DE69432581T2

DE69432581T2 - Gewebeinhibitor für Metalloproteasen Type 3 (TIMP-3)

Info

Publication number: DE69432581T2
Application number: DE69432581T
Authority: DE
Inventors: Scott M Silbiger; Raymond A. Old Lyme Road Koski
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1993-10-06
Filing date: 1994-10-04
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2014-10-05
Also published as: AU7928194A; US6683155B1; US20060286085A1; EP0648838B1; SI1319669T1; ATE412749T1; US7071317B2; HK1055977A1; DK0648838T3; PT648838E; EP1319669A2; EP2011875A1; SI0648838T1; US7435719B2; ES2315438T3; IL111171A; IL191890A0; IL162152A0; HK1009287A1; US20030143693A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Metalloproteinaseinhibitoren und auf Polynukleotide, die diese Faktoren kodieren. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf neue Säuger-Gewebeinhibitoren der Metalloproteinase (hier bezeichnet als Typ Drei oder "TIMP-3"), auf Fragmente, Derivate oder Analoga davon und auf Polynukleotide, die die gleichen kodieren. In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen.
Hintergrund der Erfindung
Bindegewebe werden in dynamischem Gleichgewicht gehalten durch die gegenteiligen Wirkungen der extrazellulären Matrixsynthese und -abbau. Die extrazelluläre Bindegewebematrix besteht vornehmlich aus Kollagenen, mit Proteoglykanen, Fibronectin, Laminin und anderen kleinen Bestandteilen, die den Rest ausmachen.
Der Abbau der Matrix wird bewerkstelligt durch das Entlassen von neutralen Metalloproteinasen aus angesiedelten Bindegewebszellen und Einwandern entzündlicher Zellen, die in der Lage sind, die meisten der Matrixmakromoleküle bei physiologischem pH abzubauen. Siehe Tabelle 1, nachstehend. Die Proteinasen schließen ein, die Säugergewebekollagenasen, Gelatinasen und Proteoglykanasen; Leukozytenkollagenase und -gelatinase (Murphy et al. Bioch. J. 283: 289–221 (1982); Hibbs et al.; J. Biol. Chem. 260: 2493–2500 (1985)); Makrophagenkollagenase und -elastase (Wert et al. J. Exp. Med. 142: 346–360 (1975); Banda et al., Biochem. J. 193: 589–605 (1981)); und Tumorkollagenasen (Liotta et al., PNAS-USA 76: 2268–2272 (1979); Liotta et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 98: 124–198 (1981); und Salo et al., J. Biol. Chem. 258: 3058–3063 (1983)). Für einen generellen Überblick über Kollagenasen und ihre Rolle in normalem und pathologischem Bindegewebedurchsatz siehe Collagenase in Normal and Pathological Connective Tissues, David E. Woolley und John M. Evanson, Hrsg. John Wiley & Sons Ltd. (1988).
Es gibt über fünf verschiedene Kollagenasetypen (I, II, III, IV, V, etc.), die unterschiedlich in den Geweben verteilt sind. Es gibt eine beachtliche Homologie und strukturelle Ähnlichkeit unter den verschiedenen Kollagenasetypen. Insbesondere zeigen Kollagenasen Spezifität für bestimmte Kollagentypen. Siehe Tabelle 1, nachstehend; Matrisian, Trends In Genetics 6: 121–125 (1990). Im Hinblick auf die Inhibierung von Kollagenasen und anderen Matrixabbauenden Metalloproteinasen ist es möglich, dass, abhängig von den gegenwärtigen Enzymen, Substraten und Inhibitionsmechanismus, ein Inhibitor auf nur eine, auf mehrere oder alle Koliagenasen und Metalloproteinasen wirken kann.
Die grundlegende Basis von degradativen Erkrankungen des Bindegewebes weist auf die Matrix-spezifischen Metalloproteinasen hin, die eine fundamentale Rolle in der Ätiologie dieser Krankheiten spielen. Solche Krankheiten schließen Epidermolysis, rheumatoide Arthritis; Hornhaut, epidermale oder gastritische Ulzeration; parodontale Krankheit, Emphysem; Knochenkrankheit; und Tumormetastase und -Invasion ein.
Die meisten Studien bezüglich Bindegewebsdegradation und Krankheiten, die solche Degradation einschließen, haben die Messung von Metalloproteinasen auf Kollagenase (die am weitest gehend untersuchte aus dieser Gruppe von Metalloproteinasen} beschränkt. Es ist jedoch selbstverständlich, dass die simultane Wirkung von Kollagenase und den anderen Matrix-abbauenden Metalloproteinasen den Abbau des Bindegewebes verschlimmern, verglichen mit dem, der durch Kollagenase alleine erreicht wird.
Spezifische natürliche Inhibitoren der Kollagenase wurden in Rohmedium aus kultivierten Bindegeweben entdeckt. Ein Metalloproteinaseinhibitor, bekannt als TIMP (tissue inhibitor of metalloproteinases) wurde im Hinblick auf physikochemische Eigenschaften und die Biochemie seiner Interaktion mit Kollagenase untersucht, Murphy et al., J. Biochem. 195: 167– 170 (1981); Cawston et al., J. Biochem. 211: 313–318 (1983); Stricklin et al., J. Biol. Chem. 258: 12252–12258 (1983), und DNA, die ihn kodiert, wurde isoliert, Docherty et al., Nature 318: 65–69 (1985); Carmichael et al., PNAS-USA 83: 2407–2411 (1986). In einem in vitro Zellkulturmodell der Tumorzellmigration durch eine natürliche Basismembran war TIMP in der Lage, die Wanderung von Kollagenase-sekretierenden Tumorzelllinien zu arretieren, Thorgeirsson et al., J. Natl. Canc. Inst. 69: 1049–1054 (1982). In vivo Mauslungenkolonisation durch Mäuse B16-F10-Melanomzellen wurde durch Injektionen von TIMP inhibiert, Schultz et al., Cancer Research, 48: 5539–5545 (1988). Die europäische Patentveröffentlichung Nr. EP 0 189 784 betrifft auch TIMP.
McCartney et al., Eur. J. Biochem. 130: 79–83 (1983) berichtete die Reinigung von einem Metalloproteinaseinhibitor aus humanen Leukozyten.
DeClerck et al., Cancer Research 46: 3580–3586 (1986) beschrieb die Anwesenheit von zwei Inhibitoren der Kollagenase in konditioniertem Medium von Rinder endothelialen Aortenzellen.
Murray et al., J. Biol. Chem. 261: 4154–4159 (1986) berichtete die Reinigung und partielle Aminosäuresequenz eines Rinder Knorpel-abgeleiteten Kollagenaseinhibitors.
Langley et al., EP 0 398 753 ("Metalloproteinaseinhibitor", veröffentlicht am 22. November 1990) offenbart einen neuen Metalloproteinaseinhibitor und Analoga, Polynukleotide, die diese kodieren, Verfahren zur Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung. Das Polypeptid in 3 darin wurde als TIMP-2 bezeichnet, was ein Molekül bezeichnet, das verschieden von TIMP-1 ist, oben. EP 0 398 753 beschreibt beides, Rinder und humane Rekombinanten von TIMP-2.
Staskus et al., J. Biol. Chem. 266: 449–454 (1991) beschreibt einen 21 kDa Vogel-Metalloproteinaseinhibitor, der aus Küken-Fibroblasten gewonnen wurde. Die Autoren beobachteten biochemische Ähnlichkeiten mit anderen Mitgliedern der TIMP- und TIMP-2-Gruppen von Proteinen und erklären, dass das Vogel Material eine TIMP-Variante sein kann oder dass es ein drittes Protein in der Metalloproteinaseinhibitorfamilie darstellen kann. (Dieses Material wird hier als "ChIMP-3" bezeichnet).
Pavloff et al., J. Biol. Chem. 267: 17321–17326 (1992) offenbart die cDNA und primäre Struktur des Metalloproteinaseinhibitors aus Kükenembryonen-Fibroblasten.
Yang et al., PNAS-USA 89: 10676–10680 (1992) beschreibt die Rolle eines 21 kDa Küken-TIMP-3-Proteins.
Herron et al., J. Biol. Chem. 261: 2814–2818 (1986) offenbart drei Metalloproteinaseinhibitoren, die durch Kaninchenhirn kapillare endotheliale Zellen hergestellt wurden.
Kishnani et al., FASEB Journal 7, Seite A371, Abstract 2148 (1993) beschreibt die Identifizierung von drei Metalloproteinaseinhibitoren in der extrazellulären Matrix von kultivierten humanen Zellen.
Die vorliegende Arbeit bezieht sich auf einen dritten Typ von Metalloproteinaseinhibitorpolypeptiden. In einem Aspekt schließt die vorliegende Erfindung die Klonierung einer rekombinanten humanen TIMP-3-Nukleinsäure und die Expression davon ein.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Klasse von neuen Gewebeinhibitoren der Metalloproteinase zur Verfügung gestellt. Zur Vereinfachung werden die vorliegenden Polypeptide als 'TIMP-3" bezeichnet, da diese Polypeptide eine neue Klasse von Mitgliedern der Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen darstellen. Ebenso werden DNA-Sequenzen, die für alle oder einen Teil der vorliegenden TIMP-3s kodieren, Vektoren, die solche DNA-Sequenzen enthalten und Wirtszellen, die transformiert oder transfiziert sind, mit solchen Vektoren zur Verfügung gestellt. Ebenso sind von der Erfindung Verfahren zur Herstellung rekombinanter TIMP-3s und Verfahren zur Behandlung von Funktionsstörungen eingeschlossen. Zusätzlich werden pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die TIMP-3s einschließen und Antikörper, die selektiv TIMP-3s bilden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die cDNA-Sequenz und Aminosäuresequenz eines rekombinanten humanen Gewebeinhibitors der Typ 3 Metalloproteinase ("TIMP-3"). Die gesamte 1240 Basenpaarsequenz, die ein Volllängenpolypeptid von 211 Aminosäuren kodiert, ist gezeigt. Eine hydrophobe Leadersequenz wird an Position –23 bis –1 gefunden. Das initiale Cystein des reifen Proteins ist mit +1 nummeriert. Die Aminosäuren, die mit degenerierten Oligonukleotiden korrespondieren, die in der Original-PCR identifiziert wurden, sind unterstrichen, mit der Ausnahme, dass das Oligo, das mit YTIK korrespondiert, analytisch verwendet wurde, um die Identität der PCR-Produkte vor der Sequenzierung zu bestätigen. Eine potentielle Glycosylierungsstelle ist kursiv geschrieben. Eine Varianten-Polyadenylisierungs-Signalsequenz ist mit Sternen markiert. (Die hier verwendeten Abkürzungen für Aminosäuren, entweder Einzelbuchstaben oder drei Buchstabenabkürzungen und Nukleinsäuren sind die, die normalerweise verwendet werden, wie in Stryer, Biochemistry, 3. Ausgabe 1988, W. H. Freeman, N.Y., Innenseite Rückeinband).
2 ist eine Fotografie eines Agarosegels von Erststrang-cDNA PCR-Produkten, die die Amplifikation von humaner Nukleinsäure zeigt. Bahn 1 zeigt PCR-Produkte aus humaner fötaler Nieren Erststrang-cDNA, die mit Primem 449–5 (SEQ ID Nr. 1) und 480–27 (SEQ ID Nr. 2) geprimt wurden. Bahn 2 zeigt die Ergebnisse der PCR-Amplifikation von fötaler Nieren Erststrang-cDNA, die mit Primem 449–15 (SEQ ID Nr. 1) und 480–28 (SEQ ID Nr. 3) geprimt wurde. Bahn 3 ist die PCR-Kit (Perkin-Elmer-Cetus)-Kontrolle. Bahn 4 ist TIMP-2-DNA, geprimt mit Primem 449–15 (SEQ ID Nr. 1) und 480–27 (SEQ ID Nr. 2). Bahn 5 ist ein Molekulargewichtsmarker.
3 ist eine Fotografie eines silbergefärbten SDS-PAGE-Gels, enthaltend das Material wie folgt: Bahn 1, Molekulargewichtsmarker; Bahn 2, TIMP-2, reduziert; Bahn 3, leer; Bahn 4, E. coli-abgeleitetes TIMP-3 aus 1, reduziert, vordialysiert; Bahn 5, E. coli-abgeleitetes TIMP-3 aus 1, reduziert, nach Dialyse, Bahnen 6, 7, 8 leer; Bahn 9, E. coli-abgeleitetes TIMP-3 aus 1, nicht reduziert, vordialysiert; Bahn 10, E. coli-abgeleitetes TIMP-3 aus 1, nicht reduziert, nach Dialyse.
4 ist eine Vergleichstabelle der humanen TIMP-3-Aminosäuresequenz aus 1 mit anderen TIMP-Familienmitgliedern. Die Nummerierung beginnt mit dem ersten Cystein des reifen Proteins. Wie man sehen kann, enthält der Abgleich Lücken für einige TIMP-Familienmitglieder. Die hier verwendete Nummerierung stimmt mit der Nummerierung, die für das rekombinante humane TIMP-3 aus 1 verwendet wurde, überein. Fettgeschriebene Buchstaben zeigen konservierte Aminosäuren an; Stirne repräsentieren potentielle Glycosylierungsstellen von TIMP-1; unterstrichene Buchstaben zeigen potentielle Glycosylierungsstellen von TIMP-3 an; die linke Klammer zeigt den Anfang des reiften Proteins an. Eine Kugel (•) zeigt die Aminosäuren an, die im rekembinanten humanen TIMP-3 einzigartig sind. Die Aminosäuresequenzen wurden in der Literatur wie folgt gefunden: Rinder TIMP-1, Freudenstein at al., Biochem. Fhysic. Res. Comm. 171: 250–256 (1990); humanes TIMP-1, Docherty et al., Nature 318: 65–69 (1985); Kaninchen-TIMP-1, Horowitz et al., J. Biol. Chem. 264: 7092–7095 (1989); Maus TIMP-1, Edwards et al., Nucieic Acid. Res. 14: 8863–8878 (1986); Johnson et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2821–2829 (1978); Gewert et al., EMBO 6: 651–657 (1987); Rinder TIMP-2, Boone et al., PNAS-USA 87: 2800– 2804 (1990); Humanes TIMP-2, Boone et al., PNAS-USA 87: 2800–2804 (1990); Maus-TIMP-2, Shimizu et al., Gene 114: 291–292 (1992); Hühner-TIMP-3, Pavloff et al., J. Biol. Chem. 267: 17321–17326 (1992). Wenn nicht anderweitig angezeigt, werden diese Sequenzen, auf die von Zeit zu Zeit hier verwiesen wird, in diesen Referenzen gefunden.
5 ist eine Vergleichstabelle der Aminosäuresequenz für den Hühner-Metalloproteinaseinhibitor von Staskus et al., J. Biol. Chem. 266: 449–454 (1991) und dem rekombinanten humanen TIMP-3 aus 1. Eine durchgezogene Linie zwischen Aminosäuren zeigt Identität an, Doppelpunkte zeigen Ähnlichkeit. Ein Einzelpunkt zeigt einen geringeren Grad der Ähnlichkeit an und kein Punkt zeigt vollständige Abweichung, wie beschrieben von Grivskov et al., Nucl. Aud. Res. 14: 6745–6763 (1986).
6 zeigt die Gesamthomologie zwischen der 1 Nukleinsäuresequenz, die TIMP-3 kodiert und der, die ChIMP-3 kodiert.
7 zeigt die maximale Homologie zwischen der 1 Nukleinsäuresequenz, die TIMP-3 kodiert und der, die ChIMP-3 kodiert.
8 zeigt den Aminosäuresequenz-Abgleich von humanem rekombinantem TIMP-3 aus 1 und humanem TIMP-2.
9 zeigt die Gesamthomologie der 1 Nukleinsäuresequenz von humanem rekombinantem TIMP-3 und der, die für humanes TIMP-2 kodiert.
10 zeigt die maximalen Homologie-Regionen der 1 Nukleinsäuresequenz, die humanes rakombinantes TIMP-3 kodiert und der, die humanes TIMP-2 kodiert.
11 zeigt den Aminosäuresequenz-Abgleich von humanem rekombinantem TIMP-3 aus 1 und humanem TIMP-1.
12 zeigt die Gesamthomologie der 1 Nukleinsäurasequenz, die humanes rekombinantes TIMP-3 kodiert und der, die humanes TIMP-1 kodiert.
13 zeigt die maximalen Homologie-Regionen der 1 Nukleinsäuresequenz, die humanes rekombinantes TIMP-3 kodiert und der, die humanes TIMP-1 kodiert.
14A und B zeigen Northern Blot-Analysen, die mit RNAs von verschiedenen Zellen durchgeführt wurden, unter Verwendung von einem TIMP-3-DNA-Fragment als Sonde.
15 zeigt ein modifiziertes Zymogramm. Bahn 1 (von links) enthält einen Proteinmolekulargewichtsstandard (siehe 3). Bahn 2 ist eine Kontrollbahn, die konditioniertes Medium mit Kollagenasen (72 kDa und interstitielle Kollagenasen, pAPMA-aktiviert) enthält. ("Colt" bezieht sich auf interstitielle Kollagenase). Bahn 3 enthält TIMP-2. Bahn 4 enthält ein TIMP-2-Analog, dem die sechs C-terminalen Cysteine fehlen. Bahnen 5, 6 und 7 enthalten E. coli-abgeleitetes TIMP-3 aus 1, Bahn 5 ist unverdünnt und Bahn 6 und 7 sind aufeinanderfolgende, zweifach serielle Verdünnungen. Wie man sehen kann, zeigte das Fehlen einer klaren Zone an dem Ort, wo die Kontrolle (Bahn 2) Aufklärung zeigte, das TIMP-3-Kollagenaseaktivität inhibiert.
16 zeigt die cDNA und Aminosäuresequenz von Varianten, die unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens gewonnen wurden.
17 zeigt eine Darstellung einer vorgeschlagenen Sekundärstruktur von Mitgliedern der TIMP-Familie von Proteinen.
Zahlreiche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann nach Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung klar sein, die Darstellungen der Praxis der Erfindung in ihren derzeit bevorzugten Ausführungsformen zur Verfügung stellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue Metalloproteinaseinhibitoren (hier kollektiv TIMP-3 genannt) und DNA-Sequenzen, die für alle oder einen Teil solcher TIMP-3 kodieren, zur Verfügung gestellt. Solche Sequenzen schließen den Einbau von Kodons, "bevorzugt" für die Expression durch ausgewählte Nichtsäugerwirte, ein; die Zur-Verfügung-Stellung von Stellen zur Spaltung durch Restriktionsendonukieaseenzyme; und die Zur-Verfügung-Stel-lung von zusätzlichen initialen, terminal- oder intermediärer DNA-Sequenzen, die die Konstruktion von fertig exprimierten Vektoren erleichtern. Die vorliegende Erfindung stellt auch DNA-Sequenzen, die für Polypeptidanaloga oder Derivate von TIMP-3 kodieren, zur Verfügung, die sich von natürlich vorkommenden Formen bezüglich der Identität oder dem Ort von einem oder mehreren Aminosäureresten unterscheiden (d. h. Deletionsanaloga, die weniger als alle der Reste, die für TIMP-3 spezifiziert sind, enthalten; Substitutionsanaloga, in denen ein oder mehrere spezifizierte Reste durch andere Reste ersetzt sind; und Additionsanaloga, in denen ein oder mehrere spezifizierte Reste dem terminalen oder medialen Teil des Polypeptids hinzugefügt sind) und die einige oder alle der biologischen Eigenschaften von Säu ger-TIMP-3 teilen.
Die erfindungsgemäßen neuen Nukleinsäuresequenzen schließen Sequenzen ein, die nützlich zur Sicherung der Expression von Polypeptidprodukten in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen, die wenigstens einen Teil der primärstrukturellen Konformation und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften von rekombinantem humanem TIMP-3 besitzen, sind. Die Nukleinsäuren können gereinigt und isoliert werden, so dass die gewünschte kodierende Region, zum Beispiel zur Herstellung der vorliegenden Polypeptide oder für diagnostische Zwecke nützlich ist, wie vollständiger nachstehend beschrieben. Die DNA-Sequenzen der Erfindung umfassen speziell: (a) die DNA-Sequenz, wie in 1 dargestellt (und komplementäre Stränge); (b) eine DNA-Sequenz, die hybridisiert (unter Hybridisierungsbedingungen, die in dem cDNA-Bibliothek Screening-Abschnitt nachstehend offenbart sind, oder äquivalente Bedingungen oder stringentere Bedingungen) mit der DNA- Sequenz aus 1 oder mit Fragmenten davon; und (c) eine DNA-Sequenz, die trotz der Degeneration des genetischen Codes an die DNA-Sequenz in 1 hybridisieren würde. Auch werden Fragmente von (a), (b) oder (c) oben, die wenigstens lang genug sind, um selektiv an humane genomische DNA, die TIMP-3 kodiert, zu hybridisieren, unter Bedingungen, die für das cDNA-Bibliothek Screening nachstehend beschrieben sind, in Erwägung gezogen. Besonders eingeschlossen in Teile (b) und (c) sind genomische DNA-Sequenzen, die allelische variante Formen von humanem TIMP-3 kodieren und/oder TIMP-3 von anderen Säugerspezies kodieren und hergestellte DNA-Sequenzen, die TIMP-3 kodieren, Fragmente von TIMP-3 und Analoga von TIMP-3, deren DNA-Sequenzen Kodons einschließen, die Transkription und Translation von Messenger-RNA in mikrobiellen Wirten erleichtern. Solche hergestellten Sequenzen können leicht konstruiert werden gemäß den Verfahren von Alton et al., PCT, veröffentlichte Anmeldung WO 83/04053.
Die genomische DNA, die die vorliegenden TIMP-3s kodier, kann zusätzliche nichtkodierende Basen enthalten oder Introns und diese genomischen DNAs sind erhältlich durch Hybridisierung der ganzen oder eines Teils der cDNA, dargestellt in 1 und 16, an eine genomische DNA-Quelle, wie eine genomische DNA-Bibliothek. Diese genomische DNA wird funktionelles TIMP-3-Pclypeptid kodieren; allerdings kann die Verwendung von cDNAs praktikabler sein, da nur die kodierende Region involviert ist, wird die rekombinante Manipulation vereinfacht.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die DNA-Sequenzen, die hier beschrieben sind, die TIMP-3-Polypeptide kodieren, wertvoll für die Information, die sie zur Verfügung stellen bezüglich der Aminosäuresequenz von dem Säugerprotein, die vormals nicht erhältlich waren. Anders ausgedrückt, DNA-Sequenzen, die durch die Endung zur Verfügung gestellt werden, sind nützlich in der Herstellung von neuen und nützlichen viralen und zirkulären Plasmid-DNA-Vektoren, neuen und nützlichen transformierten und transfizierten prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen (einschließlich bakterieller und Hefezellen und Säugerzellen, die in Kultur gewachsen sind) und neue und nützliche Verfahren zum kultivierten Wachsen von solchen Wirtszellen, die in der Lage sind, TIMP-3 und seine verwandten Produkte zu exprimieren.
Die DNA, die hier zur Verfügung gestellt wird (oder korrespondierende RNAs) kann auch in der Gentherapie verwendet werden, beispielsweise für die Behandlung von Emphysem. Zum Beispiel zeigen transgene Mäuse, die Kollagenase überexprimieren, Symptome von Lungenemphysem, D'Armiento et al., Cell 71: 955–961 (1992) zeigen, dass die Inhibierung von Kollagenase einige der Symptome von Emphysem lindern kann. Zur Zeit können Vektoren, die zur Gentherapie geeignet sind (wie retrovirale oder adenovirale Vektoren, modifiziert für Gentherapiezwecke und von Reinheit und pharmazeutischer Verträglichkeit) verabreicht werden, zur Lieferung in die Lunge. Solche Vektoren können Nukleinsäuren, die die vorliegenden Polypeptide zur Expression in der Lunge kodieren, beinhalten. Zusätzlich kann man ein Gemisch solcher Vektoren, wie die, die Gene für eine oder mehrere TIMPs enthalten, Elastaseinhibitoren oder andere Proteine, die die Symptome von Emphysem lindern, verwenden. Gentherapie kann einen Vektor einschließen, der mehr als ein Gen für ein gewünschtes Protein enthält.
Alternativ kann man keinen Vektor verwenden, um relativ stabile Anwesenheit in dem Wirt zu erleichtern. Zum Beispiel kann homologe Rekombination die Integration in ein Wirtsgenom erleichtern. Die Nukleinsäure kann in einem pharmazeutisch verträglichen Träger vorliegen, um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, wie ein Lipidlösungsträger (z. B. ein beladenes Lipid), ein Liposom oder Polypeptidträger (z. B. Polylysin). Ein Review-Artikel zur Gentherapie ist Verma, Scientific American, November 1990, Seiten 68–84.
Wie oben erwähnt, können Zielzellen in der Lunge des Rezipienten sein, aber andere Zielzellen können Knochenmarkzellen, Blutzellen, Leber- (oder andere Organ-) zelten, Muskelzellen, Fibroblasten oder andere Zellen sein. Die gewünschte Nukleinsäure kann zunächst in einer Zelle gebracht werden und die Zelle kann an einen Patienten verabreicht werden (wie ein transplantiertes Gewebe) oder die gewünschte Nukleinsäure kann direkt einem Patienten zur Aufnahme in vivo verabreicht werden.
Die Zellen, die an den Rezipienten überfragen werden, können unter Verwendung von einem oder mehreren Faktoren kultiviert werden, die das Wachstum und die Vermehrung von solchen Zellen beeinflussen, wie zum Beispiel SCF.
Die Verabreichung von DNA der vorliegenden Erfindung an die Lunge kann erreicht werden durch Bildung einer Dispersion von Partikeln oder eines Aerosols. Typischerweise wird eine Art Quellmittel eingeschlossen sein und ein Träger, wie ein Lipid oder Polypeptid. Diese Materialien müssen pharmazeutisch verträglich sein. Man kann einen Zerstäuber für diese Lieferung verwenden, wie einen Ultraschall- oder Trockenpuderzerstäuber. Alternativ kann man ein Treibmittel-basiertes System verwenden, wie ein Dosieraerosol, das Flüssigkeit oder eine Suspension von Partikeln liefern kann.
Für Gentherapiedosierungen wird man generell zwischen einer Kopie und mehreren tausend Kopien der vorliegenden Nukleinsäure pro Zelle verwenden, abhängig von dem Vektor, dem Expressionssystem, dem Alter, Gewicht und Zustand des Rezipienten und anderer Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen sind auch geeignete Materialien zur Verwendung als markierte Sonden in der Isolierung humaner genomischer cDNA, die TIMP-3 kodiert, wie vorstehend erwähnt, und verwandter Proteine, genauso wie cDNA- und genomische DNA-Sequenzen von anderen Säugerspezies. Die DNA-Sequenzen können auch hilfreich in verschiedenen altemativen Verfahren der Proteinsynthese sein (z. B. in Insektenzellen) oder, wie vorstehend beschrieben, in genetischer Therapie in Menschen und anderen Säugern. Es wird erwartet, dass die endungsgemäßen DNA-Sequenzen in der Entwicklung von transgenen Säugerspezies nützlich sind, die als eukaryotische "Wirte" dienen können, zur Herstellung von TIMP-3 und TIMP-3-Produkten in Mengen. Siehe, generell, Palmiter et al., Science 222: 809–814 (1983).
Man kann auch Antisense-Nukleinsäuren gegen die vorliegenden DNAs herstellen. Vergleiche Khokho et al., Science 243: 947–950 (1989), wobei der Antisense-RNA-Inhibitor von TIMP Swiss 3T3-Zellen Onkogenität verlieh. Antisense-Nukleinsäuren können verwendet werden, um die Expression von endogenen TIMP-3-Nukleinsäuren zu modulieren oder zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung stellt gereinigte und isolierte Polypeptidprodukte zur Verfügung, die einen Teil oder die ganze primärstrukturelle Konformation (d. h. kontinuierliche Sequenz von Aminosäureresten) und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften (z. B. immunologische Eigenschaften und in vitro biologische Aktivität) und physikalische Eigenschaften (z. B. Molekulargewicht) von natürlich vorkommendem Säuger-TIMP-3, einschließlich alleler Varianten davon, besitzen. Der Ausdruck "gereinigt und isoliert" bedeutet hier im Wesentlichen frei von unerwünschten Substanzen, so dass die vorliegenden Polypeptide nützlich für die beabsichtigten Zwecke sind. Zum Beispiel kann man ein rekombinantes humanes TIMP-3 im Wesentlichen frei von anderen humanen Proteinen oder pathologischen Mitteln haben. Diese Polypeptide sind auch dadurch charakterisiert, dass sie ein Produkt von Säugerzellen sind oder ein Produkt von chemisch-synthetischen Verfahren oder ein Produkt von prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtsexpression (z. B. durch bakterielle, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur), von exogenen DNA-Sequenzen, die durch genomische oder cDNA-Klonierung oder durch Gensynthese erhalten wurden. Die Produkte der Expression in typischer Hefe (z. B. Saccharomyces cerevisiae) oder prokaryotischen (z. B. E. coli) Wirtszellen sind frei von Assoziationen mit irgendwelchen Säugerproteinen. Die Expressionsprodukte in Vertebraten (z. B. nichthumane Säuger (z. B. COS oder CHO) und Hühner) sind frei von Assoziationen mit irgendwelchen humanen Proteinen. Abhängig von dem verwendeten Wirt oder anderen Faktoren können Polypeptide der Erfindung glycosyliert sein mit Säuger- oder anderen eukaryotischen Kohlenhydraten oder sie können nicht-glycosyliert sein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch einen anfänglichen Methionin-Aminosäurerest einschließen (an Position –1 im Hinblick auf den ersten Aminosäurerest des Polypeptids).
Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden allelen Formen von TIMP-3 umfasst die vorliegende Erfindung auch andere TIMP-3-Produkte, wie Polypeptidanaloga von TIMP-3 und Fragmente von TIMP-3. Folgt man den Verfahren der vorstehend erwähnten publizierten Anmeldung von Aldon et al. (WO 83/04053) kann man leicht Gene konstruieren und herstellen, die für die mikrobielle Expression von Polypeptiden kodieren, die Primärkonformationen haben, die sich von der hier beschriebenen bezüglich der Identität und des Orts von einem oder mehreren Resten (z. B. Substitutionen, terminale oder intermediäre Additionen und Deletionen) unterscheiden. Alternativ können Modifikationen von cDNA und genomischen Genen leicht erreicht werden durch stellengerichtete Mutagenesetechniken (site-directed mutagenesis techniques) und eingesetzt werden, um Analoga und Derivate von TIMP-3 zu erzeugen. Solche Produkte würden wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von Säuger-TIMP-3 teilen, jedoch können sie sich in anderen unterscheiden. Als Beispiele schließen die geplanten Produkte der Erfindung die ein, die verkürzt sind durch z. B. Deletionen; oder die, die stabiler gegen Hydrolyse sind (und deshalb ausgeprägtere oder länger andauernde Wirkung als natürlich vorkommende haben können); oder die verändert wurden, um eine oder mehrere potentielle Stellender Glykosylierung zu deletieren (was in höherer Aktivität für Hefe-produzierte Produkte resultieren kann); oder die, die eine oder mehrere Cysteinreste dele tiert oder ersetzt haben durch z. B. Alanin- oder Serinreste und so potentiell leichter in aktiver Form aus mikrobiellen Systemen isoliert werden; oder die, die ein oder mehrere Tyrosinreste, ersetzt durch Phenylalanin, haben und mehr oder weniger leicht an Zielproteine binden oder an Rezeptoren oder Zielzellen. Es sind auch Polypeptidfragmente eingeschlossen, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz oder Sekundärkonformation im TIMP-3 duplizieren, deren Fragmente können eine Aktivität von Säuger-TIMP-3 besitzen (z. B. immunologische Aktivität) und nicht andere (z. B. Metalloproteinase-inhibierende Aktivität).
Das vorliegende TIMP-3 kann an die extrazelluläre Matrix binden, eine Eigenschaft, die nicht von TIMP-1 und TIMP-2 geteilt wird. Somit sind Polypeptide, die nur einen Teil der kontinuierlichen Aminosäuresequenz oder Sekundärkonformation im TIMP-3 zeigen und die Fähig keit, an die extrazelluläre Matrix zu binden, besitzen, auch speziell hier in Erwägung gezogen.
Es ist beachtenswert, dass Aktivität für ein oder mehrere der Produkte der Erfindung nicht notwendig ist, um von therapeutischem Nutzen zu sein (vgl. Weiland et al., Blut 44: 173–175 (1982) oder nützlich in anderen Zusammenhängen, wie in Assays von TIMP-3-Antagonismus zu sein. Kompetitive Antagonisten können zum Beispiel in Fällen von Überproduktion von TIMP-3 sehr nützlich sein,.
Von Anwendbarkeit auf TIMP-3-Fragmente und Polypeptidanaloga der Erfindung sind Berichte von immunologischer Aktivität von synthetischen Peptiden, die im Wesentlichen den Aminosäuresequenzbestand in natürlich vorkommenden Proteinen, Glykoproteinen und Nukleoproteinen kopieren. Genauer, es wurde gezeigt, dass Polypeptide mit relativ geringem Molekulargewicht an Immunreaktionen teilhaben, die den Immunreaktionen von physiologisch signifikanten Proteinen, wie viralen Antigenen, Polypeptidhormonen und dergleichen, ähnlich in Dauer und Ausmaß sind. Eingeschlossen in die Immunreaktionen von solchen Polypeptiden ist die Provokation der Bildung von spezifischen Antikörpern in immunologisch aktiven Tieren, vgl. z. B. Lerner et al., Cell 23: 309–310 (1981); Ross et al., Nature 294: 654– 656 (1981); Walter et al., PNAS-USA 77: 5197–5200 (1980); Lerner et al., PNAS-USA, 78: 3403–3407 (1981); Walter et al., PNAS-USA 78: 4882–4886 (1981); Wong et al., PNAS-USA 79: 5322–5326 (1982); Baron et al., Cell 28: 395–404 (1982); Dressman et al., Nature 295: 185–160 (1982); und Lerner, Scientific American 248: 66–74 (1983). Vergleiche auch Kaiser et al., Science 223: 249–255 (1984) bezüglich der biologischen und immunologischen Aktivitäten von synthetischen Peptiden, die annähernd Sekundärstrukturen von Peptidhormonen teilen, aber deren primäre strukturelle Konformation nicht teilen könnten.
Ein Typ von Analogon ist ein trunkiertes TIMP-3, das die Fähigkeit besitzt, an die Zinkbindedomäne von Kollagenase zu binden. Zum Beispiel ist die Zinkbindedomäne von interstitieller Kollagenase an den Aminosäuren 218, 222 und 288 des Proenzyms lokalisiert. Goldberg, G. I., J. Biol. Chem. 261: 660–6605 (1986). Die Zinkbindedomäne der 72 kDa-Spezies der Pro-Kollagenase ist an den Aminosäuren 403–407 lokalisiert. Collier et al., Genomics 9: 429– 434 (1991). Die Zinkbindedomäne der 92 kDa-Spezies der Pro-Kollagenase ist an Aminosäuren 401–405. Van Ranst et al., Cytokene 3: 231–239 (1991). Interessanterweise ist die Zinkbindedomäne ziemlich gut unter den Enzymen konserviert: HEFGN (92 kDa-Kollagenase), HEFGN (72 kDa-Kollagenase) und HELGH (interstitielle Kollagenase). Somit ist das Motiv für Zinkbindung HEXGN, wobei X entweder F oder l. ist. Ein selektiv bindendes Molekül, wie ein Antikörper oder kleines Molekül, würde solche Zinkbindung blockieren und somit enzymatische Aktivität inhibieren. (Der Ausdruck "selektiv bindendes Molekül", wie hier verwendet, bezeichnet eine Zusammensetzung, die selektiv an ihr Ziel bindet). Man kann zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper oder einen rekombinanten Antikörper herstellen.
TIMP-2-Deletionsanaloga wurden hergestellt, die die Fähigkeit, Metalloproteinaseaktivität zu inhibieren; beibehalten haben (Willenbrock et al., Biochemistry 32: 4330–4337 (1993). Bei TIMP-2 wurde der C-Terminus verkürzt, um sechs C-terminale Cysteine zu deletieren (drei Disulfid-gebundene Schleifen). Somit könnte man im Hinblick auf die Homologie unter den verschiedenen Zinkbindedomänen Analoga von TIMP-3 mit ähnlich verkürzten C-terminalen Sequenzen herstellen. Das TIMP-3-Analogon 1–121 (unter Verwendung der Nummerierung von 1) schließt die ersten sechs Cysteinreste ein, aber nicht die letzten sechs. Man kann optional den C-Terminus bis zum Volllängenmolekül von 188 Aminosäuren veriängern. Solche Analoga können auch für jede Spezies heroestellt werden, wie ChIMP-3.
Dies ist nachstehend in Beispielen gezeigt, wie gezeigt ist, dass eine TIMP-2-Deletionsvariante interstitielle Kollagenase inhibiert. (Bieispiel 3 nachstehend). Die Zinkbindedomäne der interstitiellen Kollagenase befindet sich an einer ähnlichen Stelle wie die der 72 kDa Spezies-Kollagenase (was von TIMP-2-trunkierten Analoga beeinflusst wird, wie von Willenbrock et al., oben, gezeigt).
Da es offensichtlich ist, dass der C-Terminus nicht für Enzym-Inhibierungsaktivität notwenig ist, kann man auch den C-Tenninus chemisch modifizieren. Man könnte sich zum Beispiel eine andauernde Abgabepräparation wünschen; worin ein oder mehrere Polymermoleküle, wie Polyethylenglycol-Moleküle, angeheftet sind. Andere chemische Modifikationen schließen Anheftung eines zusätzlichen Polypeptids für die Er-zeugung eines Fusionsmoleküls ein. Somit ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung chemisch modifiziertes TIMP-3.
Die vorliegende Erfindung schließt auch diese Klasse von Polypeptiden ein, die von DNA kodiert werden, die komplementär zu dem Protein-kodierenden Strang der humanen cDNA oder der genomischen DNA-Sequenzen von TIMP-3 sind, d. h. "komplementär invertierte Proteine", wie beschrieben von Tramontano et al. Nucleic Acid Res. 12: 5049–5059 (1984). Polypeptide oder Analoga davon können auch eine oder mehrere Aminosäureanaloga, wie Peptidomimetika enthalten.
In der Erfindung sind auch pharmazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen, die wirksame Mengen von Polypeptidprodukten der Erfindung, zusammen mit pharmazeutisch ak zeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsmitteln, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägem enthalten, die in der TIMP-3-Therapie nützlich sind. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel verschiedener Pufferzusammensetzungen ein (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat, pH und Ionenstärke; Zusatzstoffe, wie Detergentien und Lösungsmittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Quellsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol); kovalente Anheftung von Polymeren, wie Polyethylenglycol an das Protein (wie oben diskutiert), vgl. zum Beispiel U.S.-Patent 4,179,337; Inkorporation von Material in Teilpräparationen von polymeren Verbindungen, wie Polylactansäure, Polyglyconsäure, etc. oder in Liposomen. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Status, Stabilität und Rate der in vivo Abgabe und Rate der in vivo Freigabe von TIMP-3 beeinflussen. Vergleiche, z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435–1712.
Generell wird eine wirksame Menge der vorliegenden TIMP-3-Polypeptide durch das Alter, Gewicht und Zustand oder Ernsthaftigkeit der Erkrankung des Rezipienten bestimmt werden (vgl. Remingtons Pharmaceutical Sciences, oben, auf Seiten 697–773, hier durch Referenz eingeschlossen. Typischerweise kann eine Dosierung von zwischen etwa 0,001 g/kg Körpergewicht bis etwa 1 g/kg Körpergewicht verwendet werden, jedoch kann mehr oder weniger verwendet werden, wie ein Fachmann weiß. Für lokale (d. h. nichtsystemische) Verabreichung, wie topische Verabreichung, kann die Dosierung zwischen etwa 0,001 g/cm² bis etwa 1 g/cm² liegen. Die Dosierung kann ein- oder mehrmals täglich erfolgen oder weniger häufig und kann in Verbindung mit anderen Zusammensetzungen, wie hier beschrieben, erfolgen. Es sollte beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hier genannten Dosierungen beschränkt ist.
Eine Vielzahl von Mitteln arbeitet zusammen, um das dynamische Gleichgewicht der extrazellulären Matrix und des Gewebes aufrecht zu erhalten. In der Behandlung von Zuständen, in denen das Gleichgewicht verzerrt ist, können ein oder mehrere der anderen Mittel in Zusammenhang mit dem vorliegenden TIMP-3 verwendet werden. Diese anderen Mittel können co-verabreicht werden oder nacheinander verabreicht werden oder eine Kombination davon. Generell können diese anderen Mittel ausgewählt sein aus einer Liste, bestehend aus den Metalloproteinasen, Serinproteasen, Inhibitoren von Matrix-abbauenden Enzymen, intrazellulären Enzymen, Zelladhäsionsmodulatoren und Faktoren, die die Expression von extrazellulären, Matrix-abbauenden Proteinasen regulieren und ihre Inhibitoren. Obwohl spezifische Beispiele nachstehend aufgelistet sind, wird der Fachmann andere Mittel kennen, die äquivalente Funktionen ausführen, einschließlich zusätzlicher Mittel oder andere Formen der aufge listeten Mittel (wie diese, die durch rekombinante DNA-Techniken synthetisch hergestellt sind und Analoga oder Derivate).
Metalloproteinasen und Serinproteasen bauen die extrazelluläre Matrix ab, wie vorstehend diskutiert. Somit kann die Verwendung von Enzymen in der Therapie erfolgen, um den Wirkungen des vorliegenden TIMP-3s entgegenzuwirken, die diesen Abbau inhibiert. Die Enzyme schließen ein, Kollagenasen, PMN (polymorph-nuklearer Leukozyt), Kollagenase, Stromelysin I, II/Transin, Matrilysin, Invadolysin, putative Metalloproteinase (PUMP-1), Urokinase Typ Plasminogenaktivator (UPA), Gewebeplasminogenaktivator (TPA) und Plasmin. PD-ECGF kann auch verwendet werden.
Andere Degradationsinhibitoren können auch verwendet werden, wenn gesteigerte oder spezifischere Verhinderung von extrazellulärem Matrixabbau gewünscht ist. Inhibitoren können ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus, α₂-Makroglobulin, Schwangerschaftszonenprotein (pregnancy zone protein), Ovostatin, α₁-Proteinaseinhibitor, α₂-Antiplasmin, Aprotinin, Proteasenexin-1, Flasminogenaktivatorinhibitor (PAl)-1, PAl-2, TIMP-1 und TIMP-2. Andere können verwindet werden, wie der Fachmann weiß.
Intrazelluläre Enzyme können auch in Verbindung mit dem vorliegenden TIMP-3 verwendet werden. Intrazelluläre Enzyme können auch den extrazellulären Matrixabbau beeinflussen und schließen lysosomale Enzyme, Glykosidasen und Cathepsine ein.
Zelladhäsionsmodulatoren können auch in Kombination mit dem vorliegenden TIMP-3 verwendet werden. Zum Beispiel, wenn man die Zelladhäsion an die extrazelluläre Matrix vor, während und nach Inhibierung der Degradation der extrazellulären Matrix unter Verwendung des vorliegenden TIMP-3s beeinflussen möchte. Zellen, die Zelladhäsion an die extrazelluläre Matrix gezeigt haben, schließen ein, Osteoclasten, Makrophagen, neutrophile Zellen, eosinophile Zellen, Killer-T-Zellen und Mastzellen. Zelladhäsionsmoduiatoren schließen Peptide ein, die ein "RGD"-Motiv oder Analogon oder mimetische Antagonisten oder Agonisten haben.
Faktoren, die die Expression von extrazellulären, Matrix-abbauenden Proteinasen und ihrer Inhibitoren regulieren, schließen Cytokine, wie LI-1 und TNF-α, TGF-β, Glukokortikoide und Retinoide ein. Andere Wachstumsfaktoren, die Zellproliferation und/oder -differenzierung bewirken, können auch verwendet werden, wenn die gewünschte Wirkung ist, die Degradation der extrazellulären Matrix unter Vennrendung des vorliegenden TIMP-3s, im Zusammenhang mit solchen zellulären Wirkungen zu inhibieren. Zum Beispiel während Entzündung kann man die Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (durch Inhibierung der enzymatischen Aktivität) wünschen und dennoch die Herstellung von neutrophilen Zellen wünschen; deshalb kann man G-CSF verabreichen. Anderen Faktoren schließen Erythropoietin, Interleukin-Familienmitglieder, SCF-M-CSF, IGF-I, IGF-II, EGF, EGF-Familienmitglieder, wie KGF, PDGF und andere ein. Man kann zusätzlich die Aktivität von Interferonen, wie Interferon Alphas, Betas, Gammas oder Consensus-Interferon wünschen. Intrazelluläre Mittel schließen G-Proteine, Proteinkinase C und Inositol-Phosphatasen ein. Während das Gebiet der Inflammationsforschung zur Zeit noch entwickelt wird und die genauen Interaktionen der beschriebenen Zusammensetzungen in vivo noch nicht vollständig verstanden sind, stellt die Verwendung der vorliegenden Polypeptide einen therapeutischen Nutzen mit einem oder mehreren Mitteln, die in der Inflammationstherapie involviert sind, dar.
Zellverkehrsmittel (cell trafficking agents) können auch verwendet werden. Zum Beispiel schließt Entzündung den Abbau von extrazellulärer Matrix und die Bewegung oder den Verkehr von Zellen an die Steile der Verietzung ein. Die Verhinderung des Abbaus der extrazeflulären Matrix kann diesen Zellverkehr verhindern. Die Verwendung des vorliegenden TIMP-3 in Verbindung mit Agonisten oder Antagonisten von Zellverkehr-modulierenden Mitteln können deshalb in der Behandlung von Entzündungen gewünscht sein. Zellverkehr-modulierende Mittel können ausgewählt sein aus der Liste, bestehend aus endothelialen Zelloberflächenrezeptoren (wie E-Selektine und -Integrine); Leukozyten-Zelloberflächenrezeptoren (L-Selektine); Chemokine und Chemolockstoffe. Zur Aufstellung von Zusammensetzungen, die in Entzündung involviert sind, vgl. Carlos et al., Immunol. Rev. 114: 5–28 (1990), das hier durch Referenz eingeschlossen ist.
Darüber hinaus können die Zusammensetzungen Neu-Differenzierungsfaktor, "NDF" einschließen und Verfahren zur Behandlung können die Verabreichung von NDF vor, gleichzeitig mit und nach der Verabreichung von TIMP-3 einschließen. Man hat erkannt, dass NDF die Produktion von TIMP-2 stimuliert und die Kombination von NDF, TIMP-1, –2 und/oder –3 kann Nutzen in der Behandlung von Tumoren zur Verfügung stellen.
Polypeptidprodukte der Erfindung können "markiert" sein durch Assoziation mit einer nachweisbaren Markersubstanz (z. B. radioaktiv markiert mit Jod¹²⁵), um Mittel zur Verfügung zu stellen, die nützlich zum Nachweis und zur Quantifizierung von TIMP-3 in festem Gewebe und flüssigen Proben, wie Blut oder Urin, sind. Nukleinsäureprodukte der Erfindung können auch mit nachweisbaren Markern (wie Radioaktivmarkierungen oder nichtisotopische Markierungen, wie Biotin) markiert sein und in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden, um die humane TIMP-3-Genposition und/oder die Position von einer verwandten Genfamilie in einer chromosomalen Karte zu lokalisieren. Nukleinsäuresequenzen, die selektiv das humane TIMP-3-Gen binden, sind zu diesem Zweck von Nutzen. Sie können auch verwendet werden zur Identifizierung von humanen TIMP-3-Genstörungen auf DNA-Ebene und verwendet werden als Genmarker zur Identifizierung von benachbarten Genen und ihrer Störungen. Hier sind Kits, die solche markierten Materialien beinhalten, eingeschlossen.
Die TIMP-3-Zusammensetzungen, die hier beschrieben sind, modifizieren die Pathogenese und stellen eine nützliche Therapie für Krankheiten des Bindegewebes, die durch Matrixdegeneration charakterisiert sind, zur Verfügung. Die vorliegenden TIMP-3-Zusammensetzungen können auch nützlich sein zur Behandlung von jeder Störung, in der exzessiver Matrixverlust durch Metalloproteinase-Aktivität ausgelöst wird. Die TIMP-3-Zusammensetzungen können allein oder in Verbindung mit einer oder mehreren der hier diskutierten Mittel verwendet werden.
Die Polypeptidprodukte der vorliegenden Erfindung sind nützlich, allein oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln, zur Behandlung von verschiedenen Funktionsstörungen, wie Epidermolysis, wo die Erkrankung mit der Überproduktion von Kollagenase verbunden ist, Bauer et al., J. Exp. Med. 148: 1378–1387 (1978). Die Produkte der vorliegenden Erfindung können auch in der Behandlung von rheumatischer Arthritis nützlich sein. Evanson et al. J. Clin. Invest. 47: 2639–2651 (1968) erkannte, dass große Mengen an Kollagenase in Kultur durch ausgeschnittenes rheumatisches synoviales Gewebe produziert wurden, dieses führte zu Immunolokalisierungs-Studien durch Woolley et al., Arthritis and Rhematism 20: 1231–1239 (1977) mit monospezifischen Antikörpern, die gegen humane rheumatische synoviale Kollagenase gerichtet sind, die hohe Spiegel von immunreaktiver Kollagenase an den Stellen von Knochenerosion (Knorpelpannusverbindungen), jedoch nicht in dem Knorpel von assoziierten Chondrocyten und nicht in dem Synovium an Stellen, entfernt von der resorbierenden Front, nachwiesen. Kollagenasen wurden auch gezeigt, unter Verwendung von vielen anderen verschiedenen Präparationen, die abgeleitet wurden von humanen rheumatischen Gelenken und unter Verwendung von Geweben, die durch andere Typen von Arthritis charakterisiert sind, wie Osteoarthritis, Reiters-Syndrom, Pseudogicht, Jugendliche Rheumatische Arthritis und Skleroderma.
In Peridontalerkrankung, die den zähnestützenden Apparat betrifft, ist der Anstieg von kollagenolytischen Enzymen offenkundig und die Zerstörung von Kollagen und Bindegewebe. Vergleiche V. -J. Uitto, S. 211–223 in Proteinases in Inflammation and Tumor Invasion, N. Tschesche, Hrsg., Walter de Gruyter & Co., Berlin, N.Y. (1988).
Kollagenasen wurden in Verbindung gebracht mit der Ulzeration einschließlich Hornhaut, epidermaler oder gastrischer Ulzeration, Brown et al., American J. of Ophthalmology 72: 1139–1142 (1971) und tatsächlich werden Metalloproteinaseinhibitoren in der Behandlung von Hornhautulzeration verwendet. Slansky et al., Annals of Ophthalmology 2: 488–491 (1970).
TIMP-3 kann besondere Anwendung für Restenose in Wundheilung nach Operation finden. Metalloproteinasen leisten einen Beitrag zu der Neuanordnung von arteriellen Zellen, einschließlich Arterienverstopfung. Die Vennrendung des vorliegenden TIMP-3s kann diese Umordnung der arteriellen Wand inhibieren. Die Lieferung von Antisense-TIMP-3-Nukleinsäure kann auch Nutzen zur Verfügung stellen.
Auf dem Gebiet der Tumorinvasion und Metastase korreliert das metastatische Potential von einigen besonderen Tumoren mit der gesteigerten Fähigkeit, Kollagenasen zu synthetisieren und zu sekretieren, Liotta et al., Nature 284: 67–68 (1980) und mit der Unfähigikeit, signifikante Mengen eines Metalloproteinaseinhibitors zu synthetisieren und sekretieren, Hicks et al., Int. J. Cancer 33: 835–844 (1984). Diese Prozesse stehen in Zusammenhang mit der Passage von Tumorzellen durch Bindegewebeschichten (Basismembran) von Gewebestellen zu der Zirkulation und umgekehrt, die durch TIMP-3 behindert werden könnte. TIMP-3 findet in gleicher Weise therapeutische Anwendung in der Inhibierung von Tumorzellausbreitung während der Entfernung von primären Tumoren, während Chemotherapie und Bestrahlungstherapie, während Ernten von kontaminiertem Knochenmark und während Rangieren von karzinomatöser Aszites.
Ein limitierender Faktor in der Verwendung von Knochenmarktransplantation für viele fortgeschrittene Krebsarten mit Einbeziehung des Knochenmarks ist das Fehlen von geeigneten Absaugtechniken. Zum Beispiel wurde metastatische interstitielle Pneumonitis nach Infusion von nichtangemessen abgesaugten Knochenmarkszellen festgestellt, Glorieux et al., Cancer 58: 2136–2139 (1986); Graeve et al., Cancer 62: 2125–2127 (1988). Die Verabreichung von TIMP-3 während der Infusion von nicht-entfernten Knochenmarkszellen wird die Notwendigkeit zur Entwicklung von teuren Absaugtechniken verringern.
Diagnostisch ist die Konelation zwischen der Abwesenheit von TIMP-3-Produktion in einer Tumorprobe und ihrem metastatischen Potential nützlich als ein prognostischer Indikator, genauso wie als Indikator für mögliche vorbeugende Therapie.
Tumore können auch mehr oder weniger verkapselt oder fibriotisch werden, aufgrund gesteigerter Kollagenablagerung (oder Inhibierung des Zusammenbruchs) durch Krebszellen und/oder umgebende normale Zellen. Gesteigerte Verkapselung, gefördert durch TIMP-3, hilft in der sauberen Tumorentfernung.
Andere pathologische Zustände, in denen exzessiver Kollagenabbau eine Rolle spielen kann und somit TIMP-3 angewendet werden kann, schließen Emphysem, Paget's Krankheit des Knochens, Osteoporose, Skleroderma, Druckatrophie des Knochens oder Gewebes wie bei Druckgeschwüren, Cholesteatom und abnormale Wundheilung ein. TIMP-3 kann zusätzlich als ein Zusatz zu anderen Wundheilungspromotoren angewendet werden, z. B. um den Durchsatz von Kollagen während des Heilungsprozesses zu modulieren.
TIMP-3 kann auch Erythroid-potenzierende Wirkung haben (d. h. Stimulierung der Differenzierung von frühren Erythroid-Vorläufern) und somit kann TIMP-3 nützlich in der Behandlung von verschiedenen Anämien sein.
Zusätzlich kann TIMP-3 in der Behandlung von immunologischen Störungen, wie Autoimmunerkrankungen (z. B. rheumatische Arthritis, Multiples sclerose) Anwendung finden, basierend auf einer potentiellen Fähigkeit, B-Zelldifferenzierung zu supprimieren, wie bestimmt durch das Verfahren von Pisko et al., J. Immunol. 136: 2141–2150 (1986).
Basierend auf seiner Fähigkeit, Bindegewebeabbau zu inhibieren, kann TIMP-3 und/oder andere TIMP-Moleküle Anwendung finden in Fällen, in denen die Inhibierung von Angiogenese nützlich ist, z. B. in der Verhinderung oder Verzögerung von Tumorentwicklung und in der Verhinderung der Invasion von Parasiten. Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren Anwendung finden für kosmetische Zwecke, indem lokalisierte Inhibierung von Bindegewebszusammenbruch die Erscheinung von Gewebe verändern kann.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren können auch nützlich in der Geburtenkontrolle oder Fertilisationsregulierung sein, da gezeigt wurde, dass TIMPs Follikelzerstörung verhindern oder verzögern, Branstorm et al., Endocrinology 122: 1715–1721 (1988) und mit der Embryonen-Präimplantations-Entwicklung interferieren.
Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren können auch nützlich in der Behandlung von Nervenzellstörungen sein, indem TIMP-3 Nervenzellen vor Schaden durch Bewahren der die Basismembran umgebenden Nervenzellen schützen kann. Deshalb können Ver- wendungen BDNF, NT-3, NGF, CNTF, NDF, SCF oder andere Nervenzellwachstum- oder Proliferations-modulierende Faktoren einschließen.
Wie vorstehend beschrieben, besitzt das vorliegende TIMP-3 eine weite Anwendbarkeit in einer Vielzahl von Störungen. Somit ist eine andere, hier eingeschlossene, Ausführungsform ein Kit, der die vorliegenden Polypeptide und optional ein oder mehrere der zusätzlichen Zusammensetzungen, die vorstehend für die Behandlung von einer Störung beschrieben worden sind, die die Degradation von extrazellulärer Matrix einschließt, einschließt. Eine zusätzliche Ausführungsform ist ein Herstellungsartikel, umfassend ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Mittel in diesem Verpackungsmaterial, wobei das pharmazeutische Mittel das (die) vorliegende(n) Polypeptid(e) enthält und wobei das Verpackungsmaterial eine Markierung umfasst,. die anzeigt, dass das pharmazeutische Mittel verwendet werden kann für eine Indikation, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Krebs, Entzündung, Arthritis, Epidermolysis, Peridontalerkrankung, Ulzeration, Emphysem, Knochenstörungen, Skleroderma, Wundheilung, Erythrocytenmangel, kosmetische Geweberskonstruktion, Fertilisation oder Embrioenimpiantationsregulation und Nervenzelistörungen. Dieser Herstellungsartikel kann optional andere Zusammensetzungen einschließen oder Beschreibungen anderer Zusammensetzungen benennen.
Die hier zur Verfügung gestellten Nukleinsäuren können Teil eines Kits oder eines Herstellungserzeugnisses sein. Genannt ist ein Herstellungserzeugnis, das ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Mittel umfasst, wobei das pharmazeutische Mittel die kürzlich zur Verfügung gestellten Nukleinsäuren enthält und wobei das Verpackungsmaterial eine Markierung umfasst, die anzeigt, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Indikation verwendet werden kann, die von der Regulierung der DNA-Expression begünstigt wird, wie eine Gentherapieindikation. Solch eine Gentherapieindikation, wie vorstehend diskutiert, schließt die Behandlung von Emphysem ein. Ein Kit, der Nukleinsäure(n) enthält, kann optional zusätzliche Faktoren beinhalten, die das ex vivo Wachstum von Rezipientenzellen beeinflussen, wie SCF. Vergleiche, z. B. Zsebo et al., PCT WO 91/05795.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sind selektiv bindende Moleküle, wie monoklonale Antikörper, die spezifisch TIMP-3 binden. Die Hybridomatechnik, original beschrieben von Kohler und Milstein Eur. J. Immunol. 6, 511–519 (1976), wurde weithin angewendet, um Hybridzelllinien zu erzeugen, die hohe Spiegel an monoklonalen Antikörpern gegen viele spezifische Antigene sekretieren. Rekombinante Antikörper (vgl. Huse et al., Science 246: 1275 (1989)) können auch hergestellt werden. Solche Antikörper können zum Beispiel für diagnostische Zwecke in einen Kit eingeschlossen werden.
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um die Erfindung vollständiger darzustellen, sie sind jedoch nicht dafür ausgelegt, sie einzuschränken.
BEISPIEL 1
Klonierunq und Expression von humaner TIMP-3-cDNA
Die gesamte Klonierungsstrategie schließt zwei Schritte ein, der erste, Erhalten eines Fragments unter Verwendung von PCR von einer humanen fötalen Nieren-cDNA-Bibliothek und den zweiten, Verwendung dieses partiellen Klonens um zwei verschiedene cDNA-Bibiiothe-ken auf Volllängen-DNA-Sequenzen zu screenen.
Es wurden degenerierte PCR-Primer verwendet, die von hochkonservierten Regionen der TIMP-Genfamilie abgeleitet wurden, um TIMP-3-cDNA aus humaner fötaler Nieren-cDNA zu amplifizieren. Dieses Produkt wurde dann als Sonde verwendet, um Klone aus einer humanen fötalen Nieren-cDNA-Bibliothek und einer normalen humanen Kolonmucosa-cDNA-Bibliothek zu isolieren. Klone mit 1240, 963 und 827 bp wurden isoliert und sequenziert. Der längste Klon kodiert das gesamte 211 Aminosäure-Pro-Polypeptid, das ein reifes Polypeptid von 188 Aminosäuren besitzt. Der Klon mittlerer Größe ist trunkiert, kodiert jedoch das gesamte reife Protein. Dem kleinsten Klon fehlt die Region, die die ersten 24 Aminosäuren des reifen Polypeptids kodiert. Die Expression und Reinigung von reifem Polypeptid wird auch gezeigt.
MATERIAL UND METHODEN
Primer und anfänglich verwendete TIMP-3-DNA-Quelle
Degenerierte PCR-Primer wurden in einem Erstrunden-Screening von Erststrang-cDNAs verwendet, um einen partiellen TIMP-3-cDNA-Klon zu erhalten. Die degenerierten PCR-Primer, die von hochkonservierten Regionen der TIMP-Familie von Proteinen abgeleitet wurden, wurden ausgewählt vgl. 4). Sie wurden auch ausgewählt aufgrund der relativ geringen Degeneriertheit ihrer Kodons.
Der Vorwärtsprimer wurde abgeleitet von einer Sequenz (VIRA), die ubiquitär in der TIMP-Familie ist und an Positionen 18–21 des reifen Proteins gefunden wird. Dieser 96-fach degenerierte Vorwärtsprimer hatte 11 Basen, die die TIMP-Sequenz plus 6 Basen für eine EcoRI- Stelle und zwei Extra-Basen (unterstrichen) kodierte. 449–15: SEQ ID Nr. 1: 5'-CGG AAT TCG TNA THM GNG C-3'.
Ein reverser Primer, korrespondierend zu einer Region von ChIMP-3 (CIWTDM) wurde synthetisiert. Dieser Primer, 480–27, schloss eine BamHI-Stelle und zwei Extrabasen ein (unterstrichen): SEQ ID Nr. 2: 5'-CGG GAT CCC ATR TCN GTC CAD ATR CA-3'.
Ein alternativer reverser Primer wurde auch verwendet: SEQ ID Nr. 3 480–28 CGG GAT CCR TCN GTC CAD ATR CA
Die konespondierende Region weicht etwas ab. Aminosäuren 163–168 des ChIMP-3 werden von der Version, die hier verwendet wird, kodiert und diese wurden gewählt, da das M und I das ChIMP-3 von anderen TIMPS unterscheidet. Anfänglich war nicht bekannt, ob diese Unterschiede auch in humanem T IMP-3 (falls solches TIMP tatsächlich existiert) vorkommen, jedoch wurde eine Ausrichtung, weg von TIMP-1 und TIMP-2 verwendet, um unenwünschte Amplifikationen zu limitieren. Das M an Position 168 war besonders nützlich. Als ein Ergebnis einer Lokalisierung am 5'-Ende des reversen Primers würde es nicht mit dem PCR-Prozess interferieren, wenn dort Fehlpaarungen sind und es würde TIMP-3-Amplifikation favorisieren gegenüber anderen DNAs, wenn diese Wahl korrekt wäre.
Amplifikation von Erststrang-cDNAs unter Verwendung von Primern
Zunächst wurden degenerierte Primer verwendet, um PCR-Produkte aus den zwei Erststrang-cDNAs zu amplifizieren. Nach einer zweiten Amplifikationsrunde wurden die PCR-Produkte aus diesen subkloniert und eines wurde ausgewählt, das als eine Sonde für cDNA-Bibliotheken verwendet wurde, wie nachstehend beschrieben.
Oligonukleotidsynthese
Oligonukleotide wurden auf dem automatisierten Synthesizer von Applied Biosystems 394 synthetisiert unter Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie. Degenenerte Oligonukleotide, die in Mengen größer als 200 nmol synthetisiert wurden, wurden durch Butanolextraktion gereinigt. Nichtdegenerierte Oligonukleotide wurden in kleineren Mengen synthetisiert und wurden Trityl-on-gereinigt unter Verwendung von Poly-pak (Glen Research Corp., Sterling, VA)-Patronen nach den Herstellerangaben. Trityl-oft-Reinigung wurde durchgeführt unter Verwendung von 1 × 25 cm Sephadex G-50-Chromatografiesäulen und TEAB als Elutionspuffer.
Polymerasekettenreaktion
Alle PCRs wurden auf Perkin Elmer Modell 9600-Instrumenten durchgeführt unter Verwendung von Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT) GeneAmp-Kits gemäß den Herstellerangaben, die hier durch Referenz eingeschlossen sind.
Die erste Runde der PCR bestand aus 5 Zyklen bei 94°C für 20 Sekunden, 50°C für 20 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden. Dies wurde gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 20 Sekunden, 50°C für 20 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden. Die PCR-Produkte wurden auf einem 2%-igen Agarosegel (SeaKem GTG, FMC, Rockland, ME) laufen gelassen, vorgefärbt mit Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO) und die Banden in dem vorhergesagten Größenbereich wurden unter Verwendung einer Pasteuer-Pipette aus dem Gel gestanzt,. Die PCR-Produkte wurden dann direkt aus den Gelfragmenten reamplifiziert unter Verwendung der gleichen PCR-Primer und des folgenden Programms: Ein Zyklus von 5 Minuten bei 95°C, gefolgt von 25 Zyklen von 94°C für 20 Sekunden, 50°C für 20 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden. Dieses Verfahren wurde ein zweites Mal durchgeführt mit dem Bestreben, große Mengen an relativ reinem Material für Subklonierung und Restriktionsanalyse zu erhalten.
Erststrang-cDNA-Quellen
Oligo dT-geprimte Erststrang-cDNA aus humaner Kolonmucosa (Dr. Gene Finley, Pittsburgh VA Medical Center) genauso wie Oligo dT-geprimte Erststrang-cDNA aus 22 Wochen alter . humaner fötaler Niere (Clontech, Palo Alto, CA) wurden als Erstrundenquellen für TIMP-3-cDNA verwendet. Wenn die Kolonmucosa-cDNA-Quelle verwendet wurde, wurden die gleichen Bindungsmuster beobachtet, die mit fötaler Nieren-cDNA beobachtet wurden, was diese Ergebnisse bestätigte. Diese PCR-Produkte der fötalen Nieren wurden dann zur Subklonierung verwendet.
Reinigung und Subklonierung von PCR-Produkten
Die PCR-Produkte wurden durch Centricon-100-Säulen (Amicon, Beverly, MA) laufen gelassen, um das Schneiden der DNA mit Restriktionsendonukleasen zu erleichtern. Die DNA wurde dann mit EcoRI und BamHI geschnitten, um sicherzustellen, dass sie nicht intern während des Subklonierungsprozesses geschnitten werden. PCR-Produkte wurden in pUC19 kloniert, nach Behandlung mit Proteinase K (Crowe et al., 1991), um die Klonierungseffizienz zu steigern. Kolonien wurden schnell durch PCR-Amplifikation mit Vektorprimern 382–3 SEQ ID Nr. 4 (5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG-3') und 382–4 SEQ ID Nr. 5 (5'-GAA TTG TGA GCG GAT AAC-3') gescreent. Diese Produkte wurden gereinigt unter Verwendung von Centricon-100-Konzentratoren und wurden sequenziert.
Ergebnisse.
Wie in 2 gezeigt, resultierten drei Banden aus der Amplifikation mit den degenerierten Primern. Klonierte DNA von zwei der Banden wurde sequenziert; die dritte Bande konnte nicht ausreichend gereinigt werden, um Subklonierung und Sequenzierung zu ermöglichen.
Die kleinere der zwei sequenzierten Banden war das gewünschte 402 bp-Fragment und die größere Bande resultierte vermutlich aus falschem Priming an die Region, die CSWYRG (Aminosäuren 169–174 des reifen Polypeptids aus 1) kodiert und war 489 bp lang. Das 402 bp-Fragment korrespondiert mit der Nukieinsäure, die die Region kodiert, die ValI-leArgAla (Lys) bis CysLeuTrpThrAspMet von 1 kodiert, mit einem EcoRI an der 5'-Seite und einem BamHI an der 3'-Seite. Das Kodon für Isoleucin an dem 3'-Ende ist auch mit dem Kodon für Leucin ersetzt.
cDNA-Bibliothek-Screening
Screening einer ersten cDNA-Bibliothek.
Bibliothek. Die erste Bibliothek, die gescreent wurde, war die Oligo(dT)-geprimte λgt11 humane Clontech, 20 und 24 Wochen fötale Nieren-cDNA-Bibliothek (Clontech).
Sonden. Die erste Runde des cDNA-Screenings wurde durchgeführt mit dem Insert von einem der klonierten degenerierten PCR-Produkte, die vorstehend beschrieben wurden, dem 402 pb-Insert. Ein geringer Hintergrundspiegel wurde aufgrund von Kontamination durch pUC19-Vektor-DNA beobachtet.
Infolgedessen wurde der Phagenüberstand von einem partiell gereinigten λgt11-Klon, der aus der ersten Runde des cDNA-Screenings erhalten wurde, als PCR-Template verwendet. Fiedman et al., Nucl. Acids. Res. 17: 8718 (1988). Dies stellte eine Sonde von hoher Qualität und Reinheit zur Verfügung. Der Primer 495–21, SEQ ID Nr. 6 5'-CGG AAT TCT GGT CTA CAC CAT CAA GC-3' korrespondierte annähernd mit der YTIK-Domäne und schloss eine EcoRI-Stelle und zwei zusätzliche Basen ein. Primer 496–16, SEQ ID Nr. 7 5'-CAT GTC GGT CCA GAG ACA CTC G-3' konespondierte mit der CLWTDM-Region und enthielt keine Restriktionsstelle. Dies resultierte in einem 333 bp-Fragment. Die Sequenz des 333 bp-Fragments war ein Teil der 402 bp-Fragmentsequenz. Das 333 bp-Fragment wurde als eine Sonde für alle Northern Blot-Analysen verwendet und für alle weiteren cDNA-Bibliothek-Screenings. Das 333 bp-Fragment konespondiert mit der Region aus 1, die TyrThrIle-Lys bis CysLeuTrpThrAspMet und die zuvor erwähnte EcoRI-Stelle kodiert.

Plaque-Hybridisierung. Etwa 200.000 Phagen wurden auf zehn 150 mm-Platten plattiert, im Duplikat auf Schleicher & Schnell gestützte Nitrocellulosemembranen gebracht und mit einem zufailsgeprimten ³ ²P-markierten (Stratagene) 402 bp-Fragment, wie oben beschrieben, getestet. Prähybridisierungen und Hybridisierungen wurden über Nacht bei 42°C durchgeführt unter Verwendung der folgenden Reagenzien (für 50 ml Lösung}:

12,5 ml	20 X SSPE
5 ml	0,5 N NaHPO₄ pH 6,8
0,1 ml	0,50 M EDTA pH 8,0
25 ml	Formamid
2,5 ml	50 X Denhardt's
0,25 ml	20% SDS
0,5 ml	10 mg/ml tRNA (Kälberleber)
1 ml	10 mg/ml Lachsspermien-DNA (nicht verwendet in der Prähybridisierungslösung)
4,15 ml	H₂O (3,15 ml verwendet in der Hybridisierungslösung)

Die Filter wurden in 0,25 X SSC bei 42°C gewaschen. Zwei positiv hybridisierende Plaques wurden gereinigt, was in zwei unabhängigen Klonen resultierte, hier genannt Timp3clone7 und Timp3clone2. Die DNA des Bakteriophagen Lambda wurde gereinigt unter Verwendung eines Qiagen Lambda DNA-Reinigungskits (Chatsworth, CA). Plattenlysate von 10 konfluenten 135 mm Petrischalen wurden für jede Probe gepoolt. 300 μl einer Lösung, enthaltend 20 mg/ml RNase, 6 mg/ml DNase I_; 0,2 mg/ml BSA, 10 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7,5, wurden zugesetzt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. 10 ml von eiskaltem 30%-igem Polyethylenglycol (PEG 6000), 3 mol NaCl wurden eingemischt und auf Eis für 60 Minuten inkubiert.
Nach Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde resuspendiert in 10 ml einer Lösung, enthaltend 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl und 25 mM EDTA, pH 7,5. 10 ml einer Lösung, enthaltend 4% SDS, wurde vorsichtig zuge geben und das Gemisch wurde bei 70°C für 10 Minuten erhitzt und dann auf Eis gekühlt. 10 ml von 2,55 Molar-Kaliumacetat, pH 4,8, wurde schnell eingemischt und die Lösung wurde bei 4°C bei 15.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einer Qiagen Tip-500-Säule laufen gelassen, die mit 10 ml 750 mM Nal, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, pH 7,0 äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 30 ml 1,0 M NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, pH 7,0, gewaschen. Schließlich wurde die Säule eluiert mit 15 ml von 1,25 mol NaCl, 50 mM MOPS, 15% Ethanol, pH 8,2. Das Eluat wurde in 0,7 Volumen Isopropanol präzipitiert und bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde luftgetrocknet für 5 Minuten und mit hochkonzentrierten EcoRI von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) geschnitten.
Die Inserts, die an die 333 bp-Sonde hybridisierten, wurden aus Agarosegelschnitten gereinigt unter Verwendung eines Qiaex DNA-Extraktionskits (Qiagen, Chatsworth, CA). Eine Lösung von 3 M NaI, 4 M NaClO₄, 5 mM Tris-H, pH 7,5 in dreifachem Volumen der Gelschnitte wurde zugesetzt, gemeinsam mit 0,1 mal des Gelschnittvolumens von 1 M Mannitol und 10 ml Qiaex-Granulat in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Das Gemisch wurde bei 50°C für 10 Minuten oder bis die Agarose vollständig gelöst war, erhitzt. Es wurde der DNA bei Raumtemperatur für 5 Minuten ermöglicht zu adsorbieren und dann wurden die Röhrchen kurz zentrifugiert (6 Sekunden). Nachdem die Überstände verworfen wurden, wurde das Qiaex-Granulat in den Röhrchen in einer Lösung, enthaltend 8 M NaClO₄ gewaschen und zentrifugiert (6 Sekunden). Diese Waschung und Zentrifugation wurde wiederholt und es folgten zwei Waschungen (jede gefolgt von 6 Sekunden Zentrifugation) in einer Lösung, enthaltend 70% Ethanol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5. Das Granulat wurde luftgetrocknet und in 20 μl Wasser eluiert.
Die gereinigten Inserts wurden in pUC19 (New England Biolabs) unter Verwendung von Boeringer Mannheims T4 DNA-Polymerase kloniert. Es lag ein Insert zu Vektor (molares)-Verhältnis von etwa 5 : 1 vor. Ligation wurde über Nacht bei 14°C durchgeführt. Das ligierte Material wurde Ethanol-präzipitiert in Anwesenheit von Glycogen, um die Rückgewinnung zu steigern. Dieses Material wurde dann in BRLs (Gibco-BRL, Gathersburg, MD)-elektroporationskompetente DH10B-Zellen elektroporiert.
Plasmid-DNA-Präparationen wurden hergestellt unter Verwendung von Qiagen-Plasmid-DNA-Reinigungskit. Eine 10 ml über Nacht-Kultur einer einzelnen Bakterienkolonie wurde in Terrific Broth [Tartoff und Hobbs, Bethesda Res. Lab. Focus 9: 12 (1987) wachsen gelassen. Pro Liter: 12 g Bacto-Trypton, 24 g Bacto-Hefeextrakt, 4 ml Glycerol] mit 50 μg/ml Ampicilin. Das über Nacht Gewachsene wurde verwendet, um eine 250 ml Kultur in einer sterilen 1 Liter abgedeckten Flasche, enthaltend Terrific Broth mit 50 μg/ml Ampicilin, zu inokulieren. Nach diesem Wachstum zur Sättigung wurde das Medium zentrifugiert bei 5.000 rpm für 10 Minuten. Das bakterielle Pellet wurde resuspendiert in 10 ml von 100 μg/ml RNaseA, 50 mM Tris-HCl. 10 ml von 200 mM NaOH, 1% SDS wurden zugefügt zu dem resuspendierten Pellet und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. 10 ml 2,55 M KAc, pH 4,8, wurde zugefügt und vorsichtig gemischt. Das Material wurde sofort bei 10000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde durch ein Baumwoll-Gaze-Pad gefiltert und das Lysat, das partikelfrei war, wurde auf eine Qiagen Tip-500-Säule gegeben, dem gleichen Verfahren folgend wie bei dem Lamda-DNA-Präparationsverfahren.
Screening einer zweiten cDNA-Bibliothek. Eine cDNA-Bibliothek aus humaner Kolonmucosa, freundlicherweie zur Verfügung gestellt von Jim Pipas der Universität Pittsburgh, war die zweite Bibliothek, die auf TIMP-3-cDNA gescreent wurde. Diese Bibliothek verwendete Uni-Zap (Stratagene, La Jolla, CA) als Vektor und hatte einen Titer von 2,4 × 10¹⁰ pfu/ml. Hybridisierung wurde durchgeführt wie mit der Nierenbibliothek, unter Verwendung der 333 bp-Sonde. Der Uni-Zap-Vektor besitzt ein pBluescript-Fhagernid, das aus dem Phagen ausgeschnitten wurde, an den die Sonde hybridisierte und direkt sequenziert.
Phagenpartikel wurden isoliert und amplifiziert wie folgt. Phagenpartikel wurden in den SM-Puffer entlassen durch Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. In einem 50 ml-Teströhrchen wurden 200 μl von O.D.₆₀₀=1,0 XL1-Blue Zellen und 200 μl des Lambda-Zap-Phagen, kombiniert mit 1 ml des R408-Helferphagen, der einen Titer von 10¹⁰ pfu/ml hatte. Das Gemisch wurde bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. 3 ml 2xYT-Medium (pro Liter: 16 g Bacto-Trypton, 10 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCl) wurden zugesetzt und das Gemisch wurde dann für 2,5 Stunden bei 37°C mit Schütteln inkubiert. Das Röhrchen wurde erhitzt bei 70°C für 20 Minuten und dann 4000 × g für 5 Minuten zentrifugiert.
Um das Phagemid zu retten, wurden 50 μl des hitzezerstörten Phagen-Stocks mit 200 μl O.D.₆₀₀=1,0 XL1-Blue Zellen in einem 1,5 ml Röhrchen inkubiert. Zusätzlich wurden 10 μl des 10² verdünnten hitzezerstörten Phagen mit 200 μl O.D.₆₀₀=1,0 XL1-Blue Zellen in einem getrennten 1,5 ml-Röhrchen inkubiert. Die Röhrchen wurden bei 37°C für 15 Minuten inkubiert und die Zellen wurden dann auf LB-Ampicilin-Platten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Kolonien, die auf der Platte erschienen, enthielten das pBluescript SK- Doppelstrang-Phagemid mit dem klonierten DNA-Insert.
Dieses Screening ergab einen Klon, hier "TIMP3HCM3" (vg. 16) genannt, dem ein Teil, der den N-Terminus des reifen Polypeptids kodiert, fehlt.
DNA-Sequenzierunq
Alle Sequenzierungen wurden auf Applied Biosystems, Inc. (ABI) 373A-automatischen Sequenzierern durchgeführt. PCR-Produkte wurden sequenziert unter Verwendung von Nested pUC-Vektor-Farbstoffprimern und ABI Katalysatoren, um die Reaktionen durchzuführen.
Doppelstrang-cDNAs, die in pUC19 kloniert waren, wurden sequenziert unter Verwendung von ABI Prism Ready Reaction Dye-Deoxy Terminator Cycle-Sequenzierungskit, unter Verwendung des Protokolls, das mit dem Kit kam. Für Bereiche mit hohem GC-Gehalt, der zu Haarnadel-Schleifen führt, wurden die Reaktionen mit den folgenden Veränderungen von dem Standard-Kitprotokoll durchgeführt: Denaturierung bei 98°C für 30 Sekunden, 12 U Amplitaq, Austausch von New England Biolabs (NEB) Vent-Polymerasepuffer für den ABI TACS-Puffer und 30 Zyklen anstelle von 25 Zyklen.
Sequenzanalyse
DNA und abgeleitete Aminosäureanalysen verwendeten die Genetik-Computergruppe (GCG)-Sequenzanalysesoftware der Universität von Wisconsin, Abteilung für Genetik, Genetic Computer Group, Inc., University Research Park, 575 Science Drive, Suite B, Madison, Wisconsin 53711.
Expression von rekombinantem humanen TIMP-3 in E. coli
Die kodierende Sequenz von Timp3clone7 wurde amplifiziert durch PCR unter Verwendung eines Standard-Kit-Protokolls. Primer 544–29 SEQ ID Nr. 8 (5'-AAC AAA CAT ATG TGC ACA TGC TCG CCC AGC C-3') besteht aus den Nukleotiden 351 bis 369, die TIMP-3-Aminosäuren 24–29 kodieren (1–6 des reifen Proteins aus 1). Eine Ndel-Stelle und 6 Extrabasen (unterstrichen) wurden eingeschlossen, um die Subklonierung in einen bakteriellen Expressionsvektor zu erleichtern. Das Methionin-Initiationscodon (kursiv) wurde zugefügt, um die Expression zu erleichtern. Der Stromabwärts-Primer, 532–13, SEQ ID Nr. 9 (5'-CGG GAT CCT ATT AGG GGT CTG TGG CAT TGA TG-3') korrespondiert zu den Nukleotiden 896 bis 914 (aus 1) mit einer zugefügten BamHI-Stelle und zwei zusätzlichen Basen (unterstrichen), wie auch Stopp-Kodons (kursiv). Das natürlich vorkommende Stopp-Kodon, TGA (TCA auf dem reversen Gegenstück) wurde verändert zu TAA (TTA auf dem reversen Gegenstück), da es ein effizienteres Stopp-Kodon in E. coli ist. Das zweite Stopp-Kodon, TAG (CTA auf dem reversen Gegenstück) wurde als Sicherheit zugefügt.
Der Vektor pCFM3102, wie nachstehend beschrieben, wurde verdaut mit Ndel und BamHI über Nacht und war das 589 bp-PCR-Fragment, das TIMP-3 kodiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Extraktion mit Phenol/Chloroform, gefolgt von Extraktion mit Chloroform alleine. Die wässrige Schicht wurde dann durch eine 1 ml Sephadex G-50-Spinsäule (in einer 1 ml-Spritze) gegeben, die mit 200 μl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0 äquilibriert wurde. Der Durchfluss aus der Säule wurde gesammelt und mit 0,1 Volumen 3 M NaAc, pH 5,4 und 2,5 Volumen 100% Ethanol präzipitiert. Nach Zentrifugation wurde das Pellet in 70% Ethanol gewaschen und in einer Speed-Vac (Savent) getrocknet. Die Pellets wurden resuspendiert in 20 μl Super-Q-Wasser.
Eine Kontrollligation, enthaltend geschnittenen pCFM3102 ohne Insert wurde zusätzlich zur TIMP-3L::pCFM3102-Litation durchgeführt. Die Ligationen wurden durchgeführt über Nacht bei 14°C, unter Verwendung von Boehringer Mannheim T4 DNA-Ligase. Sie wurden dann präzipitiert, gewaschen und wie vorstehend getrocknet. Die Pellets wurden dann rasuspendiert in 5 μl Super-Q-Wasser. 2,5 μl jeder Ligation wurde dann verwendet, um 40 μl elektroporations-kompetente Zellen zu elektroporieren.
Elektroporation des Plasmids in E. coli fand in 0,1 cm-Küvetten (Bio-Rad) bei 1,9 kV, 200 Ohm, 25 μF unter Verwendung eines Bio-Rad Gen-Pulsers statt und mit sofortiger Erholung in 5 ml SOC-Medium. Die Zellen konnten sich bei 28°C für 11,3 Stunden erholen und wurden auf LB-Platten ausplattiert, die Canamycin enthielten. Die Platten wurden bei 28°C über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden auf Inserts gescreent durch PCR unter Verwendung von vektorspezifischen Primem 315–21 (SEQ ID Nr. 10 (5'-ACC ACT GGC GGT GAT ACT GAG-3') und 315–22 (SEQ ID Nr. 11 (5'-GGT CAT TAC TGG ACC GGA TC-3').
Kolonien, die ein Insert enthielten, ergaben ein PCR-Produkt, das 589 bp länger ist als das PCR-Produkt, das von dem Onginalvektor ohne Insert abgeleitet war.
Konstruktion des Expressionsplasmids pCFM3102
Expression des reifen Proteins wurde in E. coli erreicht, unter Verwendung eines Plasmidvektors. Eine Kultur dieser E. coli, die ein Plasmid enthalten, das ein reifes Polypeptid, wie dargestellt in 1 kodiert, ist hinterlegt bei der ATCC, Zugangsnummer 69454.
Das verwendete Plasmid war abgeleitet von pCFM836, das vollständig beschrieben ist in U.S.-Patent Nr. 4,710,473. Die Konstruktion des vorliegenden Plasmids (genannt pCFM3102) aus dem beschriebenen pCFM836-Plasmid (U.S.-Patent Nr. 4,710,473) erfolgte durch Zerstörung der zwei endogenen Ndel-Restriktionsstellen durch Auffüllen mit T4-Polymeraseenzym, gefolgt von Ligation stumpfer Enden, durch Ersetzen der DNA-Sequenz zwischen der einzigartigen AatII- und ClaI-Restriktionsstellen, die den synthetischen P_L-Promotor mit einem ähnlichen Fragment enthalten, erhalten von pCFM636 (Patent Nr. 4,710,473), enthaltend den P-Promotor, durch Substitution der kleinen DNA-Sequenz zwischen den einzigartigen ClaI- und KpnI-Restriktionsstellen mit einem Oligonukleotid, das eine Anzahl von Restriktionsstellen enthält, und durch Ausführen einer Reihe von stellenspezifischen Basenaustauschen durch PCR überlappende Oligonukleotidmutagenese durch den intermediären pCFM1656-Vektor (4799 Basenpaare).
Fermentation
Das Inokulum für die Fermentation wurde gestartet durch Übertragen von 0,1 ml eines Glycerinstocks bei 1 O.D./ml in LB + 17% Glycerin von ATCC Zugangsnr. 69455 (E. coli Wirtszellen, die das pCFY13102 mit eingebauter TIMP-3-Kedierungssequenz enthalten ) in eine 2 I-Stutzenflasche, enthaltend 500 ml Luria Broth (10 g/l Trypticase-Pepton, 10 g/l Hefeextrakt und 5 g/l Natriumchlorid). Die Kultur wurde in einem Schüttelplattforminkubator bei 30°C für 16 Stunden bei 250 rpm gebracht. Die Kultur wurde dann in 8 Liter steriles Medium in einen BioLafitte 15 I- Fermenter transferiert.
Die 8 Liter des Mediums, die im Fermenter sterilisiert wurden, bestanden aus dem folgenden:

10 g/l Hefeextrakt

5,25 g/l Ammoniumsulfat

3,5 g/l zweibasisches Kaliumphosphat

4,0 g/l monobasisches Kaliumphosphat

1,25 g/l Natriumchlorid
Nachdem das sterilisierte Medium auf 30°C abgekühlt war, wurde das Folgende zugesetzt:

40 g Glucose

8 g Magnesiumsulfatheptahydrat

16 ml Spurenmetalllösung¹
Der pH des Mediums wurde bei 7,0 eingestellt, unter Verwendung von konzentrierter Phosphorsäure. Die anderen Parameter der Fermentation während dieser Batch-Phase wurden wie folgt gesetzt:
Luftflussrate = 31,0 l/Min.
Bewegung = 350 rpm
Ablesung des gelösten Sauerstoffes wurde bei 60% gesetzt
Sauerstoffflussrate = 0
Hinterdruck = 0,5 bar
Sobald die Kultur in dem Fermentationsgefäß eine O.D.600 von 6,0 erreichte, wurde eine konzentrierte Lösung von Glucose und organischem Stickstoff gestartet, unter Verwendung eines Plans, der den Einspeisungszufluss gemäß der O.D. der Kultur steuerte. Diese konzentrierte Einspeisung (Einspeisung 1) bestand aus dem Folgenden:

50 g/l Trypticase-Pepton

50 g/l Hefeextrakt

450 g/l Glucose

8,5 g/l Magnesiumheptahydrat

10 ml Spurenmetalllösung¹

10 ml Vitaminlösung²
Zu dem Zeitpunkt, an dem die konzentrierte Zuführung zum ersten Mal in den Fermenten eingeführt wurde, wurden die folgenden Veränderungen durchgeführt:
Die Bewegung wurde auf 850 rpm gesteigert,
der Hinterdruck auf 0,8 bar gesteigert.
Unter Verwendung der konzentrierten Zuführung wurde die O.D. auf 30 gesteigert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur induziert durch Steigerung der Temperatur auf 42°C. Andere Veränderungen wurden wie folgt durchgeführt: Luftflussrate verringert auf 24 l/Min. Sauerstoffflussrate gesteigert auf 3 l/Min. Zuführung 1 verringert auf 0 Zuführung 2 gestartet bei 300 ml/Std.
Zuführung 2 bestand aus dem Folgenden:

200 g/l Trypticase-Pepton

100 g/l Hefeextrakt

110 g/l Glucose
Nach 4 Stunden bei 42°C wurde die Fermentation unterbrochen und die Zeilen wurden geerntet durch Zentrifugation in Plastikbeuteln, die in einer 1 Liter-Zentrifugenflasche enthalten waren. Zentrifugation fand bei 400 rpm für 60 Minuten statt. Am Ende dieses Zeitraums wurde der Überstand entfernt und die zurückbleibende Zellpaste wurde bei –90°C eingefroren.
¹Spurenmetalllösung:

27 g/l FeCl₃·6H₂O

2 g/l ZnCl₂·4H₂O

2 g/l CaCl₂·6H₂O

2 g/l Na₂MoO₄·2H₂O

1,9 g/l CuSO₄·5H₂O

0,5 g/l H₃BO₃

100 ml/l konzentrierte HCl
²Vitaminlösung:

0,42 g/l Riboflavin

5,4 g/l Pantonsäure

6 g/l Niacin

1,4 g/l Pyridoxinhydrochlorid

0,06 g/l Biotin

0,04 g/l Folsäure
NH₂-terminale Aminosäure-Seguenzierung
Es wurde bestimmt, dass die NH₂-terminale Aminosäuresequenz von E. coli abgeleitetem rekombinantem TIMP-3-Protein identisch mit der Sequenz, abgeleitet von den cDNA-Klonen, war. Der Methionininitiator des Konstrukts wurde abgespalten. Es gab keine andere nachgewiesene proteolytische Prozessierung an dem TIMP-3 NH₂-Terminus. Keine Zuordnung wurde für cys-1 und cys-2 gemacht, da die Proteinprobe reduziert war und reduzierte Cysteine nicht leicht mit diesem Verfahren nachgewiesen werden können. Deshalb liest sich die Sequenz wie folgt: X-T-X-S-P-S-H-P-Q-D-A-F-
Verfahren
Teilweise gereinigtes rekombinantes TIMP-3, das in E. coli-Einschlusskörperchen (inclusion bodies) anwesend war, wurde einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel unterzogen und auf eine PVDF-Membran zur Sequenzanalyse elektrogeplottet. NH₂-terminale Aminosäureanalyse wurde durchgeführt auf einem Gasphasen-Sequenzer (Modell 477, Applied Biosystems, Foster City, CA) gemäß den publizierten Protokollen. Hewick et al., J. Biol. Chem., 256: 2814–2818 (1981). Der Sequenzer war ausgestattet mit einem Online-Phenylthiohydantoin (PTH) Aminosäure-Analysegerät und einem Modell 900-Datenanalysesystem (Hunkapiller et al., Methods of Protein Microcharacterization, Clifton, NJ: S. 223–247 (1986)). Die PTH-Aminosäureanalyse wurde durchgeführt mit einem Mikroflüssigkeits-Chromatografiesystem (Modell 120) unter Verwendung von dualen Spritzenpumpen und Reversed Phase (C-18)-engen Bohrungssäulen (Applied Biosystems, Inc.), mit den Ausmaßen von 2,1 mm × 240 mm.
Preteinreinigunq
Etwa 435 g Nassgewicht der E. coli-Zellpaste, geerntet von dem Fermentationslauf oder resuspendiert zu einem Volumen von 1760 ml in Wasser und ausgebrochen durch zwei Passagen durch einen Mikroverflüssiger. Das Zelllysat wurde bei 17.700 × g für 30 Min. zentrifugiert und die Pelletfraktion wurde einmal mit Wasser gewaschen (durch Resuspension und durch Rezentrifugation). Ein Teil des gewaschenen Pelletmaterials (3,1% des Gesamtvolumens) wurde resuspendiert in 10 ml von 50 mM Tris-HCl/50 mM Dithiothreitol/2% (Gewicht/Volumen) Natrium-N-lauroyisarcosin, pH 8,5. Nach Inkubation bei 50°C für 5 Min. und bei Raumtemperatur für 3 Std. wurde das Gemisch zentrifugiert bei 20.000 × g für 60 Min. Der Überstand wurde auf eine Sephacryl S-200-Gelfiltrationssäule (Pharmacia; 2 × 23 cm), äquilibriert in 20 mM Tris/HCl/1% Natrium-N-lauroylsarcosin, pH 8,0, bei Raumtemperatur, gegeben. Faktionen von 1 ml wurden gesammelt bei einer Flussrate von 5 ml/Std. und analysiert durch A₂₈₀ und durch SDS/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Fraktionen 43– 53 wurden vereinigt und der Pool wurde über einen 3 Tages-Zeitraum gegen 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,02% (Gewicht/Volumen) Natriumazid bei 4°C dialysiert.
3 zeigt ein silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel des partiell gereinigten Expressionsproduktes aus dieser Fermentation. Bahnen 4 und 5 enthalten reduziertes E. coli-abgeleitetes TIMP-3, vor und nach Dialyse. Bahnen 9 und 10 enthalten unreduziertes E. coli-abgeleitetes TIMP-3, vor und nach Dialyse. Wie man sieht, ist das apparente Molekulargewicht für das reduzierte Material etwa 22 kDa.
Wie man aus 3 sieht, war der Ertrag nach Dialyse reduziert; das Polypeptid schien der Solubilisierung etwas unzugänglich zu sein. In dem vorliegenden Verfahren resultierte die Anwesenheit von Einschlusskörperchen (inciusion bodies), die relativ unlösliches Material enthielten, in einer reduzierten Menge an gereinigtem und isoliertem TIMP-3. Obwohl dies in einem teilweise gereinigten Produkt resultierte, kennt der Fachmann Verfahren, um ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid zu erhalten. Zum Beispiel kann man andere Detergentien als Solubilisierungsmittel verwendeten oder andere Expressionssysteme, zum Beispiel eines, das die Sekretion des Polypeptids erlaubt (und somit Einschlusskörperchen eliminiert).
Expression und Reinigung wurde auch unter Verwendung eukaryotischer Zellen (COS-7-Zellen) versucht, jedoch wurde kein aktives rekombinantes TIMP-3-Polypeptid beobachtet. Dies könnte an der Anheftung des rekombinanten TIMF-3-Polypeptids an das extrazelluläre Matrixmaterial, das von COS-7-Zellen hergestellt wird, liegen. Ein möglicher Weg, um aktives Protein aus einer Säugerwirtszelle zu erhalten, kann die Verwendung von Zellen, die nicht-anheftend sind und somit keine signifikante Menge von extrazellulärem Matrixmaterial herstellen, sein. Das rekombinante Polypeptid würde dann in dem konditionierten Kulturmedium gefunden werden. Zum Beispiel könnten Jurkat-Zellen oder U937-Zellen zur rekombinanten Polypeptidexpression verwendet werden und andere nicht-anheftende Wirtszellen und Expressionssysteme sind dem Fachmann bekannt.
Ergebnisse des Screenens von zwei cDNA-Bibliotheken und Expression von rekombinantem humanen TIMP-3
Die hier dargestellte Arbeit präsentiert die Klonierung und Expression einer driften Klasse von Säuger-TIMP-Familienmitgliedern, hier kollektiv als "TIMP-3" bezeichnet. Die Nukleotidsequenz, die aus einer humanen fötalen Nieren-cDNA-Bibliothek erhalten wurde, ist in 1 gezeigt. SEQ ID Nr. 12. Wie man sieht, enthält die erhaltene Nukleinsäuresequenz 1240 Basenpaare. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz ist auch gezeigt. SEQ ID Nr. 13 (Die Aminosäuresequenz ist vorhergesagt, da das Polypeptid selbst nicht vollständig sequenziert wurde. Der Fachmann kann das Expressionsprodukt von E. coli, hinterlegt bei der ATCC, Zugangsnr. 69455 sequenzieren). Das vorhergesagte initiale Cystein des reifen Proteins ist Nummer +1. Diese Vorhersage basiert auf Vergleich mit anderen Mitgliedern der TIMP-Familie.
4 zeigt diesen Vergleich unter den bekannten Mitgliedern der TIMP-Familie. Kugelpunkte (•) zeigen diese Aminosäurereste an, die einzigatig in dem TIMP-3 aus 1, erhalten aus der Expression von humaner cDNA, sind und Fettschrift zeigt konservierte Reste an.
Wie man sieht, unterscheidet sich das vorliegende humane rekombinante TIMP-3 aus 1 von allen anderen Mitgliedern der TIMP-Familie. Während es die konservierten Cysteinreste und andere konservierte Aminosäuren in der Familie (39 insgesamt) besitzt, sind wenigstens 23 Aminosäurereste einzigartig in dem dargestellten humanen rekombinanten TIMP-3.
Die 5–13 stellen die Unterschiede zwischen dem vorliegenden humanen TIMP-3 aus 1 und Hühner-TIMP-3 ("ChIMP-3", 5–7), humanen TIMP-2 (8–10) und humanen TIMP-1 (11–13), auf sowohl Aminosäure- als auch Nukleinsäureebene dar. Die Figuren enthalten eine durchgezogene Linie zwischen Aminosäureresten, die identisch sind und Punkten, die den Grad der evoiutionären Distanz anzeigen. (Für 5, 8 und 11, die den Aminosäureabgleich darstellen, gilt die Nummerierung an Position "1" für das reife Polypeptid.
Auf Aminosäureebene sind TIMP-3 und ChIMP-3 etwa 80% identisch, mit identischen Aminosäuren, die mehr oder weniger diskontinuierlich verteilt sind (5). 6 zeigt, dass die TIMP-DNA aus 1 auf Nukleinsäureebene etwa 74% homolog zu der ChIMP-DNA ist, zwischen Nukleinsäuren 151–1087 (TIMP-3) und 1–886 (ChIMP-3). 7 zeigt, dass, auch wenn man die Region mit maximaler Homologie analysiert (Basenpaare 282–1040 aus 1 TIMP-3 und 113–884 für ChIMP-3), eine Identität von etwa 78% besteht.
8–10 zeigen einen Vergleich zwischen humanem rekombinanten TIMP-3 aus 1 und humanem TIMP-2. Auf sowohl Aminosäureebene, als auch Nukleinsäureebene sind größere Unterschiede vorhanden als mit ChIMP-3. 8 zeigt, dass dort etwa 46% Identität auf Aminosäureebene besteht. 9 zeigt, dass die Gesamthomologie etwa 52% auf Nukleinsäureebene ist und etwa 60% in der Region der maximalen Homologie (10).
11–13 zeigen einen Vergleich zwischen humanem rekombinanten TIMP-3 aus 1 und humanem TIMP-1. Auf Aminosäureebene besteht etwa 39% Identität (11) und etwa 47% Gesamthomologie auf der Nukleinsäureebene. Es besteht etwa 65% Identität in der Region der maximalen Homologie.
Biochemisch sind die berechneten isoelektrischen Punkte (pl) von dem reifen TIMP-3-Polypeptid und seinem Vorläufer jeweils 9,16 und 8,80. Es gibt eine potentielle Glycosylierungsstelle in der Carboxy-terminalen Sequenz (184: NAT). Während berichtet wurde, dass natürlich vorkommendes ChIMP-3 nicht glycosyliert ist (Pavloff et al., oben, J. Biol. Chem. 267: bei 17323), ist bislang nicht bekannt, ob natürlich vorkommendes humanes TIMP-3 glycosyliert ist. Ungeachtet dessen schließt die vorliegende Erfindung Polypeptide mit zusätzlichen chemischen Gruppen wie Kohlenhydraten ein. Der hydrophobe "Leader" des 1-Materials ist 23 Aminosäuren lang. Die Sequenzierung des N-Terminus bestätigte die Identität der ersten 12 Aminosäuren des reifen rekombinanten Polypeptids.
Die Klonierung und Expression, die hier beschrieben ist, zeigt, dass die vorligenden TIMP-3-Polypeptide neue Mitglieder in der TIMP-Familie repräsentieren.
BEISPIEL 2
Expression von TIMP-3 in verschiedenen Zellypen
Eine Auswahl von Zellen wurde auf Expression von TIMP-3-RNA getestet (was Polypeptidexpression anzeigen würde). Die Ergebnisse zeigen, dass unter normalen (d. h. nicht karzinogenen) Zellen Expression in Zellen beobachtet wird, die mit extrazellulärer Matrix-Aktivität (d. h. Wachstum und Degradation) assoziiert sind. Die normalen Zellen (oder Gewebe), in denen TIMP-3-RNA-Expression gesehen wurde (14A und B) sind Plazenta, Bindegewebszellen, embryonale Lunge, Neugeborenenvorhaut (eine von zwei Proben war leicht positiv) und (leicht positiv) erwachsene Lunge. Unter den getesteten Krebszellen waren einige positiv, einige negativ. Zum Beispiel ergaben verschiedene Brustadenokarzinomzellen ungleiche Ergebnisse; wenn eine positiv war, war eine negativ oder leicht positiv. Dies kann zeitliche Expression anzeigen, insofern, dass TIMP-3-Expression über den Verlauf der Krankheitsprogression variieren kann, obgleich die Signifikanz unklar ist. Tabelle 2, nachstehend, zeigt eine Beschreibung von den getesteten Zellen und den Ergebnissen. Nachstehend sind die Verfahren.
In vielen der positiven Zelllinien wurden drei mRNA-Banden von etwa 2,2, 2,5 und 4,4 kb Größe nachgewiesen. Die Signifikanz der verschiedenen mRNA-Banden ist unbekannt, jedoch können sie alternatives Spleißen oder verlängerte 3'- oder 5'-untranslatierte Regionen repräsentieren. Diese können RNAs sein, die verschiedene natürlich vorkommende Varianten kodieren.
Verfahren
Zwei Typen von Northern Blots wurden durchgeführt, einer mit Gesamt-RNA Transkripten und einer unter Verwendung von Poly A⁺-Schwanz-Transkripten.
Gesamt-RNA-Präparation. Gesamt-RNA für den Gesamt-RNA Northern wurde aus Zeilen extrahiert, unter Verwendung einer Modifikation eines publizierten Protokolls (Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156–159 (1987).
Zellen, die in 2 × 10 cm Petrischalen (etwa 2 × 10⁶ Zellen) gewachsen waren, wurden zweifach mit kaltem 1 × PBS gewaschen. Nachdem das ganze PBS aufgesaugt wurde, wurden 500 μl einer wässrigen Lösung, die das folgende enthielt, jeder Schale zugesetzt: 4 M Guanidiniumthiocyanat (Fluka), 25 mM Natriumcitrat pH 7,0 (Mallinckrodt), 0,5% Sarcosyl (Sigma, St. Louis, MO), 0,1 M β-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO). Das Zelllysat wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Mikrofugenröhrchen pipettiert und mit einer 25er-Nadel geschert.
Natriumacetat (pH 4) wurde dem 500 μl Lysat zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,2 M zu ergeben. Das Gemisch wurde stark von Hand geschüttelt. 1/5 Volumen Chloroform wurde zugesetzt und gründlich vermischt. Die Röhrchen wurden bei 15.000 rpm für 5 Minuten bei 20°C in einer Tomy MTX-100-Zentrifuge zentrifugiert. Die Röhrchen wurden ivertiert, um es der weißen Präzipitatschicht zu ermöglichen, sich von der wässrigen Schicht zu lösen, anstelle von erneutem Drehen. Die RNA wurde zwei zusätzliche Male re-extrahiert mit Phenol und Chloroform und wurde ein letztes Mal mit Chloroform extrahiert. 1 ml Isopropanol wurde dem Mikrofugenröhrchen zugesetzt und das Gemisch wurde bei –20°C über Nacht präzipitiert. Am nächsten Tag wurde es bei 15.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert. Das Pel- let wurde mit 1 Volumen 80%-igem Ethanol gewaschen, wieder gedreht und in einer Speed Vac (Savant, Farmingdale, NY) getrocknet.
Das Pellet wurde in 400 μl der Guanidiniumlösung, die β-Mercaptoethanol (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, resuspendiert. 800 μl Ethanol wurden diesem Gemisch zugesetzt, das dann bei 15.000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert wurde und mit 80%-igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde resuspendiert in 20 μl Wasser und die O.D. wurde bestimmt.
Poly A+-RNA Präparation. Poly A+-RNA wurde präpariert unter Verwendung von Clontech (Palo Alto, CA) Oligo dT-Cellulose-Zentrifugensäulen. 2 × 1 ml eines Hochsalzpuffers (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl) wurden durch die Säulen gewaschen und durch Schwerkraft abfließen gelassen. Gesamt-RNA, isoliert wie vorstehend beschrieben, wurde resuspendiert in einem 1 ml Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA) und wurde erhitzt bei 68°C für 3 Minuten. 0,2 ml des Probenpuffers (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA, 3 M NaCl) wurde der RNA-Lösung zugesetzt, die dann auf Eis gebracht wurde.
Die Proben wurden auf die frisch äquilibrierten Säulen gebracht und es wurde ihnen ermöglicht, unter Schwerkraft einzuziehen. Die Säulen wurden in 50 ml-Röhrchen gebracht und bei 350 × g für 2 Minuten zentrifugiert. Die Eluate wurden verworfen. 0,25 ml des Hochsalzpuffers (siehe oben) wurde jeder Säule zugefügt und die Säulen wurden bei 350 × g für 2 Minuten zentrifugiert. Diese Waschung wurde einmal wiederholt. In jedem Fall wurden die Eluate verworfen. Die Säulen wurden dann dreimal mit Niedersalzpuffer (10 mM Tris-NCl [pH7,4], 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl) gewaschen und zentrifugiert, jedes Mal bei 350 × g für 2 Minuten. Die Eluate wurden in jedem Fall verworfen. Sterile 1,5 ml Nlikrozentrifugenröhrchen wurden in die 50 ml-Röhrchen gebracht, um die nachfolgenden Elutionen zu sammeln. 0,25 ml des Elutionspuffers (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA), aufgewärmt auf 65°C, wurde auf die Säulen gebracht,. die dann bei 350 × g für 2 Minuten zentrifugiert wurden. Dieses Verfahren wurde 3 mal wiederholt auf eine Gesamtzahl von 4 Elutionen pro Säule. Von jeder Säule wurden alle Elutionen in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Die Eluate wurden Ethanol-präzipitiert, wie vorstehend.
Northern Blotting. 10 μg Gesamt-RNA wurden in jede Bahn geladen. Der Probenpuffer enthielt 10 μl Formamid, 3,5 μl Formaldehyd, 2 μl 10 × MOPS. 2 μl Ladungsfarbstoff, 0,2 μl Ethidiumbromid und 6,5 μl RNA-Probe in Wasser. Im Poly A+-RNA-Blot wurden 3 μg mRNA in jede Bahn geladen.
Die Gele für die Northern Blots bestanden aus 1,5 g Agarose, die in 95 ml Wasser geschmolzen war und dann auf 60°C abgekühlt wurde. 30 ml 5 × MOPS und 25 ml Formaldehyd (pH 4,7) wurden zu der kühlenden Agaroselösung hinzugefügt. Vor dem Transfer wurden die Gele zurechtgestutzt, um überflüssiges Gel zu entfernen. Sie wurden dann in destilliertem Wasser für 5 Minuten eingeweicht, gefolgt von 10 Minuten Einweichen in 50 mM NaOH, 10 mM NaCl bei Raumtemperatur. Die Gele wurden in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 für 45 Minuten neutralisiert und dann in 20X SSC für 1 Stunde eingeweicht. Transfer erfolgte über Nacht in 10 X SSC. Die Gele wurden auf Schleicher & Scheull (Keene, NH)-Nitrocellulosemembranen geblottet. Das Gesamt-RNA-Gel wurde auf reine Nitrocellulose geblottet und durch UV-Crosslinking unter Verwendung eines Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) fixiert. Das Poly A+-Gel wurde auf unterstützte Nitrocellulose geblottet und in einem Vakuumofen für 2 Stunden bei 80°C gebacken.
Die Blots wurden in ähnlicher Weise wie das Screenen der cDNA-Bibliothek hybridisiert. Der einzige Unterschied ist, dass für Northem Blot – Analysen RNase-freie Reagenzien verwendet wurden, wo immer es möglich war.
BEISPIEL 3
In Vitro-Aktivität von humanem rekombinantem TIMP-3
Modifiziertes Zymogramm
DeClerck et al. J. Biol. Chem. 266: 17445–17453 (1991) zeigten, dass TIMP-2 an pAPMAaktivierte Kaninchenfibroblasten-interstitielle Kollagenase binden wird in Komplexen, die in SDS stabil sind. Der 52 kDa inaktive Vorläufer wurde in ein aktives 42 kDa-Protein durch die Quecksilber-organische Verbindung (Grgancmercurial) geschnitten. Obwohl das aktive Pro- tein vornehmlich Typ 1-, 2- und 3-Kollagen abbaut, baut es auch Gelatine zu einem geringeren Grad ab.
Konditioniertes Medium (CM) aus Kaninchen Synovial-Fibroblasten enthält interstitiele Kollagenase genauso wie 72 kDa Typ 4-Gelatinase. Das CM wurde inkubiert in 5 μl von 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, pH 7,5 für 15 Minuten in entweder der Anwesenheit oder der Abwesenheit von TIMP-2 (gemäß EP 0 398 753 ), TIMP-2Δ oder die 1 TIMP-3. Beachte, dass TIMP-2Δ sich auf eine trunkierte biologisch aktive Form von TIMP-2 bezieht, mit Aminosäuren 128–194 des reifen Proteins. Tolley et al., J. Mol. Biol. 229: 1163–1164 (1993); Willenbrock et al., Biochemistry 32: 4430–4437 (1993). Es wurde zuvor gezeigt, dass TIMP-2 vorzugsweise mit 72 kDa ProKollagenase interagiert, jedoch, dass diese Komplexe nicht stabil in 0,1% (w/v) SDS sind. Stetler-Stevenson, J. Biol. Chem, 264: 17374–17378 (1989). Das getestete TIMP-3 war das dialysierte TIMP-3 aus 3.
In Abwesenheit von TIMPs waren zwei Zonen der Aufklärung sichtbar, wenn CM aus Kaninchen Synovialen-Fibroblasten auf einem 10%-igen Acrylamid, 0,1%-igem Gelatinegel laufen gelassen wurde. 15. Eine dieser Banden korrespondiert mit der 42 kDA pAPMAaktivierten interstitiellen Kollagenase. Diese Aufklärung war abwesend in der Anwesenheit von CM, inkubiert mit TIMP-2, TIMP-2Δ oder dem TIMP-3 aus 1. Die anderen Zonen der Aufklärung waren nicht betroffen, was bedeutet, dass sie keine SDS-stabilen Komplexe mit dem TIMP bilden. In einem separaten Experiment unter Verwendung der vorliegenden Verfahren (Daten nicht gezeigt) wurde eine Aufklärungszone, die durch Kollagenase in Me dium, das mit COS-7-Zellen konditioniert war, nicht durch die Anwesenheit von TIMP-2, TIMP-2Δ oder TIMP-3 inhibiert.
BEISPIEL 4
Herstellung von TIMP-3-Polypeptidanaloga und Nukleinsäurevarianten
Die Aminosäuresequenz des Volllängen-TIMP-3 ist in 1 gezeigt. Verwendet man die Nummerierung aus 1, ist die Volllängensequenz 188 Aminosäuren lang. Die Aminosäuresequenz an –23 bis –1 ist eine Leadersequenz und somit ist die Vorversion des Polypeptids 211 Aminosäuren lang.
Die kodierende Region der TIMP-3-DNA aus 1 ist –69 bis Position 664 der dargestellten Aminosäuresequenz.
Alternativ kann man für jede Variante eine Signalpeptidsequenz für eukaryotische Zellexpression konstruieren. Wie man aus 16 sehen kann, wurden zwei zusätzliche cDNA-Klone isoliert, TIMP3clone2. SEQ ID Nr. 14, 15 (ATCC-Zugangsnr. 69456) und TIMP3HCM-3 SEQ ID Nr. 16, 17 (ATCC-Zugangsnr. 69453). Diese Klone repräsentieren natürliche Varianten. TIMP3clone 2 fehlt ein Teil der Region, der den N-Terminus der Leadersequenz von TIMP3clone 7 kodiert. Somit würde dieser vorzugsweise in Prokaryoten wie E. coli exprimiert. TIMP3HCM-3 fehlt ein Teil der Region, die den NH₂-Terminus des reifen Proteins kodiert. Da diesem Klon die hydrophobe Leadersequenz fehlt, würde er vorzugsweise in Prokaryoten wie E. coli exprimiert.
16 zeigt, dass dort einige Unterschiede zwischen den drei cDNA-Klonen bestehen. Bei Nukleotid 320 ist ein A in TIMP3clone 2 und ein T in TIMP3clone 7. Dies würde in einem Wechsel der Aminosäuresequenz von einem trp zu einem arg an Position 14 der hydrophoben Leadersequenz führen. Dieser Unterschied kann ein Klonierungsartifakt sein, aufgrund seiner Lokalisierung an dem 5'-Ende von diesem Klon. ChIMP-3 hat auch ein trp an dieser Position. Eine weitere Divergenz kann an Base 529 gefunden werden, an der Klon 2 ein C und Klon 7 und HCM-3 ein T haben. Dieser Polymorphismus resultiert nicht in einem Aminosäureaustausch, da sowohl CAT und CAC his kodieren. Andere Polymorphismen werden nahe dem Poly-A-Schwanz gefunden. Dem Poly-A-Schwanz von HCM-3 geht ein einzelnes G voraus, wohingegen in den anderen zwei Klonen GG vorausgeht. Der Poly-A-Schwanz von Klon 7 ist 15 Basen lang und der Poly-A-Schwanz von HCM-3 ist 18 Basen lang. Der Poly-A-Schwanz von Klon 2 ist 17 Basen lang, ist durch drei andere Basen unterbrochen und wird von 32 Nukleotiden einer zusätzlichen 5'-untranslatierten Sequenz gefolgt.
PCR-Produkt 29 (TIMP3PCR29 SEQ ID Nr. 18, 19, vgl. 16) wurde auch aus dem humanen fötalen Nieren-cDNA-Screening gewonnen, unter Verwendung eines Insert-spezifischen Primers und eines Vektor-spezifischen Primers wie folgt: SEQ ID Nr. 21 (496–16) (CLWTDM vorwärts): 5'-CGG AAT TCT GTC TCT GGA CCG ACA TGC TCT CC 3' SEQ ID Nr. 20 (489–23) (Lambda gt11 rückwärts): 5' GAC ACC AGA CCA ACT GGT AAT G 3'.
Wie man aus 16 sehen kann, kann dies eine natürlich vorkommende C-terminale Variante repräsentieren. In 16B, unten, bis 16C, oben, sind Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen TIMP3clone7 und TIMP3PCR29 dargestellt. TIMP3PCR29, kloniert in pUC19 und gebracht in E, coli wurde hinterlegt bei der ATCC mit Zugangsnr. 69532. Jedoch wurde kein vollständiger cDNA-Klon, der dieses PCR-Produkt einschließt, in der fötalen Nieren-cDNA-Bibliothek gefunden. Es ist unbekannt, ob TIMP3PCR29 eine vollständige oder teilweise Variante oder ein PCR-Artifakt darstellt. Andere TIMP-3-Analoga können hergestellt werden. Ein Typ von Analogon ist eine trunkierte Form, die Bindung an den Teil einer Metalloproteinase zeigt, die Zink bindet. Wie oben angegeben, kann die konservierte Region für diese zinkbindende Domäne durch HEXGH, wobei X entweder F oder L ist, repräsentiert sein. Mit Analogie zu TIMP-2-Deletionsanaloga, die hergestellt wurden, können TIMP-3-Analoga, die enzyminhibierende Aktivität beibehalten, auch hergestellt werden.
17 ist eine Darstellung der vorhergesagten Sekundärstruktur für die TIMP-Familie von Proteinen. Vergleiche Alexander et al., Extracellular Matrix Degradation, in Cell Biology of Extracellular Matrix (2. Ausg., Hay, Hrsg.), Plenum Press, New York, S. 255–302. Wie man sehen kann, bilden die sechs C-terminalen Cysteine eine Sekundärstruktur, die sich etwas von der Struktur unterscheidet, die durch die Region, die die ersten sechs Cysteine einschließt, gebildet wird. Vorher wurde gezeigt, dass TIMP-2-Analoga, denen der C-Terminus bis zu und einschließlich dem sechsten Cystein des C-Terminus fehlt, Aktivität besitzen. Willenbrock et al., Biochemistry 32: 4330–4337 (1993). TIMP-3-Analoga, denen eines oder mehrere der C-terminalen Cysteine fehlt, sind diejenigen, die die Sequenz (Bezug nehmend auf die Nummerierung von 1) von 1–121 und eine der 1–122 bis 1–188 haben. Additionen, Deletionen und Substitutionen können auch mit den Aminosäuren 122–188 durchgeführt werden, genauso wie die Anheftung von chemischen Gruppen, wie Polymere.
Während die vorliegende Erfindung bezüglich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es selbstverständlich, dass Variationen und Modifikationen dem Fachmann einfal len werden. Deshalb ist es beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche all solche äquivalenten Variationen abdecken, die im Rahmen der Erfindung, wie beansprucht, liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine isolierte DNA-Sequenz, umfassend eine Sequenz, die für ein Protein kodiert, umfassend die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure +1 bis +188.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für die Expression in bakteriellen Zellen bevorzugt sind.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für, die Expression in Säugetierzellen bevorzugt sind.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für die Expression in Hefezellen bevorzugt sind.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist.
Eine Antisense-DNA bezüglich der DNA-Sequenz nach Anspruch 1.
Eine DNA-Sequenz, wie in 1 oder 16 gezeigt, wobei diese Sequenz mindestens für die Aminosäuren 1–188, wie in 1 gezeigt, kodiert und gegebenenfalls für einen zusätzlichen Methionylrest an der –1-Position kodiert.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, die kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist.
Eine Antisense-DNA bezüglich der DNA-Sequenz nach Anspruch 10.
Eine DNA-Sequenz nach Anspruch 10, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für die Expression in Bakterienzellen bevorzugt sind.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für die Expression in Säugetierzellen bevorzugt sind.
Die DNA-Sequenz nach Anspruch 10, deren Expression durch die Einbeziehung von ein oder mehreren Kodons optimiert ist, die für die Expression in Hefezellen bevorzugt sind.
Ein Vektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1.
Der Vektor nach Anspruch 16, wobei der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Der Vektor nach Anspruch 16, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
Der Vektor nach Anspruch 18, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Bakteriophagen-Vektor, einem retroviralen Vektor und einem adenoviralen Vektor.
Der Vektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 10.
Der Vektor nach Anspruch 20, wobei der Vektor ein Pfasmidvektor ist.
Der Vektor nach Anspruch 20, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
Der Vektor nach Anspruch 22, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Bakteriophagen-Vektor, einem retroviralen Vektor und einem adenoviralen Vektor.
Eine prokarotische oder eukaryotische, isolierte Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 derart transformiert oder transfiziert ist, dass die Wirtszelle das Polypeptidprodukt exprimieren kann.
Eine prokaryotische oder eukaryotische, isolierte Wirtszelle, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 10 derart transformiert oder transfiziert ist, dass die Wirtszelle das Polypeptidprodukt exprimieren kann.
Ein Polypeptid-Expressionsprodukt der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in einer prokaryutischen oder eukryotischen Wirtszelle:
Das Polypeptid nach Anspruch 26, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz HEXGH bindet, wobei X entweder F oder L ist.
Ein Polypeptid-Expressionsprodukt der DNA-Sequenz nach Anspruch 10 in einer prokarotischen oder eukaryotischen Wirtszelle.
Die Wirtszelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus denjenigen mit den American Type Culture Collection^TM-Bezeichnungen (Timp3clone7/pCFM, Timp3clone7/puC19, Timp3clone2/puC19, Timp3HCM3, TimpP3PCR29) 69455, 69454, 69456, 69453 und. 69532.
Ein Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, umfassend: Wachsen von prokaryotischen oder eukaryotischen, isolierten Wirtszellen, die mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 10 transformiert oder transfiziert sind, unter geeigneten Bedingungen und Isolierung der gewünschten Polypeptid-Expressionsprodukte der DNA-Sequenzen.
Eine Zusammensetzung, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Eine Zusammensetzung, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 31, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Lipidlösungs-Träger, einem Liposom und einem Polypeptid.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 32, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Lipidlösungs-Träger, einem Liposom und einem Polypeptid.
Gereinigtes und isoliertes Polypeptid, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.
Ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid, umfassend die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure +1 bis +188 und das die biologischen oder immunologischen Eigenschaften eines Polypeptids hat, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, wobei die biologische Eigenschaft die Inhibierung einer Metalloproteinase oder die Bindung an das extrazelluläre Matrix-Material ist und die immunologische Eigenschaft die Generierung von Antikörpern ist, die spezifisch an ein Polypeptid binden, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.
Das Polypeptid nach Anspruch 36, wobei das Polypeptid das Produkt der prokaryotischen oder eukaryotischen Expression einer exogenen DNA-Sequenz ist.
Das Polypeptid nach Anspruch 37, wobei die exogene DNA-Sequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Das Polypeptid nach Anspruch 37, wobei die exogene DNA-Sequenz eine genomische DNA-Sequenz ist.
Das Polypeptid nach Anspruch 37, wobei das Polypeptid die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.
Das Polypeptid nach Anspruch 37, wobei die exogene DNA-Sequenz sich auf einem sich autonom replizierenden DNA-Plasmid oder einem viralen Vektor befindet.
Ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 1–188, wie in 1 gezeigt, besitzt und das gegebenenfalls einen Methionylrest an Position –1 besitzt.
Das Polypeptid nach Anspruch 35 oder 36, weiterhin dadurch charakterisiert, dass es kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist.
Ein wie in 1 gezeigtes Polypeptid, das gegebenenfalls ein Methionylrest an Position –1 besitzt und dem ein oder mehrere der sechs C-terminalen Cysteinreste fehlen.
Ein wie in 1 gezeigtes Polypeptid, das gegebenenfalls ein Methionylrest an Position –1 besitzt und das die Aminosäuresequenz 1–121 und gegebenenfalls alle oder Teil der Aminosäuren 122–188 besitzt.
Das Polypeptid nach Anspruch 45, das die Kapazität besitzt, die Zink-Bindungsdomäne von Kollagenase zu binden.
Das Polypeptid nach Anspruch 45, das eine chemische Modifikation besitzt, die an, einer oder mehreren der Aminosäuren 122–1881 lokalisiert ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein gereinigtes und isoliertes Polypeptid, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger.
Ein Herstellungserzeugnis, umfassend ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Agens, wobei das pharmazeutische Agens ein Polypeptid enthält, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt und das Verpackungsmaterial ein Etikett umfasst, das darauf hinweist, dass das pharmazeutische Agens für eine Indikation verwendet werden kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebs, Entzündung, Arthritis, dystrophische Epidermolysis bullosa, parodontaler Erkrankung, Ulzeration, Emphysem, Knochenerkrankungen, Skleroderm, Wundheilung, Erythrozyt-Mängel, kosmetische Gewebswiederherstellung, Befruchtung oder Embryoimplantat-Modulation und Nervenzellerkrankungen.
Ein Herstellungserzeugnis, umfassend ein Verpackungsmaterial und ein pharmazeutisches Agens, wobei das pharmazeutische Agens eine DNA enthält, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert und das Verpackungsmaterial ein Etikett umfasst, das darauf hinweist, dass die pharmazeutische Zusammensetzung für eine Indikation verwendet werden kann, die einen Nutzen ziehen kann aus einer Gentherapie unter Verwendung solcher DNA.
Das Herstellungserzeugnis nach Anspruch 50, wobei die Indikation Emphysem ist.
Ein Kit, enthaltend eine Zubereitung eines Polypeptids, die die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, und eine oder mehrere Zusammensetzungen, die nützlich sind für die Behandlung einer Krankheit, die den Abbau der extrazellulären Matrix umfasst.
Der Kit nach Anspruch 52, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Metalloproteinasen, Serinproteasen, Inhibitoren von Matrix abbauenden Enzymen, intrazellulären Enzymen, Zelladhäsionsmodulatoren und Faktoren, die die Expression von extrazellulären Matrix abbauenden Proteinasen und ihren Inhibitoren regulieren.
Der Kit nach Anspruch 52, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E-Selectinen, Integrinen, L-Selectinen, Chemokinen und chemischen Lockstoffen.
Der Kit nach Anspruch 52, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus BDNF, NT-3, NGF, CNTF und NDF.
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagenasen, PMN-Kollagenase, Stromelysin I, II/Transin, Matrilysin, Invadolysin, PUMP-1, UPA, TPA und Plasmin.
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus α₂-Makroglobulin, Schwangerschaftszonenprotein (pregnancy zone protein), Ovostatin, α₁-Proteinaseinhibitor, α₂-Antiplasmin, Aprotinin, Protease Nexin-1, PAl-1, PAl-2, TIMP-1 und TIMP-2
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus lysosomalen Enzymen, Glycosidasen und Cathepsinen.
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ein Zelladhäsionsmodulator ist.
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ein Faktor ist, der die Expression von extrazellulären Matrix abbauenden Proteinasen und deren Inhibitoren reguliert.
Der Kit nach Anspruch 53, wobei die zusätzliche Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Interleukin, TNF α, TGF-β, Glucocorticoide, Retinoide, EPO, SCF, M-CSF, IGF-I, IGF-II, EGF, einem FGFR, KGF, PDGF, einem Interferon, Proteinkinase C und Inositolphosphatasen.
Ein Kit, einschließend eine DNA, kodierend für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz und einen oder mehrere zusätzliche Faktoren, die das ex vivo-Wachstum von Zellen beeinflussen, die mit der DNA transformiert oder transfiziert sind.
Der Kit nach Anspruch 62, einschließend SCF.
Ein moncklonaler Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.
Ein Kit, enthaltend einen monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen ein Polypeptid, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt.