CN1167502A

CN1167502A - 人dna连接酶iii

Info

Publication number: CN1167502A
Application number: CN 94195210
Authority: CN
Inventors: 卫颖飞; 威廉·A·赫塞尔廷
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1994-11-08
Publication date: 1997-12-10

Abstract

本发明公开了一种人DNA连接酰III多肽、编码这种多肽的DNA(RNA)和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明也公开了采用这种多肽经基因疗法治疗与DNA连接酶III缺损有关的疾病的方法。本发明还公开了针对这种多肽的拮抗剂和它们作为治疗剂在清除不需要的细胞上的用途。此外，本发明还公开了用于检测突变DNA连接酶III基因的测定法。

Description

人DNA连接酶III

本发明涉及新鉴别的多核苷酸、这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途、以及这些多核苷酸和多肽的产生方法。更具体地说，本发明的多肽是人DNA连接酶III。本发明也涉及抑制这些多肽作用的方法。

在复制、修复和重组期间产生DNA链的中断和间隙。在哺乳动物细胞核中，这样的间断的重新加入取决于若干不同的DNA聚合酶和DNA连接酶。通过纯化酶的生物化学和免疫学特征以前已产生了三种不同的DNA连接酶(Tomkinson，A.E，等，生物化学杂志，266：21728-21735(1991))。DNA连接酶是在哺乳动物细胞中的催化DNA复制，切补修复和重组修复的酶(Li，J.J.和Kelly，T.J.，PNAS，美国，81：6973-77(1984)和Wook，R.O.等，细胞，53：97-106(1988))。在细菌中，已发现了三种DNA连接酶，即是DNA连接酶I、DNA连接酶II以及DNA连接酶III，而在人中，发现了所有上述三种酶，但仅克隆了DNA连接酶I。

编码DNA连接酶I的人全长cDNA已通过啤酒糖酵母cdc9温度-敏感性DNA连接酶突变体的功能性互补作用获得(Barker，D.G，欧洲生物化学杂志，162：659-67(1987))。全长cDNA编码919个氨基酸残基的102-kDa蛋白质。除了微生物DNA连接酶外，其与其它已知蛋白质没有明显的序列同源性。所说的活性位点赖氨酸残基位于第568位。DNA连接酶I表现出活性需要镁和ATP。DNA连接酶I的主要功能是在后随链DNA复制期间连接冈崎片段。它也有效地封堵单链DNA中的间断，并且连接限制性内切酶DNA片段和交错末端。所说酶也能够纯化DNA平端的连接。DNA连接酶I能够连接氢键合到聚(脱氧腺苷)上的寡(脱氧胸苷)，但所说的酶与T4DNA连接酶不同，其不能连接寡(脱氧胸苷)与聚(rA)互补链。

人DNA连接酶II更稳定地与细胞核相关。该酶是一种易变的蛋白质，其在42℃迅速失活。DNA连接酶II类似其它真核DNA连接酶，需要ATP作为辅因子，但是所说酶不同于DNA连接酶I，其具有与ATP更高的相关性。DNA连接酶II催化与寡(脱氧胸苷)·聚(rA)底物(而不是与寡(rA)·聚(脱氧胸苷)底物)的磷酸二酯键的形成，因此在这一点上，其完全不同于DNA连接酶I(Arrand，J.E.等，生物化学杂志，261：9079-82(1986))。

新近检测到的较DNA连接酶II大并与该蛋白质明显不相关的酶被命名为DNA连接酶III(Tomkinson，AE等，生物化学杂志，266：21728-35(1991))。DNA连接酶III类似于DNA连接酶I并不同于DNA连接酶II之处在于，仅微弱地结合羟基磷灰石(具有对例如ATP的低的亲和性)。然而DNA连接酶I和III不是密切相关的。DNA连接酶III在DNA中有效地修复单链间断，但不能完成平端连接或超卷曲DNA的腺苷一磷酸依赖性松弛(Elder，R.H.等，欧洲生物化学杂志，203：53-58(1992))。

经DNA连接酶连接连接DNA链中断的机制已有广泛描述。所说的反应由共价酶-腺苷酸复合物的形成开始。哺乳动物和病毒DNA连接酶利用ATP作为辅因子，而细菌DNA连接酶利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸来产生腺苷酰基。ATP裂解成腺苷一磷酸和焦磷酸，后者具有经氨基磷酸酯键与在蛋白质活性位点上的E-氨基特异性赖氨酸残基连接腺苷酰残基(Gumport，R.I.等，PNAS，68：2559-63(1971))。DNA连接酶-腺苷酸中间体的再活化腺苷一磷酸残基转移到双链DNA中的单链间断的5’磷酸基末端，产生具有5’-5’磷酸酐键的共价DNA-腺苷一磷酸复合物。对微生物和哺乳动物的DNA连接酶，也分离了这一反应的中间体，但其存在时间比腺苷酰化酶的更短。在DNA连接的最后步骤，需要用来产生磷酸二酯键的未腺苷酰化的DNA连接酶通过进攻酰化位点上的邻近3’-羟基催化腺苷一磷酸残基的取代。

作为氨基酸序列同源性的结果，本发明的多肽被推断性地鉴别为人DNA连接酶III。

依据本发明的一个方面，本发明提供了新的成熟的多肽(其是人DNA连接酶III)以及生物学活性的和诊断上和治疗上有用的片段，其类似物和衍生物。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了编码人DNA连接酶III的分离的核酸分子，包括的mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及其生物学活性的和诊断上和治疗上有用的类似物和衍生物。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了经重组技术产生这些多肽的方法，该方法包括在有利于所说蛋白质表达和后续所说蛋白质回收的条件下，培养包含人DNA连接酶III核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了为与体外科学研究、DNA合成和DNA载体制造有关的目的利用这些多肽、编码这些多肽的多核苷酸的方法。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了经基因疗法治疗与不足的DNA连接酶III活性有关的疾病的方法，该方法包括体内或体外将DNA连接酶III基因插入到病人的细胞中。所说基因在转导的细胞中表达，结果该基因所编码的蛋白质可以治疗性地用于例如预防与DNA缺损有关的疾病，如异常细胞增殖(例如肿瘤)，用于治疗严重的免疫抑制、发育障碍性生长和淋巴瘤以及对DNA损伤剂的细胞过敏症。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了包含长度足以特异性地与人序列杂交的核酸分子的核酸探针，其可以诊断性地用于检测在编码DNA连接酶III之基因中的突变。

依据本发明的另一个方面，本发明提供了这些多肽的拮抗剂，其可以被胞内制造或经基因疗法施用，以抑制这些肽的活性，例如导向并消灭不需要的细胞(如癌细胞)。

本领域技术人员应清楚本发明的这些和其它方面。

后面的附图用来说明本发明的实施方案，无意于用来限制本发明的权利要求所包含的范围。

图1显示DNA连接酶III多肽的cDNA序列和相应的推断的氨基酸序列。标准的单字母缩写用来表示氨基酸。

图2说明人DNA连接酶I(上面的)和人DNA连接酶III(下面的)之间的氨基酸同源性。

图3是说明在不同的人组织中DNA连接酶III存在的凝胶的拷贝。A组是人DNA连接酶III基因Northern分析的放射自显影图。B组是作为上样参照的溴化乙锭染色凝胶。结果显示，人DNA连接酶III主要在胸腺、精巢和心脏中表达。

依据本发明的一个方面，本发明提供了编码图1的推断的氨基酸序列的成熟多肽或编码由以保藏号ATCC 75880保藏(1994年8月31日)的克隆之cDNA编码的成熟多肽的分离的核酸(或多核苷酸)。

本发明的编码多肽的多核苷酸可以从精巢，胸腺和心脏获得。本发明的多核苷酸在得自人激活的T-细胞的cDNA文库中发现。其结构上与DNA连接酶族相关，包含编码899个氨基酸残基之蛋白质的开放读框。所说蛋白质表现出与兔DNA连接酶最高程度的同源性，整个蛋白质有29％的等同性，和51％的相似性。之处。也重要的是有一个保守的活性赖氨酸残基，其在疏水氨基酸的残基两侧之边界上。序列E-KYDG-R对不同来源的(如哺乳动物细胞、酵母、牛痘病毒和噬菌体T7)酶是相同的。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或者DNA形式，该DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。所说DNA可以是双链或者单链，如果是单链，则其可以是编码链或者非编码(反义)链。所说的编码成熟多肽的编码序列编码序列可以与图1所示的编码序列或保藏的克隆的序列相同，或者可以是不同的编码序列，作为丰余和简并的结果，该编码序列编码与图1的DNA和保藏的cDNA相同的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽或由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸包括：仅成熟多肽的编码序列；成熟多肽(和可有可无的附加的编码序列)的编码序列和非编码序列，如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’-非编码序列。

这样，术语″编码多肽的多核苷酸″包括仅包含多肽的编码序列的多核苷酸，以及包含附加编码和/或非编码序列的的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的的变体，其编码图1的推断的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。所说的多核苷酸变体可以是多核苷酸的天然产生的等位变体或多核苷酸的非天然产生的变体。

这样，本发明包括编码与图1所示的或由保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变体，该变体编码图1的推断的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这样的核苷酸变体包括缺失变体，取代变体和添加或插入变体。

如上所述，所述的多核苷酸可以具有这样一种编码序列，其是图1所示的编码序列或保藏的克隆的编码序列的天然产生的等位变体。如本领域所知的，等位变体是多核苷酸的另一种形式，其具有一个或多个核苷酸的取代，缺失或者添加，而实质上不改变编码的多肽的功能。

本发明的多核苷酸也可以具有读框中融合进标记序列的编码序列，所述的标记序列使得可以纯化本发明的多核苷酸，在细菌宿主的情况下，所述的标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标记，其使得融合进标记的成熟多肽可以纯化，或者例如当使用哺乳动物细胞(如COS-7细胞)时，标记序列可以是血细胞凝集素(HA)。所说的血细胞凝集标记相应于源于流感血细胞凝集素蛋白质的表位(Wilson，I.，等，细胞，37：767(1984))。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(如果两个序列之间具有至少50％，优选的具有70％的等同性)。本发明特别涉及在严格条件下与以上所述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所使用的，术语″严格条件″指仅在序列间具有至少95％，优选的具有97％的同源性时杂交才可以发生。在一个优选的实施方案中，杂交到以上所述的多核苷酸上的多核苷酸编码这样一种多肽，其实质上保持与由图1的cDNA或保藏cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。

本文所提及的保藏物将按照用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的规定保持。这些保藏物仅仅是为了给本领域技术人员提供方便，并不是35U.S.C112条所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其编码的氨基酸序列本文一并参考，并且用于解决本文序列描述上的任何矛盾，对保藏材料的任何制造，使用或者销售需要经过许可，在此未给予任何这样的许可。

本发明还涉及DNA连接酶III多肽以及其片段，类似物以及衍生物，所述的多肽具有图1的推断的氨基酸序列或者其具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列。

术语″片段″、″衍生物″和″类似物″，当有关图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，指基本上保持与这样的多肽相同的生物功能或活性的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选地是重组多肽。

所说的图1的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代并且取代的氨基酸可以是可以不是由遗传密码子编码的。或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基包含取代基，或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙烯乙二醇)，或者(IV)这样一种，其中附加氨基酸融合进成熟多肽，其用来纯化成熟-多肽。通过本文的阐述，这样的片段、衍生物以及类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并且最好纯化至均质。

术语″分离的″意指所述的物质脱离了其原始环境(例如，天然环境，如果其是天然产生的)。例如，一种存在于活的动物中的天然-产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中某些或全部共存的物质分开的相同的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分的这样的和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，其仍然是分离的，这是因为这种载体或者组合物不是其天然环境的一部分。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体和用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明的多肽的方法。

宿主细胞是用本发明的载体经基因工程产生的(转导、转化或转染)，所说的载体可以是克隆载体或表达载体，该载体可以是例如，质粒、病毒颗粒噬菌体等形式。所说的工程宿主细胞可以在修饰的常规营养培养基中的培养，所述培养基修饰得适于激活启动子，选择转化子或扩增DNA连接酶III基因。培养条件，例如pH值和温度等，是以前用于选择来表达的宿主细胞的那些。对普通技术人员是显而易见的。

本发明的多核苷酸可以用来经重组体技术产生多肽。这样，例如，多核苷酸可以包含在各种表达多肽的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，例如猿猴病毒40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA组合衍生的载体；病毒DNA(如牛痘，腺病毒，家禽痘病毒，和假狂犬病病毒)。然而，任何其它载体也可以使用，只要其在宿主中可复制和稳定。

可以用多种方法将合适的DNA序列插入到载体中。一般来说，用本领域已知的分将DNA序列插入到适当的限制性核酸内切酶位点。这样的方法和其它方法被认为在本领域技术人员的知识范围内。

在表达载体中的所说的DNA序列可有效连接到适当的表达控制序列(启动子)上，以指导mRNA合成。这样的启动子的代表性例子可以提到的是：LTR或猿猴病毒40启动子，大肠杆菌、lac或trp、噬菌体λP_L启动子，和已知在原核或真核细胞或它们的病毒中控制基因表达的其它启动子。所说的表达载体也包含用于翻译起始和转录终止的核糖体结合位点。该载体也可以包含供扩增表达的合适的序列。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌中的四环素和氨苄青霉素抗性。

包含以上所述的适当的DNA序列以及适当的启动子或者控制序列的载体可以用于转变适当的宿主，以使其能够表达蛋白质。

作为合适宿主的代表性例子，这里可以提到的是：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如Drosorphila和Sf9；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；植物细胞，等。通过本文的阐述，对适当的宿主的选择被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

更具体地说，本发明也包括重组构建体，该构建体包含以上广泛描述的一种或多种序列。该构建体包含载体，如质粒或病毒的载体，其中已正向或方向插入了本发明的序列。在这一实施方案的更为理想的情况下，构建体还包括可有效连接到所述序列上的调节序列，包括，例如，启动子。大量适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是通过商业途径可获得的。以举例的方式给出下列载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它质粒或载体，只要它们在宿主中可复制和稳定，都可以使用。

可以用CAT(氯霉素转移酶的基因)载体或者其它带有选择性标记的载体从任何所需的基因选择启动子区。两种合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_L、和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和完全SV40、得自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-F。对适当的载体与启动子的选择健康在普通的技巧本领域的水平之内。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含以上所述构建体的宿主细胞。所说的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以由磷酸钙转染、DHAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔有效地将构建体引入到宿主细胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学中的基本方法，(1986))。

宿主细胞中的构建体可以用来以常规方式产生由重组序列编码的基因产物。此外，本发明的多肽可以由常规肽合成器合成产生。

成熟蛋白质可以在哺乳动物细胞，酵母，细菌，或适当的启动子的控制之下的其它细胞中表达，采用得自本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用来产生这种蛋白质。Sambrook等，分子克隆：实验室手册，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一并参考)描述了与原核和真核宿主一起使用合适的克隆和表达载体。

高等生物编码本发明的多肽的DNA的转录被插入到载体中的增强子序列增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用在启动子上增加其转录。例子包括复制起点后侧100至270bp上的猿猴病毒40增强子，细胞肥大病毒早期启动子增强子，复制起点后侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。

一般地，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞转化的选择性标记(例如，大肠杆菌啤酒糖酵母TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因)以及源于高表达基因的指导下游结构基因转录的启动子。这样的启动子可以是来自编码糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))，α-因子，酸性磷酸酶或热休克蛋白质等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始和终止序列装配，优选地，与能够指导翻译的蛋白质分泌进周质空间或细胞外培养基的前导序列装配。任选地，异源序列可以编码融合蛋白，包括赋予所需特征的N-末端鉴别肽，所需特征例如，表达的重组产物稳定或纯化简单。

通过在具有功能性启动子的可操作阅读相(operable reading phase)中插入合适的翻译起始和终止信号和编码所需蛋白质的结构DNA序列来构建用于细菌的有用的表达载体。所说载体包含一个或多个表型选择性标记和复制起点，以保证载体的保持和在合适时在宿主内提供扩增。适合转化的原核宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，假单胞菌属，链霉菌属，和葡萄球菌属的各个种，当然其它的也可以选择来使用。

作为一个代表性的但不是限制性的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含源于市售质粒(包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)的遗传元件)的选择性标记和细菌复制起点。这样的市售载体包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化学品公司，Vppsala，瑞典)和GEMl(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322″骨架″片段与适当的启动子和待表达的结构序列组合。

在合适的宿主菌株转化和合适的宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，用合适的方法(例如温度变换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞培养另外一段时间。

典型地经离心收获细胞，经物理或化学方法破碎细胞，保留所形成的粗产物用于进一步的纯化。

可以经任何常规的方法破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，所述方法包括冻结-解冻循环，超声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员知道的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组体蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括由Gluzman，细胞，23：175(1981)，描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系和其它能够表达相容载体的细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物的表达载体包括复制起点，适合的启动子和增强子，也可以包含任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可以用来提供所需的非转录遗传元件。

所说的DNA连接酶III多肽可以用多种方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和性层析、羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。需要时在完成成熟蛋白质的构型中可以使用蛋白质再折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)作为最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或化学合成方法的产物，经重组技术从原核或真核宿主(例如细菌，酵母，高等植物，培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生的。依据重组产生方法中使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。

DNA连接酶III多肽和以下描述的可以是多肽的兴奋剂和拮抗剂，可以依据本发明用于体内表达这样的多肽，这常被称作″基因治疗″。

这样，例如，可以对来自体内的病人细胞用编码多肽的多核苷酸(DNA或者RNA)进行基因工程操作，用工程细胞向被治疗的病人提供所说的多肽。这样的方法是本领域众所周知的。例如，可以经本领域公知的方法用包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒对细胞进行基因工程操作。

同样地，可以通过例如本领域已知的方法体内对细胞进行基因工程操作，以便体内表达多肽。如本领域已知的，可以将产生包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞施用给病人，以在体内对细胞进行基因工程处理和体内表达多肽。通过本发明的阐述，由这种方式施用本发明的多肽的这些和其它方法对本领域技术人员是显而易见的。例如，工程化细胞的载体可以不是逆转录病毒载体，如，在与合适的运送载体结合后，腺病毒可以用于体内工程化细胞。

一旦经基因治疗，DNA连接酶III多肽被胞内表达，则它就可以用于修复DNA-损害剂(如，UV辐射)产生的DNA单链间断。几种人综合症由DNA连接酶基因的正染色体隐性遗传引起。由于不修复DNA，这些综合症造成严重的免疫缺陷并极大地增加异常细胞分化的敏感性，而在细胞水平上，它们以染色体不稳定和对DNA-损害剂免疫过敏为特征。这些综合症包括范康尼氏贫血症和Blackfan-diamond贫血。

本发明的多肽也可以用于治疗严重的免疫抑制，所述免疫抑制是DNA连接酶III基因缺陷和发育障碍性生长以及淋巴瘤的结果，这种淋巴瘤导致DNA有缺陷的重新连接。

同样地，本发明的多核苷酸对鉴别具有类似的生物活性的其它分子来说也有用。筛选这样的分子的例子采用已知的DNA序列分离DNA连接酶III基因的编码区以合成寡核苷酸探针。具有与本发明的基因序列互补的序列的标记的寡核苷酸用于筛选人cDNA，基因组DNA或mRNA文库，以确定文库的哪一成员与探针杂交。

在有关的科学研究、DNA合成和DNA载体制造上也可以使用本发明的多肽和/或多核苷酸。本发明的多肽和/或多核苷酸可以出售到研究市场。这样，例如DNA连接酶III可以用于以类似于本领域其它连接酶的方式体外裂解DNA序列。

本发明也提供了筛选鉴别提高(刺激剂)或阻断(拮抗剂)由人DNA连接酶III纯化的DNA-连接反应的那些化合物的方法。这样的方法的一个例子包括将ATP、DNA连接酶III，具有单链间断处的DNA和被筛选的化合物组合，这种组合是在DNA连接酶IIII可以正常切割ATP成AMP，AMP转移进双链DNA中的单链间断的5’磷酸基末端以产生与后续被修复的单链间断的DNA-AMP复合物的条件下进行的。以上例子中的具有单链间断的DNA可以由对单链间断修复反应性的蛋白质缺损突变细胞供给，所述细胞例如XRCC1缺损的突变啮齿动物细胞和cdc9啤酒糖酵母DNA连接酶突变体。然后，可以测定提高或阻断这一反应的催化作用的化合物的能力，以确定所述化合物是否是有效的兴奋剂或拮抗剂。

人DNA连接酶III在胞内产生并在胞内发生作用，因此任何拮抗剂都必须是胞内的。人DNA连接酶III潜在的拮抗剂包括胞内产生的抗体。例如，被鉴别拮抗DNA连接酶III的抗体可以用本领域已知的方法作为信号链抗体产生，所述方法例如用编码单链抗体的DNA转化合适的细胞，以阻止人DNA连接酶III的功能。

另一个潜在的拮抗剂是采用反义技术制备的反义构建体，反义技术可以用于通过三螺旋形成或反义DNA或者RNA控制基因表达，两种方法都基于多核苷酸结合DNA或者RNA。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用来设计长度约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。一种DNA寡核苷酸被设计成与转录所涉及的基因区互补(三螺旋-参见Lee等，核酸研究，6：3073(1979)；Cooney等，科学，291：456(1988)；和Dervan等，科学，251：1360(1991))，进而阻止转录和DNA连接酶III的产生。反义RNA体内寡核苷酸杂交到mRNA上，并阻断mRNA分子翻译成为DNA连接酶III(反义-Okano，J.Neurochem.，56：560(1991)；寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以传送到细胞中，以便可以体内表达反义RNA和DNA，抑制DNA连接酶III的产生。

另一中潜在的拮抗剂包括DNA连接酶III的突变形式或突变蛋白，其识别DNA但不修复单链间断，因此，阻止人DNA连接酶III起作用。

所说的拮抗剂可以用于靶向不需要的细胞，例如，癌细胞，由于DNA连接酶III的阻止作用阻止DNA中的单链间断的修复，最终将导致细胞的死亡。

本发明的小分子兴奋剂和拮抗剂可以与合适的药物载体组合使用。这样的组合物包括治疗的有效量所述分子和药学上可接受的载体或者赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，右旋糖，水，甘油，乙醇，和它们的组合。配方应该适宜于施用的方式。

本发明也提供了药物包或试剂盒，它们包含一个或多个填装有本发明的药物组合物的一种或多种成份的容器。附在这种容器中的可以是管理药物和生物制品制造、使用或销售的政府机构所规定的告示，这一告示反映出制造、使用或销售该药供人类使用得到政府机构的同意。此外，本发明的药物组合物可以与其它治疗化合物结合使用。

所述药物组合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口服，局部，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，鼻内或真皮内途径施用。所说的药物组合物以治疗和/或预防特定疾病的有效量施用。一般来说，它们以至少大约10微克/千克体重的量施用，在大多数情况下，它们以不超过每天大约8毫克/千克体重的量施用。在大多数情况之下，剂量从每日大约10微克/千克到1毫克/千克体重，考虑用药途径和病症等因素。

全长人DNA连接酶III基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针，用来分离全长DNA连接酶III基因和与DNA连接酶III基因有高度的序列相似性的其它基因。这种类型的探针可以是，例如，30，40，50，75，90，100或150个碱基。然而，优选的探针具有在30和50个碱基对。所说的探针也可以用于鉴别相应于与全长转录物和基因组克隆或包含包括调节和启动子区、外显子和内含子之内的完全基因的克隆之cDNA克隆。所说的探针也可以用例如放射性标记，以利于杂交鉴别。

本发明也提供了人DNA连接酶III基因作为诊断剂的用途。例如，一些疾病引起遗传缺陷基因。这些基因可以通过把有缺陷的基因与正常的基因比较来检测。即，突变基因与对DNA-损害剂的过敏性和对异常细胞生长(例如肿瘤和癌)的提高的敏感性相关。

可以用各种技术在DNA水平上检测人DNA连接酶III基因中具有突变的个体。可以从病人的细胞(如血液，尿，唾液，组织活组织检查和尸体解剖材料)获得用于诊断的核酸。基因组DNA可以直接用于检测，或者在分析前用PCR酶促扩增(Saiki等，自然，324：163-166(1986))。RNA或者cDNA也可以用于相同的目的。可以通过与正常遗传型比较扩增产物大小的变化检测缺失或者插入。点突变可以经将扩增的DNA与放射性标记的DNA连接酶III RNA或者放射性标记的DNA连接酶III反义DNA序列杂交鉴别。通过核糖核酸酶A消化，或者从解链温度的不同辨别完美配对的序列和错配双链体。

可以通过检测在有或没有变性剂时凝胶上DNA片段电迁移率的改变进行基于DNA序列差异的遗传试验。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示出。不同序列的DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上区别，其中不同的DNA片段的迁移按照其特定的解链或部分解链温度停留在凝胶的不同位置(参见，例如，Myers等，科学，230：1242(1985))。

也可以由核酸酶保护测定法揭示特定位置上的序列变化，所述测定法如核糖核酸酶保护和Sl保护以及化学裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美国，85：4397-4401(1985))。

这样，可以由以下方法检测特定DNA序列，所述方法例如杂交，核糖核酸酶保护，化学裂解，直接DNA测序，或使用限制酶(例如，限制片段长度多态性)和基因组DNA的Southern印迹法。也可以经原位分析检测突变。

此外，某些疾病是被mRNA改变指导的基因表达的改变的结果或者以其为特征。另外，DNA连接酶III基因可以用作通过例如，Northern印迹法鉴别个体降低的DNA连接酶III蛋白质的水平的参照。

本发明的序列对染色体鉴别也有价值。所说的序列特异性地导向单个人染色体的特定位置，并与之杂交。此外，目前也需要鉴别染色体上的特定位点。目前仅有极少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记试剂可用来标记染色体位置。在关联与疾病有关的那些序列中，按照本发明的染色体的cDNA作图是重要的第一步。

简言之，可以通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)将序列定位于染色体。对cDNA的计算机分析用来迅速选择引物，该引物不跨越一个以上的基因组DNA中的外显子，这样使扩增方法复杂化。然后，这些引物用于PCR筛选包含单独的人染色体的体细胞杂种。仅包含相应于引物的人基因的那些杂种产生扩增片段。

体细胞杂种的PCR作图是将特定DNA定位到特定染色体的快速方法。本发明采用相同的寡核苷酸引物，可以由一组特定染色体的片段或一组大的基因组克隆以类似的方式获得亚定位。其它作图策略可以类似地用于对其染色体作图，所述策略包括原位杂交、用标记的流式分选染色体预筛选和经杂交预选择构建染色体特异性-cDNA文库。

中期染色体涂片与cDNA克隆的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步染色体定位。这一技术可以与短至500或000碱基的cDNA一起使用；然而，比2,000bp更大的克隆有结合到独特染色体位置，并具有使检测简单所需的足够信号强度的更大的可能性。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2,000bp是好的，4,000是更好的，超过4,000对获得好的结果时间的合理的百分比很可能是不必要的。这种技术的综述，参见Verma等，人染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列精确定位于染色体位置，染色体上的序列的物理位置就可以与遗传图数据关联。这样的数据可以在例如V.McKusick，在人中的孟德尔式遗传(可联机到JohnsHopkins大学Welch医学图书馆上使用)中找到。然后，基因和已对相同的染色体区作图的疾病之间的相互关系经链分析(物理邻近基因的共遗传)鉴别。本发明的基因定位于染色体13q33-34。

接着，有必要确定感染和未感染个体之间cDNA或者基因组序列中的不同。如果在某些或全部感染个体中观察到突变，但在任何正常个体中观察不到，则，所述的突变很可能是疾病的病因。

采用现有分辨率的物理作图和遗传作图技术，精确定位到与疾病相关的染色体区上的cDNA是50-500个致病性基因中的一个(这假定1兆碱基作图分辨率，每20kb一个基因)。

所说的多肽，其片段或衍生物或类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原由此产生抗体。这些抗体可以是例如，多克隆或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链和人化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域中已知的各种方法可以用于产生这样的抗体和片段。

可以通过对动物直接注射多肽或者对动物(优选的是非人动物)施用多肽可以获得针对相应于本发明的序列的多肽的抗体。然后如此获得的抗体结合多肽本身。按这种方式，即使是编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合完整天然多肽的的抗体。这种抗体可以用于从表达多肽的组织中分离多肽。

对于单克隆抗体的制备，可以使用任何通过传代细胞系培养物产生抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，自然，256：495-497)、三瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，当今免疫学，4：72)和产生人单克隆抗体的EB病毒-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体和癌疗法，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

有关产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可以采用来生产针对本发明的免疫原性多肽的单链抗体。

将进一步参照以下实施例描述本发明，然而应该清楚本发明不限于这些实施例。除非特别指明，所有份或量均指重量。

为了有利于理解下列实施例，以下描述一些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”由前面的小写p和/或后续的大写字母和/或数字命名。本文的起始质粒是市售的、无限制的公众可获得的或者是可以按已出版的方法从可获得的质粒构建的。此外，所描述的质粒的等同质粒在本领域中是已知的，对普通技术人员是显而易见的。

DNA的″消化″指以限制性内切酶催化切割DNA，这种限制性内切酶在DNA中仅作用在一定的序列上。本发明所有的各种限制酶是市售的，普通技术人员了解使用它们的反应条件，辅因子和其它需要。就分析目的而言，典型地是在约20微升缓冲液中使用1微克质粒或DNA片段以及约2单位的酶。就分离DNA片段构建质粒而言，典型地是在较大体积中用20至250单位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所采用的缓冲液和底物的量由制造者规定。通常使用37℃下的约1小时的温育时间，但可以按照供应者的说明变化。在消化之后，反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需的片段。

用Goeddel等，核酸研究，8：4057(1980)描述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行切割片段的大小分离。

″寡核苷酸″指单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链，其可以是化学合成的。这样的合成的寡核苷酸没有5’磷酸基，同时在激酶存在下不添加磷酸盐与ATP时，其就不连接另一个寡核苷酸。合成的寡核苷酸将连接到没有去磷酸化的片段。

″连接″指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，Id，p.145)。除非提供其它方式，可以采用已知缓冲液和条件用每0.5微克大约等摩尔量的待连接的DNA片段10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)进行连接。

除非有其它说明，如Graham，F.和van der Eb，A.，病毒学，52：456-457(1973)的描述进行转化。

实施例1

DNA连接酶III的细菌表达和纯化

用相应于加工过的DNA连接酶III蛋白质的5’序列的PCR寡核苷酸引物起始扩增编码DNA连接酶III的DNA序列，ATCC#75880。所说的5’寡核苷酸引物具有序列5’GCGGGATCCATGAGACTAATTCTTCCTCAG 3’，含有Bam HI限制性内切酶位点(下划线)，其后为DNA连接酶III编码序列(从假定的加工的蛋白质密码子的末端氨基酸开始)的21个核苷酸。3’序列5’GCGCTGCAGTTAAATCAAATACTGGTTTTG 3’含有PstI位点互补序列(下划线)，其后为DNA连接酶III C-末端上的DNA连接酶III的21个核苷酸。限制性内切酶位点相应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen，C.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)上的选择性内切酶位点。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)，细菌复制起点(ori)的和IPTG-调节启动子操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6组氨酸标记和限制性内切酶位点。然后用BamHI和PstI消化pQE-9。将扩增序列连接进pQE-9，并插入进具有组氨酸标记和RBS的序列的读框中。按SambrookJ.等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1989)中描述的方法用连接混合物转化大肠杆菌菌株M15/rip 4(可从Qiagen以M15/rip 4商标获得)。M15/rep 4包含质粒pR6P4的多个拷贝，所说质粒表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kan1)。依据它们在LB平板上的生长能力鉴别转化体，并选择氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA，并且通过限制分析确认。在补充有氨苄青霉素(100ug/毫升)和Kan(25ug/毫升)两者的LB培养基的液体培养中培养包含所需构建体的克隆一夜(O/N)。所说的O/N培养物用来以1∶100到1∶250的比率接种大量培养物。使细胞生长至0.4和0.6之间的光密度600(O.D.⁶⁰⁰)。添加IPTG(异丙基-B-D-硫代葡萄糖吡喃糖苷)至终浓度1mM。IPTG诱导通过失活lacI阻遏物，清除P/O导致增加的基因表达。将细胞培养另外的3至4小时。然后由离心收获细胞。细胞沉淀在离液剂6摩尔盐酸胍中溶解。离心后，溶解蛋白质提取物在镍螯合柱上在允许包含6-组氨酸标记的蛋白质紧密结合的条件下(Hochuli，E.等，层析学杂志，411：177-184(1984))经层析从所说溶液中纯化，以6摩尔盐酸胍pH值5.0(和为了再变性目的，调节至3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠，10mM谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型))从柱上洗脱。在这种溶液中温育12小时后，将蛋白质对10mM磷酸钠透析。

实施例2

采用杆状病毒表达系统克隆和表达DNA连接酶III

采用相应于基因5’和3’序列的寡核苷酸引物扩增编码全长DNA连接酶III蛋白质的DNA序列，ATCC#75880：

5’引物具有序列5’GCGCCCGGGATGAGACTAATTCTTCTCCAG 3’，包含SmaI限制性内切酶位点(粗体)，其后首先为装配真核细胞中翻译起始有效信号的21个核苷酸(Kozak，M.，分子生物学杂志，196：947-950，(1987))(翻译起始密码子″ATG″下划线)。

3’引物具有序列5’GCGGGTACCTTAAATCAAA TACTGGTTTTC 3’，包含限制性核酸内切酶Asp718切割位点(粗体)和与DNA连接酶III基因的C末端序列互补的21个核苷酸。用市售的试剂盒(“Geneclean” BIO101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离扩增序列。然后用核酸内切酶SmaI和Asp718消化该片段，再次在1％琼脂糖凝胶上纯化。这一片段指定为F2。

使用载体pRG1(pVL941载体的修饰物，下面讨论)采用杆状病毒表达系统表达DNA连接酶III蛋白质(综述参见：Summers，MD和Smith，G.E.1987，用于杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法手册，得克萨斯农业试验站公报1555)。这一表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体启动子，接着是限制性核酸内切酶Sma I与Asp718的识别位点。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组体病毒，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子相同的方向插入到多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号后。多角体蛋白序列两侧是共转染野生型病毒的细胞介导同源重组的病毒序列。许多其它杆状病毒载体可以用于替代pRG1，例如pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summers，M.D.，病毒学，170：31-39)。

然后，质粒用限制酶SmaI和Asp718消化，并按本领域已知的方法用小牛小肠磷酸酶脱磷酸化。使用市售试剂盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离所说的DNA。这一载体DNA指定为V2。

片段V2和脱磷酸化质粒V2用T4 DNA连接酶连接。然后转化大肠杆菌HB101细胞，用酶SmaI与Asp718鉴别包含具有DNA连接酶III基因的质粒(pBac DNA连接酶III)的细菌。通过DNA测序确认克隆片段的序列。

用脂转染法(Felgner等，美国科学院学报，84：7413-7417(1987))将5微克质粒pBac DNA连接酶III用1.0微克市售的线性杆状病毒(″BaculoGoldTM杆状病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。

将1微克BaculoGoldTM病毒DNA和5微克质粒pBac DNA连接酶III在含有50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中混合。添加10微升Lipofectin和90微升Grace’s的培养基后，混合并于室温下培养15分钟。然后将转染混合物逐滴添加到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL1711)中，所说细胞接种在具有无血清Grace’s培养平板上。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后将平板在27℃下培养5小时。5小时后，从平板除去转染溶液，添加1微升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。把平板放回到温箱，在27℃下连续培养4天。

4天后，收集上清液，用类似Summers和Smith(同上)所述的方法进行噬斑测定。作为一种改变，使用具有“Blue Gal”的琼脂糖凝胶(Life Technologies公司，Gaithersburg)，其使得易于分离染蓝的噬斑。(″噬斑测定″的详尽的描述也可以在LifeTechnologies公司(Gaithersburg)发布的昆虫细胞培养和杆状病毒学用户指南9-10页中找到)。

四天后，将系列稀释的病毒添加到细胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染蓝的噬斑。然后将包含重组病毒的琼脂重悬于包含200微升Grace’s培养基的Eppendcrf管中。经简短离心除去琼脂，将包含重组杆状病毒的上清液用于感染接种到35毫米培养皿中的Sf9细胞。4天后，收获这些培养皿中的上清液，于4℃贮存。

将Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace’培养基中生长。在感染复数(MOI)2下用重组杆状病毒V-DNA连接酶III感染细胞。6小时后，除去培养基，用SF900 II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(Life Technologies公司，Gaithersburg)替代。42小时后，添加5μCi³⁵S甲硫氨酸和5μCi³⁵S半胱氨酸(Amersham)。在经离心收获之前，进一步培养细胞16小时，标记蛋白质经SDS-PAGE和放射自显影显示出。

实施例3

重组DNA连接酶III在COS细胞中的表达

质粒，DNA连接酶III HA的表达来源于载体pcDNAI Amp(Invitrogen)，所述载体包含：1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起点，4)CMV启动子，接着是多接头区、SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整的DNA连接酶III前体的DNA片段和融合进其3’末端读框的HA标记克隆进载体的多接头区。由此，重组蛋白质的表达在CMV启动子指导下。HA标记相应于以前描述(I.Wilson，HNiman，R Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，细胞，37：767(1984))的源于流感血细胞凝集素蛋白质的表位。HA标记注入到我们的靶蛋白中使得易于用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。

所说的质粒构建策略描述如下：

经在克隆的原始EST上的PCR构建编码DNA连接酶III的序列，ATCC#75880，其中使用两种引物：5’引物5’GCGGAATTCATGAGACTAATTCTTCC TCAG 3’包含Eco RI位点(下划线)，其后为从起始密码子开始的DNA连接酶III编码序列的21个核苷酸，3’序列5’GCGCTCGAGTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAATCAAATACTGGTTTTGTTC 3’包含XhoI位点(下划线)的互补序列，翻译终止密码子，HA标记和DNA连接酶III编码序列的最后21核苷酸(不包括终止密码子)。因此，PCR产物包含EcoRI位点，DNA连接酶III编码序列，接着是融合进读框的HA标记，HA标记相邻的终止密码子和XhoI位点。用Eco RI和XhoI限制性内切酶消化PCR扩增DNA片段和载体，pcDNAI/Amp，并连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株SURE(从Stratagene Cloning Systems，11099 NorthTorrey Pines Road，La Jolla，CA 92037获得)，将转化的培养物平板接种到氨苄青霉素培养基平板，选择抗性克隆。从转化体分离质粒DNA，并经限制性分析检查正确片段的存在。为了表达重组DNA连接酶III，经DEAE-DEXTRAN方法(J.Sambraok，EFritsch，T.Maniatis，分子克隆：实验室手册，冷泉实验室出版社，(1989))用表达载体转染COS细胞。用放射性标记和免疫沉淀法(EHarlow，D.Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1988))检测DNA连接酶III HA蛋白质的表达。细胞用35S-半胱氨酸标记，两天后转染。收集培养物，用去垢剂(RIPA缓冲液(150mMNaCl，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH值7.5)Wilson，I.等，ID.37：767(1984))裂解细胞。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解物和培养物两者。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。

实施例4

DNA连接酶III在人组织中的表达模式

可以进行Northern印迹以检查在人组织中DNA连接酶的表达水平。用RNAzol^TMB系统(Biotecx实验室，Inc.6023 South Loop East，Houston，，TX 77033)分离总细胞RNA样品。从各特异性人组织分离的约15微克总RNA在1％琼脂糖凝胶上分离并印迹到尼龙滤膜(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，分子克隆，冷泉港出版社，(1989))上。按照Stratagene Prime-It试剂盒的说明用50ngDNA片段标记反应。标记的DNA用Slect-G-50柱(5 Prime-3 Prime，Inc.5603 Arapafioe Road，Boulder，CO 80303)纯化。于65℃在0.5M NaPO₄，pH7.4和7％SDS中将包含特定RNA印迹的滤膜与放射性标记的全长DNA连接酶III基因(1,000,000cpm/毫升)杂交过夜。在用0.5×SSC，0.1％SDS于室温洗涤两次，60℃洗涤两次后，将滤膜置于-70℃增感屏下过夜。在胸腺，精巢和心脏中RNA和DNA连接酶III的mRNA丰富(参见图3)。

通过以上教导，本发明的许多修改和变化是可能的，这些修改和变化因而在本发明所附权利要求的范围内，本发明可以用不同于以上具体描述的方式来实施。序列表(1)一般信息：(i)申请人：WEI，Y.(ii)发明名称：人DNA连接酶III(iii)序列数：2(iv)通讯地址：

(A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，

CECCHI，STEWART和OLSTEIN

(B)街道：6 BECKER FARM ROAD

(C)城市：ROSELAND

(D)州：新泽西州

(E)国家：美国

(F)ZIP：07068(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：3.5英寸磁盘

(B)计算机：IBMPS/2

(C)操作系统：MS-DOS

(D)软件：WORD PERFECT 5.1(vi)当前的申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：(Vii)在先申请的数据

(A)申请号：

(B)申请日：(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

(B)登记号：36,134

(C)证书号：325800-229(ix)电信信息：

(A)电话：201994-1700

(B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1：信息(i)序列特征

(A)长度：3325个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCACAGCGCT GTAGACTGCG CCGCATTAGA AGCCTGGCCT CCTGATGCTG TGCTCTTCAT 60CTAGACCCAA GCCCCAGGTC GTGGGACGAT TTCTCCCGTT TTTGACTCCC TGGAACTGTA 120TTGCCTGCTT TACCTGCGTA CATGTTGATT CTTTCTCATG GCAACCCCGC AGGAAACCAT 180CAAGATCTCA TTTTACAGCT GGGATTCTCT GGTTCACAGA GGTAACGGAG CTTGCCCGAG 240GCCAGTTAAA CGAGAAGATT CATCACCGCT TTGATGGCTG CCTCACAAAC TTCACAAACT 300GTTGCATCTC ACGTTCCTTT TCGAGATTTG TGTTCAACTT TAGAACGAAT ACAGAAAAGT 360AAAGGACGTG CAGAAAAAAT CAGACACTTC AGGGAATTTT TAGATTCTTG GAGAAAATTT 420CATGATGCTC TTCATAAGAA CCACAAAGAT GTCACAGACT CTTTTTATCC AGCAATGAGA 480CTAATTCTTC CTCAGCTAGA AAGAGAGAGA ATGGCCTATG GAATTAAAGA AACTATGCTT 540GCTAAGCTTT ATATTGAGTT GCTTAATTTA CCTAGAGATG GAAAAGATGC CCTCAAACTT 600TTAAACTACA GAACACCCAC TGGAACTCAT GGAGATGCTG GAGACTTTGC AATGATTGCA 660TATTTTGTGT TGAAGCCAAG ATGTTTACAG AAAGGAAGTT TAACCATACA GCAAGTAAAC 720GACCTTTTAG ACTCAATTGC CAGCAATAAT TCTGCTAAAA GAAAAGACCT AATAAAAAAG 780AGCCTTCTTC AACTTATAAC TCAGAGTTCA GCACTTGAGC AAAAGTGGCT TATACGGATG 840ATCATAAAGG ATTTAAAGCT TGGTGTTAGT CAGCAAACTA TCTTTTCTGT TTTTCATAAT 900GATGCTGCTG AGTTGCATAA TGTCACTACA GATCTGGAAA AAGTCTGTAG GCAACTGCAT 960GATCCTTCTG TAGGACTCAG TGATATTTCT ATCACTTTAT TTTCTGCATC AAAACCAATG 1020CTAGCTGCTA TTGCAGATAT TGAGCACATT GAGAAGGATA TGAAACATCA GAGTTTCTAC 1080ATAGAAACCA AGCTAGATGG TGAACGTATG CAAATGCACA AAGATGGAGA TGTATATAAA 1140TACTTCTCTC GAAATGGATA TAACTACACT GATCAGTTTG GTGCTTCTCC TACTGAAGGT 1200TCTCTTACCC CATTCATTCA TAATGCATTC AAAGCAGATA TACAAATCTG TATTCTTGAT 1260GGTGAGATGA TGGCCTATAA TCCTAATACA CAAACTTTCA TGCAAAAGGG AACTAAGTTT 1320GATATTAAAA GAATGGTAGA GGATTCTGAT CTGCAAACTT GTTATTGTGT TTTTGATGTA 1380TTGATGGTTA ATAATAAAAA GCTAGGGCAT GAGACTCTGA GAAAGAGGTA TGAGATTCTT 1440AGTAGTATTT TTACACCAAT TCCAGGTAGA ATAGAAATAG TGCAGAAAAC ACAAGCTCAT 1500ACTAAGAATG AAGTAATTGA TGCATTGAAT GAAGCAATAG ATAAAAGAGA AGAGGGAATT 1560ATGGTAAAAC AACCTCTATC CATCTACAAG CCAGACAAAA GAGGTGAAGG GTGGTTAAAA 1620ATTAAACCAG AGTATGTCAG TGGACTAATG GATGAATTGG ACATTTTAAT TGTTGGAGGA 1680TATTGGGGTA AAGGATCACG GGGTGGAATG ATGTCTCATT TTCTGTGTGC AGTAGCAGAG 1740AAGCCCCCTC GTGGTGAGAA GCCATCTGTG TTTCATACTC TCTCTCGTGT TGGGTCTGGC 1800TGCACCATGA AAGAACTGTA TGATCTGGGT TTGAAATTGG CCAAGTATTG GAAGCCTTTT 1860CATAGAAAAG CTCCACCAAG CAGCATTTTA TGTGGAACAG AGAAGCCAGA AGTATACATT 1920GAACCTTGTA ATTCTGTCAT TGTTCAGATT AAAGCAGCAG AGATCGTACC CAGTGATATG 1980TATAAAACTG GCTGCACCTT GCGTTTTCCA CGAATTGAAA AGATAAGAGA TGACAAGGAG 2040TGGCATGAGT GCATGACCCT GGACGACCTA GAACAACTTA GGGGGAAGGC ATCTGGTAAG 2100CTCGCATCTA AACACCTTTA TATAGGTGGT GATGATGAAC CACAAGAAAA AAAGCGGAAA 2160GCTGCCCCAA AGATGAAGAA AGTTATTGGA ATTATTGAGA ACTTAAAAGC ACCTAACCTT 2220AACTAACGTA ACAAAATTTC TAATATATTT GAAGATGTAG AGTTTTGTGT TATGAGTGGA 2280ACAGATAGCC AGCCAAAGCC TGACCTGGAG AACAGAATTG CAGAATTTGG TGGTTATATA 2340GTACAAAATC CAGGCCCAGA CACGTACTGT GTAATTGCAG GGTCTGAGAA CATCAGAGTG 2400AAAAACATAA TTTTGTCAAA TAAACATGAT GTTGTCAAGC CTGCATGGCT TTTAGAATGT 2460TTTAAGACCA AAAGCTTTGT ACCATGGCAG CCTCGCTTTA TGATTCATAT GTGCCCATCA 2520ACCAAAGAAC ATTTTGCCCG TGAATATGAT TGCTATGGTG ATAGTTATTT CATTGATACA 2580GACTTGAACC AACTGAAGGA AGTATTCTCA GGAATTAAAA ATTCTAACGA GCAGACTCCT 2640GAAGAAATGG CTTCTCTGAT TGCTGATTTA GAATATCGGT ATTCCTGGGA TTGCTCTCCT 2700CTCAGTATGT TTCGACGCCA CACCGTTTAT TTGGACTCGT ATGCTGTTAT TAATGACCTG 2760AGTACCAAAA ATGAGGGGAC AAGGTTAGCT ATTAAA CCT TGGAGCTTCG GTTTCATGGA 2820GCAAAAGTAG TTTCTTGTTT AGCTGAGGGA GTGTCTCATG TAATAATTGG GGAAGATCAT 2880AGTCGTGTTG CAGATTTTAA AGCTTTTAGA AGAACTTTTA AGAGAAAGTT TAAAATCCTA 2940AAAGAAAGTT GGGTAACTGA TTCAATAGAC AAGTGTGAAT TACAAGAAGA AAACCAGTAT 3000TTGATTTAAA GCTAGGTTTC CTAGTGAGGA AAGCCTCTGA TCTGGCAGAC TCATTGCAGC 3060AGGTGGTAAT GATAAAATAC TAAACTACAT TTTATTTTTG TATCTTAAAA ATCTATGCCT 3120AAAAAGTATC ATTACATATA GGAAAACAAT AATTTTAACT TTTAAGGTTG AAAAGACAAT 3180AGCCCAAAGC CAAGAAAGAA AAATTATCTT GAATGTAGTA TTCAATGATT TTTTATGATC 3240AAGGTGAAAT AAACAGTCTA AAGAAGAGGT GTTTTTATAA TATCCATATA GAAATCTAGA 3300ATTTTTACTT AGATACTAAT AAAAT 3325(2)SEQ ID NO：2：信息(i)序列特征

(A)长度：910个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Ala Ser Gln Thr Ser Gln Thr Val Ala Ser His Val Pro

5 10 15Phe Ala Asp Lys Cys Ser Thr Leu Glu Arg Ile Gln Lys Ser Lys

20 25 30Gly Arg Ala Glu Lys Ile Arg His Phe Arg Glu Phe Leu Asp Ser

35 40 45Trp Arg Lys Phe His Asp Ala Leu His Lys Asn His Lys Asp Val

50 55 60Thr Asp Ser Phe Tyr Pro Ala Met Arg Leu Ile Leu Pro Gln Leu

65 70 75Glu Arg Glu Arg Met Ala Tyr Gly Ile Lys Glu Thr Met Leu Ala

80 85 90Lys Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Asn Leu Pro Arg Asp Gly Lys Asp

95 100 105Ala Leu Lys Leu Leu Asn Tyr Arg Thr Pro Thr Gly Thr His Gly

110 115 120Asp Ala Gly Asp Phe Ala Met Ile Ala Tyr Phe Val Leu Lys Pro

125 130 135Arg Cys Leu Gln Lys Gly Ser Leu Thr Ile Gln Gln Val Asn Asp

140 145 150Leu Leu Asp Ser Ile Ala Ser Asn Asn Ser Ala Lys Arg Lys Asp

155 160 165Leu Ile Lys Lys Ser Leu Leu Gln Leu Ile Thr Gln Ser Ser Ala

170 175 180Leu Glu Gln Lys Trp Leu Ile Arg Met Ile Ile Lys Asp Leu Lys

185 190 195Leu Gly Val Ser Gln Gln Thr Ile Phe Ser Val Phe His Asn Asp

200 205 210Ala Ala Glu Leu His Asn Val Thr Thr Asp Leu Glu Lys Val Cys

215 220 225Arg Gln Leu His Asp Pro Ser Val Gly Leu Ser Asp Ile Ser Ile

230 235 240Thr Leu Phe Ser Ala Ser Lys Pro Met Leu Ala Ala Ile Ala Asp

245 250 255Ile Glu His Ile Glu Lys Asp Met Lys His Gln Ser Phe Tyr Ile

260 265 270Glu Thr Lys Leu Asp Gly Glu Arg Met Gln Met His Lys Asp Gly

275 280 285Asp Val Tyr Lys Tyr Phe Ser Arg Asn Gly Tyr Asn Tyr Thr Asp

290 295 300Gln Phe Gly Ala Ser Pro Thr Glu Gly Ser Leu Thr Pro Phe Ile

305 310 315His Asn Ala Phe Lys Ala Asp Ile Gln Ile Cys Ile Leu Asp Gly

320 325 330Glu Met Met Ala Tyr Asn Pro Asn Thr Gln Thr Phe Met Gln Lys

335 340 345Gly Thr Lys Phe Asp Ile Lys Arg Met Val Glu Asp Ser Asp Leu

350 355 360Gln Thr Cys Tyr Cys Val Phe Asp Val Leu Met Val Asn Asn Lys

365 370 375Lys Leu Gly His Glu Thr Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Ile Leu Ser

380 385 390Ser Ile Phe Thr Pro Ile Pro Gly Arg Ile Glu Ile Val Gln Lys

395 400 405Thr Gln Ala His Thr Lys Asn Glu Val Ile Asp Ala Leu Asn Glu

410 415 420Ala Ile Asp Lys Arg Glu Glu Gly Ile Met Val Lys Gln Pro Leu

425 430 435Ser Ile Tyr Lys Pro Asp Lys Arg Gly Glu Gly Trp Leu Lys Ile

440 445 450Lys Pro Glu Tyr Val Ser Gly Leu Met Asp Glu Leu Asp Ile Leu

455 460 465Ile Val Gly Gly Tyr Trp Gly Lys Gly Ser Arg Gly Gly Met Met

470 475 480Ser His Phe Leu Cys Ala Val Ala Glu Lys Pro Pro Pro Gly Glu

485 490 495Lys Pro Ser Val Phe His Thr Leu Ser Arg Val Gly Ser Gly Cys

500 505 510Thr Met Lys Glu Leu Tyr Asp Leu Gly Leu Lys Leu Ala Lys Tyr

515 520 525Trp Lys Pro Phe His Arg Lys Ala Pro Pro Ser Ser Ile Leu Cys

530 535 540Gly Thr Glu Lys Pro Glu Val Tyr Ile Glu Pro Cys Asn Ser Val

545 550 555Ile Val Gln Ile Lys Ala Ala Glu Ile Val Pro Ser Asp Met Tyr

560 565 570Lys Thr Gly Cys Thr Leu Arg Phe Pro Arg Ile Glu Lys Ile Arg

575 580 585Asp Asp Lys Glu Trp His Glu Cys Met Thr Leu Asp Asp Leu Glu

590 595 600Gln Leu Arg Gly Lys Ala Ser Gly Lys Leu Ala Ser Lys His Leu

605 610 615Tyr Ile Gly Gly Asp Asp Glu Pro Gln Glu Lys Lys Arg Lys Ala

620 625 630Ala Pro Lys Met Lys Lys Val Ile Gly Ile Ile Glu His Leu Lys

635 640 645Ala Pro Asn Leu Thr Asn Val Asn Lys Ile Ser Asn Ile Phe Glu

650 655 660Asp Val Glu Phe Cys Val Met Ser Gly Thr Asp Ser Gln Pro Lys

665 670 675Pro Asp Leu Glu Asn Arg Ile Ala Glu Phe Gly Gly Tyr Ile Val

680 685 690Gln Asn Pro Gly Pro Asp Thr Tyr Cys Val Ile Ala Gly Ser Glu

695 700 705Asn Ile Arg Val Lys Asn Ile Ile Leu Ser Asn Lys His Asp Val

710 715 720Val Lys Pro Ala Trp Leu Leu Glu Cys Phe Lys Thr Lys Ser Phe

725 730 735Val Pro Trp Gln Pro Arg Phe Met Ile His Met Cys Pro Ser Thr

740 745 750Lys Glu His Phe Ala Arg Glu Tyr Asp Cys Tyr Gly Asp Ser Tyr

755 760 765Phe Ile Asp Thr Asp Leu Asn Gln Leu Lys Glu Val Phe Ser Gly

770 775 780Ile Lys Asn Ser Asn Glu Gln Thr Pro Glu Glu Met Ala Ser Leu

785 790 795Ile Ala Asp Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Trp Asp Cys Ser Pro Leu

800 805 810Set Met Phe Arg Arg His Thr Val Tyr Leu Asp Ser Tyr Ala Val

815 820 825Ile Asn Asp Leu Ser Thr Lys Asn Glu Gly Thr Arg Leu Ala Ile

830 835 840Lys Ala Leu Glu Leu Arg Phe His Gly Ala Lys Val Val Ser Cys

845 850 855Leu Ala Glu Gly Val Ser His Val Ile Ile Gly Glu Asp His Ser

860 865 870Arg Val Ala Asp Phe Lys Ala Phe Arg Arg Thr Phe Lys Arg Lys

875 880 885Phe Lys Ile Leu Lys Glu Ser Trp Val Thr Asp Ser Ile Asp Lys

890 895 900Cys Glu Leu Gln Glu Glu Asn Gln Tyr Leu Ile

905 910

Claims

1.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(a)编码具有图1的推断的氨基酸序列的多肽或者所说多肽的片段，类似物或衍生物之多核苷酸；

(b)编码具有由包含在ATCC 75880中的cDNA编码的氨基酸序列的多肽或者所说多肽的片段，类似物或衍生物之多核苷酸。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA，

3.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。

4.权利要求1的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是基因组DNA。

5.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有图1的推断的氨基酸序列的多肽。

6.权利要求2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由ATCC 75880 cDNA编码的多肽。

7.权利要求1的多核苷酸，其具有图1所示多肽的编码序列。

8.权利要求2的多核苷酸，其具有以ATCC保藏号75880保藏的多肽的编码序列。

9.一种包含权利要求2之DNA的载体。

10.一种用权利要求9的载体遗传工程化的宿主细胞。

11.一种产生多肽的方法，该方法包括：从权利要求10的宿主细胞表达所说DNA编码的多肽。

12.一种产生能够表达多肽之细胞的方法，该方法包括用权利要求9的载体遗传工程化细胞。

13.一种分离的DNA，其可以与权利要求2的DNA杂交，并编码具有DNA连接酶III活性的多肽。

14.一种多肽，该多肽选自下组：

(I)具有图1的推断的氨基酸序列的多肽及其片段，类似物和衍生物；

(II)具有由ATCC 75880 cDNA编码的氨基酸序列的多肽及其片段，类似物和衍生物。

15.权利要求14的多肽，其中所说的多肽具有图1的推断的氨基酸序列。

16.一种针对权利要求14的多肽的抗体。

17.一种针对权利要求14的多肽的拮抗剂。

18.一种用于治疗需要DNA连接酶III活性的病人的方法，该方法包括：通过给病人提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽来给病人施用治疗有效量的权利要求14的多肽。

19.一种用于治疗需要抑制DNA连接酶III的病人的方法，该方法包括：给病人施用治疗有效量的权利要求17的拮抗剂。

20.权利要求19的方法，其中所说的拮抗剂是通过给病人提供编码所说拮抗剂的DNA并在体内表达所说的拮抗剂施用的。

21.一种用于鉴别拮抗剂和兴奋剂的方法，该方法包括：

将DNA连接酶III，具有单链间断处的DNA和被筛选的化合物组合，这种组合是在单链间断处通过DNA连接酶III可以修复的条件下进行的；和

检测所说的化合物是否增强或阻断所说的修复。

22.一种用于在病人中诊断异常细胞增殖和异常细胞增殖易感性的方法，该方法包括：在得自病人的样品中检测权利要求1的核酸中的突变。