ES2255066T3 - Dominios kunitz obtenidos de seres humanos modificados por ingenieria genetica que inhiben la elastasa de neutrofilos humana. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS PROTEINAS QUE INHIBEN LA ELASTASA DE LOS NEUTROFILOS HUMANOS (HNE). UNA GRAN FRACCION DE LA SECUENCIA DE CADA UNA DE ESTAS PROTEINAS ES IDENTICA A UNA PROTEINA HUMANA QUE PRESENTA UNA ESCASA O NULA ACTIVIDAD INHIBIDORA RESPECTO A HNE.

Description

Dominios Kunitz obtenidos de seres humanos modificados por ingeniería genética que inhiben la elastasa de neutrófilos humana.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevas proteínas que inhiben la elastasa de neutrófilos humana (hNE). Una gran parte de la secuencia de cada una de estas proteínas es idéntica a una proteína humana conocida que tiene muy poca o ninguna actividad inhibidora con respecto a hNE.

Exposición de la descripción de la información 1. hNE, sus inhibidores naturales, y patologías

La elastasa de neutrófilos humana (hNE, también conocida como Elastasa de Leucocitos Humana (hLE); EC 3.4.21.11) es una proteasa de 29 Kd con una amplio espectro de actividad frente a componentes de la matriz extracelular (CAMP82, CAMP88, MCWH89). La enzima es una de las principales proteasas neutras de los gránulos azurófilos de leucocitos polimorfonucleados y está implicada en la eliminación de patógenos y en la restructuración de tejido conectivo (TRAV88). En casos de reducción hereditaria del inhibidor de \alpha-1-proteasa en circulación (API, conocido anteriormente como \alpha1 antitripsina), el principal inhibidor fisiológico sistémico de hNE (HEED86), o la inactivación de API por oxidación ("enfisema del fumador"), puede provocarse una destrucción amplia del tejido pulmonar debido a la actividad elastolítica no controlada de hNE (CANT89).Varios trastornos respiratorios humanos, incluyendo fibrosis quística y enfisema, están caracterizados por una carga de neutrófilos aumentada en la superficie epitelial de los pulmones (SNID91, MCEL91, GOLD86) y la liberación de hNE por neutrófilos está implicada en el progreso de estos trastornos (MCEL91, WEIS89). Un estudio preliminar de la administración por aerosol de API a pacientes con fibrosis quística indica que dicho tratamiento puede ser eficaz tanto en la prevención del daño de tejido respiratorio como en el aumento de defensas antimicrobianas del hospedador (MCEL91).

API presenta algunos problemas prácticos para su uso rutinario a gran escala como agente anti-elastolítico pulmonar. Estos incluyen el tamaño relativamente grande de la molécula (394 restos, 51 kDalton), la ausencia de puentes disulfuro de estabilización intramolecular, y modificaciones post-traduccionales específicas de la proteína por glicosilación en tres sitios. Quizá es de incluso mayor importancia la sensibilidad de API a la oxidación, tal como los liberados por neutrófilos activados. Por lo tanto, sería de gran valor terapéutico un pequeño inhibidor de hNE altamente eficaz no tóxico y estable.

2. Dominio ITI 1 y dominio ITI 2 como dominios de unión a proteínas iniciales (IPBD)

Muchas especies de mamíferos tienen una proteína en su plasma que puede identificarse, por homología de secuencia y similitud de propiedades físicas y químicas, como inhibidor de inter-\alpha-tripsina (ITI), un inhibidor de proteasa en circulación grande (M_{r} aprox. 240.000) (para revisiones recientes véase ODOM90, SALI90, GEBH90, GEBH86). La secuencia de ITI humano se muestra en la Tabla 400. El inhibidor intacto es una glicoproteína y actualmente se cree que consta de tres subunidades glicosiladas que interaccionan a través de una unión glicosaminoglicano fuerte (ODOM90, SALI90, ENGH89, SELL87). La actividad anti-tripsina de ITI está localizada en la subunidad más pequeña (cadena ligera ITI, M_{r} aprox.15.000 no glicosilada) que es idéntica en secuencia de aminoácidos a un inhibidor estable a ácidos encontrado en la orina (UTI) y suero (SIT) (GEBH86, GEBH90). La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de ITI se muestra en la Tabla 400. La cadena ligera madura consta de una secuencia N-terminal de 21 restos, glicosilada en la Ser_{10,} seguida por dos dominios tipo Kunitz en tándem, el primero de los cuales está glicosilado en Asn_{45} (ODOM90). En la proteína humana, el segundo dominio tipo Kunitz ha demostrado inhibir la tripsina, quimiotripsina, y plasmina (ALBR83a, ALBR83b, SELL87, SWAI88). El primer dominio carece de estas actividades pero se ha informado de que inhibe la elastasa de leucocitos (\approx 1 \muM > K_{i}> \approx 1 nM) (ALBR83a,b, ODOM90). El ADNc que codifica la cadena ligera de ITI también codifica la \alpha-1-microglobulina (TRAB86, LAUM86, DIAR90); las proteínas se separan después de la traducción por proteolisis.

Los dos dominios Kunitz de la cadena ligera de ITI (ITI-D1 e ITI-D2) tienen varias características que los hacen útiles como Dominios de Unión Potencial Iniciales (IPBD). ITI-D1 comprende al menos los restos 26 a 76 de la secuencia de UTI mostrada en la Figura 1 del GEBH86. El dominio Kunitz podría entenderse como el que comprende los restos desde el resto 22 al resto 79. Los restos 22 al 79 constituyen un dominio de 58 aminoácidos que tienen la misma longitud que el inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) y que tiene las cisteínas alineadas. ITI-D2 comprende al menos los restos 82 a 132; podían incluirse los restos 78 y 135 para proporcionar dominios más cercanos a la longitud clásica de 58 aminoácidos. Como el espacio entre la última cisteína de ITI-D1 (resto 76 de la cadena ligera de ITI) y la primera cisteína de ITI-D2 (resto 82 de la cadena ligera de ITI) tiene sólo 5 restos, pueden asignarse 58 aminoácidos a cada dominio sin ningún solapamiento. Salvo que se indique de otra manera en este documento, se ha tomado el segundo dominio que comienza en el resto 78 de la cadena ligera de ITI. Cada uno de los dominios es altamente homólogo tanto a BPTI como a la serie de proteínas EpiNE descritas en la patente de Estados Unidos 5.223.409. Aunque no están disponibles las estructuras por rayos x de los dominios ITI-D1 e ITI-D2 aislados, estudios cristalográficos del dominio tipo Kunitz relacionado aislado del precursor de la proteína \beta amiloide del Alzheimer (AA\betaP) demuestran que este polipéptido adquiere una estructura 3D casi idéntica a la de BPTI (HYNE90).

La estructura tridimensional de la \alpha-dendrotoxina del veneno de la mamba verde se ha determinado (SKAR92) y la estructura es altamente similar a la de BPTI. El autor estado indica, ``Aunque el plegamiento de la cadena principal de \alpha-DTX es similar al del inhibidor de tripsina pancreática bovina homólogo (BPTI), hay diferencias significativas que implican segmentos de la cadena polipeptídica cercanos al "sitio anti-proteasa" de BPTI. Una comparación de la estructura de \alpha-DTX con los modelos existentes de BPTI y sus complejos con tripsina y calicreína revela las diferencias estructurales que implican la incapacidad de \alpha-DTX de inhibir la tripsina y quimiotripsina.

La estructura del veneno K de la mamba negra se ha determinado por espectroscopía por RMN y tiene una estructura 3D que es altamente similar a la de BPTI a pesar de las diferencias de secuencia de 32 aminoácidos entre los restos 5 y 55 (la primera y última cisteína) (BERN93). ``La estructura en solución de la Toxina K es muy similar a la estructura en solución del inhibidor de tripsina pancreática básico (BPTI) y la estructura cristalina por rayos-X de la \alpha-dendrotoxina de Dendroaspis angusticeps (\alpha-DTX), con valores r.m.s.d. de 1,31 \ring{A} y 0,92 \ring{A}, respectivamente, para los átomos centrales de los restos 2 a 56. Algunas diferencias estructurales locales entre la Toxina K y BPTI están directamente relacionadas al hecho de que las interacciones intermoleculares con dos de las cuatro moléculas internas del agua de hidratación en BPTI están remplazadas por enlaces de hidrógeno intramoleculares en la Toxina K''. Por tanto, es probable que la estructura 3D en solución del dominio ITI-D1 aislado o del dominio ITI-D2 aislado sean altamente similares a las estructuras de BPTI, AA\betaP, y veneno K de la mamba negra. En este caso, las ventajas descritas previamente para el uso de BPTI como un IPBD se aplican a ITI-D1 y a ITI-D2. ITI-D1 e ITI-D2 proporcionan ventajas adicionales como un IPBD para el desarrollo de actividad inhibidora anti-elastasa específica. Primero, se ha informado de que el dominio ITI-D1 inhibe tanto elastasa de leucocitos (ALBR83a,b. ODOM91) como Catepsina-G (SWAI88, ODOM90); actividades de las que carece BPTI. Segundo, ITI-D1 carece de afinidad por las serin proteasas relacionadas tripsina, quimiotripsina, y plasmina (ALBR83a.b, SWAI88), una ventaja para el desarrollo de especificidad en la inhibición. ITI-D2 tiene la ventaja de no estar glicosilado. Adicionalmente ITI-D1 e ITI-D2 son polipéptidos obtenidos de seres humanos de modo que se prevé que sus derivados muestren antigenicidad mínima en aplicaciones clínicas.

3. Secreción de proteínas heterólogas por Pichia pastoris

Se han producido varias proteínas en la levadura Pichia pastoris. Por ejemplo, Vedvick et al. (VEDV91) y Wagner et al. (WAGN92) produjeron aprotonina a partir de un promotor de la alcohol oxidasa con la inducción por metanol como una proteína secretada en el medio del cultivo (CM) a = 1 mg/ml. Gregg et al. (GREG93) ha analizado la producción de varias proteínas en P. pastoris. La Tabla 1 de GREG93 muestra proteínas que se han producido en P. pastoris y los rendimientos.

4. Producción Recombinante de Dominios Kunitz

Se ha producido aprotonina mediante tecnología de ADN recombinante (AUER87, AUER88, AUER89, BRIN90, BRIN91, ALTM91).

5. Métodos de Construcción

Salvo que se indique de otra manera, las construcciones genéticas y otras manipulaciones se realizan por métodos convencionales, tales como los encontrados en referencias estándar (por ejemplo, AUSU87 y SAMB89).

No se reconoce que ninguna referencia citada sea técnica anterior o técnica anterior pertinente, y la fechas dadas son las que aparecen en la referencia y pueden no ser idénticas a la fecha de publicación real. Las descripciones de los contenidos de cualquier referencia citada se basan en nuestra actual lectura de la misma, y nos reservamos el derecho de revisar la descripción si descubrimos un error, y de comprobar que la descripción refleja de manera precisa el trabajo real presentado. Nos reservamos el derecho de comprobar la interpretación de los trabajos citados, particularmente a la luz de nuevas evidencias o evidencias contradictorias.

Sumario de la invención

La presente invención describe una serie de pequeños inhibidores proteicos potentes de elastasa de neutrófilos humana (hNE) como se define en las reivindicaciones. Un grupo de inhibidores se obtiene de un dominio inhibidor tipo Kunitz encontrado en una proteína de origen humano, concretamente, la cadena ligera del inhibidor de inter-\alpha-tripsina humana (ITI) que contiene dominios denominados ITI-D1 e ITI-D2. La presente invención describe variantes de ITI-D2 como se define en las reivindicaciones que tienen afinidad muy alta por hNE. La presente invención comprende modificaciones de la secuencia de ITI-D2 como se define en las reivindicaciones que facilitan su producción en la levadura Pichia pastoris y que son inhibidores altamente potentes de hNE. La invención también se refiere a métodos de producción.

La invención se presenta como una serie de ejemplos que describen el diseño, producción, y ensayo de inhibidores reales y ejemplos adicionales que describen como podrían descubrirse otros inhibidores. La invención se refiere a proteínas definidas en al reivindicaciones que inhiben la elastasa de neutrófilos humana (hNE) con alta afinidad.

Nomenclatura y abreviaturas

Término	Significado
x::y	Fusión del gen x al gen y en pauta de lectura.
X::Y	Proteína de fusión expresada a partir del gen de fusión x::y.
\muM	Micromolar, 10^{-6} molar.
nM	Nanomolar, 10^{-9} molar.
pM	Picomolar, 10^{-12} molar.
Códigos de aminoácidos de una letra:
A: Ala	C: Cys	D: Asp	E: Glu
F: Phe	G: Gly	H: His	I: IIe
K: Lys	L: Leu	M: Met	N: Asn
P: Pro	Q: Gln	R: Arg	S: Ser
T: Thr	V: Val	W: Trp	Y: Tyr

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Una secuencia proteica puede llamarse un "dominio Kunitz tipo aprotonina" si contiene una secuencia que cuando se alinea para minimizar las faltas de coincidencia, puede alinearse con cuatro o menos faltas de coincidencia, con el patrón:

Cys-(Xaa)_{6-}Gly-Xaa-Cys-(Xaa)_{8}-[Tyr |Phe]-(Xaa)_{6}-Cys-(Xaa)_{2}-Phe-Xaa-[Tyr| TrP | Phe]-Xaa-Gly-Cys-(Xaa)_{4}-[Asn | Gly]-Xaa-[Phe| Tyr]-(Xaa)_{5}-Cys-(Xaa)_{3}-Cys, donde los aminoácidos entre corchetes separados por un símbolo |
son aminoácidos alternativos para una única posición.

Por ejemplo, [Tyr|Phe] indica que en esa posición el aminoácido puede ser Tyr o Phe. El símbolo Xaa indica que en esa posición puede usarse cualquier aminoácido. Para el ensayo anterior, una inserción o deleción cuenta como una falta de coincidencia.

En la aprotonina, las cisteínas se enumeran 5, 14, 30, 38, 51 y 55 y están unidas por disulfuros 5-a-55, 14-a-38, y 30-a-51. El resto 15 se llama resto P1 (SCHE67); los restos hacia el extremo amino terminal se llaman P2 (resto 14), P3 (resto 13), etc. El resto 16 se llama P1', 17 es P2', 18 es P3', etc.

Hay muchos homólogos de aprotonina, que difieren de ella en una o mas posiciones pero mantienen la estructura fundamental definida anteriormente. Para una lista dada de homólogos, es posible poner en una tabla la frecuencia de existencia de cada aminoácido en cada posición ambigua. (La secuencia que tiene el aminoácido mas dominante en cada posición ambigua se enumera como "Dominio Kunitz Consenso" en la Tabla 100).

Un "Dominio Kunitz tipo aprotonina humana" es un dominio Kunitz tipo aprotonina que se encuentra en la naturaleza en una proteína humana. Los dominios Kunitz tipo aprotonina humana incluye, aunque sin limitación, ITI-D1, ITI-D2, App-I, TFPI2-D1, TFPI2-D2, TFPI2-D3, LACI-D1, LACI-D2, LACI-D3, colágeno A3, y el dominio HKI B9. En esta lista, D1, D2, etc., indican el primer, segundo, etc. dominio de la proteína multidominio indicada.

Unión "Débil", "Moderada", "Fuerte", y "Muy Fuerte" a e inhibición de hNE se definen de acuerdo con la Tabla 55. Preferiblemente, las proteínas de la presente invención tiene una Ki de menos de 1000 pM (es decir, son inhibidores "fuertes"), más preferiblemente de menos de 50 pM, mucho más preferiblemente de menos de 10 pM (es decir, son inhibidores "muy fuertes").

Para propósitos de la presente invención, puede dividirse un dominio Kunitz tipo aprotonina en diez segmentos, en base a la secuencia consenso y la posición del sitio catalítico. Usando el esquema de numeración de aminoácidos de la aprotonina, estos segmentos con los siguientes (véase Tabla 100):

1: 1-4 (restos antes de la primera Cys)

2: 5-9 (primera Cys y restos posteriores antes de P6)

3: 10-13 (P6 a P3)

4: 14 (segunda Cys; P2)

5: 15-21 (P1, y P1' a P6')

6: 22-30 (después de P6 y hasta e incluyendo la tercera Cys)

7: 31-36 (después de la tercera Cys y hasta Gly-Cys consenso)

8: 37-38 (Gly-Cys consenso)

9: 39-42 (restos de después de Gly-Cys y antes de [Asn|Gly] consenso)

10: 43-55 (hasta la última Cys) (también incluye los restos después de la última Cys, si los hay).

Se apreciará que en esos dominios Kunitz tipo aprotonina que difieren de la aprotonina en una o más inserciones o deleciones de aminoácidos, o que tienen una cantidad diferente de aminoácidos antes de la primera cisteína o después de la última cisteína, la posición real de los aminoácidos puede diferir de la dada anteriormente. El propósito del solicitante es que estos dominios se enumeren como si correspondieran a la secuencia de aprotonina alineada, por ejemplo, la primera cisteína del dominio se enumera aminoácido 5, para el propósito de identificación de segmentos. Obsérvese que el segmento 1, aunque es una parte de la aprotonina, no es una parte de la definición formal de un dominio Kunitz tipo aprotonina; y por lo tanto no es necesario que las proteínas de la presente invención incluyan una secuencia correspondiente al segmento 1. De manera similar, parte del segmento 10 (después de la última Cys) no es una parte necesaria del dominio.

Un "inhibidor humanizado" es uno en el que al menos uno de los segmentos 3, 5, 7 y 9 difieren en al menos una modificación no conservativa a partir del dominio Kunitz tipo aprotonina humana más similar (en base a las identidades de aminoácidos), al menos uno de lo segmentos 2, 6, y 10 (considerado hasta la última Cys) es idéntico, o difiere sólo en modificaciones conservativas, a partir de dicho dominio Kunitz tipo aprotonina humana más similar, y que no es idéntico a ningún dominio Kunitz tipo aprotonina no humana de origen natural. (Obsérvese que el segmento 1 se ignora al hacer esta determinación ya que está fuera de la secuencia usada para definir un dominio, y que los segmentos 4 y 8 se ignoran porque son necesarios para la definición de un dominio Kunitz tipo aprotonina.)

Las proteínas de la presente invención son inhibidores de hNE fuertes o muy fuertes preferiblemente humanizados como se definen en las reivindicaciones. Debe observarse que los dominios Kunitz tipo aprotonina humana identificados por lo tanto de este modo son simplemente inhibidores débiles de hNE.

Un dominio Kunitz tipo aprotonina es "sustancialmente homólogo" a un dominio de referencia si, sobre la región crítica (restos 5-55 de aprotonina) expuesta anteriormente, es al menos un 50% idéntica en secuencia de aminoácidos a la secuencia correspondiente de o en el dominio de referencia, y todas las divergencias toman la forma de modificaciones conservativas y/o semiconservativas.

Las proteínas de la presente invención incluyen aquellas que comprenden un dominio Kunitz que son las proteínas de referencia EPI-HNE-3, o EPI-HNE-4, como se definen en la tabla 100.

Se describen dominios de unión a hNE de proteínas, que son al menos un 80% idénticas, más preferiblemente, al menos un 90% idénticas, en secuencia de aminoácidos a la secuencia de referencia correspondiente. Se describen proteínas en las que la cantidad de faltas de coincidencia es cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco. Se describen proteínas en las que los dominios de unión a hNE divergen del dominio de referencia únicamente en una o más modificaciones conservativas.

"Modificaciones conservativas" se define como:

a) sustituciones conservativas de aminoácidos como se define a continuación, y

b) inserciones o deleciones únicas o múltiples de aminoácidos en los extremos, en los enlaces interdominio, en los bucles o en otros segmentos de movilidad relativamente alta (como se indica, por ejemplo, por factores de alta temperatura o ausencia de resolución en difracción de rayos X, difracción de neutrones, o RMN). Preferiblemente, excepto en los extremos, no se insertan o delecionan más de aproximadamente cinco aminoácidos en un locus particular, y las modificaciones están fuera de las regiones que se sabe que contienen sitios de unión importantes para la actividad.

"Substituciones conservativas" se define en este documento como intercambios en los siguientes cinco grupos:

I. Restos no polares o ligeramente polares, alifáticos pequeños: [Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly)],

II. Aminoácidos ácidos y sus amidas: [Asp, Glu, Asn, Gln],

III. Restos con carga positiva, polares: [His, Lys, Arg],

IV. Restos no polares alifáticos: [Met, Leu, Ile, Val, (Cys)] y

V. Restos aromáticos grandes: [Phe, Tyr, Trp].

Los restos Pro, Gly y Cys están entre paréntesis porque tienen papeles conformacionales especiales. Cys a menudo participa en puentes disulfuro; cuando no hace esto, es altamente hidrófoba. Gly confiere flexibilidad a la cadena; a menudo se describe como "punto de ruptura de la hélice" aunque muchas hélices a contienen Gly. Pro confiere rigidez a la cadena y también se describe como un "punto de ruptura de la hélice". Aunque Pro se encuentra mucho más a menudo en giros, Pro también se encuentra en hélices y hojas. Estos restos pueden ser esenciales en ciertas posiciones y sustituibles en otras partes.

"Modificaciones semiconservativas" se define en este documento como transposiciones de aminoácidos adyacentes (o sus remplazamientos conservativos), y sustituciones semiconservativas. Las "sustituciones semiconservativas" se definen como intercambios entre dos de los grupos (I)-(V) anteriores que están limitadas al supergrupo compuesto por (I), (II), y (III) o al supergrupo compuesto por (IV) y (V). Para el propósito de esta definición, sin embargo, la glicina y alanina se consideran miembros de ambos supergrupos.

Las "modificaciones no conservativas" son modificaciones que no son ni conservativas ni semiconservativas.

Se describen proteínas que se caracterizan adicionalmente por una o más de las mutaciones preferidas, altamente preferidas, o más preferidas expuestas en la Tabla 711.

Se describen proteínas que tienen dominios inhibidores de hNE que no son sólo sustancialmente homólogas a un dominio de referencia, sino que también se califican como inhibidores humanizados.

Se describe que la reivindicación 1 del documento PCT/US92/01501 se refiere a proteínas denominas EpiNEalfa, EpiNE1, EpiNE2, EpiNE3, EpiNE4, EpiNE5, EpiNE6, EpiNE7 y EpiNE8. La reivindicación 3 se refiere a proteínas denominas ITI-E7, BITI-E7, BITI-E&-1222, AMINO1, AMINO2, MUTP1, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE, y MUT1619. (Con la excepción de EpiNEalfa, las secuencias de todos estos dominios aparecen en la Tabla 100.) Las reivindicaciones 4-6 se refieren a inhibidores que son homólogos a, pero no idénticos a, los inhibidores mencionados anteriormente. Estos inhibidores homólogos podrían diferir de los inhibidores principales en una o más sustituciones de clase A (reivindicación 4), una o más sustituciones de clase A o B (reivindicación 5), o una o más sustituciones de clase A, B o C (reivindicación 6). Las sustituciones de clase A, B y C se definieron en la Tabla 65 del documento PCT/US92/01501. Por comodidad, se ha duplicado la Tabla 65 en esta memoria descriptiva.

El significado de las clases A, B y C fue el siguiente: A, no se espera un efecto principal si la carga molecular permanece en el intervalo de -1 a +1; B, no se esperan efectos principales, pero son más probables que con A; y C, debe ensayarse cualquier cambio de resto de la superficie de contacto de unión. Cada posición del resto se asignó a una valoración A, B, C o X; significando X ninguna sustitución permitida. En posiciones que no son X, se indicaron las sustituciones permitidas.

La presente invención excluye dominios que corresponden exactamente a los dominios principales de las reivindicaciones 1 y 3 del documento PCT/UR92/0150. Se describen dominios que también difieren de estos dominios principales en una o mas mutaciones que no son sustituciones de clase A, no son sustituciones de clase A o B, y no son sustituciones de clase A, B, C, como se define en la Tabla 65. Se describen dominios que son cada uno más similares a una de las proteínas de referencia mencionadas anteriormente que a cualquiera de las proteínas principales expuestas en el documento PCT/US92/0150.

Los ejemplos contienen numerosos ejemplos de secuencias de aminoácidos acompañadas por secuencias de ADN que las codifican.

Ejemplo Comparativo 1

Expresión y presentación de BPTI, ITI-D1, y otros Dominios Kunitz

La Tabla 30 muestra un gen de presentación que codifica: 1) el péptido señal M13 III, 2) BPTI, y 3) los primeros pocos aminoácidos de la proteína M13 III madura. Se han producido fagos en los que este gen es el único gen tipo iii de modo que todas las copias de III expresadas se espera que estén modificadas en el extremo amino terminal de la proteína madura. Las sustituciones en el dominio BPTI pueden producirse en los casetes delimitados por los sitos AccIII, Xhol, PfIMI, APal, BssHII, SrI, XcaI, EspI, SphI o NarI (mismo reconocimiento que KasI). La Tabla 100 proporciona secuencias de aminoácido de varios dominios Kunitz, algunos de los cuales inhiben hNE. Cada una secuencias inhibidoras de hNE mostradas en la Tabla 100 pueden expresarse como una proteína de unión a hNE intacta o pueden incorporarse en una proteína más grande como dominio. Las proteínas que comprenden una parte sustancial de una de las secuencias inhibidoras de hNE encontradas en la Tabla 100 se espera que muestren actividad inhibidora de hNE. Esto es particularmente cierto si se mantiene la secuencia que comienza en la primera cisteína y continúa hasta la última cisteína.

El dominio ITI 1 es un dominio Kunitz como se analiza a continuación. La capacidad de retener fagos de presentación en matrices que presentan hNE está relacionada con la afinidad del dominio Kunitz particular (u otra proteína) presentada en el fago. La expresión del gen de fusión del dominio ITI 1::iii y la presentación de la proteína de fusión en la superficie del fago se demostraron por análisis de Western y experimentos de títulos de neutralización del fago. La infectividad del fago que presenta ITI-D1 se bloqueó en hasta un 99% por anticuerpos que se unen a ITI mientras que el fago de tipo silvestre no se vio afectado.

La Tabla 36 proporciona la secuencia de un gen de fusión que comprende: a) la secuencia señal de M13 III, b) ITI-D1, y c) la parte inicial de III madura de M13. El dominio ITI-D1 presentado por alterarse por métodos convencionales incluyendo: i) mutagénesis dirigida por oligonucleótido, de ADN fágico de cadena única, y ii) mutagénesis por casete, de ADN RF usando los sitios de restricción (BgII, EagI, NcoI, SryI, PstI y KasI (dos sitios)) indicados en el gen.

Ejemplo Comparativo 2

Fraccionamiento del fago MA-ITI-DI unido a perlas de proteasa inmovilizada en agarosa

Para ensayar si el fago que presenta la proteína de fusión ITI-D1::III interaccionan fuertemente con las proteasas elastasa de neutrófilos humana (hNE), se incubaron alícuotas del fago de presentación con perlas de hNE inmovilizada en agarosa ("perlas hNE"). Las perlas se lavaron y el fago unido se eluyó por fraccionamiento por pH como se describe en el documento US 5.223.409. Los pH usados el gradiente por etapas fueron 7,0, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5 y 2,0. Después de la elución y neutralización, se valoraron las diversas fracciones de entrada, lavado, y elución por pH. Se compararon el fago que presenta ITI-D1 con el fago que presenta EpiNE-7.

Los resultados de varios fraccionamientos se muestran el la Tabla 212 (fago EpiNE-7 o MA-ITI-D1 unido a perlas hNE). Los perfiles de elución por pH obtenidos usando el fago de presentación de control (EpiNE-7) fueron similares a perfiles previos (documento US 5.223.409). Aproximadamente el 0,3% del fago que presenta EpiNE-7 aplicado a las perlas hNE eluido durante el procedimiento de fraccionamiento y el perfil de elución tuvieron un máximo de elución a aproximadamente pH 4,0.

El fago MA-ITI-D1 no muestra evidencia de gran afinidad por las perlas hNE. Los perfiles de elución por pH para el fago MA-ITI-D1 unido a perlas hNE muestran disminuciones esencialmente monótonas en la recuperación del fago con pH en disminución. Además, las fracciones totales del fago aplicado a las perlas que se recuperaron durante los procedimientos de fraccionamiento fueron bastantes bajas: 0,002%.

Los valores publicados de K_{i} para la inhibición de elastasa de neutrófilos por la proteína ITI intacta, grande (M_{t} = 240.000) varían entre 60 y 150 nM (SWAI88, ODOM90). Nuestras propias medidas de fracción por pH del fago de presentación unido a perlas hNE demuestran que las proteínas presentadas por los fagos con baja afinidad (> 1 \muM) por hNE no están unidas por las perlas mientras que las proteínas presentadas por los fagos con mayor afinidad (nM) se unen a las perlas y se eluyen a aproximadamente pH 5. Si el primer dominio tipo Kunitz de la cadena ligera de ITI es completamente responsable de la activada inhibidora de ITI frente a hNE, y si este dominio está presentado de manera correcta en el fago MA-ITI-D1, entonces parece que la afinidad mínima de un inhibidor por hNE que permite la unión y fraccionamiento del fago de presentación en perlas hNE está entre 50 y 100 nM.

Ejemplo Comparativo 3

Alteración de la región P1 de ITI-D1

Se supone que ITI-D1 y EpiNE-7 tienen la misma configuración de 3D en solución que BPTI. Aunque EpiNE-7 e ITI-D1 son idénticos en las posiciones 13, 17, 20, 32, y 39, difieren enormemente en sus afinidades por hNE. Para mejorar la afinidad de ITI-D1 por hNE, la secuencia de EpiNE-7 Val_{\underline{15}}-Ala_{\underline{16}}-Met_{\underline{17}}-Phe_{\underline{18}}-Pro_{\underline{19}}-Arg_{\underline{20}} (los aminoácidos subrayados en negrita son alteraciones) se incorporó en la secuencia de ITI-D1 por mutagénesis con casete entre los sitios EagI y StyI/Ncol mostrados en la Tabla 35. Los aislados del fago que contiene el gen de fusión ITI-D1::III con los cambios de EpiNE-7 alrededor de la posición P1 se llaman MA-ITI-D1E7.

Ejemplo Comparativo 4

Fraccionamiento del fago MA-ITI-D1E7

Para ensayar si el fago que presenta ITI-D1E7 se une a perlas hNE, se midieron los perfiles de elución por pH. Se incubaron alícuotas de fagos que presentan EpiNE7, MA-ITI-D1, y MA-ITI-D1E7 con perlas hNE durante tres horas a temperatura ambiente (TA). Las perlas se lavaron y se eluyó el fago como se describe en el documento US 5.223.409, excepto en que sólo se realizaron tres eluciones por pH. Estos datos están en la Tabla 215. El perfil de elución por pH del fago que presenta EpiNE-7 es como se ha descrito. El fago MA-ITI-D1E7 muestra un amplio máximo de elución alrededor de pH 5. La fracción total del fago MA-ITI-D1E7 obtenido en la elución por pH de perlas hNE fue aproximadamente 40 veces menor que la obtenida usando el fago que presenta EpiNE-7.

El comportamiento de elución por pH del fago MA-ITI-D1E7 unido a perlas hNE es cualitativamente similar al visto usando fago BPTI[K15L]-III-MA. BPTI con la mutación K15L tiene una afinidad por hNE de = 3 nM. (Las alteraciones y mutaciones se indican dando el tipo de aminoácido original (tipo silvestre), después la posición, y después el nuevo tipo de aminoácido; por tanto K15L significa un cambio Lys_{15} a Leu.) Suponiendo que todo lo demás permanezca igual, el perfil de elución por pH de MA-ITI-D1E7 sugiere que la afinidad de los tres dominios ITI-D1E7 por hNE podría estar en el intervalo nM. Si este es el caso, la sustitución de la secuencia de EpiNE-7 en lugar de la secuencia de ITI-D1 alrededor de la región P1 ha producido un aumento de 20 a 50 veces en la afinidad por hNE (suponiendo K_{i} = 60 a 150 nM para ITI-D1 sin alterar).

Si EpiNE-7 e ITI-D1E7 tienen la misma estructura en solución, estas proteínas presentan las secuencias de aminoácidos idénticas para hNE sobre la superficie de interacción. A pesar de esta similitud, EpiNE7 muestra una afinidad superior de casi 1000 veces por hNE que ITI-D1E7. Esta observación pone de relieve la importancia de restos secundarios que no contactan en la modulación de fuerzas de interacción.

La cadena ligera de ITI nativa está glicosilada en las posiciones, Ser_{10} y Asn_{45} (GEBH86). La retirada de las cadenas de glicosaminoglicano ha demostrado disminuir la afinidad del inhibidor por hNE aproximadamente cinco veces (SELL87). Otra diferencia potencialmente importante entre EpiNE-7 e ITI-D1E7 es la de carga neta. Los cambios en BPTI que producen EpiNE-7 reducen la carga total en la molécula de +6 a +1. Las diferencias de secuencia entre EpiNE-7 e ITI-D1E7 reducen adicionalmente la carga de la última a -1.

Además, el cambio en la carga neta entre estas dos moléculas surge de las diferencias de secuencia que suceden en las partes centrales de las moléculas. La posición 26 es Lys en EpiNE-7 y es Thr en ITI-D1E7, mientras que en la posición 31 estos restos son Gln y Glu, respectivamente. Estos cambios en la secuencia no sólo alteran la carga neta de las moléculas sino que también colocan un resto cargado negativamente cercano a la superficie de interacción en ITI-D1E7. Puede ser que la existencia de una carga negativa en la posición 31 (que no se encuentra en ningún otro de los inhibidores de hNE descritos aquí) desestabilice la interacción inhibidor-proteasa.

Ejemplo Comparativo 5

Preparación del Fago BITI-E7

Las posibles razones de que el fago MA-ITI-D1E7 tenga afinidad inferior por hNE que el fago MA-EpiNE7 incluyen: a) escisión incorrecta de la proteína de fusión IIIseñal::ITI-D1E7::IIImadura, b) carga negativa inapropiada en el dominio ITI-D1E7, c) cambios conformacionales o dinámicos en la estructura Kunitz provocada por sustituciones tales como Phe_{4} a Ser_{4}, y d) aminoácidos no óptimos en la superficie de contacto ITI-D1E7:hNE tal como Q_{34} o A_{11}.

Para investigar las primeras tres posibilidades, se sustituyeron los primeros cuatros aminoácidos de EpiNE7 por los primeros cuatro aminoácidos de ITI-D1E7. Esta sustitución debe proporcionar un péptido que pueda escindirse por peptidasa I de la señal del mismo modo que la fusión IIIseñal::EpiNE7::IIImadura. Además, Phe_{4} de BPTI es parte del núcleo hidrófobo de la proteína; el remplazamiento con serina puede alterar la estabilidad o carácter dinámico de ITI-D1E7 de manera desfavorable. ITI-D1E7 tiene una Glu cargada negativamente en la posición 2 mientras que EpiNE7 tiene Pro. Se introdujeron los tres cambios en el extremo amino terminal de la proteína ITI-D1E7; (K1R, E2P, y S4F) por mutagénesis dirigida por oligonucleótido para producir BITI-E7; el fago que presenta BITI-E7 se llama
MA-BIT-E7.

Se compararon las propiedades de las proteínas de fusión ITI-III presentadas por el fago MA-ITI-D1 y MA-BITI usando análisis de Western como se ha descrito previamente y no se encontraron diferencias significativas en el tamaño aparente o abundancia relativa de las proteínas de fusión producidas por cada cepa de fago de presentación. Por tanto, no hay grandes diferencias en las formas procesadas de cada proteína de fusión presentada en el fago. Por extensión, tampoco hay grandes diferencias en las formas procesadas de las proteínas de fusión del gen III presentadas por MA-ITI-D1E7 y MA-EpiNE7. Por lo tanto, probablemente los grandes cambios en la conformación proteica debido a procesamiento alterado no son responsables de las grandes diferencias en la unión a perlas hNE mostradas por el fago de presentación MA-ITI-D1E7 y MA-EpiNE7.

Se caracterizaron las propiedades de unión a perlas hNE del fago de presentación MA-BITI y MA-BITI-E7 usando el procedimiento de fraccionamiento por pH ampliado descrito en el documento US 5.223.409. Estos resultados están en la Tabla 216. Los perfiles de elución por pH para MA-BITI y MA-BITI-E7 muestran diferencias significativas con los perfiles mostrados por MA-ITI-D1 y MA-ITI-D1E7. En ambos casos, las alteraciones en los supuestos extremos amino terminales de la proteína de fusión presentada producen un aumento de varias veces en la fracción del fago de presentación de entrada eluido de las perlas hNE.

La capacidad de unión de las perlas hNE para un fago de presentación varía entre las preparaciones de perlas y con la edad de cada preparación individual de perlas. Por tanto, es difícil comparar directamente los rendimientos absolutos del fago entre eluciones en diferentes momentos. Por ejemplo, la fracción del fago de presentación MA-EpiNE7 recuperada de perlas hNE varía dos veces entre los experimentos mostrados en las Tablas 212, 215 y 216. Sin embargo, las formas de los perfiles de elución por pH son similares. Es posible corregir de algún modo las variaciones en la capacidad de unión de las perlas hNE por rendimientos de fago de presentación de normalización a un rendimiento total del fago MA-EpiNE7 recuperado de las perlas en una elución concurrente. Cuando los datos mostrados en las Tablas 212, 215, y 216 están normalizados de este modo, las recuperaciones del fago de presentación, con relación a MA-EpiNE7 recuperado, se muestran en la Tabla 10.

TABLA 10

Recuperación del fago de presentación
Cepa de Fago de Presentación	Fracción de entrada normaliza
MA-ITI-D1	0,0067
MA-BIT	0,018
MA-ITI-D1E7	0,027
MA-BITI-E7	0,13

\vskip1.000000\baselineskip

Por tanto, los cambios en la secuencia amino terminal de la proteína presentada producen un aumento de tres a cinco veces en la fracción del fago de presentación eluida de las perlas hNE.

Además de la unión aumentada, los cambios introducidos en MA-BITI-E7 producen un fago que eluye de las perlas hNE a un pH inferior al que lo hace el fago MA-ITI-D1E7 parental. Aunque el fago de presentación parental eluye con un amplio máximo de pH centrado alrededor de pH 5,0, el perfil de elución por pH para el fago de presentación MA-BITI-E7 tiene un máximo de pH alrededor de pH 4,75 a pH 4,5.

El máximo de elución por pH del fago de presentación MA-BITI-E7 está entre los máximos mostrados por los fagos de presentación BPTI (K15L) y BPTI (K15V, R17L) (pH 4,75 y pH 4,5 a pH 4,0, respectivamente) descrito en el documento US 5.223.409. A partir del máximo de pH mostrado por el fago de presentación se prevé que la proteína BITI-E7 libre en solución pueda tener afinidad por hNE en el intervalo de 100 pM. Esto representaría un aumento de aproximadamente diez veces en la afinidad por hNE sobre el estimado anteriormente para ITI-D1E7.

Como se ha descrito anteriormente, el análisis de Western de proteínas fágicas muestran que no hay grandes cambios en las proteínas de fusión del gen III después de la alteración de la secuencia amino terminal. Por tanto, es improbable que los cambios en la actividad del fago de presentación por perlas hNE pueda atribuirse a alteraciones a gran escala en el plegamiento de la proteína como resultado de un procesamiento alterado ("correcto") de la proteína de fusión en los mutantes amino terminales. Las mejoras en la unión pueden en parte deberse a: 1) la disminución en la carga negativa neta (-1 a 0) de la proteína que surgen del cambio de Glu a Pro en la posición 2, o 2) estabilidad proteica aumentada como resultado de la sustitución Ser a Phe en el resto 4 en el núcleo hidrófobo de la proteína, o 3) los efectos combinados de ambas sustituciones.

Ejemplo Comparativo 6

Producción y propiedades de MA-BITI-E7-1222 y MA-BITI-E7-141

En la supuesta superficie de contacto Kunitz:nNE, BITI-E7 y EpiNE7 difieren sólo en dos posiciones: 11 y 34. En EpiNE7 estos restos son Thr y Val, respectivamente. En BITI-E7 hay Ala y Gln. Además BITI-E7 tiene Glu en 31 mientras que EpiNE7 tiene Gln. Esta carga negativa puede influir en la unión aunque el resto no está directamente en la superficie de contacto. Se usó mutagénesis dirigida por oligonucleótido para investigar los efectos de sustituciones en las posiciones 11, 31 y 34 en la interacción proteasa:inhibidor.

El derivado BITI-E7-1222 de ITI-D1 es BITI-E7 con la alteración A11T. El derivado BITI-E7-141 de ITI-D1 es BITI-E7 con las alteraciones E31Q y Q34V; los fagos que presentan estas proteínas son MA-BITI-E7-1222 y MA-BITI-E7-141. Se determinaron las propiedades de unión a perlas hNE de los fagos de presentación MA-BITI-E7-1222 y MA-BITI-E7-141 usando el protocolo de fraccionamiento por pH ampliado descrito previamente. Los resultados están en la Tablas 217 (para MA-BITI-E7 y MA-BITI-E7-1222) y 218 (para MA-EpiNE7 y MA-BITI-E7-141). Los perfiles de elución por pH para el fago MA-BITI-E7 y MA-BITI-E7-1222 son casi idénticos. Ambas cepas de fago muestran perfiles de elución por pH con máximos idénticos (entre pH 5,0 y pH 4,5) así como la máxima fracción total de fago de entrada eluida de las perlas hNE (0,03%). Por tanto, la sustitución T11A en el derivado de ITI-D1 presentado no tiene efecto apreciable en la unión a perlas hNE.

Por el contrario, los cambios en las posiciones 31 y 34 afectan fuertemente a las propiedades de unión a hNE del fago de presentación. El pH máximo del perfil de elución del fago MA-BITI-E7-141 se cambió a un pH inferior con relación al fago MA-BITI-E7 parental. Además, la posición del máximo (entre pH 4,5 y pH 4,0) es idéntica a la mostrada por el fago MA-EpiNE7 en este experimento. Finalmente, el fago MA-BITI-E7-141 muestra un aumento de diez veces, con relación al MA-BITI-E7 parental, en la fracción total del fago de entrada eluida de las perlas hNE (0,3% frente a 0,03%.) La fracción total del fago MA-BITI-E7-141 eluida de las perlas hNE es casi dos veces la del fago MA-EpiNE7.

Los resultados anteriores muestran que la unión por el fago de presentación MA-BITI-E7-141 a perlas hNE es comparable a la del fago MA-EpiNE7. Si las dos proteínas (EpiNE7 y BITI-E7-141) en solución tienen afinidades similares por hNE, entonces la afinidad de la proteína BITI-E7-141 por hNE está en el orden de 1 pM. Dicha afinidad es aproximadamente 100 veces superior a la estimada anteriormente por la proteína parental (BITI-E7) y es 10^{5} y 10^{6} veces tan grande como la afinidad por hNE presentada para la proteína ITI.

Ejemplo Comparativo 7

Mutagénesis de BITI-E7-141

BITI-E7-141 difiere de ITI-D1 en nueve posiciones (1, 2, 4, 15, 16, 18, 19, 31, y 34). Para obtener la proteína que tiene la menor cantidad de cambios con respecto a ITI-D1 manteniendo la alta afinidad específica por hNE, se investigaron los efectos de la reversión de los cambios en las posiciones 1, 2, 4, 16, 19, 31 y 34. Los derivados de BITI-E7-141 que se ensayaron son MUT1619, MUTP1, y MUTT26A. Los derivados de BITI que se ensayaron son AMINO1 y AMINO2. El derivado de BITI-E7 que se ensayó es MUTQE. Todas estas secuencias se muestran en la Tabla 100. MUT1619 restablece los restos de ITI-D1 Al_{16} y Ser_{19}. La secuencia denominada "MUTP1" impone los aminoácidos I_{15}, G_{16}, S_{19}, en el contesto de BITI-E7-141. Es probable que M_{17} y F_{18} sean óptimos para la alta afinidad de unión a hNE. G_{16} y S_{19} sucedió con frecuencia en variantes de BPTI con alta afinidad de unión a hNE obtenidas del fraccionamiento de una biblioteca de variantes de BPTI frente a hNE (ROBE92). Se introdujeron tres cambios en el supuesto extremo amino terminal del dominio ITI-D1 presentado para producir la serie MA-BITI del fago. AMINO1 lleva la secuencia K,-E2 mientras que AMINO2 lleva K_{1}-S_{4}. Otros aminoácidos en la región amino terminal de estas secuencias son como en ITI-D1. MUTQE se obtiene de BITI-E7-141 por la alteración Q31E (volviendo a imponer el resto de tipo silvestre de ITI-D1). Finalmente, el oligonucleótido mutagénico MUTT26A pretende retirar un sitio potencial de glicosilación unido a N, N_{24}-G_{25}-T_{26.} En la molécula ITI intacta aislada de suero humano, la cadena polipeptídica ligera está glicosilada en este sitio (N_{45}, ODOM90): Es probable que N_{24} se glicosile si la proteína BITI-E7-141 se produce mediante expresión en eucariotas. Dicha glicosilación puede volver inmunogénica a la proteína cuando se usa para tratamiento de larga duración. MUTT126A contiene la alteración T26A y retira el sitio de glicosilación potencial con cambios mínimos en las propiedades químicas globales del resto en esa posición. Además, frecuentemente se encuentra un resto Ala en otros homólogos de BPTI en la posición 26 (véase la Tabla 34 del documento US 5.223.409). Se realizó mutagénesis en ADNss del fago NIA-BM-E7-141.

Ejemplo Comparativo 8

Propiedades de unión a hNE del fago de presentación MA-BITI-E7-141 mutagenizado

La Tabla 219 muestra los datos de elución por pH para diversos fagos de presentación eluidos de perlas hNE. Las pfu totales aplicadas a las perlas están en la columna dos. Las fracciones de estas pfu de entrada recuperadas en cada fracción de pH del protocolo de elución por pH abreviado (pH 7,0, pH 3,5, y pH 2,0) están en las siguientes tres columnas. Para los datos obtenidos usando el protocolo de elución por pH ampliado, el listado de pH 3,5 representa la suma de las fracciones de entrada recuperadas en las muestras de elución de pH 6,0, pH 5,5, pH 5,0, pH 4,5, pH 4,0, y pH 3,5. El listado de pH 2,0 es la suma de las fracciones de entrada obtenidas de las muestras de elución a pH 3,0, pH 2,5 y pH 2,0. La fracción total de pfu de entrada obtenida durante todo el protocolo de elución por pH está en la sexta columna. La columna final de la tabla enumera la fracción total de pfu de entrada recuperada, normalizada al valor obtenido para el fago MA-BITI-E7-141.

Deben considerarse dos factores cuando se hacen comparaciones entre los datos mostrados en la Tabla 219. El primero es que debido a la naturaleza cinética de la liberación del fago a partir de las perlas hNE y el tiempo prolongado en el protocolo de elución por pH ampliado, la fracción de pfu de entrada recuperada en la fracción a pH 3,5 se enriquecerá a costa de la fracción a pH 2,0 en el protocolo ampliado con relación a los valores obtenidos en el protocolo abreviado. La magnitud de este efecto puede verse comparando los resultados obtenidos cuando se eluye el fago de presentación MA-BITI-E7-141 de las perlas hNE usando los dos protocolos. El segundo factor es que, para un intervalo de pfu de entrada enumerado en la Tabla 219, las pfu de entrada influyen en la recuperación. Cuanto mayor es las pfu de entrada, mayor es la fracción total de la entrada recuperada en la elución. Este efecto es evidente cuando las pfu de entrada difieren en más de un factor de aproximadamente 3 a 4. El efecto puede conducir a una sobreestimación de la afinidad del fago de presentación por las perlas hNE cuando los datos del fago aplicado a títulos superiores se comparan con los del fago aplicado a títulos más bajos.

Con estas ideas en mente, se pueden interpretar los datos de la Tabla 219. Los efectos de las mutaciones introducidas en el fago de presentación MA-BITI-E7-141 ("parental") en la unión del fago de presentación a perlas hNE pueden agruparse en tres categorías: los cambios que tienen pocos o ningún efecto que se pueda medir, los que tienen efectos moderados (2 a 3 veces), y los que tienen grandes efectos (> 5 veces).

Los cambios MUTT26A y MUTQE parecen tener poco efecto en la unión del fago de presentación a las perlas hNE. En términos de pfu totales recuperadas, el fago de presentación que contiene estas alteraciones se une como el parental a las perlas hNE. De hecho, los perfiles de elución por pH obtenidos para el fago de presentación parental y MUTT26A a partir del protocolo de elución por pH ampliado son indistinguibles. La unión del fago de presentación MUTTQE parece estar ligeramente reducido con relación al parental y, a la luz de las pfu aplicadas, es probable que esta unión esté algo sobreestimada.

Las alteraciones de secuencia introducidas mediante los oligonucleótidos MUTP1 y MUT1619 parecen reducir la unión del fago de presentación a perlas hNE de aproximadamente 2 a 3 veces. A la luz de los títulos de entrada y las distribuciones de pfu recuperadas entre las diversas fracciones de elución, es probable que 1) estos fagos de presentación tengan afinidades más bajas por las perlas hNE que el fago de presentación MA-EpiNE7, y 2) el fago de presentación MUT1619 tenga una afinidad superior por las perlas hNE que el fago de presentación
MUTP1.

Las alteraciones de secuencia en los extremos amino terminales de BITI-E7-141 parecen reducir la unión del fago de presentación a las perlas hNE al menos diez veces. Los cambios AMINO2 probablemente reducen la unión del fago de presentación a un grado sustancialmente superior que los cambios AMINO 1.

En base a las interpretaciones anteriores de los datos de la Tabla 219, se puede concluir que:

1.) La sustitución de ALA por THR en la posición 26 en ITI-D1 y sus derivados no tienen efecto sobre la interacción del inhibidor con hNE. Por tanto, la posibilidad de glicosilación en Asn_{24} de una proteína inhibidora producida en cultivo de células eucariotas puede evitarse sin reducir la afinidad por hNE.

2.) El aumento en la afinidad del fago de presentación por perlas hNE de los cambios E31Q y Q34V está provocado principalmente por la sustitución de Val en 34.

3.) Los tres cambios en la región amino terminal de ITI-D1 (posiciones 1, 2, y 4) influyen en la unión del fago de presentación a perlas hNE en grados variados. La alteración S4F parece tener aproximadamente el mismo efecto que el de E2P. El cambio en la posición 1 parece tener sólo un efecto pequeño.

4.) Los cambios en la región alrededor del resto P1 en BITI-E7-141 (posición 15) influye en la unión del fago de presentación a hNE. Los cambios A16G y P19S parecen reducir algo la afinidad del inhibidor (quizá 3 veces). La sustitución de I15V reduce adicionalmente la unión.

BITI-E7-141 difiere de ITI-D1 en nueve posiciones. A partir del análisis anterior, parece probable que pudiera construirse un inhibidor de NET con alta afinidad en base a ITI-D1 que diferiría de la secuencia ITI-D1 en sólo cinco o seis posiciones. Estas diferencias serían: Pro en la posición 2, Phe en la posición 4, Val en la posición 15, Phe en la posición 18, Val en la posición 34, y Ala en la posición 26. Si la glicosilación de Asn_{24} no es de interés, podría mantenerse Thr en 26.

Sumario Afinidades estimadas de derivados de ITI-D1 aislados por hNE

En base a la unión del fago de presentación y la elución de perlas hNE, es posible estimar las afinidades por hNE que pueden presentar diversos derivados de ITI-D1 libres en solución. Estas estimaciones se resumen en la Tabla 55.

Inhibidores de hNE derivados del dominio ITI 2

La presente invención comprende inhibidores de hNE derivados de ITI-D2 como se define en las reivindicaciones. Estos inhibidores se han producido en Pichia pastoris con buen rendimiento. EPI-HNE-4 inhibe la elastasa de neutrófilos humana con una K_{D} \approx 5 pM.

Purificación y propiedades de proteínas EPI-HNE I. Proteínas EPI-HNE Ejemplo 1 Secuencias de aminoácidos de EPI-HNE-3 y EPI-HNE-4

La Tabla 100 proporciona secuencias de aminoácidos de cuatro proteínas inhibidoras de elastasa de neutrófilos humana (hNE): EPI-HNE-1 (ejemplo comparativo) (idéntica a EpiNE1), EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo), EPI-FINE-3, y EPI-HNE-4. Estas proteínas se han obtenido de los dominios tipo Kunitz parentales mostrados. Cada una de las proteínas se muestra alineada con el dominio parental usando los seis restos de cisteína (sombreados) característicos del dominio tipo Kunitz. Los restos en las proteínas inhibidoras que difieren de los de la proteína parental están en recuadro superior. Se han producido las proteínas completas que tienen las secuencias de EPI-HNE-1 (ejemplo comparativo), EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo), EPI-HNE-3, y EPI-HNE-4 (Tabla 100). Se espera que proteínas más grandes que comprenden una de las secuencias de inhibición de hNE tengan una potente actividad inhibidora de hNE; EPI-HNE-3, y EPI-HNE-4 son particularmente preferidas. Se espera que proteínas que comprenden una parte significativa de una de las secuencias de inhibición de hNE encontradas en la Tabla 100 (particularmente si se mantiene la secuencia que comienza en o antes de la primera cisteína y continúa hasta o más allá de la última cisteína) muestren potente actividad inhibidora de hNE.

Se describen los inhibidores de hNE EPI-HNE-1 y EPI-HNE-2 que se obtienen de la proteína bovina BPTI (aprotinina). En el domino tipo Kunitz, estos dos inhibidores difieren de BPTI en las mismas ocho posiciones: K15I, R17F, I18F, I19P, R39M, A40G, K41N, y R42G. Además, EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) difiere tanto de BPTI como de EPI-HNE-1 (ejemplo comparativo) en la presencia de cuatro restos adicionales (EAEA) presentes en el extremo amino terminal. Estos restos se añadieron para facilitar la secreción de la proteína en Pichia pastoris.

EPI-HNE-3 se obtiene del segundo dominio Kunitz de la cadena ligera de la proteína inhibidora de inter-\alpha-tripsina humana (ITI-D2). La secuencia de aminoácidos de EPI-HNE-3 difiere de la de ITI-D2 (3-58) en sólo cuatro posiciones: R15I, 118F, Q19P y L20R. EPI-HNE-4 difiere de EPI-HNE-3 por la sustitución A3E (el resto amino terminal) que facilita la secreción de la proteína en P. pastoris y mejora la K_{D} por hNE. La Tabla 602 proporciona algunas propiedades físicas de las proteínas inhibidoras de hNE. Las cuatro proteínas son inhibidores pequeños de hNE con alta afinidad (K_{i} = 2 a 6 pM), de funcionamiento rápido (K_{\infty} = 4 a 11 x 10^{6} M^{-1}S^{-1}).

II. Producción de los inhibidores de hNE EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo), EPI-HNE-3, y EPI-HNE-4 Ejemplo 2 Sistema de producción en Pichia pastoris

Se usaron cepas transformadas de Pichia pastoris para expresar las diversas proteínas EPI-HNE obtenidas de BPTI e ITI-D2. Los casetes de expresión proteica se clonan en el plasmado pHIL-D2 usando los sitios BstBI y EcoRI (Tabla 111). La secuencia de ADN de pHIL-D2 se proporciona en la Tabla 250. El gen clonado está bajo el control transcripcional del promotor cadena arriba del gen aox1 (marcado "aox1 5'") de Pichia pastoris y las secuencias reguladoras (región sombreada oscura) y secuencias cadena abajo de poliadenilación y de terminación de la trascripción (segunda región sombreada con rayas, marcada "aox1 3'"). P. pastoris GS115 es una cepa mutante que contiene un gen de histidinol deshidrogenasa no funcional (his4). El gen his4 contenido en el plásmido pHIL-D2 y sus derivados puede usarse para complementar la deficiencia de histidina en la cepa hospedadora. La linealización del plásmido pHIL-D2 en el sitio Sacl indicado dirige la incorporación del plásmido en el genoma hospedador en el locus aox1 por recombinación homóloga durante la transformación. Las cepas de P. pastoris que contienen copias integradas del plásmido de expresión expresarán genes de proteínas bajo el control del promotor aox1 cuando el promotor se activa por el crecimiento en presencia de metanol como única fuente de carbono.

Se ha usado este sistema de producción en Pichia pastoris de alta densidad para producir proteínas por secreción en el CM celular. Se construyeron plásmidos de expresión por ligamiento de secuencias de ADN sintético que codifican el prepropéptido del factor \alpha de acoplamiento de S. cerevisiae fusionado directamente al extremo amino terminal del inhibidor de hNE deseado en el plásmido pHIL-D2 usando los sitios BstBI y EcoRI mostrados. La Tabla 251 proporciona la secuencia de ADN de un inserto BstBI-EcoRI que convierte pHIL-D2 en pHIL-D2(MF\alpha-PrePro::EPI-HNE-3). En esta construcción, la proteína de fusión se coloca bajo el control del promotor cadena arriba inducible del gen aox1 de Pichia pastoris y las secuencias cadena abajo de terminación de la trascripción del gen aox1 y de poliadenilación. Los plásmidos de expresión se linealizaron por digestión con SacI y el ADN lineal se incorporó por combinación homóloga en el genoma de la cepa GS115 de P. pastoris por transformación con esferoplastos. Los esferoplastos regenerados se seleccionaron por el crecimiento en ausencia de histidina añadida, se volvieron a sembrar en placas, y se exploraron los aislados individuales para el fenotipo de utilización de metanol (mut^{+}), niveles de secreción, y dosis génica (estimada mediante experimentos de hibridación de Southern). Se seleccionaron cepas de alto nivel de secreción para la producción de inhibidores de hNE: PEY-33 para la producción de EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) y PEY-43 para la producción de EPI-HNE-3. En estas dos cepas, se estima que se integran cuatro copias del plásmido de expresión como a una serie en tándem en el local del gen aox1.

Para facilitar la alteración del segmento que codifica el dominio Kunitz de plásmidos derivados de pHIL-D2, se retiraron dos sitios de restricción dados en la Tabla 111: el sitio BstBI en 4780 y el sitio AatII en 5498. Por tanto, el segmento que codifica el dominio Kunitz está unido por sitios AatII y EcoRI únicos. Los nuevos plásmidos se llaman pD2pick("inserto") donde "inserto" define el dominio codificado bajo el control del promotor aox1. La Tabla 253 proporciona la secuencia de ADN de pD2pick(MF\alpha::EPI-HNE-3). La Tabla 254 proporciona una lista de sitios de restricción en pD2pick(MF\alpha::EPI-HNE-3).

EPI-HNE-4 está codificada por pD2pick(MF\alphaPrePro::EPI-HNE-4) que difiere de pHIL-D2 en que: 1) el segmento AatII/EcoRI de la secuencia dada en la Tabla 251 está remplazado por el segmento mostrado en la Tabla 252 y 2) se han producido los cambios en los sitios de restricción analizados anteriormente. La cepa PEY-53 es P. pastoris GS115 transformada con pD2pick(MF\alpha::EPI-HNE-4).

Ejemplo 3 Producción de proteínas

Para producir las proteínas, se hicieron crecer las cepas de P. pastoris en fermentaciones de suministro mixto similares al procedimiento descrito por Digan et al. (DIGA89). Aunque otros han informado de la producción de dominios Kunitz en P. pastoris, es bien sabido que muchos sistemas de secreción implican proteasas. Por tanto, no es evidente que un dominio Kunitz alterado que tenga alta potencia en la inhibición de hNE pudiera secretarse por P. pastoris porque el nuevo inhibidor podría inhibir alguna enzima clave de la vía de secreción. Sin embargo, se ha descubierto que P. pastoris puede secretar inhibidores de hNE con alto rendimiento.

Brevemente, primero se hicieron crecer los cultivos en un modo discontinuo con glicerol como fuente de carbono. Después del agotamiento del glicerol, se hizo crecer el cultivo durante aproximadamente cuatro horas de un modo con suministro limitado de glicerol para aumentar adicionalmente la masa celular y para desreprimir el promotor aox1. En la fase de producción final, el cultivo se hizo crecer de un modo con suministro limitado de metanol. Durante esta fase, el promotor aox1 se activa completamente y se secreta la proteína en el CM.

La Tabla 607 y la Tabla 608 proporcionan la cinética del crecimiento celular (estimado como A_{600}) y la secreción de proteínas (mg/l) para los cultivos de PEY-33 y PEY-43 durante las partes de suministro limitado de metanol de las fermentaciones relevantes. Las concentraciones de las proteínas inhibidoras en los cultivos de fermentación se determinaron a partir de ensayos in vitro de la inhibición de hNE por alícuotas diluidas de los medios de cultivo libres de células obtenidas en los tiempos indicados. A pesar de las similitudes en la dosis génica, las condiciones de fermentación, densidades celulares, y cinética de secreción, las concentraciones finales de las proteínas inhibidoras secretadas por las dos cepas difieren en casi un orden de magnitud. La concentración final de EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) en el CM de fermentación de PEY-33 fue 720 mg/l. La concentración final de EPI-HNE-3 en el CM de fermentación de PEY-43 fue 85 mg/l. Las diferencias en las concentraciones de proteína secretada finales pueden estar provocadas por diferencias idiosincráticas en las eficacias con las que la síntesis de levaduras y los sistemas de procesamiento interaccionan con las diferentes secuencias proteicas.

La cepa PEY-33 secretó la proteína EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) en el CM como una especie molecular única con composición de aminoácidos y secuencia N-terminal que se reveló que era un dominio Kunitz correctamente procesado con la secuencia mostrada en la Tabla 601. La especie molecular principal producida por cultivos de PEY-43 fue la proteína EPI-HNE-3 procesada correctamente. Sin embargo, esta cepa también secretó una pequeña cantidad (aproximadamente del 15% al 20% de EPI-HNE-3 total) de material procesado de manera incorrecta. Este material demostró ser una mezcla de proteínas con extensiones amino terminales (principalmente de nueve a siete restos de longitud) que surgen de la escisión incorrecta del PrePro péptido líder MF \alpha del dominio Kunitz maduro. La proteína procesada correctamente se purificó sustancialmente libre de estos contaminantes como se describe a continuación.

III. Purificación de inhibidores de hNE EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) y EPI-HNE-3

Las proteínas pueden purificarse fácilmente a partir del CM de fermentación por técnicas bioquímicas convencionales. El procedimiento de purificación específico varía con las propiedades específicas de cada proteína como se describe a continuación.

Ejemplo Comparativo 9

Purificación de EPI-HNE-2

La Tabla 603 proporciona detalles de la purificación de EPI-HNE-2, lote 1. El cultivo de fermentación PEY-33 se recolectó por centrifugación a 8000 x g durante 15 minutos y el sedimento celular se deshecho. La fracción sobrenadante de 3,3 l se microfiltró usando un Minitan Ultrafiltration System (Millipore Corporation, Bedford, MA) equipado con cuatro paquetes de filtro de 0,2 \mu.

El filtrado obtenido de la etapa de microfiltración se usó en dos etapas de ultrafiltración posteriores. Primero, se realizaron dos ultrafiltraciones de 30 K sobre el microfiltrado de 0,2 \mu usando el aparato Minitan equipado con ocho placas de filtro de polisulfona de 30.000 NMWL (Nº PLTK0MP04, Millipore Corporation, Bedford, MA). La solución retenida de la primera ultrafiltración de 30 K se diluyó con NaCitrato 10 mM, pH = 3,5, y se sometió a una segunda ultrafiltración de 30 K. Los dos ultrafiltrados de 30 K se combinaron para proporcionar un volumen final de 5 l que contenían aproximadamente 1,4 g de proteína EPI-HNE-2 (estimado a partir de las medidas de inhibición de hNE).

El ultrafiltrado de 30 K se concentro cambiando el tampón en la segunda etapa de ultrafiltración usando el aparato Minitan equipado con 8 placas de filtro de 5000 NMWL (Nº PLCC0MP04, Millipore Corporation, Bedford, MA). En dos momentos durante la ultrafiltración de 5 K, se diluyó la solución retenida de aproximadamente 300 ml a 1,5 l con NaCitrato 10 mM, pH = 3,5. El retenido de ultrafiltración de 5 K final (aprox. 200 ml) se diluyó a un volumen final de 1000 ml con NaCitrato 10 mM, pH - 3,5.

La proteína EPI-HNE-2 se obtuvo a partir de la solución retenida de ultrafiltración de 5 K por precipitación con sulfato amónico a TA. Se añadieron 100 ml de acetato amónico 0,25 M, pH = 3,2 (volumen 1/10) al retenido de ultrafiltración de 5 K, seguido por un volumen final (1,1 l) de sulfato amónico 3 M. Después de incubación de 30 minutos a TA, el material precipitado se sedimentó por centrifugación a 10.000 x g durante 45 minutos. Se retiró la solución sobrenadante, se disolvió el sedimento en agua en un volumen final de 400 ml, y se repitió la precipitación con sulfato amónico usando las proporciones descritas anteriormente. El sedimento de la segunda precipitación con sulfato amónico se disolvió en acetato sódico 50 mM, pH = 3,5 a un volumen final de 300 ml.

Se retiró el sulfato amónico residual de la preparación de EPI-HNE-2 por cromatografía de intercambio iónico. La solución de la etapa de precipitación con sulfato amónico se aplicó a una columna de intercambio catiónico fuerte (volumen del lecho de 50 ml, Macroprep 50S) (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA) previamente equilibrada con NaCitrato 10 mM, pH = 3,5. Después de la carga, se lavó la columna con 300 ml de NaCitrato 10 mM, pH = 3,5. Después se eluyó por lotes EPI-HNE-2 de la columna con 300 ml de NH_{4}OAc 50 mM, pH = 6,2. Las fracciones que contenían actividad EPI-HNE-2 se combinaron y la solución resultante se liofilizó. El polvo de proteína seco se disolvió en 50 ml de dH_{2}O y la solución se pasó a través de un filtro de 0,2 m (Nº 4192, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). La concentración del inhibidor activo en la solución madre final se determinó que era 2 mM (13,5 mg/ml). Esta solución madre (EPI-HNE-2, Lote 1) se ha almacenado en alícuotas de 1 ml a 4ºC y -70ºC durante más de 11 meses sin pérdida de actividad.

La Tabla 603 resume el rendimiento y la pureza relativa de EPI-HNE-2 en diversas etapas del procedimiento de purificación. El rendimiento global del procedimiento de purificación fue aproximadamente del 30%. La fuente principal de pérdida fue la retención de material en las fracciones retenidas de las etapas de microfiltración de 0,2 \mu y ultrafiltración de 30 K.

Ejemplo 4 Purificación de EPI-HNE-3

La purificación de EPI-HNE-3, lote 1, se expone en la Tabla 604. El cultivo de fermentación PEY-43 se recolectó por centrifugación a 8.000 x g durante 15 minutos y se desechó el sedimento celular. La solución sobrenadante (3100 ml) se microfiltró a través de paquetes Minitan de 0,2 \mu (4 paquetes). Después de la concentración, se realizó una diafiltración del retenido de modo que el volumen de filtrado final de la filtración de 0,2 \mu fue 3300 ml.

Se realizó una ultrafiltración de 30 K sobre el filtrado de la etapa de microfiltración de 0,2 \mu. Cuando el volumen del retenido se hubo reducido a 250 ml, se realizó una diafiltración del retenido a un volumen de retenido constante (250 ml) durante 30 minutos a una velocidad de 10 ml/min. El volumen final resultante del filtrado fue 3260 ml.

La proteína EPI-HNE-3 y otros componentes del medio se descubrió que precipitaban de la solución cuando se concentraba el CM de fermentación. Por esta razón, no se realizó la etapa de ultrafiltración de 5 K.

Se purificó EPI-HNE-3 procesada adecuadamente sustancialmente libre de formas mal procesadas y otros componentes del cultivo de fermentación por cromatografía de intercambio iónico. Se equilibró una columna de intercambio de cationes fuerte con un volumen del lecho de 30 ml (Macroprep 50S) con NaCitrato 10 mM, pH = 3,5. El filtrado de ultrafiltración de 30 K se aplicó a la columna y se confirmó la unión de EPI-HNE-3 a la columna demostrando la pérdida completa de actividad inhibidora en el flujo a través de la columna. La columna después se lavó con 300 ml de NaCitrato 10 mM, pH = 3,5.

Para retirar EPI-HNE-3 de la columna, se eluyó secuencialmente con volúmenes de 300 ml de las siguientes soluciones:

Acetato amónico 10 mM, pH = 3,5

Acetato amónico 50 mM, pH = 4,8

Acetato amónico 50 mM, pH = 6,0

Acetato amónico 50 mM, pH = 6,0, NaCl 0,1 M

Acetato amónico 50 mM, pH = 6,0, NaCl 0,2 M

Acetato amónico 50 mM, pH = 6,0, NaCl 0,3 M

Acetato amónico 50 mM, pH = 6,0, NaCl 0,4 M

Tris/Cl 50 mN, pH = 8,0, NaCl 1,0.

La mayoría de EPI-HNE-3 eluyó en dos fracciones de acetato amónico 50 mM, pH = 6,0. La fracción de NaCl 0,1 M contenía aproximadamente un 19% de la actividad de EPI-HNE-3 de entrada (28 mg de 159 mg de entrada) y esencialmente todas las formas mal procesadas de EPI-HNE-3. La fracción de NaCl 0,2 M contenía aproximadamente un 72% (114 mg) de la EPI-HNE-3 de entrada y estaba casi completamente libre de las formas mal procesadas de peso molecular más alto y otros contaminantes que absorben en UV. Las fracciones de la elución con acetato amónico 50 mM, pH = 6,0, NaCl 0,2 M que tenían las concentraciones más altas de EPI-HNE-3 se combinaron (95 mg).

Se realizó una precipitación con sulfato amónico en el eluido de la columna de intercambio iónico con NaCl 0,2 mM, pH = 6,0. Se añadieron 800 ml de sulfato amónico 3 M a 160 ml de solución eluida (concentración de sulfato amónico final = 2,5 M) y la mezcla se incubó a TA durante 18 horas. El material precipitado después se sedimentó por centrifugación a 10.000 x g durante 45 minutos. El fluido sobrenadante se desechó y el material sedimentado se disolvió en 100 ml de agua.

El sulfato amónico residual se retiró de la preparación de EPI-HNE-3 por cromatografía de intercambio iónico discontinua. El pH de la solución proteica se ajusto a 3,0 con HOAc diluido (1/10) y la solución después se aplicó a una columna Macroprep 50S de volumen del lecho de 10 ml que se había equilibrado con NaCitrato 10 mM, pH = 3,5. Después de la carga de la muestra, se lavó la columna con 100 ml de NaCitrato 10 mM, pH = 3,5 seguido por 100 ml de dH_{2}O. Se eluyó EPI-HNE-3 de la columna con 100 ml de NH_{4}CO_{3} 50 mM, pH = 9,0. Se combinaron las fracciones de pH 9 que tenían las concentraciones más altas de EPI-HNE-3 (60 mg) y se almacenaron a 4ºC durante 7 días antes de la liofilización.

El polvo proteico liofilizado se disolvió en 26 ml de dH_{2}O y la solución se pasó a través de un filtro de 0,2 \mu (Nº 4912, Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). La concentración del inhibidor activo en la solución madre final se descubrió que era 250 \muM (1,5 mg/ml). Esta solución madre (EPI-HNE-3, Lote 1) se ha almacenado en forma de alícuotas de 1 ml a -70ºC durante más de seis meses sin pérdida de actividad. EPI-HNE-3 almacenada en solución acuosa (sin ningún tampón) se deterioró cuando se mantuvo a 4ºC. Después de cinco meses, aproximadamente el 70% del material era activo con una K_{i} de aproximadamente 12 pM.

La Tabla 604 proporciona el rendimiento y pureza relativa de EPI-HNE-3 en diversas etapas del procedimiento de purificación. Existió una etapa de purificación principal en el primer procedimiento de cromatografía de intercambio iónico. La etapa de precipitación con sulfato amónico proporcionó sólo un pequeño grado de purificación adicional. Sucedió algo de pérdida de actividad inhibidora en la incubación a pH = 9 (Véanse datos de estabilidad a pH). La producción y purificación de EPI-HNE-1 y EPI-HNE-4 fueron análogas a las de EPI-HNE-2 y EPI-HNE-3.

Ejemplo 5 Análisis con tricina-PAGE de EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) y EPI-HNE-3

Se usó el sistema de gel de tricina de alta resolución de Schagger y Von Jagow (SCHA87) para analizar las proteínas purificadas producidas (vide supra). Para una buena resolución de las proteínas EPI-HNE de peso molecular bajo se usó una capa resolución al 16,5% con capas de separación al 10% y de concentración al 4%. Después de la tinción con plata, se inspeccionó el gel que tenía:

Carril 1: EPI-HNE-2 25 ng,

Carril 2: EPI-HNE-2 50 ng,

Carril 3: EPI-HNE-2 100 ng,

Carril 4: EPI-HNE-2 200 ng,

Carril 5: EPI-HNE-3 25 ng,

Carril 6: EPI-HNE-3 50 ng,

Carril 7: EPI-HNE-3 100 ng,

Carril 8: EPI-HNE-3 200 ng, y

Carril 9: Patrones de peso molecular: RPN 755, (Amersham Corporation, Arlington Heights, IL).

Las proteínas teñidas visibles en el gel y sus pesos moleculares en Dalton son: ovalbúmina (46.000), anhidrasa carbónica (30.000), inhibidor de tripsina (21.500), lisozima (14.300), y aprotinina (6.500). La cantidad de proteína cargada se determinó a partir de las medidas de inhibición de hNE. Se descubrieron la siguientes características: EPI-HNE-2, Lote 1 muestra una única banda de tinción del tamaño previsto (aprox. 6.700 D) en todas las cargas. De manera similar, EPI-HNE-3, Lote 1 muestra una única banda de tinción del tamaño previsto (aprox. 6.200 D). En la carga más alta, se pueden detectar rastros de la forma procesada de manera incorrecta de peso molecular más alto (aprox. 7.100 D). En base al análisis PAGE de alta resolución teñido con plata, se evalúa la pureza de ambas preparaciones proteicas como significativamente superiores al 95%.

IV. Propiedades de EPI-HNE-2 (ejemplo comparativo) y EPI-HNE-3 A. Inhibición de hNE Ejemplo 6 K_{p} medidas de proteínas EPI-HNE para hNE

Se determinaron las constantes de inhibición de las proteínas que reaccionan con hNE (K_{i}) usando medidas a TA de hidrólisis de un sustrato fluorogénico (N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-7-amino-4-metilcoumarina, Sigma M-9771) por hNE: Para estas medidas, se añadieron alícuotas de soluciones madre inhibidoras diluidas apropiadamente a soluciones de 2 ml de hNE 0,847 nM en tampón de reacción (Tris-Cl 50 mM, pH = 8,0, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM, Triton-x-100 al 0,25%) en cubetas de fluorescencia de plástico. Las reacciones se incubaron a TA durante 30 minutos. Al final del periodo de incubación, se añadió el sustrato fluorogénico a una concentración de 25 \muM y el transcurso del tiempo para el aumento en la fluorescencia a 470 nm (excitación a 380 nm) debido a que la escisión del sustrato enzimático se registró usando un espectrofluorímetro (Perkin-Elmer 650-15) y registrador de banda. No se corrigió la competición entre el sustrato y el inhibidor porque (S_{0}/K_{on}) es 0,07 (donde S_{0} es la concentración de sustrato y K_{m} es la constante de unión del sustrato a hNE). K_{i} esta relacionada con K_{aparente} por K_{i} = K_{aparente} x (1/(1+(S_{0}/K_{m}))). La corrección es pequeña en comparación con los posibles errores en K_{aparente}. Las velocidades de la escisión del sustrato enzimático se determinaron a partir de las pendientes lineales de los aumentos registrados en la fluorescencia. El porcentaje de actividad residual de hNE en presencia del inhibidor se calculó como un porcentaje de la velocidad de aumento de fluorescencia observada en presencia del inhibidor con respecto al observado cuando no estaba presente el inhibidor añadido.

Se registraron los datos usados para determinar K, para la reacción de EPI-HNE-2 y EPI-HNE-3 con hNE. Los datos obtenidos como se ha descrito anteriormente se registraron como un porcentaje de actividad residual representado como función de inhibidor añadido. Los valores para K_{i} y para la concentración de inhibidor activo para la solución madre se obtienen a partir de un programa de ajuste por mínimos cuadrados. A partir de los datos, se calcularon los valores K_{i} para EPI-HNE-2 y para EPI-HNE-3 que reaccionan con hNE a TA que fueron 4,8 pM y 6,2 pM, respectivamente. Las determinaciones de K_{i} para EPI-HNE-2 y EPI-HNE-3 que reaccionan con hNE se proporcionan en la Tabla 610 y en la Tabla 611.

La cinética de activación de la velocidad para los inhibidores que reaccionan con hNE (k_{\infty}) se determinó a partir de las medidas de la inhibición progresiva de la actividad hidrolítica del sustrato por hNE después de la adición del inhibidor. Para estos experimentos, se añadió una concentración conocida de inhibidor a una solución de hNE (0,847 nM) y sustrato (25 \muM) en 2 ml de tampón de reacción en una cubeta de fluorescencia de plástico. El cambio en la fluorescencia se registró de manera continua después de la adición del inhibidor. En estos experimentos, no aumentó linealmente la fluorescencia de la muestra con el tiempo. En su lugar, la velocidad de fluorescencia disminuyo a un ritmo constante reflejando el aumento de la inhibición de hNE por el inhibidor añadido. La velocidad enzimática a tiempos seleccionados después de la adición del inhibidor se determinó a partir de la pendiente de la tangente al transcurso del tiempo de la fluorescencia en ese momento.

La constante cinética k_{\infty} para EPI-HNE-2 que reacciona con hNE se determinó del siguiente modo. Se añadió EPI-HNE-2 a 1,3 nM al tampón que contenía hNE 0,867 nM (I:E = 1,5:1) a tiempo 0. Se registró el porcentaje de actividad residual medida como una función del tiempo después de la adición de inhibidor. Se usó un programa de ajuste por mínimos cuadrados para obtener el valor de k_{\infty} = 4,0 x 10^{6} M^{-1}s^{-1}.

La cinética de desactivación de la velocidad, k_{off}, se calcula a partir de los valores medidos de K_{i} y k_{\infty} como:

k_{off} = K_{D} \times k_{\infty}.

Los valores de dichas medidas se incluyen en la Tabla 602. Las proteínas EPI-HNE son inhibidores de hNE pequeños, de alta afinidad, de funcionamiento rápido.

B. Especificidad Ejemplo 7 Especificidad de proteínas EPI-HNE

Se intentó determinar las constantes de inhibición para proteínas EPI-HNE que reaccionan con varias serin proteasas. Los resultados se resumen en la Tabla 605. En todos los casos excepto para quimiotripsina, no fue posible observar ninguna inhibición incluso cuando se añadió inhibidor 10 a 100 \muM a la enzima a concentraciones en el intervalo nM. En la Tabla 605, los valores calculados para K, (para enzimas distintas de quimiotripsina) se basan en la suposición conservativa de menos de un 10% de la inhibición a las concentraciones más altas de inhibidor ensayado. Para quimiotripsina, la K, es aproximadamente 10 \muM y probablemente no es específica.

C. Estabilidad In Vitro Ejemplo 8 Resistencia a Inactivación Oxidativa

La Tabla 620 muestra medidas de la susceptibilidad de proteínas EPI-HNE a la inactivación oxidativa en comparación con la de dos inhibidores de hNE proteicos naturales: el Inhibidor de Proteasa \alpha1 (API) y el Inhibidor de la Proteasa de Leucocitos de Secreción (SLPI). API (10 \muM), SLPI (8,5 \muM), EPI-HNE-1 (5 \muM), EPI-HNE-2 (10 \muM), EPI-HNE-3 (10 \muM), y EPI-HNE-4 (10 \muM) se expusieron al agente oxidante potente, Cloramina-T, a las proporciones oxidante:inhibidor indicadas en tampón fosfato 50 mM, pH = 7,0 durante 20 minutos a TA. Al final del periodo de incubación, las reacciones de oxidación se inactivaron añadiendo metionina a una concentración final de 4 mM. Después de una incubación adicional de diez minutos, las reacciones inactivadas se diluyeron y se ensayaron para la actividad inhibidora residual en el ensayo de inhibición de hNE convencional.

Tanto API como SLPI se inactivaron por proporciones molares bajas de oxidante a inhibidor. Las proporciones molares Cloramina-T:proteína necesarias para una inhibición del 50% de API y SLPI son aproximadamente 1:1 y 2:1, respectivamente. Estas proporciones se corresponden bien con la presencia presentada de dos a cuatro restos de metionina fácilmente oxidados en API y SLPI, respectivamente. Por el contrario, las cuatro proteínas EPI-HNE mantienen la actividad de inhibición de hNE esencialmente completa después de la exposición a Cloramina-T a todas las proporciones molares ensayadas (hasta 50:1, en los casos de EPI-HNE-3 y EPI-HNE-4). Ni EPI-HNE-3 ni EPI-HNE-4 contienen ningún resto de metionina. Por el contrario, EPI-HNE-1 y EPI-HNE-2 contienen cada una dos restos de metionina (véase Tabla 100). La resistencia de estas proteínas a la inactivación oxidativa indica que los restos de metionina son inaccesibles al oxidante o están localizados en una región de la proteína que no interacciona con
hNE.

Ejemplo 9 Estabilidad al pH

La Tabla 612 demuestra los resultados de medidas de estabilidad al pH de proteínas EPI-HNE. La estabilidad de las proteínas a la exposición a condiciones de pH en el intervalo de pH 1 a pH 10 se evalúa manteniendo los inhibidores en tampones de pH definido a 37ºC durante 18 horas y determinando la actividad inhibidora de hNE residual en el ensayo de inhibición de hNE convencional. Las proteínas se incubaron a una concentración de 1 \muM. Los tampones mostrados en la Tabla 14 se formularon como se ha descrito (STOL90) y se usaron en los intervalos de pH
indicados:

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TABLA 14

Tampones usados en los estudios de estabilidad
Tampón	pH más bajo	pH más alto
Glicina-HCl	1	2,99
Citrato-Fosfato	3	7
Fosfato	7	8
Glicina-NaOH	8,5	10

Ambos inhibidores derivados de BPTI, EPI-HNE-1 y EPI-HNE-2, son estables a todos los valores de pH ensayados. EPI-HNE-3 y EPI-HNE-4, los inhibidores derivados del dominio tipo Kunitz de proteína humana, fueron estables cuando se incubaron a bajo pH, pero mostraron alguna pérdida de actividad a pH alto. Cuando se incubaron a 37ºC durante 18 horas a pH = 7,5, la preparación de EPI-HNE-3 perdió del 10% al 15% de inhibición de hNE. EPI-HNE-4 mantiene casi toda la actividad a pH 8,5. La actividad del inhibidor derivado de M-D2 disminuyó bruscamente a niveles de pH más altos de modo que a pH 10 sólo permaneció el 30% de la actividad original. La sensibilidad de EPI-HNE-3 a la incubación a pH alto probablemente explica la pérdida de actividad de la proteína en la etapa de purificación final indicada previamente.

Ejemplo 10 Estabilidad a la Temperatura

La estabilidad de proteínas EPI-HNE a temperaturas en el intervalo de 0ºC a 95ºC se evaluó incubando los inhibidores durante treinta minutos a diversas temperaturas y determinando la actividad inhibidora residual para hNE. En estos experimentos, las concentraciones proteicas fueron 1 \muM en tampón fosfato a pH = 7. Como se muestra en la Tabla 630, los cuatro inhibidores son bastante estables a la temperatura.

EPI-HNE-1 y EPI-HNE-2 mantienen toda la actividad a todas las temperaturas por debajo de aproximadamente 90ºC. EPI-HNE-3 y EPI-HNE-4 mantienen toda la actividad inhibidora cuando se incuban a temperaturas por debajo de 65ºC. La actividad de la proteína disminuye de algún modo a temperaturas más altas. Sin embargo, las tres proteínas mantienen más del 50% de la actividad incluso cuando se incuban a 95ºC durante 30 minutos.

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Ejemplo Comparativo 10

Vías a otras secuencias inhibidoras de hNE

La presente invención demuestra que inhibidores de hNE de afinidad muy alta pueden elaborarse a partir de dominios Kunitz de origen humano con muy pocas sustituciones de aminoácidos. Se cree que casi cualquier dominio Kunitz puede convertirse en un inhibidor de hNE potente y especifico con ocho o menos sustituciones. En particular, uno cualquiera de los dominios Kunitz humanos conocidos podrían remodelarse para proporcionar un inhibidor de hNE altamente estable, altamente potente, y altamente selectivo. Hay al menos tres vías para los dominios Kunitz inhibidores de hNE: 1) remplazamiento de segmentos que se sabe que están implicados en especificar la unión a hNE, 2) remplazamiento de restos únicos que se cree que son importantes para la unión a hNE, y 3) uso de bibliotecas de dominios Kunitz para seleccionar inhibidores de hNE.

Ejemplo Comparativo 11

Sustitución de Segmentos en Dominios Kunitz

La Tabla 100 muestra las secuencias de aminoácidos de 11 dominios Kunitz humanos. Estas secuencias se han roto en diez segmentos: 1: extremo N-terminal-resto 4; 2: resto 5; 3: 6-9 (o 9a); 4: 10-13; 5: 14; 6: 15-21; 7: 22-30; 8: 31-36; 8: 37-38; 9:39-42; y 10: 43-extremo C terminal (o 42a-extremo C terminal).

Los segmentos 1, 3, 5, 7, y 9 contienen restos que influyen fuertemente en las propiedades de unión de los dominios Kunitz y están doblemente subrayados en el dominio Kunitz Consenso de la Tabla 100. A diferencia del segmento 1, todos los segmentos tienen la misma longitud excepto para el Dominio 2 de TFPI-2 que lleva un resto adicional en el segmento 2 y dos restos adicionales en el segmento 10.

El segmento 1 está en el extremo amino terminal e influye en la unión afectando a la estabilidad y dinámica de la proteína. Los segmentos 3, 5, 7, y 9 contienen restos que contactan con serin proteasas cuando un dominio Kunitz se une en el sitio activo. La inhibición de hNE de alta afinidad requiere una molécula que sea altamente complementaria a hNE. Los segmentos 3, 5, 7, y 9 suministran los aminoácidos que contactan con la proteasa. Las secuencias de los segmentos 1, 3, 5, 7, y 9 deben funcionar juntos en el contexto proporcionado por los otros y otros segmentos. Sin embargo, se ha demostrado que muchas secuencias diferentes son capaces de una inhibición de hNE de alta
afinidad.

Puede ser deseable tener un inhibidor de hNE que sea altamente similar a una proteína humana para reducir la posibilidad de inmunogenicidad. Las secuencias de la proteína inhibidora de hNE de alta afinidad candidatas pueden obtenerse tomando un dominio Kunitz tipo aprotinina que inhiba fuertemente o muy fuertemente hNE, y remplazando uno, dos, tres, cuatro o todos los segmentos 2, 4, 6, 8, y 10 por el segmento correspondiente de un dominio Kunitz humano, tal como los enumerados en la Tabla 100, u otro dominio que se sepa que tiene inmunogenicidad relativamente baja en seres humanos. (Cada uno de los segmentos 2, 4, 6, 8, y 10 pueden tomarse del mismo dominio humano, o pueden tomarse de diferentes dominios humanos). Como alternativa, puede obtenerse un dominio que inhiba fuertemente hNE de inmunogenicidad reducida tomando uno de los dominios Kunitz tipo aprotinina humana y reemplazando uno, dos, tres o todos los segmentos 3, 5, 7 y 9 (y preferiblemente también el segmento 1) por el segmento correspondiente de uno o más dominios Kunitz tipo aprotinina que inhiben hNE fuertemente o muy fuertemente. Para producir estos inhibidores de hNE humanizados se puede, por supuesto, usar, en lugar de un segmento idéntico al de una de las proteínas fuente mencionadas anteriormente, una secuencia que difiere del segmento fuente nativo en una o más modificaciones conservativas. Dichas diferencias deben, por supuesto, tomarse en consideración debido a su posible efecto sobre la actividad inhibidora y/o inmunogenicidad. En algunos casos, puede ser ventajoso que el segmento sea un híbrido de los segmentos correspondientes de dos o más dominios humanos (en el caso de los segmentos 2, 4, 6, 8 y 10) o de dos o más dominios inhibidores de hNE fuertes o muy fuertes (en el caso de los segmentos 3, 5, 7, y 9). El segmento 1 puede corresponderse al segmento 1 de un inhibidor de hNE fuerte o muy fuerte, o el segmento 1 de un dominio Kunitz tipo aprotinina humana, o ser una quimera de los segmentos 1 de ambos.

Las proteínas DPI.1.1, DPI.2.1, DPI.3.1, DPI.4.1, DPI.5.1, DPI.6.3, DPI.7.1, DPI.8.1, y DPI.9.1 se diseñaron de este modo. DPI.1.1 se obtiene de App-I remplazando los segmentos 3, 5, 7, y 9 por los segmentos correspondientes de EPI-HNE-1. DPI.2.1 se obtiene de TFPI2-D1 remplazando los segmentos 3, 5, 7 y 9 por los restos correspondientes de EPI-HNE-1. DPI.3.1 se obtiene de TFPI2-D2 remplazando los restos 9a-21 por los restos 10-21 de EPI-HNE-4 y remplazando los restos 31-42b por los restos 31-42 de EPI-HNE-4. DPI.4.1 se obtiene de TFPI2-D3 remplazando los segmentos 3, 5, 7, y 9 por los restos correspondientes de MUTQE. DPI.5.1 se obtiene de LACI-D1 remplazando los segmentos 3, 5, 7, y 9 por los restos correspondientes de MUTQE. DPI.6.1 se obtiene de LACI-D2 remplazando los segmentos 3, 5, 7, y 9 por los restos correspondientes de MUTQE. DPI.7.1 se obtiene de LACI-D3 remplazando los segmentos 3, 5, 7, 9 por los restos correspondientes de EPI-HNE-4. DPI.8.1 se obtiene del dominio Kunitz del colágeno A3 por sustitución de los segmentos 3, 5, 7, y 9 de EPI-HIVE-4. DPI.9.1 se obtiene del dominio HKI B9 remplazando los segmentos 3, 5, 7, y 9 por los restos correspondientes de EPI-HNE-4.

Aunque las quimeras descritas anteriormente constituyen realizaciones preferidas de la presente invención, la invención no se limita a estas quimeras.

Ejemplo Comparativo 12

Sustituciones puntuales en Dominios Kunitz

En este ejemplo, se analizan ciertas mutaciones de sustitución.

Todas las secuencias proteicas mencionadas en este ejemplo se pueden encontrar en la Tabla 100. Los inhibidores de proteasa diseñados se denominan "DPI" y se obtienen de dominios Kunitz humanos (también enumerados en la Tabla 100). Cada una de las secuencias denominadas DPI.i.2 (para i = 1 a 9) se obtiene del dominio dos anterior a ella en la tabla haciendo mutaciones puntuales mínimas. Cada una de las secuencias denominadas DPI.i.3 (para i = 1 a 9) se obtienen de la secuencia tres anterior a ella por mutaciones más amplias pretendidas para aumentar la afinidad. Para algunos dominios parentales, se proporcionan ejemplos adicionales. Las secuencias denominadas DPI.i.1 se analizan en el Ejemplo 21.

Las posiciones mas importantes son 18 y 15. Cualquier dominio Kunitz tiene la probabilidad de llegar a ser un buen inhibidor de hNE si Val o Ile están en 15 (siendo preferido Ile) y Phe está en 18. (Sin embargo, estas características no son necesariamente requeridas para dicha actividad.)

Si un dominio Kunitz tiene Phe en 18 e Ile o Val en 15 y no es un buen inhibidor de hNE, puede haber uno o más restos en la superficie de contacto que evitan la unión apropiada.

Los dominios Kunitz que tienen afinidad muy alta por hNE descritos en este documento (como se enumera en la Tabla 100) no tienen grupos cargados en los restos 10, 12 a 19, 21, y 32 a 42. En la posición 11, sólo se han observado grupos neutros o cargados positivamente en inhibidores de hNE de afinidad muy alta. En la posición 31, sólo se han observado grupos neutros y cargados negativamente en inhibidores de hNE de alta afinidad. Si un dominio Kunitz parental tiene un grupo cargado en cualquiera de estas posiciones donde solo se han observado grupos neutros, entonces cada uno de los grupos cargados se cambia preferiblemente a un grupo no cargado extraído de las posibilidades de la Tabla 790 como la siguiente etapa en la mejora de la unión a hNE. De manera similar, lo grupos cargados negativamente en 11 y 19 y los grupos cargados positivamente en 31 se remplazan preferiblemente por grupos extraídos de la Tabla 790.

En la posición 10, se ven Tyr, Ser, y Val en inhibidores de hNE de alta afinidad. Pueden permitirse Asn o Ala ya que esta posición puede que no contacte con hNE. En la posición 11, se ha visto Thr, Ala, y Arg en inhibidores de hNE de alta afinidad. Gln y Pro son muy comunes en 11 en dominios Kunitz y pueden ser aceptables. La posición 12 casi siempre es Gly. Si 12 no es Gly, se intenta cambiar a Gly.

Todos los inhibidores de hNE de alta afinidad producidos de este modo tienen Pro_{13}, pero no se ha demostrado que esto sea necesario. Muchos dominios Kunitz (62,5%) tienen Pro_{13}. Si 13 no es Pro, entonces un cambio a Pro puede mejorar la afinidad por hNE. También pueden ser aceptables aquí Val, Ala, Leu, o Ile.

La posición 14 es Cys. Es posible producir dominios altamente similares a dominios Kunitz en los que se omite el disulfuro 14-38. Dichos dominios probablemente son menos estables que los dominios Kunitz verdaderos que tienen los tres disulfuros convencionales.

La posición 15 preferiblemente es Ile o Val. Es más preferido Ile.

La mayoría de los dominios Kunitz (82%) tienen Gly o Ala en 16 y esto puede ser bastante importante. Si el resto 16 no es Gly o Ala, se cambia 16 a Gly o Ala; se prefiere Ala. La posición 17 en inhibidores de hNE muy potentes tiene Phe o Met; los que tienen Ile o Leu en 17 son menos potentes. Se prefiere Phe. Debe usarse Met sólo si no es importante la resistencia a oxidación. La posición 18 es Phe.

Se ha demostrado que los inhibidores de hNE de alta afinidad pueden tener Pro o Ser en la posición 19. Puede permitirse Gln o Lys en la posición 19. En la posición 21, se ha visto Tyr y Trp en inhibidores de hNE de afinidad muy alta; puede también funcionar Phe.

En la posición 31, se ha observado Gln, Glu, y Val en inhibidores de hNE de alta afinidad. Como esta está en el extremo de la superficie del contacto de unión, es probable que otros tipos funcionen bien. Deben evitarse tipos básicos (Arg y Lys). En la posición 32, se han observado Thr y Leu en inhibidores de hNE de alta afinidad. Este resto puede que no haga contacto directo y pueden funcionar bien otros tipos no cargados. Es muy habitual Pro aquí. Se ha visto Ser y es similar a Thr. Se ha visto Ala en dominios Kunitz naturales y no es probable que produzca ningún conflicto. La posición 33 siempre es Phe en dominio Kunitz.

Parece que muchos tipos de aminoácidos pueden colocarse en la Posición 34 manteniendo la alta afinidad por hNE; no son favorables restos hidrófobos grandes (Phe, Trp, Tyr). Val y Pro son mucho más preferidos en 34. Las posiciones 35-38 contienen la secuencia Tyr-Gly-Gly-Cys. Hay poca diversidad en la posición 36 en dominios Kunitz naturales. En el complejo BPYI-Tripsina, cambiando Gly_{36} a Ser reduce enormemente la unión a tripsina. Sin embargo, S36 y T36 puede que no alteren la unión a hNE y podrían incluso mejorarla. Si el resto 36 no es Gly, debe considerarse cambiarlo a Gly.

La posición 39 parece ser tolerable a una diversidad de tipos. Se sabe que Met y Gly funcionan en inhibidores de afinidad muy alta. Ala o Gly son aceptables en la posición 40; se prefiere Gly. En la posición 41, Asn es hasta ahora el tipo más habitual en dominios Kunitz naturales y puede funcionar estabilizando los dominios. En la posición 42, se prefiere Gly, pero se permite Ala.

Finalmente, las posiciones que están altamente conservadas en dominios Kunitz pueden convertirse al tipo conservado si es necesario. Por ejemplo, las mutaciones X36G, X37G, X41N, y X12G pueden ser deseables en aquellos casos en los que aún no están estos aminoácidos en estas posiciones.

Las mutaciones anteriores se resumen en la Tabla 711. La Tabla 711 contiene, por ejemplo, mutaciones de la forma X15I que indica un cambio del resto en la posición 15 (cualquiera que sea) a Ile o lo deja igual si ya es Ile. Un dominio Kunitz que contiene la mutación X18F y X15I o X15V (X15I preferido) tendrá afinidad fuerte por hNE. Como de una hasta aproximadamente 8 de las mutaciones encontradas en la Tabla 711 están impuestas, la afinidad de la proteína por hNE aumentará de modo que K_{i} se aproxime al intervalo 1-5 pM.

La secuencia de DPI.1.2 se construyó a partir de la secuencia de App-I por los cambios R15I, I18F, y F34V y debe ser un inhibidor potente de hNE. DPI.1.3 probablemente es un inhibidor más potente, que tiene los cambios R15I, M17F (para evitar la sensibilidad a oxidación), I18F, P32T, F34V, y G39M.

DPI.2.2 se obtuvo de la secuencia de TFPI2-D1 por los cambios R15I, L18F, y L34V y debe ser un inhibidor potente de hNE. DPI.2.3 puede ser más potente debido a los cambios Y11T, R15I, L17F, L18F, R31Q, Q32T, L34V, y E39M.

DPI.3.2 se obtiene de TFPI2-D2 por los cambios E15I, T18F, S26A (para evitar la glicosilación), K32T, y F34V y debe ser un inhibidor potente de hNE. DPI.3.3 puede ser más potente porque tiene los cambios A9a, D11A, D12G, Q13P, E15I, S17F, T18F, E19K, K20R, N24A (para evitar la glicosilación), K32T, F34V, y \Delta42a-42b.

DPI.4.2 se obtiene de TFPI2-D3 por los cambios S15I, N17F y V18F y debe ser un inhibidor potente de hNE. DPI.4.3 puede ser más potente porque tiene los cambios E11T, L13P, S15I, N17F, V18F, A32T, T34V, y T36G.

DPI.5.2 se obtiene de LACI-D1 por lo cambios K15I y M18F y es probable que sea un inhibidor potente de hNE. DPI.5.3 puede ser más potente debido a los cambios D10Y, D11T, K15I, I17F, M18F, y E32T. Otros cambios que pueden mejorar DPI.5.3 incluyen F21W, I34W, E39M, y Q42G.

La secuencia de DPI.6.2 se construyó a partir de la secuencia LACI-D2 humano por las mutaciones R15V e I18F. El resto de la secuencia de LACI-D2 parece ser compatible con la unión a hNE. DPI.6.3 lleva dos mutaciones adicionales que lo hacen más parecido a los inhibidores de hNE descritos aquí: Y17F y K34V. Otras alteraciones que probablemente mejoran la unión a hNE de LACI-D2 incluyen I13P, R32T, y D10S. DPI.6.4 se obtiene de DPI.6.3 por la alteración adicional N25A que evitará la glicosilación cuando la proteína se produce en una célula eucariota. Otras sustituciones que podrían evitar la glicosilación incluyen: N25K, T27A, T27E, y N25S. DPI.6.5 se mueve adicionalmente hacia los derivados de ITI-D1, ITI-D2, y BPTI que se sabe que tienen afinidad por hNE en el intervalo 1-5 pM a través de las mutaciones I13P, R15V, Y17F, I18F, T19Q, N25A, K34V, y L39Q. En DPI.6.6, las mutaciones T19Q y N25A se han revertido. Por tanto, la proteína estaría glicosilada en levaduras u otras células eucariotas en N_{25}. DPI.6.7 lleva las alteraciones I13P, R15I, Y17F, I18F, T19P, K34V, y L39Q.

DPI.7.2 se obtiene del dominio LACI humano 3 por las mutaciones R15V y E18F. DPI.7.3 lleva las mutaciones R15V, N17F, E18F, y T46K. La mutación T46K debe evitar la glicosilación en N_{44}. DPI.7.4 lleva más mutaciones de modo que es mucho más similar a los inhibidores de hNE de alta afinidad conocidos. Las mutaciones son D10V, L13P, R15V, N17F, E18F, K34V, S36G, y T46K; DPI.7.5 lleva un conjunto diferente de alteraciones: L13P, R15I, N17F, E18F, N19P, F21W, R31Q, P32T, K34V, S36G, y T46K; DPI.7.5 no debe glicosilarse en células euca-
riotas.

DPI.8.2 se obtiene de la secuencia del dominio Kunitz del colágeno A3 por los cambios R15I, D16A, I18F, y W34V y se espera que sea un inhibidor potente de hNE. DPI.8.3 se obtiene del dominio Kunitz del colágeno A3 por los cambios T13P, R15I, D16A, I18F, K20R, y W34V.

DPI.9.2 se obtiene del dominio Kunitz de HKI B9 por los cambios Q15I, T16A, y M18F y se espera que sea un inhibidor potente de hNE. DPE.9.3 puede ser más potente debido a los cambios Q15I, T16A, M18F, T19P, E31V, y A34V.

Ejemplo Comparativo 13

Bibliotecas de dominios Kunitz

Otros dominios Kunitz que pueden inhibir hNE de manera potente pueden obtenerse de dominios Kunitz humanos por sustitución de secuencias inhibidoras de hNE en dominios humanos o usando los métodos del documento US 5.223.409 y patentes relacionadas. La Tabla 720 muestra un gen que provocará la presentación de LACI-D2 humano en M13 gIIIp; esencialmente el mismo gen podría usarse para conseguir la presentación en M13 gVIIIp u otras proteínas de anclaje (tales como proteínas de la superficie externa bacteriana (OSP)). La Tabla 275 muestra un gen que provoca la presentación de LACI-D1 humana.

La Tabla 730 y la Tabla 735 proporcionan variedades de LACI-D1 y LACI-D2, respectivamente. Cada una de estas está dividida en la variedad de los restos 10-21 en un segmento y los restos 31-42 en otro. En cada caso, el ADNvg apropiado se introduce en un vector que presenta la proteína parental y la biblioteca de fago de presentación se fracciona mediante la unión para inmovilizar hNE.

Tablas

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 30 Gen de fusión IIIsp::pbti::IIImadura(fragmento inicial)

La secuencia de ADN tiene SEC ID Nº: 001; La secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 002. El ADN es lineal y se muestra en las líneas que no empiezan con "!". El ADN que codifica III madura es idéntico al ADN encontrado en M13mp18. La secuencia de aminoácidos se procesa in vivo y se forman puentes disulfuro.

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 35 Gen de fusión IIIsp::itiD1::IIImadura

El ADN tiene SEC ID Nº: 003; la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 004.

El ADN es un segmento lineal y la secuencia de aminoácidos es una proteína que se procesa in vivo y que contiene bisulfuros.

3

TABLA 55

Clases de afinidad Inhibidores de hNE derivados de ITI-D1
Clase de afinidad	K_{D} estimado	Fracción de unión	pH de elución	Proteína
		de entrada	máximo
Suave	K_{D}>10 nM	<0,005%	>6.0	ITI-D1
Moderada	1 a 10 nM	0,01% a 0,03%	5,5 a 5,0	BITI ITI-D 1 E7
Fuerte	10 a 1000 pM	0,03% a 0,06%	5,0 a 4,5	BITI-E7
				BITI-E7-1222
				AMINO1
				AMINO2
				MUTP1
Muy fuerte	< 10 pM	>0,1%	\leq4,0	BJTI-E7-141
				MUTT26A
				MUTQE
				MUT1619

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TABLA 65

Definición de mutaciones de Clase A, B y C en el documento PCT/US92/01501.
Clases: A No es espera un efecto principal si la carga molecular permanece en el intervalo de -1 a +1
\hskip1cm B Efectos principales no esperados, pero son más probables que en "A".
\hskip1cm C Resto en la superficie de contacto de unión; cualquier cambio debe ensayarse.
\hskip1cm X No se permite ninguna sustitución
Id. Res.	EpiNEI	Sustituciones	Clases
1	R	cualquiera	A
2	P	cualquiera	A
3	D	cualquiera	A
4	F	Y, W, L	B
5	C	C	X
6	L	que no sea prolina	A
7	E	L, S, T, D, N, K, R	A
8	P	cualquiera	A
9	P	cualquiera	A
10	Y	preferiblemente que no sea prolina	B
11	T	cualquiera	C
12	G	Debe ser G	X
13	P	cualquiera	C
14	C	Se prefiere enormemente C, que no sea ninguno prolina	C
15	I	V, A	C
16	A		C
17	F	L, I, M, Y, W, H, V	C
18	F	Y, W, H	C
19	P	cualquiera	C
20	R	preferiblemente que no sea prolina	C
21	Y	F \textamp Y mucho más preferidos; W, I, L preferidos; M, V permitidos	C
22	F	Y \textamp F mucho más preferidos; se prefiere sin prolina Y, F	B
23	Y	Y \textamp F fuertemente preferidos; F, Y	B
24	N	Se prefiere ausencia de prolina	A

TABLA 65 (continuación)

Clases: A No es espera un efecto principal si la carga molecular permanece en el intervalo de -1 a +1
\hskip1cm B Efectos principales no esperados, pero son más probables que en "A".
\hskip1cm C Resto en la superficie de contacto de unión; cualquier cambio debe ensayarse.
\hskip1cm X No se permite ninguna sustitución
Id. Res.	EpiNEI	Sustituciones	Clases
25	A	cualquiera	A
26	K	cualquiera	A
27	A	cualquiera	A
28	G	preferiblemente que no sea prolina	A
29	L	preferiblemente que no sea prolina	A
30	C	Debe ser G	X
31	Q	preferiblemente que no sea prolina	B
32	T	preferiblemente que no sea prolina	B
33	F	F mucho más preferida; Y posible	X
34	V	cualquiera	C
35	Y	Y mucho más preferida; W preferida; F permitida	B
36	G	G mucho más preferida; S, A perferida;	C
37	G	debe ser G mientras que 38 sea C	X
38	C	C mucho más preferida	X
39	M	cualquiera	c
40	G	A, S, N, D, T, P	c
41	N	K, Q, S, D, R, T, A, E	c
42	G	cualquiera	c
43	N	debe ser N	X
44	N	S, K, R, T, Q, D, E	B
45	F	Y	B
46	K	cualquiera que no sea prolina	B
47	ST,	N, A, G	B
48	A	cualquiera	B
49	E	cualquiera	A
50	D	cualquiera	A
51	C	debe ser C	X
52	M	cualquiera	A
53	R	cualquiera	A
54	T	cualquiera	A
55	C	debe ser C	X
56	G	cualquiera	A
57	G	cualquiera	A
58	A	cualquiera	A
Posiciones preferidas para los preferidos

4

5

6

7

8

9

10

\newpage

Las secuencias enumeradas en la Tabla 100 que inhiben fuertemente hNE son EPI-HNE-1 (=EpiNE1), EPI-HNE-2, EpiNE7, EpiNE3, EpiNE6, EpiNE4, EpiNE8, EpiNE5, EpiNE2, BITI-E7-141, MUTT26A, MUTQE, MUT1619, ITI-D1E7, AMINO1, AMINO, MUTP1, y EPf-HNE-3, y EPI-HNE-4. Las secuencias enumeradas en la Tabla 100 que tienen alta probabilidad de inhibir fuertemente HEN son DPI. 1.1, DPI.1.2, DPI.1.3, DPI.2.1, DPI.2.2, DPI.2.3, DPI.3.1, DPI.3.2, DPI.3.3, DPI.4.1, DPI.4.2, DPI. 4.3, DPI.5.1, DPI.5.2, DPI.5.3, DPL6.1, DPI.6.2, DPI.6.3, DPI.6.4, DPI.6.5, DPI.6.6, DPI.6.7, DPI.7.1, DPI.7.2, DPI. 7.3, DPI.7.4, DPI.7.5, DPI.8.1, DPI.8.2, DPI.8.3, DPI.9.1, DPI.9.2, y DPI.9.3. Los dominios Kunitz humanos enumerados en la Tabla 100: ITI-D1, ITI-D2, App-I, TFPI2-D1, TFPI2-D2, TFPI2-D3, LACI-D1, LACI-D2, LACI-D3, dominio Kunitz de colágeno A3, y dominio HKI B9.

TABLA 111 Sitios de restricción en el plásmido pHIL-D2

pHIL-D2 93-01-02
Ngen = 8157
No-cortadores
AflII	ApaI	AscI	AvaI	AvrII	BaxnHI	BglII
Bspl20I	BsrGI	BssHII	BstEII	FaeI	MluI	NruI
Pad	PmlI	RsrII	SacII	SexAI	SfiI	SgfI
SnaBI	SpeI	Sse8387I	XhoI (PaeR7I)		XmaI (SmaI)

Cortadores
AatII GACGTc	1	5498
AflIII Acrygt	1	7746
AgeI Accggt	1	1009
BlpI GCtnagc	1	597
BspEI(BspMII,AccIII) Tccgga	1	3551
BspMI gcaggt	1	4140
Bst1107I GTAtac	1	7975
BstBI(AsuII) TTcgaa	1	945 4780
Bsu3 6I CCtnagg	1	1796
EC1136I GAGctc	1	216
EcoRI Gaatcc	1	956
EspI(BpullO2I) GCtnagc	1	597
HpaI GTTaac	1	1845
NcoI Ccatgg	1	3339
NdeI CAtatg	1	7924
NsiI(Ppu1OI) ATGCAt	1	684
PflMI CCANNNNntgg	1	196
PmeI GTTTaaac	1	420
PstI CTGCAg	1	6175
PvuI CGATcg	1	6049
SapI gaagagc	1	7863
SacI GAGCTc	1	216
SaiI Gtcgac	1	2885
SeaI AGTact	1	5938
SphI GCATGc	1	4436
StuI AGGcct	1	2968
SwaI ATTTaaat	1	6532
Tth111I GACNnngtc	1	7999
XbaI Tctaga	1	1741
XcmI CCANNNNNnnnntgg	1	711

Aoxl 5'	1 a aproximadamente 950
Aoxl 3''	950 a aproximadamente 1250
His4	1700 a aproximadamente 4200
Aoxl 3'	4500 a 5400
bla	5600 a 6400
fl ori	6500 a 6900

TABLA 212

Fraccionamiento del EpiNE-7 y el fago MA-ITI-D1 en perlas hNE
	EpiNE-7	MA-ITI-D1
	pfu	pfu/ENTRADA	pfu	pfu/ENTRADA
ENTRADA	3,3 \cdot 10^{9}	1,00	3,4 \cdot 10^{11}	1,00
Lavado con TBS-	3,8 \cdot 10^{5}	1,2 \cdot 10^{-4}	1,8 \cdot 10^{6}	5,3 \cdot 10^{-6}
TWEEN Final
pH	7,0	6,2 \cdot 10^{5}	1,8 \cdot 10^{-4}	1,6 \cdot 10^{6}	4,7 \cdot 10^{6}
	6,0	1,4 \cdot 10^{6}	4,1 \cdot 10^{-4}	1,0 \cdot10^{6}	2,9 \cdot 10^{-6}
	5,5	9,4 \cdot 10^{5}	2,8 \cdot 10^{-4}	1,6 \cdot 10^{6}	4,7 \cdot 10^{-6}
	5,0	9,5 \cdot 10^{5}	2,9 \cdot 10^{-4}	3,1 \cdot 10^{5}	9,1 \cdot 10^{-7}
	4,5	1,2 \cdot 10^{5}	3,5 \cdot 10^{-4}	1,2 \cdot 10^{5}	3,5 \cdot 10^{-7}
	4,0	1,6 \cdot 10^{6}	4,8 \cdot 10^{-4}	7,2 \cdot 10^{4}	2,1 \cdot 10^{-7}
	3,5	9,5 \cdot 10^{5}	2,9 \cdot 10^{-4}	4,9 \cdot 10^{4}	1,4 \cdot 10^{-7}
	3,0	6,6 \cdot 10^{5}	2,0 \cdot 10^{-4}	2,9 \cdot 10^{4}	8,5 \cdot 10^{-8}
	2,5	1,6 \cdot 10^{5}	4,8 \cdot 10^{-5}	1,4 \cdot 10^{4}	4,1 \cdot 10^{-8}
	2,0	3,0 \cdot 10^{5}	9,1 \cdot 10^{-5}	1,7 \cdot 10^{4}	5,0 \cdot 10^{-8}
SUMA		6,4 \cdot 10^{6}	3 \cdot 10^{-3}	5,7 \cdot 10^{6}	2 \cdot 10^{-5}
SUMA es la pfu total (o fracción de entrada) obtenida de todas las fracciones de elución por pH.

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TABLA 214

Fraccionamiento abreviado del fago de presentación en perlas hNE
	Fago de presentación
	EpiNE-7	MA-ITI-D1 2	MA-ITI-D1E7 1	MA-ITI-D1E7 2
ENTRADA	1,00	1,00	1,00	1,00
	(1,8x 10^{9})	(1,2 x10^{10})	(3,3x10^{9})	(1,1x10^{9})
Lavado	6 \cdot 10^{-5}	1 \cdot 10^{-5}	2 \cdot 10^{-5}	2 \cdot 10^{-5}
pH 7,0	3 \cdot 10^{-4}	1 \cdot 10^{-5}	2 \cdot 10^{-5}	4 \cdot 10^{-5}
pH 3,5	3 \cdot 10^{-3}	3 \cdot 10^{-6}	8 \cdot 10^{-5}	8 \cdot 10^{-5}
pH 2,0	1 \cdot 10^{-3}	1 \cdot 10^{6}	6 \cdot 10^{-6}	2 \cdot 10^{-5}
SUM	4,3 \cdot 10^{-3}	1,4 \cdot 10^{-5}	1,1 \cdot 10^{-4}	1,4 \cdot 10^{-4}
Cada entrada es la fracción de entrada obtenida en ese componente.
SUMA es la fracción total de pfu de entrada obtenida de todas las fracciones de elución por pH.

TABLA 215

Fraccionamiento del fago EpiNE-7 y MA-ITI-D1E7 en perlas hNE
	EpiNE-7		MA-ITI-D1E7
	pfu Total	Fracción	pfu Total	Fracción de
		de entrada		entrada
ENTRADA	1,8 \cdot 10^{9}	1,00	3,0109	1,00
pH 7,0	5,2 \cdot 10^{5}	2,9 \cdot 10^{-4}	6,4 \cdot 10^{4}	2,1 \cdot 10^{-5}
pH 6,0	6,4 \cdot 10^{5}	3,6 \cdot 10^{-4}	4,5 \cdot 10^{4}	1,5 \cdot 10^{-5}
pH 5,5	7,8 \cdot 10^{5}	4,3 \cdot 10^{-4}	5,0 \cdot 10^{4}	1,7 \cdot 10^{-5}
pH 5,0	8,4 \cdot 10^{5}	4,7 \cdot 10^{-4}	5,2 \cdot 10^{4}	1,7 \cdot 10^{-5}
pH 4,5	1,1 \cdot 10^{6}	6,1 \cdot 10^{-4}	4,4 \cdot 10^{4}	1,5 \cdot 10^{-5}
pH 4,0	1,7 \cdot 10^{6}	9,4 \cdot 10^{-4}	2,6 \cdot 10^{4}	8,7 \cdot 10^{-6}
pH 3,5	1,1 \cdot 10^{6}	6,1 \cdot 10^{-4}	1,3 \cdot 10^{4}	4,3 \cdot 10^{-6}
pH 3,0	3,8 \cdot 10^{5}	2,1 \cdot 10^{-4}	5,6 \cdot 10^{3}	1,9 \cdot 10^{-6}
pH 2,5	2,8 \cdot 10^{5}	1,6 \cdot 10^{-4}	4,9 \cdot 10^{3}	1,6 \cdot 10^{-6}
pH 2,0	2,9 \cdot 10^{5}	1,6 \cdot 10^{-4}	2,2 \cdot 10^{3}	7,3 \cdot 10^{-7}
SUM	7,6 \cdot10^{6}	4,1 \cdot 10^{-4}	3,1 \cdot 10^{5}	1,1 \cdot 10^{-4}
SUMA es la pfu total (o fracción de entrada) obtenida de todas las fracciones de elución por pH

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(Tabla pasa a página siguiente)

11

TABLA 217

Fraccionamiento de MA-BITI-E7 y MA-BITI-E7-1222 en perlas hNE
		MA-BITI-E7	MA-BITI-E7-1222
		pfu	pfu/ENTRADA	pfu	pfu/ENTRADA
ENTRADA	1,3 \cdot 10^{9}	1,00	1,2109	1,00
pH	7,0	4,7 \cdot 10^{4}	3,6 \cdot 10^{-5}	4,0 \cdot 10^{4}	3,3 \cdot 10^{-5}
	6,0	5,3 \cdot 10^{4}	4,1 \cdot 10^{-5}	5,5 \cdot 10^{4}	4,6 \cdot 10^{-5}
	5,5	7,1 \cdot 10^{4}	5,5 \cdot 10^{-5}	5,4 \cdot 10^{4}	4,5 \cdot 10^{-5}
	5,0	9,0 \cdot 10^{4}	6,9 \cdot 10^{-5}	6,7 \cdot 10^{4}	5,6 \cdot 10^{-5}
	4,5	6,2 \cdot 10^{4}	4,8 \cdot 10^{-5}	6,7 \cdot 10^{4}	5,6 \cdot 10^{-5}
	4,0	3,4 \cdot 10^{4}	2,6 \cdot 10^{-5}	2,7 \cdot 10^{4}	2,2 \cdot 10^{-5}
	3,5	1,8 \cdot 10^{4}	1,4 \cdot 10^{-5}	2,3 \cdot 10^{4}	1,9 \cdot 10^{-5}
	3,0	2,5 \cdot 10^{3}	1,9 \cdot 10^{-6}	6,3 \cdot 10^{3}	5,2 \cdot 10^{-6}
	2,5	<1,3 \cdot 10^{3}	<1,0 \cdot 10^{-6}	<1,3 \cdot 10^{3}	< 1,0 \cdot 10^{-6}
	2,0	1,3 \cdot 10^{3}	1,0 \cdot 10^{-6}	1,3 \cdot 10^{3}	1,0 \cdot 10^{-6}
SUMA	3,8 \cdot 10^{5}	2,9 \cdot 10^{-4}	3,4 \cdot 10^{5}	2,8 \cdot 10^{-4}
SUMA es la pfu total (o fracción de entrada) obtenida de todas las fracciones de elución por pH.

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TABLA 218

Fraccionamiento de MA-EpiNE7 y MA-BITI-E7-141 en perlas hNE
		MA-EpiNE7	MA-BITI-E7-141
		pfu	pfu/ENTRADA	pfu	pfu/ENTRADA
ENTRADA	6,1 \cdot 10^{8}	1,00	2,0 \cdot 109	1,00
pH	7,0	5,3 \cdot 10^{4}	8,7 \cdot 10^{-5}	4,5 \cdot 10^{5}	2,2 \cdot 10^{-4}
	6,0	9,7 \cdot 10^{4}	1,6 \cdot 10^{-4}	4,4 \cdot 10^{5}	2,2 \cdot 10^{-4}
	5,5	1,1 \cdot 10^{5}	1,8 \cdot 10^{-4}	4,4 \cdot 10^{5}	2,2 \cdot 10^{-4}
	5,0	1,4 \cdot 10^{5}	2,3 \cdot 10^{-4}	7,2 \cdot 10^{5}	3,6 \cdot 10^{-4}
	4,5	1,0 \cdot 10^{5}	1,6 \cdot 10^{-4}	1,3 \cdot 10^{6}	6,5 \cdot 10^{-4}
	4,0	2,0 \cdot 10^{5}	3,3 \cdot 10^{-4}	1,1 \cdot 10^{6}	5,5 \cdot 10^{-4}
	3,5	9,7 \cdot 10^{4}	1,6 \cdot 10^{-4}	5,9 \cdot 10^{5}	3,0 \cdot 10^{-4}
	3,0	3,8 \cdot 10^{4}	6,2 \cdot 10^{-5}	2,3 \cdot 10^{5}	1,2 \cdot 10^{-4}
	2,5	1,3 \cdot 10^{4}	2,1 \cdot 10^{-5}	1,2 \cdot 10^{5}	6,0 \cdot 10^{-5}
	2,0	1,6 \cdot 10^{4}	2,6 \cdot 10^{-5}	1,0 \cdot 10^{5}	5,0 \cdot 10^{-5}
SUMA	8,6 \cdot 10^{5}	1,4 \cdot 10^{-3}	5,5 \cdot 10^{6}	2,8 \cdot 10^{-3}
SUMA es la pfu total (o fracción de entrada) obtenida de todas las fracciones de elución por pH.

TABLA 219

Análisis de elución por pH de la unión de nHE por un fago que presenta una variedad de BITI-E7-141
Proteína	Entrada	Fracción de entrada	Recuperación
presentada		recuperada a pH
	PFU (x 10^{9})	pH 7,0	pH 3,5 x 10^{-4}	pH 2,0 x 10^{-4}	Total x 10^{-4}	Relativo
AMIN01 (EE)	0,96	0,24	2,3	0,35	2,9	0,11
AMINO2 (AE)	6,1	0,57	2,1	0,45	3,1	0,12
BITI-E7-1222 (EE)	1,2	0,72	4,0	0,64	5,4	0,21
EpiNE7 (EE)	0,72	0,44	6,4	2,2	9,0	0,35
MUTP1 (AE)	3,9	1,8	9,2	1,2	12,0	0,46
MUT1619(EE)	0,78	0,82	9,9	0,84	12,0	0,46
MUTQE (AE)	4,7	1,2	16,	5,3	22,0	0,85
MUTT26A (EE)	0,51	2,5	19,0	3,3	25,0	0,96
BITI-E7-141 (AE)	1,7	2,2	18,0	5,4	26,0	1,00
BITI-E7-141 (EE)	0,75	2,1	21,	3,2	26,0	1,00
Notas:
EE protocolo de elución por pH ampliado
AE protocolo de elución por pH abreviado
Total fracción total de entrada = Suma de fracciones recogidas a pH 7,0, pH 3,5 y pH 2,0
Relativo Fracción total de entrada recuperada dividida por la fracción total de entrada recuperada para
BITI-E7-141

\newpage

TABLA 250 Plásmido pHIL-D2 SEC ID Nº: 070

8157 pares de bases. Se muestra solo una cadena, pero el ADN existe como ADN circular de cadena doble in vivo.

12

\newpage

TABLA 250 (continuación)

13

\newpage

TABLA 250 (continuación)

14

\newpage

TABLA 250 (continuación)

15

\newpage

TABLA 250 (continuación)

16

\newpage

TABLA 251 pHIL-D2 (MF\alphaPrePro::EPI-HNE-3) 8584 p.b

El ADN tiene SEC ID Nº: 071; El polipéptido codificado tiene SEC ID Nº: 072. El ADN es circular y de doble cadena, se muestra sólo una cadena. Se muestra la traducción de la proteína a expresar.

17

\newpage

TABLA 251 (continuación)

18

\newpage

TABLA 251 (continuación)

19

\newpage

TABLA 251 (continuación)

20

\newpage

TABLA 251 (continuación)

21

\newpage

TABLA 251 (continuación)

22

\newpage

TABLA 251 (continuación)

23

\newpage

TABLA 252 Casete BstBI-AatII para la expresión de EPI-HNE-4

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El ADN tiene SEC ID Nº: 073; la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 074

24

El ADN es un fragmento lineal que es de doble cadena in vivo, solo se muestra una cadena. La secuencia de aminoácidos es la de una proteína que contiene disulfuro que se procesa in vivo.

TABLA 253 pD2pick (MF\alphaPrePro::EPI-HNE-3), 8590 pb, ADNds CIRCULAR, una cadena mostrada. pD2pick (MF\alphaPrePro::EPI-HNE-3) El ADN tiene SEC ID Nº: 075. La proteína codificada tiene SEC ID Nº: 076

25

\newpage

TABLA 253 (continuación)

26

\newpage

TABLA 253 (continuación)

27

\newpage

TABLA 253 (continuación)

28

\newpage

TABLA 253 (continuación)

29

\newpage

TABLA 253 (continuación)

30

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TABLA 254 Mapa de restricción de pD2pick (MF\alphaPrePro::EPI-HNE-3)

\vskip1.000000\baselineskip

No cortadores

31

Cortadores, 3 o menos sitios

32

TABLA 400 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de ITI (SEC ID Nº: 077)

33

ITI-D_{1} comprende los restos 22-76 y opcionalmente uno de los restos 77, restos 77 y 78, o restos 77-79. ITI-D2 comprende los restos 88-135 y opcionalmente uno de los restos 79 o restos 78-79.

Las líneas bajo las secuencias representan disulfuros.

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TABLA 602

Propiedades físicas de inhibidores de hNE derivados de dominios Kunitz
Proteína	Parental	Nº de restos	Peso mol	pI previsto	K_{D} (pM)	k_{on} (10^{6}/M/s)	k_{off} (10^{-6}/s)
EPI-	BPTI	58	6359	9,10	2,0	3,7	7,4
HNE-1
EPI-	BPTI	62	6759	4,89	4,9	4,0	20,
HNE-2
EPI-	ITI-D2	56	6179	10,04	6,2	8,0	50,
HNE-3
EPI-	ITI-D2	56	6237	9,73	4,6	10,6	49,
HNE-4
las constantes K_{D} y k_{on} anteriores se midieron con [hNE] = 8,47 x 10^{-10} molar; k_{off} se calculó a partir de
k_{off} = K_{D} x k_{on}.

TABLA 603

Resumen de la purificación de EPI-HNE-2
Fase	Volumen (ml)	Concentración (mg/ml)	Total (mg)	Actividad (mg/A_{280})
Recogida	3,300	0,70	2,31	< 0,01
Filtrado de ultra-	5,000	0,27	1,40	< 0,01
filtración 30K
Retenido de	1,000	1,20	1,20	0,63
ultrafiltración 5K
Precipitado con	300	2,42	0,73	1,05
sulfato amónico
Eluido IEX pH6,2	98	6,88	0,67	1,03
EPI-HNE-2, LOTE 1	50	13,5	0,68	1,04

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 604

Resumen de la purificación de EPI-HNE-3
Fase	Volumen (ml)	Concentración (mg/ml)	Total (mg)	Actividad (mg/A_{280})
Recogida	3,100	0,085	263	nd
Filtrado de ultra-	3,260	0,055	179	0,007
filtración 30K
Primer diluido:	180	0,52	94	0,59
pH6,2
Precipitado con	100	0,75	75	0,59
sulfato amónico
Eluido IEX pH9	60	1,01	60	0,59
EPI-HNE-3, LOTE 1	26	1,54	40	0,45

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TABLA 605

Valores K_{1} de proteínas HNE para diversas serin proteasas de suero humano
	Inhibidor
Enzima	EPI-HNE-1	EPI-HNE-2	EPI-HNE-3	EPI-HNE-4
Elastasa de Neutrófilos Humanos	2 pM	5 pM	6 pM	5 pM
Plasmina de Suero Humano	> 6 \muM	> 100 \muM	> 100 \muM	> 90 \muM
Calicreina de Suero Humano	> 10 \muM	> 100 \muM	> 100 \muM	> 90 \muM
Trombina de Suero Humano	> 90 \muM	> 100 \muM	> 100 \muM	> 90 \muM
Uroquinasa de Orina Humana	>90 \muM	> 100 \muM	> 100 \muM	> 90 \muM
Factor X_{a} de Plasma Humano	> 90 \muM	> 100 \muM	> 100 \muM	> 90 \muM
Quimiotripsina pancreática Humana	\sim10 \muM	\sim10 \muM	\sim30 \muM	\sim10 \muM

TABLA 607

PEY-33 que produce EPI-HNE-3
Transcurso de Tiempo	Densidad Celular (A_{600})	Actividad en el
de Fermentación		sobrenadante (mg/ml)
Horas:minutos
41:09	89	28
43:08	89	57
51:54	95	92
57:05	120	140
62:43	140	245
74:45	160	360
87:56	170	473
98:13	190	656
102:25	200	678
109:58	230	710

El crecimiento del cultivo en fermentación y la secreción de proteína EPI-HNE por cepas PEY-33 de P. pastoris. El transcurso del tiempo se muestra para los cultivos de fermentación después del inicio de la fase de crecimiento por suministro limitado de metanol. El aumento en la masa celular se estima por A_{600}. La concentración de proteína inhibidora en el medio de cultivo de fermentación se determinó a partir de las medidas de inhibición de HNE por alícuotas diluidas de CM libre de células obtenido en los tiempos indicados y almacenadas a -20ºC hasta el ensayo.

TABLA 608

PEY-43 que produce EPI-HNE-3
Transcurso de Tiempo	Densidad Celular (A_{600})	Actividad en el
de Fermentación		sobrenadante (mg/ml)
Horas:minutos
44:30	107	0,63
50:24	70	9,4
52:00	117	14.
62:00	131	28.
76:00	147	39.
86:34	200	56.
100:27	185	70.
113:06	207	85.

El crecimiento del cultivo de fermentación y la secreción de proteína EPI-HNE por cepas PEY-43 de P. pastoris. El transcurso del tiempo se muestra para los cultivos de fermentación después del inicio de la fase de crecimiento por suministro limitado de metanol. El aumento en la masa celular se estima por A_{600}. La concentración de proteína inhibidora en el CM fermentador se determinó por ensayos de la inhibición de HNE por alícuotas diluidas de CM libre de células obtenido en los tiempos indicados y almacenadas a -20C hasta el ensayo.

TABLA 610

Propiedades inhibidoras de EPI-HNE-2
\mul de solución de EPI-HNE-2 añadidos	Porcentaje residual de actividad hNE
0,0	101,1
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	98,9
10,0	82,9
20,0	71,8
30,0	59,5
40,0	46,2
50,0	39,2
55,0	32,2
60,0	22,5
65,0	23,5
70,0	15,0
75,0	10,4
80,0	8,6
85,0	4,8
90,0	1,4
95,0	2,0
100,0	2,5
120,0	0,2
150,0	0,2
200,0	0,04

TABLA 611

Propiedades inhibidoras de EPI-HNE-3
\mul de solución de EPI-HNE-3 añadidos	Porcentaje residual de actividad hNE
0,0	101,2
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	100,0
0,0	98,8
10,0	81,6
20,0	66,9
30,0	53,4
40,0	38,0
50,0	27,6
55,0	21,5
60,0	13,0
65,0	11,0
70,0	7,9
75,0	3,8
80,0	3,3
85,0	2,1
90,0	1,8
100,0	1,6
110,0	0,8
120,0	0,7
160,0	0,6
200,0	0,2

TABLA 612

Estabilidad al pH de inhibidores de hNE con dominio Kinitz
pH de incubación	Porcentaje residual de actividad inhibidora de hNE
	EPI-HNE-1	EPI-HNE-2	EPI-HNE-3	EPI-HNE-4
1,0	102	98	97	98
2,0	100	97	97	100
2,6	101
3,0	100	101	100	96
4,0	98	101	102	94
5,0	100
5,5		99	99	109
6,0	100		103	99
6,5			99	100
7,0	93	103	103	93
7,5			87	109
8,0	96		84	83
8,5		104	68	86
9,4	100		44	40
10,0	98	102	27	34

Las proteínas se incubaron a 37ºC durante 18 horas en tampones de pH definido (véase el texto). En todos los casos las concentraciones de proteína fueron 1 \muM. Al final del periodo de incubación, se diluyeron alícuotas de las reacciones y se determinó la actividad de inhibición de hNE residual.

TABLA 620

Estabilidad de las proteínas inhibidoras de hNE a la oxidación por Cloramina-T
Tabla 620	Porcentaje residual de actividad inhibidora de hNE
Proporción molar	EPI-	EPI-	EPI-	EPI-	anti	SLPI
CHL-T: Inhibidor	HNE-1	HNE-2	HNE-3	HNE-4	tripsina \alpha1
0	100	100	100	100	100	100
0,25		94
0,29						93
0,30					97
0,48	102
0,50		102	97	100	85
0,59						82

TABLA 620 (continuación)

Tabla 620	Porcentaje residual de actividad inhibidora de hNE
Proporción molar	EPI-	EPI-	EPI-	EPI-	anti	SLPI
CHL-T: Inhibidor	HNE-1	HNE-2	HNE-3	HNE-4	tripsina \alpha1
0,88						73
0,95	100
1,0		102	97	100	41
1,2						65
1,4	98
1,5		95
1,9	102
2,0		102
2,1					7
2,4						48
3,0			97	100
3,8	94
4,0		95
5,0			94	100
5,2					7
5,9						18
9,5	95
10,		98	97	104
10,4					>5
12,0						15
19,0	92
30,0			100	100
50,0			94	100

Los inhibidores se incubaron en presencia de Cloramina-T a las proporciones molares indicadas durante 20 minutos a TA. Las reacciones de oxidación se inactivaron añadiendo metionina a una concentración molar de y mM. La actividad de de inhibición de hNE residual que permanece en las reacciones inactivadas se muestra como un porcentaje de la actividad observada sin oxidante añadido. Las proteínas y concentraciones en las reacciones de oxidación son: EPI-HNE-1, (5 \muM); EPI-HNE-2, (10 \muM); EPI-HNE-3,(10 \muM); EPI-HNE-4, (10 \muM); API, (10 \mumM); y SLPI,
(8,5 \muM).

TABLA 630

Estabilidad a la temperatura de proteínas EPI-HNE
	Actividad inhibidora de hNE residual
Temperatura (ºC)	EP1-HNE-1	EPI-HNE-2	EPI-HNE-3	EPI-HNE-4
0	97	101	96	100
23	100	103	105	103
37	100	97	99	98
45	103
52		101	100
55	99			98
65	94	95	87
69				82
75	100
80		101	79
85	106			63
93		88	57
95	64			48

Las proteínas se incubaron a una temperatura establecida durante 18 horas en tampón a pH 7,0. En todos los casos, las concentraciones de proteína fueron 1 \muM. Al final del periodo de incubación, se diluyeron alícuotas de las reacciones y se determinó la actividad de de inhibición de hNE residual.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 711 Mutaciones que probablemente mejoran la afinidad de un dominio Kunitz por hHE

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Mucho más preferidas

X18F;

[X15(preferido),X15V];

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Altamente preferidas

[X16A(Preferida), X16G];

[X17F(preferida), X17M, X17L, X17I, X17L];

[{X19P, X19S}(igualmente preferida), X19K, X19Q];

X37G;

X12G;

Preferidas

X13P;

X20R;

X21Y; X21W;

[X34V(preferida), X34P];

[X39Q, X39M];

[X32T, X32L];

[X31Q, X31E, X31V];

[X11T, X11A, X11R];

[X10Y, X10S, X10V];

[X40G, X40A];

X36G;

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 720 M13_III_señal::LACI-D2_Humano::M13_III_madura

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El ADN tiene SEC ID Nº: 078, la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 079.

El ADN es lineal y es de doble cadena in vivo.

La secuencia de aminoácidos es de una proteína que se procesa in vivo por escisión después de Ala_{1}; el gen completo codifica una secuencia de aminoácidos que continúa para proporcionar una proteína M13 III funcional.

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34

ALA_{101} es el primer resto de M13 III madura.

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TABLA 725 laci-d1 sintético con sitios para clonación en el vector de presentación

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El ADN tiene SEC ID Nº: 080, la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 081

35

Ala_{101} es el primer resto de M13 III madura.

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TABLA 730 Biblioteca de hNE LACI-D1

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El ADN tiene SEC ID Nº: 082, la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 083

36

La variegación en 10, 11, 13, 15, 16, 17, 19 y 20 da lugar a 253.400 secuencias de aminoácidos y 589824 secuencias de ADN. La variegación en 31, 32, 34, 39, 40 y 42 proporciona 23.328 secuencias de aminoácidos y de ADN. Hay aproximadamente 5,9 x 10^{9} secuencias proteicas y 1,4 x 10^{10} secuencias de ADN.

Ala_{101} sería el primer resto de M13 III madura.

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TABLA 735 Biblioteca de hNE LACI-D2

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El ADN tiene SEC ID Nº: 084, la secuencia de aminoácidos tiene SEC ID Nº: 085

37

6,37 x 10^{10} secuencias de aminoácidos; 1,238 x 10^{11} secuencias de ADN.

TABLA 790

Aminoácidos preferidos en los dominios Kunitz que inhiben hNE
Posición	Aminoácidos permitidos
5	C
10	YSV, (NA)
11	TAR, (QP)
12	G
13	P,(VALI)
14	C
15	IV
16	AG
17	FM,ILV(A)
18	F
19	PS, QK
20	R
21	YW,(F)
30	C
31	QEV, (AL)
32	TL, (PSA)
33	F
34	VP
35	Y
36	G
37	G
38	C
39	MQ
40	G, A
41	N altamente preferido
42	G preferido, A permitido
45	F
51	C
55	C

Menciones

ALBR83a: Albrecht et al., Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983), 364:1697-1702.

ALBR83b: Albrecht et al., Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem (1983), 364:1703-1708.

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Claims (12)

1. Una proteína que comprende un dominio Kunitz en el que la secuencia polipeptídica de parte del dominio Kunitz de la proteína es la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº 26 (EPI-HNE-3) o SEC ID Nº 27 (EPI-HNE-4).

2. La proteína de la reivindicación 1 que tiene la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº 26 (EPI-HNE-3) o SEC ID Nº 27 (EPI-HNE-4).

3. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia polipeptídica es la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº 27 (EPI-HNE-4).

4. La proteína de las reivindicaciones 1 a 3 en forma purificada.

5. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína de la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión que comprende una secuencia codificante de ADN que codifica la proteína de la reivindicación 1, estando dicha secuencia codificante unida de manera operativa a secuencias de ADN reguladoras por las que dicha secuencia codificante puede expresarse para producir dicha proteína en un hospedador adecuado.

7. Una célula transformada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 6, produciendo dicha célula dicha proteína en condiciones que conducen a la expresión de dicha secuencia codificante bajo el control de dichas secuencias reguladoras.

8. Un método para producir una proteína con actividad inhibidora frente a elastasa de neutrófilos humana, que comprende cultivar la célula transformada de la reivindicación 7 bajo condiciones que conducen a la expresión de dicha secuencia codificante, por las que dicha proteína se produce por dicha célula.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la célula es una célula de Pichia pastoris.

10. Una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una forma farmacéuticamente aceptable.

11. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. La proteína de acuerdo con la reivindicación 10 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso en medicina.