PT89916B

PT89916B - Processo para a producao de proteinas modificadas

Info

Publication number: PT89916B
Application number: PT89916A
Authority: PT
Inventors: Markus Gerhard Grutter; Manfred Liersch; Dirk Heinz
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1994-05-31
Also published as: HU209401B; FI891020A0; EP0332576A3; JP2716191B2; NO890932L; ES2063161T3; DK107389A; NO890932D0; US5079229A; IL89496A0; EP0332576B1; CA1339105C; ZA891679B; NO178870C; KR0134377B1; AU3095989A; NO178870B; JPH029392A; IE62993B1; NZ228208A

Description

CIBA-GEIGY AG e UCP GEN-PHARMA AG_O ,

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS MODIFICADAS

-2Mais concretamente estas novas proteínas modificadas são preparadas por cultura de um microorganismo hospedeiro transformado que contem um DNA codificador do composto pretendido, seguido de isolamento do referido composto ou de um seu sal.

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invento relaciona-se com mutantes de inibidores de proteases eglina B e eglina C, vectores hibridos adequados à produção de tais mutantes e microorganismos hospedeiros transformados com tais vectores híbridos, assim como com processos para a produção dos referidos vectores hibridos, microorganismos hospedeiros transfor mados e mutantes de eglina.

Dois inibidores de proteases isolados a partir da sanguessuga (Hirudo medicinalis) , designados eglina B e eglina C, estão descritos em German Offenlegungsschrift N2 2808396. Estes polipeptid eos consistem em 70 aminoácidos cada tendo um peso molecular de aproximadamente 8100 e são inibidores poderosos da quiniotripsina, subtilisina, das proteases de granulócitos de animais e humanos elastase e catepsina G e também da protease de mastócitos quinase. Pelo contrario, proteases semelhantes à tripsina não são inibidas ou são inibidas apenas num grau insignificante .

A eglina C tem a seguinte estrutura primária:

H-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH

A eglina C ao contrario da maior parte dos inibidores de proteases conhecidos, não contem quaisquer pontes dissulfureto. Tendo em consideração o seu peso molecular relativamente pequena é invulgarraente estável relativamente à desnaturação por ácidos, solução de hidróxido alcalinos ou calor e relativamente à degradação proteolitica. A estrutura primária da eglina B difere da da eglina C pela substituição do aminoácido 35, tirosina, por histidina.

As eglinas estão ate à data entre os inibidores mais fortes conhecidos da elastase de granulócitos humanos ou de animais e da catepsina G de granulócitos humanos. A libertação incontrolada ou excessiva destas proteases celulares no organismo pode intensificar um processo ihflamatório e causar destruição de tecidos por proteólise não especifica. Estas enzimas, que são responsáveis pela digestão intracelular, são optimamente activas num meio fisiológico (neutro a fracamente alcalino) e permitem que substâncias nativas dos tecidos (por exemplo elastina) e factores humoriais (por exemplo factores de coagulação do sangue ou factores do complemento) sejam rapidamente destruídos e inactivadas. Devido às suas propriedades as eglinas são portanto de interesse considerável para uso em terapia medicinal (anti-inflamatórios , antiflogísticos, choque séptico, efisema pulmonar, mucoviscidose, etc.).

Recentemente tomou-se possivel obter eglinas por processos recombinantes de engenharia genética recombinante (cf. PedLdo de Patente Europeia No. 146785).

problema subjacente ao invento é produzir novos inibidores de proteases partindo do da eglina B ou da eglina C.

-5Este problema foi solucionado de acordo com o invento pela obtenção de mutantes de eglina que diferem das eglinas naturais B e C pela substituição de um, dois ou três aminoácidos na região do centro activo (aminoácidos 45 e 46, Leu-Asp) por outros aminoácidos. Os mutantes de eglina assim obtidos de acordo com o invento apre sentam propriedades surpreendentes: comparados com eglina B e eglina C eles distinguem-se por uma maior especificidade na inibição de certas proteases ou pela inibição de proteases que não são inibidas ou apenas escassamente inibidas por eglinas B e C, por exemplo tripsina ou trombina.

invento está especificamente relacionado com mutantes de eglina de fórmula

R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-PheLeu

ProGluGlySerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsn

ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (I)>

em que R e hidrogénio ou acetilo, V é Tir ou His, X é Tre, Ser ou Pro, Y é Leu, Met, Arg, Lis, Fen, Tir ou Trp e Z é Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser ou Tre, com a condição de X não ser Tre quando Y for Leu e Z ser Asp, e seus sais.

invento relaciona-se especificamente com compostos da fórmula I em que R é acetilo, W é Tir e X é Tre, Y é Arg ou Lis e Z é Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser ou Tre, ou X é Pro, Y ó Met e Z é Asp ou X é Tre,

Y é Fen, Tir, Trp ou Met e Z é Asp e seus sais.

O invento relaciona-se princi-6\.

palmente com compostos da formula I em que R e acetilo, V é Tir, X é Tre, Y é Arg e Z é Asp, ou Ser, e seus sais.

invento está especialmente relacionado com um composto da Formula I em que R e acetilo, W é Tir, X é Tre, Y é Arg e Z é Asp e seus sais.

Os novos compostos da fórinula I podem estar não só na forma livre, mas também na forma dos seus sais, especialmente os seus sais f armaceut i camente acei táveis. Uma vez que eles contêm vários residuos de aminoácidos tendo grupos amino ou grupos guanidino livres, os compostos do invento podem, por exemplo, estar na forma de sais de adição ácida. Sais de condição ácida adequados são especialmente os sais fisiologicamente tolerados com os ácidos vulgarmente aceites em terapêutica. São ácidos inorgânicos adequados os ácidos hidro-hálicos (como sejam o ácido clorídrico) mas também o ácido sulfurico e fosfórico ou pirofosférico; são ácidos orgânicos adequados especialmente os ácidos sulfénicos (como sejam benzeno ou ácido p-toluenossulfénico ou ácidos alcano inferior-sulfénicos) tais como ácido metanossulfónico) e também ácidos carboxilicos, tais como ácido acético, ácido lático, ácido palmitico, ácido esteárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido ascérbico e ácido cítrico. Uma vez que os compostos de eglina também contêm residuos de aminoácidos tendo grupos carboxilo livres, eles podem também estar na forma de sais de metais, especialmente sais de metais alcalinos ou de metais alcalinos terrosos, por exemplo sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, ou na forma de sais de amonio, derivados de amónia ou de uma base contendo azoto orgânico e fisiologicaniente tolerada.

Uma vez que podem, no entanto, conter grupos carboxilo livres e grupos amino livres (e guanidino) simultaneamente, eles também podem estar presentes na forma de sais internos.

Os mutantes de eglina do invento e seus sais podem ser produzidos de acordo com processos, que são conhecidos per se, por exemplo por processos de engenharia genética, por exemplo através da cultura de um microorganismo hospedeiro transformado contendo um DNA que codifica um dos referidos mutantes de eglina e isolamento do mutante de eglina ou de um seu sal. Os mutantes de eglina do invento e seus sais são produzidos especialmente por:

a. produção de um DNA que codifica a eglina mutante,

b. inserção deste DNA num vector,

c. introdução do vector híbrido resultante num microorganismo hospedeiro por transformação,

d. cultura do microorganismo hospedeiro transformado em condições que permitem a expressão do mutante de eglina e

e. isolamento do mutante de eglina ou um seu sal.

DNAs codificadores de mutantes de eglina invento relacioaa-se com

DNAs contendo uma sequência de nucleotideos que codifica um mutante de eglina, especialmente um dos mutantes de eglina referido atrás como sendo especialmente preferido.

Os DNAs do invento de preferência tem nos seus extremos sequências delimitantes que incluem sitios de restrição adequados e que tornam possível a inserção do DNA num vector.

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Os DNAs do invento podem ser produzidos de acordo com processos que são conhecidos per se. Por exemplo, os DNAs podem ser produzidos por sintese quiinica, ou os seus fragmentos podem ser produzidos por sintese química e ligados enzimáticamente de um modo predeterminado, ou um DNA codificador do eglina B ou da eglina C pode ser mutagenizado em um ou mais passos.

A sintese química de DNAs é efectuada por processos que são conhecidos per se. Os processos adequados estão descritos por S.A. Narang /“Tetrahedron 39, 3 (l983)_7 e no Pedido de Patente Europeia N? 146785.

A produção dos DNAs do invento também pode ser efectuada por mutação do DNA codificador da eglina B ou da eglina C. De preferência usa-se o processo conhecido como mutagénese dirigida de sitio /~cf. M. J. Zoller et al. , Meth. Enzym. 100, 468 (1983 ) 7· Neste processo o DNA de cadeia simples de eglina é clonado no bacteriofago M13, hibridado com um oligonucleotideo complementar que contem os nucleotideos que dirigem a mutação, o produto de hibridação ê complementado para formar a cadeia dupla, o bacteriófago de cadeia dupla resultante é introduzido por transformação num hospedeiro Esclierichia coli adequado e após cultura as células de E. coli transformadas, aquelas células que contêm o DNA codificador do mutante de eglina são identificadas por hibridação com o oligonucleotideo atrás mencionada.

Produção de vectores de expressão que contem um DNA codificador de um mutante de eglina invento relaciona-se ainda com vectores de expressão que contêm uma sequência de DNA codificadora de um mutante de eglina, sequência de DNA essa que é regulada de tal forma por uma sequência de controle da expressão que o mutante de eglina é expresso numa célula hospedeira transformada com aquelas vectores de expressão.

Os vectores de expressão do presente invento são produzidos, por exemplo, pela inserção de uma sequência de DNA codificadora do mutante de eglina num DNA vector que contem uma sequência de controle da expressão que regula a referida sequencia de DNA.

A escolha de um vector adequado baseaia-se na célula hospedeira a usar na transformação. Os hospedeiros adequados são por exemplo, micro organismos, tais como leveduras, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, e especialmente estirpes de bactérias, especialmente estirpes de Escherichia coli e também Bacillus subtilis, assim como células de organismos superiores, especialmente linhas celulares estabelecidas humanas ou de animais. As células hospedeiras preferidas são estirpes de E. coli.

Em principio qualquer vector é adequado desde que replique e expresse no hospedeiro seleccionado as sequências de DNA do invento codificadoras dos mutantes de eglina.

São exemplos de vectores adequado à expressão dos mutantes de eglina numa estirpe de E. coli os bacteriéfagos, por exemplo derivados de bacteríofago ou plasmideos, tais como, especialmente, plasmideo col EI e seus

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derivados, por exemplo pMB9, pBR317 ou pBR322. Os vectores preferidos do presente invento são derivados do plasmideo pBR322. Os vectores adequados contêm um replicão completo e um gene marcador que torna possivel a selecção e identificação dos micrororganismos transformados com os plasmideos de expressão por meio de uma marca fenotipica. Os genes marcadores adequados conferem ao microorganismo, por exemplo, resistência a metais pesados, antibióticos e similares. Ainda, os vectores preferidos do presente invento contêm além das regiões do replicão e do gene marcador, sequências de reconhecimento para endonucleases de restrição, de modo a que a sequência de DNA codificadora do mutante de eglina e, sempre que apropriado, a sequencia de controle da expressão possam ser inseridos naqueles sitios.

Para regular a expressão podem ser usadas várias sequências de controle da expressão. As sequências de controle da expressão usadas são especialmente as de genes fortemente expressos da célula hospedeira que é transformada. No caso em que se usa pBR322 como vector hibrido e E. coli é usada como microorganismo hospedeiro, sequências de controle da expressão adequadas (que contêm inter alia, o promotor e o sitio de ligação ao ribossoma) são, por exemplo, as do operão lactose, operão triptofano, operão arabinose e similares, do gene da p-lactamase e as correspondentes sequências do gene N do fago ou do gene da proteina fágica fd e outras. Enquanto que o promotor do gene de p-lactamase (gene p-lac) já está incluído no plasmideo pBR322, as outras sequências de controle de expressão devem ser inseridas no plasmideo. A sequência de controle da expressão preferida no presente invento é a do operão triptofano (trp po).

Os vectores adequados à replicação e expressão em levedura contêm uma origem de replicação de levedura e uma marca genética selectiva para levedura. Os vectores hibridos que contêm uma origem de replicação de levedura, por exemplo o segmento cromossémico de replicação autonoma (ars), são mantidos extracromossoma dentro da célula de levedura após a transformação e são replicados autonomamente durante a mitose. Ainda, podem ser usados os vectores híbridos que contém sequências homólogas do DNA do plasmideo 2 μ de levedura. Tais vectores hibridos são incorporados por recombinação dentro da célula com plasmideos 2 μ já presentes ou são replicados autonomamente. Genes marcadores adequados para levedura são especialmente aqueles que conferem resistência a antibióticos ao hospedeiro ou, no caso de mutantes auxotróficos de levedura, genes que complementam defeitos do hospedeiro. Os genes correspondentes conferem, por exemplo, resistência ao antibiótico ciclo-hexiinida ou proporcionam prototrofia num niutante de levedur;. auxotrófico, por exemplo o gene ura 3, leu 2, his 3 ou, especialmente trp 1. De preferência, os vectores híbridos de levedura contem ainda uma origem de replicação e um gene marcador para um hospedeiro bacteriano, especialmente E. coli de modo a que a construção e clonagem dos vectores hibridos e seus precursores possa ser efectuada num hospedeiro bacteriano. As sequências de controle da expressão adequadas para expressão e/ou lebedura são, por exemplo, as do gene trp 1, adh I, adh II ou pho 5 e também promotores envolvidos na degradação glicolitica, por exemplo o promotor pgk e o promotor gapdh.

invento relaciona-se especialmente com vectores de expressão capazes de replicação e selecção fenotipica, que contem uma sequência de controle da expressão e uma sequência de DNA codificadora do mutante de eglina, a referida sequência de DNA juntamente com um sinal

de iniciação e sinal de terminação da transição assini como um sinal de iniciação e um sinal de paragem da tradução estando arranjados no referido plasmideo de expressão sob a regulação da referida sequencia de controle da expressão de modo a que seja expresso o mutante de eglina numa célula hospedeira transformada com o referido plasmideo de expressão .

Para se conseguir uma expressão eficaz, o gene codificador do mutante de eglina deve estar arranjado correctamente (em fase) com a sequência de controle da expressão. É vantajoso ligar a sequência de controle da expressão, na região entre a principal iniciação do mRNA e o ATG da sequência codificadora do gene que está naturalmente ligado à sequência de controle da expressão (por exemplo a sequência codificadora de p-lac se se usar o promotor p-lac), ao gene da eglina mutante, que de preferência trás o seu próprio sinal de iniciação da tradução (ATG) e sinal de paragem da tradução (por exemplo TAG ). Por este meio assegura-se transcrição e tradução eficazes.

Transformação de microorganismos invento relaciona-se também com um processo para a produção de células hospedeiras trans formadas, que se caracteriza pela transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão contendo uma sequencia de DNA que codifica o mutante de eglina e que é regulada por uma sequência de controle de expressão.

São células hospedeiras adequadas, por exemplo, os microorganismos atrás referidos, como sejam estirpes de Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtulis e especialmente Bscherichia coli. A transformação com os plasmideos de expressão do invento é efectuada, por exemplo conforme descrito na literatura, por exemplo para _S. cere visiae / A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929, (1978) /, B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J.

Bacteriol. 81, 7^1 (l9Ól)) θ E. coli / M. Mandei et al.,

J. Mol. Biol. 53 , 159 (Ι97θ)_7· As células hospedeiras trans^ formadas são com vantagem isoladas de um meio nutritivo selectivo a que se adicionou o biocida contra o qual o gene marcador contido no plasmideo de expressão confere resistência. As células que não contêm o plasmideo de expressão são mortas em tal meio.

invento também se relaciona com as células hospedeiras transformadas obtidas pelo referido método.

Cultura das células hospedeiras transformadas o recuperação dos mutantes de eglina

As células hospedeiras transformadas são usadas para produzir os mutantes de eglina. 0 processo para a produção dos mutantes de eglina compreende cultura das células hospdeiras transformadas atrás referidas e libertação e isolamento do produto a partir das células hospedeiras.

invento relaciona-se com um processo para a produção de mutantes de eglina da fórmula I e sais de tais compostos que se caracteriza pela cultura num meio liquido nutritivo, que contem fontes assimiláveis de azoto e carbono, células hospdeiras transformada com um plasmideo de expressão contendo uma sequência de DNA que codifica um mutante de eglina da fórmula I e que é regulado por uma sequência de controle de expressão e libertação e isolamento do produto a partir das células hospedeiras e, caso se pretenda, separação de uma mistura de compostos da fórmula I, obtida de acordo com o processo, nos componentes individuais e, caso se pretenda, conversão de um sal resultante no polipeptideo livre ou um polipeptideo resultante num sal.

As células hospedeiras transformadas do invento são cultivadas de modo conhecido per se. Por exemplo, podem ser usadas várias fontes de carbono para a cultura dos microorganismos hospedeiros transformados do invento. São exemplos de fontes de carbono preferidas, açucares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose, ou um acetato que pode ser usado sozinho ou em misturas adequadas. São fontes de azoto adequadas, por exemplo, aminoácidos, tais como casaminoácidos, peptideos e proteínas e os seus produtos de degradação, tais como triptona, pepton ou extractos de carne; ainda, extractos de levedura, extract de amlte, assim como sais de amónio, por exemplo cloreto sulfato ou niizato de amónio, os quais podem ser usados sózinhos ou em misturas adequadas. Sais inorgânicos que também podem ser usados são, por exemplo, sulfatos, cloretos, fosfatos e carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio.

Ainda, o meio contém, por exemplo, substancias promotoras do crescimento, tais como micronutrientes, por exemplo ferro, zinco, manganês e similares e de preferência substâncias que exercem uma pressão selectiva e evitam o crescimento das células que perderam o plastnideo de expressão. Por exemplo adiciona-se ampicilina ao meio quando o plasmidoo de expressão contem um gene amp R. Tal adição de substâncias antibióticamente activas também tem o efeito de matar microorganismos contaminantes que sejam sensíveis aos antibióticos.

Λ cultura é efectuada de acordo com processos conliecidos per se. As condições de cultura, tais como temperatura, valor de pll do meio e tempo de fermentação, são seleccionadas de modo a que sejam obtidos titulos máximos dos mutantes de eglina. Por exemplo, uma estirpe de E. c oli ou de levedura e de preferencia cultivada em condições de aerobiose em cultura submersa com agitação a uma temperatura de aproximadamente 20 a 4o°C, de preferência aproximadamente 30°C e um valor de pH entre 4 e 9, de preferência pH 7, durante aproximadamente 4 a 20 horas, de preferencia entre 8 e 12 horas. 0 produto de expressão acumula-se intracelularmente.

Quando a densidade celular atingiu um valor adequado, a cultura é interrompida o o produto o libertado das células do microorganismo. Com esta finalidade as células são rebentadas, por exemplo por tratamento com um detergente, como soja SDS ou Triton ou são lisadas com lisozima ou uma enzima de actuação semelhante. Como alternativa, ou em adição, são usadas para rebentar-abrir as células forças mecânicas, tais como, forças de shearing (por exemplo prensa X ou prensa francesa, Dyno-Mill) ou agitação com esferas de vidro ou de oxido de alumínio ou congelação, por exemplo em azoto liquido, e descongelação, por exemplo entre 30° e 4o°C, alternadas, assim como ultra-sons. Após centrifugação, as proteínas da. mistura resultante, a qual contem proteínas, ácidos nucleicos e outros componentes celulares, são enriquecidos de modo conhecido per se. Por exemplo, a maior parte dos componentes não proteicos podem ser removidos por tratamento com polietileneimina θ as proteínas, incluindo os compostos de eglina, precipitados, por exemplo por saturação da solução com sulfato de amónio ou com outros sais. As proteínas bacterianas podem também ser precipitadas por meio de acidificação com ácido acético (por exemplo 0,1%, pH 3-5). Um posterior enriquecimento em inutantes de eglina pode ser conseguido por extracção do sobrenadante de acetato de etilo coin n-butanol. Outros passos de purificação incluem, por exemplo, processos de cromatografia, tais como crmmatografia de permuta iónica, filtração em gel, cromatografia de permeação em gel, cromatografia de partição, HPLC, HPLC em fase reversa e similares. Por exemplo, após concentração por meio de electroforese em gel ou sem veiculo, os componentes misturados são separados por diálise de acordo com o tamanho molecular usando uma coluna de Sephadex adequada ou os componentes são separados por cromatografia de afinidade, por exemplo, com anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais ou comaanidroquimotripsina ou trombina acoplado a um veiculo adequado para cromatografia de afinidade ou por outros processos, especialmente os conhecidos da literatura.

Por exemplo, o isolamento dos mutantes de eglina expressos caracteriza-se pelos passos que se seguem:

separação das células da solução de cultura por meio de centrifugação, produção de um extracto bruto por rebentamento das células, por exemplo por meio de um Dyno-Mill, remoção dos componentes insolúveis por centrifugação, precipitação das proteínas bacterianas por meio de ácido acético a l7, filtração em gel de Sephadex G 50 (ou G 75) θ, caso seja apropriado, HPLC de fase reversa. A remoção dos sais é efectuada, por exemplo em Sephadex G 25. 0 teste com os anticorpos anti-eglina, como sejam anticorpos policlonais obtidos a partir de coelhos ou anticorpos monoclonais obtidos a partir de células de hibridoma, por exemplo os anticorpos monoclonais secretados pelas linhas celulares de hibridoma 299518-20 (CNCM I-3él), 299520-1 (CNCM I-362) ou 299S2O-1O (CNCM 1-3^3) ou a inibição de protease alvo, por exemplo elastase de leucócitos humanos (lILE) ou catepsina G (Cat G) / cg. U. Seemuller et al., Hoppe-Seyler'oZ.

physiol. Chem. 358, 1105 (1977) ; U. Seerauller et al. , Meth. Enzymol. 80 , 80^ (l98l) 7 podem ser usados para detectar as eglinas mutantes.

Uma mistura de compostos da fórmula I obtida de acordo com o processo, por exemplo consistindo em compostos da fórmula I em que R é II ou acetilo pode ser separada nos componentes individuais de modo conliecido per se. São processos de separação adequados, por exemplo, processos cromatográficos, por exemplo cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta iónica, HPLC ou HPLC em fase reversa, também métodos multiplicativos de partição ou electroforéticos, por exemplo eletroforese em acetato de celulose ou electroforese em gel, especialmente electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).

Dependendo do processo, os compostos do invento são obtidos na forma livre ou na forma de sais de adição ácida, sais internos ou sais com bases. Os compostos livres podem ser obtidos a partir dos siis de adição ácida de modo conhecido per se. Por outro lado é possível obter sais de adição ácida terapêuticamente aceitáveis ou sais de metais a partir dos compostos livres por reacção com ácidos ou bases, por exemplo com aqueles que formam os sais atras referidos e por concentração por evaporação ou liofilização. Os sais internos podem ser obtidos por ajustamento do pH para um ponto neutro adequado.

Preparações farmacêuticas

Os novos mutantes de eglina da fórmula I possuem importantes propriedades farmacológicas e podem ser usados na profilaxia ou tratamento de doenças que requeiram o uso de inibidores de proteases.

Os novos mutantes de eglina apresentam como inibidores de proteases uin perfil de actividade que difere do das eglinas naturais B e C como se segue: a inibição da acção de certas proteases ó aumentada ou algumas proteases não inibidas pelas eglinas naturais são fortemente inibidas enquanto que acção inibidora contra algumas proteases alvo naturais das eglinas, tais como, por exemplo, elastase de granulócitos, é enfraquecida ou desapareceu.

Por exemplo, os compostos da Fórmula I em que H¹ e hidrogénio ou acetilo, V ó Tir ou His, X e Pro, Y e Met e Z e Asp, apresentam uma maior inibição da elastase de granulócitos humana ou de animais comparada com as eglinas naturais e assim, tal como as eglinas naturais, pode ser usada, por exemplo, no tratamento de emfisema pulmamr, ARDS (síndroma da distrofia respiratória aguda), choque síptico, artrite reumática e mucoviscidose. Ao contrário das eglinas naturais, os compostos da fórmula I em que R e V têm o significado atribuído para a fórmula I, Xe Tre, Y ó Arg ou Lis e Z e Asp, apresentam uma pronunciada acção inibidora relativamente à tripsina e apenas uma ligeira acção contra a elastase de granulócitos e catepsina G. Isto aplica-se especialmente ao composto da fórmula I em que R ó acetilo,

W ó Tir, X e Tre, Y é Q e Z e As p * Τ' ai s c o mp o s t o s p o d e m, analogamente à aprotinina, serem usados, por exemplo, no tratamento de pancreatite e de choque traumático pancreatogenoso e hemorrágico.

-19Λ

Α

Os compostos da fórmula. I em que R, V e X têm os significados dados na fórmula I, Y é Arg ou Lis e Z e Asp têm uma acção inibidora pronunciada relativamente à trombina e podem ser usados, de preferência em combinação com antitrombina III, por exemplo, para o tratamento de tromboses, tromboembolismos, choque séptico e pós-traumático e coagulopatias.

invento também está relacionado com composições farmacêuticas que contêm pelo menos um dos compostos do invento ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, sempre que apropriado justamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável convencional e/ou aditivos.

Estas composições podem ser usadas especialmente no caso das indicações atrás referidas quando administrados, por exemplo, parenteralmente, como seja intravenosamente, subcutaneamente, intracutaneamente ou intramuscularmente ou topicamente.

invento também está relacionado com o uso dos novos compostos do invento e de composições farmacêuticas contendo-os para o tratamento profiláctica e terapêutico do homem ou animais especialmente no caso dos síndromas atrás referidos.

A dosagem depende especialmente da forma especifica de administração e da finalidade do trata mento ou profilaxia. 0 tamanho de uma dose unitária e o protocolo de administração podem ser adequadamente determinados com base num estudo individualizado da perturbação particular apresentada; os métodos necessários para a determinação de factores relevantes, tais como factores sanguineos, são familiares do pessoal especializado.

No caso dos mutantes de eglina inibidores da trombina, a quantidade terapeuticanente eficaz no caso de uma injecção está numa gama de dosagem de aproximadamente 0,005 até aproximadamente 0,1 mg/kg de peso do corpo. Uma gama entre aproximadamente 0,01 e aproximadamente 0,05 mg/k de peso do corpo é preferida. A administração é efectuada por injecção intravenosa, intramuscular ou subcutâ nea. Assim, as preparações farmacêuticas para administração parenteral em forma de dose unitária contêm entre aproximada mente 0,4 e aproximadamente 7,5 mg do composto do invento por dose dependendo do modo de administração. Além do ingrediente activo, estas composições farmacêuticas contêm geralmente um tampão, por exemplo um tampão fosfato, para manter o valor de pH entre aproximadamente 3,5 θ 7 e também cloreto de sódio, manitol ou sorbitol para estabelecer isotonicidade Elas podem estar na forma liofilizada ou dissolvida e as soluções podem com vantagem conter um preservativo contra bactérias, por exemplo 0,2 e 0,3% do éster motilico ou éster etilico do ácido 4-hidroxibenzéico.

Uma preparação para uso tópico dos mutantes de eglina inibidores da trombina pode estar na forma de uma solução aquosa, loção ou gel, uma solução oleosa ou suspensão ou numa pomada contendo gordura, ou especialmente uma pomada emulsionada. Uma preparação na forma de uma solução aquosa é obtida, por exemplo, por dissolução de um ingrediente activo do invento ou um seu sal terapeut icanente aceitável, numa solução tampão aquosa de pH 4 a 6,5 e, caso se pretenda, adição de um outro ingrediente activo, por exemplo um anti-inflamatário e/ou um agente de enchimento polimérico, por exemplo polivinilpirrolidona e/ou um preservativo. A concentração do ingrediente activo vai de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,5 mg, de preferência de 0,25 a 1,0 mg, por 10 ml de solução a 10 g de gel. Uma forma de aplicação oleosa para administração tópica é obtida por exemplo, por suspensão de um ingrediente activo do invento ou num seu sal terapêuticamente aceitável num

oleo, sempre que apropriado com a adição de agentes de inchamento, tais como estearato de alumínio e/ou agentes tensioactivos o valor de HLB (equilíbrio hidrofilico-lipofilico) dos quais está abaixo de 10, como sejam monoésteres de ácidos gordos de alcoóis poli-hidricos, por exemplo monoestearato de glicerol, monolaurato de sorbitano, monostearato de sorbitano ou monooleato de sorbitano. Uma pomada conten do gordura obtem-se, por exemplo, suspendendo um ingrediente activo do invento ou num seu sal numa fase gorda espallrável sempre que apropriado com a adição de um tcnsioactivo tendo um valor de HLB abaixo de 10. Uma pomada emulsionada é obtida por trituração de uma solução aquosa de um ingrediente activj do invento ou num seu sal numa base gorda espalhável e macia com a adição de um tensioactivo com um valor de HLB abaixo de 10. Todas estas formas tópicas de aplicação podem também conter preservativos. A concentração do ingrediente activo é de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,5 mg, de preferência de 0,25 a 1,0 mg, por aproximadamente 10 g do material de base.

A administração de mutantes de eglina inibidores da elastase e efectuada por injecção intravenosa ou intrapulmonalmente por inalação, por exemplo usando um dispositivo Bird. Assim, as preparações farmacêuticas para administração parenteral na forma de dosagem unitária contêm aproximadamente entre 10 e 50 mg de um composto do invento por dose, dependendo do modo de aplicação. Em adição ao ingrediente activo estas composições farmacêuticas contêm geralmente cloreto de sódio, manitol ou sorbitol para estabelecer a isotonicidade. Eles podem estar na forma liofilizada ou dissolvida e as soluções podem com vantagem conter um preservativo antibacteriano, por exemplo entre 0,2 e 0,3% do éster metílico ou éster etilico do ácido 4-hidroxibenzéico.

As preparações para uso tópico

de mutantes de eglina inibidores de elastase correspondem substancialmente aos descritos atrás.

As Preparações para inalação usadas no tratamento do sistema respiratório por administração intrapulmonar são, por exemplo, aerossóis ou vaporizadores que podem distribuir o ingrediente activo farmacoló gico na forma de gotas de uma solução ou suspensão. As Preparações em que o ingrediente activo farmacológicamente est em solução contêm, além deste, um propelente adequado e também, se necessário, um solvente adicional e/ou um estabilizador. Em vez de um gás propelente é também possível usar ar comprimido e este pode ser produzido conforme neces sário usando um sistema de compressão e saída adequado. Os respiradores Bird, que são conhecidos e usados em medicina, são especialmente adequados à administração, neste caso uma solução do ingrediente activo é introduzida no dispositivo e vaporizada com ligeiro excesso de pressão e introduzida no pulmão à medida que o paciente respira.

No caso dos mutantes de eglina inibidores de elastase, a dosagem para um animal de sangue quente (humano ou animal) pesando aproximadamente 70 kg, dependendo da idade, estado do indivíduo e natureza da doen ça, vai de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg por inalação (uma a duas vezes por dia) quando administrado por via intrapulmonar e entre aproximadamente 10 e aproximadamente 1000 mg por dia quando administrado intravenosamente por exemplo também por infusão prolongada. Concentrações na saliva e plasma terapêuticamente eficazes, que podem ser determinadas por meio de processos imunológicos, tais como ELISA, variam entre 10 e 100 pg/ml (aproximadamente 1 a 10pmol/l).

A administração de imutantes de eglina inibidores da tripsina é efectuada por exemplo por injecção parenteral, como seja intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Uma quantidade terapêuticamente eficaz está numa gama de dosagens de aproximadamente 1 a 20 mg de ingrediente activo/kg de peso do corpo. As preparações farmacêuticas contêm o ingrediente activo numa concentração ent aproximadamente 0,1 e aproximadamente 100 mg/ml de solução. Além do ingrediente activo estas preparações farmacêuticas também contêm um tampão, por exemplo um tampão fosfato (ver atrás) e também cloreto de sódio, manitol ou sorbitol para estabelecer a isotonicidade.

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Pesticidas

Os novos mutantes de eglina com a fórmula I podem também ser usados como inibidores de proteinases no controle de pragas de plantas. A partir da ocorrência natural de inibidores de proteases serina em vários géneros de plantas assumiu-se que eles representam uma protecção eficaz contra insectos fitopatogónicos,fungos e outros microorganismos através da inibição de proteases serina nos referidos organismos. Ainda, tanto plantas monocotilédoneas como dicotiledóneas podem ser transformadas com um DNA que codifique um inibidor de proteases heterólogo tal como, por exemplo, eglina B ou C, ou um mutante do eglina da fórmula I. A expressão dos correspondentes inibidores de proteinases activos confere às plantas transformadas protecção contra ataque pelos fitopatogénicos.

Existem disponíveis métodos conhecidos per se para a transformação de plantas com vectores de expressão adequados que contêm sequências de controle da expressão e um DNA codificador de um composto do invento, como seja, por exemplo, a cocultura de protoplastos ou fragi

-2't·

mentos isolados de tecido com agrobactérias que contêm os vectores adequados e a subsequente regeneração de plantas completas ou a transferência de vectores com a ajuda de vírus adequados não modificados ou modificados, como seja, por exemplo, TMV (Virus do Mosaico do Tabaco) ou CalIV (Virus Mosaico da Couve-Flor), Outros métodos são, por exemplo, a transferência directa de DMA isolado (preferido no caso de plantas monocotiledéneas, como sejam milho, aveia, centeio, arroz, sorgo, trigo, cana sacarina e outros) com a ajuda de PEG, por electroporação, por microinjecção de DMA em protoplastos isolados, calos de plantas ou embriões ou por bombardeamento com microprojecteis e outros.

As moléculas de DMA que codificam um dos compostos do invento são adequadas à transformação de plantas. São preferidas as moléculas de DMA que codificam um mutante de eglina da fórmula I em quo R é acetilo, V é Tir, X é Tre, Y é Arg e Z é Asp. A acção de inibição de proteases dos correspondentes mutantes de eglina preferido pode ser examinado em testes com o agente patogénico do milho Diabrotica virgifera (minhoca corn root Western). A adição dos mutantes de eglina preferidos a homogenatos de tecido intestinal do agente patogénico resulta numa inibição marcada da actividade proteolitica. 0 invento relaciona-se especialmente com os mutantes de eglina descritos nos Exemplos, com os DNAs que os codificam, com plasmideos de expressão contendo tais DNAs, com microorganismos hospedeiros contendo tais plasmideos de expressão e com os processos descritos para a sua produção.

Os Exemplos que se seguem ilustram o invento sem de algum modo implicarem qualquer limitação .

-25\ i

Parte Experimental

Exemplo 1: Clonagem em ?H3 do gene da eglina C

Aproximadamente 0,5 pg 4o fragmento Eco RI-Bam Hl de 230 pb (contendo o gene completo da eglina c) foi isolado a partir de 10 pg do plasmideo pML l47 por métodos de digestão com as endonucleases de restrição Eco RI e BamHI e subsequente electroforese em 1,5% de agarose de baixo ponto de fusão. Este fragmento de DNA (10 ng) é misturado com 40 ug de DNA de M13 mpS (pré-digerido com EcoRI e Bam HZ) e incubado em 50 mM Tris-IICl pg 7,4, 10 mM MgCL^, 10 mM ATP, 10 mM ditiotritol na presença de 0,125 unidades de DNA-ligase de T4 num volume de 15 pil / Zoller et al., Methods Enzym. 100, 468-500 (1983) 7· A solução resultante foi usada para transformar a estirpe JM101 de E. coli (Zoller et al., ver atrás). A mistura de transformação foi semeada em placas X-Gal (agar indicador de IPTG) (Zoller et al., ver atrás). Obtiveram-se 4o placas azuis (tipo selvagem) e 650 placas incolores.

EXEMPLO 2: Produção de DNA de cadeia simples de M13mp8 ml de uma culcurti do E.coli JM 101 (crescida em meio L: 10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levedura bacto, 5 g de NaCl, 5 g de glucose,

0,1 g de ampicilina por litro, até uma DOg = aprox. 0,5) não inoculados com uma placa incolor (retirada da placa de agar, ver Exemplo l) e mantidos durante aproximadamente 4 a 5 horas a 37°C e 180 Mers/min. Subsequentemente a cultura

desenvolvida é centrifugada durante 5 minutos numa centrífuga Eppendorf. O sobrenadante é transferido para outro tubo de centrífuga, centrifugado novamente, adicionados 200 y.1 de polietilenoglicol a 20%, 1,5 M NaCl e a mistura é mantida à temperatura ambiente durante 20 minutos e depois novamente centrifugada. 0 sobrenadante é rejeitado e o sedi mento dissolvido em 100 μΐ de 50 mM Tris-IICl pll 7,8, 1 mM EDTA (TE). A mistura é misturada com 50 μΐ de fenol/TE (15 minutos à temperatura ambiente) e depois centrifugada durante 5 minutos numa centrífuga Eppendorf. Adieiona-se 10 μΐ de acetato de sódio pHÓ e 3 volumes de etanol absoluto (25o μΐ) a 100 μΐ de sobrenadante e o total e mantido a -20°C durante a noite e depois centrifugado como descrito atrás durante 10 minutos. 0 sedimento e lavado com 1 ml de etanol a 80% e novamente centrifugado. 0 sedimento é seco à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois dissolvido em 50 μΐ de TE. A solução contem aproximadamente 5 μg de DNA de cadeia simples de M13 mp8.

Exemplo 3: Produção do gene codificador da /~Arg 45 7-eglina C

a. Fosforilação do oligonucleotideo mutagénico oligonucleotideo que se segue foi produzido por síntese quiinica para a mutagénese:

*

5'-dCTCCTTGTTACTCGGGACC-3’ μΐ do οligonucleotideo (l D0/ml = 500 ng) foram fosforilados ora 20 μΐ dc 0,0/ M Tris-HCl pH 7,6, 0,01M MgCl^, 50 mM ditiotreitol com

- ^ATP e cinase de polinucleotideos do T4 (Boeiiringer) cf.Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ed. T. Maniatis et al., página 125 7· θ oligonucleotideo fosforilado é dissolvido em 10 í^l He TE (50 ng/μΐ).

b. Mutação do gene da eglina C

3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG. G-5' * (D + 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3' (oligo iniciador) *

5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3' ₍ .

3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5' mutação ^{11 2} Pro Vai Thr Arg Asp

5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3' , .

3'-GA GGA CAA TGA GCC CTG G-5'

ESQUEMA DA MUTAÇÃO pg de DNA de cadeia simples de M13 mpS com 50 ng do oligonucleotideo iniciador fosforilado em 10 pl de 50 mM-Tris-HCl pll 7,8, 100 mM MgCl_o são mantidos a 45°C (30 minutos) e depois à temperatura ambiente (5 minutos) (emparelhamento). O que se segue foi então adicionado a esta mistura:

mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP 1 μΐ de cada, μΐ de DNA-ligase de T4 μΐ de 50mM ditiotreitol μΐ de lOmM ATP ql de 5 mg/ml de gelatina μΐ de tampão klenow lOx conc. (0,66 M Tris-IÍCl pll 7,6, iuM MgCl₂, 50 mM ditiotreitol) μΐ de DNA-polimerase (fragmento klenow) = 2,5 unidades.

A mistura foi mantida a 22°C durante 5 minutos e depois a 15°C durante l6 horas e finalmente separada electroforéticamente em l^o de agarose. 0 DNA circular de cadeia dupla resultante foi tornada visivel com brometo de etidio e isolado do gel por electroeluição (aproximadamente 10 ng em 15 μΐ de TE).

μΐ (=aproximadamente 3,5 ng) do DNA assim obtido foram usados para transformar a estirpe JM 101 de E. coli que se semeou em placas indicadoras X-Gal /IPTG (ver Exemplo l). Obtiveram-se aproximadamente 100 placas incolores.

4o destas placas foram usadas para inocular uma cultura de 2 ml de E. coli JM 101 (ver Exemplo 2). Após cultura (Exemplo 2), as células de E. coli foram separadas do sobrenadante por centrifugação (contem fagos e DNA de cadeia simples, o sedimento de células já contem o correspondente DNA de cadeia dupla mutagenizado).

Em cada um dos casos filtrou-se 50 μΐ dos 4o sobrenadantes fágicos em nitrocelulose, lavou-se (2 x TE), manteve-se sob vácuo durante 2 horas a 80°C e examinou-se de acordo com Southern / J. Mol. Diol. 28, 503-517 (1975)_7 quanto à presença da sequência de DNA mutagenizada (ill, ver esquema), usando o oligonucleotideo iniciador como sonda radioactiva (hibridação). Isto resulta em 12 potenciais sobrenadantes fágicos contendo o gene

-29K V,;

da /^-Arg 45 7^-eSliⁿa C. Quatro destes sobrenadantcs fágicos positivos foram diluidos (aproximadamente 1:105), misturados com E. co li estirpe JM 101 e semeados cm agar indicador. Isolaram-se fagos de três placas resultantes de cada um. 0 DNA de acdeia simples foi isolado a partir deles como descrito atrás. Estes 12 DNAs de cadeia simples são sequenciados de acordo com Sanger / Science 214 , 1205 (1981); Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)_7· Os 12 DNAs de cadeia simples apresentaram a sequência mutagenizada da eglina C pretendida.

Numa minipreparação, preparou-se o respectivo DNA de cadeia dupla mutagenizado (gene da / Arg 745-eglina C no plasmideo N13 mp S) a partir dos correspondentes sedimentos de células de E. coli (ver atrás Por digestão de restrição com as endonucleases de restrição EcoRI e BamIII, a inserção EcoRI-BamIII contendo o gene mutagenizado foi removida do vector isolada e clonada ao vector píIRi l4S/EcoRl/BamIH (Pedido de Patente Europeia N? l4 6?S5). 0 plasmideo pJB 618 resultante foi isolado e usado para transformar E_e coli estirpe HB101. À estirpe transformada com o plasmideo pJBÓIS foi designada E. coli HBlOl/pJB 618.

EXEMPLO 4: Produção do gene codificador dc / Pro 44 7-eglina C

A mutação / Tre 44 - / Pro

7 f°i efectuada de modo análogo ao descrito no Exemplo 3. 0 oligonucleotideo mutagénico usado tinha a seguinte estrut ura.

*

5'-CT CCT GTT CCT CTG GAG-3'

A mutação do gene da eglina C está representada no esquema que se segue

3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5’ *

+ 5 -CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' (oligo iniciador) *

5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5' mutação ^{11 2} ProValProLeuAsp 5’-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' 3'-GA GGA CAA GGA GAC CTG-5'

Quando do processamento da mistura de mutação obtiveram-se 18 mutantes potenciais / Pro 44_7-eglina C.

Por clonagem do DNA de / Pro

7-eglina C no vector pHri l48/EcoRi/3am IDE, obteve-se o plasmideo pJB591 de modo análogo ao descrito no Exemplo 3· A estirpe E. coli HB101 transformada com este plasmideo foi designada E. coli HB10l/pJB591·

Exemplo 5: Produção do gene codificador de / Arg 45, Ser 46 7-eglina C

Fez-se a mutação / Leu 45, Asp 46 7^-/ Arg 45, Ser 46 7 de modo análogo ao descrito no Exemplo 3. 0 oligonucleotideo mutagénico usado tinha a seguinte estrutura:

Kg* **

5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3’

A mutação do gene de eglina C está representada no esquema seguinte.

-32V

3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5’
	ΧλΧ Κλ	(I)
5'-GTA	ACG CAG AGA ACG AGI AAC AGG-3' (oligo iniciador)
5'-GTA	ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3'
3'-CAT	TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5'	(II)

mutação

5'-GTA	ACG	CAG AGA	ACG	AGT	AAC AGG-3'
3'-CAT	TGC	GTC TCT	TGC	TCA	TTG TCC-5'	(III)
		Leu⁷Ser	Arg	Thr	Vai* ³

Quando do processamento da mistura de mutação obtiveram-se 12 potenciais mutantes / Arg 45, Ser J-eglina C.

plasmidco pML 1^7/b foi obti do de modo analogo ao descrito no Exemplo 3 por clonagem do DNA de /Ãrg 45, Ser 46 /-eglina C no vector pHRil4S/Eco Rl/Bam III. A estirpe de E. coli ΉΒ101 transformada com este plasmideo foi designada E. coli HBlOl/pML l47/b.

-33Exemplo 6; Cultura de estirpes de E. coli transformadas

As estirpes E. coli IIB101 transformadas são cultivadas durante a noite a 37°C e 250 revs/min em 5 ml de meio L (ver Exemplo 2). 1 ml desta cul tura crescida durante a noite foi então transferida para 25 ml de meio M9. 0 meio M9 é composto do seguinte (por litro ):

Na₂HP0 ^.711,,0	13,25 g
kh₂po₄	3,0 g
NaCl	0,5 g
NH^Cl	l,o g
CaCl₂.2H₉0	0,015 g
MgSO₄.7H₂O	0,25 g
casaminoácidos	2,5 g
vitamina	0,0099 g
glucose	5,0 g
ampicilina	0,1 g

A cultura decorreu a 37°C e 250 revs/min. Após 8 a 10 horas a cultura atingiu o mais alto titulo de mutantes de eglina C /determinado através da medição da protease elastase de leucócitos humanos de acordo com U. Seemuller et al. . Hoppe-Soy ler' s Z. Pliysiol. Chem. J5S, 1105 (1977) 7Exemplo 7: Isolamento e purificação dos mutantes de eglina

As células de E. coli superprodutores foram rebentadas mecanicamente usando um Dynomill Os detritos celulares foram removidos por centrifugação em 30 minutos numa centrífuga Sorvai a 9000 revs/min.

Tendo em consideração a estabilidade elevada dos mutantes de eglina relativamente a ácidos, a maioria das proteínas ccntaminantes do sobrenadante podem ser eliminadas por precipitação com ácido acético a aproximadamente 20%: 10 ml de ácido acético aquoso a ^0% é pipetado gota a gota para 100 ml de sobrenadante ao longo de 10 minutos. A solução acidica (pll 3,^) foi agitada durante 1 hora com arrefecimento com gelo. As proteínas contaminantes precipitadas e outros componentes celulares foram removidos por centrifugação durante 30 minutos numa centrífuga Sorvai a 9000 revs/min. 0 sobrenadante foi liofilizado durante a noite num Virtis Freezemobile.

liofilizado seco amarelado foi dissolvido em 10 ml de 10 mM Tris-HCl pH 7,8 e breve mente centrifugado para tornar a solução limpida (Sorvai SS3^:15000 revs/min, 10 minutos). 0 sobrenadante amarelo e límpido foi adicionado a uma coluna de Sephadex G-50 supérflua (Pharmacia) equilibrada de 100 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro. Faz-se a eluição com 10 mM Tris-HCl pH 7,8 a um caudal de 20 ml/h. A absorção do eluato foi registada a 280 nm. Colheram-se fracções de 10 ml. 0 diagra ma de eluição mostra um pico alto (fracções 31-^0) que contem os mutantes de eglina em questão. A pureza dos mutantes de eglina nestas fracções foi confirmado por electroforese em gel de SDS e HPLC. Após filtração em gel, os mutantes de eglina estavam aproximadamente 99% puros.

A remoção do tampão das fracções de mutantes de eglina foi efectuada com uma célula de concentração. Amicon tendo uma membrana TM-Z (>IUCO 2000). Após ultrafiltração as amostras foram novamente liofilizad Obteve-se um pé incolor (aproximadamente 250 mg/100 ml de decomposição em Dynomill), que se guardou a -20°C.

Exemplo 8: Caracterização fisico-quimica dos mutantes de eglina

a. / Pro 44 7~^eSlina C

A / Pro 44 7-eglina C purificada de acordo com o Exemplo 7 foi sujeita a uma determinação de peso molecular por meio de FAB-MS. 0 pico do ião da molécula (M-H)⁺ 7 foi acertado a 8130,6. Deste modo o produto obtido de acordo com o processo é N-acetil-/ Pro 44_7-eglina C (valor teórico para M-M ⁺ : 8130,07).

A degradação triptica do mutante de eglina deu 7 fragmentos, dos quais apenas o fragmento 4, que contém a mutação Tre44-Pro 44, difere dos cor respondentes fragmentos de N^Çcetil-eglina C (cf. Pedido de Patcnto Europeia N? 146785). 0 mutante de eglina deve portanto ser designado N-acetil-/ Pro 44 /-cslina. C.

Na electroforese em gel de

SDS-PAGE /cf. U.K. Laemmli, Nature 227, 6SO-6S5 (ΐ97θ)_7 N-acetil-/Pro 44 /-eglina C comporta-se como N-aceti1-eglina C.

b. / Arg 45 7-eglina C

A determinação do peso molecular da /Ãrg 45 7^_eSliⁿa C purificada deu ura valor de 8175,4 /*M-H ⁺ 7· Assim, neste caso também, está presente um composto N-acetilado (valor teérico para M-H⁺:S175). A degradação enzimática com tripsina torna claro que o composto é N-acetil-/Ãrg 457^-eSl^ana C.

Na electroforese em gel de

SDS-PAGE N^acetil-/ Arg 45 7^_egl^{ana G} também se comporta do mesmo modo que N-acetil-eglina C.

c. / Arg 45, Ser 46 7-eglina C

A determinação do poso molecular da / Arg 45, Ser 46 7~^egli-^na C purificada dá um valor de 8148.7 / M-H⁺ 7· Assim, neste caso também, está presente um composto N-acetilado (valor teérico para M-H⁺: 8l49.l).

A degradação triptica do mutante do eglina mostra que o composto é N-acetil-/ Arg 45, Ser 46_7^-eSl^ana C.

Na electroforese em gel de SDS-PAGE N-^acetil-/ Arg 45, Ser 46 7^-egli^na C também se comporta do mesmo modo que N-acetil-eglina C.

Exemplo 9: Caracterização cinética dos mutantes de eglina

A determinação das constantes de inibição K foi efectuada de acordo com N. Bravm et al /Siol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 299-3OS (1987) 7 através da medição da velocidade de reacção na fase estacionária da libertação de p-nitroanilina a partir de misturas de inibidor de proteinases e substrato. Apenas variou a concen tração de inibidor. Uma vez que a curva OD^q- vs. tempo era linear, a libertação de p-nitro-anilina entrou aos 10 a 20 minutos. 0 Ki pode ser determinado a partir dos vários declives. As proteinases usadas foram elastase de leucócitos humanos (íILE), quimotripsina e tripsina. Exemplos de constantes de inibição estão apresentados na tabela que se segue:

Tabela: Constantes de inibição

a. HLE:

Eglina C

Ki (m) 7,5 χ 10-11 /Ãrg 457-eglina C 1,1 x 10-5

b. quimotripsina

Ki (M) 4,4 χ 10-10 8 x 10-9

c.tripsina Ki (?l) sem inibição

1,3 x 10-10

Os resultados mostram que se obteve uma eglina 0 mutante por troca de Leu 45 por Arg 45, mutante este que, ao contrário da eglina C natural, e um poderoso inibidor da tripsina mas apenas fraco inibidor de I-ILE.

Exemplo 10: Expressão de /Ãrg 45 7-eglina C e N-acetil-/ Arg 45 7-eglina C em levedura

Um sistema de expressão para genes estranhos em levedura requere um promotor forte de levedura, de preferência um promotor indutivel, e um sinal de terminação da transcrição de levedura num arranjo em tandem separado por sitios de restrição únicos para a imersão de genes estranhos. Um vector de expressão também contém sequências de DMA do levedura que permitem a rcplicação autónoma em levedura e permitem obter um elevado número de copias do plasmideo. Estas sequências são de preferência sequências 2 μ de levedura. 0 vector também tem uma marca selectiva para levedura, de preferência o gene LEU2 de levedura, assim como sequências de UNA de pBR322 com a origem de replicação e o gene de resistência à ampicilina para amplificação em E. coli. Tal vector ó um vector vai-vem para usar cm E. co li e levedura.

Um sistema de expressão adequado, conforme descrito atrás foi publicado no Pedido de Patente Europeia N- 100 5^1 e verificou-se ser altamente eficaz em levedura. Cs genes estranhos são expressos sob o controle do promotor indutivel de PH05 da fosfatase ácida de levedura. 0 promotor PH05, o gene estranho e os sinais de terminação da transcrição de PH05 foram inseridos num

39arranjo em tendem no plasmideo pJDB 207- Ele possui sequências 2 μ de levedura, o gene LEU 2 de levedura, a origea do replicação de E. coli e o gene de resistência à ampicilina.

plasmideo de expressão pJDB2O7B/PHO5-/^_Arg 45 7EGL foi construído como se segue;

a) Isolamento do fragmento vector pJDB207

Seis pg do plasmideo pJDB207P/ /IF (¢(-3 ) (EP IOO561) foram digeridos totalmente com a enzima de restrição Bam IH. Os fragmentos de DNA resultantes de 6,85 kb θ 1,15 kb de tamanho foram precipitados com etanol e ressuspensos em 4θθ μΐ de 50 mM Tris-HCl pll 8,0. Adicionou-se 4,5 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela (Boehringer, Mannlieim). A mistura foi incubada durante 1 hora a 37°C. Subsequentemente, a fosfatase foi inactivada por incubação a 65°C durante 1,5 horas. A solução foi ajustada a 150 mM NaCl. A solução de DNA foi aplicada numa almofada de 100 pl do permutador aniónico DE 52 (Whatman) equilibrado com 10 mM Tris-HCl pH 7,5 contendo 15o mM NaCl e 1 mM EDTA. Apos lavagem com o mesmo tampão, o DNA foi eluido com 4θθ pl de 10 niM Tris-HCl pH 7,5, 1,5M NaCl, 1 mM EDTA e precipitado por etanol. 0 fragmento grande BamHI de 6,85 kb foi separado do fragmento pequeno num gel de 0,6% de agarose de baixo ponto de fusão em tampão tris-borauo-EDTA pH S,3·

-4οb) Isolamento de um fragmento promotor PH05 do 534 pb

Dez p.g do plasmideo p31/R (EP 100 Sói) foram digeridos com as endonucleases de restrição ECo RI e Eam Hl. Os 3 fragmentos resultantes foram separados num gel de 0,6% de agarose de baixo ponto de fusão em tampão tris-borato-EDTA pH δ,3· O fragmento BamlII-EcoRI de 543 pb foi isolado e contem o promotor PH05 incluindo os sitios de iniciação do mRNA.

c) Isolamento do um fragmento de DNA de 230 pb contendo a sequência codificadora de / Arg 45_7°Slina C

Oito microgramas do plasmideo pBÔlS foram digeridos com as endonucleases de restrição BamlII e EcoRl. Os dois fragmentos de DNA resultantes foram separados num gel de 0,6^ de agarose de baixo ponto de fusãc em tampão tris-borato-EDTA pH S,3· Isolou-se o fragmento de 230 pb.

d) Ligação de fragmentos de DNA

Tres fragmentos de DNA descritos atrás (a-c) com extremos coesivos adequados foram ligados numa so reacção. Ligaram-se 0,1 pmoles (θ,4ρ yg ) do fragmento vector Bam Hl de 6,85 kb, 0,2 pmole ( 70 ng ) do fragmento promotor PH05 Bani HI-EcoRI de 534 pb e 0,2 pmole (29 ng) do fragmento EcoRI-Bam Hl de 230 pb do pJDBÓIS. Os tres fragmentos de DNA estavam contidos dentro de pequenos blocos de gel de agarose de baixo ponto de fusão. Juntaram-se os três pedaços de gel de agarose, liquefizeram-se a

Ó5°C e diluiram-se 2 vezes. A ligação foi feita num volume total de 270 μΐ de Ó0 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 m>I MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP com l6 unidades de DNA-ligasc de T4 (Boehringer, Mannheim) a 15°C durante ló horas. Quantidades de 10 p.1 da mistura de ligação foram adicionadas a 100 μΐ do células E. coli HB101 tratadas com cálcio e competentes para a transformação.

colónias transformadas ampR foram cultivadas individualmente em meio LB contendo 100 p.g/ml de ampicilina. O DNA de plasmideo foi preparado de acordo com o método de Hohmes et al / Anal. Biochem.

Il4 , 193 (l98l)_7 ^e analisado por dupla digestão com IlindIIL /Eco RI. 0 aparecimento de um fragmento EcoRI-IlindIII de 000 pb indica que o clone particular tem o fragmento de DNA promotor PH05-/ Arg 45 7^eSliⁿa C inserido no vector de expressão na orientação correcta. Conforme esperado, cerca de 50% dos clones tem uma inserção na orientação correcta.

Um destes clones foi isolado e referido como pJDB2O7P/PHO5-/~Arg 45_7 EGL.

e) Transformação de Saccharorayces cerevisiae GRF IS plasmideo pJDB207 R/P0H5

Arg 45 /EGL foi introduzido em Saccharomyces ce revisiae estirpe GRF 18 ( c<, his 3-H, his 3-15, Leu 2-3, Leu 2-112 can ) usando o protocolo de transformação descrito por Hinnen et al /‘Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) 7 As células de levedura transformadas foram soleccionadas em placas de meio minimo para levedura deficiente em leucina. Isolaram-se colónias de levedura transformadas que se designaram Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-/~Arg 45 7EGL.

f) Fermentação de Saccharomyces cerevisiae GRFlS/pJDB2O7R/ /PHOp-/~Arg 45 7-1L e recuperação de / Arg 45 7^-eglina C e N-acetil-/Arg 457^eSlina C

As células de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-/Ãrg 45 7-EGL foram cultivadas em 3 1 de meio minimo para leveduras com 0,03 g/l de KH_oP0^ a 30°C num Mini-Eio-reactor e colhidas a uma de 1,9.

/ Arg 45 7-®Slina C e N-acetil-/Arg 45 7^-eglina C foram expressas numa proporção molar de cerca de 2:1 (p/p). Ambos os produtos podem ser isolados a partir de homogenatos de células de levedura de acordo com o método dado para E. coli no exemplo 7.

Exemplo 11: Preparação farmacêutica

Uma solução contendo N-acetil-/Ãrg 457-^eSlina C e produzida de acordo com o Exemplo 7 foi dialisado contra uma solução de 0,9% de NaCl. A concentração da solução foi então ajustada a 1 mg/ml ou 10 mg/ml por diluição com a mesma solução de NaCl. Estas soluções foram esterilizadas por ultrafiltração (membrana com poros de 0,22 μπ).

As soluções esterilizadas poden ser usadas directamente para administração intravenosa e para infusão prolongada.

Deposito de microorganismos

A estirpe de Ξ. co li ÍÍBlOl/ /pML 147 foi depositada em 2S de Janeiro de 19S8 em Deuts Samrnlung von Microorganisaien (dsm), Mascherodor Keg lb, D-33OO Braunschweig, com o número DSM 4380.

Claims

1^. - Processo para a produção de compostos da fórmula

B-Tre-GluF*nGliSer01uL«uLieS«rF*nProaiuV*lValQHLlaTr·Vai AepGlnAlaAr<GluTirFenTreL«uHieTirProGlnTirA»pVal-W-P*nLeu ProGluGllSerProVal-X-Y-Z-LeuArgTirAanArgValArgValFenTlrAan PpoGllTreAenValValAanHiaValProHla¥alGll-OH (I) em que R e hidrogénio ou acetilo, W é Tir ou His, X é Tre, Ser ou Pro, Y é Leu, Met, Arg, Lis, Fen, Tir ou Trp e Z é Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser ou Tre, com a condição de X não ser Tre quando Y for Leu e Z for Asp, e de seus sais, caracterizado por compreender cultura de um microorganismo hospedeiro transformado que contem um DNA codificador de um composto da fórmula I e o isolamento do composto da fórmula I ou de um seu sal.

2*. - Processo para a produção de compostos da fórmula I, e de seus sais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R ser acetilo, V ser Tir e X ser Tre, ou Y ser Arg ou Lis e Z é Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser ou Tre, ou X é Pro, Y é Met e Z e Asp ou X é Tre,

Y é Fen, Tir, Trp ou Met e Z e Asp e seus sais.

3-. - Processo para a produção de compostos da formula I, e de seus sais, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R ser acetilo, V é Tir,

X é Tre, Y é Arg e Z é Asp ou Ser e seus sais.

4?. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se produzir de N-acetil-/ Arg 45 7-eglina C.

5-. - Processo para a produção de composições farmacêuticas caracterizado por se adicionar um composto da fórmula I que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, a um veiculo farmaceuticamente aceitável convencional e/ou aditivos até uma concentração final de 0,01-10%.

Ó5. - Método para o tratamento profilático ou terapêutico do corpo humano ou animal caracterizado por se administrar 0,005 a 20 mg por kg de peso do corpo por dia, de um composto da fórmula I que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1.

7-. - Método de acordo com a reivindicação ó caracterizado por o referido composto da fórmula I ser utilizado na inibição de uma protease seleccio nada do grupo constituído por elastase, trombina e tripsina.

8^. - Processo para a produção de DNA que contem uma sequência de DNA codificadora de um composto da fórmula I que pode ser produzido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir DNA por sintese química ou se produzir fragmentos seus por síntese química e se ligar estes por via enzimática num modo predeterminado ou se mutagenizar um DNA codificador da eglina B ou eglina C num ou mais passos.

9®. - Processo para a produção de um vector de expressão contendo uma sequência de DNA que codifica um composto da fórmula I que pode ser produzido

-46de acordo com a reivindicação 1 e é controlado por uma sequência de controlo da expressão, caracterizado por se inserir uma sequência de DNA codificadora de um composto da fórmula I num DNA vector que contem uma sequência de controlo da expressão, sequência esta de controlo da expressão que regula a referida sequência de DNA.

10^. - Processo para a produção de um microorganismo hospedeiro que contem um vector de expressão obtido de acordo com o processo da reivindicação 9 caracterizado por se transformar uma célula hospedeira usando um vector de expressão contendo uma sequência de DNA que codifica um composto da fórmula I e e regulada, por uma sequência de controlo da expressão.