ES2910004T3 - Proteínas de señalización de múltiples partes y sus usos - Google Patents

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Abstract

Una célula recombinante, que comprende: a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un primer dominio transmembrana y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que comprende una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando; y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa; en donde un factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de señalización de múltiples partes y sus usos
Antecedentes
Campo técnico
La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para usar proteínas de múltiples componentes en inmunoterapia y, más particularmente, usar multimerización inducida químicamente para generar proteínas receptoras de antígeno quiméricas para modular el control espacial y temporal de la iniciación de la señal celular y las respuestas posteriores durante la inmunoterapia adoptiva.
Descripción de la técnica relacionada
La terapia celular está emergiendo como un paradigma poderoso para suministrar señales complejas para una acción biológica. A diferencia de las composiciones de fármacos biológicos y de moléculas pequeñas, las células tienen el potencial de ejecutar tareas terapéuticas únicas debido a su miríada de programas sensoriales y de respuesta y mecanismos de control genético cada vez más definidos. Para lograr dicho valor terapéutico, las células deben tener una maquinaria para detectar e integrar información química y/o biológica asociada con los entornos fisiológicos locales.
El ejemplo de maquinaria de respuesta sensorial diseñada que más ha avanzado en la clínica es el de los receptores de antígeno quiméricos (CAR) en linfocitos T modificados genéticamente para su uso en inmunoterapia celular adoptiva (ver June y otros, Nat. Biotechnol. 30:611, 2012; Restifo y otros, Nat. Rev. Immunol. 12:269, 2012). La unión al antígeno estimula los dominios de señalización en el segmento intracelular del CAR, para transducir así señales que desencadenan mecanismos inflamatorios y de citotoxicidad. La inmunoterapia celular adoptiva basada en CAR se ha utilizado para tratar a pacientes de cáncer con tumores refractarios a los tratamientos de referencia convencionales (ver Grupp y otros, N. Engl. J. Med. 368:1509, 2013; Kalos y otros, Sci. Transl. Med. 3:95ra73, 2011).
Además de dirigirse a los linfocitos T e iniciar su activación, una inmunoterapia celular adoptiva eficaz también modularía preferentemente la expansión y la persistencia de los linfocitos T, así como la fuerza y la calidad de la señalización de los linfocitos T. Sin embargo, las respuestas de los linfocitos T mediadas por CAR en la actualidad no alcanzan todo el potencial de activación y proliferación de linfocitos T. La mejora de la función de CAR se ha logrado mediante la inclusión de dominios de señalización coestimuladores en la estructura de CAR (ver, por ejemplo, Kowolik y otros, Cancer Res. 66:10995, 2006; Milone y otros, Mol. Ther. 17:1453, 2009; Pule y otros, Mol. Ther. 12:933, 2005; Carpenito y otros, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:3360, 2009), pero los resultados clínicos han sido mixtos (ver, por ejemplo, Brentjens y otros, Blood 118:4817, 2011; Till y otros, Blood 119:3940, 2012; Kochenderfer y Rosenberg, Nat. Rev. Clin. Oncol. 10:267, 2013). Otros han incluido, además de un CAR, la coexpresión de ligandos coestimuladores (ver, por ejemplo, Stephan y otros, Nat. Med. 13:1440, 2007), receptores coestimuladores (ver, por ejemplo, Duong y otros, Immunother. 3:33, 2011; Wilkie y otros, J. Clin. Immunol. 32:1059, 2012), y citocinas (ver, por ejemplo, Hsu y otros, J. Immunol. 175:7226, 2005; Quintarelli y otros, Blood 110:2793, 2007).
Una preocupación con el uso de CAR es la toxicidad, que surge de dos formas: una es la destrucción dirigida del tejido normal y la segunda son los eventos adversos asociados con la liberación de citocinas (por ejemplo, la tormenta de citocinas). Por ejemplo, el daño colateral observado con los CAR dirigidos a CD19 es la aplasia de células B (Kalos y otros, 2011; Kochenderfer y otros, Blood 119:2709, 2012). Dichos efectos fuera de la diana podrían ser muy peligrosos, particularmente si el antígeno diana se encuentra en otros tejidos, como el corazón o el pulmón. Las tormentas de citocinas asociadas con una gran cantidad de linfocitos T activados pueden ser potencialmente mortales (Kalos y otros, 2011; Kochenderfer y otros, 2012). A diferencia de los tratamientos farmacológicos convencionales en los que la reducción de la dosis del fármaco puede controlar la toxicidad, la proliferación de linfocitos T no se puede controlar con las tecnologías CAR actuales y, por lo tanto, se producirá una inmunopatología una vez que se alcance un nivel umbral de linfocitos T.
En vista de las limitaciones asociadas con las respuestas de linfocitos T mediadas por CAR, existe la necesidad en la técnica de composiciones y métodos alternativos útiles para inmunoterapia en los que la modulación de la iniciación de señales en células inmunitarias y su expansión sea controlable. La presente descripción satisface tales necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.
El documento núm. US 6,972,193 B1 describe un proceso para la dimerización u oligomerización regulada de proteínas intracelulares. El documento núm. WO2014/127261 A1 describe un receptor de antígeno quimérico activo condicionalmente, heterodimérico. Fegan y otros describen técnicas y aplicaciones involucradas en el ensamblaje de proteínas que se controla químicamente. Banaszynski, y otros caracterizan el complejo ternario FKBPRapamicinaFRB. Spencer y otros describen el control de la transducción de señales con ligandos sintéticos.
El documento núm. WO2012/082841 A2 describe un linfocito T que expresa el receptor de antígeno quimérico anti­ etiqueta universal.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones. La presente descripción describe composiciones de células no naturales que tienen sistemas de transducción de señales que se controlan, tanto en su activación como en su desactivación, por agentes farmacológicos. En el presente documento se contemplan numerosos sistemas de transducción de señales de múltiples partes, que se controlan farmacológicamente.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona una célula no natural que comprende: una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa; en donde un primer factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.
En una modalidad particular, el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes.
En un aspecto adicional de la descripción, los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión se asocian con un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ácido abscísico (ABA) o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF) o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En otro aspecto de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBP y FRB, FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de estos.
En un aspecto determinado de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este.
En un aspecto particular de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este.
En un aspecto de la descripción, el factor puente es sirolimus, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus o zotarolimus.
En un aspecto adicional de la descripción, la primera molécula de ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende además un tercer dominio de multimerización.
En otro aspecto de la descripción, el tercer dominio de multimerización de la primera proteína de fusión es un dominio de unión para un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, Tmp-SLF o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto particular de la descripción, un segundo factor puente promueve la asociación de al menos dos primeras proteínas de fusión con el factor puente asociado y dispuesto entre los terceros dominios de multimerización de las primeras proteínas de fusión.
En un aspecto particular de la descripción, el complejo proteico es un homocomplejo que comprende al menos dos primeras proteínas de fusión.
En otro aspecto de la descripción, la primera proteína de fusión tiene al menos un dominio de multimerización de FKBP, DHFR o GyrB.
En un aspecto determinado de la descripción, el dominio de unión del complejo polipeptídico se une específicamente a una diana ubicada en la superficie de una célula diana.
En un aspecto adicional de la descripción, el complejo proteico es un heterocomplejo que comprende una o más primeras proteínas de fusión y una o más segundas proteínas de fusión.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio de unión del heterocomplejo proteico se une específicamente a una diana ubicada en la superficie de una célula diana.
En una modalidad particular, el dominio hidrófobo es un dominio transmembrana.
En otra modalidad particular, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD4, CD8 o CD28.
En una modalidad, el dominio activador comprende un dominio de señalización del receptor de linfocitos.
En una modalidad determinada, el dominio activador comprende uno o una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM).
En una modalidad determinada, el dominio activador comprende CD3e, CD38, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A o CD79B, o cualquier combinación de estos.
En una modalidad particular, la primera molécula de ácido nucleico codifica la primera proteína de fusión que comprende además un dominio activador diferente, un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos.
En una modalidad adicional, el dominio coestimulador se selecciona de CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40 o cualquier combinación de estos.
En una modalidad particular, el dominio activador comprende una porción citoplasmática que se asocia con una proteína de señalización citoplasmática.
En una modalidad, la proteína de señalización citoplasmática es un receptor de linfocitos o un dominio de señalización de este, una proteína que comprende una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM), un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos. En una modalidad adicional, el receptor de linfocitos o el dominio de señalización de este es CD3e, CD35, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A o CD79B, o cualquier combinación de estos.
En una modalidad adicional, el dominio coestimulador se selecciona de CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40 o cualquier combinación de estos.
En una modalidad particular, una célula no natural sobreexpresa un factor coestimulador, un factor inmunomodulador, un agonista de un factor coestimulador, un agonista de un factor inmunomodulador o cualquier combinación de estos.
En una modalidad, la segunda molécula de ácido nucleico codifica además una señal de secreción de manera que la segunda proteína de fusión es secretada por la célula no natural cuando se expresa, y opcionalmente codifica además un dominio de anclaje.
En una modalidad determinada, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando.
En una modalidad adicional, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un dominio de anticuerpo, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab.
En una modalidad particular, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es amino terminal al dominio de multimerización.
En una modalidad, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es carboxi terminal al dominio de multimerización.
En otra modalidad, la segunda molécula de ácido nucleico que codifica la segunda proteína de fusión comprende además una secuencia que codifica un enlazador dispuesto entre el dominio de unión y el segundo dominio de multimerización.
En una modalidad particular, la célula comprende además una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una tercera proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la tercera proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa.
En una modalidad particular relacionada, las proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión tienen uno, dos, tres o cuatro dominios de unión.
En una modalidad adicional, el uno, dos, tres o cuatro dominios de unión son específicos para una diana o hasta cuatro dianas diferentes.
En una modalidad determinada, el dominio de unión es específico para una diana que es un antígeno asociado con un cáncer, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad de injerto contra huésped.
En una modalidad particular, el cáncer es una neoplasia maligna sólida o una neoplasia maligna hematológica. En una modalidad adicional, el antígeno diana asociado a neoplasia maligna hematológica es CD19, CD20, CD22, CD33 o CD37.
En una modalidad, el dominio de unión se une específicamente a una diana seleccionada del receptor de folato a, integrina av£6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (GPC3), h5T4, IL-11R^, IL13R-a2, KDR, cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE-A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notchl, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
En una modalidad determinada, el primer factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En una modalidad, el segundo factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En una modalidad adicional, la primera proteína de fusión codificada comprende un primer dominio de multimerización de FRB T2098L, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio activador de CD3Z; en donde la segunda proteína de fusión codificada comprende un dominio de unión de un scFv específico para cD l9 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el primer factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural es el rapálogo AP21967. En una modalidad particular, la primera proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 15 y la segunda proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 1.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped, que comprende:
administrar una célula recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, en donde la primera molécula de ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión, y la segunda molécula de ácido nucleico codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa; y administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el dominio de unión del complejo polipeptídico se une específicamente a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped para promover una respuesta inmunomoduladora y, por lo tanto, trata la célula de una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped.
En diversos aspectos de la descripción, un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped, que comprende: administrar una célula no natural que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; administrar una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización; y administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el dominio de unión del complejo polipeptídico se une específicamente a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped para promover una respuesta inmunomoduladora y, por lo tanto, trata la enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped.
En otro aspecto de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes.
En un aspecto adicional de la descripción, los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión se asocian con un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ácido abscísico (ABA) o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF) o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto particular de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBP y FRB, FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de estos.
En un aspecto particular de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este.
En un aspecto de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este.
En un aspecto determinado de la descripción, el factor puente es sirolimus, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus o zotarolimus.
En otro aspecto determinado de la descripción, la primera molécula de ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende además un tercer dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, el tercer dominio de multimerización de la primera proteína de fusión es un dominio de unión para un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, Tmp-SLF o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto de la descripción, un segundo factor puente promueve la asociación de al menos dos primeras proteínas de fusión con el factor puente asociado y dispuesto entre los terceros dominios de multimerización de las primeras proteínas de fusión.
En un aspecto adicional de la descripción, el complejo proteico es un homocomplejo que comprende al menos dos primeras proteínas de fusión.
En un aspecto adicional de la descripción, la primera proteína de fusión tiene al menos un dominio de multimerización de FKBP, DHFR o GyrB.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión del complejo polipeptídico se une específicamente a una diana ubicada en la superficie de células de una enfermedad hiperproliferativa diana.
En otro aspecto de la descripción, el complejo proteico es un heterocomplejo que comprende una o más primeras proteínas de fusión y una o más segundas proteínas de fusión.
En otro aspecto de la descripción, el dominio de unión del heterocomplejo proteico se une específicamente a una diana ubicada en la superficie de células de una enfermedad hiperproliferativa diana.
En otro aspecto de la descripción, el dominio hidrófobo es un dominio transmembrana.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD4, CD8 o CD28.
En otro aspecto particular de la descripción, el dominio activador comprende un dominio de señalización del receptor de linfocitos.
En otro aspecto particular más de la descripción, el dominio activador comprende una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM).
En aún otro aspecto particular de la descripción, el dominio activador comprende CD3e, CD38, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A o CD79B, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto determinado de la descripción, la primera molécula de ácido nucleico codifica la primera proteína de fusión que comprende además un dominio activador diferente, un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos.
En otro aspecto de la descripción, el dominio coestimulador se selecciona de CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio activador comprende una porción citoplasmática que se asocia con una proteína de señalización citoplasmática.
En un aspecto particular de la descripción, la proteína de señalización citoplasmática es un receptor de linfocitos o un dominio de señalización de este, una proteína que comprende uno o una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM), un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos.
En un aspecto particular de la descripción, el receptor de linfocitos o el dominio de señalización de este es CD3e, CD35, c D3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A o CD79B, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto de la descripción, el dominio coestimulador se selecciona de CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40, o cualquier combinación de estos.
En otro aspecto de la descripción, la proteína de señalización citoplasmática es una combinación de CD3Z y 4-1BB o una combinación de CD3Z y OX40.
En otro aspecto más de la descripción, la célula no natural sobreexpresa además un factor coestimulador, un factor inmunomodulador, un agonista de un factor coestimulador, un agonista de un factor inmunomodulador o cualquier combinación de estos.
En un aspecto determinado de la descripción, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando.
En un aspecto determinado de la descripción, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un anticuerpo de dominio, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es amino terminal al dominio de multimerización.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es carboxi terminal al dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, la segunda proteína de fusión comprende además un enlazador dispuesto entre el dominio de unión y el segundo dominio de multimerización.
En un aspecto adicional de la descripción, la célula comprende además una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una tercera proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la tercera proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa.
En un aspecto determinado de la descripción, las proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión tienen uno, dos, tres o cuatro dominios de unión.
En un aspecto de la descripción, el uno, dos, tres o cuatro dominios de unión son específicos para una diana o hasta cuatro dianas diferentes.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión es específico para una diana que es un antígeno asociado con un cáncer.
En otro aspecto de la descripción, el cáncer es una neoplasia maligna sólida o una neoplasia maligna hematológica.
En un aspecto adicional de la descripción, el antígeno diana asociado a la neoplasia maligna hematológica es CD19, CD20, CD22, CD33 o CD37.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión se une específicamente a una diana seleccionada del receptor de folato a, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (Gp C3), h5T4, IL-11R^, IL13R-a2, k Dr , cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE-A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notchl, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
En un aspecto particular de la descripción, el primer factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, A b a o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En un aspecto particular de la descripción, el segundo factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En un aspecto adicional de la descripción, la primera proteína de fusión comprende un primer dominio de multimerización de FRB T2098L, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio activador de CD3Z; en donde la segunda proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD19 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el primer factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural es el rapálogo AP21967.
En un aspecto de la descripción, la primera proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 15 y la segunda proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 1.
En un aspecto particular de la descripción, el método comprende además administrar un agente que antagoniza o bloquea un inhibidor de la activación de linfocitos T.
En otro aspecto de la descripción, el agente antagoniza o bloquea un ligando de linfocitos T.
En un aspecto particular de la descripción, el agente antagoniza o bloquea un receptor de linfocitos T.
En un aspecto adicional de la descripción, el agente que antagoniza o bloquea un inhibidor de la activación de linfocitos T es un anticuerpo anti-PD1 o un fragmento de unión a antígeno de este, un anticuerpo anti-PD-LI o un fragmento de unión a antígeno de este, o un anticuerpo anti-CTLA4 o un fragmento de unión a antígeno de este o una endonucleasa dirigida y modificada por ingeniería genética que se dirige a PD-1.
En un aspecto particular de la descripción, el método comprende además administrar un agonista de citocina.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un heterocomplejo polipeptídico de fusión que comprende: una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador; una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión extracelular y un segundo dominio de multimerización; y un factor puente; en donde la primera proteína de fusión, la segunda proteína de fusión y el factor puente se asocian para formar un heterocomplejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión es una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando.
En otro aspecto de la descripción, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un dominio de anticuerpo, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión es amino terminal al dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión es carboxi terminal al dominio de multimerización. En un aspecto particular de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este.
En un aspecto determinado de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio hidrófobo es un dominio transmembrana.
En un aspecto determinado de la descripción, el dominio activador comprende una cadena del receptor de linfocitos. En un aspecto de la descripción, el factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En un aspecto adicional de la descripción, la segunda proteína de fusión comprende además un dominio de anclaje. En un aspecto particular de la descripción, el dominio de anclaje es un dominio transmembrana.
En otro aspecto de la descripción, la segunda proteína de fusión comprende además un dominio de señalización sub-umbral.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de anclaje es una secuencia señal de GPI.
En un aspecto de la descripción, la secuencia señal de GPI se ha alterado y la segunda proteína de fusión comprende además una molécula de GPI.
En otro aspecto de la descripción, el dominio de unión es específico para una diana que es un antígeno asociado con un cáncer, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad de injerto contra huésped.
En un aspecto adicional de la descripción, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica que tiene un antígeno diana de CD19, CD20, CD22, CD33 o CD37.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera o más de las proteínas de fusión contempladas en el presente documento.
En otro aspecto de la descripción, la molécula de ácido nucleico se dispone entre secuencias de polinucleótidos 5' y 3' homólogas a un locus genómico.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un vector de expresión que contiene un ácido nucleico contemplado en el presente documento.
En un aspecto particular de la descripción, la primera y la segunda proteínas de fusión se codifican como un mensaje policistrónico o como una sola proteína separada por un péptido 2A.
En un aspecto particular de la descripción, el mensaje policistrónico comprende un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) entre las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona una célula no natural que comprende: una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a un receptor en un linfocito T y un primer dominio de multimerización, en donde la primera proteína de fusión es secretada por la célula; y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a una diana ubicada en la superficie de una célula diana y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión es secretada por la célula; en donde un factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.
En un aspecto determinado de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes.
En un aspecto adicional de la descripción, los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión se asocian con un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ácido abscísico (ABA) o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF) o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En un aspecto particular de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBP y FRB, FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de estos.
En otro aspecto de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este.
En un aspecto particular de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este.
En un aspecto de la descripción, el factor puente es sirolimus, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus o zotarolimus.
En un aspecto particular de la descripción, una célula no natural sobreexpresa además un factor coestimulador, un factor inmunomodulador, un agonista de un factor coestimulador, un agonista de un factor inmunomodulador o cualquier combinación de estos.
En un aspecto determinado de la descripción, el dominio de unión de la primera proteína de fusión y el dominio de unión de la segunda proteína de fusión se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando.
En otro aspecto de la descripción, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un dominio de anticuerpo, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio de unión de la primera proteína de fusión es amino terminal al primer dominio de multimerización.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión de la primera proteína de fusión es carboxi terminal al primer dominio de multimerización.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es amino terminal al segundo dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es carboxi terminal al segundo dominio de multimerización.
En un aspecto de la descripción, la primera molécula de ácido nucleico que codifica la primera proteína de fusión comprende además una secuencia que codifica un enlazador dispuesto entre el dominio de unión y el primer dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, la segunda molécula de ácido nucleico que codifica la segunda proteína de fusión comprende además una secuencia que codifica un enlazador dispuesto entre el dominio de unión y el segundo dominio de multimerización.
En un aspecto particular de la descripción, el dominio de unión de la segunda molécula de ácido nucleico es específico para una diana que es un antígeno asociado con un cáncer, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad de injerto contra huésped.
En un aspecto determinado de la descripción, el cáncer es una neoplasia maligna sólida o una neoplasia maligna hematológica.
En un aspecto determinado de la descripción, el antígeno diana asociado a la neoplasia maligna hematológica es CD19, CD20, CD22, CD33 o CD37.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión de la segunda molécula de ácido nucleico se une específicamente a una diana seleccionada de receptor de a-folato, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (GPC3), h5T4, IL-11Rn, IL13R-a2, KDR, cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE -A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notch1, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
En un aspecto adicional de la descripción, el factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En un aspecto particular de la descripción, el primer ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD3 y un primer dominio de multimerización de FRB T2098L; en donde el segundo ácido nucleico codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD19 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico es el rapálogo AP21967.
En otro aspecto de la descripción, el primer ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD3 y un primer dominio de multimerización de fRb T2098L; en donde el segundo ácido nucleico codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión de un scFv específico para BCMA y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico es el rapálogo AP21967.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped que comprende: administrar una célula no natural contemplada en el presente documento y administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el dominio de unión del segundo polipéptido de fusión se une específicamente a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa para promover una respuesta inmunomoduladora y, por lo tanto, trata la enfermedad hiperproliferativa.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped que comprende: administrar una primera proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a un receptor en un linfocito T y un primer dominio de multimerización; y una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a una diana de la superficie celular en una célula de enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped y un segundo dominio de multimerización; y administrar un factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; para tratar así la enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un heterocomplejo polipeptídico de fusión que comprende: una primera proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a un receptor en un linfocito T y un primer dominio de multimerización; una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que se une a una diana de la superficie celular en una célula diana; y un factor puente; en donde la primera proteína de fusión, la segunda proteína de fusión y el factor puente se asocian para formar un heterocomplejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión. En un aspecto particular de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes. En otro aspecto de la descripción, los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión se asocian con un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ácido abscísico (ABA) o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF) o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En determinados aspectos de la descripción, el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBP y FRB, FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de estos.
En un aspecto adicional de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este.
En determinados aspectos de la descripción, el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este.
En un aspecto particular de la descripción, el factor puente es sirolimus, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus o zotarolimus.
En un aspecto de la descripción, el dominio de unión de la primera proteína de fusión y el dominio de unión de la segunda proteína de fusión se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en: una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando.
En otro aspecto de la descripción, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un dominio de anticuerpo, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab.
En un aspecto adicional de la descripción, el dominio de unión del segundo polipéptido de fusión se une específicamente a una diana seleccionada de receptor de a-folato, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvIlI, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (GPC3), h5T4, IL-11Rn, IL13R-a2, KDR, cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE -A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notch1, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
En un aspecto determinado de la descripción, la primera proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD3 y un primer dominio de multimerización de FRB T2098L; la segunda proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD19 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y el factor puente es el rapálogo AP21967.
En un aspecto particular de la descripción, la primera proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD3 y un primer dominio de multimerización de FRB T2098L; la segunda proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para BCMA y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y el factor puente es el rapálogo AP21967.
En diversas modalidades, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera o más de las proteínas de fusión contempladas en el presente documento.
En un aspecto particular de la descripción, la molécula de ácido nucleico se dispone entre secuencias de polinucleótidos 5' y 3' homólogas a un locus genómico.
En diversos aspectos de la descripción, se proporciona un vector de expresión que contiene un ácido nucleico contemplado en el presente documento.
En un aspecto de la descripción, el vector de expresión comprende la primera y la segunda proteínas de fusión codificadas como un mensaje policistrónico o como una única proteína separada por un péptido 2A.
En otro aspecto de la descripción, el mensaje policistrónico comprende un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) entre las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A - 1M muestran esquemas de varios tipos de complejos de señalización de múltiples partes de esta descripción.
La Figura 2 muestra un esquema de un ensayo para detectar la destrucción de células específicas y la secreción de citocinas con un complejo de señalización de múltiples partes particular de esta descripción. Las Figuras 3A y 3B muestran las propiedades citotóxicas de los linfocitos T humanas que expresan un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción.
La Figura 4 muestra el perfil de secreción de citocinas de linfocitos T humanas que expresan un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción.
La Figura 5 muestra que el uso de dominios de multimerización independientes que tienen diferentes especificidades para los componentes puente permite la actividad citotóxica dirigida de los linfocitos T humanas que expresan un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción. Además, esta figura muestra que los linfocitos T humanas que expresan un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción pueden ser citotóxicas incluso cuando los componentes de unión y señalización de DARIC se expresan individualmente en células separadas.
La Figura 6 muestra que los factores puente pueden funcionar en el sistema DARIC en concentraciones clínicamente relevantes.
La Figura 7 muestra que un componente de unión de DARIC puede liberarse de una célula o unirse a la superficie de la célula y todavía asociarse funcionalmente con un componente de señalización de DARIC para formar un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción.
La Figura 8 muestra que un componente de unión de DARIC puede unirse a la superficie celular a través de un anclaje de GPI y todavía asociarse funcionalmente con un componente de señalización de DARIC en presencia de un factor puente para formar un complejo de señalización de múltiples partes de esta descripción.
La Figura 9 muestra un sistema DARIC dirigido a un antígeno modelo adicional, CD123, que puede usarse para erradicar un cáncer mieloide o en un régimen de acondicionamiento para eliminar las células mieloides antes de un trasplante de médula ósea.
La Figura 10 muestra que los dominios de multimerización de FRB y FKBP12 se pueden unir al componente de unión de DARIC o al componente de señalización y seguir formando un complejo de señalización funcional de múltiples partes en presencia de un factor puente.
La Figura 11 muestra que el acoplamiento de los componentes de unión y señalización de DARIC se puede desactivar mediante la adición de un factor anti-puente, un fármaco monovalente que se une solo a uno de los dominios de multimerización y, por lo tanto, bloquea la activación de la célula.
Descripción detallada
La invención se define en las reivindicaciones. En una modalidad, se proporcionan proteínas de fusión de múltiples componentes para usar en la modulación de una respuesta biológica a la inmunoterapia, como la inmunoterapia adoptiva. A modo de antecedente, la transducción de señales por parte de los receptores de la superficie celular convierte la información extracelular en respuestas intracelulares y requiere una maquinaria tanto para el reconocimiento de ligandos como para la transducción de señales transmembrana. Los receptores de la superficie celular reconocen ligandos mediante el uso de un dominio de unión extracelular y, tras la unión del ligando, transducen señales a través de la membrana plasmática a través de dominios que abarcan la membrana conectados con dominios de señalización intracelular. Estos se presentan como unidades monocatenarias, donde la unión y la señalización están relacionadas directamente, o a través de contactos multicatenarios mediante los cuales la unión del ligando a la superficie celular permite interacciones intracelulares de dominios de señalización con otras proteínas para mediar la transducción de señales celulares.
Una ventaja de las composiciones y métodos contemplados en el presente documento es proporcionar control tanto espacial como temporal sobre tales actividades de unión y señalización para la transducción de señales. En una modalidad, esta descripción proporciona un componente de unión y un componente de señalización que se expresan cada uno como proteínas de fusión separadas, pero contienen un mecanismo de multimerización extracelular (factor puente) para volver a acoplar los dos componentes funcionales en una superficie celular, denominados en el presente documento como componentes de unión y señalización de DARIC, lo que proporciona un control temporal. Dado que el componente de unión se secreta, se expresa en la superficie o se administra en forma recombinante, entonces está presente en el entorno extracelular sin acoplarse basalmente a ninguna maquinaria de transducción de señales celulares. La proteína de fusión de señalización transmembrana que expresará la célula de interés comprende uno o más dominios de señalización intracelular (activador) fusionados a través de un dominio transmembrana a un dominio de multimerización extracelular, como una proteína FRB o FKBP12 (cualquiera que no esté presente en el componente de unión). Solo tras la aplicación del fármaco de acoplamiento a FRB/FKBP12 (por ejemplo, rapamicina o un rapálogo de esta) los componentes de unión y señalización forman un complejo que puede iniciar la transducción de señales.
En una modalidad particular, se proporciona un acoplador de linfocitos T biespecífico regulado por fármacos (BiTE) desensamblado que se expresa como proteínas de fusión separadas. Ver la Figura 1L. El BiTE comprende un componente de señalización de DARIC que comprende un agente de unión que se une a un receptor de linfocitos T y un primer dominio de multimerización; y un componente de unión de DARIC que comprende un agente de unión que se une a un antígeno en una célula diana y un segundo dominio de multimerización, tal como una proteína FRB o FKBP12 (cualquiera que no esté presente en el componente de unión). Solo tras la aplicación del fármaco de acoplamiento a FRB/FKBP12 (por ejemplo, rapamicina o un rapálogo de esta) los componentes de BiTE forman un complejo que puede iniciar la transducción de señales.
Pero el control temporal logrado a través del mecanismo de multimerización descrito en el presente documento solo prepara la maquinaria para la señalización. La multimerización inducida químicamente reconstituye un receptor potenciado por señalización, pero no activa la señalización posterior porque no hay agregación de componentes de señalización intracelular. Por lo tanto, el control espacial se logra sobre la base de la presencia o ausencia de una diana reconocida por el dominio de unión en el componente de unión. Dado que la proteína de fusión del componente de unión se secreta al exterior de la célula (o se aplica de forma externa), se acumula solo donde la diana está presente, de modo que las células solo se activarán cuando tanto la diana (por ejemplo, el antígeno de la superficie celular) como el factor puente estén presentes.
En determinados aspectos de la descripción, una célula recombinante que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión se administra a un sujeto que tiene una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad de injerto contra huésped. Dicha proteína de fusión puede denominarse componente de señalización de DARIC, que puede expresarse como una o más proteínas transmembrana. Un componente de señalización de DARIC puede contener más de un dominio de multimerización, incluido un dominio de multimerización que promueve la homodimerización en presencia del factor puente homobivalente. En tal aspecto (consulte la Figura 1c), la administración de un factor puente promoverá cierto nivel de señalización basal en ausencia de unión a una diana extracelular, por ejemplo, como una forma de impulsar la proliferación celular in vitro o in vivo antes de la activación con un componente de unión de DARIC (que en este contexto funciona como un fármaco). Para los linfocitos T, se sabe que la activación de bajo nivel promueve la proliferación, mientras que la multimerización de alto orden (como ocurriría con una alta densidad de antígeno en una célula diana y la heterodimerización de los componentes de DARIC con un componente puente) conduciría a la activación de una respuesta de citotoxicidad.
En otro aspecto de la descripción, a un sujeto que recibe una célula recombinante (no natural) (por ejemplo, un linfocito T) que expresa un componente de señalización de DARIC se le puede administrar, simultánea o secuencialmente, una proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un dominio de multimerización - un componente de unión de DARIC - y un factor puente (por ejemplo, rapamicina o un rapálogo de esta) para promover la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión (componentes de unión y señalización de DARIC, respectivamente). En determinados aspectos de la descripción, una molécula de ácido nucleico codifica además una proteína de fusión que comprende una señal de secreción, un dominio de unión y un dominio de multimerización, en donde la proteína de fusión (componente de unión de DARIC) se secreta de la célula no natural cuando se expresa. En algunos aspectos de la descripción, una molécula de ácido nucleico codifica además una proteína de fusión que comprende una señal de secreción, un dominio de unión y un dominio de multimerización, en donde la proteína de fusión expresada (componente de unión de DARIC) se secreta y se une o anclaje a la superficie celular de la célula no natural (ver la Figura 11-K). El componente de unión de DARIC se unirá específicamente a una célula diana (por ejemplo, cancerosa, autoinmunitaria) antes o después de asociarse con el componente de señalización de DARIC a través del factor puente, en donde la asociación tripartita de los dos componentes de DARIC y el factor puente desencadenará una respuesta celular que trata la enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped. Por ejemplo, la presencia de al menos un componente de unión de DARIC y una diana de la superficie celular conduciría a un aumento de las señales proporcional a la densidad de la diana debido a la multimerización.
En otro aspecto de la descripción, el componente de señalización de DARIC puede crearse aprovechando los receptores de activación existentes en la superficie de la célula (por ejemplo, linfocito T) mediante el uso de un acoplador biespecífico regulado por fármacos (BiTE). En este caso, se secretan ambos componentes de DARIC: un componente de unión que se une a una célula diana y un componente de señalización que se une a un receptor (por ejemplo, el complejo TCR/CD3) en un linfocito T. En una modalidad, una célula no natural secreta ambos componentes. En otra modalidad, una o más células no naturales secretan uno o más de los componentes.
Antes de exponer esta descripción con más detalle, puede ser útil para su comprensión proporcionar definiciones de ciertos términos que se utilizarán en el presente documento. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de esta descripción.
En la presente descripción, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relación o intervalo de números enteros debe entenderse que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo mencionado y, cuando corresponda, fracciones de este (como una décima y una centésima de un entero), a menos que se indique lo contrario. Además, se debe entender que cualquier intervalo numérico mencionado en el presente documento en relación con cualquier característica física, tal como las subunidades poliméricas, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo mencionado, a menos que se indique lo contrario. Como se usa en el presente documento, los términos "aproximadamente" significan (1) ± 1 %, ± 2 %, ± 3 %, ± 4 %, ± 5 %, ± 10 %, ± 15 % o ± 20 % del intervalo, valor o estructura indicados; (2) un valor incluye la variación inherente del error del método que se emplea para determinar el valor; o (3) un valor incluye la variación que existe entre las réplicas del experimento, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos "un" y "una" cómo se usan en el presente documento se refieren a "uno o más" de los componentes enumerados. El uso de la alternativa (por ejemplo, "o") debe entenderse que significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas o componentes enumerados. Como se usa en el presente documento, los términos "incluyen", "tienen" y "comprenden" se usan como sinónimos, términos y variantes de estos que se pretende interpretar como no limitativos.
Como se usa en el presente documento, una proteína o polipéptido "consiste esencialmente en varios dominios (por ejemplo, un dominio de unión, un enlazador o espaciador, un dominio hidrófobo, un dominio de multimerización, un dominio activador) cuando las porciones fuera de los varios dominios (por ejemplo, aminoácidos en el extremo amino o carboxi o entre dos dominios), en combinación, contribuyen como máximo al 20 % (por ejemplo, como máximo al 15 %, 10 %, 8 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de la longitud de la proteína o polipéptido y no afectan sustancialmente (es decir, no alteran la actividad en más del 50 %, tal como no más del 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %) las actividades de uno o más de los diversos dominios (por ejemplo, la afinidad de unión a la diana del dominio de unión, la capacidad del dominio de multimerización para facilitar la formación de complejos y la capacidad del dominio activador para transmitir señales funcionales a una célula). En determinadas modalidades, una proteína (por ejemplo, un polipéptido monocatenario) consta esencialmente de un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un enlazador y un dominio de multimerización, en donde la proteína puede comprender aminoácidos de unión en el amino y/o carboxilo terminal de la proteína o entre dos dominios diferentes (por ejemplo, entre el dominio de unión y el dominio de multimerización, entre el dominio de multimerización y el enlazador).
Una "proteína de fusión" o "proteína quimérica", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que incluye componentes polipeptídicos derivados de una o más proteínas o polipéptidos originales y que no se encuentra de forma natural en una célula huésped. Una proteína de fusión contendrá dos o más secuencias de aminoácidos naturales que están unidas entre sí de una manera que no ocurre de forma natural. Por ejemplo, una proteína de fusión puede tener dos o más porciones de la misma proteína unidas de una manera que normalmente no se encuentra en una célula, o una proteína de fusión puede tener porciones de dos, tres, cuatro, cinco o más proteínas diferentes unidas de una manera que normalmente no se encuentra en una célula. Una proteína de fusión puede estar codificada por una molécula de ácido nucleico en donde una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o una porción de esta se anexa en marco y, opcionalmente, está separada por nucleótidos que codifican un enlazador, espaciador o aminoácidos de unión, una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más proteínas diferentes o una porción de estas. En determinadas modalidades, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión se introduce en una célula huésped y se expresa.
Como se usa en el presente documento, el término "huésped" se refiere a una célula (por ejemplo, linfocito T) o microorganismo que puede modificarse genéticamente con una molécula de ácido nucleico exógena para producir un polipéptido de interés (por ejemplo, componentes de unión o señalización de DARIC). En determinadas modalidades, una célula huésped puede poseer opcionalmente o modificarse para incluir otras modificaciones genéticas que confieren propiedades deseadas relacionadas o no relacionadas con la biosíntesis de proteínas de fusión (por ejemplo, TCR eliminado, alterado o truncado; aumento de la expresión del factor coestimulador). En determinadas modalidades, una célula huésped es un linfocito T humano o un linfocito T humano con TCRa, TCRp o ambos desactivados con una nucleasa específica del sitio (por ejemplo, una endonucleasa dirigida LAGLIDADg , LHE).
Como se usa en el presente documento, "recombinante" o "no natural" se refiere a un organismo, microorganismo, célula, molécula de ácido nucleico o vector que tiene al menos una alteración genética manipulada o ha sido modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico heteróloga, o se refiere a una célula que ha sido alterada de manera que se puede controlar la expresión de una molécula o gen de ácido nucleico endógeno. Recombinante también se refiere a una célula que se deriva de una célula no natural o es descendiente de una célula no natural que tiene una o más de dichas modificaciones. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico que se pueden expresar y que codifican proteínas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones en las moléculas de ácido nucleico u otra alteración funcional del material genético de una célula. Por ejemplo, las células recombinantes pueden expresar genes u otras moléculas de ácido nucleico que no se encuentran en forma idéntica u homóloga dentro de una célula nativa (de tipo silvestre) (por ejemplo, una proteína de fusión o quimérica), o pueden proporcionar un patrón de expresión alterado de genes endógenos, tal como sobreexpresados, subexpresados, expresados mínimamente o no expresados en absoluto.
Los métodos recombinantes para la expresión de ácidos nucleicos exógenos o heterólogos en células son bien conocidos en la técnica. Dichos métodos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001)); y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). Ejemplos de proteínas o enzimas exógenas para expresar incluyen scFv, CD3Z, FKBP, FRB, citocinas o cualquier combinación de estas. Las modificaciones genéticas de las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión pueden conferir una capacidad bioquímica o metabólica a una célula recombinante o no natural que se diferencia con respecto a su estado natural.
Como se usa en el presente documento, el término "endógeno" o "nativo" se refiere a un gen, proteína, compuesto o actividad que normalmente está presente en una célula huésped. El término "homólogo" u "homólogo" se refiere a una molécula o actividad de una fuente exógena (no nativa) que es la misma molécula o actividad o son similares a la que se encuentra en o se deriva de una célula huésped, especie o cepa.
Como se usa en el presente documento, molécula, construcción o secuencia de ácido nucleico "heteróloga" se refiere a una molécula de ácido nucleico o una porción de una secuencia de molécula de ácido nucleico que no es nativa de una célula en la que se expresa, una molécula de ácido nucleico o una porción de una molécula de ácido nucleicos nativa de una célula huésped que se ha alterado o mutado, o una molécula de ácido nucleico con una expresión alterada en comparación con los niveles de expresión nativos en condiciones similares. Por ejemplo, se puede usar una secuencia de control heteróloga (por ejemplo, promotor, potenciador) para regular la expresión de un gen o una molécula de ácido nucleico de una manera diferente al gen o una molécula de ácido nucleico que normalmente se expresa en la naturaleza o en el cultivo. En determinadas modalidades, una molécula de ácido nucleico heteróloga puede ser homóloga a un gen de una célula huésped nativa, pero puede tener un nivel de expresión alterado o tener una secuencia diferente o ambas. En otras modalidades, las moléculas de ácido nucleico heterólogas o exógenas pueden no ser endógenas a una célula huésped o genoma huésped (por ejemplo, proteína de fusión), sino que pueden haberse introducido en una célula huésped mediante transformación (por ejemplo, transfección, electroporación), en donde la molécula añadida puede integrarse en el genoma del huésped o puede existir como material genético extracromosómico de forma transitoria (por ejemplo, ARNm) o estable durante más de una generación (por ejemplo, vector viral episómico, plásmido u otro vector autorreplicante).
En determinadas modalidades, se puede introducir más de una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena en una célula huésped como moléculas de ácido nucleico separadas, como una molécula de ácido nucleico policistrónico, como una sola molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, o cualquier combinación de estas, y todavía ser considerado como más de un ácido nucleico heterólogo o exógeno. Cuando se introducen dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas en una célula huésped, se entiende que las dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas se pueden introducir como una sola molécula de ácido nucleico (por ejemplo, en un solo vector), en vectores separados, como moléculas de ARNm únicas o múltiples, integradas en el cromosoma del huésped en un solo sitio o en múltiples sitios, y cada una de estas modalidades aún debe considerarse dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas. Por tanto, el número de moléculas de ácido nucleico heterólogas o actividades proteicas referenciadas se refiere al número de moléculas de ácido nucleico codificantes o al número de actividades proteicas, no al número de moléculas de ácido nucleico separadas introducidas en una célula huésped.
Por ejemplo, una célula puede modificarse para expresar dos o más moléculas de ácido nucleico heterólogas o exógenas, que pueden ser iguales o diferentes, que codifican una o más proteínas de fusión, como se describe en el presente documento. En determinadas modalidades, una célula huésped contendrá una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión y una segunda molécula de ácido nucleico separada que codifica una segunda proteína de fusión, o una célula huésped contendrá una sola molécula de ácido nucleico policistrónico que codifica una primera proteína de fusión y una segunda proteína de fusión, o una sola molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión, una secuencia de aminoácidos autoescindible y una segunda proteína de fusión.
Los sitios de escisión de proteasas adecuados y los péptidos de autoescisión son conocidos por el experto (ver, por ejemplo, en Ryan y otros, 1997. J. Gener. Virol 78, 699-722; Scymczak y otros, (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Los sitios de escisión de proteasas ilustrativos incluyen, sin limitación, los sitios de escisión de proteasas NIa de potyvirus (por ejemplo, proteasa del virus del grabado del tabaco), proteasas HC de potyvirus, proteasas P1 de potyvirus (P35), proteasas NIa de byovirus, proteasas codificadas por ARN-2 de byovirus, proteasas L de aftovirus, proteasas 2A de enterovirus, proteasas 2A de rinovirus, proteasas 3C de picornavirus, proteasas 24K de comovirus, proteasas 24K de nepovirus, proteasa similar a 3C del RTSV (virus esférico del tungro del arroz), proteasa similar a 3C del PYVF (virus de la mancha amarilla de la chirivía), heparina, trombina, factor Xa y enteroquinasa. Debido a su alta rigurosidad de escisión, se prefieren los sitios de escisión de proteasas de TEV (virus del grabado del tabaco) en una modalidad, por ejemplo, EXXYXQ(G/S), por ejemplo, ENLYFQG y ENLYFQS, en donde X representa cualquier aminoácido (la escisión por TEV ocurre entre Q y G o Q y S).
En determinadas modalidades, el sitio del polipéptido autoescindible comprende un sitio, secuencia o dominio 2A o similar a 2A (Donnelly y otros, 2001. J. Gen. Virol. 82: 1027-1041). En una modalidad particular, el péptido 2A viral es un péptido 2A de aftovirus, un péptido 2A de potyvirus o un péptido 2A de cardiovirus.
En una modalidad, el péptido 2A viral se selecciona del grupo que consiste en: un péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV), un péptido 2A del virus de la rinitis equina A (ERAV), un péptido 2A del virus de Thosea asigna (TaV), un péptido 2A de teschovirus-1 porcino (PTV-1), un péptido 2A de theilovirus y un péptido 2A de virus de encefalomiocarditis.
Un "complejo polipeptídico" o "complejo proteico", como se usa en el presente documento, se refiere a un dímero, trímero o multímero de orden superior formado por al menos dos polipéptidos monocatenarios diferentes, que comprenden al menos una cadena que tiene un dominio de unión específico para una diana y una cadena que tiene un dominio activador. Este término no incluye un anticuerpo formado a partir de cuatro polipéptidos monocatenarios (es decir, dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas). Un "dímero" se refiere a una entidad biológica que contiene dos subunidades asociadas entre sí, y un "complejo polipeptídico" se refiere a una entidad biológica que incluye al menos dos subunidades de proteínas y un factor puente asociado entre sí, a través de una o más formas de fuerzas intramoleculares, que incluyen los enlaces covalentes (por ejemplo, enlaces disulfuro) y otras interacciones (por ejemplo, interacciones electrostáticas, puentes salinos, enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas), y es estable en condiciones apropiadas (por ejemplo, en condiciones fisiológicas, en una solución acuosa adecuada para expresar, purificar y/o almacenar proteínas recombinantes, o en condiciones de electroforesis no desnaturalizantes y/o no reductoras).
Un "polipéptido monocatenario" es una disposición única, lineal y contigua de aminoácidos unidos covalentemente. No incluye dos cadenas polipeptídicas que se unen de forma no lineal, tal como a través de un enlace disulfuro entre cadenas (por ejemplo, una molécula de media inmunoglobulina en donde una cadena ligera se une a una cadena pesada a través de un enlace disulfuro). En determinadas modalidades, un polipéptido monocatenario puede tener o formar uno o más enlaces disulfuro intracatenarios. En ciertas otras modalidades, dos o más polipéptidos monocatenarios (por ejemplo, proteínas de fusión) pueden asociarse a través de un enlace disulfuro entre las cadenas para proporcionar un complejo potencialmente activo, siempre que el complejo esté formado por al menos una proteína no natural, tal como proteínas de fusión o quiméricas y no es un anticuerpo natural.
Un "dominio de multimerización", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula polipeptídica que preferentemente interactúa o se asocia con otra molécula polipeptídica diferente directamente o a través de una molécula puente, en donde la interacción de los diferentes dominios de multimerización contribuye sustancialmente a la multimerización o la promueve de manera eficiente (es decir, la formación de un dímero, trímero o complejo de múltiples partes, que puede ser un homodímero, heterodímero, homotrímero, heterotrímero, homomultímero, heteromultímero). Los dominios de multimerización representativos de la presente descripción incluyen FKBP, FRB, calcineurina, ciclofilina, DHFR bacteriano, PYL1, ABI1, GIB1, GAI o variantes de estos, como se proporciona en el presente documento.
En determinadas modalidades, un complejo polipeptídico comprende (i) una primera proteína de fusión que tiene un primer dominio de multimerización y (ii) una segunda proteína de fusión que tiene un segundo dominio de multimerización que no es el mismo que el primer dominio de multimerización, en donde el primer y segundo dominios de multimerización contribuyen sustancialmente o promueven eficazmente la formación del complejo polipeptídico en presencia de un factor puente. La(s) interacción(es) entre el primer y segundo dominios de multimerización contribuyen sustancialmente o promueven de manera eficiente la multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión si hay una reducción estadísticamente significativa en la asociación entre la primera y la segunda proteínas de fusión en ausencia del primer dominio de multimerización, el segundo dominio de multimerización o el factor puente. En determinadas modalidades, cuando la primera y la segunda proteínas de fusión se coexpresan, al menos aproximadamente el 60 %, por ejemplo, al menos de aproximadamente el 60 % a aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 80 % hasta aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, y al menos aproximadamente 90 % aproximadamente 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % del primero y segundo polipéptidos monocatenarios forman multímeros entre sí en presencia de un factor puente.
Como se usa en el presente documento, "dominio hidrófobo" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene una estructura tridimensional que es termodinámicamente estable en una membrana celular. La estructura de un dominio hidrófobo puede comprender una hélice alfa, un cilindro beta, una lámina beta, una hélice beta o cualquier combinación de estos. En determinadas modalidades, un dominio hidrófobo es un dominio transmembrana, tal como uno derivado de una proteína de membrana integral (por ejemplo, receptor, molécula de grupo de diferenciación (CD), enzima, transportador, molécula de adhesión celular o similares).
Como se usa en el presente documento, "dominio de anclaje" se refiere a una secuencia de aminoácidos u otra molécula que promueve la unión, el anclaje o la asociación de una proteína de fusión de esta descripción con una superficie celular. Los dominios de anclaje ilustrativos incluyen una secuencia de aminoácidos con una estructura que es estable en una membrana celular o una secuencia de aminoácidos que promueve la adición de un glicolípido (también conocido como glicosilfosfatidilinositoles o GPI) o similares. A modo de antecedente, una molécula de GPI se une postraduccionalmente a una proteína diana mediante una reacción de transamidación, lo que da como resultado la escisión de una secuencia señal de GPI carboxi-terminal (ver, por ejemplo, White y otros, J. Cell Sci.
113:721, 2000) y la transferencia simultánea de la molécula de anclaje de g Pi ya sintetizada al aminoácido carboxiterminal recién formado (consulte www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK20711 para conocer ejemplos de anclajes de GPI. En determinadas modalidades, un dominio de anclaje es un dominio hidrófobo (por ejemplo, un dominio transmembrana) o una secuencia señal de GPI. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de esta descripción con un dominio de anclaje da como resultado una proteína de fusión que comprende además una molécula de GPI.
Un "dominio activador", como se usa en el presente documento, directa o indirectamente, promueve una respuesta biológica o fisiológica en una célula cuando recibe la señal apropiada. En determinadas modalidades, el dominio activador es parte de una proteína o un complejo proteico que recibe una señal cuando se une o se une a una molécula diana y la unión desencadena una señal desde el dominio activador. El dominio activador puede promover directamente una respuesta celular cuando contiene dominios o motivos de señalización, tal como un motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM). En otras modalidades, un dominio activador promoverá indirectamente una respuesta celular al asociarse con una o más proteínas que promueven directamente una respuesta celular. Ejemplos de dominios activadores incluyen CD2, CD3e, CD38, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD79A, CD79B, CD22, CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4- 1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40 o cualquier combinación de estos.
En modalidades particulares, un "dominio transmembrana" se refiere a una porción del componente de señalización que fusiona un dominio de multimerización extracelular y uno o más dominios de señalización intracelular y ancla el componente de señalización a la membrana plasmática de linfocito T. En determinadas modalidades, un "dominio transmembrana" se refiere a una porción del componente de unión que se fusiona con un dominio de multimerización extracelular y ancla el componente de unión a la membrana plasmática de linfocito T. El dominio transmembrana puede derivarse tanto de una fuente natural, sintética, semisintética o recombinante. Los dominios transmembranas ilustrativos pueden derivarse (es decir, comprender al menos la(s) región(es) transmembrana) de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de linfocitos T, CD3e, CD3Z, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 y PD1. En varias modalidades, un dominio transmembrana de un componente de unión y/o un componente de señalización se fusiona con un enlazador de oligo o polipéptido corto, preferentemente entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud y que une opcionalmente el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular del componente de señalización.
Un "dominio de unión" (también denominado "región de unión", "agente de unión" o "resto de unión"), como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína, polipéptido, oligopéptido o péptido que posee la capacidad de reconocer específicamente y unirse a una diana (por ejemplo, CD19, CD20). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante, de una molécula biológica u otra diana de interés. Ejemplos de dominios de unión incluyen regiones variables monocatenarias de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab), ectodominios receptores (por ejemplo, c-Met) o ligandos (por ejemplo, citocinas, quimiocinas o ligandos asociados a la superficie celular). En modalidades particulares, un dominio de unión comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de este, que incluye, pero no se limita a, una Ig de camello (un anticuerpo de camélido (VHH)), Ig NAR, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, fragmentos F(ab)'3, Fv, anticuerpo Fv monocatenario ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minicuerpo, diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo, proteína Fv estabilizada con disulfuro ("dsFv") y anticuerpo de dominio único (sdAb, nanocuerpo). Se conocen una variedad de ensayos para identificar los dominios de unión de la presente descripción que se unen específicamente a una diana particular, que incluyen los análisis de transferencia Western, ELISA y Biacore.
Un dominio de unión y una proteína de fusión de este "se une específicamente" a una diana si se une a la diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación de equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual o mayor que 105 M-1, mientras que no se une significativamente a otros componentes presentes en una muestra de prueba. Los dominios de unión (o sus proteínas de fusión) pueden clasificarse como dominios de unión de "alta afinidad" (o sus proteínas de fusión) y dominios de unión de "baja afinidad" (o sus proteínas de fusión). Los dominios de unión de "alta afinidad" se refieren a los dominios de unión con una Ka de al menos 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 1013 M-1. Los dominios de unión de "baja afinidad" se refieren a los dominios de unión con una Ka de hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1 Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10­ 13 M). Las afinidades de los polipéptidos del dominio de unión y las proteínas de fusión de acuerdo con la presente descripción se pueden determinar fácilmente mediante el uso de técnicas convencionales (ver, por ejemplo, Scatchard y otros (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; y las patentes de los Estados Unidos núms. 5,283,173, 5,468,614, o el equivalente).
El "receptor de linfocitos T" (TCR) es una molécula que se encuentra en la superficie de los linfocitos T que, junto con el CD3, generalmente es responsable de reconocer los antígenos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Consiste en un heterodímero unido por enlaces disulfuro de las cadenas a y p altamente variables en la mayoría de los linfocitos T. En otros linfocitos T, se expresa un receptor alternativo formado por cadenas y y 6 variables. Cada cadena del TCR es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplásmica corta en el extremo C-terminal (ver, Abbas y Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5.a ed.), Editor: Saunders, Filadelfia, 2003; Janeway y otros, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4.a edición, Current Biology Publications, p. 148, 149 y 172, 1999). El TCR, como se usa en la presente descripción, puede ser de una o varias especies animales, que incluyen humanos, ratones, ratas u otros mamíferos.
"CD3" se conoce en la técnica como un complejo multiproteico de seis cadenas (véase, Abbas y Lichtman, 2003; Janeway y otros, p. 172 y 178, 1999). En los mamíferos, el complejo comprende una cadena CD3y, una cadena CD36, dos cadenas CD3e y un homodímero de cadenas CD3Z. Las cadenas CD3y, CD36 y CD3e son proteínas de la superficie celular altamente relacionadas de la superfamilia de inmunoglobulinas que contienen un solo dominio de inmunoglobulina. Las regiones transmembrana de las cadenas CD3y, CD36 y CD3e están cargadas negativamente, lo cual es una característica que permite que estas cadenas se asocien con las cadenas receptoras de linfocitos T cargadas positivamente. Las colas intracelulares de las cadenas CD3y, CD36 y CD3e contienen cada una un solo motivo conservado conocido como motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM, mientras que cada cadena CD3Z tiene tres. Se cree que los ITAM son importantes para la capacidad de señalización de un complejo TCR. CD3 como se usa en la presente descripción puede ser de una o varias especies animales, que incluyen humanos, ratones, ratas u otros mamíferos.
"Complejo TCR", como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo formado por la asociación de CD3 con TCR. Por ejemplo, un complejo TCR puede estar compuesto por una cadena CD3y, una cadena CD36, dos cadenas CD3e, un homodímero de cadenas CD3Z, una cadena TCRa y una cadena TCRp. Alternativamente, un complejo TCR puede estar compuesto por una cadena CD3y, una cadena CD36, dos cadenas CD3e, un homodímero de cadenas CD3Z, una cadena TCRy y una cadena TCR8.
"Un componente de un complejo TCR", como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena TCR (es decir, TCRa, TCRp, TCRy o TCR6), una cadena CD3 (es decir, CD3y, CD36, CD3e o CD3Z), o un complejo formado por dos o más cadenas de TCR o cadenas de CD3 (por ejemplo, un complejo de TCRa y TCRp, un complejo de TCRy y TCR8, un complejo de CD3e y CD38, un complejo de CD3y y CD3e, o un complejo sub-TCR de TCRa, TCRp, CD3y, CD38 y dos cadenas de CD3e).
Los términos entendidos por aquellos en la técnica de la tecnología de anticuerpos reciben cada uno el significado adquirido en la técnica, a menos que se definan expresamente de manera diferente en el presente documento. Se sabe que los anticuerpos tienen regiones variables, una región bisagra y dominios constantes. La estructura y la función de las inmunoglobulinas se revisan, por ejemplo, en Harlow y otros, Eds, Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
Por ejemplo, los términos "VL" y "VH" se refieren a la región de unión variable de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variable están formadas por subregiones discretas bien definidas conocidas como "regiones determinantes de la complementariedad" (c Dr ) y "regiones marco" (FR). El término "CL" se refiere a una "región constante de cadena ligera de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena ligera", es decir, una región constante de una cadena ligera pesada de anticuerpo. El término "CH" se refiere a una "región constante de cadena pesada de inmunoglobulina" o una "región constante de cadena pesada", que se puede dividir, según el isotipo del anticuerpo, en CH1, CH2 y CH3 (IgA, IgD, IgG), o Dominios cH l, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un "Fab" (fragmento de unión a antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a antígenos e incluye la región variable y CH1 de la cadena pesada unida a la cadena ligera a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
Como se usa en el presente documento, "una porción de dominio constante de región Fc" o "porción de región Fc" se refiere al segmento de región constante de cadena pesada del fragmento Fc (la región del "fragmento cristalizable" o región Fc) de un anticuerpo, que puede incluir uno o dominios más constantes, tales como CH2, CH3, CH4, o cualquier combinación de estos. En determinadas modalidades, una parte de la región Fc incluye los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG, IgA o IgD y cualquier combinación de estos, o los dominios CH3 y CH4 de un anticuerpo IgM o IgE y cualquier combinación de estos. En una modalidad, las estructuras CH2CH3 o CH3CH4 son del mismo isotipo de anticuerpo, como IgG, IgA, IgD, IgE o IgM. A modo de antecedente, la región Fc es responsable de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, como ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos), ADCP (fagocitosis celular dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores Fc (por ejemplo, CD16, CD32, FcRn), mayor vida media in vivo en relación con un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteína A y quizás incluso transferencia placentaria (ver Capon y otros, Nature, 337:525 (1989)).
Un "enlazador" o "espaciador" se refiere a una secuencia de aminoácidos que conecta dos proteínas, polipéptidos, péptidos, dominios, regiones o motivos y puede proporcionar una función espaciadora compatible con la interacción de los dos dominios de subunión (por ejemplo, multimerización) de manera que el polipéptido resultante conserva una afinidad de unión específica a una molécula diana o conserva la actividad de señalización (por ejemplo, la actividad del dominio activador). En determinadas modalidades, un enlazador está compuesto de aproximadamente dos a aproximadamente 35 aminoácidos, por ejemplo, o aproximadamente cuatro a aproximadamente 20 aminoácidos o aproximadamente ocho a aproximadamente 15 aminoácidos o aproximadamente 15 a aproximadamente 25 aminoácidos. En otras modalidades, un espaciador puede tener una estructura particular, como un dominio CH2CH3 de anticuerpo, un dominio bisagra o similar. En una modalidad, un espaciador comprende los dominios CH2 y CH3 de IgG1 o IgG4.
"Aminoácidos de unión" o "residuos de aminoácidos de unión" se refieren a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2 a 10) residuos de aminoácidos entre dos motivos, regiones o dominios adyacentes de un polipéptido, tal como entre un dominio de unión y un dominio de multimerización adyacente o entre una región hidrófoba y un dominio de multimerización adyacente o entre un enlazador peptídico o espaciador que une dos motivos, regiones o dominios y un dominio activador adyacente. Los aminoácidos de unión pueden resultar del diseño de la construcción de una proteína de fusión (por ejemplo, residuos de aminoácidos resultantes del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión).
Un "dominio alterado" o "proteína alterada" se refiere a un motivo, región, dominio, péptido, polipéptido o proteína con una identidad de secuencia con un motivo, región, dominio, péptido, polipéptido o proteína de tipo silvestre (por ejemplo, un FKBP12, FRP, ITAM, CD3Z, TCR humanos silvestres) de al menos el 75 % (por ejemplo, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 y% o 99,5 %). Por ejemplo, una "FKBP alterada" se refiere a una FKBP con una identidad de secuencia con una FKBP de tipo silvestre (por ejemplo, una FKBP humana) de al menos el 75 % (por ejemplo, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %). De manera similar, un "CD3Z alterado" se refiere a un CD3Z con una identidad de secuencia con un CD3Z de tipo silvestre (por ejemplo, un CD3Z humano) de al menos el 75 % (por ejemplo, 80 %, 82 %, 84 %, 86 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 %).
Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquiera de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados, por ejemplo, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por traducción in vitro, y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasas o acción de exonucleasas. En determinadas modalidades, los ácidos nucleicos de la presente descripción se producen mediante PCR. Los ácidos nucleicos pueden estar compuestos por monómeros que son nucleótidos naturales (tales como desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos), análogos de nucleótidos naturales (por ejemplo, formas enantioméricas a de nucleótidos naturales), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener modificaciones o sustitución de restos de azúcar, o restos de bases de pirimidina o purina. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, morfolino o similares. El término "molécula de ácido nucleico" también incluye "ácidos nucleicos peptídicos" (PNA), que comprenden bases de ácido nucleico naturales o modificadas unidas a un esqueleto de poliamida. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser monocatenarias o bicatenarias.
Como se usa en el presente documento, "mutación" se refiere a un cambio en la secuencia de una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica en comparación con una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica de referencia o de tipo silvestre, respectivamente. Una mutación puede dar como resultado varios tipos diferentes de cambios en la secuencia, incluida la sustitución, inserción o eliminación de nucleótido(s) o aminoácido(s). En otras modalidades, una mutación es una sustitución de uno o más nucleótidos o residuos.
El término "construcción" se refiere a cualquier polinucleótido que contenga un ácido nucleico recombinante. Una construcción puede estar presente en un vector (por ejemplo, un vector bacteriano, un vector viral) o puede estar integrada en un genoma. Un "vector" es una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede incluir ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores ilustrativos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episómico) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión).
Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa como orto-mixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena, que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, tipo B de mamíferos, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, spumavirus (Coffin, JM, Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, Tercera edición, Bn Fields, y otros, Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
"Vector lentiviral", como se usa en el presente documento, significa vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para la administración de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir establemente con alta eficiencia una amplia variedad de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetado, envoltura y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Al igual que el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de las glicoproteínas de la superficie viral con los receptores de la superficie celular. Al entrar, el ARN viral sufre una transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal de doble cadena, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas.
"Vectores lentivirales integrativos (o LV)", como se usa en el presente documento, significa vectores como ejemplos de aquellos que pueden integrarse en el genoma de una célula diana.
Por "vectores lentivirales no integrativos" (o NILV) se entiende vectores de suministro de genes eficientes que no se integran en el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa viral. En una modalidad, un NILV se refiere a un lentivirus que tiene una proteína integrasa mutada para disminuir específicamente su actividad integrasa. Mutaciones ilustrativas en el gen pol de HIV-1 adecuadas para reducir la actividad integrasa incluyen, pero no se limitan a: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A y K264H.
El término "unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de manera que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor se une operativamente con una secuencia codificante cuando puede afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). "Desvinculado" significa que los elementos genéticos asociados no están estrechamente relacionados entre sí y la función de uno no afecta al otro.
Como se usa en el presente documento, "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que contiene una molécula de ácido nucleico que está unida operativamente a una secuencia de control adecuada que puede efectuar la expresión de la molécula de ácido nucleico en un huésped adecuado. Dichas secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión de ribosomas y ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, un virus o simplemente un posible inserto genómico. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del huésped o, en algunos casos, puede integrarse en el propio genoma. En la presente descripción, "plásmido", "plásmido de expresión", "virus" y "vector" se usan a menudo de forma intercambiable.
El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basado en la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traducción.
El término "introducido" en el contexto de la inserción de una secuencia de ácido nucleico en una célula significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en donde la secuencia de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).
"Identidad de secuencia", como se usa en el presente documento, se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia que son idénticos a los residuos de aminoácidos en otra secuencia polipeptídica de referencia después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Los valores de porcentaje de identidad de secuencia son generados por el software BLAST2.0 de NCBI según lo definido por Altschul y otros (1997) " Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, con los parámetros establecidos en los valores predeterminados.
En determinadas modalidades, un dominio de inmunoglobulina alterado solo contiene sustituciones de aminoácidos conservadoras de un dominio de inmunoglobulina de tipo silvestre. En ciertas otras modalidades, un dominio de inmunoglobulina alterado solo contiene sustituciones de aminoácidos no conservadoras de un dominio de inmunoglobulina de tipo silvestre. En aún otras modalidades, un dominio de inmunoglobulina alterado contiene sustituciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras.
Una "sustitución conservadora" se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Las sustituciones conservadoras ilustrativas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, documento núm. WO 97/09433, página 10, publicado el 13 de marzo de 1997; Lehninger, Biochemistry, segunda edición; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), págs. 71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY y Cell Press, Cambridge, MA (1990), pág. 8). En determinadas modalidades, una sustitución conservadora incluye una sustitución de leucina por serina.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado" se refiere a una modificación de uno o más residuos de aminoácidos de un péptido por medios químicos o biológicos, ya sea con o sin una enzima, por ejemplo, por glicosilación, alquilación, acilación, formación de éster o formación de amida. Generalmente, un "derivado" se diferencia de un "análogo" en que un polipéptido original puede ser el material de partida para generar un "derivado", mientras que el polipéptido original puede no usarse necesariamente como material de partida para generar un "análogo". Un derivado puede tener diferentes propiedades químicas, biológicas o físicas del polipéptido original. Por ejemplo, un derivado puede ser más hidrofílico o puede tener una reactividad alterada (por ejemplo, una CDR que tiene un cambio de aminoácido que altera su afinidad por una diana, o FKBP que tiene un cambio de aminoácido que altera su afinidad por la rapamicina o un rapálogo de esta) en comparación con el polipéptido original.
Un "receptor" es una proteína presente en la membrana plasmática o en el citoplasma de una célula a la que se puede unir o asociar una molécula señal (es decir, un ligando, tal como una hormona, neurotransmisor, toxina, citocina). La unión de la molécula individual al receptor puede dar como resultado un cambio conformacional del receptor, que puede iniciar una respuesta celular. Sin embargo, algunos ligandos simplemente bloquean los receptores sin inducir ninguna respuesta (por ejemplo, antagonistas). Algunas proteínas receptoras son proteínas de membrana periféricas, muchos receptores de hormonas y neurotransmisores son proteínas transmembrana que están incrustadas en la bicapa de fosfolípidos de las membranas celulares, y otra clase importante de receptores son proteínas intracelulares tales como las de los receptores de hormonas peptídicas intracrinas y esteroides.
Como se usa en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una sustancia que se ha eliminado de la fuente en donde se encuentra de forma natural. Una sustancia no necesita estar purificada para estar aislada. Por ejemplo, una proteína producida en una célula huésped se considera aislada cuando se extrae o libera de la célula.
Una proteína contenida dentro de una fracción de lisado celular crudo se considera "aislada" para los fines de la presente descripción. Además, una "molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula de polinucleótido en forma de fragmento separado o como componente de una construcción de ácido nucleico más grande, que se ha separado de su célula de origen, que incluye el cromosoma en donde normalmente reside, menos una vez. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante, un péptido o una variante de este, que se ha separado del ADN genómico de una célula, es una molécula de ácido nucleico aislada. Otro ejemplo de una molécula de ácido nucleico aislada es un promotor de bacteriófago (por ejemplo, T5 o T7), o una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico, que puede clonarse en un vector que puede replicarse en una célula huésped adecuada. Otro ejemplo más de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente o sintetizada por PCR.
Como se usa en el presente documento, el término "purificado" se refiere a una sustancia que se ha liberado al menos parcialmente de contaminantes y otros materiales que normalmente la acompañan. Las sustancias se pueden purificar en diversos grados. Una sustancia es "sustancialmente pura" cuando una preparación o composición de la sustancia contiene menos del 1 % de contaminantes. Una sustancia es "esencialmente pura" cuando una preparación o composición de la sustancia contiene menos de un 5 % de contaminantes. Una sustancia es "pura" cuando una preparación o composición de la sustancia contiene menos de un 2 % de contaminantes. Para las sustancias que están "purificadas hasta la homogeneidad", los contaminantes no pueden detectarse con métodos analíticos convencionales.
"Tratamiento", "tratar" o "mejorar" se refiere a un tratamiento terapéutico o a un tratamiento profiláctico/preventivo. Un tratamiento es terapéutico si mejora al menos un síntoma de la enfermedad en un individuo que recibe tratamiento o si un tratamiento puede retrasar el empeoramiento de una enfermedad progresiva en un individuo, o prevenir la aparición de otras enfermedades asociadas.
Una "cantidad (o dosis) con eficacia terapéutica" o "cantidad (o dosis) efectiva" de una molécula o compuesto de unión específica se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad que se está tratando de una manera estadísticamente significativa. Cuando se hace referencia a un ingrediente activo individual, administrado solo, una dosis con eficacia terapéutica se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se hace referencia a una combinación, una dosis con eficacia terapéutica se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea que se administren en serie o simultáneamente.
El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones alérgicas u otras reacciones adversas graves cuando se administran mediante el uso de vías bien conocidas en la técnica.
Un "sujeto en necesidad" se refiere a un sujeto en riesgo, o que padece, de una enfermedad, trastorno o afección que es susceptible de tratamiento o mejora con una célula no natural, un complejo polipeptídico o una composición de estos proporcionada en el presente documento. En determinados aspectos de la descripción, un sujeto es un ser humano.
Se proporcionan otras definiciones a lo largo de la presente descripción.
En determinados aspectos, la presente descripción está dirigida a una célula no natural, que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente, ya sea secretada por la célula o anclada a la superficie celular, cuando se expresa; en donde un primer factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión. En determinadas modalidades, la segunda proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) comprende además un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI), en donde la segunda proteína de fusión localizada extracelularmente está unida o anclada a la superficie de la célula no natural. En determinadas modalidades, una proteína de fusión se anclaje a la superficie de una célula no natural mediante un dominio transmembrana, tal como un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD28 o similar. En algunas modalidades, una proteína de fusión se anclaje a la superficie de una célula no natural mediante una molécula de GPI.
En una modalidad adicional, una primera proteína de fusión, en lugar de comprender sus propios dominios hidrófobos y activadores, comprende un dominio de unión que se une a una proteína transmembrana expresada en la superficie de un linfocito T que comprende un dominio hidrófobo y activador (por ejemplo, TCR/CD3 o similar). En otros aspectos, la presente descripción se dirige a una primera célula no natural que comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y una segunda célula no natural que comprende una segunda molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se libera extracelularmente cuando se expresa; en donde un primer factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la primera superficie de la célula no natural con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.
En determinadas modalidades, el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes. Los ejemplos de factores puente que se asocian con dominios de multimerización y son útiles con las proteínas de fusión de esta descripción incluyen rapamicina (sirolimus) o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ácido abscísico (ABA) o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF) o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
Los ejemplos de análogos de rapamicina (rapálogos) incluyen los descritos en la patente de Estados Unidos núm.
6,649,595. En determinadas modalidades, un factor puente es un rapálogo con un efecto inmunosupresor sustancialmente reducido en comparación con la rapamicina. Un "efecto inmunosupresor sustancialmente reducido" se refiere a un rapálogo que tiene, al menos, menos de 0,1 a 0,005 veces el efecto inmunosupresor observado o esperado para una cantidad equimolar de rapamicina, medido clínicamente o en un sustituto in vitro apropiado (por ejemplo, inhibición de la proliferación de linfocitos T) o in vivo de la actividad inmunosupresora en humanos. Alternativamente, "efecto inmunosupresor sustancialmente reducido" se refiere a un rapálogo que tiene un valor de EC50 en un ensayo in vitro de ese tipo que es al menos 10 a 250 veces mayor que el valor de EC50 observado para la rapamicina en el mismo ensayo. Otros rapálogos ilustrativos incluyen everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus y zotarolimus.
En determinadas modalidades, los dominios de multimerización se asociarán con un factor puente que es una rapamicina o un rapálogo de esta. Por ejemplo, el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBp y FRB. Los dominios fRb son regiones polipeptídicas ("dominios" de proteínas) que pueden formar un complejo tripartito con una proteína FKBP y rapamicina o rapálogo de esta. Los dominios FRB están presentes en varias proteínas naturales, incluidas las proteínas mTOR (también denominadas en la literatura como FRAP, RAPT1 o RAFT) de humanos y otras especies; proteínas de levadura que incluyen Tor1 y Tor2; y un homólogo de FRAP de Candida. La información relativa a las secuencias de nucleótidos, la clonación y otros aspectos de estas proteínas ya se conocen en la técnica. Por ejemplo, un número de acceso de secuencia de proteína para un mTOR humano es el número de acceso de GenBank L34075.1 (Brown y otros, Nature 369:756, 1994).
Los dominios FRB para usar en las proteínas de fusión de esta descripción contienen generalmente al menos aproximadamente 85 a aproximadamente 100 residuos de aminoácidos. En determinadas modalidades, una secuencia de aminoácidos de FRB para usar en las proteínas de fusión de esta descripción comprenderá una secuencia de 93 aminoácidos Ile-2021 a Lys-2113 y una mutación de T2098L, basada en la secuencia de aminoácidos del número de acceso de GenBank L34075.1. Un dominio FRB para usar en las proteínas de fusión de esta descripción podrá unirse a un complejo de una proteína FKBP unida a rapamicina o un rapálogo de esta de esta descripción. En determinadas modalidades, una secuencia peptídica de un dominio FRB comprende (a) una secuencia peptídica natural que abarca al menos la región de 93 aminoácidos indicada de mTOR humano o regiones correspondientes de proteínas homólogas; (b) una variante de un FRB de origen natural en el que hasta aproximadamente diez aminoácidos, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos o de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 aminoácidos, o en algunas modalidades solo un aminoácido, del péptido de origen natural se ha eliminado, insertado o sustituido; o (c) un péptido codificado por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar selectivamente con una molécula de ADN que codifica un dominio FRB natural o por una secuencia de ADN que podría, salvo por la degeneración del código genético, de hibridar selectivamente con una molécula de ADN que codifica un dominio FRB natural.
Las FKBP (proteínas de unión a FK506) son los receptores citosólicos de los macrólidos, como FK506, FK520 y la rapamicina, y están muy conservadas entre especies. A los efectos de esta descripción, las FKBP son proteínas o dominios proteicos que pueden unirse a la rapamicina o a un rapálogo de esta y formar además un complejo tripartito con una proteína que contiene FRB o una proteína de fusión. Un dominio FKBP también puede denominarse "dominio de unión a rapamicina". La información relativa a las secuencias de nucleótidos, la clonación y otros aspectos de varias especies de FKBP se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Staendart y otros, Nature 346:671, 1990 (FKBP12 humano); Kay, Biochem. J. 314:361, 1996). Las proteínas FKBP homólogas en otras especies de mamíferos, en levaduras y en otros organismos también se conocen en la técnica y pueden usarse en las proteínas de fusión descritas en el presente documento. El tamaño de los dominios FKBP para usar en esta invención varía, según el tipo de proteína FKBP se emplee. Un dominio FKBP de una proteína de fusión de esta descripción será capaz de unirse a rapamicina o un rapálogo de esta y participar en un complejo tripartito con una proteína que contiene FRB (como puede determinarse por cualquier medio, directo o indirecto, para detectar dicha unión).
La secuencia peptídica de un dominio FKBP de una proteína de fusión FKBP de esta invención comprende (a) una secuencia peptídica de FKBP de origen natural, preferentemente derivada de la proteína FKBP12 humana (núm. de acceso de GenBank AAA58476.1) o una secuencia peptídica derivada de esta, de otra FKBP humana, de una FKBP murina o de otro mamífero, o de alguna otra FKBP animal, de levadura o fúngica; (b) una variante de una secuencia de FKBP de origen natural en la que hasta aproximadamente diez aminoácidos, o aproximadamente 1 a aproximadamente 5 aminoácidos o aproximadamente 1 a aproximadamente 3 aminoácidos, o en algunas modalidades solo un aminoácido, del péptido natural se ha eliminado, insertado o sustituido; o (c) una secuencia peptídica codificada por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar selectivamente con una molécula de ADN que codifica una FKBP natural o por una secuencia de ADN que podría, salvo por la degeneración del código genético, de hibridar selectivamente con una Molécula de ADN que codifica una FKBP natural.
Otros pares de dominios de multimerización incluyen FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI, o variantes de estos.
En aún otras modalidades, un factor anti-puente bloquea la asociación de al menos dos primeras proteínas de fusión con el factor puente. Por ejemplo, la ciclosporina o FK506 podrían usarse como factores anti-puente para valorar la rapamicina y, por lo tanto, detener la señalización ya que solo se une un dominio de multimerización. En determinadas modalidades, un factor anti-puente (por ejemplo, ciclosporina, FK506) es un agente inmunosupresor. Por ejemplo, se puede usar un factor anti-puente inmunosupresor para bloquear o minimizar la función de las proteínas de fusión de la presente descripción y al mismo tiempo inhibir o bloquear una respuesta inflamatoria no deseada o patológica en un entorno clínico.
En determinadas modalidades, una primera proteína de fusión (por ejemplo, componente de señalización de DARIC) tiene un primer dominio de multimerización que comprende un primer polipéptido FKBP o una variante de este, y una segunda proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) tiene un segundo dominio de multimerización que comprende un primer polipéptido FRB o variante de este. En otras modalidades, una primera proteína de fusión (por ejemplo, componente de señalización de DARIC) tiene un primer dominio de multimerización que comprende un primer polipéptido FRB o una variante de este, y una segunda proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) tiene un segundo dominio de multimerización que comprende un primer polipéptido FKBP o variante de este. En cualquiera de estas modalidades, la segunda proteína de fusión comprende además un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) y, opcionalmente, un dominio de señalización subumbral. En algunas modalidades, una segunda proteína de fusión contiene una molécula de GPI, en donde la secuencia señal de GPI se ha eliminado o alterado para unirse a la molécula de GPI.
En determinadas modalidades, una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un tercer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer y tercer dominio de multimerización se localizan extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión en una célula. En determinadas modalidades, el tercer dominio de multimerización de la primera proteína de fusión es un dominio de unión para un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, ABA o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, Tmp-SLF o un derivado de este, o cualquier combinación de estos.
En aún otras modalidades, un segundo factor puente promueve la asociación de al menos dos primeras proteínas de fusión con el factor puente asociado y dispuesto entre los terceros dominios de multimerización de las primeras proteínas de fusión. En determinadas modalidades, un complejo proteico que se forma es un homocomplejo que comprende al menos dos primeras proteínas de fusión, en donde los dominios de multimerización pueden ser DHFR (donde la molécula puente es metotrexato) o GyrB (donde la molécula puente es cumermicina) o FKBP (donde la molécula puente es AP1903 o AP20187). En ciertas otras modalidades, un complejo proteico es un heterocomplejo que comprende una o más primeras proteínas de fusión y una o más segundas proteínas de fusión.
En determinadas modalidades, un dominio hidrófobo es un dominio transmembrana, tal como un dominio transmembrana de CD4, CD8, CD28 o similares. En algunas modalidades, una proteína de fusión (por ejemplo, un componente de unión de DARIC) comprende un dominio de anclaje, tal como un dominio transmembrana o una secuencia señal de GPI. En otras modalidades, una proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) contiene una molécula de GPI, en donde la secuencia señal de GPI se ha eliminado o alterado para unirse a la molécula de GPI.
En otras modalidades, el dominio activador comprende un dominio de señalización del receptor de linfocitos o comprende una secuencia de aminoácidos que tiene uno o una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM). En aún otras modalidades, un dominio activador comprende una porción citoplasmática que se asocia con una proteína de señalización citoplasmática, en donde la proteína de señalización citoplasmática es un receptor de linfocitos o un dominio de señalización de este, una proteína que comprende una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM), un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos. Los dominios activadores ilustrativos incluyen, entre otros, CD2, CD3e, CD38, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A y CD79B, CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40 o cualquier combinación de estos. En aún otras modalidades, una primera molécula de ácido nucleico codifica la primera proteína de fusión que además comprende uno o más dominios activadores, dominios coestimuladores, factores de adhesión o cualquier combinación de estos. Como se usa en el presente documento, el término "dominio de señalización coestimuladora" o "dominio de coestimulación" se refiere a un dominio de señalización intracelular de un factor coestimulador. Los dominios coestimuladores ilustrativos incluyen, entre otros, dominios de señalización intracelular de CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM y OX40.
En determinadas modalidades, una célula no natural sobreexpresa además un factor coestimulador, un factor inmunomodulador, un agonista de un factor coestimulador, un agonista de un factor inmunomodulador o cualquier combinación de estos. En una modalidad relacionada, el cofactor IL-12 se sobreexpresa o se suministra a la célula.
Los dominios de unión a proteínas de fusión útiles en la presente invención incluyen los conocidos en la técnica o como se describe en el presente documento, o los generados por una variedad de métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos núms. 6,291,161 y 6,291,158). Por ejemplo, los dominios de unión a proteínas de fusión pueden identificarse mediante el cribado de una biblioteca de fagos Fab en busca de fragmentos Fab que se unen específicamente a una diana de interés (ver Hoet y otros, Nat. Biotechnol. 23:344, 2005). Además, las estrategias tradicionales para el desarrollo de hibridomas, tal como el uso de un antígeno diana como inmunógeno en sistemas convenientes (por ejemplo, ratones, HuMAb mouse®, TC mouse™, KM-mouse®, llamas, ovejas, pollos, ratas, hámsteres, conejos, etc.), se pueden usar para desarrollar anticuerpos contra la diana con dominios de unión específicos de la diana de interés.
Las fuentes de otros dominios de unión incluyen dominios variables de anticuerpos específicos de diana de varias especies (que pueden formatearse como anticuerpos, sFv, scFv, Fab o dominio VH soluble o anticuerpos de dominio), que incluyen humanos, roedores, aves y ovinos. Otras fuentes de dominios de unión incluyen dominios variables de anticuerpos de otras especies, tales como camélidos (de camellos, dromedarios o llamas (Ghahroudi y otros, FEBS Letters 414:521, 1997; Vincke y otros, J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; y Hamers-Casterman y otros, Nature 363:446, 1993; y Nguyen y otros, J. Mol. Biol. 275:413, 1998), tiburones nodriza (Roux y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), pez rata manchado (Nguyen y otros, Immunogenetics 54:39, 2002), o lamprea (Herrín y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 y Alder y otros, Nature Immunol. 9:319, 2008). Aparentemente, estos anticuerpos pueden formar regiones de unión a antígeno mediante el uso de solamente la región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros de cadenas pesadas únicamente (denominados "anticuerpos de cadena pesada") (Jespers y otros, Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo y otros, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral y otros, Nature Med. 12:580, 2006, y Barthelemy y otros, J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
Otras fuentes alternativas de dominios de unión específicos de la diana incluyen secuencias que codifican genotecas de péptidos aleatorios o secuencias que codifican una diversidad de aminoácidos diseñados en regiones de bucle de estructuras alternativas diferentes de anticuerpos, tales como dominios de fibrinógeno (ver, por ejemplo, Weisel y otros (1985) Science 230: 1388), dominios de Kunitz (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,423,498), proteínas repetidas de anquirina (también conocidas como DARPins; Binz y otros, J. Mol. Biol. 332:489, 2003 yBinz y otros, Nat. Biotechnol. 22:575, 2004), dominios de unión a fibronectina (también conocidos como adnectinas o monocuerpos; Richards y otros, J. Mol. Biol. 326:1475, 2003; Parker y otros, Protein Eng. Des. Sel. 18:435, 2005 y Hackel y otros, J. Mol. Biol. 381:1238, 2008), miniproteínas de nudo de cisteína (Vita y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404, 1995; Martín y otros, Nat. Biotechnol. 21:71, 2002 yHuang y otros, Structure 13:755, 2005), dominios de repetición de tetratricopéptidos (Main y otros, Structure 11:497, 2003 y Cortajarena y otros, ACS Chem. Biol.
3:161, 2008), dominios repetidos ricos en leucina (Stumpp y otros, J. Mol. Biol. 332:471, 2003), anticalinas (Skerra, FEBS J. 275:2677, 2008), dominios de lipocalina (ver, por ejemplo, publicación PCT núm. WO 2006/095164, Beste y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 y Schonfeld y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), proteínas de repetición de armadillo (ArmRP; Varadamsetty y otros, J. Mol. Biol. 424:68, 2012), diacuerpos (Manzke y otros, Int. J. Cancer 82:700, 1999), repecuerpos (Lee y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 109: 3299, 2012), minicuerpos (Hu y otros, Cancer Res. 56:3055, 1996), ciclótidos (Craik y otros, J. Mol. Biol. 294:1327, 1999), dominios tipo V (ver, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0065431), dominios de lectina tipo C (Zelensky y Gredy, FEBS J. 272:6179, 2005; Beavil y otros I, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 ySato y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb2 o Fcab™ (ver, por ejemplo, publicaciones núms. PcT WO 2007/098934; WO 2006/072620), o similares (Nord y otros, Protein Eng. 8:601, 1995; Nord y otros, Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord y otros, Eur. J. Biochem. 268:4269, 2001; y Binz y otros (2005) Nat. Biotechnol. 23:1257, 2005).
En determinadas modalidades, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando. En otras modalidades, la región variable monocatenaria de anticuerpo es un anticuerpo de dominio, sFv, scFv, F(ab')2 o Fab. En aún otras modalidades, el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es amino o carboxi terminal al dominio de multimerización.
En determinados aspectos adicionales, una célula no natural comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una fusión que comprende un dominio de unión y un dominio de multimerización y, opcionalmente, un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) o un dominio de anclaje con un dominio de señalización sub-umbral, en donde el dominio de unión se une específicamente a una diana ubicada en la superficie de una célula diana. En otras modalidades, un dominio de unión es específico para una diana que es un antígeno asociado con un cáncer (por ejemplo, neoplasia maligna sólida, neoplasia maligna hematológica), una enfermedad inflamatoria, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad de injerto contra huésped. Los antígenos diana ilustrativos incluyen, entre otros, receptor de a-folato, integrina avp6, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (GPC3), h5T4, IL-11Ra, IL13R-a2, KDR, cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE-A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notchl, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
En determinadas modalidades, dicha proteína de fusión de unión (componente de unión de DARIC) forma un complejo tripartito con el componente de señalización de DARIC y un factor puente para formar un complejo polipeptídico. Ejemplos de factores puente para tal complejo incluyen rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina o un derivado de esta, giberelina o un derivado de esta, a Ba o un derivado de este, metotrexato o un derivado de este, ciclosporina A o un derivado de esta, FKCsA o un derivado de este, o Tmp-SLF o un derivado de este.
En otros aspectos de la descripción, la presente descripción se dirige a una célula no natural que comprende (a) una primera molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y (b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión, un segundo dominio de multimerización y un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, molécula GPI), en donde la segunda proteína de fusión se localiza en la superficie celular cuando se expresa; en donde un primer factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión. En determinados aspectos de la descripción, la segunda proteína de fusión comprende además un dominio de señalización sub-umbral localizado intracelularmente.
Como se usa en el presente documento, un "dominio de señalización sub-umbral" no puede inducir o activar una cascada de transducción de señales lo suficientemente robusta en presencia de uno o más dominios de señalización sub-umbral, pero puede inducir o activar una cascada de transducción de señales o ajustar cualitativamente una señal en presencia de un dominio activador. Por ejemplo, una segunda proteína de fusión unida a una superficie celular que se asocia con otra segunda proteína de fusión unida a una superficie celular no inducirá o activará mínimamente la transducción de señales. Ejemplos de dominios de señalización sub-umbral incluyen dominios coestimuladores, tales como CD28, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD27, CD44, CD46, CD81, CD137, LFA-1, ICAM-1, VLA-4, OX40, 4-1BB, LIGHT, SLAM, ICOS, CTLA-4, PD-1 o similares.
En aspectos particulares de la descripción, una primera proteína de fusión codificada comprende un primer dominio de multimerización de FRB T2098L, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio activador de CD3Z; en donde la segunda proteína de fusión codificada comprende un dominio de unión de un scFv específico para CDl9 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12, y opcionalmente un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) o un dominio de anclaje con un dominio de señalización sub-umbral; y en donde el primer factor puente que promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula no natural es el rapálogo AP21967. Una primera proteína de fusión ilustrativa tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 15 y una segunda proteína de fusión ilustrativa tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO.: 1 o 56.
En determinadas modalidades, un componente de unión de DARIC puede tener múltiples dominios de unión. Por ejemplo, una célula no natural comprende además una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una tercera proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, opcionalmente un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) o un dominio de anclaje dominio con un dominio de señalización sub-umbral, en donde la tercera proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa. En modalidades relacionadas, las proteínas de fusión comprenden un dominio de unión que tiene uno, dos, tres o cuatro dominios de unión, en donde uno, dos, tres o cuatro dominios de unión son específicos para una diana o hasta cuatro dianas diferentes.
En cualquiera de las modalidades mencionadas anteriormente, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión (de unión) puede comprender además una secuencia que codifica un enlazador, espaciador o unión de aminoácidos dispuestos entre el dominio de unión y el segundo dominio de multimerización. En determinadas modalidades, una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) comprende además un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) y opcionalmente un dominio de señalización subumbral. En otras modalidades, una segunda proteína de fusión (por ejemplo, componente de unión de DARIC) contiene una molécula de GPI, en donde la secuencia señal de GPI se ha eliminado o alterado para unirse a la molécula de GPI.
Los ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con un exceso de transducción de señales mediada por receptores incluyen cáncer (por ejemplo, neoplasia maligna sólida y neoplasia maligna hematológica), enfermedades o afecciones autoinmunitarias o inflamatorias, sepsis resultante de infección bacteriana e infección viral.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para dirigir la activación de linfocitos T, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un componente de unión de DARIC o una composición farmacéutica de este que se une específicamente a una diana, como una diana de la superficie celular que es un antígeno específico de tumor u otro antígeno de elección en un sitio o célula donde se desea la activación de linfocitos T.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico también son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Physicians Desk Reference, 62a edición. Oradell, NJ: Medical Economics Co, 2008; Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Undécima Edición. McGraw Hill, 2005; Remington: The Science and Practice o / Pharmacy, 20a edición. Baltimore, Maryland: Lippincott Williams & Wilkins, 2000; y The Merck Index, decimocuarta edición. Whitehouse Station, Nueva Jersey: Merck Research Laboratories, 2006. Los vehículos farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes y similares. Además, también se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyentes tales como tampones, antioxidantes como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, dextrinas), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica no específica son diluyentes ilustrativos.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para inhibir el crecimiento, la metástasis o el crecimiento metastásico de una neoplasia maligna (por ejemplo, una neoplasia maligna sólida o una neoplasia maligna hematológica), que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una célula que codifica un complejo polipeptídico proporcionado en el presente documento o una composición de esta.
Una amplia variedad de neoplasias, que incluyen neoplasia maligna sólida y neoplasia maligna hematológica, son susceptibles a las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Los tipos de cáncer que se pueden tratar incluyen adenocarcinoma de mama, próstata, páncreas, colon y recto; todas las formas de carcinoma broncogénico de pulmón (que incluyen carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas); mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligno; cardiopatía carcinoide; y carcinoma (por ejemplo, de Walker, de células basales, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, de células de Merkel, mucinoso, pulmonar no microcítico, de células pequeñas, papilar, escirroso, bronquiolar, broncogénico, celular escamoso y de células de transición). Los otros tipos de neoplasias que pueden tratarse incluyen: trastornos histiocíticos; leucemia; histiocitosis maligna; Enfermedad de Hodgkin; linfoma no Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; carcinoma de células renales; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craneofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico.
Además, los siguientes tipos de cáncer también se contemplan como susceptibles de tratamiento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclondroma; cistoadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de células de la granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de células de los islotes; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de sertoli; tumor de células de la teca; leimoma; leiomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma no cromafín; y glioblastoma multiforme. Los tipos de neoplasias que pueden tratarse también incluyen angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiosarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma filodes; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; leiomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma de ovario; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasmas; nerofibromatosis; y displasia cervical.
Otros ejemplos de neoplasias que también son susceptibles a las composiciones y métodos descritos en el presente documento son neoplasias de células B, incluidos linfomas de células B (tales como diversas formas de enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (NHL) o linternas del sistema nervioso central), leucemias (como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas y leucemia mioblástica crónica) y mielomas (como el mieloma múltiple). Otras neoplasias de células B incluyen linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocitario, linfoma de la zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitario de hueso, plasmocitoma extraóseo, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células B grandes mediastínico (tímico), linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de efusión primaria, linfoma de Burkitt/leucemia, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo posterior al trasplante.
En determinadas modalidades, las células que codifican complejos polipeptídicos útiles para inhibir el crecimiento de una neoplasia maligna sólida o metástasis o el crecimiento metastásico de una neoplasia maligna sólida o una neoplasia maligna hematológica incluyen las que se unen específicamente a un antígeno tumoral o canceroso y un segundo antígeno diana en la célula cancerosa.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria o inflamatoria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una célula que codifica un complejo polipeptídico que se proporciona en el presente documento o una composición de esta.
Ejemplos de enfermedades, trastornos o afecciones autoinmunitarias o inflamatorias que pueden tratarse con las proteínas de fusión y las composiciones y sus formas de presentación unitaria incluyen enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes tipo I), dermatomiositis, polimiositis, anemia perniciosa, cirrosis biliar primaria, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (APS), hepatitis autoinmunitaria, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré (GBS), enfermedad de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, lupus neuropsiquiátrico, esclerosis múltiple (EM), miastenia grave, pénfigo vulgar, asma, artritis psoriásica, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), anemia hemolítica autoinmunitaria, penfigoide ampolloso, vasculitis, enfermedad celíaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, morfea, esclerodermia, narcolepsia, neuromiotonía, vitíligo y enfermedad autoinmunitaria del oído interno.
En determinados aspectos de la descripción, un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped comprende (a) administrar una célula recombinante que comprende una primera y una segunda molécula de ácido nucleico, en donde la primera molécula de ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión, y la segunda molécula de ácido nucleico codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa; y (c) administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el dominio de unión del complejo polipeptídico se une específicamente a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa para promover una respuesta inmunomoduladora y, por lo tanto, trata la enfermedad hiperproliferativa.
En un aspecto particular de la descripción, un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped comprende (a) administrar una o más células recombinantes que comprenden una primera molécula de ácido nucleico y una segunda molécula de ácido nucleico, en donde la primera molécula de ácido nucleico codifica una primera proteína de fusión que comprende un agente de unión que se une a un receptor expresado en un linfocito T y un primer dominio de multimerización, y la segunda molécula de ácido nucleico codifica una segunda proteína de fusión que comprende un agente de unión que se une a una diana de la superficie celular en una célula de enfermedad hiperproliferativa y un segundo dominio de multimerización, y (c) administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico, por ejemplo, un BiTE, con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el agente de unión de la primera proteína de fusión se une a un receptor en un linfocito T y el agente de unión de la segunda proteína de fusión se une a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa para promover una respuesta inmunomoduladora y por lo tanto trata la enfermedad hiperproliferativa.
En otros aspectos de la descripción, un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa, inflamatoria, autoinmunitaria o de injerto contra huésped comprende (a) administrar una célula no natural que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; (b) administrar una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión y un segundo dominio de multimerización, que comprende opcionalmente un dominio de anclaje (por ejemplo, dominio transmembrana, secuencia señal de GPI) o un dominio de anclaje con un dominio de señalización subumbral; y (c) administrar un factor puente, en donde el factor puente promueve la formación de un heterocomplejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión; en donde el dominio de unión del heterocomplejo polipeptídico se une específicamente a una diana de la superficie celular en una célula de una enfermedad hiperproliferativa para promover una respuesta inmunomoduladora y, por lo tanto, trata la enfermedad hiperproliferativa.
Cualquiera de las células no naturales, proteínas de fusión, factores puente y otras moléculas accesorias mencionadas anteriormente pueden usarse en los métodos de tratamiento de esta descripción. En determinados aspectos de la descripción, un método comprende además administrar un agente que antagoniza o bloquea un inhibidor de la activación de linfocitos T, tal como un agente que antagoniza o bloquea un ligando de linfocitos T o un receptor de linfocitos T. En determinados aspectos de la descripción, un agente que antagoniza o bloquea un inhibidor de la activación de los linfocitos T es un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-PD-L1 o un anticuerpo anti-CTLA4 o un fragmento de unión a antígeno de este, o una endonucleasa dirigida manipulada que se dirige a PD-1. En otros aspectos de la descripción, el método comprende además administrar un agonista de citocinas.
Las células, proteínas de fusión, factores puente, otras moléculas accesorias o composiciones de estos de la presente descripción pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, por inhalación en aerosol, por vía vaginal, rectal o por inyección intracraneal, o cualquier combinación de estas. En determinados aspectos de la descripción, las proteínas de fusión, los factores puente o sus composiciones se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración por inyección intravascular, intravenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. En determinados aspectos de la descripción, las proteínas de fusión, los factores puente o sus composiciones se administran por inyección, como por vía intravenosa.
También se contempla la administración de células recombinantes con un factor puente, células recombinantes con una proteína de fusión y un factor puente, o sus composiciones en combinación con un segundo agente. Un segundo agente puede ser uno aceptado en la técnica como un tratamiento estándar para un estado patológico o trastorno particular, tal como cáncer, inflamación, autoinmunidad e infección. Los segundos agentes ilustrativos contemplados incluyen células recombinantes con un factor puente, células recombinantes con una proteína de fusión y un factor puente, o sus composiciones que se unen a dianas diferentes de aquellas a las que se une el complejo proteico primario, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión derivadas de inmunoglobulinas, agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante, esteroides, AINE, agentes antiinfecciosos u otros agentes activos y auxiliares, o cualquier combinación de estos.
Los segundos agentes útiles en combinación con células recombinantes con un factor puente, células recombinantes con una proteína de fusión y un factor puente, o sus composiciones proporcionadas en el presente documento pueden ser esteroides, AINE, inhibidores de mTOR (por ejemplo, rapamicina (sirolimus), temsirolimus, deforolimus, everolimus, zotarolimus, curcumina, ácido farnesiltiosalicílico), inhibidores de la calcineurina (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus), antimetabolitos (por ejemplo, ácido micofenólico, micofenolato de mofetilo), anticuerpos policlonales (por ejemplo, globulina antitimocito), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, daclizumab, basiliximab) y proteínas de fusión CTLA4-Ig (por ejemplo, abatacept o belatacept).
Los segundos agentes útiles para inhibir el crecimiento de una neoplasia maligna sólida, inhibir la metástasis o el crecimiento metastásico de una neoplasia maligna sólida, o tratar o mejorar una neoplasia maligna hematológica incluyen agentes quimioterapéuticos, radiación ionizante y otros fármacos antineoplásicos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos contemplados como agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán y clorambucilo); quimioterapéuticos bifuncionales (por ejemplo, bendamustina); nitrosoureas (por ejemplo, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y semustina (metil-CCNU)); etileniminas y metilmelaminas (por ejemplo, trietilenmelamina (TEM), trietilentiofosforamida (tiotepa) y hexametilmelamina (HMM, altretamina)); sulfonatos de alquilo (por ejemplo, buslfan); y triazinas (por ejemplo, dacabazina (DTIC)); antimetabolitos, tales como los análogos del ácido fólico (por ejemplo, metotrexato, trimetrexato y pemetrexed (antifolato multidirigido)); análogos de pirimidina (tales como 5-fluorouracilo (5-FU), fluorodesoxiuridina, gemcitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina y 2,2'-difluorodesoxicitidina); y análogos de purina (por ejemplo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritrohidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA)); inhibidores de la topoisomerasa tipo I, tal como camptotecina (CPT), topotecán y irinotecán; productos naturales, tales como epipodofilotoxinas (por ejemplo, etopósido y tenipósido); y alcaloides de la vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina y vinorelbina); antibióticos antitumorales tales como actinomicina D, doxorrubicina y bleomicina; radiosensibilizadores tales como 5-bromodesoxiuridina, 5-yododesoxiuridina y bromodesoxicitidina; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino; ureas sustituidas, tales como hidroxiurea; y derivados de metilhidrazina tales como N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina. Los agentes terapéuticos adicionales contemplados por esta descripción para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias se denominan agentes inmunosupresores, que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmunitario del individuo que se está tratando. Los agentes inmunosupresores incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), analgésicos, glucocorticoides, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD) para el tratamiento de la artritis o modificadores de las respuestas biológicas. Las composiciones en la descripción de DMARD también son útiles en el tratamiento de muchas otras enfermedades autoinmunitarias además de la artritis reumatoide.
Los AINE ilustrativos incluyen ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico, inhibidores de Cox-2 (tales como Vioxx o Celebrex) y sialilatos. Los ejemplos de analgésicos incluyen paracetamol, oxicodona, tramadol o clorhidrato de proporxifeno. Los glucocorticoides ilustrativos incluyen cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona o prednisona. Los modificadores de la respuesta biológica ilustrativos incluyen moléculas dirigidas contra marcadores de la superficie celular (por ejemplo, CD4, CD5, etc.), inhibidores de citocinas, tales como los antagonistas del TNF (por ejemplo, etanercept (Enbrel), adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade), inhibidores de quimiocinas e inhibidores de moléculas de adhesión. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen anticuerpos monoclonales, así como también formas recombinantes de moléculas. Los DMARD ilustrativos incluyen azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, penicilamina, leflunomida, sulfasalazina, hidroxicloroquina, oro (oral (auranofín) e intramuscular) y minociclina.
En aún otros aspectos, la presente descripción proporciona un heterocomplejo polipeptídico de fusión, que comprende (a) una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un dominio hidrófobo y un dominio activador; (b) una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión extracelular y un segundo dominio de multimerización; y (c) un factor puente; en donde la primera proteína de fusión, la segunda proteína de fusión y el factor puente se asocian para formar un heterocomplejo polipeptídico con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión. Cualquiera de los componentes de proteínas de fusión y factores puente mencionados anteriormente puede usarse en estos aspectos de la descripción.
En otros aspectos, la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una cualquiera o más de las proteínas de fusión antes mencionadas. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden incorporarse en un vector de expresión (por ejemplo, un vector lentiviral), en donde la primera y la segunda proteínas de fusión se codifican como un mensaje policistrónico o como una única proteína separada por un péptido 2A. En determinados aspectos de la descripción, el mensaje policistrónico comprende un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) entre las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de fusión.
Se proporcionan ejemplos ilustrativos de componentes de unión y señalización de DARIC en las SEQ ID NO: 1-75 y más abajo en la Tabla 1.
Tabla 1. Com onentes ilustrativos de unión señalización de DARIC
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EJEMPLOS
Ejemplo 1
Construcción de componentes de unión y señalización de daric
Los componentes de unión y señalización de DARIC se clonaron por separado en un vector plasmídico que contenía un promotor T7, una señal de secreción hScn o hCD8, respectivamente, y un sitio de linealización hacia el extremo 3’. Después, se usaron plásmidos linealizados como moldes para las reacciones de transcripción in vitro, seguidas de las etapas de poliadenilación en 3' y protección en 5' para crear ARNm maduro transcrito in vitro (IVT-ARNm) para ser electroporado en linfocitos T humanas primarias. Los linfocitos T humanos se aislaron de PBMC por selección negativa mediante el uso de perlas paramagnéticas y se expandieron con perlas anti-CD3/anti-cD28 durante 48 horas antes de la electroporación. En paralelo, se realizaron electroporaciones de control mediante el uso de IVT-ARNm que codifican proteínas fluorescentes para confirmar la eficacia de la transfección, o se incorporaron proteínas fluorescentes unidas a proteínas 2A directamente en las especies de ARNm del componente DARlC. Los componentes de unión que codifican IVT-ARNm ilustrativos (scFv específico para CD19 y el dominio de multimerización FKBP12 ("DmrA"), FKBP12 F36V ("DmrB"), FRB (2021-2113) T2098L ("DmrC")) se proporcionan en las SEQ ID NO.:2, 5 y 8 (scFv específico para CD19 y dominio de multimerización f Kb P12, Fk BP12 F36V o FRB (2021-2113) T2098L, respectivamente). Los componentes de señalización de codificación de IVT-ARNm ilustrativos se proporcionan en las SEQ ID NO.: 16, 20 y 24 (dominio de multimerización FRB (2021-2113) T2098L, FKBP12 F36V o FKBP12, respectivamente, dominio transmembrana, 4-1BB y CD3Z).
La multimerización se promueve con un factor puente, tal como rapamicina o rapálogos de esta, o giberelina o derivados de esta. La rapamicina y sus derivados (por ejemplo, AP21967, también conocido como C-16-(S)-7-metilindolerapamicina, IC50 = 10 nM, un análogo de rapamicina no inmunosupresor modificado químicamente) pueden inducir la heterodimerización de proteínas de fusión que contienen FKBP12 y FRB. AP1903 o AP20187 son fármacos homobivalentes basados en el componente de rapamicina que interactúa con FKBP12, que se pueden utilizar en los escenarios de homodimerización descritos en el presente documento.
Ejemplo 2
Citotoxicidad de las células t que codifican los componentes de daric
Los linfocitos T recombinantes que expresan los dos componentes de DARIC se incubaron con células diana K562 (una línea celular de leucemia mieloide humana), que se modificaron para expresar el antígeno CD19 o CD20, para examinar la lisis de las células dianas. Brevemente, los linfocitos T se coincubaron con una mezcla 50:50 de líneas de células diana K562-CD19 y K562-CD20, en relaciones de linfocitos T a células diana de 3:1 o 10:1. En las muestras experimentales, se añadió una concentración final de 500 nM del rapálogo heterobivalente AP21967. El porcentaje relativo de cada una de las líneas celulares diana se controló mediante citometría de flujo con tinción para los antígenos CD19 y CD20 para evaluar la lisis celular (ver la Figura 3).
Se prepararon cuatro muestras de linfocitos T humanas primarias mediante electroporación con IVT-ARNm que codifica (i) un receptor de antígeno quimérico (CAR) monocatenario ampliamente validado (CD19-CAR, SEQ ID NO.:14, control positivo); (ii) el componente de señalización de DARIC solamente (DSC, SEQ ID NO.:16, control negativo); iii) el componente de unión de DARIC solamente (DBC-CD19, SEQ ID NO.:2, control negativo); y (iv) ambos componentes de unión y señalización de DARIC (DSC, SEQ ID NO.: 16 más DBC-CD19, SEQ ID No .: 2). Los porcentajes relativos de cada una de las líneas celulares diana se controlaron mediante citometría de flujo con tinción para los antígenos CD19 y CD20 (Figura 3A).
El porcentaje de citotoxicidad específica se calculó para cada condición como el cambio porcentual relativo a la relación K562-CD19:K562-CD20 de entrada. Los linfocitos T que expresan el CD19-CAR validado (SEQ ID NO.:14) mostraron una citotoxicidad sustancial y un sesgo de la relación de células CD19 frente a CD20 en el portal de células vivas, particularmente en una relación de linfocitos T a células diana de 10:1. Los linfocitos T que expresan el componente de unión de DARIC solo, el componente de señalización de DARIC solo o ambos componentes de DARIC pero sin la adición del rapálogo heterobivalente AP21967 no mostraron citotoxicidad significativa. En presencia de AP21967, se observó una citotoxicidad específica sustancial y una pérdida de las células diana K562-CD19 tras la coincubación con linfocitos T que expresan ambos componentes de DARIC (Figura 3B).
Estos resultados indican que el mecanismo DARIC puede reconstituir la lisis de células diana específica de antígeno. Además, el diseño de DARIC permite el control farmacológico de la citotoxicidad de linfocitos T específicas de antígeno.
Ejemplo 3
Perfil de secreción de citoquinas de las células t que codifican los componentes de daric
Los linfocitos T recombinantes que expresan los dos componentes de DARIC se incubaron con células diana K562 (una línea celular de leucemia mieloide humana), que se modificaron para expresar el antígeno CD19 o CD20, para examinar la expresión de citocinas. Brevemente, los linfocitos T transfectados con IVT-ARNm se coincubaron con las líneas celulares K562-CD19 o K562-CD20 mediante el uso de relaciones de linfocitos T a diana de 1:1, con o sin la adición de AP21967 500 nM. Los sobrenadantes se aislaron para el análisis de la producción de citocinas (ver la Figura 4).
Dos muestras de linfocitos T humanos primarios se aislaron, expandieron y después se prepararon mediante electroporación con IVT-ARNm que codifica (i) el CAR monocatenario validado (CD19-CAR, s Eq ID NO.:13, control positivo); o (ii) ambos componentes de unión y señalización de DARIC (DSC, SEQ ID NO.:16 más DBC-CD19, SEQ ID NO.:2). Después de lavar exhaustivamente los linfocitos T expandidos y sometidos a electroporación para eliminar las citocinas residuales del medio de crecimiento, los linfocitos T se coincubaron con líneas celulares K562 que expresaban el antígeno CD19 humano (paneles de la izquierda) o el antígeno CD20 (paneles de la derecha) en una relación de linfocitos T a células diana de 1:1 y en presencia o ausencia del rapálogo AP21967. Después, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron las concentraciones de analitos mediante el uso de perlas marcadas con anticuerpos de captura de citocinas (Becton Dickenson Cytokine Bead Array, kit de Th1/Th2 humano). La comparación con los estándares de proteínas recombinantes permitió el cálculo de las concentraciones absolutas de cada una de las seis citocinas que abarcó la matriz de perlas.
De acuerdo con los hallazgos previos de citotoxicidad, los linfocitos T que expresaron el control positivo CD19-CAR produjeron cantidades sustanciales de interferón-gamma (IFNy) e interleucina-2 (IL-2) cuando se coincubaron con células diana K562 que expresaban CD19. Los linfocitos T que expresaban los componentes de DARIC en ausencia del factor puente AP21967 no mostraron una producción significativa de citocinas, pero en presencia de AP21967 produjeron IFNy e IL-2 a niveles equivalentes o superiores al control positivo CD19-CAR monocatenario.
Ejemplo 4
Suministro lentiviral de componentes de daric
Los linfocitos T humanos primarias se aislaron, activaron y después se transdujeron con vectores lentivirales que codifican los componentes de unión y señalización de DARIC (SEQ ID NO.: 44 y 47). Los linfocitos T transducidos se coincubaron después con una mezcla de aproximadamente 50:50 de células diana K562 que expresaban CD19 (K562-CD19) o CD20 (K562-CD20) para evaluar la citotoxicidad específica del antígeno. La relación global de linfocitos T a células K562 fue de 5:1 en todas las muestras. En las muestras de control, no se añadió ningún factor puente, mientras que en las muestras experimentales se aplicó rapamicina (10 nM) o AP21967 (100 nM) como factor puente para el componente secretado de unión al antígeno y el componente de señalización (ver, por ejemplo, la Figura 1B). El componente de unión al antígeno de DARIC incluye un dominio scFv de unión al antígeno CD19 y un dominio de multimerización FKBP12, que se unió a una proteína fluorescente mCherry. Se probaron dos dominios de multimerización independientes que tenían diferentes especificidades para los componentes puente en el componente de señalización de DARIC: FRB, que es sensible a la rapamicina, y la variante FRB (2021-2113) T2098L, que es sensible tanto a la rapamicina como a AP21967, cada uno unido a la proteína fluorescente azul (BFP).
El análisis de citometría de flujo de los linfocitos T transducidos por lentivirus demostró la expresión de las proteínas mCherry y BFP simultáneamente, lo que indica que ambos componentes de DARIC se expresaron dentro de las mismas células (consulte la Figura 5, primera columna para cada tratamiento). El análisis de citometría de flujo de las células K562 demostró la eliminación dependiente de rapamicina y AP21967 de las células K562 que expresan CD19 en la muestra que expresa el dominio de multimerización variante de T2098L FRB (2021-2113), mientras que la no adición de un factor puente no tuvo efecto sobre la supervivencia celular (ver la Figura 5, fila superior de la segunda columna para cada tratamiento). Sin embargo, solo la rapamicina pudo activar la eliminación de las células K562-CD19 por parte de los linfocitos T que expresan el dominio de dimerización de FRB, mientras que AP21967 o la ausencia de un factor puente no tuvieron efecto sobre la supervivencia celular (ver la Figura 5, segunda fila de la segunda columna para cada tratamiento). Estos datos muestran la especificidad de la actividad citotóxica que se puede lograr con el sistema de componentes de múltiples partes DARIC.
Además, se mezclaron dos poblaciones de linfocitos T distintos, en las que una población expresaba un componente de unión al antígeno DARIC y la otra población expresaba un componente de señalización de DARIC. Esta población de células mixtas, cuando se cocultivó con las células K562 que expresan CD19 y CD20, mostró una respuesta de citotoxicidad dependiente de rapamicina contra las células K562-CD19, mientras que la ausencia de un factor puente no tuvo efecto sobre la supervivencia de las células diana (ver la Figura 5, fila inferior). Estos datos indican que un componente de unión al antígeno DARIC expresado por una población de linfocitos T puede actuar en trans con una población diferente de linfocitos T que expresan un componente de señalización de DARIC y atacar las células diana.
La flexibilidad del sistema DARIC se validó intercambiando los dominios de multimerización de modo que el componente de unión de DARIC dirigido a CD19 comprendiera el dominio DmrC basado en FRB y el componente de señalización de DARIC comprendiera el dominio DmrA basado en FKBP12 (SEQ ID NO.: 12, 31). Los linfocitos T humanas primarias se modificaron para expresar los componentes de DARIC “intercambiados” y después se coincubaron con mezclas 50:50 de las células diana K562-CD19 y C562-CD20 en ausencia o presencia de las concentraciones indicadas de rapamicina (Figura 10). Se observó citotoxicidad específica de antígeno en las muestras experimentales que contenían el factor puente, pero no en la muestra de control que carecía de rapamicina. Estos datos demuestran que la arquitectura del sistema DARIC es flexible y susceptible a una variedad de orientaciones de los dominios de multimerización.
Ejemplo 5
Titulación de factores puente a niveles subterapéuticos
Se probó una amplia gama de concentraciones de factores puente (rapamicina y everolimus) para determinar si un sistema DARIC puede funcionar en concentraciones clínicamente relevantes. Como en el Ejemplo 4, los linfocitos T humanos primarias se aislaron, activaron y después se transdujeron con vectores lentivirales que expresan un componente de unión de DARIC (SEQ ID NO.: 1, 4, 7) y un componente de señalización de DARIC (SEQ ID NO.:
15, 19, 23). Los linfocitos T que expresan DARIC se coincubaron después con mezclas 50:50 de las células diana K562-CD19 y K562-CD20 para evaluar la citotoxicidad específica del antígeno. La relación global de linfocitos T a células K562 fue de 5:1 en todas las muestras.
Las concentraciones indicadas de rapamicina y everolimus se agregaron a las muestras de cocultivo y después se evaluaron las respuestas de citotoxicidad mediante citometría de flujo (Figura 6). Las respuestas de citotoxicidad se mantuvieron en concentraciones subnanomolares del fármaco, muy por debajo de las concentraciones en estado estacionario de rapamicina y everolimus que se alcanzan actualmente cuando estos fármacos se administran a pacientes en la clínica.
Ejemplo 6
Uso de un componente de unión daric anclado
Se ensayaron una serie de moléculas DARIC adicionales, en las que el componente de unión al antígeno se mantuvo en la superficie de los linfocitos T en lugar de liberarse en el espacio extracelular (véase, por ejemplo, la Figura 1I). Se usaron varias regiones proteicas y dominios transmembrana para anclar el dominio de unión a la superficie del linfocito T (SEQ ID NO.: 50, 53, 56, 59), cada uno alterando los parámetros estéricos o espaciales que gobiernan la multimerización de los componentes de unión y señalización de DARIC. Como en los ejemplos anteriores, se usaron respuestas de citotoxicidad específicas de antígeno mediante el uso de linfocitos T transducidas por lentivirus y mezclas 50:50 de células diana K562-CD19 y K562-CD20 para evaluar el componente de unión de DARIC anclado. La relación global de linfocitos T a células K562 fue de 5:1 en todas las muestras, con las concentraciones indicadas de un factor puente utilizado en muestras experimentales.
Cada diseño tenía la propiedad de citotoxicidad específica de antígeno sensible al factor puente frente a las células K562-CD19. El componente de unión de DARIC anclado que contiene el dominio bisagra CD8/transmembrana CD8 (SEQ ID NO.:53) mostró un nivel medible de actividad en ausencia de un factor puente. El componente de unión de DARIC anclado que comprende el espaciador IgG4 CH2CH3 con el dominio transmembrana de CD4 (SEQ ID NO.: 56) proporcionó la respuesta citotóxica más fuerte tras la adición de rapamicina (factor puente), mientras que el componente de unión de DARIC anclado que comprende solo el dominio transmembrana de CD4 (SEQ ID nO.:50) fueron moderadamente activos (Figura 7). También se probaron componentes de unión de DARIC que comprenden una secuencia señal de GPI de la proteína CD52 (ver esquema en la Figura 1K). El DARIC anclado a GPI produjo una respuesta de citotoxicidad específica de antígeno solo en presencia de un factor puente apropiado (Figura 8). Estos datos demuestran que un componente de unión de DARIC puede liberarse o anclarse a la superficie celular y seguir funcionando con un componente de señalización de DARIC.
Se generaron construcciones lentivirales adicionales que comprendían componentes de unión de DARIC anclados y se probaron de manera similar en linfocitos T humanos, incluido un dominio transmembrana de CD4 modificado con actividad mejorada sobre otros componentes de unión de DARIC anclados a transmembrana (SEQ ID NO.:64-69). Además, los componentes de unión y señalización de DARIC se integraron en un solo marco de lectura abierto que comprende un péptido 2A situado entre los dos componentes (tal como el que se usa en la Figura 11), validando así un esquema de suministro de DARIC simplificado mediante el uso de un solo vector lentiviral (SEQ ID NO.: 66, 69, 72).
Para cualquiera de los diseños de componentes de DARIC, se esperan resultados similares mediante el uso de una variedad de diseños de vectores lentivirales, tales como aquellos que comprenden promotores bidireccionales (SEQ ID NO.:73), por ejemplo, o mediante el uso de vectores de suministro de transgenes alternativos (por ejemplo, adenovirus o AAV) y esquemas tales como al incluir la integración dirigida de transgenes a través de recombinación homóloga, un proceso que se puede estimular a una alta eficiencia mediante el uso de nucleasas específicas de genes.
Ejemplo 7
Direccionamiento de daric a otros antígenos modelo
El sistema DARIC se amplió a un antígeno modelo adicional para mostrar la amplia aplicabilidad de células artificiales que expresan receptores de múltiples partes regulados por fármacos que se contemplan en el presente documento. Se generaron líneas celulares diana K562 para expresar el antígeno CD123 mediante la subclonación de este antígeno en un vector lentiviral que comprendía un casete de selección de puromicina (SEQ ID NO.:74), se produjeron partículas lentivirales y las células K562 se infectaron y seleccionaron con puromicina. Los linfocitos T humanos primarios se aislaron, activaron y después se transdujeron con vectores lentivirales que codificaban un componente de unión de DARIC dirigido a CD123 junto con el componente de señalización de DARIC (SEQ ID NO: 70-72). Las respuestas de citotoxicidad específicas de antígeno se evaluaron mediante el uso de linfocitos T transducidas por lentivirus cocultivadas con mezclas 50:50 de células diana K562-CD19 y K562-CD123, mediante el uso de un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a CD123 tradicional como control positivo. La relación global de linfocitos T a células K562 fue de 5:1 en todas las muestras, con las concentraciones indicadas de un factor puente utilizado en muestras experimentales. Se observó citotoxicidad en la muestra de control positivo y en la muestra de CD123 DARIC que contenía rapamicina. Los resultados demostraron que la actividad citotóxica dependiente del factor puente podría lograrse con el sistema DARIC dirigido a diversos antígenos (Figura 9).
Ejemplo 8
Desactivación de daric mediante el uso de un factor anti-puente
Se probó la desactivación del sistema DARIC mediante la adición de un agente farmacológico que compite por unirse a uno de los dominios de multimerización. Los linfocitos T humanas primarias que expresaban un CAR dirigido a CD19 tradicional o linfocitos T humanos primarios que expresaban los componentes de DARIC dirigidos a CD19 (SEQ ID NO.:66) se coincubaron con mezclas 50:50 de células K562-CD19 y K562-CD20. Para los linfocitos T que expresaban el CAR dirigido a CD19 (SEQ ID NO.:14), se observó citotoxicidad tanto en presencia como en ausencia de rapamicina. Por el contrario, los linfocitos T DARIC dirigido a CD19 mostraron una citotoxicidad específica de antígeno eficaz en presencia de niveles subnanomolares de rapamicina, pero no mostró citotoxicidad en ausencia del factor puente (Figura 11). Sin embargo, cuando se agregó FK506, se observó una marcada reducción en la citotoxicidad específica de antígeno para los linfocitos T DARIC mientras que se observó una reducción mínima para los linfocitos T CAR, lo que indica que FK506 interrumpió el acoplamiento de los componentes de DARIC y desactivó la respuesta de citotoxicidad dirigida por el antígeno.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una célula recombinante, que comprende:
a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un primer dominio transmembrana y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y
b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que comprende una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando; y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente cuando se expresa;
en donde un factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión.
2. Una célula recombinante, que comprende
a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una primera proteína de fusión que comprende un primer dominio de multimerización, un primer dominio transmembrana y un dominio activador, en donde el primer dominio de multimerización se localiza extracelularmente cuando se expresa la primera proteína de fusión; y
b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de unión que comprende una región variable monocatenaria de anticuerpo, un ectodominio receptor o un ligando; y un segundo dominio de multimerización, en donde la segunda proteína de fusión se localiza extracelularmente y se ancla a la superficie celular, cuando se expresa;
en donde un factor puente promueve la formación de un complejo polipeptídico en la superficie de la célula recombinante con el factor puente asociado y dispuesto entre los dominios de multimerización de la primera y la segunda proteínas de fusión,
en donde la segunda proteína de fusión comprende además un segundo dominio transmembrana.
3. La célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2,
a) en donde el primer y segundo dominios de multimerización son iguales o diferentes;
b) en donde el primer y segundo dominios de multimerización se asocian con un factor puente seleccionado de rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina, giberelina, ácido abscísico (ABA), metotrexato, ciclosporina A, FKCsA, trimetoprima (Tmp)-ligando sintético para FKBP (SLF), o cualquier combinación de estos; o
c) en donde el primer y segundo dominios de multimerización son un par seleccionado de FKBP y FRB, FKBP y calcineurina, FKBP y ciclofilina, FKBP y DHFR bacteriano, calcineurina y ciclofilina, PYL1 y ABI1, o GIB1 y GAI.
4. La célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde
a) en donde el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB; o
b) en donde el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP.
5. La célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, sirolimus, everolimus, novolimus, pimecrolimus, ridaforolimus, tacrolimus, temsirolimus, umirolimus o zotarolimus.
6. La célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 5, en donde el primer dominio transmembrana o el segundo dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD4, CD8 o CD28.
7. La célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en donde
a) el dominio activador comprende un dominio de señalización del receptor de linfocitos
b) el dominio activador comprende uno o una pluralidad de motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM); o
c) el dominio activador comprende CD3e, CD35, CD3Z, pTa, TCRa, TCRp, FcRa, FcRp, FcRy, NKG2D, CD22, CD79A o CD79b , o cualquier combinación de estos; o
d) la primera molécula de ácido nucleico codifica la primera proteína de fusión que comprende además un dominio activador diferente, un dominio coestimulador, un factor de adhesión o cualquier combinación de estos, particularmente en donde el dominio coestimulador se selecciona de CD27, CD28, CD30, CD40, LAT, Zap70, ICOS, DAP10, 4-1BB, CARD11, HVEM, LAG3, SLAMF1, Lck, Fyn, Slp76, TRIM, OX40 o cualquier combinación de estos.
8. La célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, en donde la segunda molécula de ácido nucleico codifica además una señal de secreción de manera que la segunda proteína de fusión es secretada por la célula recombinante cuando se expresa.
9. La célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 8, en donde el dominio de unión de la segunda proteína de fusión es una región variable monocatenaria de anticuerpo y comprende un anticuerpo de dominio único, sFv, scFv o Fab.
10. La célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, en donde el dominio de unión se une específicamente a una diana seleccionada del grupo que consiste en: receptor de a-folato, integrina av06, BCMA, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD70, CD123, CD138, CD171, CEA, DLL4, EGP-2, EGP-40, CSPG4, EGFR, familia de EGFR que incluye ErbB2 (HER2), EGFRvlII, EPCAM, EphA2, EpCAM, FAP, FBP, receptor de acetilcolina fetal, Fzd7, GD2, GD3, glipicano 3 (GPC3), h5T4, IL-11Ra, M3R-a2, KDR, cadena ligera k, cadena ligera A, LeY, L1CAM, MAGE-A1, mesotelina, péptidos presentados por MHC, MUC1, MUC16, NCAM, ligandos de NKG2D, Notch1, Notch2/3, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, survivina, TAG-72, TEM, TERT, VEGFR2 y ROR1.
11. Una célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-10,
a) en donde la primera proteína de fusión codificada comprende un primer dominio de multimerización de FRB T2098L, el primer dominio transmembrana, un dominio coestimulador de 4-1BB y un dominio activador de CD3Z; en donde la segunda proteína de fusión codificada comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD19 y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el factor puente es el rapálogo AP21967, o
b) en donde la primera proteína de fusión codificada comprende un dominio de unión de un scFv específico para CD3 y un primer dominio de multimerización de FRB T2098L; en donde la segunda proteína de fusión comprende un dominio de unión de un scFv específico para BCMA y un segundo dominio de multimerización de FKBP12; y en donde el factor puente es el rapálogo AP21967.
12. Un heterocomplejo polipeptídico de fusión, que comprende:
la célula recombinante de acuerdo con las reivindicaciones de 1 a 11, en donde la primera proteína de fusión, la segunda proteína de fusión y el factor puente se asocian para formar un heterocomplejo polipeptídico.
13. El heterocomplejo polipeptídico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde:
a) la región variable monocatenaria de anticuerpo es un anticuerpo de dominio único, sFv, scFv o Fab;
b) el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB;
c) el primer dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FRB, y el segundo dominio de multimerización comprende un primer polipéptido FKBP;
d) el dominio activador comprende una cadena del receptor de linfocitos; o
e) en donde el factor puente es rapamicina o un rapálogo de esta, cumermicina, giberelina, ABA, metotrexato, ciclosporina A, FKCsA o Tmp-SLF.
14. Una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de una o más de las proteínas de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 12 a 13.
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