JPH07505896A - ヒルジンのカルボキシ末端配列に対応するペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒルジンのカルボキシ末端配列に対応するペプチド誘導体発明の詳細な説明 本発明は、酵素阻害剤としての、特にトロンビンの阻害剤としての活性を有する 新規のペプチド誘導体に関する。本発明はさらに、このような酵素阻害剤を含有 する製剤組成物のための酵素阻害剤の製造方法及び抗凝固剤としてのその使用に 関する。

したかって、本発明は１式 （式中、Ｒ１及びＲ２は水素、０１〜Ｃ４アルキルであるか又は結合してＣ１〜 Ｃ７ソクロアルキルを形成し、Ｒ’、Ｒ’及びＲ５は同一であっても異なっても よく、水素、Ｃ，−Ｃ，アルキル、ヒドロキシ、ＯＲ’　、　ＳＲ’　、ハロゲ ン、ＮＲ７Ｒ’　、　ＮＯ□、　ＣＮ、　Ｃ０ＮＲ’Ｒ’又はＣ０２Ｒ’　（こ こでＲ＠はＣ３〜Ｃ４アルキル又は０７〜Ｃ１゜アラルキルであり、Ｒ”、Ｒ” 及びＲ９は同一であっても異なってもよく、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又は０７ 〜Ｃ１゜アラルキルであるか、あるいはＲ７及びＲ１はそれらか結合する窒素原 子と一緒に５又は６貝アサンクロアルキル又はオキサザシクロアルギルを形成す る）であり；、Ａｒｇはアルギニン（Ｎ１１−ＣＨ（Ｃ）１．ＣＩｌ、Ｃｌｌ２ ＮＨ−Ｃ（＝Ｎ）ｌ）　−ＮＨ２）−Ｃｏ）であり：ＸはメチンＣ１＋又は窒素 てあり、ｎは０〜７の整数であり：Ｌはペプチドリンカ−であり、そしてＨはヒ ルジンのカルボキシ末端である）の化合物及びその塩を提供する。

本説明の範囲内では、前述及び後述の定義は好ましくは以下の意味を有する： Ｃ１〜Ｃ４アルキルは、例えばエチル、ｎ−プロピル又は特にメチルのような対 応する非分枝鎖アルキルであり、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキルは、例えばシクロペ ンチル又はシクロヘキシルであり、ハロゲンは例えばフルオロ、クロロ又はブロ モであり、Ｃ１〜Ｃ３゜アラルキルは例えば２−フェニルエチル又は特にベンジ ルのようなフェニル−０１〜Ｃ４アルキルであり、５又は６員アザシクロアルキ ルは例えばピロリジル又はピペリジルてあり、一方５又は６員オキサザシクロア ルキルは特にモルホリルである。

ペプチドリンカ−しは、天然の特に遺伝的にコードされたアミノ酸又は合成アミ ノ酸である３〜７個のアミノ酸から成る。分子のこの部分の役割は“Ｎ−末端” アリール部分とＣ−末端ヒルジン配列との間に架橋を提供することであるため、 リンカ−の構造よりむしろ長さが重要である。したがって、リンカ−に含まれる アミノ酸の選択は決定的なものではない。しかしながら、リンカ−アミノ酸の側 鎖と分子のＣ末端ヒルジン部分に存在するアミノ酸との間のあらゆる望ましくな い反作用を避けるためには、リンカ−Ｌの構築のために中性アミノ酸（即ちその 側鎖に強極性官能基、例えばカルボキシ、アミノ又はグアニジノ基を含まないア ミノ酸）を主に（又は専ら）選択することが好ましい。大きい側鎖がないアミノ 酸を選択することも好ましい。リンカ−Ｌの一部として有用なアミノ酸の例とし ては、天然又は合成ω−アミノカルボン酸、例えばグリシン、β−アラニン、４ −アミノ酪酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、Ｉｆアミノウン デカン酸等、さらに他の中性アミノ酸、例えばアラニン、セリン、トレオニン、 グルタミン、アスパラギン、フェニルグリシン、フェニルアラニン等が挙げられ る。リンカ−しのペプチド鎖に少数の、特に１個の極性アミノ酸、例えばアスパ ラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン等を含有することもできる。リン カ−しはそのＣ末端部分に、Ｃ末端遊離基Ｈが取られるヒルジン分子において上 記Ｃ末端部分に先行する１個のアミノ酸又は少数の、例えば２個又は３個のアミ ノ酸を含存してもよい。特に好ましいのは、１つ又はそれ以上のω−アミノカル ボン酸、特にグリシノ、４−アミノ酪酸、又は６−アミノカプロン酸、そして任 意に１つ又はそれ以上の特に１個の中性アミノ酸、例えばアスパラギンから成る リンカ−しである。リンカ−Ｌ中のアミノ酸は、そのアミノ基を介してＬの最初 の（“Ｎ末端”）アミノ酸がそのアミノ基を介して先行するカルボニル基−Ｃ（ ＝Ｏ）−（１式参照）に結合し、そして最後の（“Ｃ末端”）アミノ酸かそのカ ルボキシ基を介して遊離基Ｈのその後の最初のアミノ酸のアミノ基に結合するよ うに、カルボキシアミド結合（ペプチド結合）により互いに結合する。

アルギニン残基ＡｒｇとＣ末端遊離基Ｈの最初のアミノ酸との間の距離が最も重 要であることが判明した。本発明の化合物の最大抗トロンビン活性を確保するた めには、アルギニンＡｒｇのカルボニル基とＣ末端遊離基Ｈの最初のアミノ酸を 結合する主鎖か一定数の原子（結合）を含存しなければならない。特に、次式・ で示される主ｊｌ　１　］は約１８〜約２８、特に約２２〜約２６個の原子を含 汀する。

ヒルノンのカルボキシ末端かトロンビン結合に含まれることは公知である。ヒル ジンＨのカルボキシ末端（１式参照）かあらゆる公知のヒルジン及びヒルリン（ 異なるヒル種から得られる）、例えばヒルジン変異体ＨＶＩ、　ＩＶ２．　ＩＶ ３　（ＰＡ）　、並びにチロシンスルフェート残基を含有するヒルジンの脱硫酸 化変異体及びチロシンスルフェート残基がチロシンホスフェート残基に置換され る変異体を含めたその他の変異体、例えばＭ、　５ｃｈａｒｆ等（ＦＥＢＳ　Ｌ ｅｔｔ、　２５５．１０５−１１０（１９８０）　）が記載したもの及び欧州特 許出願第３４７３７６号（変異体Ｐ６及びＰＩ３）及び第３７３７６７号に記載 されたものの、対応する末端を含有すると理解されるべきである。１つ又はそれ 以上の、特に１〜３個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたヒルジンのカルボ キシ末端を有する誘導体も含まれ、この誘導体はトロンビンとの結合親和性を保 持する。公知のヒルジンのすべてにおいて見出される保存又は不変アミノ酸領域 が存在するということがＭ、　５ｃｈａｒｆ等（上記）により示された。このよ うな領域は対応するカルボキシ末端でも見出される。例えば、ヒルジンはすべて 、ヒルジンＣ末端から約９〜１１アミノ酸の距離にアスパラギン酸−フェニルア ラニンジペブチト保存領域を含有する。Ｍ、　５ｃｈａｒｆ等（上記）のナンバ リングによれば、これらはヒルジンのアミノ酸５５〜５６である。本明細書の状 況において用いる場合はいつでも、“ヒルジンのカルボキシ末端“という用語は アミノ酸５５で開始し、ヒルジンの最後の又は最後から２番目のアミノ酸で終わ るＣ末端部分を含むことを意味する。ヒルジンのこのようなカルボキシ末端部分 の例は、以下の配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：ｌ〜４参照）を有するヒルジンＨＶＩ 、　ＩＶ２．　ＩＶ３．　Ｐ６及びＰＩ３から得られる。

Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｚ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｎ　（ＩＩＩ）。

Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　１１．ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ 　Ｚ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　（ＩＶ）　。

Ａｓｐ　円〕ｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｚ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　（Ｖ）。

Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　（Ｖｌ）（式中、ＺはＴＹｒ、ＴＹｒ　（ＳＯｓＨ） 又はＴｙｒ　（Ｐｏｔ）（ｚ）である）。後者２つの場合は、チロシンのヒドロ キシ基はそれぞれ硫酸及びリン酸でエステル化され、この場合最後のアミノ酸（ 例えば１１１式におけるＧｉｎ）は存在しない。本発明の好ましいカルボキシ末 端Ｈは、１１１式（式中、ＺはＴｙｒである）のものであり、最後から二番目の グルタミン残基を任意に欠いている。

本発明の好ましい態様では、１式の化合物の“Ｃ末端”ペプチド領域Ｌ　−Ｈは 以下の配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　５と比較）：Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｕ　ＧｌｕＴｙｒ　Ｌｅｕ　（ＩＩＩ　ａ） 又は次の配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　６と比較）Ｇａｂ　Ａｃａ　Ａｓｎ　 Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　 Ｔｙｒ　Ｌｅｕ（ＩＶａ） （ここてＧａｂは４−アミノ−酪酸を示し、Ａｃａは６−アミノカプロン酸を示 す） を存する。

本発明はさらに本発明の塩、特に製薬上許容可能な非毒性塩に関する。本発明の 化合物は、例えば無機酸、特に鉱酸、例えば塩酸、硫酸又はリン酸を用いて酸付 加塩を、あるいは有機カルボン酸、スルホン又はスルホ酸、例えば酢酸、プロピ オン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチル マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マン デル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−ア セトキシ安息香酸、エンポン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）　、ニコチン酸又 はイソニコチン酸、さらにアミノ酸並びにメタンスルホン酸、エタンスルホン酸 、２−ヒドロキシェタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼン スルホン酸、４−メチルヘンゼンスルホン酸又はナフタレン−２−スルホン酸を 用いて、あるいは他の酸性有機化合物、例えばアスコルビン酸を用いて塩を生成 し得る。本発明の化合物はさらに金属塩又はアンモニウム塩、例えばアルカリ金 属及びアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム又はカ ルシウム塩、並びにアンモニア又は好適な有機アミンによるアンモニウム塩を生 成し得るが、特に塩生成に好適なものとしては、脂肪族、脂環式、脂環式−脂肪 族又はアラリファティック第一、第二又は第三モノ−、ジー又はポリアミン、さ らに複素環式塩基、例えば低級アルキルアミン、例えばトリエチルアミン、ヒド ロキシ−低級アルキルアミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２ −ヒドロキシエチル）−アミン、２−ヒドロキシエチルジエチルアミン又はトリ ー（２−ヒドロキシエチル）−アミン、カルボン酸の塩基性脂肪族エステル、例 えば４−アミノ安息香酸２−ジエチルアミノエチルエステル、低級アルキレンア ミン、例えばｌ−エチルピペリジン、シクロアルキルアミン、例えばジシクロヘ キシルアミン、又はベンジルアミン、例えばＮ、Ｎ’　−ジベンジルエチレンジ アミン、さらにピリジン型の塩基、例えばピリジン、コリジン又はキノリンが挙 げられる。本発明の化合物はさらに、内部塩を生成し得る。単離又は精製のため には、製薬上好適でない塩を用いることもできる。しかしながら、製薬上許容可 能な非毒性塩のみか治療に用いられ、したがってこれらが好ましい。

１式の化合物及び製薬上許容可能なその塩は、スペーサー配列を介してヒルジン のトロンビン−結合カルボキシ末端領域と結合する“Ｎ−末端”低分子トロンビ ン阻害剤部分から成る二価性トロンビン阻害剤を代表するものである。これらの 二価性トロンビン阻害剤は、ヒトを含めだ哺乳類においてトロンビンに対する高 特異活性を示し、したがってこれらの化合物は血栓症又は血栓症によって引き起 こされる疾患の治療又は予防に存用であり、あるいは診断試薬として血液中のト ロンビンの定量に用い得る。

本発明は特に、１式（式中、Ｒ１及びＲ２は各々Ｃ３〜Ｃ４アルキルであり、Ｒ ２，Ｒ４及びＲ５は各々水素であり；　Ａｒｇはアルギニンであり：Ｘはメチン 　ＣＨ又は窒素でありｉｎはθ〜７の整数であり；Ｌは０２〜ＣＩｍ−ω−アミ ノカルボン酸、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、フ ェニルグリシン又はフェニルアラニンから成る群から選択される３〜６個のアミ ノ酸で構成されるペプチドリンカ−であり：そしてＨはアミノ酸５５で開始し、 ヒルジンの最後の又は最後から二番目のアミノ酸で終わるヒルジンのカルボキシ 末端、チロシンスルフェート残基を含有するこのようなヒルジンの脱硫酸化変異 体、チロシンスルフェート残基がチロシンホスフェート残基に置換されるこのよ うなヒルジンの変異体、あるいは１〜３個のアミノ酸か他のアミノ酸に置換され るその誘導体であって、誘導体はトロンビンに対する結合親和性を保持し、次式 で示される主ＳＲＩ　＋か約１８〜約２８、特に約２２〜約２６個の原子を含有 する）の化合物及び製薬上許容可能なその塩に関する。

さらに本発明は、１式（式中、Ｒ’及びＲ２は各々メチルであり、Ｒ’、Ｒ’及 びＲ６は各々水素てあり；　Ａｒｇはアルギニンであり：Ｘはメチン　Ｃ１ｌて あり、ｎは２であり：ＬはＣ７〜Ｃ１７−ω−アミノカルボン酸及びアスパラギ ンから成る肝から選択される３〜６個のアミノ酸で構成されるペプチドリンカー てあり、そしてトＩはアミノ酸５５て開始し、ヒルジンＨＶＩの最後の又は最後 から二番目のアミノ酸で終わるヒルノン変異体ＨＶＩのカルボギン末端、又はそ の脱硫酸化変異体であって、次式： で示される主１１１１が約２２〜約２６個の原子を含有する）の化合物及び製薬 上許容可能なその塩に関する。

最も好ましいのは、１式（式中、Ｒ１及びＲ２は各々メチルを表し、Ｒ２、Ｒ４ 及びＲ３は各々水素であり；　Ａｒｇはアルギニンであり、Ｘはメチン　ＣＨで ありｉｎは２であり；Ｌは４−アミノ酪酸、５−アミノカプロン酸、グリシン及 びアスパラギンから成る群から選択される３〜６個のアミノ酸で構成されるペプ チドリンカ−であり：そしてＩ］はアミノ酸５５で開始し、ヒルジンＨＶＩの最 後から二番目のアミノ酸で終わる脱硫酸化ヒルジン変異体ＨＶＩのカルボキシ末 端であって、次式： て示される主鎖１１が約２２〜約２６個の原子を含有する）の化合物及び製薬上 許容可能なその塩である。

本発明の最も好ましい化合物は実施例に記載したものである。

本発明の化合物はそれ自体公知の方法で製造し得る。

１式の化合物の製造方法は、例えば１式の化合物のアミド結合形成−次断片を１ 式の化合物の二次アミド結合形成断片と反応させて（上記−次断片及び上記二次 断片は、アミド結合が上記−次及び二次断片間に形成されてその結果１式の上記 化合物を生じて、上記−次及び二次断片の一方がそれぞれ反応性遊離カルボキシ 基及びフルホキシ基を含有するがあるいはその反応性カルボン酸又はスルボン酸 誘導体を含有し、上記−次及び二次断片の他方が遊離アミノ基又はその反応性誘 導体を含有するように互いに相補的であり、この場合上記断片中の遊離官能基は 、反応に加わる２つの基を除いて、必要な場合は保護化形態である）、存在する 場合には保護基を除去し、所望により本方法により得られる塩を遊離化合物に変 換するか及び／又は本方法により得られる遊離化合物を塩に変換する工程から成 る。

本発明の方法によれば、反応の最終段階は１式の分子内のあらゆる考え得る位置 でのアミド結合の形成を包含する。遊離カルボキシ基を含有する上記断片は、以 下の式Ｖｌｌ−Ｘの化合物のいずれかで（Ｖｌｌ）　（ＶＩＩＩ） （式中、Ｔｒ−Ｌ’−０１＋はリンカ−Ｌのアミノ酸の一部から成るか又はヒル ジンＨのカルボキシ末端の付加アミノ酸を任意に含有するリンカ−Ｌから成るア ミノ酸配列を示し、Ｃ末端アミノ酸は遊離カルボキシ基を有し、反応に加わらな い遊離官能基は必要な場合は保護化形態である）。

遊離アミノ基を含有する断片は、単一アミノ酸（即ち１式の化合物のＣ末端アミ ノ酸）、リンカ−Ｌのアミノ酸の全部又は一部を任意に付加的に含有するヒルジ ンＨのカルボキシ末端部分のアミノ酸の少なくとも一部から成るジー、オリゴ− 又はポリペプチドであるか、あるいは以下の断片Ｘ＋又はＸｌｌ　：（ここで、 Ｘｌ１式の断片においてはアルギニンＡｒｇのアルファーアミノ基は遊離形態で ある）の１つである。

好ましくは、一方の断片の反応性カルボン酸又はスルホン酸誘導体を遊離アミノ 基を含有する相補的断片と反応させることにより反応を実施するが、カルボン酸 断片のカルボキシ基の誘導化はｉｎ　５ｉｔｕで実行し得る。好適な合成方法は 、例えばＭ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、　Ｐｅｐｔｉｄｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ　１９８８及びＥ、　Ａｔｈ ｅｒｔｏｎ　ａｎｄＲ，Ｃ，５ｈｅｐｐａｒｄ、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　１９８９に記載されている。

反応性カルボン酸及びスルホン酸誘導体は特に、反応性活性化エステル又は反応 性無水物であり、そして反応性環式アミドでもある。

上記のように、反応性カルボン酸誘導体はｉｎ　５ｉｔｕで生成し得る。

酸の活性化エステルは特に、例えばビニルエステル型の、例えば真ビニルエステ ル（例えば、対応するエステルを酢酸ビニルでエステル交換することにより得ら れる。活性化ビニルエステル法）、カルバモイルビニルエステル（例えば対応す る酸をイソキサゾリウム試薬で処理することにより得られる；ｌ、２−オキサジ ノウム又はＷｏｏｄｗａｒｄ法）、又は１−低級アルコギンビニルエステル（例 えば対応する酸を低級アルコキシアセチレンで処理することにより得られる；エ トキシアセチレン法）、あるいはアミジノ型のエステル、例えばＮ、　Ｎ’−二 置換アミジノエステル（例えば対応する酸を好適なＮ、　Ｎ’−二置換カルボジ イミド、例えばＮ、　Ｎ’−ジイソプロピル−又はＮ、　Ｎ’−ジシクロへキシ ル−カルボジイミドで処理することにより得られる；カルボジイミド法）、又は Ｎ、　Ｎ−二置換アミジノエステル（例えば対応する酸をＮ、　Ｎ−二置換シア ナミドで処理することにより得られる；ジアミナト法）のエステル化遊離基の結 合炭素原子で不飽和であるエステルである。活性化エステルはさらに、例えば好 適なアリールエステル、特に電子吸引置換基により好適に置換されるフェニルエ ステル（このエステルは例えば対応する酸を、Ｎ、Ｎ’−ジクロロへキシルカル ボジイミドのような縮合剤の存在下で好適に置換されたフェノール、例えば４− ニトロフェノール、４−メチルスルホニルフェノール、２，４．５−トリクロロ フェノール、２．　３．　４．　５．　６−ペンタクロロフェノール、ペンタフ ルオロフェノール又は４−フェニルジアゾフェノールで処理することにより得ら れる；活性化アリールエステル法）、シアノメチルエステル（例えば対応する酸 を、塩基の存在下でクロロアセトニトリルで処理することにより得られる）、好 適なチオエステル、特に例えば置換されないか又はニトロにより置換されるフェ ニルチオエステル（特に無水物又はカルボジイミド法を用いて例えば対応する酸 を置換しない又は例えばニトロて置換したチオフェノールで処理することにより 得られる）、あるいはアミノ又はアミドエステル（例えば対応する酸を、例えば 無水物又はカルボジイミド法、活性化Ｎ−ヒドロキシエステル法により、Ｎ−ヒ ドロキシアミノ又はＮ−ヒドロキシアミド化合物、例えばＮ−ヒドロキシスクシ ンイミド、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド又は■−ヒ ドロキシーＩＨ−ベンゾトリアゾールで処理することにより得られる）である。

反応性酸無水物はこれらの酸の対称性又は好ましくは混合性無水物、例えば無機 酸を含有する無水物、例えば酸ハロゲン化物、特に酸塩化物（例えばスルホン酸 を含めた対応する酸を塩化チオニル、五塩化リン又は塩化オキサリルのような好 適なハロゲン化剤で処理することにより得られる；酸塩化物法）；アジ化物（例 えば対応するヒドラジドを経て、そして亜硝酸によるその処置により酸エステル から得られる；アジ化物法）、対応するエステル、例えば炭酸低級アルキル半エ ステルのような炭酸手誘導体を含有する無水物（例えば対応する酸をハロギ酸例 えばクロロギ酸低級アルキルエステルで、又はｌ−低級アルコキシカルボニルー ２−低級アルコキシ−１゜２−ジヒドロキノリン、例えばｌ−低級アルコキシ力 ルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリンで処理することにより得ら れる：混合０−アルキル炭酸無水物法）、又は二ハロゲン化、特に二塩化リン酸 を含有する無水物（例えば対応する酸をオキシ塩化リンで処理することにより得 られるニオキシ塩化リン法）、あるいは有機酸を含有する無水物、例えば有機カ ルボン酸を含有する無水物（対応する酸を非置換又は置換低級アルカンカルボン 酸又はフェニル低級アルカンカルボン酸ハロゲン化物、例えばフェニル酢酸、ピ バル酸又はトリフルオロ酢酸塩化物で処理することにより得られる；混合カルボ ン酸無水物法）又は有機スルホン酸を含有する無水物（例えば対応する酸の塩、 例えばアルカリ金属塩を好適な有機スルホン酸ハロゲン化物、例えば低級アルカ ンスルホン酸又はアリールスルホン酸塩化物、例えばメタン−又はｐ−トルエン 、スルホン酸塩化物で処理することにより得られる；混合スルホン酸無水物法） 、並びに対称性無水物（例えば、カルボジイミド又はｌ−ジエチルアミノプロピ ンの存在下での対応する酸の縮合により得られる。対称性無水物法）である。

好適な環式アミドは特に、芳香族特性を有する５員ジアザ環式化合物を含有する アミド、例えばイミダゾール、（例えば対応する酸をＮ、　Ｎ’　−カルボニル ジイミダゾールで処理することにより得られる：イミダゾール法）、又はピラゾ ール、例えば３，５−ジメチルピラゾール（例えばアセチルアセトンで処理する ことにより酸ヒドラジドを経て得られる；ピラゾリド法）を含有するアミドであ る。

上記のように、カルボン酸誘導体はｉｎ　５ｉｔｕでも生成し得る。例えばＮ、 　Ｎ’−二置換アミジノエステルは遊離アミン基を有する相補的断片と遊離カル ボキシ基を有するペプチド断片の混合物を好適なＮ、　Ｎ−二置換力ルポジイミ ド、例えばＮ、　Ｎ−ジイソプロピル−又はＮ、　Ｎ’−ジシクロへキシルカル ボジイミドの存在下で反応させることにより、ｉｎ　５ｉｔｕで生成し得る。さ らに、酸のアミノ又はアミドエステルは、Ｎ、　Ｎ’−二置換力ルポジイミド、 例えばＮ。

Ｎ′−ジシクロへキシル−又はＮ、　Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドの存 在下で、並びにＮ−ヒドロキシアミン又はＮ−ヒドロキシアミド、例えばＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドの存在下で、任意に好適な塩基、例えば４−ジメチルア ミノピリジンの存在下で、対応する酸とアミノ出発物質との混合物を反応させる ことによりアシル化されるアミンの存在下で生成される。

あるいは、本発明の方法は、遊離カルボキシ基を存する断片をアミノ基か反応形 態で存在する相補的断片と反応させることによっても実行し得る；アミノ基は、 例えばホスフィツト、例えばジエチルクロロホスフィツト、１．１−フェニレン クロロホスフィツト、エチルジクロロホスフィツト、エチレンクロロホスフィツ ト又はテトラエチルピロホスフィツトとの、あるいは好適なシリル化剤、例えば 有機ハロシラン、例えばトリメチルクロロシランとの反応により活性化し得る。

アミノ基はさらに、ハロカルボニル、例えばクロロカルボニルと結合することに より活性化し得るし、あるいはイソシアネート基の形態で活性化し得る。

反応に加わらない場合には有益には保護化形態である上記断片中の官能基は特に カルボキシ、アミノ及びヒドロキシ基であり、カルバモイル及びグアニジノ基で あってもよい。

保護基及びそれらが導入され且つ除去される方法は、例えば“Ｐｒｏｔｅｃｔｉ ｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″、　Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７３．　”Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ 　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ”。

Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ、　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｖｏｌ、１５／１．　 Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９７４、及びＴｈ、　Ｗ、　Ｇｒｅｅｎｅ、“Ｐｒｏｔ ｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”、　 Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８１に記載さ れている。容易に除去し得る、即ち例えば加溶媒分解、還元又は光分解によって 起こる望ましくない二次反応を伴わないことが保護基の特徴である。

ヒドロキシ保護基は、例えばアシル遊離基、例えば非置換又は置換、例えばハロ ー置換、低級アルカノイル、例えば２，２−ジクロロアセチル、あるいは炭酸半 エステルのアシル遊離基、特にｔｅｒｔ、　−ブトキシカルボニル、非置換又は 置換ベンジルオキシカルボニル、例えば４−ニトロベンジルオキシカルボニル、 又はジフェニルメトキシカルボニル、又は２−ハロー低級アルコキシカルボニル 、例えば２．　２．　２−）リクロロエトキシ力ルボニル、又はホルミルである 。他のヒドロキシ保護基は、例えば好適なエーテル化基、例えばトリチル、ｔｅ ｒｔ、−低級アルキル、例えばｔｅｒｔ、−ブチル、２−オキサ−又は２−チア −脂肪族又は−シクロ脂肪族炭化水素遊離基、特にｌ−低級アルコキシー低級ア ルキル又はｌ−低級アルキルチ才一低級アルキル、例えばメトキシメチル、ｌ− メトキシエチル、■−エトキシエチル、メチルチオメチル、１−メチルチオエチ ル又はｌ−エチルチオエチル、あるいは５又は６還原子を有する２−オキサ−又 は２−チア−シクロアルキル、例えば２−テトラヒドロフリル又は２−テトラヒ ドロピラニル、又は対応するチア類似体、並びに非置換又は置換Ｉ−フェニルー 低級アルキル、例えば非置換又は置換ベンジル又はジフェニルメチルであって、 フェニル遊離基の置換基として適しているのは、例えばハロゲン、例えば塩素、 低級アルコキシ、例えばメトキシ、及び／又はニトロである。さらにヒドロキシ 保護基は、好ましくは置換基として低級アルキル、特にメチル、及び／又はアリ ール、例えばフェニル、特にトリー低級アルキルシリル、特にトリメチルシリル 及びジメチル−ｔｅｒｔ、−ブチルシリル、又は対応置換スタニル、例えばトリ ーｎ−ブチルスタニルを含有する有機シリル又はスタニル遊離基でもある。

カルボキシ基は、好ましくはエステル化形態で保護化され、このようなエステル 基は温和な条件下で容易に切断される。このような方法で保護化されたカルボキ シ基は、エステル化基として特にｌ−位置で分枝するか又はｌ−又は２−位置で 好適に置換される低級アルキル基を含有する。エステル化形態の好ましいカルボ キシ基は、中でもｔｅｒｔ、−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ、− ブトキシカルボニル、ｌ又は２個のアリール遊離基を有するα−アリール低級ア ルコキシカルボニルであり、これらは置換されないが又は例えば低級アルキル、 例えばｔｅｒｔ、−低級アルキル、例えばｔｅｒｔ、−ブチル低級アルコキシ、 例えばメトキシ、ヒドロキシ、ハロゲン（例えば塩素）、ニトロにより、及び／ 又はフェニルにより置換されるフェニル遊離基で、例えば置換されないか又は上 記のように置換されるベンジルオキシカルボニル、例えば４−メトキシベンジル オギンヵルポニル又は４−ニトロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルがα− 位置に置換するビフェニル−低級アルコキシカルボニル、例えば２−（ｐ−ビフ ェニル）−２−プロポキシカルボニル、あるいは置換されないか又は上記のよう に置換されるジフェニルメトキシカルボニル、例えばジフェニルメトキシカルボ ニル又はジー（４−メトキシフェニル）−メトキシカルボニル、１−低級アルコ キシー低級アルコキシカルボニル、例えばメトキシメトキシカルボニル、ｌ−メ トキシエトキシカルボニル又はｌ−エトキシメトキシカルボニル、アリールが、 置換されないか又は例えばニトロにより置換される４−ニトロフェニルのような フェニルである２、２−ジアリール−エトキシカルボニル、例えば２，２−ジー （４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニルで、ここで２つのアリール（例え ばフェニル）遊離基は互いに結合してもよく、例えば２−（９−フルオレニル） −エトキシカルボニル、１−低級アルキルチオー低級アルコキシカルボニル、例 えば１−メチルチオメトキシカルボニル又はｌ−エチルチオエトキシカルボニル であり、アロイル基が置換されないか又は例えばハロゲン（例えば臭素）により 置換されるベンゾイルであるアロイルメトキシカルボニル、例えばフェナシルオ キシカルボニル、２−ハロー低級アルコキシカルボニル、例えば２．　２．　２ −トリクロロエトキシカルボニル、２−ブロモエトキシカルボニル又は２−ヨー ドエトキシカルボニル、あるいは置換基の各々が他のものとは無関係に、置換さ れないか又は例えば低級アルキル、低級アルコキシ、アリール、ハロゲンにより 、及び／又はニトロにより置換される脂肪族、アラリファティック、脂環式又は 芳香族炭化水素遊離基、例えば非置換又は対応的置換低級アルキル、フェニル− 低級アルキル、シクロアルキル又はフェニルを表す２−（三置換シリル）エトキ シカルボニル、例えば２−トリー低級アルキルシリルエトキシカルボニル、例え ば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル又は２−（メチル−ジー（ｎ−ブチ ル）−シリル）−工トギンカルポニル又は２−トリアリールシリルエトキシカル ボニル、例えば２−トリフェニルシリルエトキンカルボニルである。

好ましい保護カルボキシ基は、例えばｔｅｒｔ、−低級アルコキシカルボニル、 例えばｔｅｒｔ、−ブトキノカルボニル、及び置換されないか又は例えば上記の ように置換されるベンジルオキシカルボニル、例えば４−メトキシ−又は４−ニ トロベンジルオキシカルボニル、あるいはジフェニルメトキシカルボニル、並び に２−（トリメチルシリル）−エトキシカルボニルである。

保護アミノ基は、例えば容易に切断可能なアシルアミノ、アリールメチルアミノ 、エーテル化メルカプトアミノ、２−アシル低級アルク−１−エニルアミノ、ソ リルアミノ又はスタニルアミノ基の形態、あるいはアジド基の形態であり得る。

対応するアシルアミノ基においては、アシルは、例えば１８個までの炭素原子を 有する有機カルボン酸、特に置換されないか又は例えばハロゲン又はアリールに より置換されるアルカンカルボン酸の、あるいは置換されないか又は例えばハロ ゲン（例えば塩素）、低級アルコキン（例えばメトキシ）、ニトロにより、及び ／又はフェニルにより置換される安息香酸の、あるいは炭酸半エステルの対応す る遊離基である。このようなアシル基は、例えば低級アルカノイル（例えばホル ミル、アセチル又はプロピオニル）、ハロ低級アルカノイル（例えば２−ハロア セチル、特に２−クロロ−１２−ブロモ−１２−ヨード、２，２．２−トリフル オロ−又は２，２．２−トリクロロアセチル）、置換されないか又は例えばハロ ゲン、低級アルコキシ、ニトロにより及び／又はフェニルにより置換されるベン ゾイル、例えばベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−メトキシベンゾイル又 は４−ニトロベンゾイル、又は低級アルキル遊離基の１−位置で分枝するかある いはｌ−又は２−位置で好適に置換される低級アルコキシカルボニル、特にｔｅ ｒｔ、−低級アルコキシカルボニル、例えばｔｅｒｔ、−ブトキシカルボニル、 低級アルケニルオキシカルボニル、例えばアリルオキシカルボニル、置換されな いが又は例えば低級アルキル、特にｔｅｒｔ、−低級アルキル（例えばｔｅｒｔ 、−ブチル）、低級アルコキシ（例えばメトキシ）、ヒドロキシ、ハロゲン（例 えば塩素）、ニトロにより及び／又はフェニルにより置換される好ましくはフェ ニルである１又は２個のアリール遊離基を有するα−アリール低級アルコキシカ ルボニル、例えば非置換又は置換ベンジルオキシカルボニル、例えば４−ニトロ ベンジルオキシカルボニル、ビフェニルがα−位置に置換するビフェニル−低級 アルコキシカルボニル、例えば２−（ｐ−ビフェニル）−２−プロポキシカルボ ニル、あるいは置換ジフェニルメトキシカルボニル、例えばベンズヒドロキシカ ルボニル又はジー（４−メトキシフェニル）−メトキシカルボニル、アリールが 、置換されないか又は例えばニトロにより置換される４−ニトロフェニルのよう なフェニルである２、２−ジアリール−エトキシカルボニル、例えば２．２−ジ ー（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニルで、ここで２つのアリール（例 えばフェニル）遊離基は互いに結合してもよく、例えば９−フルオレニル−メト キシカルボニルであり、アロイル基が置換されないが又は例えばハロゲン（例え ば臭素）により置換される好ましくはベンゾイルであるアロイルメトキシカルボ ニル、例えばフェナシルオキシカルボニル、２−ハロー低級アルコキシカルボニ ル、例えば２゜２、　２−トリクロロエトキシカルボニル、２−ブロモエトキシ カルボニル又は２−ヨードエトキシカルボニル、任意に置換２−フェニルスルホ ニルエトキシカルボニル、例えば２−（４−メチルスルホニルフェニルスルホニ ル）−エトキシカルボニル、あるいは置換基の各々が他のものとは無関係に、１ ５個までの炭素原子を有し、置換されないか又は例えば低級アルキル、低級アル コキシ、アリール、ハロゲンにより、又はニトロにより置換される脂肪族、アラ リファティック、脂環式又は芳香族炭化水素遊離基、例えば対応する非置換又は 置換低級アルキル、フェニル−低級アルキル、シクロアルキル又はフェニルであ る２−（三置換シリル）エトキシカルボニル、例えば２−トリー低級アルキルシ リルエトキシカルボニル、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル又は ２−（メチル−ジ−ｎ−ブチル−シリル）−エトキシカルボニル又は２−トリア リールシリルエトキシカルボニル、例えば２−トリフェニルシリルエトキシカル ボニルである。

さらにアミノ保護基として好適なアシル遊離基は、存機リン酸、ホスホン酸又は ホスフィン酸の対応する遊離基、例えばジ低級アルキルホスホリル、例えばジメ チルホスホリル、ジエチルホスホリル、ジ−ｎ−プロピルホスホリル又はジイソ プロピルホスホリル、ジシクロアルキルホスホリル、例えばジフェニルホスホリ ル、置換されないか又は例えばニトロにより置換されるジー（フェニル低級アル キル）ホスホリル、例えばジベンジルホスホリル又はジ（４−ニトロベンジル） ホスホリル、非置換又は置換フェノキシフェニルホスホニル、例えばフェノキシ フェニルホスホニル、ジー低級アルキルホスフィニル、例えばジエチルホスフィ ニル、あるいは非置換又は置換ジフェニルホスフィニル、例えばジフェニルホス フィニルである。

モノ−、ジー又は特にトリーアリールメチルアミノ基であり得るアリールメチル アミノ基においては、アリール遊離基は特に非置換又は置換フェニル遊離基であ る。このような基は、例えばベンジルアミノ、ジフェニルメチルアミノ及び特に トリチルアミノである。

このような遊離基により保護されるアミノ基におけるエーテル化メルカプト基は 、特にアリールが特に置換されないか又は低級アルキル（例えばメチル又はｔｅ ｒｔ、−ブチル）、低級アルコキシ（例えばメトキシ）、ハロゲン（例えば塩素 ）により、及び／又はニトロにより置換されるフェニルであるアリールチオ又は アリール低級アルキルチオである。対応するアミノ保護基は、例えば４−ニトロ フェニルチオである。

アミノ保護基として用い得る２−アシル−低級アルク−１−エン−１−イル遊離 基において、アシルは、例えば低級アルカンカルボン酸の、置換されないか又は 例えば低級アルキル（例えばメチル又はｔｅｒｔ、−ブチル）、低級アルコキシ （例えばメトキシ）、ハロゲン（例えば塩素）により、及び／又はニトロにより 置換される安息香酸の、又は特に炭酸半エステル（例えば炭酸低級アルキル半エ ステル）の対応する遊離基である。対応する保護基は、特に１−低級アルカノイ ルプロブ−１−エン−２−イル、例えば１−エトキシカルボニル−プロブ−１− エン−２−イルである。

アミノ基は、プロトン化形態でも保護化し得る；対応する陰イオンとしては、特 に強無機酸（例えばハロゲン化水素酸）の陰イオン、例えば塩素又は臭素陰イオ ン、あるいは存機スルホン酸（例えばｐ−トルエンスルホン酸）の陰イオンを考 慮に入れる。

好ましいアミノ保護基は、炭酸半エステルのアシル遊離基、特にｔｅｒｔ、−ブ トキシカルボニル、アリルオキシカルボニル又は置換されないか又は例えば上記 のように置換されるベンジルオキシカルボニル、例えば４−ニトロベンジルオキ シカルボニル、又はジフェニルメトキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキ シカルボニル、又は２−ハロー低級アルコキシカルボニル、例えば２．　２．　 ２−トリクロロエトキシカルボニル、及びｌ−リチル又はホルミルである。

非置換カルバモイル基は、例えばＮ−（９−キサンテニル）誘導体の形態で、又 はＮ−（モノ−、ジー又はトリーアリールメチル）誘導体の形態（ここで、アリ ールは特に、置換されないか又は５個までの同一の又は異なる置換基、好ましく は低級アルキル（例えばメチル）、又は低級アルコキシ（例えばメトキシ）を含 有するフェニルである）で保護化される。このようなアリールメチル保護基の例 を以下に記載する＝４−メトキシベンジル、２．　４．　６−１−リメトキシベ ンジル、ジフェニルメチル、ジー（４−メトキシフェニル）−メチル、ジー（４ −メチルフェニル）−メチル及び（４−メチルフェニル）−（〔高分子キャリア ー〕−フェニル）−メチル。好ましいカルバモイル保護基はトリチルである。

グアニジノ基は、例えばプロトン化により、あるいはニトロにより又は好適に置 換されるスルホニル基、例えばアリールスルホニル（ここでアリールは、置換さ れないか又は例えば低級アルキル（例えばメチル）を含有するフェニルであるか 、あるいは置換されないか又は例えば低級アルキル（例えばメチル）により置換 され、芳香族炭素原子を介して結合されるベンゾヘテロシクリル（例えばクロマ ニル）である）、例えば４−メトキシフェニルスルホニル又は２゜２、　５．　 ７．　８−ペンタメチル−６−クロマニルスルホニルによって保護化し得る。

本出願においては、保護基、特にカルボキシ保護基により、保護される官能基に 、特にカルボキシ基に結合する高分子キャリアーにより、キャリアーかいわゆる Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド合成に特に適しており、且つ容易に除去し得ると 理解されるべきである。このような高分子キャリアーは、例えば好ましくはジビ ニルベンゼンとの共重合により弱く架橋されるポリスチレン樹脂であり、樹脂は アミノ酸及びペプチド残基の可逆的結合に適した架橋員を存する。特に上記の弱 架橋ポリスチレン樹脂に関連して、これらの架橋員は特に、置換されないか又は 置換される、そしてポリスチレン樹脂の芳香族遊離基と直接結合するメチレン基 である。メチレン基の置換基は好ましくはエーテル又はエステル基によりメチレ ン基に結合し、アミノ酸又はペプチド断片の官能基、特にカルボキシ基と一緒に 保護基、特に対応するカルボキシ基（例えばエステル化カルボキシ基）を形成し 得る好適な官能基を含有する。このような架橋員は、例えばα位置に低級アルコ キシ（例えばメトキシ）、あるいは置換されないか又は例えば〇−及び／又はｐ −位置で例えば低級アルコキシ（例えばメトキシ）により置換されるフェニルを 任意に含有する４−メトキシベンジルアルコールの２価の遊離基であって、４− メトキシベンジルの場合、４−メトキシ基の炭素原子はポリスチレン樹脂のフェ ニル遊離基と直接結合し、ベンジルヒドロキシ基はアミノ酸又はペプチド断片の カルボキシ官能基をエステル化する。

アミド結合を形成する反応は、それ自体公知の方法で実行し得る。

反応条件は特に反応に加わるカルボキシ基が通常は好適な溶媒又は希釈剤あるい はその混合物の存在下で、そして必要な場合には、例えば反応に加わるカルボキ シ基が無水物の形態で存在するばあいに好適な酸結合剤でもあり得る縮合剤の存 在下で、冷却又は加熱しながら、例えば約−３０°Ｃ〜約＋１５０°Ｃ１特に＋ １０°Ｃ〜＋７０°Ｃ１好ましくは室温（杓子２０”Ｃ）〜＋５０°Ｃの範囲の 温度で、密閉反応容器中で、及び／又は不活性ガス（例えば窒素）の大気中で活 性化されるか否かそして如何に活性化されるかに依っている。

通例の縮合剤は、例えばカルボジイミド、例えばＮ、　Ｎ’−ジエチル−１Ｎ、 Ｎ’−ジイソプロピル−１Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへキシル−又はＮ−エチル−Ｎ ’　−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、好適なカルボニル化 合物、例えばカルボニルジイミダゾール、あるいは１．　２−オキサジノウム化 合物、例えば２−エチル−５−フェニル−１，２−才キサゾリウムー３′−スル ホネート及び２−　ｔｅｒｔ、−ブチル−５−メチルイソキサゾリウム過塩素酸 塩、好適なアシルアミノ化合物、例えば２−エトキシ−１−エトキシカルボニル −１，２−ジヒドロキノリン、さらにウロニウム化合物、例えば２−　（ＩＨ− ベンゾトリアゾール−１−イル）　−１，１，３゜３−テ１トラメチルウロニウ ムテトラフル才口ボレート（ＴＢＴＵ）　、又はホスホニウム化合物、例えばベ ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニ ウムヘキサフルオロホスフェ−１−（ＢＯｒ’）又はベンゾトリアゾール−１− イル−オキシ−ピロリジノホスホニウムへギサフルオロホスフエート（ｐｙＢＯ Ｐ）である。通例の酸結合剤は、例えばアルカリ金属炭酸塩又は重炭酸塩、例え ばナトリウム又はカリウｌ、の炭酸塩又は重炭酸塩（通常は並びに硫酸塩）、あ るいは有機塩基、例えば通例では立体的ヒンダードトリ低級アルキルアミン、例 えばＮ、Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミンである。

上記のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド合成は、１式の化合物の半自動又は全自動 合成に特に適しており、この場合、反応に加わらない官能基が通常は保護化形態 であるアミノ酸及び／又はペプチド断片及び／又は他の非ペプチド部分はアミド 基を介し、て互いに結合して、生成されるペプチド断片の単離を伴わない。末端 ペプチド中に存在する官能基の１つ（一般的には末端カルボキンＭ）は、前述の ように架橋員により好適な高分子キャリアーと任意に結合する。原則とシ１．て 、本工程の変形はペプチドの通例の合成と同様に実施するが１．高分子キャリア 一部分を含有するすでに合成された（ペプチド）断片においては反応に加わる官 能基（通常は末端アミノ基）のペプチド基がらの遊離は、各々の場合に反応に加 わらない官能基の保護基が保持される条件下で実行される。

カルボキシ−、アミノ−、ヒドロキシ−、カルボン醋酸アミド−、カルバモイル −及び／又はグアニジノ−保護基の除去は、それ自体公知の方法で、例えばβ− 説離、加溶媒分解、特に加水分解（酸性又は塩基性条件下で）、アルコリーシス 、アシトリーシス又は塩基を用いた処理により、還元、特に水素化分解又は化学 的還元によって実行し得るし、任意に段階的に又は同時に酵素法も用い得る。

したがって、ｔｅｒｔ、−低級アルコキシカルボニル又は有機シリル基により２ −位置で、あるいは低級アルコキシ又は低級アルキルチオにより１−位置で置換 された低級アルコキシカルボニル、あるいは非置換又は置換ジフェニルメトキシ カルボニルをアシトリーシスにより、例えばハロゲンを含有し得る低級アルカン カルボン酸のような好適な酸、例えばギ酸又はトリフルオロ酢酸を用いた処理に よって請求核性化合物（例えばフェノール又はアニソール）の付加を用いて又は 用いずに、遊離カルボキシに変換し得る。非置換又は置換ベンジルオキシカルボ ニルは、例えば水素化分解により、即ち金属水素化触媒（例えばパラジウム触媒 ）の存在下での水素を用いた処理により遊離し得る。さらに、好適置換ベンジル オキシカルボニル（例えば４−ニトロベンジルオキシカルボニル）は、化学的還 元により、例えばアルカリ金属ジチオナイト、例えばナトリウムジチオナイトを 用いた、あるいは還元金属（例えば亜鉛）、又は還元金属塩（例えばクロミウム （ＩＩ）塩）を用いた処理により、通常は金属と一緒に、発生期水素、例えば酸 、特に好適なカルボン酸（例えば置換されないか又は例えばヒドロキシにより置 換される低級アルカンカルボン酸）、例えば酢酸、ギ酸、グリコール酸、ジフェ ニルグリコール酸、乳酸、マンデル酸、４−クロロマンデル酸又は酒石酸、ある いはアルコール又はチオールを、水を好ましくは加えて生成し得る水素供給体の 存在下て遊離し得る。２．２−ジアリールエトキン力ルポニル又は２−（９−フ ルオレニル）−エトキシカルボニル基は、穏やかな塩基性条件下で、例えばピペ リジンを用いた処理により、切断し得る。上記のように還元金属又は金属塩を用 いた処理により、２−ハロ低級アルコキシカルボニル（任意に２−ブロモ低級ア ルコキシカルボニル基を対応する２−ヨード低級アルコキシカルボニル基に変換 後に）又はアロイルメトキシカルボニル基を遊離カルボニルに変換し得るし、さ らに核性の、好ましくは塩生成性の試薬、例えばナトリウムトリフエルレート又 はナトリウムヨウ化物で処理することによりアロイルメトキシカルボニルを切断 し得る。

大環式ポリエーテル（“クラウンエーテノピ）の存在下でフッ素陰イオン、例え ばアルカリ金属フッ化物、例えばナトリウム又はカリウムのフッ化物を生成する フッ化水素酸の塩を用いて、あるいは非プロトン性極性溶媒、例えばジメヂルス ルホキシド又はＮ、　Ｎ−ジメチルアセトアミドの存在下てフッ化物又は有機第 四塩基、例えばテトラ低級アルキルアンモニウムフッ化物又はテトラブチルアン モニウムフッ化物を用いて処理することにより、置換２−シリルエトキシカルボ ニルも遊離カルボニルに変換し得る。

保護化アミノ基は、それ自体公知の方法で、保護基の性質に依って、種々の方法 で、しかし好ましくは加溶媒分解又は還元により遊離する。２−ハロ低級アルコ キシカルボニルアミノ（任意に２−ブロモ低級アルコキシカルボニルアミノ基の ２−ヨード低級アルコキシカルボニルアミノ基への変換後に）、アロイルメトキ シカルボニルアミノ又は４−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノは、例えば 好適な化学的還元剤（例えば亜鉛）を用いて好適なカルボン酸（例えば水性酢酸 ）の存在下で処理することにより切断し得る。アロイルメトキシカルボニルアミ ノは請求核性、好ましくは塩生成性試薬（例えばナトリウムチオフェルレート） で処理することによっても切断し得るし、４−二トロベンジルオキシカルポニル もアリカリ金属ジチオナイト（例えばナトリウムジチオナイト）で処理しても切 断し得る。非置換又は置換ジフェニルメトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ、− 低級アルコキシカルボニルアミノ又は２−三置換シリルエトキシカルボニルアミ ノは、好適な酸、例えば置換されないか又は例えばハロゲン（例えばフッ素）に より置換される低級アルカンカルボン酸、例えばギ酸又はトリフルオロ酢酸で処 理することにより切断し得るし、２．２−ジアリールエトキシカルボニルアミノ 、例えば２．２−ジー（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニルアミノ、２ −（４−メチルスルホニルフェニルスルホニル）−エトキシカルボニルそして９ −フルオレニル−メトキシカルボニルアミノも好適な塩基例えば脂肪族アミン、 好ましくは第二アミン、例えばピペリジンで処理することにより切断し得る。ア ミノ基は、例えば水素化分解により、即ち好適な水素化触媒（例えばパラジウム 触媒）の存在下で水素で処理することにより非置換又は置換ベンジルオキシカル ボニルアミノから、例えば酸、例えば鉱酸、例えば塩酸で、あるいは有機酸、例 えばギ酸又はトリフルオロ酢酸で処理することにより水の非存在下で非置換又は 置換トリアリールメチルアミノ又はホルミルアミノから、並びに加水分解又はア ルコリーシスにより有機シリルアミノ基から遊離し得る。２−ハロアセチル、例 えば２−クロロアセチルにより保護されるアミノ基は、例えばチオ尿素を用いて 塩基の存在下で、又はチオ尿素のチオレート塩（例えばアルカリ金属チオレート ）を用いて処理することにより、そしてその結果生じた縮合生成物のその後の加 溶媒分解（例えばアルコリーシル又は水素化分解）により遊離し得る。２−置換 シリルエトキシカルボニルにより保護されるアミノ基は、対応的保護化カルボキ シ基の遊離に関して上記したようにフッ化物陰イオンを生じるフッ化水素酸の塩 で処理することにより遊離アミノ基に変換し得る。

アジド基の形態で保護されるアミノは、例えば還元により、例えば水素化触媒（ 例えば酸化プラチナ、パラジウム又はラネーニッケル）の存在下で水素を用いた 触媒的水素化により、あるいは酸（例えば酢酸）の存在下で亜鉛を用いた処理に より遊離アミノに変換し得る。触媒的水素化は、好ましくは不活性溶媒（例えば ハロゲン化炭化水素、例えば塩化メチレン）中で、あるいは水中又は水と有機溶 媒（例えばアルコール又はジオキサン）の混合物中で、約２０″Ｃ〜２５°Ｃで 、あるいは冷却又は加熱しながら実施する。

好適なアシル基、有機シリル基によりあるいは非置換又は置換ｌ−フェニルー低 級アルキルにより保護化されるヒドロキシ基は、対応的保護化アミノ基と同様に 遊離し得る。２．２−ジクロロアセチルに保護されるヒドロキシ基は、例えば塩 基性加水分解によって、モしてｔｅｒｔ、−低級アルキル（例えばｔｅｒｔ、− ブチル）により、あるいは２−オキサ−又は２−チア−脂肪族又は脂環式炭化水 素遊離基によりエステル化されるヒドロキシ基は、アンドリーシスにより、例え ば鉱酸又は強カルボン酸（例えばトリフルオロ酢酸）で処理することにより遊離 し得る。

９−キサンテニルで保護されるカルボン酸アミド基は、例えば氷酢酸に溶解した 臭化水素を用いて、又はアニソールの存在下でフッ化水素を用いて処理すること により遊離し得る。モノ−、ジー又はトリーアリールメチルにより保護されるカ ルボン酸アミド基は、例えばアニソールの存在下でフッ化水素を用いて処理する ことにより遊離し得る；さらにジフェニルメチル保護基は、例えばパラジウム− オン−カーボン触媒の存在下で水素化分解により除去し得るし、ジー（４−メト キシフェニル）−メチル保護基又は２．　４．　６−トリメトキシベンジル保護 基は、例えばトリフルオロ酢酸で処理することにより除去し得る。

有機スルホニル基により保護されるグアニジノ基、例えば４−メチルフェニルス ルホニル−グアニジノ又は２．　２．　５．　７．　８−ペンタメチル−６−ク ロマニルスルホニルグアニジノは、例えば好適な酸（例えばトリフルオロ酢酸） で処理して遊離し得る。ニトロで保護されるグアニジノ基は、例えばパラジウム −オン−カー４．ボン触媒の存在下で水素化分解により遊離し得る。

保護化官能基、特に保護基が上記のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド合成に於いて 同時にキャリアー物質として作用する対応するカルボキシ基は、例えば上記のよ うなそれ自体公知の方法で切断し得る。好適な架橋員を介して高分子キャリアー 物質と結合する対応的エステル化カルボキシ基は、架橋員の性質に従って切断し 得る。例えば、活性化ベンジル架橋員を有するエステル基を介して高分子キャリ アー物質と結合するカルボキシ基、例えばメトキシ基の炭素原子が例えばジビニ ルベンゼンで弱く架橋されるポリスチレン樹脂のフェニル遊離基と結合する４− メトキシベンジルオキシカルボニル基は、例えば好適な酸（例えばトリフルオロ 酢酸）を用いた処理により、上記の非置換又は置換ベンジルオキシカルボニル基 と同様に遊離し得る。

いくつかの保護官能基が存在する場合には、所望により、例えばアシトリーシス によって、例えばトリフルオロ酢酸又はギ酸を用いた処理により、あるいは還元 によって、例えば亜鉛及び酢酸を用いて、又は水素及び水素化触媒（例えばパラ ジウム−オン−カーボン）を用いて処理することにより、これらのうぢの１つ以 上の保護基を同時に除去し得るように保護基を選択し得る。

ヒルジンのカルボキシ末端は、それ自体公知の方法で製造する。

所望の断片を、例えばペプチド合成機で合成して、宿主中で直接発現するか、又 は発現前駆体蛋白質あるいは酵素又は化学薬剤を伴う融合蛋白質から切断し得る 。

普通は、２０個未満のアミノ酸を有する異種蛋白質は大腸菌のような天然宿主か らは十分量で発現及び単離されない。ヒルジンのカルボキシ末端断片のような小 蛋白質の発現のために考え得る方法としては、問題の小蛋白質をフレーム内で別 の蛋白質と融合させて、融合蛋白質を作ることである。その融合パートナ−から 所望の蛋白質を遊離させるために、いくつかの方法か開発されてきた（Ｎｉｓｈ ｉｋａｗａｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１．４ ８７−４９２　（１９８７）　；　Ｇａｒｄｅｌｌａ　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５．１５８５４−１５８５９　（１９９０）　；　Ａｌ ｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　４，５９３−６００　（１９９１） ）　ａ考え得る宿主は、酵母菌のような真菌類又は大腸菌のような細菌である。

好適な内生的融合パートナ−は、高度発現蛋白質である。好ましいのはニグリン 、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、大腸菌におけるトリプトファン合 成に関与するいくつかの蛋白質、プロティンＡ又はクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼのような蛋白質である。

ヒルジンの所望のカルボキシ末端断片は、融合蛋白質の発現及び精製後に融合パ ートナ−から除去されねばならない。所望の断片と融合パートナ−との間に天然 切断部位かない場合、これは一般的に所望の断片を融合パートナ−と結合し、化 学的又は酵素的手段によって選択的に切断される切断部位を含有するリンカ−配 列によりなされる。このような切断部位としては、例えば臭化ジシアンの作用を 受けやすいメチオニル遊離基、Ｌｙｓ後のエンテロキナーゼにより切断されるテ トラペプチジル遊離基Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓを含めたポリペプチド鎖 、あるいはＶ８プロテアーゼ、トリプシン、ペプチダーゼｙｓｃα又はｙｓｃ　 Ｆのような酵素による特異的切断を受けやすいあらゆる他の切断■か挙げられる 。

融合蛋白質は、それ自体公知の方法で、融合蛋白質の発現及び単離を可能にする 条件下で形質転換宿主を培養することから成る組換え体ＤＮＡ技術により調製し 得る。さらに所望の化合物は、以下の工程により製造する： ・強プロモーターの制御下で上記融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含有する 発現カセットを包含する発現ベクターを提供し、・発現ベクターを感受性宿主中 に移し、・融合蛋白質の発現を可能にする条件下で形質転換宿主を培養し、そし て ・融合蛋白質を単離する。

発現ベクターは、例えば正常組換え体ＤＮＡ技術により調製し得る。

ヒルジン断片（Ｈ）とＸｌｌｌ式： （式中、残基Ｒ３〜Ｒ６及びｎは上記と同じ意味を存する）の遊離基との間のペ プチドリンカ−（Ｌ）か遺伝的にコードされるアミノ酸のみを含有する場合、発 現ベクターは完全ペプチドリンカー−ヒルジン断片（−Ｌ−Ｈ）をコードするＤ ＮＡを包含し得る。単離ペプチドリンカー−ヒルジン断片のＮ末端は、Ｘｌｌｌ 式の遊離基に直接結合し得る。ペプチドリンカ−か非遺伝的コード化アミノ酸（ 例えば４−アミノ−酪酸及び６−アミノカプロン酸）を含有する場合は、単離ヒ ルジン断片はこれらの非遺伝的コード化アミノ酸に、そしてその後Ｘ１ｌ１式の 遊離基に作用しなければならないし、あるいは非遺伝的コード化アミノ酸はＸｌ ｌｌ式の遊離基に作用し、次いで単離ヒルジン断片に作用しなければならない。

１式の化合物の塩は、それ自体公知の方法で製造し得る。例えば、塩基性基より 多くの酸性基を含有する１式の化合物の塩は、例えば金属化合物（例えば好適ｔ よ有機カルボン酸のアルカリ金属塩、例えばエチルカプロン酸のナトリウム塩） を用いて、あるいは無機アルカリ金属又はアルカリ土類金属塩（例えば重炭酸ナ トリウム）を用いて、あるいはアンモニア又は好適な有機アミンを用いて処理す ることにより生成し得るが、好ましくは化学量論的量の又は少し超えるだけの量 の基土成剤を用いる。１式の化合物の酸付加塩は、通例の方法で、例えば酸又は 好適な陰イオン交換試薬を用いた処理により得られる。遊離酸性基及び遊離塩基 性基を含有する１式の化合物の内部塩は、例えば塩（例えば酸付加塩）を、例え ば弱塩基を用いて等電点に中和することにより、又は液体イオン交換剤を用いた 処理により生成し得る。

塩は、通例の方法で遊離化合物に変換し得る。金属及びアンモニウム塩は、例え ば好適な酸を用いた処理（ごまり、そして酸（＝１加塩は例えば好適な塩基性剤 を用いた処理により遊離化合物に変換し得る。

ＭＰＩｓ化合物は、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィーによっても得 られる。

１式の化合物の調製のために用いる出発化合物は公知であるか、又は当業界（： 公知の方法で調製し得る。

本発明の化合物は、）・ロンビン介在性及びトロンビン関連性機能及び工程に起 因する種々の疾患の治療及び予防のための組成物、組合せ及び方法に有用である 。これらの例としては、心筋梗塞、卒中、肺塞栓症、深在静脈血栓症、汎発性血 管向凝固症候群、末梢動脈閉塞、動脈損傷又は侵襲性心臓学的処置後の再狭窄、 急性又は慢性アテローム性動脈硬化症、水腫及び炎症、種々の細胞の調節工程（ 例えば分泌、形状変化、増殖）、癌及び転移、並びに神経変性疾患が挙げられる 。

本発明のトロンビン阻害剤は、例えば製薬上許容可能なキャリアー又は希釈剤と 混合することにより製薬上有用な組成物中に処方し得る。これらの組成物は、患 者の血栓症を治療又は予防するのに用い得る。

本発明の別の態様によれば、トロンビン阻害剤は、血栓症の治療のために、ある いは患者における再還流を確立するのに又は再閉塞を防止するのに必要な血栓崩 壊剤の用量を低減するために組成物中に用い得る。さらに、本発明のトロンビン 阻害剤は、血栓崩壊剤を用いて治療される患者の再還流時間を低減し又は再閉塞 時間を増大するために組成物中に用い得る。これらの組成物は、製薬上有効量の 本発明のトロンビン阻害剤及び製薬」二有効量の血栓崩壊剤、例えばプラスミノ ゲン活性剤を含有する。

これらの組成物中では、トロンビン阻害剤及び血栓崩壊剤は血餅を溶解するため に相補的に作用し、その結果それらで処置した患者の再還流時間を低減し、再閉 塞時間を増大する。血栓崩壊剤は血餅を溶解し７、一方トロンビン阻害剤は新規 に露呈された、血餅に閉じ込められた、又は血餅と結合したトロンビンが血餅を 再生しないようにする。本発明の組成物中のトロンビン阻害剤の使用は、有益に は、単独で投与された場合は余りにも低過ぎて血栓崩壊作用を引き起こぜないと 以前は考えられていた用量での血栓崩壊剤の投与を可能にする。これにより血栓 溶解剤の使用に伴う例えば出血性合併症のような望ましくない副作用のいくつか が避けられる。

本発明の組合せ及び組成物中に用い得る血栓崩壊剤は、当業界で公知のものであ る。このような薬剤としては、天然供給源から精製される組織プラスミノゲン活 性剤、組換え体組織プラスミノゲン活性剤、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ 、プロウロキナーゼ、アニソール化ストレプトキナーゼブラスミノゲン活性剤複 合体（ＡＳＰＡＣ）、動物唾液腺プラスミノゲン活性剤、及び公知の生物学的に 活性な」−記のあらゆるものの誘導体か挙げられる。トロンビン阻害剤及び血栓 崩壊剤は、同一投与形態であっても、あるいは別々に、しかし同時的に又は順次 投与される分離投与形態てあってもよい。順次投与においては、血栓崩壊剤投与 の５時間前〜５時間後の時点で患者にトロンビン阻害剤を投与する。好ましくは 、トロンビン阻害剤は血栓崩壊剤投与の２時間面〜２時間後の時点で患者に投与 する。

本発明の組成物は、種々の方法で、例えば非経口的に又は局所的に患者に投与し 得る。組成物は、投与の所望の方法に適したアジュバント及び希釈剤を用いて処 方する。したがって組成物はポーラスとして又は連続注入により静脈内に、筋肉 内に−を椎傍及び関節周囲を含む−、皮下に、皮肉に、関節腔内に、関節滑液嚢 内に、箱内に、病巣内に、骨膜に、あるいは鼻腔又は局所経路により投与し得る 。

非経口組成物は、好ましくはポーラス形態で又は定量注入として静脈内に投与す る。トロンビン阻害剤が抗血小板化合物として用いられている場合は、定量注入 が好ましい。トロンビン阻害剤が抗凝固薬どして用いられている場合には、皮下 又は静脈内ポーラス注射が好ましい。非経口投与のためには、トロンビン阻害剤 を任意に他の成分と一緒に滅菌ビヒクルに懸濁又は溶解し、滅菌した後、好適な バイアル又はアンプルに充填して、密封する。好ましくは、アジュバント（例え ば麻酔薬、防腐剤、安定剤、溶液促進剤）及び／又は緩衝剤をビヒクルに溶解す る。懸濁液の場合、界面活性剤又は湿潤剤、及び／又は上記のような池のアジュ バントを、その成分が均一に分布するのを促すために組成物中に含入し得る。

局所投与のために処方される組成物は、例えば水性ゼリー、油懸濁液又は乳化軟 膏形態であってもよい。

上記の組成物は、それぞれ慣用的混合又は親液法により調製され、約０．１〜７ ５％、親液性状態の場合は１００％の活性成分を含有する。

投与される活性化合物の用量は、温血動物（哺乳類）の種、体重、年齢及び個々 の症状、並びに投与形態に依っている。

本発明のトロンビン阻害剤の好ましい製薬上有効用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ　 （治療される患者の体重当たり）〜５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜０．５　 ｍｇ／　ｋｇである。

血栓崩壊剤も用いる場合、血栓崩壊剤の製薬上有効用量は１０％〜８０％の慣用 的用量範囲、即ちその薬剤を単一療法に使用する場合に用いられる用量である。

本発明のトロンビン阻害剤は、侵襲性用具の表面をコーティングするための組成 物中及び方法に用いてもよく、その結果このような用具を受容する患者の血餅形 成又は血小板活性化の危険性が低く成る。本発明の組成物でコーティングされ得 る表面としては、例えば人工装具、人工弁、血管移植片、ステント及びカテーテ ルが含まれる。これらの用具をコーティングする方法は、当業者には公知である 。これらの例としては、用具の表面へのトロンビン阻害剤含有組成物の化学的架 橋又は物理的吸着が挙げられる。

本発明のトロンビン阻害剤を含有する組成物は、転移増殖の阻止によって示され るように、腫瘍転移の治療にも用い得る。本発明のトロンビン阻害剤により治療 し得る転移性腫瘍の例としては、脳の癌、肺の癌、骨癌及び腫瘍性形質細胞癌が 挙げられる。

本発明のトロンビン阻害剤を含有する組成物は、内皮細胞による血小板活性化因 子（ＰＡＦ）合成の抑圧を含めたトロンビン誘発性内皮細胞の活性化を阻止する ために用いてもよい。組成物は、トロンビン誘発性炎症及び水腫を特徴とする疾 患の治療に重要な用途を有し、これにはＰＡＦが介在すると考えられる。このよ うな疾患としては、成人性呼吸窮迫症候群、敗血症性ショック、敗血症、敗血症 の治療又は予防のための再還流損傷、並びに他の疾患が挙げられる。

本発明のトロンビン阻害剤又はそれらを含有する組成物は、例えば透析処置、血 液濾過、又は手術中の血液バイパスのような工程における体外血液のための抗凝 固剤として、並びに患者への偶発的投与のために体外に保存される血液製品中に 、そして種々の検定のために用いられる患者から採集した血液中に用いてもよい 。このような製品としては、全血、血漿又は凝固の防止が望ましいあらゆる血液 分画が挙げられる。

これらの種類の組成物中のトロンビン阻害剤の量又は濃度は、治療される血液の 用量を、さらに好ましくはそのトロンビン含量を基礎にしており、Ｏ，０１ｍｇ ／体外血液６０ｍ１〜５ｍｇ／体外血液６０ｍ１である。

本発明のトロンビン阻害剤は血餅結合トロンビンを阻害するのに用い得るが、こ れは血餅付着成長に関与し、トロンビン伸展を阻止すると考えられる。普通に用 いられる抗トロンビン剤（例えばヘパリン及び低分子ヘパリン）か血餅結合トロ ンビンに対して有効でないため、これは特に重要である。

図面の簡単な説明 下記の実験部分において、本発明の態様を添付の図面に関して説明する： 図１は、ｐＰＬ、　Ｍｕ、ニグリンの構築の模式的説明である。

以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はそれらに限定されない。

実験部分 略号： Ａｃａ＝６−アミノへキサン酸（アミノカプロン酸）Ａｐａ＝５−アミノペンタ ン酸 Ｇａｂ＝４−アミノ酪酸 Ａｐｒ＝３−アミノプロピオン酸 Ａｕｄ　＝１１−アミノ−ウンデカン酸ＤＩＣＤ＝ジイソプロピルカルボジイミ ドＤＭＡ　＝ジメチルアセトアミド ＴＥＡ＝トリフルオロ酢酸 ＴＦＥ　＝　ｌ−リフルオロエタノールＤＣＥ＝１，２−ジクロロエタン ＤＩＰＥ−ジイソプロピルエーテル ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミンＨＯＢｔ＝　１−ヒドロキシベンゾトリ アゾールＰｍｃ　＝２．　２．　５．　７．　８−ペンタメチルクロ７：／−６ −スルホニル− ＴＢＴＵ＝２−（ＬＨ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１゜３．３−テ トラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（Ｒ，Ｋｎｏｒｒｅｔ　ａｌ、、 　（１９８９）　ＴＩ（Ｌ　３０．１９２７−１９３０）ＤＭＦ　＝ジメチルホ ルムアミド ＴＨＦ　＝テトラヒドロフラン ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド ＡＣＮ−アセトニトリル ＮＭＰ二Ｎ−メチルピロリドン ＰＥ　＝石油エーテル ＴＥＡＢ緩衝液＝１ｍ　）リエチルアンモニウム重炭酸塩ＭＡＬＤ　Ｉ−ＭＳ− 質量補助レーザー脱着イオン化質量分析法以下の実施例においては、別記しない 限り、“ヒルジン”という用語は脱硫酸ヒルジン変異体ＨＶＩを示す。

実施例 実施例１：塩酸Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル− （Ｓ）−アルギニルクロリドａ）オルトアニリン酸（１ｋｇ）及びα−メチルス チレン（６８３ｇ）を水中で攪拌しながら混合し、８時間還流加熱した。αメチ ルスチレンのさらなる部分（２Ｘ１４８ｇ）を３０分間に亘って加えて、６時間 還流した。混合物を８５°Ｃで濾過し、回収した固体生成物を沸騰水で、次いて エタノールで洗浄して、真空オーブン中で乾燥した。生成物をエーテル（１５０ ｍｌ）とともに攪拌し、濾しとって乾燥した。５０％水性エタノールから再結晶 化して１−アミノ−４−（α、α−ジメチルベンジル）−ベンゼン−２−スルホ ン酸（融点２６３〜２６５℃）を得た。

ｂ＞　ｉ−アミノ−４−（α、α−ジメチルベンジル）−ベンゼン−２−スルホ ン酸（５８２，７ｇ　）を２０１！反応容器中の水（４１）に懸濁し、濃塩酸を 加え（４００ｍｌ）　、混合物を攪拌し、６５°Ｃに２０分間加熱した。懸濁液 を２０°Ｃに冷却し、濃塩酸（４００ｍｌ）を加えた後、水（４００ｍｌ）に溶 解したＮａＮ０　ｔ　（１３８ｇ　）の溶液を滴下し、温度を２５°Ｃ以下に保 持した。その結果生じた混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。５０％次亜リ ン酸（１，７ｋｇ）を３０分間に亘って滴下し、混合物を室温で１時間攪拌した 。次に混合物を温度か６０°Ｃに達するまで徐々に暖めて、発泡をおさめて暗褐 色溶液を生じ、これを−夜冷部させて、次に濾過して少量の固体を除去した。濾 液を蒸発させて４１の容量にし、水酸化ナトリウムペレット（９ｓｏｇ）を漸ケ 添加して中和してｐＨ１０〜１１とし、水（：Ｍ）を加えて溶液を７０°Ｃに暖 めた。ＮａＣ１（８００ｇ　）を加え、生成物を結晶化させた。濾過して固体を 収集し、飽和ブラインで洗浄して、乾燥させた。１５％ｗ／ｖ　ＮａＣ１（水性 ）から再結晶化後、固体を氷水とともに攪拌して塩を除去し、濾過し、乾燥して 、アセトン中で攪拌し、濾しとって乾燥して、３−（α、α−ジメチルベンジル ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム塩を洗浄液から回収した。

ｃ）３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（９， ６ｇ　）をＤＭＦ（１６ｍｌ）に溶解し、１０℃に冷却した。温度を２０°Ｃ以 下に保ちながら塩化チオニル（１２ｍｌ）を滴下した。混合物を室温に暖めて、 １時間攪拌した。溶液を氷／水（１００ｍｌ）に注ぎ入れ、混合物をエーテル（ ３部８ｍｌ）で抽出した。併合抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）Ｌ、溶媒を蒸発させ て淡黄色蝋質結晶を生じ、これをヘキサン（２００ｍｌ）に溶解して、脱色した （木炭）。蒸発させて３−（α。

α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリドの白色結晶を生成し、これ を真空下で室温で乾燥させた。融点４７．５〜４９°Ｃ０ｄ）（Ｓ）−アルギニ ン（１２，６ｇ）及びＫＩＣＯ□（１２，０３ｇ）を激しく攪拌しながら５０％ 水／ジオキサン（２５０ｍｌ）に懸濁し、反応混合物をく５°Ｃに冷却した。３ −（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリド（２１，４ｇ）を ６部に分けてく５℃で３０分に亘って加えた。混合物を２０°Ｃで２時間攪拌し た。無色固体が沈殿した。

蒸発させてジオキサンを除去し、水性残渣を濃塩酸で酸性にした。

混合物を酢酸エチル（３ｘ　５０ｍ１）で抽出し、水性相及び全固体物質を併合 して、中和（４Ｍ　Ｎａ０ｔ（）　シた。懸濁液を２０℃で１６時間攪拌した。

固体沈殿物を濾過して収集し、少量の水とともに１６時間攪拌した。濾過して固 体を収集し、乾燥（ＮａＯＨベレット）して、Ｎａ−（３−（α、α−ジメチル ベンジル）ベンゼンスルホニル’）−（Ｓ）−アルギニンを得た。融点１２２〜 １２４°Ｃ０（実測値：　Ｃ，５３，４９；Ｈ，６，８１；　Ｎ、１１．９２　 ；　Ｓ、　６．９３．　Ｃ，ＩＨ，ｓＮ、０４ｓ、２．３Ｈ２０はＣ２５３，２ ２、Ｈ，６，９３；　Ｎ、　１１．８２　、　Ｓ、　６．７７％を要する）。

ｅ）Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ） −アルギニン（９３６ｍｇ）を５ＯＣ１２（５ｍｌ）とともに２０°Ｃで２時間 攪拌した。ドライエーテル（４０ｍｌ）を激しく攪拌しながら加えた。上清液を 生成した白色ガムから注ぎ出し、これをドライエーテル（２Ｘ　４０ｍ１）で滴 定した。ガムを真空中（ＮａＯＨベレット）に２０分分間−て、Ｎａ−（３−（ α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニルクロリ ドのばりばりした白色発泡体を得た。

実施例２：塩酸１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスル ホニル’）−（Ｓ）−アルギニル’）−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジ ン ａ）ｔ−ブトキシカルボニル−Ａｒｇ　（ＮＯ２）　−ＯＨ（１１，７ｇ）をＤ ＭＦ（６０ｍｌ）に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（４，０４ｍ１）を加えた。

混合物を一１０’Ｃに冷却し、イソブチルクロロホルメート（４，８ｍ１）を加 えた。混合物を一１０°Ｃで１０分間攪拌して、ＤＭＦ（６０ｎ＋１）に溶解し た４−（２−カルボキシエチル）ピペリジンメチルエステル酢酸塩（８，５ｇ） 及びＮ−メチルモルホリン（４，０４ｍ１）の溶液を一１０°Ｃて加えた。

反応混合物を一１Ｏ°Ｃて１０分攪拌し、次いで３０分に亘って室温にした。

蒸発させて溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）に溶解し、７％水性 クエン酸、ブライン、飽和水性ＮａＨＣＯｓ　（２回）及びブラインの５０ｍ１ 部分で２回洗浄し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）　して、溶媒を蒸発させてクロマトグ ラフィーで精製して、１−　（Ｓ）−Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎω −ニトロアルギニル−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジンメチルエステル をガムとして得た。

ｂ）１−　（Ｓ）−Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎω−ニトロアルギニ ル−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジンメチルエステル（ｌｏｇ）を酢酸 エチル（２１ｍｌ）に溶解し、酢酸エチルに溶解したＨＣｌの溶液（２Ｎ、　６ ３．５ｍ１）を加えた。混合物を室温で２時間攪拌し、溶媒を蒸発させてガムを 生成し、酢酸エチルの１００ｍ１部分を繰り返し加え、溶媒を蒸発させて、余分 なＨＣｌを除去した。最後にクロマトグラフィー処理で精製したガムをＮａ１ｌ （ベレット上で真空下に置き、塩酸１−（Ｓ）　−Ｎω−ニトロアルギニル−４ −（２−カルボキシエチル）ピペリジンメチルエステルを得た。

Ｃ）塩酸１−　（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル−４−（２−カルボキシエチル ）ピペリジンメチルエステル（１，９７ｇ）をジクロロメタン（１２ｍｌ）に懸 濁し、Ｎ−メチルモルホリン（１，１６ｍ１）を加えた。

溶液を０°Ｃに冷却し、３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル クロリド（１，４ｇ）を０°Ｃで３０分に亘って一部ずつ加えた。

さらに３０分攪拌後、ジクロロメタン（１２ｍｌ）を加え、溶液をブライン（２ Ｘ　２５ｍ１）で洗浄し、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）　シて、蒸発させて溶媒を除去 した。生成物１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホ ニル−（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピペ リジンメチルエステルを、溶離剤としてＣＨＣｌ、　／ＣＨｓＯＨ（容量で９５ ：５）を用いてシリカゲルのカラム（１５０ｇ）上でのフラッシュクロマトグラ フィーにより単離した。

ｄ）１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（ Ｓ）　−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジン メチルエステル（１，７ｇ）をメタノール（６０ｍｌ）と酢酸（６ｍｌ）の混合 物に溶解し、ｌＯ％Ｐｄ／　Ｃ（０，５ｇ　）の存在下で室温で１６時間水素化 （１気圧）した。濾過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させて除去した。残渣をメ タノールから結晶化して精製１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル） ベンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピ ペリジンメチルエステル酢酸塩を得た（融点１８８〜１９０°Ｃ）。さらに溶離 剤としてＣｌＩＣ１，／ＣＨ，ＯＨ／ＣＨ，Ｃ００Ｈ（容量で６　：　ｌ　：　 １）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製物質を単離した。

ｅ）！−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（ Ｓ）−アルギニル）　−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジンメチルエステ ル（１，０７ｇ）をメタノール（１０ｍ１）及びジオキサン（１０ｍｌ）に溶解 し、水性Ｉ　Ｎ　Ｎａ０Ｈ（６，８ｍ１）と−緒に室温で３時間攪拌した。ｌ　 Ｎ　Ｈ，５Ｏ４（６，８ｍ１）を加えて、溶媒を回転蒸発により除去し、残渣か ら敷部のエタノールを蒸発させて残渣を乾燥した。熱エタノールを用いて生成物 を固体残渣から抽出し、乾燥して生成物を生じた。これを水（５ｍｌ）に溶解し 、Ｉ　Ｎ　ＨＣＩ（０，７７ｍ１）を加えた。固体塩酸塩を濾過により収集し、 水で洗浄して乾燥し、塩酸１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベ ンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）　−４−（２−カルボキシエチル）ピ ペリジンを得た（融点２１５°Ｃ）。（実測値：　Ｃ，５７，３；　Ｈ，６，８ ；Ｎ、　１１．３；　Ｓ、　５．５　：Ｃ１，５，５，Ｃｚ＊Ｈ４１ＮａＯ−Ｓ −ＨＣｌはＣ，５７，３、Ｈ。

７．０　、　Ｎ、　１１．５；　ｓ、　５．３　；　Ｃ１，５，８％を要する） 。

実施例３．塩酸１−　（Ｓ）　−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（６−カルボ キシヘキシル）ピペリジンエチルエステルａ）塩化チオニル（１，０３ｍ１）を 塩酸４−ピリジンヘキサノール（２，４２ｇ）に加え、混合物を２０°Ｃで３０ 分攪拌した。余分量の飽和水性ＮａＨＣＯｓ及びＣＨＣＩｘ（２０ｍｌ）を加え た。有機相を飽和ＮａＨＣＯ，、ブライン及び水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４） 、溶媒を蒸発させて粗製物質を生成し、これをシリカゲル上でのフラッシュクロ マトグラフ４−（ＣＨ３０）１　：　Ｃ）ＩＣ１，＝容量で１：４９）により精 製して、４−（６−クロロヘキシル）ピリジンを油として得た。

ｂ）　ＤＭＳＯ（４，２５ｍ１）に溶解したＮａＣＮ（５０９ｍｇ）をＤＭＳＯ （４，２５ｍ１）に溶解した４−（６−クロロヘキシル）ピリジン（１，７１ｇ 　）に加えた。

混合物を６０°Ｃで３時間攪拌し、水（１００ｍｌ）中に注ぎ入れて、クロロホ ルム（３Ｘ　１５ｍ１）で抽出した。併合抽出物を水（２Ｘ　２０ｍ１）で洗浄 し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）　して、溶媒を蒸発させて４−（６−ジアツヘキシル ）ピリジンを得た。

ｃ）４−　（６−ジアツヘキシル）ピリジン（１，４５ｇ）をエタノール（３， ６ｍ１）及びａｌｌ（ＣＩ水溶液（３，６ｍ１）の混合物と一緒に６０〜７０° Ｃで７２時間攪拌した。冷却反応混合物を水（２０ｍｌ）及びクロロホルム（２ ０ｍｌ）間に分配し、分離有機相を乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）　Ｌ、て蒸発させ、塩 酸４−（６−カルボキシヘキシル）ピリジンエチルエステルを得た。

ｄ）塩酸４−（６−カルボキシヘキシル）ピリジンエチルエステル（１，１７ｇ ）をＣ１，０Ｉ（２２，５ｍ１）及び酢酸（２，５ｍ１）に溶解し、Ａｄａｍ触 媒（１００ｍｇ）の存在下で２０°Ｃで１６時間水素化（１気圧Ｈ１）シた。濾 過して触媒を除去し、溶媒を蒸発させて塩酸４−（６−カルボキシヘキシル）ピ ペリジンエチルエステルを生成し、これを真空下に保持した（ＮａＯＨベレット ）。

ｅ）ｔ−ブトキシカルボニル−Ａｒｇ　（ＮＯＪ　−ＯＨ（３１，９ｇ）をＤＭ Ｆ（４６５ｍｌ）に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）　（３１，９ｍ１ ）を加えた。混合物を−１５”Ｃに冷却し、イソブチルクロロホルメート（Ｂｕ ＯＣＯＣｌ）　（３８ｍｌ）を加えた。反応液を一１５°Ｃで１５分攪拌した。

塩酸４−（６−カルボキシヘキシル）ピペリジンエチルエステル（９７，４ｇ） をＮＭＭ（３１，９ｍｌ　）とともにＤＭＦ　（４６５ｍｌ）に溶解し、溶液を 一１５°Ｃに冷却した。２つの溶液を一１０°Ｃ以下で攪拌しながら併合し、攪 拌を−ｌＯ°Ｃで３０分、次いで２０°Ｃで２時間継続した。蒸発させて溶媒を 除去し、残渣を酢酸エチル（３００ｍｌ）に溶解し、これを飽和水性ＮａＨＣＯ ，（２Ｘ　２５０ｍ１）　、ブライン、７％水性クエン酸及びブラインで洗浄し 、乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）　シて、溶媒を蒸発させ、溶媒として酢酸エチルを用い てシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィー処理１１−　（Ｓ）−Ｎα−ｔ −ブトキシカルボニル−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（６−カルボキシヘキ シル）ピペリジンエチルエステルを得た。

ｆ）１−　（Ｓ）−Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎω−ニトロアルギニル） −４−（６−カルボキシヘキシル）ピペリジンエチルエステル（１５６ｇ）を飽 和ＨＣＩ／ＣＨ＊Ｃ０ＯＨ（６２５ｍｌ）に溶解し、反応混合物を２０°Ｃで２ ．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させて、クロマトグラフィーにより精製して得た 塩酸１−　（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（６−カルボキシヘキシル ）ピペリジンエチルエステル残渣を次の工程に直接用いるために真空中（ＮａＯ Ｈベレット）に保持した。

実施例４：塩酸１−　（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（４−カルボキ シブチル）ピペリジンエチルエステル実施例３と同様の方法で、しかし塩酸６− ピリジンヘキサノールの代わりに塩酸４−ピリジンブタノールから出発して、表 題化合物を調製した。

実施例５．塩酸１−（３−カルボキシプロピル）ピペラジンエチルエステル ａ）１−ベンジルピペラジン（３，７ｇ）、エチル４−ブロモブチレート（３， ９ｇ　）及びトリエチルアミン（２，９３ｍ１）を２０°Ｃで１６時間攪拌した 。反応混合物を水（２００ｍｌ）とＣＩＣＩ’ｓ　（２００ｍｌ　）との間に分 配した。

有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）　シ、蒸発させて黄色油を生成し、これを酢酸 エチルを用いてシリカゲルのパッドから溶離することにより精製して、精製ｌ− ベンジル−４−（３−カルボキシプロピル）ピペラジンエチルエステルを無色油 として得た。

ｂ）１−ベンジル−４−（３−カルボキシプロピル）ピペラジンエチルエステル （４，７ｇ　）をエタノール（１６０ｍｌ）に溶解し、ＩＮ）ＩｃＩ（１７，６ ｍ１）を加えて、混合物を反応が完了するまで２０°ＣでｌＯ％Ｐｄ／Ｃ（０， ４７ｇ）の存在下で水素化（１気圧Ｈ２）シた。濾過して触媒を除去し、濾液を 蒸発させて、塩酸１−（３−カルボキシプロピル）ピペラジンエチルエステルを 残留溶媒を含をするガムとして生じ、これを真空中（ＮａＯＨペレット）に保持 した。

実施例６：塩酸１−（４−カルボキシブチル）ピペラジンエチルエステル ａ）実施例５ａに記載の手順を用い、エチル４−ブロモブチレートの代わりにエ チル５−ブロモバレレートを用いて、フラッシュクロマトグラフィー処理後、ｌ −ベンジル−４−（４−カルボキシブチル）ピペラジンエチルエステルを油とし て得た。

ｂ）実施例５ｂに記載の手順を用い、ｌ−ベンジル−４−（３−カルボキシプロ ピル）ピペラジンエチルエステルの代わりに１−ベンジル−４−（４−カルボキ シブチル）ピペラジンエチルエステルを用いて、塩酸１−（４−カルボキシブチ ル）ピペラジンエチルエステルを油として得て、これを放置して結晶化した。

実施例７：塩酸１−（５−カルボキシペンチル）ピペラジンエチルエステル ａ）実施例５ａに記載の手順を用い、エチル４−ブロモブチレートの代わりにエ チル６−ブロモヘキサノエートを用いて、ｌ−ベンジル−４−（５−カルボキシ ペンチル）ピペラジンエチルエステルを油として得た。

ｂ）実施例５ｂに記載の手順を用い、ｌ−ベンジル−４−（３−カルボキンプロ ピル）ピペラジンエチルエステルの代わりに１−ベンジル−４−（５−カルボキ シペンチル）ピペラジンエチルエステルを用いて、塩酸１−（５−カルボキシペ ンチル）ピペラジンエチルエステルを油として得て、これを放置して結晶化した 。

実施例８．塩酸１−（６−カルボキシヘキシル）ピペラジンエチルエステル ａ）実施例５ａに記載の手順を用い、エチル４−ブロモブチレートの代わりにエ チル７−ブロモヘプタノエートを用いて、１−ヘンシル−４−（６−カルボキシ ヘキシル）ピペラジンエチルエステルを油として得た。

ｂ）実施例５ｂに記載の手順を用い、１−ベンジル−４−（３−カルボキシプロ ピル）ピペラジンエチルエステルの代わりに１−ベンジル−４−（６−カルボキ シヘキシル）ピペラジンエチルエステルを用いて、塩酸１−（６−カルボキシヘ キシル）ピペラジンエチルエステルを油として得て、これを放置して結晶化した 。

実施例９ 実施例２に記載の方法と同様の方法で、出発物質として４−（２−カルボキシエ チル）ピペリジンメチルエステル酢酸塩の代わりにそれぞれ塩酸１−（３−カル ボキシプロピル）ピペラジンエチルエステル、塩酸】−（４−カルボキシブチル ）ピペラジンエチルエステル、塩酸１−（５−カルボキシペンチル）ピペラジン エチルエステル、及び塩酸１−（６−カルボキシヘキシル）ピペラジンエチルエ ステルを用いて、以下の化合物を調製した：塩酸１−　（（Ｓ）−Ｎω−ニトロ アルギニル）−４−（３−カルボキシプロピル）ピペラジンエチルエステル塩酸 １−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（４−カルボキシブチル）ピペ ラジンエチルエステル塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（５ −カルボキシペンチル）ピペラジンエチルエステル塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニ トロアルギニル’）−４−（６−カルボキシヘキシル）ピペラジンエチルエステ ル実施例１Ｏ 実施例２に記載の方法と同様の方法で、３−（α、α−ジメチルベンジル）ベン ゼンスルホニルクロリド及び塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４ −（６−カルボキシヘキシル）ピペリジンエチルエステル、塩酸１−　（（Ｓ） −Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（４−カルボキシブチル）ピペリジンエチル エステル、塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（３−カルボキ シプロピル）ピペラジンエチルエステル、塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアル ギニル）−４−（４−カルボキシブチル）ピペラジンエチルエステル、塩酸１− 　（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（５−カルボキシペンチル）ピペ ラジンエチルエステル、又は塩酸１−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４ −（６−カルボキシヘキシル）ピペラジンエチルエステルから出発して、以下の 化合物を調製した： 塩酸１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（６−カルボキシヘキシル）ピペリジン 塩酸１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（４−カルボキシブチル）ピペリジン 塩酸１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（３−カルボキシプロピル）ピペラジン 塩酸１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（４−カルボキシブチル）ピペラジン 塩酸１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（５−カルボキシペンチル）ピペラジン 塩酸１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ ）−アルギニル）−４−（６−カルボキシヘキシル）ピペラジン。

実施例１１：１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホ ニル）　−（Ｓ）−アルギニル）ピペリジン−４−酢酸ａ）無水テトラヒドロフ ラン（ＴＨＦ０５０ｍｌ）に懸濁した（Ｓ）−Ｎａ−ｔ−ブトキシカルボニル− Ｎω−ニトロアルギニン（３，１ｇ）の攪拌冷却懸濁液にトリエチルアミン（０ ，８ｇ　）を−２０°Ｃで５分間に亘って滴下し、攪拌をさらに１０分間継続し た。次に攪拌混合物にイソブチルクロロホルメート（１，１ｇ）を−２０°Ｃで １０分間に亘って滴下し、混合物をさらに１０分間攪拌した。次いで攪拌混合物 にＴＨＦ（２０ｍｌ）中の４−（エトキシカルボニルメチル）ピペリジン（１， ４ｇ）を−２０°Ｃて１０分間に亘って滴下し、−２０°Ｃでさらに１０分間攪 拌後、混合物を１時間攪拌しながら室温に暖めた。反応混合物を蒸発させて濃縮 し、残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈して、混合物を水（３Ｘ　１５ｍ１ ）、水性５％Ｎａ）ｔｃＯ＝　（２ｘ　１５ｍ１）　、水性１０％クエン酸（２ ｘ　１５ｍ１）次いで水（２Ｘ　１５ｍ１）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）した 。溶媒を蒸発させて油を生じ、これを溶離剤として酢酸エチルを用いてシリカゲ ル上でクロマトグラフィーにかけて１−（（Ｓ）−Ｎａ−ｔ−ブトキシカルボニ ル−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（エトキシカルボニルメチル）ピペリジン を淡黄色油として得た。訂（エタノール）＝０．１６゜ ｂ）０〜５°Ｃに冷却したジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解したｌ−（（Ｓ） −Ｎａ−１−ブトキシカルボニル−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（エトキシ カルボニルメチル）ピペリジン（１，２ｇ）の攪拌溶液にトリフルオロ酢酸（２ ，８ｇ　）を徐々に加え、反応混合物を室温に暖めてから、６時間攪拌した。次 にトルエン（３０ｍ１）を加え、混合物を蒸発させて濃縮し、次いでさらにトル エン（２Ｘ　３０ｍ１）と同時蒸発させて、その結果生じた残渣をエーテルで滴 定し、濾過して収集して、エーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて恒量にして、 １−（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（エトキシカルボニルメチル） ピペリジントリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た。

Ｒｆ　（ＢｕＯ［（／ＣＨｓＣＯＯＨ／ｌ（，０３：　２　：　１　）　＝０． ５０゜Ｃ）上記の１−　（（Ｓ）−Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（エトキシ カルボニルメチル）ピペリジントリフルオロ酢酸塩（２，１ｇ　）をドライＣＨ ｚＣＩｚ　（５０ｍｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（１，３ｇ　）を加えなが ら０〜５°Ｃで攪拌して、溶液を得た。この溶液にドライＣＨｚＣＩｔ　（５ｍ ｌ）に溶解した３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリド （１，２ｇ）の溶液を０〜５℃で滴下し、次いで反応混合物を２０°Ｃで３時間 攪拌した。次にＣＨｚＣｌｔ　（５０ｍｌ）を加えて反応混合物を希釈し、ブラ イン（３ｘ　１５０ｍ１）で洗浄して、有機相を乾燥（ＭｇＳＯ，）（、、蒸発 させて濃縮して固体残渣を生じ、これを溶離剤として酢酸エチル／メタノール（ ９：　１）を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて精製した。この ようにして１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニ ル）−（Ｓ）〜Ｎω−ニトロアルギニル）−４−（エトキシカルボニルメチル） ピペリジンを淡黄色油として得た。Ｒｆ　（ＥｔＯＨ）　＝０．２１゜ｄ）１− （Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）− Ｎω−ニトロアルギニル）−４〜（エトキシカルボニルメチル）ピペリジン（３ ００ｍｇ）をＣｚＨｓＯＨ（１５０ｍｌ）とＣＨｙＣＯＯＨ（２ｍｌ）の混合物 中に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（３０ｍｇ）の存在下で３５°Ｃて５時間水素化した （５０気圧Ｉ（２）。触媒除去後、混合物を蒸発させて濃縮し、油残渣を生じ、 これを酢酸エチル（２０ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａｚＣＯｘ　（３ｘ　５　ｍｌ ）　、飽和ＮａＣ１（３Ｘ　５　ｍｌ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ，）　Ｌ、蒸 発させて残渣を得た。残渣をイソプロノ（ノール（１０ｍｌ）に溶解し、木炭と 一緒に２時間攪拌して、濾過し、蒸発させて固体を生じ、これをエーテルで滴定 し、濾過により収集してエーテルで洗浄し、真空乾燥した。このようにして白色 固体１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）− （Ｓ）−アルギニル）−４−（エトキシカルボニルメチル）ピペリジンを得た。

融点１４４°ＣｏＲｆ　（ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ／Ｈ２０３：　１　：　１　）　 ＝０．５９゜”ＣＮＭＲスペクトルは本生成物と一致した。

ｅ）無水エタノール（２，５ｍ１）中の１−　（Ｎ（Ｚ　−（３−（α、ａ　− ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−４−（エト キシカルボニルメチル）ピペリジン（５００ｍｇ）の懸濁液に水性Ｉ　Ｍ　Ｎａ ０）Ｉ（１，７ｍ１）を添加し、そしてその混合物を２４時間室温において攪拌 する。次にこの反応混合物をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂ＣＧ１２０（）（”　０２ ５ｍ１）上でクロマトグラフィーにかける。この樹脂カラムを、中性ｐＨまで最 初に水性５０％エタノールにより、次にエタノール／８．０　／ＮＨバ比重０． ８８）　（５：　４　：　１）により溶離させる。生成物を含む両分を蒸発させ 、残渣を得て、これをエタノールにより共沸させ（３回）、エーテルも共に粉砕 し、ろ過により回収し、エーテルで洗浄し、そして真空中で乾燥させる。このよ うにして、１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニ ル）−（Ｓ）−アルギニル）ピペリジン−４−酢酸、融点１８８−１９１″Ｃ１ Ｒｆ　（ＢｕＯＨ／　ＨＯＡＣ／Ｈ２０３：　１　：　１　）　０．５８を得る 。”ＣＮＭＲスペクトルは、本生成物と一致した。

実施例１２：１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニ ル−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリジン−酢酸４−（エトキシカルボニルメチル ）−ピペリジン（３５７ｍｇ）及びＥｔＪ　（０，２８ｍ１）をＤＭＦ（５ｍｌ ）に溶解し、水中で冷却した。ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解した塩酸Ｎα−（３−（ α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニルクロリ ド（９５３ｍｇ）を５°Ｃ以下で攪拌しながら１０分間に滴下した（ｐＨ＞９） 。さらに３０分間攪拌後、混合物を濾過し、濾液を蒸発乾燥して、残留油をエタ ノール（２Ｘ５ｍｌ）で同時蒸発させてＤＭＦから遊離した。その結果生じた油 をメタノール（２ｍｌ）に溶解し、激しく攪拌したＮａ−ドライエーテル（２５ ｍ１　）に滴下した。上清液をデカントし、残留ガムを真空中（濃硫酸）に保持 してばりばりの発泡体を得た。ＣＨ，ＣＮ／Ｈ，０／ＣＦ、Ｃ００Ｉ（（容量で ３３０：６７０　：　１）を用いて分取ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ　Ｃ８）により 発泡体から生成物を単離して粗製物質を生じ、これをｌＭＣｌ３ＣＯＯＨ（３ｍ ｌ）及びＩ　Ｎ　ＨＣＩ　（２ｍ１）の混合物中に溶解し、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ２ 樹脂のカラム（４０ｘ　３　ｃｍ）に通し、これを水性ＩＭ　Ｃ１，Ｃ０ＯＨで 溶離して単離した。この粗製物質から精製塩酸１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメ チルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）−２−（４−エトキ シカルボニルメチル）ピペリジンを得た。生成したエステルを実施例８ｅに記載 の手順にしたがって加水分解して、１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジ ル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）ピペリジン−酢酸を得た。生成 物は、実施例１１に記載の手順で得られたものと同一であった。

実施例１３ 実施例１１に記載の方法と同様の方法で以下の化合物を調製した：２−（１−（ Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−ア ルギニル）ピペリジン−４−イル）エタンスルホン酸（融点１８２〜４°Ｃ）。

元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ、Ｓ）の値は予測値と申し分なく適合した。

実施例１４：　ａ−（１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼ ンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）ピペリド−４−イル）プロピオニル−（ ＧＩＹ）４　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）　（ＢＴＩ−１）ａ）保護化ＢＴ Ｉ−１／樹脂 ＢＴＩ−１のペプチド部分の構築は、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ｐ−ベンジルオキシベ ンジルエステル−ポリスチレン樹脂（１％架橋。Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）から出発するＭｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ合成により達成したが、この場合、アミノ基が９−フルオレニル− メトキシカルボニル（Ｐｍｏｃ）で保護されるし一ロイシンのカルボキシ基を４ −メトキシベンジルアルコール（ここで、メトキシ基の炭素原子はジビニルベン ゼンで１％架橋され、同時にキャリアーとして作用するポリスチレン樹脂の芳香 族環と結合する）でエステル化した。このために、アミノ保護基（本発明の場合 はＦｍｏｃ基）の交互除去、及び各段階で得られるペプチド／樹脂中間生成物の 単離を伴わないＦｍｏｃ　−アミノ酸誘導体のカップリングに適した全自動ペプ チド合成装置を用いた。３官能アミノ酸を対応的保護化誘導体として導入した： Ｆｍｏｃ−３ｅｒ　（Ｂｕｔ）　（ここで、セリンの側鎖のヒドロキシ基はｔｅ ｒｔ、−ブチルに保護される）　、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｕｔ及びＦｍｏｃ− Ｇｌｕ−ＯＢｕｔ（ここで、アスパラギン酸の３−カルボキシ基及びグルタミン 酸の４−カルボキシ基はそれぞれｔｅｒｔ、−ブタノールでエステル化される） 　、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）　（ここで、チロシンのヒドロキシ基はｔｅｒ ｔ、−ブチルにより保護される）　、Ｆｍｏｃ−４ｇ口（Ｔｒｔ）　（ここで１ ．アスパラギンの３−アミド官能基はトリチル（トリフェニルメチル）により保 護される）。

第一段階では、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−０ＨをＬｅｕ／樹脂出発物質と結 合させ、次に他のＦｍｏｃアミノ酸を、以下の順に、足並みを揃えて各段階後に 得られるペプチド／樹脂中間生成物と結合させる：　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ ｔ）−０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＤＨ， Ｆｍｏｃ−１１ｅ−ＯＨ，Ｐｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｇ ｌｕ（ＯＢｕｔ）−０Ｈ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ ｔ）−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−０Ｈ，Ｆ ｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−０１（。

Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｇｌｙの場合のダブルカッ プリング）。個々の段階は以下の計画に従って実行した。約３０ｍ１の洗浄液を 各場合に各操作に用い、別記しない限り室温で実施し、反応混合物は一様に振盪 した。

３．２ｇのＦｍｏｃ−Ｌｅｕ／樹脂出発物質（約１．５ｍＭ）から開始して、以 下の工程（各段階に関して反復して）を実行した；−イソプロパツールを用いて ０．８分間１回洗浄ニー−次カップリングのための予備活性化：　４．５ｍｍｏ ｌのそれぞれのＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸をＤＭＡに溶解したＨＯＢｔの０．４Ｍ 溶液１２．４ｍｌに溶解し、ＤＭＡに溶解したＤＩＣＤの１Ｍ溶液４．９５ｍ１ を加えた。反応混合物を約４０分間室温に保ち、次いでその形態で用いた。この 時間の間に、下記のＦｍｏｃ保護基の洗浄及び除去はすでに進行中であったニー ＤＭＡに溶解したピペリジンの２０％溶液で、各々１分間の持続時間で、樹脂出 発物質を１５回処理（Ｆｍｏｃ保護基の除去）；−減圧下でガス抜きしたＤＭＡ を用いて、各々０．４分間の持続時間で３回洗浄ニ ーイソプロパツールを用いて０．８分間１回洗浄；−減圧下でガス抜きしたＤＭ Ａを用いて、各々０．４分間の持続時間で５回洗浄； 一合間を見て（上記参照）調製しておいた一次カツブリング試薬の付加。二次カ ップリングのための予備活性化：　４．５ｍｍｏｌのそれぞれのＦｍｏｃ　−Ｌ −アミノ酸をＤＭＡに溶解したＨＯＢ　ｔの０．４Ｍ溶液１２．４ｍｌに溶解し 、ＤＭＡに溶解したＤＩＣＤの１Ｍ溶液４．９５ｍ１を加えた。反応混合物を攪 拌しながら約４０分間室温に保ち、この間に一次カツブリングが起きたニ ーー次カップリング反応から室温て４０分後にカップリング混合物の除去； 一合間を見て（上記参照）調製しておいた二次カップリング試薬の付加。カップ リング反応は３０分間実施したニー減圧下でガス抜きしたＤＭＡを用いて、０． ４分間２回洗浄。

−約３０ｍ１の無水酢酸、ピリジン及びＤＭＡのＩ：１：８混合物を用いて５分 間１回処理（成長中のペプチド鎖でまだ遊離し−Ｃいたアミン基のアセチル化の ため）。

一減圧下でガス抜きしたＤＭＡを用いて、各々０．４分間の持続時間で４回洗浄 。

この方法で、以下のＦｍｏｃ−ペプチド／樹脂中間生成物を得た：Ｆｍｏｃ−Ｇ ｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１ｙ−Ａｓｎ　（Ｔｒ　ｔ）−Ｇ　１ｙ−Ａ ｓ　ｐ　（ＯＢｕ　Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯＢ普@ｔ　）− Ｇ　［ｕ（ＯＢｕ　ｔ　）−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕ　ｔ　）−Ｇｌｕ （ＯＢｕｔ）−Ｔｙｒ（Ｂｕ　ｔｌｌ、ｅｕ−樹脂（ここで“樹脂”とは、カル ボキシ基−エステル化ポリスチレン（ジビニルベンゼンと１％架橋）−メトキシ −４−フェニルメトキシ遊離基を指す）。

ペプチド／樹脂中間生成物（１８４ＢＭ、約１．１ｇ）のＮ末端グリシン残基の Ｆｍｏｃ保護基の除去（Ｔ）ＭＡに溶解したピペリジンの２０％溶液。

上記参照）後、ＤＭ、Ａ中の０．５０Ｍ　ＨＯＢｔ　ｉ、２１ｍ１に溶解した１ −（Ｎ（２−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ）− アルギニル）−４−（２−カルボキンエチル）ピペリジン３１８ｍｇ（５２３Ｂ Ｍ）　、Ｔｌ３ＴＵ　１９５ｍｇ（６０７ｕ、Ｍ）及びＤＩ腿ｉｏ４ｍｇ（６０ ７ｕ　Ｍ　）の溶液を加えた。混合物を室温に１時間保った。その結果生じた保 護化ＢＴＩ−１／樹脂　：３−　（１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベン ジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）− プロピオニル−Ｇｌｙ−ＧＩＹ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ− Ａｓｐ（ＯＢｕ　ｔ　）−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｇ　１ｕ（ＯＢｕｔ） −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ ）−Ｌｅｕ−樹脂をイソプロパツールで４回洗浄し、減圧下で乾燥した。

ｂ）高分子キャリアー及び保護基の除去高分子キャリアー及び易酸性保護基を除 去するために、ペプチド／樹脂化合物１．１７ｇ（約０．１８ｍｍｏｌ）を、ト リフルオロ酢酸（９５％）及びエタンジチオールの９８＝２混合（ｖ／ｖ）２０ ｍｌと一緒に室温で５分間２回振盪し、次いで濾過した。濾過残渣を２０ｍ１の 各ＤＣＥ及び２０ｍ１の各ＴＦＥで３回洗浄した。併合濾液及び洗浄液を減圧下 で室温で濃縮して容量を約２０ｍ１とし、ＤＩＰＥ及び石油エーテル（低沸点） の１　：　１　（ｖ／ｖ）混合物約１２０ｍ１を加えて粗製ペプチドを沈殿させ た。濾過して沈殿物を単離し、沈殿混合物５０ｍ１で洗浄し、減圧下で乾燥した 。

精製のために、そのようにして得た粗製ペプチドの５０ｍｇ了りコートを１．５ ｍｌのＡＣＮ／水（９：　］　ｖ／ｖ）及び０．５ｍｌの酢酸の混合物中に溶解 し、以下の条件下で高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけた：カラム Ｃ２０Ｘ２５０ｍｍ、　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５Ｃ４（３００Ｂ）　、製造；Ｍ ａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、　Ｄｕｒｅｎ、　Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｐｕｂｌ ｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ）　；　０．１％水性ＴＦＡを溶離剤（Ａ）として 、ＡＣＮに溶解したＴＦＡの０．１％溶液を溶離剤（Ｂ）として用いた。直線勾 配は３０分で１０％Ｂ→〉５０％Ｂで、処理速度１５ｍ１／分、Ｕｖ光２１５ｎ ｍで検出。主分画（保持時間約１４分）を収集し、減圧下で濃縮して、親液化し た。酢酸（９５％）から再親液化後、表題化合物ＢＴＩ−１を無色固体として得 た。

ＨＰＬＣ：カラムＮｕｃ！ｅｏｓｉｌ　７Ｃ１８（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅ ｌ、　Ｄｕｒｅｎ、　ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃ　ｏｆ　Ｇｅｒｍａｎｙ ）、寸法：　４．６Ｘ２５０ｍｍ　；溶離剤（Ａ）　：　０．１％水性ＴＦＡ　 、直線勾配置０％Ｂ　＋　＞　９０％Ｂ（３０分）、１ｍｌ／分、ＵＶ光２１５ ｎＥＩｌで検出。単一ピークの保持時間：１９．７分、ＦＡＢ−ＭＳ　（Ｍ”　 −Ｈ）　：　２２３７．０　（算出分子量：　２２３７．４）。

実施例１５ 実施例１４に記載の方法と同様の方法で以下の化合物を調製した：３−（１−（ Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−ア ルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−（Ｇｌｙ）ｓ−Ａｓｎ−ヒ ルジン（５４−６４）　（ＢＴＩ−２）　。

ＨＰＬＣ：保持時間１８．１分；　ＰＡＢ−ＭＳ　（Ｍ”　−Ｈ）　：　２１８ ０．４　（算出分子量：２１８０．４）　。

ＨＰＬＣ条件は実施例１４に記載したものと同様であった。

実施例１６：　３−　（１−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベン ゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニ ル−Ｇａｂ　−Ａｃａ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）（ＢＴＩ−３） 構成単位として３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリド 、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｐｍｃ）　（Ｐｍｃ　：アルギニンのグアニジノ官能基 の保護基である２、２．　５．　７．　８−ペンタメチル−クロマン−６−スル ホニル）、及びＦｍｏｃ−カルボキシ−エチル−ピペリジンを用いて段階的方法 で、表題化合物の非ペプチド部分を固相に集めた。

ａ）　Ｆｍｏｃ　−４−（２−カルボギンエチル）−ピペリジンの調製４−（２ −カルボキンエチル）−ピペリジン−アセテ−目、１８ｇ（５，４３ｍｍｏｌ） を水６．０ｍｌ及びトリエチルアミン１．５０ｍ１　（１０，８ｍｍｏｌ）に溶 解し、フルオし・ニル−メトキシ−カルボニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミ ドエステル（アセトニトリル６．０ｍｌに懸濁）２．７５ｇ（８，１５ｍｍｏｉ ）を加え、混合物を室温で４時間攪拌した。２回（１１／２及び３時間後）、フ ルオレニル−メトキシ−カルボニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル １８３ｍｇ　（１，０９ｍｍｏｌ）を加えた。２　Ｎ　ＩＣ１５，５ｍｌを付加 後、混合物を酢酸エチル２００ｏ＋１に溶解し、水３０ｍ１で６回洗浄した。硫 酸ナトリウムで存機相を乾燥し溶媒を真空蒸発させた後、その結果生じた油を酢 酸エチル／石油エーテルから結晶化した。凝固点１１７〜１１９．５℃（補正な し）。生成物はｔｔｃにより均質であることが判明し、構造はＩ　Ｈ−ＮＭＲに より確証した。

ｂ）固相合成及び非ペプチド部分の付着ＢＴＩ−１に関して記載されているのと 同様にして、ペプチド部分を調製した（実施例１４と比較）。標準プロトコール を用いてペプチド部分（Ｆｍｏｃ　−Ａｃａ及びＦｍｏｃ−Ｇａｂ　；　Ａｃａ 　：　６−アミノ−カプロン酸、Ｇａｂ　：　４−アミノ−酪酸）　、　Ｆｍｏ ｃ−カルボキシ−エチル−ピペリジン及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｐｍｃ）を付着 させた後、３−Ｃａ、ａ−ジメチルペンシル）ベンゼンスルホニル基を以下のよ うに結合した：ＤＭＡ／ピリジン（１：　１　ｖ／ｖ）　０．２６ｍ１に溶解し た３−Ｃａ、ａ−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリド２４．１ｍｇ 　（８１，７回Ｍ）及びＤＩＥＡ　１４μｍ　（８１ｇＭ）をＡｒｇ　（Ｐｍｃ ）　−（カルボキシ−エチル−ピペリジン）　−Ｇａｂａ−Ａｃａ−Ａｓｎ−ヒ ルジン（５４−６４）　−ベンジルオキシ−ベンジルエステル−樹脂１６０ｍｇ 　（２７μＭ）に加え、室温で４０分反応させた。次に同量の３−（α、α−ジ メチルベンジル）ベンゼンスルホニルクロリドを加え、さらに５０分間反応させ た。

上記のように樹脂をＤＭＡ及びイソプロパツールで洗浄した。樹脂からの切断は 、ＢＴＩ−１に関して上記されているのと同様に行なった（実施例１４と比較） 。側鎖保護基（Ｐｍｃ　Ｉ　）を除去するために、さらにＴＦＡ　（９５％）／ エタンジチオール（４：　Ｉｖ／ｖ）を用いて室温て２時間処理する必要があっ た。単離及び精製はＢＴＩ−１に関して上記されているように実施した。

ＢＴＩ−３の特徴を以下に示す。

ＨＰＬＣ：保持時間２０．５分（実施例１４に記載されているのと同条件）；Ｆ ＡＢ−ＭＳ　（Ｍ”　−Ｈ）　：　２２０６．８　（算出分子量：　２２０７． ５）。

実施例１７ 実施例１６に記載されているのと同じ方法で以下の化合物を調製した： ３−（１−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル） −（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−Ａｕｄ−Ａｓ ｎ−ヒルジン（５４−６４）　（Ａｕｄ　：　１１−アミノ−ウンデカン酸）　 （ＢＴＩ−４） ３−（＋−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル） −（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−Ｇａｂ　−（ Ｇ１．Ｙ）２−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）　（ＢＴＩ　５）３−（１−（ Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−ア ルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−ＡＩ）ｒ　（Ｇｌｙ）ｚ　 Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）　（Ａｐｒ　：　３−アミノ−プロピオン酸） 　（ＢＴＩ−６’）３−（＋−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベ ンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオ ニル−Ｇｌｙ　−Ｇｌｕ　−（Ｇｌｙ）ｚ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）（ ＢＴＩ−７） ３−（＋−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル） −（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−Ｇｌｙ　−Ｌ ｙｓ　−（Ｇｌｙ）ｚ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）（ＢＴＩ−８） ３−（１−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル） −（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−Ｇｌｙ　−Ｐ ｈｅ　−（Ｇｌｙ）ｔ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）（ＢＴＩ−９） それぞれＦＡＢ−ＭＳ（ＦＡＢ）及びレーザー脱着ＭＳ　（ＬＤ）により測定し た場合の各化合物のＨＰＬＣ保持時間（ｒｔｏ分ｍｉｎで表示。条件は実施例１ ４参照）及び分子量（算出分子量）を以下に示す：阻害剤　ｒｔ（分）ＭＳ ＢＴＩ　−４２２，４２１９１，６（２１９２，６）ＬＤＢＴＩ−５２０，０２ ２０７，５（２２０８，４）ＬＤＢＴＩ−６、２０，２２１９３，０（２１９４ ，４）ＬＤＢＴＩ　−７１９，８２３０９，２（２３０９，５）ＬＤＢＴＩ−８ １９，０２３０７，７（２３０８，６）ＬＤＢＴＩ−９２１，１２３２７，２（ ２３２７，６）ＬＤ実施例１８ 前実施例と同様の方法で以下の化合物を調製した：３−（１−（Ｎα−（３−（ α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピ ペリド−４−イル）−プロピオニル−Ａｐｒ　−Ａｐａ−Ａｓｎ−ヒルジン（５ ４−６４）３−（１−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンス ルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオニル−（ Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ　−（ホモＰｈｅ”　）ヒルジン（５４−６４）７−（１− （Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）− アルギニル）−ピペリド−４−イル）−ヘプタノイル−（ＧＩＹ）２−Ａｓｎ− ヒルジン（５４−６４）５−（１−（Ｎα−（３−（α、α−ジメチルベンジル ）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−ペン タノイル−（Ｇｌｙ）ｚ　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）４−（１−（Ｎａ− （３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル’）−（Ｓ）−アルギ ニル）−ピペラジン−４−イル）−ブタノイル−（Ｇｌｙ）＊　Ａｓｎ−ヒルジ ン（５４−６４）５−（１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベン ゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペラジン−４−イル）−ペンタノ イルー（Ｇｌｙ）ｓ　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）６−（１−（Ｎａ−（３ −（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル） −ピペラジン−４−イル）−ヘキサノイル−（Ｇｕｙ）＊　Ａｓｎ−ヒルジン（ ５４−６４）？−（１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼン スルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペラジン−４−イル）−ヘプタノイル −（ＧＩＹ）ｚ　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）２−（＋−（Ｎａ−（３−（ α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）　・−アルギニル） −ピペリド−４−イル）−アセチル−（ＧＩＹ）４　Ａｓｎ−ヒルジン（５４− ６４）２−（１−（Ｎａ−（３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホ ニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−エタンスルホニル−（ ＧＩＹ）４　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）。

実施例１９：非経口投与用製剤組成物 実施例１３〜１６のいずれかに記載のＢＴＩ化合物を含有する溶液を０．９％Ｎ ａＣ１溶液に対して透析した。次に同−ＮａＣ１溶液で０．２〜２．０ｍｇ／ｍ ｌに希釈して溶液の濃度を調節した。その結果生じた溶液を限外濾過（膜孔０． ２２μｍ）で滅菌した。

滅菌溶液は、例えば静脈内投与に直接用い得る。

実施例２０：λＰ１プロモーター後方のニグリンＣの発現のための発現ベクター の構築 ＤＮＡ操作はすべて一別記しない限り一標準プロトコール（例えば、Ｍａｎｉａ ｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ 　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２））に従って実 施した。

プラスミドｐＰＬ、　Ｍｕは、単−Ｎｃｏ　Ｉ及びＨｉｎｄｌ１１部位間にｐｕ ｃ　８ポリ−クローニング部位を有する（Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎ ｇ、　Ｇｅｎｅ、　１９゜２５９−２６８　（１９８２））プラスミドｐＰＬｍ ｕｓＭｃｏｒｉ　（Ｂｕｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　 Ｒｅｓ、１３．　１９２３−１９３８　（１９８５））である。プラスミドｐＰ Ｌ、　Ｍｕ及びｐＬＭ１４７をそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ及びＥ ｃｏＲＩで線状にした。これらのＤＮＡの５′突起型末端をヌクレアーゼＳ！消 化（１００ｍＭＮａＣ１；　５０ｍＭ　Ｃ１，ＣＯＯＮａ　；　０．１ｍＭ　Ｚ ｎＣ１ｚ　；酢酸でｐＨ４，５，室温で３０分）により除去した。次にプラスミ ドを別々に、β−ラクタマーゼをコードする遺伝子及びＤＮＡ断片のＰｖｕ１部 位でλプロモーターを含有するｐＰＬ、　Ｍｕから切り離し、そしてニグリンＣ 遺伝子を含有するｐＬＭ１４７の断片をアガロースゲルから単離し、結紮して、 その結果プラスミドｐｐＬ、　Ｍｕ、ニグリンを生じた（図１）。

実施例２１：熱誘導 大腸菌５０９３６株（ＡＴＣＣ３９６２４）をプラスミドｐｃ１８５７　（Ｂｕ ｅ［ｌ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３．１９２３−１９３８　（１９８ ５；　Ｒｅｍａｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ２２、１０３−１１３　（１９ ８３）））及びｐＰＬ、Ｍｕ、　：ｒ−グリシで新たに形質転換して、アンピシ リン及びカナマイシンを含有するＬＢ平板上でコロニー形成させた。４０ｍｇ／ 　Ｉ！のアンピシリン及びカナマイシンを含有するＬＢ中で３０℃で増殖させた 一夜培養５０ｍ１を、室温で同一培地２００ｍ１を倉入したＩＯ００ｍｌ三角フ ラスコに加えた。培養を６５°Ｃ水浴中で振盪しなから４２°Ｃに加温し、次い で４２°Ｃ水浴シェーカーに移した。５時間インキュベーション後に遠心分離し て細胞を収穫した。細胞ペーストを凍結し、−７６°Ｃに保持した。

実施例２２．λＰ、プロモーター後方のニグリンｃ−（Ｇｌｙ）２Ｔｈｒ−Ｌｙ ｓ−（ＧＩＹ）ｓ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）の発現のための発現ベクタ ーの構築 互いに一部交雑した２つの合成オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ　１０　ＮＯニア及 びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・８） ＴＡＴＡＧＴＴ八八ＣＣへへＧＴＴＣＣＧＣＡＴＧＴ’ｒＧＧＴＧＧ　ＴＧＧＣ ＡＣＴＡＡＧ　ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧ　ＧＣＡＡＣ５ｓＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ’ ｒＡＧ八ＧＧへ八ＣＴへ　ＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴ　ＣＴＣＴＴＣＧ八八Ａ　Ｔへ へＣＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡbＣ６０ Ｃ６１ をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。この反応で得られた二重鎖ＤＮＡ断 片は、８個のＣ−末端アミノ酸、その後の（Ｇｌｙ）ｚ　−Ｔｈｒ　−しＹｓ　 −（Ｇｌｙ）ｔ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）　、その後の翻訳停止コドン をコードし、１ｌｐａｌ及びＢａｍ１ｌｌ制限部位が側面に位置した。このＤＮ Ａ断片をアガロースゲルから単離し、ｌ１ｐａｌ及びＢａｍ１ｌｌで切断して、 １１ｐａｌ及びＢａｍ１ｌｌ切断ｐＰＬ、　Ｍｕ、ニグリンベクターに結紮して 、プラスミドｐＰＬ、　Ｍｕ、ニグリン−ｈ　ｉ　ｒ、を生じ、これを融合蛋白 質ニグリンｃ　−（Ｇｌｙ）ｚ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−ヒ ルジン（５４−６４）　（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）の発現のためにここで用いた。

実施例２３・融合蛋白質ニグリン−（Ｇｌｙ）ｚ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　（Ｇｌｙ） ４−Ａｓｎ−−ヒルノン（５４−６４）の単離発酵−懸濁液１．６ｉ！からの細 胞３．１ｇを酢酸／水（１：９Ｖ／Ｖ）１６ｍｌ中に懸濁し、４５秒間に２回（ パルスモード）音波処理した。４°Ｃで遠心分離後、上清を減圧下で乾燥した。

原料（１１８ｍｇ）は１４．８ｍｇの精製融合蛋白質（ｌｉＰＬｃにより精製物 質との比較から算出）を含有した。融合蛋白質は、　ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１０ Ｃ１８＠、溶離剤（１０％−＋９０％アセトニトリル（０，１％ＴＦＡ）、３０ 分で、１５ｍ１／分）を用いたＨＰＬＣにより精製し、２１５ｎｍで検出し得た （純度〉９８％、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ；補正質量）。

実施例２４．ニグリン−（ＧＩＹ）ｚ　Ｔｈｒ　ＬＹＳ　（ＧＩＹ）４　Ａｓｎ −ヒルジン（５６−６４）のトリプシン切断 実施例２３に記載の原料（１，１ｍｇのニグリン−（Ｇｌｙ）ｒ−Ｔｈｒ　−Ｌ ｙｓ　−（Ｇｌｙ）ｔ　Ａｓｎ−ヒルジン（５６−６４））　９．５ｍｇを水５ ＋ｎｌ及びＴＥＡＢ−緩衝液１５０ｕ　１に溶解した。３０°Ｃでトリプシン（ Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ、シーケンシング等級）３０Ｍｇを加え、２．５時間後 、さらに２０Ｍｇのトリプシンを加えた。計４時間のインキュベーション後、混 合物を減圧下で２５°Ｃで１ｍｌに濃縮した。精製はモノーＱカラム上で実行し た：緩衝液Ａ　：　５０ｍＭ　ＴＥＡＡ、　０．０１Ｍ　ＮａＣ１緩衝液Ｂ　： 　５０ｍＭ　ＴＥＡＡ、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１勾配二　〇％Ｂ→４０％Ｂ、２６分 ２６００ｍで検出。

純度＞９８９６の（Ｇｌｙ）４−　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）を得た（Ｍ ＡＬＤＩ−ＭＳ：補正質量）。

実施例２５：非保護化１−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼン スルホニル−（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジン の（ＧＩＹ）４　Ａｓｎ−ヒルジン（５６−６４）どのカップリング １−（Ｎａ−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ）− アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジン８．６ｍｇ　（１５Ｈ ｎｏｌ）をＤＩＥＡ　１５Ｈｎｏｌを含有するＮＭＰ　１００μ＋に溶解し、Ｔ ＢＴＵ　４．８ｍｇ　（１５Ｈｎｏｌ）を加えた。室温で５分後、（ＧＩＹ）４ −　Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）　１６．８ｍｇを加え、ＮＭＰ　４０μ］ で希釈した。

５分後にＤＩＥＡ　２．５７μＩ　（１５Ｈｎｏｌ）を加えた。４５分後、反応 混合物をＤＩＰＥ／ＰＥ　（１：　１　ｖ／　ｖ）　Ｉ　ｍｌ中に滴下した。生 成した油を遠心分離で収集し、０．５ｍ１（７）Ｄ［ＰＥ／ＰＲ（１：　１　ｖ ／　ｖ）で１回、２００μｍの水で３回洗浄した。その結果生じたものを減圧下 でｈａｓ　（１５，９ｍｇ）を用いて乾燥した。精製はｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　７ Ｃ１８＠カラム（１００Ａ）　２０Ｘ２５０順を用いて実施した。

勾配：ｌＯ％→９０％アセトニトリル（０，１％ＴＦＡ）、６０分、１８ｍ１／ 分２１５ｎｍで検出。

純度〉９８％の１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホ ニル−（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピペリジン−（Ｇ ｌｙ）４−＾ｓｎ−ヒルジン（５４−６４）を得た（ＭＡＬＤ　Ｉ−ＭＳ）。

実施例２６　：　Ｐｍｃ保護化１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル） ベンゼンスルホニル＝（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピ ペリジンの合成 ａ）−次アミノ酸の樹脂とのカップリングＦｍｏｃ　−４−（２−カルボキシエ チル）−ピペリジン（実施例１６）１．３２ｇ　（３，４８ｍｏｌ）をＤＭＦ　 １．１ｍｌ及び１，２−ジクロロエタン１４ｍ１に溶解し、ヒドロキシ−トリア ルコキシ−ベンズヒドリル−ポリスチレン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）　２．０ ０ｇ　（１，１６ｍｍｏ比ドロキシ官能基）を加え、０〜５°Ｃに冷却した。５ 分間に亘って、ジクロロへキシルカルボジイミド７６６ｍｇ　（３，７１ｍｍｏ ｌ）をジクロロエタン１．４ｍｌに溶解し、最後にｐ−ジメチルアミノ−ピリジ ン５６．７ｍｇ　（０，４６ｍｍｏ　ｌ）を加えた。２０分後、Ｎ−メチル−モ ルホリン１１７ｍｇ　（１，１６ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５時間室温 に保った。次いで樹脂をイソプロパツールで手広く洗浄し、減圧下で乾燥した。

ｂ）樹脂結合Ｐｍｃ保護化１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル）ベン ゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキンエチル）ピペリ ジンの構築 変性樹脂１．７ｇに、自動ペプチド合成機で以下の工程を適用した：（洗浄はす べて、各々洗浄剤１０ａ＋１及び反応体を用いて実施した）−イソプロパツール を用いて０．８分間１回洗浄；−一次カツブリングのための予備活性化：　Ｆｍ ｏｃ−Ａｒｇ　（Ｐｍｃ）　−０Ｈ１、５９ｇ　（２，４ｍｍｏ　１）をＤＭＡ に溶解したＨＯＢｔの０６５Ｍ溶液５．２８ｍ１　（２，６４ｍｍｏｌ）に溶解 し、ＤＭＡに溶解したＤＣＣＩの２Ｍ溶液１．３２ｍ１　（２，６４ｍｍｏｌ） を加えた。反応混合物を約４０分間室温に保ち、次いでその形態で用いた。この 時間の間に、下記のＦｍｏｃ保護基の洗浄及び除去はすでに進行中であったニ ー　ＤＭＡに溶解したピペリジンの２０％溶液で、各々１分間の持続時間で、樹 脂出発物質を１７回処理（Ｆｍｏｃ保護基の除去）；−減圧下でガス抜きしたＤ ＭＡを用いて、各々０．４分間の持続時間で３回洗浄； 一イソプロパツールを用いて０．８分間１回洗浄；−減圧下でガス抜きしたＤＭ Ａを用いて、各々０．４分間の持続時間で５回洗浄； 一合間を見て（上記参照）調製しておいたカップリング試薬の付加及び旧ＥＡ　 ４５２μｍ　（１，６４ｍｍｏｌ）の付加。

−カップリング反応から室温で６０分後にカップリング混合物の除去； 一減圧下でガス抜きしｊ＝ＤＭＡを用いて、０．４分間２回洗浄；−約３０ｍ１ の無水酢酸、ピリジン及びＤＭＡの１　：　１　：　８　（ｖ／ｖ／Ｖ）混合物 を用いて５分間１回処理（成長中のペプチド鎖でまだ遊離していたアミノ基のア セチル化のため）；−減圧下でガス抜きしたＤＭＡを用いて、各々０．４分間の 持続時間で４回洗浄。

アセチル化段階を含まずにこの方法を繰り返した：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ　（Ｐｍｃ ）−ＯＨ溶液の代わりに、ＤＭＡ　４．６ｍｌに溶解したフェニール−’）　ミ ル７、）’ｖホニルクロリド（ＰＣＳＣｌ　）　４２９ｍｇ　（１，４５ｍｍｏ ｌ）をＤＩＥＡ　２４９ｕ　ｌ　（１，４５ｍｍｏｌ）と−緒に樹脂に加えた。

室温で６５分後、液体を除去した。ＤＭＡ　３ｍｌに溶解したＰＣＳＣ１２６８ ｍｇ　（０，９７ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ　１６６μＩ　（０，９７ｍｍｏｌ）と −緒に用いて、二次力・ノブリングを８５分間実施した。最後に樹脂をイソブロ ノくノールで５回洗浄し、高真空下で乾燥した。

Ｃ）高分子キャリアーの除去 高分子キャリアーを除去するために、ペプチド／樹脂化合物１．０ｇ（約０．２ ４ｍｍｏｌ）を、酢酸及びＤＣＨの１＝９混合物（ｖ／ｖ）ｉｏｍｌと一緒に室 温で１時間振盪し、次いで濾過した。濾過残渣を７ｍｌの各ＤＣＥ及び７ｍｌの 各ＴＦＥで３回洗浄した。併合濾液を減圧下で濃縮してｔｅｒｔ、−ブタノール １５ｍ１に溶解し、減圧下で乾燥して、ＭＡＬＤ　Ｉ−ＭＳで特性表示した。

実施例２７　：　Ｐｍｃ保護化１−（Ｎα−３−（α、α−ジメチルベンジル） ベンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル）−４−（２−カルボキシエチル）ピ ペリジンの（Ｇｌ）’）ａ　−Ａｓｎ−ヒルジン（５６−６４）とのカップリン グ 実施例２５に記載されているように、Ｐｍｃｌ−（Ｎα−３−（α。

α−ジメチルベンジル）ベンゼンスルホニル−（Ｓ）−アルギニル−４−　（２ −カルボキシエチル）ピペリジン１２．６ｍｇ　（１５μｎｏｔ）を用いてカッ プリングを実施した。原料はＭＡＬＩ）　Ｉ−　ＭＳで特性表示した。

実施例２８　：　Ｐｍｃ基の除去 実施例２７から得られた原料０．　５ｍｇを室温てＴＦＡ（９５％）／エタンジ チオール（９５　：　５　ｖ／ｖ）　２０μｌ中に２時間保持した。次に反応混 合物をＤＩＰＥ／ＰＥ　（　１　：　１　ｖ／　ｖ）　１００μｍに加えた。無 色沈殿を０〜５°Ｃに冷却し、遠心分離した。ＤＩＰＥ／ＰＥ　（　１　：　１ 　ｖ／　ｖ）で３回洗浄後、白色粉末を減圧下で乾燥し、）ＩＰＬＣで同定した 。

配列表 （１）一般情報： （ｉｉ）配列の数＝ｌｌ （２）配列番号＝１に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）梨二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ （伍）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型−Ｃ末端 （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：　Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：　１．　、　１１ （Ｄ）他の情報：／注＝“脱硫酸ヒルジンＨＶＩのアミノ酸５５−６５（欧州特 許第１　４２８６０号）”（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：９ （Ｄ）他の情報＝／注＝“チロシンは硫酸又はリン酸でエステル化し得る （ｘｌ）配列：配列番号：ｌ： Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ｇｉｎ（２）配列番号＝２に関する情報： （ｉ）配列の特性： （Ａ）長さ＝１２アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列、Ｎ。

（ｉｎ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメン）・型・Ｃ末端 （ｖｉ　）起源： （Ａ）生物名：　ｌ１ｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ペプチド （Ｂ）存在位置＋１．．１２ （Ｄ）池の情報：／注二“脱硫酸ヒルノンＩＩＶ３のアミノ酸５５−６５　（Ｐ Ａ）　（ＰＣＴ８６１０３４９３号）”（ｉｘ）配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号　修飾部位 （Ｂ）存在位置　１０ （Ｄ）他の情ｔｌｊ　：　／注＝”チロシンは硫酸又はリン酸でエステル化し得 る （ｘｌ）配列、配列番号、２゜ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕｌ　５　１０ （２）配列番号：３に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー２直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（ｉｉ）アンチセンス＋Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：Ｃ末端 （ｖｉ　）起源： （Ａ）生物名：　Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ペプチド （Ｂ、）存在位置：　１．　、１１ （Ｄ）他の情報：／注＝“脱硫酸ヒルジンＰ６のアミノ酸５３−６３（欧州特許 第３４７３７６号）” （ｉｘ）配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号　修飾部位 （Ｂ）存在位置：９ （Ｄ）他の情報、／注＝”チロシンは硫酸又はリン酸でエステル化し得る （ｘｉ）配列：配列番号、３゜ Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　 Ｌｅｕ　５ｅｒ（２）配列番号：４に関する情報。

（ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類　ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｉ）アンチセンス、Ｎｏ （Ｖ）フラグメント型、Ｃ末端 （ｖｉ　）起源。

（Ａ）生物名゛旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（仄）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．１２ （Ｄ）他の情報：／注二“脱硫酸ピルジンＰ１８のアミノ酸５ｌ−６２（欧州特 許第３４７３７６号）” （ｘｉ）配列：配列番号　４８ 八ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇ１ｎ（２）配列番号、５に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ、１６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｕ）配列の種類　ペプチド （ｉｉ）ハイボセティカル配列　Ｎｏ （ｉｉ）アンチセンス　Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：Ｃ末端 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号、ペプチド （Ｂ）存在位置：　１．　、１６ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ペプチド （Ｂ）存在位置：１．．５ （Ｄ）他の情報：／注“合成リンカ−“（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号、領域 ＣＢ）存在位置：　６．　、１６ （Ｄ）他の情報、／注＝“脱硫酸ヒルジンＨＶＩのＣ末端アミノ酸５４−６４″ （ｘｉ）配列：配列番号＝５＝ （２）配列番号、６に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ＝１４アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列　Ｎｏ（ｉｉ）アンチセンス二Ｎａ （ｖ）フラグメント型：Ｃ末端 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号ニドメイン （Ｂ）存在位置：４．．１４ （Ｄ）他の情報：／標識＝ヒルジン ／注＝“ヒルジン（５４−６４）　” （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）池の情報：／注＝”Ｘａａ＝４−アミノ−酪酸”（ｉｘ）配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号：修飾部位 （Ｂ）存在位置、２ （Ｄ）他の情報：／注＝“Ｘａａ＝６−アミノカプロン酸“（ｘｌ）配列、配列 番号・６： Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕｌ　５　１０ （２）配列番号、７に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：５５塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トボロシー二直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセティカル配ダｌＩニ ーＮ０（ｉｉ）アンチセンス、Ｎｏ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）存在位置：１．．２５ （Ｄ）他の情銀：／生物＝“合成的” ／注＝“ニグリンのＣ末端をコードするＤＮＡ”（注）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）存在位置：　２６．　 、５５ （Ｄ）他の情報：／生物＝“合成的” ／注＝“スペーサーをコードするＤＮＡ　”（ｘｉ）配列：配列番号ニア： （２）配列番号、８に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ二６■塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木繊 （Ｄ）、１−ボロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイボセテイカル配列：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （ｉｘ）配列の特徴 （Δ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）存在位置：相補体（１ ，，９） （Ｄ）他の情報：／生物＝“合成的” ／注＝“リンカ−” （飲）配列の特徴： （Ｂ）存在位置：相補体（１０，、１２）（Ｄ）他の情報・／生物＝”合成的” ／′注−゛停止コドン” （ｉｘ　）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）存在位置：相補体（＋ ３．　、　／１５）（Ｄ）他の情ｆｉｔ　：　／生物＝”合成的”／注＝”ヒル ジン（５４−６４）をコードする（−）ＤＮＡ” （ｉｘ　）配列の特徴。

（Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）存在位置：相補体（４ ６，、６１）（Ｄ）他の情報：／生物＝“合成的“ ／注二“スペーサーの最終部分（重複）の（−）　ＤＮＡ　” （ｘｉ）配列：配列番号、８： ＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＴ　ＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴ　ＣＴＣＴ ＴＣＧＡＡＡ　ＴＣＡＣＣＧＴＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣU０ Ｃ６１ （２）配列番号＝９に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Δ）長さ：２７６塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ　）ハイボセテイカル配列＝Ｎ Ｏ（ｉｉｉ）アンチセンス−ＮＯ （ｖｉ）直接の起源： （Ｂ）クローン名：　ｐｐｔ、、　Ｍｕ、ニグリン−ｈｉｒ（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置、１．　、２７６ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“融合蛋白質”（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　特徴（Ｂ）存在位置：１．．２Ｌ３ （Ｄ）他の情報：／生成物＝“ニグリン”（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　特徴（Ｂ）存在位置：　２１４　、　、２ ４０（Ｄ）他の情報、／生成物“スペーサー”（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ｍ１ｓｃ　特徴（Ｂ）存在位置：　２４１　、　、２ ７６（Ｄ）他の情報：／生成物“ヒルジン（５４−６４）“（ｘｉ）配列：配列 番号：９： 八ＴＧ　ＡＣＴ　ＧＭ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＧＭ　ＣＴＧ　ＭＡ　ＴＣＴ 　ＴＴＣＣＣＡ　ＧＭ　ｃＴＴ、ｃＴＴ　ｃｃＴ　４８ＡＡＡ　ＡＣｒ　ＧＴＴ 　ＧＡＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＡＣＴ　ＣＴＧ　ＣＡ Ｔ　ＴＡＣＣＣＧ　ＣＡＧ　９６ＬＹ５　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａ ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇ１ｎＴＡＣＧＡＣＧＴＴ　ＴＡＣＴＴＣＣＴＧ　ＣＣＧ　ＧＭ　ＧＧＴ 　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＧＡＣＣＴＧ　１４４Ｔｙｒ　Ａ ｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐ ｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＬｅｕＣＧＴ　ＴＡＣＡＡＣＣＧＴ　 ＧＴｒ　ＣＧＴ　ＧＴｒ　”ｆＴｃ　ＴＡＣＡＡＣＣＣＡ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　Ａ ＡＣＧＴＴ　ＧＴｒ　１９２Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ 　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ 　Ｖａ１ＭＣＣＡＴ　ＧＴＴ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧ ＣＡＣＴ　ＭＧ　Ｃ；ＧＴ　にＧＣＧＧＴ　ＧにＣＡＡＣ２４０Ａｓｎ　Ｈｉｓ 　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＨＬｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＧＭ　ＧＡ Ｇ　ＡＴＣＣＣＴ　ＧＭ　ＧＡＧ　ＴＡＣＣＴＣＴＡＧ　２７６Ｇｌｙ　Ａｓｐ 　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ （２）配列番号：１０に関する情報： （ｉ）配列の特性 （Ａ）長さ：９１アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：蛋白質 （ｘｌ）配列：配列番号：ｌＯｌ Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ ＬＹ５　Ｔｈｒ　ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　 Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｖ ａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＬｅｕＡｒｇ　Ｔｙｒ　八ｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａ ｌ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　’ｒｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｎ　Ｖａｌ　ＶａP 八ｓｎ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｙ　Ａｓｐ　Ｐ ｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ（２ ）配列番号＝１１に関する情報： （１）配列の特性 （Ａ）長さ：ｌＯアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木組 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｉ）アンチセンス、Ｎｏ （ｖ）フラグメント型：Ｃ末端 （ｖｉ　）起源。

（Ａ）生物名：　Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ（ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号、ペプチド （Ｂ）存在位置：１．、ｌｏ （Ｄ）他の情報：／注二“脱硫酸ヒルジンＨＶＩのアミノ酸５５−６４（欧州特 許第１４２８６０号） （ｘｉ）配列：配列番号、１１： Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕｌ　５　１０ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年ＩＯ月２チ日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｉ式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１及びＲ２は水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキルであるか又は結合してＣ３〜 Ｃ７シクロアルキルを形成し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は同一であっても異なっても よく、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ヒドロキシ、ＯＲ■，ＳＲ■，ハロゲン、Ｎ Ｒ７Ｒ８，ＮＯ２，ＣＮ，ＣＯＮＲ７Ｒ８又はＣＯ２Ｒ９（ここでＲ５はＣ１〜 Ｃ４アルキル又はＣ７〜Ｃ１０アラルキルであり、Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は同一で あっても異なってもよく、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ７〜Ｃ１０アラルキ ルであるか、あるいはＲ７及びＲ８はそれらが結合する窒素原子と一緒に５又は ６員アザシクロアルキル又はオキサザシクロアルキルを形成する）であり；Ａｒ ｇはアルギニン〔ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２ ）−ＣＯ〕であり；ＸはメチンＣＨ又は窒素であり；ｎは０〜７の整数であり： Ｌはペプチドリンカーであり、そしてＨはヒルジンのカルボキシ末端である）の 化合物及びその塩。
2. ２．Ｒ１及びＲ２が各々Ｃ１〜Ｃ４アルキルであり、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５が各々 水素であり；Ａｒｇがアルギニンであり；ＸがメチンＣＨ又は窒素であり；ｎが ０〜７の整数であり；ＬがＣ２〜Ｃ１２−ω−アミノカルボン酸、アラニン、セ リン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、フェニルグリシン又はフェニル アラニンから成る群から選択される３〜６個のアミノ酸を含有するペプチドリン カーであり；そしてＨがヒルジンのアミノ酸５５で始まり、最後の又は最後から ２番目のアミノ酸で終わるヒルジンのカルボキシ末端であって、このようなヒル ジンの脱硫酸化変異体がチロシン硫酸塩残基を含有し、このようなヒルジンの変 異体においてチロシン硫酸塩残基がチロシンリン酸塩残基に置換されるか、ある いはその誘導体において１−３アミノ酸が他のアミノ酸に置換され、誘導体がト ロンビンに対する親和性を保持し；次式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）で示される主領ＩＩが約１８〜約２ ８、特に約２２〜約２６個の原子を含有する請求項１記載のＩ式の化合物及び製 薬上許容可能なその塩。
3. ３．Ｒ１及びＲ２が各々メチルを示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５が各々水素であり； Ａｒｇがアルギニンであり；ＸがメチンＣＨであり；ｎが２であり；ＬがＣ２〜 Ｃ１２−ω−アミノカルボン酸及びアスパラギンから成る群から選択される３〜 ６個のアミノ酸を含有するペプチドリンカーであり；そしてＨがヒルジンＨＶ１ 又はその脱硫酸化変異体のアミノ酸５５で始まり、最後の又は最後から２番目の アミノ酸で終わるヒルジン変異体ＨＶ１のカルボキシ末端であって、；次式：▲ 数式、化学式、表等があります▼ で示される主鎖ＩＩが約２２〜約２６個の原子を含有する請求項１記載のＩ式の 化合物及び製薬上許容可能なその塩。
4. ４．Ｒ１及びＲ２が各々メチルを示し、Ｒ３，Ｒ４及びＲ５が各々水素であり； Ａｒｇがアルギニンであり；ＸがメチンＣＨであり；ｎが２であり；Ｌが６−ア ミノーカプロン酸、４−アミノー酪酸、グリシン及びアスパラギンから成る群か ら選択される３〜６個のアミノ酸を含有するペプチドリンカーであり；そしてＨ がヒルジンＨＶ１のアミノ酸５５で始まり、最後から２番目のアミノ酸で終わる 脱硫酸化ヒルジン変異体ＨＶ１のカルボキシ末端であって、；次式：▲数式、化 学式、表等があります▼ で示される主領ＩＩが約２２〜約２６個の原子を含有する請求項１記載のＩ式の 化合物及び製薬上許容可能なその塩。
5. ５．Ｈが以下の： 【配列があります】（ＩＩＩ，配列番号：１）， 【配列があります】（ＩＶ，配列番 号：２）， 【配列があります】（Ｖ，配列番号： ３），及び 【配列があります】（Ｖｌ，配列 番号：４） （式中、ＺはＴｙｒ，Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）又はＴｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）であり、後 者２つの場合は、チロシンのヒドロキシ基はそれぞれ硫酸及びリン酸でエステル 化され、この場合最後のアミノ酸は存在しなくてもよい）から成る群から選択さ れる請求項１記載のＩ式の化合物。
6. ６．Ｈが 【配列があります】（配列番号：１１）である請求項１記載のＩ式の化合物。
7. ７．遊離基Ｌ−Ｈが 【配列があります】 （ＩＩＩａ．配列番号：５） である請求項１記載のＩ式の化合物。
8. ８．遊離基Ｌ−Ｈが 【配列があります】 （ＩＶａ，配列番号：６） （ここでＧａｂは４−アミノ−酪酸を示し、Ａｃａは６−アミノカプロン酸を示 す） である請求項１記載のＩ式の化合物。
9. ９．請求項１記載の３−（１−（Ｎα−（３−（α，α−ジメチルベンジル）ベ ンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピオ ニル−Ｇａｂ−Ａｃａ−Ａｓｎ−ヒルジン（５４−６４）。
10. １０．請求項１記載の３−（１−（Ｎα−（３−（α，α−ジメチルベンジル） ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピ オニル−（Ｇｌｙ）４−Ａｓｎ−ヒルジンＨＶ１（５４−６４）。
11. １１．請求項１記載の３−（１−（Ｎα−（３−（α，α−ジメチルベンジル） ベンゼンスルホニル）−（Ｓ）−アルギニル）−ピペリド−４−イル）−プロピ オニル−（ＧＩｙ）ａ−Ａｓｎ−ヒルジンＨＶ１（５４−６４）。
12. １２．請求項１記載のＩ式の化合物又は製薬上許容可能なその塩を含有する製剤 組成物。
13. １３．ヒト又は動物の身体の予防又は治療のための方法に用いるための請求項１ 記載のＩ式の化合物又は製薬上許容可能なその塩。
14. １４．請求項１記載のＩ式の化合物又は製薬上許容可能なその塩を上記哺乳類に 投与することを包含する哺乳類におけるトロンビン介在性及びトロンビン関連性 機能に起因する疾患の治療及び予防のための方法。
15. １５．有効量の請求項１記載のＩ式の化合物又は製薬上許容可能なその塩を血液 に付加することを包含する血中のトロンビンの阻害方法。
16. １６．Ｉ式の化合物のアミド結合形成一次断片をＩ式の化合物の二次アミノ結合 形成断片と反応させ、ここで、上記式Ｉの化合物を作るために上記一次断片及び 上記二次断片は、上記一次及び二次断片間にアミド結合が形成されるように互い に相補的であり、上記一次及び二次断片の一方がそれぞれ反応性遊離カルボキシ 基及びスルホニル基、あるいはそれらの反応性カルボン酸又はスルホン酸誘導体 を含有し、そして上記一次及び二次断片の他方が遊離アミノ基又はその反応性誘 導体を含有し、ここで、上記断片中の遊離官能基が、反応に参加する２つの基を 除いて、必要な場合には保護化形態でありそして存在し得る保護基を除去し、所 望により本方法に従って得られる塩を遊離化合物に変換するか、及び／又は本方 法で得られた遊離化合物を塩に変換する工程から成る請求項１記載のＩ式の化合 物の製造方法。
17. １７．以下の： ａ）ヒルジンのカルボキシ末端及び任意にペプチドリンカーを包含する融合蛋白 質のための発現カセットを構築し、ｂ）好適な宿主中で融合蛋白質を発現し、ｃ ）任意にペプチドリンカー（Ｌ）を含有するヒルジン（Ｈ）のカルボキシ末端部 分を融合蛋白質から単離し、ｄ）任意にペプチドリンカー（Ｌ）を含有するヒル ジン（Ｈ）のカルボキシ末端部分のＮ末端をＸＩＩＩ式：▲数式、化学式、表等 があります▼ （式中、残基Ｒ１〜Ｒ５及びｎは請求項１に記載されたものと同様の意味を有す る）の遊離基と結合させるか、あるいはヒルジン断片（Ｈ）のＮ末端をペプチド リンカー（Ｌ）と、そしてその後ＸＩＩＩ式の遊離基と結合させるか、あるいは ペプチドリンカー（Ｌ）をＸＩＩＩ式の遊離基と、そしてその後にヒルジン断片 （Ｈ）のＮ末端と結合させる工程から成る請求項１記載のＩ式の化合物の製造方 法。
18. １８．請求項１６又は１７記載の方法により得られる化合物。