DE69635447T2

DE69635447T2 - Plasma-kallikrein inhibitoren vom kunitz-typ

Info

Publication number: DE69635447T2
Application number: DE69635447T
Authority: DE
Inventors: S. Mark DENNIS; A. Robert LAZARUS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2016-06-05
Also published as: CA2220130A1; IL122116A0; ATE310087T1; DE69635447T4; WO1996039519A1; DE69635447D1; EP0832232A1; US5780265A; ZA964608B; EP0832232B1; EP0832232B9; AU6048296A; JPH11511963A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf neue Polypeptide, die zumindest eine Domäne vom Kunitztyp umfassen, die Plasma-Kallikrein hemmende Aktivität aufweist. Die Erfindung bezieht sich weiters auf die für diese neuen Polypeptide kodierende DNA sowie auf die Rekombinationsmaterialien und -verfahren zur Herstellung dieser Plasma-Kallikrein-Inhibitoren. Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese neuen Plasma-Kallikrein-Inhibitoren enthalten, zur Behandlung von Krankheiten und Störungen, bei denen die Hemmung von Plasma-Kallikrein indiziert ist.
Beschreibung des Standes der Technik
Kallikrein
Kallikrein ist eine Serin-Protease der Mehrkomponenten-Koagulationskaskade, die im Kontaktsystem des intrinsischen Stoffwechselwegs der Blutgerinnung eine Rolle spielt. Kallikrein spaltet auch hochmolekulares Kininogen (HMWK), um Bradykinin (einen wirksamen Vasodilator und Endothelzellenaktivator) zu bilden, das Prourokinase und Pasminogen (fibrinolytisch) aktivieren kann und für eine wechselseitige Aktivierung von oberflächengebundenem Faktor XII zu Faktors XIIa einen Feedback-Mechanismus bereitstellen kann. Zusätzlich dazu kann es auch Neutrophile dazu stimulieren, die Freisetzung von Elastase zu bewirken. Sowohl Faktor XIIa als auch Kallikrein können zur Erzeugung von Plasmin führen, wodurch Fibrinolyse hervorgerufen wird. Obwohl es in den Kontaktaktivierungsstoffwechselwegen eine wichtige Rolle spielt, ist Plasma-Kallikrein somit sowohl an der Fibrin-Ablagerung und -Lyse, der Modulierung des Blutdrucks, der Komplementaktivierung als auch der Unterstützung des Entzündungssystems beteiligt. Für einen Überblick über den Kontaktaktivierungsstoffwechselweg und das Kallikrein-Kinin-System siehe Bhoola, K. D. et al., Pharmacological Rev. 44 (1), 1–80 (1992), und Wachtfogel, Y. T., Thromb. Res. 72, 1–21 (1993).
Präkallikrein, der Vorläufer von Kallikrein, ist ein Glykoprotein, das aus einer einzigen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von 80.000 Da besteht und in normalem Plasma in einer Konzentration von etwa 50 μg/ml (600 nM) vorhanden ist. Im Blut zirkulieren 75% des Präkallikreins gebunden an hochmolekulares Kininogen (HMWK). Kallikrein besteht aus 2 Disulfid-verbundenen Ketten mit 43.000 und 33.000–36.000 Da. Die leichte Kallikreinkette enthält die enzymatische Domäne, während die Schwerkette für die oberflächenabhängige Aktivierung der Koagulation erforderlich zu sein scheint. Aufgrund seiner Rolle in verschiedenen biologischen Funktionen wurde die Regulierung des Plasma-Kallkikreins als eine Form der therapeutischen Intervention intensiv untersucht.
Kontaktaktivierungsstoffwechselwege bei Krankheiten
Die Kontaktaktivierung ist ein Oberflächen-vermittelter Stoffwechselweg, der zum Teil für die Regulierung von Entzündung und Gerinnung verantwortlich ist. Die bei diesem Stoffwechselweg beteiligten Proteine umfassen Faktor XII (Hageman Faktor), Präkallikrein (Fletcher Faktor), hochmolekulares Kininogen (HWK) und C1-Inhibitor (Schmaler A. N. et al., "Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice" (Colman, R. W. Hirsh, J., Marder, V. & Salzman, E. W. (Hrsg.)), 18–38, J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1987)). Der Zymogen-Faktor FXII und Präkallikrein werden als Beginn dieses Stoffwechselwegs in aktive Serin-Proteasen umgewandelt. Es wurde vermutet, dass die Beteiligung dieses Plasmaproteasesystems bei einer Vielzahl klinischer Manifestationen, einschließlich von septischem Schock, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen (ARDS), Verbrauchskoagulopathie (DIC) und verschiedenen anderen Erkrankungszuständen, eine wichtige Rolle spielt (Coleman R. W., N. Engl. J. Med. 320, 1207–1209 (1989); Bone, R. C. Arch. Intern. Med. 152, 1381–1389 (1992)).
Das Kontaktsystem der intrinsischen Gerinnung und das Komplementsystem werden bei Sepsis und septischem Schock übermäßig aktiviert, insbesondere im Fall eines fatalen septischen Schocks. Das Kontaktsystem kann an der Erzeugung von vielen vasoaktiven Mediatoren wie Bradykinin, FXIIa, FXIIf und C5a beteiligt sein, von de nen man glaubt, dass sie bei der Pathogenese von fatalem Schock eine Rolle spielen. Bradykinin, FXIIa und XFFf sind wirksame Induktoren für Hypotonie, wobei C5a ein Indikator für Vasodilation und Vasopermeabilität ist. Die Spiegel von FXII, Präkallikrein und hochmolekulares Kininogen sind bei einem nicht-fatalen Schock signifikant reduziert, sind aber bei einem fatalen septischen Schock auf etwa 30%, 57% bzw. 27% der normalen Werte enorm gesenkt. Diese Änderungen werden ungeachtet dessen beobachtet, ob der septische Zustand durch grampositive oder gramnegative Bakterien bewirkt wird.
Der Kontaktaktivierungsstoffwechselweg ist sowohl an der Fibrin-Ablagerung und -Lyse als auch an der Auslösung von Neutrophil-Aktivierung, Komplementaktivierung und an der Modulierung des Blutdrucks beteiligt.
Septischer Schock
Septischer Schock stellt die häufigste Todesursache bei Menschen in Intensivstationen in den Vereinigten Staaten von Amerika dar (Parillo, J. E. et al., Ann. Int. Med. 113, 227–242 (1990); Schmeichel C. J. & McCormick D., BioTechnol. 10, 264–267 (1992)). Er wird gewöhnlich durch einen lokalen Infektionsherd ausgelöst, der in den Blutstrom eindringt. Die Ursache für das Auftreten von Sepsis und Schock können Infektionen mit entweder gramnegativen, grampositiven bakteriellen oder Pilz-Mikroorganismen sein. Alle diese Organismen scheinen ein gemeinsames Muster der kardiovaskulären Fehlfunktion zu induzieren. In den letzten Jahren wurde die aggressive Fluidtherapie als primäres Mittel zur Behandlung von septischem Schock akzeptiert. Eine adäquate Ergänzung von Körperflüssigkeit steht mit erhöhter Herzleistung und geringem Gefäßwiderstand in Verbindung. Trotz Behandlung führt der septische Schock zu einem drastischen Abfall des systemischen Gefäßwiderstands und zu generalisierter Butstrom-Fehlverteilung. Die aggressive Therapie kehrt Schock und Tod in etwa 50% der Fälle um. Nicht-responsive Hypotonie, die Folge von sehr geringem Gefäßwiderstand, kann durch Fluidinfusion nicht korrigiert werden. Von den Patienten, die an septischem Schock sterben, sterben etwa 75% an persistenter Hypotonie und die übrigen aufgrund von mehrfachem Organsystemversagen.
Der Anstieg der Herzleistung und der Vasodilation bei septischem Schock wird der Wirkung von Entzündungsmediatoren zugeschrieben. Bei septischem Schock werden Komponenten des Kallikrein-Kinin-Systems abgereichert, was eine Aktivierung dieses Systems vermuten lässt. Dies ist aber im Fall eines kardiogenen Schocks nicht der Fall, was vermuten lässt, dass das Kallikrein-Kinin-System bei septischem Schock eine Hauptrolle spielt (Martinez-Brotons, F. et al., Thromb. Haemostas. 58, 709–713 (1987)). Während die tatsächlichen Ereignisse, die zu septischem Schock führen, DIC und Hypotonie noch nicht geklärt wurden, lassen die bekannten Wechselwirkungen von verschiedenen Komponenten der vielen physiologischen Systeme vermuten, dass die Aktivierung des Kontaktstoffwechselwegs zu einem Zustand des septischen Schocks, mehrfachem Organversagen und zum Tod führen kann (Bone, R. C., siehe oben), wie dies in 1 dargestellt ist.
ARDS
ARDS ist eine komplexe Lungenstörung, die in den USA jährlich etwa 150.000 Menschen mit einer Sterblichkeitsrate von 50% betrifft. Leukozyten, Blutplättchen und die proteolytischen Stoffwechselwege von Gerinnung und Komplement vermitteln ARDS. ARDS umfasst die Aktivierung des Kontaktaktivierungsstoffwechselwegs und eine Abreicherung des C1-Inhibitors. Sepsis-induziertes ARDS führt im Vergleich zu Trauma-induziertem ARDS zu einer stärkeren Verbrauchskoagulopathie (DIC) und Fibrinolyse, mehr Fibrinabbauprodukten und reduzierten ATIII-Werten (Carvalho, A. C. et al., J. Lab. Clin. Med. 112, 270–277 (1988)).
Verbrauchskoagulopathie
Die Verbrauchskoagulopathie (DIC) ist eine Störung, die als Reaktion auf eine Gewebeschädigung und eindringende Mikroorganismen auftritt, gekennzeichnet durch weit verbreitete Ablagerung von Fibrin und abgereicherten Fibrinogenspiegeln (Muller-Berghaus, G., Semin. Thromb. Hemostasis 15, 58–87 (1989)). Es gibt längere Zeiten von Prothrombin und aktiviertem partiellem Thromboplastin. DIC wurde in klinischen Erscheinungsbildern einer großen Vielzahl von Erkrankungen beobachtet (Frucht man, S. M. & Rand, J. H., "Thrombosis in Cardiovascular Disorders", Fuster, V. & Verstraete M. (Hrsg.), 501–513, W. B. Saunders, Philadelphia (1992)).
Hypotonie, DIC und Neutrophil-Aktivierung werden alle durch die Wechselwirkung zwischen Faktor XIIa, Plasma-Kininogenen und Kallikrein ausgelöst. Ein Mangel an einem dieser drei Proteine führt aufgrund der Redundanz im System aufgrund von Blutplättchen, anderen Gerinnungsfaktoren und Endothelzellen nicht zu hämostatischen Störungen.
Plasma-Kallikrein-Inhibitoren
Eine große Anzahl therapeutischer Ansätze zu septischem Schock und damit verwandten Störungen wurde bereits identifiziert, einschließlich u.a. verschiedene Cytokin-Antagonisten, Mabs (für Endotoxin, Gewebefaktor, Tumornekrosefaktor (TNF), Neutrophile etc.), Kinin-Antagonisten, Protein zur Steigerung der Bakteriozid-Permeabilität, PAF-Antagonisten, C1-Inhibitor, DEGR-Fxa und aktiviertem Protein C. Es ist aufgrund der komplizierten Natur der Erkrankung möglich, dass ein Ansatz bei der Behandlung von septischem Schock erfolgreich sein kann, der zahlreiche Mittel oder Mittel, die zahlreiche Stoffwechselwege betreffen, umfasst (Schmeichel C. J. & McCormick D., siehe oben). Wirksame Serinprotease-Inhibitoren, die reversibel die Koagulationsproteasen, die Kontaktaktivierung, Fibrinoyse, Entzündung, Komplementaktivierung und hypotensive Stoffwechselwege hemmen können, stellen einen Ansatz für die Behandlung von Erkrankungen dar, die von diesen Stoffwechselwegen beeinflusst werden.
Protein-Inhibitoren spielen bei der Regulierung von Proteasen in einer großen Vielzahl von physiologischen Prozessen eine wichtige Rolle. Der wichtige physiologische Inhibitor von Plasma-Kallikrein ist C1-Inhibitor, ein Serin, das zu einer irreversiblen Hemmung führt. C1-Inhibitor ist auch der wichtige physiologische Inhibitor von FXIIa und der Komplementstoffwechselwegproteasen C1r und C1s. α2-Makroglobulin, ein weiterer wichtiger Inhibitor von Kallikrein, hemmt die Kinin-bildende Funktion, während nur teilweise die esterolytische Aktivität gehemmt wird. Antithrombin-III kann ebenfalls Kallikrein hemmen, aber selbst in Gegenwart von Heparin nur langsam. α2-Antiplasmin und α1-Antitrypsin sind schlechte Kallikrein-Inhibitoren. Es wurde gezeigt, dass eine mutierte Form des α₁-Proteinase-Inhibitors (α₁-Proteinase-Inhibitor-Pittsburgh), der ein Arg an der P₁-Position und ein Ala an der P₂-Position enthält, im Vergleich zum C1-Inhibitor, dem wirksamsten bekannten natürlichen Inhibitor dieser Proteasen, ein wirksamerer Inhibitor des Faktors XIIf (FXIIf) und Kallikreins ist (Schapira, M. et al., J. Clin. Invest. 80, 582–585 (1987); Patston, P. A. et al., J. Biol. Chem. 265, 10786–10791 (1990)). Mit dieser mutierten Form behandelte Ratten waren teilweise vor Hypotonie, die aus der Injektion von FXIIf resultierte, geschützt.
Kürzlich wurde gezeigt, dass Ecotin, ein 142-Reste-Protein von E. coli, wirksam Plasma-Kallikrein mit einem K_i von ca. 160 pM hemmt; obwohl Ecotin nicht völlig selektiv ist und wirksam Faktor XIIa, Faktor Xa und Humanleukozyt-Elastase hemmt (Seymour, J. L. et al., Biochemistry 33, 3949–3958 (1994)).
Rinder-Pankreas-Trypsin-Inhibitor (BPTI, Aprotinin) ist ein gut untersuchtes Mitglied der Familie der Kunitz-Domäne der Serinprotease-Inhibitoren, die Plasma-Kallikrein mit einem K_i von ca. 30 nM mäßig hemmen (Fritz, N., und Wunderer, G., Arzneim.-Forsch. Drug Res. 33, 479–494 (1983); Creighton, T. E., und Charles, I. G., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987)). BTTI ist aber ein wirksamerer Inhibitor von Plasmin.
Aprotinin wurde bei einer Vielzahl klinischer Zustände verwendet, umfassend akute Bauchspeicheldrüsenentzündung, septischen und hämorraghischen Schock, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen und zahlreichen Traumata; in der letzten Zeit hat es sich sowohl klinisch als auch in Modellen des kardiopulmonalen Bypasses als viel versprechend erwiesen (Westaby, S., Ann. Thorac. Surg. 55, 1033–1041 (1993); Watchfogel, T. et al., Thorac. Cardiovasc. Surg. 106, 1–10 (1993)).
Als Breitband-Serinprotease-Inhibitor vom Kunitztyp kann Aprotinin die Aktivierung der Koagulationskaskade, die durch den Kontaktaktivierungsstoffwechselweg initiiert wurde, verhindern. Es kann auch die Aktivierung von Neutrophilen und anderen Entzündungsreaktionen, die sich aus durch Ischämie und Hypoxie verursachten Gewebeschäden ergeben, verhindern. Man glaubt, dass diese Vorteile von ihrer Kallikrein- oder Plasmin-hemmenden Aktivität stammen; die Tatsache aber, dass Aprotinin weder sehr wirksam noch selektiv ist, macht die Interpretation dieser Wirkungen schwierig.
Aprotinin hemmt die Kontakt-, Neutrophil- und Blutplättchenaktivierungssysteme während der simulierten extrakorporalen Perfusion, was durch eine Verringerung des Blutverlusts, die Verhinderung von Neutrophil-Degranulierung, Blutplättchenaktivierung und -aggregation sowie die Bildung von Kallikrein-C1q-Inhibitor- und C1-C1-Inhibitor-Komplexen bewiesen wird (Watchfogel et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106, 1–10 (1993)). Es wurde verwendet, um Plasma-Kallikrein während eines LPS-induzierten endotoxischen Schocks bei Schweinen zu hemmen, was dazu führte, dass arterielle Hypotonie vermieden wurde (Seibeck, M. et al., J. Trauma 34, 193–198 (1993)). Aprotinin wurde auch verwendet, um die Beteiligung des Plasma-Kallikrein-Kinin-Systems an der hämodynamischen und renalen Funktion bei Patienten mit hepatischer Zirrhose zu untersuchen (MacGilchrist, A., Clin. Sci. 87, 329–335 (1994)). Es wurde gezeigt, dass Aprotinin für renale Hydrodynamiken günstig ist, die zu verbessertem/-r Nierenfluss und -filtration führen.
Gegenwärtig wird gezeigt, dass Trasylol^® (Aprotinin, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) das Kontaktsystem von Plasma hemmt, dass massiv auf dem ersten Weg des Bluts durch den kardiopulmonalen Bypasskreislauf während der Bypass-Verfahren aktiviert wird (Westaby, S., Ann. Thorac. Surg. 55, 1033–41 (1993)). Aprotinin blockiert die Kontaktaktivierung des Kallikrein-Systems während des kardiopulmonalen Bypasses und wirkt in Synergie mit Heparin bei der Verhinderung von Thrombosenbildung durch Inhibierung der intrinsischen Koagulationskaskade (Westaby, siehe oben). Trasylol^® wurde auch prophylaktisch bei septischem Schock, hämorrhagischem Schock, postoperativer nekrotischer Bauchspeicheldrüsenentzündung und postoperativer Lugenembolie eingesetzt.
Kunitz-Domänen
Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp (BPTI, z.B. Aprotinin) sind eine gut charakterisierte Proteinfamilie, die extensive Strukturhomologie zeigt, einschließlich einer tertiären Falte, die eine ausgedehnte Bindungsschleife enthält, die in die aktive Stelle der verwandten Serinprotease passt (Bode, W., und Huber, R., Eur. J. Biochem. 204, 433–451 (1992)). Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp sind bekannterweise langsame, eng-bindende, reversible Inhibitoren von Serinproteasen, die sich an die aktive Stelle binden und gemäß dem Standardmechanismus hemmen (Laskowsky, Jr., M. und Kato, I., Ann. Rev. Biochem. 49, 593–626 (1980)). Spaltung zwischen dem P₁- und dem P₂-Rest erfolgt, wenn überhaupt, sehr langsam (Bode, W. und Huber, R., Eur. J. Biochem. 204, 433–451 (1992); Laskowsky, Jr., M. und Kato, I., Annu. Rev. Biochem. 49, 593–626 (1980). Der P₁-Rest bezeichnet die Position, die der spaltbaren Peptidbindung des Substrats oder Inhibitors vorangeht und in die S₁-Bindungsstelle passt, wie dies durch Schecter und Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157–162 (1967), definiert ist. Die Nummerierung der Reste entspricht jener von BPTI, so dass Rest 15 an der P₁-Position liegt).
Einige der Kontaktreste in der Bindungsschleife (Positionen 11, 15, 17 und 19) sind unter den Kunitz-Domänen relativ variabel (Creighton, T. E. und I. G. Charles, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987)). Die Position 13 ist gewöhnlich ein Pro. Die Position 12 ist immer ein Gly. Die Cystein-Reste an den Positionen 14 und 38, die eine Disulfidbindung bilden, werden immer in Kunitz-Domänen gefunden; andere Reste wie z.B. Ala, Gly, Ser oder Thr können die Cysteine ersetzen (Marks, C. B. et al., Science 235, 1370–1373 (1987)).
In der 58-Reste-Kunitz-Proteaseinhibitordomäne des Vorläufers zum Alzheimer-Amyloid β-Protein (APPI) und anderer Kunitz-Domänen liegen die Reste 13 und 39 sowie die Reste 17 und 34 in unmittelbarer Nähe (3) (Hynes, T. R. et al., Biochemistry 29, 10018–10022 (1990)). Die Reste an den Positionen 16 und 18 sind unter den Kunitz-Domänen im Allgemeinen invarianter (Creighton, T. E. und I. G. Charles, Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987)); andere Reste können aber an diesen Positionen ebenfalls die Bindung ändern. Somit können die Reste an den Positionen 11 bis 19, 34, 38 und 39 allesamt die Bindungsaffinität und Spezifität für Serinproteasen beeinflussen (3).
Andere Reste sind aber ebenfalls wichtig. So weisen z.B. APPI und BPTI an der Position 52 Methionin auf, obwohl andere Kunitz-Domänen eine Vielzahl von Resten an dieser Position aufweisen (2). Methionin an dieser Position kann durch verschiedene Reste ersetzt werden, die in Bezug auf die Erzeugung des Proteins vorteilhaft sind. So ist Methionin für Oxidation anfällig, wodurch Methioninsulfoxid gebildet wird, das die Reinigung verkomplizieren kann. Auch kann ein Protein als Fusionsprotein rekombinant hergestellt werden, gefolgt von der Spaltung mit CNBr, die an Methioninresten spaltet (Auerswald, E. A. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 27–35 (1988)). Somit ist es notwendig, andere Methioninreste im Protein von Interesse zu entfernen, um ein intaktes Produkt zu erzeugen. Es ist nicht zu erwarten, dass Substitutionen an Position 52 große Auswirkungen auf die Hemmungsaktivität haben, da diese von der primären Bindungsschleife der Kunitz-Domäne so weit entfernt ist (3).
Substrate und Inhibitoren von Trypsin-ähnlichen Proteasen wie Kallikrein und FXIa weisen entweder Arg oder Lys am P₁-Rest auf ( EP 339.942 A2 ). Manchmal wird Methionin aber an der P₁-Position gefunden, und dies kann auch für die gute Hemmung der Serinproteasen bevorzugt sein (McGrath, M. E. et al., J. Biol. Chem. 266, 6620–6625 (1991)). Das Einführen von Resten wie Val, Leu oder Ile an Position P₁ der Kunitz-Domänen führt zu wirksamen Inhibitoren von Human-Leukozyten-Elastase (HLE) und dem begleitenden Verlust der Hemmungsaktivität des Wildtyps (Beckmann, J. et al., Eur. J. Biochem. 176, 675–682 (1991); Sinha, S. et al., J. Biol. Chem. 266, 21011–21013 (1991)).
Kürzlich wurde APPI, das in seiner Struktur ähnlich zu BPTI ist (Hynes, T. et al., Biochemistry 29, 10018–10022 (1990)), als Gerüst für Phagendisplay einer großen Bibliothek von Varianten verwendet, um wirksame und spezifische Aktivstellen-Inhibitoren des Gewebefaktors Faktor VIIa (TF-FVIIa) auszuwählen (Dennis, M. S. und La zarus, R. A., J. Biol. Chem. 269, 22129–22136 (1994); Dennis, M. S. und Lazarus, R. A., Biol. Chem. 269, 22137–22144 (1994)). Ein direkter Vergleich der in dieser Studie erzeugten Varianten mit dem Gewebefaktor Faktor VIIa zeigte einen 95fachen Anstieg der Bindungsaffinität für Plasma-Kallikrein durch die Änderung des P₁-Rests von Lys zu Arg. Die Daten waren mit jenen, die zuvor für BTTI gezeigt wurden, worin Arg und Lys an der Position P₁ studiert wurden, nicht inkonsistent (Scott, C. F. et al., Blood 69, 1431–1436). In dieser Studie führte einer Änderung der Position P₁ von Lys zu Arg zu einem 20-mal wirksameren Inhibitor von Plasma-Kallikrein. Keine dieser Studien ließ einen spezifischen Inhibitor von Plasma-Kallikrein vermuten, da die Proteasen eine Hemmung anderer Serinproteasen wie von Gewebefaktor Faktor VIIa, Faktor X1a oder Plasmin zeigten.
APPI wird leicht in Bakterien wie E. coli exprimiert (Castro, M. et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)) sowie in Hefe wie etwa P. pastoris. Die Röntgen-Kristallstruktur des Proteins ist bekannt (Hynes, T. R. et al., Biochemistry 29, 10018–10022 (1990)). Zusätzlich dazu stammt es von einer Humansequenz ab, was die Immunogenität für beliebige therapeutisch nutzbare Varianten minimiert.
Trotz der Fortschritte in der unmittelbaren Vergangenheit gibt es immer noch einen Bedarf an wirksamen spezifischen Inhibitoren von Plasma-Kallikrein zur Entwicklung gezielter therapeutischer Werkzeuge.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die wirksam und reversibel Proteasen der Koagulation, Kontaktaktivierung, Fibrinolyse, Entzündung, Komplementaktivierung und hyptensiven Stoffwechselwege hemmen können. Insbesondere stellt die Erfindung eine wirksame Hemmung von Plasma-Kallikrein bereit. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein Serinprotease-Inhibitor-Polypeptid. Der Polypeptid-Inhibitor der vorliegenden Erfindung umfasst zumindest eine nicht-native Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp, die Plasma-Kallikrein wirksam hemmen kann.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das Plasma-Kallikrein hemmt, das eine nicht-native Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp umfasst, wobei die Serinprotease-Inhbitor-Domäne vom Kunitztyp eine primäre Bindungsschleife aufweist: Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'; sowie eine sekundäre Bindungsschleife, die Xaa19' umfasst, worin:
die Sequenz Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4' GHCRAAHP (SEQ. ID Nr. 72) ist;
Xaa5 aus der aus D, E und P bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und
Xaa19' aus der aus V, W und Y bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
In einem bevorzugten Aspekt ist Xaa5 D.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung weist die Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp die folgende Sequenz auf:
R₁-Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4'-R₂-Xaa19'-R₃,
worin:
R₁ ein Peptid aus 10 Aminosäuren ist, worin die der Aminosäureposition Xaa15' entsprechende Aminosäure C ist;
R₂ ein Peptid aus 14 Aminosäuren ist, worin die den Aminosäurepositionen Xaa23', Xaa36' und Xaa40' entsprechenden Aminosäuren C sind.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Domäne vom Kunitztyp aus etwa 58 Aminosäuren mit einer primären Bindungsschleife, die die Aminosäuren Xaa5-Xaa4-Xaa3-Xaa2-Xaa1-Xaa1'-Xaa2'-Xaa3'-Xaa4' umfasst, und einer sekundären Bindungsschleife, die die Aminosäure Xaa19' umfasst, wie dies für die Erfindung oben definiert wurde.
Beispiele für Kunitz-Domänen weisen ein R₁ auf, das aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
ein R₂, das aus der aus
bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und
ein R₂, das aus der aus
bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Bevorzugte Polypeptide umfassen auch Polypeptide, die Plasma-Kallikrein hemmen und eine Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp mit einer primären und einer sekundären Bindungsschleife umfassen, wie oben beschrieben, und worin R₁ für die Aminosäurereste 1–10 von APPI (SEQ ID Nr. 6) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht; R₂ für die Aminosäurereste 20–33 von APPI (SEQ ID Nr. 14) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht; und R₃ für die Aminosäurereste 35–58 von APPI (SEQ ID Nr. 23) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht.
Gemäß vorliegender Erfindung können die Serinprotease-Inhibitoren Plasma-Kallikrein wirksam hemmen. Aus diesem Grund weist ein bevorzugtes Polypeptid im Kontext der vorliegenden Erfindung eine scheinbare Dissoziationskonstante (Ki*) für Plasma-Kallikrein von weniger als etwa 500 picomolar (pM) auf. Noch mehr bevorzugt weisen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine K_i für Plasma-Kallikrein von weniger als etwa 300 pM und insbesondere weniger als etwa 100 pM auf. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Serinprotease-Inhibitoren Plasma-Kallikrein wirksam und spezifisch hemmen. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung hemmen die Serinprotease-Inhibitoren Plasma-Kallikrein und können andere Serinproteasen der Koagulationskaskade wie Faktor Xa, Gewebefaktor Faktor VIIa, Thrombin, Faktor XIIa oder aktiviertes Protein C nicht nennenswert hemmen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung eine Stoffzusammensetzung, die isolierte Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, die für das Polypeptid der Erfindung kodiert, umfasst. Die Erfindung umfasst weiters eine Expressionskontrollsequenz, die mit dem DNA-Molekül operabel verbunden ist, einen Expressionsvektor, vorzugsweise ein Plasmid, das das DNA-Molekül umfasst, wobei die Kontrollsequenz von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt wird, sowie eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle.
Bevorzugte Expressionvektoren der vorliegenden Erfindung können z.B. aus pBR-322, phGH1, pBO475, pRIT5, pRIT2T, pKK233-2, pDR540 und pPL-λ ausgewählt sein, wobei der am meisten bevorzugte Vektor pSAlz1 ist.
Bevorzugte Wirtszellen, die den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthalten, können z.B. aus Spezies vom E. coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), E. coli-Stamm JM01, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537), E. coli c600, E. coli W3110 (F-, λ-, phototrophisch, ATCC Nr. 27325), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcesans und Pseudomonas ausgewählt werden, wobei die am meisten bevorzugte Wirtszelle E. coli W3110 (ATCC Nr. 27325) oder ein Derivat davon ist, so etwa der Stamm mit Proteasedefizienz 27C7 (ATCC Nr. 55244).
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem Verfahren hergestellt werden, das die Schritte des Isolierens oder Synthetisierens von Nukleinsäuresequenzen, die für eine beliebige der oben beschriebenen Aminosäuresequenzen kodieren, des Ligierens der Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, der die Nukleinsäuresequenz in einem geeigneten Wirt exprimieren kann, des Transformierens des Wirts mit dem Expressionsvektor, in den die Nukleinsäuresequenz ligiert worden ist, und des Kultivierens des Wirts unter Bedingungen, die für die Expression der Nukleinsäuresequenz geeignet sind, wodurch das Protein, für das die ausgewählte Nukleinsäuresequenz kodiert, durch den Wirt exprimiert wird. Vorzugsweise wird das Polypeptid daraufhin aus der Wirtszellkultur gewonnen. In diesem Verfahren kann der Ligationsschritt weiters das Ligieren der Nukleinsäure in einen geeigneten Expressionsvektor umfassen, so dass die Nukleinsäure operabel mit einem geeigneten Sekretionssignal verbunden wird, wodurch die Aminosäuresequenz vom Wirt sekretiert wird. Das Sekretionssignal kann aus der aus einer Signalsequenz, wie z.B. stlI, lamB, Herpes-gD, Ipp, alkalischer Phosphatase, Invertase und α-Faktor bestehenden Gruppe ausgewählt werden und ist vorzugsweise stlI.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich weiters auf therapeutische Anwendungen von hierin beschriebenen Zusammensetzungen. Somit umfasst die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten und das gereinigte Polypeptid der Erfindung umfasst.
Diese Anwendungen umfassen z.B. die Polypeptide oder Zusammensetzung davon gemäß vorliegender Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des Körpers eines Menschen oder eines Tiers. Solche Behandlungen umfassen die Behandlung von Entzündungen, septischem Schock, Hypotonie, ARDS, DIC, kardiopulmonalem Bypass-Eingriff und Blutung nach einem chirurgischen Eingriff.
Beschreibung der Zeichnungen
1. Schematische Darstellung von ausgewählten Enzymen und Mediatoren, welche die Koagulation, den Kontakt, die fibrinolytischen, entzündlichen und Komplementstoffwechselwege modulieren. Die Aktivierung dieser Stoffwechselwege kann zu indizierten klinischen Krankheitsbildern führen.
2. Sequenzabgleich der Kunitz-Domänen aus Säugetierquellen. Verglichen werden APPI (Reste 1–58) (SEQ ID Nr. 34) aus dem Amyloid-β-Protein-Vorläufer der Alzheimer-Erkrankung beim Menschen, Reste 287–344 (Castro, M. et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)); TFPI-KD1 (Kunitz-Domäne 1) (Reste 22–79) (SEQ ID Nr. 35), TFPI-KD2 (Reste 93–150) (SEQ ID Nr. 36) und TFPI-KD3 (Reste 185–242) (SEQ ID Nr. 37) des menschlichen TFPI (Gewebefaktorproteininhibitor oder LACI, Broze Jr., G. J. et al., Biochemistry 29, 7539–7546 (1990); ITI-KD1 bzw. ITI-KD2, (Reste 22–79 und 78–135) (SEQ ID Nr. 38 und 39) des menschlichen Inter-α-Trypsin-Inhibitors (Vetr, N. et al., FEBS Lett. 245, 137–140); Collagen α 3 (VI) (Reste 2899–2956) (SEQ ID Nr. 40) vom Vorläufer der Collagen-α-3(VI)-Kette (Chu, M. L. et al., EMBO J. 9, 385–393 (1990); HKIB9 (7–60) (SEQ ID Nr. 41) Humanprotease-Inhibitor vom Kunitztyp, HKIB9 (Norris, K., in Genbank Database (31. Dezember 1993, Freigabe 39,0), eingereicht am 19. Jänner 1994); BPTI (1–58) (SEQ ID Nr. 42). Aprotinin und pankreatischer basischer Trypsin-Inhibitor vom Rind (Creighton T. E. und Charles, I. G., Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987)). Es ist auch ein Motiv-Abgleich der Invarianten Reste aufgelistet.
3. Modell von APPI und anderer Kunitz-Domänen. Die Zahlen beziehen sich auf die in APPI und anderen Kunitz-Domänen gefundenen Reste; Rest 15 entspricht dem P₁-Rest. Die gepunktete Fläche bezieht sich auf die primäre (Reste 11–19) und die sekundäre (umfassend Rest 34) Bindungsschleife von APPI und anderen Kunitz- Domänen. Disulfidbindungen zwischen Cysteinresten an den Positionen 14 und 38, 5 und 55 und 30 und 51 sind strichliert dargestellt.
4A und 4B. Bestimmung der scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten der ausgewählten Kunitz-Domänen mit Plasma-Kallikrein und FXIa. Die Hemmungsaktivität ist als Aktivitätsbruch (gehemmte Rate/nicht-gehemmete Rate) für verschiedene Hemmungskonzentrationen dargestellt. Die scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskostanten wurden mittels nicht-linearer Regressionsanalyse der Daten für Gleichung 1 bestimmt. In 4A ist der Aktivitätsbruch von 0,5 nM Plasma-Kallikrein in Gegenwart von APP (
) BPTI (
), KALI-10 (O) und KALI-DY (☐) dargestellt. Die K_i*-Werte sind in den Tabellen III und IV angeführt.
5A und 5B. Die Konzentration von APPI (
), BPTI (
) und KALI-DY (☐) ist über der x-fachen Verlängerung der Koagulationszeit nach Initiierung durch Ellagsäure im APTT-Test (5A) oder mittels TF-Membranen im PT-Test (5B) dargestellt. Die nicht-gehemmten Koagulationszeiten betrugen 33,6 s bzw. 14 s für ATTT bzw. PT.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
In der gesamten Beschreibung verwendete Abkürzungen umfassen: FXIIa für Faktor XIIa; HMWK für hochmolekulares Kininogen; FXIa für Faktor XIa; FXa für Faktor Xa; TF für Gewebefaktor; FVIIa für Faktor VIIa; BPTI für pankreatischen basischen Trypsininhibitor; APPI für Amyloid-β-Protein-Vorläuferinhibitor von Alzheimer; K_i* für scheinbare Gleichgewichtsdissoziationskonstante; BSA für Rinderserumalbumin; HPLC für Hochleistungsflüssigchromatographie; PT für Prothrombinzeit; APTT für aktivierte partielle Thromboplastinzeit.
Die Bezeichnungen "Serinproteaseinhibitordomäne vom Kunitztyp"; "Domäne vom Kunitztyp", "Kunitz-Domäne" und dergleichen werden austauschbar hierin gebraucht, um sich auf eine etwa 58 Aminosäurereste umfassende Proteindomäne zu beziehen, die durch Konservierung von Cystein-Resten mit dem Serinproteaseinhibitor BPTI (pankreatischer Trypsin-Inhibitor vom Rind) gekennzeichnet ist (Creighton und Charles, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987)), die erstmals in kristalliner Form 1936 isoliert wurde (Kunitz, M. und Northop, J. H., J. Gen Physiol. 19, 991–1007 (1936)). Kunitz-Domänen haben die Crystein-Rest-Position, die tertiäre Faltung und strukturelle Eigenschaften gemeinsam. 3 ist ein Modell der Tertiärstruktur der Kunitz-Domäne des Amyloid-β-Proteinvorläufers von Alzheimer, das die Cystein-Rest-Position zeigt.
Es wurde eine Proteinfamilie identifiziert, die eine, zwei oder drei Kunitz-Domänen enthält. Die Familie umfasst: LACI (Lipoprotein-assoziierten Koagulationsinhibitor, auch TFPI oder Gewebefaktor-Proteininhibitor; Broze, Jr. G. J. et al., Biochemistry 29, 7539–7546 (1990); APPI (Amloyid-β-Proteinverläufer von Alzheimer; Hynes, T. R., Biochemistry 29, 10018–10022 (1990)); die α-3-Kette vom VI-Collagen vom Humantyp (siehe WO 93/14119) und Inter-α-Trypsin-Inhibitor (Hochstrasser, K., E., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 473 (1985)). 2 zeigt die Sequenzausrichtung von Kunitz-Domänen aus Säugetierquellen. Domänen vom Kunitztyp wurden auch im Eiweiß von Schildkröten aus dem Roten Meer, Chelonianin (Kato, I., und Tominaga, N., Fed. Proc. 38, 3342–3357 (1979) und β-Kette von B1-Bungarotoxin (Kondo, K. et al., J. Biochem. 91, 1519 (1982)) identifiziert. Sie wurden auch in vielen Schlangengiften identifiziert. Kunitz-Domänen enthalten sechs spezifisch beabstandete Cysteine, die natürlich in Disulfidbindungen vorkommen (Bode, W., und Huber, R., Eur. J. Biochem. 204, 433–451 (1992)). Die drei Disulfidbrücken stabilisieren das Protein und sind zum Teil für die gesamte dreidimensionale Faltungscharakteristik einer Kunitz-Domäne verantwortlich (3). In der Serinprotease vom Kunitztyp mit 58 Resten BPTI und im APPI sind Cysteine an den Resten 5, 14, 30, 38, 51 und 55 vorhanden. Die Entfernung einer Disulfidbrücke geht aber nicht mit großen Strukturänderungen einher (Eigenbrot, C. et al., Protein Eng. 3, 591–598 (1990)).
Die Kristallstruktur von Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp wurde für BPTI (siehe oben) und APPI (Hynes, T. R. et al., Biochem. 29. 10018–10022 (1990)) bestimmt.
Ein zentrales, antiparalleles, dreistrangiges β-Faltblatt und eine C-terminale α-Helix bilden den Kern der Domäne (Bode, W., und Huber, W., siehe oben). Die Segmente der Kerndomäne bilden das Stützgerüst für die exponierte primäre Bindungsschleife des passend gefalteten Proteins (die "primäre Bindungsschleife", wie sie hierin definiert ist) (Bode, W., und Huber, R., siehe oben). Eine sekundäre Bindungsschleife ergibt sich entlang der primären Bindungsschleife, um zwischen der Kunitz-Domäne und dem zugehörigen Proteasetarget die Grenzfläche zu definieren (die "sekundäre Bindungsschleife", wie sie hierin definiert ist) (Rühlman, A. et al., J. Mol. Biol. 77, 417–436 (1973)).
"Nicht-nativ" soll sich, wie hierin verwendet, auf Domänen vom Kunitztyp mit einer Aminosäuresequenz beziehen, die sich von natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen unterscheidet. Beispiele für natürlich vorkommende Kunitz-Domänen sind z.B. jene, die in 2 und in der Beschreibung des Standes der Technik beschrieben sind. Die Aminosäuresequenz der nicht-nativen Domänen vom Kunitztyp der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen zumindest durch Modifikationen der primären und sekundären Bindungsschleifen, wie dies hierin beschrieben wird. In einer Ausführungsform wird die nicht-natürliche Domäne vom Kunitztyp von einer natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne abgeleitet, indem eine oder mehrere Aminosäuren der natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne ersetzt werden. Eine solche Modifizierung kann z.B. durch Änderung der DNA-Sequenz erfolgen, die für eine natürlich vorkommende Kunitz-Domäne kodiert. In einigen Fällen kann die nicht-native Domäne vom Kunitztyp von einer natürlich vorkommenden Domäne vom Kunitztyp abgeleitet werden, indem direkt eine oder mehrere der Aminosäureseitenketten der natürlich vorkommenden Kunitz-Domäne chemisch modifiziert werden.
Die "primäre Bindungsschleife" einer Kunitz-Domäne wird mit P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄' (Reste 11–19 von BPTI und APPI) bezeichnet. Die "sekundäre Bindungsschleife" wird mit P₁₉'-P₂₀'-P₂₁'-P₂₂'-P₂₃'-P₂₄' (Reste 34–39 von BPTI und APPI) bezeichnet.
Die Bezeichnung "P₁" bezeichnet hierin die Position, die der spaltbaren Peptidbindung der Serinprotease-Inhibitoren vorangeht, wie zuvor von Schecter, I., und Berger, A., Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157–162 (1967) definiert. Ähnlich dazu wird die Bezeichnung "P₁" verwendet, um einen Bezug zu der Position herzustellen, die auf die spaltbare Peptidbindung des Inhibitors folgt. Ansteigende Ziffern beziehen sich auf die nächstfolgende Position, die der spaltbaren Bindung vorangeht (z.B. P₂ und P₃) oder nachfolgt (z.B. P₂' und P₃'). Die Restnummerierung entspricht jener von BPTI, so dass sich Rest 15 an der Position P₁ befindet.
In den Polypeptiden der Erfindung ersetzen die Bezeichnungen Xaa P in Bezug auf die Aminosäurepositionen. Somit entspricht Xaa₁ P₁, und Xaa₁' entspricht P₁'.
APPI bezieht sich auf das 58 Aminosäuren umfassende Polypeptid des Amyloid-β-Proteinvorläufers der Alzheimererkrankung beim Menschen, Reste 287–344 (Castro, et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)). In diesem Protein entspricht P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄' den Resten 11–19 der primären Bindungsschleife. P₁₉' entspricht dem Rest 34 der sekundären Bindungsschleife.
Die Bezeichnung "Aminosäure" soll sich im Kontext der vorliegenden Erfindung auf natürlich vorkommende L-α-Aminosäuren oder -reste beziehen. Hierin werden die allgemein verwendeten Ein- und Drei-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren verwendet (Lehninger, A. L., Biochemistry, 2. Ausgabe, 71–92, Worth Publishers, New York (1975)).
Die Bezeichnung "konservative" Aminosäuresubstitution, wie sie in dieser Erfindung gebraucht wird, bezieht sich auf Aminosäuresubstitutionen, die funktionell äquivalente Aminosäuren substituieren. Konservative Aminosäureänderungen führen zu stillen Änderungen in der Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins. So wirken z.B. eine oder mehrere Aminosäuren ähnlicher Polarität als funktionelle Äquivalente und ergeben eine stille Änderung innerhalb der Aminosäuresequenz des Proteins. Konservative Aminosäuresubstitutionen wurden als die in Tabelle 1 auf Seite 240 von Taylor, W. R., J. Mol. Biol. 188, 233–258 (1986), dargelegte Aminosäuresubstitutionen definiert. Die größten Sets von konservativen Aminosäuresubstitutionen umfassen:

(1) hydrophob: His, Trp, Tyr, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala;
(2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) polar: Ser, Thr, Asn, Gln;
(4) sauer/negativ geladen: Asp, Glu;
(5) geladen: Asp, Glu, Arg, Lys, His;
(6) basisch/positiv geladen: Arg, Lys, His;
(7) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(8) Reste, die die Ausrichtung der Kette beeinflussen: Gly, Pro; und
(9) aromatisch: Trp, Tyr, Phe, His.

Zusätzlich dazu können strukturell ähnliche Aminosäuren durch manche der jeweiligen Aminosäuren ersetzt werden. Gruppen von strukturell ähnlichen Aminosäuren umfassen: (Ile, Leu und Val); (Phe und Tyr); (Lys und Arg); (Gln und Asn); (Asp und Glu); und (Gly und Ala). Beispiele für konservative Aminosäuresubstitutionen werden vorzugsweise in Übereinstimmung mit Folgendem durchgeführt: Gly oder Ser für Ala; Lys für Arg; Gln oder His für Asn; Glu für Asp; Ser für Cys; Asn für Gln; Asp für Glu; Ala oder Pro für Gly; Asn oder Gln für His; Leu oder Val für Ile; Ile oder Val für Leu; Arg, Gln oder Glu für Met; Met, Leu oder Tyr für Phe; Thr für Ser; Ser für Thr; Tyr für Trp; Trp oder Phe für Tyr; Ile oder Leu für Val.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die operabel mit einer geeigneten Kontrollsequenz verbunden ist, die die Expression des Proteins, für das die DNA kodiert, in einem geeigneten Wirt bewirken kann. Solche Kontrollsequenzen umfassen im Allgemeinen einen Promotor, um die Transkription zu bewirken, eine optionale Operatorsequenz, um die Transkription zu kontrollieren, eine Sequenz, die für die geeigneten mRNA-Ribosom-Bindungsstellen kodiert, und Sequenzen, die das Ende von Transkription und Translation kontrollieren. Der Vektor kann ein Plasmid sein, ein Phagenteilchen oder ein "Phagemid", oder einfach ein potenzielles Genominsert.
Wurde der Vektor in einen geeigneten Wirt transformiert, so kann der Vektor unabhängig vom Wirt-Genom replizieren und funktionieren, oder er kann sich in manchen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid", "Vektor" und "Phagemid" austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Form von Vektoren darstellt. Die Erfindung soll aber solche andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalenten Funktionen dienen und die in der Technik bekannt sind oder werden.
"Operabel verbunden" bezeichnet, wenn die Beziehung zwischen zwei DNA- oder Polypeptidsequenzen beschrieben wird, einfach, dass sie funktionell miteinander verbunden sind. So ist z.B. eine Präsequenz operabel mit einem Peptid verbunden; wenn sie als Signalsequenz wirkt, wobei sie bei der Sekretion der reifen Form des Proteins am wahrscheinlichsten unter Beteiligung an der Abspaltung der Signalsequenz eine Rolle spielt. Ein Promotor ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; eine Ribosom-Bindungsstelle ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation zulässt.
Entdeckung und bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfinder haben herausgefunden, dass der Ersatz oder die Substitution gewisser Schlüsselaminosäuren, die an Positionen innerhalb der primären und sekundären Bindungsstellen von Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp und um diese herum zu finden sind, die Wirksamkeit der Inhibitoren in Bezug auf Plasma-Kallikrein dramatisch verbessern kann. Die vorliegende Erfindung stellt somit Polypeptide bereit, die eine oder mehrere nicht-native Domänen vom Kunitztyp umfassen, die wirksam Plasma-Kallikrein hemmen sollen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Reste 11–19 und 34, die den Resten P₅-P₄-P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃'-P₄' und P₁₉' eines Serinprotease-Inhibitors vom Kunitztyp entsprechen, aus natürlich vorkommenden Aminosäuren ausgewählt, so dass eine wirksame Hemmung von Plasma-Kallikrein erreicht wird. Von den vielen Wechselwir kungen zwischen den Serinprotease-Substellen und den Seitenketten in der primären Bindungsstelle der Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp (P₅-P₄') (Bode, W. und Huber, R., Eur. J. Biochem. 204, 433–451 (1992); Laskowski, M., Jr. und Kato, I., Annu. Rev. Biochem. 49, 593–626 (1980)) sind die Wechselwirkungen des P₁-Rests mit der Spezifitätstasche energetisch am wichtigsten und stellen somit die primären Spezifitätsdeterminanten dar (siehe 3). In einem Komplex aus Domäne vom Kunitztyp und Serinprotease füllt die Seitenkette des Rests 15 der Domäne vom Kunitztyp die Position P₁, die der Scissil-Peptidbindung vorangeht. Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird Plasma-Kallikrein wirksam durch Polypeptide gehemmt, die eine Domäne vom Kunitztyp umfassen, worin an der Position 15 (P₁) ein Arg zu finden ist. Während bevorzugte Polypeptide eine Kunitz-Domäne mit Arg an der Position P₁ umfassen, wird Lys an P₁ ebenfalls in Betracht gezogen.
Die Kristallstrukturen der Domänen vom Kunitztyp zeigen andere Reste innerhalb der primären Bindungsschleife, die wahrscheinlich mit der Serinprotease in Kontakt kommen (Hynes, T. R. et al., siehe oben (1990); Bode, W. und Huber, R., siehe oben (1992); Kossiakoff, A. A. et al., Biochem. Soc. Trans. 21, 614–618 (1993)). Obwohl die Aminosäure an der Position P1 im Allgemeinen die Affinität der Inhibitoren für die aktive Stelle der Serinprotease dominieren (Scott, C. F. et al., Blood 69, 1431–1436 (1987); Laskowski, M., Jr. und Kato, I., siehe oben (1980); Beckmann, J. et al., Eur. J. Biochem. 176, 675–682 (1988); Sinha, S. et al., J. Biol. Chem. 266, 21011–21013 (1991)), weiß man auch, dass Reste außerhalb dieser Region (11–14 und 16–19 wie auch Rest 34 der sekundären Bindungsschleife) ebenalls bei der Bindungsaffinität und -spezifität für Serinprotease eine Rolle spielen (Kossiakoff A. A. et al., siehe oben (1993); Roberts, B. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2429–2433 (1992)).
Die Erfinder haben herausgefunden, dass sich wirksame Plasma-Kallikrein-Inhibitoren ergeben, wenn zusätzlich zu Arg an der Position 15 die Aminosäurereste an den Positionen 11–14 und 16–19 in der primären Bindungsschleife Ser, Thr, Arg, Leu, Asp, Pro oder Glu an der Position 11 sind (P₅); Gly an der Position 12 (P₄); Gly, Thr, His, Pro, Arg oder Leu an der Position 13 (P₃); Ala oder Gly an der Position 16 (P₁'); Ser, Ala, Leu, Asn oder Trp an der Position 17 (P₂'); His oder Ile an der Position 18 (P₃'); und Pro, Tyr, Leu oder Trp an der Position 19 (P₄'). Das gewöhnlich an den Positionen 14 (und 38) eines Serinprotease-Inhibitors vom Kunitztyp vorhandene Cys wird beibehalten. An der sekundären Bindungsschleife an der Positition 34 (P₁₉') werden die Aminosäuren Phe, Val, Tyr, Trp und Ser bevorzugt.
Noch mehr bevorzugt ergeben sich wirksame Plasma-Kallikrein-Inhibitoren, wenn zusätzlich zu einem Arg an der Position 15 die Aminosäurereste an den Positionen 11–14 und 16–19 in der primären Bindungsschleife Asp, Pro oder Glu an der Position 11 (P₅) sind; Gly an der Position 12 (P₄); His, Pro, Arg oder Leu an der Position 13 (P₃); Ala oder Gly an der Position 16 (P₁'); Ala, Leu, Asn oder Trp an der Position 17 (P₂'); His oder Ile an der Position 18 (P₃'); und Pro, Tyr, Leu oder Trp an der Position 19 (P₄'). Das normalerweise an den Positionen 14 (und 38) eines Serinprotease-Inhibitors vom Kunitztyp vorhandene Cys wird beibehalten. An der sekundären Bindungsschleife an der Positition 34 (P₁₉') werden die Aminosäuren, Val, Tyr, Trp und Ser bevorzugt.
Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass die Polypeptide, die zumindest eine nicht-native Domäne vom Kunitztyp umfassen, was zu einer erhöhten Wirksamkeit für Plasma-Kallikrein führte, auch die Faktor XIa-Serinprotease, die in Humanplasma zu finden ist, hemmten. Im Gegensatz dazu waren die nicht-natürlichen Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp nicht Inhibitoren von FXIIa, FXa, Thrombin, TF-FVIIa oder aktiviertem Protein C. Zusätzlich dazu hemmten die meisten der ausgewählten Kunitz-Inhibitorvarianten Plasmin nur geringfügig, wobei eine moderate (> 60%) Hemmung bei ausgewählten Varianten beobachtet wurde.
Gemäß eines bevorzugten Aspekts der vorliegenden Erfindung umfassen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zumindest eine nicht-native Domäne vom Kunitztyp und hemmen Plasma-Kallikrein, aber nicht Plasmin. Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassen die Polypeptide eine Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp, worin die Position 11 Glu, Asp oder Pro ist; die Positionen 12–19 Gly, His, Cys, Arg, Ala, Ala, His bzw. Pro sind; und worin die Position 34 der sekun dären Bindungsschleife Val, Tyr oder Trp ist. Besonders bevorzugt von dieser Gruppe von Polypeptiden sind Polypeptide, die eine Serinprotease-Inhibitordomäne vom Kunitztyp umfassen, worin die Position 11 Asp ist.
Die Erfindung stellt somit ein Polypeptid bereit, das zumindest eine Domäne vom Kunitztyp mit einer primären und sekundären Bindungsschleife umfasst, wie oben beschrieben. Die übrigen Reste der Domäne vom Kunitztyp werden aus natürlich vorkommenden Aminosäuren ausgewählt, so dass die Gesamt-Tertiärstruktur der Domäne vom Kunitztyp erhalten bleibt. Demgemäß werden die für die Domäne vom Kunitztyp charakteristischen Cystein-Reste an den Positionen 5, 14, 30, 38, 51 und 55 im Allgemeinen beibehalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Reste, die die primäre und die sekundäre Bindungsschleife der Domänenvariante vom Kunitztyp flankieren, aus jenen Resten ausgewählt, die die natürlich vorkommenden Domänen vom Kunitztyp bilden. So besteht z.B. eine typische Domäne vom Kunitztyp aus 58 Aminosäuren. Gemäß der vorliegende Erfindung werden die Aminosäurereste 11–19 und 34 wie oben beschrieben ausgewählt, um eine wirksame Hemmung von Plasma-Kallikrein zu erzielen. Die flankierenden Reste, d.h. die Reste 1–10, 20–33 und 35–58, können – zusätzlich dazu, dass die richtigen Cystein-Reste wie beschrieben beibehalten werden – aus den entsprechenden Resten der natürlich vorkommenden Domänen vom Kunitztyp ausgewählt werden, so dass die richtige dreidimensionale Struktur und die gewünschte Aktivität beibehalten werden.
In bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung werden die flankierenden Reste 1–10, 20–33 und 35–58 aus den entsprechenden flankierenden Regionen anderer Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp, die in der Technik allgemein bekannt sind, ausgewählt. Solche Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp umfassen die in 2 beschriebenen. Somit werden die Reste 1–10 in einer bevorzugten Ausführungsform aus VREVCSEQAE (SEQ ID Nr. 6), MHSFCAFKAD (SEQ ID Nr. 7), KPDFCFLEED (SEQ ID Nr. 8), GPSWCLTPAD (SEQ ID Nr. 9), KEDSCQLGYS (SEQ ID Nr. 10), TVAACNLPIV (SEQ ID Nr. 11), LPNVCAFPME (SEQ ID Nr. 12) und RPDFCLEPPY (SEQ ID Nr. 13) ausgewählt; die Reste 20–33 werden aus der aus RWYFDVTEGKCAPF (SEQ ID Nr. 14), RFFFNIFTRQCEEF (SEQ ID Nr. 15), RYFYNNQTKQCERF (SEQ ID Nr. 16), RFYYNSVIGKCRPF (SEQ ID Nr. 17), RYFYNGTSMACETF (SEQ ID Nr. 18), LWAFDAVKGKCVLF (SEQ ID Nr. 19), KWYYDPNTKSCARF (SEQ ID Nr. 20), RWFFNFETGECELF (SEQ ID Nr. 21) und RYFYNAKAGLCQTF (SEQ ID Nr. 22) bestehenden Gruppe ausgewählt; und die Reste 35–58 werden aus der aus YGGCGGNRNNFDTEEYCAAVCGSA (SEQ ID Nr. 23), YGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSA (SEQ ID Nr. 24), YGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD (SEQ ID Nr. 25), YGGCLGNMNNFETLEECKNICEDG (SEQ ID Nr. 26), YSGCGGNENNFTSKQECLRACKKG (SEQ ID Nr. 27), YGGCMGNGNNFVTEKECLQTCRTV (SEQ ID Nr. 28), YGGCQGNGNKFYSEKECREYCGVP (SEQ ID Nr. 29), YGGCGGNENKFGSQKECEKVCAPV (SEQ ID Nr. 30), YGGCGGNSNNFLRKEKCEKFCKFT (SEQ ID Nr 31) und YGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA (SEQ ID Nr. 32) bestehenden Gruppe ausgewählt, die den äquivalenten Resten in den Serinprotease-Inhibitordomänen vom Kunitztyp von APPI (Reste 1–58) (SEQ ID Nr. 34) vom Amyloid-β-Proteinvorläufer der Alzheimererkrankung beim Menschen, de Resten 287–344 (Castro, M. et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)); TFPI-KD1 (Reste 22–79) (SEQ ID Nr. 35), TFPI-KD2 (Reste 93–150) (SEQ ID Nr. 36) und TFPI-KD3 (Reste 185–242) (SEQ ID Nr. 37) des humanen TFPI (Gewebefaktorprotein-Inhibitor oder LACL, Broze, Jr., G. J. et al., Biochemistry 29, 7539–7546 (1990)); ITI-KD1 bzw. ITI-KD2 (Reste 22–79 und 78–135) (SEQ ID Nr. 38 und 39) des humanen Inter-α-Trypsin-Inhibitors (Vetr, H. et al., FEBS Lett. 245, 137–140 (1989)); Collagen α 3 (VI) (Reste 2899–2956) (SEQ ID 40) Collagen α 3 (VI) Kettenvorläufer (Chu, M. L. et al., EMBO J. 9, 385–393 (1990)); HKIB9 (7–60) (SEQ ID Nr. 41) Humanprotease-Inhibitor vom Kunitztyp, HKIB9 (Norris, K., in Genbank Database (31. Dezember 193, Release 39,0), eingereicht am 19. Jänner 1994); BPTI (1–58) (SEQ ID Nr. 42), Aprotinin, pankreatischer basischer Rindertrypsin-Inhibitor (Creighton, T. E. und Charles, I. G., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 511–519 (1987), wie dies in 2 dargestellt ist, entsprechen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung sind die Reste für die primäre und die sekundäre Bindungsschleife, wie oben beschrieben, im Kontext der flankierenden Regionen 1–10 (SEQ ID Nr. 6), 20–33 (SEQ ID Nr. 14) und 35–58 (SEQ ID Nr. 23) von APPI dargestellt.
Fachleute auf dem Gebiet der Technik werden verstehen, dass konservative Aminosäuresubstitutionen wie jene, die oben beschrieben wurde, in den gesamten hierin beschriebenen Polypeptiden durchgeführt werden können, wobei aber zu beachten ist, dass die resultierenden Polypeptide die Fähigkeit besitzen, Plasma-Kallikrein, wie hierin definiert, wirksam zu hemmen.
Fachleute auf dem Gebiet der Technik werden erkennen, dass eine Domäne vom Kunitztyp innerhalb eines größeren funktionellen Proteins aufscheinen kann. Der Serinprotease-Inhibitor TFPI enthält z.B. 3 Domänen vom Kunitztyp. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das zumindest eine Domäne vom Kunitztyp umfasst, von der man erwarten kann, dass sie wirksam Plasma-Kallikrein, wie oben ausgeführt, hemmt.
Bestimmung der Gleichgewichtsdissoziationskonstanten
Gemäß vorliegender Erfindung können die Polypeptide, die eine oder mehrere nicht-native Domänen vom Kunitztyp, wie sie hierin definiert sind, umfassen, Plasma-Kallikrein wirksam hemmen. Die Erfinder haben somit dafür gesorgt, dass Aminosäuren in den primären und sekundären Bindungsschleifen der Domänenvarianten vom Kunitztyp zu finden sind, von denen erwartet werden kann, dass sie wirksam Plasma-Kallikrein hemmen.
Es kommt zu einer wirksamen Hemmung, wenn das Polypeptid eine scheinbare Dissoziationskonstante (K_i*) für Plasma-Kallikrein von weniger als etwa 500 picomolar (pM) aufweist. Noch mehr bevorzugt weisen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung eine K_i für Plasma-Kallikrein von weniger als etwa 300 pM und insbesondere weniger als etwa 100 pM auf.
Die scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i*) können durch Verfahren bestimmt werden, die für engbindende Inhibitoren abgeleitet wurden (Bieth, J., Proteinase Inhibitors, 463–469 (1974); Williams, J. W. und Morrison, J. F., Methods Enzymol 63, 437–467 (1979), wobei angenommen wird, dass das Enzym und der Inhibitor einen reversiblen Komplex mit einer Stöchiometrie von 1:1 bilden, wie dies für die Wechselwirkung der Kunitz-Domänen mit Serinproteasen beobachtet wurde (Bode, W. und R. Huber, siehe oben (1992); Laskowski, M., Jr. und I. Kato, Annu. Rev. Biochem., siehe oben (1980)). Die Daten werden mittels nicht-linearer Regressionsanalyse an Gleichung I angepasst:
worin V_i/V₀ der Aktivitätsbruch (stationäre gehemmte Rate durch die nicht-gehemmte Rate) ist, [E₀] die Gesamtaktivstellenkonzentration von Plasma-Kallikrein ist und [I₀] die Gesamtkonzentration des Inhibitors ist.
Indem die scheinbarten K_i*-Werte mit anderen relevanten Serinproteasen, die in Humanplasma gefunden werden, gemessen werden, kann die relative Spezifität von natürlich vorkommenden Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp wie PPI, BPTI und auch Polypeptiden, die eine oder mehrere nicht-native Kunitz-Domänen umfassen, bestimmt werden. Zu Aliquoten des reihenverdünnten Polypeptid-Inhibitors können entweder aktiviertes Protein C, Thrombin, FXa, FXIa, FXIIa, Gewebefaktor FVIIa oder Plasmin zugegeben werden. Nach Inkubation und Addition des geeigneten Substrats werden Plots des Aktivitätsbruchs über der Inhibitor-Konzentration angefertigt, wie dies in den Beispielen beschrieben wird.
Gemäß vorliegender Erfindung hemmen ausgewählte Varianten, die mittels Trypsinaffinitätschromatographie und Umkehrphasen-HPLC gereinigt wurden, wirksam Plasma-Kallikrein, wobei die scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i*) weniger als etwa 300 pM betragen.
Als spezielles Beispiel für eine solche mutierte Form hemmte KALI-DY, das sich von APPI an 6 Schlüsselresten (11Asp, 13His, 17Ala, 19Pro und 34Tyr) unterschied, Plasma-Kallikrein mit einer K_i* = 15 f 14 pM, was einen Anstieg der Bindungsaffinität von mehr als dem 10.000fachen im Vergleich zum natürlich vorkommenden Serinprotease-Inhibitor APPI darstellt.
Ähnlich wie die natürlich vorkommenden Serinprotease-Inhibitoren wie APPI, hemmten auch die Varianten den Faktor XIa mit hoher Affinität, wobei die K_i*-Werte in einem Bereich von 0,3 bis 14 nM variierten; KALI-DY hemmte den Faktor XIa mit einer K_i* = 8,2 ± 3,5 nM. KALI-DY hemmte Plasmin, Thrombin, Faktor Xa, Faktor XIIa, aktiviertes Protein C oder den Gewebefaktor VIIa nicht. Konsistent mit dem Profil der Proteasespezifität verlängerten KALI-DY und andere nicht-native Inhibitoren die Koagulationszeit in einem Prothrombin-Zeittest nicht, aber sie verlängerten die Koagulationszeit in einem Zeittest mit aktiviertem partiellem Thromboplastin auf das > 3,5fache auf 1 μM.
Koagulationstests
Die gesteigerte Affinität der Polypeptid-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung für Plasma-Kallikrein relativ zu nativen Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp wie BPTI und APPI zeigt sich in ihrer Fähigkeit, die Koagulationszeit in einem Zeittest für aktiviertes partielles Thromboplastin zu verlängern. Bevorzugte Polypeptid-Inhibitoren innerhalb der vorliegenden Erfindung verlängerten die Koagulationszeit im Zeittest für aktiviertes partielles Thromboplastin, aber nicht im Prothrombinzeittest (PT-Test). Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Technik klar ist, stellt der APTT-Test einen Hinweis auf ein Maß des eigenen Koagulationsstoffwechselwegs dar. Somit verlängern in einer bevorzugten Ausführungsform Polypeptide gemäß vorliegender Erfindung die Koagulationszeit im APTT-Test um das zumindest 1fache und im Allgemeinen um das 2- bis 4fache. In einer bevorzugten Ausführungsform verlängern die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung die Koagulationszeit um den Faktor 3,5.
Chemische Synthese
Ein Verfahren zur Herstellung der Kunitz-Domänenvarianten umfasst die chemische Synthese des Proteins, gefolgt von einer Behandlung unter oxidierenden Bedingungen, die für das Erhalten einer nativen Konformation, d.h. der korrekten Verbindungen durch Disulfidbindungen, geeignet sind. Dies kann unter Einsatz von für Fachleute allgemein bekannten Methoden erzielt werden (siehe Kelley, R. F. und Winkler, M. E., "Genetic Engineering Principles and Methods" (Setlow, J. K. (Hrsg.)), Plenum Press, N. Y., Band 12, 1–19 (1990); Stewart, J. M. und Young, J. D., "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Co. Rockford, IL (1984)).
Polypeptide der Erfindung, insbesondere jene, die 58 Aminosäurereste enthalten, können mithilfe von Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5132 (1985)). Die Festphasensynthese beginnt am Carboxy-Ende des mutmaßlichen Peptids, indem eine geschützte Aminosäure an ein geeignetes Harz gebunden wird, wie dies in den 1-1 und 1-2 auf den Seiten 2 und 4 von Stewart und Young, siehe oben, gezeigt wird.
Bei der Synthese von Polypeptiden der Erfindung wird die carboxyterminale Aminosäure, deren α-Aminogruppe geeignet geschützt ist, an ein chlormethyliertes Polystyrolharz gebunden (siehe 1-4, Seite 14 von Stewart und Young, siehe oben). Nach dem Entfernen der α-Aminoschutzgruppe mit z.B. Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid und nach Neutralisation z.B. in TEA kann mit dem nächsten Zyklus der Synthese fortgefahren werden.
Die übrigen α-Amino- und bei Bedarf Seitenketten-geschützten Aminosäuren werden daraufhin nacheinander in der gewünschten Reihenfolge mittels Kondensation angebunden, um ein an das Harz gebundenes Zwischenprodukt zu erhalten. Alternativ dazu können einige Aminosäuren auch aneinander gebuden werden, wodurch ein Peptid gebildet wird, bevor das Peptid der wachsenden Festphasen-Polypeptidkette hinzugefügt wird.
Die Kondensation zwischen zwei Aminosäuren oder einer Aminosäure und einem Peptid oder einem Peptid und einem Peptid kann gemäß herkömmlichen Kondensationsverfahren wie dem Azid-Verfahren, dem Verfahren mit gemischtem Säureanhydrid, dem DCC-Verfahren (Dicyclohexylcarbodiimid), dem aktiven Ester-Verfahren (p-Nitrophenyl-Verfahren, BOP- [Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat-] Verfahren, dem N-Hydroxy-bernsteinsäureester-Verfahren) und dem Woodward-Reagens-K-Verfahren durchgeführt werden. Im Fall der Verlängerung der Peptidkette im Festphasenverfahren wird das Peptid an der C-terminalen Aminosäure an einen unlöslichen Träger gebunden. Als unlösliche Träger können jene verwendet werden, die mit der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure reagieren, um eine Bindung zu bilden, die später leicht gespalten werden kann, wie z.B. Halogenmethylharz wie etwa Chlormethylharz und Brommethylharz, Hydroxymethylharz, Aminomethylharz, Benzhydrylaminharz und t-Alkyloxycarbonylhydrazid-Harz.
Allen chemischen Synthesen von Peptiden ist der Schutz der reaktiven Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäuregruppen mit geeigneten Schutzgruppen an dieser Stelle gemein, bis die Gruppe schlussendlich entfernt wird, nachdem die Kette vollständig zusammengesetzt wurde. Sie haben auch den Schutz der α-Aminogruppe auf einer Aminosäure oder einem Fragment gemein, während die Gruppierung an der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt vom selektiven Entfernen der α-Aminoschutzgruppe, um eine nachfolgende Reaktion an dieser Stelle stattfinden zu lassen. Demgemäß haben sie gemein, dass als ein Schritt bei der Synthese ein Zwischenprodukt hergestellt wird, das jeden der Aminosäurereste in der gewünschten Sequenz in der Peptidkette umfasst, wobei verschiedene dieser Reste Seitenketten-Schutzgruppen aufweisen. Diese Schutzgruppen werden daraufhin üblicherweise im Wesentlichen gleichzeitig entfernt, um auf diese Weise nach erfolgter Reinigung das gewünschte resultierende Produkt zu erzeugen.
Nachfolgend sind Beispiele für Schutzgruppen, die für den Schutz der α- und ε-Aminoseitenkettengruppen verwendet werden können, angegeben: Benzylolxycarbonyl (abgekürzt Z), Isonicotinyloxycarbonyl (iNOC), O-Chlorbenzyloxycarbonyl [Z(NO₂], p-Methoxybenzyloxycarbonyl [Z(OMe)], t-Butoxycarbonyl (Boc), t-Amyloxycarbonyl (Aoc), Isobornyloxycarbonyl, Adamatyloxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)-2-propyloxycarbonyl (Bpoc), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), Methylsulfonylethoxycarbonyl (Msc), Trifluoracetyl, Phthalyl, Formyl, 2-Nitrophenylsulfenyl (NPS), Diphenylthiophosphinyl (Ppt), Dimethylthiophosphinyl (Mpt) und dergleichen.
Als Schutzgruppe für die Carboxylgruppe können z.B. die folgenden Beispiele genannt werden: Benzylester (OBzl), Cyclohexylester (Chx), 4-Nitrobenzylester (ONb), t-Butylester (OBut), 4-Pyridylmethylester (OPic) und dergleichen. Es ist erwünscht, dass spezifische Aminosäuren wie Arginin, Cystein und Serin, die eine andere funktionelle Gruppe als Amino- und Carboxylgruppen aufweisen, bei Bedarf durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden. So kann z.B. die Guanidinogruppe in Arginin mit Nitro, p-Toluolsulfonyl, Bezyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzolsulfonyl, 4-Methoxy-2,6-dimethylbenzolsulfonyl (Mds), 1,3,5-Trimethylphenylsulfonyl (Mts) und dergleichen geschützt werden. Die Thiolgruppe in Cystein kann mit p-Methoxylbenzyl, Triphenylmethyl, Acetylaminomethylethylcarbamoyl, 4-Methylbenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl (Tmb) etc. geschützt werden, und die Hydroxylgruppe im Serin kann mit Benzyl, t-Butyl, Acetyl, Tetrahydropropanyl etc. geschützt werden.
Stewart und Young, siehe oben, liefern detaillierte Informationen in Bezug auf die Verfahren zur Herstellung von Peptiden. Der Schutz von α-Aminogruppen ist auf den Seiten 14–18 beschrieben, und die Blockade von Seitenketten ist auf den Seiten 18–28 beschrieben. Eine Tabelle mit den Schutzgruppen für Amino-, Hydroxyl- und Sulfhydrylfunktionen ist auf den Seiten 149–151 zu finden.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vervollständigt wurde, wird das Peptid-Zwischenprodukt vom Harzträger durch Behandlung mit einem Reagenz, wie z.B. flüssigem HF, und einem oder mehreren Thio-hältigen Fängern entfernt, wodurch nicht nur das Peptid vom Harz abgespalten wird, sondern auch alle übrigen Seitenkettenschutzgruppen abgespalten werden. Nach der HF-Spaltung wird die Proteinsequenz mit Ether gewaschen, in ein großes Volumen von verdünnter Essigsäure übergeführt und gerührt, wobei der pH-Wert mit Ammoniumhydroxid auf etwa 8,0 eingestellt wird.
Vorzugsweise um eine Alkylierung der Reste im Polypeptid zu vermeiden (z.B. die Alkylierung von Methionin-, Cystein- und Tyrosinresten), wird ein Thiokresol- und Kresol-Fänger verwendet. Das Harz wird mit Ether gewaschen und unmittelbar anschließend in ein großes Volumen von verdünnter Essigsäure übergeführt, um es löslich zu machen und intermolekulare Vernetzung zu minimieren. Eine 250 μM Polypeptidkonzentration wird in etwa Z Litern 0,1 M Essigsäurelösung verdünnt. Die Lösung wird daraufhin gerührt, und ihr pH-Wert wird mithilfe von Ammoniumhydroxid auf etwa 8,0 eingestellt. Nachdem der pH-Wert eingestellt wurde, nimmt das Polypeptid seine gewünschte Konformationsanordnung ein.
Kunitz-Domänen können entweder mittels chemischer Synthese, wie dies oben beschrieben wurde, oder mithilfe von semisynthetischen Verfahren hergestellt werden. Die Verfahren der chemischen Synthese oder semisynthetischen Verfahren ermöglichen, dass nicht-natürliche Aminosäurereste aufgenommen werden können. Dies wurde für Kunitz-Domänen bereit durchgeführt und beschrieben (Beckmann, J. et al., Eur. J. Biochem. 176, 675–682 (1988); Bigler, T. L. et al., Prot. Sci. 2, 786–799 (1993)).
Für Polypeptide, die eine oder mehrere der hierin beschriebenen Domänen vom Kunitztyp enthalten, sind die im US-Patent Nr. 5.403.737 beschriebenen Techniken der chemischen Ligation zur chemischen Synthese von großen Biomolekülen besonders nützlich.
Mutagenese und Synthesetechniken
Es stehen verschiedene Techniken zur Verfügung, die angewendet werden können, um mutierte DNA zu erzeugen, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren kann. So ist es z.B. möglich, mutierte DNA auf Grundlage von natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen abzuleiten, die für die Änderungen in der Aminosäuresequenz des resultierenden Proteins in Bezug auf die native Domäne vom Kunitztyp wie etwa das APPI-Molekül kodieren. Diese mutierte DNA kann verwendet werden, um die Polypeptide der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Zur Illustration können etwa mit Expressionsvektoren, die für APPI (Castro et al., siehe oben) oder andere zur Verfügung stehende, natürlich vorkommende Polypeptide mit Kunitz-Domäne kodieren, die Techniken der ortsspezifischen Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol. 204, 125–139 (1991); Carter, P. et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller, M. J. et al., Nucl. Acids. Res. 10, 6487 (1982)), der Kassettenmutagenese (Wells, J. A. et al., Gene 34, 315 (1985)), der Restriktionsselektionsmutagenese (Wells, J. A. et al., Philos. Trans., R. Soc. London Ser A 317, 415 (1986)) oder andere bekannte Techniken mit der DNA durchgeführt werden. Die mutierte DNA kann daraufhin durch Insertieren in die geeigneten Expressionsvektoren anstelle der Ausgangs-DNA verwendet werden. Das Wachstum der Wirtsbakterien, welche die Expressionsvektoren mit der mutierten DNA enthalten, ermöglicht die Produktion von Kunitztyp-Serinproteaseinhibitor-Varianten, die wie hierin beschrieben isoliert werden können.
Für Polypeptide, die eine oder mehrere Domänen vom Kunitztyp enthalten, wie dies hierin beschrieben wird, kann die Domäne vom Kunitztyp in ein größeres Biomolekül ligiert werden, indem die chemischen Ligationstechniken zum Einsatz kommen, die im US-Patent Nr. 5.403.737 beschrieben sind, um z.B. große Biomoleküle chemisch zu synthetisieren.
Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese stellt ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Varianten vom Kunitztyp der vorliegenden Erfindung dar. Diese Technik ist allgemein bekannt und wurde von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Kurz gesagt wird die native oder nicht-geänderte DNA einer nativen Domäne vom Kunitztyp, wie z.B. APPI, durch Hybridisierung eines Oligonukleotids, das für die gewünschte Mutation kodiert, an ein DNA-Templat geändert, wobei das Templat die einsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen darstellt, das/der die nicht-geänderte oder native DNA-Sequenz von APPI enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase eingesetzt, um einen gesamten zweiten Komplementärstrang des Templats zu synthetisieren, der auf diese Weise den Oligonukleotid-Primer aufnimmt und für die gewählte Änderung in der DNA der Kunitztyp-Domänen-Untereinheit kodiert.
Allgemein werden Oligonukleotide mit zumindest einer Länge von 25 Nukleotiden verwendet. Ein optimales Oligonukleotid weist 12 bis 15 zum Templat vollkommen komplementäre Nukleotide auf jeder Seite des/der für die Mutation kodierenden Nukleotids/-e auf. Dies stellt sicher, dass das Oligonukleotid richtig an das einsträngige DNA-Templat-Molekül hybridisiert. Die Oligonukleotide können leicht unter Einsatz von nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden, wie sie etwa von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1987), beschrieben sind.
Ein einsträngiges DNA-Templat kann auch erzeugt werden, indem mithilfe von Standardtechniken doppelsträngige Plasmid-DNA oder eine andere DNA denaturiert wird.
Um die native DNA-Sequenz zu ändern (um z.B. Aminosäuresequenzvarianten zu erzeugen), wird das Oligonukleotid unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an ein einsträngiges Templat hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird daraufhin zugegeben, um den komplementären Strang des Templats unter Verwendung des Oligonukleotids als Primer für die Synthese zu synthetisieren. Es wird daraufhin ein Heteroduplex-Molekül gebildet, so dass ein Strang der DNA für die mutierte Form der Kunitz-Domäne kodiert und der andere Strang (das Ausgangstemplat) für die native, nicht-geänderte Sequenz der Kunitz-Domäne kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird daraufhin in eine geeignete Wirtszelle transformiert, gewöhnlich ein Prokaryot wie E. coli 27C7. Nachdem die Zellen gezüchtet wurden, werden sie auf Agarose-Platten ausplattiert und mithilfe eines Oligonukleotid-Primers, der mit 32-Phosphat radiomarkiert wurde, gescreent, um Bakterienkolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mutierte Region wird daraufhin entfernt und in einen geeigneten Vektor für die Proteinproduktion eingesetzt, im Allgemeinen in einen Expressionsvektor von der Art, wie sie üblicherweise zur Transformation eines geeigneten Wirts verwendet wird.
Das eben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplex-Molekül erzeugt wird, in dem beide Stränge des Plasmids die Mutationen) enthalten. Die Modifikationen sind wie folgt: Das einsträngige Oligonukleotid wird wie oben beschrieben an das einsträngige Templat anneliert. Ein Gemisch aus drei Desoxyribonukleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP), wird mit einem modifizierten Thiodesoxyribocystein, das als dCTP-(αS) bezeichnet wird (von der Amersham Corporation erhältlich), kombiniert. Dieses Gemisch wird dem Templat-Oligonukleotid-Komplex hinzugefügt. Nach Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein Strang der DNA, der abgesehen von den mutierten Basen identisch mit dem Templat ist, erzeugt. Zusätzlich dazu enthält dieser neue DNA-Strang dCTP-(αS) anstelle von dGTP, was dazu dient, ihn vor Restriktionsendonukleaseverdau zu schützen.
Nachdem der Templatstrang des doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten wurde, kann der Templat-Strang mit ExoIII-Nuklease oder mit einer anderen geeigneten Nuklease nach der Region, die die zu mutagenisierende Stelle(n) enthält, verdaut werden. Die Reaktion wird daraufhin angehalten, um ein Molekül zu erhalten, dass nur zum Teil einsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird daraufhin mithilfe von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase gebildet. Dieses Homoduplex-Molekül kann daraufhin in eine geeignete Wirtszelle wie E. coli 27C7 transformiert werden, wie dies bereits beschrieben wurde.
DNA, die für Kunitz-Domänenvarianten mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kodiert, kann auf verschiedene Weise erzeugt werden. Liegen die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander, so können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonukleotids, das für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert, mutiert werden. Wenn die Aminosäuren aber ein wenig voneinander beabstandet sind (um mehr als etwa 10 Aminosäuren voneinander getrennt sind), so ist es schwieriger, ein einziges Oligonukleotid zu erzeugen, das für alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eines von zwei alternativen Verfahren eingesetzt werden.
Im ersten Verfahren wird ein getrenntes Oligonukleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonukleotide werden daraufhin gleichzeitig an die einsträngige Templat-DNA anneliert, und der zweite Strang der DNA, der aus dem Templat erzeugt wird, kodiert für alle gewünschten Aminosäuresubstitutionen.
Das Alternativverfahren umfasst zwei oder mehr Mutageneserunden, um die gewünschte Mutante zu erzeugen. Die erste Runde ist wie jene, die für einzelne Mutanten beschrieben wurde: Es wird eine DNA vom Wildtyp als Templat verwendet, ein Oligonukleotid, das für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird an dieses Templat anneliert, und das Heteroduplex-DNA-Molekül wird erzeugt. Die zweite Mutageneserunde verwendet die mutierte DNA, die in der ersten Runde der Mutagenese erzeugt wurde, als Templat. Somit enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das Oligonukleotid, das für die zusätzliche(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodiert, wird daraufhin an dieses Templat anneliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für die Mutationen aus sowohl der ersten als auch der zweiten Runde der Mutagenese. Diese resultierende DNA kann als Templat in einer dritten Mutageneserunde verwendet werden, usw.
Ein bevorzugter Vektor für die rekombinierte Expression der Kunitz-Domänenvarianten ist pSALz1. Dieser Vektor enthält, wie im Beispiel 1 beschrieben, Replikationsstartpunkte für E. coli, den alkalischen Phosphatase-Promotor, die stlI-Signalsequenz und ein APPI-Variantengen sowie das Ampicillin-Widerstandsgen. Andere bevorzugte Vektoren sind pBO475, pRIT5 und pRIT2T (Pharmacia Biotechnology). Diese Vektoren enthalten geeignete Promotoren, gefolgt von der Z-Domäne von Protein A, wodurch Gene in die Vektoren eingeführt werden können, um als Fusionsproteine exprimiert zu werden. Eine nähere Diskussion dieser Vektoren folgt später.
Andere bevorzugte Vektoren können unter Verwendung von Standardtechniken konstruiert werden, indem die relevanten Merkmale der hierin beschriebenen Vektoren kombiniert werden. Relevante Merkmale des Vektors umfassen den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle, das APP1-Varianten-Gen oder die Genfusion (die Z-Domäne von Protein A und der APP1-Variante und deren Linker), die Signalsequenz, "die Antibiotikaresistenz-Marker, die Kopienzahl und die geeigneten Replikationsstartpunkte.
Bei E. coli wurden Kunitz-Domänen als intakte sekretierte Proteine exprimiert (Castro, M. et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)), als intrazellular exprimierte Proteine (Altman, J. D. et al., Protein Eng. 4, 593–600 (1991) oder als Fusionsproteine (Sinha, S. et al., J. Biol. Chem. 266, 21011–21013 (1991); Lauritzen, C. et al., Prot. Express. Purif. 2, 372–378 (1991); Auerswald, E. A. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 27–35 (1988)).
Die Wirtszelle kann prokaryoatisch oder eukaryotisch sein. Prokaryoten werden zum Klonieren und Exprimieren von DNA-Sequenzen bevorzugt, um Ausgangs-Polypeptide, Segment-substituierte Polypeptide, Rest-substituierte Polypeptide und Polypeptid-Varianten zu erzeugen. So kann z.B. der E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) als E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537) und E. coli c600 und c600 hfl, E. coli W3110 (F-, γ-, protrophisch (ATCC Nr. 37325), Bazillen wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans sowie verschiedene Pseudomonas-Spezies verwendet werden. Der bevorzugte Prokaryot ist E. coli W3110 (ATCC 27325) wie auch das Nicht-Suppressor-Derivat 27C7 (ATCC 55,244). Werden sie von Prokaryoten exprimiert, so enthalten die Polypeptide gewöhnlich ein N-terminales Methionin oder ein Formylmethionin, und sie sind nicht glykosyliert. Im Fall von Fusionsproteinen befindet sich das N-terminale Methionin oder Formylmethionin am Aminoterminus des Fusionsproteins oder der Signalsequenz des Fusionsproteins. Diese Beispiele dienen natürlich nur der Veranschaulichung und keineswegs der Einschränkung.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Organismen wie Hefekulturen oder Zellen, die aus vielzelligen Organismen stammen, verwendet werden. Im Prinzip kann mit einer beliebigen solchen Zellkultur gearbeitet werden. Das größte Interesse gab es aber für Zellen von Wirbeltieren, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) wurde zu einem reproduzierbaren Verfahren ("Tissue Culture", Kruse and Patterson (Hrsg.), Academic Press (1973). Beispiele für solche nützliche Wirtszellenlinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Eizelllinien von Chinesischen Hamstern (CHO-Zelllinien), W138-, 293-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zelllinien. Es wurden Hefeexpressionsvektoren verwendet, um Kunitz-Domänen zu erzeugen (Wagern, S. L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 1138–1145 (1992); Vedvick, T. et al., J. Indust. Microbiol. 7, 197–202 (1991)). Insbesondere wurde die Hefe Pichia pastoris erfolgreich unter Verwendung der Präpro-Signalsequenz des Saccharomyces cerevisiae-Übereinstimmungsfaktors α und der Promotor- und Terminatorsequenzen der P. pastoris-Alkoholoxidase AOXI verwendet. Es werden dabei auch andere Hefeexpressionsvektoren und Wirte ins Auge gefasst, die herkömmlicherweise zur Expression von heterologen Proteinen verwendet werden.
Genfusionen
Eine Variation der obigen Verfahren erwägt die Verwendung von Genfusionen, worin das Gen, das für die APP1-Variante kodiert, im Vektor mit einem Gen, das für ein anderes Protein oder ein Fragment eines anderen Proteins kodiert, assoziiert ist. Dies führt dazu, dass die APPI-Variante von der Wirtszelle als Fusion mit einem anderen Protein produziert wird. Das "andere" Protein ist oftmals ein Protein oder Peptid, das von der Zelle sekretiert werden kann, wodurch es möglich wird, das gewünschte Protein aus dem Kulturmedium zu isolieren und zu reinigen und dadurch die Notwendigkeit der Zerstörung der Wirtszellen zu eliminieren, die sich dann ergibt, wenn das gewünschte Protein im Inneren der Zelle verbleibt. Alternativ dazu kann das Fusions protein intrazellular exprimiert werden. Es ist zweckdienlich, Fusionsproteine zu verwenden, die stark exprimiert werden.
Die Verwendung von Genfusionen kann, wenngleich dies nicht wesentlich ist, die Expression von heterologen Proteinen in E. coli wie auch die nachfolgende Reinigung dieser Genprodukte erleichtern (Harris, T. J. R., "Genetic Engineering", Williamson, R. (Hrsg.), Academic, London, Band 4, 127 (1983); Uhlen, M. und Moks, T., Methods Enzymol. 185, 129–143 (1990)). Protein-A-Fusionen werden oftmals verwendet, da die Bindung von Protein A, oder insbesondere der Z-Domäne von Protein A, an IgG für die Reinigung des fusionierten Proteins eine "Affinitätshilfe" bietet (Nilsson, B. und Abrahmsen, L., Methods Enzymol. 185, 144–161 (1990)). Es wurde auch gezeigt, dass viele heterologe Proteine abgebaut werden, wenn sie direkt in E. coli exprimiert werden, dass sie aber stabil sind, wenn sie als Fusionsproteine exprimiert werden (Marston, F. A. O., Biochem. J. 240, 1 (1986)).
Als Fusionsproteine exprimierte APP1-Varianten können passend gefaltet werden, oder es ist eine Faltung erforderlich, um die native Struktur zu erhalten. Die geeignet gefalteten Fusionsproteine können als Serinprotease-Inhibitor aktiv und nützlich sein. Noch mehr bevorzugt ist aber das korrekt gefaltete Protein, das durch in der Technik bekannte Verfahren aus dem Fusionsprotein erhalten wird. Fusionsproteine können unter Verwendung von Chemikalien wie Bromcyan, das an einem Methionin spaltet, oder Hydroxylamin, das zwischen Asn und Gly spaltet, gespalten werden. Unter Einsatz von standardisierter DNA-Rekombinationstechnologie können die Nukleotidbasenpaare, die für diese Aminosäuren kodieren, unmittelbar vor dem 5'-Terminus des APPI-Variantengens insertiert werden.
Alternativ dazu kann proteolytische Spaltung von Fusionsproteinen zum Einsatz kommen, wozu kürzlich ein Überblick erschienen ist (Carter, P., "Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes", Ladtisch, M. R., Wilson, R. C., Painton, C. C. und Builder, S. E. (Hrsg.), American Chemical Society Symposium Series Nr. 427, Kapitel 13, 181–193 (1990)).
Proteasen wie Faktor Xa, Thrombin, Subtilisin und Mutanten davon wurden erfolgreich zur Spaltung von Fusionsproteinen verwendet. Gewöhnlich wird ein Peptid-Linker, der einer Spaltung durch die verwendete Protease unterzogen wird, zwischen das "andere" Protein (z.B. die Z-Domäne von Protein A) und das Protein von Interesse, wie z.B. eine APPI-Variante, insertiert. Kommt DNA-Rekombinationsmethodik zum Einsatz, so werden die für den Linker kodierenden Nukleotidbasenpaare zwischen die Gene oder für die anderen Proteine kodierenden Genfragmente insertiert. Die proteolytische Spaltung von teilweise gereinigten Fusionsproteinen, die den korrekten Linker enthalten, kann entweder an dem nativen Fusionsprotein oder dem reduzierten oder denaturierten Fusionsprotein ausgeführt werden.
Das Protein kann, wenn es als Fusionsprotein exprimiert wird, geeignet gefaltet sein oder auch nicht. Auch kann der spezifische Peptid-Linker, der die Spaltungsstelle enthält, für die Protease zugänglich sein oder auch nicht. Diese Faktoren bestimmen, ob das Fusionsprotein denaturiert oder erneut gefaltet werden muss, und falls dies so ist, ob dieses Verfahren vor oder nach der Spaltung anzuwenden ist.
Ist eine Denaturierung oder Neufaltung erforderlich, so wird das Protein üblicherweise mit einem Chaotrop behandelt, wie etwa Guanidin-HCl, und es wird danach mit einem Redox-Puffer behandelt, der z.B. reduziertes und oxidiertes Dithiothreitol oder Glutathion in den geeigneten Verhältnissen, mit dem geeigneten pH-Wert und der richtigen Temperatur enthält, so dass das Protein von Interesse erneut in seine native Struktur gefaltet wird.
Nützlichkeit
Es wurde vorgeschlagen, dass das Kontaktaktivierungssystem in einer Vielzahl klinischer Zustände, einschließlich septischem Schock, kardiopulmonaler Bypass-Chirurgie, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen und angeborenem Angioödem, eine wesentliche Rolle spielt (Bone, R. C., Arch. Intern. Med. 152, 1381–1389 (1992); Colman, R. W., N. Engl. J. Med. 320, 1207–1209 (1989)). Inhibitoren des Kontaktsystems können somit bei der Regulierung von Entzündungen und/oder thrombotischen Störungen eine wichtige Rolle spielen.
Die hierin beschriebenen Polypeptide sind für die Behandlung von Krankheiten zweckdienlich, bei denen eine Intervention bei der Aktivierung der Kontaktstoffwechselwege oder bei der Neutrophilaktivierung indiziert ist (z.B. Entzündung, Koagulation, Fibrinolyse und Komplementaktivierung). Genauer gesagt sind die vorliegenden Inhibitoren insbesondere bei der Behandlung von Erkrankungen nützlich, bei denen die Hemmung von Plasma-Kallikrein (und FXIa) indiziert ist (siehe 1), wie z.B. bei der Behandlung von Sepsis oder septischem Schock, Entzündung, ARDS, DIC, Hypotonie; kardiopulmonaler Bypass-Chirurgie und bei Blutungen nach chirurgischen Eingriffen, wie dies detailliert im Abschnitt über den Stand der Technik beschrieben wurde.
Die hierin beschriebenen Polypeptide sind besonders in klinischen Situationen nützlich, bei denen eine akute oder chronische Therapie erforderlich ist. Es wird angenommen, dass Indikationen, für die eine Akuttherapie indiziert ist, mehr bevorzugt sind als jene für eine chronische Therapie. Die pharmazeutische Verwendung von fremden oder mutierten Humanproteinen kann immunogen sein; Fremdproteine werden aber verwendet, um akute Indikationen zu behandeln. Ein Beispiel für ein solches Protein ist Streptokinase, ein Protein, das von Streptokokken stammt, als Fibrinolytikum wirkt und allgemein zur Behandlung von akutem Infarkt des Herzmuskels verwendet wird. Die hierin beschriebenen Mittel können eine Immunreaktion auslösen; damit verwandte Fremdproteine wie BPTI wurden klinisch beim Menschen eingesetzt, und es wird nicht angenommen, dass sie eine ernste Immunreaktion auslösen. Die kovalente Anbindung von Polyethylenglykol (PEG) an die hierin beschriebenen Mittel kann die Immunogenität und Toxizität reduzieren und die Halbwertszeit verlängern, wie dies in Zusammenhang mit anderen Proteinen beobachtet wurde (Katre, N. V., J. Immunol. 144, 209–213 (1990); Posznansky, M. J. et al., FEB 239, 18–22 (1988); Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3582–2586 (1977)).
Aprotinin hemmt die Kontakt-, Neutrophil- und Blutplättchenaktivierungssysteme während simulierter extrakorporaler Perfusion, was sich durch die Verringerung von Blutverlust und Kallikrein-C1-Inhibitor- und C1-C1-Inhibitorkomplexe und die Verhinderung von Degranulierung der Neutrophilen, Blutplättchenaktivierung und -aggregation zeigt (Westaby, S., Ann. Thor. Surg. 55, 1033–1041 (1993); Wachtfogel, Y. et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 106, 1–10 (1993)). Es wurde während LPS-induziertem endotoxischem Schock bei Schweinen verwendet, und es verhinderte arterielle Hypotonie (Seibeck, M. et al., J. Trauma 34, 193–198 (1993)). Bei Patienten mit hepatischer Zirrhose führte Aprotinin zu einer verbesserten Nierenfunktion und -filtration (MacGilchrist, A., Clin. Sci. 87, 329–335 (1994). Die Kunitz-Domänen-Inhibitoren für Plasma-Kallikrein, die hierin beschrieben sind, können geeigneterweise für die Behandlung von diesen und damit in Zusammenhang stehenden Indikationen verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können bei der Modulation der durch Plasma-Kallikrein vermittelten Funktionen therapeutisch nützlich sein, ebenso wie dies mit Aprotinin der Fall ist. Die vorliegenden Polypeptide bieten den Vorteil einer gesteigerten Wirksamkeit und Spezifität für Plasma-Kallikrein, wodurch Formulierungen mit geringerer Dosis ermöglicht werden. Effektive Dosen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden gemäß relevanten Techniken bestimmt. Die Auswahl der Zusammensetzungen, die Häufigkeit der Verabreichung sowie die Menge an zu verabreichender Zusammensetzung werden der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung und deren Schwere, der Natur des verwendeten Polypeptids, dem Gesamtzustand des Patienten entsprechend und nach Ermessen des behandelnden Arztes gewählt. Typische Dosierungen sind analog zur Behandlung anderer Erkrankungszustände unter Verwendung anderer analoges Proteine wie Aprotinin. Typischerweise enthalten die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung etwa 1% bis etwa 95% des Wirkstoffs, vorzugsweise etwa 10% bis etwa 50%.
Vorzugsweise erfolgt die Dosierung mittels intravenöser Injektion oder kurzfristiger Infusion. Um optimale therapeutische Wirkung zu erzielen, muss die Dosierung langfristig verabreicht werden. Eine langfristige Dosierung kann wiederholt während des Tages verabreicht werden, indem z.B. wiederholt Einzelinjektionen gegeben werden, oder durch Einführung in eine kontinuierliche Tropfinfusion.
Für die intravenöse Injektion oder kurzfristige Infusion werden einem Erwachsenen im Allgemeinen zwischen etwa 1 und 1.000 mg und vorzugsweise zwischen etwa 1 und 100 mg verabreicht. Es wird eine langfristige Dosierung von etwa 0,5 bis etwa 50 mg angenommen.
Andere wirksame Dosen können von Fachleuten auf dem Gebiet der Technik leicht mittels Routinetests ermittelt werden, indem Dosis-Reaktions-Kurven erstellt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Polypeptide der Erfindung umfassen, können in geeigneter Art und Weise verabreicht werden, einschließlich parenteral, topisch, oral oder lokal (z.B. als Spray oder transdermal) oder in einer beliebigen Kombination davon. Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht, wobei die Art des Trägers sich je nach Verabreichungsmodus unterscheidet, so wird z.B. bei oraler Verabreichung üblicherweise ein fester Träger und bei intravenöser Verabreichung flüssige Salzlösung als Träger verwendet.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen pharmazeutisch annehmbare Komponenten, die mit dem Gegenstand und Protein der Erfindung kompatibel sind. Diese umfassen allgemein Suspensionen, Lösungen und Elixiere und insbesondere biologische Puffer, wie z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Kochsalzlösung, Dulbecco-Medium und dergleichen. Es können auch Sprays verwendet werden oder Träger wie Stärken, Zucker, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Zersetzungsmittel und dergleichen (im Fall von oralen Festpräparaten wie etwa Pulvern, Kapseln und Tabletten).
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" im Allgemeinen von einer Durchführungsstelle der bundesstaatlichen oder nationalen Regierung zugelassen oder in der US-Pharmakopöe oder einer anderen allgemein aner kannten Pharmakopöe für die Verwendung bei Tieren und insbesondere bei Menschen gelistet.
Eine ausgewählte Formulierung kann unter Verwendung einer Vielzahl der zuvor angeführten Puffermittel oder sogar Trägermittelstoffe, umfassend z.B. pharmazeutisch reine/-n/-s Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin-Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen, erzielt werden. "PEGylierung" der Zusammensetzungen kann unter Einsatz in der Technik bekannter Verfahren erreicht werden (siehe z.B. Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/16555, US-Patent Nr. 5.122.614 an Enzon und Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00748). Orale Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Retardformulierungen oder Pulvern eingenommen werden.
Die vorliegende Erfindung wurde notwendigerweise mit Bezug auf die gewissen spezifischen Verfahren und Materialien diskutiert. Es ist zu verstehen, dass die Diskussion dieser spezifischen Verfahren und Materialien in keiner Hinsicht irgendeine Einschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung darstellt, der sich auch auf jegliche Alternativmaterialien und -verfahren erstreckt, die dafür geeignet sind, das Ziel der vorliegenden Erfindung umzusetzen.
Beispiel 1
Konstruktion und Reinigung von Plasma-Kallikrein-Inhibitoren
Verfahren
Menschlicher Faktor VIIa, Faktor Xa, Faktor XIa, aktiviertes Protein C und Thrombin wurden von Haematologic Technologies Inc. (Essex Jct., VT) erworben. Human-Plasma-Kallikrein und Faktor XIIa wurden von Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN, USA) erstanden. Das für die APPI-Sequenz kodierende Gen ist bei Castro, M. et al., FEBS Lett. 267, 207–212 (1990)) beschrieben; rekombinanter Human-Gewebefaktor_1–243 (TF) wurde, wie bei Paborsky, L. R. et al., Biochemistry 28, 8072–8077 (1989) und Paborsky, L. R. et al., J. Biol. Chem. 266, 21911–21916 (1991) beschrieben, in E. coli hergestellt. BPTI (Trasylol^®) wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) erworben. Rindertrypsin und TRITON^® X-100 wurden von Sigma Chemicals, Inc. gekauft. Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V wurde von Calbiochem (La Jolla, CA, USA) erhalten. Humanplasmin, S-2302, S. 2251 und S-2366 wurden von Kabi Vitrum (Schweden) erstanden, und Spectrozyme FXa wurde von American Diagnostica erworben (Greenwich, CT, USA). Der E. coli Strang XL1-Blue wurden von Stratagene (La Jolla, CA, USA) erworben. Alle anderen erworbenen Reagenzmitteln waren von der höchsten im Handel erhältlichen Reinheit.
Das Plasmid pSAlz1 wurde konstruiert, indem ein für die APP1-Sequenz kodierendes synthetisches Gen in einen geeigneten Expressionsvektor für die Sekretion von APPI in das Periplasma und Medium sekretiert wurde. Der pSAlz1-Vektor enthielt den alkalischen Phosphatase-Promotor, das stlI-Sekretierungssignal, das APPI-Gen, die fl- und colE1-Replikationsstartpunkte und das Ampicillinresistenzgen, wie dies bei Castro et al. (Castro, M. et al., siehe oben (1990)) beschrieben ist. Die Konstruktion von APPI-Mutanten unter Verwendung des pSAlz1-Vektors wurde unter Einsatz von ortsgerichteter Oligonukleotid-Mutagenese, wie zuvor beschrieben (Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 204, 125–139 (1991)), durchgeführt; die ausgewählten Klone wurden mittels Didesoxy-Sequenzanalyse analysiert (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977)).
Für entweder APPI oder die ausgewählten Mutanten kodierende Phagemide wurden in den E. coli Strang 27C7, ein Derivat von E. coli W3110, für die Expression der Kunitz-Domänen-Inhibitoren transformiert. Über Nacht wurden die gesättigten Kulturen (1%) in 250 ml phosphatarmes Minimalmedium eingeimpft (Chang, C. N. et al., Gene 55, 189–196 (1987)), das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, und 20 h lang bei 37°C gezüchtet.
Inhibitoren wurden aufgrund der stlΙ-Signalsequenz in das Periplasma sekretiert und traten schließlich in das Medium aus. Zellen und Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation (8.000 × g, 10 min) entfernt; der Überstand wurde auf einen pH von 7,5–8,5 mittels 1 M NaOH eingestellt und danach auf eine Affinitätssäule aus 1 ml Trypsin- Affigel 10 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) geladen, die entsprechend den Herstellerangaben präpariert worden war. Die Säule wurde mit 100 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl und 20 mM CaCl₂ gewaschen, und die Inhibitoren wurden mit 4 ml von 10 mM HCl, 0,5 M KCl eluiert. Die Inhibitoren wurden weiters unter Verwendung von C18-RP-HPLC (250 × 4,6 mm, VYDAC) gereinigt; sie wurden in 0,1% Trifluoressigsäure eingebracht und mit einem CH₃CN-Gradienten von 5 auf 40% mit 1 ml/min eluiert. Die Elutionsprofile wurden sowohl bei A₂₁₄ als auch bei A₂₈₀ überwacht. Es wurde für jeden Inhibitor zwischen 30 bis 35% CH3CN ein einzelner, gut aufgelöster Peak detektiert. Die Inhibitor-Sequenzen wurden unter Verwendung eines Sciex API 3 Massenspektrometers, das mit einer einziehbaren Elektrosprayquelle für die Massenanalyse ausgerüstet ist, auf die geeignete Masse hin untersucht. Mehrfach geladene Ionen von Pferde-Myoglobin (MG = 16.951 Da) wurden für die Instrumentenkalibrierung verwendet.
Ergebnisse
Ortsgerichtete Mutanten wurden erzeugt, um die bevorzugten Aminosäuren an den Positionen 11–19 und 34 einer Kunitz-Domäne auf wirksame Hemmung von Plasma-Kallikrein hin zu untersuchen. Die ortsgerichteten Mutanten von APPI weisen die folgende allgemeine Formel auf: R₁-Xaa₅-Xaa₄-Xaa₄-Xaa₂-Xaa₁-Xaa₁'-Xaa₂'-Xaa₃'-Xaa₄'-R₂-Xaa₁₉'-R₃ worin R₁ die Aminosäurereste 1–10 von APPI, VREVCSEQAE (SEQ. ID. Nr. 6) darstellt; R₂ die Aminosäurereste 20–33 von APPI, RWYFDVTEGKCAPF (SEQ ID Nr. 14) darstellt; und R₃ die Aminosäurereste 35 bis 58 von APPI, YGGCGGNRNNFDTEEYCAAVCGSA (SEQ. ID. Nr. 23) (SEQ. ID. Nr. 23) darstellt. Die in diesem Beispiel verwendete APPI-Sequenz weist eine zusätzliche Mutation des Rests 52 auf, so dass Met in der nativen Sequenz durch Ala ersetzt ist. Es wird nicht angenommen, dass diese Mutation eine Auswirkung auf die Hemmaktivität hat.
Die nicht natürlich vorkommenden Kunitz-Domänen, die erhalten wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgelistet.
Tabelle 1 Sequenzen der Kunitz-Domänen-Mutanten
Die in Tabelle I aufgelisteten Kunitz-Domänen-Varianten ergeben im Allgemeinen wirksame und selektive Hemmung von Plasma-Kallikrein (siehe Beispiele 2 und 3). Andere Sequenzen, die Plasma-Kallikrein hemmen, werden in der nachfolgenden Tabelle II beschrieben.
Tabelle II
Beispiel 2
Bestimmung von Gleichgewichtsdissoziationskonstanten
Verfahren
Die scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i*) wurden für die in Tabelle I aufgelisteten Kunitz-Domänen-Mutanten bestimmt. Die K_i*-Werte wurden unter Anwendung von Verfahren bestimmt, die für engbindende Inhibitoren abgeleitet wurden (Bieth, J., "Protease Inhibitors" (Fritz, H., Tschesche, H., Greene, L. J., und Tru scheit, E., (Hrsg.)) 463–469, Springer-Verlag, New York (1974); Williams, J. W. und Morrison, J. F., siehe oben (1979)), unter der Annahme, dass Enzym und Inhibitor einen reversiblen Komplex mit einer Stöchiometrie von 1:1 bilden, wie dies bei der Wechselwirkung von Kunitz-Domänen mit Serinproteasen beobachtet wurde (Bode, W. und Huber, R., siehe oben (1992); Laskowski, M., Jr. und Kato, I., siehe oben (1989)).
Die Konzentrationen des Inhibitor-Ausgangsmaterials wurden mittels Titration mit Aktivstellen-titriertem Trypsin genau bestimmt (Jameson, G. W., Biochem. J. 131, 107–117 (1973)). Nach einer einstündigen Inkubation von 80 nM Trypsin plus einer Aliquote eines verdünnten Inhibitors in 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ und 0,05% Triton X-100 bei Raumtemperatur wurden 20 μl von 5 mM N^α-Benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid zu einem Gesamtvolumen von 150 μl zugegeben. Daraufhin wurde die Änderung des Absorptionsvermögens bei 405 nm überwacht. Die Konzentrationen wurden unter der Annnahme einer Stöchiometrie zwischen Inhibitor und Trypsin von 1:1 bestimmt.
Die Hemmung von Plasma-Kallikrein durch ausgewählte APPI-Mutanten (Tabelle I) wurde bei 25°C in 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ und 0,005% Triton X-100 unter Verwendung einer Aliquote derselben verdünnten Inhibitorlösungen bestimmt. Die Reaktionen (200 μl) wurden in Mikrotiterplatten durchgeführt, und die Rate des Substrats (0,7 mM S2302) wurde bei 405 nm nach einer 1,5-stündigen Inkubation überwacht. Der Plot des Ratenbruchs über der Konzentration des Inhibitors wurde mittels nicht-linearer Regressionsanalayse an die Gleichung 1 angepasst, um die scheinbaren Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_i*) zu bestimmen: Gleichung 1:
worin V_i/V₀ der Aktivitätsbruch (gehemmte Rate im stationären Zustand durch nicht-gehemmte Rate) ist, [E₀] die Gesamtaktivstellenkonzentration von Plasma-Kallikrein ist und [I₀] die Gesamtkonzentration des Inhibitors ist.
Die in Tabelle I beschriebenen Kunitz-Domänen-Inhibitoren wiesen scheinbare Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im Bereich von 10 bis 300 pM (Tabelle III und Tabelle IV) auf.
Die Konsensussequenz der nachfolgenden Tabelle III, die aus Pro, Asp oder Glu an der Position 11 (P₅), His an der Position 13 (P₃), Arg an der Position 15 (P₁), Ala an den Positionen 16 (P₁') und 17 (P₂'), His an der Position 18 (P₃'), Pro an der Position 19 (P₄') und Val oder Tyr an der Position 34 (P₁₉') von APPI besteht, wurde basierend auf mehreren Beobachtungen mit Polypeptiden aus Tabelle II wie auch auf den in Tabelle IV angeführten Ergebnissen entwickelt. Es wurde herausgefunden, dass Varianten von APPI mit Arg an Position 15 (P₁) und His, Ala, His und Pro an den Positionen 13, 17, 18 bzw. 19 Plasma-Kallikrein wirksam hemmen. In diesen Varianten wurde eine Bevorzugung von Pro, Asp oder Glu an Position 11 (P₅) beobachtet, und an Position 34 (P₁₉') waren Val oder Tyr bevorzugt. Das Cystein an Position 14 (P₂), das eine Disulfidbindung mit dem Cystein an Position 38 (P₂₃') der Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitztyp bildet, blieb unverändert. Da Gly in Domänen vom Kunitztyp nahezu immer an Position 12 (P₄) anztreffen ist, wurde es nicht variiert.
Insbesondere Mutanten der Konsensusdomänen vom Kunitztyp, die ein Asp an Position 11 aufwiesen, zeigten scheinbare Gleichgewichtsdissoziationskonstanten unter 50 pM. Eine solche mutierte Form, KALI-DY, hemmte Plasma-Kallikrein mehr als 10.000fach besser als APPI und mehr als 3.000fach wirksamer als BPTI (Aprotinin, Trasylol^®).
Beispiel 3
Spezifitätstests
Verfahren
Tests zur Untersuchung der Spezifität von APPI, BPTI und Kunitz-Domänen-Varianten im Vergleich zu anderen an der Koagulation beteiligten Serinproteasen wurden unter Einsatz des folgenden Formats durchgeführt. Aliquoten (30 μl) verschiedener Inhibitoren, die auf 500 nM verdünnt wurden, wurden mit jeder Protease (100 μl) im geeigneten Puffer inkubiert. Nach 2 Stunden Inkubation des Gemischs Substrat/Inhibitor bei Raumtemperatur wurde das geeignete Substrat (20 μl) zugegeben, und es wurde das Absorptionsvermögen bei 405 nm überwacht. Es wurden Kontrollen, die keinen Inhibitor und kein Enzym enthielten, getestet, um die nicht-gehemmte Rate bzw. die Substrathydrolyserate zu messen. Die Enzyme und Substrate wurden in 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ und 0,005% Triton X-100 wie folgt gescreent: Thrombin (6,2 nM), 0,7 mM S2366; FXa (2,5 nM), 0,7 mM Spectrozyme FXa; FXIa (1,8 nM), 0,7 mM S2366; aktiviertes Protein C (7,6 nM), 0,7 mM S2366; Plasmin (32 nM), 0,7 mM S2251; Faktor XIIa (14 nM), 0,7 mM S2302, TF (77nM)-FVIIa (14 nM), 0,7 mM S2366 und Plasma-Kallikrein (3,5 nM), 0,7 mM S2302. Der FXIa-Test enthielt auch 1 mg/ml BSA. Die Konzentration von FXIa während des gesamten Tests bezieht sich auf die Konzentration der Aktivstellen. Für dieses Experiment waren die Konzentrationen von Thrombin, TF-FVIIa, FXa, FXIa, FXIIa und Plasmin approximativ und wurden auf Grundlage der Angaben der Hersteller bestimmt.
Ergebnisse
Die Hemmung anderer relevanter im Humanplasma gefundener Serinproteasen wurde ebenfalls gemessen, um die relative Spezifität der im Beispiel 2 beschriebenen Kunitz-Domänen-Inhibitoren zu bestimmen. Die Serinproteasen (1 bis 20 nM) wurden in Gegenwart von 100 nM Inhibitor untersucht. Der Bruchteil der proteolytischen Restaktivität ist in Tabelle IV angegeben. Alle ausgewählten mutierten Formen der Kunitz- Domänen hemmten FXIa, während keine davon FXIIa, FXa, Thrombin, TF-FVIIa oder aktiviertes Protein C in nennenswertem Ausmaß hemmte (Tabelle IV). Die meisten ausgewählten Kunitz-Inhibitoren hemmten Plasmin nur geringfügig, und es wurde eine moderate (> 60%) Hemmung für KALI-38, KALI-42 und KALI-48 beobachtet; die Konsensus-Mutanten des Beispiels 2 (Tabelle III) hemmten Plasmin nicht nennenswert. Der Grad, in dem FXIa durch ausgewählte Inhibitoren, einschließlich der Konsensusmutanten, gehemmt wurde, wurde durch Messen des K_i* näher untersucht. Die Hemmung von Plasma-Kallikrein (0,5 nM) in Gegenwart von APPI, BPTI, KALI-D und KALI-DY ist in 4A dargestellt. Die Hemmung von FXIa (3,5 nM) durch APPI, BPTI, KALI-10 und KALI-DY ist in 4B dargestellt, und die K_i*-Werte sind in den Tabellen III und IV aufgelistet.
Beispiel 4
Koagulationstests
Verfahren
Die Koagulationszeiten für normales Humanplasma wurden mittels eines MLA Electra 800 Coagulometer (Laboratory Automation, Inc., Pleasantville, NY, US) und Dade-Reagenzien (Baxter Health Care Corp., Miami, FL, USA) bestimmt.
Für die Tests auf aktivierte partielle Thromboplastinzeiten (APTT) wurde die Aktivierungszeit mit 120 s und die Erfassungszeit abhängig vom erwarteten Resultat des Tests mit 300 bis 600 s festgelegt. Es wurden zitriertes normales Humanplasma und Inhibitor gemeinsam inkubiert. Die Probe (Plasma und Inhibitor) und der Aktivator (Actin FS) wurden automatisch pipettiert und gemeinsam 2 Minuten lang bei 37°C inkubiert, danach wurde CaCl₂ zugegeben, und es wurde die Koagulationszeit mittels optischer Messung bestimmt. Die Gesamtinkubationszeit von Inhibitor mit Plasma betrug vor Zugabe des Aktivators ca. 3 Minuten und vor Zugabe von CaCl₂ 5 Minuten.
Ergebnisse
Wie aus den Spezifitätstests vorherzusagen war, verlängerte KALI-DY die Koagulationszeit im APPT, einem Maß für den intrinsischen Koagulationsstoffwechselweg, nicht aber das PT, ein Maß für den extrinsischen Koagulationsstoffwechselweg (5A). KALI-DY war beträchtlich effektiver als APPI, ein FXIa-Inhibitor (K_i* = 2,7 nM), oder BPTI, ein Kallikrein-Inhibitor (K_i* = 45 nM). Zusätzlich dazu konnten, obwohl Plasma-Kallikrein zu 600 nM im Plasma vorhanden war, 250 nM KALI-DY die Koagulation um das 2fache verlängern.
KALI-DY verlängerte die Koagulationszeit des Oberflächen-vermittelten Kontaktaktivierungsstoffwechselwegs in konzentrationsabhängiger Weise, wie dies im APTT gemessen wurde. Es wurde eine mehr als 3,5fache Verlängerung der Koagulationszeit bei 1 μM mit KALI-DY im Vergleich zu einer 2,8- und 1,8fachen Verlängerung, die bei APPI bzw. BPTI beobachtet wurden, beobachtet (5A). Im Gegensatz dazu verlängerten weder KALI-DY noch BPTI oder APPI die Koagulationszeit in einem Gewebefaktor-initiierten PT-Test nennenswert (5B).
Alle hierin zitierten Referenzen sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, das Plasma-Kallikrein hemmt, umfassend eine nicht-native Inhibitordomäne einer Serinprotease vom Kunitztyp, worin die Inhibitordomäne der Serinprotease vom Kunitztyp eine primäre Bindungsschleife Xaa₅-Xaa₄-Xaa₃-Xaa₂-Xaa₁-Xaa_1'-Xaa_2'-Xaa_3'-Xaa_4' und eine sekundäre Bindungsschleife, die Xaa_19' umfasst, aufweist, worin: die Sequenz Xaa₄-Xaa₃-Xaa₂-Xaa₁-Xaa_1'-Xaa_2'-Xaa_3'-Xaa_4' GHCRAAHP (Seq.-ID Nr. 72) ist; Xaa₅ aus der aus D, E und P bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und Xaa_19' aus der aus V, W und Y bestehenden Gruppe ausgewählt
Polypeptid nach Anspruch 1, worin Xaa₅ D ist.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, worin die Inhibitordomäne der Serinprotease vom Kunitztyp die Sequenz: R₁-Xaa₅-Xaa₄-Xaa₃-Xaa₂-Xaa₁-Xaa_1'-Xaa_2'-Xaa_3'-Xaa_4'-R₂-Xaa_19'-R₃ aufweist, worin R₁ ein Peptid aus 10 Aminosäuren ist, worin die Aminosäure, die der Aminosäureposition Xaa₁₁ entspricht, ein C ist; R₂ ein Peptid aus 14 Aminosäuren ist, worin die Aminosäure, die der Aminosäureposition Xaa_15' entspricht, ein C ist; und R₃ ein Peptid aus 24 Aminosäuren ist, worin die Aminosäuren, die den Aminosäurepositionen Xaa_23', Xaa_36' und Xaa_40' entsprechen, ein C sind.
Polypeptid nach Anspruch 3, worin: R₁ aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist; R₂ aus der aus
bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und R₃ aus der aus
bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polypeptid nach Anspruch 4, worin R₁ für die Aminosäurereste 1–10 von APPI (Seq.-ID Nr. 6) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht; R₂ für die Aminosäurereste 20–33 von APPI (Seq.-ID Nr. 14) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht; und R₃ für die Aminosäurereste 35–58 von APPI (Seq.-ID Nr. 23) oder konservative Aminosäuresubstitutionen davon steht.
DNA, die für ein Polypeptid nach einem der vorangehenden Ansprüche kodiert.
DNA nach Anspruch 6, das weiters eine Expressionskontrollsequenz umfasst, die mit der DNA operabel verbunden ist.
Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 7.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 8 transformiert ist.
Verfahren zur Expression eines DNA-Moleküls, das für einen Serinproteaseinhibitor kodiert, in einer Wirtszelle, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 9 unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers oder eines Tierkörpers.