KR0134377B1 - 에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물

Info

Publication number
KR0134377B1
KR0134377B1 KR1019890002759A KR890002759A KR0134377B1 KR 0134377 B1 KR0134377 B1 KR 0134377B1 KR 1019890002759 A KR1019890002759 A KR 1019890002759A KR 890002759 A KR890002759 A KR 890002759A KR 0134377 B1 KR0134377 B1 KR 0134377B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
eglin
mutants
dna
formula
compound
Prior art date
Application number
KR1019890002759A
Other languages
English (en)
Other versions
KR890014735A (ko
Inventor
게르아트트 그뤼터 마르쿠스
하인츠 디르크
리르슈 만프레드
Original Assignee
로트베른하르트 엠., 발덱 베르너
노바르티스 아게
베르너 에이. 레슈타이너
유씨피 겐-파르마 에이지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 로트베른하르트 엠., 발덱 베르너, 노바르티스 아게, 베르너 에이. 레슈타이너, 유씨피 겐-파르마 에이지 filed Critical 로트베른하르트 엠., 발덱 베르너
Publication of KR890014735A publication Critical patent/KR890014735A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR0134377B1 publication Critical patent/KR0134377B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/855—Proteins from animals other than mammals or birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

에글린 B 및 에글린 C의 돌연변이체, 이를 암호화하는 DNA 서열, 이러한 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물
본 발명은 프로테아제 억제제인 에글린 B 및 에글린 C의 돌연변이체, 이러한 돌연변이체의 제조에 적합한 하이브리드 벡터, 이러한 하이브리드 벡터로 형질전환된 숙주 미생물, 및 이들 하이브리드, 형질전환된 숙주 미생물 및 에글린 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.
거머리(히루도 메디시날리스 : Hirudo medicinalis)로부터 분리되는, 에글린 B 및 에글린 C로 명명된 두가지의 프로테아제 억제제가 독일연방공화국 공개 특허 공보 제2808396호에 기술되어 있다. 이들 폴리펩타이드는 각기 70개의 아미노산으로 이루어지며, 약 8100의 분자량을 가지며, 키모트립신 및 섭틸리신, 동물 및 사람의 과립구 프로테아제 엘라스타제 및 카텝신 G, 및 비만세포 프로테아제 키마제의 강력한 억제제이다. 이와는 대조적으로, 트립신과 유사한 프로테아제는 억제되지 않거나 단지 극소로 억제된다.
에글린 C는 다음 일차 구조를 갖는다;
H-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly-
SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal-
ValAsnHisValProHisValGly-OH
대부분의 공지된 프로테아제 억제제와는 달리 에글린 C는 어떠한 디설파이드결합도 함유하지 않는다. 에글린 C는 분자 크기가 작지만, 산, 알카리 수산화물 용액 또는 열 및 단백질 분해적 분해에 대해 비범하게 안정하다. 에글린 B의 일차구조는 아미노산 35번의 티로신이 히스티딘에 의해 치환되어 있어 에글린 C의 구조와 다르다.
에글린은 현재까지 사람 및 동물 과립구 엘라스타제 및 사람 과립구 카텝신 G에 대한 공지된 억제제중 가장 강한 것중의 하나이다. 유기체에서 이들 세포성 프로테아제가 억제되지 않거나 과량이 방출되면 염증 진행을 촉진시키며 비-특이적 단백질 분해에 의해 조직 파괴를 유도한다. 세포내 분해의 원인이 되는 이들 효소는, 생리학적(중성 내지 약염기성)배지에서 최적으로 활성이며 천연조직 물질(예 : 엘라스틴) 및 체액성 인자(예 : 혈액 응고 인자 및 보체인자)를 신속하게 파괴 및 불활성화시킨다. 현재까지 알려진 에글린 특성에 의해 에글린은 의학적 치료[소염제(antiinflammatory, antiphlo gistic), 패혈성 쇼크, 폐기종, 췌장 섬유증 등]에 사용되는 상당히 중요한 것이다.
최근에 재조합 유전공학 방법에 의해 에글린을 수득할 수 있게 되었다.(참조 : 유럽 특허원 제146785호)
본 발명에 기초가 되는 문제는 에글린 B 또는 에글린 C로부터 출발하는 신규의 프로테아제 억제제를 제조하는 것이다.
이 문제는 활성 중심(아미노산 45 및 46, Leu-Asp)의 영역내의 하나, 두 개 또는 세 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시켜 천연 에글린 B 및 에글린 C와는 상이한 에글린 돌연변이체를 제공함으로써 본 발명에 의해 해결되었다. 본 발명에 따라 수득된 에글린 돌연변이체는, 에글린 B 및 에글린 C와 비교하여, 특정 프로테아제의 억제에 있어 특이성이 증가되거나, 예를 들어 트립신이나 트롬빈과 같이 에글린 B 및 에글린 C로는 억제되지 않거나 거의 억제되지 않는 프로테아제가 억제되는 구별되는 놀라운 특성을 나타낸다.
본 발명은 특히 서열식(Ⅰ)의 에글린 돌연변이체 및 이의 염에 관한 것이다.
R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnYyrAspVal-W-PheLeu
ProGluGlySerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn
ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (Ⅰ)
상기 식에서, R은 수소 또는 아세틸이고, W는 Tyr 또는 His이고, X는 Thr, Ser 또는 Pro이고, Y는 Leu, Met, Arg, Lys, Phe, Try 또는 Trp이며, Z는 Asp, Glu, Gln, Asn, Ala, Ser 또는 Thr이고, 단 Y가 Leu이고 Z가 Asp일 때 X는 Thr이 아니다.
본 발명은 특히 R이 아세틸이고, W가 Tyr이고 ; X는 Thr이고 Y는 Arg, 또는 Lys 이고 Z는 Asp, Glu, Gln, Asn, Ala, Ser 또는 Thr이거나, X는 Pro이고 Y는 Met이고 Z는 Asp이거나, X는 Thr이고 Y는 Phe, Tyr, Trp 또는 Met이며 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
본 발명은 주로 R이 아세틸이고, W가 Tyr이고 , X는 Thr이고, Y는 Arg이며, Z가 Asp 또는 Ser 인 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
본 발명은 특히 R이 아세틸이고, W가 Tyr이고 , X는 Thr이고 Y는 Arg이며 Z는 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염에 관한 것이다.
서열식(Ⅰ)의 신규 화합물은 유리 형태 뿐만 아니라 이의 염의 형태, 특히 이의 약제학적으로 허용되는 염의 형태로도 존재할 수 있다. 이들은 유리 아미노 그룹 또는 구아니디노 그룹을 갖는 몇 개의 아미노산 잔기를 함유하므로, 본 발명의 화합물은 예를들어 산 부가염의 형태로 존재할 수 있다. 적합한 산 부가염은 특히 통상 치료학적으로 허용되는 산과의 생리학적으로 허용되는 염이다. 적합한 무기산은 할로겐화수소산(예: 염산)은 물론 황산, 인산 또는 피로인산이며; 적합한 유기산은 특히 설폰산(예 : 벤젠 또는 p-톨루엔설폰산 또는 메탄설폰산과 같은 저급 알칸설폰산) 및 카복실산(예: 아세트산, 락트산, 팔미트산, 스테아르산, 말산, 타타르산, 아스코르브산 및 시트르산)이다. 또한, 에글린 화합물은 유리 카복시 그룹을 갖는 아미노산 잔기를 함유하므로, 이들은 또한 금속염, 특히 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘염과 같은 알카리 금속 또는 알카리 토금속염의 형태로, 또는 암모니아 또는 생리학적으로 허용되는 유기 질소-함유 염기로부터 유도된 암모늄염의 형태로 존재할 수 있다. 그러나, 이들은 유리 카복시 그룹 및 유리 아미노( 및 구아니도)그룹을 동시에 함유하므로, 또한 내부염의 형태로도 존재할 수 있다.
본 발명의 에글린 돌연변이체 및 이의 염은 예를 들어 유전공학 방법에 의해 널리 공지되어 있는 방법에 따라, 예를들어 상기한 에글린 돌연변이체중 하나를 암호화하는 DNA를 함유하는 형질전환된 숙주 미생물을 배양하고 에글린 돌연변이체 또는 이의 염을 분리하여 제조할 수 있다. 본 발명의 에글린 돌연변이체 및 이의 염은 특히, a. 에글린 돌연변이체를 암호화하는 DNA를 제조하고, b. 이 DNA를 벡터내에 삽입시키고, c. 제조된 하이브리드 벡터를 숙주 미생물내로 형질전환시켜 도입하고, d. 에글린 돌연변이체의 발현을 허용하는 조건하에서 형질전환된 숙주 미생물을 배양한 후, e. 에글린 돌연변이체 또는 이의 염을 분리시켜 제조할 수 있다.
에글린 돌연변이체의 암호화 DNA
본 발명은 에글린 돌연변이체, 특히 바람직한 것으로서 상기 언급된 에글린 돌연변이체중 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA에 관한 것이다.
본 발명의 DNA는 바람직하게는 그의 말단에 적합한 제한 부위를 포함하고 DNA의 벡터내로의 삽입을 가능케하는 플랭킹(flanking)서열을 갖는다.
본 발명의 DNA는 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, DNA는 화학적으로 제조되거나, 이의 단편을 화학적 합성에 의해 제조하고 미리 결정된 방식으로 효소적으로 연결시키거나, 에글린 B 또는 에글린 C를 암호화하는 DNA를 하나 이상의 과정으로 돌연변이시킬수 있다.
DNA의 화학적 합성은 널리 공지된 방법에 따라 수행된다. 적합한 공정들이 문헌[참조: S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3(1983)] 및 유럽 특허원 제146785호에 기술되어 있다.
본 발명은 DNA의 제조는 또한 에글린 B 또는 에글린 C의 암호화 DNA를 돌연변이시켜 수행할 수 있다.
바람직하게는, 부위 지시된 돌연변이유발로서 알려진 방법을 이용한다.[참조 : M.J. Zoller et al., Meth. Enzym. 100, 468(1983)]. 이 방법에서는 일본쇄 에글린 DNA를 박테리오파아지 M13에 클로닝시키고, 돌연변이를 지시하는 뉴클레오타이드를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화 시킨 후 하이브리드화 생성물을 보충하여 이본쇄를 형성시키고, 형성된 이본쇄 박테리오파아지를 적합한 이. 콜라이 숙주내로 형질전환시켜 도입한 후, 형질전환된 이, 콜라이 세포를 배양하고, 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA를 함유하는 세포들을 상기 언급된 올리고뉴클레오타이드로 하이브리드화시켜 동정한다.
에글린 돌연변이체의 암호화 DNA를 함유하는 발현 벡터의 제조
본 발명은 또한 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA서열을 함유하는 발현 벡터에 관한 것으로, 이 DNA서열은 에글린 돌연변이체가 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포내에서 발현될 수 있도록 발현 조절 서열에 의해 조절된다.
본 발명의 발현 벡터는, 예를 들어 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA서열을 조절하는 발현 조절 서열을 함유하는 벡터 DNA내로 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA서열을 삽입하여 제조한다.
적합한 벡터의 선택은 형질전환되는 숙주세포에 기초한다. 적합한 숙주는 예를들면 효모(에: 사카로마이세스 세레비지애), 및 특히 세균 균주, 특히 에스케리키아 콜라이 균주, 및 바실러스 섭틸리스와 같은 미생물은 물론 고등 유기체의 세포, 특히 확립된 사람 또는 동물 세포주를 들 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 이. 콜라이 균주이다.
원칙적으로 선택된 숙주내에서 에글린 돌연변이체를 암호화하는 본 발명의 DNA서열을 복제하고 발현하는 모든 벡터가 적합하다.
이. 콜라이 균주내에서 에글린 돌연변이체의 발현에 적합한 벡터의 예들은 박테리오파아지, 예를 들어 벡테리오파아지 유도체, 또는 플라스미드, 특히 플라스미드 co1 E1 및 이의 유도체(예: pMB9, pSF2124, pBR317, 또는 pBR322)이다. 바람직한 본 발명의 벡터는 플라스미드pBR322로부터 유도된다. 적합한 벡터는 완전한 레플리콘 및 표현형 마커(marker)에 의해 발현 플라스미드로 형질전환된 미생물의 선별 및 동정을 가능케 하는 마커 유전자를 함유한다. 적합한 마커 유전자는 미생물에게 예를들어 중금속, 항생제 등에 대한 내성을 제공한다. 더욱이, 바람직한 본 발명의 벡터는 레플리콘 및 마커 유전자 영역과는 별도로 제한 엔도 뉴클리아제에 대한 인지 서열을 함유하므로, 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA서열 및 필요한 경우, 발현 조절 서열을 이러한 부위에 삽입할 수 있다.
몇몇 발현 조절 서열을 사용하여 발현을 조절할 수 있다. 사용되는 발현 조절 서열은 특히 형질전환될 숙주 세포의 강력히 발현되는 유전자의 것이다. pBR322가 하이브리드 발현 벡터로서 사용되고 이. 콜라이가 숙주 미생물로서 사용된 경우, 적합한 발현 조절 서열(이는 특히 프로모터 및 라이보좀 결합 부위를 포함한다)은 β-락타마제 유전자의 락토즈 오페론, 트립토판 오페론, 아라비노즈 오페론등, 및 파아지 N-유전자 또는 파아지 fd-층 단백질 유전자의 상응하는 서열등이다. β-락타마제 유전자(β-lac-gene)의 프로모터는 이미 플라스미드 pBR322에 함유되어 있으나, 기타 발현 조절 서열은 플라스미드내에 삽입시켜야 한다. 본 발명에서 바람직한 발현 조절 서열은 트립토판 오페론(trp po)이다.
효모에 있어서 복제 및 발현에 적합한 벡터는 효모 복제 개시점 및 효모에 대한 선별적 유전적 마커를 함유한다. 예를 들어 염색체 자동 복제 단편(ars)과 같은 효모 복제 개시점을 함유하는 하이브리드 벡터는 형질전환 후 효모 세포내에서 염색체외적으로 보유되며 유사분열 기간중 자동적으로 복제된다. 또한, 효모 2μ-플라스미드 DNA와 유사한 서열을 함유하는 하이브리드 벡터를 사용할 수 있다. 그러한 하이브리드 벡터는 세포내에서 이미 존재하는 2μ플라스미드와 재조합하여 혼입시키거나 자동적으로 복제시킨다. 효모에 대한 적합한 마커 유전자는 특히 숙주에 항생제 내성을 제공하는 것이며, 영양 요구성(auxotrophic)효모 돌연변이체인 경우는 숙주 결함을 보충하는 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를 들어 항생 물질인 사이클로헥시미드에 대한 내성을 제공하거나, 예를들어 ura 3, leu 2, his3 또는 특히 trp 1 유전자와 같은 영양요구성 효모 돌연변이체에 있어 프로토트로피(prototrophy)를 제공한다. 바람직하게는, 효모 하이브리드 벡터는 또한 세균 숙주, 특히 이. 콜라이에 대한 복제 개시점 치 마커 유전자를 함유하므로, 하이브리드 벡터 및 이들의 전구체의 작제 및 클로닝이 세균 숙주에서 수행될 수 있다. 효모에서의 발현에 적합한 발현 조절 서열은 예를 들어 trp 1, adh Ⅰ, adhⅡ 또는 pho 5유전자의 조절 서열 및 pgk 및 gapdh프로모터와 같은 해당과정에 포함되는 프로모터이다.
본 발명은 특히, 에글린 돌연변이체의 암호화 DAN서열 및 발현 조절 서열을 포함하는 복제 및 표현형 선별이 가능한 발현 벡터에 관한 것으로, 이 DNA서열은, 전사 개시 시그날 및 종결 시그날은 물론 해독 개시 시그날 및 종결 시그날과 함께, 에글린 돌연변이체가 발현 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포내에서 발현되도록 상기 발현 조절 서열의 조절하에 발현 플라스미드내에 배열된다.
효과적인 발현을 위해서, 에글린 돌연변이체의 암호와 유전자는 발현 조절 서열과 함께 정확히(페이즈(phase)중) 배열되어야 한다. 주요 mRNA개시점과 발현 조절 서열에 천연적으로 연결된 유전자 암호화 서열(예: β-lac 프로모터를 사용하는 경우 β-lac 암호화 서열)의 ATG사이 영역의 발현조절 서열을, 바람직하게는 자체의 해독 개시 시그날(ATG) 및 해독 종결 시그날(예: TAG)을 수반하는 에글린 돌연변이체 유전자에 연결시키는 것이 유리하다. 이 방법으로 효과적인 전사 및 해독이 보장된다.
미생물의 형질전환
본 발명은 또한 숙주세포를 에글린 돌연변이체를 암호화하고 발현 조절 서열로 조절되어지는 DNA서열을 함유한 발현 벡터로 형질전환시킴을 특징으로 하는, 형질 전환된 숙주세포의 제조방법에 관한 것이다.
적합한 숙주세포는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애, 바실러스 섭틸리스 및 특히 에스케리키아 콜라이와 같은 상기-언급된 미생물이다. 본 발명의 발현 플라스미드로의 형질전환은 예를 들어, 에스. 세레비지애의 경우에는 문헌[참조: A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 75, 1929, (1978)]에 기술된 방법으로 비. 섭틸리스의 경우에는 문헌[참조: Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol 81,741(1961)]의 방법으로, 이. 콜라이의 경우에는 문헌[참조: M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159(1970)]에 기술된 방법으로 수행한다. 형질전환된 숙주세포는 발현 플라스미드내에 함유된 마커 유전자가 내성을 부여하는 살생제가 가해진 선별 영양배지로부터 분리시키는 것이 유리하다. 발현 플라스미드를 함유하지 않은 세포는 상기 배지중에서 사멸된다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 수득할 수 있는 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
형질전환된 숙주세포를 배양하고 에글린 돌연변이체를 회수한다. 형질전환된 숙주세포를 사용하여 에글린 돌연변이체를 제조한다. 에글린 돌연변이체의 제조방법은 상기-언급된 형질 전환된 숙주세포를 배양하고 생성물을 숙주세포로부터 유리 및 분리시킴을 특징으로 한다.
본 발명은 특히 동화성 탄소 및 질소 공급원을 함유하는 액체 영양배지중에서 서열식(Ⅰ)의 에글린 돌연변이체를 암호화하고 발현 조절 서열로 조절되어지는 DNA서열을 함유한 발현 플라스미드로 형질전환시킨 숙주세포를 배양시키고, 숙주 세포로부터 생성물을 유리 및 분리시키며, 필요할 경우, 상기 방법에 따라서 수득된 서열식(Ⅰ)의 화합물의 혼합물을 개개의 성분으로 분리시키고, 필요할 경우, 생성된 염을 유리 폴리펩타이드로 전환시키거나 생성된 폴리펩타이드를 염의 전환시킴을 특징으로 하여, 서열식(Ⅰ)의 에글린 돌연변이체 및 상기 화합물의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환된 숙주세포는 널리 공지된 방법으로 배양한다. 예를 들면, 본 발명의 형질전환된 숙주 미생물을 배양하기 위하여 다양한 탄소 공급원을 사용할 수 있다. 바람직한 탄소 공급원의 예는 글루코오즈, 말토오즈, 만니톨 또는 락토오즈와 같은 동화성 탄수화물, 또는 그 자체로 또는 적합한 혼합물로 사용될 수 있는 아세테이트이다. 적합한 질소 공급원은 예를 들면, 카사미노산과 같은 아미노산, 펩타이드 및 단백질, 및 트립톤, 펩톤 또는 고기 추출물과 같은 이들의 분해산물이며, 추가로 그 자체로 또는 적합한 혼합물로 사용될 수 있는 효모 추출물, 맥아 추출물, 암노늄염(예: 염화암모늄), 황산염 또는 질산염이다. 또한 사용될 수 있는 무기염은 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 황산염, 염화물, 인산염 및 탄산염이다.
더욱이, 배지는 예를 들면, 미량원소(예: 철, 아연, 망간등)와 같은 성장-촉진 물질, 및 바람직하게는 선별력을 나타내고 발현 플라스미드를 상실한 세포의 성장을 억제하는 물질을 함유한다. 예를 들어, 발현 플라스미드가 ampR유전자를 함유하는 경우, 앰피실린을 배지에 가한다. 이와 같이 항생물질적으로 활성인 물질의 첨가는 또한 항생물질에 민감한 오염성 미생물을 사멸시키는 효과를 나타낸다.
배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행한다. 온도, 배지의 pH 및 발효시간과 같은 배양조건은 최대 역가의 에글린 돌연변이체가 수득될 수 있도록 선택한다. 예를들어, 이. 콜라이 또는 효모 균주는 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃, pH 4내지 9, 바람직하게는 pH 7에서, 약 4내지 20시간, 바람직하게는 8내지 12시간 동안, 호기성 조건하 액침 배양으로 진탕시키거나 교반시키면서 배양하는 것이 바람직하다. 발현 생성물은 세포내에 축적된다.
세포 밀도가 적합한 수준에 도달하게 되면, 배양을 중단시키고 생성물을 미생물의 세포로부터 분리시킨다. 이를 위하여 세포를 예를 들어 SDS 또는 트리톤과 같은 세제로 처리하거나 라이소자임 또는 유사한 활성의 효소로 용해시켜 붕괴시킨다. 또다른 방법으로, 또는 이에 추가로, 전단력(예: X-프레스, 프렌치 프레스, 다이노-밀(Dyno-Mill)또는 유리 비드 또는 산화 알루미늄을 사용한 교반과 같은 기계력을 이용하거나, 예를 들어 액체 질소중에서의 동결과 예를 들어 30°내지 40℃의 해동을 교번시키거나, 초음파를 이용하여 세포를 붕괴시킨다. 원심분리 후, 단백질, 핵산 및 다른 세포 성분을 함유하는 생성된 혼합물의 단백질을 널리 공지된 방법으로 농축시킨다. 예를 들어, 많은 비-단백질 성분을 폴리에틸렌이민 처리법으로 분리시키고, 에글린 화합물을 포함한 단백질을, 예를 들어 용액을 황산 암모늄 또는 다른 염으로 포화시켜 침전시킨다. 세균성 단백질은 또한 아세트산(예: 0.1%, pH 3 내지 5)으로 산성화 시킴으로써 침전시킬 수 있다. 에틸 아세테이트 상등액을 n-부탄올로 추출시킴으로써 에글린 돌연변이체를 더욱 농축시킬 수 있다. 기타 정제화 단계는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과법, 겔 투과 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, HPLC, 역상 HPLC등과 같은 크로마토그래피 방법을 포함한다. 예를들어, 겔 또는 담체-비함유 전기영동으로 전하를 띄게 한 후, 혼합된 성분을 분자 크기에 따라서 적합한 세파덱스(Sephadex)컬럼을 사용하여 투석시켜 분리하거나, 성분을 예를 들어 항체, 특히 모노클로날 항체, 또는 친화성 크로마토그래피에 적합한 담체와 커플링된 무수키모트립신 또는 트롬빈으로 친화 크로마토그래피시켜 분리하거나, 추가의 방법, 특히 문헌에 공지된 방법으로 분리시킨다.
예를 들어, 발현된 에글린 돌연변이체의 분리는 하기 공정을 포함한다:
원심분리에 의해 세포를 배양액으로부터 분리시키고, 세포를 예를들면 다이노-밀에 의해 붕괴시켜 조 추출물을 생성하며, 원심분리시켜 불용성 성분을 제거시키고, 1% 아세트산으로 세균성 단백질을 침전시키며, 세파덱스 G50(또는 G75)상에서 겔 여과시키고, 필요할 경우, 역상 HPLC를 수행한다. 염의 제거는 예를 들어 세파덱스 G25상에서 수행한다.
래비트로부터 수득할 수 있는 폴리클로날 항체 또는 하이브리도마 세포로부터 수득할 수 있는 모노클로날 항체, 예를 들어 하이브리도마 세포주 299S18-20(CNCM Ⅰ-361), 299S20-1(CNCM Ⅰ-362) 또는 299S20-10(CNCM Ⅰ-363)에 의해 분비되는 모노클로날 항체와 같은 항-에글린 항체를 사용한 시험, 또는 표적 프로테아제, 예를 들어 사람 백혈구 엘라스타제(HLE) 또는 카텝신 G(Cat G)[참조: U. Seemuller et al., Hoppe-Seyler＇s Z. Physiol. Chem. 358, 1105 (1977): U. Seemuller et al., Meth. Enzym. 80, 804(1981)]의 억제를 이용하여 에글린 돌연변이체를 검출할 수 있다.
예를들어 R이 H 또는 아세틸인 서열식(Ⅰ)의 화합물로 구성된, 본 방법에 따라서 수득할 수 있는 서열식(Ⅰ) 화합물의 혼합물을 널리 공지된 방법으로 개개의 성분으로 분리시킬 수 있다. 적합한 분리방법은 예를 들어, 크로마토그래피 방법(예: 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, HPLC 또는 역상 HPLC), 배수 분배법 또는 전기영동법, 예를 들어 셀룰로즈 아세테이트 상에서의 전기영동 또는 겔 전기영동, 특히 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)이다.
이용되는 방법에 따라서, 본 발명의 화합물은 유리형태로 또는 산부가염, 내부염 또는 염기와의 염 형태로 수득된다. 유리 화합물은 공지된 방법으로 산부가염으로부터 수득될 수 있다. 또한, 산 또는 염기, 예를들어 치료학적으로 허용되는 산부가염 또는 금속염을 형성하는 산 또는 염기와 반응시키고, 증발 또는 동결 건조로 농축시켜 유리 화합물로부터 상기 언급된 염을 수득할 수 있다. 내부염은 pH를 적당한 중성치로 조절시켜 수득할 수 있다.
약제학적 제제
서열식(Ⅰ)의 신규한 에글린 돌연변이체는 유용한 약리학적 특성을 가지며 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
신규한 에글린 돌연변이체는 프로테아제 억제제로서 다음과 같이 천연 에글린 B 및 C의 활성 프로필과는 상이한 활성을 나타낸다.: 즉, 특정 프로테아제에 대한 억제 작용이 증가되거나, 천연 에글린에 의해 억제되지 않은 특정의 프로테아제가 강하게 억제되는 한편, 예를들면 과립구 엘라스타제와 같은 에글린의 몇몇 천연표적 프로테아제에 대한 억제작용이 약화되거나 소멸된다. 예를 들어, R이 수소 또는 아세틸이고, W가 Tyr 또는 His이며, X가 Pro이고, Y가 Met이며 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물은 천연 에글린과 비교해 볼 때 사람 치 동물 과립구 엘라스타제에 대한 증가된 억제를 나타내므로, 천연 에글린과 같이, 예를 들어, 폐기종, ARDS(급성 호흡 곤란 증후군), 폐혈성 쇼크, 류마티스성 관절염 및 췌장섬유증의 치료에 사용할 수 있다. 천연 에글린과는 달리, R 및 W가 서열식(Ⅰ)에 대해 주어진 의미를 가지고 X가 Thr이며 Y가 Arg 또는 Lys이고 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물은 트립신에 대한 현저한 억제작용을 나타내고 과립구 엘라스타제 및 카텝신 G에 대하여는 단지 약간의 작용만을 나타낸다. 이는 특히 R이 아세틸이고 W가 Thr 이며, X가 Thr이고 Y가 Arg이며 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물에 적용된다. 이런 화합물은 아프로티닌과 유사하게, 예를들면, 췌장염 및 외상성 췌장 발생 및 출혈성 쇼크의 치료에 사용될 수 있다. R, W 및 X가 서열식(Ⅰ)에 대해 제시된 의미를 가지고 Y가 Arg 또는 Lys이고 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물은 트롬빈에 대한 현저한 억제작용을 가지며, 바람직하게는 안티트롬빈 Ⅲ와 병용하여, 예를들면 혈전증, 혈전색전증, 폐혈성 및 외상후 쇼크 및 응혈이상증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 필요한 경우, 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제와 함께, 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 적어도 하나 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이들 조성물은, 특히 예를들어 정맥내, 피내, 피하 또는 근육내와 같은 비경구, 또는 국소투여될 때 특히 상기-언급된 적용에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 특히 상기-언급된 증후군의 경우에 있어서, 인체 또는 동물체를 예방 및 치료하기 위한 본 발명의 신규한 화합물 및 이를 함유한 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
용량은 특히 특정한 투여형태 및 치료 또는 예방 목적에 의존한다. 단일용량의 크기 및 투여 스케줄은 표현된 특정한 장애에 관한 개개의 평가를 기준으로하여 결정하는 것이 최상일 수 있고, 혈액 인자와 같은 관련된 인자를 결정하는 필수방법은 전문가에게 공지되어 있다.
트롬빈-억제 에글린 돌연변이체의 경우에 있어서, 주사시 치료 유효량은 약 0.005 내지 약 0.1㎎/체중 ㎏의 용량범위내이다. 약 0.01 내지 약 0.05㎎/체중㎏의 범위가 바람직하다. 정맥내, 근육내 또는 피하주사로 투여한다. 따라서, 단일 용량 형태의 비경구 투여용 약제학적 제제는 투여방식에 따라서 용량당 본 발명의 화합물 약 0.4 내지 약 7.5㎎을 함유한다. 활성성분이외에 이들 약제 조성물은 또한 통상적으로 pH가 약 3.5 내지 7로 유지되도록 완충물질(예: 인산염 완충물질)을 함유하고, 또한 등장성이 되게 하기 위하여 염화나트륨, 만니톨 또는 솔비톨을 함유한다. 이들은 동결-건조 또는 용해된 형태로 존재할 수 있고 용액은 유리하게는 항균적으로 활성인 방부제, 예를 들어 0.2 내지 0.3% 4-하이드록시 벤조산 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르를 함유할 수 있다.
트롬빈-억제 에글린 돌연변이체의 국소투여용 제제는 용액제, 로션 또는 젤리, 유성 용액제 또는 현탁제, 또는 지방-함유 연고제 또는, 특히, 유화 연고제 형태로 존재할 수 있다. 수성 용액제 형태의 제제는, 예를 들어 본 발명의 활성성분, 또는 이의 치료학적으로 허용되는 염을 pH 4 내지 6.5의 수성 완충용액 중에 용해시키고, 필요한 경우, 추가의 활성성분, 예를 들면 소염제, 및/또는 중합성 점착제(에: 폴리비닐피롤리딘), 및/또는 방부제를 가하여 수득한다. 활성성분의 농도는 용액 10㎖ 또는 젤리 10g당 약 0.1 내지 약 1.5㎎, 바람직하게는 0.25 내지 1.0㎎이다. 국소투여용 유성 형태의 제제는 예를 들어, 본 발명의 활성 성분 또는 이의 치료학적으로 허용되는 염을, 필요할 경우 알루미늄 스테아레이트, 및/또는 HLB값(친수성-친지성 균형)이 10이하인 다가 알코올의 지방산 모노에스테르(예: 글리세롤 모노스테아레이트, 솔비탄 모노라우레이트, 솔비탄 모노스테아레이트 또는 솔비탄 모노올레에이트)와 같은 표면-활성제(계면 활성제)와 같은 팽윤제의 첨가와 함께, 오일중에 현탁시켜 수득한다. 지방-함유 연고제는, 예를들어, 본 발명의 활성성분 또는 이의 염을, 필요할 경우 HLB값이 10이하인 계면활성제의 첨가와 함께, 전착가능한 지방 염기중에 현탁시켜 수득한다. 유화성 연고제는 본 발명의 활성성분 또는 이의 염의 수용액을 HLB값이 10이하인 계면활성제의 첨가와 함께 유연하고 전착가능한 지방 염기중에서 연화시켜 수득한다. 이들 국소투여 형태의 모든 제제는 또한 방부제를 함유할 수 있다. 활성성분의 농도는 기재 약 10g당, 약 0.1 내지 약 1.5㎎, 바람직하게는 0.25 내지 1.0㎎이다.
엘라스타제-억제 에글린 돌연변이체의 투여는 정맥내 주사로 또는 폐내로 예를 들어 버어드(Bird)장치를 사용하여 흡입시켜 수행한다. 따라서, 단일용량 형태의 비경구투여용 약제학적 제제는 투여방식에 따라서, 용량당 본 발명의 화합물 약 10 내지 50㎎을 함유한다. 활성성분에 덧붙여 이들 약제 조성물은 또한 통상적으로 등장성을 이루기 위한 염화 나트륨, 만니톨 또는 솔비톨을 함유한다. 이들은 동결-건조되거나 용해된 형태로 존재할 수 있고, 용액제는 유리하게는 항균적으로 활성인 방부제, 예를 들어 0.2 내지 0.3% 4-하이드록시벤조산 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르를 함유할 수 있다.
엘라스타제-억제 에글린 돌연변이체의 국소투여용 제제는 상기 기술된 것에 실질적으로 상응한다.
폐내 투여에 의한 호흡기도 치료용 흡입제제는 예를 들어, 용액 또는 현탁액의 점적(drop)형태로 약리학적 활성성분을 분산시킬 수 있는 에어로졸 또는 분무제이다. 약리학적 활성성분이 용액으로 함유된 제제는, 이와는 별도로, 적합한 추진제를 함유하고, 또한 필요할 경우, 부가의 용매 및/또는 안정화제를 함유한다. 추진제 가스 대신, 압축공기를 또한 사용할 수 있고, 이는 적합한 압축 및 방출장치를 이용하여 목적한 바와 따라 제조될 수 있다. 공지되고 의학에 사용되는 버어드 호흡기가 투여에 특히 적합하며, 이와 같은 경우에 활성 성분의 용액은 장치내로 도입되며, 약간의 과압으로 기화되어 환자가 호흡할 때 폐내로 도입된다.
엘라스타제-억제 에글린 돌연변이체의 경우, 약 70㎏의 무게가 나가는 온혈동물(사람 또는 동물)에 대한 용량은 연령, 개체의 상태 및 질병의 특성에 따라서, 폐내 경로를 통하여 투여할 경우 한 번 흡입(일일 1회 내지 2회)시마다 약 10 내지 30㎎이고, 정맥내, 예를 들어 또한 지속된 주입에 의해 투여할 경우 1일당 약 10 내지 약 1,000㎎이다. ELISA와 같은 면역학적 방법에 의해 측정될 수 있는, 치료학적으로 유효한 타액 및 혈장 농도는 10 내지 100㎍/㎖(약 1내지 10μmol/1)이다.
트립산-억제 에글린 돌연변이체의 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사와 같은 비경구 투여로 수행한다. 치료학적 유효량은 활성성분 약 1 내지 20㎎/체중㎏범위의 용량이다. 약제학적 제제는 약 0.1 내지 약 100㎎/용액㎖농도의 활성성분을 함유한다. 활성성분이외에 이들 약제학적 제제는 또한 완충물질, 예를 들어 인산염 완충물질(상기 참조), 및 등장성을 이루게 하기 위한 염화나트륨, 만니톨 또는 솔비톨을 함유한다.
살충제
서열식(Ⅰ)의 신규한 에글린 돌연변이체는 또한 식물중에서 해충을 방제하는데 있어서 프로테이나제 억제제로서 사용될 수 있다. 다양한 식물의 속에서 천연적으로 발생하는 세린 프로테아제 억제제로부터, 이들이 식물병원성 곤충, 진균 및 기타 미생물내의 세린 프로테아제를 억제함으로써 상기 미생물에 대한 유효한 보호를 나타낸다고 추정된다. 더욱이, 단자엽식물강 또는 쌍자엽식물강 식물을 이종 프로테아제 억제제(예: 에글린 B 또는 C), 또는 서열식(Ⅰ)의 에글린 돌연변이체를 암호화하는 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 상응하는 활성 프로테이나제 억제제의 발현으로 형질전환된 식물을 식물병원체에 의한 감염으로부터 보호한다.
식물을 발현 조절 서열 및 본 발명의 화합물의 암호화 DNA를 함유하는 적합한 발현 벡터로 형질전환시키는데 널리 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어 조직의 원형질체 또는 분리된 단편을 적당한 벡터를 함유하는 아그로박테리아와 함께 공배양하고 완전한 식물로 재생하거나 적합한 변형되지 않거나 변형된 바이러스[예: TMV (Tobacco Mosaic Virus) 또는 CaMV(Cauliflower Mosaic Virus)]의 보조로 벡터를 전이시키는 방법이 있다. 다른 방법은 예를 들어, PEG의 보조로, 전기천공, 분리된 원형질체, 식물 칼루스(callus) 또는 배아내로의 DNA의 마이크로 주입, 또는 마이크로발사 충격에 의한 분리된 DNA(옥수수, 귀리, 보리, 쌀, 수수, 밀, 자당등과 같은 단자엽식물강 식물의 경우에 바람직함)의 직접적 전이가 있다.
본 발명의 화합물의 암호화 DNA분자는 식물내로 형질전환시키는데 적합하다. R이 아세틸이고, W가 Tyr 이며, X가 Thr이고, Y가 Arg이며 Z가 Asp인 서열식(Ⅰ)의 에글린 돌연변이체의 암호화 DNA분자가 바람직하다. 상응하는 바람직한 에글린 돌연변이체의 프로테아제-억제작용은 옥수수 병원체 디아브로티카 버지페라(Diabrotica virgifera)(서양 옥수수 근충)를 사용한 시험에서 연구될 수 있다. 바람직한 에글린 돌연변이체를 병원체의 장 조직의 파쇄물에 첨가한 결과 단백질 분해활성이 현저하게 억제되었다.
본 발명은 특시 실시예에 기술되는 에글린 돌연변이체, 이의 암호화 DNA, 이 DNA를 함유하는 발현 플라스미드, 이 발현 플라스미드를 함유하는 숙주 미생물 및 이들의 제조를 위해 기술된 방법에 관한 것이다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하는 것으로써 제한하려는 것이 아니다.
[실시예 1, 에글린 C 유전자의 M13 클로닝]
플라스미드 pML 147 10㎍을 제한 엔도튜클레아제 Eco RI 및 Bam HI로 분해한 후, 1.5%의 저융점 아가로즈중에서 전기영동시켜 230bp Eco RI-Bam HI 단편(완전 에글린 C 유전자 포함) 약 0.5㎍을 분리한다. 이 DNA단편(10ng)을 M13mp8 DNA(Eco RI 및 Bam HI로 미리-분해됨) 40ng와 혼합하고 15μ1 용적의 T4 DNA리가 제0.125단위의 존재하에서 50mM 트리스-HC1(pH 7.4), 10mM MgCl2, 10mM ATP, 10mM디티오트레이톨 중에서 항온처리한다.[참조: Zoller et al., Methods Enzym. 100, 468-500(1983)]. 생성된 용액을 사용하여 이. 콜라이 균주 JM 101을 형질전환시킨다.(Zoller et al., 상기 참조). 형질전환 혼합물을 X-Gal(IPTG-지시제-한천)평판에 도포한다.(Zoller et al., 상기 참조). 40개의 푸른색(야생형) 및 650개의 무색 플라크를 수득한다.
[실시예 2, M13mp8 일본쇄 DNA의 제조]
이. 콜라이 JM101의 배양물[L 배지(ℓ당 박토트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g, NaCl 5g, 글루코즈 5g, 앰피실린 0.1g)중에서 0D623가 약 0.5가 될 때까지 배양시킴] 2㎖를 무색의 플라크(한천 평판으로부터 취함, 참조 : 실시예 1)로 접종시켜 37℃ 및 180rpm에서 약 4 내지 5시간 동안 유지시킨다. 이어서 성장 배양물을 에펜도르프 원심분리기내에서 5분간 원심분리시킨다. 상등액을 새로운 원심분리 튜브에 옮겨서 다시 원심분리시키고, 20%폴리에틸렌 글리콜 및 1.5M NaCl 200μl을 첨가하여 전체를 실온에서 20분간 유지시킨 후 다시 원심분리시킨다. 상등액을 버리고 펠렛을 50mM 트리스-HCl(pH 7.8) 및 1mM EDTA(TE) 100μl중에 용해시킨다. 그 혼합물을 페놀/TE 50μl와 혼합한 후(실온에서 15분) 에펜도르프 원심분리기중에서 5분간 원심분리시킨다. 나트륨 아세테이트(pH 6) 10μl 및 무수 에탄올(250μl) 3용적을 상등액 100μl에 첨가하고 전체를 -20℃에서 밤새 유지시킨 후 상기에 기술한 바대로 10분간 원심분리시킨다. 펠렛을 80% 에탄올 1㎖로 세척하고 다시 원심분리시킨다. 펠렛을 실온에서 10분간 건조시킨 후, TE 50μl중에 용해시킨다. 이 용액은 약 5㎍의 M13mp8 일본쇄 DNA를 함유한다.
[실시예 3, [Arg 45]-에글린 C를 암호화하는 유전자의 제조]
a. 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드의 키나제 처리
다음 뉴클레오타이드를 돌연변이 유발을 위해 화학적 합성에 의해 제조한다.
5′- dCTCCTTGTTACTCGGGACC-3′
올리고 뉴클레오타이드(1 OD/㎖=500ng) 10μl를 0.07M 트리스-HCl(pH 7.6), 0.01M MgCl2, 50mM 디티오트레이톨 20μl중에서 [-32P]ATP 및 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Boehringer)로 키나제 처리한다. [참조: Molecular Cloning, A Laboratory Manual. ed. T. Maniatis rt., page 125].키나제 처리된 올리고뉴클레오타이드를 TE(50ng-μl중에 용해시킨다.
b. 에글린 C유전자의 돌연변이
3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5'
+5'-CT CCT GTT ACT ACT CGG GAC C-3' (Ⅰ)
(올리고 프라이머)
5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3'
3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5' (Ⅱ)
돌연변이
42Pro Val Thr Arg Asp
5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3'
3'-GA GGA CAA TGA GCC CTG G-5' (Ⅲ)
돌연변이도식
50mM 트리스-HC1(pH 7.8), 100mM MgCl2, 10μl중의 키나제 처리된 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 50ng와 M13mp8 일본쇄 DNA 1μ를 45℃(30분)에서 이어서 실온에서(5분)유지 시킨다.(어닐링). 이어서 다음을 이 혼합물에 가한다. 10mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP 각각 1μl, T4 DNA 리가제 1μl, 50mM 디티오트레이톨 2μl, 10mM ATP 1μl, 50㎎/ml 젤라틴 1μl, 10배 농축 클레노우 완충액(0.66M 트리스-HCl(pH 7.6), 50mM MgCl2, 50mM 디티오트레이톨) 1μl, 및 DNA 폴리머라제(클레노우 단편) 1μl=2.5단위.
혼합물을 22℃에서 5분간 이어서 15℃에서 16시간 유지시킨 후 최종적으로 1%아가로즈상에서 전기영동적으로 분리한다. 생성된 환형, 이본쇄 DNA를 에티듐 부로마이드로 가시화시키고 전기용출시켜 겔로부터 분리한다.(15μl TE중 약 10ng). 이러한 방법으로 수득한 DNA 5μl(=약 3.5ng)을 이. 콜라이 균주 JM 101내로 형질 전환시키고 X-Gal/IPTG지시제 평판상에 도포한다(참조 : 실시예 1). 약 100개의 무색 플라크를 수득한다.
이 플라크중 40개를 2ml의 이. 콜라이 JM101배양물을 접종시키는데 사용한 (참조 : 실시예 2)항온처리(실시예 2)후, 이. 콜라이 세포를 상등액(이는 파아지 및 일본쇄 DNA를 포함하며, 세포 펠렛은 이미 상응하는 돌연변이된 이본쇄 DNA를 포함한다)으로부터 원심분리하여 분리시킨다.
각 경우에 40개의 파아지 상등액 50μl를 니트로셀룰로즈를 통해 여과시키고, 세척(2xTE)하고, 진공하에 2시간 동안 80℃에서 유지시킨후, 서던(Southern)[참조 : J. Mol.Biol. 98, 503-517(1975)]에 따라, 방사성 탐침(하이브리드화)으로서 올리고머뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 돌연변이된 DNA서열(Ⅲ, 참조 : 도식)의 존재를 조사한다. 이에 따라[Arg 45] 에글린C유전자를 함유하는 12개의 잠정적 파아지 상등액을 형성한다. 이들 양성 파아지 상등액중 4개를 희석시키고(약 1:105), 이. 콜라이 균주 JM 101와 혼합하여 지시제 한천상에 도포한다. 각각의 형성된 플라크중 3개의 파아지를 분리시킨다. 일본쇄 DNA를 이로부터 상기 기술된 방법으로 분리시킨다. 이들 12개의 일본쇄 DNA를 생거(Sanger)의 방법 [참조 : SCIENCE 214, 1205(1981) : Proc. Natl. ACAD. Sci. USA 74, 5463(1977)]에 따라 서열분석한다. 12개의 일본쇄 DNA 모두가 목적하는 돌연변이된 에글린 C서열을 나타낸다.
소형 제제에 있어서, 각각의 돌연변이된 이본쇄 DNA(플라스미드 M13mp8중의 [Arg 45]에글린 C 유전자)를 상응하는 이. 콜라이 세포 펠렛으로부터 제조한다(상기 참조). 제한 엔도뉴클레아제 Eco RI 및 Bam HI으로 제한 분해하여, 돌연변이된 유전자를 함유하는 Eco RI 및 Bam HI 삽입체를 벡터로부터 절단하고, 분리하여 벡터 pHRi 148/Eco RI/Bam HI내에 클로닝시킨다.(유럽 특허원 제146785호). 이로부터 생성된 플라스미드 pJB 618을 분리시키고, 이. 콜라이 균주 HB 101 이내로 형질전환시킨다. 플라스미드 pJB 618로 형질전환시킨 균주를 이. 콜라이 HB 101-pJB 618로 명명한다.
[실시예 4, [Pro 44]-에글린C를 암호화하는 유전자의 제조]
[Thr 44]-[Pro 44]돌연변이를 실시예3에 기술된 바와 유사한 방법으로 수행한다. 사용된 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드는 다음의 구조를 가진다.
5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3'
에글린C유전자의 돌연변이가 다음 도식에 나타난다.
3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5'
+5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC C-3' (Ⅰ)
(올리고 프라이머)
5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC C-3'
3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5' (Ⅱ)
돌연변이
42Pro Val Pro Leu Asp
5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC C-3'
3'-GA GGA CAA GGA GAC CTG G-5' (Ⅲ)
돌연변이 혼합물의 후처리를 수행하여 18개의 잠정적 [Pro 44]-에글린C 돌연변이체를 수득한다.
벡터 pHRi 148/Eco RI/Bam HI내에 [Pro 44]-에글린C DNA를 클로닝하여, 플라스미드 pJB 591을 실시예 3에 기술된 바와 유사한 방법으로 수득한다. 이 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 HB 101균주를 이. 콜라이 HB 101/pJB 591로 명명한다.
[실시 예 5, [Arg 45, Ser 46]-에글린C를 암호화하는 유전자의 제조]
[Leu 45, Asp 46]-[Arg 45, Ser 46] 돌연변이를 실시예 3에 기술된 바와 유사한 방법으로 수행한다. 사용된 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드는 다음 구조를 갖는다.
5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3'
에글린 C유전자의 돌연변이가 다음 도식에 나타난다.
3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5'
+5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3' (Ⅰ)
(올리고 프라이머)
5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3'
3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5' (Ⅱ)
돌연변이
5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3'
3'-CAT TGC GTC TCT TGC TCA TTG TCC-5' (Ⅲ)
Leu47Ser Arg Thr Val43
돌연변이 혼합물을 후처리하여 12개의 잠정적 [Arg 45, Ser 46]-에글린C-돌연변이체를 수득한다. 플라스미드 pML 147/b를 [Arg 45, Ser 46]-에글린C-DNA를 벡터 pHRi 148/Eco RI/Bam HI내로 클로닝하여 실시예 3에 기술된 바와 유사한 방법으로 수득한다. 이 플라스미드로 형질전환된 이. 콜라이 HB 101균주를 이. 콜라이 HB 101/pML 147/b로 명명 한다.
[실시예 6, 형질전환된 이. 콜라이 균주 배양]
형질전환된 이. 콜라이 HB 101균주를 5ml의 L 배지(참조 : 실시예 2)중에서 37℃ 및 250rpm에서 밤새 배양한다. 이어서 이러한 밤새 배양한 배양물 1ml를 이어서 25ml의 M9배지에 옮긴다.
M9 배지는 다음과 같이 구성된다(리터당) : Na2HPO4.7H2O 13.25g, KH2PO43.0g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1.0g, CaCl2.2H2O 0.015g, MgSO2.7H2O 0.25g, 카사미노산 2.5g, 비타민 B1 0.0099g, 글루코즈 5.0g, 앰피실린 0.1g 37℃ 및 250rpm에서 배양을 수행한다. 8 내지 10시간후, 배양물은 에글린 C 돌연변이체가 최고로 높은 역가에 도달한다.[U. Seemuler et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358,1105 (1977)]에 따라 프로테아제 사람 백혈구 엘라스타제를 측정하여 구함
[실시예 7, 에글린 돌연변이체의 분리 및 정제]
과생성 이.콜라이 세포를 다이노 밀을 사용하여 기계적으로 붕괴시킨다. 세포 부스러기를 소발(Sorval) 원심분리기에서 9000rpm에서 30분동안 원심분리시킨다. 산에 대한 에글린 돌연변이체의 높은 안정성 때문에, 상등액중의 다수의 외인성 단백질을 약 20% 아세트산으로 침전시켜 제거할 수 있다: 40% 수성 아세트산 10ml로 10분내에 상등액 100ml에 피펫으로 적가한다. 이러한 산성 용액(pH 3.4)을 얼음으로 냉각시키면서 1시간 동안 교반시킨다. 침전된 외인성 단백질 및 기타 세포 성분들을 소발 원심분리기에서 9000rpm으로 30분간 원심분리시킨다. 상등액을 버티스 프리즈모빌(Virtis Freezemobile)중에서 밤새 동결 건조시킨다.
건조된 황색의 동결건조물을 10mM 트리스-HCl(pH 7.0) 10ml중에 용해시키고 짧게 원심분리시켜 맑은 용액으로 만든다(Sorval SS34; 15000rpm, 10분). 맑은 황색 상등액을 평형화시킨 길이 100㎝ 직경 2.5㎝의 세파덱스 G-50 초미세 칼럼(Pharmacia)에 가한다. 최대 20ml-h의 유속의 10mM 트리스-HCl(pH 7.8)으로 용출을 수행한다. 용출물의 흡광도를 280nm에서 기록한다. 10ml의 분획을 수집한다.
용출 다이어그램은 문제의 에글린 돌연변이체를 함유하는 고 피크(분획 31 내지 40)를 나타낸다. 이들 분획중의 에글린 돌연변이체의 순도를 SDS겔 전기영동 및 HPLC로 확인한다. 겔 여과를 수행한 후, 에글린 돌연변이체는 약 99%의 순도를 나타낸다.
에글린 돌연변이체 분획으로부터 완충액을 제거하는 것은 YM-2 막(MWCO 2000)을 갖는 AMICON농축 셀로 수행한다. 한외여과시킨후 샘플을 다시 동결 건조시킨다. 무색의 분말을 수득하며(약 250㎎/100ml Dynomill 분해), 이를 약 -20℃에서 저장한다.
[실시예 8, 에글린 돌연변이체의 물리화학적 특성화]
a. [Pro 44]-에글린 C
실시예 7에 따라 정제된 [Pro 44]-에글린 C를 FAB-MS의 방법으로 분자량 측정을 한다. 분자 이온 피크[M-H+]는 8130.6에서 명백하다. 따라서 이 방법에 따라 수득된 생성물은 N-아세틸-[Pro 44]-에글린 C이다(M-H+에 대한 이론치 : 8130.07).
에글린 돌연변이체의 트립신 분해로부터 7개의 단편을 생성하며, 이중 돌연변이 Thr 44-Pro 44를 함유하는 단지 4개의 단편만이 상의하는 Nα-아세틸-에글린 C의 단편들과 다르다(참조: 유럽 특허원 제146785호). 따라서 에글린 돌연변이체는 Nα-아세틸-[Pro 44]-에글린 C로 명명된다.
PAGE-SDS겔 전기영동 [참조 : U.K. Laemmli, Nsture 227, 680-685(1970)]에서, Nα-아세틸-[Pro 44]-에글린 C는 Nα-아세틸-에글린 C와 동일한 양상을 나타낸다.
b. [Arg 45]-에글린 C
정제된 [Arg 45]-에글린 C의 분자량 측정으로부터 8175.[M-H+]치를 얻는다. 따라서, 이 경우 또한 N-아세틸 화합물이 존재한다.([M-H+의 이론치 : 8175). 트립신에 의한 효소적 분해는 화합물이 Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린 C임을 명백하게 한다.
PAGE-SDS겔 전기영동에서, Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린 C는 또한 Nα-아세틸-에글린 C와 동일한 양상을 나타낸다.
c. [Arg 45, Ser 46]-에글린C
정제된 [Arg 45, Ser 46]-에글린C의 분자량을 결정으로부터 8148.7[M-H+]의 값을 얻는다. 따라서, 이 경우 또한, N-아세틸 화합물이 존재한다.(M-H+의 이론치 : 8149.1). 에글린 돌연변이체의 트립신 분해는 화합물이 Nα-아세틸-[Arg 45, Ser 46]-에글린C임을 나타낸다.
PAGE-SDS겔 전기영동에서, Nα-아세틸-[Arg 45, Ser 46]-에글린C는 또한 Nα-아세틸-에글린 C와 동일한 양상을 나타낸다.
[실시예 9, 에글린 돌연변이체의 역학 특성화]
억제상수 Ki의 측정을 문헌[참조 : N. Braum et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368,299-308(1987)]에 따라 프로테이나제-억제제 기질 혼합물로부터 p-니트로아닐린 방출의 정상 상태에서 반응속도를 측정하여 수행한다. 단지 억제제 농도만을 변화시킨다. 곡선 OD405대 시간이 일차식이므로, p-니트로 아닐린의 방출은 10 내지 20분에 일어난다. Ki는 여러 가지 기울기로부터 구할 수 있다. 사용된 프로테이나제는 사람의 백혈구 엘라스타제(HLE), 키모트립신 및 트립신이다. 억제 상수의 예들을 다음 표에 열거한다.
Figure kpo00001
그 결과, Leu 45를 Arg 45로 대체하여 수득한 에글린C 돌연변이체는 천연 에글린C와는 대조적으로 매우 강한 트립신 억제제이나 단지 약한 HLE억제제로 나타난다.
[실시예 10, 효모에서[Arg 45]-에글린C 및 Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린C의 발현]
효모에서 외인성 유전자에 대한 발현 시스템은 외인성 유전자 삽입에 대한 유일한 제한 부위에 의해 분리되는 직렬 배열의 강력한 효모 프로모터(바람직하게는 유도성 프로모터) 및 효모 전사 종결 시그날을 필요로 한다. 발현 벡터는 또한 효모에서 자동복제를 허용하며 높은 플라스미드 복제수를 유도하는 효모 DNA 서열을 포함한다. 이들 서열은 바람직하게는 효모 2μ서열이다. 벡터는 또한 효모 선별 마커, 바람직하게는 효모 LEU 2 유전자는 물론 복제 기원을 함유하는 pBR 322 DNA서열 및 이. 콜라이에서 증식을 위한 앰피실린 내성 유전자를 갖는다. 이러한 벡터는 이. 콜라이 및 효모에서 사용하기 위한 셔틀(shuttle)벡터이다.
상기 기술한 적합한 발현 시스템은 유럽 특허원 제100,561로 공개되어 있으며 효모에서 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 외인성 유전자는 효모의 산 포스파타제의 유도성 PH05 프로모터의 조절하에 발현된다. PH05 프로모터, 외인성 유전자 및 PH05 전사 종결 시그날을 플라스미드 pJDB 207에 직렬 배열로 삽입한다. 이는 효모 2μ서열, 효모 LEU 2 유전자, 이. 콜라이 복제 기원 및 앰피실린 내성 유전자를 포함한다.
발현 플라스미드 pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL은 다음과 같이 작제한다.
a) pJDB 207벡터 단편의 분리
플라스미드 pJDB 207R/ⅠF(α-3)(EPA 100, 561) 6㎍을 제한 엔도뉴클리아제 Bam HI으로 완전히 분해한다. 생성된 6.85kb 및 1.15kb크기의 DNA단편을 에탄올로 침전시키고 송아지 장의 알카리성 포스파타제(Boehringer, Mannheim) 4.5단위를 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 400μl재현탁시킨다. 혼합물을 1시간 동안 37℃에서 항온처리한다. 이어서, 포스파타제를 65℃에서 1.5시간 동안 항온처리하여 불활성화시킨다. 용액을 150mM NaCl로 조정한다. DNA용액을 150mM NaCl 및 1mM EDTA를 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 평형시킨 DE 52(Whatman) 음이온 교환기의 100μl베드에 가한다. 동일 완충액으로 세척한 후, DNA를 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1.5M NaCl, 1mM EDTA의 400μl 용출시키고 에탄올로 침전시킨다. 큰 6.85kb Bam HI 단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액(pH8.3)중의 0.6% 저용융 아가로즈겔상에서 작은 단편으로부터 분리시킨다.
b) 534bp PH05프로모터 단편의 분리
플라스미드 p31/R(EPA 100,561) 10㎍을 제한 엔도뉴클리아제 Eco RI 및 Bam HI으로 분해시킨다. 생성된 3개의 단편의 트리스-보레이트-EDTA 완충액(pH 8.3)중의 0.6% 저용융 아가로즈겔상에 분리시킨다.
mRNA개시 부위를 포함한 PH05 프로모터를 함유하는 534bp Bam HI-Eco RI 단편을 분리한다.
c) [Arg 45]-에글린 C의 암호화 서열을 함유하는 230bp DNA단편의 분리
플라스미드 pJB 6188㎍을 제한 엔도뉴클리아제 Bam HI 및 Eco RI로 분해시킨다. 생성된 2개의 DNA단편을 트리스-보레이트-EDTA 완충액(pH 8.3)중의 0.6% 저용융 아가로즈겔상에 분리시킨다. 230bp 단편을 분리한다.
d) DNA단편의 연결
적합한 점착성 말단을 가진 상기한 3개의 DNA 단편(a 내지 c)을 하나의 반응으로 연결시킨다. 6.85kb Bam HI벡터 단편 0.1pmole(0.45㎍), 534 bp Bam HI-Eco RI PH05 프로모터 단편 0.2pmole(70ng) 및 pJB 618의 230bp Eco RI - Bam HI단편 0.2pmole(29ng)을 연결시킨다. 3개의 DNA 단편 모두를 저용융 아라로즈의 작은 겔 블록에 넣는다. 3개의 아가로즈 겔 조각을 모으고, 65℃에서 액화하여 2배로 희석한다. 15℃에서 16시간 동안 총 용적 270μl의 60mM 트리스-HCI(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP중에서 T4 DNA 리가제(Boehringer, Mannheim) 16단위로 연결시킨다. 연결 혼합물 10μl 분취량을 칼슘 처리된 형질전환용 컴피턴트 이. 콜라이 HB 101 세포에 가한다.
24개의 형질전환된 ampR콜로니를 100㎍/ml의 앰피실린을 함유한 LB 배지중에서 개별적으로 성장시킨다. 플라스미드 DNA를 문헌[참조: Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193(1981)]의 방법에 따라 제조하여 Hind Ⅲ/Eco RI 이중 분해에 의해 분석한다. 600bp Eco RI-Hind Ⅲ 단편의 출현은 특정 클론이 발현 벡터내에 정확안 배향으로 삽입된 PH05 프로모터- [Arg 45]에글린 C-DNA 단편을 가짐을 시사한다. 예견한 바와 같이, 약 50%의 클론이 적확한 배양의 삽입체를 갖는다. 이들 클론중 하나를 분리시켜 pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL로 명명한다.
e) 사카로마이세스 세레비지애 GRF18의 형질전환
플라스미드 pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL을 문헌[참조: Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929(1978)]에 기술된 형질전환 프로토콜을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애의 균주 GRF18(α, his 3-11, his 3-15, Leu 2-3, Leu 2-112, canR)내에 도입시킨다. 형질전환된 효모 세포를 루이신이 결핍된 효모 최소 배지 평판상에서 선별한다. 단일의 형질전환된 효모 콜로니를 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 GRF18/ pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL로 명명한다.
f) 사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL의 발효 및 [Arg 45]-에글린C 및 Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린C의 회수
사카로마이세스 세레비지애 GRF18/pJDB207R/PH05-[Arg 45] EGL의 세포를 30℃의 미니 바이오리액터(Mini-Bioreactor)상에서 0.03g/1 KH2PO4를 함유한 3ℓ의 최소 배지중에서 성장시키고 OD600가 1.9일 때 회수한다. [Arg 45]-에글린C 및 Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린C를 2:1(w/w)의 비율로 발현시킨다. 두 생성물 모두를 실시예 7에서의 이. 콜라이에 대한 방법에 따라 효모 세포 분쇄물로부터 분리할 수 있다.
[실시예 11, 약제학적 제제]
Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린C를 함유하고 실시예 7에 따라 제조된 용액을 0.9% NaCl용액에 대해 투석한다. 이어서 용액의 농도를 동일한 NaCl용액으로 희석하여 1㎎/ml 또는 10㎎/ml 로 조정한다. 이 용액을 한외여과(0.22㎛ 세공의 막)하여 멸균시킨다.
멸균 용액을 정맥투여용 및 장기 점적 주입용으로 직접 사용할 수 있다.
미생물의 기탁
이. 콜라이 HB 101/pML 147은 1988년 1월 28일에 Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen(DSM)에 기탁번호 제DSM 4380호로서 기탁되었다.

Claims (9)

  1. 하기 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염.
    R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal
    AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnYyrAspVal-W-PheLeu
    ProGluGlySerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn
    ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (Ⅰ)
    상기 식에서, R은 수소 또는 아세틸이고, W는 Tyr 또는 His이고, X는 Thr, Ser 또는 Pro이고, Y는 Leu, Met, Arg, Lys, Phe, Try 또는 Trp이며, Z는 Asp, Glu, Gln, Asn, Ala, Ser 또는 Thr이고, 단 Y가 Leu이고 Z가 Asp일 때 X는 Thr이 아니다.
  2. 제1항에 있어서, R은 아세틸이고, W가 Tyr이며 ; X는 Thr이고 Y는 Arg, 또는 Lys 이고 Z는 Asp, Glu, Gln, Asn, Ala, Ser 또는 Thr이거나, X는 Pro이고 Y는 Met이고 Z는 Asp이거나, X는 Thr이고 Y는 Phe, Tyr, Trp 또는 Met이며 Z는 Asp인 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염.
  3. 제1항에 있어서, R이 아세틸이고, W가 Tyr이고 : X는 Thr이고, Y는 Arg이며, Z가 Asp 또는 Ser 인 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염.
  4. 제1항에 따른 Nα-아세틸-[Arg 45]-에글린C.
  5. 제1항에 따른 서열식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 엘라스타제, 트롬빈 또는 트립신 억제제의 사용을 필요로 하는 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  6. 서열식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하는 DNA를 함유하는 형질전환된 에스케리키아 콜라이 또는 사카로마이세스 세레비지애를 배양하고, 이로부터 서열식(Ⅰ)의 화합물 또는 이의 염을 분리시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따른 서열식(Ⅰ)의 화합물 및 이의 염을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 따른 서열식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하는 DNA서열을 함유하는 DNA.
  8. 제1항에 따른 서열식(Ⅰ)의 화합물을 암호화하며 발현 조절 서열에 의해 조절되는 DNA서열을 함유하는 발현 벡터.
  9. 제8항에 따른 발현 벡터를 함유하는 에스케리키아 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지애.
KR1019890002759A 1988-03-07 1989-03-07 에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물 KR0134377B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH840/88-6 1988-03-07
CH84088 1988-03-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR890014735A KR890014735A (ko) 1989-10-25
KR0134377B1 true KR0134377B1 (ko) 1998-04-20

Family

ID=4196431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019890002759A KR0134377B1 (ko) 1988-03-07 1989-03-07 에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5079229A (ko)
EP (1) EP0332576B1 (ko)
JP (1) JP2716191B2 (ko)
KR (1) KR0134377B1 (ko)
AT (1) ATE103930T1 (ko)
AU (1) AU623881B2 (ko)
CA (1) CA1339105C (ko)
DD (1) DD283645A5 (ko)
DE (1) DE58907373D1 (ko)
DK (1) DK107389A (ko)
ES (1) ES2063161T3 (ko)
FI (1) FI96116C (ko)
HU (1) HU209401B (ko)
IE (1) IE62993B1 (ko)
IL (1) IL89496A0 (ko)
NO (1) NO178870C (ko)
NZ (1) NZ228208A (ko)
PT (1) PT89916B (ko)
TW (1) TW211522B (ko)
ZA (1) ZA891679B (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6342373B1 (en) * 1983-11-21 2002-01-29 Ucp Gen-Pharma Ag Process for preparing recombinant eglin, protease inhibitor
US5674833A (en) * 1990-09-18 1997-10-07 Novo Nordisk A/S Detergent compositions containing protease and novel inhibitors for use therein
US5604201A (en) * 1993-01-08 1997-02-18 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of The Oregon Health Sciences University, A Non-Profit Organization Methods and reagents for inhibiting furin endoprotease
TW492975B (en) * 1993-07-26 2002-07-01 Novartis Ag Tryptase inhibitor
BR9711540A (pt) 1996-09-24 2001-06-19 Protector & Gamble Company Inibidores de protease proteìnico estabilizados e variantes dos mesmos
US7001884B2 (en) * 2001-06-18 2006-02-21 Regents Of The University Of Michigan Eglin c based drugs for treatment of disease

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
DE3324534A1 (de) * 1983-07-07 1985-01-17 Ciba-Geigy Ag, Basel Modifizierte protease-inhibitoren, verfahren zu ihrer herstellung und daraus bereitete pharmazeutische mittel
GR80965B (en) * 1983-11-21 1985-03-20 Ciba Geigy Ag Method for the preparation of protease inhibitors
US4711848A (en) * 1984-03-14 1987-12-08 Zymogenetics, Inc. Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin
DE3585969D1 (de) * 1984-06-14 1992-06-11 Chiron Corp Protease-inhibitoren des alpha-1-antitrypsin typs mit modifizierter aktiever stelle und deren herstellung.
HU204563B (en) * 1984-12-06 1992-01-28 Synergen Biolog Inc Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them
GB2188322A (en) * 1986-03-26 1987-09-30 Bayer Ag Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host
GB2199582A (en) * 1987-01-07 1988-07-13 Bayer Ag Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
DD283645A5 (de) 1990-10-17
DK107389D0 (da) 1989-03-06
FI96116B (fi) 1996-01-31
ES2063161T3 (es) 1995-01-01
KR890014735A (ko) 1989-10-25
NO178870C (no) 1996-06-19
NO890932D0 (no) 1989-03-06
AU3095989A (en) 1989-09-07
EP0332576A2 (de) 1989-09-13
TW211522B (ko) 1993-08-21
US5079229A (en) 1992-01-07
IE890719L (en) 1989-09-07
ATE103930T1 (de) 1994-04-15
PT89916B (pt) 1994-05-31
PT89916A (pt) 1989-11-10
FI96116C (fi) 1996-05-10
JPH029392A (ja) 1990-01-12
NO890932L (no) 1989-09-08
FI891020A (fi) 1989-09-08
NO178870B (no) 1996-03-11
DE58907373D1 (de) 1994-05-11
IE62993B1 (en) 1995-03-08
FI891020A0 (fi) 1989-03-03
AU623881B2 (en) 1992-05-28
NZ228208A (en) 1990-08-28
DK107389A (da) 1989-09-08
CA1339105C (en) 1997-07-29
ZA891679B (en) 1989-10-25
EP0332576B1 (de) 1994-04-06
HU209401B (en) 1994-05-30
HUT50503A (en) 1990-02-28
JP2716191B2 (ja) 1998-02-18
IL89496A0 (en) 1989-09-10
EP0332576A3 (en) 1990-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU604953B2 (en) Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology, process, expression vector and recombinant host therefor and pharmaceutical use thereof
CA1339106C (en) Hirullin polypeptides having anticoagulant activity
JPH08504568A (ja) ウシ膵トリプシン阻害因子から誘導される因子ＶＩＩａ−組織因子複合体の阻害因子
CA1326216C (en) Dna sequences coding for proteins having the biological activity of husi-type i inhibitors, biotechnological methods for the preparation of said proteins and pharmaceutical compositions containing said proteins
CA2025070C (en) Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homgeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof
KR0134377B1 (ko) 에글린 b 및 에글린 c의 돌연변이체, 이를 암호화하는 dna 서열, 이러한 dna를 포함하는 재조합 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 돌연변이체를 제조하는 방법 및 돌연변이체를 함유하는 약제학적 조성물
WO1988003171A1 (en) Human pancreatic secretory trypsin inhibitors produced by recombinant dna methods and processes for the production of same
EP0352228A2 (en) Novel proteins
US5180667A (en) Genes encoding eglin C mutants
US5268296A (en) DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
DE69432975T2 (de) Tryptase hemmer
EP0352227A2 (en) Modified proteins
US5231010A (en) Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof
US6077827A (en) Family of peptides known as xenoxins
US5739283A (en) Prevention of invasive pulmonary aspergillosis with serine proteinase inhibitors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20011229

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee