを作製できる。
１．１ プラスミドおよび核酸の操作
pMAL-c2X(NEB BioLabs)をベースとした発現ベクターpMAL‐3CLを、山本典生先生(東京
医科歯科大学)より供与していただいた。pMAL-3CLは、N末端側のマルトース結合タンパク
質、6個のヒスチジンタグ及びFlagタグ(MBP-His-Flag)と完全長SARS 3CLプロテアーゼと
を含む75kDaの融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターである。この融合タン
パク質をエンテロキナーゼで処理することによって、融合タンパク質のＮ末端側のMBP-Hi
s FlagがSARS 3CLプロテアーゼから切り離され、MBP-His FlagのないSARS 3CLプロテアー
ゼが得られる。
尚、発現ベクターpMAL‐3CLは、例えば以下のようにして作製することができる。SARS
CoV感染細胞からRNAを抽出し、RT-PCRで3CL protease コード領域をクローニングするが
、その時にセンスプライマーにはBamH1認識配列、Hisタグ配列、Flag配列を5’側に付加
し、アンチセンスプライマーにはSalI認識配列を付加しておく。PCR産物をBamH1 とSalI
で切断し、pMAL-c2XのBamH1とSalIクローニング部位にリガーゼで組み込ませる。これに
より、発現ベクターpMAL‐3CLを作製できる。
このpMAL-3CLを用いて、pGEM-3CLを次のように作製した。
先ずpMAL-3CLから、次のプライマーを用いて完全長SARS 3CLプロテアーゼをコードする
配列をPCR法により増幅した。
NheI部位を有するプライマー：5’- ccggctagcGGTTTTAGGAAAATGGCATTCC（配列番号５）
XhoI部位を有するプライマー：5’- ccgctcgagTTGGAAGGTAACACCAGAG（配列番号６）
先ずpMAL-3CLから、次のプライマーを用いて完全長SARS 3CLプロテアーゼをコードする
配列をPCR法により増幅した。
NheI部位を有するプライマー：5’- ccggctagcGGTTTTAGGAAAATGGCATTCC（配列番号５）
XhoI部位を有するプライマー：5’- ccgctcgagTTGGAAGGTAACACCAGAG（配列番号６）
そして、このPCR産物をpGEM T-easy(プロメガ)に直接クローニングしてpGEM-3CLを得た
。
。
また、qET-3CLを次のように作製した。
すなわち、qET-3CLは、pET-21a(+)(ノバゲン)のNheI/XhoI部位にpGEM-3CLのSARS 3CLプ
ロテアーゼをコードする断片に対応するNheI-XhoI断片を挿入することによって作製した
。pET-3CLは、N末端側の3種類のアミノ酸(Met-Ala-Ser)と、C末端側の2種類のアミノ酸(L
eu-Glu)及びHisタグと、完全長3CLプロテアーゼとを含む34kDaの融合タンパク質をコード
する遺伝子を含むベクターである。
すなわち、qET-3CLは、pET-21a(+)(ノバゲン)のNheI/XhoI部位にpGEM-3CLのSARS 3CLプ
ロテアーゼをコードする断片に対応するNheI-XhoI断片を挿入することによって作製した
。pET-3CLは、N末端側の3種類のアミノ酸(Met-Ala-Ser)と、C末端側の2種類のアミノ酸(L
eu-Glu)及びHisタグと、完全長3CLプロテアーゼとを含む34kDaの融合タンパク質をコード
する遺伝子を含むベクターである。
さらに、pGEM-3CL-R188Iを次のように作製した。
3CL-R188Iプロテアーゼを構成するため、Stemmerらによって記述された逆PCR法によっ
て、部位特異的変異誘発を行った(Stemmer et al. (1992) Enzymatic Inverse PCR: A Re
striction Site Independent, Single-Fragment Method for High-Efficiency, Site-Dir
ected Mutagenesis. BioTechniques 13, 214-220.)。点変異を生じさせるのに使用した鋳
型はpGEM-3CLであり、使用したプライマーは次のものである。尚、下記プライマー中、下
線を引いたヌクレオチドが変異を受けたものである。
5’- atctctCGTCTCCATACAAACTGCACAGGCTG（配列番号７）
5’- atctctCGTCTCTGTATGTCAACAAATGGACC（配列番号８）
PCR実施後、直線状の完全長プラスミドの両末端をBsmBI(CGTCTCN’NNNN)で消化した。
これにより、直線状プラスミドの両末端には、オーバーハングが生じた。そして、このNN
NNオーバーハングを利用して、直線状のプラスミドの両末端を連結し、pGEM-3CL-R188Iを
得た。このライゲーションステップは直線状プラスミドの両末端に生じたNNNNオーバーハ
ングを利用したものであるので、pGEM-3CL-R188Iには余分な配列が付加されない。このた
め、pGEM-3CL-R188Iの配列は、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番
目〜第564番目のアルギニンに対応するコドンが、イソロイシンに対応するコドンに変わ
っていることを除きpGEM-3CLと同じである。
3CL-R188Iプロテアーゼを構成するため、Stemmerらによって記述された逆PCR法によっ
て、部位特異的変異誘発を行った(Stemmer et al. (1992) Enzymatic Inverse PCR: A Re
striction Site Independent, Single-Fragment Method for High-Efficiency, Site-Dir
ected Mutagenesis. BioTechniques 13, 214-220.)。点変異を生じさせるのに使用した鋳
型はpGEM-3CLであり、使用したプライマーは次のものである。尚、下記プライマー中、下
線を引いたヌクレオチドが変異を受けたものである。
5’- atctctCGTCTCCATACAAACTGCACAGGCTG（配列番号７）
5’- atctctCGTCTCTGTATGTCAACAAATGGACC（配列番号８）
PCR実施後、直線状の完全長プラスミドの両末端をBsmBI(CGTCTCN’NNNN)で消化した。
これにより、直線状プラスミドの両末端には、オーバーハングが生じた。そして、このNN
NNオーバーハングを利用して、直線状のプラスミドの両末端を連結し、pGEM-3CL-R188Iを
得た。このライゲーションステップは直線状プラスミドの両末端に生じたNNNNオーバーハ
ングを利用したものであるので、pGEM-3CL-R188Iには余分な配列が付加されない。このた
め、pGEM-3CL-R188Iの配列は、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番
目〜第564番目のアルギニンに対応するコドンが、イソロイシンに対応するコドンに変わ
っていることを除きpGEM-3CLと同じである。
最後に、pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iを次のように作製した。
すなわち、pMAL-3CLの短いSphI-StyI断片およびpET-3CLの短いNheI-XhoI断片を、各々
に対応するpGEM-3CL-R188Iの断片に置換することにより、発現ベクターpMAL-3CL-R188Iお
よびpET-3CL-R188Iを構成した。
すなわち、pMAL-3CLの短いSphI-StyI断片およびpET-3CLの短いNheI-XhoI断片を、各々
に対応するpGEM-3CL-R188Iの断片に置換することにより、発現ベクターpMAL-3CL-R188Iお
よびpET-3CL-R188Iを構成した。
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iについて配列決定分析を行い、pMAL-3CL-R188Iお
よびpET-3CL-R188Iには所望の変異のみが存在し、意図しない変異が全く見られないこと
を確認した。すなわち、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番目〜第5
64番目の塩基のみが、アルギニンのコドン「aga」からイソロイシンのコドン「ata」に変
異していた（配列番号１）。
よびpET-3CL-R188Iには所望の変異のみが存在し、意図しない変異が全く見られないこと
を確認した。すなわち、SARS 3CLプロテアーゼをコードする塩基配列うち第562番目〜第5
64番目の塩基のみが、アルギニンのコドン「aga」からイソロイシンのコドン「ata」に変
異していた（配列番号１）。
１．２．3CLプロテアーゼの発現および精製
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iで、大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)pLysをそれぞ
れ形質転換した。
形質転換した大腸菌株を、50μg ml-1のアンピシリンを含有する10mlのLB培地内で37℃
で一晩増殖させ、ペレット化し、100mlの新鮮培地で2時間増殖させた。さらに、この大腸
菌株に0.5mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて28℃で2時間振と
うし、組換えタンパク質（3CL-R188Iプロテアーゼ）の発現を誘発した。この時、pMAL-3C
L-R188Iで形質転換した大腸菌からは、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMBP-His-F
lagが付加した融合タンパク質として発現し、pET-3CL-R188Iで形質転換した大腸菌からは
、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMet-Ala-Serが付加し、そのC末端側にLeu-Glu
とHisタグが付加した融合タンパク質として発現した。
pMAL-3CL-R188IおよびpET-3CL-R188Iで、大腸菌株DH5αおよびBL21(DE3)pLysをそれぞ
れ形質転換した。
形質転換した大腸菌株を、50μg ml-1のアンピシリンを含有する10mlのLB培地内で37℃
で一晩増殖させ、ペレット化し、100mlの新鮮培地で2時間増殖させた。さらに、この大腸
菌株に0.5mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を加えて28℃で2時間振と
うし、組換えタンパク質（3CL-R188Iプロテアーゼ）の発現を誘発した。この時、pMAL-3C
L-R188Iで形質転換した大腸菌からは、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMBP-His-F
lagが付加した融合タンパク質として発現し、pET-3CL-R188Iで形質転換した大腸菌からは
、3CL-R188IプロテアーゼはそのN末端側にMet-Ala-Serが付加し、そのC末端側にLeu-Glu
とHisタグが付加した融合タンパク質として発現した。
ついで、細胞をペレット化し、該ペレット化した細胞を、Hisタグ付加タンパク質の精
製のための、10mMイミダゾール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルおよび10μl ml-1
のプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する溶液L(50mM Na2HPO4、pH7.0、300mM Na
Cl)20mlで再懸濁し、氷水中でBioruptor(コスモ・バイオ、東京、日本)を使用し、1回に
つき200W、30秒間として120秒間隔で4回にわたり超音波処理を行った。細胞残屑を14000
×gで20分間の遠心分離で除去し、上清の粗抽出液を採集した。採集した粗抽出液を、10m
Mイミダゾールを含有する溶液Lで平衡化したベッド体積1mlのTALON Metal Affinity Resi
n (クロンテック)に適用した。SARS 3CLプロテアーゼを含む融合タンパク質を、同溶液20
mlで洗浄後、125mMイミダゾールを含有する溶液Lで溶出させた。Centricon YM-10 (10kDa
カットオフ、ミリポア)を使用した限外濾過によって緩衝液を20mMトリス-HCl pH7.5に交
換するとともに、結合させた溶出画分(1.3ml)を0.2mlに濃縮した。
製のための、10mMイミダゾール、1mMフッ化フェニルメチルスルホニルおよび10μl ml-1
のプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)を含有する溶液L(50mM Na2HPO4、pH7.0、300mM Na
Cl)20mlで再懸濁し、氷水中でBioruptor(コスモ・バイオ、東京、日本)を使用し、1回に
つき200W、30秒間として120秒間隔で4回にわたり超音波処理を行った。細胞残屑を14000
×gで20分間の遠心分離で除去し、上清の粗抽出液を採集した。採集した粗抽出液を、10m
Mイミダゾールを含有する溶液Lで平衡化したベッド体積1mlのTALON Metal Affinity Resi
n (クロンテック)に適用した。SARS 3CLプロテアーゼを含む融合タンパク質を、同溶液20
mlで洗浄後、125mMイミダゾールを含有する溶液Lで溶出させた。Centricon YM-10 (10kDa
カットオフ、ミリポア)を使用した限外濾過によって緩衝液を20mMトリス-HCl pH7.5に交
換するとともに、結合させた溶出画分(1.3ml)を0.2mlに濃縮した。
タグが付加していない3CL-R188Lプロテアーゼの精製のため、N末端側にMBP-His-Flag-
タグを付加したプロテアーゼ(約1.5mgのタンパク質)をMetal Affinity Resinで処理した
画分を、20mMトリス-HCl pH7.4、50mM NaCl、2mM CaCl2を含有する緩衝液1ml中で17Uの組
換えエンテロキナーゼ (ノバゲン)とともに21℃で2時間さらにインキュベートした。この
エンテロキナーゼ処理により、MBP-His-Flag-タグを3CL-R188Lプロテアーゼから切り離し
た。さらに、EKapture Agarose (ノバゲン)を使用して溶液からエンテロキナーゼを除去
した後、緩衝液をCentricon YM-10を使用して20mMビス-トリスpH5.5に交換した。ついで
、エンテロキナーゼで処理した画分を同緩衝液で平衡化したベッド体積1mlのDEAE Sephar
ose (GEヘルスケア)に適用した。タグが付加していない3CL-R188LプロテアーゼはSepharo
se樹脂を通過し、MBP-His-Flag断片は樹脂中に保持された。場合により、MBP-His-Flag断
片を0.5M KClを含有する同緩衝液で溶出させることができた。
タグを付加したプロテアーゼ(約1.5mgのタンパク質)をMetal Affinity Resinで処理した
画分を、20mMトリス-HCl pH7.4、50mM NaCl、2mM CaCl2を含有する緩衝液1ml中で17Uの組
換えエンテロキナーゼ (ノバゲン)とともに21℃で2時間さらにインキュベートした。この
エンテロキナーゼ処理により、MBP-His-Flag-タグを3CL-R188Lプロテアーゼから切り離し
た。さらに、EKapture Agarose (ノバゲン)を使用して溶液からエンテロキナーゼを除去
した後、緩衝液をCentricon YM-10を使用して20mMビス-トリスpH5.5に交換した。ついで
、エンテロキナーゼで処理した画分を同緩衝液で平衡化したベッド体積1mlのDEAE Sephar
ose (GEヘルスケア)に適用した。タグが付加していない3CL-R188LプロテアーゼはSepharo
se樹脂を通過し、MBP-His-Flag断片は樹脂中に保持された。場合により、MBP-His-Flag断
片を0.5M KClを含有する同緩衝液で溶出させることができた。
１．３．3CLプロテアーゼの分解についての検討および切断部位の同定
3CLプロテアーゼの分解について検討するため、C末端側にHis-タグを付加した3CLプロ
テアーゼのMetal Affinity Resinで処理した画分を基質として使用した。画分(約4μgの
タンパク質)を0.05Uのエンテロキナーゼまたは0.5μgの精製した3CL-R188Lプロテアーゼ
とともに室温で14時間インキュベートした後、溶液を15% SDS-PAGEゲル上で分離し、ポリ
ビニリデンジフルオライド(PVDF)膜にエレクトロブロットした。His-タグ付加3CLプロテ
アーゼおよびその切断された産物を、抗-His-タグのモノクローナル抗体(ノバゲン)、ビ
オチン化抗-マウスIgG(ベクター)、および増幅されたアルカリホスファターゼImmun-Blot
アッセイキット(バイオ・ラッド)を使用して視覚化した。
3CLプロテアーゼの分解について検討するため、C末端側にHis-タグを付加した3CLプロ
テアーゼのMetal Affinity Resinで処理した画分を基質として使用した。画分(約4μgの
タンパク質)を0.05Uのエンテロキナーゼまたは0.5μgの精製した3CL-R188Lプロテアーゼ
とともに室温で14時間インキュベートした後、溶液を15% SDS-PAGEゲル上で分離し、ポリ
ビニリデンジフルオライド(PVDF)膜にエレクトロブロットした。His-タグ付加3CLプロテ
アーゼおよびその切断された産物を、抗-His-タグのモノクローナル抗体(ノバゲン)、ビ
オチン化抗-マウスIgG(ベクター)、および増幅されたアルカリホスファターゼImmun-Blot
アッセイキット(バイオ・ラッド)を使用して視覚化した。
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、N末端側にMBP-His-Flag-タグを付加した3
CLプロテアーゼのMetal Affinity Resin（金属アフィニティー樹脂）で精製した画分(12
μgタンパク質)を1Uのエンテロキナーゼとともに21℃で30分間インキュベートし、ついで
15% SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移した。Coomassieブルー染色後、20kDaおよび13
kDaバンドを分析した。この時、N末端側の配列決定は、Edmanシーケンシングに従った（M
atsudaira, P. (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotte
d onto polyvinylidene difluoride membranes.J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.）。
この分析はアプロサイエンス生命科学研究所(鳴門、日本)でApplied Biosystems 491 Pro
tein Sequencerを使用して行った。
CLプロテアーゼのMetal Affinity Resin（金属アフィニティー樹脂）で精製した画分(12
μgタンパク質)を1Uのエンテロキナーゼとともに21℃で30分間インキュベートし、ついで
15% SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜に移した。Coomassieブルー染色後、20kDaおよび13
kDaバンドを分析した。この時、N末端側の配列決定は、Edmanシーケンシングに従った（M
atsudaira, P. (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotte
d onto polyvinylidene difluoride membranes.J. Biol. Chem. 262, 10035-10038.）。
この分析はアプロサイエンス生命科学研究所(鳴門、日本)でApplied Biosystems 491 Pro
tein Sequencerを使用して行った。
１．４．基質ペプチド
Rinkアミド樹脂(4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノメチル)-フェノキシ樹脂)
(Rink, H. (1987) Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a t
rialkoxy-diphenyl-methylester resin. Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790.)から出発す
るFmoc型固相ペプチド合成法(SPPS)( Atherton, E et al. (2004) Synthesis of Peptide
s and Peptidemimetics E22a, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp740-754.)に従い、
以下の基質ペプチド（SO1, SO3, SR1）を合成した。
SO1; H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2（配列番号９）
SO3; H-Lys-Val-Ala-Thr-Val-Gln-Ser-Lys-Met-Ser-Asp-NH2（配列番号１０）
SR1; H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-Gln-Thr-Ala-Gln-Ala-Ala-Gly-Thr-Asp-Thr-NH2（配
列番号１１）
上記各アミノ酸配列において、右端の-NH2は、これらのペプチドのC末端がアミドにな
っていることを示している。
Rinkアミド樹脂(4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノメチル)-フェノキシ樹脂)
(Rink, H. (1987) Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a t
rialkoxy-diphenyl-methylester resin. Tetrahedron Lett. 28, 3787-3790.)から出発す
るFmoc型固相ペプチド合成法(SPPS)( Atherton, E et al. (2004) Synthesis of Peptide
s and Peptidemimetics E22a, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, pp740-754.)に従い、
以下の基質ペプチド（SO1, SO3, SR1）を合成した。
SO1; H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2（配列番号９）
SO3; H-Lys-Val-Ala-Thr-Val-Gln-Ser-Lys-Met-Ser-Asp-NH2（配列番号１０）
SR1; H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-Gln-Thr-Ala-Gln-Ala-Ala-Gly-Thr-Asp-Thr-NH2（配
列番号１１）
上記各アミノ酸配列において、右端の-NH2は、これらのペプチドのC末端がアミドにな
っていることを示している。
具体的には、20%ピペリジン/DMFを用いたFmocの脱保護と標準のジイソプロピルカルボ
ジイミド/HOBtプロトコルを用いた縮合反応とを組み合わせることによって固相合成を行
った。各ペプチドを、25℃で3時間にわたるTFA-チオアニソール(10:1)処理によって樹脂
から切断した後、分取HPLCによって精製した。さらにMALDI-TOF MS分析によって均一性を
確認した。
ジイミド/HOBtプロトコルを用いた縮合反応とを組み合わせることによって固相合成を行
った。各ペプチドを、25℃で3時間にわたるTFA-チオアニソール(10:1)処理によって樹脂
から切断した後、分取HPLCによって精製した。さらにMALDI-TOF MS分析によって均一性を
確認した。
SO1; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0ml/分、CH3CN(10〜20%)/30
分] 溶出時間19.62分、[M+H]+ 1192.714(計算値1192.681)。
SO3; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150 mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜20%)/
30 分] 溶出時間8.58分、[M+H]+ 1192.288(計算値1192.637)。
SR1; HPLC [コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜50%)/
30 分] 溶出時間11.07分、[M+H]+ 1633.758(計算値1633.794)。
分] 溶出時間19.62分、[M+H]+ 1192.714(計算値1192.681)。
SO3; HPLC[コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150 mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜20%)/
30 分] 溶出時間8.58分、[M+H]+ 1192.288(計算値1192.637)。
SR1; HPLC [コスモシール製5C18 ARカラム(4.6×150mm)、1.0 ml/分、CH3CN(10〜50%)/
30 分] 溶出時間11.07分、[M+H]+ 1633.758(計算値1633.794)。
１．５．3CLプロテアーゼ活性
分析HPLCを用いた基質ペプチドの切断アッセイにより、3CLプロテアーゼのタンパク質
分解活性を検出した。具体的には、7mM DTTを含有する20mMトリス-HCl緩衝液 pH7.5中の
各基質ペプチドを3CLプロテアーゼとともに37℃でインキュベートし、0.1%トリフルオロ
酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いた分析HPLC(コスモシール製5C18逆相カラム、4
.6×150mm)によって切断反応を監視した。各加水分解産物をMALDI-TOF MS分析によって同
定した。
37℃での精製プロテアーゼ変異体による各基質の加水分解反応の初期速度測定値により
、速度論的パラメータのKmおよびkcatを判定した。プロテアーゼを異なる最終濃度の各基
質(0〜168μM)を含有する様々な溶液に添加することにより、各反応を開始した。異なる
基質に対して切断活性が異なることから、酵素の最終濃度と消化時間は適宜変更した（変
異型プロテアーゼで10〜170nM、反応時間15〜90分）。反応後、分析HPLC(コスモシール製
5C18逆相カラム、4.6×150mm、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの10%〜20%直線
勾配を使用)によって加水分解物を分析した。各基質のピーク面積の減少から初期消化速
度を計算した。Kmを[S]/v対[S]（[S]は基質の濃度、vは初期反応速度）のプロットから計
算した。すべての反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
分析HPLCを用いた基質ペプチドの切断アッセイにより、3CLプロテアーゼのタンパク質
分解活性を検出した。具体的には、7mM DTTを含有する20mMトリス-HCl緩衝液 pH7.5中の
各基質ペプチドを3CLプロテアーゼとともに37℃でインキュベートし、0.1%トリフルオロ
酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いた分析HPLC(コスモシール製5C18逆相カラム、4
.6×150mm)によって切断反応を監視した。各加水分解産物をMALDI-TOF MS分析によって同
定した。
37℃での精製プロテアーゼ変異体による各基質の加水分解反応の初期速度測定値により
、速度論的パラメータのKmおよびkcatを判定した。プロテアーゼを異なる最終濃度の各基
質(0〜168μM)を含有する様々な溶液に添加することにより、各反応を開始した。異なる
基質に対して切断活性が異なることから、酵素の最終濃度と消化時間は適宜変更した（変
異型プロテアーゼで10〜170nM、反応時間15〜90分）。反応後、分析HPLC(コスモシール製
5C18逆相カラム、4.6×150mm、0.1%トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの10%〜20%直線
勾配を使用)によって加水分解物を分析した。各基質のピーク面積の減少から初期消化速
度を計算した。Kmを[S]/v対[S]（[S]は基質の濃度、vは初期反応速度）のプロットから計
算した。すべての反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
１．６．阻害物質
チオールプロテアーゼに対する代表的阻害物質E-64(Hanada, K. et al. (1978) Isolat
ion and Characterization of E-64, a New Thiol Protease Inhibitor. Agric. Biol. C
hem. 42, 523-528.)を（株）ペプチド研究所(大阪府箕面市、日本)から購入した。
チオールプロテアーゼに対する代表的阻害物質E-64(Hanada, K. et al. (1978) Isolat
ion and Characterization of E-64, a New Thiol Protease Inhibitor. Agric. Biol. C
hem. 42, 523-528.)を（株）ペプチド研究所(大阪府箕面市、日本)から購入した。
また、基質のテトラペプチド配列およびC末端側にアルデヒドを有するアルデヒド型阻
害物質（Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-L
eu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO）をNa- Fmoc-保護基を用いた従来の溶液相合成によって
合成した。具体的にはEt2NHによるFmocの脱保護とBOP試薬による対応するFmoc-アミノ酸
の縮合の組み合わせにより、Fmoc-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CON(OCH3)CH3から出発して連
続的にペプチド鎖を伸長した。鎖伸長の完了後、LiAlH4を用いてC末端側のアミドを還元
し、対応するペプチド-アルデヒドを生成した(Nahm, S.et al. (1981) N-methoxy-n-meth
ylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett. 22, 3815-3818.)。0.1%
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの15〜25%の直線勾配(60分、流速3ml/分)を用いた
セミ分取HPLC(コスモシール、5C18逆相カラム、1.0×250mm)等によって粗生成物を精製し
、さらに1H-NMR(Bruker AV300M分光計)等によって均一性等を確認した。
害物質（Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-L
eu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO）をNa- Fmoc-保護基を用いた従来の溶液相合成によって
合成した。具体的にはEt2NHによるFmocの脱保護とBOP試薬による対応するFmoc-アミノ酸
の縮合の組み合わせにより、Fmoc-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CON(OCH3)CH3から出発して連
続的にペプチド鎖を伸長した。鎖伸長の完了後、LiAlH4を用いてC末端側のアミドを還元
し、対応するペプチド-アルデヒドを生成した(Nahm, S.et al. (1981) N-methoxy-n-meth
ylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett. 22, 3815-3818.)。0.1%
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの15〜25%の直線勾配(60分、流速3ml/分)を用いた
セミ分取HPLC(コスモシール、5C18逆相カラム、1.0×250mm)等によって粗生成物を精製し
、さらに1H-NMR(Bruker AV300M分光計)等によって均一性等を確認した。
ここで、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu- NHCH(CH2
CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-V
al-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOは、より詳細には、次のように合成した。
尚、下記合成において、分取HPLC分析はELITE LaChrom system(OD, 220nm)（HITACHI）
を用いて行った。このとき、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II (4.6x150 mm または10x250 m
m)（Nacalai tesque）を用いた。
また、1H(300MHz)NMRおよび13C(75MHz)NMRのスペクトログラムをAM-300（Bruker）に記
録した。化学シフトは、TMS(0ppm)またはCHCl3(1Hについては7.28ppm、また、13Cについ
ては77.0ppm)に対するppmで表わした。
また、Autoflex-II(Bruker)により高分解能MALDI TOF-MSマススペクトルを測定した。
さらに、旋光度は、SEPA-300 polarimeter(HORIBA)を用いて、ナトリウムD線で測定し
た。
CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-V
al-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOは、より詳細には、次のように合成した。
尚、下記合成において、分取HPLC分析はELITE LaChrom system(OD, 220nm)（HITACHI）
を用いて行った。このとき、カラムはCOSMOSIL 5C18-AR-II (4.6x150 mm または10x250 m
m)（Nacalai tesque）を用いた。
また、1H(300MHz)NMRおよび13C(75MHz)NMRのスペクトログラムをAM-300（Bruker）に記
録した。化学シフトは、TMS(0ppm)またはCHCl3(1Hについては7.28ppm、また、13Cについ
ては77.0ppm)に対するppmで表わした。
また、Autoflex-II(Bruker)により高分解能MALDI TOF-MSマススペクトルを測定した。
さらに、旋光度は、SEPA-300 polarimeter(HORIBA)を用いて、ナトリウムD線で測定し
た。
(1) Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOの合成
(1-1)Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Glu-OBut(1.28 g, 3 mmol)をCH2Cl2(10 ml)に溶解し、HN(Me)2塩酸塩(0.29 g, 3.
56 mmol)、BOP(1.59 g, 3.56 mmol)、DIEA(1.91 ml, 12 mmol)を加え、室温で2時間撹拌
した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％Na
HCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を
溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し
、目的物をさらに精製することなくそのまま次のTFA処理を行った。目的物にanisole (0.
65 ml, 6.0 mmol)とTFA (7.0 ml)を加え、室温で1時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣
をヘキサンで洗浄した後減圧下で乾燥した。得られた残渣をDMF (10 ml)に溶解し、HN(OM
e)Me塩酸塩(0.38 g, 3.90 mmol)、BOP(1.72 g, 3.90 mmol)、DIEA(1.70 ml, 11 mmol)を
加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％
クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶
媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量
1.13 g (85 %), [a]D 27 +46.7 (c 0.24, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 2.00 (m, 1H), 2.
16 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.79 (s, 3H)
, 4.22 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.76 (br s, 1H), 5.91 (d, J=8.1 Hz, 1H),
7.31 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 7.75
(d, J=8.3 Hz, 2H); 13C NMR d; 27.72, 29.13, 32.29, 35.63, 37.24, 47.27, 51.04,
61.72, 67.09, 120.05, 125.23, 125.34, 127.15, 127.78, 141.37, 141.40, 143.89, 14
4.12, 156.39, 162.44, 171.99; MALDI TOF-MS; Calcd. 462.201 for C24H29N3O5Na, Fou
nd. 462.126 for [M+Na]+
(1-1)Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Glu-OBut(1.28 g, 3 mmol)をCH2Cl2(10 ml)に溶解し、HN(Me)2塩酸塩(0.29 g, 3.
56 mmol)、BOP(1.59 g, 3.56 mmol)、DIEA(1.91 ml, 12 mmol)を加え、室温で2時間撹拌
した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％Na
HCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を
溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し
、目的物をさらに精製することなくそのまま次のTFA処理を行った。目的物にanisole (0.
65 ml, 6.0 mmol)とTFA (7.0 ml)を加え、室温で1時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣
をヘキサンで洗浄した後減圧下で乾燥した。得られた残渣をDMF (10 ml)に溶解し、HN(OM
e)Me塩酸塩(0.38 g, 3.90 mmol)、BOP(1.72 g, 3.90 mmol)、DIEA(1.70 ml, 11 mmol)を
加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％
クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶
媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量
1.13 g (85 %), [a]D 27 +46.7 (c 0.24, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 2.00 (m, 1H), 2.
16 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.94 (s, 3H), 2.95 (s, 3H), 3.22 (s, 3H), 3.79 (s, 3H)
, 4.22 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.76 (br s, 1H), 5.91 (d, J=8.1 Hz, 1H),
7.31 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.61 (br t, J=8.3 Hz, 2H), 7.75
(d, J=8.3 Hz, 2H); 13C NMR d; 27.72, 29.13, 32.29, 35.63, 37.24, 47.27, 51.04,
61.72, 67.09, 120.05, 125.23, 125.34, 127.15, 127.78, 141.37, 141.40, 143.89, 14
4.12, 156.39, 162.44, 171.99; MALDI TOF-MS; Calcd. 462.201 for C24H29N3O5Na, Fou
nd. 462.126 for [M+Na]+
(1-2)Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Gln-N(OMe)Me (0.73 g, 1.66 mmol)をCH3CN (8 ml)に溶解し、Et2NH (8.6 ml)を
加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製
することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2(5 ml)に溶解し、Fmoc-L
eu-OH (0.49 g, 1.39 mmol)、BOP(0.61 g, 1.39 mmol)、DIEA(0.44 ml, 2.77 mmol)を加
え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％ク
エン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒
を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収
量 0.60 g (91 %), [a]D 27 -27.6 (c 1.1, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.94 (s, 3H), 0
.96 (s, 3H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 1H), 2.00 (br s, 1H), 2.14-2.21 (m
, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.19-4.24 (m, 1H)
, 4.22 (d, J=6.9 Hz, 1H), 4.29-4.42 (m, 2H), 4.92 (br s, 1H), 5.40 (d, J=8.4 Hz,
1H), 7.32 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.
75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 22.06, 23.12, 24.77, 26.77, 29.18, 32.33, 35.70
, 37.20, 42.19, 47.32, 49.64, 53.66, 61.71, 67.09, 120.06, 120.08, 125.22, 127.2
0, 127.82, 141.40, 143.97, 144.02, 156.19, 171.80, 172.36, 172.43; MALDI TOF-MS;
Calcd. 575.285 for C30H40N4O6Na, Found. 575.174 for [M+Na]+
Fmoc-Gln-N(OMe)Me (0.73 g, 1.66 mmol)をCH3CN (8 ml)に溶解し、Et2NH (8.6 ml)を
加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製
することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2(5 ml)に溶解し、Fmoc-L
eu-OH (0.49 g, 1.39 mmol)、BOP(0.61 g, 1.39 mmol)、DIEA(0.44 ml, 2.77 mmol)を加
え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した後、有機層を5％ク
エン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒
を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収
量 0.60 g (91 %), [a]D 27 -27.6 (c 1.1, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.94 (s, 3H), 0
.96 (s, 3H), 1.53-1.63 (m, 2H), 1.66-1.72 (m, 1H), 2.00 (br s, 1H), 2.14-2.21 (m
, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 4.19-4.24 (m, 1H)
, 4.22 (d, J=6.9 Hz, 1H), 4.29-4.42 (m, 2H), 4.92 (br s, 1H), 5.40 (d, J=8.4 Hz,
1H), 7.32 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.
75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 22.06, 23.12, 24.77, 26.77, 29.18, 32.33, 35.70
, 37.20, 42.19, 47.32, 49.64, 53.66, 61.71, 67.09, 120.06, 120.08, 125.22, 127.2
0, 127.82, 141.40, 143.97, 144.02, 156.19, 171.80, 172.36, 172.43; MALDI TOF-MS;
Calcd. 575.285 for C30H40N4O6Na, Found. 575.174 for [M+Na]+
(1-3)Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 1.09 mmol)をCH3CN (6 ml)に溶解し、Et2NH (5.6 ml
)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに
精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2-DMF(2.5 ml-2.5 ml
)に溶解し、Fmoc-Val-OH (0.44 g, 1.30 mmol)、BOP(0.58 g, 1.30 mmol)、DIEA(0.41 ml
, 2.58 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油
状物質として得た。収量 0.61 g (86 %), [a]D 27 -11.6 (c 1.0, CHCl3), 1H NMR (CDCl3
) d; 0.86 (m, 12H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.97 (br s, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 2.37-
2.39 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.03 (br t
, J=7.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.31-4.53 (m, 3H), 4.92 (br s, 1H), 5.5
8 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 6.56 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39
(t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 17
.97, 19.38, 22.10, 23.03, 24.83, 29.20, 31.25, 35.73, 37.28, 41.79, 47.32, 49.56
, 52.01, 60.61, 61.71, 67.24, 120.08, 125.22, 127.21, 127.84, 141.43, 144.05, 15
6.58, 171.32, 171.85, 172.36; MALDI TOF-MS; Calcd. 674.353 for C35H49N5O7Na, Fou
nd. 674.211 for [M+Na]+
Fmoc-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 1.09 mmol)をCH3CN (6 ml)に溶解し、Et2NH (5.6 ml
)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに
精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をCH2Cl2-DMF(2.5 ml-2.5 ml
)に溶解し、Fmoc-Val-OH (0.44 g, 1.30 mmol)、BOP(0.58 g, 1.30 mmol)、DIEA(0.41 ml
, 2.58 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を油
状物質として得た。収量 0.61 g (86 %), [a]D 27 -11.6 (c 1.0, CHCl3), 1H NMR (CDCl3
) d; 0.86 (m, 12H), 1.49-1.65 (m, 2H), 1.97 (br s, 1H), 2.12-2.17 (m, 2H), 2.37-
2.39 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.94 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 4.03 (br t
, J=7.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.9 Hz, 1H), 4.31-4.53 (m, 3H), 4.92 (br s, 1H), 5.5
8 (br d, J=8.7 Hz, 1H), 6.56 (br d, J=7.5 Hz, 1H), 7.30 (t, J=7.5 Hz, 2H), 7.39
(t, J=7.5 Hz, 2H), 7.59 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.5 Hz, 2H); 13C NMR d; 17
.97, 19.38, 22.10, 23.03, 24.83, 29.20, 31.25, 35.73, 37.28, 41.79, 47.32, 49.56
, 52.01, 60.61, 61.71, 67.24, 120.08, 125.22, 127.21, 127.84, 141.43, 144.05, 15
6.58, 171.32, 171.85, 172.36; MALDI TOF-MS; Calcd. 674.353 for C35H49N5O7Na, Fou
nd. 674.211 for [M+Na]+
(1-4)Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 0.92 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解
し、Et2NH (4.8 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた
。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml
)に溶解し、Fmoc-Ala-OH (0.34 g, 1.09 mmol)、BOP(0.49 g, 1.09 mmol)、DIEA(0.35 ml
, 2.20 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)
を油状物質として得た。収量 0.51 g (77 %), [a]D 27 -30.3 (c 0.90, CHCl3), 1H NMR (
CDCl3) d; 0.87 (d, J=6.6 Hz, 6H), 0.93 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 3H)
, 1.51-1.67 (m, 3H), 1.95-2.14 (m, 3H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.88 (s, 6H), 3.17(s,
3H), 3.72 (s, 3H), 4.20 (t, J=7.2 Hz, 1H), 4.28-4.41 (m, 2H), 4.46 (br s, 1H),
4.57 (br s, 1H), 4.83 (br s, 1H), 5.08 (br s, 1H), 6.21 (br s, 1H), 7.24 (t, J=7
.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 2
H), 7.95 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.66, 19.42, 22.65, 22.88, 25.04, 27.92, 29.34,
31.51, 32.33, 35.58, 37.20, 42.06, 47.27, 49.01, 50.59, 51.76, 58.92, 61.79, 67
.19, 120.06, 125.32, 127.17, 127.81, 141.39, 144.05, 162.49, 171.03, 172.07, 172
.94; MALDI TOF-MS; Calcd. 745.390 for C38H54N6O8Na, Found. 745.199 for [M+Na]+
Fmoc-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.60 g, 0.92 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に溶解
し、Et2NH (4.8 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥させた
。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(5 ml
)に溶解し、Fmoc-Ala-OH (0.34 g, 1.09 mmol)、BOP(0.49 g, 1.09 mmol)、DIEA(0.35 ml
, 2.20 mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで抽出した
後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有機層をMg
SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)
を油状物質として得た。収量 0.51 g (77 %), [a]D 27 -30.3 (c 0.90, CHCl3), 1H NMR (
CDCl3) d; 0.87 (d, J=6.6 Hz, 6H), 0.93 (d, J=6.6 Hz, 6H), 1.36 (d, J=6.9 Hz, 3H)
, 1.51-1.67 (m, 3H), 1.95-2.14 (m, 3H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.88 (s, 6H), 3.17(s,
3H), 3.72 (s, 3H), 4.20 (t, J=7.2 Hz, 1H), 4.28-4.41 (m, 2H), 4.46 (br s, 1H),
4.57 (br s, 1H), 4.83 (br s, 1H), 5.08 (br s, 1H), 6.21 (br s, 1H), 7.24 (t, J=7
.2 Hz, 2H), 7.37 (t, J=7.4 Hz, 2H), 7.60 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.74 (d, J=7.5 Hz, 2
H), 7.95 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.66, 19.42, 22.65, 22.88, 25.04, 27.92, 29.34,
31.51, 32.33, 35.58, 37.20, 42.06, 47.27, 49.01, 50.59, 51.76, 58.92, 61.79, 67
.19, 120.06, 125.32, 127.17, 127.81, 141.39, 144.05, 162.49, 171.03, 172.07, 172
.94; MALDI TOF-MS; Calcd. 745.390 for C38H54N6O8Na, Found. 745.199 for [M+Na]+
(1-5)Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.56 g, 0.77 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に
溶解し、Et2NH (4.0 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥さ
せた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(
5 ml)に溶解し、Fmoc-Ser(But)-OH (0.36 g, 0.94 mmol)、BOP(0.41 g, 0.94 mmol)、DIE
A(0.30 ml, 1.89 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで
抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有
機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用い
るシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-G
ln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.58 g (86 %), [a]D 27 -22.8 (c 0.15,
CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.84-0.92 (m, 12H), 1.15 (s, 9H), 1.34 (d, J=6.6 Hz,
3H), 1.55-1.63 (m, 3H), 1.89-1.99 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 2.36 (br s, 2H), 2
.88 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.47 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.71 (t, J=7.8
Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.21 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.29-4.50 (m, 4H), 4.83 (br s, 1H
), 4.94 (br s, 1H), 5.09 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 7.26 (br t, J=7.4 Hz, 2H),
7.37 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (br d, J=6.9 Hz, 2H), 7.74 (br d, J=7.2 Hz, 2H)
, 7.83 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.51, 19.26, 22.36, 22.79, 24.95
, 27.35, 27.90, 29.20, 31.57, 35.42, 37.09, 41.80, 47.15, 48.99, 51.67, 54.98, 5
8.70, 61.70, 62.20, 67.05, 119.89, 125.22, 127.02, 127.65, 141.26, 143.92, 162.3
4, 170.02, 171.00, 172.00; MALDI TOF-MS; Calcd. 888.041 for C45H66N7O10Na, Found
. 888.253 for [M+Na]+
Fmoc-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.56 g, 0.77 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml-3 ml)に
溶解し、Et2NH (4.0 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧下乾燥さ
せた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残渣をDMF(
5 ml)に溶解し、Fmoc-Ser(But)-OH (0.36 g, 0.94 mmol)、BOP(0.41 g, 0.94 mmol)、DIE
A(0.30 ml, 1.89 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を留去し残渣を酢酸エチルで
抽出した後、有機層を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、飽和食塩水で洗浄した。有
機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣を、溶出液としてCHCl3:MeOH=10:0.5を用い
るシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物(Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-G
ln(Me)2-N(OMe)Me)を油状物質として得た。収量 0.58 g (86 %), [a]D 27 -22.8 (c 0.15,
CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d; 0.84-0.92 (m, 12H), 1.15 (s, 9H), 1.34 (d, J=6.6 Hz,
3H), 1.55-1.63 (m, 3H), 1.89-1.99 (m, 1H), 2.07-2.17 (m, 2H), 2.36 (br s, 2H), 2
.88 (s, 3H), 2.89 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.47 (t, J=7.8 Hz, 1H), 3.71 (t, J=7.8
Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 4.21 (t, J=7.1 Hz, 1H), 4.29-4.50 (m, 4H), 4.83 (br s, 1H
), 4.94 (br s, 1H), 5.09 (br s, 1H), 6.39 (br s, 1H), 7.26 (br t, J=7.4 Hz, 2H),
7.37 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 7.62 (br d, J=6.9 Hz, 2H), 7.74 (br d, J=7.2 Hz, 2H)
, 7.83 (br s, 1H), 8.03 (br s, 1H); 13C NMR d; 18.51, 19.26, 22.36, 22.79, 24.95
, 27.35, 27.90, 29.20, 31.57, 35.42, 37.09, 41.80, 47.15, 48.99, 51.67, 54.98, 5
8.70, 61.70, 62.20, 67.05, 119.89, 125.22, 127.02, 127.65, 141.26, 143.92, 162.3
4, 170.02, 171.00, 172.00; MALDI TOF-MS; Calcd. 888.041 for C45H66N7O10Na, Found
. 888.253 for [M+Na]+
(1-6)Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.57 g, 0.66 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml
-3 ml)に溶解し、Et2NH (3.4 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧
下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残
渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Thr(But)-OH (0.33 g, 0.80 mmol)、BOP(0.35 g, 0.80 mm
ol)、DIEA(0.25 ml, 1.57 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2O
を加え、析出する沈殿を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、水で洗浄した。DMF/Et2O
で再沈殿し、目的物(Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固形物
として得た。収量 0.40 g (59 %), [a]D 27 -13.2 (c 0.68, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d;
0.93-0.95 (br s, 12H), 1.17 (s, 12H), 1.31 (s, 9H), 1.41 (br d, J=6.0 Hz, 3H), 1
.67 (br s, 3H), 1.93 (br s, 1H), 2.13 (br s, 1H), 2.38 (br s, 3H), 2.92 (s, 3H),
2.97 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.51 (br s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.87 (br d, J=7.8 Hz
, 1H), 4.22 (br s, 4H), 4.42 (br s, 4H), 4.96 (br s, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.1
4-7.41 (m, 7H), 7.58 (br d, J=5.7 Hz, 2H), 7.77 (br d, J=6.3 Hz, 2H); 13C NMR d;
17.28, 17.35, 17.89, 19.33, 21.48, 23.24, 24.73, 27.45, 28.30, 29.08, 29.65, 35
.51, 37.23, 40.50, 47.22, 49.11, 50.49, 51.89, 54.52, 59.07, 60.83, 61.58, 66.72
, 67.19, 120.08, 124.98, 125.08, 127.12, 127.84, 141.39, 143.61, 143.75, 156.07,
162.36, 169.63, 171.05, 171.35, 171.94, 172.31; MALDI TOF-MS; Calcd. 1045.252 f
or C53H81N8O12Na, Found. 1045.426 for [M+Na]+
Fmoc-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (0.57 g, 0.66 mmol)をCH2Cl2-CH3CN (3 ml
-3 ml)に溶解し、Et2NH (3.4 ml)を加え、室温で40分撹拌した。溶媒を留去し残渣を減圧
下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った。得られた残
渣をDMF(5 ml)に溶解し、Fmoc-Thr(But)-OH (0.33 g, 0.80 mmol)、BOP(0.35 g, 0.80 mm
ol)、DIEA(0.25 ml, 1.57 mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2O
を加え、析出する沈殿を5％クエン酸水溶液、5％NaHCO3水溶液、水で洗浄した。DMF/Et2O
で再沈殿し、目的物(Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固形物
として得た。収量 0.40 g (59 %), [a]D 27 -13.2 (c 0.68, CHCl3), 1H NMR (CDCl3) d;
0.93-0.95 (br s, 12H), 1.17 (s, 12H), 1.31 (s, 9H), 1.41 (br d, J=6.0 Hz, 3H), 1
.67 (br s, 3H), 1.93 (br s, 1H), 2.13 (br s, 1H), 2.38 (br s, 3H), 2.92 (s, 3H),
2.97 (s, 3H), 3.20 (s, 3H), 3.51 (br s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.87 (br d, J=7.8 Hz
, 1H), 4.22 (br s, 4H), 4.42 (br s, 4H), 4.96 (br s, 1H), 6.78-6.81 (m, 2H), 7.1
4-7.41 (m, 7H), 7.58 (br d, J=5.7 Hz, 2H), 7.77 (br d, J=6.3 Hz, 2H); 13C NMR d;
17.28, 17.35, 17.89, 19.33, 21.48, 23.24, 24.73, 27.45, 28.30, 29.08, 29.65, 35
.51, 37.23, 40.50, 47.22, 49.11, 50.49, 51.89, 54.52, 59.07, 60.83, 61.58, 66.72
, 67.19, 120.08, 124.98, 125.08, 127.12, 127.84, 141.39, 143.61, 143.75, 156.07,
162.36, 169.63, 171.05, 171.35, 171.94, 172.31; MALDI TOF-MS; Calcd. 1045.252 f
or C53H81N8O12Na, Found. 1045.426 for [M+Na]+
(1-7)Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me
Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (78 mg, 75 mmol)をCH2Cl2-CH3CN
(1.5 ml-1.5 ml)に溶解し、Et2NH (0.59 ml)を加え、室温で60分撹拌した。溶媒を留去
し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った
。得られた残渣をDMF(3 ml)に溶解し、Ac2O(0.14 ml, 1.48 mmol)、DIEA(0.24 ml, 1.48
mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2Oを加え、析出する沈殿をDMF
/Et2Oで再沈殿し、目的物(Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固
形物として得た。収量 40 mg (63 %), [a]D 27 -17.5 (c 0.20, DMF), 1H NMR (DMSO-d6)
d;0.80-0.88 (m, 12H), 1.04 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 3
H), 1.17 (s, 9H), 1.36-1.46 (m, 2H), 1.53-1.60 (m, 1H), 1.63-1.83 (m, 2H), 1.91
(s, 3H), 1.97 (m, 1H), 2.30 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.
10 (s, 3H), 3.41-3.46 (m, 1H), 3.51-3.59 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.87-3.90 (m, 1H
), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.30-4.39 (m, 4H), 4.71 (br s, 1H), 7.61-7.97 (m, 6H); 13C
NMR d; 18.49, 18.92, 19.64, 21.94, 22.97, 23.54, 24.40, 27.57, 28.45, 30.75, 35
.29, 37.01, 48.61, 53.60, 57.75, 58.10, 62.25, 67.50, 169.89, 170.98, 171.64, 17
2.23; MALDI TOF-MS; Calcd. 865.538 for C40H74N8O11Na, Found. 865.476 for [M+Na]
+
Fmoc-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (78 mg, 75 mmol)をCH2Cl2-CH3CN
(1.5 ml-1.5 ml)に溶解し、Et2NH (0.59 ml)を加え、室温で60分撹拌した。溶媒を留去
し残渣を減圧下乾燥させた。生成物をさらに精製することなくそのまま次の縮合を行った
。得られた残渣をDMF(3 ml)に溶解し、Ac2O(0.14 ml, 1.48 mmol)、DIEA(0.24 ml, 1.48
mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去し残渣にH2Oを加え、析出する沈殿をDMF
/Et2Oで再沈殿し、目的物(Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln(Me)2-N(OMe)Me)を固
形物として得た。収量 40 mg (63 %), [a]D 27 -17.5 (c 0.20, DMF), 1H NMR (DMSO-d6)
d;0.80-0.88 (m, 12H), 1.04 (d, J=6.3 Hz, 3H), 1.10 (s, 9H), 1.11 (d, J=6.6 Hz, 3
H), 1.17 (s, 9H), 1.36-1.46 (m, 2H), 1.53-1.60 (m, 1H), 1.63-1.83 (m, 2H), 1.91
(s, 3H), 1.97 (m, 1H), 2.30 (br t, J=7.4 Hz, 2H), 2.80 (s, 3H), 2.90 (s, 3H), 3.
10 (s, 3H), 3.41-3.46 (m, 1H), 3.51-3.59 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.87-3.90 (m, 1H
), 4.10-4.15 (m, 1H), 4.30-4.39 (m, 4H), 4.71 (br s, 1H), 7.61-7.97 (m, 6H); 13C
NMR d; 18.49, 18.92, 19.64, 21.94, 22.97, 23.54, 24.40, 27.57, 28.45, 30.75, 35
.29, 37.01, 48.61, 53.60, 57.75, 58.10, 62.25, 67.50, 169.89, 170.98, 171.64, 17
2.23; MALDI TOF-MS; Calcd. 865.538 for C40H74N8O11Na, Found. 865.476 for [M+Na]
+
(1-8)Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (30 mg, 36 mmol)をDMF-THF (1.5 m
l-1.5 ml)に溶解し、LiAlH4(30 mg)を加え、室温で90分撹拌した。反応液をセライトろ過
し溶媒を減圧留去した。生成物をCosmosil 5C18 (10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA
containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 15% to 60% in 60 min) で精製した
。目的物を含むピーク（42分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収量 5.2 mg
(19 %) 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.82-0.93 (m, 12H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1
.14 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 1.31-1.36 (m, 3H), 1.56-1.64 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2
.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.33 (m, 2H), 2.85 (br s, 3H), 2.97 (br s, 3H), 3.61-3.70
(m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.10-4.24 (m, 6H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd
. 806.501 for C38H69N7O10Na, Found. 806.121 for [M+Na]+
得られた粉末 (7.1 mg, 9 mmol) にanisole (15 ml, 6.0 mmol)とTFA (0.5 ml)を加え、
室温で2時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣にエーテル(5 ml)と0.1% aq.TFA (5 ml)を
加えた。水層をエーテル(5 ml) で洗浄後、水層を凍結乾燥した。生成物をCosmosil 5C18
(10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradie
nt, 10% to 40% in 60 min) で精製した。目的物(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO)を含むピーク（25.6分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収
量 1.8 mg (30 %), HPLC retention time, 14.36 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm),
0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1
H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.84-0.94 (m, 12H), 1.14-1.17 (m, 3H), 1.33-1.37
(m, 3H), 1.56-1.63 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.32-2.35 (m, 2H),
2.84-2.87 (m, 3H), 2.94-2.99 (m, 3H), 3.74-3.76 (m, 1H), 3.81-3.85 (m, 1H), 4.1
7-4.33 (m, 6H), 4.77-4.82 (m, 1H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 694.375 for
C30H53N7O10Na, Found. 694.337 for [M+Na]+
Ac-Thr(But)-Ser(But)-Ala-Val-Leu-Gln-N(OMe)Me (30 mg, 36 mmol)をDMF-THF (1.5 m
l-1.5 ml)に溶解し、LiAlH4(30 mg)を加え、室温で90分撹拌した。反応液をセライトろ過
し溶媒を減圧留去した。生成物をCosmosil 5C18 (10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA
containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 15% to 60% in 60 min) で精製した
。目的物を含むピーク（42分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収量 5.2 mg
(19 %) 1H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.82-0.93 (m, 12H), 1.10-1.14 (m, 3H), 1
.14 (s, 9H), 1.17 (s, 9H), 1.31-1.36 (m, 3H), 1.56-1.64 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2
.10-2.17 (m, 1H), 2.28-2.33 (m, 2H), 2.85 (br s, 3H), 2.97 (br s, 3H), 3.61-3.70
(m, 2H), 3.97-4.02 (m, 1H), 4.10-4.24 (m, 6H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd
. 806.501 for C38H69N7O10Na, Found. 806.121 for [M+Na]+
得られた粉末 (7.1 mg, 9 mmol) にanisole (15 ml, 6.0 mmol)とTFA (0.5 ml)を加え、
室温で2時間撹拌した。室温でTFAを留去、残渣にエーテル(5 ml)と0.1% aq.TFA (5 ml)を
加えた。水層をエーテル(5 ml) で洗浄後、水層を凍結乾燥した。生成物をCosmosil 5C18
(10 x 250 mm)を用いるHPLC (0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradie
nt, 10% to 40% in 60 min) で精製した。目的物(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2
CON(CH3)2)-CHO)を含むピーク（25.6分に溶出）を集め、凍結乾燥し白色粉末を得た。収
量 1.8 mg (30 %), HPLC retention time, 14.36 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm),
0.1 % TFA containing CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1
H NMR (CD3CN containing D2O) d; 0.84-0.94 (m, 12H), 1.14-1.17 (m, 3H), 1.33-1.37
(m, 3H), 1.56-1.63 (m, 3H), 2.02 (s, 3H), 2.02-2.09 (m, 1H), 2.32-2.35 (m, 2H),
2.84-2.87 (m, 3H), 2.94-2.99 (m, 3H), 3.74-3.76 (m, 1H), 3.81-3.85 (m, 1H), 4.1
7-4.33 (m, 6H), 4.77-4.82 (m, 1H), 9.44 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 694.375 for
C30H53N7O10Na, Found. 694.337 for [M+Na]+
上記合成中間体より同様の操作により以下の各誘導体を合成した。
(2)Ac-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 18.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (CD3CN) d; 0
.86-0.99 (m, 12H), 1.51-1.64 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.31-2.37 (m, 2H), 3.98 (br
t, J=5.9 Hz, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.78-4.86 (m, 1H), 6.82
(br d, J=7.8 Hz, 2H), 6.96 (br d, J=8.7 Hz, 1H); MALDI TOF-MS; Calcd. 435.259 fo
r C20H46N4O5Na, Found. 435.955 for [M+Na]+
HPLC retention time, 18.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (CD3CN) d; 0
.86-0.99 (m, 12H), 1.51-1.64 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.31-2.37 (m, 2H), 3.98 (br
t, J=5.9 Hz, 1H), 4.27-4.33 (m, 1H), 4.55-4.63 (m, 1H), 4.78-4.86 (m, 1H), 6.82
(br d, J=7.8 Hz, 2H), 6.96 (br d, J=8.7 Hz, 1H); MALDI TOF-MS; Calcd. 435.259 fo
r C20H46N4O5Na, Found. 435.955 for [M+Na]+
(3)Ac-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 12.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (D2O) d; 0.8
6-0.94 (m, 12H), 1.33 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.57-1.67 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.00-2
.22 (m, 3H), 2.45-2.49 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 4.08 (d, J=8.1 Hz, 1
H), 4.28 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 2H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd.
506.296 for C23H41N5O6Na, Found. 506.216 for [M+Na]+
HPLC retention time, 12.64 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 60% in 30 min], 1H NMR (D2O) d; 0.8
6-0.94 (m, 12H), 1.33 (d, J=7.2 Hz, 3H), 1.57-1.67 (m, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.00-2
.22 (m, 3H), 2.45-2.49 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 4.08 (d, J=8.1 Hz, 1
H), 4.28 (q, J=7.2 Hz, 1H), 4.38-4.42 (m, 2H), 9.41 (br s); MALDI TOF-MS; Calcd.
506.296 for C23H41N5O6Na, Found. 506.216 for [M+Na]+
(4)Ac-Ser-Ala-Val-Leu- NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO
HPLC retention time, 14.38 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1H NMR (CD3CN conta
ining D2O) d; 0.85-0.92 (m, 12H), 1.36 (d, J=7.5 Hz, 3H), 1.56-1.66 (m, 3H), 1.9
8 (s, 3H), 2.07-2.10 (m, 1H), 2.30-2.35 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.6
4-3.69 (m, 1H), 3.77-3.83 (m, 1H), 4.00-4.02 (m, 1H), 4.19-4.30 (m, 23H), 9.44 (
br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 593.328 for C26H46N6O8Na, Found. 593.258 for [M+Na]+
HPLC retention time, 14.38 min [Cosmosil 5C18 (4.6 x 150 mm), 0.1 % TFA containi
ng CH3CN:0.1% aq.TFA; CH3CN gradient, 10% to 40% in 30 min], 1H NMR (CD3CN conta
ining D2O) d; 0.85-0.92 (m, 12H), 1.36 (d, J=7.5 Hz, 3H), 1.56-1.66 (m, 3H), 1.9
8 (s, 3H), 2.07-2.10 (m, 1H), 2.30-2.35 (m, 2H), 2.86 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.6
4-3.69 (m, 1H), 3.77-3.83 (m, 1H), 4.00-4.02 (m, 1H), 4.19-4.30 (m, 23H), 9.44 (
br s); MALDI TOF-MS; Calcd. 593.328 for C26H46N6O8Na, Found. 593.258 for [M+Na]+
１．７．阻害活性
基質として前記合成ウンデカペプチドSO1を用い、阻害活性について検討した。上記の
ように、分析HPLCにより、様々な濃度の阻害物質の存在下における精製3CLプロテアーゼ
変異体による基質の切断を監視した。阻害活性を、S字形用量-応答曲線から得られるIC50
値を用いて評価した。反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
基質として前記合成ウンデカペプチドSO1を用い、阻害活性について検討した。上記の
ように、分析HPLCにより、様々な濃度の阻害物質の存在下における精製3CLプロテアーゼ
変異体による基質の切断を監視した。阻害活性を、S字形用量-応答曲線から得られるIC50
値を用いて評価した。反応を3回繰り返し、結果を平均化した。
２．結果
２．１．成熟3CLプロテアーゼの発現
本発明者は、大腸菌内で、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にMBP-His-Flagタグを結合
した融合タンパク質を発現させた後、まず、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側のMBP-His-F
lagタグを切断することによって、タグを結合していない3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロ
テアーゼ）を得ようとした。
２．１．成熟3CLプロテアーゼの発現
本発明者は、大腸菌内で、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にMBP-His-Flagタグを結合
した融合タンパク質を発現させた後、まず、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側のMBP-His-F
lagタグを切断することによって、タグを結合していない3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロ
テアーゼ）を得ようとした。
IPTG誘導による全細胞抽出物中の主な産物として、SARS 3CLプロテアーゼのN末端側にM
BP-His-Flagタグを結合した融合タンパク質に対応する約75kDaの産物が生成された(図2A
、レーン1)。粗抽出物の金属アフィニティー樹脂への吸着後、目的の75kDa産物がイミダ
ゾールで容易に溶出され、過剰量のイミダゾールを限外濾過によって除去した(図2A、レ
ーン2)。75kDaの産物は3CLプロテアーゼのP1/P2切断部位を有するウンデカペプチド基質S
01を切断しなかった。これは、N末端側の分子の大きいMBP-His-Fragタグの影響だと考え
られる。融合タンパク質の通常のエンテロキナーゼ処理により、Coomassie染色後にSDS-P
AGE上でN末端側のMBP-His-Flagタグに対応する42kDaの産物が得られたが、MBP-His-Flag
タグが切り離された3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロテアーゼ）に対応する33kDaの産物は
ほとんど検出されなかった(図2A、レーン3)。このエンテロキナーゼで処理した調製物で
は、SO1基質に対するタンパク質分解活性は全く検出されなかった。しかし、エンテロキ
ナーゼの添加に先立ちSO1を75kDaの産物と混合すると、SO1が効率的に切断された(図3A)
。この反応混合物では、想定されたSO1の断片ペプチドが明確に検出され、MALDI-TOF MS
分析によって同定された(図3A;ピーク1、H-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2の場合で[M+H]+ 593
.365(計算値593.353); ピーク2、H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-OHの場合で[M+H]+ 618.288
(計算値618.347))。この結果は、75kDaの融合タンパク質がエンテロキナーゼで消化され
て成熟3CLプロテアーゼが一時的に生成し、それがS01基質を切断したことを示唆している
。
BP-His-Flagタグを結合した融合タンパク質に対応する約75kDaの産物が生成された(図2A
、レーン1)。粗抽出物の金属アフィニティー樹脂への吸着後、目的の75kDa産物がイミダ
ゾールで容易に溶出され、過剰量のイミダゾールを限外濾過によって除去した(図2A、レ
ーン2)。75kDaの産物は3CLプロテアーゼのP1/P2切断部位を有するウンデカペプチド基質S
01を切断しなかった。これは、N末端側の分子の大きいMBP-His-Fragタグの影響だと考え
られる。融合タンパク質の通常のエンテロキナーゼ処理により、Coomassie染色後にSDS-P
AGE上でN末端側のMBP-His-Flagタグに対応する42kDaの産物が得られたが、MBP-His-Flag
タグが切り離された3CLプロテアーゼ（成熟3CLプロテアーゼ）に対応する33kDaの産物は
ほとんど検出されなかった(図2A、レーン3)。このエンテロキナーゼで処理した調製物で
は、SO1基質に対するタンパク質分解活性は全く検出されなかった。しかし、エンテロキ
ナーゼの添加に先立ちSO1を75kDaの産物と混合すると、SO1が効率的に切断された(図3A)
。この反応混合物では、想定されたSO1の断片ペプチドが明確に検出され、MALDI-TOF MS
分析によって同定された(図3A;ピーク1、H-Ser-Gly-Phe-Arg-Lys-NH2の場合で[M+H]+ 593
.365(計算値593.353); ピーク2、H-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-OHの場合で[M+H]+ 618.288
(計算値618.347))。この結果は、75kDaの融合タンパク質がエンテロキナーゼで消化され
て成熟3CLプロテアーゼが一時的に生成し、それがS01基質を切断したことを示唆している
。
本発明者は、C末端側にHisタグを有する3CLプロテアーゼも発現させたが、N末端側にMB
P-His-Flagタグを有するプロテアーゼと異なり、IPTG誘導による全細胞抽出物の主な産物
として目的の34kDaのタンパク質が検出されなかった(図4A、レーン1)。しかし、金属アフ
ィニティー樹脂を用いて目的のタンパク質を部分精製することができ(図4A、レーン2)、
抗-His-タグ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって所望の34kDaの産物が確認さ
れた(図4B、レーン1)。本発明者は、イミダゾールを除去して室温に放置すると、34kDaの
タンパク質の免疫染色強度が低下し、新たに14kDaのタンパク質が現れることを見いだし
た(図4B、レーン2)。さらに、プロテアーゼをエンテロキナーゼとともに室温で一晩イン
キュベートすると、この3CLプロテアーゼの分解産物と考えられるものが検出された(図4B
、レーン3)。これらの結果を組み合わせると、天然型成熟3CLプロテアーゼがタンパク質
分解を受けやすいことが強く示唆される。
P-His-Flagタグを有するプロテアーゼと異なり、IPTG誘導による全細胞抽出物の主な産物
として目的の34kDaのタンパク質が検出されなかった(図4A、レーン1)。しかし、金属アフ
ィニティー樹脂を用いて目的のタンパク質を部分精製することができ(図4A、レーン2)、
抗-His-タグ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって所望の34kDaの産物が確認さ
れた(図4B、レーン1)。本発明者は、イミダゾールを除去して室温に放置すると、34kDaの
タンパク質の免疫染色強度が低下し、新たに14kDaのタンパク質が現れることを見いだし
た(図4B、レーン2)。さらに、プロテアーゼをエンテロキナーゼとともに室温で一晩イン
キュベートすると、この3CLプロテアーゼの分解産物と考えられるものが検出された(図4B
、レーン3)。これらの結果を組み合わせると、天然型成熟3CLプロテアーゼがタンパク質
分解を受けやすいことが強く示唆される。
２．２．3CLプロテアーゼの切断部位の同定
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、成熟3CLプロテアーゼとN末端側のMBP-His
-Flagタグとからなる75kDaの融合タンパク質のエンテロキナーゼ消化(図2B)について注意
深く検討した。金属アフィニティー樹脂処理後の試料では、融合タンパク質に対応する75
kDaの産物が検出された(図2B、レーン１)。次に、前記画分を少量のエンテロキナーゼで1
5分間処理すると、目的の33kDaの産物がCoomassie染色でかすかに検出されるとともに、3
3kDaの産物の分解産物と考えられる産物として、20kDaおよび13kDaで2つのバンドも検出
された(図2B、レーン2)。処理時間が30分、60分と経過すると33kDaのバンドは徐々に消失
した(図2B、レーン3（30分）、レーン4（60分）)。この新たに現れた13kDaのタンパク質
は、免疫染色によって検出されるC末端側にHis-タグを付加した3CLプロテアーゼのタンパ
ク質分解産物と同一であるように思われた(図4B、レーン2〜4)。13kDaのタンパク質をPVD
Fメンブランにブロッテングし、アミノ酸シークエンサーで解析したところ、産物のN末端
側配列がGln-Thr-Ala-Gln-Alaであると判定された。この結果は、成熟3CLプロテアーゼが
188Arg/189Gln部位で切断されることを示している。さらに、188Arg/189Gln部位を有する
ヘキサデカペプチドであるSR1基質を用いて、成熟3CLプロテアーゼが生成されるときにタ
ンパク質分解活性が発現されるか検討した(図3B)。予想どおり、75kDaの融合タンパク質
が通常のエンテロキナーゼ処理の間にヘキサデカペプチドを切断する一方(図3B; ピーク1
、H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-OHの場合で[M+H]+ 690,282(計算値690.358))、同一条件下
でエンテロキナーゼ単独によってSR1ペプチドを切断することができなかった。
3CLプロテアーゼの切断部位を同定するため、成熟3CLプロテアーゼとN末端側のMBP-His
-Flagタグとからなる75kDaの融合タンパク質のエンテロキナーゼ消化(図2B)について注意
深く検討した。金属アフィニティー樹脂処理後の試料では、融合タンパク質に対応する75
kDaの産物が検出された(図2B、レーン１)。次に、前記画分を少量のエンテロキナーゼで1
5分間処理すると、目的の33kDaの産物がCoomassie染色でかすかに検出されるとともに、3
3kDaの産物の分解産物と考えられる産物として、20kDaおよび13kDaで2つのバンドも検出
された(図2B、レーン2)。処理時間が30分、60分と経過すると33kDaのバンドは徐々に消失
した(図2B、レーン3（30分）、レーン4（60分）)。この新たに現れた13kDaのタンパク質
は、免疫染色によって検出されるC末端側にHis-タグを付加した3CLプロテアーゼのタンパ
ク質分解産物と同一であるように思われた(図4B、レーン2〜4)。13kDaのタンパク質をPVD
Fメンブランにブロッテングし、アミノ酸シークエンサーで解析したところ、産物のN末端
側配列がGln-Thr-Ala-Gln-Alaであると判定された。この結果は、成熟3CLプロテアーゼが
188Arg/189Gln部位で切断されることを示している。さらに、188Arg/189Gln部位を有する
ヘキサデカペプチドであるSR1基質を用いて、成熟3CLプロテアーゼが生成されるときにタ
ンパク質分解活性が発現されるか検討した(図3B)。予想どおり、75kDaの融合タンパク質
が通常のエンテロキナーゼ処理の間にヘキサデカペプチドを切断する一方(図3B; ピーク1
、H-Gly-Pro-Phe-Val-Asp-Arg-OHの場合で[M+H]+ 690,282(計算値690.358))、同一条件下
でエンテロキナーゼ単独によってSR1ペプチドを切断することができなかった。
２．３．3CL-R188I-プロテアーゼ変異体（組換えタンパク質）の発現および精製
ついで本発明者は、タンパク質分解に抵抗性を示す活性を持つ安定な3CLプロテアーゼ
を得るため、Arg-188が部位特異的変異誘発によりIleと置換された3CLプロテアーゼ変異
体(3CL-R188I)を構築した。
ついで本発明者は、タンパク質分解に抵抗性を示す活性を持つ安定な3CLプロテアーゼ
を得るため、Arg-188が部位特異的変異誘発によりIleと置換された3CLプロテアーゼ変異
体(3CL-R188I)を構築した。
天然型3CLプロテアーゼと同様、細菌細胞内でN末端側にMBP-His-FlagタグまたはC末端
側にHisタグを有する3CL-R188Iプロテアーゼを発現させた。N末端側にタグを有する3CL-R
188Iプロテアーゼの75kDaの産物を金属アフィニティー樹脂によって部分精製した（図5A
、レーン2）。尚、図5A、レーン１はこの金属アフィニティー樹脂精製前の粗抽出液をSDS
-PAGEで分離したものである。通常のエンテロキナーゼ処理後、3CL-R188Iプロテアーゼに
対応する目的の33kDaの産物（組換えタンパク質）およびMBP-His-Flagに対応する42kDaの
断片はSDS-PAGE上でCoomassie色素に強く染色されたが、タンパク質分解産物は全く検出
されなかった(図5A、レーン3)。本発明者は、この段階で、アフィニティーアガロースに
よりエンテロキナーゼを除去した後に、組換えタンパク質のSO1基質に対するタンパク質
分解活性を確認した。pH5.5でのアニオン交換クロマトグラフィーにより、3CL-R188Iプロ
テアーゼをさらに精製した。つまり、予想どおり計算値pI6.24の3CL-R188Iプロテアーゼ
が樹脂を通過し、計算値pI5.08のMBP-His-Flagが樹脂上に吸着された(図5A、レーン4（通
過画分）、レーン5（樹脂の保持画分）)。細菌培養物100mlから約0.10mgの精製したタグ
が付加していない組み換えタンパク質が得られた。
側にHisタグを有する3CL-R188Iプロテアーゼを発現させた。N末端側にタグを有する3CL-R
188Iプロテアーゼの75kDaの産物を金属アフィニティー樹脂によって部分精製した（図5A
、レーン2）。尚、図5A、レーン１はこの金属アフィニティー樹脂精製前の粗抽出液をSDS
-PAGEで分離したものである。通常のエンテロキナーゼ処理後、3CL-R188Iプロテアーゼに
対応する目的の33kDaの産物（組換えタンパク質）およびMBP-His-Flagに対応する42kDaの
断片はSDS-PAGE上でCoomassie色素に強く染色されたが、タンパク質分解産物は全く検出
されなかった(図5A、レーン3)。本発明者は、この段階で、アフィニティーアガロースに
よりエンテロキナーゼを除去した後に、組換えタンパク質のSO1基質に対するタンパク質
分解活性を確認した。pH5.5でのアニオン交換クロマトグラフィーにより、3CL-R188Iプロ
テアーゼをさらに精製した。つまり、予想どおり計算値pI6.24の3CL-R188Iプロテアーゼ
が樹脂を通過し、計算値pI5.08のMBP-His-Flagが樹脂上に吸着された(図5A、レーン4（通
過画分）、レーン5（樹脂の保持画分）)。細菌培養物100mlから約0.10mgの精製したタグ
が付加していない組み換えタンパク質が得られた。
同様に、C末端側にHisタグを有する3CL-R188Iプロテアーゼに対応する34kDaのタンパク
質がIPTG誘導後の全細胞溶解物の主な産物として生成された(図5B、レーン1)。金属アフ
ィニティー樹脂による単一ステップによる操作で、十分に精製された目的物が得られた(
図5B、レーン2)。この場合、約0.13mgのC末端側にHis-タグが付加した精製タンパク質が1
00mlの培養物から得られた。
質がIPTG誘導後の全細胞溶解物の主な産物として生成された(図5B、レーン1)。金属アフ
ィニティー樹脂による単一ステップによる操作で、十分に精製された目的物が得られた(
図5B、レーン2)。この場合、約0.13mgのC末端側にHis-タグが付加した精製タンパク質が1
00mlの培養物から得られた。
限外濾過により緩衝液を交換するとともに、タグのない精製タンパク質及びC末端側にH
isタグを有する精製タンパク質を濃縮し、等容量のグリセロールを添加した。各溶液を-2
0℃で保存したところ、少なくとも数か月間、触媒活性の低下は全くなかった。
isタグを有する精製タンパク質を濃縮し、等容量のグリセロールを添加した。各溶液を-2
0℃で保存したところ、少なくとも数か月間、触媒活性の低下は全くなかった。
N末端側にタグが付加した成熟3CLプロテアーゼをエンテロキナーゼ消化する間にSR1オ
リゴペプチドが効率的に切断されたことから、本発明者は3CLプロテアーゼ変異体がエン
テロキナーゼの非存在下で成熟3CLプロテアーゼを切断しうる否かを検討した。精製した3
CL-R188IプロテアーゼとC末端側にHis-タグが付加した成熟3CLプロテアーゼとの室温での
インキュベーションによって3CLプロテアーゼ由来の分解産物が確かに得られた（図4B、
レーン4）。なお、精製3CL-R188I試料にはエンテロキナーゼの基質でコンタミネーション
の指標に用いられるCleavege Conttol Protein（ノバゲン）を切断する活性は認められな
かった。これらの結果は、成熟プロテアーゼは自己タンパク質分解を受けるという可能性
を示唆している。
リゴペプチドが効率的に切断されたことから、本発明者は3CLプロテアーゼ変異体がエン
テロキナーゼの非存在下で成熟3CLプロテアーゼを切断しうる否かを検討した。精製した3
CL-R188IプロテアーゼとC末端側にHis-タグが付加した成熟3CLプロテアーゼとの室温での
インキュベーションによって3CLプロテアーゼ由来の分解産物が確かに得られた（図4B、
レーン4）。なお、精製3CL-R188I試料にはエンテロキナーゼの基質でコンタミネーション
の指標に用いられるCleavege Conttol Protein（ノバゲン）を切断する活性は認められな
かった。これらの結果は、成熟プロテアーゼは自己タンパク質分解を受けるという可能性
を示唆している。
２．４．3CL-R188Iプロテアーゼの速度論的特性
3つの異なる基質(SO1、SO3、SR1)を用い、タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼ及びC
末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼの触媒活性について検討した。その
速度論的データを表1にまとめる。タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼは、SO1
の消化を最も効率的に触媒した(Km=33.8μM、kcat=4753 s-1)。SO1基質におけるkcat/Km
と比較した場合、SO3およびSR1基質における相対効率はそれぞれ0.06および0.01であった
。C末端側にHis-タグを有する3CL-R188Iのkcat/Km値は、kcat値が顕著な低下を示すこと
からタグが付加していない酵素の0.03倍である。一方、Km値における有意差は2種類のタ
ンパク質間で全く認められなかった。この結果は、残基数個をC末端に付加すると3CLプロ
テアーゼの触媒効率が影響を受けることを示している。
3つの異なる基質(SO1、SO3、SR1)を用い、タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼ及びC
末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼの触媒活性について検討した。その
速度論的データを表1にまとめる。タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼは、SO1
の消化を最も効率的に触媒した(Km=33.8μM、kcat=4753 s-1)。SO1基質におけるkcat/Km
と比較した場合、SO3およびSR1基質における相対効率はそれぞれ0.06および0.01であった
。C末端側にHis-タグを有する3CL-R188Iのkcat/Km値は、kcat値が顕著な低下を示すこと
からタグが付加していない酵素の0.03倍である。一方、Km値における有意差は2種類のタ
ンパク質間で全く認められなかった。この結果は、残基数個をC末端に付加すると3CLプロ
テアーゼの触媒効率が影響を受けることを示している。
２．５．阻害活性
タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼを用い、E-64および新規に合成した基質をベー
スとするアルデヒド型阻害物質の阻害効果を解析した。1.6mM E-64の存在下であっても、
3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の分解は全く低下しなかった。それに対し、1.6mM
のAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（合成ペプチドアルデヒド1とも言う）は3
CL-R188Iの活性をほぼ完全に阻害した。用量-応答曲線(図6)から、合成ペプチドアルデヒ
ド1のIC50値が155μMであることが分かった。また、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（それぞれ、合成ペプチドアルデヒド2〜4とも言う）も3CL-R
188Iの活性を阻害する作用があることが分かった。図7の用量-応答曲線から、合成ペプチ
ドアルデヒド2のIC50値が26μMであることが分かった。また、図8の用量-応答曲線から、
合成ペプチドアルデヒド3のIC50値が〜6mMであることが分かった。さらに、図9の用量-応
答曲線から、合成ペプチドアルデヒド4のIC50値が37μMであることが分かった。これらの
結果を、下記表2にまとめる。
タグのない精製3CL-R188Iプロテアーゼを用い、E-64および新規に合成した基質をベー
スとするアルデヒド型阻害物質の阻害効果を解析した。1.6mM E-64の存在下であっても、
3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の分解は全く低下しなかった。それに対し、1.6mM
のAc-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（合成ペプチドアルデヒド1とも言う）は3
CL-R188Iの活性をほぼ完全に阻害した。用量-応答曲線(図6)から、合成ペプチドアルデヒ
ド1のIC50値が155μMであることが分かった。また、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-
NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO（それぞれ、合成ペプチドアルデヒド2〜4とも言う）も3CL-R
188Iの活性を阻害する作用があることが分かった。図7の用量-応答曲線から、合成ペプチ
ドアルデヒド2のIC50値が26μMであることが分かった。また、図8の用量-応答曲線から、
合成ペプチドアルデヒド3のIC50値が〜6mMであることが分かった。さらに、図9の用量-応
答曲線から、合成ペプチドアルデヒド4のIC50値が37μMであることが分かった。これらの
結果を、下記表2にまとめる。
尚、図６〜９中、横軸は、阻害物質（合成ペプチドアルデヒド）の濃度であり、縦軸は
阻害（％）である。縦軸の阻害（％）は、各濃度の阻害剤が存在する条件下でプロテアー
ゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害剤が存在していない条件下でプロテア
ーゼが基質を切断する量を100とする切断率を出し、これを100から引いて阻害率としたも
のである。
阻害（％）である。縦軸の阻害（％）は、各濃度の阻害剤が存在する条件下でプロテアー
ゼにより基質が切断される量をHPLCで定量し、阻害剤が存在していない条件下でプロテア
ーゼが基質を切断する量を100とする切断率を出し、これを100から引いて阻害率としたも
のである。
３．考察
これまで成熟SARS CoV 3CLプロテアーゼタンパク質は大腸菌で発現することができ、そ
の結晶構造も解析されていたが、今回、成熟3CLプロテアーゼがタンパク質分解による分
解を受けやすいことが見いだされた。
エンテロキナーゼは本来の切断部位（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）のLys以外の塩基性残基で
タンパク質を切断することが報告されているが、エンテロキナーゼが3CLプロテアーゼを
分解することが明らかとなった(Collins-Racie, L.A. et al. (1995) Production of rec
ombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the nov
el secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13, 982-987.)。
これまで成熟SARS CoV 3CLプロテアーゼタンパク質は大腸菌で発現することができ、そ
の結晶構造も解析されていたが、今回、成熟3CLプロテアーゼがタンパク質分解による分
解を受けやすいことが見いだされた。
エンテロキナーゼは本来の切断部位（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）のLys以外の塩基性残基で
タンパク質を切断することが報告されているが、エンテロキナーゼが3CLプロテアーゼを
分解することが明らかとなった(Collins-Racie, L.A. et al. (1995) Production of rec
ombinant bovine enterokinase catalytic subunit in Escherichia coli using the nov
el secretory fusion partner DsbA. Biotechnology 13, 982-987.)。
しかし、本発明者は以下の結果から3CLプロテアーゼは自己分解すると考えた：(a) N末
側にMBP-His-Flagタグを有する触媒活性を示さない3CLプロテアーゼを大腸菌で発現させ
ると3CLプロテアーゼが抽出液中に多量に得られたが、C末側にHisタグを有する活性を持
つ3CLプロテアーゼを発現させると3CLプロテアーゼが抽出液中にわずかしか存在しなかっ
た；(b) N末側にタグを有する精製野生型3CLプロテアーゼをエンテロキナーゼ処理すると
SO1およびSR1オリゴペプチドを切断する活性が認められたが、エンテロキナーゼ単独では
同一条件下で3種類のオリゴペプチド基質を切断しなかった；(C) C末側にHisタグを有す
る野生型3CLプロテアーゼが精製3CL-R188Iプロテアーゼにより分解された。
側にMBP-His-Flagタグを有する触媒活性を示さない3CLプロテアーゼを大腸菌で発現させ
ると3CLプロテアーゼが抽出液中に多量に得られたが、C末側にHisタグを有する活性を持
つ3CLプロテアーゼを発現させると3CLプロテアーゼが抽出液中にわずかしか存在しなかっ
た；(b) N末側にタグを有する精製野生型3CLプロテアーゼをエンテロキナーゼ処理すると
SO1およびSR1オリゴペプチドを切断する活性が認められたが、エンテロキナーゼ単独では
同一条件下で3種類のオリゴペプチド基質を切断しなかった；(C) C末側にHisタグを有す
る野生型3CLプロテアーゼが精製3CL-R188Iプロテアーゼにより分解された。
分解産物断片のアミノ酸配列決定を行うことにより、成熟3CLプロテアーゼが188Arg/18
9Gln部位で切断されることが見いだされた。同部位は、成熟3CLプロテアーゼのキモトリ
プシン様触媒ドメイン(1-184)とC末端α-ヘリックスドメイン(201-303)とをつなぐ長いル
ープ領域(残基185-200)内に存在する(図1)。成熟3CLプロテアーゼのホモ二量体構造では
、α-ヘリックスドメインは一方の単量体のアミノ末端を他方の単量体の活性部位と相互
作用しうる位置に方向づける役割を担うと想定されている(Yang, H. et al. (2003) The
crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease and
its complex with an inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.)
。また、N末端側の触媒領域のみの発現では、発現したタンパク質の触媒効率が低下する
ことも報告されている(Bacha, U. et al. (2004) Identification of Novel Inhibitors
of the SARS Coronavirus Main Protease 3CLpro. Biochemistry 43, 4906-4912.)。これ
らの知見は、188Arg/189Gln部位でのタンパク質分解によって成熟3CLプロテアーゼの触媒
効率が速やかに低下するという本発明者の知見と一致する。成熟プロテアーゼにおける発
現の間での自己タンパク質分解による分解がHIV-1およびHTLV-1プロテアーゼなどのアス
パラギン酸プロテアーゼにおいて報告されており(Rose, J. R. et al. (1993) Regulatio
n of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid
substitutions. J. Biol. Chem. 268, 11939-11945.；Laco, G. S. et al. (1997) Mole
cular analysis of the feline immunodeficiency virus protease: generation of a no
vel form of the protease by autoproteolysis and construction of cleavage-resitan
t proteases. J. Viol. 71, 5505-5511.；Louis, J. M. et al. (1999) Stabilization f
rom Autoproteolysis and Kinetic Characterization of the Human T-cell Leukemia Vi
rus Type 1 Proteinase. J. Biol. Chem. 274, 6660-6666.)、これらはプロテアーゼの速
やかな分解がウイルスプロテアーゼにおいてあり得ることを示唆している。
9Gln部位で切断されることが見いだされた。同部位は、成熟3CLプロテアーゼのキモトリ
プシン様触媒ドメイン(1-184)とC末端α-ヘリックスドメイン(201-303)とをつなぐ長いル
ープ領域(残基185-200)内に存在する(図1)。成熟3CLプロテアーゼのホモ二量体構造では
、α-ヘリックスドメインは一方の単量体のアミノ末端を他方の単量体の活性部位と相互
作用しうる位置に方向づける役割を担うと想定されている(Yang, H. et al. (2003) The
crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease and
its complex with an inhibitor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13190-13195.)
。また、N末端側の触媒領域のみの発現では、発現したタンパク質の触媒効率が低下する
ことも報告されている(Bacha, U. et al. (2004) Identification of Novel Inhibitors
of the SARS Coronavirus Main Protease 3CLpro. Biochemistry 43, 4906-4912.)。これ
らの知見は、188Arg/189Gln部位でのタンパク質分解によって成熟3CLプロテアーゼの触媒
効率が速やかに低下するという本発明者の知見と一致する。成熟プロテアーゼにおける発
現の間での自己タンパク質分解による分解がHIV-1およびHTLV-1プロテアーゼなどのアス
パラギン酸プロテアーゼにおいて報告されており(Rose, J. R. et al. (1993) Regulatio
n of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid
substitutions. J. Biol. Chem. 268, 11939-11945.；Laco, G. S. et al. (1997) Mole
cular analysis of the feline immunodeficiency virus protease: generation of a no
vel form of the protease by autoproteolysis and construction of cleavage-resitan
t proteases. J. Viol. 71, 5505-5511.；Louis, J. M. et al. (1999) Stabilization f
rom Autoproteolysis and Kinetic Characterization of the Human T-cell Leukemia Vi
rus Type 1 Proteinase. J. Biol. Chem. 274, 6660-6666.)、これらはプロテアーゼの速
やかな分解がウイルスプロテアーゼにおいてあり得ることを示唆している。
3CLプロテアーゼのタンパク質分解を抑制するため、本発明者は成熟3CLプロテアーゼの
第188番目の位置でArg残基を置換した。適切な置換残基としてIleを選択してイオン性グ
アニジン基を除去した。この変異により、本発明者は、タグのない精製3CL-R188Iプロテ
アーゼとC末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼを容易に得ることができ
た。
第188番目の位置でArg残基を置換した。適切な置換残基としてIleを選択してイオン性グ
アニジン基を除去した。この変異により、本発明者は、タグのない精製3CL-R188Iプロテ
アーゼとC末端側にHisタグを有する精製3CL-R188Iプロテアーゼを容易に得ることができ
た。
ついで、3つの異なる基質であるSO1、SO3およびSR1基質を用い、R188I 3CLプロテアー
ゼ変異体の触媒活性について検討した。P1/P2切断部位を有するSO1基質は、3CLプロテア
ーゼのN末端側の自己切断部位であり、3CLプロテアーゼにとって最適な基質であることが
報告されている(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purification, and Substrate S
pecificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 3C-like Proteinase.
J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。SO3基質は3CLプロテアーゼのP3/P4切断部位を有する
ウンデカペプチドである。SR1基質は今回新規に見いだされたタンパク質分解部位(188Arg
/189Gln)を有するヘキサデカペプチドである。タグのない成熟3CL-R188Iプロテアーゼの
触媒能がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼと比べて極めて高く、それが特
にkcat値で顕著であり、成熟3CLプロテアーゼでは12.2/分、3CL-R188Iでは4753/秒である
ことが見いだされた。HisタグをC末端側に付加した3CL-R188Iプロテアーゼ変異体では、
触媒活性が3CL-R188Iプロテアーゼの3%にまで低下した。これらの結果は、成熟3CLプロテ
アーゼのNおよびC末端側での付加的配列により、数個の残基付加によっても触媒活性が顕
著な影響を受けることを示唆している(Hsu, M. -F. et al. (2005) Mechanism of the Ma
turation Process of SARS-CoV 3CL Protease. J. Biol. Chem. 280, 31257-31266.)。
ゼ変異体の触媒活性について検討した。P1/P2切断部位を有するSO1基質は、3CLプロテア
ーゼのN末端側の自己切断部位であり、3CLプロテアーゼにとって最適な基質であることが
報告されている(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purification, and Substrate S
pecificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 3C-like Proteinase.
J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。SO3基質は3CLプロテアーゼのP3/P4切断部位を有する
ウンデカペプチドである。SR1基質は今回新規に見いだされたタンパク質分解部位(188Arg
/189Gln)を有するヘキサデカペプチドである。タグのない成熟3CL-R188Iプロテアーゼの
触媒能がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼと比べて極めて高く、それが特
にkcat値で顕著であり、成熟3CLプロテアーゼでは12.2/分、3CL-R188Iでは4753/秒である
ことが見いだされた。HisタグをC末端側に付加した3CL-R188Iプロテアーゼ変異体では、
触媒活性が3CL-R188Iプロテアーゼの3%にまで低下した。これらの結果は、成熟3CLプロテ
アーゼのNおよびC末端側での付加的配列により、数個の残基付加によっても触媒活性が顕
著な影響を受けることを示唆している(Hsu, M. -F. et al. (2005) Mechanism of the Ma
turation Process of SARS-CoV 3CL Protease. J. Biol. Chem. 280, 31257-31266.)。
タグが付加していない3CL-R188IプロテアーゼのSO3基質とSO1基質に対する相対効率（S
O3/SO1比）がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼに対して報告されたものと
正確に同一であったことは注目される(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purificat
ion, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。一方、SR1基質に対する触媒の
相対効率は、成熟3CLプロテアーゼの11の切断部位のひとつであるP5/P6部位での切断に対
して報告されたものとほぼ同一であった(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purific
ation, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviru
s 3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。これらのデータは、成熟3CL
プロテアーゼがArg188/Gln189部位でSARS CoVのポリタンパク質前駆体を本来の切断部位
の場合とほぼ等しい効率で消化しうることを示唆している。したがって、成熟3CLプロテ
アーゼと大きさが等しいプロテアーゼ変異体を応用することがSARS CoV 3CLプロテアーゼ
に対して有効な阻害物質をスクリーニングするのに有効であると考えられる。
O3/SO1比）がC末端側にHisタグを有する成熟3CLプロテアーゼに対して報告されたものと
正確に同一であったことは注目される(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purificat
ion, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。一方、SR1基質に対する触媒の
相対効率は、成熟3CLプロテアーゼの11の切断部位のひとつであるP5/P6部位での切断に対
して報告されたものとほぼ同一であった(Fan, K. et al. (2004) Biosynthesis, Purific
ation, and Substrate Specificity of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronaviru
s 3C-like Proteinase. J. Biol. Chem. 279, 1637-1642.)。これらのデータは、成熟3CL
プロテアーゼがArg188/Gln189部位でSARS CoVのポリタンパク質前駆体を本来の切断部位
の場合とほぼ等しい効率で消化しうることを示唆している。したがって、成熟3CLプロテ
アーゼと大きさが等しいプロテアーゼ変異体を応用することがSARS CoV 3CLプロテアーゼ
に対して有効な阻害物質をスクリーニングするのに有効であると考えられる。
タグが付加していない3CL-R188Iプロテアーゼを用いたに関するスクリーニングにおい
て、基質をベースとするアルデヒド型阻害物質(Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-
CHO)はSO1基質の消化を中程度に阻害した。これまで報告された様々な阻害物質と比較す
ると活性は高くなかったが(IC50=155μM)、3CLプロテアーゼについて先に報告された基質
をベースとする阻害物質の構造-活性の関係性に関する研究(Ghosh, A. K. et al. (2005)
Design and Synthesis of Peptidomimetic Severe Acute Respiratory Syndrome Chymot
rypsin-like Protease Inhibitors. J. Med. Chem. 48, 6767-6771.; Shie, J. -J. et a
l. (2005) Discovery of Potent Anilide Inhibitors against the Severe Acute Respir
atory Syndrome 3CL Protease.J. Med. Chem. 48, 4469-4473.; Chen, L. -R. et al. (2
005) Synthesis and evaluation of isatin derivatives as effective SARS coronaviru
s 3CL protease inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 3058-3062.; Shie, J. -J.
et al. (2005) Inhibition of the severe acute respiratory syndrome 3CL protease
by peptidomimetic α, β-unsaturated esters. Bioorg. Med. Chem. 13, 5240-5252.;
Jain, R. P. et al. (2004) Synthesis and Evaluation of Keto-Glutamine Analogues a
s Potent Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome 3CLpro. J. Med. Chem. 4
7, 6113-6116.)を参照することにより、阻害能を増強することができると予想される。
て、基質をベースとするアルデヒド型阻害物質(Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-
CHO)はSO1基質の消化を中程度に阻害した。これまで報告された様々な阻害物質と比較す
ると活性は高くなかったが(IC50=155μM)、3CLプロテアーゼについて先に報告された基質
をベースとする阻害物質の構造-活性の関係性に関する研究(Ghosh, A. K. et al. (2005)
Design and Synthesis of Peptidomimetic Severe Acute Respiratory Syndrome Chymot
rypsin-like Protease Inhibitors. J. Med. Chem. 48, 6767-6771.; Shie, J. -J. et a
l. (2005) Discovery of Potent Anilide Inhibitors against the Severe Acute Respir
atory Syndrome 3CL Protease.J. Med. Chem. 48, 4469-4473.; Chen, L. -R. et al. (2
005) Synthesis and evaluation of isatin derivatives as effective SARS coronaviru
s 3CL protease inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 3058-3062.; Shie, J. -J.
et al. (2005) Inhibition of the severe acute respiratory syndrome 3CL protease
by peptidomimetic α, β-unsaturated esters. Bioorg. Med. Chem. 13, 5240-5252.;
Jain, R. P. et al. (2004) Synthesis and Evaluation of Keto-Glutamine Analogues a
s Potent Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome 3CLpro. J. Med. Chem. 4
7, 6113-6116.)を参照することにより、阻害能を増強することができると予想される。
また、本実施例において、Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-V
al-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)
-CHOも3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の消化を阻害することが分かった。これらの
阻害物質(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOおよびAc-Ser-Ala-Val-Le
u-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO)は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害するので、SA
RSの治療のために使用し得る。
al-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびAc-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)
-CHOも3CL-R188IプロテアーゼによるSO1基質の消化を阻害することが分かった。これらの
阻害物質(Ac-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Val-Leu-NHCH(CH2CH
2CON(CH3)2)-CHO、Ac-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOおよびAc-Ser-Ala-Val-Le
u-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO)は、SARS 3CLプロテアーゼの触媒活性を阻害するので、SA
RSの治療のために使用し得る。
Claims (2)
- CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその塩を含む、SARS 3CLプロテアーゼ阻害剤。
- CH3CO-Thr-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、CH3CO-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHO、およびCH3CO-Ser-Ala-Val-Leu-NHCH(CH2CH2CON(CH3)2)-CHOからなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその塩を含む、SARS治療用医薬組成物。
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|---|---|---|---|---|
| US20060014821A1 (en) * | 2003-08-27 | 2006-01-19 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of SARS 3C like protease |
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- 2008-08-18 JP JP2008210118A patent/JP5353111B2/ja not_active Expired - Fee Related
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