DE69534656T2

DE69534656T2 - Gentechnisch manipulierte menschliche kunitz domänen die menschliche neutrophile elastase hemmen

Info

Publication number: DE69534656T2
Application number: DE69534656T
Authority: DE
Inventors: Charles Arthur LEY; Charles Robert LADNER; Kosow Sonia GUTERMAN; Lindsay Bruce ROBERTS; William Markland; Baribault Rachel KENT
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-12-16
Also published as: WO1996020278A3; DE69534656D1; ES2255066T3; WO1996020278A2; DK0797666T3; CA2207820A1; JPH10510996A; EP1734121A2; ATE311452T1; US5663143A; EP0797666B1; JP3977419B2; EP0797666A2; EP1734121A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neuartige Proteine, die menschliche neutrophile Elastase (hNE) inhibieren. Ein großer Anteil der Sequenz jedes dieser Proteine ist identisch zu einem bekannten menschlichen Protein, welches sehr geringe oder keine inhibitorische Aktivität bezüglich hNE besitzt.
Angaben zur Offenbarung von Information
1. hNE, seine natürlichen Inhibitoren und Pathologien
Menschliche neutrophile Elastase (hNE, auch bekannt als menschliche Leukozyten-Elastase (hLE); EC 3.4.21.11) ist eine 29-Kd-Protease mit einem weiten Aktivitätspektrum gegen extrazelluläre Matrixkomponenten (CAMP82, CAMP88, MCWH89). Das Enzym ist eines der bedeutendsten neutralen Proteasen der Azurgranula der polymorphkernigen Leukozyten und ist in die Elimination von Pathogenen und die Restrukturierung von Bindegewebe einbezogen (TRAV88). In Fällen einer vererbten Verringerung des zirkulierenden α-1-Protease-Inhibitors (API, früher bekannt als α-1-anti-Trypsin), der hauptsächliche systemische physiologische Inhibitor von hNE (HEID86), oder in der Inaktivierung von API durch Oxidation („Raucher-Emphysem"), kann eine weitläufige Zerstörung von Lungengewebe aus der unkontrollierten elastolytischen Aktivität von hNE resultieren (CANT89). Mehrere Atemwegserkrankungen der Menschen, einschließlich zystische Fibrose und Emphysem, sind durch eine gesteigerte Belastung der epithelialen Oberfläche der Lungen durch Neutrophile charakterisiert (SNID91, MCEL91, GOLD86), und eine Freisetzung von hNE durch Neutrophile wird mit dem Fortschritt dieser Erkrankungen in Verbindung gebracht (MCEL91, WEIS89). Eine vorläufige Studie einer Aerosol-Verabreichung von API an Patienten mit zystischer Fibrose zeigt, dass eine solche Behandlung sowohl für eine Vorbeugung von Schäden am Atemwegsgewebe als auch für eine Steigerung der antimikrobiellen Verteidigung des Wirts wirksam sein kann (MCEL91).
API zeigt einige praktische Probleme für eine routinemäßige Verwendung im großen Maßstab als anti-elastolytisches Mittel für die Lungen. Diese schließen die relativ große Größe des Moleküls ein (394 Reste, 51 k Dalton), das Fehlen von intramolekularen stabilisierenden Disulfidbrücken und spezielle post-translationale Modifikationen des Proteins durch Glykosylierung an drei Stellen. Vielleicht von noch größerer Bedeutung ist die Sensitivität von API gegenüber Oxidation, wie die, die von aktivierten Neutrophilen freigesetzt werden. Daher wäre ein kleiner, stabiler nicht-toxischer hocheffizienter Inhibitor von hNE von großem therapeutischem Wert.
2. ITI-Domäne 1 und ITI-Domäne 2 als Ausgangs-Proteinbindedomänen (initial protein binding domains, IPBD)
Viele Säugerarten haben ein Protein in ihrem Plasma, das durch Sequenzhomologie und Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften als Inter-α-Trypsin-Inhibitor (ITI) identifiziert werden kann; ein großer (M_r ca. 240.000) zirkulierender Protease-Inhibitor (für aktuelle Reviews siehe ODOM90, SALI90, GEBH90, GEBH86). Die Sequenz von menschlichem ITI wird in Tabelle 400 gezeigt. Der intakte Inhibitor ist ein Glykoprotein, von dem zurzeit angenommen wird, dass er aus drei glykolisierten Untereinheiten besteht, die durch eine starke Glykosaminoglykan-Verbindung interagieren (ODOM90, SALI90, ENGH89, SELL87). Die anti-Trypsin-Aktivität von ITI ist auf der kleinsten Untereinheit gelegen (ITI leichte Kette, unglykosyliert M_r ca. 15.000) die in der Aminosäuresequenz identisch zu einem in Urin (UTI) und Serum (STI) gefundenen säurestabilen Inhibitor ist (GEBH86, GEBH90). Die Aminosäuresequenz der leichten Kette von ITI wird in Tabelle 400 gezeigt. Die reife, leichte Kette besteht aus einer N-terminalen Sequenz aus 21 Resten, glykosyliert am Ser₁₀, gefolgt von zwei Tandemdomänen vom Kunitz-Typ, von denen die erste am Asn₄₅ glykosyliert ist (ODOM90). Im menschlichen Protein wurde gezeigt, dass die zweite Domäne vom Kunitz-Typ Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin inhibiert (ALBR83a, ALBR83b, SELL87, SWAI88). Der ersten Domäne fehlen diese Aktivitäten, aber es wurde berichtet, dass sie Leukozyten- Elastase inhibiert (≈ 1 μM > K_i > ≈ 1 nM) (ALBR83a, b, ODOM90). Die cDNA, die für die ITI leichte Kette kodiert, kodiert auch für α-1-Mikroglobulin (TRAB86, KAUM86, DIAR90); die Proteine werden post-translational durch Proteolyse getrennt.
Die zwei Kunitz-Domänen der leichten Kette von ITI (ITI-D1 und ITI-D2) besitzen eine Anzahl an Eigenschaften, die sie als potentielle Ausgangs-Bindedomänen (IPBD) verwendbar machen. ITI-D1 umfasst mindestens die Reste 26 bis 76 der UTI-Sequenz, die in 1 von GEBH86 gezeigt wird. Man könnte sich die Kunitz-Domäne so denken, dass sie die Reste von so früh wie Rest 22 bis soweit wie Rest 79 umfasst. Reste 22 bis 79 stellen eine 58-Aminosäuren-Domäne dar, die dieselbe Länge wie pankreatischer Trypsyin-Inhibitor aus Rind (BPTI) besitzt und die die Cysteine in Anordnung hat. ITI-D2 umfasst mindestens die Reste 82 bis 132; Reste so früh wie 78 und so spät wie 135 könnten eingeschlossen werden, um Domänen näher an der klassischen 58-Aminosäurelänge zu ergeben. Da der Abstand zwischen dem letzten Cystein von ITI-D1 (Rest 76 der leichten Kette von ITI) und dem ersten Cystein von ITI-D2 (Rest 82 der leichten Kette von ITI) nur fünf Reste beträgt, kann man keiner Domäne 58 Aminosäuren ohne eine gewisse Überlappung zuordnen. Wenn es nicht anders erwähnt wird, haben wir hierin die zweite Domäne beim Rest 78 der leichten Kette von ITI beginnen lassen. Jede der Domänen ist stark homolog sowohl zu BPTI als auch zur EpiNE-Serie der Proteine, die im US-Patent 5,223,409 beschrieben werden. Obwohl keine Röntgenkristallstrukturen der isolierten Domänen ITI-D1 und ITI-D2 erhältlich sind, zeigen kristallographische Studien der verwandten Domäne vom Kunitz-Typ, die aus dem Alzheimer-amyloiden β-Protein Vorläufer (AAβP) isoliert wurden, dass dieses Polypeptid eine 3D-Struktur annimmt, die fast identisch von der von BPTI ist (HYNE90).
Die dreidimensionale Struktur von α-Dendrotoxin vom Schlangengift der grünen Mamba wurde bestimmt (SKAR92), und die Struktur ist sehr ähnlich zu der von BPTI. Der Autor stellt fest „obwohl die Faltung der Hauptkette von α-DTX ähnlich zu der des homologen pankreatischen Trypsin-Inhibitors aus Rind (BPTI) ist, gibt es signifikante Unterschiede, die Abschnitte der Polypeptidkette nahe der „anti-Proteasestelle" von BPTI einbeziehen. Ein Vergleich der Struktur von α-DTX mit vorhandenen Modellen von BPTI und seinen Komplexen mit Trypsin und Kallikrein enthüllt strukturelle Unterschiede, die die Unfähigkeit von α-DTX, Trypsin und Chymotrypsin zu inhibieren, erklären."
Die Struktur des Schlangengifts K der schwarzen Mamba wurde durch NMR-Spektroskopie bestimmt und besitzt eine 3D-Struktur, die sehr ähnlich zu der von BPTI ist, trotz 32 Unterschieden in der Aminosäuresequenz zwischen den Resten 5 und 55 (das erste und letzte der Cysteine) (BERN93). „Die Struktur von Toxin K in Lösung ist sehr ähnlich zur Struktur des basischen pankreatischen Trypsin-Inhibitors (BPTI) in Lösung und der Röntgen-Kristallstruktur des α-Dendrotoxins von Dendroaspis angusticeps (α-DTX), mit Werten einer mittleren quadratischen Abweichung (root mean square deviation, r.m.s.d.) von jeweils 1,31 Å und 0,92 Å, für die Atome des Rückgrats von den Resten 2 bis 56. Einige lokale Strukturunterschiede zwischen Toxin K und BPTI sind direkt auf die Tatsache zurückzuführen, dass intramolekulare Interaktionen mit zwei der vier inneren Moleküle von Hydratationswasser in BPTI durch intramolekulare Wasserstoffbrücken in Toxin K ersetzt wurden." Daher ist es wahrscheinlich, dass die 3D-Struktur in Lösung von entweder der isolierten ITI-D1-Domäne oder der isolierten ITI-D2-Domäne sehr ähnlich zu den Strukturen von BPTI, AAβP und dem Schlangengift K der schwarzen Mamba sein werden. In diesem Fall gelten die Vorteile, die vorher für die Verwendung von BPTI als ein IPBD beschrieben wurden, auch für ITI-D1 und für ITI-D2. ITI-D1 und ITI-D2 bieten zusätzliche Vorteile als ein IPBD für die Entwicklung von spezifischer inhibitorischer Aktivität gegen Elastase. Zuerst wurde beschrieben, dass die ITI-D1-Domäne sowohl Leukozyten-Elastase (ALBR83a, b, ODOM90) und Cathepsin-G (SWAI88, ODOM90) inhibiert; Aktivitäten, welche BPTI fehlen. Zweitens fehlt ITI-D1 eine Affinität für die verwandten Serienproteasen Trypsin, Chymotrypsin, und Plasmin (ALBR83 a, b, SWAI88), ein Vorteil für die Entwicklung von Spezifität in der Inhibition. ITI-D2 hat den Vorteil, nicht glykosyliert zu sein. Zusätzlich sind ITI-D1 und ITI-D2 Polypeptide von menschlichem Ursprung, so dass erwartet wird, dass Derivate eine minimale Antigenizität in klinischen Anwendungen zeigen.
3. Sekretion von heterologen Proteinen aus Pichia pastoris
Andere haben eine Anzahl von Proteinen in der Hefe Pichia pastoris hergestellt. Zum Beispiel stellten Vedvick et al. (VEDV91) und Wagner et al. (WAGN92) Aprotinin aus dem Alkohol-Oxidase-Promotor durch Methanol-Induktion als ein sekretiertes Protein in das Kulturmedium (KM) her, zu ≈ 1 mg/mL. Gregg et al. (GREG93) haben eine Übersicht über die Herstellung einer Anzahl von Proteinen in P. pastoris geliefert. Die Tabelle 1 von GREG93 zeigt Proteine, die in P. pastoris hergestellt wurden und die Ausbeuten.
4. Rekombinante Herstellung von Kunitz-Domänen:
Aprotinin wurde durch rekominante DNA-Technologie hergestellt (AUER87, AUER88, AUER89, AUER90, BRIN90, BRIN91, ALTM91).
5. Konstruktionsverfahren:
Falls nicht anders erwähnt, werden genetische Konstruktionen und andere Manipulationen durch Standardmethoden durchgeführt, wie sie in Standardreferenzen gefunden werden (z.B. AUSU87 und SAMB89).
Es wird kein Zugeständnis gemacht, dass irgendeine zitierte Referenz Stand der Technik oder relevanter Stand der Technik ist, und die angegebenen Daten sind die, die auf der Referenz erscheinen und müssen nicht dem wirklichen Publikationsdatum entsprechen. Die Beschreibungen der Lehren irgendeiner zitierten Referenz basieren auf unserer gegenwärtigen Interpretation davon, und wir behalten uns das Recht vor, die Beschreibung zu überarbeiten, wenn wir auf einen Fehler aufmerksam werden, und in Frage zu stellen, ob die Beschreibung die tatsächlich wiedergegebene Arbeit akkurat wiederspiegelt. Wir behalten uns das Recht vor, die Interpretation von zitierten Arbeiten in Frage zu stellen, insbesondere in Anbetracht von neuen oder widersprüchlichen Beweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Serie von kleinen wirkungsstarken proteinartigen Inhibitoren von menschlicher neutrophiler Elastase (hNE), wie in den Ansprüchen definiert. Eine Gruppe von Inhibitoren stammt aus einer inhibitorischen Domäne vom Kunitz-Typ, die in einem Protein von menschlichem Ursprung gefunden wurde, nämlich der leichten Kette von menschlichem Inter-α-Trypsin-Inhibitor (ITI), welche Domänen enthält, die als ITI-D1 und ITI-D2 bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung offenbart Varianten von ITI-D2, wie in den Ansprüchen definiert, die eine sehr hohe Affinität für hNE besitzen. Die vorliegende Erfindung umfasst Modifikationen in der ITI-D2-Sequenz, wie in den Ansprüchen definiert, die ihre Herstellung in der Hefe Pichia pastoris erleichtern und die sehr wirkungsstarke Inhibitoren von hNE sind. Die Erfindung betrifft auch Herstellungsverfahren.
Die Erfindung wird als eine Serie von Beispielen gezeigt, die den Entwurf, die Herstellung und das Testen von tatsächlichen Inhibitoren beschreiben und zusätzliche Beispiele, die beschreiben, wie andere Inhibitoren entdeckt werden könnten. Die Erfindung betrifft Proteine, wie in den Ansprüchen definiert, die mit hoher Affinität menschliche neutrophile Elastase (hNE) inhibieren.
Nomenklatur und Abkürzungen
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung
Eine Proteinsequenz kann „Aprotinin-artige Kunitz-Domäne" genannt werden, wenn sie eine Sequenz enthält, die, wenn sie durch „Alignment" angeordnet wird, um Fehlpaarungen zu minimieren, mit vier oder weniger Fehlpaarungen durch „Alignment" angeordnet werden kann zur Abfolge:
Cys-(Xaa)₆-Gly-Xaa-Cys-(Xaa)₈-[Tyr|Phe]-(Xaa)₆-Cys-(Xaa)₂-Phe-Xaa-[Tyr|Trp|Phe]-Xaa-Gly-Cys-(Xaa)₄-[Asn|Gly]-Xaa-[Phe|Tyr]-(Xaa)₅-Cys-(Xaa)₃-Cys, wobei Amino-säuren in Klammern, die durch ein |-Symbol getrennt werden, alternative Aminosäuren für eine einzige Position darstellen. Zum Beispiel bedeutet [Tyr|Phe], dass an dieser Position die Aminosäure entweder Tyr oder Phe sein kann. Das Symbol Xaa bedeutet, dass an dieser Position jede beliebige Aminosäure verwendet werden kann. Für den oben genannten Test zählen eine Insertion oder Deletion als eine Fehlpaarung.
In Aprotinin werden die Cysteine mit 5, 14, 30, 38, 51 und 55 nummeriert und werden durch die Disulfide 5-auf-55, 14-auf-38 und 30-auf-51 verbunden. Der Rest 15 wird P1-Rest genannt (SCHE67); Reste gegen den Aminoterminus werden P2 (Rest 14), P3 (Rest 13) etc. genannt. Rest 16 wird P1' genannt, 17 ist P2', 18 ist P3' etc.
Es gibt viele Homologe von Aprotinin, die sich von diesem an einer oder mehren Positionen unterscheiden, aber die grundsätzliche oben definierte Struktur beibehalten. Für eine bestimmte Liste von Homologen ist es möglich, die Häufigkeit des Auftretens jeder Aminosäure bei jeder zweideutigen Position tabellarisch aufzulisten. (Die Sequenz, die die vorherrschendste Aminosäure an jeder zweideutigen Position besitzt, wird als „Konsensus-Kunitz-Domäne" in Tabelle 100 aufgelistet).
Eine „menschliche Aprotinin-artige Kunitz-Domäne" ist eine Aprotinin-artige Kunitz-Domäne, die in der Natur in einem menschlichen Protein gefunden wird. Menschliche Aprotinin-artige Kunitz-Domänen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, ITI-D1, ITI-D2, App-I, TFPI2-D1, TFPI2-D2, TFPI2-D3, LACI-D1, LACI-D2, LACI-D3, A3-Kollagen und die HKI B9-Domäne. In dieser Liste bedeuten D1, D2 etc. die erste, zweite etc. Domäne des angezeigten Multi-Domänen-Proteins.
„Schwache", „gemäßigte", „starke" und „sehr starke" Bindung an und Inhibition von hNE werden im Einklang mit Tabelle 55 definiert. Bevorzugter Weise haben die Proteine der vorliegenden Erfindung einen K_i von 1.000 pM (d.h. sind „starke" Inhibitoren), noch bevorzugter weniger als 50 pM, am meisten bevorzugt weniger als 10 pM (d.h. sind „sehr starke" Inhibitoren).
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine Aprotinin-artige Kunitz-Domäne in zehn Abschnitte aufgeteilt werden, basierend auf der Konsensus-Sequenz und der Lage des katalytischen Zentrums. Unter Verwendung des Schemas zur Aminosäurenummerierung von Aprotinin sind diese Abschnitte wie folgt (siehe Tabelle 100):

1: 1–4 (Reste vor dem ersten Cys)
2: 5–9 (erstes Cys und folgende Reste vor P6)
3: 10–13 (P6 bis P3)
4: 14 (zweites Cys; P2)
5: 15–21 (P1 und P1' bis P6')
6: 22–30 (nach P6 und bis zu und inkl. dem dritten Cys)
7: 31–36 (nach dem dritten Cys und bis zum Konsensus Gly-Cys
8: 37–38 (Konsensus Gly-Cys)
9: 39–42 (Reste nach Gly-Cys und vor dem Konsensus [Asn|Gly]
10: 43–55 (bis zum letzten Cys) (schließt auch die Reste nach dem letzten Cys ein, falls vorhanden)

Es wird verstanden werden, dass in diesen Aprotinin-artigen Kunitz-Domänen, die sich von Aprotinin durch eine oder mehrere Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen unterscheiden, oder die eine verschiedene Anzahl von Aminosäuren vor dem ersten Cystein oder nach dem letzten Cystein haben, sich die tatsächliche Aminosäureposition von der oben angegebenen unterscheiden kann. Es ist die Absicht des Anmelders, dass diese Domänen so nummeriert werden, dass sie zu der durch Alignment angeordneten Aprotininsequenz korrespondieren, z.B., das erste Cystein der Domäne wird zum Zwecke der Identifikation des Abschnitts als Aminosäure 5 nummeriert. Es ist zu bemerken, dass der Abschnitt 1, obwohl er ein Teil von Aprotinin ist, kein Teil der formellen Definition einer Aprotinin-artigen Kunitz-Domäne ist, und daher ist es keine Voraussetzung, dass die Proteine der vorliegende Erfindung eine zu Abschnitt 1 korrespondierende Sequenz einschließen.
In ähnlicher Weise ist ein Teil von Abschnitt 10 (nach dem letzten Cys) kein notwendiger Teil der Domäne.
Ein „humanisierter Inhibitor" ist einer, in dem mindestens einer der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 sich durch mindestens eine nicht-konservative Modifikation von der ähnlichsten (basierend auf Aminosäureidentitäten) menschlichen Aprotinin-artigen Kunitz-Domäne unterscheidet, in dem mindestens einer der Abschnitte 2, 6 und 10 (bis zum letzten Cys betrachtet) identisch ist, oder sich nur durch konservative Modifkationen von der besagten ähnlichsten menschlichen Aprotinin-artigen Kunitz-Domäne unterscheidet, und welche nicht zu irgendeiner natürlich vorkommenden nicht menschlichen Aprotinin-artigen Kunitz-Domäne identisch ist. (Es ist zu bemerken, dass Abschnitt 1 bei dieser Bestimmung ignoriert wird, da er außerhalb der Sequenz ist, die benutzt wird, um eine Domäne zu definieren, und Abschnitte 4 und 8 werden ignoriert, weil sie für die Definition einer Aprotinin-artiger Kunitz-Domäne notwendig sind.)
Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind bevorzugter Weise humanisierte starke oder sehr starke hNE-Inhibitoren, wie in den Ansprüchen definiert. Es sollte bemerkt werden, dass die menschlichen Aprotinin-artigen Kunitz-Domänen, die bisher identifiziert wurden, nur schwache hNE-Inhibitoren sind. Eine Aprotinin-artige Kunitz-Domäne ist „im Wesentlichen homolog" zu einer Referenzdomäne, wenn sie über die oben ausgeführte kritische Region (Aprotininreste 5–55) mindestens 50 % identisch in Aminosäuresequenz zur korrespondierenden Sequenz von der oder innerhalb der Referenzdomäne ist, und alle Abweichungen die Form von konservativen und/oder semi-konservativen Modifikationen annehmen.
Proteine der vorliegenden Erfindung schließen solche ein, die eine Kunitz-Domäne umfassen, die aus den Referenzproteinen EPI-HNE-3 oder EPI-HNE-4 besteht, wie in Tabelle 100 definiert.
Es werden hNE-Bindedomänen von Proteinen offenbart, welche mindestens 80 % identisch, noch bevorzugter mindestens 90 % identisch in Aminosäuresequenz zur korrespondierenden Referenzsequenz sind. Proteine werden offenbart, in denen die Anzahl an Fehlpaarungen 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 ist. Es werden Proteine offenbart, in denen die hNE-Bindedomänen von der Referenzdomäne nur durch eine oder mehrere konservative Modifikationen abweichen.
„Konservative Modifikationen" werden definiert als:

a) konservative Substitutionen von Aminosäuren, wie später definiert, und
b) einzelne oder mehrfache Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren an den Termini, an den Grenzen zwischen den Domänen, in Schleifen oder in anderen Abschnitten mit relativ hoher Beweglichkeit (wie zum Beispiel gezeigt durch hohe Temperaturfaktoren oder mangelnde Auflösung in der Röntgenstrukturbeugung, Neutronenbeugung oder NMR). Bevorzugter Weise werden nicht mehr als etwa fünf Aminosäuren an einem speziellen Lokus inseriert oder deletiert, außer an den Termini, und die Modifikationen sind außerhalb von Regionen, von denen bekannt ist, dass sie Verbindungsstellen enthalten, die wichtig für die Aktivität sind.

„Konservative Substitutionen" sind hierin definiert als Austausche innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen:

I. Kleine aliphatische, nicht-polare oder leicht-polare Reste: [Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)]
II. Saure Aminosäuren und ihre Amide: [Asp, Glu, Asn, Gln],
III. Polare, positiv geladene Reste: [His, Lys, Arg],
IV. Aliphatische nicht-polare Reste: [Met, Leu, Ile, Val, (Cys)], und
V. Große, aromatische Reste: [Phe, Tyr, Trp]

Die Reste Pro, Gly und Cys sind in Klammern, weil sie spezielle Rollen in der Konformation spielen. Cys nimmt oft an Disulfidbrücken teil; wenn es das nicht tut, ist es stark hydrophob. Gly verleiht der Kette Flexibilität; es wird oft als „Helixbrecher" beschrieben, obwohl viele α-Helices Gly enthalten. Pro verleiht der Kette Steilheit und wird auch als „Helixbrecher" beschrieben. Obwohl Pro am häufigsten in Schleifen gefunden wird, wird Pro auch in Helices und Sheets gefunden. Diese Reste können an bestimmten Positionen essentiell und woanders ersetzbar sein.
„Semi-konservative Modifikationen" werden hierin definiert als Transpositionen von benachbarten Aminosäuren (oder ihre konservativen Austausche) und semi-konservative Substitutionen. „Semi-konservative Substitutionen" sind definiert als Austausche zwischen zwei der obigen Gruppen (I)–(V), die entweder auf die Übergruppe bestehend aus (I), (II) und (III) beschränkt sind oder auf die Übergruppe bestehend aus (IV) und (V). Zum Zwecke dieser Definition werden jedoch Glycin und Alanin als Mitglieder beider Übergruppen betrachtet.
„Nicht-konservative Modifikationen" sind Modifikationen, die weder konservativ noch semikonservativ sind.
Es werden Proteine offenbart, die weiterhin durch eine oder mehrere der bevorzugten, stark bevorzugten oder am meisten bevorzugten Mutationen charakterisiert sind, die in Tabelle 711 aufgeführt sind.
Es werden Proteine offenbart, die hNE-inhibitorische Domänen besitzen, die nicht nur beträchtlich homolog zu einer Referenzdomäne sind, sondern auch als humanisierte Inhibitoren gelten.
Es wird offenbart, dass Anspruch 1 von PCT/US92/01501 sich auf Proteine bezieht, die EpiNEalpha, EpiNE1, EpiNE2, EpiNE3, EpiNE4, EpiNE5, EpiNE6, EpiNE7 und EpiNE8 genannt werden. Anspruch 3 bezieht sich auf Proteine, die ITI-E7, BITI-E7, BITI-E&-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE und MUT1619 genannt werden. (Mit der Ausnahme von EpiNEalpha erscheinen Sequenzen von allen diesen Domänen in Tabelle 100.) Ansprüche 4–6 betreffen Inhibitoren, die homolog, aber nicht identisch, mit den vorher erwähnten Inhibitoren sind. Diese Inhibitoren könnten sich von den Leit-Inhibitoren durch eine oder mehrere Substitutionen der Klasse A (Anspruch 4) oder einer oder mehrerer Substitutionen der Klassen A oder B (Anspruch 5) oder einer oder mehrerer Substitutionen der Klasse A, B oder C (Anspruch 6) unterscheiden. Substitutionen der Klasse A, B und C werden in Tabelle 65 von PCT/US92/01501 definiert. Zur Erleichterung wurde Tabelle 65 in dieser Beschreibung wiedergegeben.
Die Bedeutung der Klassen A, B und C waren wie folgt: A, kein bedeutender Effekt erwartet, wenn die molekulare Ladung im Bereich –1 bis +1 bleibt; B, keine bedeutende Effekte erwartet, aber wahrscheinlicher als in A; und C, Rest in der Bindungs-Grenzfläche, jeder Austausch muss getestet werden. Jeder Position eines Restes wurde eine Wertung von A, B, C oder X zugewiesen; X bedeutet, dass keine Substitution erlaubt ist. An den nicht-X-Positionen wurden erlaubte Substitutionen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung schließt Domänen aus, die exakt den Leit-Domänen der Ansprüche 1 und 3 von PCT/US92/01501 entsprechen. Es werden Domänen offenbart, die sich auch von diesen Leit-Domänen durch eine oder mehrere Mutationen unterscheiden, die keine Klasse A-Substitutionen, oder Klasse A- oder B-Substitutionen und keine Klasse A-, B- oder C-Substitutionen sind, wie in Tabelle 65 definiert. Es werden Domänen offenbart, von denen jede ähnlicher zu einem der vorher genannten Referenzproteine ist als zu irgendeinem der in PCT/US92/01501 beschriebenen Leit-Proteine.
Die Beispiele enthalten zahlreiche Beispiele von Aminosäuresequenzen, die von DNA-Sequenzen begleitet werden, die sie kodieren.
Vergleichsbeispiel 1: Expression und Display von BPTI, ITI-D1 und anderen Kunitz-Domänen
Tabelle 30 zeigt ein Display-Gen, das kodiert: 1) das M13 III Signalpeptid, 2) BPTI und 3) die ersten paar Aminosäuren des reifen M13 III-Proteins. Es wurden Phagen hergestellt, in denen dieses Gen das einzige iii-artige Gen ist, so dass von allen exprimierten Kopien von III erwartet wird, dass sie am Amino-Terminus des reifen Proteins modifiziert sind. Substitutionen in der BPTI-Domäne können in den Kassetten gemacht werden, die durch die AccIII, XhoI, PflMI, ApaI, BssHII, StuI, XcaI, EspI, SphI oder NarI (selbe Erkennung als KasI)-Restriktionsschnittstellen eingegrenzt werden. Tabelle 100 zeigt Aminosäuresequenzen einer Anzahl von Kunitz-Domänen, von denen einige hNE inhibieren. Jede der in Tabelle 100 gezeigten hNE-inhibierenden Sequenzen kann als intaktes hNE-bindendes Protein exprimiert werden, oder kann als eine Domäne in ein größeres Protein eingebaut werden. Von Proteinen, die einen wesentlichen Teil einer der in Tabelle 100 gefundenen hNE-inhibierenden Sequenzen umfassen, wird erwartet, dass sie hNE-inhibitorische Aktivität zeigen. Dies trifft besonders zu, wenn die Sequenz beibehalten wird, die mit dem ersten Cystein beginnt und durch das letzte Cystein weitergeht.
Die Domäne I von ITI ist, wie unten beschrieben, eine Kunitz-Domäne. Die Fähigkeit eines Display-Phagen, auf Matrices zurückgehalten zu werden, die hNE aufweisen, hängt mit der Affinität der speziellen Kunitz-Domäne (oder einem anderen Protein), die auf dem Phagen präsentiert wird, zusammen. Eine Expression des ITI-Domäne 1::iii-Fusionsgens und eine Präsentation des Fusionsgens auf der Phagenoberfläche wurde durch Western-Analyse und Experimente zur Phagentiter-Neutralisation gezeigt. Die Infektiosität von ITI-D1-Display-Phagen wurde durch Antikörper, die ITI binden, bis zu 99 % blockiert, während Wildtyp-Phagen nicht beeinträchtigt wurden.
Tabelle 35 zeigt die Sequenz eines Fusionsgens umfassend: a) die Signalsequenz von M13 III, b) ITI-D1 und c) den anfänglichen Teil des reifen III von M13. Die präsentierte ITI-D1-Domäne kann durch Standardverfahren verändert werden, einschließlich: i) Oligonukleotidgerichtete Mutagenese von einzelsträngiger Phagen-DNA und ii) Kassettenmutagenese von RF-DNA unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen (BglI, EagI, NcoI, SryI, PstI und KasI (zwei Schnittstellen)), die im Gen geschaffen wurden.
Vergleichsbeispiel 2: Fraktionierung von MA-ITI-D1-Phagen, die an Agarose-immobilisierte Proteasekügelchen gebunden sind
Um zu testen, ob Phagen, die ITI-D1::III-Fusionsprotein präsentieren, stark mit den Proteasen menschliche neutrophile Elastase hNE interagieren, wurden Aliquots von Display-Phagen mit Agarose-immobilisierten hNE-Kügelchen („hNE-Kügelchen") inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen und gebundene Phagen durch pH-Fraktionierung, wie in US 5,223,409 beschrieben, eluiert. Die pHs, die in dem schrittweisen Gradienten verwendet wurden, waren 7,0, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5 und 2,0. Nach Elution und Neutralisierung wurde in den verschiedenen Auftrags-, Wasch- und pH-Elutionsfraktionen der Titer bestimmt. Phagen, die ITI-D1 präsentierten, wurden mit Phagen verglichen, die EpiNE-7 präsentierten.
Die Ergebnisse von mehreren Fraktionierungen werden in Tabelle 212 gezeigt (EpiNE-7- oder MA-ITI-D1-Phagen, gebunden an hNE-Kügelchen). Die pH-Elutionsprofile, die unter Verwendung des Kontroll-Display-Phagen (EpiNE-7) erhalten wurden, waren früheren Profilen ähnlich ( US 5,223,409 ). Etwa 0,3 % der EpiNE-7-Display-Phagen, die auf die hNE-Kügelchen aufgetragen wurden, eluierten während der Verfahrensweise der Fraktionierung, und das Elutionsprofil besaß ein Maximum für eine Elution bei etwa pH 4,0.
Die MA-ITI-D1-Phagen zeigen keine Anzeichen einer großen Affinität für hNE-Kügelchen. Die pH-Elutionsprofile für an hNE-Kügelchen gebundene MA-ITI-D1-Phagen zeigen im Wesentlichen eine einförmige Abnahme an Phagen, die bei sinkendem pH gewonnen wurden. Weiterhin waren die gesamten Anteile der auf die Kügelchen aufgetragenen Phagen, die während der Verfahrensweisen der Fraktionierung gewonnen wurden, ziemlich gering: 0,002 %.
Veröffentlichte K_i-Werte der Inhibition von neutrophiler Elastase durch das intakte, große ITI-Protein (M_r = 240.000) liegen im Bereich zwischen 60 und 150 nM (SWAI88, ODOM90). Unsere eigenen Messungen der pH-Fraktion von an hNE-Kügelchen gebundenen Display-Phagen zeigt, dass Phagen, die Proteine mit geringer Affinität für hNE präsentieren (> 1 μM), nicht durch die Kügelchen gebunden werden, während Phagen, die Proteine mit größerer Affinitität (nM) präsentieren, an die Kügelchen binden und bei etwa pH 5 eluiert werden. Wenn die erste Domäne vom Kunitz-Typ der leichten Kette von ITI voll für die inhibitorische Aktivität von ITI gegen hNE verantwortlich ist, und wenn diese Domäne korrekt auf dem MA-ITI-D1-Phagen präsentiert wird, dann scheint es, dass die minimale Affinität eines Inhibitors für hNE, der ein Binden und Fraktionieren von Display-Phagen auf hNE-Kügelchen erlaubt, zwischen 50 und 100 nM ist.
Vergleichsbeispiel 3: Veränderung der P1-Region von ITI-D1
Wir nehmen an, dass ITI-D1 und EpiNE-7 in Lösung dieselbe 3D-Konfiguration besitzen wie BPTI. Obwohl EpiNE-7 und ITI-D1 an den Positionen 13, 17, 20, 32 und 39 identisch sind, unterscheiden sie sich stark in ihren Affinitäten für hNE. Um die Affinität von ITI-D1 für hNE zu verbessern, wurde die EpiNE-7-Sequenz Val ₁₅-Ala ₁₆-Met ₁₇-Phe ₁₈-Pro ₁₉-Arg₂₀ (fettgeschriebene, unterstrichene Aminosäuren sind Veränderungen) in die ITI-D1-Sequenz durch Kassettenmutagenese zwischen die EagI- und StyI/NcoI-Schnittstellen, die in Tabelle 35 gezeigt werden, eingebaut. Phagenisolate, die das ITI-D1::III-Fusionsgen mit den EpiNE-7-Austauschen um die P1-Position enthalten, werden MA-ITI-D1E7 genannt.
Vergleichsbeispiel 4: Fraktionierung der MA-ITI-D1E7-Phagen
Um zu testen, ob ITI-D1E7-Display-Phagen hNE-Kügelchen binden, wurden pH-Elutionsprofile gemessen. Aliquots von EpiNE-7-, MA-ITI-D1- und MA-ITI-D1E7-Display-Phagen wurden mit hNE-Kügelchen drei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen und die Phagen wurden wie in US 5,223,409 beschrieben eluiert, außer dass nur drei pH-Elutionen durchgeführt wurden. Diese Daten befinden sich in Tabelle 215. Das pH-Elutionsprofil von EpiNE-7-Display-Phagen ist wie beschrieben. MA-ITI-D1E7-Phagen zeigen ein breites Elutionsmaximum um pH 5. Der gesamte Anteil von MA-ITI-D1E7-Phagen, die durch pH-Elution von hNE-Kügelchen erhalten wurden, war etwa 40-fach weniger als die, die unter Verwendung von EpiNE-7-Display-Phagen erhalten wurden.
Das pH-Elutionsverhalten von MA-ITI-D1E7-Phagen, die an hNE-Kügelchen gebunden sind, ist qualitativ ähnlich zu dem, das bei Verwendung von BPTI[K15L]-III-MA-Phagen beobachtet wird. BPTI mit der K15L-Mutation hat eine Affinität für hNE von ≈ 3 nM. (Veränderungen und Mutationen werden angezeigt durch Wiedergabe des originalen (Wildtyp) Aminosäuretyps, dann der Position und dann des neuen Aminosäuretyps; das heißt K15L bedeutet einen Austausch von Lys₁₅ zu Leu.). Unter der Annahme, dass alles andere gleich bleibt, deutet das pH-Elutionsprofil für MA-ITI-D1E7 an, dass die Affinität der freien ITI-D1E7-Domäne für hNE im nM-Bereich sein könnte. Wenn das der Fall ist, hat die Substitution der EpiNE-7-Sequenz anstelle der ITI-D1-Sequenz um die P1-Region eine 20- bis 50-fache Steigerung der Affinität für hNE hervorgerufen (unter der Annahme, dass K_i = 60 bis 150 nM für die unveränderte ITI-D1).
Wenn EpiNE-7 und ITI-D1E7 in Lösung dieselbe Struktur besitzen, zeigen diese Proteine identische Aminosäuresequenzen zu hNE über die Interaktionsoberfläche. Trotz dieser Ähnlichkeit zeigt EpiNE-7 eine grob geschätzt 1.000-fach größere Affinität für hNE als ITI-D1E7 es tut. Diese Beobachtung stellt die Wichtigkeit von nicht in Kontakt tretenden sekundären Resten für die Modulation von Interaktionsstärken heraus.
Die native leichte Kette von ITI ist an zwei Positionen glykosyliert, Ser₁₀ und Asn₄₅ (GEBH86). Es wurde gezeigt, dass ein Entfernen der Glykosaminoglykanketten die Affinität des Inhibitors für hNE etwa 5-fach verringert (SELL87). Ein anderer möglicherweise wichtiger Unterschied zwischen EpiNE-7 und ITI-D1E7 ist der der Nettoladung. Die Austausche in BPTI, die EpiNE-7 herstellen, reduzieren die gesamte Ladung auf dem Molekül von +6 zu +1. Sequenzunterschiede zwischen EpiNE-7 und ITI-D1E7 reduzieren die Ladung auf Letzterem weiterhin zu –1. Weiterhin stammt die Änderung in der Nettoladung zwischen diesen zwei Molekülen von Sequenzunterschieden, die in zentralen Teilen der Moleküle vorkommen. Position 26 ist ein Lys in EpiNE-7 und ist ein Thr in ITI-D1E7, während diese Reste an Position 31 jeweils Gln und Glu sind. Diese Änderungen in der Sequenz ändern nicht nur die Nettoladung auf den Molekülen, sondern positionieren auch einen negativ geladenen Rest nahe an die Interaktionsoberfläche in ITI-D1E7. Es kann sein, dass das Vorkommen einer negativen Ladung bei Position 31 (die in keinem anderen der hier beschriebenen hNE-Inhibitoren gefunden wird), die Inhibitor-Protease-Interaktion destabilisiert.
Vergleichsbeispiel 5: Herstellung von BITI-E7-Phagen
Mögliche Gründe dafür, dass MA-ITI-D1E7-Phagen eine geringere Affinität für hNE als MA-EpiNE7-Phagen haben, schließen ein: a) unkorrekte Spaltung des IIISignal::ITI-D1E7::reifesIII Fusionsprotein, b) ungeeignete negative Ladung auf der ITI-DIE7-Domäne, c) Konformations- oder dynamische Änderungen im Kunitz-Rückgrat, die durch Substitutionen wie Phe₄ bis Ser₄ verursacht werden, und d) nicht-optimale Aminosäuren in der ITI-D1E7:hNE-Kontaktfläche, wie Q₃₄ oder A₁₁.
Um die ersten drei Möglichkeiten zu untersuchen, substituierten wir die ersten vier Aminosäuren von EpiNE7 mit den ersten vier Aminosäuren von ITI-D1E7. Diese Substitution sollte ein Peptid liefern, das durch Signalpeptidase-I in derselben Weise gespalten werden kann wie die IIISignal::EpiNE7::reifeIII Fusion. Weiterhin ist Phe₄ von BPTI ein Teil des hydrophoben Kerns des Proteins; ein Ersetzen durch Serin könnte die Stabilität oder den dynamischen Charakter von ITI-D1E7 ungünstig verändern. ITI-D1E7 hat ein negativ geladenes Glu an der Position 2, während EpiNE7 Pro besitzt. Wir haben die drei Änderungen am Aminoterminus des ITI-D1E7-Proteins (K1R, E2P und S4F) durch Oligonukleotidgerichtete Mutagenese eingeführt, um BITI-E7 herzustellen; Phagen, die BITI-E7 präsentieren, werden MA-BITI-E7 genannt.
Wir haben die Eigenschaften der ITI-III-Fusionsproteine, die von den Phagen MA-ITI-D1 und MA-BITI präsentiert werden verglichen unter Verwendung von Western-Analyse wie vorher beschrieben, und haben keine signifikanten Unterschiede in der scheinbaren Größe oder relativen Menge der Fusionsproteine gefunden, die von einem der Display-Phagenstämme hergestellt werden. Daher gibt es keine großen Unterschiede in den prozessierten Formen jedes Fusionsproteins, das auf dem Phagen präsentiert wird. Als Erweiterung davon sind auch keine großen Unterschiede in den prozessierten Formen der Gen-III-Fusionsproteine vorhanden, die durch MA-ITI-D1E7 und MA-EpiNE7 präsentiert werden. Große Änderungen in der Proteinkonformation auf Grund von verändertem Prozessieren sind daher vermutlich nicht für die großen Unterschiede in der Bindung an hNE-Kügelchen, die durch MA-ITI-D1E7 und MA-EpiNE7 Display-Phagen gezeigt wurden, verantwortlich.
Wir haben die Bindungseigenschaften an hNE-Kügelchen von MA-BITI- und MA-BITI-E7-Display-Phagen charakterisiert unter Verwendung der erweiterten Verfahrensweise der pH-Fraktionierung, die in US 5,223,409 beschrieben wird. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 216. Die pH-Elutionsprofile für MA-BITI und MA-BITI-E7 zeigen signifikante Unterschiede zu den Profilen, die durch MA-ITI-D1 und MA-ITI-D1E7 gezeigt werden. In beiden Fällen verursachen die Änderungen am vermeintlichen Aminoterminus des präsentierten Fusionsproteins einen mehrfachen Anstieg am Anteil des aufgetragenen Display-Phagens, der von den hNE-Kügelchen eluiert wird.
Die Bindungskapazität von hNE-Kügelchen für Display-Phagen variiert unter den Zubereitungen der Kügelchen und mit dem Alter jeder individuellen Zubereitung der Kügelchen. Daher ist es schwer, die absoluten Ausbeuten an Phagen von Elutionen zu vergleichen, die zu verschiedenen Zeiten durchgeführt wurden. Zum Beispiel variiert der Anteil an MA-EpiNE7-Display-Phagen, der von hNE-Kügelchen gewonnen wurde, zweifach zwischen den in Tabellen 212, 215 und 216 gezeigten Experimenten. Jedoch sind die Formen der pH-Elutionsprofile ähnlich. Es ist möglich, etwas für die Variationen in der Bindungskapazität an hNE-Kügelchen zu korrigieren, indem die Display-Phagenausbeuten auf die Gesamtausbeute von MA-EpiNE7-Phagen, die in einer gleichzeitigen Elution von den Kügelchen gewonnen wurden, zu normalisieren. Wenn die in Tabelle 212, 215 und 216 gezeigten Daten so normalisiert werden, werden die gewonnenen Display-Phagen relativ zum gewonnenen MA-EpiNE7 in Tabelle 10 gezeigt.
Damit führen die Austausche in der Amino-terminalen Sequenz des präsentierten Proteins zu einem drei- bis fünffachen Anstieg im Anteil des Display-Phagen, der von hNE-Kügelchen eluiert wird. Zusätzlich zu einer verstärkten Bindung, führen die Änderungen, die in MA-BITI-E7 eingeführt wurden, zu Phagen, die von hNE-Kügelchen bei einem geringeren pH eluieren, als die Eltern-Phagen MA-ITI-D1E7. Während die Eltern-Display-Phagen mit einem breiten pH-Maximum, welches um pH 5,0 konzentriert ist, eluieren, besitzt das pH-Elutionsprofil für MA-BITI-E7-Display-Phagen ein pH-Maximum um etwa pH 4,75 bis pH 4,5.
Das pH-Elutionsmaximum der MA-BITI-E7-Display-Phagen liegt zwischen den Maxima, die durch BPTI(K15L)- und BPTI(K15V, R17L)-Display-Phagen gezeigt werden (jeweils pH 4,75 und pH 4,5 bis pH 4,0), beschrieben in US 5,223,409 . Aus dem pH-Maximum, das durch die Display-Phagen gezeigt wird, sagen wir voraus, dass das BITI-E7-Protein frei in der Lösung eine Affinität für hNE im 100 pM-Bereich haben kann. Dies würde einen annähernd 10-fachen Anstieg an Affinität für hNE verglichen mit dem, der oben für ITI-D1E7 geschätzt wurde, darstellen.
Wie oben beschrieben wurde, zeigt Western-Analyse von Phagen-Proteinen, dass es keine großen Änderungen in Gen-III-Fusionsproteinen nach Veränderungen der Amino-terminalen Sequenz gibt. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Änderungen in Affinität der Display-Phagen für hNE-Kügelchen den umfassenden Veränderungen in der Proteinfaltung zugeschrieben werden können, die von verändertem („korrektem") Prozessieren des Fusionsproteins in den Amino-terminalen Mutanten resultiert. Die Verbesserungen in der Bindung können teilweise begründet sein durch: 1) das Absinken der negativen Nettoladung (–1 bis 0) auf dem Protein, das vom Glu zu Pro-Austausch bei Position 2 stammt, oder 2) erhöhter Proteinstabilität, die von der Ser zu Phe-Substitution bei Rest 4 im hydrophoben Kern des Proteins resultiert, oder 3) die kombinierten Wirkungen beider Substitutionen.
Vergleichsbeispiel 6: Herstellung und Eigenschaften von MA-BITI-E7-1222 und MA-BITI-E7-141
Innerhalb der vermuteten Kunitz:hNE-Kontaktfläche unterscheiden sich BITI-E7 und EpiNE7 nur an zwei Positionen: 11 und 34. In EpiNE7 sind diese Reste jeweils Thr und Val. In BITI-E7 sind sie Ala und Gln. Zusätzlich hat BITI-E7 ein Glu bei 31, während EpiNE7 Gln hat. Diese negative Ladung könnte die Bindung beeinflussen, obwohl sich der Rest nicht direkt in der Kontaktfläche befindet. Wir haben Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese benutzt, um die Auswirkungen von Substitutionen an den Positionen 11, 31 und 34 auf die Protease:Inhibitor-Interaktion zu untersuchen.
Das ITI-D1-Derivat BITI-E7-1222 ist BITI-E7 mit dem Austausch A11T. ITI-D1-Derivat BITI-E7-141 ist das BITI-E7 mit den Änderungen E31Q und Q34V; Phagen, deren Gegenwart diese Proteine anzeigt, sind MA-BITI-E7-1222 und MA-BITI-E7-141. Wir haben die Bindungseigenschaften an hNE-Kügelchen von MA-BITI-E7-1222 und MA-BITI-E7-141-Display-Phagen untersucht unter Verwendung des erweiterten pH-Fraktionierungsprotokolls, das vorher beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 217 (für MA-BITI-E7 und MA-BITI-E7-1222) und 218 (für MA-EpiNE7 und MA-BITI-E7-141). Die pH-Elutionsprofile für die MA-BITI-E7- und MA-BITI-E7-1222-Phagen sind fast identisch. Beide Phagenstämme zeigen pH-Elutionsprofile mit identischen Maxima (zwischen pH 5,0 und pH 4,5) sowie denselben gesamten Anteil von aufgetragenen Phagen, die von hNE-Kügelchen eluiert werden (0,03 %). Damit hat die T11A-Substitution im präsentierten ITI-D1-Derivat keinen nennenswerten Effekt auf die Bindung an hNE-Kügelchen.
Im Gegensatz dazu beeinträchtigen die Austausche an den Positionen 31 und 34 die hNE-Bindungseigenschaften der Display-Phagen stark. Das pH-Maximum des Elutionsprofils von MA-BITI-E7-141-Phagen ist zu einem niedrigeren pH bezüglich des Eltern-Phagen MA-BITI-E7 verschoben. Weiterhin ist die Position des Maximums (zwischen pH 4,5 und pH 4,0) identisch mit der, die durch MA-EpiNE7-Phagen in diesem Experiment gezeigt wurde. Schließlich zeigen die MA-BITI-E7-141-Phagen einen 10-fachen Anstieg im Verhältnis zum elterlichen MA-BITI-E7 im gesamten Anteil an aufgetragenen Phagen, die von hNE-Kügelchen eluiert wurden (0,3 % gegenüber 0,03 %). Der gesamte Anteil an MA-BITI-E7-141-Phagen, die von hNE-Kügelchen eluiert wurden, entspricht fast dem zweifachen von der von MA-EpiNE7-Phagen.
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen, dass die Bindung durch MA-BITI-E7-141-Display-Phagen an hNE-Kügelchen vergleichbar mit der von MA-EpiNE7-Phagen ist. Wenn die zwei Proteine (EpiNE7 und BITI-E7-141) in Lösung ähnliche Affinitäten für hNE besitzen, dann ist die Affinität des BITI-E7-141-Proteins für hNE in der Größenordnung von 1 pM. Eine solche Affinität ist annähernd 100-fach größer als die, die vorangehendend für das Elternprotein (BITI-E7) geschätzt wurde und ist 10⁵ bis 10⁶ mal so groß wie die Affinität für hNE, die für das intakte ITI-Protein berichtet wird.
Vergleichsbeispiel 7: Mutagenese von BITI-E7-141
BITI-E7-141 unterscheidet sich von ITI-D1 an neun Positionen (1, 2, 4, 15, 16, 18, 19, 31 und 34). Um das Protein zu erhalten, das die wenigsten Änderungen von ITI-D1 besitzt, während es hohe spezifische Affinität für hNE beibehält, haben wir die Auswirkungen einer Umkehr der Austausche an Position 1, 2, 4, 16, 19, 31 und 34 untersucht. Die Derivate von BITI-E7-141, die getestet wurden, sind MUT1619, MUTP1 und MUTT26A. Die Derivate von BITI, die getestet wurden, sind AMINO1 und AMINO2. Das Derivat von BITI-E7, das getestet wurde, ist MUTQE. Alle diese Sequenzen werden in Tabelle 100 gezeigt. MUT1619 stellt die ITI-D1-Reste Ala₁₆ und Ser₁₉ wieder her. Die als „MUTP1" bezeichnete Sequenz bestätigt die Aminosäuren I₁₅, G₁₆, S₁₉ im Zusammenhang von BITI-E7-141. Es ist wahrscheinlich, dass M₁₇ und F₁₈ optimal für eine hNE-Bindung mit hoher Affinität sind. G₁₆ und S₁₉ treten häufig in den hNE-bindenden BPTI-Varianten mit hoher Affinität auf, die aus der Fraktionierung einer Bibliothek von BPTI-Varianten gegen hNE erhalten wurden (ROBE92). Drei Austausche am vermuteten Aminoterminus der präsentierten ITI-D1-Domäne wurden eingefügt, um die MA-BITI-Phagen-Serie herzustellen. AMINO1 trägt die Sequenz K₁ bis E₂, während AMINO2 K₁ bis S₄ trägt. Andere Aminosäuren in der Amino-terminalen Region dieser Sequenzen sind wie in ITI-D1. MUTQE stammt aus BITI-E7-141 durch den Austausch Q31E (was den ITI-D1 Wildtyp-Rest wiederherstellt). Schließlich ist beabsichtigt, dass das mutagenisierende Oligonukleotid MUTT26A eine mögliche Stelle für N-verknüpfte Glykosylierung entfernt, N₂₄-G₂₅-T₂₆. Im intakten ITI-Molekül, das aus humanem Serum isoliert wurde, ist die leichte Polypeptidkette an dieser Stelle glykosyliert (N₄₅, ODOM90). Es ist wahrscheinlich, dass N₂₄ glykosyliert sein wird, wenn das BITI-E7-141-Protein durch eukaryotische Expression hergestellt wird. Eine solche Glykosylierung kann das Protein immunogen machen, wenn es für eine Langzeitbehandlung verwendet wird. Das MUTT26A enthält die Veränderung T26A und entfernt die möglichen Glykosylierungsstellen mit minimalen Änderungen der allgemeinen chemischen Eigenschaften des Rests an dieser Position. Zusätzlich wird ein Ala-Rest häufig in anderen BPTI-Homologen an Position 26 gefunden (Siehe Tabelle 34 von US 5,223,409 ). Die Mutagenese wurde mit ssDNA des MA-BITI-E7-141-Phagen durchgeführt.
Vergleichsbeispiel 8: hNE-Bindungseigenschaften von mutagenisiertem MA-BITI-E7-141-Display-Phagen
Tabelle 219 zeigt die pH-Elutionsdaten für verschiedene von hNE-Kügelchen eluierte Display-Phagen. Die gesamten pfu, die auf die Kügelchen aufgetragen wurden, befinden sich in Spalte 2. Die Anteile dieser Auftrags-pfu, die in jeder pH-Fraktion des verkürzten pH-Elutionsprotokolls gewonnen wurden (pH 7,0, pH 3,5 und pH 2,0) befinden sich in den nächsten drei Spalten. Für die Daten, die unter Verwendung des erweiterten pH-Elutionsprotokolls erhalten wurden, stellt die pH 3,5-Auflistung die Summe der Anteile des Auftrags dar, die in den Elutionsproben von pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0 und pH 3,5 gewonnen wurden. Die pH 2,0-Auflistung ist die Summe der Anteile des Auftrags, erhalten aus den pH 3,0-, pH2,5- und pH 2,0-Elutionsproben. Der gesamte Anteil an Auftrags-pfu, der während des pH-Elutionsprotokolls erhalten wurde, befindet sich in der sechsten Spalte. Die letzte Spalte der Tabelle listet den gesamten Anteil von gewonnenen Auftrags-pfu auf, normalisiert auf den Wert, der für MA-BITI-E7-141-Phagen erhalten wurde.
Zwei Faktoren müssen in Betracht gezogen werden, wenn Vergleiche zwischen den in Tabelle 219 gezeigten Daten gemacht werden. Der Erste ist, dass auf Grund der kinetischen Natur der Phagenfreisetzung von hNE-Kügelchen und der längeren Zeit, die in das erweiterte pH-Elutionsprotokoll einbezogen ist, wird der Anteil an Auftrags-pfu, der in der pH 3,5-Fraktion gewonnen wird, auf Kosten der pH 2,0-Fraktion im erweiterten Protokoll bezüglich dieser Werte, die im verkürzten Protokoll gewonnen werden, angereichert sein. Die Größe dieser Wirkung kann gesehen werden, wenn die Ergebnisse verglichen werden, die erhalten werden, wenn MA-BITI-E7-141-Display-Phagen von hNE-Kügelchen unter Verwendung der zwei Protokolle eluiert wurden. Der zweite Faktor ist, dass für den Bereich an Auftrags-pfu, der in Tabelle 219 aufgelistet ist, die Auftrags-pfu die Gewinnung beeinflussen. Je größer die Auftrags-pfu, umso größer der gesamte Anteil des Auftrags, der in der Elution gewonnen wird. Diese Wirkung erscheint, wenn Auftrags-pfu sich durch mehr als den Faktor von etwa 3 bis 4 unterscheiden. Diese Wirkung kann zu einem Überschätzen der Affinität von Display-Phagen für hNE-Kügelchen führen, wenn Daten von Phagen, die in höheren Titern aufgetragen wurden, mit der von Phagen verglichen werden, die in geringeren Titern aufgetragen wurden.
Unter Berücksichtigung dieser Vorbehalte können wir die Daten in Tabelle 219 interpretieren. Die Wirkungen der Mutationen, die in MA-BITI-E7-141-Display-Phagen eingeführt wurden („elterlich") auf die Bindung von Display-Phagen an hNE-Kügelchen kann in drei Kategorien gruppiert werden: die Austausche, die geringe oder keine messbaren Auswirkungen haben, die, die gemäßigte (2- bis 3-fache) Auswirkung haben und die, die große (> 5-fach) Auswirkungen haben.
Die Austausche MUTT26A und MUTQE scheinen eine geringe Auswirkung auf die Bindung von Display-Phagen an hNE-Kügelchen zu haben. Was die gesamten zurück gewonnenen pfu betrifft, so binden Diplay-Phagen, die diese Änderungen enthalten, an hNE-Kügelchen so gut wie die elterlichen. Tatsächlich sind die pH-Elutionsprofile, die für die elterlichen und die MUTT26A-Display-Phagen aus dem erweiterten pH-Elutionsprotokoll erhalten werden, nicht zu unterscheiden. Die Bindung des MUTQE-Display-Phagen scheint bezüglich des elterlichen gering reduziert zu sein und, angesichts der aufgetragenen pfu ist es wahrscheinlich, dass diese Bindung etwas überbewertet wird.
Die Sequenzveränderungen, die über die MUTP1 und MUT1619 Oligonukleotide eingefügt wurden, scheinen die Bindung von Display-Phagen an hNE-Kügelchen etwa 2- bis 3-fach zu reduzieren. Angesichts der Auftragstiter und der Verteilungen von zurück gewonnener pfu unter den verschiedenen Elutionsfraktionen ist es wahrscheinlich, dass 1) diese beiden Display-Phagen geringere Affinitäten für hNE-Kügelchen haben als es der MA-EpiNE7-Display-Phage tut und 2) die MUT1619-Display-Phagen eine größere Affinität für hNE-Kügelchen haben als es die MUTP1-Display-Phagen tun.
Die Sequenzänderungen am Aminoterminus von BITI-E7-141 scheinen die Bindung durch Display-Phagen an hNE-Kügelchen mindestens 10-fach zu reduzieren. Die AMINO2-Austausche reduzieren vermutlich die Display-Phagen-Bindung in einem beträchtlich höheren Ausmaß als es die AMINO1-Austausche tun.
Auf Grund der vorangehenden Interpretationen der Daten in Tabelle 219 können wir darauf schließen, dass:

1) Die Substitution von ALA für THR an der Position 26 in ITI-D1 und seinen Derivaten keine Wirkung auf die Interaktion des Inhibitors mit hNE hat. Daher kann die Möglichkeit einer Glykosylierung eines Inhibitor-Proteins am Asn₂₄, das in einer eukaryotischen Zellkultur hergestellt wird, ohne Verringerung der Affinität für hNE vermieden werden.
2) Der Anstieg an Affinität von Display-Phagen für hNE-Kügelchen aus den Austauschen E31Q und Q34V stammt primär aus der Substitution von Val bei 34.
3) Alle drei Austausche in der Amino-terminalen Region von ITI-D1 (Positionen 1, 2 und 4) beeinflussen die Bindung von Display-Phagen an hNE-Kügelchen in unterschiedlichen Ausmaßen. Die S4F-Veränderung scheint etwa dieselbe Wirkung zu haben wie E2P. Der Austausch an Position 1 scheint nur eine kleine Wirkung zu besitzen.
4) Die Austausche in der Region um den P1-Rest in BITI-E7-141 (Position 15) beeinflussen die Bindungen von Display-Phagen an hNE. Die Austausche A16G und P19S scheinen die Affinität des Inhibitors etwas zu reduzieren (vielleicht 3-fach). Die Substitution von I15V reduziert die Bindung weiter.

BITI-E7-141 unterscheidet sich von ITI-D1 an neun Positionen. Aus der vorangehenden Diskussion heraus scheint es wahrscheinlich, dass ein auf ITI-D1 basierender hNE-Inhibitor mit hoher Affinität konstruiert werden könnte, der sich von der ITI-D1-Sequenz nur an fünf oder sechs Positionen unterscheiden würde. Diese Unterschiede wären: Pro an Position 2, Phe an Position 4, Val an Position 15, Phe an Position 18, Val an Position 34 und Ala an Position 26. Wenn eine Glykosylierung von Asn₂₄ von keiner Bedeutung ist, könnte Thr an 26 beibehalten werden.
Zusammenfassung: geschätzte Affinitäten von isolierten ITI-D1-Derivaten für hNE
Auf Grund von Display-Phagenbindung an und Elution von hNE-Kügelchen ist es möglich, Affinitäten für hNE abzuschätzen, die verschiedene Derivate von ITI-D1 frei in Lösung zeigen könnten. Diese geschätzten Werte werden in Tabelle 55 zusammengefasst.
Von der ITI-Domäne 2 abgeleitete hNE-Inhibitoren
Die vorliegende Erfindung umfasst aus ITI-D2 abgeleitete hNE-Inhibitoren, wie in den Ansprüchen definiert. Diese Inhibitoren wurden in guter Ausbeute in Pichia pastoris hergestellt. EPI-HNE-4 inhibiert die menschliche neutrophile Elastase mit einem K_D ≈ 5 pM.
Reinigung und Eigenschaften von EPI-HNE-Proteinen
I. EPI-HNE Proteine
Beispiel 1: Aminosäuresequenzen von EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4
Tabelle 100 zeigt die Aminosäuresequenzen von vier Inhibitor-Proteinen der menschlichen neutrophilen Elastase (hNE): EPI-HNE-1 (Vergleichsbeispiel) (identisch zu EpiNE1), EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel), EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4. Diese Proteine stammen aus den gezeigten elterlichen Domänen vom Kunitz-Typ. Jedes dieser Proteine wird durch Alignment an die Elterndomäne angeordnet unter Verwendung der sechs Cysteinreste (schattiert) gezeigt, die für die Domäne vom Kunitz-Typ charakteristisch sind. Reste innerhalb der Inhibitor-Proteine, die sich von denen in den Elternproteinen unterscheiden, sind in Großbuchstaben. Es wurden ganze Proteine mit den Sequenzen EPI-HNE-1 (Vergleichsbeispiel), EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel), EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4 (Tabelle 100) hergestellt. Von größeren Proteinen, die eine der hNE-inhibierenden Sequenzen umfassen, wird erwartet, dass sie potente hNE-inhibitorische Aktivität besitzen; EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4 sind besonders bevorzugt. Es wird erwartet, dass Proteine, die einen bedeutenden Teil von einer der in Tabelle 100 gefundenen hNE-inhibierenden Sequenzen umfassen (besonders wenn die Sequenz beibehalten wird, die an oder vor dem ersten Cystein beginnt und bis zum letzten Cystein oder darüberhinaus weitergeht), potente hNE-inibitorische Aktivität zeigen werden.
Es werden die hNE-Inhibitoren EPI-HNE-1 und EPI-HNE-2 offenbart, die aus dem Rinderprotein BPTI (Aprotinin) abgeleitet sind. Innerhalb der Domäne vom Kunitz-Typ unterscheiden sich diese zwei Inhibitoren von BPTI an den gleichen acht Positionen: K15I, R17F, I18F, I19P, R39M, A40G, K41N und R42G. Zusätzlich unterscheidet sich EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) von sowohl BPTI als auch EPI-HNE-1 (Vergleichsbeispiel) durch die Gegenwart von vier zusätzlichen Resten (EAEA), die am Amino-Terminus vorhanden sind. Diese Reste wurden hinzugefügt, um die Sekretion des Proteins in Pichia pastoris zu erleichtern.
EPI-HNE-3 ist aus der zweiten Kunitz-Domäne der leichten Kette des menschlichen inter-α-Trypsin-Inhibitor-Proteins (ITI-D2) abgeleitet. Die Aminosäuresequenz von EPI-HNE-3 unterscheidet sich von der von ITI-D2(3–58) an nur vier Positionen: R15I, I18F, Q19P und L20R. EPI-HNE-4 unterscheidet sich von EPI-HNE-3 durch die Substitution A3E (der Amino-terminale Rest), was sowohl die Sekretion des Proteins in P. pastoris erleichtert, als auch den K_D für hNE verbessert. Tabelle 602 zeigt einige physikalische Eigenschaften der hNE-Inibitorproteine. Alle vier Proteine sind kleine, hoch affine (K_i = 2 bis 6 pM), schnell wirkende (k_on = 4 bis 11 × 10⁶ M^–1s^–1) Inhibitoren von hNE.
II. Herstellung der hNE-Inhibitoren EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel), EPI HNE-3 und EPI-HNE-4
Beispiel 2: Das Pichia pastoris - Herstellungssystetem
Es wurden transformierte Stämme von Pichia pastoris verwendet, um die verschiedenen EPI-HNE-Proteine, die von BPTI und ITI-D2 abgeleitet sind, zu exprimieren. Proteinexpressionskassetten werden in das Plasmid pHIL-D2 unter Verwendung der BstBI- und EcoRI-Schnittstellen (Tabelle 111) kloniert. Die DNA-Sequenz von pHIL-D2 wird in Tabelle 250 gezeigt. Das klonierte Gen ist unter der transkriptionellen Kontrolle des stromaufwärts gelegenen aox1-Gen-Promotors (bezeichnet als „aox1 5'") von P. pastoris und regulatorischen Sequenzen (dunkel schattierte Region) und stromabwärts gelegenen Polyadenylierungs- und Transkriptions-Terminations-Sequenzen (zweite gekreuzt schraffierte Region, bezeichnet „aox1 3'"). P. pastoris GS115 ist ein mutierter Stamm, der ein nicht-funktionsfähiges Histidinol-Dehydrogenase-Gen (his4) enthält. Das auf dem Plasmid pHIL-D2 enthaltene his4-Gen und seine Derivate können verwendet werden, um die Histidin-Defizienz im Wirtsstamm auszugleichen. Eine Linearisierung des Plasmids pHIL-D2 an der gezeigten SacI-Schnittstelle steuert den Einbau des Plasmids in das Wirtsgenom am aox1-Lokus durch homologe Rekombination während der Transformation. Stämme von P. pastoris, die eingebaute Kopien des Expressionsplasmids enthalten, werden Proteingene unter der Kontrolle des aox1-Promotors exprimieren, wenn der Promotor durch Wachstum in Gegenwart von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle aktiviert wird.
Wir haben dieses Pichia pastoris-Herstellungssystem hoher Dichte verwendet, um Proteine durch Sekretion in das Zell-KM herzustellen. Die Expressionsplasmide wurden hergestellt durch Ligieren von synthetischen DNA-Sequenzen, kodierend für das direkt an den Aminoterminus des gewünschten hNE-Inhibitors fusionierte S. cerevisiae-Mating-Faktor-α-PräPro-Peptid, in das Plasmid pHIL-D2 unter Verwendung der gezeigten BstBI und der EcoRI Schnittstellen. Tabelle 251 zeigt die DNA-Sequenz eines BstBI-bis-EcoRI-Inserts, das pHIL-D2 in pHIL-D2 (MFα-PräPro::EPI-HNE-3) umwandelt. In dieser Konstruktion wird das Fusionsprotein unter die Kontrolle des stromaufwärts gelegenen induzierbaren P. pastoris aox1-Genpromotors und die stromabwärts gelegenen aox1-Gentranskriptions-Terminations- und Polyadenylierungs-Sequenzen gestellt. Expressions-Plasmide wurden durch SacI-Verdau linearisiert, und die lineare DNA wurde durch homologe Rekombination in das Genom des P. pastoris-Stamms GS115 durch Sphäroplasten-Transformation eingebaut. Regenerierte Sphäroplasten wurden auf Wachstum in der Abwesenheit von zugefügtem Histidin selektiert, neu plattiert, und die individuellen Isolate wurden einem Screening auf Methanol-Verwendungs-Phenotyp (mut⁺), Sekretionsspiegel und Gendosis (abgeschätzt durch Southern Hybridisierungsexperimente) unterzogen. Stämme mit hohem Sekretionsspiegel wurden zur Herstellung von hNE-Inhibitoren ausgewählt: PEY-33 zur Herstellung von EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) und PEY-43 zur Herstellung von EPI-HNE-3. Wir schätzen, dass in beiden dieser Stämme vier Kopien des Expressionsplasmids in einer Tandemanordnung in den aox1-Gen-Lokus integriert sind.
Um die Veränderung des Kunitz-Domänen-kodierenden Abschnitts des von pHIL-D2 abgeleiteten Plasmids zu erleichtern, entfernten wir die zwei in Tabelle 111 gezeigten Restriktionsschnittstellen: die BstBI bei 4.780 und die AatIII-Schnittstelle bei 5.498. Damit wird der für die Kunitz-Domänen kodierende Abschnitt durch einzigartige AatII und EcoRI-Schnittstellen begrenzt. Die neuen Plasmide werden pD2pick („Insert") genannt, wobei „Insert" die Domäne definiert, die unter Kontrolle des aox1-Promotors kodiert ist. Tabelle 253 zeigt die DNA-Sequenz von pD2pick (MFα::EPI-HNE-3). Tabelle 254 zeigt eine Auflistung von Restriktionsschnittstellen in pD2pick (MFα::EPI-HNE-3).
EPI-HNE-4 wird durch pD2pick (MFaPräPro::EPI-HNE-4) kodiert, welches sich von pHIL-D2 darin unterscheidet, dass: 1) der AatII/EcoRI-Abschnitt, der in Tabelle 251 gezeigten Sequenz, durch den in Tabelle 252 gezeigten Abschnitt ersetzt wird und 2) die oben diskutierten Austausche in den Restriktionsschnittstellen gemacht wurden. Stamm-PEY-53 ist P. pastoris GS115, der mit pD2pick (MFα::EPI-HNE-4) transformiert wurde.
Beispiel 3: Proteinherstellung
Um die Proteine herzustellen, wurden P. pastoris-Stämme in „Mixed Feed"-Fermentationen ähnlich zur von Digan et al. (DIGA89) beschriebenen Verfahrensweise, wachsen gelassen. Obwohl andere die Herstellung von Kunitz-Domänen in P. pastoris beschrieben haben, ist es gut bekannt, dass viele Sekretionssysteme Proteasen einbeziehen. Daher zieht es nicht automatisch nach sich, dass veränderte Kunitz-Domänen mit einer hohen Potenz zur hNE-Inhibition von P. pastoris sekretiert werden kann, da der neue Inhibitor irgendein Schlüsselenzym im Sekretionsweg inhibieren könnte. Dennoch haben wir herausgefunden, dass P. pastoris hNE-Inhibitoren mit hohen Ausbeuten sekretieren können.
Kurz gesagt wurden die Kulturen zuerst im „Batch-Modus" mit Glycerin als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen. Nach dem Erschöpfen des Glycerins wurde die Kultur für etwa vier Stunden in Glycerin-limitiertem „Feed"-Modus wachsen gelassen, um die Zellmasse weiter zu erhöhen und den aox1-Promotor zu dereprimieren. In der letzten Herstellungsphase wurde die Kultur in Methanol-limitiertem „Feed"-Modus wachsen gelassen. Während dieser Phase ist der aox1-Promotor voll aktiv und das Protein wird in das KM sekretiert.
Tabelle 607 und Tabelle 608 zeigen die Kinetiken des Zellwachstums (geschätzt als A₆₀₀) und der Proteinsekretion (mg/l) für die Kulturen von PEY-33 und PEY-43, während der Methanol-limitierten „Feed"-Anteile der relevanten Fermentationen. Konzentrationen der Inhibitor-Proteine in den Fermentationskulturen wurden aus in vitro -Tests der hNE-Inhibition durch verdünnte Aliquots von zellfreien Kulturmedien, die zu den angezeigten Zeitpunkten erhalten wurden, bestimmt. Trotz Ähnlichkeiten in der Gendosis, den Fermentationsbedingungen, den Zelldichten und den Sekretionskinetiken, unterscheiden sich die Endkonzentrationen von Inhibitor-Proteinen, die durch die zwei Stämme sekretiert werden, um fast eine Größenordnung. Die Endkonzentration von EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) im PEY-33-Fermentations-KM war 720 mg/l. Die Endkonzentration von EPI-HNE-3 im PEY-43-Fermentations-KM war 85 mg/l. Die Unterschiede in den sekretierten Proteinendkonzentrationen können aus idiosynkratischen Unterschieden der Effizienzen, mit denen die Hefesynthese und Prozessierungssysteme mit den verschiedenen Proteinsequenzen interagieren, resultieren.
Der Stamm PEY-33 sekretiert EPI-HNE-2-Protein (Vergleichsbeispiel) als eine einzelne molekulare Spezies in das KM, von dem die Aminosäurezusammensetzung und N-terminale Sequenzierung zeigten, dass diese die korrekt prozessierte Kunitz-Domäne mit der in Tabelle 601 gezeigten Sequenz ist. Die molekulare Haupt-Spezies, die durch PEY-43-Kulturen hergestellt wurde, war das korrekt prozessierte EPI-HNE-3-Protein. Jedoch sekretiert dieser Stamm auch eine kleine Menge (etwa 15 % bis 20% des gesamten EPI-HNE-3's) an unkorrekt prozessiertem Material. Es zeigte sich, dass dieses Material eine Mischung aus Proteinen mit Amino-terminalen Verlängerungen (primär neun oder sieben Reste lang) ist, die aus der unkorrekten Spaltung des MF-α-PräPro-Leaderpeptids von der reifen Kunitz-Domäne herrührt. Das korrekt prozessierte Protein wurde im Wesentlichen frei von diesen Verunreinigungen gereinigt, wie unten beschrieben.
III. Reinigung der hNE-Inhibitoren EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) und EPI-HNE-3
Die Proteine können leicht aus Fermenter-KM durch biochemische Standardverfahren gereinigt werden. Die spezifische Verfahrensweise zur Reinigung ändert sich mit den spezifischen Eigenschaften jedes Proteins, wie unten beschrieben.
Vergleichsbeispiel 9: Reinigung von EPI-HNE-2
Tabelle 603 zeigt Einzelheiten zur Reinigung von EPI-HNE-2, Charge 1. Die PEY-33-Fermenterkultur wurde durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 Minuten geerntet, und das Zellpellet wurde verworfen. Die 3,3 Liter-Fraktion des Überstands wurde mikrofiltriert unter Verwendung des Minitan Ultrafiltration Systems (Millipore Corporation, Bedford, MA), das mit vier 0,2 μ Filtereinheiten ausgestattet war.
Das aus dem Mikrofiltrationsschritt erhaltene Filtrat wurde in zwei folgenden Ultrafiltrationsschritten verwendet. Zuerst wurden mit dem 0,2 μ-Mikrofiltrat zwei 30 K-Ultrafiltrationen durchgeführt unter Verwendung des Minitan-Apparates, ausgestattet mit acht 30,000 NMWL-Polysulfonfilterplatten (#PLTK0MP04, Millipore Corporation, Bedford, MA). Die Retentat-Lösung aus der ersten 30 K-Ultrafiltration wurde mit 10 mM NaCitrat, pH = 3,5, verdünnt und einer zweiten 30 K-Ultrafiltration unterworfen. Die zwei 30 K-Ultrafiltrate wurden kombiniert und ergaben ein Endvolumen von 5 Litern, die etwa 1,4 Gramm von EPI-HNE-2-Protein (geschätzt aus hNE-Inhibitionsmessungen) enthielten.
Das 30 K-Ultrafiltrat wurde mit einem Pufferwechsel im zweiten Ultrafiltrationsschritt konzentriert unter Verwendung des Minitan-Apparats, der mit acht 5.000 NMWL-Filterplatten (#PLCC0MP04, Millipore Corporation, Bedford, MA) ausgestattet war. Zu zwei Zeitpunkten während der 5 K-Ultrafiltration wurde die Retentat-Lösung mit 10 mM NaCitrat, pH = 3,5 von etwa 300 ml auf 1,5 Liter verdünnt. Das am Ende erhaltene 5 K-Ultrafiltrationsretentat (ca. 200 ml) wurde auf ein Endvolumen von 1.000 ml mit 10 mM NaCitrat, pH = 3,5 verdünnt.
EPI-HNE-2-Protein wurde aus der 5 K-Ultrafiltrationsretentatlösung durch Ammoniumsulfatfällung bei Raumtemperatur erhalten. 100 ml von 0,25 M Ammoniumacetat, pH = 3,2, (1/10 Volumen) wurden zum 5 K-Ultrafiltrationsretentat zugefügt, gefolgt von einem Endvolumen (1,1 Liter) von 3 M Ammoniumsulfat. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Material durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 45 Minuten pelletiert. Die überstehende Lösung wurde entfernt, das Pellet wurde in Wasser auf ein Endvolumen von 400 ml aufgelöst und die Ammoniumsulfatfällung wurde unter der Verwendung der oben beschriebenen Verhältnisse wiederholt. Das Pellet aus der zweiten Ammoniumsulfatfällung wurde in 50 mM Natriumazetat, pH = 3,5, auf ein Endvolumen von 300 ml aufgelöst.
Restliches Ammoniumsulfat wurde aus der EPI-HNE-2-Präparation durch Ionenaustauschchromatographie entfernt. Die Lösung aus dem Ammoniumsulfatfällungsschritt wurde auf eine starke Kationentauschersäule aufgetragen (50 ml Bettvolumen Makroprep 50 S) (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA), die zuvor mit 10 mM NaCitrat, pH = 3,5, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wurde die Säule mit 300 ml 10 mM NaCitrat, pH = 3,5 gewaschen. EPI-HNE-2 wurde dann im Batch-Verfahren von der Säule mit 300 ml von 50 mM NH₄OAc, pH = 6,2 eluiert. Die EPI-HNE-2-Aktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und die resultierende Lösung wurde lyophilisiert. Das getrocknete Proteinpulver wurde in 50 ml dH₂O aufgelöst und die Lösung wurde durch ein 0,2 μ-Filter (#4192, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) durchtreten gelassen. Die Konzentration des aktiven Inhibitors in der endgültigen Stammlösung wurde als 2 mM (13,5 mg/ml) bestimmt. Diese Stammlösung (EPI-HNE-2, Charge 1) wurde als 1 ml Aliquots bei 4 °C und –70 °C mehr als 11 Monate ohne Verlust an Aktivität gelagert.
Tabelle 603 fasst die Ausbeuten und die relative Reinheit von EPI-HNE-2 bei verschiedenen Schritten in der Verfahrensweise zur Reinigung zusammen. Die gesamte Ausbeute der Reinigungsverfahrensweise war etwa 30 %. Die Hauptquelle für Verluste war ein Zurückhalten von Material in den Retentatfraktionen der 0,2 μ-Mikrofiltrations- und 30 K-Ultrafiltrationsschritte.
Beispiel 4: Reinigung von EPI-HNE-3
Die Reinigung von EPI-HNE-3, Charge 1, wird in Tabelle 604 gezeigt. Die PEY-43-Fermenterkultur wurde durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 Minuten geerntet und das Zellpellet wurde verworfen. Die Lösung des Überstands (3.100 ml) wurde durch 0,2 μ Minitaneinheiten (4 Einheiten) mikrofiltriert. Nach der Konzentration wurde eine Diafiltration des Retentats durchgeführt, so dass das Endvolumen des Filtrats aus der 0,2 μ-Filtration 3.300 ml war.
Eine 30 K-Ultrafiltration wurde mit dem Filtrat des 0,2 μ-Mikrofiltrationsschritts durchgeführt. Sobald das Retentatvolumen auf 250 ml reduziert worden war, wurde eine Diafiltration des Retentats bei einem konstanten Retentatvolumen (250 ml) für 30 Minuten bei einer Geschwindigkeit von 10 ml/min durchgeführt. Das resultierende Endvolumen des Filtrats war 3.260 ml.
Es wurde gefunden, dass EPI-HNE-3-Protein und andere Komponenten des Mediums aus der Lösung ausfallen, wenn das Fermenter-KM konzentriert wurde. Aus diesem Grund wurde der 5 K-Ultrafiltrationsschritt nicht durchgeführt.
Korrekt prozessiertes EPI-HNE-3 wurde im Wesentlichen frei von fehl-prozessierten Formen und anderen Fermenterkulturkomponenten durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Eine starke Kationentauschersäule von 30 ml Bettvolumen (Makroprep 50S) wurde mit 10 mM NaCitrat pH = 3,5 äquilibriert. Das 30 K-Ultrafiltrationsfiltrat wurde auf die Säule aufgetragen und die Bindung von EPI-HNE-3 an die Säule wurde bestätigt, in dem der vollständige Verlust von Inhibitor-Aktivität im Säulendurchfluss gezeigt wurde. Die Säule wurde dann mit 300 ml von 10 mM NaCitrat, pH = 3,5, gewaschen.
Um EPI-HNE-3 von der Säule zu entfernen, eluierten wir es nacheinander mit 300 ml Volumina der folgenden Lösungen:
100 mM Ammoniumacetat, pH = 3,5
50 mM Ammoniumacetat, pH = 4,8
50 mM Ammoniumacetat, pH = 6,0
50 mM Ammoniumacetat, pH = 6,0, 0,1 M NaCl
50 mM Ammoniumacetat, pH = 6,0, 0,2 M NaCl
50 mM Ammoniumacetat, pH = 6,0, 0,3 M NaCl
50 mM Ammoniumacetat, pH = 6,0, 0,4 M NaCl
50 mM Tris/Cl pH = 8,0, 1,0 NaCl
Der Großteil des EPI-HNE-3 eluierte in zwei 50 mM Ammoniumacetat-, pH = 6,0 -Fraktionen. Die 0,1 M NaCl-Fraktion enthielt etwa 19 % der aufgetragenen EPI-HNE-3-Aktivität (28 mg von 159 mg Auftrag) und im Wesentlichen alle der fehl-prozessierten Formen von EPI-HNE-3. Die 0,2 M NaCl-Fraktion enthielt etwa 72 % (114 mg) des aufgetragenen EPI-HNE-3, und war fast vollständig frei von den fehl-prozessierten Formen mit höherem Molekulargewicht und anderen UV-absorbierenden Verunreinigungen. Die Fraktionen aus der 50 mM Ammoniumacetat-, pH = 6,0, 0,2 M NaCl -Elution mit den höchsten Konzentrationen an EPI-HNE-3 wurden vereinigt (95 mg).
Eine Ammoniumsulfatfällung wurde mit dem 0,2 M NaCl, pH = 6,0-Eluat von der Ionentauschersäule durchgeführt. 800 ml an 3 M Ammoniumsulfat wurden zu 160 ml an Eluatlösung zugefügt (Endkonzentration Ammoniumsulfat = 2,5 M) und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden inkubiert. Das gefällte Material wurde dann durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 45 Minuten pelletiert. Die Flüssigkeit des Überstands wurde verworfen und das pelletierte Material wurde in 100 ml Wasser gelöst.
Restliches Ammoniumsulfat wurde aus der EPI-HNE-3-Präparation durch Batch-Ionenaustauschchromatographie entfernt. Der pH der Proteinlösung wurde auf 3,0 mit verdünnter (1/10) HOAc eingestellt und die Lösung wurde dann auf eine Makroprep 50S-Säule von 10 ml Bettvolumen aufgetragen, die mit 10 mM NaCitrat, pH = 3,5 äquilibriert worden war. Nach dem Laden der Probe wurde die Säule mit 100 ml von 10 mM NaCitrat, pH = 3,5 gewaschen, gefolgt von 100 ml dH₂O. EPI-HNE-3 wurde von der Säule mit 100 ml von 50 mM NH₄CO₃, pH = 9,0 eluiert. pH9-Fraktionen mit den höchsten Konzentrationen an EPI-HNE-3 wurden vereinigt (60 mg) und bei 4 °C 7 Tage vor der Lyophilisierung gelagert.
Das lyophilisierte Proteinpulver wurde in 26 ml dH₂O gelöst und die Lösung wurde durch ein 0,2 μ-Filter (#4912, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) durchtreten gelassen. Es wurde gefunden, dass die Konzentration an aktivem Inhibitor in der endgültigen Stammlösung 250 μM (1,5 mg/ml) war. Diese Stammlösung (EPI-HNE-3, Charge 1) wurde als 1 ml Aliquots bei –70 °C für mehr als sechs Monate ohne Verlust an Aktivität gelagert. In wässriger Lösung gelagertes EPI-HNE-3 (ohne jegliche Pufferung) wurde bei einer Lagerung bei 4 °C abgebaut. Nach fünf Monaten war etwa 70 % des Materials mit einem K_i von etwa 12 pM aktiv.
Tabelle 604 zeigt die Ausbeute und relative Reinheit von EPI-HNE-3 bei verschiedenen Schritten in der Verfahrensweise der Reinigung. Ein Haupt-Reinigungsschritt trat bei der ersten Verfahrensweise der Ionenaustauschchromatographie auf. Der Ammoniumsulfatfällungsschritt lieferte nur einen kleinen Grad an weiterer Reinigung. Ein gewisser Verlust an Inhibitor-Aktivität trat bei Inkubation bei pH = 9 auf (siehe pH-Stabilitätsdaten). Die Herstellung und Reinigung von EPI-HNE1 und EPI-HNE-4 waren analog zu denen von EPI-HNE-2 und EPI-HNE-3.
Beispiel 5: Tricin-PAGE-Analyse von EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) und EPI-HNE-3
Das hoch auflösende Tricin-Gelsystem von Schagger und von Jagow (SCHA87) wurde benutzt, um die hergestellten gereinigten Proteine zu analysieren (siehe oben). Für eine gute Auflösung der EPI-HNE-Proteine von kleinem Molekulargewicht benutzten wir eine 16,5 % auflösende Schicht mit 10 % Trenn- und 4 % Sammelschichten. Nach einer Silberfärbung untersuchten wir ein Gel mit:

Bande 1: EPI-HNE-2 25 ng,
Bande 2: EPI-HNE-2 50 ng,
Bande 3: EPI-HNE-2 100 ng,
Bande 4: EPI-HNE-2 200 ng,
Bande 5: EPI-HNE-3 25 ng,
Bande 6: EPI-HNE-3 50 ng,
Bande 7: EPI-HNE-3 100 ng,
Bande 8: EPI-HNE-3 200 ng, und
Bande 9: Molekulargewichtsstandard: RPN 755, (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL).

Gefärbte, auf dem Gel sichtbare Proteine und ihre Molekulargewichte in Dalton sind: Ovalbumin (46.000), Carboanhydrase (30.000), Trypsin-Inhibitor (21.500) Lyoszym (14.300) und Aprotinin (6.500). Die Menge an aufgetragenem Protein wurde aus Messungen der hNE-Inhibition bestimmt. Wir fanden die folgenden Eigenschaften. EPI-HNE-2, Charge 1, zeigt eine einzige gefärbte Bande der erwarteten Größe (ca. 6.700 D) bei allen Auftragsproben. Ähnlich zeigt das EPI-HNE-3, Charge 1, Protein eine einzige gefärbte Bande der erwarteten Größe (ca. 6.200 D). Bei der größten Auftragsmenge können Spuren der unkorrekt prozessierten Form mit höherem Molekulargewicht (ca. 7.100 D) nachgewiesen werden. Auf der Grundlage von silbergefärbter hoch auflösender PAGE-Analyse, wird bestimmt, dass die Reinheit beider Proteinpräparationen signifikant größer als 95 % ist.
IV. Eigenschaften von EPI-HNE-2 (Vergleichsbeispiel) und EPI-HNE-3
A. Inhibition von hNE
Beispiel 6: Gemessene K_Ds von EPI-HNE-Proteinen für hNE
Inhibitionskonstanten für mit hNE reagierende Proteine (K_i) wurden bestimmt unter Verwendung von Raumtemperaturmessungen der Hydrolyse eines fluorogenen Substrats (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-7-Amino-4-Methylcumarin, Sigma M-9771) durch hNE. Für diese Messungen wurden Aliquots der geeignet verdünnten Inhibitor-Stammlösungen zu 2 ml Lösungen von 0,847 nM hNE in Reaktionspuffer (50 mM Tris-Cl, pH = 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 0,25 % Triton-X-100) in Fluoreszenz-Küvetten aus Kunststoff hinzugefügt. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde das fluorogene Substrat bei einer Konzentration von 25 μM zugefügt, und der Zeitverlauf für einen Anstieg an Fluoreszenz bei 470 nm (Anregung bei 380 nm) auf Grund von enzymatischer Substratspaltung unter Verwendung eines Spektrofluorometers (Perkin-Elmer 650–15) und Schreibers aufgezeichnet. Wir haben nicht für die Kompetition zwischen Substrat und Inhibitor korrigiert, weil (S₀/K_on) 0,07 ist (wobei So die Substratkonzentration und K_m die Bindungskonstante des Substrats für hNE ist). K_i hängt mit K_apparent zusammen durch K_i = K_apparent × (1/(1 + (S₀/K_m))). Die Korrektur ist klein verglichen mit den möglichen Fehlern in K_apparent. Die Geschwindigkeiten der enzymatischen Substratspaltung wurden aus den linearen Steigungen der gemessenen Anstiege an Fluoreszenz bestimmt. Die Prozent Restaktivität von hNE in Gegenwart des Inhibitors wurde berechnet als die Prozentzahl der Geschwindigkeit an Fluoreszenzanstieg, die in Gegenwart des Inhibitors beobachtet wurde, zu der, die beobachtet wurde, wenn kein zugefügter Inhibitor vorhanden war.
Wir haben Daten aufgenommen, die benutzt wurden, um K_i für die Reaktion von EPI-HNE-2 und EPI-HNE-3 mit hNE zu bestimmen. Die wie oben beschriebenen erhaltenen Daten werden als Prozent Restaktivität, aufgetragen als Funktion von zugegebenem Inhibitor, aufgenommen. Die Werte für K_i und für die aktive Inhibitor-Konzentration in der Stammlösung werden durch ein Programm zum Anpassen mit der Methode kleinster Fehlerquadrate („least square fit") erhalten. Aus den Daten wurden K_i-Werte für EPI-HNE-2 und für EPI-HNE-3, die mit hNE bei Raumtemperatur reagieren, als 4,8 pM beziehungsweise 6,2 pM berechnet. Die Bestimmungen des K_i für EPI-HNE-2 und EPI-HNE-3, das mit hNE reagiert, werden in Tabelle 610 und Tabelle 611 gezeigt.
Die kinetischen Assoziationskonstanten für mit hNE reagierende Inhibitoren (k_on) wurden aus Messungen der fortschreitenden Inhibition der hydrolytischen Substrataktivität durch hNE nach Zugabe von Inhibitor bestimmt. Für diese Experimente wurde eine bekannte Konzentration von Inhibitor zu einer Lösung von hNE zugefügt (0,847 nM) und Substrat (25 μM) in 2 ml Reaktionspuffer in einer Fluoreszenz-Küvette aus Kunststoff. Die Fluoreszenzänderung nach Zugabe des Inhibitors wurde kontinuierlich aufgenommen. In diesen Experimenten stieg die Fluoreszenz der Probe nicht linear mit der Zeit an. Stattdessen fiel der Anteil an Fluoreszenz stetig ab, was eine steigende Inhibition von hNE durch den zugegebenen Inhibitor wiederspiegelte. Die enzymatische Geschwindigkeit bei ausgewählten Zeitpunkten nach Zugabe des Inhibitors wurde aus der Steigung der Tangente an den Zeitverlauf der Fluoreszenz zu diesem Zeitpunkt bestimmt.
Die kinetische Konstante k_on für mit hNE reagierendes EPI-HNE-2 wurde wie folgt bestimmt. EPI-HNE-2 zu 1,3 nM wurde zu einem Puffer, enthaltend 0,867 nM hNE (I:E = 1,5:1) zum Zeitpunkt 0 hinzugefügt. Die gemessenen Prozent Restaktivät wurde als eine Funktion der Zeit nach Zugabe des Inhibitors aufgenommen. Ein Programm zur Anpassung mit der Methode kleinster Fehlerquadrate („least square fit") wurde benutzt, um den Wert von k_on = 4,0 × 10⁶ M^–1s^–1 zu erhalten.
Die kinetische Dissoziationskonstante k_off wird aus den gemessenen Werten von K_i und k_on berechnet als: k_off = K_D × k_on.
Die Werte solcher Messungen sind in Tabelle 602 eingeschlossen. Die EPI-HNE-Proteine sind kleine, hoch affine, schnell wirkende Inhibitoren von hNE.
B. Spezifität
Beispiel 7: Spezifität der EPI-HNE-Proteine
Wir versuchten, die Inhibitionskonstanten für mit einigen Serinproteasen reagierende EPI-HNE-Proteine zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 605 zusammengefasst. In allen Fällen außer bei Chymotrypsin konnten wir keine Inhibition beobachten, selbst wenn 10 bis 100 μM-Inhibitor zu Enzymen bei Konzentrationen im nM-Bereich zugefügt wurden. In Tabelle 605 basieren unsere berechneten Werte für K_i (für die Enzyme außer Chymotrypsin) auf der konservativen Annahme von weniger als 10 % Inhibition bei der höchsten getesteten Inhibitor-Konzentration. Für Chymotrypsin ist der K_i etwa 10 μM und ist vermutlich nicht spezifisch.
C. In Vitro Stabilität
Beispiel 8: Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativer Inaktivierung
Tabelle 620 zeigt Messungen der Empfänglichkeit von EPI-HNE-Proteinen für oxidative Inaktivierung, verglichen mit der von zwei anderen natürlichen Protein-hNE-Inhibitoren: α-1-Protease-Inhibitor (API) und sekretorischer-Leukozyten-Protease-Inhibitor (SLPI). API (10 μM), SLPI (8,5 μM), EPI-HNE-1 (5 μM), EPI-HNE-2 (10 μM), EPI-HNE-3 (10 μM) und EPI-HNE-4 (10 μM) wurden dem potenten Oxidationsmittel Chloramin-T ausgesetzt, in den gezeigten Oxidationsmittel:Inhibitor-Verhältnissen in 50 mM Phosphatpuffer, pH = 7,0 für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubationszeit wurden die Oxidationsreaktionen durch Zufügen von Methionin auf eine Endkonzentration von 4 mM abgefangen. Nach einer weiteren 10-minütigen Inkubation wurden die abgefangenen Reaktionen verdünnt und auf Inhibitor-Restaktivität mit unserem Standard-hNE-Inhibitions-Test getestet.
Sowohl API als auch SLPI werden durch niedrige molare Verhältnisse von Oxidationsmittel zu Inhibitor inaktiviert. Die molaren Verhältnisse an Chloramin-T:Protein, die für eine 50 %ige Inhibition von API und SLPI benötigt werden, sind etwa 1:1 beziehungsweise 2:1. Diese Verhältnisse stimmen gut mit dem berichteten Vorhandensein von zwei und vier leicht oxidierten Methioninresten in API beziehungsweise SLPI überein. Im Gegensatz dazu behalten alle vier EPI-HNE-Proteine im Wesentlichen eine vollständige hNE-Inhibitions-Aktivität nach einem Aussetzen gegenüber Chloramin-T bei allen getesteten molaren Verhältnissen (bis zu 50:1, in den Fällen von EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4). Weder EPI-HNE-3 noch EPI-HNE-4 enthalten irgendwelche Methioninreste. Im Gegensatz dazu enthalten EPI-HNE-1 und EPI-HNE-2 jeweils zwei Methioninreste (Siehe Tabelle 100). Die Widerstandsfähigkeit dieser Proteine gegenüber oxidativer Inaktivierung zeigt, dass die Methioninreste entweder dem Oxidationsmittel unzugänglich sind oder sich in einer Region des Proteins befinden, die nicht mit hNE interagiert.
Beispiel 9: pH-Stabilität
Tabelle 612 zeigt die Ergebnisse von Messungen der pH-Stabilität von EPI-HNE-Proteinen. Die Stabilität der Proteine gegenüber einem Aussetzen von pH-Bedingungen im Bereich von pH 1 bis pH 10 wurde getestet, indem die Inhibitoren in Puffer von definiertem pH bei 37 °C für 18 Stunden gehalten wurden und die hNE-inhibitorische Restaktivität im Standard-hNE-Inhibitions-Test bestimmt wurde. Die Proteine wurden bei einer Konzentration von 1 μM inkubiert. Die in Tabelle 14 gezeigten Puffer wurden wie beschrieben formuliert (STOL90) und in den gezeigten pH-Bereichen verwendet:
Beide BPTI abgeleiteten Inhibitoren, EPI-HNE-1 und EPI-HNE-2 sind bei allen getesteten pH-Werten stabil. EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4, die Inhibitoren, die von der menschlichen Proteindomäne vom Kunitz-Typ abgeleitetet sind, waren stabil, wenn sie bei niedrigem pH inkubiert wurden, aber zeigten einen gewissen Verlust an Aktivität bei hohem pH. Wenn sie bei 37 °C für 18 Stunden bei pH = 7,5 inkubiert wurden, verlor die EPI-HNE-3-Präparation 10 bis 15 % ihrer hNE-Inhibitions-Aktivität. EPI-HNE-4 behält fast die volle Aktivität bis pH 8,5 bei. Die Aktivität des von ITI-D2 abgeleiteten Inhibitors fiel bei höheren pH-Werten scharf ab, so dass bei pH 10 nur 30 % der ursprünglichen Aktivität blieben. Die Sensitivität von EPI-HNE-3 gegenüber einer Inkubation bei hohem pH erklärt vermutlich den Aktivitätsverlust des Proteins im letzten Reinigungsschritt, der vorher bemerkt wurde.
Beispiel 10: Temperaturstabilität
Die Stabilität von EPI-HNE-Proteinen gegenüber Temperaturen im Bereich von 0 °C bis 95 °C wurde durch Inkubieren der Inhibitoren für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen und Bestimmen der inhibitorischen Restaktivität für hNE getestet. In diesen Experimenten waren die Proteinkonzentrationen 1 μM in Phosphatpuffer bei pH = 7. Wie in Tabelle 630 gezeigt wird, sind die vier Inhibitoren recht temperaturstabil.
EPI-HNE-1 und EPI-HNE-2 behalten die volle Aktivität bei allen Temperaturen unter etwa 90 °C bei. EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4 behalten volle inhibitorische Aktivität bei, wenn sie bei Temperaturen unter 65 °C inkubiert werden. Die Aktivität des Proteins fällt bei höheren Temperaturen etwas ab. Jedoch behalten alle drei Proteine mehr als ≈ 50 % Aktivität bei, selbst wenn sie bei 95 °C für 30 Minuten inkubiert werden.
Vergleichsbeispiel 10: Wege zu anderen hNE-inhibitorischen Sequenzen
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass sehr hoch affine hNE-Inhibitoren aus Kunitz-Domänen von menschlichem Ursprung mit sehr wenigen Aminosäuresubstitutionen entwickelt werden können. Es wird angenommen, dass fast jede Kunitz-Domäne mit acht oder weniger Substitutionen zu einem potenten und spezifischen hNE-Inhibitor gemacht werden kann. Insbesondere könnte jede der bekannten menschlichen Kunitz-Domänen umgebaut werden, um einen hoch stabilen, hoch potenten und hoch selektiven hNE-Inhibitor zu liefern. Es gibt mindestens drei Wege zu hNE-inhibitorischen Kunitz-Domänen: 1) Ersetzen der Abschnitte, von denen bekannt ist, dass sie in ein Spezifischmachen der hNE-Bindung einbezogen sind, 2) Ersetzen von einzelnen Resten, die als wichtig für die hNE-Bindung gehalten werden, und 3) Verwendung von Bibliotheken von Kunitz-Domänen, um hNE-Inhibitoren auszuwählen.
Vergleichsbeispiel 11: Substitution von Abschnitten in Kunitz-Domänen
Tabelle 100 zeigt die Aminosäuresequenzen von 11 menschlichen Kunitz-Domänen. Diese Sequenzen wurden in 10 Abschnitte aufgeteilt: 1:N-Terminus-Rest 4; 2:Rest 5; 3:6–9 (oder 9a); 4:10–13; 5:14; 6:15–21; 7:22–30, 8:31–36; 8:37–38; 9:39–42; und 10:43-C-Terminus (oder 42a-C-Terminus).
Abschnitte 1, 3, 5, 7 und 9 enthalten Reste, die die Bindungseigenschaften von Kunitz-Domänen stark beeinflussen und sind in der Konsensus-Kunitz-Domäne von Tabelle 100 doppelt unterstrichen. Außer Abschnitt 1 besitzen alle Abschnitte dieselbe Länge, außer der TFPI-2-Domäne 2, die einen zusätzlichen Rest in Abschnitt 2 und zwei zusätzliche Reste in Abschnitt 10 trägt.
Abschnitt 1 befindet sich am Aminoterminus und beeinflusst die Bindung, indem er die Stabilität und Dynamik des Proteins beeinträchtigt. Abschnitte 3, 5, 7 und 9 enthalten Reste, die mit Serinproteasen in Kontakt treten, wenn eine Kunitz-Domäne an das aktive Zentrum bindet. Eine hNE-Inhibition von hoher Affinität benötigt ein Molekül, das hoch komplementär zu hNE ist. Abschnitte 3, 5, 7 und 9 liefern die Aminosäuren, die mit der Protease in Kontakt treten. Die Sequenzen in Abschnitten 1, 3, 5, 7 und 9 müssen in dem Zusammenhang, der von ihnen gegenseitig und den anderen Abschnitten bereitgestellt wird, zusammenarbeiten. Dennoch haben wir gezeigt, dass sehr viele verschiedene Sequenzen die Fähigkeit zur hNE-Inhibition mit hoher Affinität besitzen.
Es kann wünschenswert sein, einen hNE-Inhibitor zu haben, der einem menschlichen Protein sehr ähnlich ist, um die Möglichkeit einer Immunogenität zu reduzieren. Kanditaten für hNE-Inhibitor-Proteinsequenzen mit hoher Affinität können erhalten werden, indem eine Kunitz-Domäne vom Aprotinin-Typ genommen wird, die stark oder sehr stark hNE inhibiert und einer, zwei, drei, vier oder alle der Abschnitte 2, 4, 6, 8 und 10 mit den entsprechenden Abschnitten einer menschlichen Kunitz-Domäne, wie die in Tabelle 100 aufgelisteten, oder mit anderen Domänen, von denen man weiss, dass sie relativ geringe Immunogenität in Menschen haben, ersetzt werden. (Jeder der Abschnitte 2, 4, 6, 8 und 10 kann aus derselben menschlichen Domäne genommen werden, oder sie können von verschiedenen menschlichen Domänen genommen werden.)
Alternativ kann eine reduzierte Immunogenität, stark hNE-inhibierende Domäne erhalten werden, in dem eine der menschlichen Kunitz-Domänen vom Aprotinin-Typ genommen wird und eine, zwei, drei oder alle der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 (und bevorzugter Weise auch Abschnitt 1) durch die entsprechenden Abschnitte von einer oder mehreren Aprotinin-artigen Kunitz-Domänen, die stark oder sehr stark hNE inhibieren, ersetzt werden. Beim Herstellen dieser humanisierten hNE-Inhibitoren kann man natürlich anstelle eines Abschnitts, der zu einem der vorher genannten Ursprungsproteine identisch ist, einen Abschnitt benutzen, der sich vom nativen Ursprungsabschnitt durch eine oder mehrere konservative Modifikationen unterscheidet. Solche Unterschiede sollten natürlich unter der nötigen Berücksichtigung ihrer möglichen Wirkung auf inhibitorische Aktivität und/oder Immunogenität gemacht werden. In machen Fällen kann es vorteilhaft sein, dass der Abschnitt ein Hybrid entsprechender Abschnitte von zwei oder mehr menschlichen Domänen (im Falle der Abschnitte 2, 4, 6, 8 und 10) oder von zwei oder mehr starken oder sehr starken hNE-Inhibitor-Domänen (im Falle der Abschnitte 3, 5, 7 und 9) ist. Abschnitt 1 kann dem Abschnitt 1 eines starken oder sehr starken hNE-Inhibitors, oder dem Abschnitt 1 einer menschlichen Aprotinin-artigen Kunitz-Domäne entsprechen, oder eine Chimäre der Abschnitte 1 von beiden sein.
Die Proteine DPI.I.1.1, DPI.2.1, DPI.3.1, DPI.4.1, DPI.5.1, DPI.6.3, DPI.7.1, DPI.8.1 und DPI.9.1 wurden auf diese Art entworfen. DPI.1.1 ist aus App-I durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Abschnitten von EPI-HNE-1 abgeleitet. DPI.2.1 ist aus TFPI2-D1 durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Resten aus EPI-HNE-1 abgeleitet. DPI.3.1 ist aus TFPI2-D2 durch Ersetzen der Reste 9a–21 mit den Resten 10–21 von EPI-HNE-4 und Ersetzen der Reste 31–42b mit den Resten 31–42 von EPI-HNE-4 abgeleitet. DPI.4.1 ist aus TFPI2-D3 durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Resten von MUTQE abgeleitet. DPI.5.1 ist aus LACI-D1 durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Resten aus MUTQE abgeleitet. DPI.6.1 ist aus LACI-D2 durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Resten von MUTQE abgeleitet. DPI.7.1 ist aus LACI-D3 durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 9 mit den entsprechenden Resten von EPI-HNE-4 abgeleitet. DPI.8.1 ist aus der Kunitz-Domäne von A3-Kollagen durch Substitution der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 von EPI-HNE-4 abgeleitet. DPI.9.1 ist aus der HKI-B9-Domäne durch Ersetzen der Abschnitte 3, 5, 7 und 9 mit den entsprechenden Resten von EPI-HNE-4 abgeleitet.
Während die oben beschriebenen Chimären bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, ist die Erfindung nicht auf diese Chimären beschränkt.
Vergleichsbeispiel 12: Punktsubstitutionen in Kunitz-Domänen
In diesem Beispiel werden bestimmte Substitutionsmutationen diskutiert.
Alle in diesem Beispiel erwähnten Proteinsequenzen sind in Tabelle 100 zu finden. Entworfene Protease-Inhibitoren werden als „DPI" (designed protease inhibitors) bezeichnet und sind aus menschlichen Kunitz-Domänen (auch in Tabelle 100 aufgelistet) abgeleitet. Jede dieser als DPI.i.2 (für i = 1–9) bezeichneten Sequenzen ist aus der Domäne zwei über ihr in der Tabelle durch das Einfügen minimaler Punktmutationen abgeleitet. Jede der als DPI.i.3 bezeichneten Sequenzen (für i = 1 bis 9) ist aus der Sequenz drei über ihr durch extensivere Mutationen, die Affinität erhöhen sollen, abgeleitet. Für einige Elterndomänen sind zusätzliche Beispiele gegeben. Die als DPI.i.1 bezeichneten Sequenzen werden in Beispiel 11 diskutiert.
Die wichtigsten Positionen sind 18 und 15. Jede Kunitz-Domäne wird wahrscheinlich ein guter hNE-Inhibitor, wenn Val oder Ile an 15 sind (wobei Ile bevorzugt ist) und Phe an 18 ist. (Jedoch werden diese Merkmale nicht notwendigerweise für solche Aktivität benötigt.)
Wenn eine Kunitz-Domäne Phe bei 18 und entweder Ile oder Val bei 15 besitzt und kein guter hNE-Inhibitor ist, dann können einer oder mehrere Reste in der Kontaktfläche sein, die eine ordentliche Bindung verhindern.
Die hierin offenbarten Kunitz-Domänen mit sehr hoher Affinität für hNE (wie in Tabelle 100 aufgelistet) haben keine geladenen Gruppen bei den Resten 10, 12–19, 21 und 32–42. An Position 11 wurden nur neutrale und positiv geladene Gruppen in hNE-Inhibitoren mit sehr hoher Affinität beobachtet. An Position 31 wurden nur neutrale und negativ geladene Gruppen in hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität beobachtet. Wenn eine Eltern-Kunitz-Domäne eine geladene Gruppe bei einer dieser Positionen besitzt, wo nur neutrale Gruppen beobachtet wurden, dann wird jede dieser geladenen Gruppen bevorzugter Weise in eine ungeladene Gruppe, ausgesucht aus den Möglichkeiten in Tabelle 790, umgewandelt, als der nächste Schritt, um die Bindung an hNE zu verbessern. Ähnlich werden negativ geladene Gruppen bei 11 und 19 und positiv geladene Gruppen bei 31 bevorzugter Weise durch Gruppen, ausgesucht aus Tabelle 790, ersetzt.
An der Position 10 werden Tyr, Ser und Val in hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität beobachtet. Asn oder Ala können erlaubt sein, da diese Position mit hNE vermutlich nicht in Kontakt tritt. An der Position 11 wurden Thr, Ala und Arg in hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität beobachtet. Gln und Pro sind sehr häufig an 11 in Kunitz-Domänen und können akzeptierbar sein. Position 12 ist fast immer Gly. Wenn 12 nicht Gly ist, versuche man es zu Gly zu ändern.
Alle der hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität, die bisher hergestellt wurden, haben Pro₁₃, aber es wurde nicht gezeigt, dass dies nötig ist. Viele (62,5 %) der Kunitz-Domänen haben Pro₁₃. Wenn 13 nicht Pro ist, dann kann ein Austausch zu Pro die hNE-Affinität verbessern. Val, Ala, Leu oder Ile können hier auch akzeptierbar sein.
Position 14 ist Cys. Es ist möglich, zu Kunitz-Domänen sehr ähnliche Domänen herzustellen, in denen das 14-38-Disulfid ausgelassen ist. Solche Domänen sind wahrscheinlich weniger stabil als echte Kunitz-Domänen mit den drei Standard-Disulfiden.
Position 15 ist bevorzugter Weise Ile oder Val. Ile ist weiter bevorzugt.
Die meisten Kunitz-Domänen (82 %) haben entweder Gly oder Ala an 16 und dies mag ziemlich wichtig sein. Wenn Rest 16 nicht Gly oder Ala ist, sollte man 16 entweder zu Gly oder Ala austauschen; Ala ist bevorzugt. Position 17 hat in sehr potenten hNE-Inhibitoren entweder Phe oder Met; die, die Ile oder Leu an 17 haben, sind weniger potent. Phe ist bevorzugt. Met sollte nur verwendet werden, wenn eine Widerstandsfähigkeit gegenüber Oxidation nicht wichtig ist. Position 18 ist Phe.
Es wurde gezeigt, dass die hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität entweder Pro oder Ser an Position 19 haben können. Gln oder Lys an Position 19 können erlaubt sein. An Position 21 wurden Tyr und Trp in hNE-Inhibitoren mit sehr hoher Affinität beobachtet; Phe könnte auch funktionieren.
An Position 31 wurden Gln, Glu und Val in hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität beobachtet. Da diese am Rand der Bindungskontaktfläche liegt, funktionieren andere Typen wahrscheinlich gut. Man sollte basische Typen vermeiden (Arg und Lys). An Position 32 wurden Thr und Leu in hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität beobachtet. Dieser Rest kann vielleicht keinen direkten Kontakt machen und andere ungeladenen Typen könnten gut funktionieren. Pro ist hier sehr häufig. Ser wurde beobachtet und ist ähnlich zu Thr. Ala wurde in natürlichen Kunitz-Domänen beobachtet und wird wahrscheinlich keinen Konflikt hervorrufen. Position 33 ist in Kunitz-Domänen immer Phe.
Es scheint, dass viele Aminosäuretypen an Position 34 gesetzt werden können, wobei eine hohe Affinität für hNE beibehalten wird; große hydrophobe Reste (Phe, Trp, Tyr) sind ungünstig. Val und Pro sind an 34 am meisten bevorzugt. Positionen 35–38 enthalten die Sequenz Tyr-Gly-Gly-Cys. Es gibt in natürlichen Kunitz-Domänen nur geringe Diversität an Position 36. Im BPTI-Trypsin-Komplex reduziert ein Austausch von Gly₃₆ zu Ser stark die Bindung an Trypsin. Trotzdem können S36 oder T36 nicht mit der Bindung an hNE interferieren und könnten sie sogar verbessern. Wenn Rest 36 nicht Gly ist, sollte man in Betracht ziehen, ihn zu Gly auszutauschen.
Position 39 scheint eine Vielzahl von Typen zu tolerieren. Met und Gln sind dafür bekannt, in Inhibitoren mit sehr hoher Affinität zu funktionieren. Entweder Ala oder Gly sind an Position 40 akzeptabel; Gly ist bevorzugt. An Position 41 ist Asn bei Weitem der häufigste Typ in natürlichen Kunitz-Domänen und könnte wirken, die Domänen zu stabilisieren. An Position 42 ist Gly bevorzugt, aber Ala ist erlaubt.
Schließlich können die Positionen, die in Kunitz-Domänen stark konserviert sind, wenn nötig zum konservierten Typ umgewandelt werden. Zum Beispiel können die Mutationen X36G, X37G, X41N und X12G in den Fällen wünschenswert sein, die diese Aminosäuren noch nicht an diesen Positionen haben.
Die vorangehenden Mutationen werden in Tabelle 711 zusammengefasst. Tabelle 711 enthält zum Beispiel Mutationen der Form X15I, was einen Austausch des Rests an Position 15 (was auch immer er ist) zu Ile bedeutet, oder ihn zu lassen, wenn er schon Ile ist. Eine Kunitz-Domäne, die die Mutationen X18F und entweder X15I oder X15V enthält (X15I bevorzugt), wird eine starke Affinität für hNE besitzen. Sobald von einer bis zu etwa 8 der in Tabelle 711 gefundenen Mutationen ausgeführt wird, wird die Affinität des Proteins für hNE ansteigen, so dass sich der K_i dem Bereich 1–5 pM annähert.
Die Sequenz DPI.1.2 wurde aus der Sequenz von App-I durch die Austausche R15I, I18F und F34V konstruiert und sollte ein potenter hNE-Inhibitor sein. DPI.1.3 ist wahrscheinlich ein potenterer Inhibitor, mit den Austauschen R15I, M17F (um Sensitivität gegenüber Oxidation zu vermeiden), I18F, P32T, F34V und G39M.
DPI.2.1 ist aus der Sequenz von TFPI2-D1 durch die Austausche R15I, L18F und L34V abgeleitet und sollte ein potenter hNE-Inhibitor sein. DPI.2.3 könnte noch potenter sein, auf Grund der Austausche Y11T, R15I, L17F, L18F, R31Q, Q32T, L34V und E39M.
DPI.3.2 ist aus TFPI2-D2 durch die Austausche E15I, T18F, S26A (um Glykosylierung zu verhindern), K32T und F34V abgeleitet und sollte ein potenter hNE-Inhibitor sein. DPI.3.3 könnte noch potenter sein durch die Austausche Δ9a, D11A, D12G, Q13P, E15I, S17F, T18F, E19K, K20R, N24A (um Glykosylierung zu verhindern), K32T, F34V und Δ42a–42b.
DPI.4.2 ist aus TFPI2-D3 durch die Austausche S15I, N17F und V18F abgeleitet und sollte ein potenter Inhibitor von hNE sein. DPI.4.3 könnte noch potenter sein durch die Austausche E11T, L13P, S15I, N17F, V18F, A32T, T34V und T36G.
DPI.5.2 ist aus LACI-D1 durch die Austausche K15I und M18F abgeleitet und ist wahrscheinlich ein potenter Inhibitor von hNE. DPI.5.3 könnte noch potenter sein auf Grund der Austausche D10Y, D11T, K15I, I17F, M18F und E32T. Andere Austausche, die DPI.5.3 verbessern können, schließen F21W, I34V, E39M und Q42G ein.
Die Sequenz von DPI.6.2 wurde aus der Sequenz von menschlichem LACI-D2 durch die Mutationen R15V und I18F konstruiert. Der Rest der Sequenz von LACI-D2 scheint mit hNE-Bindung kompatibel zu sein. DPI.6.3 trägt zwei weitere Mutationen, die es ähnlicher den hier offenbarten hNE-Inhibitoren machen: Y17F und K34V. Andere Veränderungen, die wahrscheinlich die hNE-Bindung von LACI-D2 verbessern, schließen ein I13P, R32T und D10S. DPI.6.4 ist aus DPI.6.3 durch die zusätzliche Veränderung N25A abgeleitet, die eine Glykosylierung verhindern wird, wenn das Protein in einer eukaryotischen Zelle hergestellt wird. Andere Substitutionen, die eine Glykosylierung verhindern würden, schließen ein: N25K, T27A, T27E, N25S und N25S. DPI.6.5 bewegt sich weiter auf ITI-D1-, ITI-D2- und BPTI-Derivate zu, von denen bekannt ist, dass sie eine Affinität für hNE im 1–5 pM-Bereich durch die Mutationen I13P, R15V, Y17F, I18F, T19Q, N25A, K34V und L39Q besitzen. In DPI.6.6 wurden die T19Q- und N25A-Mutationen zurückgewandelt. Daher würde das Protein in Hefe oder anderen eukaryotischen Zellen am N₂₅ glykosyliert werden. DPI.6.7 trägt die Veränderungen I13P, R15I, Y17F, I18F, T19P, K34V und L39Q.
DPI.7.2 ist aus der menschlichen LACI-Domäne 3 durch die Mutationen R15V und E18F abgeleitet. DPI.7.3 trägt die Mutationen R15V, N17F, E18F und T46K. Die T46K-Mutation sollte eine Glykosylierung am N₄₄ verhindern. DPI.7.4 trägt mehr Mutationen, so dass es viel ähnlicher zu den bekannten hNE-Inhibitoren mit hoher Affinität ist. Die Mutationen sind D10V, L13P, R15V, N17F, E18F, K34V, S36G und T46K. DPI.7.5 trägt einen unterschiedlichen Satz an Veränderungen: L13P, R15I, N17F, E18F, N19P, F21W, R31Q, P32T, K34V, S36G und T46K; DPI.7.5 sollte nicht in eukaryotischen Zellen glykosyliert werden.
DPI.8.2 ist aus der Sequenz der Kunitz-Domäne des A3-Kollagens durch die Austausche R15I, D16A, I18F und W34V abgeleitet und wird für einen potenten hNE-Inhibitor gehalten. DPI.8.3 ist aus der Kunitz-Domäne des A3-Kollagens durch die Austausche T13P, R15I, D16A, I18F, K20R und W34V abgeleitet.
DPI 9.2 ist aus der HKI-B9-Kunitz-Domäne durch die Austausche Q15I, T16A und M18F abgeleitet und wird für einen potenten hNE-Inhibitor gehalten. DPI.9.3 könnte noch potenter sein auf Grund der Austausche Q15I, T16A, M18F, T19P, E31V und A34V.
Vergleichsbeispiel 13: Bibliotheken von Kunitz-Domänen
Andere Kunitz-Domänen, die potent hNE inhibieren, können aus menschlichen Kunitz-Domänen erhalten werden, entweder durch Substituieren von hNE-inhibierenden Sequenzen in menschliche Domänen oder durch Verwenden der Verfahren von US 5,223,409 und verwandten Patenten. Tabelle 720 zeigt ein Gen, das die Präsentation von menschlicher LACI-D2 auf M13 gIIIp hervorrufen wird; im Wesentlichen dasselbe Gen könnte benutzt werden, um eine Präsentation auf M13 gVIIIp oder anderen Ankerproteinen (wie bakteriellen äußeren Oberflächenproteinen (OSPs)) zu erreichen. Tabelle 725 zeigt, dass ein Gen die Präsentation von menschlichem LACI-D1 hervorruft.
Tabelle 730 und Tabelle 735 zeigen Variegationen von LACI-D1 beziehungsweise LACI-D2. Jede von diesen ist aufgeteilt in eine Variegation der Reste 10–21 in einem Abschnitt und Reste 31–42 in einem anderen. In jedem Fall wird die geeignete vgDNA in einen Vektor eingeführt, der das Elternprotein präsentiert, und die Bibliothek an Display-Phagen wird durch Bindung an immobilisiertes hNE fraktioniert.
TABELLEN
Tabelle 30: IIIsp::bpti::reifesIII (Ausgangsfragment) Fusionsgen.
Die DNA-Sequenz hat SEQ ID Nr. 001; die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 002. Die DNA ist linear und wird in den Zeilen gezeigt, die nicht mit einem „!" beginnen. Die DNA, die für reifes III kodiert, ist identisch zur DNA die in M13mp18 gefunden wird. Die Aminosäuresequenz wird in vivo prozessiert, und Disulfidbrücken formen sich.
Tabelle 35: IIIsp::itiD1::reifesIII Fusionsgen.
Die DNA hat SEQ ID Nr. 003; die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 004.
Die DNA ist ein linearer Abschnitt, und die Aminosäuresequenz ist ein Protein, das in vivo prozessiert wird, und das Disulfide enthält.
Tabelle 55: Affinitätsklassen von aus ITI-D1-abgeleiteten hNE-Inhibitoren
Tabelle 65: Definition von Klasse A-, B- und C-Mutationen in PCT/US92/01501.
Klassen:

A Kein bedeutender Effekt erwartet, wenn die molekulare Ladung im Bereich von –1 bis +1 bleibt
B Keine bedeutenden Effekte erwartet, aber wahrscheinlicher als in „A".
C Rest in der Bindungs-Grenzfläche; jeder Austausch muss getestet werden.
X Keine Substitution erlaubt.

Die in Tabelle 100 aufgelisteten Sequenzen, die stark hNE inhibieren, sind EPI-HNE-1 (=EpiNE1), EPI-HNE-2, EpiNE7, EpiNE3, EpiNE6, EpiNE4, EpiNE8, EpiNE8, EpiNE2, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE, MUT1619, ITI-D1E7, AMINO1, AMINO2, MUTP1 und EPI-HNE-3 und EPI-HNE-4. Die in Tabelle 100 aufgelisteten Sequenzen, die eine hohe Wahrscheinlichkeit besitzen, hNE stark zu inhibieren sind DPI.1.1, DPI.1.2, DPI.1.3, DPI.2.1, DPI.2.2, DPI.2.3, DPI.3.1, DPI.3.2, DPI.3.3, DPI.4.1, DPI.4.2, DPI.4.3, DPI.5.1, DPI.5.2, DPI.5.3, DPI.6.1, DPI.6.2, DPI.6.3, DPI.6.4, DPI.6.5, DPI.6.6, DPI.6.7, DPI.7.1, DPI.7.2, DPI.7.3, DPI.7.4, DPI.7.5, DPI.8.1, DPI.8.2, DPI.8.3, DPI.9.1, DPI.9.2 und DPI.9.3. In Tabelle 100 aufgelistete menschliche Kunitz-Domänen: ITI-D1, ITI-D2, App-I, TFPI2-D1, TFPI2-D2, TFPI2-D3, LACI-D1, LACI-D2, LACI-D3, A3 Kollagen Kunitz-Domäne und HKI B9-Domäne.
Tabelle 111: Restriktionsschnittstellen im Plasmid pHIL-D2

pHIL-D2, 93-01-02
Ngene = 8157

Nicht-Schneider
Schneider

Aoxl 5'	1 bis etwa 950
Aoxl 3'	950 bis etwa 1250
His4	1700 bis etwa 4200
Aoxl 3'	4500 bis 5400
bla	5600 bis 6400
fl ori	6500 bis 6900

Tabelle 212: Fraktionierung von EpiNe-7 und MA-ITI-D1 Phagen auf hNE-Kügelchen
SUMME bedeutet die gesamten pfu (oder der Anteil des Auftrags), die von allen pH-Elutionsfraktionen erhalten werden.
Tabelle 214: Verkürzte Fraktionierung von Display-Phagen auf hNE-Kügelchen
Jeder Eintrag ist der Anteil des Auftrags, der in dieser Komponente erhalten wird.
SUMME bedeutet der gesamte Anteil von Auftrags-pfu, der von allen pH-Elutionsfraktionen erhalten werden.
Tabelle 215: Fraktionierung von EpiNE-7 und MA-ITI-D1E7-Phagen auf hNE-Kügelchen
SUMME bedeutet die gesamten pfu (oder der Anteil des Auftrags), die von allen pH-Elutionsfraktionen erhalten werden.
Tabelle 217: Fraktionierung von MA-BITI-E7 und MA-BITI-E7-1222 auf hNE-Kügelchen
SUMME bedeutet die gesamten pfu (oder Anteil des Auftrags), die von allen pH-Elutionsfraktionen erhalten werden.
Tabelle 218: Fraktionierung von MA-EpiNE7 und MA-BITI-E7-141 auf hNE-Kügelchen
SUMME bedeutet die gesamte pfu (oder der Anteil des Auftrags), die von allen pH-Elutionsfraktionen erhalten werden.
Tabelle 219: pH-Elutionsanalyse der hNE-Bindung durch die BITI-E7-141-Varianten Display-Phagen
Anmerkung:

EE

Erweitertes pH-Elutionsprotokoll

AE

Abgekürztes pH-Elutionsprotokoll

Total

Gesamter Anteil des Auftrags = Summe der Fraktionen, die bei pH 7,0, pH 3,5 und pH 2,0 gesammelt wurden.

Relativ

Gesamter Anteil des gewonnen Auftrags, geteilt durch den Gesamtanteil des Auftrags, der für BITI-E7-141 gewonnen wurde

Tabelle 250: Plasmid pHIL-D2 SEQ ID Nr. 070
8157 Basenpaare. Nur ein Strang wird gezeigt, aber die DNA existiert in vivo als doppelsträngige, zirkuläre DNA.
Tabelle 250, fortgesetzt
Tabelle 250, fortgesetzt
Tabelle 250, fortgesetzt
Tabelle 250, fortgesetzt
Tabelle 251: pHIL-D2 (MFαPräPro::EPI-HNE-3) 8584 b.p.
Die DNA hat SEQ ID Nr. 071; das kodierte Polypeptid hat SEQ ID Nr. 072. Die DNA ist zirkulär und doppelsträngig, nur ein Strang wird gezeigt. Die Translation des Proteins, das exprimiert werden soll, wird gezeigt.
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 251, fortgesetzt
Nicht-Schneider
Schneider, 3 oder weniger Schnittstellen
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 251, fortgesetzt
Tabelle 252: BstBI-AatII-EcoRI – Kassette zur Expression von EPI-HNE-4
Die DNA hat SEQ ID Nr. 073; die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 074
Die DNA ist ein lineares Fragment, das in vivo doppelsträngig ist, nur ein Strang wird gezeigt. Die Aminosäuresequenz ist die eines Disulfid-enthaltenden Proteins, das in vivo prozessiert wird.
Tabelle 253: pD2pick (MFαPräPro::EPI-HNE-3) 8590 by ZIRKULÄRE dsDNA, ein Strang gezeigt. pD2pick (MFαPräPro::EPI-HNE-3)
Die DNA hat SEQ ID Nr. 075. Das kodierte Polypeptid hat SEQ ID Nr. 076.
Tabelle 253, fortgesetzt
Tabelle 253, fortgesetzt
Tabelle 253, fortgesetzt
Tabelle 253, fortgesetzt
Tabelle 253, fortgesetzt
Tabelle 254: Restriktionskarte von pD2pick (MFαPräPro::EPI-HNE-3)
Nicht-Schneider
Schneider, 3 oder weniger Schnittstellen
Tabelle 400: Aminosäuresequenz der leichten Kette von ITI (SEQ ID Nr. 077)
ITI-D1 umfasst die Reste 22 bis 76 und gegebenenfalls einen von Rest 77, Reste 77 und 78 oder Reste 77 bis 79.
ITI-D2 umfasst die Reste 80 bis 135 und gegebenenfalls einen von Rest 79 oder Reste 78 bis 79.
Die Striche unter den Sequenzen stellen die Disulfide dar.
Tabelle 602: Physikalische Eigenschaften von hNE-Inhibitoren, die aus Kunitz-Domänen abgeleitet sind
Die oben gezeigten Konstanten K_D und k_on wurden mit [hNE] = 8,47 × 10^–10 molar gemessen; k_off wurde aus k_off = K_D × k_on berechnet.
Tabelle 603: ZUSAMMENFASSUNG DER REINIGUNG VON EPI-HNE-2
Tabelle 604: ZUSAMMENFASSUNG DER REINIGUNG VON EPI-HNE-3
Tabelle 605: K_i-Werte von EPI-HNE-Proteinen für verschiedene menschliche Serum-Serienproteasen
Tabelle 607: PEY-33, das EPI-HNE-2 produziert
Kulturwachstum im Fermenter und Proteinsekretion von EPI-HNE durch P. pastoris-Stämme PEY-33. Der Zeitverlauf wird für Fermenterkulturen nach Initiation der Wachstumsphase bei Methanol-limitiertem „Feed" gezeigt. Der Anstieg an Zellmasse wird durch A₆₀₀ geschätzt. Die Konzentration an Inhibitor-Protein im Fermenterkulturmedium wurde aus Messungen der hNE-Inhibition durch verdünnte Aliquots von zellfreiem KM bestimmt, die bei den gezeigten Zeitpunkten erhalten wurden und bei –20 °C bis zum Versuch gelagert wurden.
Tabelle 608: PEY-43, das EPI-HNE-3 produziert
Kulturwachstum im Fermenter und Proteinsekretion von EPI-HNE durch P. pastoris-Stämme PEY-43. Der Zeitverlauf wird für Fermenterkulturen nach Initiation der Wachstumsphase bei Methanol-limitiertem „Feed" gezeigt. Der Anstieg an Zellmasse wird durch A₆₀₀ geschätzt. Die Konzentration an Inhibitor-Protein im Fermenterkulturmedium wurde aus Versuchen der hNE-Inhibition durch verdünnte Aliquots von zellfreiem KM bestimmt, die bei den gezeigten Zeitpunkten erhalten wurden und bei –20 °C bis zum Versuch gelagert wurden.
Tabelle 610: Inhibitorische Eigenschaften von EPI-HNE-2
Tabelle 611: Inhibitorische Eigenschaften von EPI-HNE-3
Tabelle 612: pH-Stabilität von Kunitz-Domänen hNE-Inhibitoren
Die Proteine wurden bei 37 °C für 18 Stunden in Puffer mit definiertem pH inkubiert (siehe Text). In allen Fällen waren die Proteinkonzentrationen 1 μM. Am Ende der Inkubationszeit wurden Aliquots der Reaktionen verdünnt und die Restaktivität von hNE-Inhibition bestimmt.
Tabelle 620: Stabilität von hNE-inhibitorischen Proteinen gegenüber Oxidation durch Chloramin-T.
Die Inhibitoren wurden in Gegenwart von Chloramin-T in den gezeigten molaren Verhältnissen für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Oxidationsreaktionen wurden durch Zugabe von Methionin bis zu einer Endkonzentration von 4 mM abgefangen. Restaktivität der hNE-Inhibition, die in den abgefangenen Reaktionen zurück blieb, wird als Prozentzahl der Aktivität gezeigt, die ohne zugefügtes Oxidationsmittel beobachtet wurde. Proteine und Konzentrationen in den Oxidationsreaktionen sind: EPI-HNE-1, (5 μM); EPI-HNE-2, (10 μM); EPI-HNE-3, (10 μM); EPI-HNE-4, (10 μM); API, (10 μM) und SLPI, (8,5 μM).
Tabelle 630: Temperaturstabilität von EPI-HNE-Proteinen
Die Proteine wurden bei der angegebenen Temperatur für 18 Stunden in einem Puffer bei pH 7,0 inkubiert. In allen Fällen waren die Proteinkonzentrationen 1 μM. Am Ende der Inkubationszeit wurden Aliquots der Reaktionen verdünnt und die Restaktivität von hNE-Inhibition bestimmt.
Tabelle 711: Mutationen, die wahrscheinlich die Affinität einer Kunitz-Domäne für hNE verbessern.
Am meisten bevorzugt

X18F;
[X15I (bevorzugt), X15V];

Stark bevorzugt

[X16A (bevorzugt), X16G];
[X17F (bevorzugt), X17M, X17L, X17I, X17L];
[{X19P, X19S} (gleichermaßen bevorzugt), X19K, X19Q];
X37G;
X12G

Bevorzugt

X13P;
X20R;
X21Y; X21W;
[X34V (bevorzugt), X34P];
[X39Q, X39M];
[X32T, X32L];
[X31Q, X31E, X31V];
[X11T, X11A, X11R];
[X10Y, X10S, X10V];
[X40G, X40A];
X36G;

Tabelle 720: M13_III_Signal::Menschliche_LACI-D2::reife_M13_III DNA hat SEQ ID Nr. 078, die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 079. Die DNA ist linear und ist in vivo doppelsträngig.
Die Aminosäuresequenz ist die eines Proteins, das in vivo durch Spaltung nach Ala_–1 prozessiert wird; das gesamte Gen kodiert für eine Aminosäuresequenz, die weitergeht, um ein funktionelles M13-III-Protein zu ergeben.
Ala₁₀₁ ist der erste Rest des reifen M13 III.
Tabelle 725: Synthetisches laci-d1 mit Restriktionsschnittstellen zum Klonieren in einen Display-Vektor.
Die DNA hat SEQ ID Nr. 080, die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 081
Ala₁₀₁ ist der erste Rest des reifen M13 III.
Tabelle 730: LACI-D1 hNE-Bibliothek
DNA hat SEQ ID Nr. 082, Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 083
Variegation bei 10, 11, 13, 15, 16, 17, 19 und 20 lässt die 253 400 Aminosäuresequenzen und die 589 824 DNA-Sequenzen entstehen. Variegation bei 31, 32, 34, 39, 40 und 42 ergibt 23 328 Aminosäure- und DNA-Sequenzen. Es gibt etwa 5,9 × 10⁹ Proteinsequenzen und 1,4 × 10¹⁰ DNA-Sequenzen.
Ala₁₀₁ wäre der erste Rest des reifen M13 III.
Tabelle 735: LACI-D2 hNE-Bibliothek
DNA hat SEQ ID Nr. 084; die Aminosäuresequenz hat SEQ ID Nr. 085
6,37 × 10¹⁰ Aminosäuresequenzen; 1,238 × 10¹¹ DNA-Sequenzen
ZITIERTE LITERATUR

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Claims

Protein, umfassend eine Kunitz-Domäne, wobei die Polypeptidsequenz des Kunitz-Domänenteils des Proteins die Polypeptidsequenz von SEQ ID Nr. 26 (EPI-HNE-3) oder SEQ ID Nr. 27 (EPI-HNE-4) ist.
Protein nach Anspruch 1 mit der Polypeptidsequenz SEQ ID Nr. 26 (EPI-HNE-3) oder SEQ ID Nr. 27 (EPI-HNE-4).
Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polypeptidsequenz die Polypeptidsequenz von SEQ ID Nr. 27 (EPI-HNE-4) ist.
Protein nach Ansprüchen 1 bis 3 in gereinigter Form.
DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das Protein nach Anspruch 1 kodiert.
Expressionsvektor, enthaltend eine kodierende DNA-Sequenz, die für das Protein nach Anspruch 1 kodiert, wobei die kodierende Sequenz funktionell mit regulatorischen DNA-Sequenzen verbunden ist, wodurch die kodierende Sequenz exprimiert werden kann, um das Protein in einem geeigneten Wirt zu erzeugen.
Transformierte Zelle, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die Zelle das Protein unter Bedingungen erzeugt, die die Expression der kodierenden Sequenz unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen ermöglichen.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Inhibitorwirkung gegen menschliche neutrophile Elastase, das das Kultivieren der transformierten Zelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die die Expression der kodierenden Sequenz ermöglichen, umfasst, wodurch das Protein durch die Zelle erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Zelle eine Pichia pastoris Zelle ist.
Protein nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4 in einer pharmazeutisch geeigneten Form.
Pharmazeutische Zubereitung, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Protein nach Anspruch 10 oder pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 11 zur Verwendung in der Medizin.