DE69533544T2

DE69533544T2 - Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten

Info

Publication number: DE69533544T2
Application number: DE69533544T
Authority: DE
Inventors: William Markland; Charles Robert LADNER
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1994-01-11
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2015-01-12
Also published as: US6071723A; US6010880A; US6423498B1; US20030165896A1; ATE529444T1; PT737207E; EP1489097B1; JP2013249302A; US8431359B2; US20110152193A1; CA2180954C; EP0737207B1; DK0737207T3; JP2012111779A; EP0737207A1; ATE277081T1; US6103499A; CA2180954A1; JPH09509048A; PT1489097E

Description

Hintergrund der Erfindung
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf neue Mutanten der ersten Kunitzdomäne (K₁) des humanen Lipoprotein-assoziierten Gerinnungsinhibitors LACI, die Plasmin inhibieren. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf andere modifizierte Kunitz-Domänen, die Plasmin inhibieren, und auf andere Plasmininhibitoren.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Der hauptsächlich verantwortliche Wirkstoff fair die Fibrinolyse ist Plasmin, die aktivierte Form von Plasminogen. Viele Substanzen können Plasminogen aktivieren, einschließlich aktivierter Hageman-Faktor, Streptokinase, Urokinase (uPA), Gewebe-Plasminogenaktivator (tPA) und Plasmakallikrein (pKA). pKA ist sowohl ein Aktivator der Zymogenform der Urokinase als auch ein direkter Plasminogenaktivator.
Plasmin ist in normalem zirkulierendem Blut nicht nachweisbar, aber Plasminogen, das Zymogen, ist mit in etwa 3 μM anwesend. Eine zusätzliche, nicht gemessene Menge von Plasminogen ist an Fibrin und andere Komponenten der extrazellulären Matrix und Zelloberflächen gebunden. Normales Blut enthält den physiologischen Inhibitor von Plasmin, α₂-Plasmininhibitor (α₂-PI) mit in etwa 2 μM. Plasmin und α₂-PI bilden einen 1:1-Komplex. Matrix- oder zellgebundenes Plasmin ist für die Inhibierung durch α₂-PI relativ unzugänglich. Somit kann die Aktivierung von Plasmin die neutralisierende Kapazität von α₂-PI überschreiten, was zu einem profibrinolytischen Zustand führt.
Einmal gebildetes Plasmin:

i. baut Fibrinklumpen ab, manchmal vorzeitig;
ii. verdaut Fibrinogen (das Baumaterial von Klumpen), wobei es die Homöostase behindert, indem es die Bildung von bröckeligen, leicht zu lysierenden Klumpen aus den Abbauprodukten, sowie die Inhibierung der Blutplättchenadhäsion/aggregation durch die Fibrinogen-Abbauprodukte verursacht;
iii. interagiert direkt mit Blutplättchen, um die Glykoproteine Ib und IIb/IIIa zu spalten, wobei es die Adhäsion an verletztes Endothel in Gebieten mit einem Blutfluss mit hohen Scherkräften verhindert und die Aggregationsantwort beeinträchtigt, die für die Blutplättchenpfropfen-Bildung (ADEL86) erforderlich ist;
iv. inaktiviert proteolytisch Enzyme des extrinsischen Gerinnungs-Signalwegs, wobei es einen prolytischen Zustand weiter fördert.

Robbins (ROBB87) haben das Plasminogen-Plasmin-System im Einzelnen in einem Übersichtsartikel dargestellt. ROBB87 und die darin zitierten Literaturstellen sind hierin durch Verweis einbezogen.
FIBRINOLYSE UND FIBRINOGENOLYSE
Eine nicht-angemessene Fibrinolyse und Fibrinogenolyse, die zu übermäßiger Blutung führt, ist eine häufige Komplikation chirurgischer Verfahren, die eine extrakorporale Zirkulation erfordern, wie z.B. kardiopulmonaler Bypass, und tritt auch bei der thrombolytischen Therapie und der Organtransplantation, insbesondere der Leber, auf. Andere klinische Zustände, die durch ein häufiges Auftreten einer Blutungsdiatese gekennzeichnet sind, schließen Leberzirrhose, Amyloidose, akute Promyelozytenleukämie und feste Tumoren ein. Die Wiederherstellung der Homöostase erfordert die Infusion von Plasma und/oder Plasmaprodukten, was mit den Risiken einer immunologischen Reaktion und der Pathogenexponierung, z.B. an Hepatitisvirus und HIV, verbunden ist.
Sehr hohe Blutverluste können einer Resolution auch bei massiven Infusionen widerstehen. Wenn die Blutung als lebensbedrohlich eingestuft wird, wird sie mit Antifibrinolytika, wie z.B. ε-Aminocapronsäure (siehe HOOV93) (EACA), Tranexamsäure oder Aprotinin (NEUH89) behandelt. Aprotinin ist auch als Trasylol^TM und als Boviner Pankreatischer Trypsininhibitor (BPTI) bekannt. Im Folgenden wird Aprotinin hierin als „BPTI" bezeichnet. EACA und Tranexamsäure verhindern lediglich, dass Plasmin Fibrin bindet, indem es an die Kringles bindet, somit verbleibt Plasmin als freie Protease im Plasma. BPTI ist ein direkter Inhibitor von Plasmin und ist der wirksamste dieser Wirkstoffe. Auf Grund des Potentials für thrombotische Komplikationen, Nierentoxizität und im Falle von BPTI Immunogenität werden diese Wirkstoffe mit Vorsicht verwendet und gewöhnlich als „letztes Mittel" (PUTT89) zurückgehalten. Allen drei antifibrinolytischen Wirkstoffen mangelt es an Zielspezifität und Affinität, und sie interagieren mit Geweben und Organen mittels nicht charakterisierter metabolischer Stoffwechselwege. Die auf Grund der geringen Affinität erforderlichen hohen Dosen, die Nebenwirkungen auf Grund des Mangels an Spezifität und das Potential für Immunreaktionen, sowie für Organ/Gewebetoxizität kommen zusammen gegen die prophylaktische Verwendung dieser Antifibrinolytika zur Verhinderung von Blutungen oder als postoperative Routinetherapie, um eine Transfusionstherapie zu verhindern oder zu verringern. Somit besteht ein Bedarf an einem sicheren Antifibrinolytikum. Die essentiellen Eigenschaften solch eines Wirkstoffs sind:

i. Neutralisierung relevanter fibrinolytischer Zielenzym(e);
ii. hochaffine Bindung an Zielenzyme, um die Dosis zu minimieren;
iii. hohe Spezifität für das Ziel, um die Nebenwirkungen zu verringern; und
iv. hoher Grad der Ähnlichkeit zu humanem Protein, um eine mögliche Immunogenität und Organ-/Gewebetoxizität zu minimieren.

Alle fibrinolytischen Enzyme, die mögliche Ziele fair die Inhibierung durch ein wirksames Antifibrinolytikum sind, sind Chymotrypsin-homologe Serinproteasen.
ÜBERMÄSSIGE BLUTUNGEN
Eine übermäßige Blutung kann von einer mangelhaften Gerinnungsaktivität, einer erhöhten fibrinolytischen Aktivität oder einer Kombination beider Zustände herrühren. Bei den meisten Blutungsdiathesen muss man die Plasminaktivität kontrollieren. Man nimmt an, dass die klinisch zuträgliche Wirkung von BPTI bei der Verringerung des Blutverlusts das Ergebnis seiner Inhibiering von Plasmin (K_D ~ 0,3 nM) oder von Plasmakallikrein (K_D 100 nM) oder beider Enzyme ist.
GARD93 stellt in einem Übersichtsartikel die gegenwärtig verwendeten Thrombolytika dar und sagt, dass eine übermäßige Blutung ein ernstes Sicherheitsproblem ist, auch wenn thrombolytische Wirkstoffe (z.B. tPA) durchaus Blutgefäße öffnen. Obwohl tPA und Streptokinase kurze Plasma-Halbwertszeiten haben, verbleibt das von ihnen aktivierte Plasmin eine lange Zeit in dem System, und in dem System besteht, wie bereits gesagt wurde, ein potentieller Mangel an Plasmininhibitoren. Somit kann eine übermäßige Aktivierung von Plasminogen zu einer geführlichen Unfähigkeit zur Blutgerinnnung und einer gesundheitsschädlichen oder tödlichen Blutung führen. Ein starker, hochspezifischer Plasmininhibitor wäre in solchen Fällen hilfreich.
BPTI ist ein starker Plasmininhibitor; es wurde jedoch gefunden, dass es ausreichend antigen ist, um einen Hauttest bei der zweiten Verwendungen zu erfordern. Außerdem sind die für die Kontrolle einer Blutung erforderlichen Dosen von BPTI ziemlich hoch, und der Wirkungsmechanismus ist nicht klar. Einige sagen, dass BPTI auf Plasmin einwirkt, wogegen andere sagen, dass es mittels der Inhibierung von Plasmakallikrein wirkt. FRAE89 berichtet, dass Dosen von in etwa 840 mg BPTI bei 80 Patienten mit offenen Herzoperationen den Blutverlust um fast die Hälfte verringerten und die durchschnittliche Transfusionsmenge um 74 % verringert wurde. Miles Inc. hat kürzlich Trasylol in den USA zur Verringerung von Blutungen in der Chirurgie eingeführt (siehe Miles Produktbroschüre über Trasylol). LOHM93 schlägt vor, dass Plasmininhibitoren für die Kontrolle von Blutungen in der Augenchirurgie nützlich sein können. SHER89 berichtet, dass BPTI nützlich sein kann, um Blutungen in der Kolonchirurgie zu begrenzen.
Ein Plasmininhibitor, der in etwa so wirksam wie BPTI oder wirksamer ist, aber nahezu identisch zu einer humanen Proteindomäne ist, bietet ein ähnliches therapeutisches Potential, aber erzeugt ein geringeres Antigenitätspotential.
ANGIOGENESE
Plasmin ist das Schlüsselenzym bei der Angiogenese. OREI94 berichtet, dass ein 38-kDa-Fragment von Plasmin (dem die katalytische Domäne fehlt) ein starker Inhibitor der Metastasierung ist, was darauf hindeutet, dass die Inhibierung von Plasmin für die Blockierung der Metastasierung von Tumoren nützlich sein kann (FIDL94). Siehe auch ELLI92.
PLASMIN
Plasmin ist eine von Plasminogen abgeleitete Serinprotease. Die katalytische Domäne von Plasmin (oder „CatDom") spaltet Peptidbindungen, insbesondere nach Arginin-Resten und in einem geringeren Maße nach Lysinen, und ist hoch homolog zu Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein und vielen anderen Serinproteasen. Der größte Teil der Spezifität von Plasmin rührt von der Bindung der Kringles an Fibrin her (LUCA83, VARA83, VARA84). Bei der Aktivierung wird die Bindung zwischen ARG₅₆₁-Val₅₆₂ geschnitten, was dem neuen freien Aminoterminus erlaubt, eine Salzbrücke zu bilden. Die Kringles bleiben dennoch durch die zwei Disulfide an die CatDom gebunden (COLM87, ROBB87).
Über BPTI wurde berichtet, dass es Plasmin mit einer K_D von in etwa 300 pM (SCHN86) inhibiert. AUER88 berichtet, dass BTPI(R₁₅) eine K_i für Plasmin von in etwa 13 nM hat, was darauf hindeutet, dass R₁₅ erheblich schlechter als K₁₅ bezüglich der Plasminbindung ist. SCHN86 berichtet, dass BPTI, worin die Reste C₁₄ und C₃₈ in Alanin umgewandelt wurden, eine K_i für Plasmin von in etwa 4,5 nM hat. KIDO88 berichtet, dass APP-I eine K_i für Plasmin von in etwa 75 pM (7,5 × 10^–11 M) hat, der stärkste Inhibitor fair humanes Plasmin über den bisher berichtet wurde. DENN94a berichtet jedoch, dass APP-I Plasmin mit einer K_i = 225 nM (2,25 × 10^–7 M) inhibiert. Unsere zweite und dritte Bibliothek wurden auf Grund der Annahme konstruiert, dass APP-I ein starker Plasminbinder ist. Das Selektionsverfahren selektierte die APP-I-Reste an den meisten Positionen nicht, und der Bericht von DENN94a erklärt, warum es dazu kam.
Mit rekombinanten DNA-Techniken ist es möglich, ein neues Protein durch Exprimieren eines mutierten Gens, das eine Mutante des nativen Proteingens ist, zu erhalten. Verschiedene Strategien zur Auswahl von Mutationen sind bekannt. In einer Strategie werden einige Reste konstant gehalten, andere werden zufallsabhängig mutiert, und noch andere werden in einer vorbestimmten Weise mutiert. Dies wird „Variierung" genannt, und ist in Ladner et al. USP 5,223,409 definiert.
DENN94a und DENN94b berichten über Selektionen von Kunitz-Domänen, die auf der Bindung von APP-I an den Komplex von Prothrombinase mit Faktor VII basieren. Sie verwendeten LACI-K1 nicht als Parental und verwendeten Plasmin nicht als Zielmolekül. Der Binder mit der höchsten Affinität, den sie erhielten, hatte eine K_D für sein Zielmolekül von in etwa 2 nM. Unsere Selektanten der ersten Runde haben eine Affinität in diesem Bereich, aber unsere Selektanten der zweiten Runde sind in etwa 25-fach besser als dieser.
Man nimmt an, dass Proteine, die aus einer bestimmten Spezies stammen, mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort auslösen, wenn sie in Individuen dieser Spezies injiziert werden. Marine Antikörper sind in Menschen in hohem Maße antigen. „Chimäre" Antikörper, die humane konstante Domänen und murine variable Domänen haben, sind entschieden weniger antigen. Sogenannte „humanisierte" Antikörper haben humane konstante Domänen und variable Domänen, bei denen die CDRs aus murinen Antikörpern stammen, während das Rahmenwerk der variablen Domänen humanen Ursprungs ist. „Humanisierte" Antikörper sind viel weniger antigen als „chimäre" Antikörper. In einem „humanisierten" Antikörper sind fünfzig bis sechzig Reste des Proteins nicht-humanen Ursprungs. Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen in den meisten Fällen nur in etwa sechzig Aminosäuren, und gewöhnlich gibt es zehn oder weniger Unterschiede zwischen dem konstruierten Protein und dem Parentalprotein. Obwohl Menschen durchaus Antikörper sogar gegen humane Proteine, wie z.B. Humaninsulin, entwickeln, neigen solche Antikörper dazu, schwach zu binden, und häufig hindern sie das injizierte Protein nicht daran, seine beabsichtigte biologische Funktion zu entfalten. Die Verwendung eines Proteins aus der zu behandelnden Spezies garantiert nicht, dass es nicht zu einer Immunantwort kommen wird. Dennoch verringert das Auswählen eines Proteins mit einer einem humanen Protein sehr ähnlichen Sequenz stark das Risiko einer starken Immunantwort in Menschen.
Kunitz-Domänen sind sehr stabil und können effizient in Hefe oder anderen Wirtsorganismen hergestellt werden. Es wurde über wenigstens 10 humane Kumitz-Domänen berichtet. Obwohl zu einem Zeitpunkt angenommen wurde, dass APP-I ein starker Plasmininhibitor ist, gibt es derzeit keine humanen Kunitz-Domänen, die Plasmin vergleichbar gut inhibieren wie BPTI. Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Sequenzen von Kunitz-Domänen bereitzustellen, die sowohl starke Inhibitoren von Plasmin sind, als auch humanen Kumitz-Domänen bezüglich der Sequenz nahe stehen.
Die Verwendung ortsspezifischer Mutagenese, ob nicht-zufallsabhängig oder zufallsabhängig, um mutierte Bindungsproteine mit verbesserter Aktivität zu erhalten, ist im Stand der Technik bekannt, aber ein Erfolg ist nicht sicher.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mutanten von BPTI-homologen Kunitz-Domänen, die humanes Plasmin stark inhibieren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Mutanten einer Domäne von humanem LACI, die wahrscheinlich für Menschen nicht-immunogen sind und die Plasmin mit einer K_D von vorzugsweise in etwa 5 nM oder weniger, mehr bevorzugt von in etwa 300 pM oder weniger und am meisten bevorzugt von in etwa 100 pM oder weniger inhibieren. Die Erfindung bezieht sich auch auf die therapeutische und diagnostische Verwendung dieser neuen Proteine.
Plasmin-inhibierende Proteine sind nützlich fair die Vorbeugung oder Behandlung klinischer Zustande, die von Plasmin verursacht oder verschlimmert werden, einschließlich nicht-angemessener Fibrinolyse oder Fibrinogenolyse, übermäßiger Blutung im Zusammenhang mit Thrombolytika, postoperativer Blutung und nicht-angemessener Androgenese. Plasminbindende Mutanten, seien sie inhibitorisch oder nicht, sind nützlich für den Nachweis von Plasmin in Proben in vitro, für die Bilddarstellung von Gebieten mit Plasmin-Aktivität in vivo und fair die Reinigung von Plasmin.
Ein besonders bevorzugtes Protein, SPI11, wurde aus einer Bibliothek selektiert, die eine Variabilität an den Positionen 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 und 21 erlaubt und eine Affinität für Plasmin besitzt, die geringer als 100 pM ist (d.h. BPTI bezüglich der Bindung in etwa 3-fach überlegen) und dennoch zu LACI, einem menschlichen Protein, bezüglich der Sequenz viel ähnlicher ist als zu BPTI, einem Rinderprotein. Andere LACI-K1-Mutanten, die aus dieser Bibliothek selektiert wurden, und von denen angenommen wird, dass sie eine sehr hohe Affinität für Plasmin besitzen, schließen SPI15, SPI08 und SPI23 ein. Eine zusätzliche Bibliothek, die eine Variation an den Positionen 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 31, 32, 34, 35 und 39 erlaubt, wurde gescreent, und eine Konsensussequenz (SPIcon1) wurde gefunden. Varianten, von denen gezeigt wurde, dass sie besser als QS4 sind, und die somit mehr bevorzugt sind, schließen SPI51 und SPI47 ein. Sequenzen, die wahrscheinlich eine sehr hohe Affinität für Plasmin besitzen und dennoch eine im wesentlichen humane Aminosäuresequenz bewahren, wurden identifiziert und schließen die Sequenzen SPI60, SPI59, SPI42, SPI55, SPI56, SPI52, SPI46, SPI49, SPI53, SPI41 und SPI57 ein. Die Aminosäuresequenz-Information, die dem aktiven Zentrum von Plasmin eine hohe Affinität verleiht, kann auf andere Kunitz-Domänen, insbesondere auf Kunitz-Domänen humanen Ursprungs, übertragen werden. Konstruktionen mehrerer solcher Proteine werden offenbart.
Die bevorzugten Plasmininhibitoren der vorliegenden Erfindung erfüllen eine oder mehrere der folgenden Anforderungen:

1) die K_i für Plasmin ist höchstens 20 nM, vorzugsweise nicht mehr als in etwa 5 nM, mehr bevorzugt nicht mehr als in etwa 300 pM und am meisten bevorzugt nicht mehr als in etwa 100 pM,
2) der Inhibitor umfasst eine Kunitz-Domäne, die die in der Tabelle 14, in der die Reste mit Bezug auf BPTI nummeriert sind, gezeigten Anforderungen erfüllt,
3) an den Kunitz-Domänen-Positionen 12–21 und 32–39 eine der für diese Position in der Tabelle 15 aufgelisteten Aminosäuretypen und
4) der Inhibitor ist in der Aminosäuresequenz ähnlicher zu einer Referenzsequenz ausgewählt aus der Gruppe SPI11, SPI15, SPI08 als dies die Aminosäuresequenz dieser Kunitz-Domäne zu der Sequenz von BPTI ist.

NOMENKLATUR
Affinitäten werden hierin als K_D (K_D(A,B)=[A][B]/[A–B]) angegeben. Eine numerisch kleinere K_D spiegelt eine höhere Affinität wieder. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein „Plasmin-inhibierendes Protein" eines, das Plasmin bindet und mit einer K_i von in etwa 20 nM oder weniger inhibiert. „Inhibierung" bezieht sich auf das Blockieren der katalytischen Aktivität von Plasmin und ist auch in vitro in Untersuchungen unter Verwendung chromogener oder fluorogener Substrate oder in Untersuchungen, die Makromoleküle einschließen, messbar.
Aminosäurereste werden auf drei Weisen genannt: vollständiger Name der Aminosäure, Drei-Buchstaben-Standardkode und Einzelbuchstaben-Standardkode. In Tabellen wird nur der Einzelbuchstabenkode verwendet. Der Text verwendet vollständige Namen und den Drei-Buchstabenkode, wo die Klarheit dies erfordert.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind „im Wesentlichen homologe" Sequenzen zu wenigstens 51 %, mehr bevorzugt wenigstens 80 %, über eine beliebige spezifizierte Region identisch. Hierin werden Sequenzen, die identisch sind, als „im Wesentlichen homolog" aufgefasst. Sequenzen wurden noch als „im Wesentlichen homolog" angesehen werden, falls sie innerhalb einer Region von wenigstens 20 Aminosäuren ausreichend ähnlich sind (51 % oder mehr), aber außerhalb der Vergleichsregion vollständig unterschiedlich sind. Eine Insertion einer Aminosäure in einer Sequenz im Vergleich zu der anderen zählt als eine Fehlpaarung. Am meisten bevorzugt sind nicht mehr als sechs Reste mit Ausnahme der Termini unterschiedlich. Vorzugsweise ist die Sequenzabweichung, insbesondere in den spezifizierten Regionen, in der Form von „konservativen Modifikationen".
„Konservative Modifikationen" sind definiert als

(a) konservative Aminosäuresubstitutionen wie in der Tabelle 9 definiert; und
(b) einzelne oder mehrfache Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren an den Termini, an Domänengrenzen, in Loops oder in anderen Segmenten mit relativ hoher Mobilität.

Vorzugsweise sind an einem beliebigen Ort mit Ausnahme der Termini nicht mehr als in etwa sechs Aminosäuren insertiert oder deletiert, und die Modifikationen sind außerhalb von Regionen, von denen bekannt ist, dass sie wichtige Bindungsstellen enthalten.
KUNITZ-DOMÄNEN
Hierin werden „Kunitz-Domäne" und „KuDom" austauschbar verwendet, um ein Homolog von BPTI (nicht des Kunitz-Sojabohnen-Trypsininhibitors) zu bezeichnen. Eine KuDom ist eine Domäne eines Proteins, die wenigstens 51 Aminosäuren (und bis zu 61 Aminosäuren) umfasst, die wenigstens zwei und vorzugsweise drei Disulfide enthält. Hierin sind die Reste aller Kunitz-Domänen mit Bezug auf BPTI nummeriert (d.h. die Reste 1–58). Somit ist der erste Cysteinrest der Rest 5 und das letzte Cystein ist 55. Eine Aminosäuresequenz soll für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Kunitz-Domäne angesehen werden, falls sie mit drei oder weniger Fehlpaarungen an der in der Tabelle 14 gezeigten Sequenz ausgerichtet werden kann. Eine Insertion oder Deletion eines Restes soll als eine Fehlpaarung zählen. In der Tabelle 14 stimmt „x" mit einer beliebigen Aminosäure überein, und „X" stimmt mit den für diese Position aufgelisteten Typen überein. Disulfidbindungen verbinden wenigstens zwei von: 5 mit 55, 14 mit 38 und 30 mit 51. Die Anzahl der Disulfide kann auf eines verringert werden, aber keines der Standard-Cysteine soll ungepaart bleiben. Somit soll, falls ein Cystein verändert wird, ein kompensierendes Cystein an einem geeigneten Ort hinzugefügt werden oder das entsprechende Cystein soll ebenfalls durch ein Nicht-Cystein ersetzt werden (wobei letzteres im Allgemeinen bevorzugt ist). Zum Beispiel hat der Proteaseinhibitor aus der akzessorischen Drüse der männlichen Drosophila funebris kein Cystein an der Position 5, sondern hat ein Cystein an der Position –1 (unmittelbar vor der Position 1); dieses bildet vermutlich ein Disulfid mit Cys₅₅. Falls Cys₁₄ und Cys₃₈ ersetzt werden, entfällt das Erfordernis von GLy₁₂ (Gly oder Ser)₃₇ und Gly₃₆. An jedes Ende einer Kunitz-Domäne können von Null bis viele Reste, einschließlich zusätzlicher Domänen (einschließlich anderer KuDoms) angehängt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Proteaseinhibitoren, wie z.B. Kunitz-Domänen, funktionieren, indem sie an das aktive Zentrum der Protease binden, so dass eine Peptidbindung (die „spaltbare Bindung"): 1) nicht gespalten wird, 2) sehr langsam gespalten wird oder 3) ohne Auswirkung gespalten wird, weil die Struktur des Inhibitors die Freisetzung oder Trennung der gespaltenen Segmente verhindert. Bei Kunitz-Domänen halten Disulfidbindungen das Protein sogar zusammen, falls exponierte Peptidbindungen gespalten werden. Ausgehend von dem Rest auf der Aminoseite der spaltbaren Bindung und in Richtung weg der von der Bindung werden die Reste konventioneller Weise P1, P2, P3 etc. genannt. Reste, die auf die spaltbare Bindung folgen, werden P1', P2', P3' etc. genannt (SCHE67, SCHE68). Es ist allgemein anerkannt, dass jede Serinprotease (mehrere Reste umfassende) Stellen S1, S2, etc. hat, die die Seitengruppen und Hauptkettenatome der Reste P1, P2, etc. des Substrats oder Inhibitors aufnehmen, sowie Stellen S1', S2', etc., die die Seitengruppen und Hauptkettenatome von P1', P2', etc. des Substrats oder Inhibitors aufnehmen. Es sind die Wechselwirkungen zwischen den S-Stellen und den P-Seitengruppen und den Hauptkettenatomen, die der Protease Spezifität im Hinblick auf Substrate und den Inhibitoren Spezifität im Hinblick auf Proteasen verleihen. Da das Fragment, das den neuen Aminoterminus umfasst, als erstes die Protease verlässt, haben sich viele Wissenschaftler, die Proteaseinhibitoren in Form kleiner Moleküle entwerfen, auf Verbindungen konzentriert, die die Stellen S1, S2, S3, etc. binden.
LASK80 stellt Protein-Proteaseinhibitoren in einem Übersichtsartikel dar. Einige Inhibitoren haben mehrere reaktive Stellen auf einer Polypeptidkette, und diese Domänen haben gewöhnlich verschiedene Sequenzen, Spezifitäten und sogar Topologien. Es ist bekannt, dass das Substituieren von Aminosäuren in der P₅- bis P₅'-Region die Spezifität eines Inhibitors beeinflusst. Zuvor konzentrierte sich die Aufmerksamkeit auf den P1-Rest und die sehr nahe bei ihm gelegenen, weil diese die Spezifität von einer Enzymklasse zu einer anderen verändern können. LASK80 schlägt vor, dass unter den KuDoms Inhibitoren mit P1 = Lys oder Arg Trypsin inhibieren, diejenigen mit P1 = Tyr, Phe, Trp, Leu und Met Chymotrypsin inhibieren und diejenigen mit P1 = Ala oder Ser wahrscheinlich Elastase inhibieren. Unter den Kazal-Inhibitoren, fährt LASK80 fort, sind Inhibitoren mit P1 = Leu oder Met starke Inhibitoren von Elastase, und bei der Bowman-Kirk-Familie wird Elastase mit P1 = Ala, aber nicht mit P1 =Leu inhibiert. Solche begrenzte Veränderungen führen nicht zu Inhibitoren mit wirklich hohe Affinität (d.h. besser als 1 bis 10 nM).
Kunitz-Domänen sind oben definiert. Die 3D-Struktur (mit hoher Auflösung) von BPTI (der archetypischen Kunitz-Domäne) ist bekannt. Eine der Röntgenstrukturen ist in der Brookhaven-Protein-Datenbank als „6PTI" hinterlegt. Die 3D-Strukturen einiger BPTI-Homologer (EIGE90, HYNE90) sind bekannt. Wenigstens siebzig KuDom-Sequenzen sind bekannt. Bekannte humane Homologe schließen drei KuDoms von LACI (WUNT88, GIRA89, NOV089), zwei KuDoms von Inter-α-Trypsininhibitor, APP-I (KID088), eine KuDom aus Kollagen und drei KuDoms von TFPI-2 (SPRE94) ein.
LACI
Der Lipoprotein-assoziierte Gerinnungsinhibitor (LACI) ist ein humanes Serum-Phosphoglycoprotein mit einem Molekulargewicht von 39 kDA (Aminosäuresequenz in Tabelle 1), der drei KuDoms enthält. Wir beziehen uns hierin im Folgenden auf das Protein als LACI und auf dessen Kunitz-Domänen als LACI-K1 (Reste 50–107), LACI-K2 (Reste 121–178) und LACI-K3 (213–270). Über die cDNA-Sequenz von LACI wurde in WUNT88 berichtet. GIRA89 berichtet über Mutationsstudien, bei denen die P1-Reste jeder der drei KuDoms verändert wurden. LACI-K1 inhibiert den Faktor VIIa (F.VII_a), wenn F.VII_a mit Prothrombinase komplexiert wird, und LACI-K2 inhibiert den Faktor X_a. Es ist nicht bekannt, ob LACI-K3 irgendetwas inhibiert. Weder LACI noch eine der KuDoms von LACI ist ein starker Plasmininhibitor.
Erfindungsgemäße KuDoms sind im Wesentlichen homolog zu LACI-K1, aber unterscheiden sich auf unten erörterte Weisen, die eine starke Plasmin-Inhibierungsaktivität verleihen. Andere erfindungsgemäße KuDoms sind homolog zu anderen natürlich vorkommenden KuDoms, insbesondere zu anderen humanen KuDoms. Für die Verwendung in Menschen sind die erfindungsgemäßen Proteine so ausgebildet, dass sie bezüglich ihrer Sequenz ähnlicher zu einer humanen KuDom sind als zu BPTI, um das Risiko, eine Immunantwort auszulösen, zu verringern.
ERSTE BIBLIOTHEK VON LACI-K1 UND SELEKTANTEN FÜR DIE BINDUNG AN PLASMIN
Die Anmelder haben eine erste Bibliothek von LACI-K1 auf Mutanten gescreent, die eine hohe Affinität für humanes Plasmin aufweisen, und die in der Tabelle 2 und der Tabelle 3 gezeigten Sequenzen enthalten. Diese Sequenzen können, wie in der Tabelle 16 gezeigt, zusammengefasst werden, worin „bevorzugte Reste" solche sind, die in wenigstens einer der 32 als Plasmin-bindend identifizierten Varianten vorkommen. Die Bevorzugungen bei den Resten 13, 16, 17, 18 und 19 sind stark, wie in der Tabelle 17 gezeigt. Obwohl der Bereich der bei 31 und 32 erlaubten Typen begrenzt ist, deutet die Selektion darauf hin, dass eine saure Gruppe bei 31 und eine neutrale Gruppe bei 32 bevorzugt ist. Bei dem Rest 17 war Arg bevorzugt; Lys und andere positiv geladene Aminosäuren waren nicht in der Bibliothek und können ein geeigneter Ersatz für Arg sein. Viele Aminosäuretypen an den Positionen 34 und 39 sind mit einer hochaffinen Plasminbindung vereinbar, aber einige Typen mögen die Bindung behindern.
Es sollte beachtet werden, dass die Anmelder nicht alle positiven Isolate dieser oder anderer hierin offenbarter Bibliotheken sequenziert haben, und dass einige der möglichen Proteine nicht in nachweisbaren Mengen vorgelegen haben mögen.
ZWEITE BIBLIOTHEK, DIE DIE RESTE 10–21 VARIIERT
Die Anmelder haben eine zweite Bibliothek mit in der Tabelle 5 gezeigten LACI-K1-Derivaten hergestellt, die eine Variierung bei den Resten 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 und 21 erlauben. Diese wurde auf die Bindung an Plasmin gescreent, und die in der Tabelle 6 gezeigten Proteine wurden erhalten.
„Konsensus" in der Tabelle 6 ist E ₁₀ TGPCRARFERW ₂₁, worin die sieben unterstrichenen Reste sich von LACI-K1 unterscheiden. Nur saure Aminosäuren (Glu:17 oder Asp:15) wurden an der Position 10 beobachtet; Lys und Asp sind nicht zulässig. Da Glu und Asp mit nahezu gleicher Häufigkeit erschienen, tragen sie vermutlich in gleicher Weise zu der Bindung bei. Saure Reste wurden nicht an der Position 11 beobachtet. Thr war am häufigsten (11/32), wobei Ser oft erschien (9/32); Gly erschien 8 mal. Bei 13 war Pro stark bevorzugt (24/32), mit Ala auf dem zweiten Platz bei 5/32. Bei 15 war Arg stark bevorzugt (25/32), aber einige wenige (7/32) Isolate haben Lys. Beachte, dass BPTI(R₁₅) ein schlechterer Plasmininhibitor ist als BPTI. Bei 16 war Ala bevorzugt (22/32), aber Gly erschien ziemlich oft (10/32). Bei 17 war Arg am häufigsten (15/32), mit Lys auf dem zweiten Platz (9/32). Bei den Resten 17 und 18 hat APP-I Met und Ile. Bei 18 ließen wir Ile oder Phe zu. Nur vier Isolate haben Ile bei 18, und keines von diesen hat Met bei 17. Dies war überraschend im Hinblick auf KID088, aber durchaus verständlich im Hinblick auf DENN94a. Diese Sammlung von Isolaten weist eine breite Verteilung bei 19: (Glu:8, Pro:7, Asp:4, Ala:3, His:3, Gly:2, Gln:2, Asn:1, Ser:1 und Arg:1) auf, aber saure Seitengruppen sind gegenüber basischen stark bevorzugt. Bei 21 war die Verteilung (Trp:16, Phe: 14, Leu:2, Cys:0); BPTI hat Tyr bei 21.
Die Bindung klonal reiner Phagen, die das eine oder andere dieser Proteine präsentieren, wurde mit der Bindung des BPTI-Phagen verglichen (Tabelle 6). Die Anmelder bestimmten die K_i des Proteins SPI11 und fanden, dass sie in etwa 88 pM beträgt, was erheblich besser als BPTI ist.
DRITTE BIBLIOTHEK, DIE 10–21 UND 31–39 VARIIERT
Die Anmelder verwendeten ein Gemisch von Phagen der zweiten Bibliothek (variiert bei den Resten 10, 11, 13, 15, 16, 17, 18, 19 und 21), das zweimal auf die Bindung von Plasmin selektiert worden war, als Quelle fair DNA, in die, wie in der Tabelle 7 gezeigt, Variierungen bei den Resten 31, 32, 34, 35 und 39 eingeführt wurden.
Diese Bibliothek wurde in drei Runden auf Bindung an Plasmin gescreent, und die in der Tabelle 8 gezeigten Isolate wurden erhalten. Die Verteilung von Aminosäure-Typen ist in der Tabelle 18 gezeigt, worin „x" den nicht erlaubten Aminosäure-Typ bedeutet, und „*" den Wildtyp fair LACI-K1 angibt.
Diese Sequenzen lieferten einen Konsensus von E ₁₀TGPCRAKFDRW ₂₁...E₃₁ AFVYGGCGG₄₀ (SPIcon1 in der Tabelle 4) in der 10–21- und 31–40-Region. Die 10 unterstrichenen Aminosäuren unterscheiden sich von LACI-K1. An 8 veränderten Positionen war ein zweiter Typ recht häufig: Asp bei 10, Ala bei 11, Glu bei 19, Phe bei 21, Thr bei 31, Pro oder Ser bei 32, Leu oder Ile bei 34 und Glu bei 39. Bei der Position 17 weist der hochwirksame Inhibitor SPI11 R auf. Somit unterscheidet sich die Sequenz D₁₀ TGPCRARFDRF₂₁...E₃₁ AFIYGGCEG₄₀ (DPI-1.1.1 in der Tabelle 4) von LACI-K1 nur durch sechs Reste, stimmt mit den selektierten Sequenzen bei den Resten überein, die einen starken Konsensus aufweisen, und hat bevorzugte Substitutionen bei den Positionen 10, 17, 21, 34 und 39. Von DPI-1.1.1 wird erwartet, dass es eine sehr hohe Affinität für Plasmin und ein geringes Potential für Immunogenität in Menschen aufweist.
Vorläufige Tests der Proteine SPI11 und, zum Vergleich, BPTI auf Plasmininhibitor-Aktivität zeigten, dass SPI11 signifikant stärker als BPTI mit einer K_i von in etwa 88 pM ist.
Eine KuDom, die, wie in der Tabelle 4 gezeigt, an den Resten 5–55 hochgradig homolog zu einer beliebigen der Sequenzen SPI11 und SPI15 ist, ist wahrscheinlich ein wirksamer Inhibitor (K_D > 5 nM) von Plasmin und hat ein geringes Potential für Antigenität in Menschen. Um eine hohe Affinität zu Plasmin aufzuweisen, hätte eine KuDom in mehr bevorzugter Weise eine Sequenz, die an den Resten 10–21 und 31–39 identisch ist und fünf oder weniger Unterschiede bei den Resten 5–9, 22–30 und 40–45 als im Vergleich eine beliebige der Sequenzen SPI11, SPI15, SPI08, SPI23, SPI51, SPI47, QS4 und NS4 hat.
Unter Verwendung der selektierten Sequenzen und der Bindungsdaten der selektierten und natürlichen KuDoms können wir eine Vorschrift für eine hochaffine Plasmin inhibierende KuDom angeben, die auf andere humane KuDom-Parentale angewendet werden kann. Zunächst muss die KuDom die Anforderungen in der Tabelle 14 erfüllen. Die in der Tabelle 15 gezeigten Substitutionen verleihen einer beliebigen KuDom wahrscheinlich eine hochaffine Plasmin-inhibierende Aktivität. Somit ist ein Protein, das eine Sequenz enthält, die eine KuDom ist, wie in der Tabelle 14 gezeigt, und das an jeder der Positionen 12–21 und 32–39 einen in der Tabelle 15 für diese Position gezeigten Aminosäure-Typ enthält, wahrscheinlich ein starker Inhibitor von humanem Plasmin. Mehr bevorzugt hätte das Protein einen in der Tabelle 15 gezeigten Aminosäure-Typ bei allen in der Tabelle 15 aufgelisteten Positionen. Um das Potential für eine Immunantwort zu verringern, sollte man die eine oder andere humane KuDom als Parentalprotein verwenden, um die Sequenz außerhalb der Bindungsregion zu erhalten.
Es ist wahrscheinlich, dass ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen von Rest 5 bis Rest 55 (wie in der Tabelle 4 gezeigt) homolog zu SPI11 ist und an den Positionen 13–19, 31, 32, 34 und 39 identisch mit SPI11 ist, humanes Plasmin mit einer K; von 5 nM oder weniger inhibieren wird. SPI11 unterscheidet sich von LACI-K1 an 7 Positionen. Es ist nicht klar, ob diese Substitutionen gleich wichtig für die Förderung der Plasminbindung und -Inhibierung sind. Es gibt sieben Moleküle, in denen eine der substituierten Positionen von SPI11 zu dem in LACI-K1 gefundenen Rest verändert ist (d.h. „umgewandelt"), 21, in denen zwei der Reste umgewandelt sind, 35, in denen drei Reste umgewandelt sind, 35, in denen vier umgewandelt sind, 21, in denen fünf umgewandelt sind und sieben, in denen sechs umgewandelt sind. Es wird erwartet, dass diejenigen mit mehreren umgewandelten Resten eine geringere Affinität für Plasmin aber auch ein geringeres Potential für Immunogenität haben werden. Ein Fachmann kann ein Protein mit ausreichender Wirksamkeit und geringer Immunogenität aus dieser Sammlung von 126 auswählen. Es ist auch möglich, dass Substitutionen in SPI11 durch Aminosäuren, die von LACI-K1 abweichen, die Immunogenität verringern können, ohne die Affinität für Plasmin in einem Maße zu verringern, das das Protein ungeeignet für die Verwendung als Arzneimittel macht.
KONSTRUIERTE KuDom-PLASMININHIBITOREN
Im Folgenden wird „DPI" „Designed Plasmin Inhibitors" (konstruierte Plasmininhibitoren) bezeichnen, das sind KuDoms, die Aminosäuresequenz-Information aus der SPI-Molekülserie, speziell SPI11, enthalten. Sequenzen mehrerer DPIs und ihre Parentalproteine sind in der Tabelle 4 angegeben.
Die Sequenzen DPI-1.1.1, DPI-1.1.2, DPI-1.1.3, DPI-1.1.4, DPI-1.1.5 und DPI-1.1.6 (in der Tabelle 4) unterscheiden sich von LACI-K1 durch 6, 5, 5, 4, 3 bzw. 2 Aminosäuren und stellen eine Serie dar, in der die Affinität für Plasmin langsam abnimmt, während die Ähnlichkeit zu einer humanen Sequenz zunimmt, um die Wahrscheinlichkeit von Immunogenität zu verringern. Die Selektionen aus jeder der Bibliotheken zeigen, dass M18F eine Schlüsselsubstitution ist und dass entweder I17K oder I17R sehr wichtig ist. Selektionen aus der zweiten und dritten Bibliothek deuten darauf hin, dass Arg bei 15 stark bevorzugt ist, dass eine saure Seitengruppe bei 11 nachteilig für die Bindung ist. Der sehr starke Inhibitor SPI11 unterscheidet sich von dem Konsensus, indem er wie BPTI R₁₇ hat. DPI-1.1.1 trägt die Mutationen D11T, K15R, I17R, M18F, K19D und E32A und ist wahrscheinlich als Plasmininhibitor hochwirksam. DPI-1.1.2 trägt D11T, K15R, I17R, M18F und K19D und ist wahrscheinlich sehr wirksam. DPI-1.1.3 trägt die Mutationen D11A, K15R, I17R, M18F und K19D im Vergleich zu LACI-K1. DPI-1.1.3 unterscheidet sich von DPI-1.1.2 in dem es A₁₁ statt T₁₁ hat; beide Proteine sind wahrscheinlich sehr starke Plasmininhibitoren. DPI-1.1.4 trägt die Mutationen I17R, M18F, K19D und E32A und sollte ziemlich stark sein. Da DPI-1.1.4 weniger SPI11-Mutationen hat, mag es weniger stark sein, aber es ist auch mit geringerer Wahrscheinlichkeit immunogen. DPI-1.1.5 trägt die Mutationen I17R, M18F und K19D. Dieses Protein ist wahrscheinlich ein guter Inhibitor und ist mit geringerer Wahrscheinlichkeit immunogen. DPI-1.1.6 trägt nur die Mutationen I17R und M18F, aber sollte Plasmin inhibieren.
Das Protein DPI-1.2.1 basiert auf dem humanen LACI-K2 und ist in der Tabelle 4 gezeigt. Die Mutationen P11T, I13P, Y17R, I18F, T19D, R32E, K34I und L39E vermitteln wahrscheinlich eine hohe Affinität für Plasmin. Einige dieser Substitutionen mögen nicht notwendig sein; insbesondere mögen P11T und T19D nicht notwendig sein. Andere Mutationen, die die Plasminaffinität verbessern könnten, schließen E9A, D10E, G16A, Y21W, Y21F, R32T, K34V und L39G ein.
Das Protein DPI-1.3.1 (Tabelle 4) basiert auf dem humanen LACI-K3. Es ist beabsichtigt, dass die Mutationen R11T, L13P, N17R, E18F, N19D, R31E, P32E, K34I und S36G eine hohe Affinität für Plasmin verleihen. Einige dieser Substitutionen mögen nicht notwendig sein; insbesondere mögen N19D und P32E nicht notwendig sein. Andere Veränderungen, die die K_D verbessern könnten, schließen D10E, N17K, F21W und G39E ein.
Das Protein DPI-2.1 (Tabelle 4) basiert auf der KuDom des humanen Kollagen α3. Die Mutationen E11T, T13P, D16A, F17R, I18F, L19D, A31E, R32E und W34I verleihen wahrscheinlich eine hohe Affinität für Plasmin. Einige dieser Substitutionen mögen nicht notwendig sein; insbesondere mögen L 19D und A31 E nicht notwendig sein. Andere Mutationen, die die Plasminaffinität verbessern könnten, schließen K9A, D10E, D16G, K20R, R32T, W34V und G39E ein.
DPI-3.1.1 (Tabelle 4) ist von der Domäne 1 des humanen TFPI-2 abgeleitet. Die Austausche Y11T, L17R, L18F, L19D und R31E verleihen wahrscheinlich eine hohe Affinität für Plasmin. Die Mutation L19D mag nicht erforderlich sein. Andere Mutationen, die die Plasminbindung fördern könnten, schließen Y21W, Y21F, Q32E, L34I, L34V und E39G ein.
DPI-3.2.1 (Tabelle 4) ist von der Domäne 2 des humanen TFPI-2 abgeleitet. Diese Parentaldomäne enthält Insertionen nach Rest 9 (ein Rest) und 42 (zwei Reste). Die Mutationen (V₉SVDDQC₁₄ ersetzt durch V₉ETGPC₁₄), E15R, S17K, T18F, K32T, F34V und (H₃₉RNRIENR₄₄ ersetzt durch (E₃₉GNRNR₄₄) verleihen wahrscheinlich Affinität für Plasmin. Wegen der Notwendigkeit, die Zahl der Aminosäuren zu ändern, hat DPI-3.2.1 ein höheres Potenzial für Immunogenität als andere modifizierte humane KuDoms.
DPI-3.3.1 (Tabelle 4) ist von der Domäne 3 des humanen TFPI-2 abgeleitet. Die Substitutionen E11T, L13P, S15R, N17R, V18F, T34I und T36G verleihen wahrscheinlich eine hohe Affinität für Plasmin. Die Mutationen E11T, L13P und T34I mögen nicht notwendig sein. Andere Mutationen, die die Plasminbindung fördern mögen, schließen D10E, T19D, Y21W und G39E ein.
DPI-4.1.1 (Tabelle 4) stammt von dem menschlichen ITI-K1 durch die Mutationen S10E, M15R, M17K, T18F, Q34V und M39G. Die Mutationen M39G und Q34V mögen nicht notwendig sein. Andere Mutationen, die die Plasminbindung fördern sollten, schließen ein: A11T, G16A, M17R, S19D, Y21W und Y21F.
DPI-4.2.1 (Tabelle 4) stammt von dem humanen ITI-K2 durch die Mutationen V10D, R11T, F17R, I18F und P34V. Die Mutation P34V mag nicht notwendig sein. Andere Mutationen, die die Plasminbindung fördern sollten, schließen ein: V10E, Q19D, L20R, W21F, P34I und Q39E. DPI-4.2.2 ist ein besonders bevorzugtes Protein, da es nur drei Mutationen hat: R11T, F17R und I18F. DPI-4.2.3 ist ein besonders bevorzugtes Protein, da es nur vier Mutationen hat: R11T, F17R, I18F und L20R. DPI-4.2.4 ist ein besonders bevorzugtes Protein, da es nur fünf Mutationen hat: R11T, F17R, I18F, L20R und P34V. DPI-4.2.5 trägt die Mutationen V10E, R11T, F17R, I18F, L20R, V31E, L32T, P34V und Q39G und inhibiert Plasmin wahrscheinlich sehr stark. Jedes der Proteine DPI-4.2.1, DPI-4.2.2, DPI-4.2.3, DPI-4.2.4 und DPI-4.2.5 ist sehr wahrscheinlich ein sehr starker Inhibitor von Plasmin.
Vor DENN94a wurde angenommen, dass APP-I ein sehr starker Plasmininhibitor ist. Deshalb war es überraschend, Proteine aus einer Bibliothek zu selektieren, die konstruiert war, um die APP-I-Reste an den Positionen 10 bis 21, die stark von APP-I abwichen, zu erlauben. Dennoch kann APP-I in einen wirksamen Plasmininhibitor umgewandelt werden. DPI-5.1 ist von dem humanen APP-I (auch als Protease Nexin-II bekannt) durch die Mutationen M17R und I18F abgeleitet und ist wahrscheinlich ein viel besserer Plasmininhibitor als APP-I selbst. DPI-5.2 trägt die weiteren Mutationen S19D, A31E und F34I, die eine höhere Affinität für Plasmin fördern mögen.
DPI-6.1 ist von der HKI-B9-KuDom (NORR93) durch fünf Substitutionen abgeleitet: K11T, Q15R, T16A, M17R und M18F. DPI-6.1 ist wahrscheinlich ein starker Plasmininhibitor. DPI-6.2 trägt die zusätzlichen Mutationen T19D und A34V, die die Plasminbindung fördern sollten.
Obwohl BPTI der beste bekannte, natürlich vorkommende KuDom-Plasmininhibitor ist, konnte er verbessert werden. DPI-7.1 ist von BPTI durch die Mutation I18F abgeleitet, die wahrscheinlich die Affinität für Plasmin erhöht. DPI-7.2 trägt die weitere Mutation K15R, die die Plasminbindung erhöhen sollte. DPI-7.3 trägt die hinzugefügte Mutation R39G. DPI-7.4 trägt die Mutationen Y10D, K15R, I18F, I19D, Q31E und R39G und sollte eine sehr hohe Affinität für Plasmin haben.
MODIFIKATION VON KUNITZ-DOMÄNEN
KuDoms sind ziemlich klein; falls dies ein pharmakologisches Problem verursachen sollte, wie z.B. übermäßig schnelle Eliminierung aus dem Blutkreislauf, können zwei oder mehr solche Domänen verbunden werden. Ein bevorzugter Linker ist eine Sequenz einer oder mehrerer Aminosäuren. Ein bevorzugter Linker ist einer, der zwischen wiederholten Domänen eines humanen Proteins gefunden wird, speziell die Linker, die in humanen BPTI-Homologen gefundenen werden, von denen eines zwei Domänen (BALD85, ALBR83b) und ein anderes drei (WUNT88) hat. Peptidlinker haben den Vorteil, dass das gesamte Protein dann durch rekombinante DNA-Techniken exprimiert werden kann. Es ist auch möglich, einen Nicht-Peptidyl-Linker zu verwenden, wie z.B. einen der gewöhnlich für die Herstellung immunogener Konjugate verwendeten. Ein alternatives Mittel zur Erhöhung der Verweildauer einer BPTI-artigen KuDom im Serum ist, sie an Polyethylenglycol zu binden, so genannte PEGylierung (DAVI79).
WEGE ZUR VERBESSERUNG DER SPEZIFITÄT VON SPI11 UND ANDERER KuDom-PLASMININHIBITOREN
Da wir einen großen Teil der Oberfläche der KuDom SPI11 komplementär zu der Oberfläche von Plasmin gemacht haben, ist R₁₅ nicht essenziell für die spezifische Bindung an Plasmin. Viele der Enzyme in den Gerinnungs- und fibrinolytischen Signalwegen spalten vorzugsweise nach Arg oder Lys. Keinen basischen Rest an der P1-Position zu haben, mag zu einer höheren Spezifität führen. Die Variante SPI11-R15A (in der Tabelle 11 gezeigt), die ein Ala an P1 hat, ist wahrscheinlich ein guter Plasmininhibitor und mag im Vergleich zu anderen Proteasen eine höhere Spezifität für Plasmin haben als SPI11. Die Affinität von SPI11-R15A für Plasmin ist wahrscheinlich geringer als die Affinität von SPI11 für Plasmin, aber der Affinitätsverlust für andere Arg/Lysbevorzugende Enzyme ist wahrscheinlich größer, und bei vielen Anwendungen ist die Spezifität wichtiger als die Affinität. Andere Mutanten, die wahrscheinlich eine gute Affinität und eine sehr hohe Spezifität haben, schließen SPI11-R15G und SPI11-R15N-E32A ein. Dieser Ansatz könnte auf andere hochaffine Plasmininhibitoren angewandt werden.
ERHÖHEN DER AFFINITÄT VON SPI11
Die Variation von SPI11, wie in der Tabelle 12 gezeigt, und die Selektion von Bindern produziert wahrscheinlich eine Kunitz-Domäne, die eine höhere Affnität für Plasmin hat als SPI11. Diese vierte Bibliothek erlaubt eine Variierung des 14–38-Disulfids. Die zwei gezeigten DNA-Segmente werden synthetisiert und mit Primern in einer PCR-Reaktion verwendet, um dsDNA herzustellen, die sich von NsiI bis BstEII erstreckt. Die Primer sind identisch zu den 5'-Enden der gezeigten synthetischen Stückchen und mit einer Länge von 21 im Fall des ersten und 17 im Fall des zweiten. Da die Variabilität sehr hoch ist, würden wir anstreben, zwischen 10⁸ und 10⁹ Transformanten (je mehr, desto besser) zu erhalten.
HERSTELLUNGSVERFAHREN
Erfindungsgemäße Proteine können durch eine beliebige herkömmliche Technik hergestellt werden, einschließlich

a) nicht-biologische Synthese durch sequenzielles Koppeln von Komponenten, z.B. Aminosäuren,
b) Herstellung durch rekombinante DNA-Techniken in geeigneten Wirtszellen und
c) Halbsynthese, z.B. durch Entfernen unerwünschter Sequenzen aus LACI-K1 und Ankoppeln synthetischer Austauschsequenzen.

Hierin offenbarte Proteine werden vorzugsweise rekombinant in einem geeigneten Wirt, wie z.B. Bakterien der Genera Bacillus, Escherichia, Salmonella, Erwinia und Hefen der Genera Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhinosporidium, Saccharomyces und Schizosaccharomyces oder kultivierter Säugerzellen, wie z.B. COS-1, produziert. Die mehr bevorzugten Wirte sind Mikroorganismen der Spezies Pichia pastoris, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli und Yarrowia lipolytica. Ein beliebiger Promotor, der in der Wirtszelle seine Funktion erfüllt, kann verwendet werden, um die Genexpression zu kontrollieren.
Die Proteine werden vorzugsweise sekretiert, und am meisten bevorzugt werden sie aus konditioniertem Medium erhalten. Die Sekretion ist der bevorzugte Weg, weil die Proteine mit einer höheren Wahrscheinlichkeit korrekt falten und in konditioniertem Medium mit wenigen Kontaminanten produziert werden können. Die Sekretion ist nicht erforderlich.
Falls es keinen spezifischen Grund gibt, Glycogruppen einzuschließen, bevorzugen wir Proteine, die so konstruiert sind, dass ihnen N-gekoppelte Glycosylierungsstellen fehlen, um das Potenzial für Antigenität von Glycogruppen zu verringern und so, dass gleichwertige Proteine in einer großen Vielzahl von Organismen exprimiert werden können, einschließlich: 1) E. coli, 2) B. subtilis, 3) P. pastoris, 4) S. cerevisiae und 5) Säugerzellen.
Es gibt verschiedene Mittel, um das Problem von Wirtszellen zu verringern, die Proteasen produzieren, die das rekombinante Produkt abbauen; siehe u. a. BANE90 und BANE91. VAND92 berichtet, dass die Überexpression der B. subtilis-Signalpeptidase in E. coli zu einer erhöhten Expression eines heterologen Fusionsproteins führt. ANBA88 berichtet, dass die Zugabe von PMSF (einem Serinprotease-Inhibitor) zu dem Kulturmedium die Ausbeute eines Fusionsproteins verbesserte.
Andere Faktoren, die die Produktion dieser und anderer hierin offenbarter Proteine beeinflussen mögen, schließen ein: 1) der Kodongebrauch (das Optimieren von Kodons für den Wirt ist bevorzugt), 2) Signalsequenz, 3) Aminosäuresequenz anbeabsichtigten Prozessierungsstellen, Anwesenheit und Lokalisierung von Prozessierungsenzymen, Deletion, Mutation oder Inhibierung verschiedener Enzyme, die das konstruierte Produkt verändern oder abbauen und Mutationen, die den Wirt geneigter zur Sekretion machen könnten (Sekretions-geneigte Wirte sind bevorzugt).
Referenzwerke über die allgemeinen Prinzipien der rekombinanten DNA-Technologie schließen Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Bände I und II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985); Old, et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, NY, (1987, 1992). Diese Literaturstellen sind hierin durch Querverweis vollständig einbezogen, wie es auch die darin zitierten Literaturstellen sind.
TESTS FÜR DIE PLASMINBINDUNG UND -HEMMUNG
Jedes geeignete Verfahren kann verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Verbindungen zu untersuchen. Scatchard (Ann NY Acad Sci (1949) 51: 660–669) beschrieb ein klassisches Verfahren zur Messung und Analyse einer Bindung, das auf die Proteinbindung anwendbar ist. Dieses Verfahren erfordert ein relativ reines Protein und die Fähigkeit, gebundenes Protein von ungebundenem zu unterscheiden.
Ein zweites, geeignetes Verfahren zur Messung der K_D ist es, die gegen das Enzym gerichtete inhibitorische Aktivität zu messen. Falls die zu messende K_D in dem 1-nM- bis 1-μM-Bereich ist, erfordert dieses Verfahren chromogene oder fluorogene Substrate und einige zehn Mikrogramm bis Milligram von relativ reinem Inhibitor. Für die erfindungsgemäßen Proteine, die eine K_D in dem Bereich von 5 nM bis 50 pM haben, reichen Nanogramm bis Mikrogramm des Inhibitors. Bei der Verwendung dieses Verfahrens kann die Kompetition zwischen dem Inhibitor und dem Enzymsubstrat zu einer gemessenen K_i führen, die höher als die tatsächliche K_i ist. Die vorliegend berichtete Messung ist nicht entsprechend korrigiert, weil die Korrektur sehr klein wäre und jede Korrektur die K_i verringern würde. Hierin verwenden wir die gemessene K_i als direktes Maß der K_D.
Ein drittes Verfahren zur Bestimmung der Affinität eines Proteins für ein zweites Material ist es, das Protein auf einer genetischen Packung, wie z.B. M13, zu präsentieren und die Fähigkeit des Proteins, sich an das immobilisierte „zweite Material" anzulagern, zu messen. Dieses Verfahren ist hochempfindlich, weil die genetischen Packungen amplifiziert werden können. Wir erhielten durch die Verwendung eines pH-Stufengradienten wenigstens halbquantitative Werte fair die Bindungskonstanten. Inhibitoren mit bekannter Affinität für die Protease werden verwendet, um Standardprofile zu erstellen, anhand derer andere Phagen-präsentierte Inhibitoren beurteilt werden. Jedes beliebige andere geeignete Verfahren zur Messung von Proteinbindung kann verwendet werden.
Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Proteine eine K_D für Plasmin von höchstens in etwa 5 nM, mehr bevorzugt höchstens in etwa 300 pM und am meisten bevorzugt 100 pM oder weniger. Vorzugsweise ist die Bindung inhibitorisch, so dass die K_i gleich der K_D ist. Die K_i von SPI11 für Plasmin ist in etwa 88 pM.
PHARMAZEUTISCHE VERFAHREN UND ZUBEREITUNGEN
Das bevorzugte Individuum dieser Erfindung ist ein Säuger. Die Erfindung ist besonders nützlich für die Behandlung von Menschen, aber ist auch für veterinärmedizinische Anwendungen geeignet.
„Schutz" bedeutet hierin „Verhinderung", „Unterdrückung" und „Behandlung". „Verhinderung" schließt die Verabreichung eines Arzneimittels vor der Induktion einer Erkrankung ein. „Unterdrückung" schließt die Verabreichung eines Arzneimittels vor dem klinischen Auftreten einer Erkrankung ein. „Behandlung" schließt die Verabreichung eines Arzneimittels nach dem Auftreten einer Erkrankung ein.
In der Human- und Veterinärmedizin mag es nicht möglich sein, zwischen „Verhindern" und „Unterdrücken" zu unterscheiden, da das/die induzierende(n) Ereigniss(e) unbekannt oder verborgen sein kann oder der Patient erst nach dem Auftreten des/der induzierenden Ereignis(se) ermittelt werden kann. Wir verwenden den Begriff „Prophylaxe" als getrennt von „Behandlung", wobei er „Verhindern" und „Unterdrücken" umfassen soll. Hierin schließt „Schützen" „Prophylaxe" ein. Der Schutz muss nicht absolut sein, um nützlich zu sein.
Die erfindungsgemäßen Proteine können durch beliebige Mittel, systemisch oder topisch, verabreicht werden, um ein Individuum gegen eine Erkrankung oder einen Beschwerdezustand zu schützen. Zum Beispiel kann die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung auf einem beliebigen parenteralen Weg, durch Bolus-Injektion oder graduelle Perfusion, erfolgen. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung auf dem oralen Weg erfolgen. Eine geeignete Behandlungsstrategie umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge des Proteins, die als Einzeldosis oder in Form mehrerer Dosen über einen Zeitraum von Stunden, Tagen, Monaten oder Jahren, verabreicht wird.
Die geeignete Dosis eines erfindungsgemäßen Proteins kann von dem Alter, dem Geschlecht, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, der Art einer gleichzeitigen Behandlung, soweit zutreffend, der Häufigkeit der Behandlung und der gewünschten Wirkung abhängen. Die am meisten bevorzugte Dosis kann jedoch an das einzelne Individuum angepasst sein, so wie dies der Fachmann versteht und bestimmen kann, indem ohne unzumutbare Experimente die Dosis auf eine in der Technik bekannte Weise angepasst wird.
Bezüglich Verfahren fair präklinische und klinische Tests von Arzneimitteln, einschließlich Proteinen, siehe z.B. Berkow et al., Hrsg., The Merck Manual, 15. Auflage, Merck und Co., Rahway, NJ., 1987; Goodman et al., Hrsg., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, B. Auflage, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3. Auflage, ADIS Press, LTD., Williams und Wilkins, Baltimore, MD. (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown und Co., Boston (1985), wobei die genannten Literaturstellen und darin zitierten Literaturstellen hierin durch Verweis eingeschlossen sind.
Zusätzlich zu einem hierin offenbarten Protein kann eine pharmazeutische Zusammensetzung pharmazeutisch zulässige Träger, Arzneimittelträger oder Hilfsstoffe enthalten. Siehe z.B. Berker, supra, Goodman, supra, Avery, supra und Ebadi, supra.
DIAGNOSTISCHE IN-VITRO-VERFAHREN UND REAGENZIEN
Erfindungsgemäße Proteine können in vitro zu jeder beliebigen geeigneten Probe zugegeben werden, die Plasmin enthalten könnte, um das vorhandene Plasmin zu messen. Dafür muss der Test ein Signal-erzeugendes Systems (SPS) enthalten, das ein nachweisbares Signal liefert, das von der Menge des vorhandenen Plasmins abhängt. Das Signal kann visuell oder instrumentell nachgewiesen werden. Mögliche Signale schließen die Produktion farbiger, fluoreszierender oder lumineszierender Produkte, Änderungen der Eigenschaften der Absorption oder Emission von Strahlung durch einen Testbestandteil oder ein Testprodukt und die Ausfällung oder Agglutination eines Bestandteils oder Produkts ein.
Der Bestandteil des SPS, der am engsten mit dem diagnostischen Reagens verbunden ist, wird die „Markierung" genannt. Eine Markierung kann z.B. ein Radioisotop, ein Fluorophor, ein Enzym, ein Co-Enzym, ein Enzymsubstrat, eine elektronendichte Verbindung oder ein agglutinierbares Teilchen sein. Ein radioaktives Isotop kann unter Verwendung von zum Beispiel einem γ-Zähler oder einem Szintillationszähler oder durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Besonders nützliche Isotope schließen ³H, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ¹⁴C und vorzugsweise ¹²⁵I ein. Es ist auch möglich, eine Verbindung mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn die Fluoreszens-markierte Verbindung Licht mit der richtigen Wellenlänge ausgesetzt wird, kann seine Anwesenheit nachgewiesen werden. Unter den am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Fluoreszens-Markierungsverbindungen befinden sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin. Alternativ können Fluoreszenz-emittierende Metalle, wie z.B. ¹²⁵Eu oder andere Lanthanide an dem Bindungsprotein unter Verwendung solcher Metallchelat-bildender Gruppen wie Diethylentriaminpentaessigsäure oder Ethylendiamintetraessigsäure befestigt werden. Die Proteine können auch durch Kopplung an eine chemilumineszente Verbindung, wie z.B. Luminol, Isolumino, theromatischen Acridinester, Imidazol, Acridinsalz und Oxalatester nachweisbar markiert werden. Ebenso kann eine biolumineszierende Verbindung, wie z.B. Luciferin, Luciferase und Aequorin, verwendet werden, um das Bindungsprotein zu markieren. Die Gegenwart eines biolumineszierenden Proteins wird durch Nachweis der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt. Enzymmarkierungen, wie z.B. Meerrettichperoxidase und alkalische Phosphatase, sind bevorzugt.
Es gibt zwei Grundtypen der Tests: heterogene und homogene. Bei heterogenen Tests beeinflusst die Bindung des Affinitätsmoleküls an den Analyten nicht die Markierung; somit muss die gebundene Markierung von der freien Markierung abgetrennt werden, um die Menge des Analyten zu bestimmen. Bei homogenen Tests beeinflusst die Wechselwirkung die Aktivität der Markierung, und der Analyt kann ohne Abtrennung gemessen werden.
Im Allgemeinen kann ein plasminbindendes Protein (PBP) in der gleichen Weise wie ein Antiplasmin-Antikörper diagnostisch verwendet werden. Somit kann es, abhängig von dem Testformat, für die Untersuchung von Plasmin oder, durch kompetitive Hemmung, von anderen Substanzen, die Plasmin binden, verwendet werden.
Die Probe wird normalerweise eine biologische Flüssigkeit, wie z.B. Blut, Urin, Lymphe, Samen, Milch oder Zerebrospinalflüssigkeit oder ein Derivat davon oder ein biologische Gewebe, z.B. ein Gewebeschnitt oder Homogenat, sein. Die Probe könnte alles Beliebige sein. Falls die Probe eine biologische Flüssigkeit oder Gewebe ist, kann sie aus einem Menschen oder anderen Säuger, Wirbeltier oder Tier oder aus einer Pflanze gewonnen werden. Die bevorzugte Probe ist Blut oder eine Fraktion oder ein Derivat davon.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das plasminbindende Protein (PBP) immobilisiert, und in der Probe vorhandenes Plasmin kann mit einer bekannten Menge eines markierten oder spezifisch markierbaren Plasminanalogs kompetitieren. Das „Plasminanalog" ist ein Molekül, das fähig ist, mit Plasmin um die Bindung an das PBP zu kompetitieren, und schließt Plasmin selbst ein. Es kann bereits markiert sein oder kann nachfolgend durch spezifische Bindung der Markierung an einen Rest, der das Plasminanalog von Plasmin unterscheidet, markiert werden. Die Phasen werden getrennt und das markierte Plasminanalog in einer Phase wird quantifiziert.
In einem „Sachwichtest" werden sowohl ein insolubilisiertes Plasmin-Bindungsmittel (PBA) als auch ein markiertes PBA verwendet. Der Plasminanalyt wird von dem insolubilisierten PBA gefangen und wird durch das markierte PBA markiert, wobei ein ternärer Komplex gebildet wird. Die Reagenzien können zu der Probe in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden. Die PBAs können gleich oder verschieden sein, und nur ein PBA muss ein erfindungsgemäßes PBP sein (das andere kann z.B. ein Antikörper sein). Die Menge an markiertem PBA in dem ternären Komplex ist zu der Menge von Plasmin in der Probe direkt proportional.
Die beiden oben beschriebenen Ausführungsbeispiele sind beide heterogene Tests. Ein homogener Test erfordert nur, dass die Markierung von der Bindung von PBP an Plasmin beeinflusst wird. Der Plasmin-Analyt kann auf seine eigene Markierung einwirken, falls ein Plasmininhibitor als ein diagnostisches Reagens verwendet wird.
Eine Markierung kann direkt oder indirekt (z.B. durch einen markierten Anti-PBP-Antikörper), kovalent (z.B. mit SPDP) oder nicht-kovalent, an das plasminbindende Protein gebunden sein, um ein diagnostisches Reagens herzustellen. In ähnlicher Weise kann das plasminbindende Protein an einen Festphasenträger gebunden werden, um ein Festphasen(„Fänger")-diagnostisches Reagens zu bilden. Geeignete Träger schließen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen und Magnetit ein. Der Träger kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung in einem gewissen Umfang fest oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann jede beliebige Struktur haben, so lange das gekoppelte Molekül in der Lage ist, Plasmin zubinden.
Diagnostische In-vivo-Verwendungen
Eine Kunitz-Domäne, die sehr fest an Plasmin bindet, kann für die In-vivo-Bilddarstellung verwendet werden. Die diagnostische Bilddarstellung von Krankheitsherden wurde als eine der größten kommerziellen Möglichkeiten fair monoklonale Antikörper angesehen, aber diese Möglichkeit wurde nicht erreicht. Trotz erheblicher Anstrengungen wurden nur zwei auf monoklonalen Antikörpern basierende Bilddarstellungsmittel zugelassen. Die mit monoklonalen Antikörpern erhaltenen enttäuschenden Ergebnisse beruhen zu einem großen Teil auf

(i) unzureichender Affinität und/oder Spezifität;
(ii) geringem Eindringen zu den Zielorten;
(iii) langsamer Beseitigung von Nicht-Zielorten;
(iv) Immunogenität (die meisten sind murin); und
(v) hohen Herstellungskosten und geringer Stabilität.

Diese Beschränkungen haben die Meisten auf dem diagnostischen Bilddarstellungsgebiet dazu veranlasst, mit der Entwicklung Peptid-basierter Bilddarstellungsmittel zu beginnen. Während diese potenziell die Probleme des geringen Eindringens und der langsamen Beseitigung lösen, ist es unwahrscheinlich, dass Peptid-basierte Bilddarstellungsmittel eine ausreichende Affinität, Spezifität und In-vivo-Stabilität besitzen, um für die meisten Anwendungen geeignet zu sein.
Konstruierte Proteine sind in einzigartiger Weise geeignet, die Anforderungen an ein Bilddarstellungsmittel zu erfüllen. Insbesondere vereinen sich die außergewöhnliche Affinität und Spezifität, die durch die Konstruktion kleiner, stabiler Proteindomänen humanen Ursprungs, die bekannte In-vivo-Beseitigungs-Raten und -mechanismen aufweisen, erreichbar sind, um frühzeitigere, verlässlichere Ergebnisse, eine geringere Toxizität, geringere Nebenwirkungen, geringere Herstellungs- und Lagerungskosten und eine leichtere Herstellung der Markierung zu ermöglichen. Tatsächlich sollte es möglich sein, das Ziel von Echtzeit-Darstellungen mit konstruierten Protein-Bilddarstellungsmitteln zu erreichen. Plasmin-bindende Proteine, z.B. SPI11, mögen nützlich für die Lokalisierung von Orten innerer Blutung sein.
Radioaktiv markiertes Bindungsprotein kann dem menschlichen oder tierischen Individuum verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt typischerweise durch Injektion, z.B. intravenös oder arteriell, oder durch andere Verabreichungsmittel in einer ausreichenden Menge, um eine nachfolgende dynamische und/oder statische Bilddarstellung unter Verwendung geeigneter Radioaktivitäts-Nachweisvorrichtungen zu ermöglichen. Die Dosierung ist die geringste Menge, die in der Lage ist, eine diagnostisch effektive Bilddarstellung zu ermöglichen, und kann durch herkömmliche Mittel des Standes der Technik unter Verwendung bekannter radioaktiver Bilddarstellungsmittel als Anhaltspunkt bestimmt werden.
Typischerweise wird die Bilddarstellung an dem gesamten Körper des Individuums oder an dem für den zu untersuchenden Zustand oder die Erkrankung relevanten Teil des Körpers oder Organ durchgeführt. Das radioaktiv markierte Bindungsprotein hat sich angehäuft. Die Menge des zu einem gegebenen Zeitpunkt in den relevanten Zielorganen angehäuften radioaktiv markierten Bindungsproteins kann dann bestimmt werden.
Eine besonders geeignete Radioaktivitäts-Nachweisvorrichtung ist eine Szintillationskamera, wie z.B. eine γ-Kamera. Die Nachweisvorrichtung in der Kamera nimmt den radioaktiven Zerfall wahr und zeichnet ihn auf (und digitalisiert ihn wahlweise). Die digitalisierte Information kann in jeder beliebigen geeigneten Weise, wovon zahlreiche im Stand der Technik bekannt sind, analysiert werden. Zum Beispiel kann eine Zeit-Aktivitäts-Analyse die Aufnahme bis zur Beseitigung des radioaktiv markierten Bindungsproteins durch die Zielorgane im Zeitverlauf darstellen.
Verschiedene Faktoren werden bei der Auswahl eines geeigneten Radioisotops in Erwägung gezogen. Das Isotop wird ausgewählt: um eine Auflösung mit guter Qualität bei der Bilddarstellung zu ermöglichen, um sicher bei der diagnostischen Anwendung in Menschen und Tieren zu sein und, vorzugsweise, um eine kurze Halbwertszeit zu haben, um dadurch die Menge der von dem Körper aufgenommenen Strahlung zu verringern. Das verwendete Radioisotop sollte vorzugsweise pharmakologisch inert sein, und die verabreichten Mengen sollten keinen erheblichen physiologischen Effekt haben. Das Bindungsprotein kann mit verschiedenen Isotopen von Iod, z.B. ¹²³1, ¹²⁵I oder ¹³¹I (siehe zum Beispiel US-Patent 4,609,725) radioaktiv markiert sein. Die Menge der Markierung muss in geeigneter Weise überprüft werden.
Bei Verabreichungen an menschliche Individuen kann es wünschenswert sein, andere Radioisotope als ¹²⁵I für die Markierung zu verwenden, um die gesamte dosimetrische Belastung des Körpers zu verringern und die Nachweisbarkeit des markierten Moleküls zu optimieren. Unter dem Gesichtspunkt einer leichten klinischen Verfügbarkeit fair die Verwendung in Menschen schließen bevorzugte Radiomarkierungen ein: ^99mTc, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁹⁰Y, ¹¹¹In, ^113mIn, ¹²³I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re oder ²¹¹At. Radiomarkiertes Protein kann nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Diese schließen Radiohalogenierung durch das Chloramin-T- oder das Lactoperoxidase-Verfahren und eine nachfolgende Reinigung durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie ein, siehe z.B. Gutkowska et al. in „Endocrinology and Metabolism Clinics of America: (1987) 16 (1):183. Andere Verfahren zur radioaktiven Markierung, wie z.B. IODOBEADS^TM, können verwendet werden.
Ein radiomarkiertes Protein kann in jeder beliebigen Weise verabreicht werden, die es dem aktiven Mittel ermöglicht, den Wirkort des Mittels in einem Säuger zu erreichen. Weil Proteine bei der oralen Verabreichung verdaut werden, würde gewöhnlich eine parenterale Verabreichung, z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär, verwendet werden, um die Absorption zu optimieren.
Andere Verwendungen
Die erfindungsgemäßen Plasmin-Bindungsproteine können auch verwendet werden, um Plasmin aus einer Flüssigkeit, z.B. Blut, zu reinigen. Zu diesem Zweck wird PBP vorzugsweise auf einem unlöslichen Träger immobilisiert. Solche Träger schließen die bereits als nützlich für die Herstellung von diagnostischen Festphasenreagenzien erwähnten ein.
Proteine können als Molekulargewichtsmarker als Referenz bei der Trennung oder Reinigung von Proteinen verwendet werden. Es kann erforderlich sein, Proteine zu denaturieren, damit sie als Molekulargewichtsmarker dienen können. Eine zweite allgemeine Verwendungsmöglichkeit für Proteine ist die Verwendung von hydrolysiertem Protein als Nährstoffquelle. Proteine können auch verwendet werden, um die Viskosität einer Lösung zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Protein kann für jeden beliebigen der vorstehenden Zwecke verwendet werden, sowie für therapeutische und diagnostische Zwecke, wie an früherer Stelle in dieser Beschreibung erörtert.
HERSTELLUNG VON PEPTIDEN
Die chemische Polypeptidsynthese ist ein sich schnell entwickelndes Gebiet der Technik, und Verfahren für die Festphasen-Polypeptidsynthese sind in den folgenden Literaturstellen gut beschrieben, die hiermit durch Verweis vollständig eingeschlossen sind: (Merrifield, J Amer Chem Soc 85:2149–2154 (1963); Merrifield, Science 232:341–347 (1986); Wade et al., Biopolymers 25:521–537 (1986); Fields, Int J Polypeptide Prot Res 35:161 (1990); MilliGen Report Nrn. 2 und 2a, Millipore Corporation, Bedford, MA (1987); Ausubel et al., supra, und Sambrook et al., supra. Tan und Kaiser (Biochemistry, 1977, 16:1531–41) synthetisierten BPTI und ein Homolog vor achtzehn Jahren.
Wie im Stand der Technik bekannt ist, umfassen solche Verfahren das Blockieren oder Schützen reaktiver funktioneller Gruppen, wie z.B. freier Amino-, Carboxyl- und Thiogruppen. Nach der Bildung von Polypeptidbindungen werden die Schutzgruppen entfernt. Somit erfordert das Hinzufügen jedes Aminosäurerestes mehrere Reaktionsschritte für das Schützen und Entschützen. Die derzeitigen Verfahren verwenden die Festphasensynthese, wobei die C-terminale Aminosäure kovalent an unlösliche Harzpartikel gebunden wird, die filtriert werden können. Die Reaktanden werden durch Waschen der Harzpartikel mit entsprechenden Lösungsmitteln unter Verwendung eines Automaten entfernt. Verschiedene Verfahren, einschließlich des „tBoc"-Verfahrens und des „Fmoc"-Verfahrens sind im Stand der Technik wohl bekannt. Siehe inter alia Atherton et al., J Chem Soc Perkin Trans 1:538–546 (1981) und Sheppard et al., Int J Polypeptide Prot Res 20:451–454 (1982).
BEISPIELE
Beispiel 1: Konstruktion einer LACI-(K1)-Bibliothek
Eine synthetische Oligonukleotid-Duplex, die NsiI- und MluI-kompatible Enden aufwies, wurde in einen Parentalvektor (LACI-K1::III) kloniert, der zuvor mit den obigen zwei Enzymen gespalten wurde. Das resultierende ligierte Material wurde durch Elektroporation in den XLIMR-(F^–)-E. coli-Stamm transfiziert und auf Ampicillin-(Ap)-Platten plattiert, um Phagen-erzeugende Ap^R-Kolonien zu erhalten. Das Variierungsschema für die Phase 1 konzentrierte sich auf die P1-Region und betraf die Reste 13, 16, 17, 18 und 19. Es erlaubte 6,6 × 10⁵ verschiedene DNA-Sequenzen (3,1 × 10⁵ verschiedene Proteinsequenzen). Die erhaltene Bibliothek bestand aus 1,4 × 10⁶ unabhängigen Cfus, was einer in etwa zweifachen Repräsentation der gesamten Bibliothek entsprach. Der anhand dieser Plattierung hergestellte Phagenvorrat enthielt einen Gesamttiter von 1,4 × 10¹³ Pfus in in etwa 3,9 ml, worin jeder unabhängige Klon im Durchschnitt 1 × 10⁷ Mal und insgesamt 2,6 × 10⁶ Mal pro ml des Phagenvorrats repräsentiert war.
Um die Variierung der Reste 31, 32, 34 und 39 (Phase II) zu erlauben, wurden synthetische Oligonukleotid-Duplices mit MluI- und BstEII-kompatiblen Enden in zuvor gespaltene R_f-DNA kloniert, die von den folgenden abgeleitet war

i) dem Parentalkonstrukt,
ii) der Phase-I-Bibliothek, oder
iii) präsentierenden Phagen, die aus der ersten Phase aufgrund der Bindung an ein gegebenes Zielmolekül selektiert waren.

Das Variierungsschema für die Phase II erlaubte 4096 verschiedene DNA-Sequenzen (1600 verschiedene Proteinsequenzen) aufgrund von Veränderungen bei den Resten 31, 32, 34 und 39. Die abschließende Phase-II-Variierung hängt von dem Ausmaß der Variierung ab, die nach den drei Runden der Bindung und Eluierung mit einem gegebenen Zielmolekül in der Phase I übrig bleibt.
Die kombinierte mögliche Variierung beider Phasen entspricht 2,7 × 10⁸ verschiedenen DNA-Sequenzen oder 5,0 × 10⁷ verschiedenen Proteinsequenzen. Wenn zuvor selektierte Präsentationsphagen als Ursprung der R_f-DNA für die Phase-II-Variierung verwendet werden, ist das endgültige Ausmaß der Variierung wahrscheinlich in dem Bereich von 10⁵ bis 10⁶.
Beispiel 2: Screening der LACI-K1-Bibliothek auf die Bindung an Plasmin
Das Schema für die Selektion von LACI-K1-Varianten, die Plasmin binden, umfasst die Inkubation der Phagenpräsentationsbibliothek mit Plasmin-Kügelchen (Calbiochem, San Diego, CA; Katalog-Nr. 527802) in einem Puffer (PBS, enthaltend 1 mg/ml BSA), bevor ungebundene und schlecht gebundene Präsentationsphagenvarianten mit PBS, das 0,1 Tween 20 enthält, weggewaschen werden. Die stärker gebundenen Präsentationsphagen werden mit einem Niedrig-pH-Eluierungspuffer, typischerweise Citratpuffer (pH 2,0), der 1 mg/ml BSA enthält, der sofort mit Tris-Puffer auf pH 7,5 neutralisiert wird, eluiert. Dieser Vorgang stellt eine einzige Selektionsrunde dar.
Der neutralisierte, eluierte Präsentationsphage kann verwendet werden, entweder:

i) um einen F⁺-Stamm von E. coli zu inokulieren, um einen neuen Präsentationsphagen-Vorrat für die Verwendung in nachfolgenden Selektionsrunden (so genanntes konventionelles Screening) herzustellen, oder
ii) direkt für eine andere unmittelbare Selektionsrunde mit den Proteasekügelchen (so genanntes Quickscreening).

Typischerweise werden drei Runden eines der Verfahren oder eine Kombination der beiden durchgeführt, um endgültig ausgewählten Präsentationsphagen zu erhalten, wovon eine repräsentative Anzahl entweder als Gemische von Präsentationsphagen oder als Einzelklone sequenziert und bezüglich ihrer Bindungseigenschaften analysiert werden.
Für die LACI-K1-Bibliothek wurden zwei Selektionsphasen durchgeführt, die jeweils aus drei Bindungs- und Eluierungsrunden bestanden. Die Phase-I-Selektion verwendete die Phase-I-Bibliothek (variierte Reste 13, 16, 17, 18 und 19), die drei Runden der Bindung und Eluierung gegen Plasmin durchlief, was zu einer Subpopulation von Klonen führte. Die von diesen selektierte Subpopulation abgeleitete R_f-DNA wurde zur Herstellung der Phase-II-Bibliothek (Hinzufügung der variierten Reste 31, 32, 34 und 39) verwendet. In etwa 5,6 × 10⁷ unabhängige Transformanten wurden erhalten. Die Phase-II-Bilbiotheken wurden drei weiteren Bindungs- und Eluierungsrunden mit derselben Zielprotease unterzogen, was zu den endgültigen Selektanten führte.
Nach zwei Phasen der Selektion gegen Plasmin-Agarosekügelchen wurde eine repräsentative Anzahl (16) Präsentationsphagen der letzten Selektion sequenziert. Die Tabelle 2 zeigt die Sequenzen der selektierten LACI-K1-Domänen mit den selektierten Aminosäuren an den variierten Positionen in Großbuchstaben. Beachte die absolute Selektion der Reste P₁₃, A₁₆, R₁₇, F₁₈ und E₁₉. Es gibt eine sehr starke Selektion für E bei 31 und Q bei 32. Es gibt keinen Konsensus bei 34; die beobachteten Aminosäuren sind {T₃, Y₂, H₂, D, R, A, V₂, I₃ und L}. Die Aminosäuren mit Seitengruppen, die an C_β verzweigt sind (T, I und V), sind mehrfach repräsentiert und sind bevorzugt. An der Position 39 gibt es keinen starken Konsensus (G₆, D₃, Q₂, A₂, R, F, E), aber G, D, Q und A scheinen bevorzugt zu sein (in dieser Reihenfolge).
Ein separates Screening der LACI-K1-Bibliothek gegen Plasmin ergab einen sehr ähnlichen Konsensus anhand 16 sequenzierter, ausgewählter Präsentationsphagen. Diese Sequenzen sind in der Tabelle 3 gezeigt (selektierte Reste in Großbuchstaben). Diese Sequenzen weichen von denjenigen der Tabelle 2 ab, indem E hier an der Position 19 vorherrscht. Es gibt einen Konsensus bei 34 (T₅, V₃, S₃, I₂, L, A, F) von T, V oder S. Bei der Kombination der beiden Sätze gibt es eine Präferenz für (in der Reihenfolge der Präferenz) T, V, I, S, A, H, Y und L, wobei F, D und R erlaubt sind.
EXPRESSION, REINIGUNG UND KINETISCHE ANALYSE
Die drei Isolate QS4, ARFK#1 und ARFK#2 wurden in einen Hefe-Expressionsvektor umkloniert. Der Hefe-Expressionsvektor ist von pMFalpha8 (KLTRJ82 und MIYA85) abgeleitet. Die LACI-Varianten-Gene wurden an einen Teil des matα1-Gens fusioniert, wodurch ein Hybridgen erzeugt wurde, das aus dem matα1-Promotor-Signalpeptid und dem -Leader bestand, die an die LACI-Variante Sequenz-fusioniert waren. Die Klonierungsstelle ist in der Tabelle 24 gezeigt. Beachte, dass das korrekt prozessierte LACI-K1-Variantenprotein, wie in der Tabelle 2 und der Tabelle 3 detailliert angegeben, mit der Hinzufügung der Reste Glu-Ala-Ala-Glu an das N-terminale Met (Rest 1 in der Tabelle 2 und der Tabelle 3) sein sollte. Die Expression in S. cerevisiae ergab eine Ausbeute von in etwa 500 μg Proteaseinhibitor pro Liter Medium. In Hefe exprimiertes LACI (Kunitz-Domäne 1), BPTI und LACI-Varianten: QS4, ARFK#1 und ARFK#2 wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Trypsin-Agarosekügelchen gereinigt.
Der am meisten bevorzugte Produktionswirt ist Pichia pastoris unter Verwendung des Alkoholoxidase-Systems. Andere haben eine Anzahl von Proteinen in der Hefe Pichia pastoris produziert. Zum Beispiel haben Vedvick et al. (VEDV91) und Wagner et al. (WAGN92) Aprotinin von dem Alkoholoxidase-Promotor durch Induktion durch Methanol als ein in das Kulturmedium mit ≈1 mg/ml sekretiertes Protein produziert. Gregg et al. (GREG93) haben die Produktion einer Anzahl von Proteinen in P. pastoris in einem Übersichtsartikel dargestellt. Die Tabelle 1 von GREG93 zeigt Proteine, die in P. pastoris hergestellt wurden und die Ausbeuten.
Kinetische Daten
Die Inhibierung der Hydrolyse von Succinyl-Ala-Phe-Lys-(F₃Ac)AMC (einem Methylcumarin) (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) durch Plasmin bei 2,5 × 10^–3 M mit veränderlichen Inhibitormengen wurde an die Standardform durch Least-Square-Fit für ein fest bindendes Substrat angepasst. Eine vorläufige Kinetikanalyse der zwei ARFK-Varianten zeigte eine sehr ähnliche inhibitorische Aktivität zu derjenigen der QS4-Variante. Diese Messungen wurden mit physiologischen Salzmengen (150 mM) durchgeführt, sodass die Affinitäten relevant für die Wirkungen der Proteine im Blut sind.
Die Tabelle 23 zeigt, dass QS4 ein hochspezifischer Inhibitor von humanem Plasmin ist. Phage, der das LACI-K1-Derivat QS4 präsentiert, bindet an Plasminkügelchen wenigstens 50 Mal häufiger, als er an die anderen Proteaseziele bindet.
NEUE BIBLIOTHEK FÜR PLASMIN
Eine neue Bibliothek von LACI-K1-Domänen, die auf M13-gIIIp präsentiert werden und die in der Tabelle 5 gezeigte Diversität enthalten, wurde hergestellt und auf Plasminbindung gescreent. Die Tabelle 6 zeigt die selektierten Sequenzen und den Konsensus. Wir charakterisierten die Bindung der selektierten Proteine, indem wir die Bindung klonal reinen Phagens mit BPTI-Präsentationsphagen verglichen. Die Isolate 11, 15, 08, 23 und 22 waren dem BPTI-Phagen überlegen. Wir produzierten lösliches SPI11 (Selected Plasmin Inhibitor #11) und testeten seine inhibitorische Aktivität, wobei wir eine K; von 88 pM erhielten, was wenigstens zweifach besser als BPTI ist. Deshalb glauben wir, dass die Selektanten SPI15, SPI08 und SPI22 BPTI bei weitem überlegen sind und dass SPI23 wahrscheinlich in etwa gleich stark wie BPTI ist. Alle aufgelisteten Proteine sind einer Aminosäuresequenz eines humanen Proteins viel näher, als es BPTI ist, und haben somit ein geringeres immunogenes Potenzial.
Tabelle 1: Sequenz des gesamten LACI: SEQ ID NR. 1
Die Signalsequenz (1–28) ist in Großbuchstaben und unterstrichen
LACI-K1 ist in Großbuchstaben
LACI-K2 ist unterstrichen
LACI-K3 ist in Fettdruck
Tabelle 5: vgDNA für LACI-D1, um die Reste 10, 11, 13, 15, 16, 17 & 19 für Plasmin im Hinblick auf App-I (von der nunmehr bekannt ist, dass sie nicht sehr wichtig ist) zu variieren.

DNA : 262,144 * 4 = 1; 048,576
Protein : 143,360 * 4 = 573,440,
Die Aminosäuresequenz hat die SEQ ID NR. 85.

Diese Variierung erlaubt der AppI-Sequenz, an den P6-P6'-Positionen zu erscheinen.

„Unters." ist die Anzahl der Unterschiede von dem Konsensus.
„Phagenbindung" ist die Bindung von Phagen, die das angegebene Protein präsentieren, im Vergleich zu der Bindung von Phagen, die BPTI präsentieren.

Tabelle 7: Variierung der Reste 31, 32, 34 und 39
Die Aminosäuresequenz hat SEQ ID NR. 87.
Die EcoRI-Stelle wurde entfernt; somit kann eine Spaltung mit EcoRI dazu verwendet werden, die Parental-DNA zu beseitigen (oder wenigstens weitgehend zu entfernen).
Es gibt 262.144 DNA-Sequenzen und 72.000 Proteinsequenzen.
Tabelle 8, fortgesetzt
In der Tabelle bedeutet „-,,, dass das Protein den Konsensustyp (Con1) aufweist. Con1 enthält an jeder Position den häufigsten Typ; die in Con1 gezeigten Aminosäuren wurden nicht variiert. Vier Positionen (10, 31, 34 und 39) zeigten eine signifikante Toleranz gegenüber einem zweiten Typ, was zu 15 Neben-Konsensussequenzen führte: Con2-Con16. Die Spalte „# Unters." gibt die Anzahl der Unterschiede zu Con1 unter „C1", die Unterschiede zu dem nächsten von Con1-Con6 unter „C" und die Unterschiede zu LACI-K1 unter „K1" an. SPI11 wurde aus einer Bibliothek selektiert, in der die Reste 31–39 wie beim Wildtyp blieben.
Der Wechsel von A, F, H, I, L, M, P, V, W oder Y zu C ist semikonservativ, falls das neue Cystein als ein freies Thiol verbleibt.
Der Wechsel von M zu E, R, K ist semikonservativ, falls die ionische Spitze der neuen Seitengruppe die Proteinoberfläche erreichen kann, während die Methylengruppen hydrophobe Kontakte bilden.
Der Wechsel von P zu einem aus K, R, E oder D ist semikonservativ, falls die Seitengruppe auf oder nahe der Oberfläche des Proteins ist.
Tabelle 12: vgDNA für LACI-D1 für die Variierung der Reste 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 37, 38 und 39 für Plasmin im Hinblick auf App-I und SPI11

Der erste (obere} DNA-Strang hat die SEQ ID NR. 120.
Der zweite (untere) DNA-Strang hat die SEQ ID NR. 121.
Die Aminosäuresequenz hat SEQ ID NR. 122.
Der obere Strang muss für die Kodons 31–42 (gezeigt) nicht synthetisiert werden, sondern wird mittels PCR anhand der gezeigten Stränge erzeugt.

Es gibt 1,37 × 10¹¹ DNA-Sequenzen, die für 4,66 × 10¹⁰ Aminosäuresequenzen kodieren.
In der Tabelle 15 sind die fett gedruckten Rest-Typen bevorzugt.
LACI-K1-Phagen wurden als Einheit für die Bindung bei jedem Zielmolekül zugrunde gelegt und die anderen Präsentationsphagen sind als relative Bindung angegeben. BPT::III-Phagen sind nicht leicht von Trypsin ablösbar.
TABELLE 24: Mat α S. cerevisiae Expressionsvektoren:
Wir erwarten, dass die Mata-Präsequenz vor GLU_a-ALA_b- abgespalten wird.
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WUNT88: Wun et al., J. BIOL. CHEM. (1988) 263:6001–6004.

Claims

Isoliertes Polypeptid umfassend eine Kunitzdomänenstruktur, umfassend die Aminosäuresequenz: Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Gly-Xaa13-Cys-Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Arg-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Cys-Xaa31-Xaa32-Phe-Xaa34-Xaa35-Gly-Gly-Cys-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46-Xaa47-Xaa48-Xaa49-Xaa50-Cys-Xaa52-Xaa53-Xaa54-Cys-Xaa56-Xaa57-Xaa58, worin: eine jede von Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa56, Xaa57 oder Xaa58 abwesend sein kann; Xaa10 ausgewählt ist aus Asp und Glu; Xaa11 ausgewählt ist aus Thr, Ala und Ser; Xaa13 Pro ist; Xaa15 Arg ist; Xaa16 Ala ist; Xaa17 Arg ist; Xaa18 Phe ist; Xaa19 ausgewählt ist aus Glu und Asp; Xaa21 ausgewählt ist aus Phe und Trp; Xaa22 ausgewählt ist aus Tyr und Phe; Xaa23 ausgewählt ist aus Tyr und Phe; Xaa31 ausgewählt ist aus Asp und Glu; Xaa32 ausgewählt ist aus Thr, Ala und Glu; Xaa34 ausgewählt ist aus Val, Ile und Thr; Xaa35 Tyr ist; Xaa36 Gly ist; Xaa39 ausgewählt ist aus Glu, Gly und Asp; Xaa40 ausgewählt ist aus Gly und Ala; Xaa43 ausgewählt ist aus Asn und Gly; und Xaa45 ausgewählt ist aus Phe und Tyr, worin das Polypeptid Plasmin inhibiert.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid humanes Plasmin mit einem K_i von 20 nanomolar oder weniger inhibiert, vorzugsweise 5 nanomolar oder weniger, und mehr bevorzugt 300 picomolar oder weniger, wie gemessen durch kompetitive Inhibierung des Enzyms um die Bindung zwischen dem Inhibitor und dem Enzymsubstrat.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin das Polypeptid humanes Plasmin mit einem K_i von 100 picomolar oder weniger inhibiert, wie gemessen durch kompetitive Inhibierung des Enzyms um die Bindung zwischen dem Inhibitor und dem Enzymsubstrat.
Polypeptid nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SPI11 (SEQ ID NR:40), SPI15 (SEQ ID NR:41), DPI-1.1.1 (SEQ ID NR:61), DPI-1.1.2 (SEQ ID NR:62) und DPI-1.1.3 (SEQ ID NR:63).
Verwendung eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 bei der Herstellung eines Medikaments fair die Behandlung von nicht angemessener Fibrinolyse oder Fibrinogenolyse, übermäßiger Blutung assoziiert mit Thrombolytika, postoperativer Blutung oder nicht angemessener Angiogenese.
Verfahren zur Untersuchung der Anwesenheit von Plasmin in einer Probe, das umfasst Zugeben eines Polypeptids nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 in markierter oder insolubilisierter Form zu der Probe und Bestimmen, ob sich ein Komplex des Polypeptids und Plasmin in der Probe gebildet hat.
Verfahren zur Reinigung von Plasmin aus einer Mischung, das Inkontaktbringen der Mischung mit dem Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 in insolubilisierter Form und Bindenlassen des Plasmins umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das Polypeptid nach einem beliebigen der Ansprüche 1–4 in einem pharmazeutisch geeigneten Träger.