ES2315438T3 - Composicion de inhibidor de metaloproteinasa de tejido quimicamente modificado de tipo tres (timp-3) y procedimientos. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido humano recombinante que presenta parte o la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica que consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido está modificado químicamente.
Description
Composición de inhibidor de metaloproteinasa de
tejido químicamente modificado de tipo tres (TIMP-3)
y procedimientos.
La presente invención se refiere en general a
inhibidores de metaloproteinasa. En particular, la invención se
refiere a los inhibidores de metaloproteinasa de tejido de mamífero
químicamente modificados (denominados en la presente memoria de tipo
tres o "TIMP-3"), y a los fragmentos.
Los tejidos conectivos se mantienen en
equilibrio dinámico mediante los efectos opuestos de síntesis y
degradación de la matriz extracelular. La matriz extracelular del
tejido conectivo está constituida fundamentalmente por colágenos,
con proteoglucanos, fibronectina, laminina y otros componentes
minoritarios que constituyen el resto.
La degradación de la matriz es producida por la
liberación de las metaloproteinasas neutras procedentes de las
células de tejido conectivo residentes y de las células
inflamatorias invasoras que son capaces de degradar a pH
fisiológico la mayoría de las macromoléculas de la matriz. Véase la
Tabla 1, a continuación. Las proteinasas incluyen las colagenasas,
las gelatinasas y las proteoglucanasas del tejido de mamífero; la
leucocito-colagenasas y las gelatinasas (Murphy
et al., Biochem. J. 283: 289-221 (1982);
Hibbs et al., J. Biol. Chem. 260: 2493-2500
(1985)); macrófago-colagenasas y elastasas (Werb
et al. J. Exp. Med. 142: 346-360 (1975);
Banda et al., Biochem. J. 193: 589-605
(1981)); colagenasas tumorales (Liotta et al.,
PNAS-USA 76: 2268-2272 (1979);
Liotta et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98:
124-198 (1981); y Salo et al; J. Biol. Chem.
258: 3058-3063 (1983)). Para un examen general de
las colagenasas y de su papel en el metabolismo normal y patológico
del tejido conectivo véase Collagenase in Normal and Pathological
Connective Tissues, David E. Woolley y John M. Evanson, eds., John
Wiley & Sons Ltd. (1988).
Existen más de cinco tipos diferentes de
colágeno (I, II, III, IV, V, etc.) que están distribuidos de forma
diferente entre los tejidos. Existe una homología considerable y una
similitud estructural entre los diversos tipos de colágeno.
Determinadas cologenasas presentan alguna especificidad para
determinados tipos de colágeno. Véase la Tabla 1, a continuación;
Matrisian, Trends In Genetics 6: 121-125
(1990). Con respecto a la inhibición de las colagenasas y de otras
metaloproteinasas que degradan la matriz, es posible que,
dependiendo de las enzimas, sustratos y mecanismos inhibidores
existentes, un inhibidor pueda actuar en solo una, en varias, o en
todas las colagenasas y metaloproteinasas.
Las metaloproteinasas de matriz se dividen en
tres subclases principales, indicadas con números árabes, basándose
en sus especificidades del sustrato.
Las enzimas de cada clase están en negrita y las
denominaciones alternativas se muestran entre paréntesis. MMP,
metaloproteinasa de matriz; PMN, leucocito polimorfonuclear.
Las bases fundamentales de las enfermedades
degenerativas de los puntos del tejido conectivo con las
metaloproteinasas específicas de la matriz desempeñan un papel
fundamental en la etiología de estas enfermedades. Dichas
enfermedades incluyen epidermólisis vesicular distrófica; artritis
reumatoide; úlcera corneal, epidérmica o gástrica; periodontopatía;
enfisema; osteopatía y metástasis o invasión tumoral.
La mayoría de los estudios sobre degradación del
tejido conectivo y de las enfermedades que implican dicha
degradación han limitado la determinación de las metaloproteinasas a
la colagenasa (la más ampliamente estudiada de este grupo de
metaloproteinasas). Se comprende sin embargo, que los efectos
simultáneos de la colagenasa y de las demás metaloproteinasas que
degradan la matriz agravarán la degradación del tejido conectivo más
de lo que se consigue mediante la colagenasa sola.
Se descubrieron inhibidores naturales
específicos de la colagenasa en medio bruto a partir de tejidos
conectivos cultivados. Se ha estudiado un inhibidor de
metaloproteinasa conocido como TIMP (inhibidor de tejido de
metaloproteinasas) con respecto a las propiedades fisicoquímicas y
a la bioquímica de su interacción con la colagenasa, Murphy et
al., J. Biochem. 195: 167-170 (1981); Cawston
et al., J. Biochem. 211: 313-318 (1983);
Stricklin et al., J. Biol. Chem. 258:
12252-12258 (1983) y se ha aislado el ADN que lo
codifica, Docherty et al., Nature 318: 65-69
(1985); Carmichael et al., PNAS-USA 83:
2407-2411 (1986). En un modelo de cultivo celular
in vitro de migración de la célula tumoral a través de una
membrana basal natural, el TIMP fue capaz de detener la migración
de una línea celular tumoral que segrega colagenasa, Thorgeirsson
et al., J. Natl. Canc. Inst. 69: 1049-1054
(1982). La colonización in vivo del pulmón de ratón por las
células del melanoma B16-F10 murino se inhibió
mediante inyecciones de TIMP, Schultz et al., Cancer
Research 48: 5539-5545 (1988). La publicación de
la patente europea nº EP 0 189 784 también se refiere al TIMP.
McCartney et al., Eur. J. Biochem. 130:
79-83 (1983) describe la purificación de un
inhibidor de metaloproteinasa procedente de leucocitos humanos.
DeClerck et al., Cancer Research 46:
3580-3586 (1986) describe la presencia de dos
inhibidores de colagenasa en el medio acondicionado procedente de
células bovinas endoteliales de aorta.
Murray et al., J. Biol. Chem. 261:
4154-4159 (1986) describe la purificación y la
secuencia parcial de aminoácidos de un inhibidor de colagenasa
procedente del cartílago bovino.
Langley et al., patente EP 0 398 753
("Metalloproteinase Inhibitor", publicada el 22 de noviembre de
1990) da a conocer un nuevo inhibidor de metaloproteinasa y
análogos, los polinucleótidos que codifican los mismos, los
procedimientos de producción, las composiciones farmacéuticas y los
procedimientos de tratamiento. El polipéptido de la Figura 2 en la
presente memoria se denomina TIMP-2, el cual designa
una molécula distinta de TIMP-1, supra. La
patente EP 0 398 753 describe tanto el TIMP-2
recombinante como el humano.
Staskus et al., J. Biol. Chem. 266:
449-454 (1991) describe un inhibidor de
metaloproteinasa aviar de 21 kDa obtenido a partir de fibroblastos
de pollo. Los autores indican las similitudes bioquímicas con otros
componentes del grupo TIMP y TIMP-2 de proteínas y
el estado en que puede estar una variante de TIMP en el material
aviar o puede representar una tercera proteína dentro de la familia
de inhibidores de metaloproteinasa. (Este material se denomina en la
presente memoria "ChIMP-3").
Pavloff et al., J. Biol. Chem. 267:
17321-17326 (1992) da a conocer el ADNc y la
estructura primaria de un inhibidor de proteinasa procedente de los
fibroblastos del embrión de pollo.
Yang et al., PNAS-USA 89:
10676-10680 (1992) describe el papel de un
TIMP-3 de pollo con una proteína de 21 kDa.
El presente trabajo se refiere a un tercer tipo
de polipéptidos inhibidores de metaloproteinasa.
Según la presente invención, se proporciona una
clase de inhibidores de metaloproteinasa para el tejido. Por
comodidad, los presentes polipéptidos se denominan
"TIMP-3", estos polipéptidos representan una
nueva clase de compuestos de los inhibidores de metaloproteinasas
para el tejido.
Específicamente, la presente invención
proporciona un polipéptido humano recombinante que presenta parte o
la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como se ha
expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica que
consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho
polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras
proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido
se encuentra químicamente modificado. La presente invención
proporciona asimismo un kit de diagnóstico para detectar una
correlación entre la ausencia de producción de
TIMP-3 en un espécimen tumoral y su potencial
metastásico que comprende un polipéptido humano recombinante de la
invención y un material de acondicionamiento. Además, está previsto
el Arn antisentido que es complementario a una parte de la secuencia
de ADN que se ha expuesto en la figura 1.
La Figura 1 muestra la secuencia del ADNc y la
secuencia de aminoácidos de un inhibidor de metaloproteinasa de tipo
3 ("TMIP-3") recombinante del tejido humano. Se
presenta la secuencia completa de 1.240 pares de bases que codifica
un polipéptido completo de 211 aminoácidos. Una secuencia principal
hidrófoba se encuentra en la posición -23 a -1. La cisteína inicial
de la proteína madura se encuentra en la posición +1. Los
aminoácidos correspondientes a los oligonucleótidos degenerados que
identifican los productos originales de PCR están subrayados,
excepto que se utilice analíticamente el oligo correspondiente a
YTIK para confirmar la identidad de los productos de PCR antes del
secuenciado. Una zona de glucosilación potencial está en cursiva.
Una secuencia variante con señales de poliadenilación se marca con
asteriscos. (Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria para
los aminoácidos, las abreviaturas de una sola letra o de tres letras
y las de los ácidos nucleicos son las utilizadas normalmente, como
en Stryer, Biochemistry, 3ª ed. 1988, W.H. Freeman, N.Y., en la
contraportada).
La Figura 2 es una fotografía de un gel de
agarosa de los productos de PCR de la primera cadena del ADNc, que
demuestra la ampliación del ácido nucleico humano. La vía 1 presenta
los productos por PCR de la primera cadena del ADNc del riñón del
feto humano cebada con los cebadores 449-15 (SEC ID
nº 1) y 480-27 (SEC ID nº 2). La vía 2 presenta los
resultados de la ampliación por PCR de la primera cadena del ADNc
del riñón del feto cebada con cebadores 449-15 (SEC
ID nº 1) y 480-28 (SEC ID nº 3). La vía 3 es la
referencia con el equipo de PCR
(Perkin-Elmer-Cetus). La vía 4 es el
ADN de TIMP-2 cebado con los cebadores
449-15 (SEC ID nº 1) y 480-27 (SEC
ID nº 2). La vía 5 son los marcadores del peso molecular.
La Figura 3 es una fotografía del material que
contiene gel SDS-PAGE teñido con plata como sigue:
vía 1, marcadores del peso molecular; vía 2, TIMP-2,
reducido; vía 3, blanco; vía 4, E. coli procedente del
TIMP-3 de la Figura 1, reducido, antes de la
diálisis; vía 5, E. coli procedente del
TIMP-3 de la Figura 1, reducido, después de la
diálisis, vías 6, 7, 8, blanco; vía 9, E. coli procedente del
TIMP-3 de la Figura 1, sin reducir, antes de la
diálisis; vía 10, E. coli procedente del
TIMP-3 de la Figura 1, sin reducir, después de la
diálisis.
La Figura 4 es una Tabla de comparación de la
secuencia de aminoácidos del TIMP-3 humano de la
Figura 1 con otros componentes de la familia TIMP. La numeración
empieza en la primera cisteína de la proteína madura. Como se puede
observar, la alineación contiene huecos para algunos componentes de
la familia TIMP. La numeración utilizada en la presente memoria está
de acuerdo con la numeración utilizada para el
TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1. Las
letras en negrita indican los aminoácidos conservados; los
asteriscos representan las zonas de glucosilación potencial de
TIMP-1; las letras subrayadas indican las zonas de
glucosilación potencial de TIMP-3; el corchete
izquierdo indica el comienzo de las proteínas maduras. El punto
(\bullet) indica los aminoácidos que son exclusivos para el
TIMP-3 recombinante humano. Las secuencias de
aminoácidos se encuentran en la bibliografía como sigue:
TIMP-1 bovino, Freudenstein et al., Biochem.
Physic. Res. Comm. 171: 250-256 (1990);
TIMP-1 humano, Docherty et al., Nature 318:
65-69 (1985); TIMP-1 de conejo,
Horowitz et al., J. Biol. Chem. 264:
7092-7095 (1989); TIMP-1 de ratón,
Edwards et al., Nucleic Acid. Res. 14:
8863-8878 (1986); Johnson et al., Mol. Cell.
Biol. 7: 2821-2829 (1978); Gewert et al.,
EMBO 6: 651-657 (1987); TIMP-2
bovino, Boone et al., PNAS-USA 87:
2800-2804 (1990); TIMP-2 humano,
Boone et al., PNAS-USA 87:
2800-2804 (1990); TIMP-2 de ratón,
Shimizu et al., Gene 114: 291-292 (1992);
TIMP-3 de pollo, Pavloff et al., J. Biol.
Chem. 267: 17321-17326 (1992). Excepto que se
indique de otra manera, estas secuencias referidas de vez en cuando
en la presente memoria se encontraron en estas referencias.
La Figura 5 es una Tabla de comparación de la
secuencia de aminoácidos para el inhibidor de metaloproteinasa de
pollo de Staskus et al., J. Biol. Chem. 266:
449-554 (1991) y el TIMP-3
recombinante humano de la Figura 1. Una línea continua entre los
aminoácidos indica identidad, dos puntos indican similitud. Un solo
punto indica un grado menor de similitud y no indica diferencia
total, como describe Grivskov et al., Nucl. Aud. Res. 14:
6745-6763 (1986).
La Figura 6 muestra la homología general entre
la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica a
TIMP-3 y la que codifica a
ChIMP-3.
La Figura 7 muestra la homología máxima entre la
secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica a
TIMP-3 y la que codifica a
ChIMP-3.
La Figura 8 muestra la alineación de la
secuencia de aminoácidos del TIMP-3 recombinante
humano de la Figura 1 y la del TIMP-2 humano.
La Figura 9 muestra la homología general de la
secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 del
TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el
TIMP-2 humano.
La Figura 10 muestra las zonas de homología
máxima de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que
codifica el TIMP-3 recombinante humano y la que
codifica el TIMP-2 humano.
La Figura 11 muestra la alineación de la
secuencia de aminoácidos del TIMP-3 recombinante
humano de la Figura 1 y la del TIMP-1 humano.
La Figura 12 muestra la homología general de la
secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que codifica el
TIMP-3 recombinante humano y la que codifica el
TIMP-1 humano.
La Figura 13 muestra las zonas de homología
máxima de la secuencia del ácido nucleico de la Figura 1 que
codifica el TIMP-3 recombinante humano y la que
codifica el TIMP-1 humano.
Las Figuras 14 A y B muestran los análisis por
transferencia de Northern realizados en el ARNs de una variedad de
células, utilizando un fragmento de ADN del TIMP-3
como sonda.
La Figura 15 muestra un cimograma modificado. La
vía 1 (desde el lado izquierdo) contiene un patrón de peso molecular
de proteína (véase la Figura 3). La vía 2 es una vía de referencia
que contiene medio acondicionado con colagenasas (colagenasas de 72
kDa e intersticiales, activadas con pAPMA). ("Coll" se refiere
a la colagenasa intersticial). La vía 3 contiene
TIMP-2. La vía 4 contiene un análogo de
TIMP-2 que carece de las seis cisteínas
C-terminales. Las vías 5, 6 y 7 contienen E.
coli procedente del TIMP-3 de la Figura 1,
estando la vía 5 sin dividir y siendo las vías 6 y 7 diluciones
dobles en serie consecutivas. Como se puede apreciar, la falta de
una zona clara en la posición en la que la referencia (vía 2)
presenta eliminación indica que TIMP-3 inhibe la
actividad de la colagenasa.
La Figura 16 muestra la secuencia de ADNc y de
aminoácidos de las variantes obtenidas utilizando el presente
procedimiento.
La Figura 17 muestra una ilustración de una
estructura secundaria propuesta de los componentes de la familia
TIMP de proteínas.
Numerosos aspectos y ventajas de la invención se
pondrán de manifiesto para los expertos en la materia considerando
la descripción detallada siguiente que proporciona ilustraciones de
la práctica de la invención en sus formas de realización preferidas
actualmente.
Según la presente invención, son descritos
nuevos inhibidores de metaloproteinasa (denominados en la presente
memoria, en conjunto, TIMP-3) y secuencias de ADN
que codifican todos o parte de dichos TIMP-3. Dichas
secuencias incluyen la incorporación de codones "preferidos"
para la expresión por huéspedes no mamíferos seleccionados; la
provisión de zonas de escisión por los enzimas de restricción
endonucleasas; y la provisión de secuencias adicionales iniciales,
terminales o intermedias de ADN que facilitan la construcción de
vectores expresados fácilmente. Las secuencias de ADN pueden
asimismo codificar análogos de polipéptidos o derivados de
TIMP-3 que se diferencian de las formas naturales
desde el punto de vista de la identidad o de la posición de uno o
más residuos de aminoácido (es decir, análogos de deleción que no
contienen todos los residuos especificados para
TIMP-3; análogos de sustitución, en los que uno o
más residuos especificados están sustituidos por otros residuos; y
análogos de adición en los que se añaden uno o más residuos de
aminoácido a una parte terminal o media del polipéptido) y que
comparten alguna o todas las propiedades biológicas del
TIMP-3 del mamífero.
Las secuencias de ácido nucleico incluyen
secuencias útiles para asegurar la expresión en las células huésped
procarióticas o eucarióticas de los productos del polipéptido que
poseen por lo menos una parte de la conformación estructural
primaria y una o más propiedades biológicas del
TIMP-3 recombinante humano. Los ácidos nucleicos se
pueden purificar y aislar, de modo que la zona de codificación
deseada sea útil, por ejemplo, para producir los presentes
polipéptidos o con fines de diagnóstico, como se describe con más
detalle más adelante. Estas secuencias de ADN comprenden
específicamente: (a) la secuencia de ADN indicada en la Figura 1 (y
las cadenas complementarias); (b) una secuencia de ADN que se
hibrida (en las condiciones de hibridación descritas en el apartado
de identificación del banco de ADNc, en condiciones equivalentes o
en condiciones más limitadas) con la secuencia de ADN de la Figura
1 o con fragmentos de la misma; y (c) una secuencia que se
hibridaría, sólo para la degeneración del código genético, con la
secuencia de ADN de la Figura 1. También se contemplan fragmentos
de (a), (b) ó (c) anteriores que son por lo menos de longitud
suficiente para hibridarse selectivamente con el ADN genómico
humano que codifica TIMP-3, en las condiciones
descritas más adelante para la identificación del banco de ADNc.
Las secuencias del ADN genómico están comprendidas específicamente
en las partes (b) y (c) que codifican formas variantes alelas del
TIMP-3 humano y/o que codifican el
TIMP-3 de otras especies de mamíferos y secuencias
de ADN producidas que codifican el TIMP-3,
fragmentos de TIMP-3 y análogos de
TIMP-3 cuyas secuencias de ADN pueden incorporar
codones que facilitan la transcripción y la traducción del ARN
mensajero en huéspedes microbianos. Dichas secuencias producidas
pueden ser construidas fácilmente según los procedimientos de Alton
et al., solicitud WO 83/04053 publicada por PCT.
El ADN genómico que codifica los presentes
TIMP-3 puede contener bases adicionales no
codificadoras, o intrones, y dichos ADN genómicos se obtienen
hibridando todo o parte del ADNc, ilustrado en las Figuras 1 y 16,
con una fuente de ADN genómico, tal como un banco de ADN genómico
humano. Dicho ADN genómico codificará el polipéptido funcional del
TIMP-3; sin embargo, la utilización de los ADNc
puede ser más práctica porque, como solamente está implicada la zona
de codificación, se facilita la manipulación recombinante.
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria que codifican los polipéptidos de TIMP-3 son
válidas para la información que proporcionan concerniente a la
secuencia de aminoácidos de la proteína del mamífero que no ha
estado disponible anteriormente. Dicho de otra manera, estas
secuencias de ADN son útiles para generar nuevos y útiles vectores
víricos y circulares del ADN del plásmido, nuevas y útiles células
huésped procarióticas y eucarióticas transfectadas (incluyendo
células bacterianas y de levaduras y células de mamíferos
desarrolladas en cultivo) y nuevos y útiles procedimientos para el
desarrollo en cultivo de dichas células huésped capaces de expresión
del TIMP-3 y sus productos relacionados.
El ADN descrito en la presente memoria (o los
ARN correspondientes) se pueden también utilizar para la terapia
génica para, por ejemplo, el tratamiento del enfisema. Por ejemplo,
el ratón transgénico que sobreexpresa la colagenasa presenta
síntomas de enfisema pulmonar, D'Armiento et al., Cell 71:
955-961 (1992), lo que indica que la inhibición de
la colagenasa puede mejorar alguno de los síntomas del enfisema.
Actualmente, los vectores adecuados para la terapia génica (tales
como los vectores retrovíricos o adenovíricos modificados para los
fines de la terapia génica y de pureza y aceptabilidad farmacéutica)
se pueden administrar en el interior del pulmón. Dichos vectores
pueden incorporar el ácido nucleico que codifica los presentes
polipéptidos para la expresión en el pulmón. Además, se puede
utilizar una mezcla de dichos vectores, tal como la que contiene
genes para uno o más TIMP, inhibidores de elastasa u otras proteínas
que mejoren los síntomas del enfisema. La terapia génica puede
implicar un vector que contiene más de un gen para una proteína
deseada.
Por otra parte, no se puede utilizar ningún
vector para facilitar la presencia relativamente estable en el
huésped. Por ejemplo, la recombinación homóloga puede facilitar la
integración dentro de un genoma del huésped. El ácido nucleico se
puede situar dentro de un excipiente farmacéuticamente aceptable
para facilitar la absorción celular, tal como un excipiente de
solución de lípidos (p. ej.: un lípido cargado), un liposoma, o un
excipiente de polipéptido (p. ej.: polilisina). Scientific
American, noviembre de 1990, páginas 68-84, de
Verma, es un artículo de revista sobre terapia génica.
Como se mencionó anteriormente, las células
objetivo pueden estar dentro de los pulmones del receptor, pero
otras células objetivo pueden ser células de la médula ósea, células
de la sangre, células del hígado (o de otros órganos), células
musculares, fibroblastos u otras células. El ácido nucleico deseado
se puede situar en primer lugar dentro de una célula y la célula se
puede administrar a un paciente (tal como un tejido trasplantado) o
se puede administrar el ácido nucleico deseado directamente al
paciente para su absorción in vivo.
Las células que se han de transfectar para el
receptor se pueden cultivar utilizando uno o más factores que
afectan el crecimiento o la proliferación de dichas células, como
por ejemplo, SCF.
La administración del ADN en el pulmón se puede
realizar mediante formación de una dispersión de partículas, o un
aerosol. Típicamente, estará implicado algún tipo de agente de carga
y un excipiente, tal como un lípido o un polipéptido. Estos
materiales deben ser farmacéuticamente aceptables. Se puede utilizar
un nebulizador para dicho suministro, tal como un nebulizador
ultrasónico o de nieve carbónica. Como alternativa, se puede
utilizar un sistema basado en un propelente, tal como un inhalador
de dosificación, que puede suministrar líquido o una suspensión de
partículas.
Para las dosis de terapia génica, se utilizará
generalmente entre una copia y varios centenares de copias del
presente ácido nucleico por célula, dependiendo del vector, del
sistema de expresión, de la edad, del peso y de la enfermedad del
receptor y de otros factores que son evidentes para los expertos en
la materia.
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria son también materiales adecuados para utilizar como sondas
marcadas en el aislamiento del ADN genómico humano que codifica a
TIMP-3, como se mencionó anteriormente, y las
proteínas relacionadas además de las secuencias del ADNc y del ADN
genómico de otra especie de mamífero. Las secuencias de ADN también
pueden ser útiles en varios procedimientos alternativos de síntesis
de proteínas (p. ej.: en las células de insectos) o, como se
describió anteriormente, en la terapia génica en pacientes humanos
y otros mamíferos. Es de esperar que estas secuencias del ADN sean
útiles para desarrollar especies transgénicas de mamíferos que
puedan servir como "huéspedes" eucarióticos para la producción
de TIMP-3 y de productos de TIMP-3
en cantidad. Véase, en general, Palmiter et al., Sciencie
222: 809-814 (1983).
Asimismo, se pueden preparar ácidos nucleicos
con cadena complementaria frente a los ADN descritos en la presente
memoria. Compare, Khokho et al., Science 243:
947-950 (1989), de modo que el inhibidor del ARN
cadena complementaria del TIMP otorgue oncogenicidad en las células
Swiss 3T3. Los ácidos nucleicos con cadena complementaria se pueden
utilizar para modular o evitar la expresión de los ácidos nucleicos
endógenos del TIMP-3.
Los productos de polipéptido de la presente
invención que presentan parte o la totalidad de la conformación
estructural primaria (es decir, la secuencia continua de residuos de
aminoácido) del polipéptido como se ha expuesto en la figura 1
pueden estar purificados y aislados y pueden presentar una o más de
las propiedades biológicas (p. ej.: las propiedades inmunológicas y
la actividad biológica in vitro) y de las propiedades
físicas (p. ej.: el peso molecular) de las variantes alelas de los
mismos que comprenden el TIMP-3 natural del
mamífero. El término "purificado y aislado" en la presente
memoria significa fundamentalmente exento de sustancias superfluas,
de modo que los presentes polipéptidos sean útiles para el fin
pretendido. En particular, se puede tener un TIMP-3
recombinante humano exento fundamentalmente de otras proteínas
humanas o de agentes patológicos. Estos polipéptidos se
caracterizan además por ser el producto de las células del mamífero,
o el producto de procedimientos químicos de síntesis o de la
expresión del huésped procariótico o eucariótico (p. ej.: mediante
células en cultivo bacterianas, de levadura, de plantas superiores,
de insectos y de mamíferos) de secuencias de ADN exógeno obtenidas
por clonación genómica o de ADNc o por síntesis génica. Los
productos de la expresión en la levadura típica (p. ej.:
Saccharomyces cerevisiae) o en las células huésped
procarióticas (p. ej.: E. coli) están exentos de asociación
con cualquiera de las proteínas de mamífero. Los productos de la
expresión en las células de vertebrados (p. ej.: mamíferos no
humanos (p. ej.: COS ó CHO) y aves de corral) están exentos de
asociación con cualquiera de las proteínas humanas. Dependiendo del
huésped empleado, y de otros factores, los polipéptidos de la
invención pueden estar glucosilados con carbohidratos de mamíferos
o de otros eucariotas o pueden estar sin glucosilar. Los
polipéptidos de la invención pueden incluir un residuo inicial del
aminoácido metionina (en la posición -1 con respecto al primer
residuo de aminoácido del polipéptido).
Siguiendo los procedimientos de la solicitud
publicada indicada anteriormente de Alton et al., (documento
WO 83/04053), se puede diseñar y producir fácilmente genes que
codifiquen la expresión microbiana de polipéptidos con
conformaciones primarias que se diferencien de las especificadas en
la presente memoria desde el punto de vista de la identidad o de la
posición de uno o más residuos (p. ej.: sustituciones, adiciones
terminales o intermedias y deleciones). Como alternativa, se pueden
realizar fácilmente modificaciones del ADNc y de los genes
genómicos mediante técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida y
empleadas para generar análogos y derivados de
TIMP-3. Tales productos compartirían por lo menos
una de las propiedades biológicas del TIMP-3 del
mamífero pero se pueden diferenciar en otros. Como ejemplos, los
productos proyectados comprenden los que están reducidos mediante
p. ej.: deleciones; o los que son más estables a la hidrólisis (y,
por consiguiente, pueden tener efectos más pronunciados o de mayor
duración que los naturales); o los que se han alterado al eliminar
una o más zonas potenciales para la glucosilación (que pueden
producir mayores actividades para los productos producidos por
levaduras); o que poseen uno o más residuos de cisteína eliminados o
sustituidos por, p. ej.: residuos de alanina o serina y se aíslan
potencialmente con más facilidad en forma activa a partir de los
sistemas microbianos; o que poseen uno o más residuos de tirosina
sustituidos por fenilalanina o que se unen por lo menos más
fácilmente para dirigirse a proteínas o a receptores en las células
diana. Además están comprendidos los fragmentos de polipéptido que
duplican únicamente una parte de la secuencia continua de
aminoácidos o las conformaciones secundarias dentro del
TIMP-3, cuyos fragmentos pueden poseer una
actividad de TIMP-3 del mamífero (p. ej.: actividad
inmunológica) y no otras (p. ej.: actividad inhibidora de la
metaloproteinasa).
El presente TIMP-3 puede unirse
a la matriz extracelular, característica no compartida por
TIMP-1 y TIMP-2. Por lo tanto, los
polipéptidos que presentan solamente una parte de la secuencia
continua de aminoácidos o de las conformaciones secundarias dentro
del TIMP-3, que poseen la capacidad de unirse a la
matriz extracelular están además contempladas específicamente en la
presente memoria.
Es de destacar que esta actividad no es
necesaria para cualquiera de los productos de la invención u otros
que tengan utilidad terapéutica (véase, Weiland et al., Blut
44: 173-175 (1982) o utilidad en otros contextos,
tales como en pruebas de antagonismo de TIMP-3. Los
antagonistas competitivos pueden ser bastante útiles, por ejemplo,
en casos de sobreproducción de TIMP-3.
De aplicación para los fragmentos de
TIMP-3 y los análogos de la invención son los
informes de actividad inmunológica de los péptidos sintéticos que
duplican sustancialmente la secuencia aminoácidos existente en las
proteínas naturales, glucoproteínas y nucleoproteínas. Más
específicamente, se ha demostrado que los polipéptidos de peso
molecular relativamente bajo participan en reacciones inmunitarias
que son similares en duración y alcance a las reacciones
inmunitarias de las proteínas fisiológicamente importantes tales
como los antígenos víricos, las hormonas de polipéptido y
similares. La provocación de la formación de anticuerpos específicos
en animales inmunológicamente activos está incluida entre las
reacciones inmunitarias de dichos polipéptidos. Véase, p. ej.:
Lerner et al., Cell 23: 309-310 (1981); Ross
et al., Nature 294: 654-656 (1981); Walter
et al., PNAS-USA 77:
5197-5200 (1980); Lerner et al.,
PNAS-USA 78: 3403-3407 (1981);
Walter et al., PNAS-USA 78:
4882-4886 (1981); Wong et al.,
PNAS-USA 79: 5322-5326 (1982);
Baron et al., Cell 28: 395-404 (1982);
Dressman et al., Nature 295: 185-160 (1982);
y Lener, Scientific American 248: 66-74
(1983). Véase, además, Kaiser et al., Sciencie 223:
249-255 (1984) que se refiere a las actividades
biológicas e inmunológicas de péptidos sintéticos que comparten poco
más o menos estructuras secundarias de hormonas peptídicas pero
pueden no compartir su conformación estructural primaria.
Un tipo de análogo es un TIMP-3
truncado con capacidad para unirse al dominio de unión al cinc de la
colagenasa. Por ejemplo, el dominio de unión al cinc en la
colagenasa intersticial está situado en los aminoácidos 218, 222 y
228 en el proenzima. Goldberg, G.I., J. Biol. Chem. 261:
660-6605 (1986). El dominio de unión al cinc de la
especie de procolagenasa de 72 kDa está situado en los aminoácidos
403 a 407. Collier et al., Genomics 9:
429-434 (1991). El dominio de unión al cinc de la
especie de procolagenasa de 92 kDa se encuentra en los aminoácidos
401 a 405. Van Ranst et al., Cytokene 3:
231-239 (1991). De modo interesante, el dominio de
unión al cinc se conserva bastante bien entre las enzimas: H E F G H
(colagenasa de 92 kDa), H E F G H (colagenasa de 72 kDa) y H E L G
H (colagenasa intersticial). Por consiguiente, el motivo para la
unión del cinc es H E X G H en el que X es F ó L. Una molécula de
unión selectiva, tal como un anticuerpo o una molécula pequeña
bloqueraría dicha unión al cinc y por lo tanto inhibiría la
actividad enzimática. (El término "molécula con unión
selectiva" tal como se utiliza en la presente memoria indica una
composición que se une selectivamente a su objetivo). Se puede
preparar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
recombinante.
\newpage
Se han preparado análogos de deleción de
TIMP-2 que han conservado la capacidad de inhibir la
actividad de la metaloproteinasa. Willenbrock et al.,
Biochemistry 32: 4330-4337 (1993). Para
TIMP-2, se acortó el terminal C al eliminar las
cisteínas C-terminales (tres bucles unidos al
disulfuro). Por lo tanto, en vista de la homología entre los
diversos dominios de unión al cinc, se podrían preparar análogos de
TIMP-3 similares con secuencias
C-terminales igualmente acortadas. El análogo
1-121 de TIMP-3 (que utiliza la
numeración de la Figura 1 de la presente memoria) incluye los seis
primeros residuos de cisteína, pero no los seis últimos. Se puede
prolongar opcionalmente el terminal C hasta la molécula completa de
188 aminoácidos. Dichos análogos también se pueden preparar para
cualquier especie, tal como ChIMP-3.
Esto se demuestra además más adelante en los
ejemplos, como una variante de deleción de TIMP-2 se
demuestra que inhibe la colagenasa intersticial. (Ejemplo 3 más
adelante). El dominio de unión al cinc de la colagenasa
intersticial se sitúa de igual forma que el de la colagenasa de la
especie de 72 kDa (lo que fue demostrado por Willenbrock et al.,
supra, que está afectado por los análogos truncados de
TIMP-2).
Además, puesto que es evidente que el terminal C
no es necesario para la actividad de inhibición del enzima, se
puede modificar químicamente el terminal C. Se puede desear, por
ejemplo, una preparación de liberación lenta mediante la cual se
unan una o más moléculas de polímero tales como las moléculas de
polietilenglicol. Otras modificaciones químicas incluyen la unión
de un polipéptido adicional para la creación de una molécula de
fusión. Por lo tanto, la presente invención se refiere al
TIMP-3 químicamente modificado.
Los polipéptidos pueden asimismo ser codificados
por partes del ADN complementario con la cadena de codificación de
la proteína de las secuencias del ADNc humano o del ADN genómico del
TIMP-3 es decir, "proteínas complementarias
invertidas" tal como describe Tramontano et al., Nucleic Acid
Res. >-> 12: 5049-5059 (1984). Los
polipéptidos o sus análogos pueden también contener uno o más
análogos de aminoácido, tales como los peptidomiméticos.
Asimismo están comprendidos en la invención las
composiciones farmacéuticas que se componen de cantidades eficaces
de productos de polipéptidos de la invención junto con diluyentes,
conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o
excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en la terapia de
TIMP-3. Dichas composiciones comprenden diluyentes
con varios contenidos de tampón (p. ej.: Tris-HCl,
acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como
detergentes y agentes solubilizantes (p. ej.: Tween 80, Polisorbato
80), antioxidantes (p. ej.: ácido ascórbico, metabisulfito de
sodio), conservantes (p. ej.: Thimersol, alcohol bencílico) y
cargas (p. ej.: lactosa, manitol); enlace covalente de polímeros,
tal como polietilenglicol, con la proteína (tal como se expuso
supra, véase, por ejemplo la patente U.S. nº 4.179.337);
incorporación del material en las preparaciones en forma de
partículas de los compuestos poliméricos tales como el ácido
poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en los liposomas. Dichas
composiciones influyen en el estado físico, la estabilidad, la
velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación
in vivo de TIMP-3. Véase, p.
ej.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas
ej.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas
\hbox{1435-1712.}
Generalmente, una cantidad eficaz de los
presentes polipéptidos de TIMP-3 estará determinada
por la edad, peso y estado o gravedad de la enfermedad del
receptor. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra,
en las páginas 697-773. Se puede utilizar
típicamente una dosis comprendida entre aproximadamente 0,001 g/kg
de peso corporal y aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, pero se
puede utilizar más o menos, como reconocerá un especialista
experto. Para aplicaciones locales (es decir, no generalizadas), tal
como las aplicaciones tópicas, la dosificación puede estar
comprendida entre aproximadamente 0,001 g/cm^{2} y aproximadamente
1 g/cm^{2}. La dosificación puede hacerse una o más veces al día,
o con menos frecuencia y puede hacerse junto con otras
composiciones como se describe en la presente memoria. Se debe
indicar que la presente invención no se limita a las dosis referidas
en la presente memoria.
Una variedad de agentes actúa conjuntamente para
mantener el equilibrio dinámico de la matriz extracelular y los
tejidos. En el tratamiento de enfermedades en la que el equilibrio
está desviado, se pueden utilizar uno o más de los demás agentes
junto con el presente TIMP-3. Estos otros agentes se
pueden administrar conjuntamente o administrar en serie, o una
combinación de los mismos. En general, estos otros agentes se pueden
seleccionar de entre la lista constituida por las
metaloproteinasas, serina-proteasas, inhibidores de
los enzimas que degradan la matriz, enzimas intracelulares,
moduladores de adhesión celular y factores que regulan la expresión
de las proteinasas que degradan la matriz extracelular y sus
inhibidores. Aunque los ejemplos específicos están relacionados más
adelante, un experto en la materia reconocerá otros agentes que
realizan funciones equivalentes (tales como los producidos
sintéticamente, por técnicas de ADN recombinante y sus análogos y
derivados).
Las metaloproteinasas y las
serina-proteasas degradan la matriz extracelular,
tal como se expuso anteriormente. Por lo tanto, la utilización de
enzimas en terapia puede ser que contrarreste los efectos del
presente TIMP-3 que inhibe dicha degradación. Las
enzimas comprenden colagenasas, PMN (leucocito polimorfonuclear)
colagenasa, estromelisina I, II/transina, matrilisina,
invadolisina, supuesta metaloproteinasa (PUMP-1),
activador de plasminógeno de tipo urocinasa (UPA), activador de
plasminógeno para el tejido (TPA) y plasmina. Se puede utilizar
también PD-ECGF.
Otros inhibidores de degradación se pueden
también utilizar si se desea un aumento o una prevención más
específica de la degradación de la matriz extracelular. Los
inhibidores se pueden seleccionar de entre el grupo constituido por
\alpha_{2}-macroglobulina, proteína de la zona
del embarazo, ovostatina, inhibidor de la
\alpha_{1}-proteinasa,
\alpha_{2}-antiplasmina, aprotinina,
nexin-1 proteasa, inhibidor del activador del
plasminógeno (PAI)-1, PAI-2,
TIMP-1 y TIMP-2. Se pueden utilizar
otros, como reconocerá un experto en la materia.
Además se pueden utilizar enzimas intracelulares
junto con el presente TIMP-3. Los enzimas
intracelulares pueden afectar la degradación de la matriz
extracelular y comprenden enzimas lisosómicas, glucosidasas y
catepsinas.
También se pueden utilizar moduladores de
adhesión celular en combinación con el presente
TIMP-3. Por ejemplo, se puede querer modular la
adhesión celular a la matriz extracelular antes, durante o después
de la inhibición de la degradación de la matriz extracelular
utilizando el presente TIMP-3. Las células que han
presentado adhesión celular a la matriz extracelular comprenden
osteoclastos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, linfocitos T
destructores y mastocitos. Los moduladores de adhesión celular
comprenden los péptidos que contienen un motivo "RGD", análogo,
antagonistas miméticos o agonistas.
Los factores que regulan la expresión de las
prteinasas que degradan la matriz extracelular y sus inhibidores
comprenden las citocinas, tales como IL-1 y
TNF-\alpha, TGF-\beta,
glucocorticoides y retinoides. Además se pueden utilizar otros
factores de crecimiento que efectúan la proliferación celular y/o la
diferenciación si el efecto deseado es inhibir la degradación de la
matriz extracelular utilizando el presente TIMP-3,
junto con dichos efectos celulares. Por ejemplo, durante la
inflamación, se puede desear el mantenimiento de la matriz
extracelular (mediante inhibición de la actividad enzimática)
todavía desear la producción de neutrófilos; por lo tanto se puede
administrar G-CSF. Otros factores comprenden la
eritropoyetina, componentes de la familia de la interleucina,
componentes de las familias SCF, M-CSF,
IGF-I, IGF-II, EGF, FGF, tales como
KGF, PDGF y otros. Se puede desear además la actividad de los
interferones, tales como los interferones alfa, beta, gamma o el
interferón de consenso. Los agentes intracelulares comprenden las
G-proteínas, la proteín-cinasa C y
las inositol fosfatasas. Aunque el campo de investigación de la
inflamación está actualmente en desarrollo, y las interacciones
exactas de las composiciones in vivo descritas no se
comprenden en toda su extensión, la utilización de los presentes
polipéptidos puede proporcionar beneficios terapéuticos con uno o
más agentes implicados en la terapia de la inflamación.
Se pueden utilizar además agentes de tráfico
celular. Por ejemplo, la inflamación implica la degradación de la
matriz extracelular y el movimiento o tráfico de las células a la
zona de la lesión. La prevención de la degradación de la matriz
extracelular puede evitar dicho tráfico celular. La utilización del
presente TIMP-3 junto con agonistas o antagonistas
de los agentes de la modulación del tráfico celular puede ser, por
consiguiente, deseada en el tratamiento de la inflamación. Los
agentes de modulación de tráfico celular se pueden seleccionar de
entre la lista constituida por receptores de la superficie de la
célula endotelial (tales como las E-selectinas y
las integrinas); los receptores de la superficie del leucocito
(L-selectinas); quimiocinas y quimioatrayentes.
Para un examen de las composiciones implicadas en la inflamación,
véase Carlos et al., Immunol. Rev. 114: 5-28
(1990).
Además, las composiciones pueden incluir un
nuevo factor de diferenciación, "NDF", y los procedimientos de
tratamiento pueden incluir la administración de NDF antes,
simultáneamente con, o después de la administración de
TIMP-3. Se ha descubierto que NDF estimula la
producción de TIMP-2, y la combinación de NDF,
TIMP-1, -2 y/o -3 puede proporcionar beneficios en
el tratamiento de los tumores.
Los productos de polipéptido de la invención
pueden estar "marcados" mediante asociación con una sustancia
marcadora detectable (p. ej.: radiomarcada con ^{125}I) para
proporcionar reactivos útiles para la detección y cuantificación de
TIMP-3 en el tejido sólido y en muestras líquidas
tales como sangre u orina. Los productos de ácido nucleico también
pueden estar marcados con marcadores detectables (tales como
radiomarcadores y marcadores no isotópicos tal como la biotina) y
ser empleados en procesos de hibridación para localizar la posición
del gen TIMP-3 humano y/o la posición de cualquier
familia de genes relacionada en un mapa cromosómico. Las secuencias
de ácido nucleico que se unen selectivamente al gen
TIMP-3 humano son útiles para este fin. También se
pueden utilizar para identificar trastornos por el gen
TIMP-3 humano al nivel del ADN y ser utilizados para
identificar los genes del entorno y sus trastornos. En la presente
memoria se contemplan los equipos que contienen dichos materiales
marcados.
Las composiciones de TIMP-3
descritas en la presente memoria modifican la patogénesis y
proporcionan una terapia beneficiosa para las enfermedades de los
tejidos conectivos caracterizadas por la degradación de la matriz.
Además, las presentes composiciones de TIMP-3 pueden
ser útiles en el tratamiento de cualquier trastorno en el que la
actividad de la metaloproteinasa produce la pérdida excesiva de la
matriz. Las composiciones de TIMP-3 se pueden
utilizar solas o junto con uno o más de los agentes expuestos en la
presente memoria.
Los productos de polipéptido de la presente
invención son útiles, solos o en combinación con otros fármacos,
para el tratamiento de varios trastornos tal como la epidermólisis
vesicular distrófica en la que la enfermedad está ligada a la
sobreproducción de colagenasa, Bauer et al., J. Exp. Med.
148: 1378-1387 (1978). Los productos de la presente
invención también pueden ser útiles para el tratamiento de la
artritis reumatoide. Evanson et al., J. Clin. Invest. 47:
2639-2651 (1968) indicaron que el tejido sinovial
reumatoide extirpado produce grandes cantidades de colagenasa, en
cultivo, esto conduce a los estudios de inmunolocalización de
Woolley et al., Arthritis and Rheumatism 20:
1231-1239 (1977), con anticuerpos monoespecíficos
dirigidos contra la colagenasa sinovial reumatoide humana que
detecta grandes cantidades de colagenasa inmunorreactiva en las
zonas de erosión de la articulación (uniones del panículo
cartilaginoso) pero no en el cartílago de los condrocitos asociados
y tampoco en el líquido sinovial en las zonas alejadas del frente
reabsorbente. Las colagenasas también se han manifestado utilizando
muchas otras preparaciones diferentes procedentes de las
articulaciones reumatoides humanas y utilizando tejidos
caracterizados por otros tipos de artritis tales como la
osteoartritis, síndrome de Reiter, pseudogota, artritis reumatoide
juvenil y esclerodermia.
\newpage
En la periodontopatía que afecta el aparato de
soporte del diente, la elevación de los enzimas colagenolíticos es
evidente, así como la destrucción del colágeno y del tejido
conectivo. Véase V.J. Uitto, págs. 211-213 en
Proteinases in Inflammation and Tumor Invasion, H. Tschesche, ed.,
Walter de Gruyter & Co., Berlín, N.Y. (1988).
Las colagenasas han estado implicadas en la
úlcera incluyendo la úlcera corneal, epidérmica o gástrica, Brown
et al., American J. of Ophthalmology 72:
1139-1142 (1971), y, realmente, los inhibidores de
metaloproteinasa se utilizan en el tratamiento de la úlcera
corneal. Slansky et al., Annals of Ophthalmology 2:
488-491 (1970).
En la cicatrización de la herida después de la
intervención quirúrgica, TIMP-3 puede presentar una
aplicación particular para la restenosis. Las metaloproteinasas
contribuyen a la reorganización de las células arteriales,
incluyendo el bloqueo de la arteria. La utilización del presente
TIMP-3 puede inhibir dicha reorganización de la
pared arterial. La administración de ácido nucleico del
TIMP-3 de cadena complementaria puede también
proporcionar beneficios.
En el campo de la invasión y metástasis tumoral,
el potencial metastásico de determinados tumores se correlaciona
con el aumento de capacidad para sintetizar y segregar colagenasas,
Liotta et al., Nature 284: 67-68 (1980) y
con la incapacidad para sintetizar y segregar cantidades importantes
de un inhibidor de metaloproteinasa, Hicks et al., Int. J.
Cancer 33: 835-844 (1984). Estos procesos están
relacionados con el paso de las células tumorales a través de las
capas de tejido conectivo (membrana basal) desde las zonas del
tejido a la circulación y viceversa, que podrían estar retardadas
por el TIMP-3. El TIMP-3 tiene
igualmente aplicación terapéutica para inhibir la diseminación
durante la eliminación de los tumores primarios, durante la
quimioterapia y la terapia de radiación, durante la recolección de
la médula ósea contaminada y durante la derivación de las ascitis
carcinomatosa.
Un factor limitativo en la utilización del
trasplante de médula ósea en muchos cánceres avanzados con
implicación de la médula ósea es la ausencia de técnicas adecuadas
de purga. Por ejemplo, se ha indicado la neumonía intersticial
metastásica seguida de la infusión de las células de médula ósea
purgadas impropiamente, Glorieux et al., Cancer 58:
2136-2139 (1986); Graeve et al., Cancer 62:
2125-2127 (1988). El TIMP-3
administrado durante la infusión de células de médula ósea sin
purgar aliviará la necesidad de desarrollar técnicas costosas de
purga.
Desde el punto de vista del diagnóstico, la
correlación entre la ausencia de producción de
TIMP-3 en una muestra de tumor y su potencial
metastásico sirve como indicador de pronóstico además de un
indicador para la posible terapia de prevención.
Los tumores pueden llegar a estar también más o
menos encapsulados o fibróticos debido al aumento de deposición de
colágeno (o inhibición de la degradación) tanto por las células
cancerosas como por las células normales circundantes. El aumento de
encapsulación favorecido por el TIMP-3 ayuda a la
escisión limpia del tumor.
Otras enfermedades patológicas en las que la
degradación excesiva de colágeno puede desempeñar un papel y por lo
tanto en las que se puede aplicar TIMP-3, comprenden
el enfisema, la osteopatía de Paget, osteoroposis, esclerodermia,
la atrofia ósea o de los tejidos por presión como en las úlceras,
colesteatoma y cicatrización anormal de la herida.
TIMP-3 se puede aplicar además como complemento a
otros promotores de la cicatrización de la herida, p. ej.: para
modular el metabolismo del colágeno durante el proceso de
cicatrización.
TIMP-3 puede presentar además
actividad potenciadora eritroide (es decir, estimulación de la
diferenciación de los primeros progenitores eritroides) y por lo
tanto, TIMP-3 puede servir para el tratamiento de
diversas anemias.
Además TIMP-3 puede tener
aplicación en el tratamiento de trastornos inmunológicos tales como
las enfermedades autoinmunitarias (p. ej.: artritis reumatoide,
esclerosis múltiple) basadas en la capacidad potencial para
suprimir la diferenciación del linfocito B según se determina por el
procedimiento de Pisko et al., J. Inmunol. 136:
2141-2150 (1986).
Basándose en su capacidad para inhibir la
degradación del tejido conectivo, TIMP-3 y/o otras
moléculas de TIMP tienen aplicación en los casos en que la
inhibición de la angiogénesis es útil, p. ej.: al prevenir o
retardar el desarrollo tumoral y en la prevención de la invasión de
parásitos. Además, las presentes composiciones y procedimientos se
pueden aplicar con fines cosméticos, en esta inhibición localizada
de la degradación del tejido conectivo pueden alterar el aspecto del
tejido.
Las presentes composiciones y procedimientos
también pueden servir para el control de la natalidad o en la
modulación de la fertilización ya que se ha demostrado que los TIMP
evitan o retardan la ruptura folicular, Branstrom et al.,
Endocrinology 122: 1715-1721 (1988), e
interfieren en el desarrolo de la preimplantación del embrión.
Las presentes composiciones y procedimientos
pueden ser útiles en el tratamiento de los trastornos de la célula
nerviosa en los que TIMP-3 puede proteger las
células nerviosas del daño evitando que la membrana basal rodee las
células nerviosas. Por consiguiente, las utilizaciones pueden
implicar a BDNF, NT-3, NGF, CNTF, NDF, SCF, u otros
factores de modulación de crecimiento o de proliferación de la
célula nerviosa.
Como se describió anteriormente, el presente
TIMP-3 tiene amplia aplicación en una diversidad de
trastornos. Por lo tanto, otra forma de realización contemplada en
la presente memoria es un equipo que incluye los presentes
polipéptidos y opcionalmente una o más de las composiciones
adicionales descritas anteriormente para el tratamiento de un
trastorno que implica la degradación de la matriz extracelular. Una
forma de realización adicional es un artículo manufacturado que
comprende un material envasado y un agente farmacéutico dentro de
dicho material envasado, en el que dicho agente farmacéutico
contiene el/los presente(s) polipéptido(s) y en el que
dicho material envasado comprende una etiqueta que indica que dicho
agente farmacéutico se puede utilizar para una indicación
seleccionada de entre el grupo constituido por: cáncer, inflamación,
artritis, epidermólisis vesicular distrófica, periodontopatía,
úlcera, enfisema, osteopatías, escleroderma, cicatrización de la
herida, insuficiencias de eritrocitos, reparación del tejido
cosmético, fertilización o modulación del implante del embrión y
trastornos de las neuronas. Este artículo manufacturado puede
incluir opcionalmente otras composiciones o descripciones en la
etiqueta de otras composiciones.
Los ácidos nucleicos descritos en la presente
memoria pueden también ser incorporados como parte de un equipo o
artículo manufacturado. Se contempla un artículo manufacturado que
comprende un material envasado y un agente farmacéutico, en el que
dicho agente farmacéutico contiene dichos ácidos nucleicos y en los
que dicho material envasado se compone de una etiqueta que indica
que dicha composición farmacéutica se puede utilizar para una
indicación que se aprovecha de la modulación de dicha expresión del
ADN, tal como una indicación de la terapia génica. Tales
indicaciones de la terapia génica, expuestas anteriormente, incluyen
el tratamiento del enfisema. Un equipo que contiene el/los
ácido(s) nucleico(s) puede incluir, opcionalmente,
factores adicionales que afectan el crecimiento ex vivo de
las células receptoras, tal como SCF. Véase, p. ej.: Zsebo et
al., PCT WO 91/05795.
Las moléculas de unión selectiva pueden ser
TIMP-3 que se une específicamente a los anticuerpos
monoclonales. La técnica de hibridoma descrita originalmente por
Kohler y Milstein Eur. J. Immunol. 6: 511-519
(1976) ha sido ampliamente aplicada para producir líneas celulares
híbridas que segregan grandes cantidades de anticuerpos
monoclonales contra muchos antígenos específicos. También se pueden
preparar anticuerpos recombinantes, (véase Huse et al.,
Sciencie 246: 1275 (1989)). Dichos anticuerpos se pueden
incorporar, por ejemplo, en un equipo con fines de diagnóstico.
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar
más completamente la invención, pero no se han de considerar como
limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La estrategia global de clonación implicaba dos
etapas, la primera, obteniendo un fragmento que utiliza PCR
procedente de un banco de ADNc de riñón fetal humano, y la segunda,
utilizando este clon parcial para identificar dos bancos diferentes
de ADNc para las secuencias del ADNc completas.
Los cebadores degenerados por PCR procedente de
zonas muy conservadas de la familia del gen de TIMP se utilizaron
para amplificar el ADNc del TIMP-3 a partir del ADNc
del riñón fetal humano. Este producto se utilizó a continuación
como sonda para aislar los clones procedentes de un banco de ADNc
del riñón fetal humano y un banco del ADNc de la mucosa del colon
humano normal. Los clones de 1.240, 963 y 827 bp se han aislado y
secuenciado. El clon más largo codifica el polipéptido completo de
211 aminoácidos, que tiene un polipéptido maduro de 188 aminoácidos.
El clon de tamaño intermedio está truncado pero codifica la
proteína madura completa. El clon más pequeño está perdiendo la
zona que codifica los 24 primeros aminoácidos del polipéptido
maduro. Además se demostró la expresión y purificación del
polipéptido maduro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron cebadores degenerados por PCR en
una primera ronda de identificación de la primera cadena del ADNc
para obtener un clon parcial de ADNc del TIMP-3. Se
seleccionaron los cebadores degenerados por PCR derivados de zonas
muy conservadas de la familia TIMP de proteínas, (véase Figura 4).
Además se escogieron debido a la degeneración relativamente baja de
sus codones.
El cebador delantero procedía de una secuencia
(VIRA) que es ubicua por todas partes de la familia TIMP y se
encuentra en las posiciones 18 a 21 de las proteínas maduras. Este
cebador delantero degenerado 96 veces poseía 11 bases que
codificaron la secuencia de TIMP más 6 bases para una zona
EcoRI y 2 bases extras (subrayadas): SEC ID nº 1 5'-CGG
AAT TCG TNA THM GNG C-3'.
Un cebador inverso correspondiente a la zona
ChIMP-3 (CIWTDM) ha sido sintetizado. Este primero,
480-27, incluye una zona BamHI y dos bases
extra (subrayadas): SEC ID nº 2 5'-CGG GAT CCC ATR TCN GTC
CAD ATR CA-3'.
Se utilizó también un cebador inverso
alternativo:
SEC ID nº 3 480-28 CGG GAT CCR
TCN GTC CAD ATR CA
La zona correspondiente es algo variable. Los
aminoácidos 163 a 168 de ChIMP-3 se codificaron
mediante la versión utilizada en la presente memoria y estos se
seleccionaron debido a que M e I distinguían el
ChIMP-3 de otros TIMP. No se supo al principio si
estas diferencias estarían también presentes en el
TIMP-3 humano (si dicho TIMP existe realmente), no
obstante, se utilizó un sesgo aparte de TIMP-1 y
TIMP-2 para limitar las amplificaciones superfluas.
El M en la posición 168 fue especialmente útil. Como resultado de
esta posición en el extremo 5' del cebador inverso, si esta
selección fuera correcta no debería interferir con el proceso PCR
si estuvieran mal emparejados y ello favorecería la ampliación de
TIMP-3 sobre otros ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
En primer lugar, se utilizaron cebadores
degenerados para ampliar productos de PCR procedentes de las 2
primeras cadenas de ADNc. Después de segunda ronda de ampliación
los productos de PCR de éstas se subclonaron y se seleccionó una
que se utilizó como sonda para los bancos de ADNc, tal como se
describe a continuación.
Síntesis del oligonucleótido. Se
sintetizaron oligonucleótidos en sintetizadores Applied Biosystems
394 automatizados utilizando la química estándar de la
fosforamidita. Se purificaron por extracción con butanol los
oligonucleótidos degenerados, que se sintetizaron en cantidades
mayores de 200 nmoles. Los oligonucleótidos no degenerados se
sintetizaron en cantidades más pequeñas y se purificaron en tritilo
utilizando cartuchos Poly-pak (Glen Research Corp.,
Sterling, VA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La
purificación en tritilo se realizó utilizando columnas de
cromatografía Sephadex G-50 de 1 \times 25 cm y
TEAB como tampón de elución.
Reacción en cadena de polimerasa. Todas
las PCR se realizaron en instrumentos Perkin Elmer modelo 9600
utilizando equipos GeneAmp de Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT)
según las instrucciones del fabricante que se incorporan a la
presente memoria como referencia.
La primera ronda de PCR consistió en 5 ciclos a
94ºC durante 20 segundos, a 50ºC durante 20 segundos y a 72ºC
durante 30 segundos. Esto fue seguido por 30 ciclos a 94ºC durante
20 segundos, a 50ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 30
segundos. Los productos de PCR se introdujeron en gel de agarosa al
2% (SeaKem GTG, FMC, Rockland, ME), teñidos previamente con bromuro
de etidio (Sigma, St. Louis, MO), y se perforaron las bandas en el
intervalo de tamaño predicho del gel utilizando una pipeta Pasteur.
Los productos de PCR se volvieron a ampliar a continuación
directamente a partir de los fragmentos de gel utilizando los mismos
cebadores de PCR y el programa siguiente: 1 ciclo de 5 minutos a
95ºC seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 20 segundos, a 50ºC
durante 20 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Este proceso se
realizó una segunda vez en un intento de obtener grandes cantidades
de material relativamente puro para los análisis de subclonación y
de restricción.
Fuentes de la primera cadena del ADNc. La
primera cadena del ADNc cebada con oligo dT de la mucosa del colon
humano (Dr. Gene Finley, Pittsburgh VA Medical Center) así como la
primera cadena del ADNc cebada con oligo dT procedente del riñón
fetal humano de 22 semanas (Clontech, Palo Alto, CA) se utilizaron
como fuentes en primera ronda del ADNc del TIMP-3.
Cuando se utilizó la fuente de ADNc de la mucosa del colon, se
observó el mismo modelo de bandas que las observadas con los ADNc
de riñón fetal, lo que confirmaba aquellos resultados. Estos
productos de PCR de riñón fetal se utilizaron a continuación para la
subclonación.
Purificación y subclonación de productos de
PCR. Los productos de PCR se pasaron a través de columnas
Centricon-100 (Amicon, Beverly, MA) para facilitar
que el ADN se escinda con las endonucleasas de restricción. El ADN
se cortó a continuación con EcoRI y BamHI para
asegurar que no se escindirían internamente durante el proceso de
clonación. Los productos de PCR se clonaron en pUC19 después del
tratamiento con proteinasa K (Crowe et al., 1991) para
aumentar la eficacia de clonación. Las colonias se detectaron
rápidamente mediante amplificación por PCR con cebadores
382-3 del vector SEC ID nº 4 (5'-GTT
TTC CCA GTC ACG ACG-3') y 382-4 SEC
ID nº 5 (5'-GAA TTG TGA GCG GAT
AAC-3'). Estos productos se purificaron utilizando
concentradores Centricon-100 y se secuenciaron.
Resultados. Como se muestra en la Figura
2 resultaron tres bandas de la ampliación con los cebadores
degenerados. Se secuenció el ADN clonado a partir de dos de las
bandas; la tercera banda no se pudo purificar suficientemente para
permitir la subclonación y el secuenciado.
La más pequeñas de las dos bandas secuenciadas
fue el fragmento de 402 bp deseado y la banda mayor procedía
supuestamente del falso cebado de la zona que codifica CSWYRG
(aminoácidos 169 a 174 del polipéptido maduro de la Figura 1) y fue
de 489 bp. El fragmento de 402 bp corresponde al ácido nucleico que
codifica la zona que abarca ValIleArgAla (Lys) a CysLeuTrpThrAspMet
de la Figura 1, con un EcoRI en el lado 5' y un BamHI
en el lado 3'. Además, el codón para la isoleucina en el extremo 3'
se sustituyó por el codón para la leucina.
\vskip1.000000\baselineskip
Banco. El primer banco cribado fue un
banco de ADNc del riñón fetal humano de 20 y 24 semanas (Clontech)
la Clontech \lambdagt11 cebada con oligo (dT).
Sondas. La primera ronda de cribado del
ADNc se realizó con la inserción de uno de los productos clonados
de PCR degenerados descritos anteriormente, la inserción de 402 bp.
Se observó un nivel más bajo de fondo como resultado de la
contaminación con el ADN del vector pUC19. Por consiguiente, se
utilizó como plantilla de PCR el fago sobrenadante procedente de un
clon \lambdagt11 purificado parcialmente obtenido a partir de la
primera ronda de cribado del ADN. Friedman et al., Nucl. Acids
Res. 17: 8718 (1988). Esto proporcionó una sonda de gran
calidad y pureza. El cebador 495-21, SEC ID nº 6
5'-CGG AAT TCT GGT CTA CAC CAT CAA
GC-3' correspondió aproximadamente al dominio YTIK
e incluía una zona EcoRI y dos bases adicionales. El cebador
496-16, SEC ID nº 7 5'-CAT GTC GGT
CCA GAG ACA CTC G-3', corresponde a la zona CLWTDM y
no incluía ninguna zona de restrición. Esto produjo un fragmento de
333 bp. La secuencia del fragmento de 333 bp fue una parte de la
secuencia del fragmento de 402 bp. El fragmento de 333 bp se utilizó
como sonda para todos los análisis de transferencia de Northern y
para todo el cribado adicional del banco de ADNc. El fragmento de
333 bp corresponde a la zona de la Figura 1 que codifica
TyrThrIleLys a través de CysLeuTrpThrAspMet y de la zona
EcoRI mencionada anteriormente.
Hibridación en placa. Se colocaron en
placas aproximadamente 200.000 fagos en 10 placas de 150 mm,
recogidas por duplicado en membranas soportadas de nitrocelulosa de
Schleicher & Schuell y sondadas con un fragmento de 402 bp
cebado al azar marcado con ^{32}P (Stratagene) descrito
anteriormente. Se realizaron prehibridaciones e hibridaciones
durante toda la noche a 42ºC utilizando los siguientes reactivos
(para 50 ml de solución):
- 12,5 ml
- SSPE 20X
- 5 ml
- NaHPO_{4} 0,5 N pH 6,8
- 0,1 ml
- EDTA 0,50 M pH 8,0
- 25 ml
- formamida
- 2,5 ml
- Denhardt 50X
- 0,25 ml
- SDS al 20%
- 0,5 ml
- 10 mg/ml de ARNt (hígado de ternera)
- 1 ml
- 10 mg/ml de ADN de esperma de salmón (no utilizado en la solución de prehibridación)
- 4,15 ml
- H_{2}O (3,15 ml utilizados en la solución de hibridación).
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavaron los filtros en SSC 0,25X a 42ºC. se
purificaron positivamente las placas de hibridación, produciendo 2
clones independientes denominados aquí Timp3clone7 y Timp3clone2. El
ADN del bacteriófago lambda se purificó utilizando un equipo de
purificación de ADN Qiagen Lambda (Chatsworth, CA). Se agruparon
para cada muestra los lisados en placa procedentes de 10 placas
Petri confluentes de 135 mm. Se añadieron 300 \mul de una
solución que contenía 20 mg/ml de RNasa, 6 mg/ml de DNasa I, 0,2
mg/ml de BSA, EDTA 10 mM, Tris-HCl 100 mM, NaCl 300
mM, pH 7,5 y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Se mezclaron en
NaCl 3 M, 10 ml de polietilenglicol (PEG 6000)al 30% en hielo
frío y se incubaron en hielo durante 60 minutos.
Después de la centrifugación a 10.000 \times
g durante 10 minutos, se descargó el sobrenadante. El
sedimento se volvió a poner en suspensión en 10 ml de una solución
que contenía Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM y EDTA 25
mM, pH 7,5. Se añadió poco a poco 10 ml de una solución que contenía
SDS al 4% y se calentó la mezcla a 70ºC durante 10 minutos y a
continuación se enfrió en hielo. Se mezcló rápidamente 10 ml de
acetato de potasio 2,55 M, pH 4,8 y la solución se centrifugó a 4ºC
a 15.000 \times g durante 30 minutos. El sobrenadante se
introdujo en una columna Qiagen tip-500 que se había
equilibrado con 10 ml de NaCl 750 mM, MOPS 50 mM, etanol al 15%, pH
7,0. Se lavó a continuación la columna con 30 ml de NaCl 1,0 M, MOPS
50 mM, etanol al 15%, pH 7,0. por último, se eluyó la columna con
15 ml de NaCl 1,25 M, MOPS 50 mM, etanol al 15%, pH 8,2. Se
precipitó el eluido en 0,7 volúmenes de isopropanol y se centrifugó
a 4ºC durante 30 minutos. El sedimento se secó con aire durante 5
minutos y se cortó con EcoRI de alta concentración de
Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania).
La inserciones que se han hibridado con la sonda
de 333 bp se purificaron en secciones de gel de agarosa utilizando
un equipo de extracción de ADN Qiaex (Qiagen, Chatsworth, CA). Se
añadió una solución de NaI 3 M, NaClO_{4} 4 M,
Tris-H 5 mM, pH 7,5 con tres veces el volumen de gel
de sílice, junto con 0,1 vez el volumen de la sección de gel de
manitol 1 M y 10 ml de resina Qiaex en un tubo de microcentrifuga de
1,5 ml. Se calentó a 50ºC esta mezcla durante 10 minutos o hasta
que se disolvió completamente la agarosa. Se dejó adsorber el ADN a
temperatura ambiente durante 5 minutos y a continuación se
centrifugaron los tubos brevemente (6 segundos). Después de
descargar los sobrenadantes, se lavó la resina Qiaex en una solución
que contenía NaClO_{4} 8 M y se centrifugó (6 segundos). Este
lavado y centrifugación se repitió y se continuó con 2 lavados (cada
uno seguido de centrifugaciones de 6 segundos) en una solución que
contenía etanol al 70%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM,
EDTA 1 mM, pH 7,5. Se secó la resina con aire y se eluyó en 20
\mul de agua.
Las inserciones purificadas se clonaron en pUC19
(New England Biolabs) utilizando T4 ADN polimerasa de Boehringer
Mannheim. Existía una relación (molar) inserción a vector de
aproximadamente 5:1. Se realizaron ligaduras toda la noche a 14ºC.
El material ligado de precipitó en etanol en presencia de glucógeno
para aumentar la recuperación. Este material se electroporó a
continuación en células DH10B competentes de electroporación de BRL
(Gibco-BRL, Gathersburg, MD).
Se realizaron preparaciones de ADN de plásmido
utilizando el equipo de purificación de ADN de plásmido de Qiagen.
10 ml de un cultivo de toda la noche de una sola colonia bacteriana
se cultivó en caldo estupendo [Tartoff y Hobbs, Bethesda Res.
Lab. Focus 9: 12 (1987). Por cada litro: 12 g de
bacto-triptona, 24 g de estracto de
bacto-levadura, 4 ml de glicerol] con 50 \mug/ml
de ampicilina. El cultivo de toda la noche se utilizó para inocular
250 ml de cultivo en un matraz separador de 1 litro que contenía
caldo estupendo con 50 \mug/ml de ampicilina. Después de esto se
cultivó a saturación, se centrifugó el medio a 5.000 rpm durante 10
minutos. El sedimento bacteriano se volvió a poner en suspensión en
10 ml de 100 \mug/ml de RNasaA, Tris-HCl 50 mM.
Se añadió 10 ml de NaOH 200 mM, SDS al 1% al sedimento resuspendido
y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se
añadió 10 ml de KAc 2,55 M, pH 4,8 y se mezcló poco a poco. Se
centrifugó a 10.000 rpm inmediatamente el material durante 10
minutos. Se filtró el sobrenadante a través de una torunda de gasa
de algodón y el lisado que estaba exento de partículas se añadió a
una columna Qiagen tip-500 siguiendo el mismo
procedimiento que para el procedimiento de preparación del ADN
lambda.
Cribado de un segundo banco de ADNc. Un
banco de ADNc procedente de la mucosa del colon humano, gentilmente
cedida por Jim Pipas de la Universidad de Pittsburgh, fue el segundo
banco cribado para el ADNc del TIMP-3. Este banco
utilizó Uni-Zap (Stratagene, La Jolla, CA) como
vector y presentó un resultado de la valoración de 2,4 \times
10^{10} pfu/ml. La hibridación se realizó como para el banco del
riñón, utilizando la sonda de 333 bp. El vector
Uni-Zap presenta un fago de tamaño medio pBluescript
que fue escindido del fago con el que se hibridaron las sondas y se
secuenció directamente.
Se aislaron las partículas de fago y se
ampliaron de la forma siguiente. Las partículas de fago se liberaron
en el tampón SM incubando durante 2 horas a temperatura ambiente.
En un tubo de ensayo de 50 ml, se mezclaron 200 \mul de células
XL1-Blue D.O._{600} = 1,0 y 200 \mul del fago
lambda Zap con 1 ml del fago cooperador R 408 que tenía un
resultado de valoración de 10^{10} pfu/ml. Esta mezcla se incubó a
37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 3 ml de medio 2xYT (por cada
litro: 16 g de bacto-triptona, 10 g de extracto de
bacto-levadura, 5 g de NaCl) y la mezcla se incubó
a continuación durante 2,5 horas a 37ºC en agitación. Se calentó el
tubo a 70ºC durante 20 minutos y a continuación se centrifugó a
4.000 \times g durante 5 minutos.
Para rescatar el fago de tamaño medio, se
incubaron 50 \mul de la existencia del fago disgregado por calor
con 200 \mul de células XL1-Blue de D.O._{600} =
1,0 en un tubo de 1,5 ml. Además, se incubaron 10 \mul de una
dilución al 10^{-2} de fago disgregado por calor con 200 \mul de
células XL1-Blue de D.O._{600} = 1,0 en un tubo
de 1,5 ml por separado. Los tubos se incubaron a 37ºC durante 15
minutos y a continuación se colocaron en placas con ampicilina LB y
se incubaron toda la noche a 37ºC. Las colonias que aparecieron en
la placa contenían el fago de tamaño medo de doble cadena
pBluescript SK con la inserción del ADN clonada.
Esto dio como resultado la detección de un clon,
denominado en esta memoria "TIMP3HCM3" (véase la Figura 16),
que carece de una parte que codifica el terminal N del polipéptido
maduro.
Todo el secuenciado se realizó con
secuenciadores automatizados 373A de Applied Biosystems, Inc. (ABI).
Los productos de PCR se secuenciaron utilizando cebadores
coloreados con el vector pUC anidados y catalizador de ABI para
realizar las reacciones.
Se secuenciaron los ADNc de doble cadena
clonados en pUC19 utilizando el equipo Prism Ready Reaction
Dye-Deoxy Terminator Cycle Sequencing de ABI
utilizando el protocolo que venía con el equipo. Para las áreas con
alto contenido de GC que conducen a bucles de horquilla, las
reacciones se realizaron con los siguientes cambios en el protocolo
del equipo estándar: desnaturalización a 98ºC durante 30 segundos,
Amplitaq 12 U, sustitución del tampón Vent Polimerasa de New
England Biolabs (NEB) por el tampón TACS de ABI y 30 ciclos en lugar
de 25 ciclos.
Los análisis de ADN y de aminoácidos deducidos
utilizaron el paquete de software para análisis de secuencias
Genetics Computer Group (GCG) del Departamento de Genética de la
Universidad de Wisconsin, Genetic Computer Group, Inc., University
Research Park, 575 Science Drive, Suite B, Madison, Wisconsin
53711.
Se amplió la secuencia de codificación de
Timp3clone7 mediante PCR utilizando el protocolo del equipo
estándar. El cebador 544-29 SEC ID nº 8
(5'-AAC AAA CAT ATG TGC ACA TGC TCG CCC AGC
C-3') consta de los nucleótidos 351 a 369, que
codifica los aminoácidos 24 a 29 de TIMP-3 (1 a 6 de
la proteína madura de la Figura 1). Se incluyeron una zona
NdeI y 6 bases más (subrayadas) para facilitar la
subclonación en un vector de expresión bacteriano. Se añadió el
codón iniciador de metionina (en cursiva) para facilitar la
expresión. El cebador corriente abajo, 532-13, SEC
ID nº 9 (5'-CGG GAT CCT ATT AGG GGT CTG TGG
CAT TGA TG-3') corresponde a los nucleótidos 896 a
914 (de la Figura 1) con una zona BamHI añadida y 2 bases
adicionales (subrayadas) además de dos codones de terminación (en
cursiva). Se cambió el codón de terminación natural, TGA (TCA en la
cadena complementaria opuesta), ya que es una terminación más eficaz
en E. coli. El segundo codón de terminación, TAG, (CTA en la
cadena complementaria opuesta), se añadió como copia de reserva.
El vector pCFM3102, tal como se describe más
adelante, se digirió toda la noche con NdeI y BamHI
aunque era el fragmento de PCR de 589 bp que codifica
TIMP-3. Se detuvo la reacción mediante extracción
con fenol/cloroformo seguida de extracción con cloroformo solo. La
capa acuosa se pasó a continuación a través de una columna rotativa
Sephadex G-50 de 1 ml (en una jeringuilla de 1 ml)
que estaba equilibrada con 200 \mul de Tris-HCl 10
mM, EDTA 1 mM, pH 8,0. El flujo a través de la columna se recogió y
se precipitó con 0,1 volúmenes de NaAc 3 M, pH 5,4 y 2,5 volúmenes
de etanol al 100%. Después de la centrifugación se lavó el sedimento
en etanol al 70% y se secó en un Speed-Vac
(Savant). Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión en 20
\mul de agua Super-Q.
Se realizó una falsa ligadura que contenía
pCFM3102 cortado sin inserción además de la ligadura
TIMP-3::
pCFM3102. Se realizaron ligaduras toda la noche a 14ºC, utilizando T4 ADN ligasa de Boehringer Mannheim. A continuación se precipitaron, se lavaron y se secaron como anteriormente. Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión a continuación en 5 \mul de agua Super-Q. Se utilizaron 2,5 \mul de cada ligadura para electroporar 40 \mul células competentes de electroporación.
pCFM3102. Se realizaron ligaduras toda la noche a 14ºC, utilizando T4 ADN ligasa de Boehringer Mannheim. A continuación se precipitaron, se lavaron y se secaron como anteriormente. Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión a continuación en 5 \mul de agua Super-Q. Se utilizaron 2,5 \mul de cada ligadura para electroporar 40 \mul células competentes de electroporación.
La electroporación del plásmido en E.
coli tuvo lugar en cubetas de 0,1 cm (Bio-Rad) a
1,9 kV, 200 ohmios, 25 \muF utilizando Gen Pulser de
Bio-Rad y con recuperación inmediata en 5 ml de
medio SOC. Se recuperaron las células a 28ºC durante 11,3 horas y
se colocaron sobre placas LB que contenían kanamicina. Las placas
se incubaron a 28ºC toda la noche. Se detectaron las inserciones en
las colonias mediante PCR utilizando cebadores específicos del
vector 315-21 SEC ID nº 10 (5'-ACC
ACT GGC GGT GAT ACT GAG-3') y 315-22
SEC ID nº 11 (5'-GGT CAT TAC TGG ACC GGA
TC-3'). Las colonias con inserciones proporcionaron
productos por PCR procedentes del vector originalsin inserción.
La expresión de la proteína madura se realizó en
E. coli utilizando un vector del plásmido. Un cultivo de
este E. coli, que contiene plásmido que codifica a un
polipéptido maduro tal como se presenta en la Figura 1, se deposita
en el ATCC, nº de registro 69454.
El plásmido utilizado procedía de pCFM836, que
está descrito totalmente en la patente nº 4.710.473.
La construcción para el presente plásmido
(denominada pCFM3102) procedente del plásmido pCFM836 descrito
(patente U.S. nº 4.710.473) era para destruir las dos zonas de
restricción NdeI endógenas, completando el extremo con
enzima T4 polimerasa, seguido de ligadura del extremo romo,
sustituyendo la secuencia del ADN entre las únicas zonas de
restricción AatII y ClaI que contienen el promotor
P_{L} sintético, sustituyendo la secuencia pequeña del ADN entre
las únicas zonas de restricción ClaI y KpnI por un
oligonucleótido que contiene numerosas zonas de restricción y
realizando una serie de cambios de base dirigida por mutagénesis de
oligonucleótido con solape por PCR a través de del vector intermedio
pCFM1656 (4799 pares de bases).
El inóculo para la fermentación se inició
transfiriendo 0,1 ml de una existencia de glicerol a 1 D.O./ml en
LB + glicerol al 17% del registro ATCC nº 69455 (células huésped de
E. coli conteniendo el pCFM3102 con secuencias de
codificación insertadas de TIMP-3) en un matraz de
cuello alto de 2 l conteniendo 500 ml de Luria Broth (10 g/l de
tripticasa-peptona, 10 g/l de extracto de levadura y
y 5 g/l de cloruro de sodio). El cultivo se colocó en un incubador
con plataforma de agitación a 30ºC durante 16 horas a 250 rpm. A
continuación se transfirió el cultivo a 8 litros de medio estérilen
un fermentador BioLafitte de 15 l.
Los 8 litros del medio que se esterilizaron en
su lugar en el fermentador constaban de lo siguiente:
- 10 g/l
- extracto de levadura
- 5,25 g/l
- sulfato de amonio
- 3,5 g/l
- fosfato dibásico de potasio
- 4,0 g/l
- fosfato monobásico de potasio
- 1,25 g/l
- cloruro de sodio
\newpage
Después de esterilizar el medio enfriado a 30ºC,
se añadió lo siguiente:
- 40 g
- glucosa
- 8 g
- sulfato de magnesio heptahidratado
- 16 ml
- solución vestigios de metales^{1}
\vskip1.000000\baselineskip
Se ajustó el pH del medio a pH 7,0 utilizando
ácido fosfórico concentrado. Los demás parámetros de la fermentación
durante esta fase discontinua se ajustaron como sigue:
caudal de aire = 31,0 l/min
agitación = 350 rpm
indicación de oxígeno disuelto fijada en el
60%
caudal de oxígeno = 0
contrapresión = 0,5 bar
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez el cultivo en el recipiente de
fermentación alcanzó una D.O. 600 de 6,0, se puso en marcha una
solución concentrada de glucosa y nitrógeno orgánico utilizando un
programa que aumenta el caudal de alimentación según la D.O. del
cultivo. Esta alimentación concentrada (Alimentación 1) consistía en
lo siguiente:
- 50 g/l
- tripticasa-peptona
- 50 g/l
- extracto de levadura
- 450 g/l
- glucosa
- 8,5 g/l
- magnesio heptahidratado
- 10 ml
- vestigios de solución de metales^{1}
- 10 m/l
- solución de vitaminas^{2}
\vskip1.000000\baselineskip
En el momento de introducir la primera
alimentación en el fermentador, se realizaron los siguientes
cambios:
se aumentó la agitación a 850 rpm
se aumentó la contrapresión a 0,8 bar
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando la alimentación concentrada, se
aumentó la D.O. a 30. En este punto se produjo el cultivo subiendo
la temperatura a 42ºC. Se hicieron otros cambios como sigue:
se disminuyó el caudal de aire a 24 l/min
se aumentó el caudal de oxígeno a 3 l/min
se redujo la alimentación 1 a 0
se inició la alimentación 2 a 300 ml/h
\vskip1.000000\baselineskip
la alimentación 2 consistió en lo siguiente:
200 g/l de
tripticasa-peptona
100 g/l de extracto de levadura
110 g/l de glucosa
\newpage
Después de 4 horas a 42ºC se detuvo la
fermentación y se recogieron las células por centrifugación en
bolsas de plástico que contenían en su interior un frasco de
centrifugadora de 1 litro. La centrifugación fue a 400 rpm durante
60 minutos. Al final de este periodo se separó el sobrenadante y la
pasta de células restante se congeló a -90ºC.
^{1}Solución de vestigios de metales:
- 27 g/l
- FeCl_{3}\cdot6H_{2}O
- 2 g/l
- ZnCl_{2}\cdot4H_{2}O
- 2 g/l
- CaCl_{2}\cdot6H_{2}O
- 2 g/l
- Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O
- 1,9 g/l
- CuSO_{4}\cdot5H_{2}O
- 0,5 g/l
- H_{3}BO_{3}
- 100 ml/l
- HCl concentrado
\vskip1.000000\baselineskip
^{2}Solución de vitaminas:
- 0,42 g/l
- riboflavina
- 5,4 g/l
- ácido pantoténico
- 6 g/l
- niacina
- 1,4 g/l
- hidrocloruro de piridoxina
- 0,06 g/l
- biotina
- 0,04 g/l
- ácido fólico
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de aminoácidos con terminal
NH_{2} de la proteína de TIMP-3 recombinante
procedente de E. coli se determinó que era idéntica a la
secuencia deducida actuación prolongada de los clones de ADNc. Se
escindió el iniciador de metionina procedente de la construcción. No
existió ningún otro tratamiento proteolítico detectado en el
terminal NH_{2} de TIMP-3. No se realizó ninguna
asignación para cys-1 y
cys-2 ya que la muestra de proteína se
redujo y las cisteínas reducidas no se pueden detectar fácilmente
por este procedimiento. Por lo tanto, la lectura de la secuencia es
la siguiente:
X-T-X-S-P-S-H-P-Q-D-A-F-.
\vskip1.000000\baselineskip
El TIMP-3 recombinante
purificado parcialmente presente en cuerpos de inclusión de E.
coli se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y
se transfirió eléctricamente sobre una membrana de PVDF para el
análisis de la secuencia. Se realizó el análisis de los aminoácidos
con terminal NH_{2} en un secuenciador en fase gas (modelo 477,
Applied Biosystems, Foster City, CA) según los protocolos
publicados. Hewick et al., J. Biol. Chem., 256:
2814-2818 (1981). El secuenciador se equipó con un
analizador del aminoácido feniltiohidantoína (PTH) en línea y un
sistema de análisis de datos modelo 900 (Hunkapiller et al.,
Methods of Protein Microcharacterization, Clifton, NJ: págs.
223-247 (1986)). El análisis del aminoácido PTH se
realizaron con un sistema de microcromatografía líquida (modelo
120) utilizando bombas de doble émbolo y fase inversa
(C-18) columnas de diámetro reducido (Applied
Biosystems, Inc.), con las dimensiones de 2,1 mm \times 240
mm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se volvió a poner en suspensión aproximadamente
435 g de peso húmedo de pasta de células de E. coli,
recogidas de la fermentación realizada, en un volumen de 1.760 ml
de agua y y se interrumpió mediante dos pases por un
microfluidizador. El lisado celular se centrifugó a 17.700 \times
g durante 30 min, y la fracción de sedimento se lavó una vez
con agua (mediante resuspensión y recentrifugación). Un parte del
material del sedimento lavado (3,1% del total) se volvió a poner en
suspensión en 10 ml de Tris-HCl 50 mM/ditiotreitol
50 mM/N-lauroilsarcosina de sodio al 2% (p/v), pH 8,5.
Después de la incubación a 50ºC durante 5 min y a temperatura
ambiente durante 3 h, se centrifugó la mezcla a 20.000 \times
g durante 60 min. El sobrenadante se aplicó a una columna de
filtración con gel Sephacryl S-200 (Pharmacia; 2
\times 23 cm) equilibrada en Tris-HCl 20
mM/ditiotreitol 50 mM/N-lauroilsarcosina de sodio al 1% pH
8,0 a temperatura ambiente. Se recogieron fracciones de 1 ml a un
caudal de 5 ml/h y se analizaron por A_{280} y por
SDS/electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Se agruparon las
fracciones 43 a 53 y el conjunto se dializó durante un periodo de 3
días frente a Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), azida de
sodio al 0,02% (p/v), a 4ºC.
La Figura 3 presenta un gel de
SDS-PAGE teñido con plata del producto de expresión
parcialmente purificada procedente de esta fermentación. Las vías 4
y 5 contienen TIMP-3 reducido procedente de E.
coli, antes y después de la diálisis. Las entradas 9 y 10
contienen TIMP-3 no reducido procedente de E.
coli, antes y después de la diálisis. Como se puede apreciar,
el peso molecular aparente para el material reducido es
aproximadamente de 22 kDa.
Como se puede ver en la Figura 3, el rendimiento
después de la diálisis se redujo; el polipéptido parece ser algo
incapaz para la solubilización. En el presente procedimiento, la
presencia de cuerpos de inclusión que contienen material
relativamente insoluble dio como resultado un rendimiento reducido
de TIMP-3 purificado y aislado. Aunque esto dio
como resultado un producto parcialmente purificado, un experto
reconocerá en el acto procedimientos para obtener un polipéptido
purificado y aislado. Por ejemplo, se pueden utilizar diferentes
detergentes como agentes solubilizantes o utilizar un sistema de
expresión diferente, por ejemplo, uno que permita la secreción del
polipéptido (y por lo tanto la eliminación de los cuerpos de
inclusión).
Se intentó también la expresión y purificación
utilizando células eucarióticas (células COS-7), sin
embargo no se observó ningún polipéptido de TIMP-3
recombinante activo. Esto puede haber sido debido a la adherencia
del polipéptido TIMP-3 recombinante para el material
con matriz extracelular producido por las células
COS-7. Una manera posible de obtener la proteína
activa a partir de una célula huésped de mamífero puede ser utilizar
células que sean no adherentes y no producir, por consiguiente,
ninguna cantidad significativa de material con matriz extracelular.
El polipéptido recombinante se encontraría entonces en el medio de
cultivo acondicionado. Por ejemplo, se pueden utilizar células de
Jurkat o células U937 para la expresión del péptido recombinante y
otras células huésped no adherentes y sistemas de expresión serán
evidentes para los expertos en la materia.
\vskip1.000000\baselineskip
El trabajo de la presente memoria presenta la
clonación y expresión de una tercera clase de componentes de la
familia TIMP de mamífero, denominada en la presente memoria en
conjunto "TIMP-3". En la Figura 1 se presenta
a secuencia de nucleótido obtenida a partir de un banco de ADNc de
riñón fetal humano. Como se puede observar, la SEC ID nº 12,
secuencia de ácido nucleico obtenida contiene 1240 pares de bases.
Se presenta también la secuencia de aminoácidos predicha. La SEC ID
nº 13 (secuencia de aminoácidos predicha, ya que no se obtuvo la
secuencia completa del propio polipéptido. Un experto en la materia
puede secuenciar el producto de la expresión de E. coli
depositado en el ATCC, nº de registro 69455). La cisteína inicial
predicha de la proteína madura es el número +1. Esta predicción se
basa en la comparación con otros componentes de la familia TIMP.
La Figura 4 presenta esta comparación entre los
componentes de l familia TIMP. Los puntos (\bullet) indican los
residuos de aminoácido que son únicos para el TIMP-3
de la Figura 1 obtenida a partir de la expresión del ADNc humano y
el tipo en negrita indica los residuos conservados.
Como se puede apreciar, el presente
TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 es
distinto de los demás componentes de la familia TIMP. Mientras
posean los residuos de cisteína conservados y otros aminoácidos
conservados dentro de la familia (39 en total), por lo menos 23
residuos de aminoácido son exclusivos del TIMP-3
recombinante humano ilustrado.
Las Figuras 5 a 13 ilustran las diferencias
entre el presente TIMP-3 recombinante humano de la
Figura 1 y el TIMP-3 del pollo
("ChIMP-3", Figuras 5 a 7), el
TIMP-2 humano (Figuras 8 a 10) y
TIMP-1 humano (Figuras 11 a 13), tanto en las
concentraciones de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Las Figura
contienen una línea continua entre los residuos de aminoácido que
son idénticos y puntos que indican el grado de distancia evolutiva.
(Para las Figuras 5, 8 y 11, que ilustran el alineamiento de
aminoácidos, la numeración de la posición "1" es para el
polipéptido maduro).
Al nivel de aminoácidos, TIMP-3
y ChIMP-3 son aproximadamente el 80% idénticos,
estando los aminoácidos más o memos dispersados continuamente
(Figura 5). La Figura 6 demuestra que, al nivel del ácido nucleico,
en ADN del TIMP-3 de la Figura 1 es aproximadamente
el 74% homóloga con el ADN del ChIMP-3 entre los
ácidos nucleicos 151 a 1087 (TIMP-3) y entre 1 a
886 (ChIMP-3). La Figura 7 demuestra que aún
analizando la zona de máxima analogía, los pares de bases 282 a
1040 del TIMP-3 de la Figura 1 y 113 a 884 para
ChIMP-3, existe aproximadamente el 78% de
identidad.
Las Figuras 8 a 10 ilustran una comparación
entre el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y
el TIMP-2 humano. Tanto al nivel de aminoácido como
al nivel del ácido nucleico existen mayores distinciones que con
ChIMP-3. La Figura 8 demuestra que existe
aproximadamente el 46% de identidad al nivel de aminoácido. La
Figura 9 demuestra que, al nivel de ácido nucleico, la homología
global es aproximadamente el 52% del total y aproximadamente el 60%
en la zona de máxima homología (Figura 10).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las Figuras 11 a 13 ilustran una comparación
entre el TIMP-3 recombinante humano de la Figura 1 y
el TIMP-1 humano. Al nivel de aminoácido, existe
aproximadamente el 39% de identidad (Figura 11) y aproximadamente el
47% de la homología total al nivel del ácido nucleico. Existe
aproximadamente el 65% de identidad en la zona de máxima
homología.
Bioquímicamente, los puntos isoeléctricos
calculados (pI) del polipéptido TIMP-3 maduro y su
precursor son 9,16 y 8,80, respectivamente. Existe una zona de
glucosilación potencial en la secuencia terminal carboxi (184:NAT).
Mientras que el ChIMP-3 natural se señala que no
está glucosilado (Pavloff et al., supra, J. Biol. Chem. 267:
en 17323), no se sabe actualmente si el TIMP-3
humano natural está glucosilado. A pesar de todo, la presente
invención incluye polipéptidos con grupos químicos adicionales,
tales como hidratos de carbono. El principal material hidrófobo de
la Figura 1 tiene una longitud de 23 aminoácidos. El secuenciado del
N-terminal confirmó la identidad de los primeros 12
aminoácidos del polipéptido recombinante maduro.
La clonación y expresión descrita en la presente
memoria demuestra que los presentes polipéptidos de
TIMP-3 representan nuevos componentes en la familia
TIMP.
Se probó la expresión del ARN del
TIMP-3 en una variedad de células (lo que indicaría
la expresión del polipéptido). Los resultados demuestran que entre
las células normales (es decir, no cancerosas), la expresión se
observa en células asociadas a la actividad de kla matriz
extracelular (es decir, crecimiento o degradación). Las células (o
tejidos) normales en los que se observa la expresión del ARN de
TIMP-3 (Figuras 14A y B) son las de la placenta,
célula del estroma, pulmón del embrión, prepucio del recién nacido
(siendo una de cada dos muestras ligeramente positiva) y pulmón del
adulto (ligeramente positiva). Entre las células de cáncer probadas,
algunas fueron positivas, otras fueron negativas. Por ejemplo,
varias líneas celulares de adenocarcinoma de mama dieron resultados
disparatados; uno fue positivo, otro fue negativo, otro fue
ligeramente positivo. Esto puede indicar expresión temporal, porque
la expresión de TIMP-3 puede variar durante el curso
de la evolución de la enfermedad, aunque el significado no está
claro. La Tabla 2, a conti-
nuación, presenta una descripción de las células probadas y de los resultados. A continuación están los procedimientos.
nuación, presenta una descripción de las células probadas y de los resultados. A continuación están los procedimientos.
En muchas de las líneas celulares positivas se
detectaron tres bandas de ARNm de un tamaño aproximado de 2,2, 2,5
y 4,4 kb. Se desconoce el significado de las diferentes bandas de
ARNm pero puede representar corte y empalme alternativo o extendido
a las zonas 3' y 5' no traducidas. Estas pueden ser ARN que
codifican diferentes variantes naturales.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se realizaron dos tipos de transferencia de
Northern, una en transcripciones de ARN y otra utilizando
transcripciones con cola de poli A+.
Preparación de ARN total. Se extrajo de
las células ARN total para la northern de ARN total utilizando una
modificación de un protocolo publicado. (Chomczynski y Sacchi,
Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987).
Se cultivaron las células en cápsulas de Petri
de 2 \times 10 cm (aproximadamente 2 \times 10^{6} células),
se lavaron dos veces con 1\times PBS frío. Después de aspirar todo
el PBS, se añadieron 500 \mul de una solución acuosa que contenía
lo siguiente en cada placa: tiocianato de guanidinio 4 M (Fluka),
citrato de sodio 25 mM pH 7,0 (Mallinckrodt), sarcosyl 0,5% (Sigma,
St. Louis, MO), \beta-mercaptoetanol 0,1 M
(Sigma, St. Louis, MO). Se pipeteó el lisado celular en un tubo de
microcentrífuga Eppendorf de 1,5 ml y se distribuyó con una aguja de
calibre 25.
Se añadió acetato de sodio (pH 4) a los 500
\mul de lisado para preparar una concentración final de 0,2 M. La
mezcla se agitó fuertemente a mano. Se añadió 1/5 de volumen de
cloroformo y se mezcló completamente. Se centrifugaron los tubos a
15.000 rpm durante 5 minutos a 20ºC en una centrífuga Tomy
MTX-100. Se invirtieron los tubos para dejar que la
capa de precipitado blanco se separase de la capa acuosa en lugar de
volver a centrifugar. Se volvió a extraer el ARN con fenol y
cloroformo dos veces más y se se extrajo una última vez con
cloroformo. Se añadió 1 ml de isopropanol al tubo de microcentrífuga
y se precipitó la mezcla a -20ºC toda la noche. Al día siguiente se
centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos. Se lavó el precipitado
con 1 volumen de etanol al 80%, se volvió a centrifugar y se secó
en un Speed Vac (Savant, Farmingdale, NY).
Se volvió a poner en suspensión el sedimento en
400 \mul de la solución d guanidinio que contenía
\beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO). Se
añadieron a la mezcla 800 \mul de etanol, que se centrifugó a
continuación a 15.000 rpm durante 15 minutos y se lavó con etanol
al 80%. Este sedimento se volvió a poner en suspensión en 20 \mul
de agua y se determinó la D.O.
Preparación de ARN de Poli A+. Se preparó
ARN de poli A+ utilizando columnas de fibra de celulosa con oligo
dT de Clontech (Palo Alto, CA). Se lavó a través de las columnas con
2 \times 1 ml de un tampón de alta salinidad
(Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 0,5 M) y
se drenó por gravedad. Se volvió a poner en suspensión el ARN
total, aislado como se describió anteriormente, en 1 ml de tampón de
elución (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM) y se
calentó a 68ºC durante 3 minutos. Se añadieron 0,2 ml de tampón de
muestra (Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 3
M) a la solución de ARN, que se colocó a continuación en hielo.
Se cargaron las muestras en columnas
equilibradas recientemente y se dejó empapar por gravedad. Las
columnas se colocaron dentro de tubos de 50 ml y se centrifugaron a
350 \times g durante 2 minutos. Se descargaron los
eluídos. Se añadió 0,25 ml del tampón de alta salinidad (véase
anteriormente) a cada columna y las columnas se centrifugaron a 350
\times g durante 2 minutos. Este lavado se repitió una vez.
En cada caso se descargaron los eluídos. Se lavaron a continuación
las columnas 3 veces con tampón de baja salinidad
(Tris-HCl 10 mM [pH 7,4], EDTA 1 mM, NaCl 0,1 M) y
se centrifugaron cada vez a 350 \times g durante 2 minutos.
Se descargaron los eluídos en cada caso. Los tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml estériles se colocaron dentro de los tubos
de 50 ml para recoger las eluciones posteriores. Se aplico a las
columnas 0,25 ml de tampón de elución (Tris-HCl 10
mM [pH 7,4], EDTA 1 mM) calentado a 65ºC, los cuales se
centrifugaron a continuación a 350 \times g durante 2
minutos. Este procedimiento se repitió 3 veces durante un total de 4
eluciones por columna. Se recogieron todas las eluciones de cada
columna en un tubo de microcentrífuga. Los eluyentes se precipitaron
con etanol como anteriormente.
Transferencia de Northern. Se cargó 10
\mug de ARN total en cada vía. El tampón de muestra incluía 10
\mul de formamida, 3,5 \mul de formaldehído, 2 \mul de
10\times MOPS, 2 \mul de colorante de carga, 0,2 \mul de
bromuro de etidio y 6,5 \mul de muestra de ARN en agua. La mancha
de ARN con poli A+ tenía 3 \mug de ARNm cargado en cada vía.
Los geles para las transferencias de Northern
consistían en 1,5 g de agarosa mezclada en 95 ml de agua y a
continuación enfriada a 60ºC. Se añadieron 30 ml de 5 x MOPS y 25 ml
de formaldehído (pH 4,7) a la solución de agarosa enfriada. Antes
de transferirlos, los geles se ajustaron para eliminar el exceso de
gel. Se remojaron a continuación en agua destilada durante 5
minutos, seguido de un remojado de 10 minutos en NaOH 50mM, NaCl 10
mM a temperatura ambiente. Se neutralizaron los geles en
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 durante 45 minutos y a
continuación se remojaron con 20X SSC durante 1 hora. La
transferencia tuvo lugar durante toda la noche en 10X SSC. Se
transfirieron los geles sobre membranas de nitrocelulosa de
Schleicher & Scheull (Keene, NH). El gel de ARN total se
transfirió sobre nitrocelulosa pura y se fijó por reticulación UV
utilizando un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). El gel de
poli A+ se transfirió sobre un soporte de nitrocelulosa y se coció
al vacío en un horno durante 2 horas a 80ºC.
Se hibridaron las transferencias de forma
similar al cribado del banco de ADNc. La única diferencia es que
para el análisis de la transferencia de Northern, se utilizaron
reactivos exentos de RNasa dondequiera que fue posible.
DeClerck et al., J. Biol. Chem. 266:
17455-17453 (1991) demostraron que
TIMP-2 se unirá a la colagenasa intersticial
p-APMA activada del fibroblasto de conejo en
complejos que son estables en SDS. El precursor inactivo de 52 kDa
se escindió en una proteína de 42 kDa mediante el organomercurial.
Aunque la proteína activa degrada principalmente el colágeno de los
tipos I, II y III, también degradará la gelatina en menor grado.
El medio acondicionado (CM) de fibroblastos
sinoviales de conejo contiene colagenasa intersticial además de
gelatinasa de tipo IV de 72 kDa. Se incubó el CM en 5 \mul de
Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH
7,5 durante 15 minutos en presencia o ausencia de
TIMP-2 (según el documento EP 0 398 753),
TIMP-2\Delta ó TIMP-3 de la
Figura de 1. Obsérvese que TIMP-2\Delta se refiere
a una forma biológicamente activa truncada de
TIMP-2 con 128 a 194 aminoácidos de la proteína
madura eliminada. Tolley et al., J. Mol. Biol. 229:
1163-1164 (1993); Willenbrock et al.,
Biochemistry 32: 4430-4437 (1993). Se ha
demostrado anteriormente que TIMP-2 interactúa
preferentemente con la procolagenasa de 72 kDa aunque estos
complejos no eran estables en SDS al 0,1% (p/v).
Stetler-Stevenson, J. Biol. Chem., 264:
17374-17378 (1989). El TIMP-3
probado fue el TIMP-3 dializado de la Figura 3.
En ausencia de los TIMP, son visibles 2 zonas de
eliminación cuando se pasan fibroblastos sinoviales de conejo sobre
acrilamida al 10%, gel de gelatina al 0,1%. Figura 15. Una de las
bandas corresponde a la colagenasa intersticialde 42 kDa activada
por pAPMA. Esta eliminación estuvo ausente en presencia de CM
incubado con TIMP-2, TIMP-2\Delta
o el TIMP-3 dela Figura 1. La otra zona de
eliminación no fue afectada, lo que significa que no formó un
complejo estable de SDS con el TIMP. En un experimento aparte
utilizando los presentes procedimientos (datos no mostrados), una
zona de eliminación generada por la colagenasa en medio
acondicionado por células COS-7 no se inhibió por la
presencia de TIMP-2, TIMP-2\Delta
ó TIMP-3.
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 1 se presenta la secuencia de
aminoácidos del TIMP-3 completo. Utilizando la
numeración de la Figura 1, la secuencia completa tiene una longitud
de 188 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos comprendida entre
-23 y -1 es la secuencia principal, y por lo tanto la versión previa
del polipéptido tiene una longitud de 211 aminoácidos.
La zona de codificación del ADN del
TIMP-3 está comprendida entre la posición
1-69 y 564 de la secuencia de ácido nucleico
ilustrada.
Por otra parte, para ambas variantes, se puede
construir una secuencia de péptido con señal para la expresión en
la célula eucariótica. Como se puede observar en la Figura 16, se
han aislado dos clones de ADNc adicionales, TIMP3clone2. SEC ID nº
14 y nº 15 (de registro de ATCC nº 69456) y
TIMP3HCM-3 Sec. ID nº 16, 17 (de registro ATCC nº
69453).Estos clones representan variantes naturales. TIMP3clone2
carece de parte de la zona que codifica el terminal N de la
secuencia principal de TIMP3clone7. Propiamente dicho, esto se
expresaría preferentemente en un procariota, tal como E.
coli. TIMP3HCM-3 carece de una parte de la zona
que codifica el terminal NH_{2} de la proteína madura. Como este
clon carece de la secuencia principal hidrófoba, se expresaría
preferentemente en un procariota, tal como E. coli.
La Figura 16 muestra que existen algunas
diferencias entre los tres clones de ADNc. En el nucleótido 320,
existe una A en TIMP3clone 2 y una T en TIMP3clone 7. Esto
produciría un cambio en la secuencia de aminoácido comprendida
entre trp y arg en la posición 14 de la secuencia
hidrófoba principal. Esta diferencia puede ser un artefacto de
clonación debido a su posición en el extremo 5' de este clon.
ChIMP-3 también presenta un trp en esta
posición. Se puede hallar otra divergencia en la base 529, en la que
el clon 2 tiene una C y los clones 7 y HCM-3 tienen
una T. Este polimorfismo no produce un cambio de aminoácidos porque
tanto CAT como CAC codifican a his. Otros polimorfismos se
encuentran en o cerca de la cola de poli A. La cola de poli A de
HCM-3 está precedida por una única G, mientras que
en los otros 2 clones está precedida por GG. La cola poli A del
clon 7 tiene una longitud de 15 bases y la cola del
HCM-3 tiene una longitud de 18 bases. La cola poli
A del clon 2 de 17 bases de longitud, está interrumpida por otras 3
bases y está seguida de 32 nucleótidos de la secuencia no traducida
5' adicional.
El producto 29 de PCR (TIMP3PCR29 SEC ID nº 18 y
nº 19, véase la Figura 16) se obtuvo también a partir del cribado
del ADNc del riñón fetal humano, utilizando un cebador específico de
inserción y un cebador específico del vector como sigue:
\newpage
SEC ID nº 21 (496-16) (CLWTMD
delantero):
5'-CGG AAT TCT GTC TCT GGA CCG
ACA TGC TCT CC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 20 (489-23)(gt\mu
lambda inversa):
5' GAC ACC AGA CCA ACT GGT AAT G 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede apreciar en la Figura 16, esta
puede representar una variante con terminal C natural. En la Figura
16B, abajo, a 16C, arriba, se indican las diferencias en la
secuencia de aminoácidos entre el TIMP3clone 7 y el TIMP3PCR29. El
TIMP3PCR29, clonado en pUC19 y colocado en E. coli se ha
depositado en el ATCC con el nº de registro 69532. Sin embargo, no
se ha encontrado un clon de ADNc completo que abarca este producto
de PCR en el banco de ADNc de riñón fetal. Se desconoce si
TIMP3PCR29 representa una variante total o parcial o un artefacto de
PCR.
Se pueden preparar otros análogos de
TIMP-3. Un tipo de análogo es una forma truncada que
presenta una unión a la parte de una metaloproteinasa que se une al
cinc. Como se indicó anteriormente, la zona conservada para este
dominio de unión al cinc puede estar representada por H E X G H, en
la que X es F ó L. Por analogía a los análogos de deleción de
TIMP-2 que se han preparado, se pueden preparar
también los análogos de TIMP-3 que mantienen la
actividad de inhibición del enzima.
La Figura 17 es una ilustración de la estructura
secundaria propuesta para la familia TIMP de proteínas. Véase
Alexander et al., Extracellular Matrix Degradation, en Cell
Biology of Extracellular Matix, (2ª ed., Hay, ed.), Plenum Press,
Nueva York, págs, 255-302. Como se puede observar,
las seis cisteínas con terminal C forman una estructura secundaria
que está algo separada de la estructura formada por la zona que
abarca las seis primeras cisteínas. Anteriormente, se ha demostrado
que los análogos de TIMP-2 que carecen del terminal
Cualquier comprenden hasta e incluyen la 6ª cisteína desde el
terminal C, presentan actividad. Willenbrock et al.,
Biochenistry 32: 4330-4337 (1993). Los análogos
de TIMP-3 que carecen de una o más cisteinas con
terminal C son las que presentan la secuencia (referida a la
numeración de la Figura 1) de 1 a 121 y cualquiera comprendida
entre 1 a 122 y 1 a 188. Se pueden también realizar adiciones,
deleciones y sustituciones en los aminoácidos 122 a 188, además de
la unión a grupos químicos, tales como polímeros.
Mientras que la presente invención se ha
descrito desde el punto de vista de las formas de realización
preferidas, se entiende que las variaciones y modificaciones
resultarán evidentes para los expertos en la materia.
\global\parskip0.000000\baselineskip
INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Amgen Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composición de inhibidor de metaloproteinasa de tejido de tipo tres (TIMP-3) y procedimientos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- DESTINATARIO: Amgen Inc./Patent Operations/KMP
\vskip0.800000\baselineskip
- CALLE: 1840 Dehavilland Drive
\vskip0.800000\baselineskip
- CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.800000\baselineskip
- ESTADO: California
\vskip0.800000\baselineskip
- PAÍS: USA
\vskip0.800000\baselineskip
- CÓDIGO POSTAL: 91320-1789
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.800000\baselineskip
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.800000\baselineskip
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.800000\baselineskip
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 1240 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 211 aminoácidos
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 963 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 198 aminoácidos
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 820 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 92 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 164 aminoácidos
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.800000\baselineskip
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.800000\baselineskip
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Polipéptido humano recombinante que presenta
parte o la totalidad de la estructura primaria del polipéptido como
se ha expuesto en la figura 1 y que presenta la propiedad biológica
que consiste en inhibir una metaloproteinasa, en el que dicho
polipéptido recombinante está sustancialmente exento de otras
proteínas humanas o agentes patológicos, y en el que el polipéptido
está modificado químicamente.
2. Polipéptido recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante es el
producto de la expresión eucariótica o procariótica de una secuencia
de ADN exógeno.
3. Polipéptido recombinante según la
reivindicación 2, en el que dicha secuencia de ADN exógeno es
portada sobre un vector plásmido de ADN que se replica de manera
autónoma.
4. Polipéptido recombinante según la
reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante se une a
la secuencia de aminoácidos H E X G X H, en la que X es F ó L.
5. ARN antisentido que es complementario a una
parte de la secuencia de ADN expuesta en la figura 1 y que presenta
la propiedad que consiste en modular o prevenir la expresión de una
metaloproteinasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que están fijadas una o más moléculas de polímero.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el
que una o más de las moléculas de polímero son polietilenglicol.
8. Polipéptido según la reivindicación 1,
modificado químicamente por la fijación de un polipéptido adicional
para la creación de una molécula de fusión.
9. Polipéptido humano recombinante según la
reivindicación 1, para la preparación de una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres avanzados, en
el dicho polipéptido debe ser administrado durante la infusión de
las células de médula ósea no purgadas.
10. Kit de diagnóstico para detectar una
correlación entre la falta de producción de TIMP-3
en un espécimen tumoral y su potencial metastásico que comprende un
polipéptido humano recombinante según la reivindicación 1 y un
material de acondicionamiento.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US134231 | 1987-12-24 | ||
| US08/134,231 US6562596B1 (en) | 1993-10-06 | 1993-10-06 | Tissue inhibitor of metalloproteinase type three (TIMP-3) composition and methods |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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| ES03005363T Expired - Lifetime ES2315438T3 (es) | 1993-10-06 | 1994-10-04 | Composicion de inhibidor de metaloproteinasa de tejido quimicamente modificado de tipo tres (timp-3) y procedimientos. |
Family Applications Before (1)
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|---|---|---|---|
| ES94115578T Expired - Lifetime ES2194852T3 (es) | 1993-10-06 | 1994-10-04 | Inhibidor de metaloproteinasa de tejido de tipo tres (timp-3). |
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