DE3930522A1 - Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben - Google Patents
Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselbenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Apro
tinin-Varianten; Verfahren, die beschriebenen Peptid
varianten als homogen prozessierte Sekretionsprodukte
in transformierten Hefen herzustellen sowie die rekombi
nanten Aprotinin-Varianten enthaltende Arzneimittel.
Aprotinin ist ein gut untersuchtes Protein mit 58 Amino
säuren, welches inhibitorisch auf Trypsin, Chymotrypsin,
Plasmin und Plasma-Kallikrein wirkt (H. Fritz und G. Wunderer,
Drug. Res. 33, 479-494, 1983; W. Gebhard,
H. Tschesche und H. Fritz, Proteinase Inhibitors,
Barrett und Salvesen (eds.), Elsevier Science Publ. BV
375-387, 1986).
Das aus Organen des Rindes gewonnene Aprotinin ist die
Wirksubstanz des Arzneimittels Trasylol®, welches für
die Behandlung verschiedener Erkrankungen, wie z. B.
hyperfibrinolytischer Blutungen und traumat.-haemora
gischer Schock verwendet wird.
Darüber hinaus existieren neue klinische Befunde, die
zeigen, daß durch die Anwendung von Trasylol® bei Ope
rationen am offenen Herzen der durch Fibrinolyse und
Koagulation bedingte Blutverlust erheblich reduziert
werden kann (W. van Oeveren et al. Ann. Thorac. Surg.
44, 640-645, 1987; D. Royston et al. Lanzet II,
1289-1291, 1987; B. P. Bistrup et al., Lanzet I,
366-367, 1988).
Es konnte gezeigt werden, daß semisynthetisch erzeugte
Homologe von Aprotinin, die in Pos. 15 der Aminosäure
sequenz anstelle von Lysin andere Aminosäuren enthalten,
ein von Aprotinin deutlich abweichendes Wirkprofil und
Wirkungsspezifität besitzen (Tschesche et al., US-Patent
45 95 674; H. R. Wenzel et al. in Chemistry of Peptids
and Proteins, Band 3, 1985).
Einige dieser semisynthetischen Aprotinin-Homologe be
sitzen beispielsweise eine stark inhibierende Wirkung
auf Elastase aus Pankreas und Leukozyten. Bedingt durch
diese neuartige Wirkungsspezifität können diese Aproti
nin-Homologe therapeutisch bei Erkrankungen verwendet
werden, die durch eine erhöhte Freisetzung von Elastase
mit verursacht werden, wie z. B. Emphysen-Bildung, ARDS
(Adult Respiratory Distress Syndrom) und rheumatoider
Arthritis.
Andere Aprotinin-Homologe mit Arginin in Pos. 15 sind
durch eine gegenüber Aprotinin deutlich gesteigerte In
hibitor-Wirkung auf das bei der Blutgerinnungskaskade
zentral beteiligte Plasma-Kallikrein gekennzeichnet.
Die durch halbsynthetische Umwandlung des Rinder-Apro
tinins erzielbaren Ausbeuten fallen erfahrungsgemäß ge
ring aus. Es war daher für die Herstellung großer Mengen
von Aprotinin-Homologen vorteilhaft unter Verwendung
synthetisch hergestellter Gene, Gen-Produkte in pro
karyontischen Mikroorganismen fermentativ herzustellen
(Auerswald et al., Patent EP 01238993 A2) B. v. Wil
cken-Bergmann et al., EMBO J. 5, 3219-3225, 1986).
Für die Herstellung von rek. Aprotinin-Varianten in E.
coli-K-12-Stämmen wurden beispielsweise Expressions
systeme verwendet, die das Aprotinin-Mutein als intra
zellulär gebildetes Fusionsprotein mit einem geeigneten
Fusionspartner, wie z. B. dem N-terminalen Peptid-Anteil
der MS-2-Replikase in Form von intrazellulären Ein
schlußkörpern akkumulieren (E. A. Auerswald et al.,
Biol. Chem. Hoppe Seyler 369, 27-35, 1988).
Daneben können auch E. coli-Expressions-/Sekretions-
Systeme verwendet werden, die durch Fusion des Aproti
nin-Muteins mit geeigneten Gen-Sequenzen für sekreto
rische Signalpeptide, wie z. B. der OmpA-Signalsequenz
oder der phoA-Signalsequenz die Sekretion von hemmak
tiven Aprotinin-Varianten ins Periplasma der Bakterien
zelle ermöglichen (persönliche Mitteilung, Dr. W. Bruns
- Bayer AG; C. B. Marks et al., J. Biol. Chem. 261, 7115
- 7118, 1986).
Unter den eukaryontischen Systemen eignen sich besonders
Hefe-Expressionssysteme für die gentechnische Herstel
lung von rek. Aprotinin-Varianten, bei denen das Gen-
Produkt entweder intrazellulär akkumuliert wird oder als
Fusion mit einer geeigneten sekretorischen Signalsequenz
aus Hefen durch den Sekretionsweg geschleust und nach
Abspaltung durch eine Membranprotease als hemmaktive
Substanz in das Kulturmedium exportiert wird. Als ge
eignete Signalsequenzen für die Sekretion können bei
spielsweise verwendet werden die Signalsequenzen des
alpha-mating-Faktors, der alpha-Amylase, der Glucoamy
lase oder der Invertase.
Neben E. coli und Hefen können aber auch zahlreiche
andere pro- und eukaryontische Expressions-/Sekretions-
Systeme für die Herstellung von rek. Aprotinin-Varianten
verwendet werden, wie z. B. Bacilli, Staphylococci oder
Aspergilli.
Wie die o. a. Beispiele zeigen, ist die Expression von
Aprotinin-Muteinen in verschiedenen pro- und eukaryon
tischen Systemen Stand der Technik.
Im Hinblick auf eine großtechnische Herstellung ist es
dabei vorteilhaft, die Aprotinin-Varianten nicht in
einer intrazellulär akkumulierten Form, sondern durch
Nutzung der systemeigenen Sekretionsmechanismen als
aktive Substanz ins Fermentationsmedium exportiert zu
erhalten.
Bei der Verwendung von Hefe-Systemen werden dazu gen
technisch an den N-Terminus der Aprotinin-Varianten
Signalsequenzen von sekretorischen Hefe-Proteinen, wie
z. B. der alpha-Amylase, der Glucoamylase, der Invertase
oder des alpha-mating-Faktors fusioniert.
Die enzymatische Abspaltung des Signalpeptids vom N-
Terminus der Aprotinin-Varianten erfolgt beim Membran
transfer durch ein Hefe-eigenes Enzym, das eine spezi
fische Spaltsequenz (am C-Terminus des Signalpeptids)
erkennt (s. Review-Artikel R. C. Das and J. L. Shultz,
Biotechn. Progress 3, 43-48, 1987).
Im Falle der in Hefen exprimierten rek. Aprotinin-Vari
anten mit der natürlichen N-terminalen Aminosäuresequenz
"Arg-Pro-Asp" hat sich jedoch gezeigt, daß durch eine
nicht korrekte Abspaltung der o. a. Signalpeptide das
sekretierte Material variable N-terminale Additionen von
Aminosäure der verschiedenen fusionierten Signalpeptide
aufweist. Ein einheitlich und korrekt prozessiertes, für
die Aufreinigung geeignetes Sekretionsprodukt tritt
nicht auf.
Die teilweise oder völlige Fehlprozessierung von Sekre
tionsprodukten ist in der Literatur auch für andere he
terologe Proteine beschrieben, die als Fusionsprodukte
mit Hefe-eigenen sekretorischen Signalsequenzen expri
miert werden (R. C. Das and J. L. Shultz, Biotechn.
Progress 3, 43-48, 1987; P. J. Barr et al., J. Biol.
Chem. 263, 16471-16478, 1988).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß gentechnisch
veränderte Aprotinin-Varianten, die beispielsweise eine
Deletion der Aminosäure Prolin in Pos. 2 oder die eine
N-terminale Addition von Ala-(-2)-Gln-(-1) aufweisen,
in Hefe zu einem hohen Prozentsatz korrekt prozessiert
werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft also rek. Aprotinin
mit einer Deletion der Aminosäure Prolin in Position 2
oder einer Addition von Alanin-(-2)-Glutamin-(-1). Das
Aprotinin kann humanen oder tierischen Ursprungs sein.
Ganz besonders bevorzugt sind Aprotinin-Varianten aus
der Gruppe
Des Pro-2-Val-15-Leu-17,
Des Pro-2-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15.
Des Pro-2-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Arznei
mittel enthaltend eines oder mehrere der oben beschrie
benen Aprotinine.
Bevorzugt sind Aprotinine die zusätzlich zu den oben
genannten Austauschen weitere Austausche in einer oder
mehreren der Positionen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
34, 36, 37, 38, 39 und 52 aufweisen. Näheres über die
Austausche und die Aminosäuren die in den jeweiligen
Positionen stehen können ist den Europäischen Patentan
meldungen EP 238 993, 297 362 bzw. 307 592 zu ent
nehmen.
In den nachfolgenden Beispielen wird die gentechnische
Konstruktion von rek. Aprotinin-Muteinen beschrieben,
die gegenüber dem natürlichen Aprotinin veränderte N-
terminale Aminosäuresequenzen aufweisen. Desweiteren
wird beispielhaft die Expression dieser Aprotinin-
Muteine in Hefe als Fusionsprodukt mit der alpha-mating-
Faktor-Prä-Pro-Sequenz sowie die Aufreinigung der pro
zessierten Sekretionsprodukte, beschrieben. Die über
wiegend einheitliche N-terminale Prozessierung der iso
lierten Aprotinin-Varianten und deren Hemmeigenschaften
werden ebenfalls gezeigt.
Die Enzyme für molekulargenetische Experimente wurden
von Boehringer Mannheim (BRD), Gibco-BRL (USA) und
Pharmacia (Schweden) bezogen.
Die Standardtechniken für molekulargenetische Experi
mente, wie z. B. Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli,
Isolierung und Ligierung von DNA-Fragmenten für Klonie
rungsexperimente mit verschiedenen Enzymen sind be
schrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor (1982).
Die für die Herstellung der Aprotinin-Varianten be
nötigten DNA-Blöcke bzw. DNA-Primer (für gezielte
Mutagenese) wurden mit dem DNA-Synthesizer 380 A
der Fa. Applied Biosystems hergestellt. Die Reinigung
der entschützten DNA-Oligonukleotide erfolgte routine
mäßig über denaturierende Polyacrylamid-Gelelektropho
rese oder als Tritylderivate mittels Hochdruck-Flüs
sigkeitschromatographie (HPLC).
Die gezielte Mutagenese von spezifischen Aminosäure
codons oder Genabschnitten erfolgt nach der Methode von
Eckstein (J. W. Taylor, J. Ott und F. Eckstein, Nucl.
Acids Res. 13, 8764-8785, 1985) unter Verwendung des
Mutagenese-Kits der Fa. Amersham-Buchler (Best.-Nr. RPN.
2322).
Zur Kontrolle der DNA-Sequenzen von Gen- und Vektor
konstruktionen wurde einzelsträngige, in M13-Vektoren
subklonierte DNA nach der Methode von Sanger sequenziert
(F. Sanger et. al., PNAS 74, 5463-5467, 1977). Doppel
strängige DNA wurde nach der Methode von M. Hattori und
Y. Sakahi, Anal. Biochem. 152, 232-238, 1986) sequen
ziert.
Es wurden 100 ml einer Hefezellsuspension des Stamms
SC106 (MAT-alpha, hom3, ga12, his6, ura3; Stamm S2207A,
Yeast Genetics Stock Center, University of California
Berkeley, Ca 94720, USA) mit einer Zellkonzentration
von 2×10⁷ ml abzentrifugiert; das Zellsediment wurde
einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris×HCl, pH 7,5, 1 mM
EDTA) und dann mit 5 ml LiA-Puffer (0,1 M Lithium-
Acetat in PE-Puffer) gewaschen. Die Zellen wurden dann
in 1 ml LiA-Puffer suspendiert und 1 Stunde bei 30°C
inkubiert.
Zu 0,1 ml Zellsuspension wurden 10 µl der Plasmidlösung
(1-5 µg DNA) und 15 µl einer Carrier-DNA (denaturierte
DNA aus Heringssperma, 3 mg/ml) gegeben. Nach einer In
kubation für 30 min bei 30°C wurden 0,7 ml Polypropylen
glykol (40% Polypropylenglykol 3350 in LiA-Puffer) zu
gegeben und weitere 60 min bei 30°C inkubiert. Die
Zellen wurden danach einem Hitzeschock unterworfen
(5 min, 42°C) und anschließend 4 sec in einer Eppendorf-
Mikrofuge abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde zweimal
mit jeweils 0,5 ml TE-Puffer gewaschen; die Zellen
wurden dann in 0,1 ml TE-Puffer suspendiert und auf
Selektiv-Nährboden ausplattiert. Transformanden wurden
nach 3 Tagen Inkubation bei 30°C erhalten.
Transformanden wurden in SD-Medium (0,67% Yeast
Nitrogen-Base ohne Aminosäuren, 2% D-Glucose) supple
mentiert mit Threonin, Methionin und Histidin (jeweils
20 mg/Ltr.) bei 30°C kultiviert. Nach Erreichen einer
ausreichenden Zelldichte (i. d. R. 5×10⁹ Zellen/ml)
wurden die Zellen abzentrifugiert und die Trypsin- oder
Elastase-hemmende Aktivität im Kulturüberstand gemessen.
Es wurden folgende Medien verwendet:
Die Komponenten wurden im entionisiertem Wasser gelöst,
der pH-Wert wurde auf 5,5 eingestellt. Die Nährlösungen
wurden für 20 min bei 121°C sterilisiert. Glucose wurde
in 1/5 des notwendigen Volumens an entionisiertem Wasser
gelöst, getrennt sterilisiert und nach dem Abkühlen mit
der Nährlösung vereinigt.
Die Hefe-Transformanden wurden auf SD-Platten (Medium
SD + 2% Agar) bis zu 4 Wochen im Kühlschrank gehalten.
Die Langzeitlagerung erfolgt in flüssigem Stickstoff.
Vorkulturen wurden in Nährlösung SD2 im 1-Ltr. Schüttel
kolben (Füllvolumen: 100 ml) hergestellt. Die Kolben
wurden mit einer Einzelkolonie von der SD-Stammplatte
beimpft und für 2-3 Tage bei 28°C auf einer Schüttel
maschine bei 280 Upm inkubiert (Schüttelkreisdurch
messer: 2,5 oder 5,0 cm).
10-Ltr.-Fermenter wurden mit dem Zellsediment aus
1,0-Ltr.-Vorkultur suspendiert - in etwa 200 ml Vor
kulturmedium - beimpft. Die Fermentationsbedingungen
waren: Nährlösung SC6, 28°C, Rührerdrehzahl 600 Upm,
Belüftungsrate 0,5 vvm, pH-Kontrolle mit 2,5 N NaOH und
2,5 N H₂SO₄.
Die Kulturen wurden kontinuierlich mit Glucose und
einmal täglich mit Difco-Hefeextrakt gefüttert.
500 g Glucose in einem Gesamtvolumen von 1000 ml; Beginn
der Fütterung 4 Std. nach Beimpfung mit einer Rate von
0,02 ml/Ltr. x min nach 10-20 Std. Erhöhung auf
0,1 ml/Ltr. x min.
Die Zufütterungsrate von Glucose wurde so gewählt, daß
der Respirationsquotient nicht wesentlich über 1 stieg.
Difco-Hefeextrakt: Es wurde einmal täglich Hefeextrakt
in einer Menge von 5 g/Ltr. zugegeben. Der Hefeextrakt
wurde als Suspension in entionisiertem Wasser herge
stellt.
Glucose- und Hefeextraktlösungen wurden bei 121°C für
20 min. sterilisiert.
Nach einer Fermentationsdauer von 96 Std. wurde unter
den angegebenen Bedingungen ein Zelltrockengewicht von
ca. 30 g/Ltr. erzielt. Die erzielte Produktausbeute lag
bei 6 g/Ltr.
Proteine wurden üblicherweise mit SDS-Polyacrylamid-Gel
elektrophorese (Laemmli, Nature 277, 680, 1970) und
Färbung mit Coomassie Brilliant Blau nachgewiesen.
Etwa 1 nMol Protein wurde in Gegenwart von 200 µl 6 M
HCl, 0,05% β-Mercaptoethanol unter Vakuum bei 110°C
22 h inkubiert. Die Hydrolysate wurden getrocknet, in
150 µl 0,2 M Natrium-Citratpuffer pH 2,2 gelöst und
filtriert. Die Aminosäureanalyse wurde an einem Bio
tronic LC 5000 Aminosäureanalysator mit Fluoreszenz-
Detektor und Shimadzu C-R2AX-Integrator durchgeführt.
Die Aminosäuren wurden nach Reaktion mit o-Phthaldial
dehyd entsprechend der Literatur quantifiziert (Benson
& Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 619, 1975).
1-2 nMol Protein wurde nach Lösen in 30 µl Trifluor
essigsäure auf Polybren-behandelte Glasfaserfilter auf
gebracht und im Gasphasensequenator (Applied Biosystems)
nach Hewick et al., J. Biol. Chem. 256, 7990, 1981)
sequenziert. Phenylthiohydantoin-Derivate wurden mit
Hilfe einer Cyano-HPLC-Säule (DuPont) wie bei Beyreuther
et al., Modern Methods in Protein Chemistry, 303-325,
Walter de Gruyter, Berlin (1983) beschrieben mit Hilfe
eines Waters HPLC-Systems separiert und analysiert.
Die Trypsinaktivität wurde nach Geiger und Fritz Methods
of Enzymatic Analysis, Vol. V 3rd. ed., Bergmeyer (ed),
Verlag Chemie, Weinheim (1984), p. 121 mit Benzoyl-L-
arginin-p-nitroanilid als Substrat bestimmt. Das freige
setzte p-Nitroanilin wurde spektrophometrisch bei 405 nm
gemessen. Enzym und Inhibitor wurden vor der Zugabe des
Substrats 15 min vorinkubiert.
Humane Leukozyten-Elastase kam von Elastin Products
Company, Inc. P. O. Box 147, Pacific, Miss, 63069/USA.
Als Substrat wurde MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (Bachem,
Bubendorf/Schweiz) verwendet. Die Testbedingungen sind
in Tabelle 3 angegeben. Allgemein wurden die Inhibitor
proben nach Verdünnung mit Testpuffer und Zugabe von
Substrat (gelöst in DMSO in einer Konzentration von
0,1 M und mit Puffer auf die Konzentration der Stamm
lösung gebracht) gestartet und die Freisetzung von p-
Nitroanilin aus dem Substrat bei 405 nm kontinuierlich
verfolgt. 100%-Werte wurden in entsprechenden Tests
ohne Inhibitoren bestimmt. Die Hemmung (in Prozent) wurde
aus folgender Gleichung errechnet:
Tabelle 3 | |
Bedingungen des Elastase-Hemmtests (Nakjima et al., J. Biol. Chem. 254, 4027, 1979) | |
Puffer | |
0,2 M Tris/HCl, pH 8,0 + 0,1% Tween 80 | |
Gesamtvolumen nach Substratzugabe | 0,65 ml |
Enzymmenge/Test | 50 ng |
Präinkubationszeit bei Raumtemperatur | 30 min |
Substrat | MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA |
Stocklösung | 0,065 M |
Menge/Test | 0,1 ml |
Testtemperatur | 30°C |
Für die Klonierung von Aprotinin-Muteinen in Hefe wurde
ein Derivat des E. coli-Hefe-Shuttle-Vektors pMT 15
(Abb. 1) verwendet.
Der Vektor pMT 15 enthält das Ampicillin-Resistenz-Gen
als selektiven Marker für E. coli und ein URA3-Genfrag
ment für Hefe. Für die Replikation in E. coli und Hefe
wurde der Col E1-Origin aus pBR 322 und ein DNA-Segment
der B-Form des 2 µ-Plasmids aus Hefe verwendet. Für die
Expression von heterologen Genen wurde der MAT 1-alpha-
Promotor und die Kodierungsregion für die N-terminale
Prä-Pro-Sequenz des alpha-Faktor-Vorläufer-Proteins in
Form eines Eco RI - Hind III-Fragments aus dem Plasmid
pCY 17 (Korjan und Herskowitz, Cell 30, 933, 1982)
eingebaut.
Downstream von der alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz enthält
der Vektor pMT 15 ein Bam HI-Sal I-Fragment des URA3-
Gens aus Hefe mit einer Transkriptions-Terminator-Funk
tion (Yarger et al., Mol. Cell. Biol. 8, 1095, 1986).
Das 235 bp PstI-Hind III-Fragment von pMT 15, das die
kodierende Region der alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz
trägt, wurde in den Vektor M13 mp18 kloniert und einer
gezielten Mutagenese unterworfen unter Verwendung des
Oligonukleotid-Primers
5′-GAA-GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3′.
Als Ergebnis der Mutagenese wurde das Serin-
Kodon in Pos. 81 der alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz von
TCT zu AGC geändert, wodurch eine neue Hind III-Restrik
tionsschnittstelle erzeugt wurde (Abb. 2). Mit dem ver
kürzten 213 bp PstI-Hind III-Fragment wurde in pMT 15
das 235 bp Pst I-Hind III-Fragment ersetzt. Das so modi
fizierte Plasmid wurde mit pS 580 bezeichnet; es enthält
als KEX2-Prozessierungsstelle die kodierende Sequenz für
Lys-Arg statt Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala (Abb. 3).
Zur Fusion mit der alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz in
pS 580 wurde ein synthetisches Val-15-Leu-17-Aprotinin-Gen
verwendet, das am 5′-Ende um die fünf letzten Codons
der alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz bis zur Hind-III-
Schnittstelle in pS 580 verlängert wurde (Abb. 4).
Das modifizierte Val-15-Leu-17-Aprotinin-Gen wurde in
die geöffnete Hind III-BamHI-Schnittstelle von pS 580
eingebaut. Auf diese Weise wurde das 3′-Ende der alpha-
Faktor-Prä-Pro-Sequenz mit der Lys-Arg-Prozessierungs
stelle rekonstituiert und eine Leserasterfusion mit dem
Val-15-Leu-17-Aprotinin-Gen erzeugt (Abb. 5).
Das pS 580-Derivat erhielt die Bezeichnung pS 604.
Zur Eliminierung der Aminosäure Prolin in Pos. 2 von
Val-15-Leu-17-Aprotinin wurde das am 5′-Ende mit der
Prä-Pro-Sequenz des alpha-Faktors fusionierte Aprotinin-
Mutein als Hind III-Bam-HI-Kasette aus pS 604 isoliert
und in dem Mutagenese-Vektor M13-mp18 kloniert.
Zur Deletion des Prolin-Codons in Pos. 2 wurde im
1. Mutagenesezyklus der folgende synthetische Muta
geneseprimer benutzt:
5′-AGC TTG GAT AAA AGA CGT GAC TTC TGC CTC GAG CCG CCG TAC ACT GGG CC-3′.
Die Deletion des Prolin-Codons in Pos. 2 des Val-15-Leu-17-
Aprotinin-Gens wurde durch DNA-Sequenzierung veri
fiziert.
Für die Konstruktion des DesPro2-Arg-15-Aprotinin-Gens
wurde das im M13-mp18-Mutagenese-Vektor klonierte
DesPro2-Val-15-Leu-17-Aprotinin-Gen einem zweiten
Mutagenese-Zyklus unterworfen.
Für den molekulargenetischen Austausch der Codon Pos. 15
und Pos. 17 wurde der folgende Mutagenese-Primer ver
wendet:
Der Austausch von Val-15 gegen Arg-15 und Leu-17 gegen
Arg-17 wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Anschließend wurden beide rek. Aprotinin-Muteine, wie
in Beispiel 1 beschrieben, durch Einbau in die Hind III-Bam
HI-Spaltstellen des Shuttle-Vektors pS 580 mit der
alpha-Faktor-Prä-Pro-Sequenz fusioniert. Die pS 580
Derivate erhielten die Bezeichnung pS 707 (enthält
DesPro2-Val-15-Leu-17-Aprotinin und pA 202 (enthält
DesPro2-Arg-15-Aprotinin).
Für die gentechnische Addition des Dipeptids Ala-Gln an
den N-Terminus der o. g. Aprotinin-Muteine wurden die in
dem M13-Mutagenese-Vektor klonierten Gene für DesPro2-
Val-15-Leu-17-Aprotinin und DesPro2-Arg-15-Aprotinin
einem weiteren Mutagenese-Zyklus unter Verwendung des
folgenden DNA-Primers unterworfen:
Die am 5′-Terminus modifizierte DNA-Sequenz der beiden
Aprotinin-Muteine wurde durch DNA-Sequenzierung bestä
tigt.
Die Klonierung des Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Apro
tinin-Gens und Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-Aprotinin-Gens in
den Hefe Shuttle-Vektor pS 580 erfolgte analog zu den
in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Die pS 580-Derivate mit den klonierten Aprotinin-Mutei
nen Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Aprotinin und
Ala(-2)-Gln- (-1)-Arg-15-Aprotinin erhielten die Be
zeichnung pS 744 und pA 204.
Entsprechend der oben beschriebenen Methode wurde der
Hefe-Stamm SC 106 mit den Plasmid-Vektoren pS 604,
pS 707, pA 202, pS 744 und pA 204 transformiert.
Die URA 3⁺-Hefe-Transformanden wurden isoliert und unter
Induktionsbedingungen (s. Methodenteil) kultiviert. Zur
Ausbeutemessung wurden die Kulturüberstände im Fall der
zu exprimierenden Aprotinin-Muteine mit Valin in Pos. 15
und Leucin in Pos. 17 auf Elastase-Hemmaktivität ge
prüft. Im Falle der zu exprimierenden Aprotinin-Muteine
mit Argin in Pos. 15 wurde der o. g. Trypsin-Hemmtest
durchgeführt. Anschließend wurden die im 10-Ltr.-Fer
menter sekretierten Expressionsprodukte der Aprotinin-
Muteine aufgereinigt und charakterisiert.
Fermentationsbrühen aus 10-Ltr.-Ansätzen wurden bei
9000 Upm abzentrifugiert (15-30 Minuten). Die Über
stände wurden über verschiedene Filter (8-0,2 µm)
filtriert, mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 7,5 mS
verdünnt und mit Zitronensäure auf pH 3 eingestellt. Die
so vorbehandelten Proben wurden mit 100-200 ml S-Se
pharose Fast Flow (Pharmacia) in 50 mM Natriumcitrat
pH 3 versetzt und 30-60 Minuten gerührt. Anschließend
wurde das Gel mit 1-5 Ltr. 50 mM Natriumcitrat pH 3,
50 mM TRIS HCl pH 9 und schließlich 20 mM Hepes pH 6 ge
waschen. Das gewaschene Gel wurde in eine geeignete
Säule überführt und am BIO-PILOT-System (Pharmacia) mit
einem Gradienten zwischen 0 und 1 M Natriumchlorid in
20 mM Hepes pH 6 eluiert und fraktioniert. Nach Bestim
mung der Hemmaktivität im Hemmtest mit humaner Leukozy
tenelastase bzw. Rindertrypsin wurden die entsprechenden
Fraktionen gesammelt und im Rotationsverdampfer einge
engt.
Dieses Material wurde weiter gereinigt durch Gelfiltra
tion an Sephadex G-50 superfine (Pharmacia) und Chroma
tographie an S-Sepharose Fast Flow bzw. S-Sepharose HP
oder Mono S (Pharmacia) in 20 mM Hepes pH 6. Von S-Se
pharose wurde mit einem Gradienten zwischen 0 und 1 M
NaCl eluiert. Fraktionen wurden durch Gelelektrophorese
und entsprechenden Hemmtests überprüft. Fraktionen mit
Hemmaktivität wurden gesammelt, gegen 0,1 M NH₄ HCO₃
dialysiert und gefriergetrocknet (Abb. 6).
Typischerweise wurden Ausbeuten von 20-40% bezogen
auf die im Fermentationsansatz vorhandene Menge an In
hibitoren erhalten.
Die Lyophilisate wurden zunächst durch Aminosäureanalyse
(Abb. 7) und N-terminale Sequenzierung (Applied Bio
systems Sequenator) charakterisiert (Abb. 8).
Im Falle des Val-15-Leu-17-Aprotinins wurde kein sekre
tiertes Material gefunden, das am N-Terminus dieser
Aprotinin-Variante korrekt gespalten war (korrekte
Prozessierung). Demgegenüber wurden die Aprotinin-
Varianten, die entweder die Deletion in Pos. 2 oder aber
die N-terminale Extension Ala(-2)-Gln(-1) aufweisen, zu
70-90% mit dem korrekt prozessierten N-Terminus ge
funden (Abb. 8 und 9).
Zusätzlich wurden die Hemmkinetiken mit humaner Leuko
zytenelastase bzw. Schweine-Pankreaskallikrein bestimmt
(Abb. 10). Dabei zeigte sich, daß die Veränderungen am
N-Terminus keinerlei Einfluß auf die Hemmeigenschaften
haben.
Abb. 1 Restriktionskarte des E. coli-Hefe-Shuttle-
Vektors pMT 15
Die für die Genexpression in Hefe essentiellen DNA-Signal-Sequenzen sind eingerahmt.
Die für die Genexpression in Hefe essentiellen DNA-Signal-Sequenzen sind eingerahmt.
Abb. 2 Gentechnische Einführung einer neuen Hind-III-
Schnittstelle in die Prä-Pro-alpha-Faktor-
Sequenz
Die Hind-III-Erkennungssequenz wurde erzeugt durch Austausch des Kodons für Serin (TCT zu AGC).
Die Hind-III-Erkennungssequenz wurde erzeugt durch Austausch des Kodons für Serin (TCT zu AGC).
Abb. 3 Konstruktionsschema des E. coli-Hefe-Shuttle-
Vektors pS 580.
Abb. 4 DNA-Sequenz des synthetischen Val-15-Leu-17-
Aprotinin-Gens mit der am 5′-Ende bis zur
Hind-III-Schnittstelle verlängerten DNA-
Sequenz des alpha-Faktor-Leaders (alpha-
Faktor-Prä-Pro-Sequenz)
Die Spaltstelle des KEX2-Hefe-Enzyms in der Aminosäuresequenz ist markiert.
Die Spaltstelle des KEX2-Hefe-Enzyms in der Aminosäuresequenz ist markiert.
Abb. 5 Konstruktionsschema des E. coli-Hefe-Shuttle-
Vektors pS 604.
Abb. 6 Flußschema der Reinigung von Aprotinin-Va
rianten aus S. cerevisiae-Fermentationsüber
ständen.
Abb. 7 Aminosäureanalysen einiger ausgewählter
DesPro-2- und Ala-(-2)-Gln-(-1)-Varianten.
Abb. 8 N-terminale Sequenzanalyse ausgewählter
DesPro-2- und Ala-(-2)-Gln-(1-)-Varianten.
Abb. 9 Prozessierung einiger DesPro-2- und Ala-(-2)-
Gln-(-1)-Varianten durch die KEX2-Protease.
Abb. 10 Inhibitorkonstanten der DesPro-2- und Ala-
(-2)-Gln(-1)-Varianten.
Claims (7)
1. Aprotinin mit einer Deletion der Aminosäure Prolin
in Pos. 2 oder einer Addition von Alanin-(-2)-
Glutamin-(1-).
2. Aprotinin gemäß Anspruch 1 humanen oder tierischen
Ursprungs.
3. Aprotinin gemäß den Ansprüchen 1 und 2 mit zusätz
lichen Variationen in einer oder mehreren der Posi
tionen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 36, 37,
38, 39 und 52.
4. Aprotinin-Varianten aus der Gruppe
DesPro-2-Val-15-Leu-17,
DesPro-2-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15.
DesPro-2-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15.
5. Arzneimittel enthaltend Aprotinin gemäß den
Ansprüchen 1 bis 4.
6. Verfahren zur Herstellung von Aprotinin-Varianten
gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß
mit einem geeigneten Vektor Hefen oder andere
niedere Eukaryonten transformiert werden, die
Transformanden kultiviert werden und die Aprotinin-
Varianten aus der Kulturbrühe gereinigt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der transformierte
und kultivierte niedere Eukaryont S. cerevisiae ist.
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8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |