HU213582B - Process for producing of recombinant aprotinin derivatives and pharmaceutical compositions thereof - Google Patents

Process for producing of recombinant aprotinin derivatives and pharmaceutical compositions thereof Download PDF

Info

Publication number
HU213582B
HU213582B HU905877A HU587790A HU213582B HU 213582 B HU213582 B HU 213582B HU 905877 A HU905877 A HU 905877A HU 587790 A HU587790 A HU 587790A HU 213582 B HU213582 B HU 213582B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
aprotinin
arg
ala
val
leu
Prior art date
Application number
HU905877A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
HUT62031A (en
HU905877D0 (en
Inventor
Rathindra Das
Juergen Ebbers
Dietrich Hoerlein
Michael Schedel
Original Assignee
Bayer Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Ag filed Critical Bayer Ag
Publication of HU905877D0 publication Critical patent/HU905877D0/hu
Publication of HUT62031A publication Critical patent/HUT62031A/hu
Publication of HU213582B publication Critical patent/HU213582B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás rekombináns aprotinin-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.
A találmány értelmében az adott fehéijeváltozatot transzformált élesztővel homogén processzív kiválasztási termék formájában állítjuk elő.
Az aprotinin egy jól ismert, 58 aminosavból álló fehérje, amely inhibitor hatást fejt ki a tripszinre, a kimotripszinre, a plazminra és a plazma-kallikreinre [H. Fritz és G. Wunderer: Drug. Rés. 33, 479—494 (1983); W. Gebhard, H. Tschesche és H. Fritz: Proteinase Inhibitors, Barrett und Salvesen kiadó, Elsevier Science Publ. BV 375-387 (1986)].
A szarvasmarha szervezetéből kinyert aprotinin a trazilol nevű gyógyszerkészítmény hatóanyaga, és különböző betegségek, így hiperfibrinolítikus vérzés és traumás haemorrhagiás sokk kezelésére alkalmas.
Ezenkívül, klinikai kísérletek azt mutatják, hogy a trazilol operációk során jelentős mértékben csökkenti a nyitott szív fibrinolízis és koaguláció által okozott vérveszteségét [W. van Oeveren és munkatársai: Ann. Thorac. Surg., 44, 640-645 (1987); D. Royston és munkatársai: Láncét II., 1289-1291, (1987); Β. P. Bistrup és munkatársai: Láncét I, 366-367 (1988)].
Kimutatták, hogy a félszintetikus úton előállított és a 15. helyzetű aminosav helyén lizin helyett más aminosavat tartalmazó aprotinin homológ az aprotinintól lényegesen eltérő hatásprofillal és fajlagossággal rendelkezik [4 595 647 számú USA-beli szabadalmi leírás; H. R. Wenzel és munkatársai: Chemistry of Peptides and Proteins, 3. kötet (1985)].
A félszintetikus aprotinin homológok néhány képviselője például erős inhibitor hatást fejt ki a hasnyálmirigyből és a leukocitákból származó elasztázra. A hatás alapján ezek az aprotinin homológok terápiás célból felhasználhatók az elasztáz fokozott kiválasztásával járó betegségek kezelésére, ilyen például az emfiszéma-képződés, az ARDS (Aduit Respiratory Distress Syndrom) és reumás artritisz.
A 15. helyzetben arginint tartalmazó aprotinin homológok az aprotininhez képest jóval erősebb inhibitor hatást fejtenek ki a véralvadási folyamatban résztvevő plazma-kallikreinre.
A szarvasmarha aprotinin félszintetikus átalakítása a tapasztalatok szerint csak csekély kitermeléssel valósítható meg. Nagy mennyiségű aprotinin homológok előállításához tehát szintetikus gének felhasználásával különböző géntermékek prokarióta mikroorganizmusban történő fermentatív előállítására van szükség [01 238 993 számú európai szabadalmi leírás, B. v. Wilcken-Bergmann és munkatársai: EMBO J., 5, 3219-3225 (1986)].
Rekombináns aprotinin-származékok K 12 E. coli törzsben történő előállításához olyan kifejezőrendszert alkalmaznak, amely az aprotinin mutánst intracellulárisan képzett fúziós fehérjeként megfelelő fúziós partnerrel, például az MS 2 replikáz N-terminális peptidrészével intracelluláris zárvány formájában halmozza fel [E. A. Auerswald és munkatársai:
Bioi. Chem. Hoppé Seyler, 369, 27-35 (1988)].
Emellett felhasználhatók olyan E. coli kifejező- és kiválasztórendszerek is, amelyek az aprotinin mutánst megfelelő kiválasztási szignálpeptid génszekvenciájával, például OmpA szignálszekvenciával vagy phoA szignálszekvenciával egyesítik, és így a gátló hatással rendelkező aprotinin-származékot a baktériumsejt periplazmájából kiválasztják [Dr. W. Bruns, Bayer AG személyes közlése, C. B. Marks és munktársai: J. Bioi. Chem., 261, 7115-7118, (1986)].
Az eukarióta rendszerek közül elsősorban az élesztő kifejezőrendszerek alkalmasak rekombináns aprotinin-származékok géntechnológiai előállítására, amelyeknél a géntermék intracellulárisan felhalmozódik, vagy megfelelő kiválasztási szignálszekvenciával fuzionálva az élesztőből a kiválasztási utakon keresztül eltávozik, és membrán proteázzal végzett hasítás után gátló hatással rendelkező anyagként a tápközegben megtalálható. A kiválasztáshoz szignálszekvenciaként alkalmazható az amating-faktor, az α-amiláz, a glukoamiláz vagy az invertáz szignálszekvenciája.
E. coli és élesztő mellett számos más pro- és eukarióta kifejező és kiválasztó rendszer felhasználható a rekombináns aprotinin-származékok előállítására, ilyenek például a Bacillus, Staphylococcus vagy Aspergillus rendszerek.
Mint a fenti példák is mutatják, az aprotinin mutánsok különböző pro- és eukarióta rendszerekben történő kifejezése a technika állásához tartozik.
Az ipari előállítás szempontjából előnyösebb, ha az aprotinin-származék nem intracellulárisan halmozódik fel, hanem a rendszerhez tartozó kiválasztási mechanizmusok felhasználásával aktív anyagként a tápközegbe juttatjuk.
Élesztő rendszerek alkalmazása esetén ehhez az aprotinin-származék N-terminális részéhez kiválasztási élesztő fehérjék, például α-amiláz, glukoamiláz, invertáz vagy α-mating-faktor szignálszekvenciáját kapcsolják.
Az aprotinin-származék N-terminális részéhez kapcsolódó szignálpeptid enzimatikus lehasítását a membrán szállítás során olyan élesztőben működőképes enzimmel végzik, amely speciális hasítószekvenciát (a szignálpeptid C-terminális részénél) ismer fel [R. C. Das és J. L. Schultz: Biotechn. Progress, 3,43X8 (1987)].
Az élesztőben kifejezett és természetes Arg-Pro-Asp N-terminális aminosav szekvenciával rendelkező rekombináns aprotinin-származékoknál azonban azt tapasztalták, hogy a szignálpeptid pontatlan lehasítása miatt az aprotinin N-terminális részéhez különböző kapcsolt szignálpeptidekből származó aminosavak kapcsolódnak. Ennek következtében egységes és pontosan levezetett, további tisztításra alkalmas kiválasztási termék nem nyerhető.
A kiválasztási termékkel kapcsolatban jelentkező részlegesen vagy teljesen hibás folyamat az irodalom szerint más heterológ fehérjéknél is előfordul, amelyek fúziós termékként élesztőben működőképes kiválasztási szignálszekvenciával lettek kifejezve [R. C. Das és J. L. Schultz: Biotechn. Progress, 3,43X8 (1987); P. J. Barr és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 16471-16478 (1988)].
HU 213 582 Β
Meglepő módon azt találtuk, hogy a géntechnológiailag módosított aprotinin-származékok, például a megfelelő pozíciókban egy vagy több változtatást tartalmazó aprotininszármazékok élesztőben nagy százalékban pontosan kifejezhetők.
A találmány tehát eljárás N-terminálisan módosított aprotinin vagy a 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 36, 37, 38, 39, 41 és 52 aminosav-helyeken egy vagy több változtatást tartalmazó aprotinin-származék előállítására oly módon, hogy az aprotinint vagy a tárgyi körben meghatározott aprotinin-származékot kódoló DNS szekvenciában a 2-es helyzetű prolin kódját kiiktatjuk vagy a DNS szekvenciához egy alanin(-2)-glutamin(-l) szakaszt kódoló DNS-szakaszt addicionálunk, az így módosított DNS-szekvenciát szekréciós szignálszekvenciával fuzionáljuk, és élesztő kifejező rendszerben kifejezzük.
Az aprotinin lehet humán vagy állati eredetű.
Különösen előnyösek a következő aprotinin-származékok:
DesPro-2-Val-l 5-Leu-17,
DesPro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19, Ala(-2)-Gln(- 1)-Val-15-Leu-17, Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19, DesPro-2-Arg-15,
DesPro-2-Arg-15-Ala-17, Ala(-2)-Gln(-l)-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15 -Alá-17.
A találmány kiterjed a fenti aprotinin-származékot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására is.
Ezeket a cseréket és az adott pozíciókban található aminosavakat részletesen ismertetik a 238 993,297 362 és 307 592 számú európai közrebocsátási iratok.
A következő példákban részletesen leírjuk a természetes aprotininhez képest megváltoztatott N-terminális aminosav-szekvenciával rendelkező rekombináns aprotinin mutánsok géntechnológiai előállítását. Ezenkívül, példaszerűen bemutatjuk a fenti aprotinin mutánsok élesztőben α-mating-faktor-pre-pro-szekvenciával képzett fúziós termék formájában történő kifejezését, valamint a kapott kiválasztási termék tisztítását. Szintén bemutatjuk az izolált aprotinin-származékok egységes Nterminális feldolgozását és a termékek gátló tulajdonságait.
A géntechnológiai kifejezéshez alkalmazott enzimek a Boehringer Mannheim (NSZK), Gibco-BRL (USA) és a Pharmacia (Svédország) cégeknél szerezhetők be.
Az általánosan alkalmazott lépéseket, például a plazmid-DNS E. coliból történő izolálását, a klónozáshoz alkalmazott DNS ffagmensek különböző enzimekkel végzett izolálását és ligálását Maniatis és munkatársai ismertetik [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)].
Az aprotinin-származékok előállításához szükséges DNS blokkokat, illetve (a célzott mutációhoz alkalmas) DNS prímért DNA-Synthesizer 380 A berendezéssel (Applied Biosystems) állítjuk elő. A védőcsoportoktól megszabadított DNS-oligonukleotid tisztítását a szokásos denaturált poliakrilamid gélelektroforézissel vagy tritil-származékként nagynyomású folyadékkromatográfiásán (HPLC) végezzük.
A speciális aminosav kodonok vagy génszakaszok célzott mutációját Eckstein módszerével [J. W. Taylor, J. Ott és F. Eckstein: Nucl. Acids Rés., 13, 8764-8785 (1985)] az Amersham-Buchler cég mutációs készletével (megrendelési szám: RPN 2322) végezzük.
A gén- és vektorszerkezetek DNS-szekvenciájának ellenőrzéséhez egyszálú, M13-vektorba szubklónozott DNS-t szekvenálunk Sanger módszerével [F. Sanger és munkatársai: PNAS, 74, 5463-5467 (1977)]. A kettős szálú DNS-t M.Hattori és Y. Sakahi módszerével [Anal. Biochem. 152, 232-238 (1986)] szekvenáljuk.
Az S. cerevisiae transzformálásához 100 ml 2* 107/ml sejtkoncentrációjú SCI06 élesztő sejtszuszpenziót (Mat-a, hom3, gal2, his6, ura3; S2207A törzs, Yeast Genetics Stock Center, University of Califomia Berkeley CA 94720, USA) lecentrifugáljuk, a sejtüledéket 5 ml TE-pufferrel (10 mmól/1 TrisxHCl, pH = 7,5, 1 mmól/1 EDTA), majd 5 ml Lia-pufferrel (0,1 mól/1 lítium-acetát TE-pufferben) mossuk. A sejteket 1 ml LiA-pufferben szuszpendáljuk, és 1 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
0,1 ml sejtszuszpenzióhoz 10 μΐ plazmid-oldatot (1-5 pg DNS) és 15 μΐ hordozó DNS-t (denaturált DNS hering spermából, 3 mg/ml) adunk. 30 °C hőmérsékleten 30 percen keresztül végzett inkubálás után 0,7 ml polipropilénglikolt (40 tömeg% polipropilénglikol 3350 LiA-pufferben) adunk hozzá, és 30 °C hőmérsékleten további 60 percen keresztül inkubáljuk. A sejteket ezután hőkezelésnek (42 °C, 5 perc) vetjük alá, majd 4 másodpercen keresztül Eppendorf mikrocentrifugában centrifugáljuk. A sejtpelletet 2x0,5 ml TE-pufferben mossuk, majd 0,1 ml TE-pufferben szuszpendáljuk, és szelektív tápközegre visszük. A transzformánsokat 30 °C hőmérsékleten 3 napig végzett inkubálás után kapjuk.
A transzformánsok kifejlesztéséhez és a kiválasztási termékek analíziséhez a transzformánsokat egyenként 20 mg/1 treoninnal, metioninnal és hisztidinnel kiegészített SD közegben (0,67 tömeg% élesztő nitrogénbázis aminosav nélkül, 2 tömeg% D-glukóz) 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Megfelelő sejtsűrűség (5χ 109 sejt/ml) elérése után a sejteket lecentrifugáljuk, és méljük a felülúszó tripszin vagy elasztáz gátló hatását. A rekombináns aprotinin-származékok 10 literes méretben élesztő transzformánsok fermentálásával történő kifejezéséhez a következő közegeket alkalmazzuk:
SD:Bacto élesztő nitrogénbázis 6,7 g/1 glukóz 20,0 g/1
SD2:Bacto élesztő nitrogénbázis 6,7 g/1 glukóz 20,0 g/1
KH2PO4 6,7 g/1
SC6:Difco élesztő extraktum 20,0 g/1
KH2PO4 1,4 g/1 (NH4) 2SO4 2,0 g/1
MgSO4x7H2O 0,25 g/1
Antifoam SÁG 471 habzásgátló 0,1 ml/1 (Union Carbide)
A komponenseket ionmentesített vízben oldjuk, pH = 5,5 értékre állítjuk, a tápoldatokat 121 °C hőmér3
HU 213 582 Β sékleten 20 percen keresztül sterilizáljuk. A glukózt az ionmentesített víz egyötöd térfogatában oldjuk, külön sterilizáljuk, és lehűlés után a tápoldattal egyesítjük.
A törzstenyészetként szolgáló élesztő transzformánsokat SD lemezen (SD közeg+2 tömeg% agar) 4 héten keresztül hűtőszekrényben, ennél hosszabb ideig folyékony nitrogénben tároljuk.
Az előtenyészetett SD 2 tápoldatban 1 literes rázólombikban (töltési térfogat 100 ml) állítjuk elő. A lombikokat az SD törzs lemezről származó egyes telepekkel oltjuk be, és 2-3 napon keresztül 28 °C hőmérsékleten rázóberendezésben 280 fordulat/perc értéken inkubáljuk (rázókör átmérője: 2,5-5,0 cm).
A 10 literes fermentációhoz egy 10 liter térfogatú fermentort 1,0 liter előtenyészetből származó sejtüledék 200 ml előtenyésztéshez alkalmazott tápközegben szuszpendálunk. A fermentáció körülményei: tápközeg SC6, 28 °C, keverő fordulatszáma 600 fordulat/perc, levegőztetési arány 0,5 wm, pH ellenőrzés 2,5 n nátrium-hidroxiddal és 2,5 n kénsavval.
A tenyészetet folyamatosan glukózzal és naponta egyszer Difco élesztő extraktummal tápláljuk.
A glukózos tápláláshoz 500 g glukózt alkalmazunk 1000 ml ossz térfogatban. Az adagolás kezdete 4 órával a beoltás után 0,02 ml/lxperc arányban, 10-20 óra elteltével ezt 0,1 ml/lxperc értékre emeljük. A glukóz adagolást aszerint választottuk meg, hogy a lélegeztetési együttható ne lépje túl lényegesen az 1 értéket.
Naponta egyszer Difco élesztő extraktumot adunk g/1 mennyiségben. Az élesztő extraktumot ionmentesített vízben szuszpendálva adagoljuk.
A glukóz és élesztő extraktum oldatot 121 °C hőmérsékleten 20 percen keresztül sterilizáljuk.
órás fermentálás után mintegy 30 g/1 száraz sejttömeget kapunk. A termékre vonatkoztatott kitermelés g/1. A fehérjéket a szokásos módon SDS poliakrilamid gélelektroforézissel [Laemmli, Natúré 277, 680 (1970)] és Coomassie Brilliant Blau színezékkel történő színezéssel mutatjuk ki. Az aminosav analízishez mintegy 1 nmól fehérjét 200 pl 6 mól/1 sósav és 0,05 tömeg% β-merkapto-etanol jelenlétében 22 órán keresztül 110°C hőmérsékleten vákuumban inkubáljuk. A hidrolizátumot szárítjuk, 150 μΐ 0,2 mól/1 nátrium-citrát pufferben (pH = 2,2) oldjuk, és szűrjük. Az aminosav analízist Biotronic LC 5000 aminosav analizátorral, fluoreszcensz detektorral és Shimadzu C-R2AX integrátorral végezzük. Az aminosavakat kvantitative o-ftáldialdehiddel reagáltatva határozzuk meg [Bensőn és Hare: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 619 (1975)].
Az aminosav szekvenáláshoz 1-2 nmól fehéqét 30 μΐ trifluor-ecetsavban oldunk, és polibrénnel kezelt üvegszálas szűrőre visszük, és gázfázisú szekvenátorban (Applied Biosystems) Hewick és munkatársai módszerével [J. Bioi. Chem., 256, 7990 (1981)] szekvenáljuk. A fenil-tiohidantoinszármazékot ciano-HPLC oszlop (DuPont) segítségével Beyreuther és munkatársai módszerével [Modem Methods in Protein Chemistry, 303-325, Walter de Gruyter, Berlin (1983)] Waters-féle HPLC rendszerben választjuk el és analizáljuk.
gátlás (%) = 100 x 25
A tripszin-aktivitást Geiger és Fritz módszerével [Methods of Enzymatic Analysis, V. kötet, 3. kiadás, Bergmeyer Verlag Chemie, Weinheim, 121. oldal (1984)] benzoil-L-arginin-p-nitroanilid szubsztráton ha5 tározzuk meg. A kiválasztott p-nitroanilint spektrofotometriásán 405 nm-en mérjük. Az enzimet és az inhibitort a szubsztrátum hozzáadása előtt 15 percen keresztül előinkubáljuk.
Az elasztáz gátlás vizsgálatához humán leukocita elasztázt alkalmazunk (Elastin Products Company, Inc., USA). Szubsztrátumként MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNS-t (Bachem, Bubendorf, Svájc) alkalmazunk. A vizsgálati körülményeket a 3. táblázat foglalja össze. Az inhibitor mintát tesztpufferral történő hígítás és szubszt15 rátum (0,1 mól/1 koncentrációban DMSO-ban oldva, pufferrel a törzsoldat koncentrációjára állítva) hozzáadása után indítjuk, és a p-nitroanilin felszabadulását 405 nm-en folyamatosan követjük. A 100%-os értéket inhibitor nélkül végzett azonos vizsgálattal állapítjuk meg. A százalékos gátlást az alábbi egyenlettel számoljuk:
inhibitor jelenlétében mért OD inhibitor nélkül mért OD puffer: 0,2 mól/1 Tris/HCl, pH = 8,0 + 0,1 tömeg Tween 80 a szubsztrátum adagolás utáni össztérfogat: 0,65 ml enzimmenyiség kísérletenként: 50 ng szobahőmérsékleten végzett előinkubálás: 30 perc szubsztrátum: MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNS törzsoldat: 0,065 mól/1 mennyiség kísérletenként: 0,1 ml vizsgálati hőmérséklet: 30 °C.
3. táblázat: Az elasztáz gátlás vizsgálatának körülményei [Nakajima és munkatársai: J.Biol.Chem. 254, 4027 (1979)].
1. példa
Val-15-Leu-l 7-, DesPro-2- Val-15-Leu-l 7-, DesPro-2-Arg-15-,
DesPro-2-Val-l5-Leu-l7-Arg-19- és DesPro-2-Arg-l 5-Ala-l 7-aprotinin génjének előállítása és klónozása
Az aprotinin mutánsok élesztőben történő klónozásához az E. coli élesztő Shuttle vektor pMT 15 származékát (1. ábra) alkalmazzuk.
A pMT 15 vektor E. colira szelektív markerként ampicillin rezisztenciáért felelős gént, élesztő vonatkozásában URA3 génfragmenst tartalmaz. Az E. coliban és élesztőben történő replikációhoz pBR322-ből származó Col El-origót és élesztőből származó 2 μ-plazmidB-formájának DNS-szegmensét alkalmazzuk. A heterológ gé55 nek kifejezéséhez MÁT 1-a promotert és pCY 17 plazmidból [Kórján és Herskowitz: Cell, 30,933 (1982)] származó EcoRI-HindlII fragmens formájában az a-faktor előprotein N-terminális pre-pro-szekvenciáját építjük be.
Az α-faktor pre-pro-szekvenciától lefelé a pMT 15
HU 213 582 Β vektor az élesztőből származó és átírástermináló funkcióval rendelkező URA3-gén BamHI-Sall fragmensét tartalmazza [Yarger és munkatársai: Mól. Cell. Bioi., 8, 1095 (1986)].
A pMT 15 235 bp Pstl-HindlII fragmensét, amely az α-faktor pre-pro-szekvencia kódoló szakaszát hordozza, M13 mpl8 vektorba klónozzuk, és 5'-GAA-GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3' oligonukleotid primer alkalmazásával célzott mutációnak vetjük alá. A mutáció eredményeként az α-faktor pre-pro-szekvencia 81 helyzetű szerin kodonját TCT-röl AGC-re változtatjuk, miáltal új HindlII hasítóhelyet kapunk (2. ábra). A rövidített 213 bp Pstl-HindlII fragmenssel a pMT 15-ben a 235 bp Pstl-HindlII fragmenst helyettesítjük. Az így módosított plazmid a pS 580 jelet kapta, amely KEX2 feldolgozóhelyként a Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala helyett Lys-Arg kódolószakaszt tartalmaz (3. ábra).
Az α-faktor pre-pro-szekvencia pS 580-ban történő füziój ához Val-15-Leu-17-aprotinin gén szintetikus változatát alkalmazzuk, amely az 5' végen az α-faktor pre-pro-szekvencia utolsó öt kodonjával és a pS 580 HindlII hasítóhelyével van meghosszabítva (4. ábra).
A módosított Val-15-Leu-17-aprotinin gént apS 580 nyitott HindlII-Bam Hl hasítóhelyére építjük be. Ily módon visszaállítjuk az α-faktor pre-pro-szekvencia Lys-Arg feldolgozóhellyel ellátott 3' végét, és a Val-15-Leu-17-aprotinin génnel egy Leseraster fúziót kapunk (5. ábra).
A pS 580 származék a pS 604 számot kapta.
A Val-15-Leu-17-aprotinin 2-es helyzetű prolinjának kiiktatásához az 5' végén az α-faktor pre-pro-szekvenciájával fuzionált aprotinin mutánst a pS 604-ből HindlII-BamHI kazettaként izoláljuk, és M13 mpl8 mutációs vektorba klónozzuk.
A 2-es helyzetű prolin kodon kiiktatásához az egyes mutációs ciklusban a következő szintetikus mutációs prímért alkalmazzuk:
5'-AGC TTC GAT AAA AGA CGT GAC TTC TGC CTC GAG CCG CCG TAC ACT GGG CC-3'
A Val-15-Leu-17-aprotinin génből a 2-es helyzetű prolin kodon kiiktatását DMS szekvenálással ellenőrizzük.
A DesPro-2-Arg-15-aprotinin gén előállításához az Ml3 mpl8 mutációs vektorba klónozott DesPro-2-Val-15-Leu-17-aprotinin génen egy második mutációs ciklust hajtunk végre.
A 15 és 17 helyzetű kodon géntechnológiai kicseréléséhez a következő mutációs prímért alkalmazzuk:
5'-T GGG CCC TGC AGA GCT CGT ATC ATC CGT T-3’
Arg Arg
A Val-15 Arg-15-re és a Leu-17 Arg-17-re történő lecserélését DNS szekvenálással ellenőrizzük.
Ezután mindkét rekombináns aprotinin mutánst a pS 580 Shuttle vektor HindlII-BamHI hasítóhelyére történő beépítéssel az α-faktorpre-pro-szekvenciával egyesítjük. A pS 580 származék a pS 707 (DesPro-2-Val-15-Leu-17-aprotinint tartalmaz) és pA 202 (DesPro-2-Arg-15-aprotinint tartalmaz) nevet kapta.
A DesPro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19-aprotinin (pS 773 vektor) és a DesPro-2-Arg-15-Alá-17-aprotinin (pA 206 vektor) előállítását és klónozását a fent ismertetett módon végezzük.
2. példa
Ala(-2) Gln(-1)-Val-15-Leu-17-,
Ala(-2)-Gln(-l)-Arg-15-,Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19- ésAla(-2)-G!n(-l)-Arg-15-Ala-l 7-aprotinin génjének előállítása
Az Ala-Gln dipeptidnek fent említett aprotinin mutánsokhoz N-terminálisan történő hozzákapcsolásához az Ml3 mutációs vektorba klónozott DesPro-2-Val-15-Leu-17-aprotinin és DesPro-2-Arg-15-aprotinin géneket egy újabb mutációs ciklusnak vetjük alá, amelyhez a következő DNS prímért alkalmazzuk:
5'-AGC TTG GAT AAA AGA GCT CAA CGT CCG GAC TTC TGC C-3'
Alá Gin
A két aprotinin mutáns 5'terminális részén módosított DNS szekvenciáját DNS szekvenálással ellenőrizzük.
Az Ala(-2)-Gln(-l)-Val-l 5-Leu-17-aprotinin gén és az Ala(-2)-Gln(-l)-Arg-15-aprotinin gén élesztő Shuttle vektor pS 580-ba történő klónozását az 1. példában leírt módon végezzük.
A klónozott Ala(-2)-Gln(-l)-Val-15-Leu-17-aprotinin és Ala(-2)-Gln(-l)-Arg-15-aprotinin származékot tartalmazó pS 580 származék a pS 744 és pA 204 jelet kapta.
Az Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19-aprotinin (pS 744 vektor) és Ala(-2)-Gln(-1 )-Arg-15-Ala-17-aprotinin (pA 207 vektor) előállítását és klónozását a fent leírt módon végezzük.
3. példa
A rekombináns aprotinin-származékok élesztőben történő kifejezése
A fent leírt módon az SCI06 élesztőtörzset pS 604, pS 707, pS 744, pS 773, pS 774, pA 202, pA 204 és pA 207 plazmidvektorral transzformáljuk.
Az URA3+ élesztő transzformánst izoláljuk, és indukciós körülmények (lásd fent) között tenyésztjük. A kitermelés ellenőrzéséhez a 15 pozícióban valint és 17 pozícióban leucint tartalmazó kifejezendő aprotinin mutáns esetében a tenyészet felülúszóját elasztázgátló hatásra vizsgáljuk. A 15 pozícióban arginint tartalmazó kifejezendő aprotinin mutáns esetében a fent ismertetett tripszingátló hatást vizsgáljuk. Ezután a 10 literes fermentorban kívánt kifejezett terméket tisztítjuk és jellemezzük.
4. példa
A rekombináns aprotinin-származék tisztítása
A 10 literes berendezés fermentációs elegyét 9000 fordulat/perc értéken centrifugáljuk (15-30 perc). A felülúszót különböző szűrőkön (8-0,2 pm) szüljük, vízzel 7,5 mS vezetőképességig hígítjuk, és citromsavval pH = -3 értékre állítjuk. Az így előkezelt mintát 50 mmól/1 nátrium-citrát pufferben (pH = 3) felvett 100-200 ml S-Sepharose Fást Flow anyaggal (Pharmacia) elegyítjük, és 30-60 percen keresztül kevertetjük. Ezután a gélt
HU 213 582 Β
1-5 liter 50 mmól/1 nátrium-citrát pufferrel (pH = 3), 50 mmól/1 Tris/HC 1 pufferrel (pH = 9), végül 20 mmól/1 HEPES pufferrel (pH = 6) mossuk. A mosott gélt megfelelő oszlopra visszük és BIO-PILOT rendszerben (Pharmacia) 0 és 1 mól/1 nátrium-klorid/20 mmól/1 HEPES puffer (pH = 6) gradiens rendszerrel eluáljuk és frakcionáljuk. A gátló hatás humán leukocita elasztázzal, illetve szarvasmarha tripszinnel történő meghatározása után a megfelelő frakciókat összegyűjtjük, és forgó vákuumbepárlóban bepároljuk.
Ezt az anyagot Sephadex G-50 szuperfínom tölteten (Pharmacia) gélszűréssel és S-Sepharose Fást Flow, illetve S-Sepharose HP vagy Mono S tölteten (Pharmacia) 20 mmól/1 HEPES pufferben (pH = 6) kromatográfiásan tovább tisztítjuk. Az S-Sepharose-ról 0-1 mól/1 nátrium-klorid gradienssel eluálunk. A frakciókat gélelektroforézissel és a megfelelő gátló hatás vizsgálatával ellenőrizzük. A gátló hatással rendelkező frakciókat összegyűjtjük, 0,1 mól/1 ammónium-hidrogén-karbonáttal szemben dializáljuk, és fagyasztva szárítjuk (6. ábra).
A fermentációs elegyben lévő inhibitor mennyiségre vonatkoztatva általában 20-40% kitermelést kapunk.
5. példa
A 4. példa szerint kapott inhibitor jellemzése
A lioíilizátumot először aminosav analízissel (7. ábra), majd N-terminális szekvenálással (Applied Biosystems szekvenátor) jellemezzük (8. ábra).
A Val-15-Leu-17-aprotinin esetében olyan kiválasztott anyagot nem találtunk, amely a fenti aprotinin-származék N-terminális részén pontosan van hasítva (pontos feldolgozás). Ezzel szemben azonban, azok az aprotinin-származékok, amelyekből a 2-helyzetű aminosavat kiiktattuk, vagy amelyeket N-terminálisan Ala(-2)-Gln(-l)-szakasszal meghosszabbítottunk, 70-90%-ban a pontosan feldolgozott N-terminálist hordozzák (8. és 9. ábra).
A pontos gátlási kinetikát humán leukocita elasztázzal, illetve disznó hasnyál kallikreinnel határozzuk meg (10. ábra). Ennek során azt találjuk, hogy az N-terminális részen végzett változtatás nem befolyásolja a gátló tulajdonságot.
Az ábrák ismertetése:
1. ábra: pMT 15 E. coli élesztő Shuttle vektor restrikciós térképe, ahol az élesztőben történő gén kifejezésért felelős DNS szignálszekvencia be van keretezve.
2. ábra: Új Hindlll hasítóhely géntechnológiai bevitele a pre-pro-a-faktor szekvenciába, ahol a Hindlll felismerőhely a szerin kodon kicserélésével (TCT-böl AGC) nyerhető.
3. ábra: A pS 580 E. coli élesztő Shuttle vektor előállítása.
4. ábra: A szintetikus Val-15-Leu-17-aprotinin gén
DNS szekvenciája az 5' végén a Hindlll hasítóhelyig meghosszabbított α-faktor prepro-DNS-szekvenciával együtt, ahol jelölve van a KEX2 élesztőenzim hasítóhelye.
5. ábra: A pS 604 E. coli élesztő Shuttle vektor előállítása.
6. ábra:
Az S. cerevisiae fermentációs felülúszóból nyert aprotinm-származékok tisztítása.
7. ábra: Egy kiválasztott DesPro-2- és Ala(-2)-Gln(-l)-variáns aminosav analízise.
8. ábra: Egy kiválasztott DesPro-2- és Ala(-2)-Gln(-l)-variáns N-terminális szekvencia analízise.
9. ábra: Egy DesPro-2- és Ala(-2)-Gln(-l)-variáns
KEX2 proteáz segítségével történő előállítása.
10. ábra: A DesPro-2- és Ala(-2)-Gln(-l)-variáns inhibitor konstansa.

Claims (6)

1. Eljárás N-terminálisan módosított aprotinin vagy N-terminálisan módosított a 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 34, 36, 37, 38, 39, 41 és 52 aminosav-helyeken egy vagy több változtatást tartalmazó aprotinin-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy az aprotinit vagy a tárgyi körben meghatározott aprotinin-származékot kódoló DNS szekvenciában a 2-es helyzetű prolin kódját kiiktatjuk vagy a DNS szekvenciához egy alanin(-2)-glutamin(-l) szakaszt kódoló DNS-szakaszt addicionálunk, az így módosított DNS-szekvenciát szekréciós szignálszekvenciával fuzionáljuk, és élesztő kifejező rendszerben kifejezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási DNS-szekvenciaként humán vagy állati eredetű, aprotinint kódoló gént alkalmazunk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás
DesPro-2-Val-15-Leu-17,
DesPro-2-Val-15-Leu-17-Arg-19, Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17, Ala(-2)-Gln(-1)-Val-15-Leu-17-Arg-19, DesPro-2-Arg-15,
DesPro-2-Arg-15-Ala-17,
Ala(-2) -Gln(-1)-Arg-15,
Ala(-2)-Gln(-1)-Arg-15-Alá-17 aprotinin-származék előállítására, azzal jellemezve, hogy az aprotinin-származékot kódoló DNS-szekvenciában a 2-es helyzetű prolin kódját kiiktatjuk vagy a DNS-szekvenciához alanin(-2)-glutamin(-l) szakaszt kódoló DNS-szakaszt addicionálunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid kifejezése során a szignálszekvenciával fuzionált DNS szekvencia mellett egy promoter- vagy terminátor-szekvenciát, gazdaspecifikus replikátorszekvenciát, valamint szelekciós markért tartalmazó vektorral élesztőt transzformálunk, a transzformánsokat tenyésztjük, és a módosított aprotinint vagy aprotinin-származékot a tenyészközegből izoláljuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy éleszőként S. cerevisiae-t transzformálunk.
6. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított N-terminálisan módosított aprotinint vagy aprotinin-származékot gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal keverünk össze, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU905877A 1989-09-13 1990-09-12 Process for producing of recombinant aprotinin derivatives and pharmaceutical compositions thereof HU213582B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3930522A DE3930522A1 (de) 1989-09-13 1989-09-13 Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU905877D0 HU905877D0 (en) 1991-03-28
HUT62031A HUT62031A (en) 1993-03-29
HU213582B true HU213582B (en) 1997-08-28

Family

ID=6389306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU905877A HU213582B (en) 1989-09-13 1990-09-12 Process for producing of recombinant aprotinin derivatives and pharmaceutical compositions thereof

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5164482A (hu)
EP (1) EP0419878B1 (hu)
JP (1) JP2916228B2 (hu)
KR (1) KR0169976B1 (hu)
AT (1) ATE113074T1 (hu)
AU (1) AU632361B2 (hu)
CA (1) CA2025070C (hu)
DD (1) DD299311A5 (hu)
DE (2) DE3930522A1 (hu)
DK (1) DK0419878T3 (hu)
ES (1) ES2062235T3 (hu)
FI (1) FI104724B (hu)
HU (1) HU213582B (hu)
IL (1) IL95618A (hu)
ZA (1) ZA907266B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2208511A (en) * 1987-08-07 1989-04-05 Bayer Ag Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology
US5591603A (en) * 1987-08-28 1997-01-07 Novo Nordisk A/S Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells
DK450187D0 (da) * 1987-08-28 1987-08-28 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
US5056341A (en) * 1989-06-08 1991-10-15 Sanyo Electric Co., Ltd. Washing machine
US5231010A (en) * 1989-09-13 1993-07-27 Bayer Aktiengesellschaft Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof
IL99585A0 (en) * 1990-10-01 1992-08-18 Novo Nordisk As Aprotinin analogues,their production and pharmaceutical compositions containing them
DE4417353A1 (de) * 1994-05-18 1996-01-25 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz
US5786328A (en) * 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US5780265A (en) * 1995-06-05 1998-07-14 Genentech, Inc. Kunitz type plasma kallikrein inhibitors
DE19629982A1 (de) 1996-07-25 1998-01-29 Bayer Ag Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften
DE19725014A1 (de) * 1997-06-13 1998-12-17 Bayer Ag Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten
WO2003033009A2 (en) * 2001-07-10 2003-04-24 Omnio Ab Novel drug targets for arthritis
US20060218667A1 (en) * 2004-10-12 2006-09-28 Vojdani Fakhrieh S Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants
CA2619657C (en) 2005-09-16 2016-01-26 Bayer Cropscience Sa Transplastomic plants expressing lumen-targeted protein

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5037806A (en) * 1985-02-22 1991-08-06 Monsanto Company Biologically active method using somatotropins
GB2188322A (en) * 1986-03-26 1987-09-30 Bayer Ag Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host
GB2208511A (en) * 1987-08-07 1989-04-05 Bayer Ag Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology
DK225488D0 (da) * 1988-04-26 1988-04-26 Novo Industri As Polypeptid
DK450187D0 (da) * 1987-08-28 1987-08-28 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner

Also Published As

Publication number Publication date
EP0419878A1 (de) 1991-04-03
IL95618A0 (en) 1991-06-30
ZA907266B (en) 1991-07-31
FI104724B (fi) 2000-03-31
IL95618A (en) 1996-09-12
CA2025070C (en) 2001-01-02
JPH03197496A (ja) 1991-08-28
US5164482A (en) 1992-11-17
EP0419878B1 (de) 1994-10-19
AU632361B2 (en) 1992-12-24
AU6245390A (en) 1991-03-21
KR0169976B1 (ko) 1999-02-01
FI904474A0 (fi) 1990-09-11
DK0419878T3 (da) 1994-11-21
JP2916228B2 (ja) 1999-07-05
ES2062235T3 (es) 1994-12-16
DE59007498D1 (de) 1994-11-24
HUT62031A (en) 1993-03-29
CA2025070A1 (en) 1991-03-14
KR910006483A (ko) 1991-04-29
ATE113074T1 (de) 1994-11-15
HU905877D0 (en) 1991-03-28
DE3930522A1 (de) 1991-03-21
DD299311A5 (de) 1992-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3126975B2 (ja) プロテイナーゼ阻害因子、それらの調製方法およびそれらを含有する薬物
JP2810743B2 (ja) アプロチニン同族体およびその製造方法
US20060068480A1 (en) Polypeptides and polypeptide analogues
AU675926B2 (en) A human kunitz-type protease inhibitor variant
HU218104B (hu) Humán, Kunitz-típusú proteázgátló változatai
EP0621869B1 (en) Human kunitz-type protease inhibitor variants
US5935854A (en) Human amyloid protein precursor homolog and kunitz-type inhibitor
HU213582B (en) Process for producing of recombinant aprotinin derivatives and pharmaceutical compositions thereof
US5278285A (en) Variant of Kunitz-type inhibitor derived from the α3-chain of human type VI collagen produced by recombinant DNA technology
US5239058A (en) Proteins having anticoagulant properties
IE903245A1 (en) Proteins having anticoagulant activity
US5945275A (en) Nematode-extracted anticoagulant protein
US5707831A (en) Process for preparing recombinant aprotinin and recombinant aprotinin variants having the natural N-terminal sequence
US5231010A (en) Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof
US5661001A (en) High molecular weight desulphatohirudin
CA2047119C (en) Vitro processing of fusion proteins
KR0134377B1 (ko) 에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물
US5028534A (en) DNA clones of human placental plasminogen activator inhibitor
US5328997A (en) Processes for making proteins having anticoagulant properties
JP2798573B2 (ja) ヒト好中球エラスターゼ阻害活性を有する天然型ポリペプチドおよびそれを含有する医薬製剤
US6132990A (en) Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same
JPH05308988A (ja) 新規ポリペプチド、新規ｄｎａ、新規ベクター、新規形質転換体、新規医薬組成物、および新規ポリペプチドの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee