DE69233108T2

DE69233108T2 - Hemmstoffe für menschliche neutrophile elastase und menschliches kathepsin g

Info

Publication number: DE69233108T2
Application number: DE69233108T
Authority: DE
Inventors: Charles Arthur LEY; Charles Robert LADNER; Kosow Sonia GUTERMAN; Lindsay Bruce ROBERTS; William Markland; Baribault Rachel KENT
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2012-02-29
Also published as: EP0573603A1; ATE431364T1; CA2105304C; CA2105304A1; ATE243710T1; EP0573603B1; ES2124203T1; WO1992015605A2; DE573603T1; JP3819931B2; EP1325931B1; JPH06510522A; AU1581692A; WO1992015605A3; ES2124203T3; DK0573603T3; EP1325931A1; DE69233108D1; DE69233760D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Protease-Inhibitoren und insbesondere kleine gentechnologisch hergestellte Proteine, die die menschliche Neutrophilen-Elastase (hNE) hemmen, und Proteine, die menschliches Cathepsin G (hCG) hemmen.
Beschreibung des zugrundeliegenden Standes der Technik
Neutrophilen-Elastase und Cathepsin G. Die aktiven Zentren von Serinproteasen weisen eine hohe Ähnlichkeit auf. Trypsin, Chymotrypsin, Neutrophilen-Elastase, Cathepsin G und viele andere Proteasen weisen untereinander eine starke Sequenzhomologie auf. Die sogenannte katalytische Triade umfasst (in der Chymotrypsinogen-Standardnumerierung) Asparaginsäure-102, Histidin-57 und Serin-195. Reste, welche sich in der Nähe der katalytischen Triade befinden, bestimmen die Substratspezifität des jeweiligen Enzyms (siehe CREI84, S. 366–7). Die Struktur und Funktion der Verdauungsenzyme Trypsin, Pankreas-Elastase und Chymotrypsin ist eingehender untersucht worden als bei den Enzymen aus Neutrophilen. Es sind Röntgenstrukturen von mit einem Substrat komplexiertem hNE ermittelt worden und die Ähnlichkeit des aktiven Zentrums von hNE zu jenem von Trypsin ist sehr hoch. Die Spezifität von hNE ist höher als von Trypsin und geringer als von Faktor X_a.
Serinproteasen sind in lebenden Organismen ubiquitär und spielen eine lebenswichtige Rolle bei Prozessen, wie: Verdauung, Blutgerinnung, Fibrinolyse, Immunantwort, Befruchtung und posttranslationale Prozessierung von Peptidhormonen. Obwohl die Rollen, die diese Enzyme spielen, lebenswichtig sind, kann eine unkontrollierte oder unangemessene proteolytische Aktivität sehr schädigend sein. Mehrere Serinproteasen sind direkt an ernsten Krankheitszuständen beteiligt.
Die menschliche Neutrophilen-Elastase (hNE oder HLE; EC 3.4.21.11) ist eine 29 kD-Serumprotease mit einem breiten Aktivitätsspektrum gegenüber Komponenten der extrazellulären Matrix (CAMP82, CAMP88, MCWH89 und darin zitierte Literatur). Das Enzym ist eine der hauptsächlichen neutralen Proteasen der azurophilen Granula von polymorphkernigen Leukozyten und ist an der Eliminierung von Pathogenen und an der Umstrukturierung von Bindegewebe beteiligt (TRAV88). In Fällen einer vererbten Verringerung von zirkulierendem alpha-1-Anti-Protease-Inhibitor (α1-PI), dem hauptsächlichen physiologischen Inhibitor von hNE (HEID86), oder der Inaktivierung von α1-PI durch Oxidation („Raucher-Emphysem") kann eine umfängliche Zerstörung von Lungengewebe aus einer unkontrollierten elastolytischen Aktivität von hNE resultieren (CANT89, BEIT86, HUBB86, HUBB89a,b, HUTC87, SOMM90, WEWE87). Mehrere Atemwegserkrankungen beim Menschen, einschließlich zystischer Fibrose und Emphysem, sind durch eine erhöhte Konzentration von Neutrophilen auf den epithelialen Oberflächen der Lungen gekennzeichnet (SNID91, MCEL91, GOLD86) und die hNE-Freisetzung durch Neutrophile ist an dem Fortschreiten dieser Krankheiten beteiligt (MCEL91, WEIS89). hNE ist als essentielle Komponente beteiligt an dem Teufelskreis von:
welcher bei zystischer Fibrose (CF) beobachtet wird (NADE90). Eine unangemessene hNE-Aktivität ist sehr schädlich, und um das Fortschreiten des Emphysems zu stoppen oder um die Symptome von CF zu lindern, wird ein Inhibitor von sehr hoher Affinität benötigt. Der Inhibitor muss für hNE sehr spezifisch sein, da er ansonsten andere lebenswichtige Serinproteasen o der Esterasen hemmt. Nadel (NADE90) hat gemutmaßt, dass der Beginn einer übermäßigen Sekretion durch 10^–10 M hNE initiiert wird; folglich muss der Inhibitor die Konzentration von freiem hNE deutlich unter dieses Niveau verringern. Dementsprechend ist hNE ein Enzym, für welches ein hervorragender Inhibitor benötigt wird.
Es gibt Berichte, die vermuten, dass Proteinase 3 (auch als p29 oder PR-3 bekannt) so wichtig wie oder sogar wichtiger als hNE ist; siehe NILE89, ARNA90, KAOR88, CAMP90 und GUPT90. Cathepsin G ist eine andere durch Neutrophile produzierte Protease, die Krankheiten hervorrufen kann, wenn sie im Übermaß vorhanden ist; siehe FERR90, PETE89, SALV87 und SOMM90. Cathepsin G ist weniger stabil als hNE und dementsprechend in vitro schwieriger zu untersuchen. Powers und Harper (POWE86) geben an, dass Cathepsin G an Entzündungen, Emphysemen, Schocklunge (ARDS) und rheumatoider Arthritis beteiligt ist.
Proteinartige Serinprotease-Inhibitoren. Eine große Anzahl von Proteinen wirkt als Serinprotease-Inhibitoren, indem sie als hochspezifisches limitierte Proteolyse-Substrat für deren Zielenzyme dienen. In vielen Fällen ist die Peptidbindung an der reaktiven Stelle („spaltbare Bindung") in wenigstens einer Disulfid-Schleife enthalten, was sicherstellt, dass während der Umwandlung eines jungfräulichen zu einem modifizierten Inhibitor die beiden Peptidketten nicht dissoziieren können.
Es hat sich eine spezielle Nomenklatur entwickelt, um die aktive Stelle des Inhibitors zu beschreiben. Indem man an dem Rest auf der Aminoseite der spaltbaren Bindung beginnt und sich von der Bindung wegbewegt, werden die Reste als P1, P2, P3 u. s. w. bezeichnet (SCHE67). Reste, die auf die spaltbare Bindung folgen, werden als P1', P2', P3' u. s. w. bezeichnet. Es ist festgestellt worden, dass die Hauptkette von Proteininhibitoren, die eine sehr unterschiedliche Gesamtstruktur aufwei sen, in der Region zwischen P3 und P3' hochgradig ähnlich ist bei besonders hoher Ähnlichkeit für P2, P₁ und P1' (LASK80 und darin zitierte Arbeiten). Es wird allgemein angenommen, dass jede Serinprotease Stellen S1, S2 u. s. w., die die Seitengruppen von Resten P1, P2 u. s. w. des Substrats oder Inhibitors aufnehmen, und Stellen S1', S2' u. s. w., die die Seitengruppen von P1', P2' u. s. w des Substrats oder Inhibitors aufnehmen, hat (SCHE67). Es sind die Wechselwirkungen zwischen den S-Stellen und den P-Seitengruppen, die der Protease Spezifität hinsichtlich Substraten und den Inhibitoren Spezifität hinsichtlich Proteasen verleihen.
Die Serinprotease-Inhibitoren sind gemäß sowohl Sequenzähnlichkeit als auch der topologischen Beziehung von deren aktiver Stelle und deren Disulfid-Schleifen in Familien eingeordnet worden. Die Familien umfassen die Rinderpankreas-Trypsin-Inhibitor- (Kunitz), sekretorischer Pankreas-Trypsin-Inhibitor- (Kazal), Bowman-Birk-Inhibitor- und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (Kunitz)-Familien. Einige Inhibitoren haben mehrere reaktive Stellen auf einer einzelnen Polypeptidkette und diese unterschiedlichen Domänen können unterschiedliche Sequenzen, Spezifitäten und sogar Topologien aufweisen.
Eine der unüblicheren Eigenschaften dieser Inhibitoren ist ihre Fähigkeit, eine gewisse Form von inhibitorischer Aktivität sogar nach Ersatz des P1-Rests beizubehalten. Es ist des weiteren festgestellt worden, dass das Substituieren von Aminosäuren in der P₅- bis P_5'-Region und insbesondere der P3- bis P3'-Region die Spezifität eines Inhibitors stark beeinflussen kann. LASK80 vermuteten, dass innerhalb der BPTI (Kunitz)-Familie Inhibitoren mit P1 Lys und Arg dazu neigen, Trypsin zu hemmen, jene mit P1 = Tyr, Phe, Trp, Leu und Met dazu neigen, Chymotrypsin zu hemmen, und jene mit P1 = Ala oder Ser wahrscheinlich Elastase hemmen. Sie fahren fort, dass unter den Kazal-Inhibitoren Inhibitoren mit P1 = Leu oder Met starke In hibitoren von Elastase sind und in der Bowman-Kirk-Familie Elastase mit P1 Ala, aber nicht mit P1 Leu gehemmt wird.
Wir werden als nächstes eine Anzahl von proteinartigen Anti-Elastase- und anti-Cathepsin G-Inhibitoren von besonderem Interesse diskutieren. Bekannte HNE- und Cathepsin G-Inhibitoren umfassen den Kunitz-Familien-Inhibitor UTI (GEBH86), den Eglin/Gerste-Familien-Inhibitor Eglin (SCHN86b) und die Inhibitoren alpha1-Antichymotrypsin und alpha1-Antitrypsin (BARR86) aus der Serpin-Familie.
α₁-Proteinase-Inhibitor (α1-Antitrypsin). Ein logischer Ansatz für eine Behandlung von Krankheiten, die übermäßig hohen hNE-Konzentrationen zugeschrieben werden können, ist eine Behandlung mit dem irreversiblen endogenen Inhibitor α₁-PI. STON90 berichtet über Untersuchungen der Wirksamkeit von α₁-PI, um Hamsterlungen vor einer Schädigung durch hNE zu schützen. Sie kommen zu dem Schluss, dass α₁-PI in vivo nur ungefähr 16% so wirksam ist, wie man ausgehend von in vitro-Messungen geschätzt haben würde. Nichtsdestoweniger zeigt α₁-PI eine therapeutische Wirkung. Eine vorläufige Studie einer Aerosol-Verabreichung von α₁-PI an Patienten mit zystischer Fibrose zeigt, dass eine solche Behandlung sowohl bei der Verhütung von Atemwegsgewebeschäden als auch bei der Erhöhung der anti-mikrobiellen Abwehr durch den Wirt wirksam sein kann (MCEL91).
Es gibt bei dieser routinemäßigen Verwendung als pulmonales anti-elastolytisches Mittel jedoch praktische Probleme. Diese umfassen die relativ große Größe des Moleküls (394 Reste, 51 kD), das Fehlen von intramolekularen stabilisierenden Disulfidbrücken und spezielle posttranslationale Modifikationen des Proteins durch Glycosylierung an drei Stellen. HEIM91 berichtet über die Hemmung der PNG-Leukozyten-vermittelten Endothelzell-Ablösung durch Protease-Inhibitoren. Sie verglichen sekretorischen Leukozyten-Protease-Inhibitor (SLPI), α1-Protease- Protease-Inhibitor (α1-PI) und einen Chlormethylketon-Inhibitor (CMK). Während SLPI und CMK die hNE-vermittelte Zell-Ablösung hemmten, tat α1-PI dies nicht; der Autor vermutet, dass aufgrund von seiner Größe α1-PI nicht zu der Stelle, bei der hNE wirkt, vordringen kann. Da die im Rahmen der Erfindung offenbarten Inhibitoren kleiner als SLPI sind, erwarten wir, dass sie sich frei durch den extrazellulären Raum bewegen.
Darüber hinaus können sowohl gespaltener α1-PI als auch der α1-PI/hNE-Komplex (BAND88a,b) chemotaktische Faktoren für Neutrophile sein. Dies könnte ein ernster Nachteil sein, wenn gewünscht wird, den Zyklus zu unterbrechen, durch welchen übermäßig hohe Anzahlen von Neutrophilen zur Lunge wandern, hNE freisetzen, das hNE mit dem α1-PI reagiert, wodurch ein Signal für mehr Neutrophile, zu den Lungen zu wandern, erzeugt wird. Dementsprechend wäre ein kleiner, stabiler, nicht-toxischer und starker Inhibitor von hNE von großem therapeutischem Wert.
Menschlicher sekretarischer Pankreas-Trypsin-Inhibitor. Dies ist ein Inhibitor aus der Kazal-Familie. Die Inhibitoren dieser Familie werden in Zymogen-Granula gelagert und mit den Zymogenen im Pankreassaft sezerniert. Im allgemeinen sind die natürlichen Kazal-Inhibitoren spezifisch für Trypsin. Es gibt jedoch Ausnahmen, wie bestimmte Domänen von Ovomucoiden und Ovoinhibitoren, die Chymotrypsin, Subtilisin und Elastase hemmen.
Während der Wildtyp-hPSTI gegenüber hNE vollständig inaktiv ist, berichten Collins et al. (COLL90) über maßgeschneiderte Varianten von menschlichem sekretorischem Pankreas-Trypsin-Inhibitor (hPSTI) mit hoher Affinität für hNE. Drei der berichteten Varianten haben K_i für hNE unter 10 pM: PSTI-5D36 bei 7,3 pM, PSTI-4A40 bei 7 pM und PSTI-4F21 bei 5,2 pM.
Kürbissamen-Inhibitor. Die Kürbissamen-Inhibitoren sind noch eine weitere Familie von Serinprotease-Inhibitoren. Jene, über die bislang berichtet worden ist, weisen Lysin oder Arginin am P1-Rest auf, hemmen Trypsin und sind vollständig inaktiv gegenüber hNE. McWherter et al. (1989) synthetisierten mehrere Homologe des Kürbissamen-Inhibitors III CMTI-III. CMTI-III hat eine K_i für Trypsin von ~1,5·10^–12 M. McWherter et al. (MCWH89) schlugen eine Substitution von „moderat sperrigen hydrophoben Gruppen" („moderately bulky hydrophobic groups") an P1 vor, um Spezifität für HLE (das gleiche wie hNE) zu verleihen. Sie erwarteten, dass für Cathepsin G sperrige (insbesondere aromatische) Seitengruppen stark bevorzugt seien. Sie stellten fest, dass PHE, LEU, MET und ALA anhand ihrer Kriterien funktionierten; TRP, TYR oder HIS wurden nicht untersucht. (Es ist anzumerken, dass ALA die zweitkleinste verfügbare Seitengruppe aufweist). Sie stellten fest, dass ein breiterer Satz von substituierten Resten (VAL, ILE, LEU, ALA, PHE, MET und GLY) eine nachweisbare Bindung an HLE ergab. Insbesondere hat CMTI-III (VAL₅) eine K_i = 9 nM bezogen auf hNE.
„Kunitz"-Domänen-Proteinase-Inhibitoren. Rinderpankreas-Trypsin-Inhibitor (BPTI, auch bekannt als Aprotonin) ist ein Serinprotease-Inhibitor von 58 Aminosäuren aus der BPTI (Kunitz)-Domänen (KuDom)-Familie. Unter dem Handelsnamen TRASYLOL wird dieser verwendet, um den Wirkungen von während einer Pankreatitis freigesetztem Trypsin entgegenzuwirken. Es ist nicht nur dessen Sequenz von 58 Aminosäuren bekannt, sondern es ist auch die 3D-Struktur von BPTI mit hoher Auflösung durch Röntgenbeugung (HUBE77), MARQ83, WLOD84, WLOD87a, WLOD87b), Neutronenbeugung (WLOD84) und durch NMR (WAGN87) bestimmt worden. Eine der Röntgenstrukturen ist bei der Brookhaven Protein Data Bank als „6PTI" hinterlegt [ebenda]. Die 3D-Struktur von verschiedenen BPTI-Homologen (EIGE90, HYNE90) ist ebenfalls bekannt. Es ist über mindestens sechzig Homologe berichtet worden; die Sequenzen von 39 Homologen sind in Tabelle 13 an gegeben und die Aminosäuretypen, die an jeder Position auftreten, sind in Tabelle 15 zusammengestellt. Die bekannten menschlichen Homologen umfassen Domänen von Lipoprotein-assoziiertem Gerinnungs-Inhibitor (LACI) (WUNT88, GIRA89), Inter-α-Trypsin-Inhibitor (ALBR83a, ALBR83b, DIAR90, ENGH89, TRIB86, GEBH86, GEBH90, KAUM86, ODOM90, SALI90) und das Alzheimer-beta-Amyloid-Vorläuferprotein. Zirkularisiertes BPTI und zirkulär permutiertes BPTI haben ähnliche Bindungseigenschaften wie BPTI (GOLD83). Einige zu BPTI homologe Proteine weisen mehr oder weniger Reste an einem der beiden Termini auf.
Bei BPTI befindet sich der P1-Rest an Position 15. Tschesche et al. (TSCH87) berichteten über die Bindung von mehreren BPTI-P1-Derivaten an verschiedene Proteasen:
Dissoziationskonstanten für BPTI-P1-Derivate, molar:
Aus dem Bericht von Tschesche et al. folgern wir, dass mit „+" gekennzeichnete Molekülpaare K_ds ≥ 3,5·10^–6 M haben und dass mit „–" gekennzeichnete Molekülpaare K_ds ≥ 3,5·10^–6 M haben. Es ist offensichtlich, dass Wildtyp-BPTI nur mäßige Affinität für hNE hat; es sind jedoch Mutanten von BPTI mit höherer Affinität bekannt. Obwohl in der Tabelle nicht gezeigt, bindet BPTI nicht signifikant hCG. Jedoch stellten Brinkmann und Tschesche (BRIN90) eine Dreifachmutante von BPTI her (nämlich K15F, R17F, M52E), die hinsichtlich hCG eine K_i von 5,0 × 10^–7 M hat.
Arbeiten betreffend BPTI und dessen Homologe umfassen: STAT87, SCHW87, GOLD83, CHAZ83, CREI74, CREI77a, CREI77b, CREI80, SIEK87, SINH90, RUEH73, HUBE74, HUBE75, HUBE77, KIDO88, PONT88, KIDO90, AUER87, AUER90, SCOT87b, AUER88, AUER89, BECK88b, WACH79, WACH80, BECK89a, DUFT85, FIOR88, GIRA89, GOLD84, GOLD88, HOCH84, RITO83, NORR89a, NORR89b, OLTE89, SWAI88 und WAGN79.
Inter-α-Trypsin-Inhibitor (ITI) ist ein großer (M_r ca. 240000) zirkulierender Protease-Inhibitor, der im Plasma von vielen Säugetierspezies gefunden wird (für zusammenfassende Übersichten siehe ODOM90, SALI90, GEBH90, GEBH86). Seine Affinitätskonstante für hNE beträgt 60–150 nM; für Cathepsin G ist sie 20–6000 nM. Der intakte Inhibitor ist ein Glycoprotein und es wird gegenwärtig angenommen, dass er aus drei glycosylierten Untereinheiten besteht, die durch eine starke Glycosaminoglycan-Verknüpfung wechselwirken (ODOM90, SALI90, ENGH89, SELL87). Die anti-Trypsin-Aktivität von ITI befindet sich auf der kleinsten Untereinheit (leichte Kette von ITI, M_r unglycosyliert ca. 15000), die hinsichtlich der Aminosäuresequenz identisch ist mit einem säurestabilen Inhibitor, der im Urin (UTI) und Serum (STI) gefunden wird (GEBH86, GEBH90). Die reife leichte Kette besteht aus einer N-terminalen Sequenz von 21 Resten, die an SER₁₀ glycosyliert ist, gefolgt von zwei Tandem-KuDoms, von denen die erste an ASN₄₅ glycosyliert ist (ODOM90). Bei dem menschlichen Protein ist gezeigt worden, dass die zweite KuDom (ITI-D2 oder HI-8t) Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin hemmt (ALBR83a, ALBR83b, SELL87, SWAI88). Der ersten Domäne (ITI-D1 oder HI-8e, welche die Reste 22–76 der in 1 von GEBH86 gezeigten UTI-Sequenz umfasst) fehlen diese Aktivitäten (ALBR83a,n, SWAI88), es ist aber berichtet worden, dass sie Leukozyten-Elastase (10^–6 > K_i > 10^–9) (–ALBR83a,b, ODOM90) und Cathepsin G (SWAI88, ODOM90) hemmt. Die Affinität ist jedoch zu schwach, um direkt nützlich zu sein.
Sinha et al. (SINH91) berichten über die Umwandlung der KuDom von Alzheimer-β-Amyloid-Vorläuferprotein in einen hNE-Inhibitor mit K_i = 800 pM, wenn Arginin an der P1-Stelle (Rest 13) durch Valin ersetzt wurde. Sie stellten ein zweites Protein her, das drei Mutationen aufwies (nämlich R13V(P1), A14S(P1'), M15I(P2')). Die Veränderungen an P1' und P2' entsprechen den Aminosäuren, die in der aktiven Stelle von α₁-PI gefunden werden. Dieses Protein ist hinsichtlich hNE vollständig inaktiv. Sie stellen fest: „Caution should therefore be used in extrapolating site-specific mutagenesis results among mechanistically unrelated inhibitors. In addition, unpredictable results can be obtained even within the KuDom family, as our experience with chymotrypsin and kallikrein illustrate". (Man sollte dementsprechend Vorsicht walten lassen, wenn man Ergebnisse aus einer ortsspezifischen Mutagenese bei mechanistisch nichtverwandten Inhibitoren extrapoliert. Zusätzlich können nicht-vorhersagbare Ergebnisse sogar innerhalb der KuDom-Familie erhalten werden, wie unsere Erfahrung mit Chymotrypsin und Kallikrein veranschaulicht.")
Nicht-proteinartige Elastase-Inhibitoren. Die Verbindungen ICI 200,355 (SOMM91) und ICI 200,880 zeigen eine starke Präferenz für HNE gegenüber anderen Proteasen, wie Trypsin. Diese Verbindungen sind Analoga von Peptiden, bei denen das Amid-Stickstoffatom der spaltbaren Bindung durch eine CF₃-Gruppe ersetzt worden ist. Jede dieser Verbindungen weist eine Isopropylgruppe (so wie Valin) an der P1-Position und einen Prolylrest an P2 auf. Keine der Verbindungen weist irgendeine Verlängerung in Richtung auf P1' auf. Imperiali und Abeles (IMPE86) beschreiben Protease-Inhibitoren, bestehend aus Acetylpeptidylmethylketonen, bei denen die terminale Methylgruppe null bis drei Fluoratome trägt; in keiner von deren Verbindun gen gibt es einen P1'-Rest. PEET90 (und darin zitierte Arbeiten) berichtet über die Synthese von Peptidylfluormethylketonen und Peptidyl-α-ketoestern und die inhibitorischen Eigenschaften von diesen Verbindungen bezogen auf Schweinepankreas-Elastase (PPE), HNE, Ratten-Cathepsin G und menschliches Cathepsin G; diese Verbindungen erstrecken sich nicht bis zu P1'. Mehdi et al. (MEDH90) berichten über die Hemmung von HNE und menschlichem Cathepsin G durch Methylester von Peptidyl-α-ketocarbonsäuren; keine dieser Verbindungen enthält P1'-Reste. Angelastro et al. (ANGE90) berichtet über Proteaseinhibitoren, die Diketogruppen aufweisen; keine dieser Verbindungen erstreckt sich über P1 hinaus.
Govhardan und Abeles (GOVH90) beschreiben Verbindungen, in denen das Amid -NH- durch -CF₂-CH₂- ersetzt ist, gefolgt von einem α-Amino-verknüpften Aminosäuremethylester, wodurch ein P1'-Rest bereitgestellt wird.
Imperiali und Abeles (IMPR87) beschreiben Inhibitoren von Chymotrypsin, die sich bis zu P3' erstrecken. Durch diese Autoren zitierte Arbeiten geben an, dass die inhibitorische Konstante K_i verringert werden kann, indem spezifisch die S1'-, S2'-, S3'- ... -Bindungsstellen auf der Protease angepasst werden. Diese Autoren diskutieren nicht die Inhibition von HNE. Darüber hinaus sind deren Inhibitoren nicht von Protein-Protease-Inhibitoren von hoher Affinität abgeleitet; stattdessen werden die Seitengruppen an P1', P2' und P3' durch Versuch und Irrtum bestimmt. Zusätzlich insertieren sie zwischen P1 und P1' -CO-CF₂-CH₂- anstelle von -CO-NH-, so dass der distale Teil der Kette verschoben wird. Wir bevorzugen es, -CO-NH- durch -CO-CF₂- oder -CO-CFH- zu ersetzen, so dass der Rest der Reste Konformationen einnehmen kann, die hochgradig ähnlich zu jenen, die EpiNE-Proteinen gefunden werden, sind.
Eine andere Klasse von Protease-Inhibitoren sind jene, in denen das Carbonyl-Kohlenstoffatom des spaltbaren Peptids durch Bor ersetzt ist. Diese Verbindungen hemmen Serinproteasen, sind aber nicht sehr spezifisch.
Eine andere Klasse von Elastase-Inhibitoren sind die Chlormethylketone, wie von Robert et al. ( US 4,665,053 ) beschrieben. Diese Verbindungen weisen ein Chloratom angrenzend an eine Ketogruppe auf. Das Serin im aktiven Zentrum der Protease wirkt als ein Nukleophil, welches Chlor verdrängt und ein kovalentes Enzym-Inhibitor-Addukt ergibt, das irreversibel inaktiv ist. An-Zhi et al. (FEBS Lett. 234 (2) 367–373 (1988)) beschreiben die Röntgenkristallstruktur von HNE mit einem Peptidylchlormethylketon. Tsuda et al. (Chem Pharm Bull, 35 (9) 3576–84 (1987)) beschreiben die Synthese von Peptidchlormethylketonen und deren Aktivität gegenüber Proteasen, einschließlich HNE. Ganu und Shaw (Thrombosis Research, 45: 1–6 (1987)) beschreiben verbesserte Peptidylchlormethylketon-Plasmin-Inhibitoren. Da die Chlormethylketone irreversible Addukte bilden, sind sie als Arzneimittel weniger wünschenswert. Andere Klassen von Inhibitoren, die irreversible Komplexe bilden, umfassen a) Peptidenollactone (J Biol Chem 266 (1) 13–21 (1991) und Biochemistry 29: 4305–11 (1990)), Isocumarine (Krantz et al., US 4,657,893 , Powers et al., US 4,845,242 , und Kobuko et al., US 4,980287 ) und Peptidyl(α-aminoalkyl)phosphonatdiphenylester (Biochemistry 30: 485–93 (1991)).
Eine Klasse von Verbindungen, die mit den Chlormethylketonen verwandt sind, die mit einem gewissen Ausmaß an Spezifität reversibel an Proteasen binden, umfasst Peptidylmethylketone. Peters und Fittkau (Biomed Biochim Acta 49 (4) 173–178 (1990) und darin zitierte Arbeiten) berichten, dass Peptidylmethylketone Serin- und Cysteinproteasen reversibel binden und dass die Bindung von der Sequenz der Peptidylgruppe abhängt. Wenn die Peptidylmethylketone als Peptidanaloga angesehen werden, in denen die Carbonylgruppe einer Aminosäure durch eine Methylgruppe ersetzt ist, diskutieren Peters und Fittkau nur Verbindungen, die in Richtung des Aminoterminus verlängert sind. Dementsprechend liefern sie nur P1, P2 u. s. w., nicht aber P1', P2' u. s. w.
Sonstige Angaben über die Inhibition von Elastasen: PADR91 berichtet, dass Elastin (das definitive Substrat aller Elastasen) die Wirksamkeit von verschiedenen reversiblen und irreversiblen hNE-Inhibitoren stark verringert verglichen mit der Wirksamkeit, die mittels kleinen löslichen künstlichen Substraten bestimmt wird. Sie haben festgestellt, dass beide Klassen von Inhibitoren eine zwanzigfach bis mehr als hundertfach geringere Wirksamkeit aufweisen. Sie vermuten, dass Elastin die „on"-Rate verringert, aber sie sagen, dass sie für dieses Phänomen keine Erklärung haben. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die synthetischen Inhibitoren (die allesamt relativ hydrophob sind) an Elastin (das ebenfalls hydrophob ist) binden. Sie untersuchten einen reversiblen Proteininhibitor, Schleim-Protease-Inhibitor, der eine K_i = 30 nM ohne Elastin oder 900 nM mit Elastin hat. Wenn unsere Inhibitoren einen 30-fachen Wirksamkeitsverlust erleiden, können sie nach wie vor freies hNE auf unter 10^–10 M verringern.
Es wird kein Zugeständnis gemacht, dass eine jegliche der zitierten Referenzen Stand der Technik oder unmittelbar relevanten Stand der Technik darstellt, und die angegebenen Daten sind jene, die auf der Referenz angegeben sind, und sind möglicherweise nicht identisch mit dem tatsächlichen Veröffentlichungsdatum. Alle in diesen Unterlagen zitierten Referenzen werden hiermit unter Bezugnahme aufgenommen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Mutanten von Kunitz-Domäne-Serinprotease-Inhibitoren, wie BPTI und ITI-D1 mit substantiell verstärkter Affinität für Elastase.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ein nicht natürlich vorkommendes Protein, das menschliche Neutrophilen-Elastase hemmt und das ein Protein ist, das mindestens die Kernsequenz einer nicht natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne umfasst, wobei eine Kunitz-Domäne durch Cysteine in Positionen, die den Positionen 5, 30, 51 und 55 des Rinderpankreas-Trypsin-Inhibitors (BPTI) entsprechen, Glycin in einer Position, die der BPTI-Position 12 entspricht, Asn in einer Position, die BPTI 43 entspricht, und Phe in einer Position, die BPTI33 entspricht, gekennzeichnet ist, mit der Maßgabe, dass, wenn die Positionen, die BPTI 14 und 38 entsprechen, Cystein sind, die Position, die BPTI 37 entspricht, Glycin ist; wobei die Kernsequenz die Reste sind, die den BPTI-Positionen 5–55 entsprechen; wobei in der nichtnatürlich vorkommenden Kunitz-Domäne der Rest, der der BPT2-Position 18 entspricht, Phe ist und wobei die Reste, die den BPTI-Positionen 39–42 entsprechen, alle ungeladene Aminosäuren sind.
Diese Mutationen haben eine Affinität für Elastase, die schätzungsweise mindestens eine Größenordnung höher ist als jene der Wildtyp-Domäne und in einigen Fällen mindestens drei Größenordnungen (1000-fach) höher ist.
Für einige der Proteine zeigen die kinetischen inhibitorischen Daten, dass die Bindungsaffinität im Bereich von 1,0 × 10^–12 M bis 3,0 × 10^–12 M liegt. Andere Proteine werden auf Fusionsphagen präsentiert („phage-display") und die Affinität für hNE oder hCG wird durch das pH-Elutionsprofil von immobilisierter aktiver Protease (hNE oder hCG) abgeschätzt. Eine Anzahl von Proteinen ist in nützlichen Mengen als sezernierte Proteine in Hefe produziert worden.
Die Erfindung betrifft auch lineare und cyclische Oligopeptid-Analoga von Aprotonin und verwandten Polypeptiden, die spezifisch menschliche Neutrophilen-Elastase und/oder Cathepsin G binden. Sie betrifft insbesondere Analoga der neuen Elastase-bindenden Polypeptide (EpiNe) und Cathepsin G-bindenden Polypeptide, die hier offenbart werden.
Diese Analoga unterscheiden sich von Aprotonin und dessen verwandten Inhibitoren in mehrerer Hinsicht. Zuerst sind sie kleinere Moleküle, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von weniger als 1500 Dalton, und umfassend nur die P₅-P_5'-Reste (oder Analoga davon) oder eine Untergruppe davon. Zweitens ist die spaltbare Peptid (-CO-NH-)-Bindung zwischen den Resten P₁ und P_1' durch eine im wesentlichen nicht-hydrolysierbare Bindung ersetzt, die im wesentlichen den Abstand zwischen den alpha-Kohlenstoffatomen dieser zwei Reste aufrechterhält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Fraktionierung der Mini-PEPI-Bibliothek an hNE-Körnern („beads"). Die Abszisse zeigt den pH des Puffers. Die Ordinaten zeigen die Phagenmenge (als Bruchteil der eingesetzten Phagen), welche bei einem gegebenen pH erhalten wird. Ordinate im Maßstab × 10³.
2 veranschaulicht die Fraktionierung der MYMUT PEPI-Bibliothek an hNE-Körnern. Die Abszisse zeigt den pH des Puffers. Die Ordinaten zeigen die Phagenmenge (als Bruchteil der eingesetzten Phagen), welche bei einem gegebenen pH erhalten wird. Ordinate im Maßstab × 10³.
3 zeigt die Elutionsprofile für die EpiNE-Klone 1, 3 und 7. Jedes Profil ist in einem solchen Maßstab gezeigt, dass der Peak 1,0 ist, um die Gestalt der Kurve zu betonen.
4 zeigt das pH-Profil für die Bindung von BPTI-III-MK und EpiNE1 an Cathepsin G-Körner. Die Abszisse zeigt den pH des Puffers. Die Ordinate zeigt die Phagenmenge (als Bruchteil der eingesetzten Phagen), welche bei einem gegebenen pH erhalten wird. Ordinate im Maßstab × 10³.
5 zeigt das pH-Profil für die Fraktionierung der MYMUT-Bibliothek an Cathepsin G-Körnern. Die Abszisse zeigt den pH des Puffers. Die Ordinate zeigt die Phagenmenge (als Bruchteil der eingesetzten Phagen), welche bei einem gegebenen pH erhalten wird. Ordinate im Maßstab × 10³.
6 zeigt eine zweite Fraktionierung der MYMUT-Bibliothek über Cathepsin G.
7 zeigt Elutionsprofile an immobilisiertem Cathepsin G für Phagen, die hinsichtlich einer Bindung an Cathepsin G ausgewählt wurden.
8 zeigt die Form einer Gruppe von bevorzugten HNE-Inhibitoren, welche im Folgenden als Klasse I-Inhibitoren bezeichnet werden. Die mit 7, 8, 9 und 10 markierten Kohlenstoffatome sind chirale Zentren.
9 zeigt die Form einer zweiten Gruppe von bevorzugten HNE-Inhibitoren, welche im Folgenden als Klasse II-Inhibitoren bezeichnet werden. Die mit 7, 8, 9 und 10 markierten Kohlenstoffatome sind chirale Zentren.
10 zeigt 2-Carboxymethyl-6-aminomethylanthrachinon als Linker. Es können andere relativ starre Moleküle von ähnlichen Abmessungen verwendet werden.
11 zeigt Verbindungen I bis XVIII, die an der Herstellung von Analoga des VAL-ALA-Dipeptids, worin -NH- durch -CF₂-, -CH₂- oder -CHF- ersetzt ist, für Klasse I- und Klasse-II-Inhibitoren beteiligt sind.
12 zeigt die Form einer dritten Gruppe von bevorzugten HNE-Inhibitoren, welche im Folgenden als Klasse III-Inhibitoren bezeichnet werden. Mit 8, 9 und 10 markierte Kohlenstoffatome sind chirale Zentren.
13 zeigt Verbindungen XXXI bis XXXV, die an der Synthese des Bor-enthaltenden Dipeptid-Analogs, das bei Klasse I- und Klasse II-Inhibitoren verwendet wird, beteiligt sind.
14 zeigt Verbindungen XLI bis XLIV, die an der Synthese eines Abschnitts des in 5 gezeigten Moleküle beteiligt sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Kleine Proteine mit hoher Affinität für Elastase oder Cathepsin G
Die Erfindung betrifft Muteine von BPTI, ITI-D1 und anderen Inhibitoren vom Kunitz-Domänen-Typ, die eine hohe Affinität für Elastase und Cathepsin G aufweisen. Einige der beschriebenen Inhibitoren sind von BPTI und einige von ITI-D1 abgeleitet. Es könnten jedoch Hybride der identifizierten Muteine und anderer Inhibitoren vom Kunitz-Domänen-Typ konstruiert werden.
Zu dem Zweck, die Affinität einer großen Anzahl von unterschiedlichen BPTI- und ITI-D1-Muteinen gleichzeitig zu bestimmen, wurden DNA-Sequenzen, die für das BPTI oder ITI-DI ko dierten, in das Genom des Bakteriophagen M13 eingeführt. Die KuDom wird auf der Oberfläche von M13 als eine aminoterminale Fusion mit dem Gen III-Hüllprotein präsentiert. Es wurden Veränderungen in die KuDom-Aminosäuresequenz eingeführt. Jede reine Population von Phagen, welche eine bestimmte KuDom präsentierte, wurde hinsichtlich ihrer Wechselwirkungen mit immobilisierter hNE oder hCG charakterisiert. Basierend auf einem Vergleich mit den pH-Elutionsprofilen von Phagen, die andere KuDoms mit bekannten Affinitäten für die jeweilige Protease präsentieren, wurden mutierte KuDoms mit hoher Affinität für die Ziel-Proteasen identifiziert. Nachfolgend wurden die Sequenzen dieser mutierten KuDoms bestimmt (typischerweise durch Sequenzieren der entsprechenden DNA-Sequenz).
Es ist gezeigt worden, dass bestimmte Aprotonin-artige Protease-Inhibitoren eine hohe Affinität für HNE (~10¹²/M) aufweisen. Diese 58 Aminosäure-Polypeptide wurden biologisch aus einer Bibliothek von Aprotinin-Mutanten, welche über Diversität bei der Synthese hergestellt worden waren, ausgewählt. Es wurden die Positionen P1, P1', P2', P3' und P4' variiert: Bei P1 wurden nur VAL und ILE ausgewählt, obwohl LEU, PHE und MET aufgrund der Synthesebedingungen möglich gewesen wären. Bei P1' waren ALA und GLY möglich und beide wurden in Proteinen mit hoher Affinität gefunden. (Obwohl in der Bibliothek nicht untersucht, weisen viele Inhibitoren von Serinproteasen aus der Kazal-Familie Glutaminsaure oder Asparaginsäure an P1' auf.) Alle ausgewählten Proteine enthielten entweder PHE oder MET an P2'; LEU, ILE und VAL, die Aminosäuren mit verzweigten aliphatischen Seitengruppen sind, befanden sich in der Bibliothek, behindern aber offensichtlich eine Bindung an HNE. Überraschenderweise befindet sich an Position P3' aller Proteine, die aufgrund von hoher Affinität für HNE ausgewählt wurden, Phenylalanin. Niemand hatte vermutet, dass P3' eine entscheidende Position für die Bestimmung von Spezifität in Bezug auf HNE ist. Bei P4' waren SER, PRO, THR, LYS und GLN möglich; mit Ausnahme von THR wurden alle von diesen beobachtet. In den Derivaten mit der höchsten Affinität werden PRO und SER gefunden.
Wie zuvor festgehalten, ist BPTI ein Protein von 58 Aminosäuren. Die Sequenz von BPTI ist in Eintrag 1 von Tabelle 13 angegeben. Die Erfindung ist nicht auf 58 Aminosäuren-Proteine beschränkt, da erwartet wird, dass Homologe, die mehr oder weniger Aminosäuren aufweisen, aktiv sein werden.
Wildtyp-BPTI ist kein guter Inhibitor von hNE. BPTI mit einer einzigen K15L-Mutation zeigt eine moderate Affinität für HNE (K_d = 2,9·10^–9 M) (BECK88b). Es ist jedoch die aminoterminale Kunitz-Domäne (BI-8e) der leichten Kette von Rinder-Inter-α-trypsin-Inhibitor durch Proteolyse erzeugt worden und es wurde gezeigt, dass diese ein starker Inhibitor von HNE ist (K_d = 4,4·10^–11 M) (ALBR83).
Es ist vorgeschlagen worden, dass der P1-Rest der primäre bestimmende Faktor für die Spezifität und Wirkkraft von BPTI-artigen Molekülen ist (SINH91, BECK88b, LASK80 und darin zitierte Arbeiten). Obwohl sowohl BI-8e als auch BPTI(K15L) LEU an deren jeweiligen P1-Positionen aufweisen, gibt es einen 66-fachen Unterschied bei den Affinitäten dieser Moleküle für HNE. Wir haben dementsprechend die Hypothese aufgestellt, dass andere-strukturelle Merkmale zur Affinität von BPTI-artigen Molekülen für HNE beitragen müssen.
Ein Vergleich der Strukturen von BI-8e und BPTI(K15L) enthüllt die Anwesenheit von drei positiv geladenen Resten an den Positionen 39, 41 und 42 von BPTI, die in BI-8e fehlen. Diese hydrophilen und hoch geladenen Reste von BPTI werden auf einer Schleife präsentiert, die unter der Schleife, die den P1-Rest enthält, liegt und die mit dieser über eine Disulfid-Brücke verbunden ist. Reste innerhalb der darunterliegenden Schleife (insbesondere Rest 39) nehmen an der Wechselwirkung von BPTI mit der Oberfläche von Trypsin teil (BLOW72) und können signifikant zu der festen Bindung von BPTI an Trypsin beitragen. Diese hydrophilen Reste könnten jedoch das Andocken von BPTI-Varianten an HNE behindern. BI-8e zeigt eine hohe Affinität für HNE und enthält keine geladenen Reste an den Resten 39–42, was diese Hypothese unterstützt. Folglich wurden die Reste 39 bis 42 von Wildtyp-BPTI durch die entsprechenden Reste (MGNG) des menschlichen Homologs von BI-8e ersetzt. Wie wir vorausgeahnt hatten, zeigte ein BPTI(K15L)-Derivat, welches die MGNG 39–42-Substitution enthielt, eine höhere Affinität für HNE als dies die nur eine einzige. Substitution aufweisende Mutante BPTI(K15L) tat. Mutanten von BPTI mit Met an Position 39 sind bekannt, aber die Positionen 40–42 wurden nicht gleichzeitig mutiert.
Die Tabellen 207 und 208 präsentieren die Sequenzen von zusätzlichen neuen BPTI-Mutanten mit hoher Affinität für hNE. Wir glauben, dass diese Mutanten eine Affinität für hNE aufweisen, die ungefähr eine Größenordnung höher ist als jene von BPTI (K15V, R17L). Alle diese Mutanten enthalten neben den Mutationen in der aktiven Stelle, die in den Tabellen gezeigt sind, die MGNG-Mutation an den Positionen 39–42.
In ähnlicher Weise präsentiert Tabelle 209 die Sequenzen von neuen BPTI-Mutanten mit hoher Affinität für Cathepsin G. Der P1-Rest in den EpiC-Mutanten ist überwiegend MET, bei einem Beispiel von PHE, während bei BPTI P1 LYS ist und in den EpiNE-Varianten P1 entweder VAL oder ILE ist. Bei den EpiC-Mutanten ist P1' (Rest 16) überwiegend ALA mit einem Beispiel von GLY und P2' (Rest 17) ist PHE, ILE oder LEU. Interessanterweise scheinen die Reste 16 und 17 eine Paarbildung infolge komplementärer Größe zu zeigen, zumindest bei dieser kleinen Probe. Der kleine GLY-Rest zeigt eine Paarbildung mit dem sperrigen PHE, während der relativ gesehen größere ALA-Rest eine Paarbildung mit den weniger sperrigen LEU und ILE zeigt. Alternativ könnte die Paarbildung entsprechend Flexibilität an P1' erfolgen; Glycin an P1' könnte ermöglichen, dass die Seitengruppe von Phenylalanin eine Tasche erreicht, welche nicht zugänglich ist, wenn P1' Alanin ist. Wenn P1' Alanin ist, scheinen Leucin oder Isoleucin die beste Wahl zu sein.
Obwohl BPTI bei Menschen mit sehr wenigen Nebenwirkungen eingesetzt worden ist, bringt eine KuDom, die eine viel höhere Ähnlichkeit zu einer menschlichen KuDom aufweist, viel weniger Risiken, eine Immunantwort hervorzurufen, mit sich. Dementsprechend transferierten wir die Veränderungen an der aktiven Stelle, die in EpiNE7 gefunden wurden, in die erste KuDom von Inter-α-trypsin-Inhibitor (Beispiel IV). Für den Zweck dieser Anmeldung ist die Numerierung der Nukleinsäuresequenz für das ITI-leichte Kette-Gen jene von TRAB86 und jene der Aminosäuresequenz ist diejenige, die für UTI in 1 von GEBH86 gezeigt ist. Die erforderliche kodierende Sequenz für ITI-DI sind die 168 Basen zwischen den Positionen 750 und 917 in der in TRAB86 aufgeführten cDNA-Sequenz. Die Aminosäuresequenz von menschlichem ITI-D1 ist 56 Aminosäuren lang, wobei sie sich von Lys-22 bis Arg-77 der vollständigen leichte Kette-Sequenz von ITI erstreckt. Die P1-Stelle von ITI-DI ist Met-36. Die Tabellen 220–221 führen bestimmte ITI-Mutanten auf; es ist anzumerken, dass die Reste gemäß der homologen Kunitz-Domäne von BPTI numeriert sind, d.h. wobei der P1-Rest die Nummer 15 trägt. Es sollte festgehalten werden, dass es wahrscheinlich annehmbar ist, den Aminoterminus von ITI-D1 zu verkürzen, wenigstens bis zu dem ersten Rest, welcher zu BPTI homolog ist.
Die EpiNE7-inspirierte Mutation (BPTI 15–19-Region von ITI-D1 verstärkte dessen Affinität für hNE signifikant. Wir haben auch entdeckt, dass eine Mutation eines unterschiedlichen Teils des Moleküls (BPTI 1–4-Region) eine ähnliche Zunahme der Affinität bewirkte. Wenn diese beiden Mutationsmuster kombi niert wurden, wurde ein synergistischer Anstieg der Affinität beobachtet. Weitere Mutationen bei nahebei gelegenen Aminosäuren (BPTI 26, 31, 34) führten zu zusätzlichen Verbesserungen bei der Affinität.
Die Elastase bindenden Muteine von ITI-DI, die hier ins Auge gefasst werden, unterscheiden sich vorzugsweise von der Wildtyp-Domäne an einer oder mehreren der folgenden Positionen (numeriert wie für BPTI): 1, 2, 4, 15, 16, 18, 19, 31 und 34. Mehr bevorzugt weisen sie eine oder mehrere der folgenden Mutationen auf: Lys1 → Arg; Glu2 → Pro; Ser4 → Phe*; Met15 → Val*, Ile; Gly16 → Ala; Thr18 → Phe*; Ser19 → Pro; Thr26 → Ala; Glu31 → Gln; Gln34 → Val*. Die Einführung von einer oder mehreren der mit einem Stern versehenen Mutationen ist besonders wünschenswert und in einer bevorzugten Ausführungsform sind wenigstens alle der mit einem Stern versehenen Mutationen vorhanden.
Für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht sich, dass die identifizierten HNE- und HCG-Inhibitoren auf eine solche Weise modifiziert werden können, dass die Veränderung die Affinität, Spezifität oder Stabilität des Inhibitors nicht stark verringert. Vorgeschlagene Veränderungen können anhand von mehreren Grundlagen untersucht werden. Zuerst fragen wir, ob eine bestimmte Aminosäuren in das KuDom-Gerüst an einer gegebenen Stelle passen kann; eine Veränderung, die das Gerüst zerstört, wird mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit die Bindung beeinträchtigen und die Spezifität verringern. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Aminosäure in das KuDom-Gerüst passen kann, kann auf mehrere Weisen beurteilt werden: 1) tritt die Aminosäure an dieser Position in irgendeiner bekannten KuDom auf? 2) Zeigen Strukturmodelle von KuDoms eine Verträglichkeit zwischen der Struktur und der vorgeschlagenen Substitution an? und 3) legen dynamische Rechenmodelle nahe, dass das vorgeschlagene mutierte Protein stabil sein wird? Die Sequenzvariabilität von in der Natur vorkommenden KuDoms liefert uns den Beweis dafür, dass bestimmte Aminosäuren an bestimmten Stellen akzeptabel sind; das Fehlen von Beispielen beweist nicht, dass die Aminosäure nicht passen würde.
Wenn eine vorgeschlagene Veränderung als strukturell akzeptabel angesehen wird, fragen wir dann, welche Auswirkung diese auf die Bindung an die Zielstruktur und an andere Substanzen haben wird. Im allgemeinen wird man ein mutiertes Protein, welches einen veränderten Rest in der Grenzfläche zwischen KuDom und Zielstruktur aufweist, testen müssen, üblicherweise über Bindungsstudien eines Phagens, der das mutierte Protein präsentiert. Die meisten Veränderungen in der Bindungsgrenzfläche verringern die Bindung, aber einige erhöhen tatsächlich die Affinität. Veränderungen an Resten, welche von der Bindungsgrenzfläche weit entfernt sind, verringern die Bindung üblicherweise nicht, wenn das Protein nicht destabilisiert wird.
Tabelle 61 zeigt die Variabilität von 39 in der Natur vorkommenden Kunitz-Domänen. Alle diese Proteine weisen 51 Reste in der Region C₅ bis C₅₅ auf; die gesamte Anzahl von Resten variiert aufgrund der Tatsache, dass die Proteine mehr oder weniger Reste an den Termini aufweisen. Tabelle 62 listet die Namen der Proteine auf, die in Tabelle 61 enthalten sind. Tabelle 64 zitiert Arbeiten, wo diese Sequenzen aufgezeichnet sind. Tabelle 63 zeigt ein Histogramm davon, wie viele Stellen eine bestimmte Variabilität zeigen, gegenüber der Variabilität. „Kern" bezieht sich auf Reste von 5 bis 55, die eine höhere Sequenz- und Strukturähnlichkeit zeigen, als dies Reste außerhalb des Kerns tun.
An zehn Positionen wird in allen 42 Fällen ein einziger Aminosäure-Typ beobachtet; diese sind C₅, G₁₂, C₁₄, C₃₀, F₃₃, G₃₇, C₃₈, N₄₃, C₅₁ und C₅₅. Obwohl es Berichte gibt, dass jede dieser Po sitionen ohne vollständigen Strukturverlust substituiert werden könnte, liegen nur G₁₂, C₁₄, G₃₇, und C₃₈ nahe genug bei der Bindungsgrenzfläche, so dass ein Anreiz gegeben ist, um Veränderungen vorzunehmen. G₁₂ liegt in einer Konformation vor, die nur Glycin annehmen kann; dieser Rest wird am besten so gelassen, wie er ist. Marks et al. (MARK87) ersetzten sowohl C₁₄ als auch C₃₈ durch entweder zwei Alanine oder zwei Threonine. Die C₁₄/C₃₈-Cysteinbrücke, die Marks et al. entfernten, ist diejenige, die sehr nahe an der spaltbaren Bindung in BPTI liegt; überraschenderweise funktionierten beide mutierten Moleküle als Trypsin-Inhibitoren. Sowohl BPTI(C14A,C38A) als auch BPTI(C14T,C38T) sind stabil und hemmen Trypsin. Das Verändern dieser Reste könnte einen nützlichen Inhibitor erzeugen, der eine nützliche Stabilität bewahrt, und die auf Phagen erfolgende Präsentation (Phagen-„Display") einer variierten Population ist der beste Weg, um Mutanten zu erhalten und zu testen, die Veränderungen an entweder 14 oder 38 verkörpern. Nur wenn das C₁₄/C₃₈-Disulfid entfernt ist, würde die strenge Konservierung von G₃₇ beseitigt werden.
An sieben Positionen (nämlich 23, 35, 36, 40, 41, 45 und 47) wurden nur zwei Aminosäure-Typen gefunden. An Position 23 werden nur Y und F beobachtet; die p-Position des Phenylrings ist für Lösemittel zugänglich und weit entfernt von der Bindungsstelle. Es ist wahrscheinlich, dass hier vorgenommene Veränderungen geringe Einflüsse auf die Bindung ausüben und keine hohe Priorität für eine Variation haben werden. In ähnlicher Weise findet man bei 35 nur die aromatischen Reste Y und W; Phenylalanin würde hier wahrscheinlich gut funktionieren. Bei 36 herrscht Glycin vor, obwohl Serin auch festgestellt wird. Andere Aminosäuren, speziell {N, D, A, R}, sollten möglich sein und würden die Bindungseigenschaften wahrscheinlich beeinflussen. Bei Position 40 findet man nur G oder A; Strukturmodelle legen nahe, dass andere Aminosäuren toleriert werden würden, insbesondere jene in dem Satz {S, D, N, E, K, R, L, M, Q und T}. Position 40 liegt nahe genug an der Bindungsstelle, dass Veränderungen hier die Bindung beeinflussen könnten. Bei 41 sind nur N und K gefunden worden, aber es sollte eine jegliche Aminosäure außer Prolin möglich sein. Die Seitengruppe ist exponiert, so dass hydrophile Seitengruppen bevorzugt sind, speziell {D, S, T, E, R, Q und A}. Dieser Rest ist weit genug von der Bindungsstelle entfernt, so dass nicht erwartet wird, dass Veränderungen hier große Auswirkungen auf die Bindung haben. Bei 45 ist F hochgradig bevorzugt, aber es wird einmal Y beobachtet. Da eine Kante des Phenylrings exponiert ist, wird eine Substitution von anderen aromatischen Aminosäuren (W oder H) wahrscheinlich Moleküle von ähnlicher Struktur erzeugen, obwohl es schwierig ist, vorherzusagen, wie die Stabilität beeinflusst werden wird. Aliphatische Aminosäuren, wie Leucin oder Methionin (die keine verzweigten Cβs haben) könnten hier ebenfalls funktionieren. Bei 47 sind nur S und T festgestellt worden, aber andere Aminosäuren, speziell {N, D, G und A} sollten stabile Proteine ergeben.
Bei einer Position (44) sind nur drei Aminosäure-Typen beobachtet worden. Hier herrscht Asparagin vor und kann interne Wasserstoffbrückenbindungen bilden. Andere Aminosäuren sollten möglich sein, mit Ausnahme von vielleicht Prolin.
Bei den restlichen 40 Positionen sind vier oder mehr Aminosäuren beobachtet worden; an 28 Positionen werden acht oder mehr Aminosäure-Typen gefunden. An Position 25 gibt es 13 verschiedene Typen und an 5 Positionen (1, 6, 17, 26 und 34) gibt es 12 Typen. Prolin (die starrste Aminosäure) ist an vierzehn Positionen beobachtet worden: 1, 2, 8, 9, 11, 13, 19, 25, 32, 34, 39, 49, 57 und 58. Die ϕ,ψ-Winkel von BPTI (CREI84, Tabelle 6-3, S. 222) zeigen an, dass Prolin an den Positionen 1, 2, 3, 7, 8, 9, 11, 13, 16, 19, 23, 25, 26, 32, 35, 36, 40, 42, 43, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 56 und 58 möglich sein sollte. Prolin kommt an vier Positionen (34, 39, 57 und 58) vor, wo die ϕ,ψ- Winkel von BPTI darauf hinweisen, dass es inakzeptabel sein sollte. Wir schließen daraus, dass die Hauptkette sich in diesen Fällen örtlich umlagert.
Basierend auf diesen Daten und unter Ausschluss der sechs Cysteine schließen wir, dass die KuDom-Struktur jene Substitutionen, die in Tabelle 65 gezeigt sind, zulassen wird. Die Klasse zeigt an, ob die Substitutionen: A) mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit ein stabiles Protein mit im wesentlichen der gleichen Bindung an hNE, hCG oder irgendeine andere Serinprotease wie die Ausgangssequenz ergeben werden, B) wahrscheinlich eine ähnliche Bindung wie die Ausgangssequenz ergeben werden oder C) wahrscheinlich Proteine ergeben werden, welche die KuDom-Struktur bewahren, die aber wahrscheinlich die Bindung beeinflussen werden. Mutanten in Klasse C müssen hinsichtlich Affinität getestet werden, was unter Verwendung eines „Display-Phagen"-Systems, wie von jenem, das in WO/02809 erläutert wird, relativ einfach ist. Die Affinität von hNE- und hCG-Inhibitoren ist am empfindlichsten gegenüber Substitutionen an den Positionen 15, 16, 17, 18, 34, 39, 19, 13, 11, 20, 36 von BPTI; wenn der Inhibitor eine Mutante von ITI-D1 ist, müssen diese Positionen zu deren ITI-D1-Äquivalenten konvertiert werden, indem die Cysteine in BPTI und ITI-D1 einander zugeordnet werden („alignment").
Bestimmte von unseren hNE-Inhibitoren werden als PR-3-Inhibitoren nützlich sein. Wir haben die Wechselwirkung unserer Inhibitoren mit hNE durch Bezugnahme auf den BPTI-Trypsin-Komplex anhand eines Modells untersucht. Zuerst listeten wir die Reste von Trypsin auf, die BPTI berühren. Als nächstes berücksichtigten wir die entsprechenden Sätze von Resten aus hNE und PR-3. Diese Sätze unterscheiden sich an elf Resten. Nur einer der Unterschiede tritt in der S1-Spezifitätstasche auf, nämlich V₁₉₀ in hNE gegenüber I₁₉₀ in PR3. Wir nehmen dementsprechend an, dass unsere hNE-Inhibitoren wahrscheinlich eben so PR-3-Inhibitoren sein werden. Es ist insbesondere wahrscheinlich, dass die Inhibitoren, die Valin an P1 aufweisen, PR3 hemmen werden. PR3 weist ein zusätzliches Methyl in dieser Region auf, so dass wahrscheinlicher ist, dass die Inhibitoren, die ein Methyl weniger aufweisen, fest binden werden.
BPTI ist relativ klein; wenn dies ein pharmakologisches Problem verursachen sollte, wie eine übermäßig schnelle Entfernung aus dem Kreislauf, können zwei oder mehr von BPTI abgeleitete Domänen durch eine Verbindungsstruktur oder einen Linker verknüpft werden. Dieser Linker ist vorzugsweise eine Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren. Ein bevorzugter Linker ist einer, der zwischen wiederholten Domänen eines menschlichen Proteins gefunden wird, speziell die Linker, die in menschlichen BPTI-Homologen gefunden werden, von denen eines zwei Domänen (BALD85, ALBR83b) und ein anderes von diesen drei aufweist (WUNT88). Peptid-Linker haben den Vorteil, dass das gesamte Protein dann durch Techniken der in vitro-DNA-Rekombination exprimiert werden kann. Es ist auch möglich, einen Nicht-Peptidyl-Linker zu verwenden, wie einen, der gewöhnlich verwendet wird, um immunogene Konjugate zu bilden. Beispielsweise eine BPTI-artige KuDom an Polyethylenglycol, eine sogenannte PEGylierung (DAVI79).
Ein anderes mögliches pharmakologisches Problem ist die Immunogenität. BPTI ist bei Menschen mit sehr wenig Nebenwirkungen eingesetzt worden. Siekmann et al. (SIEK89) haben immunologische Eigenschaften von BPTI und einigen Homologen untersucht. Darüber hinaus kann man die Wahrscheinlichkeit einer Immunantwort verringern, indem man von einem menschlichen Protein ausgeht. Dementsprechend kann man, indem man nicht-essentielle Reste verändert, das Protein verändern, so dass es einem menschlichen Protein stärker ähnelt. Es ist auch gezeigt worden, dass andere Modifizierungen, wie eine PEGylierung, die Immunantwort verringern (DAVI79).
Referenzbeispiel
Affinitätsmessungen
Die Affinität eines Proteins für ein anderes Molekül kann auf viele Weisen gemessen werden. Scatchard (Ann NY Acad Sci (1949) 51: 660–669) hat ein klassisches Verfahren zur Bindungsmessung und -analyse beschrieben, das auf die Bindung von Proteinen angewandt worden ist. Dieses Verfahren erfordert relativ reine s. Protein und die Fähigkeit, gebundenes Protein von ungebundenem zu unterscheiden.
Ein zweites Verfahren, das für die Messung der Affinität von Inhibitoren für Enzyme geeignet ist, besteht darin, die Fähigkeit des Inhibitors, die Wirkung. des Enzyms zu verlangsamen, zu messen. Dieses Verfahren erfordert abhängig von der Geschwindigkeit, mit der das Enzym Substrat spaltet, und der Verfügbarkeit von chromogenen oder fluorogenen Substraten mehrere zehn Mikrogramm bis Milligramm von relativ reinem Inhibitor.
Ein drittes Verfahren zur Bestimmung der Affinität eines Proteins für ein zweites Material besteht darin, das Protein auf einer genetischen Verpackung, wie M13, präsentieren zu lassen und die Fähigkeit des Proteins zu messen, an dem immobilisierten „zweiten Material" zu haften. Dieses Verfahren ist hochempfindlich, da die genetischen Verpackungen amplifiziert werden können. Dieser Ansatz ist nicht vollständig neu. Makela, O., H. Sarvas und I. Seppala („Immunological Methods Based on Antigen-Coupled Bacteriophages", J Immunol Methods (1980), 37: 213–223) diskutieren Verfahren zur Verwendung von chemisch an Bakteriophagen konjugierten Haptanen, um die Konzentration von Antikörpern mit Affinität für die Haptane zu messen. Die Erfindung verwendet einen neuen Ansatz, indem das bindende Protein genetisch durch den Phagen kodiert wird. Darüber hinaus erhalten wir zumindest halbquantitative Werte für die Bindungskonstanten durch die Verwendung eines pH-Stufen-Gradienten. Es werden Inhibitoren von bekannter Affinität für die immobilisierte Protease verwendet, um Standardprofile zu erstellen, gegenüber welchen andere auf Phagen präsentierte Inhibitoren beurteilt werden. Tabelle 203 zeigt das Profil von BPTI-Phagen und von BPTI(K15L)-Phagen, wenn diese Phagen von immobilisierter hNE eluiert werden. Die Profile können von einer Charge von immobilisierter Protease zur nächsten und mit dem Alter des immobilisierten Präparats variieren. Nichtsdestotrotz ermöglichen uns die relativen Gestalten der Profile, überlegene Inhibitoren zu identifizieren.
Ascenzi et al. (ASCE90) untersuchten die thermodynamischen Eigenschaften der Bindung von BPTI an den Gerinnungsfaktor X_a vom Menschen und vom Rind. Sie fanden heraus, dass K_A mehr als 30-fach abfiel, wenn der pH von 9 auf 5 abgesenkt wurde. Aufgrund des Histidins, das im aktiven Zentrum gefunden wird, treten derartige K_A-Veränderungen mit dem pH wahrscheinlich allgemein bei der Bindung von Serinproteasen an KuDoms (und andere Inhibitoren) auf. Der pH, bei dem diese Veränderungen auftreten, ist charakteristisch für die jeweilige Protease und den jeweiligen Inhibitor. Es kann festgestellt werden, dass das Protonieren des Histidins im aktiven Zentrum, wenn ein Inhibitor gebunden ist, umfasst, eine Ladung zu vergraben, was üblicherweise energetisch ungünstig ist. Der umgekehrte Effekt ist, dass ein Inhibitor, der sehr fest bindet, den pK_a des Imidazols für eine Protonierung effektiv senkt.
Innerhalb der gesamten Unterlagen verwendeten die Schüttelinkubationen Labquake-Schüttler.
Herstellung von immobilisierter menschlicher Neutrophilen-Elastase
Ein ml Reacti-Gel 6 × CDI aktivierte Agarose (Pierce Chemical Co.) in Aceton (200 μl gepackte Körner) wurde in eine leere Select-D-Zentrifugensäule (5Prime-3Prime) eingefüllt. Das Aceton wurde abgezogen und die Körner wurden zweimal schnell mit 1,0 ml eiskaltem Wasser und 1,0 ml eiskalter 100 mM Borsäure, pH 8,5, 0,9% NaCl gewaschen. Zweihundert μl von 2,0 mg/ml menschlicher Neutrophilen-Elastase (hNE) (CalBiochem, San Diego, CA) in Boratpuffer wurden den Körnern zugesetzt. Die Säule wurde verschlossen und durch Umwenden an einem Labquake-Schüttler bei 4°C 36 h gemischt. Die hNE-Lösung wurde abgezogen und die Körner wurden mit eiskaltem 2,0 M Tris, pH 8,0, über einen Zeitraum von 2 h bei 4°C gewaschen, um restliche reaktive Gruppen zu blockieren. Es wurde eine 50%-ige Aufschlämmung der Körner in TBS/BSA hergestellt. Dazu wurde ein gleiches Volumen von sterilem 100% Glycerol zugesetzt und die Körnern wurden als 25%-ige Aufschlämmung bei –20°C gelagert. Vor einer Verwendung wurden die Körner dreimal mit TBS/BSA gewaschen und es wurde eine 50%-ige Aufschlämmung in TBS/BSA hergestellt.
BEISPIEL I
CHARAKTERISIERUNG UND FRAKTIONIERUNG VON KLONAL REINEN POPULATIONEN VON PHAGEN, VON DENEN JEDER EIN EINZELNES CHIMÄRES APROTININ-HOMOLOG/M13-GEN III-PROTEIN PRÄSENTIERT:
Dieses Beispiel zeigt, dass chimäre Phagenproteine, die eine an eine Zielstruktur bindende Domäne präsentieren, von immobilisierter Zielstruktur durch Verringern des pH eluiert werden können, und der pH, bei dem das Protein eluiert wird, zeigt die Bindungsaffinität der Domäne für die Zielstruktur an.
Standardprozeduren:
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Manipulationen bei Raumtemperatur ausgeführt. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Zellen XL1-Blue^TM (Stratagene, La Jolla, CA).
1) Demonstration der Bindung von BPTI-III-MK-Phagen an aktive Trypsin-Körner
Wir haben gezeigt, dass BPTI-III präsentierende („display-") Phagen immobilisiertes aktives Trypsin binden. Die Demonstration der Bindung von Display-Phagen an immobilisierte aktive Protease und der nachfolgenden Rückgewinnung von infektiösen Phagen mit einem charakteristischen pH-Elutionsprofil erleichtert die Evaluierung von bestimmten Mutanten, da man nicht mehrere zehn Mikrogramm von jedem mutierten Protein herstellen und reinigen muss.
Der Phage MK wird von M13 abgeleitet, indem ein kan^R-Gen in die intergenische Region insertiert wird. BPTI-III-MK-Phagen werden von MK abgeleitet, indem für BPTI kodierende DNA in das Gen III zwischen den Codons, welche die Signalsequenz spezifizieren, und jenen, welche das reife Protein spezifizieren, insertiert wird. Der Phage MA wird von M13 abgeleitet, indem ein amp^R-Gen in die intergenische Region insertiert wird; der Phage BPTI-III-MA wird von Phage MA abgeleitet, indem bpti in III zwischen dem Signalpeptid und reifes III kodierenden Regionen insertiert wird. BPTI-III-MK und BPTI-III-MA präsentieren BPTI fusioniert an den Aminoterminus des Gen III-Proteins, ungefähr fünf Kopien pro Virion.
Fünfzig μl BPTF-III-MK-Phage (3,7·10¹¹ pfu/ml) in entweder 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,0 mg/ml BSA (TBS/BSA)-Puffer oder 50 mM Natriumcitrat, pH 6,5, 150 mM NaCl, 1,0 mg/ml BSA (CBS/BSA)-Puffer wurden zu 10 μl einer 25%-igen Aufschlämmung von immobilisiertem Trypsin (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) ebenfalls in TBS/BSA oder CBS/BSA hinzugesetzt. Als Kontrolle wurden 50 μl MK-Phage (9,3·10¹² pfu/ml) zu 10 μl einer 25%-igen Aufschlämmung von immobilisiertem Trypsin in entweder TBS/HSA- oder CBS/BSA-Puffer hinzugesetzt. Die Infektiosität des BPTI-III-MK-Phagen ist 25-mal geringer als jene des MK- Phagen; dementsprechend stellen die oben gewählten Bedingungen sicher, dass eine ungefähr äquivalente Anzahl von Phagenteilchen zu den Trypsin-Körnern hinzugesetzt werden. Nach 3 h Mischen auf einem Labquake-Schüttler (Labindustries Ind., Berkeley, CA) wurde 0,5 ml von entweder TBS/BSA oder CBS/BSA zu den Proben, wo passend, hinzugesetzt. Die Körner wurden 5 min gewaschen und durch Zentrifugation für 30 s zurückgewonnen. Der Überstand wurde entfernt und es wurde 0,5 ml TBS/0,1% Tween-20 hinzugesetzt. Die Körner wurden 5 min auf dem Schüttler gemischt und durch Zentrifugation zurückgewonnen. Der Überstand wurde entfernt und die Körner wurden weitere fünf Mal mit TBS/0,1% Tween-20 gewaschen, wie oben beschrieben. Schließlich wurden die Körner in 0,5 ml Elutionspuffer (0,1 M HCl, enthaltend 1,0 mg/ml BSA, eingestellt auf pH 2,2 mit Glycin) resuspendiert, 5 min gemischt und durch Zentrifugation zurückgewonnen. Die Überstandsfraktion wurde entfernt und durch die Zugabe von 130 μl 1 M Tris, pH 8,0 neutralisiert. Aliquots des neutralisierten Eluats wurden in LB-Brühe verdünnt und hinsichtlich Plaque-bildenden Einheiten titriert.
Ein signifikanter Prozentsatz des eingesetzten BPTI-III-MK-Phagen band an immobilisiertes Trypsin und wurde durch Waschen mit Elutionspuffer zurückgewonnen. Die Menge von Fusionsphage, der an die Körner band, war in TBS-Puffer (pH 7,5) höher als in CBS-Puffer (pH 6,5). Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die Affinität von BPTI für Trypsin bei pH 7,5 höher ist als bei pH 6,5 (VINC72, VINC74). Ein viel geringerer Prozentsatz des MK-Kontrollphagen (welcher kein BPTI präsentierte) band an immobilisiertes Trypsin und diese Bindung war pH-unabhängig. Bei pH 6,5 banden 1675-mal mehr BPTI-III-MK-Phagen als MK-Phagen an Trypsin-Körner, während bei pH 7,5 ein 2103-facher Unterschied beobachtet wurde. Dementsprechend haften BPTI präsentierende Fusionsphagen an aktiven Trypsin-Körnern und können als infektiöse Phagen zurückgewonnen werden.
Erzeugung von P1-Mutanten von BPTI
Um die Spezifität der Wechselwirkung von BPTI-III-Fusionsphagen mit immobilisierten Serinproteasen zu demonstrieren, wurden Einzelaminosäuresubstitutionen an der P1-Position (Rest 15 von BPTI) des BPTI-III-Fusionsproteins eingeführt. Die K15L-Veränderung wird gewünscht, da BPTI(K15L) ein mäßig guter Inhibitor der menschlichen Neutrophilen-Elastase (HNE) (K_d = 2,9·10^–9 M) (BECK88b) und ein schlechter Inhibitor von Trypsin ist. Fusionsphagen, die BPTI(K15L) präsentieren, binden an immobilisierte HNE, aber nicht an immobilisiertes Trypsin. BPTI-III-MK-Fusionsphagen zeigen den entgegengesetzten Phänotyp (binden an Trypsin, binden aber nicht an HNE). Diese Beobachtungen veranschaulichen die Bindungsspezifität von BPTI-III-Fusionsphagen für immobilisierte Serinproteasen.
Charakterisierung der Affinität von BPTI-III-MK- und BPTI(K15L)-III-MA-Phagen für immobilisiertes Trypsin und menschliche Neutrophilen-Elastase
Dreißig μl BPTI-III-MK-Phagen in TBS/BSA (1,7·10¹¹ pfu/ml) wurden zu 5 μl einer 50%-igen Aufschlämmung von entweder immobilisierter menschlicher Neutrophilen-Elastase oder immobilisiertem Trypsin (Pierce Chemical Co.) ebenfalls in TBS/BSA zugesetzt. In ähnlicher Weise wurden 30 μl BPTI(K15L)-III-MA-Phage in TBS/BSA (3,2·10¹⁰ pfu/ml) zu entweder immobilisierter HNE oder immobilisiertem Trypsin hinzugesetzt. Die Proben wurden auf einem Labquake-Schüttler 3 h gemischt. Die Körner wurden mit 0,5 ml TBS/BSA 5 min gewaschen und durch Zentrifugation zurückgewonnen. Der Überstand wurde entfernt und die Körner wurden fünfmal mit 0,5 ml TBS/0,1% Tween-20 gewaschen. Schließlich wurden die Körner in 0,5 ml Elutionspuffer (0,1 M HCl, enthaltend 1,0 mg/ml BSA, eingestellt auf pH 2,2 mit Glycin) resuspendiert, 5 min gemischt und durch Zentrifugation zurückgewonnen. Die Überstandfraktion wurde entfernt, mit 130 μl 1 M Tris, pH 8,0 neutralisiert, in LB-Brühe verdünnt und hinsichtlich Plaque-bildenden Einheiten titriert.
Auswirkung des pH auf die Dissoziation von gebundenem BPTI-III-MK und BPTI(K15L)-III-MA-Phagen von immobilisierter Neutrophilen-Elastase
Die Affinität eines gegebenen Fusionsphagens für eine immobilisierte Serinprotease kann auf der Grundlage der Menge von gebundenem Fusionsphagen, welche von den Körnern durch Waschen mit einem stufenweise verlaufenden Gradienten, der beispielsweise von ungefähr pH 7,0 bis ungefähr pH 2,2 in Stufen von 1 oder 0,5 pH-Einheiten verläuft, eluiert, charakterisiert werden. Da die Affinität der oben beschriebenen BPTI-Varianten für HNE nicht hoch ist (K_d > 1·10^–9 M) haben wir antizipiert, dass Fusionsphagen, die diese Varianten präsentieren, bei einem pH über 2,2 von HNE-Körner abdissoziieren könnten. Darüber hinaus könnten Fusionsphagen von HNE-Körnern bei einem speziellen pH, der für die präsentierte spezielle BTPI-Variante charakteristisch ist, abdissoziieren. Es könnten Puffer mit niedrigem pH, welche stringente Waschbedingungen bereitstellen, erforderlich sein, um Fusionsphagen, welche eine BPTI-Variante mit einer hohen Affinität für HNE präsentieren, abzudissoziieren, wohingegen neutrale pH-Bedingungen ausreichend sein könnten, um einen Fusionsphagen, welcher eine BPTI-Variante mit einer schwachen Affinität für HNE präsentiert, abzulösen.
Dreißig μl BPTI(K15L)-III-MA-Phage (1,7·10¹⁰ pfu/ml in TBS/BSA) wurden zu 5 μl einer 50%-igen Aufschlämmung von HNE-Körnern ebenfalls in TBS/BSA hinzugesetzt. In ähnlicher Weise wurden 30 μl BPTI-III-MA-Phage (8,6·10¹⁰ pfu/ml in TBS/BSA) zu 5 μl HNE-Körnern hinzugesetzt. Dementsprechend wurde eine ungefähr äquivalente Anzahl von Phagenteilchen zu den Körnern hinzugesetzt. Proben wurden 3 h unter Schütteln inkubiert. Die Körner wurden mit 0,5 ml TBS/BSA 5 min unter Schütteln gewaschen, durch Zentrifugation zurückgewonnen und der Überstand entfernt. Die Körner wurden mit 0,5 ml TBS/0,1% Tween-20 5 min gewaschen und durch Zentrifugation zurückgewonnen. Es wurden vier zusätzliche Waschschritte mit TBS/0,1% Tween-20 ausgeführt. Die Körner wurden mit 0,5 ml 100 mM Natriumcitrat, pH 7,0, enthaltend 1,0 mg/ml BSA, gewaschen. Die Körner wurden durch Zentrifugation zurückgewonnen und der Überstand wurde entfernt. Die HNE-Körner wurden nacheinander mit einer Reihe von 100 mM Natriumcitrat, 1,0 mg/ml BSA-Puffern von pH 6,0, 5,0, 4,0 und 3,0 und schließlich mit dem 2,2-Elutionspuffer gewaschen. Die pH-Waschlösungen wurden durch die Zugabe von 1 M Tris, pH 8,0, neutralisiert, in LB-Brühe verdünnt und hinsichtlich Plaque-bildenden Einheiten titriert.
Tabelle 203 veranschaulicht, dass ein geringer Prozentsatz der eingesetzten BPTI-III-MK-Fusionsphagen an den HNE-Körnern haftete und überwiegend in den Waschflüssigkeiten mit pH 7,0 und 6,0 zurückgewonnen wurde. Ein signifikant höherer Prozentsatz der BPTI(K15L)-III-MA-Phagen band an die HNE-Körner und wurde überwiegend in den Waschflüssigkeiten mit pH 5,0 und 4,0 zurückgewonnen. Dementsprechend sind Bedingungen niedrigeren pHs (d. h. stringentere Bedingungen) erforderlich, um BPTI(K15L)-III-MA-Phagen gegenüber BPTI-MK-Phagen von immobilisierter HNE abzudissoziieren. Die Affinität von BPTI(K15L) ist über 1000-mal höher als jene von BPTI für HNE (unter Verwendung der berichteten K_d-Werte (BECK88b)). Dies legt folglich nahe, dass Bedingungen niedrigeren pHs erforderlich sind, um Fusionsphagen, welche eine BPTI-Variante mit einer höheren Affinität für HNE präsentieren, abzudissoziieren.
Auswirkung einer Mutation der Reste 39–42 von BPTI(K15L) auf dessen Affinität für immobilisierte HNE
Dreißig μl BPTI(K15L,MGNG)-III-MA-Phage (9,2·10⁹ pfu/ml in TBS/BSA) wurden zu 5 μl einer 50%-igen Aufschlämmung von immo bilisierter HNE ebenfalls in TBS/BSR hinzugesetzt. In ähnlicher Weise wurden 30 μl BPTI(K15L)-III-MA-Phage (1,2·10¹⁰ pfu/ml in TBS/BSA) zu immobilisierter HNE hinzugesetzt. Die Proben wurden 3 h unter Schütteln inkubiert. Die Körner wurden 5 min mit 0,5 ml TBS/BSA gewaschen und abzentrifugiert. Die Körner wurden fünfmal mit 0,5 ml TBS/0,1% Tween-20 gewaschen. Schließlich wurden die Körner nacheinander mit einer Reihe von 100 mM Natriumcitrat-Puffern mit pH 7,0, 6,0, 5,5, 5,0, 4,75, 4,5, 4,25, 4,0 und 3,5 gewaschen. Die pH-Waschflüssigkeiten wurden neutralisiert, in LB-Brühe verdünnt und hinsichtlich Plaque-bildenden Einheiten titriert.
Es banden nahezu zweimal so viele BPTI(K15L,MGNG)-III-MA-Phagen als BPTI(K15L)-III-MA-Phagen an HNE-Körner. In beiden Fällen enthielt die pH 4,75-Fraktion den größten Anteil von rückgewonnenen Phagen, was bestätigt, dass das Ersetzen der Reste 39–42 von Wildtyp-BPTI durch M₃₉GNG aus BI-8e die Bindung der BPTI(K15L)-Variante an HNE verstärkt.
Konstruktion von BPTI(K15V,R17L)-III-MA
BPTI(K15V,R17L) zeigt die höchste Affinität für HNE von jeglichen BPTI-Varianten, die bislang beschrieben worden sind (K_d = 6·10^–11 M) (AUER89). Um das Elutionssystem zu testen, wurde ein Phage, der dieses BPTI(K15V,R17L) präsentiert, erzeugt und als Referenzphage verwendet, um die Affinität von Fusionsphagen, welche eine BPTI-Variante mit bekannter Affinität für freies HNE präsentieren, zu charakterisieren.
Affinität von BPTI(K15V,R17L)-III-MA-Phagen für immobilisierte HNE
Vierzig μl BPTI (K15,R17L)-III-MA-Phage (9,8·10¹⁰ pfu/ml) in TBS/BSR wurden zu 10 μl einer 50%-igen Aufschlämmung von immobilisierter HNE ebenfalls in TBS/BSA hinzugesetzt. In ähnlicher Weise wurden 40 μl BPTI(K15L,MGNG)-III-MA-Phage (5,13·10⁹ pfu/ml) in TBS/BSA zu immobilisierter HNE hinzugesetzt. Die Proben wurden 1,5 h geschüttelt. Die Körner wurden einmal 5 min mit 0,5 ml TBS/BSA und dann fünfmal mit 0,5 ml TBS/1,0% Tween-20 gewaschen. Die Körner wurden dann nacheinander mit einer Reihe von 50 mM Natriumcitrat-Puffern von pH 7,0, 6,0, 5,0, 4,5, 4,0, 3,74, 3,5 und 3,0, welche 150 mM NaCl, 1,0 mg/ml BSA enthielten, gewaschen. Für BPTI(K15L,MGNG)-IIF-MA wurden die Wäschen bei pH 3,75 und 3,0 ausgelassen. Bei jedem pH wurden zwei Waschschritte ausgeführt und die Überstände vereinigt, mit 1 M Tris, pH 8,0 neutralisiert, in LB-Brühe verdünnt und hinsichtlich Plaque-bildenden Einheiten titriert.
Die pH 4,5- und 4,0-Fraktionen enthielten den größten Anteil der zurückgewonnenen BPTI(K15V,R17L)-III-MA-Phagen. BTPI(K15L,MGNG)-III-MA-Phagen wurden wie BPTI(K15L)-III-MA-Phagen überwiegend in den pH 5,0- und 4,5-Fraktionen zurückgewonnen, wie oben. Die Affinität von BPTI(K15V,R17L) ist 48-mal höher als jene von BPTI(K15L) für HNE (unter Verwendung der K_d-Werte, AUER89, für BPTI(K15V,R17L) und BECK88b für BPTI (K15L)). Dass das pH-Elutionsprofil für BPTI (K15V,R17L)-III-MA-Phagen einen Peak bei pH 4,0 zeigt, während das Profil für BPTI(K15L)-III-MA-Phagen einen Peak bei pH 4,5 zeigt, unterstützt die Behauptung, dass niedrigere pH-Bedingungen erforderlich sind, um von immobilisierter HNE Fusionsphagen abzudissoziieren, welche eine BPTI-Variante mit einer höheren Affinität für freies HNE präsentieren.
BEISPIEL 22
BPTI-Derivate mit hoher Affinität für hNE
Wir haben bewirkt, dass BPTI-Mutanten an der Oberfläche von von M13 abgeleiteten Display-Phagen als aminoterminale Fusionen an das Gen III-Protein (gIIIp) erscheinen; M13 weist ungefähr fünf Kopien von gIIIp pro Virion auf. Unsere Phagenbibli othek umfasste theoretisch die 1728 BPTI-Mutanten mit PHE, LEU, ILE, VAL oder MET an den Positionen 15 und 17, GLY oder ALA an Position 16, PHE, SER, THR oder ILE an Position 18 und SER, PRO, THR, LYS oder GLN an Position 19 als Ergebnis einer Expression eines BPTI-Gens (welches für die vorerwähnte MGNG-Mutation kodiert), welches einer kontrollierten zufallsgesteuerten Mutagenese unterzogen und hinsichtlich hNE-bindender Aktivität gescreent worden ist, indem Phagen, die die Mutanten tragen, mit immobilisierter hNE inkubiert wurden und die Phagen mit zunehmend saureren Puffer eluiert wurden. Es wurden zwanzig Mutanten (siehe Klonbezeichnungen in den Tabellen 207– 208) für eine Sequenzierung ausgewählt und diese zeigten acht einzigartige Sequenzen. Die Tabellen 207 und 208 zeigen die Sequenzen von neun (den acht plus einer anderen, die in einer Pilotstudie identifiziert worden war) BPTI-Derivaten mit hoher Affinität für hNE. EpiNE1, EpiNE3, EpiNE5, EpiNE6 und EpiNE7 eluierten bei pH 3,5; EpiNE2, EpiNE4 und EpiNE8 bei pH 3,5–4.
Dass pH-Bedingungen unter 4,0 erforderlich sind, um EpiNE1, EpiNE3 und EpiNE7 tragende Phagen von immobilisierter HNE zu eluieren, legt nahe, dass sie BPTI-Varianten mit einer höheren Affinität für HNE als BPTI(K15L,R17L) präsentieren.
EpiNE1, EpiNE3 und EpiNE7 wurden als lösliche Proteine exprimiert und auf HNE-Inhibitionsaktivität durch den fluorometrischen Assay von Castillo et al. (CAST79) analysiert; die Daten wurden durch die Methode von Green und Work (GREE53) analysiert. EpiNE1, EpiNE3 und EpiNE7 sind als freie Proteine sowohl in E. coli als auch in Hefe produziert worden. Die Fähigkeit dieser Proteine, hNE zu hemmen, wurde gemessen, indem die Spaltung eines fluorogenen Substrats verfolgt wurde. Die K_i für diese Verbindungen beträgt 1 pM, 3 pM und 3 pM. Es werden Phagen, die EpiNE1 präsentieren, verwendet, um ein Referenz-pH-Elutionsprofil zu erstellen, um eine schnelle Charakterisierung von anderen KuDom-Inhibitoren, die auf Phagen präsentiert werden, zu ermöglichen. Alle der aufgelisteten EpiNEs haben niedrigere K_ds als BPRI(K15V,R17L) (60 pM).
Eine Untersuchung der Sequenzen der EpiNE-Klone bringt Licht ins Dunkel. Es zeigt sich eine starke Präferenz für entweder VAL oder ILE an der P1-Position (Rest 15), wobei VAL gegenüber ILE im Verhältnis 14 zu 6 begünstigt ist. Es wurden keine Beispiele von LEU, PHE oder MET an der P1-Position beobachtet, obwohl die gescreente Bibliothek theoretisch Mutanten mit diesen Aminosäuren an P1 umfasst haben sollte. Dies stimmt überein mit der Beobachtung, dass BPTI-Varianten mit Einzelaminosäuresubstitutionen von LEU, PHE oder MET für LYS₁₅ eine signifikant niedrigere Affinität für HNE zeigen als ihre Gegenstücke, die entweder VAL oder ILE enthalten (BECK88b).
PHE ist an Position 17 stark begünstigt, wobei es bei 12 von 20 Klonen auftritt. MET ist der zweithäufigste Rest an dieser Position, tritt aber nur auf, wenn sich VAL an Position 15 befindet. An Position 18 wurde PHE in allen 20 sequenzierten Klonen beobachtet, sogar obwohl die Bibliothek andere Reste an dieser Position umfasst haben sollte. Dieses Ergebnis ist recht überraschend und konnte ausgehend von früheren Mutationsanalysen von BPTI, Modellerstellung oder aufgrund von irgendwelchen theoretischen Gründen nicht vorhergesagt werden. Wir schließen daraus, dass die Anwesenheit von PHE an Position 18 die, Fähigkeit von jedem der EpiNEs, an HNE zu binden, signifikant erhöht. Schließlich tritt an Position 19 PRO in 10 von 20 Codons auf, während SER, der zweithäufigste Rest, bei 6, von 20 Codons auftritt. Von den Resten, die für eine Mutagenese in der vorliegenden Studie zielgerichtet angesteuert wurden, ist Rest 19 derjenige, der der Kante der Wechselwirkungsoberfläche eines Inhibitors mit HNE am nächsten liegt. Nichtsdestotrotz wird ein Überwiegen von PRO beobachtet und könnte anzeigen, dass PRO an 19, wie PHE an 18, die Bindung dieser Proteine an HNE verstärkt. Interessanterweise erscheint EpiNE5 nur einmal und unterscheidet sich von EpiNE1 nur an Position 19; in gleicher Weise unterscheidet sich EpiNE6 von EpiNE3 nur an Position 19. Diese Veränderungen; in ähnlicher Weise unterscheidet sich EpiNE6 von EpiNE3 nur an Position 19. Diese Veränderungen können nur eine geringfügige Auswirkung auf die Fähigkeit dieser Proteine, mit HNE zu Wechselwirken, haben. Dies wird durch die Tatsache unterstützt, dass die pH-Elutionsprofile für EpiNE5 und EpiNE6 sehr ähnlich zu jenen von EpiNE1 bzw. EpiNE3 sind.
Nur EpiNE2 und EpiNE8 zeigen pH-Profile, die sich von jenen der anderen ausgewählten Klone unterscheiden. Beide Klone enthalten LYS an Position 19, was die Wechselwirkung von BPTI mit HNE einschränken könnte. Wir können jedoch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass andere Veränderungen innerhalb von EpiNE2 und EpiNE8 (R15L bzw. Y21S) deren Affinität für HNE beeinflussen.
Position 18 ist zuvor nicht als eine Schlüsselposition bei der Bestimmung der Spezifität oder Affinität von Aprotinin-Homologen oder -Derivaten für bestimmte Serinproteasen identifiziert worden. Ebensowenig ist darüber berichtet oder gemutmaßt worden, dass Phenylalanin an Position 18 Spezifität und hohe Affinität für HNE verleihen wird.
BEISPIEL III
BPTI-Derivate mit hoher Affinität für hCG
Die gleiche Bibliothek von BPTI-Mutanten tragenden Phagen wurde gleichfalls auf Cathepsin G-bindende Aktivität gescreent. 7 zeigt die Bindungs- und pH-Profile für die individuellen Cat G-bindenden Klone (bezeichnet als EpiC-Varianten). Alle Klone zeigten kleinere Peaks, welche einen graduellen Abfall von gebunden Phagen überlagern, bei Elutionen bei pH 5 (Klone 1, 8, 10 und 11) oder pH 4,5 (Klon 7). Tabelle 209 gibt Klone an, die eine Bindung an Cat G-Körner zeigen.
Ein Vergleich der pH-Profile, die für die EpiC-Varianten mit Cat G und die EpiNE-Varianten für hNE erstellt wurden, zeigt, dass die EpiNE-Varianten eine hohe Affinität für hNE aufweisen, wohingegen die EpiC-Varianten eine moderate Affinität für Cat G aufweisen.
Der P1-Rest in den EpiC-Mutanten ist überwiegend MET mit einem Beispiel von PHE, während er in BPTI LYS ist und in den EpiNE-Varianten entweder VAL oder LEU ist. In den EpiC-Mutanten ist der Rest 16 überwiegend ALA mit einem Beispiel von GLY und der Rest 17 ist PHE, ILE oder LEU. Interessanterweise scheinen die Reste 16 und 17 eine Paarbildung infolge komplementärer Größe zu zeigen, wenigstens in dieser kleinen Probe. Der kleine GLY-Rest zeigt eine Paarbildung mit dem sperrigen PHE, während der relativ größere ALA-Rest eine Paarbildung mit den weniger sperrigen LEU und ILE eingeht. Die Hauptmenge der verfügbaren Reste in der MYMUT-Bibliothek für die Positionen 18 und 19 ist in den EpiC-Varianten repräsentiert.
BEISPIEL IV
ITI:D1-Derivate mit hoher Affinität für hNE
Konstruktion des Display-Vektors (Präsentationsvektors).
Wir verwenden die Nukleinsäurenumerierung des ITI-leichte-Kette-Gens, welche in TRAB86 gefunden wird, und die für UTI in 1 von GEBH86 gezeigte Aminosäurenumerierung. Wir manipulierten DNA gemäß Standardmethoden, wie in SAMB89 und AUSU87 beschrieben.
Die Proteinsequenz von menschlichem ITI-D1 besteht aus 56 Aminosäureresten, die sich von LYS₂₂ bis ARG₇₇ der vollständigen Sequenz der leichten Kette von ITI erstrecken. Diese Sequenz wird durch die 168 Basen zwischen den Positionen 750 und 917 in der in TRAB86 aufgeführten cDNA-Sequenz kodiert. Diese Aminosäuresequenz kodierende DNA wurde durch Standardmaßnahmen in das M13-Gen iii insertiert. Phagenisolate, die das ITI-DI-III-Fusionsgen enthalten, werden als MA-ITI bezeichnet und tragen ein amp^R-Gen. Eine Expression des ITI-D1::III-Fusionsproteins und dessen Präsentation auf der Phagenoberfläche wurden durch Western-Analyse und Phagen-Titer-Neutralisierungsexperimente mit Kaninchen-anti(hITI)-Serum gezeigt.
Fraktionierung von an Körner von mittels Agarose immobilisierter Protease gebundenen MA-ITI-Phagen.
Um zu testen, ob Phagen, die das ITI-D1-III-Fusionsprotein präsentieren, stark mit den Proteasen menschliche Neutrophilen-Elastase (hNE) oder Cathepsin G wechselwirken, wurden Aliquots von Display-Phagen mit Körnern von mittels Agarose immobilisierter hNE oder von mittels Agarose immobilisiertem Cathepsin G (hNE-Körnern bzw. Cat-G-Körnern) inkubiert. Die Körner wurden gewaschen und gebundener Phage durch pH-Fraktionierung eluiert. Der Gang bei der Senkung des pHs war: pH 7,0, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5 und 2,0. Nach Elution und Neutralisierung wurden die verschiedenen Fraktionen von eingesetztem Material, Waschflüssigkeiten und Material aus den pH-Elutionen titriert.
Die Ergebnisse von mehreren Fraktionierungen sind in Tabelle 212 (EpiNE-7 oder MTA-ITI-Phagen, gebunden an hNE-Körner) und Tabelle 213 (EpiC-10- oder MA-ITI-Phagen, gebunden an Cat-G-Körner) zusammengefasst. Für die beiden Typen von Körnern (hNE oder Cat-G) waren die pH-Elutionsprofile, die unter Verwendung des Kontroll-Display-Phagen (EpiNE-7 bzw. EpiC-10) erhalten wurden, ähnlich zu jenen, die zuvor festgestellt wurden. Ungefähr 0,3% der EpiNE-7-Display-Phagen, die auf die hNE-Körner aufgetragen worden waren, wurden während der Fraktionierungsprozedur eluiert und das Elutionsprofil wies ein Maximum für die Elution bei ungefähr pH 4,0 auf. Es wurde ein kleinerer Bruchteil, 0,02%, der EpiC-10-Phagen, die auf die Cat-G-Körner aufgetragen worden waren, eluiert und das Elutionsprofil zeigte ein Maximum nahe pH 5,5.
Bei den MA-ITI-Phagen gibt es Nachweise für eine hohe Affinität weder für auf Agarosekörnern immobilisierte hNE noch für auf Agarosekörnern immobilisiertes Cathepsin-G. Die pH-Elutionsprofile für MA-ITI-Phagen, gebunden an hNE- oder Cat-G-Körner, zeigen im wesentlichen monotone Abnahmen bei der Pha genrückgewinnung mit fallendem pH. Ferner waren die gesamten Bruchteile der auf die Körner aufgetragenen Phagen, die während der Fraktionierungsprozeduren rückgewonnen wurden, relativ niedrig: 0,002% von hNE-Körnern und 0,003% von Cat-G-Körnern.
Veröffentlichte Werte von K_i für die Inhibition von Neutrophilen-Elastase durch das intakte große (M_r = 240000) ITI-Protein reichen von 60 bis 150 nM und es ist über Werte zwischen 20 und 6000 nM für die Inhibition von Cathepsin G durch ITI berichtet worden (SWAI88, ODOM90). Unsere eigenen Messungen von pH-Fraktionen von Display-Phagen, welche an hNE-Körner gebunden sind, zeigen, dass Phagen, welche Proteine mit niedriger Affinität (> μM) für hNE präsentieren, durch die Körner nicht gebunden werden, während Phagen, welche Proteine mit höherer Affinität (nM) präsentieren, an die Körner binden und bei etwa pH 5 eluiert werden. Wenn die erste KuDom der leichten Kette von ITI allein für die inhibitorische Aktivität von ITI gegenüber hNE verantwortlich ist und wenn diese Domäne auf dem MA-ITI-Phagen korrekt präsentiert wird, dann scheint es, dass die minimale Affinität eines Inhibitors für hNE, die eine Bindung und Fraktionierung von Display-Phagen an hNE-Körnern. erlaubt, 50 bis 100 nM ist.
Veränderung der P1-Region von ITI-D1.
Wenn ITI-D1 und EpiNE-7 in Lösung die gleiche Konfiguration wie BPTI annehmen, dann haben diese beiden Polypeptide sowohl in der primären als auch der sekundären Bindungsschleife identische Aminosäuresequenzen mit Ausnahme von vier Resten im Bereich der P1-Position und an den Positionen 11 und 34. Für ITI-D1 ist die Sequenz für die Positionen 15 bis 20 (in ITI-D1 entspricht Position 15 Position 36 in der UTI-Sequenz von GEBH86):
Diese beiden Proteine unterscheiden sich in ihren Affinitäten für hNE stark. Um die Affinität von ITI-D1 für hNE zu verbessern, wurde die EpiNE-7-Sequenz durch Kassetten-Mutagenese in die ITI-D1-Sequenz an den Positionen 15 bis 20 inkorporiert. Phagen, die das ITI-D1-III-Fusionsgen mit den EpiNE-7-Veränderungen im Bereich der P1-Position enthalten, werden als MA-ITI-E7 bezeichnet.
Fraktionierung von MA-ITI-E7-Phagen.
Um zu untersuchen, ob die Veränderungen an den Positionen 15, 16, 18 und 19 des ITI-D1-III-Fusionsproteins die Bindung von Display-Phagen an hNE-Körner beeinflussen, wurden abgekürzte pH-Elutionsprofile gemessen. Aliquots von EpiNE-7, MA-ITI und MA-ITI-E7-Display-Phagen wurden mit hNE-Körnern drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Körner wurden gewaschen und Phagen wurden eluiert, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass nur drei pH-Elutionen ausgeführt wurden: pH 7,0, 3,5 und 2,0. Die Ergebnisse dieser Elutionen sind in Tabelle 214 gezeigt.
Es wurde festgestellt; dass Bindung und Elution der EpiNE-7- und MA-ITI-Display-Phagen so waren, wie beschrieben. Der gesamte Bruchteil von eingesetzten Phagen war für den EpiNE-7-Phagen hoch (0,4%) und für den MA-ITI-Phagen niedrig (0,0010. Ferner zeigte der EpiNE-7-Phage eine maximale Phagenelution in der pH 3,5-Fraktion, während der MA-ITI-Phage nur eine monoto ne Abnahme der Phagenausbeuten mit abnehmendem pH zeigte, wie oben festgestellt wurde.
Der MA-ITI-E7-Phage zeigt bezogen auf MA-ITI-Phagen erhöhte Bindungsausmaße an hNE-Körner. Der gesamte Bruchteil der eingesetzten Phagen, welcher von den Körnern eluiert wird, ist für beide MA-ITI-E7-Phagenstämme zehnmal höher als für den MA-ITI-Phagen (obwohl noch vierzigmal niedriger als bei EpiNE-7-Phagen). Ferner zeigen die pH-Elutionsprofile der MA-ITI-E7-Phagenstämme maximale Elutionen in den pH 3,5-Fraktionen, ähnlich zu dem EpiNE-7-Phagen.
Um die Bindungseigenschaften von MA-ITI-E7-Phagen weiter zu definieren, wurde die zuvor beschriebene ausgedehnte pH-Fraktionierungsprozedur unter Verwendung von an hNE-Körner gebundenen Phagen ausgeführt, wie in Tabelle 215 gezeigt. Das pH-Elutionsprofil von EpiNE-7-Display-Phagen ist, wie zuvor beschrieben. In diesem höher aufgelösten pH-Elutionsprofil zeigen die MA-ITI-E7-Phagen ein breites Elutionsmaximum mit einem Zentrum im Bereich von pH 5. Wieder war der gesamte Bruchteil von MA-ITI-E7-Phagen, welcher bei einer pH-Elution ausgehend von hNE-Körnern erhalten wird, ungefähr vierzigfach geringer als jener, der unter Verwendung von EpiNE-7-Display-Phagen erhalten wird.
Das pH-Elutionsverhalten von an hNE-Körner gebundenem MA-ITI-E7-Phagen ist qualitativ ähnlich zu jenem, welches bei Verwendung von BPTI[K15L]-III-MA-Phagen festgestellt wird. BPTI mit der K15L-Mutation weist eine Affinität für hNE von ~3·10^–9 M auf. Unter der Annahme, dass ansonsten alles gleich bleibt, legt das pH-Elutionsprofil für MA-ITI-E7 nahe, dass die Affinität der freien ITI-D1-E7-Domäne für hNE im nM-Bereich liegt. Dementsprechend hat die Substitution der EpiNE-7-Sequenz anstelle der ITI-D1-Sequenz im Bereich der P1-Region eine offen sichtlich 20- bis 50-fach erhöhte Affinität für hNE erzeugt (unter der Annahme, dass K_i = 60 bis 150 nM für ITI-D1).
Wenn EpiNE-7 und ITI-D1-E7 in Lösung die gleiche Struktur aufweisen, präsentieren diese Proteine im Bereich der gesamten Wechselwirkungsoberfläche die gleichen Aminosäuresequenzen gegenüber hNE. Trotz dieser Ähnlichkeit zeigt EpiNE-7 eine grob 1000-fach höhere Affinität für hNE als dies ITI-D1-E7 tut. Diese Beobachtung betont die Bedeutung von nicht in Kontakt tretenden sekundären Resten bei der Modulierung von Wechselwirkungsstärken.
Die leichte Kette von ITI ist an SER10 und ASN45 glycosyliert (GEBH86). Es ist gezeigt worden, dass die Entfernung der Glycosaminoglycanketten die Affinität des Inhibitors für hNE ungefähr 5-fach verringert (SELL87). Ein anderer potentiell wichtiger Unterschied zwischen EpiNE-7 und ITI-D1-E7 ist jener der Nettoladung. BPTI hat die Ladung +6, während EpiNE7 die Ladung +1 hat und ITI-D1 die Ladung –1 hat. Darüber hinaus resultiert die Ladungsveränderung zwischen diesen beiden Molekülen aus Unterschieden in den zentralen Abschnitten der Moleküle, die sich in der Nachbarschaft zu der Bindungsoberfläche befinden. Position 26 ist in EpiNE-7 LYS und ist in ITI-D1-E7 THR, während sich an Position 31 die Reste GLN bzw. GLU befinden. Diese Sequenzveränderungen verändern nicht nur die molekulare Nettoladung, sondern plazieren auch eine negative Ladung in der Nähe der Wechselwirkungsoberfläche in ITI-D1-E7. Es könnte sein, dass das Auftreten einer negativen Ladung an Position 31 (welche in jeglichen anderen hNE-Inhibitoren, die hier beschrieben werden, nicht gefunden wird) die Inhibitor-Protease-Wechselwirkung destabilisierte.
Herstellung von BITI-E7-Phagen
Wir ersetzten K₁EDS von ITI-D1 durch R₁PDF aus EpiNE7, um den Phagen MA-BITI-E7 herzustellen. Phe₄ von BPTI ist ein Teil des hydrophoben Kerns des Proteins; ein Ersatz durch Serin könnte die Stabilität oder den dynamischen Charakter von ITI-E7 in ungünstiger Weise verändern. ITI-E7 weist ein negativ geladenes Glu an Position 2 auf, während EpiNe7 Pro aufweist.
Wir nahmen die gleichen Veränderungen an dem mutmaßlichen Aminoterminus des ITI-III-Fusionsproteins, das durch den Phagen MA-ITI präsentiert wird, vor. Dieser Phage wurde als MA-BITI bezeichnet.
Wir verglichen die Eigenschaften der durch die Phagen MA-ITI und MA-BITI präsentierten ITI-III-Fusionsproteine unter Verwendung einer Western-Analyse. Wir stellten keine signifikanten Unterschiede bei der scheinbaren Größe oder relativen Häufigkeit der durch einen der beiden Display-Phagenstämme produzierten Fusionsproteine fest. Dementsprechend gibt es keine großen Unterschiede bei den prozessierten Formen der beiden Fusionsproteine, die auf den Phagen präsentiert werden. In Erweiterung gibt es auch keine großen Unterschiede bei den prozessierten Formen der Gen III-Fusionsproteine, die von MA-ITI-E7 und MA-EpiNE7 präsentiert werden. Es ist dementsprechend nicht wahrscheinlich, dass große Veränderungen in der Proteinkonformation aufgrund einer stark veränderten Prozessierung für die großen Unterschiede bei der Bindung an hNE-Körner, die durch MA-ITI-E7- und MA-EpiNE7-Display-Phagen gezeigt werden, verantwortlich sind.
Wir charakterisierten die Bindungseigenschaften von MA-BITI- und MA-BITI-E7-Display-Phagen an hNE-Körner unter Verwendung der zuvor beschriebenen ausgedehnten pH-Fraktionierungsprozedur, siehe Tabelle 216. Das pH-Elutionsprofil von MA-EpiNE7-Display-Phagen, die an hNE-Körner gebunden sind, ist ähnlich zu jenem, das zuvor beschrieben wurde. Die pH-Elutionsprofile für MA-BITI und MA-BITI-E7 zeigen signifikante Unterschiede gegenüber den Profilen, die MA-ITI und MA-ITI-E7 zeigen (siehe Tabellen 212 und 215). In beiden Fällen produzieren die Veränderungen an dem mutmaßlichen Aminoterminus des präsentierten Fusionsproteins eine mehrfache Zunahme des Bruchteils der eingesetzten Display-Phagen, welcher von den hNE-Körnern eluiert wird.
Die Bindungskapazität von hNE-Körnern für Display-Phagen variiert zwischen den Körner-Präparaten und mit dem Alter für jedes individuelle Präparat von Körnern. Dementsprechend sollte man die relativen Gestalten von Profilen, die mittels Körnern von im wesentlichen dem gleichen Alter und aus derselben Charge erhalten werden, vergleichen. Beispielsweise variiert der Bruchteil von MA-EpiNE7-Display-Phagen, der von hNE-Körnern zurückgewonnen wird, zweifach zwischen den Experimenten, die in den.. Tabellen 212, 215 und 216 gezeigt sind, und ausgehend von Ergebnissen, die anderswo in den vorliegenden Unterlagen angegeben sind. Jedoch sind die Gestalten der pH-Elutionsprofile recht ähnlich. Es ist möglich, eine näherungsweise Korrektur hinsichtlich der Schwankungen bei der Bindungskapazität von hNE-Körnern vorzunehmen, indem Display-Phagen-Ausbeuten hinsichtlich der Gesamtausbeute von MA-EpiNE7-Phagen, die von den Körnern bei einer gleichzeitig erfolgenden Elution zurückgewonnen werden, normalisiert werden. Wenn die in den Tabellen 212, 215 und 216 gezeigten Daten so normalisiert werden, sind die Rückgewinnungen von Display-Phagen bezogen auf rückgewonnenes MA-EpiNE7:

Display-Phagen-Stamm normalisierter Bruchteil des eingesetzten Materials

MA-ITI 0,0067

MA-BITI 0,027

MA-ITI-E7 0,027

MA-BITI-E7 0,13
Dementsprechend produzieren die Veränderungen der aminoterminalen Sequenz des präsentierten Fusionsproteins eine drei- bis fünffache Zunahme des Bruchteils von von hNE-Körnern eluierten Phagen. Während MA-ITI-E7 mit einem breiten pH-Maximum mit einem Zentrum im Bereich von pH 5,0 eluiert, weist das pH-Elutionsprofil für MA-BITI-E7-Phagen ein pH-Maximum im Bereich von pH 4,75 bis pH 4,5 auf.
Das pH-Elutionsmaximum der MA-BITI-E7-Display-Phagen befindet sich zwischen den zuvor beschriebenen (Beispiel III) Maxima, die von den BPTI(K15L)- und BPTI(K15V,R17L)-Display-Phagen gezeigt werden (pH 4,75 bzw. pH 4,5 bis pH 4,0). Ausgehend von dem pH-Maximum, welches durch die Display-Phagen gezeigt wird, schätzen wir ab, dass das frei in Lösung befindliche BITI-E7-Protein eine Affinität für hNE im Bereich von 10^–10 M aufweist. Dies würde eine ungefähr zehnfache Zunahme der Affinität für hNE gegenüber jener, die oben für ITI-E7 geschätzt wurde, darstellen.
Wie oben beschrieben, zeigt eine Western-Analyse von Phagenproteinen, dass es keine großen Veränderungen bei den Gen III-Fusionsproteinen bei einer Veränderung der aminoterminalen Sequenz gab. Dementsprechend ist es unwahrscheinlich, dass die Veränderungen der Affinität von Display-Phagen für hNE-Körner in großem Umfang erfolgenden Veränderungen bei der Proteinfaltung, welche aus einer veränderten („korrekten") Prozessierung des Fusionsproteins bei den aminoterminalen Mutanten resultieren, zugeschrieben werden können. Die Verbesserungen bei der Bindung können teilweise zurückzuführen sein auf: 1) die Abnahme der negativen Nettoladung (–1 auf 0) an dem Protein, welche aus der GLU-zu-PRO-Veränderung an Position 2 resultiert, oder 2) eine erhöhte Proteinstabilität, welche aus der SER-zu-PHE-Substituion an Rest 4 in dem hydrophoben Kern des Proteins resultiert, oder 3) die kombinierten Effekte von beiden Substitutionen.
Produktion und Eigenschaften von MA-BITI-E7-1222 und MA-BITI-E7-141
Innerhalb der mutmaßlichen KuDom:hNE-Grenzfläche unterscheiden sich BITI-E7 und EpiNE7 nur an zwei Positionen: 11 und 34. In EpiNE7 sind diese Reste THR bzw. VAL. In BITI-E7 sind sie ALA und GLN. Zusätzlich weist BITI-E7 GLU an 31 auf, während EpiNE7 GLN aufweist. Diese negative Ladung könnte die Bindung beeinflussen, obwohl der Rest sich nicht direkt in der Grenzfläche befindet. Wir verwendeten eine Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese, um die Auswirkungen von Substitutionen an den Positionen 11, 31 und 34 auf die Protease:Inhibitor-Wechselwirkung zu untersuchen.
Der Phage MA-BITI-E7-1222 ist der gleiche wie BITI-E7 mit der Mutation A11T. Der Phage MA-BITI-E7-141 ist der gleiche wie BITI-E7 mit den Mutationen E31Q und Q34V.
Wir bestimmten die Bindungseigenschaften von MA-BITI-E7-1222- und MA-BITI-E7-141-Display-Phagen an hNE-Körnern unter Verwendung des ausgedehnten pH-Fraktionierungsprotokolls, wie in den Tabellen 217 (für MA-BITI-E7 und MA-BITI-E7-1222 gezeigt) und 218 (für MA-EpiNE7 und MA-BITI-E7-141) gezeigt.
Dementsprechend hat die Substitution von THR durch ALA an Position 11 in dem präsentierten ITI-Derivat keine merkbare Auswirkung auf die Bindung von Display-Phage an hNE-Körner.
Im Gegensatz dazu beeinflussen die Veränderungen an den Positionen 31 und 34 die hNE-Bindungseigenschaften des Display-Phagens tiefgreifend (Tabelle 218). Das pH-Maximum des Elutionsprofils von MA-BITI-E7-141-Phagen ist bezogen auf den MA-BITI-E7-Ausgangsphagen zu einem niedrigeren pH verschoben. Ferner ist die Position des Maximums (zwischen pH 4,5 und pH 4,0) identisch zu jener, die durch MA-EpiNE7-Phagen in diesem Experiment gezeigt wird. Schließlich zeigen die MA-BITI-E7-141-Phagen bezogen auf die MA-BITI-E7-Ausgangsphagen eine zehnfache Zunahme bei dem gesamten Bruchteil von eingesetztem Phagen, welcher von hNE-Körnern eluiert wird (0,3% gegenüber 0,03%). Tatsächlich ist der gesamte Bruchteil von MA-BITI-E7-141-Phagen, welcher von den hNE-Körnern eluiert wird, nahezu der zweifache von jenem von MA-EpiNE7-Phagen.
Die oben diskutierten Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von MA-BITI-E7-141-Display-Phagen an hNE-Körner vergleichbar ist mit jener von MA-EpiNE7-Phagen. Dementsprechend könnte BITI-E7-141 eine K_D < 1 pM aufweisen. Eine solche Affinität ist ungefähr 100-fach höher als jene, die oben für den Ausgangsphagen (BITI-E7) geschätzt wurde, und ist 10⁵- bis 10⁶-mal so groß wie die Affinität für hNE, die für das intakte ITI-Protein berichtet wird.
Mutagenese von BITI-E7-141
BITI-E7-141 unterscheidet sich von ITI-D1 an neun Positionen (1, 2, 4, 15, 16, 18, 19, 31 und 34). Um das Protein mit den wenigsten Änderungen ausgehend von ITI-D1 zu erhalten, wobei eine hochspezifische Affinität für hNE beibehalten wird, haben wir die Auswirkungen einer Umkehrung der Veränderungen an den Positionen 1, 2, 4, 16, 19, 31 und 34 untersucht. Die Veränderungen., die wir in das BITI-E7-141-Protein eingeführt haben, sind nachfolgend schematisch aufgeführt.
ITI-D1-Reste sind in Fettdruck gezeigt und Reste, die weder in ITI-D1 noch in BILTI-E7-141 gefunden werden, sind in Fettdruck unterstrichen gezeigt. MUT1619 stellt die ITI-D1-Reste an den Positionen 16 und 19 wieder her. Es ist wahrscheinlich, dass MET an 17 und PHE an 18 optimal für eine hNE-Bindung mit hoher Affinität sind, aber F₁₇F₁₈ ist ebenfalls wirksam. GLY an 16 und SER an 19 traten bei den hNE mit hoher Affinität bindenden BPTI-Varianten, die ausgehend von einer Fraktionierung einer Bibliothek von BPTI-Varianten gegenüber hNE erhalten worden sind (ROBE91), häufig auf. Dementsprechend scheint es wahrscheinlich, dass die ITI-D1-Sequenz an diesen Positionen wiederhergestellt werden kann, während die hochspezifische Affinität für hNE beibehalten wird. Die als MUT200 bezeichnete Sequenz ist hypothetisch, es ist aber sehr wahrscheinlich, dass sie hohe Affinität für hNE aufweist.
Die BITI-Display-Phagen wurden produziert, indem K₁EDS der ITI-Phagen durch R₁PDF aus EpiNE7 ersetzt wurde.
In die Sequenz für BIBI-E7 waren zwei Veränderungen eingeführt worden, um BITI-E7-141 herzustellen: GLU zu GLN an Position 31 und GLN zu VAL an Position 34.
Die BITI-E7-141-Proteinsequenz ASN24-GLY25-THR26 stimmt mit der allgemeinen Erkennungssequenz ASN-X-THR/SER für eine N-verknüpfte Glycosylierung in eukaryotischen Organismen überein. In dem intakten ITI-Molekül, das aus menschlichem Serum isoliert wird, ist das Polypeptid der leichten Kette an dieser Stelle glycosyliert (ASN45, ODOM90). Es ist wahrscheinlich, dass ASN24 glycosyliert werden wird, wenn das BITI-E7-141-Protein über eine eukaryotische Expression produziert wird. Eine solche Glycosylierung könnte bewirken, dass das Protein schwierig bis zur Homogenität zu reinigen und immunogen ist, wenn es für eine Langzeitbehandlung verwendet wird. Wir veränderten T₂₆ zu A, da in KuDoms an dieser Stelle häufig Alanin gefunden wird.
hNE-Bindungseigenschaften von mutagenisierten MA-BITI-E7-141-Display-Phagen
Die Bindungseigenschaften der individuellen Phagenpopulationen an hNE-Körner wurden unter Verwendung der abgekürzten und ausgedehnten pH-Elutionsprotokolle, die zuvor beschrieben worden sind, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 219 aufgeführt.
Tabelle 219 zeigt die pH-Elutionsdaten für die verschiedenen Display-Phagen, die von hNE-Körnern eluiert worden sind. Die gesamten pfu (Plaque-bildenden Einheiten), die auf die Körner aufgebracht worden sind, sind in der zweiten Spalte gezeigt. Die Bruchteile dieser eingesetztem pfu, welche in jeder pH-Fraktion des abgekürzten pH-Elutionsprotokolls (pH 7,0, pH 3,5 und pH 2,0) zurückgewonnen worden sind, sind in den nächsten drei Spalten aufgelistet. Für Daten, die unter Verwendung des ausgedehnten pH-Elutionsprotokolls erhalten worden sind, repräsentieren die bei pH 3,5 aufgelisteten Werte die Summe der Fraktionen von rückgewonnenem eingesetztem Material in den pH 6,0-, pH 5,5-, pH 5,0-, pH 4,5-, pH 4,0- und pH 3,5-Elutionsproben. In ähnlicher Weise ist der bei pH 2,0 aufgelistete Wert die Summe der Bruchteile von eingesetztem Material, welche aus den pH 3,0-, pH 2,5- und pH 2,0-Elutionsproben erhalten wurden. Der gesamte Bruchteil der eingesetzten pfu, welcher im gesamten Verlauf des pH-Elutionsprotokolls erhalten wird, ist in der sechsten Spalte von Tabelle 219 aufgezeichnet. Die letzte Spalte der Tabelle listet den gesamten Bruchteil von rückgewonnenen eingesetzen Phagen auf, welcher hinsichtlich des für MA-BITI-E7-141-Display-Phagen erhaltenen Werts normalisiert ist.
Zwei Faktoren müssen berücksichtigt werden, wenn Vergleiche zwischen den in Tabelle 219 gezeigten Daten angestellt werden. Der erste ist, dass aufgrund der kinetischen Natur der Phagenfreisetzung von hNE-Körnern und der längeren Zeit, die in dem ausgedehnten pH-Elutionsprotokoll involviert ist, der Bruchteil von eingesetzten pfus, der in der pH 3,5-Fraktion zurückgewonnen wird, auf Kosten der pH 2,0-Fraktion in dem ausgedehnten Protokoll bezogen auf jene Werte, die in dem abgekürzten Protokoll erhalten werden, angereichert sein wird. Die Größe dieses Effekts kann festgestellt werden, indem die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn MA-BITI-E7-141-Display-Phagen von hNE-Körnern unter Verwendung der beiden Protokolle eluiert werden, verglichen werden. Der zweite Faktor besteht darin, dass für den in Tabelle 219 aufgelisteten Bereich von eingesetzten pfu die eingesetzten pfu die Rückgewinnung beeinflussen. Je größer die eingesetzten pfu sind, umso höher ist der gesamte Bruchteil des eingesetzten Materials, der in der Elution zurückgewonnen wird. Dieser Effekt ist augenscheinlich, wenn die eingesetzten pfu sich um mehr als einen Faktor von ungefähr 3 bis 4 unterscheiden. Dieser Effekt kann zu einer Überschätzung der Affinität von Display-Phagen für hNE-Körner führen, wenn Daten ausgehend von Phagen, welche bei höheren Titern eingesetzt werden, mit jenen ausgehend von Phagen, die bei niedrigeren Titern eingesetzt werden, verglichen werden.
Im Bewusstsein dieser Vorbehalte, interpretieren wir die Tabelle 219. Die Auswirkungen der in den MA-BITI-E7-141-Display-Phagen („Ausgangsphagen") eingeführten Mutationen auf die Bindung von Display-Phagen an hNE-Körner können in drei Kategorien eingestuft werden: jene Veränderungen, die wenig oder keine Auswirkungen haben, jene, die mäßige (2- bis 3-fach) Auswirkungen haben und jene, die große (> 5-fach) Auswirkungen haben.
Die MUTT26A- und MUTQE-Veränderungen scheinen nur geringfügige Auswirkungen auf die Bindung von Display-Phagen an hNE-Körner zu haben. Berücksichtigt man die gesamten rückgewonnenen pfu, binden die Display-Phagen, welche diese Veränderungen enthalten, ebenso gut wie die Ausgangsphagen an hNE-Körner. Tatsächlich sind die pH-Elutionsprofile, welche für die Ausgangsphagen und die MUTT26A-Display-Phagen ausgehend von dem ausgedehnten pH-Elutionsprotokoll erhalten werden, ununterscheidbar. Die Bindung des MUTQE-Display-Phagen scheint bezogen auf die Ausgangsphagen geringfügig verringert zu sein und im Lichte der eingesetzten pfu ist es wahrscheinlich, dass diese Bindung etwas überschätzt wird.
Die über die MUTP1- und MUT1619-Oligonukleotide eingeführten Sequenzveränderungen scheinen die Bindung von Display-Phagen an hNE-Körner ungefähr 2- bis 3-fach zu verringern. Im Lichte der eingesetzten Titer und der Verteilungen von pfu, welche in den verschiedenen Elutionsfraktionen zurückgewonnen werden, ist es wahrscheinlich, dass 1) beide Display-Phagen geringere Affinitäten für hNE-Körner als MA-EpiNE7-Display-Phagen haben und 2) die MUT1619-Display-Phagen eine höhere Affinität für hNE-Körner als die MUTP1-Display-Phagen haben.
Die Sequenzveränderungen am Aminoterminus von BITI-E7-14 scheinen die Bindung durch den Display-Phagen an hNE-Körner um das mindestens 10-fache zu verringern. Die AMINO2-Veränderungen verringern die Display-Phagen-Bindung wahrscheinlich in einem substantiell höheren Ausmaß, als dies die AMINO1-Veränderungen tun.
Auf der Grundlage der obigen Interpretationen der in Tabelle 219 aufgelisteten Daten können wir schließen, dass:

1.) Die Substitution von THR durch ALA an Position 26 in ITI-D1 und dessen Derivaten hat keine Auswirkung auf die Wechselwirkung des Inhibitors mit hNE. Dementsprechend kann die Möglichkeit einer Glycosylierung eines in eukaryotischer Zellkultur produzierten Inhibitorproteins an ASN24 ohne Verringerung der Affinität für hNE vermieden werden.
2.) Die Zunahme der Affinität von Display-Phagen für hNE-Körner, welche durch die Veränderungen von GLU zu GLN an Position 31 und von GLN zu VAL an 34 hervorgerufen wird, resultiert primär aus der VAL-Substitution an 34.
3.) Alle drei Veränderungen, die in der aminoterminalen Region von ITI-D1 (Positionen 1, 2 und 4) eingeführt werden, beeinflussen die Bindung von Display-Phagen an hNE-Körner in unterschiedlichem Ausmaß. Die Veränderung an Position 4 (SER zu PHE) scheint eine viel größere Wirkung zu haben als die Veränderung an Position 2. Die Veränderung an Position 1 könnte wenig oder gar keine Wirkung haben.
4.) Die Veränderungen in der Region um den P1-Rest in BITI-E7-141 (Position 15) herum beeinflussen die Bindung von Display-Phagen an hNE. Die Veränderungen von ALA zu GLY an 16 und PRO zu SER an 19 scheinen die Affinität des Inhibitors etwas (vielleicht 3-fach) zu verringern. Die Substitution von VAL durch ILE an Position 15 verringert die Bindung weiter.

BITI-E7-141 unterscheidet sich von ITI-D1 an neun Positionen. Auf der Grundlage der obigen Diskussion scheint es wahrschein lich, dass ein auf ITI-D1 basierender hNE-Inhibitor von hoher Affinität konstruiert werden könnte, der sich von der ITI-D1-Sequenz nur an vier oder fünf Positionen unterscheiden würde. Diese Unterschiede wären: PHE an Position 4, VAL an Position 15, PHE an Position 18, VAL an Position 34 und ALA an Position 26. Wenn eine Glycosylierung von ASN24 ohne Bedeutung ist, könnte THR an 26 beibehalten werden.
10. Zusammenfassung: geschätzte Affinitäten von isolierten ITI-D1-Derivaten für hNE
Auf der Grundlage der Bindung von Display-Phagen an und der Elution von Display-Phagen von hNE-Körner(n) ist es möglich, Affinitäten für hNE abzuschätzen, die verschiedene Derivate von ITI-D1 frei in Lösung zeigen könnten. Diese Abschätzungen sind nachfolgend und in Tabelle 220 zusammengefasst.
ZITIERTE LITERATUR
ALBR83a: Albrecht, et al., Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983), 364: 1697–1702.
ADEY88: Adeyemi und Hodgson, J Clin Lab Immunol (1988) 27 (1) 1–4.
AFFO88: Afford, et al., Btol Chem Hoppe-Seyler (1988) 369: 1065– 74.
ALTM91: Altman, et al., Protein Engineering (1991) 4 (5) 593–600.
ARSE86: Arsenis, et al., Agents Actions Suppl (1986) AAS 18 (Recent Adv Connect Tissue Res) 63–8.
ARSE88: Arsenis, et al., Current Eye Research (1988) 7 (2) 95–102.
ASCE90: Ascenze, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1990) 371: 389– 393.
ALBR83b: Albrecht, et al., Hoppe-Seyler's Z Physiol chem (1983), 364: 1703–1708.
ANGE90: Angelastro et al. (1990) J. Med. Chem. 33: 13–16.
ARNA90: Arnaout, in Immunological Reviews (1990), 114.
AUER87: Auerswald, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1987), 368: 1413–1425.
AUER88: Auerswald, et al., Bio Chem Hoppe-Seyler (1988), 369 (Supplement): 27–35.
AUER89: Auerswald, et al., Vereinigtes Königreich-Patentanmeldung GB 2,208,511 A.
AUER90: Auerswald, et al., U.S.-Patent 4,894,436 (16. Jan 1990).
ADSU87: Ausubel, et al., Editors, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und Wiley-Interacience, Publishers: John Wiley & Sons, New York, 1987.
BALD85: Balduyck, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1985), 366: 9– 14.
BAND88a: Banda, et al., J Exp Med 167 (5) 1608–15 (1988)
BAND88b: Banda, et al., J Biol Chem 263 (9) 4481–4 (1988)
BARR86: Barrett und Salyesen, Herausgeber, Protease Inhibitors, veröffentlicht von Elsevier, Amsterdam, 1986.
BECK88b: Beckmann, et al., Eur J Biochem (1988), 176: 675–82,
BECK89a: Beckmann, et al., J Protein Chem (1989), (1) 101–113.
BIET86: Bieth, S. 217–320 in Regulation of Matrix Accumulation, Hrsg.: RP Mecham, Academic Press, Orlando, 1986.
BLOW72: Blow &al., J Mol Biol (1972), 69: 137ff.
BARB91 Barbas, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88: 7978–82.
BASS90 Bass, et al., Proteins (1990) 8: 309–14.
BONN89 Bonney, et al., J Cell Biochem (1989) 39 (1) 47–53.
BOUD87 Boudier, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1987) 368: 981– 990.
BRIN90 Brinkmann und Tschesche, Biol Cbem Hoppe-Seyler (1994) 371 Suppl: 43–52.
BRIN91 Brinkmann, et al., Eur J Biochem (1991) 202 (1) 95–9.
BUTT91 Buttle, et al., Biochem J (1991) 276 (2) 325–31.
CAMP82: Campbell, Senior, McDonald, und Cox, (1982) J Clin Invest 70: 845–52.
CAMP88: Campbell und Campbell (1988) J Cell Biol 106: 667–676.
CAMP90: Campanelli, et al., J Exp Med (Dec 1990), 172: 1709–15.
CANT89: Cantor und Turino, (1989) Kapitel 16 in ROBE89.
CHAZ83: Chazin, et al., Eur J Biochem (1985), 152 (2) 429–37.
CHAZ85: Chazin, et al., Eur J Biochem (1985), 152 (2) 429–37.
COLL90: Callins, et al., (1990) Biol Chem Hoppe-Seyler 371 Suppl. s. 29–36.
CREI74: Creighton (1974) J Mol Biol 87: 579–602.
CREI77a: Creighton, J Mol Biol (1977), 113: 275–293.
CREI77b: Creighton, J Mol Biol (1977), 113: 295–312.
CREI80: Creighton, J Mol Biol (1980), 144: 521–550.
CREI84: Creighton, Proteins: Structures and Molecurar Principles, W H Freeman & Co, New York, 1984.
DAVI79: Davia et al, US-Patent 4,179,337 (1979)
DIAR90: Diarra-Mehrpour, et al., Eur J Biochem (1990), 191: 131– 139.
DOHE90 Doherty und Mehdi, Int J Immunopharmac (1990) 12 (7) 787– 795.
DUFT85: Dufton, Eur J Biochem (1985), 153: 647–654.
EIGE90: Eigenbrot, Randal, und Kossiakoff, Protein Engineering (1990), 3 (7) 592–598.
ENTGH89: Enghild, Thogersen, Pizzo, und Salvesen, J Biol Biochem (1989), 264: 15975–15981.
FERR90: Ferrer-Lopez, et al., American J Physiology (1990) 258: C1100–C1107.
FIOR88: Fioretti, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1988), 369, (Suppl) 37–42.
GEBH86: Gebhard, W, und K Hochstraaser, S. 389–401 in BARR86.
GEBH90: Gebhard, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1990), 71, suppl 13–22.
GIRA89: Girard, et al., Nature (1989), 338: 528–20.
GOLD83: Goldenberg, und Creighton, J Mol Biol (1983), 165 (2) 407–13.
GOLD84: Goldenberg und Creighton (1984) J Mol Biol 179: 527–45.
GOLD86: Goldstein und Doering, (1986) Am Rev Respir Dis 134: 49– 56.
GOLD88: Goldenberg, Biochem (1988), 27: 2481–89.
GOVH90: Govhardan und Abeles, (1990) Archives Biochem Biophys 280: 137–146.
GUPT90: Gupta, et al., Blood (Nov 15 1990), 76 (10) 2162.
GREE91 Greenwood, et al., J Mol Biol (1991) 224: 821–827.
GROE91 Groeger, et al., J Protein Chem (1991) 10 (2) 246–251.
HEID86: Heidtmann und Travis, Kapitel 14 in ROBE86.
HIEM91: Hiemstra, et al., Immunobiology (Stuttgart) 182 (2) 117–26 (1991)
HOCH84: Hoschstrasser, und Wachter, US-Patent 4,485,100 (27 Nov 1984).
HUBB86: Hubbard und Crystal, Respiration (1986), 50 (Suppl 1) 55– 73.
HUBE74: Huber, et al., J Mol Biol (1974), 89: 73–101.
HUBE75: Huber, et al., Biophys Struct Mechan (1975), 1: 189–201.
HUBE77: Huber, et al., Biophys Struct Mech (1975), 1 (3) 189–201.
HUTC87: Hutchinson, Eur J Respir Dis (1987), 71 (Supl. 153) 78–85.
HYNE90: Hynes, et al., Biochemistry (1390), 29: 100181–0022.
SUBB89a: Hubbard, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 85: 680– 4.
HUBB89b: Hubbard , et al., Annals of Internal Medicine (1989) 111: 206–212.
IMPE86: Imperiali und Abeles, (1986) Biochem 25: 760–67.
IMPE87: Imperiali und Abeles, (1987) Biochem 26: 4474–77.
KAOR88: Kao, et al., J Clin Invest (1988), 82: 1963–73.
KAUM86: Kaumerer, et al., Nucleic Acids Res (1986), 14: 7839–7850
KIDO88: Kido, et al., J Biol Chem (1988), 263: 18104–7.
KIDO90: Kido, et al., Biochem & Biophys Res Camm (16 Mär. 1990), 167 (2) 716–21.
KITA90 Kitaguchi, et al., Biochim Biophys Acta (1990) 1038: 105– 113.
LASK80: Laskowski und Kato, Ann Rev Biochem (1980), 49: 593–626.
LAZU83: Lazure, et al., Canadian J Biochem Cell Biol (1983), 61: 287–92.
MARQ83: Marquart, et al., Acta Cryst, H (1983), 39: 480ff.
MCWH89: McWherter, et al., Biochemistry (1989), 28: 5708–14.
MEHD90: Mehdi et al. (1990) Biochem Biophys Res Commun 166: 595– 600.
NADE87: Nadel, und Borson, Biorheology (1987), 24: 541–549.
NADE90: Nadel, 1990 Cystic Fibrosis Meeting, Arlington, Va., S. 156 und Rubenstein et al, (1990) J Clin Invest 86: 555–9.
NILE89: Niles, et Hlood (1989), 74 (6) 1888–93.
NORR89a: Norris und Petersen, Europäische Patentanmeldung 0 339 942 A2.
NORR89b: Norris et al., PCT-Patentanmeldung WO89/01968.
ODOM90: Odom, Int J Biochem (1990), 22: 925–930.
OLTE89: Oltersdorf, et al., Nature (1989), 341: 144–7.
PADR89 Padrines, et al., (1989) Am Rev Respir Dis 139 (3) 783–90 (1989)
PEET90: Peet, et al., (1990) J Med Chem 33: 394–407.
PETE89: Peterson, J Lab Clin Med (1989), 113 (3) 297–308.
PONT88: Ponte, et al., Nature (1988), 331: 525–7.
POWE86: Powers und Harper, S. 55–152 von BARR86.
PADR91: Padrines und Bieth, Am J Respir Cell Moll Biol (1991) 4: 187–193
RITO83: Ritonja, Meloun, und Gubensek, Biochim Biophys Acta (1983), 746: 138–145.
ROBE89: Robert und Hornbeck, Herausgeber, Elastin and Elastases, Volume II, CRC Press, Boca Raton, FL. 1989.
RUEH73: Ruehlmann, et al., J Mol Biol (1973), 71: 417–436.
SALI90: Salier, TIHS (1990), 15: 435–439.
SALV87: Salvesen, et al., Biochem (1987), 26: 2289–93.
SAMB89: Sambrook, J, EF Fritsch, und T Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
SCHE67: Schecter und Berger, Biochem Biophys Res Commun (1967) 27: 157–162.
SCHN86b: Schnebli und Braun, Kapitel 21 in BARR86.
SCHW87: Schwarz, et al., Biochemistry (1987), 26: (12) p3544–51.
SCOT87b: Scott, et al., Blood (1987), 69: 1431–6.
SEEM86: Kapitel 8 in BARR86.
SELL87: Selloum, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1987), 268: 47– 55.
SIEK87: Siekmann, et al., Biol Chem Hoppe-Seyler (1987), 368: 1589–96.
SIEK89: Siekmann, et al ., Biol Chem Hoppe-Seyler (1989), 370: 677– 81
SINH90: Sinha, et al., J Biol Chem (1990), 265 (16) 8983–5.
SINH91: Sinha, et al., (1991) J Biological Chem 266: 21011–13.
SNID91: Snider, et al., (1991) Ann N Y Acad Sci 624: 45–59.
SOMM89: Sommerhoff, et al., J Immunol (1989), 142: 2450–56.
SOMM90: Somnerhoff, et al., J Clin Invest (März 1990), 85: 682– 689.
SOMM91: Sommerchoff et al., (1991) Eur J Pharmacology 193: 153–158.
STAT87: States, et al., J Mol Biol (1987), 195 (3) 731–9.
STON90: Stone, et al., Eur Respir J 3 (6) 673–8 (1990)
SWAI88: Swaim und Pizzo, Biochem J (1988), 254: 171–178.
TRAB86: Traboni, C, R Cortese, Nucleic Acids Res (1986), 14 (15) 6340.
TRAV88: Travis, (1988) Am J Med 84 (6A) 37–42
TRIB86: Traboni, C, R Cortese, Nucleic Acids Res (1986), 14 (15) 6340.
TSCH87: Techesche, et al., Biochimica et Biophysica Acta (1987), 913: 97–101.
VINC72: Vincent et al., Biochem (1972), 11: 2967ff.
VINC74: Vincent et al., Biochem (1974), 13: 4205.
WACH79: Wachter, et al., Hoppe-Seyler Z Physiol Chem (1979), 360: 1297–1303.
WACH80: Wachter, et al., FEBS Letters (1980), 119: 58–62.
WAGN79: Wanger, et al., Bur J Hiochem (1979), 95: 239–248.
WAGN87: Wagner, et al., J Mol Biol (1987), 196 (1) 227–31.
WEIS89: Weiss (1989) New Engl J Med 320: 365–76.
WEWE87: Wewers, et al., New Engl J Med (1987), 316 (17) 1055–62.
WLOD84: Wlodawer, et al., J Mol Biol (1984), 180 (2) 301–29.
WLOD87a: Wlodawer, et al., J Mol Biol (1987), 198 (3) 469–80.
WLOD87b: Wlodawer, et al., J Mol Biol (1987), 193 (1) 145–56.
WUNT88: Wun, et al., J Biol Chem (1988), 263: 6001–4.
WELL90 Wells, Biochem (1990) 29 (37) 8509–17.
WILL91a: Williams, et al., J Biol Chem (15 März 1991) 266 (8) 5182–90).
WILL91b: Williams, et al., Experimental Lung Research (1991) 17: 725–41.
Tabelle 13: BPTI-Homologe (1–19)
Tabelle 13, Fortsetzung (HPTI-Homologe 20–35)
Tabelle 13, Fortsetzung
Tabelle 13, Fortsetzung (Homologe 36–40)
Tabelle 13, Fortsetzung
Legende zu Tabelle 13
Tabelle 15: Häufigkeit von Aminosäuren an jeder Position in BPTI und 58 Homologen
Tabelle 15: Häufigkeit von Aminosäuren an jeder Position in BPTI und 58 Homologen (Fortsetzung)
Legende zu Tabelle 15
Tabelle 61: Variabilität von natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen
Tabelle 61: Variabilität von natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen (Fortsetzung)
Tabelle 62: In der Zusammenstellung von Tabelle 61 verwendete Kunitz-Sequenzen
Tabelle 63: Histogramm von (Anzahl von Resten mit angegebener Variabilität) gegenüber der Variabilität
Tabelle 64: Referenzen für die Tabelle von natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen (Tabelle 62)
Tabelle 65: Auswirkungen von Mutationen bei Kunitz-Domänen auf die Bindung an Serinproteasen.
Tabelle 65: Auswirkungen von Mutationen bei Kunitz-Domänen auf die Bindung an Serinproteasen (Fortsetzung)
TABELLE 203 Auswirkung des pH auf die Dissoziation von gebundenen BPTI-III-MK- und BPTI(K15L)-III-MA-Phagen von immobilisierter HNE
Die gesamte eingesetzte Menge von BPTI-III-MK-Phagen betrug 0,030 ml × (8,6·10¹⁰ pfu/ml) = 2,6·10⁹.
Die gesamte eingesetzte Menge von BPTI(K15L)-III-MA-Phagen betrug 0,030 ml × (1,7·10¹⁰ pfu/ml) = 5,2·10⁸.
Unter der Annahme, dass die Infektiosität von BPTI(K15L)-III-MA-Phagen fünfmal geringer ist als jene von BPTI-III-MK-Phagen, stellen die oben eingesetzten Phagenausgangsmengen sicher, dass eine äquivalente Anzahl von Phagenpartikeln zu der immobilisierten HNE zugesetzt wird.
TABELLEN 207–208 (zusammengefasst) SEQUENZEN DER EpiNE-KLONE IN DER P1-REGION
Tabelle 209: DNA-Sequenzen und vorhergesagte Aminosäuresequenzen im Bereich der P1-Region von BPTI-Analoga, ausgewählt hinsichtlich einer Bindung an Cathepsin G
TABELLE 211 Auswirkungen von Antiseren auf die Phagen-Infektiosität
TABELLE 212 Fraktionierung von EpiNE-7- und MA-ITI-Phagen an hNE-Körnern
TABELLE 213 Fraktionierung von EpiC-10- und MA-ITI-Phagen an Cat-G-Körnern
TABELLE 214 Abgekürzte Fraktionierung von Display-Phagen an hNE-Körnern
TABELLE 215 Fraktionierung von EpiNE-7- und MA-ITI-E7-Phagen an hNE-Körnern
TABELLE 216 Fraktionierung von MA-EpiNE-7, MA-BITI und MA-BITI-E7 an hNE-Körnern
TABELLE 216 (Fortsetzung) Fraktionierung von MA-EpiNE-7, MA-BITI und MA-BITI-E7 an hNE-Körnern
TABELLE 217 Fraktionierung von MA-BITI-E7 und MA-BITI-E7-1222 an hNE-Körnern
TABELLE 218 Fraktionierung von MA-EpiNE7 und MA-BITI-E7-141 an hNE-Körnern
TABELLE 219 pH-Elutionsanalyse der hNE-Bindung durch die BITI-E7-141-Display-Phagen-Variante
TABELLE 220
Unterstrichen und in Fettdruck gezeigte Reste sind gegenüber jenen, die in ITI-D1 vorhanden sind, verändert.
Schlüssel der Sequenzen:

1. ITI-D1
2. ITI-E7
3. BITI
4. BITI-E7
5. BITI-E7-1222
6. AMINO1
7. AMINO2
8. MUTP1
9. BITI-E7-141
10. MUTT26A
11. MUTQE
12. MUT1619

TABELLE 221 Informationen die gleichen wie in Tabelle 220, konzentrieren sich aber auf die Stellen, wo Veränderungen vorgenommen wurden
Sequenzschlüssel der gleiche wie in Tabelle 220.
TABELLE 222

Claims

Nicht natürlich vorkommendes Protein, das menschliche Neutrophilen-Elastase hemmt und das ein Protein ist, das mindestens die Kernsequenz einer nicht natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne umfasst, wobei die Kunitz-Domäne durch Cysteine in Positionen, die den Positionen 5, 30, 51 und 55 des Rinderpankreas-Trypsin-Inhibitors (BPTI) entsprechen, Glycin in einer Position, die der BPTI-Position 12 entspricht, Asn in einer Position, die der BPTI-Position 43 entspricht, und Phe in einer Position, die der BPTI-Position 33 entspricht, gekennzeichnet ist, mit der Maßgabe, dass, wenn die Positionen, die BPTI 14 und 38 entsprechen, Cystein sind, die Position, die BPTI 37 entspricht, Glycin ist; wobei die Kernsequenz die Reste sind, die den BPTI-Positionen 5–55 entsprechen; wobei in der nicht natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne, der Rest, der der BPTI-Position 18 entspricht, Phe ist, und wobei die Reste, die den BPTI-Positionen 39–42 entsprechen, alle ungeladene Aminosäuren sind.
Protein nach Anspruch 1, das Reste umfasst, die den BPTI-Positionen 1–58 entsprechen.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Reste, die den BPTI-Positionen 14 und 38 entsprechen, Cys sind, und der Rest, der der BPTI-Position 37 entspricht, Gly ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Rest, der der BPTI-Position 45 entspricht, Phe ist und der Rest, der der BPTI-Position 43 entspricht, Asn ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Rest, der der BPTI-Position 15 entspricht, Val, Ile oder Leu ist.
Protein nach Anspruch 5, wobei der Rest, der der BPTI-Position 15 entspricht, Val ist.
Protein nach Anspruch 5, wobei der Rest, der der BPTI-Position 15 entspricht, Ile ist.
Protein nach Anspruch 5, wobei der Rest, der der BPTI-Position 15 entspricht, Leu ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Rest, der der BPTI-Position 16 entspricht, Ala oder Gly ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Rest, der der BPTI-Position 17 entspricht, Met, Phe, Ile oder Leu ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Rest, der der BPTI-Position 19 entspricht, Pro, Ser, Lys oder Gln ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Rest, der der BPTI-Position 16 entspricht, Ala ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Rest, der der BPTI-Position 17 entspricht, Phe ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Rest, der der BPTI-Position 19 entspricht, Pro ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Rest, der der BPTI-Position 39 entspricht, Met ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Rest, der der BPTI-Position 40 entspricht, Gly, Ala, Ser, Asn, Thr oder Pro ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Rest, der der BPTI-Position 40 entspricht, Gly oder Ala ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei der Rest, der der BPTI-Position 40 entspricht, Gly ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Rest, der der BPTI-Position 41 entspricht, Asn, Gln, Ser, Thr oder Ala ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei der Rest, der der BPTI-Position 41 entspricht, Asn ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei der Rest, der der BPTI-Position 42 entspricht, Gly ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der Rest, der der BPTI-Position 40 entspricht, Gly ist und der Rest, der der BPTI-Position 42 entspricht, Gly ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Reste, die den BPTI-Positionen 40, 41 und 42 entsprechen, Gly, Asn beziehungsweise Gly sind.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Reste, die den BPTI-Positionen 39, 40, 41 und 42 entsprechen, Met, Gly, Asn beziehungsweise Gly sind.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei der Rest, der der BPTI-Position 31 entspricht, Gln ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei der Rest, der der BPTI-Position 34 entspricht, Pro ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei der Rest, der der BPTI-Position 34 entspricht, Val ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei der Rest, der der BPTI-Position 1 entspricht, Arg ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei der Rest, der der BPTI-Position 2 entspricht, Pro ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei der Rest, der der BPTI-Position 3 entspricht, Asp ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei der Rest, der der BPTI-Position 4 entspricht, Phe ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei für jeden Rest, der einer vorher nicht spezifizierten Position entspricht, die Referenz-Kunitz-Domäne eine Kunitz-Domäne der leichten Kette eines menschlichen ITI ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei für jeden Rest, der einer vorher nicht spezifizierten Position entspricht, die Referenz-Kunitz-Domäne BPTI oder die erste Kunitz-Domäne der leichten Kette eines menschlichen ITI (menschlicher ITI-D1) ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 33, wobei die Domäne eine höhere prozentuale Identität zu einer natürlich vorkommenden menschlichen Kunitz-Domäne der Tabellen 13, 15 oder 62 besitzt als zu jeglichen anderen natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen der Tabellen 13, 15 oder 62.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 34, wobei die Kernaminosäuresequenz der nicht natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne eine prozentual höhere Identität zu der von menschlichem ITI-D1 besitzt als zu der von BPTI.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 35, wobei sich die Kernsequenz der Domäne ansonsten von der Kernsequenz einer Referenz-Kunitz-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EpiNeα, EpiNe1, EpiNe2, EpiNe3, EpiNe4, EpiNe5, EpiNe6, EpiNe7 und EpiNe8 der Tabellen 207 bis 208, nur durch eine oder mehrere Substitutionen der Klasse A und/oder eine oder mehrere Substitutionen der Klasse B wie in Tabelle 65 definiert unterscheidet.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 35, wobei sich die Kernsequenz der Domäne ansonsten von der Kernsequenz einer Referenz-Kunitz-Domäne, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EpiNeα, EpiNe1, EpiNe2, EpiNe3, EpiNe4, EpiNe5, EpiNe6, EpiNe7 und EpiNe8 der Tabellen 207 bis 208, nur durch eine oder mehrere Substitutionen der Klasse A wie in Tabelle 65 definiert unterscheidet.
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kernsequenz der Domäne aus einer Aminosäuresequenz besteht, die zu der der Kernsequenz eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EpiNeα, EpiNe1, EpiNe2, EpiNe3, EpiNe4, EpiNe5, EpiNe6, EpiNe7 und EpiNe8 der Tabellen 207 bis 208 identisch ist.
Protein nach Anspruch 1, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EpiNeα, EpiNe1, EpiNe2, EpiNe3, EpiNe4, EpiNe5, EpiNe6, EpiNe7 und EpiNe8 der Tabellen 207 bis 208.
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kernsequenz der Domäne aus einer Aminosäuresequenz besteht, die zu der der Kernsequenz eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ITI-E7, BITI-E7, BITI-E7-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE und MUT1619 von Tabelle 220 identisch ist.
Protein nach Anspruch 1, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ITI-E7, BITI-E7, BITI-E7-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE und MUT1619 von Tabelle 220.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 41, umfassend eine Aminosäuresequenz, die sich ansonsten von der Kernsequenz eines Referenzinhibitors nur durch eine oder mehrere Substitutionen der Klasse A nach Tabelle 65 unterscheidet, wobei der Referenzinhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ITI-E7, BITI-E7, BITI-E7-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE und MUT1619 von Tabelle 220.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 41, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die sich ansonsten von der Kernsequenz eines Referenzinhibitors nur durch eine oder mehrere Substitutionen der Klasse A und/oder B nach Tabelle 65 unterscheidet, wobei der Referenzinhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ITI-E7, BITI-E7, BITI-E7-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE und MUT1619 von Tabelle 220.
Protein nach Anspruch 1, wobei (a) der Rest, der der BPTI-Position 15 entspricht, Val oder Ile ist und/oder (b) der Rest, der der BPTI-Position 17 entspricht, Phe ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 44, wobei die Kunitz-Domäne in ihrer Aminosäuresequenz zu keiner der in Tabelle 13 dargestellten Aminosäuresequenzen identisch ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 38, 40 oder 42 bis 45, das mindestens zwei der mutanten Kunitz-Domänen umfasst.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 46, das eine starke (10^–9 > K_D > 10^–11 M) oder sehr starke (K_D < 10^–11 M) Bindungsaffinität für menschliche Neutrophilen-Elastase besitzt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 47, das eine sehr starke (K_D < 10^–11 M) Bindungsaffinität für menschliche Neutrophilen-Elastase besitzt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 48, das ein chimeres Phagenprotein ist.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 49, das in polyethylenglycolysierter Form vorliegt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 50, das in gereinigter Form vorliegt.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 50 zur Verwendung in der Bindung menschlicher Neutrophilen-Elastase.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 50 zur Verwendung in der Hemmung menschlicher Neutrophilen-Elastaseaktivität.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 50 zur Verwendung in der Hemmung von schädlicher menschlicher Neutrophilen-Elastaseaktivität.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 50 zur Verwendung in der Hemmung von übermäßiger Neutrophilen-Elastaseaktivität.
Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 50 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmnung schädlicher menschlicher Neutrophilen-Elastaseaktivität.
Verwendung einer für die Hemmung wirksamen Menge eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 50 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von übermäßiger menschlicher Neutrophilen-Elastaseaktivität.