CN1798838A - 一种蛋白酶的抑制剂蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物－酶相互作用位点的多肽序列。本发明还提供了一种已分离纯化的DNA序列，该DNA序列编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白；一种特征在于其中含有所述已分离纯化的DNA序列的表达载体；一种转化了所述表达载体的原核或真核宿主细胞；以及提供了一种制备嵌合抑制剂蛋白的方法。

Description

一种蛋白酶的抑制剂蛋白及其用途
技术领域
本发明是关于一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物一酶相互作用位点的多肽序列。
本发明的其它另外的目的是提供一种已分离纯化的DNA序列，该DNA序列编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白；提供一种特征在于其中包含所述已分离纯化DNA序列的表达载体；提供一种转化了所述表达载体的原核或真核宿主细胞；以及提供一种制备嵌合抑制剂蛋白的方法。
背景技术
在活有机体表达的所有蛋白中，蛋白酶是其中调节细胞生死代谢途径的最关键蛋白。事实上，蛋白酶和底物最初的相互作用和随后的裂解，都以包括血栓形成、血凝固作用和细胞凋亡在内的广泛而重要的生物现象为基础。
调节异常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡可能是与蛋白酶有关的多种疾病(诸如癌症、自身免疫性疾病、炎症和感染性疾病)病理的关键因素。基于这样的猜想，对调节异常的蛋白酶解，或蛋白酶和抗蛋白酶的失衡进行了集中研究。在癌症和炎症疾病(例如风湿性关节炎和肺气肿)模型中对抗蛋白酶解药剂进行的不同研究也均表明，加强抗蛋白酶解的治疗和蛋白酶及抗蛋白酶的平衡作用，结果可以得到引人注意的改善。
例如在美国人最常被诊断出的癌症前列腺癌中，一般认为蛋白酶在包括肿瘤迅速增殖、侵入和转移等肿瘤细胞的恶性表现中起重要作用。
人类腺激肽释放酶(hK2)蛋白是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，主要在前列腺上皮中表达。最早从人精浆里分离的hK2目前已经成为前列腺癌的诊断标志(Deperthes等人，1995″Isolation of prostatic kallikrein hK2，alsoknown as hGK-1，in human seminal plasma″Biochim Biophys Acta，1245，311-6)。
除作为诊断标志外，hK2的蛋白酶解活性表明hK2在癌症进程中起作用。现已提出该酶的几个潜在功能，包括：尿激酶型血纤蛋白溶酶原激活物的活化作用和血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂-1的灭活作用、前体前列腺特异抗原(pro-PSA)的活化作用、纤连蛋白的降解作用和胰岛素样生长因子结合蛋白的降解作用(IGF-BP)(详见Cloutier等人，2004″Development ofrecombinant inhibitors specific to human kallikrein 2 using phase-displayselected substrates″Eur J Biochem 3，607-13)。
近来研究表明，在癌症特别是前列腺癌中，激肽释放酶hK2能与已知为蛋白酶抑制剂-6(PI-6)的蛋白酶抑制剂形成特异性复合体。基于对所述特异性复合体的发现，US 6284873和US 6472143提供了一种用于检测是否存在癌症或者有无组织坏死诊断方法。
考虑到hK2的前列腺组织特异性表达和在癌症发展过程中其所有潜在底物的参与，也可以将hK2作为潜在的治疗靶标(Darson等人，1997″Humanglandular kallikrein 2(hK2)expression in prostatic intraepithelial neoplasia andadenocarcinoma：a novel prostate cancer marker″Urology 49，857-62)。因此，开发特异性长效蛋白酶抑制剂，特别是激肽释放酶抑制剂会非常有用。
所述蛋白酶抑制剂可以选自丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)家族，该家族很大，是涉及调节复合体生理过程的蛋白质家族。所述蛋白的分子量在45千道尔顿左右，可以分成两组：一组有抑制作用，另一组没有抑制作用。
丝氨酸蛋白酶抑制剂包括暴露的柔性反应位点环结构，或丝氨酸蛋白酶抑制剂反应环结构(RSL)，所述环结构涉及与推定的靶蛋白酶之间的相互作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂与所述靶蛋白酶结合，所述RSL的P1-P′1易裂键(P1-P′1scissile bond)断裂之后，形成一种新的共价络合物(Huntington等人，2000″Structure of a serpin-protease complex shows inhibition bydeformation″Nature 407，923-6)。所述络合物的形成诱发主要构象重排，并因此不可逆地捕获所述靶蛋白酶。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制特异性主要归结于P1-P′1位点残基的属性和所述RSL的长度。改变RSL结构域或丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应位点可以作为一种途径，用于推定丝氨酸蛋白酶抑制剂与靶蛋白酶之间的抑制过程，并用于开发特异性的抑制剂(Dufour等人，2001″The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha1-antitrypsin to its reaction with furin″J Biol Chem 276，38971-9和Plotnick等人，2002″The effects of reactive site location on the inhibitory properties of theserpin alpha(1)-antichymotrypsin″J Biol Claem 277，29927-35)。
几种丝氨酸蛋白酶抑制剂如蛋白C抑制剂、α2抗纤溶酶、抗凝血酶-III、α1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、或蛋白酶抑制剂6，已经被鉴定为hK2的抑制剂(Saedi等人，2001″Human kallikrein 2(hK2)，but not prostate-specific antigen(PSA)，rapidly complexes with protease inhibitor 6(PI-6)released from prostatecarcinoma cells″Int J Cancer 94，558-63)。hK2和ACT之间形成络合物的速度相对较慢，主要归因于所述RSL的P1-P′1位点上的亮氨酸358-丝氨酸359(Leu 358-Ser 359)残基，和不利于所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的肽键。
迄今为止，只公开了一些新的对血浆激肽释放酶特异性抑制的激肽释放酶抑制剂优选物及其在治疗和诊断方法中的应用(专利US 6057287、US6333402、US 5994125和US 5795865)。然而这些专利所描述的抑制剂制品与牛胰胰蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域同源，尤其是与脂蛋白相关的促凝剂抑制物(LACI)的Kunitz结构域同源。所述Kunitz结构域特异性抑制血浆激肽释放酶。
除了对血浆激肽释放酶有特异性外，这些抑制剂分子非常小，并以一种可逆的方式与血浆激肽释放酶结合。上述方法的主要缺点之一是，应用上述蛋白以可逆的方式抑制靶蛋白酶有一定风险，即所述靶蛋白酶经解络作用而恢复其活性。
因此如这里所述，应用较大分子抑制剂的一个优点是形成以不可逆的方式抑制蛋白酶靶标的共价络合物。本发明的更大优点是：众所周知，所述大型共价络合物能从循环中被快速消除。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种对所述蛋白酶具有高度特异性的蛋白酶抑制剂蛋白及其在药用组合物中的应用。所述抑制剂蛋白是一种嵌合体，该嵌合体包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点的多肽序列。
本发明的另一个目的是提供一种已分离纯化的DNA序列，该DNA序列编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白；提供一种特征在于其中包含所述已分离纯化DNA序列的表达载体；以及提供一种转化了所述表达载体的原核或真核宿主细胞。
本发明的再一个目的是提供一种制备蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)选择对对蛋白酶的底物-酶特异相互作用位点进行编码的多核苷酸序列；
b)将多核苷酸序列引入编码丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制剂蛋白的序列中，由此得到嵌合序列；
c)使所述嵌合序列在适合的条件下在细胞表达系统中表达；以及
d)复性蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白。
附图说明
图1显示还原条件下纯化重组体ACT的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，泳道1为变体6.1，泳道2为野生型ACT；
图2显示ACT野生型重组体(rACTWT)及其变体对hK2抑制作用的化学计量(SI)；通过用线性回归分析法外推I/E(抑制剂/hK2)的比率(即x轴的截距)，测定所述SI；
图3中，A和B表示hK2与重组体抑制剂形成络合物；箭头标明hK2(E)，抑制剂(I)及hK2-ACT络合物(E-1)；
图4中，A和B表示ACT野生型重组体(rACTwT)及其变体在准一级条件下对hK2抑制作用；准一级条件下，使用进程曲线方法测量hK2和重组丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的相互作用；
图5表示通过SDS-PAGE分析法在还原条件下测定实施例1和实施例2中开发的抑制剂的纯度；
图6中，A显示重组体ACT与人激肽释放酶(hK2)之间的抑制反应的蛋白质印迹分析；B显示重组体ACT与前列腺特异性抗原(PSA)之间的抑制反应的蛋白质印迹分析；
图7A表示MD820的DNA及蛋白质序列；
图7B表示MD62的DNA及蛋白质序列；
图7C表示MD83的DNA及蛋白质序列；
图7D表示MD67的DNA及蛋白质序列；
图7E表示MD61的DNA及蛋白质序列；
图7F表示MD518的DNA及蛋白质序列；
图7G表示MDCI的DNA及蛋白质序列；
图8表示ACT和MD抑制剂的RSL序列比较；其中常规字体的残基是野生型ACT(ACTWT)共有的，黑体和下划线标注的残基对应ACT变体在所述RSL上的突变；丝氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的断裂位点用星号(*)标注在P1-P′1残基之间；
图9表示pQE9表达载体图谱；
图10A显示MD62对肿瘤生长的抑制作用；将由人激肽释放酶2转染的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)，植入裸鼠体内，然后用MD62治疗(5或25微克/注射剂)；
图10B显示MD67对肿瘤生长的抑制作用；将由人激肽释放酶2转染的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)，植入裸鼠体内，然后用MD67治疗(5或25微克/注射剂)；
图11显示MDCI对肿瘤生长的抑制作用；将由人激肽释放酶2转染的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)，植入裸鼠体内，然后用MDCI治疗(5或50微克/注射剂)；
具体实施方式
本发明是关于一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该抑制剂蛋白包括起抑制作用的多肽序列，和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点的多肽序列。
所述嵌合抑制剂蛋白是指含有两种或两种以上多肽的蛋白。所述多肽来源不同，即所述多肽在自然界中不共存。
这里所用的术语“蛋白质”“多肽”“多肽的(polypeptidic)”“肽”和“肽的(peptidic)”可以互换，用以表示一系列通过相邻残基的α-氨基和羧基之间形成肽键而互相连接的氨基酸残基。
本发明所述的嵌合蛋白是蛋白酶的抑制剂，包括起抑制作用的多肽序列和至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点的多肽序列。所述底物-酶相互作用位点的多肽序列赋予抑制剂对某一特定蛋白酶表现高度选择性，该多肽序列根据所要抑制的蛋白酶进行选择。
典型的所述底物-酶相互作用位点的多肽序列可以是底物活性位点序列。所述“底物活性位点序列”是指底物的一段序列，该序列是蛋白酶优先识别的位点。蛋白酶对底物活性位点序列的识别可以导致底物的活化、钝化或降解。大多数情况下，这种高度亲合作用不仅包括对特异序列的识别，而且包括对该特异序列三维构象的识别。
本发明还包括底物活性位点序列的分子嵌合体。“分子嵌合体”指多核苷酸序列，该多核苷酸序列可以包含底物活性位点序列的功能部分，并且例如可以采用本领域技术人员公知的蛋白质化学技术得到。
本发明还考虑到了底物活性位点序列的特定组合、或其片段或亚组成部分。
所述“片段”是指与底物活性位点的相应序列在长度上至少共有40％的氨基酸的序列。所述序列只要显示出与其来源的天然序列相同的性质就可以采用。优选所述序列为与底物活性位点的相应序列在长度上共有氨基酸超过70％的序列；优选共有氨基酸超过80％的序列；更优选共有氨基酸超过90％的序列。
所述片段可以用本领域公知的各种方法和技术(例如化学合成)制备。
本发明还包括底物活性位点序列的变体。术语“变体”是指具有在一定程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽，即经过保守氨基酸取代而与天然序列不同的氨基酸序列；因此一个或多个氨基酸可被其它具有相同特性和构象作用的氨基酸取代。氨基酸序列变体包括天然氨基酸序列的氨基酸序列的特定位点的取代、缺失和/或插入。保守的氨基酸取代在这里定义为下列五组之一范围内的互换：
I、小分子脂肪族的非极性或弱极性的残基：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)
II、带正电的极性残基：组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)
III、带负电的极性残基及其酰胺残基：天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)
IV、大分子芳香族残基：苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)
V、大分子脂肪族非极性残基：甲硫氨酸(Met)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)
本发明的底物优选为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白，在此情况下底物活性位点序列可以是丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环序列本身、及该序列的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体。
所述“丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环”或“反应位点环”或RSL指在丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白上发现的暴露的柔性反应位点环，该环与推定的靶蛋白酶相互作用有关。按照惯例，从所述易裂键氨基端的残基开始，并向远离该键的方向延伸，将残基命名为P1、P2、P3等。所述易裂键之后的残基被称为P′1、P′2、P′3等。所述RSL通常包括6-12个氨基酸残基。
所述RSL序列可以选自包含SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列的序列、以及它们的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体。
所述RSL序列还可以选自如下列表1中所示的各种可能的序列。
                                       表1
                                 RSL中可以变化的位点
                                     在反应位点环中的位置
  P5   P4   P3   P2   P1   P’1   P’2   P’3   P’4
L IOOEAVTRSPOTIHTP   SKSVTTLRVPRSKDPELLSSRTSTQOMQTF   STPFVKOORLFADLTVGSAQEEPAOVLHVOLWMTSSHSR   RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRKK   TSSSSSSSSSSSSTTAAAAAAVVVVVMMMMMPPLFNNNDDQQI   ENLEIPSOATAPAPSSGAPPSQLAGDRSM DSMMEPPTSEEKARG VMYLL
对应于潜在的底物肽的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环(RSL)上的P4-P’3残基的氨基酸序列空格代表为得到hK2的底物特异性而无需修饰的位点。
通常所述蛋白酶选自含有激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)的组中。所述蛋白酶优选为人激肽释放酶，最优选的人激肽释放酶是hK2(也公知为hGK-1)。
hK2属于所述激肽释放酶基因家族，该家族包括15个成员，但是只有前列腺特异性抗原(PSA或hK3)和hK2被前列腺高水平表达。hK2潜在的生理作用之一是对射精后立即形成的包埋精子的凝胶(sperm-entrapping gel)起蛋白水解作用，特别是对精子凝素(Semenogelin)和纤连蛋白进行裂解。此外，体外实验证明通过IGF结合蛋白水解，hK2能提高胰岛素样生长因子(IGF)的促有丝分裂作用。体外实验也表明hK2激活尿激酶原，使激肽原(可能通过B2缓激肽受体存在EGF-受体交叉激活作用)产生缓激肽样物质，并使pro-PSA前体转变为活性形式。所述hK2的活性存在争议，争议倾向于hK2可能有利于前列腺癌细胞的细胞外基质蛋白降解和随之发生的前列腺癌细胞的脱附与转移。另外，hK2能通过释放促有丝分裂因子和激活生长受体，促进前列腺癌发展。
所要抑制的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的情况下，那么该蛋白酶选自含有组织蛋白酶(K、L和S亚型)、激素原硫醇蛋白酶和胱冬肽酶家族(Caspase)(Caspase-1、Caspase-3、Caspase-49和Caspase-8)的组中。
所述半胱氨酸蛋白酶是利用半胱氨酸残基催化活性的蛋白水解酶，可以分成至少30个蛋白家族。每一个家族所包含的蛋白，具有相似的氨基酸序列和进化保守序列模体(motif)，所述模体反映了所述家族成员相似的三维结构。
抑制剂嵌合蛋白中起抑制作用的多肽序列通常为丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶。
所述起抑制作用的多肽序列选自丝氨酸蛋白酶的情况下，那么所述起抑制作用的多肽序列优选为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白序列本身、该序列的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体。
所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白序列选自α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制剂(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相关蛋白前体(ATR)、α-2-血纤蛋白溶酶抑制剂(AAP)、人抗凝血酶-III前体(ATIII)、蛋白酶抑制剂10(PI10)、人胶原蛋白结合蛋白2前体(CBP2)、蛋白酶抑制剂7(P17)、亮氨酸丝氨酸(leuserpin)蛋白酶抑制剂2(HLS2)、人血浆蛋白酶Cl抑制剂(C1INH)、单核细胞/中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(M/NEI)、纤溶酶原激活物抑制剂-3(PAI3)、蛋白酶抑制剂4(PI4)、蛋白酶抑制剂5(PI5)、蛋白酶抑制剂12(PI12)、人内皮纤溶酶原激活物抑制剂-1前体(PAI-1)、人胎盘纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前体(PEDF)、蛋白酶抑制剂6(PI6)、蛋白酶抑制剂8(PI8)、蛋白酶抑制剂9(PI9)、人鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、人鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-结合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白和蛋白酶抑制剂14(PI14)及其片段、分子嵌合体、组合和/或变体的组中。
鉴于大多数所述丝氨酸蛋白酶抑制蛋白的名称各异，我们在表2内总结了它们的详细说明。
                                                            表2
丝氨酸蛋白酶抑制蛋白   编号   RSL序列
PI或ATT、AIAT_人α-1-抗胰岛素前体(α-1蛋白酶抑制剂)(α-1抗蛋白酶) sp|P01009| GTEAAGAMFLEAIPMSIPPE
PIL或ATR、AIAU_人α-1-抗胰岛素相关蛋白前体   sp|P20848|   GTEATGAPHLEEKAWSKYQT
PLI或AAP、A2AP_人α-2-抗血纤维蛋白溶酶前体(α-2-抗血纤维蛋白溶酶抑制剂)(α-2-PI)(α-2-AP) sp|P08697| GVEAAAATSIAMSRMSLSSF
AACT、AACT_人α-1-抗胰凝乳蛋白酶前体(ACT)   sp|P01011|   GTEASAATAVKITLLSALVE
AT3、ANT3_人凝血酶-前体III前体(ATIII)   sp|P01008|   GSEAAASTAVVIAGRSLNPN
PI10，BOMA_人BOMAPIN(蛋白酶抑制剂10)   sp|P48595|   GTEAAAGSGSEIDIRIRVPS
CBP2、CBP2_人胶原蛋白结合蛋白2前体(COLLIGIN2)   sp|P50454|   GNPFDQDIYGREELRSPKLF
PI7或PNI.GDN_人神经胶质NEXIN前体(GDN)(蛋白酶NEXIN1)(PNI)(蛋白酶抑制剂7) sp|P07093| GTKASAATTAILIARSSPPW
HCF2，HEP2_人肝磷脂辅因子II前体(HC-II)(蛋白酶抑制剂LEUSERPIN2)(HLS2) sp|P05546| GTQATTVTTVGFMPLSTQVR
C1NH或C1IN，IC1_人血浆蛋白酶C1抑制剂前体(C1INH)   sp|P05155|   GVEAAAASAISVARTLLVFE
ELANH2或PI2，ILEU_人白细胞弹性蛋白酶抑制剂(LEI)(单核细胞/中性粒细胞弹性蛋白酶)(M/NEI)(EI) sp|P30740| GTEAAAATAGIATFCMLMPE
PCI或PLANH3或PROCI，IPSP_人血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂前体(PCI)(蛋白C抑制剂)(纤溶酶原激活物抑制剂-3)(PAI3) sp|P05154| GTRAAAATGTIFTFRSARLN
PI4或KST、KAIN_人激肽释放酶前体(激肽释放酶抑制剂)(蛋白酶抑制剂4) sp|P29622| GTEAAAATTFAIKFFSAQTN
PI5、MASP_人MADPIN前体(蛋白酶抑制剂5)   sp|P36952|   GGDSIEVPGARILQHKDELN
PI12、NEUS_人神经丝氨酸前体(蛋白酶抑制剂12)   sp|Q99574|   GSEAAAVSGMIAISRMAVLY
PAI1或PLANH1，sp|P05121|_人内皮血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1前体(PAI-1) sp|P05121| GTVASSSTAVIVSARMAPEE
PAI2或PLANH2，PAI2_人胎盘血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-2(PAI-2)(单核细胞ARG-丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白)(尿激酶抑制剂) sp|P05120| GTEAAAGTGGVMTGRTGHGG
PEDF，PEDF_人色素上皮衍生因子前体(PEDF)(EPC-1)   sp|P36955|   GAGTTPSPGLQPAHLTFPLD
PI6或PTI、PTI6_人胎盘凝血酶抑制剂(细胞质抗蛋白酶)(CAP)(蛋白酶抑制剂6) sP|P35237| GTEAAAATAAIMMMRCARFV
PI8、PTI8_人细胞质抗蛋白酶2(CAP2)(CAP-2)(蛋白酶抑制剂8)   sp|P50452|   GTEAAAATAVVRNSRCSRME
PI9，PTI9_人细胞质抗蛋白酶2(CAP3)(CAP-3)(蛋白酶抑制剂9)   sp|P50453|   GTEAAAASSCFVVAECCMES
SCCA1，SCC1_人鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)(蛋白T4-A)   sp|P29508|   GAEAAAATAVVGFGSSPAST
SCCA2，SCC2_人鳞状细胞癌抗原1(SCCA-2)(LEUPIN)   sp|P48594|   GVEAAAATAVVVVELSSPST
TBG、THBG_人甲状腺素结合球蛋白前体(T4-结合球蛋白)   sp|P05543|   GTEAAAVPEVELSDQPENTF
MEGSIN   gi|4505149|ref|NP_003775.1|   GTEATAATGSNIVEKQLPQS
PI14，pancpin，TSA2004   gi|3724282|dbj|BAA33766.1|   GSEAATSTGIHIPVIMSLAQ
根据本发明嵌合抑制剂蛋白的实施例，申请人意外地发现6种特异性抑制所述蛋白酶hK2的新嵌合抑制剂蛋白，所述新嵌合抑制剂蛋白如表3所示：
                      表3
  嵌合抑制剂   别名   SEQ ID N°(蛋白质)
  rACT8.20rACT6.2rACT8.3rACT6.7rACT6.1ACT5.18   MD820MD62MD83MD67MD61MD518   24681012
为了改变所述丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的特异性，可以通过修饰所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)的RSL得到所述嵌合抑制剂蛋白。众所周知，所述α1-抗胰凝乳蛋白酶(rACT)抑制一大组人类酶如胰凝乳蛋白酶、肥大细胞食糜酶、组织蛋白酶G、前列腺激肽释放酶hK2和PSA(hK3)。利用实施例1中详述的噬菌体展示技术选出的作为hK2酶的底物的所述肽序列已经用于取代所述易裂键及所述RSL的相邻氨基酸残基。重组抑制剂在细菌内制备，经亲合层析纯化。
野生型rACT对hK2的抑制很慢(12-16小时)；相比之下，被修饰了的rACTs在几分钟之内很快形成共价络合物。所述6种rACT变体中的3种以高缔合常数特异结合hK2(见表5和表6)。用过量的抑制剂([I]o/[E]o为100∶1)培养30分钟，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制；而rACT8.20抑制95％酶活性，rACT5.18抑制73％酶活性。在上述反应条件下，野生型rACT对hK2没有表现出抑制作用。在所有变体中，两种(rACT8.3和rACT5.18)只特异性抑制hK2，不抑制其它测试酶。另两种变体也抑制PK活性，rACT6.7抑制率为36％，rACT6.2抑制率为100％。野生型rACT和变体rACT8.20抑制两种胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Chtr和PSA活性；但是也能抑制PK和HNE活性。所有所述重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白都没有抑制hK1和uPA的活性。
此外，申请人还发现用编码蛋白C抑制剂的RSL的底物五肽序列取代野生型重组体ACT(rACTWT)所述RSL结构上的残基P3-P’3，得的嵌合抑制剂(MDCI)产物能抑制激肽释放酶hK2和hK3。
因此，所述蛋白酶嵌合抑制剂可以选自含有MD820、MD62、MD61、MD67和MDCI的组中。所述嵌合抑制剂优选为MD62或MD61。
众所周知，抑制作用的化学计量(SI)值高于1，通常可以认为具有丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白底物性质。在本方案中，初始米氏(Michaelis)络合物形成和所述RSL裂解之后，大多数所述络合物裂解成具有活性的酶，而裂解后的抑制剂明显失活。通过使抑制剂与蛋白酶的比达10∶1，即抑制剂过量，培养所述样品，申请人分析了无络合物形成和所述抑制剂裂解的ACT变体-hK2反应。上述接近或低于计算得出的所述被测ACT变体的SI值的条件通常利于丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白或丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白-蛋白酶络合物的蛋白水解(见表6)。申请人意外地观察到所述假说的矛盾之处，因为不管SI值如何高，始终未观察到hK2对变体ACT的降解作用。不能用上述理论限定，一种可能的解释是在测定SI的条件下，ACT没有降解。在体外形成共价ACTs-hK2络合物的速度很慢。这一点和我们观察到的结果吻合：25℃下培养30分钟后，未检测到野生型ACT对hK2的抑制作用(表5)，甚至在37℃下延长培育时间后，hK2只部分络合了野生型ACT(图3)。
申请人还评定了所述新抑制剂对其它蛋白酶的特异性。对所有蛋白酶的评定过程都在同样条件(模拟生理条件)下进行，以确保更好地解释进一步的体内应用。将噬菌体展示筛选出的底物hK2的RSL裂解位点，置换到野生型ACT中，使该野生型的ACT变成hK2的高灵敏抑制剂。此外，其中两种所述抑制剂表现出对hK2的反应唯一性，对进行研究的其它类似公知的生物靶底物如血浆激肽释放酶、hK1、PSA、尿激酶和人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)没有反应性。据申请人了解，本发明首次报道了开发hK2的特异性抑制剂。
令人感兴趣的是，rACT8.20(MD820)不仅抑制hK2，还抑制胰凝乳蛋白酶，并轻微地抑制血浆激肽释放酶和人弹性蛋白酶，表现出一种广泛的抑制作用特异性。
所述嵌合抑制剂蛋白的起抑制作用的序列还可以选自半胱氨酸蛋白酶，因为现有大量文献记载的实例充分证明，丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白对半胱氨酸蛋白酶也有抑制作用(Gettins P.G.W.，2002″Serpin structure，mechanism，and function″in Chem.Rev，102，4751-4803)。这些实例包括：丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白鳞癌细胞抗原对组织蛋白酶K、L及S的抑制作用；所述α-1抗胰凝乳蛋白酶对激肽原硫醇蛋白酶的抑制作用；病毒丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白crmA对胱冬肽酶家族成员的抑制作用，所述胱冬肽酶家族成员包括胱冬肽酶1(白细胞介素13转化酶)、胱冬肽酶3和胱冬肽酶8；人丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白PI19对胱冬肽酶1、胱冬肽酶4和胱冬肽酶8的抑制作用。
按照本发明，将重组技术应用于制备蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白时，优选采用编码所述多肽的核酸分子及其片段。
因此本发明还涉及一种分离和纯化了的DNA序列，该序列编码上述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白。
根据本发明“分离和纯化了的DNA序列”是指所述编码本发明蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的核酸分子，或能编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的核酸所处的状态。所述核酸不含或基本不含与之天然相关的材料如其它的多肽或者核酸，所述与之天然相关的材料可以在其自然环境或在通过在体内或体外实施的重组DNA技术进行制备(例如细胞培养)的环境中找到。
这里能用的DNA是任何多脱氧核苷酸，例如包括双链DNA、单链DNA、其中一条或者两条单链由两个或两个以上片段组成的双链DNA、其中一条或者两条单链含有连续的磷酸二酯主链的双链DNA、包含一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA、两条DNA链完全互补的双链DNA、两条DNA链只有部分互补的双链DNA、环状DNA、共价闭合DNA、线性DNA、共价交联DNA、cDNA、化学合成DNA、半合成DNA、生物合成DNA、天然分离出的DNA、酶解后的DNA、剪切后的DNA、标记过的DNA例如放射性标记的DNA和荧光染料标记的DNA、包含一个或多个非自然发生种的核苷酸的DNA。
编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的DNA序列本身或其片段可用标准的化学技术合成，例如磷酸三酯法或通过自动合成方法和PCR方法。
根据本发明所述分离纯化的编码嵌合抑制剂蛋白的DNA序列还可以通过酶技术生产。这样可以用在预先确定的核苷酸识别序列断裂核苷酸分子的限制酶，去从包含所述核苷酸序列的更长的核苷酸分子中分离该核苷酸序列。所述核苷酸序列如编码所述嵌合抑制剂蛋白的DNA(或RNA)，或其片段。
本发明还包括多核糖核苷酸(RNA)形式的核苷酸，例如包括单链RNA、双链RNA、其中一条或者两条单链由两个或两个以上片段组成的双链RNA、其中一条或者两条单链都含有连续的磷酸二酯主链的双链RNA、包含一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA、两条RNA链完全互补的双链RNA、两条RNA链只有部分互补的双链RNA、共价交联RNA、酶解后的RNA、mRNA、剪切后的RNA、化学合成RNA、半合成RNA、生物合成RNA、天然分离出的RNA、标记过的RNA例如放射性标记的RNA和荧光染料标记的RNA、包含一个或多个非自然发生种的核苷酸的RNA。
所述分离纯化的编码蛋白酶嵌合抑制剂的DNA序列优选选自含有SEQID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13的组中。
本发明还包括上述序列的变体，即通过保守核苷酸取代作用从所涉及序列变化而来的核苷酸序列。所述保守核苷酸取代作用指一个或多个核苷酸被其它同样性质的核苷酸取代。
而本发明还提供一种表达载体，该表达载体含有上述分离纯化的编码蛋白酶嵌合抑制剂蛋白的序列。本领域技术人员公知，表达载体的选择直接有赖于想要得到的功能性质，例如嵌合抑制剂蛋白表达和所要转化或转染的宿主细胞。
此外，表达载体还可以含有可以与所述分离纯化的DNA序列连接的启动子。这意味着连接后的分离纯化的编码本发明蛋白酶嵌合抑制剂蛋白的DNA序列，可以在适合的调控序列控制下允许表达，即插入的所述分离纯化的DNA序列得到转录和翻译。
在此使用的术语“启动子”指本领域公知的任何附加的调控序列如常用于多肽表达或可以包括附加的一个或多个单独的靶序列的启动子和/或增强子、聚腺苷酸化位点和剪接点，和任选的编码选择性标记的序列。可应用的启动子选自与宿主细胞相容的启动子，例如：从病毒的基因组中得到的启动子和从异源哺乳动物启动子中得到的启动子。所述病毒可以是多瘤病毒、腺病毒(如腺病毒2)、乳头状瘤病毒(牛乳头状瘤病毒)、鸟肉瘤病毒、细胞巨化病毒(如鼠或人细胞巨化病毒即时早期启动子)、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(如猿猴病毒40早期和晚期启动子)。所述异源哺乳动物启动子可以是如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子或热激启动子。
可以使用的增强子例如已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列，或真核细胞病毒中的增强子如所述猿猴病毒40(SV40)增强子、所述细胞巨化病毒早期启动子的增强子、多瘤病毒和腺病毒的增强子。
多种宿主/表达载体组合都可以应用于表达本发明所述的DNA序列。例如有用的表达载体可以包括：染色体片段、非染色体片段和合成的DNA序列片段。合适的载体包括SV40的衍生物和公知的细菌质粒如大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322和pMB9以及它们的衍生物；质粒如RP4；噬菌体DNA，如噬菌体X(phage X)众多的衍生物(如NM9899)和其它噬菌体(如M13和单链丝状噬菌体DNA)；酵母质粒如2μ质粒或其衍生物；用于真核细胞的载体如可用于昆虫和哺乳动物细胞中的载体；源于质粒和噬菌体DNA组合的载体如经修饰应用于噬菌体DNA的质粒或其它表达控制序列；及上述物质的类似物。
最优选的表达质粒是pQE-9。
本发明还提供一种被所述表达载体转化或转染的真核或原核宿主细胞。
术语“转染的细胞”或“转化的细胞”或“转染/转化的细胞”是指其中导入有胞外DNA并因此为所述胞外DNA提供场所的细胞。所述DNA被导入细胞中，因此所述核苷酸能作为染色体的一部分或者作为额外染色体组分被复制。
可以采用众所周知的方法将含有根据本发明的已分离纯化的DNA序列的表达载体转化或转染到合适的真核或原核细胞中，所述方法的选用通常取决于所用载体的类型。有关这些方法见于例如Maniatis等人，1982，MolecularCloning，A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory，以及商业上提供的方法。
在此公开的所述嵌合抑制剂蛋白优选在细胞表达系统里重组制备。
多种单细胞的宿主细胞可用于表达本发明所述的DNA序列。所述宿主包括公知的真核和原核宿主如大肠杆菌、假单胞菌、枯草杆菌、链霉菌等细菌菌株；真菌如酵母；动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴(African Green Mobkey)肾细胞(如COS1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(如Sf9)；以及人细胞和组织培养植入细胞。优选宿主细胞为细菌细胞，更优选大肠杆菌细胞。
本发明还关于含有所述嵌合抑制剂蛋白作为活性成分并选择性地含有一种或多种适合的药物载体的药物组合物。
除含有至少一种所述嵌合抑制剂蛋白，药物组合物还优选含有一种或多种适合的药物载体如赋形剂。载体和/或辅剂有助于将活性化合物制备成药用剂型。
可选用的载体、赋形剂或稳定剂以一定的剂量和浓度应用于受试者时必须无毒。所述载体、赋形剂或稳定剂包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸(citrate)及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲苯基氯化铵、氯化六甲铵、氯化苄烷铵、苯索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(约少于10个残基)多肽；蛋白质，如血清蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；食糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属络合物(如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如吐温(TWEEN)、PLURONICS、或聚乙二醇(PEG)。
药物组合物的剂型可以是全身系统型的，也可以是局部型的。比如，此类组合物的剂型可以是各种非肠道给药途径，如皮下、静脉内、皮内、肌肉、腹膜内、鼻内、透皮、口腔途径，或经过植入装置，还可以通过蠕动的给药方式。
所述含有上述嵌合抑制剂蛋白作为活性成分的药物组合物还可以加入或注入到生物可吸收基质中；所述基质的给药形式包括：基质悬浮体、凝胶或固相载体。此外，所述基质可以由生物高聚物组成。
可以制备出常释剂型。常释剂型的合适的例子包括含抗体的固态疏水聚合物半透性基质。所述基质的形态为成型粒子，如膜剂或微胶囊剂。常释剂型基质的例子包括聚酯、水凝胶(如聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯、或聚乙烯醇)、聚交酯(US 3773919)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸盐共聚物、非可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOT(TM)(包括乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林的可注射用微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
应用于体内给药的制剂必须无菌。此要求可以很容易地通过如无菌滤膜过滤达到。
很容易理解，本发明嵌合抑制剂蛋白的适当剂量取决于受试者的年龄、性别、健康状况和体重、以及受试者同时接受治疗的种类和预期效果的性质。
最适剂型取决于疾病、嵌合抑制剂蛋白、给药方式；可能包括片剂、胶囊、糖锭、牙膏、栓剂、吸入剂、液剂、膏剂和注射剂。
本发明还包括对所述嵌合抑制剂蛋白氨基酸的氨基酸修饰作用。所述氨基酸修饰作用用于将所述嵌合抑制剂蛋白交联到水不溶性基质、或所述其它大分子载体上，或提高所述嵌合抑制剂蛋白的溶解度、改善所述嵌合抑制剂蛋白的吸收、及所述嵌合抑制剂蛋白穿过血脑屏障的渗透性。这类修饰为本领域公知，可以选择性地消除或削弱任何所述蛋白可能存在的不良副作用及类似作用。
本发明优选的药物组合物含有作为活性成分的嵌合抑制剂蛋白；选择性的药物组合物可以含有分离纯化的编码所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的DNA序列作为活性成分。该药物组合物既可以含有单独的分离纯化的DNA序列以及含有所述分离纯化的DNA序列的表达载体，也可以含有事先转染了表达载体的所述宿主细胞。在含有事先转染了表达载体的所述宿主细胞时，为避免任何抗原性问题，宿主细胞优选从接受治疗的病人身上分离。这种基因和细胞治疗途径特别适用于需要反复给予药物组合物的病人，因为所述分离纯化的基因、表达载体或事先转染了表达载体宿主细胞能并入病人的细胞，从而内源产生所述蛋白。
本发明还提供了对哺乳动物体内与蛋白水解相关紊乱的治疗或预防方法，该方法包括给予所述哺乳动物上述药物组合物。
这里对哺乳动物体内与蛋白水解相关紊乱的治疗或预防方法，适用于hK2激肽释放酶活性有害的紊乱情况，包括诸如癌症、自身免疫紊乱、炎症紊乱如良性前列腺肥大，或传染性紊乱。
所述术语“癌症”指代或描述一种哺乳动物生理状况，其典型特征是无节制的细胞增殖。可以治愈的癌症例子包括但不仅限于前列腺癌、乳腺癌或转移瘤。
在优选的方法中，所述哺乳动物为人类，所述用于给药的嵌合抑制剂蛋白选自表3中所列的特异性抑制所述hK2蛋白酶的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白实例。
本发明的范围还包括上述药用组合物用于制备治疗或预防哺乳动物体内与蛋白水解相关紊乱的药剂的用途。所述紊乱hK2激肽释放酶活性有害的紊乱情况，包括诸如癌症、自身免疫紊乱、炎症紊乱如良性前列腺肥大，或传染性紊乱。
癌症的实例包括但不限于前列腺癌、乳腺癌或转移瘤。
一般情况下，本发明所述嵌合抑制剂蛋白以达预期目的量使用。用于治疗和预防紊乱时，所述嵌合抑制剂蛋白或其药物组合物以治疗有效量给药或涂敷。所述治疗有效量是指可以改善或防止被治疗主体的症状、或延长被治疗主体的存活时间的有效量。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本发明公开提供的细节。
对全身系统给药方式而言，可以根据体外试验初步估计治疗有效总量或剂量。例如，在动物模型中用公式计算出所要达到的循环浓度范围包括细胞培养测定的半数有效剂量(IC50)的剂量。上述信息可以应用于更精确地确定人体使用剂量。
应用本领域公知的技术，初始剂量也可以从体内试验数据中估算，例如动物模型。本领域普通技术人员能够很容易地根据动物试验数据对人体给药进行优化，并且理所当然地会参考被治疗主体本身、该主体的体重、该主体的紊乱严重程度、给药方式和处方医生的诊断。
本发明还包括制备蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)选择对对蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点进行编码的多核苷酸序列，
b)将所述多核苷酸序列引入编码丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制剂蛋白序列中，由此得到嵌合序列，
c)使所述嵌合序列在适合的条件下在细胞表达系统中表达，以及
d)复性蛋白酶的所述嵌合抑制剂蛋白。
选择编码对蛋白酶具有特异性的酶-底物相互作用位点的多核苷酸序列，可以由以下不同技术完成。例如，展示底物用蛋白酶选择，如鼠白血病逆转录病毒直接从活细胞上展示肽，这样可避免细菌表达(Buchholz等人，1998)或类似的方法：应用嵌合辛德比斯病毒(Sindbis virus)库，该库也可以应用于蛋白酶断裂位点的体内选择；应用转染了感兴趣的酶的哺乳动物细胞(Pacini等人，2000″In vivo selection of protease cleavage sites by usingchimeric Sindbis virus libraries″J Virol.74，22：10563-70)。
还可预见的是酵母系统，特异蛋白水解位点的基因检验(GASP)包括将随机底物融合在完整膜蛋白中，使所述膜酵母附带有底物；该膜酵母中，细胞质转录因子可以结合报告基因的启动子(Kang等人，2001″An improvedstrategy for a genetic assay for site-specific proteolysis″Mol.Cell.30；11(2)：263-6)。
近来出现了许多检测蛋白酶底物特异性的组合化学库。其中包括组合荧光底物库和位置扫描-合成组合库。
另外一种名为固定肽库的方法，通过测量液相的荧光强度来检测库中每个成员的相关底物特异性，并用Edman测序法鉴别所述易裂键(Hu等人，2002″Rapid determination of substrate specificity of clostridium histolyticumbeta-collagenase using an immobilized peptide library″J.Biol.Chem.8，277(10)：8366-71)。
如果用噬菌体展示技术测定蛋白酶底物特异性，会产生具有毫无遗漏的多样性的噬菌体-展示随机肽库，并经纯化蛋白酶筛选。此公知技术适于所述特异性的情况，目的在于建立噬菌体-展示随机肽库，该库包括氨基酸长度一定的所有可能的氨基酸序列组合。这样大型库通过在丝状噬菌体末端上展示随机序列而建立，并扩增后通过蛋白酶快速检验其特异性。
根据实施例1和2，申请人已经建立了五聚物库，该库包括1.8×108独立转化株，可以视为完整，因为理论上所有可能的3.2×106个随机五聚物序列都被展示出来了。噬菌体序列进一步证实了所述五聚物插入体的随机性。然后将展示有随机五肽的噬菌体融合到配体中去(6×His)并使之固定在亲合支持物上。所述支持物为Ni-NTA基质。用所述蛋白酶(在实施例1和2中所述蛋白酶是hK2)培养之后，表达灵敏底物的噬菌体从固相中释放出来。释放出来的噬菌体用于感染F+(F-positiv)细菌，可以检验出其滴度，并进行扩增。然后通过沉淀将所述噬菌体纯化，扩增然后固定在亲合支持物上进行下一轮的筛选。为了得到高特异性的多核苷酸序列，所述五肽的选择总共重复了8次。将最后一轮筛选出的噬菌体克隆涂布到培养皿上，每种噬菌体的DNA编码底物活性位点的区域都得到了扩增，通过所述酶裂解检验所述序列。
然后将编码底物活性位点的多核苷酸序列引入到编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列中，如引入到编码rACT的序列中，得到嵌合序列。所述rACT的RSL结构域中P1密码子上游18bp位置，事先引入了两个沉默限制位点Sac II和Mlu I；所述P1密码子下游18bp位置，分配所述筛选出的编码底物活性位点的多核苷酸序列的亚克隆。
重组嵌合抑制剂在适当的培养条件下，在例如大肠杆菌TG1菌株中产生。所述适当的培养条件取决于所要表达的所述重组嵌合抑制剂，可以包括在10-40℃培养10-30小时。
正如申请人在实施例1和实施例2中所示，令人惊讶的是16℃培养16小时可实现表达，并且得到rACT完全完整的变体产物。
最后，当重组嵌合抑制剂分泌出来时，可以在培养基中复性；当没有分泌出来时，可以从细胞表达系统中提取；然后用本领域公知技术如高效液相色谱、凝胶电泳、亲合层析、超滤、离子交换等进行纯化。本领域技术人员明显知道，用于纯化特定重组嵌合抑制剂的实际条件部分取决于下列因素如：静电荷、疏水性、亲水性等。
就亲合层析纯化而言，可以使用任何特异结合重组嵌合抑制剂或His标签的抗体。其它亲合性分子如Ni2+-氨三乙酸交联琼脂糖珠，和特异结合His标签的亲合性分子也包括在本发明范围内。
然后可以根据嵌合抑制剂蛋白抑制蛋白酶的活性来进一步得到检验。任何常规的方法如斯卡查德法(Scatchard method)(Scatclzard，1949 Ann NYAcadSci 51：660-669)都可完成该检验。斯卡查德法描述了一种经典的测量和分析蛋白之间结合的方法，该法要求相对纯净的蛋白和区分结合蛋白和未结合蛋白的能力。
另一种适合测量嵌合抑制剂蛋白与酶亲合性的方法是，测量所述嵌合抑制剂蛋白减缓酶作用的能力。取决于所述酶裂解底物的速度和发色或产生荧光底物的可用性，此法要求相对纯净的嵌合抑制剂蛋白。
本发明优选的所述嵌合抑制剂蛋白抑制所述蛋白酶活性，具有比它们的野生型对应体更高的亲合性。
这里公开的所述嵌合抑制剂蛋白优选在细胞表达系统里重组产生。所述表达系统可以是真核或者原核宿主细胞。
多种单细胞宿主细胞应用于表达本发明所述嵌合体抑制剂蛋白。所述宿主可以包括公知的真核和原核宿主，如细菌菌株大肠杆菌、大肠杆菌、假单胞菌、枯草杆菌、链霉菌等细菌菌株；真菌如酵母；动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(如COS1、COS7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(如Sf9)、以及人细胞和组织培养植入细胞。所述宿主细胞优选为选自分类属枯草杆菌、埃希氏菌、沙门氏菌和解糖肠球菌(Erwinia)的细菌细胞。细菌宿主细胞更优选为大肠杆菌细胞。
根据本发明，用含分离纯化的DNA序列的表达载体转化或转染合适的真核或原核宿主细胞，通常可以根据所选用载体的类型使用公知的方法予以实现。有关这些方法见于例如Maniatis等人，1982，Molecular Cloning，Alaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，以及商业上提供的方法。
本发明的另外一个目的是提供一种检测体内或体外样品中蛋白酶的诊断试剂盒，该试剂盒包括分离纯化的DNA序列。所述DNA序列选自SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQ IDN°11和SEQ ID N°13及它们的互补序列，以及它们的片段和/或它们的变体。
本发明还选择性地预见了一种检测样品中蛋白酶的诊断试剂盒，该试剂盒可以包括根据本发明的蛋白酶嵌合抑制剂蛋白。所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白可以是如选自MD820、MD62、MD61、MD67和MD CI。
上述术语“样品”指任何合适的标本，可以含有蛋白酶或编码蛋白酶的序列、或可以结合所述嵌合抑制剂蛋白或所述编码所述嵌合抑制剂蛋白的分离纯化的DNA序列。
所述诊断试剂盒可以包括能检测蛋白酶的系统，其中检测信号取决于蛋白的存在量。所述信号可以通过目测或仪器检测。可能的信号包括有色产物、荧光或发光产物、检验成分或产物的吸收或发射辐射性质变更、组成产物的沉淀或凝集。所述检验成分可以是标记，如放射性同位素、荧光团、酶、辅酶、酶的底物、电子密集化合物、可凝集离子。所述试剂盒中的所述检验成分可以结合嵌合抑制剂蛋白，或者结合分离纯化的DNA序列。
最后，本发明还公开提供了一种对哺乳动物体内与蛋白水解相关紊乱的治疗或预防方法，该方法包括给予所述哺乳动物服用含有重组野生型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白作为活性成分的药物组合物。
以上所述对哺乳动物体内与蛋白水解相关紊乱的治疗或预防方法，适用于hK2激肽释放酶活性有害的紊乱情况，包括诸如癌症、自身免疫紊乱、炎症紊乱如良性前列腺肥大或传染性紊乱。
通过参考以下实施例，可以对上述描述进行更全面的理解。然而这些实施例是实施本发明的典型方法，并不限制本发明的范围。
实施例1应用噬菌体展示筛选底物来开发特异抑制人hK2的重组ACT抑制剂
材料
按已有方法从人精液中纯化出hK2和hK3(PSA)(Frenette G，Gervais Y，Tremblay RR，Dube JY.1998″Contamination of purified prostate-specific antigenpreparations by kallikrein hK2″J Urol 159，1375-8)，抗hK2和抗PSA单克隆抗体由加拿大Laval大学RR Tremblay教授惠赠。人胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶血纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)、人激肽释放酶hK1、人血浆激肽释放酶(PK)、人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)和商品ACT(人血浆α1-抗胰凝乳蛋白酶)购自Calbiochem公司。Z-Phe-Arg-AMC、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC、Z-Gly-Gly-Arg-AMC、MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC购自Calbiochem公司。CFP-TFRSA-YFP荧光底物按已有方法开发出来(Mahaian NP等人，1999″Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal theactivation of specific caspases during apoptosis″Cheni Biol 6，401-9)。人血浆α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的cDNA由宾夕法尼亚大学Dr.Harvey Rubin教授惠赠。
定点诱变
将ACT的cDNA亚克隆到pQE-9表达载体(Qiagen，德国，图9)，并在rACTWT的氨基末端(N-terminal)导入HIS6标签后，将两个限制酶切位点Sac II和MluI分别接在RSL结构域的PI密码子的上游18bp处和下游18bp处。根据Stratagene公司提供的快变(quickchange)突变实验方案，用寡核苷酸5′-GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3′对Sac II进行同义突变；用5′-GCACAATGGTACGCGTC TCCACTAATG-3′对MluI进行同义突变。
底物噬菌体展示库的构建
用修饰的pH0508b噬菌粒制备底物噬菌体库(Lowrnafi等人，1991，″Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display″Biocheinistry 12，10832-8)。构建包括在Gly-Gly-Gly-Ser-重复-富含区域(Gly-Gly-Gly-Ser-repeat-rich region)的任意一端存在的HIS6标签，所述富含区域在噬菌体M13基因III的羧基末端结构域(密码子249-406)之前。随机五肽通过用5′端被生物素酰化的引物对模板寡核苷酸进行PCR延伸而制得。所述模板寡核苷酸在产生的简并密码子两端都有合适的限制位点。所述简并密码子是：
5′TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGT CATAGCAGTCGCTGCA-3′(其中N可以是任意核苷酸，S可以是G或C)，所述引物相应的侧翼区域为5′TGAGCTAGTCTAGATAGGTG-3′和5′-TGCAGCGACTGCTATGA-3′。PCR模板按已有方法进行消化和纯化(Smitll G.P，Scott J.K.1993″Libraries of peptides and proteins displayed onfilamentous phage″Methods Enzymol.217，228-57)，并被插入到由XbaI/SalI消化好的pH0508b载体中，并电穿孔导入到XL1-Blue(F-)。库容量可根据转化效率进行估计。所述转化效率可通过将少部分转化细胞涂布到含氨苄青霉素(100微克/毫升)和四环素(15微克/毫升)的Luria-Bertani平板上进行检测。其余的转化细胞用于制备噬菌体库，加入M13K07辅助噬菌体培养过夜。所述辅助噬菌体的浓度使感染复数达每毫升100个空斑形成单位(p.f.u.)。从上清液中收集噬菌体，并通过聚乙二醇沉淀进行纯化。从中随机选取200个克隆用于测序，以验证该库的随机性。
噬菌体展示五肽库的筛选
所述新五肽库用hK2筛选8轮。用10毫升含1毫克/毫升BSA的氯化钠/磷酸缓冲液(NaCl/Pi)洗涤100微升Ni2+-氨三乙酸交联琼脂糖珠(Ni2+-氨三乙酸交联琼脂糖树脂)。
将噬菌体微粒(1011)加入到平衡好的Ni2+-氨三乙酸交联琼脂糖树脂中，4℃下缓慢搅拌3个小时使二者结合。随后用NaCl/Pi(含1毫克/毫升的BSA，5毫摩尔/升的咪唑和0.1％的吐温20)洗涤所述树脂以去除没有结合的噬菌体微粒，然后在NaCl/Pi中平衡所述树脂。所述底物噬菌体在37℃下在27纳摩尔/升(nM)(终浓度)的hK2中暴露45分钟。还进行了不含蛋白酶的空白筛选。将裂解的噬菌体释放到上清液中，用XL1-Blue大肠杆菌扩增，然后进行下一轮筛选。八轮筛选后，大约15个单克隆从第五轮、第六轮和第八轮筛选中被挑选出来，并且分离了质粒DNA，将质粒上编码所述底物的区域进行了测序。
重组野生型ACT及其变体的构建和表达
使用引物通过模板寡核苷酸的PCR延伸生成相应在反应活性部位环上P3和P3′之间(见下表4)的位置有变化的6个变体：
rACT8.20，5’-TACCGCGGTCAAAATCACC CTCCCGTTCTCGGAGCAGTGGAGACGCGTGA-3’；
rACT6.3，5’-TACCGCGGTCAAAATCACC AGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA-3’；
rACT8.3，5’-TACCGCGGTCAAAATC AGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；
rACT6.7，5’-TACCGCGGTCAAAATC AAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA-3’；
rACT6.1，5’-TACCGCGGTCAAAATC ATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；
rACT5.18，5’-TACCGCGGTCAAAATCACC GAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA-3’
(其中划线序列编码反应活性部位环的新断裂位点)，所述引物相应的侧翼区是5′-TACCGCGGTCAAAATC-3和5′-TCACGCGTGTCCAC-3′。将PCR产物用Sac II和Mlu I限制酶消化，然后亚克隆到消化好的rACTWT构建体中。重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白在大肠杆菌TG1菌株中制备。细胞在37℃下在含100微克/毫升氨苄青霉素的2xTY培养基(每升含16克胰蛋白胨、10克酵母提取物、5克氯化钠)中生长至A600＝0.5。然后加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5毫摩尔/升，使重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白在16℃下表达16小时。通过沉淀收集100毫升培养物里的细胞，重悬于冷磷酸缓冲液(PBS)中，经过弗氏压碎器，复性所有可溶的细胞质蛋白。细胞碎片通过离心去除，上清液加入Ni2+-氨三乙酸交联琼脂糖珠，4℃下90分钟以结合重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白。随后用50毫摩尔/升pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、500毫摩尔/升的NaCl和25毫摩尔/升的咪唑洗涤所述树脂；结合在树脂上的蛋白质用50毫摩尔/升pH值为8.0的Tris、500毫摩尔/升的NaCl和150毫摩尔/升的咪唑洗脱10分钟。一旦完成纯化，在4℃下将rACT在50毫摩尔/升pH值为8.0的Tris、500毫摩尔/升的NaCl和0.05％Triton X-100中透析16小时。每种纯化物的蛋白浓度用Bradford蛋白质分析法(Bradford assay)测定，通过考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶光密度测定使蛋白浓度标准化(Laemmli UK.1970″Cleavageof structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4″Nature 227，680-5)。
                            表4
重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)及其变体的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环(RSL)序列对比
  重组丝氨酸蛋白酶抑制剂   选择的底物多肽   P6   P5   P4   P3   P2   P1   P’1   P’2   P’3   P’4   P’5   P’6
  rACTWTrACT8.20rACT6.2rACT8.3rACT6.7rACT6.1ACT5.18 LR↓SRARR↓SIDRGR↓SEKLR↓TTMTR↓SNER↓VSP   VVVVVVV   KKKKKKK   IIIIIII   TTTR K MT   LL R G L T E   L* R * R * R * R * R * R *   SSSS T S V   AR I E T N S   LA DLLA P   VVVVVVV   EEEEEEE   TTTTTTT
底物多肽用噬菌体展示随机五肽库，经激肽释放酶hK2筛选。
常规字体的残基是野生型ACT(rACTwT)共有的，黑体和下划线标注的残基对应ACT变体在所述RSL上的重置底物多肽。hK2底物多肽中的易裂键用↓表示，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的断裂位点用星号(*)标注在P1-P′1残基之间。
抑制作用测定和抑制作用的化学计量(SI)
用hK2和另外不同的酶测定rACTWT及其变体的抑制作用的化学计量(SI)值。初始测试时rACT与蛋白酶摩尔比过量100倍，所述蛋白酶为激肽释放酶(hK2)、前列腺特异性抗原(PSA)、人激肽释放酶(hK1)、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、人血浆激肽释放酶(PK)、尿激酶(uPA)和人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)。反应在反应缓冲液(50毫摩尔/升pH值为7.5的Tris、150毫摩尔/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下进行30分钟(PSA在37℃下进行90分钟)；残余的蛋白酶活性通过加荧光底物检测(hKl、hK2和PK加Z-Phe-Arg-AMC；Chtr加Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC；uPA加Z-Gly-Gly-Arg-AMC；HNE加MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC；PSA加CFP-TFRSA-YFP)。将加本发明的抑制剂的酶活性与未被抑制的反应进行对比。观察加抑制剂的反应，通过培养不同浓度的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白检测SI。用线性回归分析活性分数(受抑制的酶反应速率/未受抑制的酶反应速率)与抑制剂对蛋白酶摩尔比率的关系曲线，抑制作用的化学计量由横坐标截距可得。
动力学
在准一级条件下，使用进程曲线方法测量，hK2、胰凝乳蛋白酶、人血浆激肽释放酶(PK)和人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)与不同的rACT的相互作用的缔合速率常数(Morrison JF，Walsh CT.1988″The behavior andsignificance of slow-binding enzyme inllibitors″Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol 61，201-301)。在此条件下，将固定量的蛋白酶(2纳摩尔/升)与不同浓度的抑制剂(0-800纳摩尔/升)和过量的底物(10微摩尔/升)混合。所有反应都在反应缓冲液(50毫摩尔/升pH值为7.5的Tris、150毫摩尔/升的NaCl、0.05％Triton X-100和0.01％的BSA)中，25℃下进行45分钟。产物生成速率通过FLx800荧光96孔微板测读仪(Biotek，美国)测量。在此模型中，抑制作用在整个反应过程中视为不可逆的，酶活性的进程用产物生成(P)表示，酶的起始速率(Vz)，被抑制一段时间(t)酶的一级反应速率为(kobs)，速率常数只取决于抑制剂浓度。
          P＝(Vz/kobs)×[1-e(-kobs)]            方程1
对每种抑制剂的kobs都在4个不同抑制剂浓度下用方程1计算非线性回归的数据得到。通过绘制kobs对抑制剂浓度[I]测定二级反应速率常数k′，k′等于上述曲线的斜率(k′＝Δkobs/Δ[I])。由于抑制剂和底物竞争，以下方程2用于校正二级反应常数k′，考虑底物浓度[S]和所述蛋白酶对其底物的米氏常数Km，得出ka。
        ka＝(1+[S]/Km)×k’                    方程2
hK2对Z-FR-AMC的Km为67微摩尔/升，胰凝乳蛋白酶对Suc-AAPF-AMC的Km为145微摩尔/升，PK对Z-FR-AMC的Km为170微摩尔/升，HNE对MeOSuc-AAPV-AMC的Km为130微摩尔/升。
络合物生成和抑制剂降解的蛋白质印迹法分析
激肽释放酶hK2与不同的重组ACT，以[I]o∶[E]o比为100∶1，在50毫摩尔/升的Tris、200毫摩尔/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，37℃下培养3小时。将蛋白样品在95℃加热5分钟，用SDS-PAGE(12％的丙烯酰胺，T∶C比19∶1)分离，然后电印迹转移至Hybond-ECL(Amersham Pharmacia)硝化纤维膜上。游离的hK2和hK2-ACT络合物用鼠抗hK2单克隆抗体和碱性磷酸酯酶共轭的羊抗鼠二抗检测。蛋白质印迹用ECL检测试剂盒(Amersham Phannacia Biotech)显影。hK2还和ACT8.3或ACT6.7在25℃(动力学条件)下，以[I]o∶[E]o比为100∶1，在50毫摩尔/升的Tris、200毫摩尔/升的NaCl和0.05％Triton X-100中，培养30分钟。蛋白质用抗His6单克隆抗体进行蛋白质印迹法检测，然后按上述方法检测二抗。
可溶性重组野生型及变体ACT的制备
野生型丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白α-1抗胰凝乳蛋白酶用于开发激肽释放酶hK2特异性抑制剂。rACTWTRSL结构中P3-P′3之间的残基被底物五肽取代。所述底物五肽由上述噬菌体展示技术选出。6种rACT变体(见表1)得以设计并构建。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的RSL中的Leu-358-Ser-359，排列底物多肽的易裂键。rACTWT及其变体作为氨基末端位置含His标签的融合蛋白，由大肠杆菌TG1表达。所有的融合蛋白都在低温下制备，使得蛋白主要以活性可溶形式积聚。在自然条件下纯化，蛋白生成的水平在1.0-2.5毫克/升之间变化。纯化的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的纯度，例如变体6.1(泳道1)和野生型ACT(泳道2)，经SDS-PAGE分析评价超过98％(图1)。
rACT变体的特异性主要针对激肽释放酶hK2
包括人嗜中性弹性蛋白酶、凝乳蛋白酶样(Chtr、PSA或hK3)和胰岛素样(hK2、hK1、PK、uPA)蛋白酶在内的一系列酶已被筛选出来，以检测rACT变体的抑制特异性(表5)。
                                               表5
                                   rACTWT及其变体的抑制性概况
  ACT8.20(LR↓SRA)a   ACT6.2(RR↓SID)a   ACT8.3(RGR↓SE)a   ACT6.7(KLR↓TT)a   ACT6.1(MTR↓SN)a ACT5.18(ER↓VSP)a   ACTWT(LL↓SA)a
  MD820   MD62   MD83   MD67   MD61 MD518
  Protease 抑制率％b
  hK2ChtrPKHNEPSA(hK3)hK1尿激酶   956654304500   10001000000   100000000   1000360000   100010060000 73000000   01000158000
a在对应于由hK2选出的底物多肽的重组ACT的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环(RSL)上断裂的氨基酸序列
b蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白，以[I]o∶[E]o比为100∶1，25℃下培养30分钟(PSA在37℃下90分钟)。
抑制百分率符合100×(1-(抑制剂存在的反应速率/未受抑制的空白反应速率))
与过量抑制剂([I]o∶[E]o比为100∶1)培养30分钟，hK2被rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7和rACT6.1完全抑制，但是rACT8.20和rACT5.18对酶活性的抑制分别为95％和73％。在此条件下，野生型rACT未表现对hK2的活性有抑制。在所述变体中，两种变体(rACT8.3和rACT5.18)特异性抑制hK2，对其它测试的酶没有抑制作用。另外两种变体，rACT6.7和rACT6.2对PK也分别有36％和100％的抑制作用。野生型ACT和变体rACT8.20抑制两种胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Chtr和PSA，而且还抑制PK和HNE。所述重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白都没有表现出对激肽释放酶hK1和uPA的抑制活性。
与野生型ACT相比，变体ACT对hK2的抑制作用化学计量明显改善
抑制作用化学计量的检测是在所有酶的生理条件的pH和离子强度下完成的，以保证最有价值的比较。重组野生型ACT给出的对胰凝乳蛋白酶的SI值为2(表6)，与商购ACT在相似条件下得到的值相同(数据未给出)。
                                          表6
rACTWT及其变体与hK2及其它蛋白酶的抑制作用化学计量值和反应二级速率常数(ka)的比较
  ACT8.20(LR↓SRA)cMD820   ACT6.2(RR↓SID)cMD62   ACT8.3(RGR↓SE)cMD83 ACT6.7(KLR↓TT)cMD67   ACT6.1(MTR↓SN)cMD61   ACT5.18(ER↓VSP)cMD518   ACTWT(LL↓SA)c
蛋白酶   SI (ka)bM-1s-1   SI   ka bM-1s-1   SI ka bM-1s-1 SI ka bM-1s-1   SI ka bM-1s-1   SI ka bM-1s-1   SI ka bM-1s-1
hK2ChtrPKHNE   105134150334 1779905424158   25-18-   6261-6217-   34--- 2439--- 9-277- 8991-201-   19-16159  3442-80241192   139--- 595---   -2-- -61295--
a用线性回归分析外推I/E比而检测的报告SI值(见图1)
b如《实验规程(Experimental Procedure)》中所述，丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白-蛋白酶反应的二级反应常数通过在准一级或二级条件下测定。
c在对应于hK2选出的底物多肽的重组ACT的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环(RSL)上P3-P3’残基的氨基酸序列
-，没有可检测到的抑制活性。
为了检测所有重组变体的SI值，申请人将hK2(5纳摩尔/升)与浓度不同(6.25-500纳摩尔/升)的rACT8.20(×)、rACT6.2(□)、rACT8.3(△)、rACT6.7(◇)、rACT6.1 rACT5.18(○)、rACTWT(+)，在反应缓冲液中25℃下培养30分钟。hK2残余的活性(速率)通过加入荧光底物(10微摩尔/升)Z-FR-AMC检测。速率分数对应受抑制的酶反应速率(Vi)/未受抑制的空白酶反应速率(vo)之比。所述SI的检测通过线性回归分析外推I/E比(即x轴截距)。
如图2所示，所有新构建的ACT变体都表现出比野生型ACT低的对hK2的SI值。所有这些变体中，rACT6.7、rACT6.1和rACT6.2的对hK2的SI值最低(分别是9、19和25)。然而rACT6.2和rACT6.1还有对PK的最低SI值(18和16)，rACT6.7对PK的SI值(277)高很多。两种对hK2特异的重组ACT，rACT8.3和rACT5.18具有较高的SI比，分别为34和139。rACT8.20抑制剂对包括hK2的所有测试酶的SI值都高达100。
变体ACT与hK2形成稳定络合物没有降解抑制剂
hK2与rACT8.20、rACT6.2、rACT8.3、rACT6.7、rACT6.1、rACT5.18和野生型ACT，以I∶E比为100∶1，在37℃下培养30分钟。与酶相互作用后，在还原的条件下，用鼠抗-hK2抗体检测抑制剂的衰减，然后用蛋白质印迹法分析rACT与hK2(rACT8.20(泳道1)、rACT6.2(泳道2)、rACT8.3(泳道3)、rACT6.7(泳道4)、rACT6.1(泳道5)、rACT5.18(泳道6)和野生型ACT(泳道7))的反应产物。图3A显示了当将hK2与ACT变体培养时，游离hK2(E)完全消失，形成共价络合物(EI)。该共价络合物表现出高稳定性，因为它在经过16小时的培养期后没有裂解(数据未给出)。野生型的ACT对hK2的抑制要慢得多，3小时培养之后多数还未络合。检测到的对hK2的SI值升高不能归因于非络合物促进ACT变体抑制剂降解。
进一步在非动力学条件(25℃下30分钟)下，将ACT8.3(泳道1)或ACT6.7(泳道3)与hK2(在蛋白质印迹上分别为泳道2和泳道4)以I∶E比为10∶1培养。络合物的生成在还原条件下，用鼠抗-His标签单克隆抗体(图3B)通过蛋白质印迹分析。所有的抑制剂蛋白不是和hK2络合，就是表现出非断裂的状态，表明可能的底物途径对丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白-蛋白酶相互作用不重要。
变体ACT表现出与hK2极高的缔合常数
每种蛋白酶表现出的与抑制剂的反应性决定了其与变体ACT抑制反应的速率。最终hK2和重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的相互作用在准一级条件下，用进程曲线测定。将hK2(2纳摩尔/升)和底物Z-FR-AMC(10微摩尔/升)加入到具有变化量(20-800纳摩尔/升)的抑制剂rACT8.20(◇)、rACT5.18(+)(图4A)和抑制剂rACT6.2(○)、rACT8.3(□)、rACT6.7(△)、rACT6.1(×)(图4B)中。描述进程的曲线用方程1非线性回归分析，以所述丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白浓度对速率(kobs)作图。
测定kobs之后，缔合常数(ka)用蛋白酶对其相应底物(表4)的Km计算出来。野生型ACT与胰凝乳蛋白酶的ka值与文献(Cooley等人，2001″Theserpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteasesthrough efficient reactions at two active sites″Biochemistry 40，15762-70)公开的数据相同。重组rACT6.7表现出与hK2结合最高的ka(8991M-1s-1)，而它与PK的ka是与hK2的ka的四十五分之一。相反，重组rACT6.2与hK2的ka和与PK的ka相等，该重组rACT表现出缺乏对这两种酶的辨别能力。hK2特异重组抑制剂rACT8.3和rACT5.18的ka值很低，分别为2439M-1s-1和595M-1s-1，但是非hK2特异性的rACT8.20表现出与hK2缔合的ka为1779M-1s-1，相比之下高于其与Chtr、PK和HNE缔合的活性。其中一种重组丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白rACT6.1，与PK的反应速率高于与hK2的反应速率。
实施例2
特异性抑制人hK2和hK3蛋白酶的重组ACT抑制剂的开发
如实施例1所述，用编码蛋白C抑制剂(PCI)的RSL的底物五肽序列(表7)取代野生型重组体ACT(rACTWT)的RSL结构上的残基P3-P’3。
                               表7
重组丝氨酸蛋白酶抑制剂ACT、PCI和ACTPCI的反应丝氨酸蛋白酶抑制剂环(RSL)的排列
                                                                      RSL序列
  丝氨酸蛋白酶抑制剂   P6   P5   P4   P3   P2   P1   P’1   P’2   P’3   P’4   P’5   P’6
rACTWT   氨基酸序列 V K I T L L S A L V E T
  DNA序列(密码子)   GTC   AAA   ATC   ACC   CTC   CTT   TCT   GCA   TTA   GTG   GAG   GTC
  rPCIWT   氨基酸序列   T   I   F   T   F   R   S   A   R   L   N   S
  rACTPCI(MD CI)   氨基酸序列   V   K   I   T   F   R   S   A   L   V   E   T
  DNA(密码子)   GTC   AAA   ATC   ACC   TTT   AGA   TCT   GCA   TTA   GTG   GAG   GTC
常规字体的残基是和野生型重组rACT(ACTwT)共有的，黑体和下划线标注的残基对应ACT变体在所述RSL上的重置底物多肽。底物多肽中的易裂键用↓表示，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白上推定的断裂位点用星号(*)标注在P1-P′1残基之间。
简要地讲，为制备重组蛋白ACTPCI(MDCI)，TG1细胞在合适的培养基中生长之后，用相应的构建体进行转化。然后促使细胞达到最佳密度，在16℃下表达重组抑制剂16小时。
重组抑制剂ACTPCI从细菌细胞质中提取出来，如前面的实例所述，用Ni-NTA柱亲合层析分离所述重组抑制剂ACTPCI。
通过SDS-PAGE对重组ACT表达的分析
在还原条件下，用SDS-PAGE分析实施例1和2中开发的不同的抑制剂纯度，结果见图5。
抑制剂的评价
对所述抑制剂进行了进一步的分析，以评价它们的特异性以及它们抑制蛋白酶的亲合性。所述蛋白酶为人激肽释放酶hK2和hK3(图6)，以及血浆激肽释放酶、胰岛素、尿激酶、弹性蛋白酶、凝血酶、hK14和人激肽释放酶8(表8)。所述两种酶具有不同的酶特异性(hK2：胰岛素样；hK3：胰凝乳蛋白酶样)，但都被ACT天然抑制。虽然ACT被认为是血液循环中的天然hK3抑制剂，但是它对hK2的抑制作用较差。
用蛋白质印迹法分析rACT和人激肽释放酶间的抑制反应，结果见图6。对于每一种ACT变体，将1微克抑制剂与100纳克hK2或hK3在37℃生理条件下培养1小时。
用抗hK2 9D5的单克隆抗体进行检测的结果见图6A。
泳道1：只有hK2，2：商购ACT+hK2，3：野生型ACT+hK2，4：MD820+hK2，5：MDCI+hK2，6：MD62+hK2，7：MD61+hK2。
图6B显示了用抗-His抗体(重组ACT蛋白上带有的His标签)检测hK3-ACT络合物的结果。
泳道1：PSA，2：PSA+ACT，3：野生型ACT+PSA，4：MD820+PSA，5：MDCI+PSA，6：MD62+PSA，7：MD61+PSA。
氨基酸在反应环内变化，用筛选出的hK2特异性底物序列将ACT改造为对hK2高度特异性而不抑制hK3的抑制剂(MD820、MD61、MD62)。所述结果验证了前面表4的内容。
只有基于蛋白C抑制剂(PCI)反应环的MDCI能抑制所测试的两种激肽释放酶(hK2和hK3)。
MD61和MD62是对hK2具有极高亲合性的抑制剂，3分钟内抑制所有的hK2蛋白(在同样条件下)，相比之下，野生型或者商购的α-1抗胰凝乳蛋白酶需要培养12个小时以上才能抑制同样量的hK2(数据未给出)。
                        表8
                    MDCI的抑制概况
  蛋白酶   抑制率％b   SI   KaM-1s-1
  胰凝乳蛋白酶血浆激肽释放酶胰岛素尿激酶弹性蛋白酶凝血酶hK14人激肽释放酶   98100100000100～25   14.61---3.2～180   86216259001126025---287000
实施例3
MD抑制剂对肿瘤生长的抑制作用
3.1MD62和MD67抑制剂对肿瘤生长的抑制作用
雄激素依赖的人前列腺癌细胞系DU-145得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。应用逆转录病毒技术得到转染有hK2基因的DU-145细胞(DU145/hK2)。
收集指数生长的DU145/hK2细胞，以7.5×107个细胞/毫升的浓度重悬于含1或10微克抑制剂的DMEM(Invitrogen)培养基中。所述细胞悬液以1∶2的比例与matrigel基质(BD BioSciences)混合，皮下注射(3×106个细胞/40微升)到8周龄无胸腺Swiss裸鼠(两只鼠/组)的左右胁腹。每只鼠接种两个位置。
接种肿瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射50微克或10微克MD62、MD67或者100微克或10微克ACT-WT。接种肿瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射25微克或5微克抑制剂(MD62和MD67)或者50微克或5微克ACT-WT。
图10A显示出MD62对肿瘤生长的抑制作用。转染了人激肽释放酶2的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)移植到裸鼠体内，然后用MD62治疗(5或25微克/注射剂)。
图10B显示出MD67对肿瘤生长的抑制作用。转染了人激肽释放酶2的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)移植到裸鼠体内，然后用MD67治疗(5或25微克/注射剂)。
3.2MDCI抑制剂对肿瘤生长的抑制作用
雄激素依赖的人前列腺癌细胞系DU-145得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。应用逆转录病毒技术得到转染有hK2基因的DU-145细胞(DU145/hK2)。
收集指数生长的DU145/hK2细胞，以7.5×107个细胞/毫升的浓度重悬于含1或10微克抑制剂的DMEM(Invitrogen)培养基中。所述细胞悬液以1∶2的比例与基质matrigel(BD Biosciences)混合，皮下注射(3×106个细胞/40微升)到8周龄无胸腺Swiss裸鼠(两只鼠/组)的左右胁腹。每只鼠接种两个位置。
接种肿瘤后的第6天、第12天和第18天，皮下注射100微克或10微克MDCI或ACT-WT。接种肿瘤后的第24天、第30天、第33天、第36天、第39天和第41天，皮下注射50微克或5微克MDCI或ACT-WT。
图11显示出MDCI对肿瘤生长的抑制作用。转染了人激肽释放酶2的前列腺癌细胞DU-145(3×106个细胞)移植到裸鼠体内，然后用MDCI治疗(5或50微克/注射剂)。

Claims (38)

1.一种蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，该嵌合抑制剂蛋白包括：
a)起抑制作用的多肽序列和
b)至少一段对所述蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点的多肽序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述底物-酶相互作用位点的多肽序列为底物活性位点序列、该序列的片段、该序列的分子嵌合体、该序列的组合和/或该序列的变体。
3.根据权利要求2所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述底物活性位点序列为丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环序列、该序列的片段、该序列的分子嵌合体、该序列的组合和/或该序列的变体。
4.根据权利要求3所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白反应环序列选自包括SEQ ID No 16、17、18、19、20、21、22序列、所述序列的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体的组中。
5.根据权利要求1-4所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述蛋白酶选自包括激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶(Chtr)、尿激酶(uPA)和人嗜中性弹性蛋白酶(HNE)的组中。
6.根据权利要求5所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述激肽释放酶为hK2激肽释放酶蛋白。
7.根据权利要求1-6所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列为对丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶起抑制作用的多肽序列。
8.根据权利要求7所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述起抑制作用的多肽序列为丝氨酸蛋白酶抑制剂序列、该序列的片段、该序列的分子嵌合体、该序列的组合和/或该序列的变体。
9.根据权利要求9所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂序列选自包括α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、蛋白C抑制剂(PCI)、α-1抗蛋白酶(AAT)、人α-1抗胰蛋白酶相关蛋白前体(ATR)、α-2-血纤蛋白溶酶抑制剂(AAP)、人抗凝血酶-III前体(ATIII)、蛋白酶抑制剂10(PI10)、人胶原蛋白结合蛋白2前体(CBP2)、蛋白酶抑制剂7(PI7)、亮氨酸丝氨酸蛋白酶抑制剂2(HLS2)、人血浆蛋白酶Cl抑制剂(C1 INH)、单核细胞/中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(M/NEI)、纤溶酶原激活物抑制剂-3(PAI3)、蛋白酶抑制剂4(PI4)、蛋白酶抑制剂5(PI5)、蛋白酶抑制剂12(PI12)、人内皮纤溶酶原激活物抑制剂-1前体(PAI-1)、人胎盘纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、人色素上皮衍生因子前体(PEDF)、蛋白酶抑制剂6(PI6)、蛋白酶抑制剂8(PI8)、蛋白酶抑制剂9(PI9)、人鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、人鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、T4-结合球蛋白(TBG)、Megsin蛋白、蛋白酶抑制剂14(PI14)、以及它们的片段、它们的分子嵌合体、它们的组合和/或它们的变体的组中。
10.根据前述任意一项权利要求所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白选自包括MD820、MD 62、MD 61、MD 67和MD CI的组中。
11.根据权利要求10所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白为MD 62或MD 67。
12.一种对蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白进行编码的分离纯化的DNA序列，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白为前述任意一项权利要求所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白。
13.根据权利要求12所述分离纯化的DNA序列，其特征在于，所述序列选自包括SEQ ID N°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ IDN°9、SEQ ID N°11和SEQ ID N°13的组中。
14.一种表达载体，其特征在于，该载体包括权利要求12-13所述分离纯化的DNA序列。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，该载体还包括能够连接所述分离纯化的DNA序列的启动子。
16.一种真核或原核宿主细胞，其特征在于，该细胞转染有权利要求14或15所述的表达载体。
17.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白作为活性成分，以及选择性结合的一种或多种适合的药物载体。
18.一种对哺乳动物体内与蛋白水解相关的紊乱进行治疗或预防的方法，该方法包括给所述哺乳动物服用权利要求17所述的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述紊乱是这样一种紊乱，在该紊乱中hK2激肽释放酶的活性是有害的。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述紊乱为癌症、自身免疫紊乱、炎症紊乱或传染性紊乱。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌症为前列腺癌、乳腺癌或转移瘤。
22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述炎症紊乱为良性前列腺肥大。
23.权利要求17所述药用组合物的用途，其特征在于，该组合物用于制备对哺乳动物体内与蛋白水解相关的紊乱进行治疗或预防的药剂。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述紊乱是这样一种紊乱，在该紊乱中hK2激肽释放酶的活性是有害的。
25.根据权利要求23或24所述的用途，其特征在于，所述紊乱为癌症、自身免疫紊乱、炎症紊乱或传染性紊乱。
26.根据权利要求25所述的用途，其特征在于，所述癌症为前列腺癌、乳腺癌或转移瘤。
27.根据权利要求25所述的用途，其特征在于，所述炎症紊乱为良性前列腺肥大。
28.一种制备权利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
a)选择对对蛋白酶具有特异性的底物-酶相互作用位点进行编码的多核苷酸序列，
b)将多核苷酸序列引入编码丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶的抑制剂蛋白的序列，由此得到嵌合序列，
c)使所述嵌合序列在适合的条件下在细胞表达系统中表达，以及
d)复性蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述步骤a)通过噬菌体展示库筛选完成。
30.根据权利要求28和29所述的方法，其特征在于，所述适合的条件包括将细胞表达系统在10-40℃的温度下培养10-30个小时。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述适合的条件包括将细胞表达系统在16℃下培养16个小时。
32.根据权利要求28-31所述的方法，其特征在于，所述步骤b)通过从所述细胞表达系统中提取并分离所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白完成。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的分离通过亲合层析方法完成。
34.根据权利要求28-33所述的方法，其特征在于，进一步检验所述蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白的抑制所述蛋白酶活性的能力。
35.根据权利要求28-34所述的方法，其特征在于，所述细胞表达系统为真核或原核细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述原核细胞为细菌细胞。
37.一种检测样品中蛋白酶的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒包括任意合适的分离纯化的DNA序列，所述DNA序列选自包括SEQ IDN°1、SEQ ID N°3、SEQ ID N°5、SEQ ID N°7、SEQ ID N°9、SEQID N°11和SEQ ID N°13、它们的互补序列、它们的片段和/或它们的变体的组中。
38.一种检测样品中蛋白酶的诊断试剂盒，其特征在于，该诊断试剂盒含有权利要求1-11所述的蛋白酶的嵌合抑制剂蛋白。
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