DE60024450T2 - Modulierung der angiogenese durch verwendung von anti-angiogenischen angiotensin-7 und dafür kodierende polynukleotiden zur behandlung von tumoren - Google Patents

Modulierung der angiogenese durch verwendung von anti-angiogenischen angiotensin-7 und dafür kodierende polynukleotiden zur behandlung von tumoren Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Das für die Entwicklung, den Erhalt und die Reparatur differenzierter Zellen und Geweben verantwortliche zelluläre Verhalten wird zu einem Großteil durch interzelluläre Signale reguliert, die über Wachstumsfaktoren und andere Liganden und ihre Rezeptoren vermittelt werden. Die Rezeptoren für diese intrazellulären Signalmoleküle sind auf der Zelloberfläche der reagierenden Zellen lokalisiert. Wachstumsfaktoren und andere Liganden binden an die Rezeptoren und lösen dadurch eine Transduktion eines Signals über die Zellmembran aus. Eine solche Signaltransduktion kann auf verschiedene Art und Weise auftreten, einschließlich einer Porenbildung und einer Phosphorylierung. Die Phosphorylierung von Tyrosinen auf Proteinen durch Tyrosinkinasen ist eine der Schlüsselfunktionen, durch die Signale über die Zellmembran transduziert werden. Tatsächlich kodieren etliche zur Zeit bekannte Protein-Tyrosinkinasegene-Transmembran-Rezeptoren für Polypeptid-Wachstumsfaktoren und Hormone.
  • Es wird allgemein angenommen, dass die Angiogenese stark durch Wachstumsfaktoren und andere Liganden reguliert wird. Die Angiogenese und die damit einhergehende Gewebeentwicklung und Regeneration hängt von eng kontrollierten Prozessen einer Endothelzellproliferation, Migration, Differenzierung und Überleben ab. Sowohl stimulatorische als auch inhibitorische Liganden scheinen direkt oder indirekt mit den zellulären Rezeptoren während dieser Prozesse zu interagieren. Die Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basismembran durch Enzyme, freigesetzt durch Endothelzellen und Leukozyten. Die Endothelzellen, die das Lumen von Blutgefäßen auskleiden, stehen dann durch die Basismembran hervor. Angiogene Stimulatoren induzieren Endothelzellen zu einer Migration durch die erodierten Basismembranen. Die wandernden Zellen bilden dann eine "Absprossung" des Elternblutgefäßes, wo die Endothelzellen eine Mitose durchlaufen und proliferieren. Die Endothelsprossen verbinden sich miteinander, um kapillare Schlaufen zu bilden und erzeugen so ein neues Blutgefäß.
  • Die an der Endothelzellregulation beteiligten Liganden und Rezeptoren werden langsam aufgeklärt. Insbesondere wurden Endothel-Wachstumsfaktor-Rezeptoren und ihre Kinasen entdeckt. Zum Beispiel wurde ein Gen, kodierend eine Endothelzelltransmembran-Tyrosinkinase von Partanen et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8913–17 (1990)) beschrieben. Dieses Gen und sein kodiertes Protein wird als "TIE" bezeichnet, was eine Abkürzung für "Tyrosinkinase mit Ig und EGF-Homologiedomänen" ist (siehe Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1698–1707 (1992); internationale Patentveröffentlichung WO99/15653). Eine erhöhte TIE-Expression wurde während einer Neovaskularisierung als assoziiert mit der Entwicklung von Eierstockfollikeln und Granulationsgewebe bei Hautwunden dargestellt. (Siehe Korhonen et al., Blood 80: 2548–2555 (1992)). So spielt das TIE-Protein vermutlich eine Rolle bei der Angiogenese.
  • Zwei strukturell verwandte Ratten-TIE-rezeptorähnliche Tyrosinkinasen, TIE-1 und TIE-2 wurden dargestellt; diese Rezeptoren werden durch distinkte Gene kodiert. (Siehe Maisonpierre et al., Oncogene 8: 1631–7 (1993)). Es erwies sich, dass beide Gene weit verbreitet in Endothelzellen von embryonalem und postnatalem Geweben exprimiert werden. Signifikante Niveaus der TIE-2-Transkripte waren auch in anderen embryonalen Zellpopulationen, einschließlich dem Linsenepithel, dem Herzepikard und Regionen des Mesenchyms präsent. (Siehe Maisonpierre et al., supra). Die vorherrschende Expression von TIE-Rezeptoren in vaskulärem Endothel legt nah, dass TIE eine Rolle bei der Entwicklung und dem Erhalt des vaskulären Systems und insbesondere der Angiogenese spielt.
  • Es wurden auch Liganden der TIE-Rezeptoren charakterisiert. Zwei TIE-2 bindende Liganden, Angiopoietin-1 (Ang-1) und Angiopoietin-2 (Ang-2) wurden identifiziert. Das Ang-1-Polypeptid steht mit der TIE-2-Rezeptor-Tyrosinkinase in Wechselwirkung. (Siehe Maisonpierre et al., Science 277: 55–60 (1997)). Das Ang-2-Polypeptid ist zum Ang-1-Polypeptid antagonistisch und verhindert eine Bindung des aktivierenden Liganden und blockiert seine Fähigkeit, die TIE-2-Kinaseaktivität und Autophosphorylierung zu stimulieren. Ang-1 und Ang-2 binden jedoch nicht an TIE-1. Ang-1 und Ang-2 sind ungefähr 60% identisch; die Aminosäuresequenzen dieser Polypeptide teilen sich eine ähnliche Domänenstruktur mit einer N-terminalen aufgedrehten Spulenregion und einer C-terminalen Fibrinogen-ähnlichen Domäne. Eine Northern-Analyse (RNA) zeigt, dass die ANG-1-RNA weit verbreitet exprimiert wird, dass jedoch die Expression der ANG-2-RNA sehr begrenzt ist. ANG-2-RNA ist nur in Geweben wie den Ovarien, dem Uterus und der Plazenta vorhanden, die eine vaskuläre Ummodulierung durchlaufen. Es wird angenommen, dass Ang-1 dasselbe ist wie der menschliche TIE-Rezeptorligand "htie-2"oder"hTL-1". (Siehe internationale Patentveröffentlichung WO 99/15653).
  • In letzter Zeit wurden andere Liganden für den TIE-2-Rezeptor identifiziert. (Siehe Valenzuela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1904–09 (1999)). Diese Liganden werden als TIE-Ligand-33 (oder Angiopoietin-3 (Ang-3)) und TIE-Ligand-4 (oder Angiopoietin-4 (Ang-4)) bezeichnet. Ang-3, ein Maus-Polypeptid, scheint für den Tie2-Rezeptor antagonistisch zu wirken, während Ang-4, ein menschliches Polypeptid, ein Agonist zu sein scheint. Die genaue physiologische Rolle von Ang-3- und Ang-4-Polypeptiden muss jedoch noch aufgeklärt werden.
  • Andere TIE-Ligandhomologe von Menschen, NL1 bis NL6 und NL8, wurden ebenfalls identifiziert. (Siehe internationale Patentveröffentlichungen WO 99/15653 und WO 99/15654). Eines dieser Homologe, NL6, wurde durch Screening einer cDNA-Bibliothek auf Sequenzen identifiziert, die sekretorische Signale kodieren. Die darauffolgende Analyse von Gesamtlängen-NL6 cDNA ergab eine Homologie zu den TIE-Liganden-Rezeptoren. Die anderen Homologen, NL1–5 und NL8 wurden durch ein Screening einer EST-Datenbank auf Sequenzen identifiziert, die eine Ähnlichkeit zu NL6 zeigen. Basierend auf ihrer Ähnlichkeit zu NL6 wurde außerdem vorgeschlagen, dass NL1-5 und NL8 an der Angiogenese beteiligt sind. Es erwies sich, dass NL1 und NL8 dazu in der Lage waren, Zellen tumorigen zu machen. (Siehe internationale Patentveröffentlichung WO 99/15653).
  • Die Anzahl der TIE-Ligandenhomologen, einschließlich Ang-1 bis Ang-4 und der NL-Familie legt nahe, dass diese Liganden diverse Rollen in der Angiogenese spielen. Eine weitere Charakterisierung dieser Liganden ist daher ein wichtiger Schritt für das Verständnis ihrer Rolle in der Angiogenese. Insbesondere tritt eine persistente, nicht regulierte Angiogenese bei einer Vielzahl von Erkrankungszuständen, einschließlich einer Tumormetastase und einem abnormalen Wachstum von Endothelzellen auf und unterstützt den pathologischen Schaden, der bei diesen Bedingungen angetroffen wird. So kann die Charakterisierung von angiogenen Faktoren auch die Entwicklung von Behandlungen für die Erkrankungen erleichtern, die mit einer Angiogenese in Verbindung stehen (oder von denen die Hypothese existiert, dass sie mit dieser in Verbindung stehen). Es wurde z.B. vorgeschlagen, dass eine Tumorbildung von der Angiogenese abhängt. So können TIE-Ligandenhomologe, die die Angiogenese inhibieren, therapeutische Behandlungen für solche Tumoren bereitstellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Hier wird die Verwendung eines isolierten Ang-7-Polypeptids für die Behandlung einer Erkrankung beschrieben, bei einem Subjekt, das einer Angiogenesetherapie bedarf, wobei die Erkrankung ein Tumor ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Ang-7-Polypeptiden mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von isolierten ANG-7-Nukleinsäuren, die die Ang-7-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNA, wie auch ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren. Solche Nukleinsäuren beinhalten die ANG-7 cDNA-Sequenz mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1. Ebenfalls werden Verfahren zur Erzeugung von Ang-7-Polypeptiden beschrieben, durch rekombinante Verfahren durch Verwendung rekombinanter Vektoren. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante prokaryontische und/oder eukaryontische Wirtszellen, umfassend eine ANG-7-Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Ang-7-Polypeptid. In einem damit in Beziehung stehenden Aspekt werden Nukleinsäurekonstrukte bereitgestellt, die ANG-7-Nukleinsäuren und/oder Ang-7-Polypeptide exprimieren. Solche Konstrukte beinhalten typischerweise einen Transkriptionspromotor und einen Transkriptionsterminator, jeweils operabel zur Expression der ANG-7-Nukleinsäure angebunden.
  • Ein weiterer Aspekt betrifft Verfahren, die die Expression der Polypeptide involvieren oder Polynukleotide, kodierend die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, zum Zweck einer Gentherapie. Wie hier verwendet, ist Gentherapie als Verfahren der Bereitstellung einer Expression von Nukleinsäuresequenzen von exogenem Ursprung in einem Individuum für die Behandlung eines Erkrankungszustands innerhalb des Individuums definiert.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Ang-7-Polypeptiden gemäß SEQ ID NO: 2 oder ANG-7-Polynukleotiden gemäß SEQ ID NO: 1 für therapeutische Zwecke, die die Modulation der Angiogenese involvieren für die Behandlung von Krebs. Solche Behandlungen beinhalten weiter die Verwendung der Ang-7-Polypeptide bei der Proteinersatztherapie und Proteinmimetik.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden sich unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung und die Zeichnungen erhellen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Nukleotidsequenz der ANG-7-cDNA.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz des menschlichen Ang-7-Polypeptids. Die Sequenz ist in dem Einbuchstabencode der Aminosäuren dargestellt.
  • 3 zeigt eine Ausrichtung der Ang-7-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) mit derjenigen von Ang-1 (SEQ ID NO: 3), Ang-2 (SEQ ID NO: 4), Ang-3 (SEQ ID NO: 5) und Ang-4 (SEQ ID NO: 6). Identische Aminosäuren werden in Kästen angegeben.
  • 4 zeigt ein Expressionsprofil von ANG-7-RNA in menschlichen Geweben. Die Expressions-Niveaus der ANG-7-RNA in unterschiedlichen Geweben werden dargestellt. Entlang der Horizontalachse identifizieren Referenzzahlen die folgenden Gewebe:
    Figure 00070001
  • 5 zeigt die Ergebnisse der in vitro-Translation von Ang-7-RNA. Spur 1: Regenbogen [14C]-methylierte Protein Molekulargewichtsmarker (Amersham, Little Chalfont Buckinghamshire, England), enthaltend die folgenden Proteine: Olvalbumin (46 kDa), Carbonanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor (21,5 kDa), Lysozym (14,3 kDa) und Aprotinin (6,5 kDa). Spur 2: In vitro-Translationsprodukte von ANG-7-RNA unter Verwendung des T7-Promotors des Säuger-Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(–) (Invitrogen, Groningen, Niederlande). Spur 3: In vitro-Translationsprodukte von RNA unter Verwendung des SP6-Promotors des Säuger-Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(–) (negative Kontrolle). Spur 4: Positive Kontrolle des in vitro-Translationssystems (Promega Madison, USA).
  • 6 zeigt eine Western Blot-Analyse des Zellextrakts von CHO-Zellen, die transient mit einem ANG-7-Expressionskonstrukt transfiziert waren. Spur 1: Protein-Molekulargewichtsmarker. Spur 2: CHO-Zellen (Negativkontrolle). Spur 3: transient transfizierte CHO-Zellen, die das Ang-7-Polypeptid exprimieren. Die Ang-7-Polypeptidbande ist mit einem Pfeil markiert.
  • 7 zeigt eine Western Blot-Analyse des Ang-7-Polypeptids im Zelllysat von stabil transfizierten HEK293-Zellklonen. Spur 1: Protein-Molekulargewichtsmarker. Spur 2: Zelllysat von HEK293-Zellen (Negativkontrolle). Spur 3: Zelllysat von stabil transfizierten HEK293-Zellen, die das Ang-7-Polypeptid exprimieren.
  • 8 zeigt eine Western Blot-Analyse von konditionierten Medien von einem stabil transfizierten HEK293-Zellklon, der das Ang-7-Polypeptid exprimiert. Spur 1: konditionierte Medien von HEK293-Zellen (Negativkontrolle). Spur 2: konditionierte Medien von dem stabil transfizierten HEK293-Zellklon, der das Ang-7-Polypeptid exprimiert.
  • 9A und 9B zeigen die Ergebnisse einer Reinigung des Ang-7-Polypeptids aus konditionierten Medien. 9A: Western Blot-Analyse; 9B: Coomassie-gefärbtes SDS-Gel des gereinigten Ang-7-Polypeptids. Die Pfeile in 9B zeigen die Position von rekombinantem Ang-7-Polypeptid. Für jede Figur sind die Spuren 1–5 Fraktionen 1–5, eluiert von der Ni-NTA-Agarosesäule. Die Spur "neg. C" zeigt die negative Kontrolle (konditionierte Medien von HEK293-Zellen). In 9B repräsentieren die Doppelbanden vermutlich unterschiedliche Glykosylierungsformen des Ang-7-Polypeptids.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Bevor die Erfindung im Detail dargestellt wird, können für ihr weiteres Verständnis die hier dargestellten Definitionen bestimmter hiernach verwendeter Bezeichnungen hilfreich sein.
  • Definitionen:
  • Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, dieselbe Bedeutung, die der Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise darunter verstehen würde. Andere Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich sind, können in der Praxis oder dem Test der vorliegenden Erfindung verwendet werden; so werden nur beispielhafte Verfahren und Materialien beschrieben. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Bezeichnungen unten definiert.
  • Die Bezeichnung "Angiogenese" bedeutet die Erzeugung neuer Blutgefäße in einem Gewebe oder Organ. Die Angiogenese beinhaltet eine Neovaskularisierung und collaterale Vaskularisierung. "Normale Angiogenese" beinhaltet unter normalen physiologischen Bedingungen neue Blutgefäßbildungen, assoziiert mit einer Wundheilung, fötale und embryonale Entwicklung und Bildung des Corpus luteum, des Endometriums und der Plazenta. "Unerwünschte Angiogenese" bezieht sich auf eine Angiogenese, die unter abnormen physiologischen Bedingungen auftritt, so z.B. bei einer Erkrankung oder einem klinischen Zustand, die mit pathologischen Schäden assoziiert sind, die mit einer unkontrollierten Angiogenese in Beziehung stehen. Zum Beispiel kann eine unerwünschte Angiogenese während einer Tumorbildung auftreten, wobei eine Neovaskularisierung innerhalb des Tumors vorliegt.
  • Die Bezeichnung "ANG-7-Nukleinsäuren" (d.h. in allen Großbuchstaben und kursiv) betrifft Polynukleotide, kodierend Ang-7-Polypeptide, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomische DNA wie auch Antisinn-Nukleinsäuren.
  • Die Bezeichnung ANG-7-Gen" (d.h. mit allen Großbuchstaben und kursiv) bezeichnet kodierende Sequenzen, dazwischen gelagerte Sequenzen und regulatorische Elemente, die die Transkription und/oder Translation kontrollieren.
  • Die Begriffe "Polynukleotid" und "Nukleinsäure" bezeichnen ein Polymer, bestehend aus einer Vielzahl von Nukleotideinheiten (Ribonukleotid oder Desoxyribonukleotid oder verwandte Strukturvarianten), die typischerweise über Phosphodiesterbindungen gebunden sind. Ein Polynukleotid oder eine Nukleinsäure kann im wesentlichen jede Länge aufweisen, typischerweise von ungefähr sechs (6) Nukleotiden bis ungefähr 109 Nukleotiden oder mehr. Polynukleotide oder Nukleinsäuren beinhalten RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen und Mischpolymere, sowohl Sinn- als auch Antisinnstränge und können auch chemisch oder biochemisch modifiziert werden oder nicht natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten, wie der Fachmann einfach erkennen wird. Solche Modifikationen beinhalten z.B. Markierungen, eine Methylierung, eine Substitution von ein oder mehr der natürlich auftretenden Nukleotide durch ein Analog, Internukleotidmodifikationen wie z.B. ungeladene Bindungen (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate und ähnliche), geladene Bindungen (z.B. Phosphorthioate, Phosphordithioate und ähnliche), daran hängende Bestandteile (z.B. Polypeptide), interkalierende Mittel (z.B. Acridin, Psoralen und ähnliche), Chelatbildner, Alkylatoren und modifizierte Bindungen (z.B. alpha-anomere Nukleinsäuren und ähnliche). Ebenfalls beinhaltet sind synthetische Moleküle, die Polynukleotide in ihrer Fähigkeit zur Bindung an eine bestimmte Nukleotidsequenz über eine Wasserstoffbrückenbindung und andere chemische Interaktionen nachahmen. Solche Moleküle sind auf dem Gebiet bekannt und beinhalten z.B. diejenigen, worin Peptidbindungen Phosphatbindungen im Rückgrat des Moleküls ersetzen.
  • Der Begriff "Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid von ungefähr sechs (6) bis ungefähr einhundert (100) Nukleotiden oder mehr in seiner Länge. So sind Oligonukleotide eine Untergruppe der Polynukleotide. Oligonukleotide können auf einem automatisierten Oligonukleotidsynthetisierer synthetisiert werden (z.B. denjenigen von Applied Biosystems (Foster City, CA)), gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anleitungen.
  • Der Begriff "Primer" bezieht sich auf ein Polynukleotid, typischerweise ein Oligonukleotid, das natürlich auftreten kann, als Enzymverdau oder synthetisch in vitro erzeugt wird, das als Initiationspunkt einer Polynukleotidsynthese wirkt, wenn es unter Bedingungen verwendet wird, unter denen ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert wird.
  • Der Begriff "Ang-7-Polypeptid" bezieht sich auf Polypeptide mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
  • Der Begriff "Polypeptid" bezieht sich auf ein Polymer von Aminosäuren und sein Äquivalent und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts; so sind Peptide und Oligopeptide (d.h. Fragmente) und Proteine in der Definition eines Polypeptids mit beinhaltet. Dieser Begriff beinhaltet auch Derivate des Ang-7-Polypeptids, z.B. Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und ähnliche. In der Definition werden ebenfalls beispielsweise Polypeptide beinhaltet, die ein oder mehr Analoge einer Aminosäure enthalten (z.B. unnatürliche Aminosäuren und ähnliche), Polypeptide mit substituierten Bindungen wie auch andere Modifikationen, die auf dem Gebiet bekannt, sowohl natürliche als auch nicht natürliche.
  • Der Begriff "biologisch aktiv" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, eine Angiogenese zu modulieren, wie z.B. durch Beeinflussung der Endothelrohrbildung (z.B. unter Verwendung des HUVEC-Assays von Beispiel 9 (infra)) oder die ein Tumorzellwachstum oder eine Proliferation beeinflussen (z.B. unter Verwendung des Tumorzellwachstums-Inhibitionsassays gemäß Beispiel 10 (infra)). Biologisch aktive Moleküle können Ang-7-Polypeptide, Nukleinsäuren, kodierend Ang-7-Polypeptide und anti-Ang-7-Antikörper sein, die die Angiogenese modulieren (z.B. Inhibition oder Stimulation der Endothelrohrbildung) oder durch Modulation des Tumorzellwachstums oder der Proliferation (z.B. Inhibition oder Stimulation des Tumorzellwachstums).
  • Die Begriffe "therapeutisch nützlich" oder "therapeutisch effektiv" betreffen eine Molekülmenge (z.B. eines Ang-7-Polypeptids, anti-Ang-7-Antikörpers oder einer ANG-7- Nukleinsäure) die genügt, um eine Angiogenese zu modulieren (z.B. Inhibition oder Stimulation der Endothelrohrbildung) oder das Tumorzellwachstum oder die Proliferation zu modulieren (z.B. Inhibition oder Stimulation des Tumorzellwachstums) in einem Subjekt, wie z.B. einem Patienten oder einem Säuger.
  • Die Begriffe "diagnostisch nützlich" oder "diagnostisch effektiv" bezeichnen ein Molekül (z.B. ein Ang-7-Polypeptid, einen anti-Ang-7-Antikörper oder eine ANG-7-Nukleinsäure) zum Nachweis der Angiogenese oder zur Inhibition der Angiogenese bei einem Subjekt. Diese Bezeichnungen beinhalten weiterhin Moleküle, die für den Nachweis von Erkrankungen oder klinischen Zuständen oder der Empfänglichkeit gegenüber Erkrankungen oder klinischen Zuständen, die mit Mutationen in einer ANG-7-Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in Bezug stehen oder zum Nachweis einer Überexpression oder Unterexpression von Ang-7-Polypeptiden, die durch solche Sequenzen kodiert werden, nützlich sind.
  • Der Begriff "Ang-7-Verbindungen" oder "Ang-7-anti-angiogene Verbindungen" bezeichnet biologisch aktive Ang-7-Polypeptide, biologisch aktive ANG-7-Nukleinsäuren und ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren.
  • Die Begriffe "Aminosäure", "Aminosäurerest" oder "Rest" bezeichnen natürlich auftretende L- oder D-Aminosäuren, wie weiter unten beschrieben. Auf Aminosäuren wird hier entweder durch die allgemein bekannten Drei-Buchstabensymbole oder die Ein-Buchstabensymbole Bezug genommen, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlen werden. Nukleotide können ähnlich durch ihre allgemein akzeptierten Ein-Buchstabencodes bezeichnet werden (siehe z.B. Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3. Ausgabe) 1994)).
  • Die Begriffe "identisch" oder "Prozent Identität" im Kontext von zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen beziehen sich auf zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die denselben oder einen spezifizierten Prozentsatz von Nukleotiden oder Aminosäuren aufweisen, die dieselben sind, wenn sie im Hinblick auf maximale Übereinstimmung verglichen und ausgerichtet werden, gemessen unter Verwendung eines der folgenden Sequenz-Vergleichsalgorithmen oder durch visuelle Überprüfung.
  • Der Begriff "im wesentlichen identisch" im Kontext von zwei Nukleinsäuren oder zwei Polypeptidsequenzen bezieht sich auf zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die mindestens eine 60%ige, typischerweise 80%ige, besonders typisch 90 bis 95%ige Identität aufweisen, wenn sie im Hinblick auf maximale Übereinstimmung verglichen oder ausgerichtet werden, gemessen unter Verwendung eines der unten beschriebenen Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Überprüfung. Eine Anzeige, dass zwei Polypeptidsequenzen "im wesentlichen identisch" sind ist diejenige, dass ein Polypeptid mit Antikörpern immunologisch reagiert, die gegen das zweite Polypeptid gezüchtet wurden.
  • "Ähnlichkeit" oder "prozentuale Ähnlichkeit" im Kontext von zwei oder mehr Polypeptidsequenzen betrifft zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, die dieselben sind, oder eine spezifizierte Prozentzahl von Aminosäureresten oder konservative Substitutionen davon aufweisen, die dieselben sind, wenn sie im Hinblick auf maximale Übereinstimmung verglichen und ausgerichtet werden, gemessen unter Verwendung einer der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Überprüfung. Beispielsweise kann eine erste Proteinregion als ähnlich zu einer Region von einem menschlichen Ang-7-Polypeptid angesehen werden, wenn die Aminosäuresequenz der ersten Region mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% oder sogar 95% identisch oder konservativ substituiert ist zu einer Region des Ang-7- Polypeptids, wenn es mit irgendeiner Sequenz im Ang-7-Polypeptid mit einer gleichen Anzahl von Aminosäuren verglichen wird, wie der Anzahl, die in der ersten Region enthalten ist oder verglichen mit einer ausgerichteten Sequenz des Ang-7-Polypeptids, das durch ein Computerähnlichkeitsprogramm, das auf dem Gebiet bekannt ist, wie oben diskutiert, ausgerichtet wurde.
  • Der Begriff "im wesentlichen ähnlich" im Kontext von Polypeptidsequenzen zeigt an, dass das Polypeptid eine Sequenz umfasst, mit mindestens 70% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz oder vorzugsweise 80% oder noch bevorzugter 85% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz, besonders bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von ungefähr 10 bis 20 Aminosäureresten. Im Kontext von Aminosäuresequenzen beinhaltet "substanzielle Ähnlichkeit" weiterhin konservative Substitutionen von Aminosäuren. Ein Polypeptid ist so im wesentlichen ähnlich zu einem zweiten Polypeptid, wenn z.B. die beiden Peptide nur in ein oder mehr konservativen Substitutionen zu unterscheiden sind.
  • Der Begriff "konservative Substitution", wenn er ein Polypeptid beschreibt, betrifft eine Veränderung der Aminosäurezusammensetzung des Polypeptids, die die Aktivität des Polypeptids nicht wesentlich verändert. So betrifft "eine konservative Substitution" einer bestimmten Aminosäuresequenz Aminosäuresubstitutionen derjenigen Aminosäuren, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind oder die Substitution von Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (z.B. sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht polar usw.), so dass die Substitutionen von sogar kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich verändern. Tabellen für konservative Substitutionen stellen funktionell ähnliche Aminosäuren bereit und sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:
    • 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T),
    • 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E),
    • 3) Asparagin (N), Glutamin (Q),
    • 4) Arginin (R), Lysin (K),
    • 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V) und
    • 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
  • (Siehe auch Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)). Zusätzlich sind auch individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer kodierten Sequenz ebenfalls "konservative Substitutionen" verändern, hinzufügen oder deletieren.
  • Für den Sequenzvergleich dient typischerweise eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Wenn ein Sequenzvergleichsalgorithmus verwendet wird, werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, Koordinaten werden bezeichnet, falls nötig und die Sequenzalgorithmus-Programmparameter werden bezeichnet. Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann die prozentuale Sequenzidentität für die Testsequenz (-sequenzen) relativ zu der Referenzsequenz, basierend auf den bezeichneten Programmparametern.
  • Eine optimale Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich kann z.B. durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), durch den Homologieausrichtungsalgorithmus von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), durch eine "Suche-nach Ähnlichkeit" von Pearson & Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), durch Computerimplementationen dieser Algorithmen (z.B. GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch visuelle Überprüfung durchgeführt werden. (Siehe allgemein Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1996)).
  • Ein Beispiel für einen nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erzeugt eine multiple Sequenzausrichtung von einer Gruppe von verwandten Sequenzen unter Verwendung progressiver paarweiser Ausrichtungen, um die prozentuale Sequenzidentität darzustellen. Es trägt auch einen Baum oder ein Dendrogramm auf, das die Clusterbeziehungen darstellt, die verwendet werden, um die Ausrichtung zu erzeugen. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Ausrichtungsverfahrens von Feng & Doolitle (J. Mol. Evol. 35: 351–360 (1987)). Das verwendete Verfahren ist ähnlich dem von Higgins & Sharp beschriebenen (CABIOS 5: 151–153 (1989)). Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen ausrichten, jeweils mit einer maximalen Länge von 5.000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Das multiple Ausrichtungsverfahren beginnt mit der paarweisen Ausrichtung der zwei besonders ähnlichen Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei ausgerichteten Sequenzen erzeugt wird. Dieses Cluster wird dann mit der am nächsten verwandten Sequenz oder dem Cluster ausgerichteter Sequenzen ausgerichtet. Zwei Cluster von Sequenzen werden durch einfache Verlängerung der paarweisen Ausrichtung zwei individueller Sequenzen ausgerichtet. Die endgültige Ausrichtung wird durch eine Reihe progressiver paarweiser Ausrichtungen erreicht. Das Programm wird durch Bestimmung spezifischer Sequenzen und ihrer Aminosäure- oder Nukleotidkoordinaten für Regionen eines Sequenzvergleichs und durch Bezeichnung der Programmparameter durchgeführt. Eine Referenzsequenz kann z.B. mit anderen Testsequenzen verglichen werden, um die prozentuale Sequenzidentitätsbeziehung unter Verwendung der folgenden Parameter zu bestimmen: Default-Lückengewicht (gap weight) (3,00), Default-Lückenlängengewicht (0,10) und gewichtete Endlücken. Ein anderes nützliches Programm für die multiple Ausrichtung von Sequenzen ist MEGALIGNTM Expert Sequence Analysis Software (DNASTAR, Madison, Wisconsin).
  • Ein anderes Beispiel für einen Algorithmus, der für die Bestimmung der prozentualen Sequenzidentitität und Ähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der von Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)) beschrieben wird. (Siehe auch Zhang et al., Nucleic Acid. Res. 26: 3986–90 (1998); Altschul et al., Nucleic Acid Res., 25: 3389–402 (1997). Eine Software zur Durchführung der BLAST-Analysen ist öffentlich von dem National Center für Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhältlich. Dieser Algorithmus involviert zunächst die Identifikation von hochrangigen (high scoring) Sequenzpaaren (HSPs) durch Identifikation kurzer Wörter der Länge W in der fraglichen Sequenz, die entweder einem positiv gewerteten Grenzwert T entsprechen oder diesen ausfüllen, wenn sie mit einem Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet werden. T wird als Nachbarschaftswortwertgrenzwert bezeichnet (neighborhood word score threshold) (Altschul et al. (1990) supra). Diese anfänglichen Nachbarschaftsworttreffer wirken als Samen zur Initiation von Suchen, um längere HSPs zu finden, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in den beiden Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert und zwar so lange, wie die kumulative Ausrichtungsbewertung erhöht werden kann. Die Verlängerung der Worttreffer in jeder Richtung wird beendet, wenn: die kumulative Ausrichtungsbewertung um die Quantität X von dem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Bewertung auf null oder darunter abfällt, aufgrund einer Akkumulation von ein oder mehr negativ wertenden Restausrichtungen oder wenn das Ende von jeder Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Defaults eine Wörterlänge (W) von 11, die BLOSUM62 Scoringmatrix (siehe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10916–9 (1992)), Ausrichtungen (B) von 50, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge.
  • Zusätzlich zu einer Berechnung der prozentualen Sequenzidentität führt der BLAST-Algorithmus auch eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (siehe z.B. Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873: 77 (1993)). Ein Maß der Ähnlichkeit, wie sie vom BLAST-Algorithmus bereitgestellt wird, ist die geringste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die eine Anzeige der Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der ein Treffer zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Eine Nukleinsäure wird z.B. als ähnlich mit einer Referenzsequenz angesehen, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit im einem Vergleich der Test-Nukleinsäure mit der Referenz-Nukleinsäure weniger als ungefähr 0,1, typischerweise weniger als ungefähr 0,01 und besonders typisch weniger als ungefähr 0,001 beträgt.
  • Eine weitere Anzeige, dass zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide im wesentlichen identisch sind, ist diejenige, dass das durch die erste Nukleinsäure kodierte Polypeptid immunologisch kreuzreaktiv mit dem Polypeptid ist, das durch die zweite Nukleinsäure kodiert wird, wie unten beschrieben. So ist ein Polypeptid typischerweise im wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, wenn z.B. die beiden Polypeptide nur durch konservative Substitutionen zu unterscheiden sind.
  • Die Begriffe "Transformation" oder "Transfektion" bedeuten das Verfahren einer stabilen Veränderung des Genotyps einer Empfängerzelle oder eines Mikroorganismus durch Einführung von Polynukleotiden. Dies wird typischerweise durch eine Veränderung des Phänotyps der Empfängerzelle oder des Organismus nachgewiesen. Der Begriff "Transformation" wird allgemein auf Mikroorganismen angewandt, während "Transfektion" verwendet wird, um dieses Verfahren in Zellen zu beschreiben, die von multizellulären Organismen abstammen. Verfahren zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden allgemein in den US-Patenten Nrn. 4,683,202, 4,683,195 und 4,800,159 offenbart. Andere hier verwendete Nomenklatur und viele der Laborverfahren der Zellkultur, der Molekulargenetik und der Nukleinsäurechemie und Hybridisierung, die unten beschrieben werden, sind wohlbekannt und werden auf dem Gebiet üblicherweise verwendet. (Siehe allgemein Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1996); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)). Standardtechniken werden für die rekombinanten Nukleinsäureverfahren, die Polynukleotidsynthese, die Herstellung biologischer Proben, die Präparation von cDNA-Fragmenten, die Isolation von mRNA und ähnliches verwendet. Allgemeine enzymatische Reaktionen und Reinigungsschritte werden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Behandlung eines Tumors bei einem Subjekt im Bedarf einer anti-Angiogenesetherapie bereit, wobei anti-angiogene Ang-7-Polypeptide mit SEQ ID NO: 2 verwendet werden. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren der Verwendung von ANG-7-Nukleinsäuren, wie unten ausführlicher beschrieben, für diesen Zweck. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung von Ang-7-Polypeptiden und/oder ANG-7-Nukleinsäuren für die Behandlung von Krebs.
  • ANG-7-Nukleinsäuren:
  • Es werden hier isolierte Nukleinsäuren, die Ang-7-Polypeptide kodieren, beschrieben, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNA wie auch Antisinn-Nukleinsäuren und ihre Verwendung bei der Modulation der Angiogenese. ANG-7-Nukleinsäuren beinhalten die ANG-7-cDNA-Sequenz (z.B. SEQ ID NO: 1).
  • Als Referenz werden hier auch Nukleinsäuren beschrieben, die mit den vorstehenden Sequenzen hybridisierbar sind oder zu diesen komplementär. Solche Nukleinsäuren beinhalten mRNAs, DNAs, cDNAs, genomische DNA wie auch Antisinn-Nukleinsäuren und biologisch aktive diagnostische oder therapeutisch nützliche Fragmente oder Varianten davon. Es werden auch Nukleinsäuren bereitgestellt, die eine Sequenz umfassen, die mit mindestens 10, 25, 50, 100, 200 oder 250 Nukleotiden oder mehr eines ANG-7-Gens oder einer cDNA komplementär sind. In einem Aspekt ist eine Nukleinsäure mit einer ANG-7-Nukleinsäure (z.B. mit der SEQ ID NO: 1) unter Bedingungen hoher Stringens hybridisierbar und wird bereitgestellt.
  • Beispielhaft und nicht begrenzend werden Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringens wie folgt verwendet: Prähybridisierung von Filtern, die DNA enthalten, wird für 8 Stunden bis über Nacht bei 65°C in einem Puffer durchgeführt, der aus 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA besteht. Die Filter werden 48 Stunden bei 65°C in einer Prähybridisierungsmischung, enthaltend 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5 bis 20 × 106 cpm einer 32P-markierten Sonde hybridisiert. Das Waschen der Filter wird bei 37°C für 1 Stunde in einer Lösung durchgeführt, die 2 × SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll und 0,01% BSA enthält. Darauf folgt ein Waschen in 0,1 × SSC bei 50°C für 45 Minuten vor der Autoradiografie. Andere hochstringente Bedingungen, die verwendet werden können, sind auf dem Gebiet bekannt (siehe allgemein Ausubel et al., supra).
  • Gemäß einem anderen Aspekt wird eine Nukleinsäure bereitgestellt, die mit einer ANG-7-Nukleinsäuren unter Bedingungen moderater Stringens hybridisierbar ist. Beispielhaft und nicht begrenzend sind Verfahren unter Verwendung solcher Bedingungen einer moderaten Stringens die folgenden: die Prähybridisierung von Filtern, die DNA enthalten, wird 8 Stunden bis über Nacht bei 55°C in einem Puffer durchgeführt, der aus 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,2% Ficoll, 0,02% BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA besteht. Die Filter werden 24 Stunden bei 55°C in einer Prähybridisierungsmischung, die 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5 bis 20 × 106 cpm einer 32P markierten Sonde enthält, hybridisiert. Das Waschen der Filter wird bei 37°C für 1 Stunde in einer Lösung durchgeführt, enthaltend 2 × SSC, 0,01% PVP, 0,01% Ficoll und 0,01% BSA.
  • Gemäß einem anderen Aspekt wird eine Nukleinsäure bereitgestellt, die mit einer ANG-7-Nukleinsäuren unter Bedingungen niedriger Stringens hybridisierbar ist. Beispielhaft und nicht begrenzend sind Verfahren unter Verwendung solcher Bedingungen einer niedrigen Stringens die folgenden: Filter, enthaltend DNA werden 6 Stunden bei 40°C in einer Lösung vorbehandelt, die 35% Formamid, 5 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,1% Ficoll, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthält. Die Hybridisierungen werden in derselben Lösung mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 10% (Gewicht/Volumen) Dextransulfat und 5 bis 20 × 106 cpm 32P-markierte Sonde. Die Filter werden in einer Hybridisierungsmischung 18 bis 20 Stunden bei 40°C inkubiert und dann 1,5 Stunden bei 55°C in einer Lösung gewaschen, die 2 × SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS enthält. Die Waschlösung wird durch frische Lösung ersetzt und für zusätzliche 1,5 Stunden inkubiert. Die Filter werden trockengetupft und durch Autoradiografie belichtet. Andere niedrigstringente Bedingungen, die verwendet werden können, sind auf dem Gebiet wohlbekannt (z.B. solche, die für eine Kreuzspezieshybridisierung verwendet werden) (siehe auch Shilo und Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6789–6792 (1981)).
  • Niedrige, moderate und hoch stringente Bedingungen sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und werden in vorhersagbarer Weise abhängig von der Basenzusammensetzung der bestimmten Nukleinsäuresequenz und dem spezifischen Organismus, von dem die Nukleinsäuresequenz abstammt, variieren. Für Anleitungen im Hinblick auf solche Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, NY, Seiten 9.47–9.57 (1989)); und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989)).
  • Spezifische Ausführungsformen für das Klonieren einer ANG-7-Nukleinsäure sind die folgenden und werden als bestimmtes Beispiel, jedoch nicht als Begrenzung präsentiert.
  • Für eine Expressionsklonierung (eine Technik, die auf dem Gebiet wohlbekannt ist) wird eine Expressionsbibliothek durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren konstruiert. Zum Beispiel wird eine mRNA (z.B. menschlich) isoliert, eine cDNA wird hergestellt und dann in einen Expressionsvektor (z.B. ein Bakteriophagenderivat) ligiert, so dass sie durch die Wirtszelle, in die sie eingeführt wurde, exprimiert werden kann. Es können verschiedene Screening-Assays verwendet werden, um auf das exprimierte Ang-7-Polypeptid zu selektieren. Gemäß einer Ausführungsform können anti-Ang-7-spezifische Antikörper für die Selektion verwendet werden.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um die gewünschte Sequenz in einer genomischen oder cDNA-Bibliothek vor der Selektion zu amplifizieren. Oligonukleotide, die bekannte ANG-7-Sequenzen repräsentieren, z.B. selektiert von SEQ ID NO: 1, können als Primer in der PCR verwendet werden. In einer typischen Ausführungsform repräsentiert das Oligonukleotid mindestens einen Teil der ANG-7-konservierten Segmente der Sequenzidentität zwischen ANG-7 unterschiedlicher Spezies.
  • Die synthetischen Oligonukleotide können als Primer für eine Amplifikation bestimmter Sequenzen innerhalb eines ANG-7-Gens durch PCR unter Verwendung von Nukleinsäuren von einer Quelle (RNA oder DNA), typischerweise einer cDNA-Bibliothek von potenziellem Interesse verwendet werden. Die PCR kann z.B. durch Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus Thermalcyclisierers und einer Taq-Polymerase (Gene Amp) durchgeführt werden. Die amplifizierte DNA kann eine mRNA oder cDNA oder genomische DNA von jeder eukaryontischen Art beinhalten. Der Fachmann kann wählen, etliche unterschiedliche degenerierte Primer zur Verwendung in den PCR-Reaktionen zu synthetisieren.
  • Es ist außerdem möglich, die Stringens der Hybridisierungsbedingungen, die beim Priming der PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um höhere oder niedrigere Grade einer Nukleotidsequenz-Ähnlichkeit zwischen der bekannten ANG-7-Sequenz und der verwandten Nukleinsäure, die isoliert wird, zu ermöglichen. Für eine Kreuzspezies-Hybridisierung werden typischerweise niedrigstringente Bedingungen verwendet. Für Hybridisierungen in derselben Art werden typischerweise moderat stringente Bedingungen verwendet. Nach einer erfolgreichen Amplifikation eines Segments einer verwandten ANG-7-Nukleinsäure kann dieses Segment molekular kloniert und sequenziert werden und als Sonde verwendet werden, um eine vollständige cDNA oder einen genomischen Klon zu isolieren. Dies kann wiederum die Bestimmung einer vollständigen Nukleotidsequenz erlauben, wie auch die Analyse ihrer Expression und die Produktion des Proteinprodukts für eine funktionale Analyse, wie unten beschrieben. Auf diese Weise können zusätzliche Nukleinsäuren, die Ang-7-Polypeptide und Ang-7-Polypeptidvarianten kodieren, identifiziert werden.
  • Die oben erwähnten Verfahren sollen die folgende allgemeine Beschreibung von Verfahren nicht begrenzen, durch die ANG-7-Nukleinsäuren erhalten werden können. Jede eukaryontische Zelle kann potenziell als Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonieren von ANG-7-Nukleinsäuren dienen. Die Nukleinsäuren, die das Ang-7-Polypeptide kodieren, können aus Vertebraten-Quellen isoliert werden, einschließlich Säugerquellen wie dem Schwein, dem Rind, der Katze, Vögeln, Pferden, Kaninchen und Menschen wie auch zusätzlichen Primatenquellen. Die DNA kann durch Standardverfahren erhalten werden, die auf dem Gebiet bekannt sind, aus klonierter DNA (z.B. einer DNA-"Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonieren oder durch Klonieren genomischer DNA oder Fragmenten davon, die aus der gewünschten Zelle gereinigt wurden. (Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover, (Hrsg.), DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Band I, II. (1985)). Klone, die von genomischer DNA abstammen, können regulatorische und Intron-DNA-Regionen zusätzlich zu den kodierenden Regionen enthalten; Klone, die von cDNA abstammen, werden typischerweise nur Exonsequenzen enthalten. Welche Quelle auch immer, die Nukleinsäure kann molekular in einen geeigneten Vektor für die Vervielfältigung der Nukleinsäure kloniert werden.
  • Bei dem molekularen Klonieren von ANG-7-Nukleinsäuren aus genomischer DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige ein ANG-7-Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung bestimmter Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man eine DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwenden oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie z.B. durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können dann gemäß ihrer Größe durch Standardverfahren aufgetrennt werden, beinhaltend aber nicht begrenzt auf Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie.
  • Sobald die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann die Identifizierung des spezifischen DNA-Fragments, das das gewünschte Gen enthält, auf eine Anzahl von Art und Weisen bewirkt werden. Zum Beispiel kann ein Teil eines ANG-7-Gens, einer cDNA (jeder Art) oder ihrer spezifischen RNA oder ein Fragment davon gereinigt und markiert werden, die erzeugten DNA-Fragmente können durch Nukleinsäurehybridisierung mit der markierten Sonde einem Screening unterworfen werden (siehe z.B. Benton und Davis, Science 196: 180 (1975); Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961 (1975)). Diese DNA-Fragmente mit substanzieller Identität zu der Sonde werden hybridisieren. Es ist auch möglich, das geeignete Fragment durch Restriktionsenzymverdau (mehrere Verdaus) und Vergleich der Fragmentgrößen mit den gemäß bekannter Restriktionskarten erwarteten, falls diese zur Verfügung stehen, zu identifizieren. Eine weitere Selektion kann auf der Basis der Eigenschaften des Gens durchgeführt werden.
  • Alternativ kann die Gegenwart des Gens durch Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften des exprimierten Produkts basieren. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die die geeigneten mRNAs hybridselektieren, selektiert werden, die ein Polypeptid erzeugen, das z.B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Wanderung, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, proteolytische Verdaukarten, Modulation der Angiogenese, Rezeptorbindungsaktivität oder antigene Eigenschaften wie die für das Ang-7-Polypeptid bekannten aufweist. Immunserum oder ein Antikörper, der spezifisch an das Ang-7-Polypeptid bindet, kann verwendet werden, um putativ Ang-7-Polypeptid synthetisierende Klone durch Bindung in einem ELISA (enzymgebundener Immunosorbent-Assay) -artigen Verfahren zu identifizieren.
  • ANG-7-Nukleinsäuren können auch durch mRNA-Selektion durch Nukleinsäurehybridisierung, gefolgt von einer in vitro-Translation identifiziert werden. Bei diesem Verfahren werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Solche DNA-Fragmente repräsentieren typischerweise zur Verfügung stehende gereinigte DNA einer anderen Art (z.B. Mensch, Maus und ähnliche). Immunopräzipitationsanalysen oder funktionelle Assays (z.B. Inhibition der Angiogenese, Endothelrohrbildung in vitro, Tumorinhibition oder Bindung an einen TIE-Rezeptor) der in vitro-Translationsprodukte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und daher die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezifische mRNAs durch Adsorption von Polysomen selektiert werden, die aus Zellen isoliert wurden, an immobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen das Ang-7-Polypeptid gerichtet sind. Eine radioaktiv markierte ANG-7-cDNA kann unter Verwendung der selektierten mRNA (von den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als Sonde verwendet werden, um die ANG-7-Nukleinsäurefragmente unter anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.
  • Alternativen, um die ANG-7-genomische DNA zu isolieren, beinhalten die chemische Synthese der Gensequenz selbst von einer bekannten Sequenz oder die Umwandlung von cDNA zu mRNA, die ein Ang-7-Polypeptid kodiert, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. RNA für die cDNA-Klonierung des ANG-7-Gens kann z.B. aus Zellen isoliert werden, die das Ang-7-Polypeptid exprimieren. Andere Verfahren sind möglich.
  • Die identifizierten und isolierten ANG-7-Nukleinsäuren können dann in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden. Eine große Zahl von Vektor-Wirts-Systemen, die auf dem Gebiet bekannt sind, können verwendet werden. Mögliche Vektoren beinhalten Plasmide oder modifizierte Viren, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Das Vektorsystem wird so selektiert, dass es mit der Wirtszelle kompatibel ist. Solche Vektoren beinhalten Bakteriophagen, wie z.B. lambda-Derivate, hefeintegrative und zentromere Vektoren, das 2 μ-Plasmid und Derivate davon oder Plasmide wie z.B. pBR322, pUC oder pRSETC (InVitrogen, San Diego, Kalifornien), Plasmidderivate oder den Bluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, Kalifornien), um nur einige zu nennen, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Die Insertion der ANG-7-Nukleinsäuren in einen Klonierungsvektor kann z.B. durch Ligation des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor bewirkt werden, der komplementäre cohäsive Termini aufweist. Wenn die zur Fragmentierung der DNA verwendeten komplementären Restriktionsstellen in dem Klonierungsvektor nicht vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle jedoch enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligation von Nukleotidsequenzen (Linkern) an die DNA-Enden erzeugt werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonukleotid-kodierende Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen umfassen. Eine Restriktionsstelle kann auch in eine Nukleinsäure durch PCR-Amplifikation der Nukleinsäure unter Verwendung eines Primers (von Primern) eingeführt werden, der die gewünschte Restriktionsstelle (-stellen) -kodiert. Gemäß einem alternativen Verfahren können der gespaltene Vektor und die ANG-7-Nukleinsäuren durch homopolymere Schwanzbildung (tailing) modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation und ähnliches eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
  • Gemäß einem anderen Verfahren kann das ANG-7-Gen nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor in einem "Shot-gun"-Ansatz identifiziert und isoliert werden. Die Anreicherung für das ANG-7-Gen z.B. durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor durchgeführt werden. Gemäß spezifischen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte ANG-7-Gen, die cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenz inkorporieren, die Erzeugung multipler Kopien des Gens. So kann das Gen in großen Mengen durch Züchten von Transformanten, Isolation der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und falls nötig, Gewinnen des inserierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA, erhalten werden.
  • In diesem spezifischen Fall wurde die ANG-7-cDNA durch Homologie mit einem anderen bekannten Angiopoietin, Ang-1, isoliert. Kurz gefasst wurden Fragmente von ANG-7-cDNA durch eine BLAST-Suche (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–402 (1997)) gegen die exprimierte Sequenz-Tag (EST)-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) unter Verwendung der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Ang-1 als Referenz isoliert. Zwei ESTs mit überlappenden Sequenzen wurden isoliert. Ein Gesamtlängen-cDNA-Fragment, kodierend das Ang-7-Polypeptid, wurde durch Screening einer Gesamtlängen-menschlichen cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines radioaktiv markierten ESTs kloniert. Die darauffolgende Analyse der menschlichen ANG-7 cDNA (SEQ ID NO: 1) identifzierte einen offenen Leserahmen von 493 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2). Die abgeleitete Aminosäuresequenz kodierte ein Polypeptid mit ungefähr 57 kDa. Die darauffolgende Analyse der ANG-7 cDNA bestätigt, dass sie die Synthese eines rekombinant exprimierten Polypeptids von diesem anscheinenden Molekulargewicht, wie bestimmt durch SDS-PAGE, dirigiert. Das menschliche Ang-7-Polypeptid ist 23,9% und 23,5% ähnlich zu den Ang-1- bzw. -2-Polypeptiden. Die Aminosäurekonservierung ist über die Länge der beiden Proteine verteilt. Das Expressionsprofil des Ang-7-Polypeptids zeigt an, dass das Polypeptid in einer Vielzahl von intensiv vaskularisierten Geweben, einschließlich dem Herzgewebe, dem Uterus, der Brustdrüse und dem Corpus callosum exprimiert wird.
  • Ein Klon, der ANG-7 cDNA beherbergt, ANG-7-cDNA/pGEM wurde bei der DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, am 26. Juni 2000 unter der Hinterlegungsnummer DSM 13562 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags für die internationale Anerkennung einer Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zecke des Patentverfahrens und der dementsprechenden Regeln (Budapester Vertrag) durchgeführt.
  • Ang-7-Polypeptide, Fragmente, Varianten, Derivate und Analoge:
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Ang-7-Polypeptide und ihre Verwendung bei der Modulation der Angiogenese für die Behandlung von Tumoren. Das Ang-7-Polypeptid weist die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 auf. Das Ang-7-Polypeptid ist biologisch aktiv. Ein biologisch aktives Ang-7-Polypeptid bezieht sich auf die Fähigkeit des Moleküls, die Angiogenese zu modulieren wie z.B. durch Beeinflussung der Endothelrohrbildung wie z.B. beschrieben im HWEC-Assay in Beispiel 9 (infra) oder durch Beeinflussung des Tumorzellwachstums oder der Proliferation (siehe z.B. Beispiel 10). Alternativ können solche Polypeptide, die die gewünschte Immunogenizität oder Antigenizität aufweisen, in einem Immunoassay für eine Immunisierung, zur Inhibition der Ang-7-Polypeptidaktivität und ähnlichem verwendet werden.
  • Zusätzlich können Ang-7-Polypeptide chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein Peptid, korrespondierend zum einem Teil oder Fragment eines Ang-7-Polypeptids, das eine gewünschte Domäne umfasst oder das eine gewünschte Aktivität in vitro vermittelt, durch Verwendung von chemischen Syntheseverfahren z.B. unter Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers synthetisiert werden.
  • In einer Ausführungsform ist das Ang-7-Polypeptid ein chimäres oder Fusionsprotein, umfassend ein Ang-7-Polypeptid, gebunden am Amino- oder Carboxyende über eine Peptidbindung an eine Aminosäuresequenz eines anderen Proteins. In einer Ausführungsform wird ein solches chimäres Protein durch rekombinante Expression einer Nukleinsäure, kodierend das Protein, erzeugt. Das chimäre Produkt kann durch Ligation der geeigneten Nukleinsäuresequenz, kodierend die gewünschten Aminosäuresequenzen, miteinander durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren im geeigneten Kodierungsrahmen und Expression des chimären Produkts durch allgemein auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann das chimäre Produkt durch Protein-Syntheseverfahren hergestellt werden (z.B. durch Verwendung eines automatischen Peptidsynthetisierers).
  • Expression von ANG-7-Nukleinsäuren oder Ang-7-Polypeptiden
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen Wirtszellen ein Konstrukt, das eine ANG-7-Nukleinsäure exprimiert. Eine solche Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie z.B. eine Säugerzelle, eine niedere eukaryontische Zelle wie z.B. eine Hefezelle oder eine prokaryontische Zelle wie z.B. eine Bakterienzelle sein. Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch die Calciumphosphattransfektion bewirkt werden, auch durch DEAE-dextranvermittelte Transfektion oder Elektroporation (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 2. Auflage, Appleton und Lang, Paramount Publishing, East Norwalk, Conn. (1984)), durch die Calciumchlorid-vermittelte Transformation, durch die Lithiumacetat-vermittelte Transformation und ähnliche.
  • Die Konstrukte in den Wirtszellen können in konventioneller Weise verwendet werden, um das Ang-7-Polypeptid zu erzeugen. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um solche Polypeptide zu erzeugen, unter Verwendung von RNAs, die von der ANG-7-Nukleinsäure abstammen. Alternativ kann das Ang-7-Polypeptid synthetisch durch konventionelle Peptidsynthetisierer erzeugt werden.
  • ANG-7-Nukleinsäuren können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien, Insekten oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Repräsentative Expressionsvektoren beinhalten Plasmid, Phagen und/oder virale Vektorsequenzen, wie z.B. die von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor, NY, (1989)) beschriebenen. Zum Beispiel beinhalten geeignete Vektoren Adenovirusvektoren, Retrovirusvektoren, einschließlich Lentivirusvektoren, Vacciniavirusvektoren, Cytomegalievirus-virale Vektoren und Baculovirusvektoren (siehe z.B. Knops et al., J. Biol. Chem. 266: 7285 (1991)) und ähnliche. DNA-Sequenzen, die vom SV40-viralen Genom abstammen, z.B. SV 40 origin, früher Promotor, Enhancer-, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die benötigten nicht transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen. Repräsentative nützliche Vektoren beinhalten pRc/CMV- und pcDNA3-Vektoren (Invitrogen, San Diego, Kalifornien).
  • Promotoren, die dazu in der Lage sind, die Transkription einer Nukleinsäure zu dirigieren, können induzierbare oder konstitutive Promotoren sein und beinhalten virale und zelluläre Promotoren. Für die Expression in Säuger-Wirtszellen beinhalten geeignete virale Promotoren den immediate early Cytomegalieviruspromotor (Boshart et al., Cell 41: 521–30 (1985)) und den SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854–64 (1981)). Geeignete zelluläre Promotoren für die Expression von Nukleinsäuren in Säugerwirtszellen beinhalten den Maus-Metallothionien-1-Promotor (Palmiter et al., US-Patent Nr. 4,579,821) und den Tetracyclin-reagierenden Promotor (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–51 (1992); Pescini et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 202: 1664–67 (1994)), sind jedoch nicht darauf begrenzt. Transkriptions-Terminationssignale sind ebenfalls typischerweise stromabwärts von der interessierenden Kodierungssequenz lokalisiert. Geeignete Transkriptions-Terminationssignale beinhalten die frühen oder späten Polyadenylierungssignale von SV40 (Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304–19 (1982)), das Polyadenylierungssignal von der Adenovirus 5 e1B-Region und den menschlichen Wachstumshormon-Genterminator (DeNoto et al., Nucleic Acid. Res. 9: 3719–30 (1981)).
  • Die Transkription von ANG-7-Nukleinsäuren in Säugerzellen wird durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-wirkende Elemente der DNA mit in der Regel ungefähr 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu verstärken. Beispiele beinhalten den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100 bis 270), einen Cytomegalievirus frühen Promotorenhancer, einen Polyomaenhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirusenhancer.
  • Säugerzellen können durch eine Anzahl von Verfahren transfiziert werden, einschließlich der Calciumphosphatpräzipitation (siehe z.B. Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham und Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)); einer Lipofektion (siehe z.B. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–17 (1987)) und einer Mikroinjektion und Elektroporation (siehe z.B. Neumann et al., EMBO J. 1: 814–45 (1982)). Säugerzellen können mit einem Virus, wie z.B. SV40, CMV und ähnlichen transduziert werden. Im Falle von viralen Vektoren können klonierte DNA-Moleküle durch Infektion empfänglicher Zellen durch virale Teilchen eingeführt werden. Retrovirale, einschließlich lentivirale und adenovirale Vektoren werden zur Verwendung bei der Expression von ANG-7-Nukleinsäuren in Säugerzellen bevorzugt, insbesondere wenn die ANG-7-Nukleinsäuren für die Gentherapie verwendet werden.
  • Typischerweise werden selektierbare Marker verwendet um Zellen zu identifizieren, die die ANG-7-Nukleinsäuren enthalten. Selektierbare Marker werden allgemein in die Zellen zusammen mit den klonierten DNA-Molekülen eingeführt und beinhalten Gene, die eine Resistenz gegenüber Arzneimitteln vermitteln, wie z.B. Neomycin, Hygromycin und Methotrexat. Selektierbare Marker können auch Auxotrophien in der Wirtszelle komplementieren. Wiederum andere selektierbare Marker stellen nachweisbare Signale bereit, wie z.B. die β-Galaktosidase oder das grün fluoreszierende Protein, um Zellen zu identifizieren, die ANG-7-Nukleinsäuren enthalten. Die selektierbaren Marker können amplifizierbar sein. Solche amplifizierbaren selektiven Marker können verwendet werden, um die Zahl von Sequenzen zu amplifizieren, die in das Wirtsgenom integriert sind.
  • Verschiedene Säugerzellkultursysteme können verwendet werden, um die ANG-7-Nukleinsäuren zu exprimieren. Beispiele für Säuger-Expressionssysteme beinhalten die COS-7-Linien der Affen-Nieren-Fibroblasten (siehe z.B. Gluzman, Cell 23: 175 (1981)) und andere Zelllinien, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können wie z.B. die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa-, BHK-, VERO-, HeLa-, MDCK-, 293-, WI38-, HEK-, HUVEC-Zelllinien. Sobald sie etabliert sind, können solche Zelllinien in Kultur gezüchtet werden. Verfahren für die Kultivierung menschlicher Zellen in vitro und für die Immortalisierung von Zellen sind dem Fachmann bekannt.
  • Für eine langzeitige Produktion rekombinanter Polypeptide mit hohem Ertrag wird eine stabile Expression bevorzugt. Es können z.B. Zelllinien technologisch hergestellt werden, die stabil Konstrukte exprimieren, die die ANG-7-Nukleinsäuren enthalten. Anstelle einer Verwendung von Expressionsvektoren, die viralen Ursprünge einer Replikation enthalten, können die Wirtszellen mit ANG-7-Nukleinsäuren durch geeignete Expressionskontrollelemente (z.B. Promotor- und Enhancersequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen und ähnliche) und einen selektierbaren Marker transformiert werden. Folgend auf die Einführung eines solchen Expressionsvektors in Säugerzellen können die gentechnologisch veränderten Zellen 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium gezüchtet werden und dann auf ein Selektivmedium umgeschaltet werden. Der selektierbare Marker in dem Expressionsvektor verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es Zellen, den Vektor in das Chromosom stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien expandiert werden können.
  • Eine Anzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich dem Herpex simplex-Virus-Thymidinkinase (tk) (siehe z.B. Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (hprt) (siehe z.B. Szybalski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)) und Adeninphosphoribosyl-Transferase-Gen (aprt) (siehe z.B. Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)) System sind jedoch nicht auf diese begrenzt und können in tk–-, hgprt–- bzw. aprt–-Zellen verwendet werden. Eine Antimetabolitenresistenz kann ebenfalls als Basis einer Selektion für die Dihydrofolatreduktase (dhfr) verwendet werden, die eine Resistenz gegenüber Methotrexat vermittelt (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1980); O'Hare et al., FEBS Lett. 210: 731 (1981)); gpt, das eine Resistenz gegen Mycophenolsäure vermittelt (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)); Neomycin, das eine Resistenz gegen das Aminoglykosid G-418 vermittelt (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)); und Hygromycin, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin vermittelt (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)).
  • Die ANG-7-Nukleinsäuren können auch in Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, filamentösen Pilzen und anderen einzel- oder multizellulären Organismen exprimiert werden, die gegenüber einer Transformation und/oder Transfektion zugänglich sind. Verfahren für die Expression klonierter Gene in Saccharomyces cerevisiae sind allgemein auf dem Gebiet bekannt. (Siehe z.B. "Gene Expression Technology" In Methods in Enzymology, Band 185, Goeddel (Hrsg.), Academic Press, San Diego, CA (1990); "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology" In Methods in Enzymology, Guthrie und Fink (Hrsg.), Academic Press, San Diego, CA (1991)), Filamentöse Pilze (z.B. Stämme von Aspergillus) können ebenfalls verwendet werden, um die ANG-7-Nukleinsäuren zu exprimieren. Verfahren zur Expression heterologer Gene und cDNAs in kultivierten Säugerzellen und in E. coli werden im Detail in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, NY (1989)) diskutiert. Wie dem Fachmann klar sein würde, kann man ANG-7-Nukleinsäuren in anderen Wirtszellen wie z.B. Vogel-, Insekten- und Pflanzenzellen unter Verwendung regulatorischer Sequenzen, Vektoren und Verfahren, die in der Literatur gut etabliert sind, exprimieren.
  • Rekombinante Expressionsvektoren, die für die Expression in Bakterienzellen geeignet sind, beinhalten typischerweise einen Ursprung der Replikation und selektierbare Marker, die eine Transformation der Wirtszelle ermöglichen (z.B. die Ampicillin- oder Tetracyclinresistenzgene von E. coli oder das TRP1- oder URA3-Gen von S. cerevisiae) und einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Gen abstammt, um die Transkription einer stromabwärts gelagerten Struktursequenz zu dirigieren. Solche Promotoren können von Operons abstammen, die glykolytische Enzyme kodieren, wie z.B. die 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), den alpha-Faktor, die saure Phosphatase, Hitzeschockproteine, Translations-Elongations-Faktor und ähnliche. Die heterologe ANG-7-Nukleinsäure wird in einer geeigneten Phase mit Translationsinitiations- und Terminationssequenzen zusammengefügt und vorzugsweise einer Leadersequenz, die die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium dirigieren kann. Optional kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein kodieren, beinhaltend ein N-terminales Identifikationspeptid, das gewünschte Eigenschaften verleiht (z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts). Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation beinhalten Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, obwohl auch andere im Rahmen einer Routineauswahl verwendet werden können.
  • Geeignete Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung umfassen einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Ursprung der Replikation, abgeleitet von Plasmiden, umfassend genetische Elemente des wohlbekannten Klonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017). Andere Vektoren beinhalten die pBLUESCRIPT-Vektoren (Stratagene), PKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis.), sind jedoch nicht darauf begrenzt. Diese PBR322 "Rückgrat"-Sektionen werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
  • Geeignete Expressionsvektoren umfassen weiterhin einen Fusionspartner für eine einfacherere Reinigung eines gewünschten Polypeptids oder zur Erzeugung löslicher Polypeptide. Beispiele für kommerzielle Fusionsvektoren beinhalten pET32a (Novagen, Madison, Wis), pGEX-4T-2 (Pharmacia) und pCYB3 (New England Biolabs, Beverly, Mass.), sind jedoch nicht darauf begrenzt. Expressionsvektoren, die die Verwendung von Fusionspartnern vermeiden, können ebenfalls insbesondere für eine Expression von Ang-7-Polypeptiden in bakteriellen Zellen auf hohem Niveau konstruiert werden. Vektoren können z.B. zur Optimierung der Translationskopplung hergestellt werden, wie beschrieben von Pilot-Mathias et al. (Gene 128: 219–225 (1993)). Alternativ kann eine ANG-7-Nukleinsäure mit einem separaten Hilfsplasmid coexprimiert werden, das selbst ein Protein oder Peptid kodiert, das die Löslichmachung eines Ang-7-Polypeptids von Interesse unterstützt (siehe z.B. Makrides, Microbiological Reviews 60: 512 (1996)).
  • Folgend auf die Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und dem Wachstum des Wirtsstamms auf eine geeignete Zelldichte wird der selektierte Promotor durch geeignete Mittel (z.B. Temperaturverlagerung oder chemische Induktion) dereprimiert und die Zellen werden für eine zusätzliche Zeitspanne kultiviert. Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen und der resultierende Rohextrakt für die weitere Reinigung zurückgehalten. Mikrobielle Zellen, die bei der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch jedes geeignete Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftauzyklen, Beschallung, mechanischem Aufbruch oder die Verwendung von Zelllysemitteln; solche Verfahren sind dem üblichen Fachmann bekannt.
  • Ang-7-Polypeptide können unter Verwendung einer Anzahl etablierter Verfahren isoliert werden, wie z.B. einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von anti-Ang7-Antikörpern, die an einen festen Träger gekoppelt sind und einer sequenzspezifischen Chromatographie, wie beschrieben von Lobanenkov et al. (Oncogene 5: 1743–53 (1990)) und unter Verwendung von Antikörpern gegen ein Epitop-tagged Ang-7-Polypeptide (z.B. anti-HIS4, myc, FLAG und ähnliche). Zusätzliche Isolierungsverfahren beinhalten unter anderem Reinigungsmittel wie eine Flüssigchromatographie, Hochdruckflüssigchromatographie, FPLC, Gradientenzentrifugation und Geleelektrophorese. Verfahren der Proteinreinigung sind auf dem Gebiet bekannt und können für die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden, wie hier beschrieben, angewandt werden. (Siehe allgemein Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)).
  • Anti-Ang-7-Antikörper
  • Hier werden in einem Referenzbeispiel anti-Ang-7-Antikörper zur Verwendung bei der Modulation der Angiogenese bereitgestellt. Solche Antikörper können an Ang-7-Polypeptide binden. Ang-7-Polypeptide können zur Herstellung von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern, folgend z.B. dem Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256: 495 (1975)) verwendet werden. Solche monoklonalen Antikörper können dann die Basis für eine Behandlung, therapeutische Verwendung oder einen diagnostischen Test bilden.
  • Die Erzeugung nicht-menschlicher Antiseren oder monoklonaler Antikörper (z.B. murin, Lagomorpha, Schweine oder Pferde) kann z.B. durch Immunisierung eines Tiers mit Ang-7-Polypeptiden mit oder ohne Adjuvans bewirkt werden. Für die Erzeugung monoklonaler Antikörper werden Antikörper-erzeugende Zellen von immunisierten Tieren erhalten, immortalisiert und einem Screening unterzogen oder zunächst einem Screening für die Produktion des Antikörpers unterzogen, der an das Antigen bindet und dann immortalisiert. Es kann wünschenswert sein, die Antigen-Bindungsregionen (z.B. F(ab'), F(ab')2, Fv oder hypervariable Regionen) von nicht-menschlichen Antikörpern in das Rahmenwerk eines menschlichen Antikörpers durch rekombinante DNA-Verfahren zu übertragen, um ein im wesentlichen menschliches Molekül zu erzeugen. Verfahren zur Erzeugung solcher "humanisierter" Moleküle sind allgemein wohlbekannt und werden z.B. in den US-Patenten Nrn. 4,816,567; 4,816,397; 5,693,762 und 5,712,120, der internationalen Patentveröffentlichung WO 87/02671 und WO 90/00616 und der europäischen Patentveröffentlichung 0,239,400 beschrieben, deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind). Alternativ kann ein menschlicher monoklonaler Antikörper oder Teile davon identifiziert werden, indem zunächst eine menschliche B-Zell-cDNA-Bibliothek auf DNA-Moleküle einem Screening unterzogen wird, die Antikörper kodieren, die spezifisch an ein Ang-7-Polypeptid binden, und zwar gemäß dem allgemein vorgestellten Verfahren von Huse et al. (Science 246: 1275–81 (1989)). Das DNA-Molekül kann dann kloniert und amplifiziert werden, um Sequenzen zu erhalten, die den Antikörper (oder die Bindungsdomäne) mit der gewünschten Spezifität kodieren. Die Phagendisplaytechnologie bietet andere Techniken zur Selektion von Antikörpern, die Ang-7-Polypeptide binden. (Siehe z.B. die internationalen Patentveröffentlichungen WO 91/17271 und WO 92/01047 und Huse et al., supra).
  • Antikörper können auch durch genetische Immunisierung unter Verwendung von Expressionsvektoren erzeugt werden, um die Expression der Ang-7-Polypeptide zu dirigieren. Ein Teilchenbombardement-vermittelter Gentransfer (Tang et al., Nature 356: 152–54 (1992); Eisenbaum et al., DNA & Cell Biol. 12: 791–97 (1993); Johnston und Tang, Meth. Cell. Biol. 43 PtA: 353–65 (1994); Vahlsing et al., J. Immun. Meth. 175: 11–22 (1994)) und ein retroviraler Gentransfer (Wang et al., DNA & Cell Biol. 12: 799–805 (1993)); Stover, Curr. Opin. Immunol. 6: 568–71 (1994); Laube et al., Human Gene Ther. 5: 853–62 (1994)) wurden verwendet, um spezifische Antikörperreaktionen auf Proteine, kodiert durch transferrierte Gene, zu erzeugen. Diese Verfahren erlauben die Erzeugung von Antikörpern, ohne dass eine Proteinreinigung nötig ist. Solche Verfahren können verwendet werden, um Panels von Antikörpern zu erzeugen, die spezifisch für Ang-7-Polypeptide sind. Monoklonale Antikörper können auch unter Verwendung dieser Verfahren erzeugt werden.
  • Antikörper gegen Ang-7-Polypeptide können als Reagenzien zum Nachweis von Ang-7-Polypeptiden in biologischen Proben verwendet werden, wie z.B. Tumor-Biopsieproben, Gewebe- und Organsektionen, periphären Blutzellen und ähnlichen. Solche Antikörper können auch in Immunoassays verwendet werden, um Ang-7-Polypeptidniveaus nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Immunoassays, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten enzymgebundene Immunosorbentassays, Immunoblots, Inhibitions- oder Kompetitionsreaktionen, Sandwichassays, Radioimmunopräzipitation und ähnliche, sind jedoch nicht darauf begrenzt. (Siehe z.B. US-Patente 4,642,285; 4,376,110; 4,016,043; 3,879,262; 3,852,157; 3,850,752; 3,839,153; 3,791,932 und Harlow und Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)).
  • In einem Assay werden Ang-7-Polypeptide unter Verwendung markierter Antikörper, vorzugsweise markierter monoklonaler Antikörper, identifiziert und/oder quantifiziert. Die Antikörper werden mit Geweben oder Zellen umgesetzt und dann werden die Gewebe oder Zellen überprüft um zu bestimmen, ob die Antikörper spezifisch an das Ziel Ang-7-Polypeptid gebunden sind. Solche Assays werden typischerweise unter Bedingungen, die für eine Immunkomplexbildung hinleitend sind, durchgeführt. Ein nicht-markierter primärer Antikörper kann in Kombination mit Markierungen verwendet werden, die mit dem primären Antikörper zum Nachweis des Ang-7-Polypeptids reaktiv sind. Zum Beispiel kann der primäre Antikörper indirekt durch einen markierten sekundären Antikörper nachgewiesen werden, der so entworfen wurde, dass er spezifisch den primären Antikörper nachweist. Alternativ kann der anti-Ang-7-Antikörper direkt markiert werden. Eine große Vielzahl von Markierungen kann verwendet werden, wie z.B. Radionuklide, Teilchen (z.B. Gold, Ferritin, magnetische Teilchen und rote Blutzellen), Fluorophore, chemilumineszierende Mittel, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) und ähnliche.
  • Die Ang-7-Polypeptide können in einem diagnostischen Assay für den Nachweis der Polypeptidniveaus gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, z.B. in verschiedenen Geweben, da eine Unterexpression der Proteine im Vergleich mit normalen Kontrollgewebeproben die Gegenwart einer abnormalen Angiogenese, z.B. eines Tumors, nachweisen kann. Assays, die verwendet werden, um die Niveaus von Proteinen in einer Probe nachzuweisen, die von einem Wirt abstammt, sind dem Fachmann wohlbekannt und beinhalten Radioimmunoassays, kompetitive Bindungsassays, Western Blot-Analysen, ELISA-Assays und Assays vom Sandwich-Typ. Diagnostische Assays beinhalten auch den Nachweis von Polynukleotiden, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren.
  • Verwendung von ANG-7-Nukleinsäuren und/oder Ang-7-Polypeptiden
  • Ang-7-Verbindungen beinhalten Ang-7-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2, wie hier beschrieben. Solche Ang-7-Verbindungen können weiterhin ANG-7-Nukleinsäuren beinhalten, die das Ang-7-Polypeptid der Erfindung, wie hier beschrieben, kodieren und Ang-7-anti-Sinn-Nukleinsäuren, wie unten im Detail beschrieben. Störungen, die die Angiogenese involvieren, können durch die Verwendung der Ang-7-Verbindung, wie oben definiert, behandelt werden, die die Angiogenese inhibiert, wie z.B. durch Verabreichung der Ang-7-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2 und/oder von ANG-7-Nukleinsäuren. Ähnlich können Störungen, bei denen die Angiogenese defizient oder erwünscht ist, durch Verabreichung einer Ang-7-anti-Sinn-Nukleinsäure oder eines Ang-7-Polypeptids, wie oben definiert, das die Ang-7-Funktion inhibiert, behandelt werden.
  • Die Verbindungen können therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht werden. Sie können mit der Wirtszelle in vivo, ex vivo oder in vitro kontaktiert werden, in einer effektiven Menge, wie in den folgenden Beispielen demonstriert.
  • Gentherapie
  • ANG-7-Nukleinsäuren, die die Ang-7-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, können in einem Prozess einer Gentherapie verwendet werden. Die Gentherapie bezieht sich auf ein Verfahren zur Bereitstellung der Expression von Nukleinsäuresequenzen von exogenem Ursprung in einem Subjekt für die Behandlung einer Erkrankung oder eines klinischen Zustandes bei diesem Subjekt. Eine solche Gentherapie kann an der Behandlung einer Erkrankung oder eines klinischen Zustandes beteiligt sein, die Krebs, die Wundheilung, eine Diabetes Retinopathie, eine Makuladegeneration, kardiovaskuläre Erkrankungen und klinische Zustände beinhalten können, die eine Angiogenese beim Reproduktionssystem involvieren, einschließlich einer Regulation der Plazentavaskularisierung oder zur Verwendung als Abtreibungsmittel, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. Die Zufuhr der Nukleinsäure zu dem Subjekt kann entweder direkt geschehen, in welchem Fall der Patient der Nukleinsäure oder dem Nukleinsäure-tragenden Vektor direkt ausgesetzt wird oder indirekt, in welchem Fall Zellen zunächst mit der Nukleinsäure in vitro transformiert werden und diese dann in den Patienten transplantiert werden. Diese zwei Ansätze sind jeweils als in vivo- oder ex vivo-Gentherapie bekannt. Das Ang-7-Polypeptid kann z.B. rekombinant durch biotechnologische Manipulation von Zellen mit einem Polynukleotid (DNA oder RNA), das für das Polypeptid, das Fragment oder die Variante kodiert, ex vivo exprimiert werden, die bearbeiteten Zellen können dann einem Patienten, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll, bereitgestellt werden. Die Zellen können auch durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren gentechnologisch manipuliert werden, und zwar durch Verwendung eines retroviralen/lentiviralen Partikels, der RNA enthält, die das Ang-7-Polypeptid kodiert. Beispielhafte Verfahren werden unten beschrieben.
  • Für einen allgemeinen Überblick über die Verfahren der Gentherapie siehe Goldspiel et al. (Clinical Pharmacy 12: 488–505 (1993)); Wu und Wu (Biotherapy 3: 87–95 (1991)); Tolstoshev (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573–596 (1993)); Mulligan (Science 260: 926–932 (1993)); Morgan und Anderson (Ann. Rev. Biochem. 62: 191–217 (1993)); und May (TIBTECH 11: 155–215 (1993)). Verfahren, die allgemein auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden und die auch hier verwendet werden können, beinhalten die in Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)), Kriegler (Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)) und den US-Patenten 6,077,663; 6,077,835; 6,077,705 und 6,075,012 beschriebenen. Verfahren unter Verwendung anderer exogener Sequenzen für die Gentherapie sind ebenfalls auf die Gentherapie unter Verwendung der ANG-7-Nukleinsäuren anwendbar (siehe z.B. US-Patent Nr. 6,066,624).
  • Etliche Verfahren zur Übertragung potenziell therapeutischer Gene auf definierte Zellpopulationen sind bekannt (siehe z.B. Mulligan, Science 260: 926–31 (1993)). Diese Verfahren beinhalten:
    • 1) den direkten Gentransfer (siehe z.B. Wolff et al., Science 247: 1465–68 (1990)).
    • 2) Den Liposomen-vermittelten DNA-Transfer (siehe z.B. Caplen et al., Nature Med. 3: 39–46 (1995); Crystal, Nature Med. 1: 15–17 (1995); Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 280–85 (1991)).
    • 3) Den Retrovirus-vermittelten DNA-Transfer (siehe z.B. Kay et al., Science, 262: 117–19 (1993); Anderson, Science 256: 808–13 (1992)). Retroviren, von denen die oben beschriebenen retroviralen Plasmidvektoren abgeleitet werden können, beinhalten Lentiviren. Sie beinhalten weiterhin den Moloney-Maus-Leukämievirus, den Milz-Nekrose-Virus, Retroviren wie den Rous-Sarcom-Virus, den Harvey-Sarcom-Virus, den Vogelleukosevirus, den Gibbonaffen-Leukämievirus, den menschlichen Immunodefizienzvirus, den myeloproliferativen Sarcomvirus und den Brusttumorvirus, sind jedoch nicht hierauf begrenzt. In einer Ausführungsform wird der retrovirale Plasmidvektor von dem Maus-Moloney-Leukämievirus abgeleitet. Beispiele, die die Verwendung von retroviralen Vektoren in der Gentherapie illustrieren, beinhalten weiterhin die folgenden: Clowes et al. (J. Clin. Invest. 93: 644–651 (1994)); Kiem et al. (Blood 83: 1467–1473 (1994)); Salmons und Gunzberg (Human Gene Therapy 4: 129–141 (1993)) und Grossman und Wilson (Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110–114 (1993)).
    • 4) Den DNA-Virus-vermittelten DNA-Transfer. Solche DNA-Viren beinhalten Adenoviren (vorzugsweise auf Ad-2- oder Ad-5-basierende Vektoren), Herpesviren (vorzugsweise auf Herpes simplex-Virus basierende Vektoren) und Parvoviren (vorzugsweise "defekte" oder nicht-autonome auf Parvovirus basierende Vektoren, noch bevorzugter auf Adeno-assoziiertem Virus basierende Vektoren, besonders bevorzugt auf AAV-2-basierende Vektoren) (siehe z.B. Ali et al., Gene Therapy 1: 367–84 (1994); US-Patente 4,797,368 und 5,139,941, deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist). Adenoviren weisen den Vorteil auf, dass sie einen breiten Wirtsbereich aufweisen, ruhende oder terminal differenzierte Zellen infizieren, wie z.B. Neuronen oder Hepatozyten und im wesentlichen nicht onkogen zu sein scheinen. Adenoviren scheinen sich nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Da sie extrachromosomal existieren, reduziert sich das Risiko einer Insertionsmutagenese deutlich. Adenoassoziierte Viren zeigen ähnliche Vorteile wie auf Adenovirus basierende Vektoren, jedoch zeigen AAVs eine ortsspezifische Integration auf das menschliche Chromosom 19.
  • Kozarsky und Wilson (Current Opinion in Genetics and Development 3: 499–503 (1993)) präsentieren einen Überblick über die auf Adenovirus basierende Gentherapie. Bout et al. (Human Gene Therapy 5: 3–10 (1994)) demonstrierten die Verwendung von adenoviralen Vektoren zum Transfer von Genen auf die respiratorischen Epithelien von Rhesusaffen. Herman et al. (Human Gene Therapy 10: 1239–1249 (1999)) beschreiben die intra-Prostata-Injektion eines replikationsdeffizienten Adenovirus, der das Herpes simplex-Thymidinkinasegen enthält, in die menschliche Prostata, gefolgt von einer intravenösen Verabreichung des Prodrugs Ganciclovir in einem Phase I klinischen Versuch. Andere Beispiele der Verwendung von Adenoviren bei der Gentherapie können bei Rosenfeld et al. (Science 252: 431–434 (1991)); Rosenfeld et al. (Cell 68: 143–155 (1992)); Mastrangeli et al. (J. Clin. Invest. 91: 225–234 (1993)) und Thompson (Oncol. Res. 11: 1–8 (1999)) gefunden werden.
  • Die Wahl eines bestimmten Vektorsystems zur Übertragung des interessierenden Gens wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen. Ein wichtiger Faktor ist die Natur der Zielzellpopulation. Obwohl retrovirale Vektoren intensiv untersucht und in einer Anzahl von Gentherapieanwendungen verwendet wurden, sind diese Vektoren allgemein für die Infektion von sich nicht teilenden Zellen ungeeignet. Zusätzlich weisen Retroviren ein Potenzial für eine Onkogenizität auf. Kürzliche Entwicklungen auf dem Gebiet der lentiviralen Vektoren können jedoch einige dieser Nachteile überwinden (siehe Naldini et al., Science 272: 263–7 (1996)).
  • Die Gentherapie mit einer DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, wird einem Subjekt (z.B. einem Patienten oder Säuger), das dessen bedarf, zusammen mit oder direkt nach der Diagnose zur Verfügung gestellt. Der Fachmann wird anerkennen, dass jeder geeignete Gentherapievektor, enthaltend DNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die Techniken zur Konstruktion eines solchen Vektors sind bekannt (siehe z.B. Anderson, Nature 392 25–30 (1998); Verma, Nature 389 239–42 (1998)). Die Einführung des Vektors zur Zielstelle kann unter Verwendung bekannter Verfahren geschehen.
  • In einer Ausführungsform wird die ANG-7-Nukleinsäure in einen Expressionsvektor inseriert. Die ANG-7-Nukleinsäuren kodieren ein Ang-7-Polypeptid oder chimäres Protein. Insbesondere umfasst ein solches Expressionsvektorkonstrukt typischerweise einen Promotor, der operabel an eine ANG-7-Nukleinsäure (z.B. cDNA oder ein Teil der kodierenden Region) gebunden ist, wobei der Promotor induzierbar oder konstitutiv und optional gewebsspezifisch ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform können, falls eine endogene ANG-7-Nukleinsäure defekt ist, die defekten Sequenzen durch exogene ANG-7 kodierende Sequenzen ersetzt werden und andere gewünschte Sequenzen, die von Regionen flankiert werden, die eine homologe Rekombination an einer gewünschten Stelle im Genom unterstützen, wodurch eine intrachromosomale Expression der exogenen ANG-7-Nukleinsäure zur Verfügung gestellt wird. (Siehe z.B. Koller und Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435–438 (1989)); US-Patente Nrn. 5,631,153; 5,627,059; 5,487,992 und 5,464,764).
  • Nukleinsäuren können auch gebunden an ein Peptid verabreicht werden, von dem bekannt ist, dass es in den Kern eintritt, indem die Nukleinsäure gebunden an einen Liganden verabreicht wird, der einer rezeptorvermittelten Endozytose unterliegt (siehe z.B. Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987)), der in Zielzelltypen verwendbar ist, die spezifisch die Rezeptoren exprimieren und ähnliches. In einer anderen Ausführungsform kann ein Nukleinsäure-Ligandenkomplex gebildet werden, worin der Ligand ein fusogenes virales Peptid umfasst, um Endosomen aufzubrechen, was es der Nukleinsäure ermöglicht, einen lysosomalen Abbau zu vermeiden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Nukleinsäure in vivo auf eine zellspezifische Aufnahme abzielen und ihre Expression, indem auf einen spezifischen Rezeptor abgezielt wird (siehe z.B. internationale Patentveröffentlichungen WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188 und WO 93/20221). Alternativ kann die Nukleinsäure intrazellulär eingeführt und in die Wirtszell-DNA zur Expression durch homologe Rekombination eingebaut werden. (Siehe z.B. Koller und Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342: 435–438 (1989)); US-Patente Nrn. 5,631,153; 5,627,059; 5,487,992 und 5,464,764)).
  • Gemäß einer spezifischen Ausführungsform wird ein viraler Vektor verwendet, der eine ANG-7-Nukleinsäure enthält. Zum Beispiel kann ein retroviraler Vektor verwendet werden (siehe Miller et al., Meth. Enzymol. 17: 581–599 (1993)). Diese retroviralen Vektoren wurden so modifiziert, dass retrovirale Sequenzen deletiert wurden, die für die Verpackung des viralen Genoms nicht notwendig sind sowie für die Integration in die Wirtszell-DNA. Die in der Gentherapie zu verwendende ANG-7-Nukleinsäure wird in den Vektor kloniert, was die Zufuhr des Gens zum Patienten erleichtert. Mehr Details über retrovirale Vektoren können in Boesen et al. (Biotherapy 6: 291–302 (1994)) nachgelesen werden, der die Verwendung eines retroviralen Vektors zur Zufuhr des mdrl-Gens zu hämatopoetischen Stammzellen beschreibt, damit die Stammzellen gegenüber einer Chemotherapie resistenter werden.
  • Andere Ansätze einer Gentherapie involvieren die Übertragung eines Gens auf Zellen in Gewebskulturen durch Verfahren wie Elektroporation, Lipofektion, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion oder virale Infektion. Typischerweise beinhalten die Verfahren den Transfer eines selektierbaren Markers in die Zellen. Die Zellen werden dann einer Selektion unterzogen, um diejenigen Zellen zu isolieren, die das transferierte Gen aufgenommen haben und dieses exprimieren. Die selektierten Zellen werden dann einem Patienten zugeführt.
  • Vielzählige Verfahren sind auf dem Gebiet zur Einführung von Fremdgenen in Zellen bekannt (siehe z.B. Loeffler und Behr, Meth. Enzymol. 217: 599–618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217: 618–644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69–92 (1985)) und können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Technik stellt typischerweise einen stabilen Transfer der Nukleinsäure in die Zelle bereit, so dass die Nukleinsäure durch die Zelle exprimierbar und vererbbar ist und auch von der Zellnachkommenschaft exprimiert wird.
  • Die resultierenden rekombinanten Zellen können einem Patienten durch verschiedene auf dem Gebiet bekannte Verfahren zugeführt werden. Typischerweise werden die Zellen subkutan injiziert. Alternativ können rekombinante Hautzellen als Hauttransplantat auf den Patienten übertragen werden. Rekombinante Blutzellen (z.B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen) werden typischerweise intravenös verabreicht. Die Menge an Zellen, die für die Verwendung vorgesehen ist, hängt von der gewünschten Wirkung ab, wie auch dem Zustand des Patienten und ähnlichem und kann von dem Fachmann bestimmt werden.
  • Zellen, in die eine Nukleinsäure zum Zweck einer Gentherapie eingeführt werden kann, umfassen jeden gewünschten, zur Verfügung stehenden Zelltyp und beinhalten Endothelzellen, Prostatazellen, Epithelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatozyten, Blutzellen (wie z.B. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryozyten und Granulozyten), verschiedene Stamm- oder Vorläuferzellen (insbesondere hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen, wie z.B. diejenigen, die aus dem Knochenmark, dem Nabelschnurblut, dem periphären Blut, der fötalen Leber und ähnlichem erhalten werden), sind jedoch nicht darauf begrenzt. Die für die Gentherapie verwendeten Zellen sind in der Regel für den Patienten autolog, es können jedoch heterologe Zellen verwendet werden, die im Hinblick auf Kompatibilität mit dem Patienten typisiert wurden.
  • Verabreichung von Ang-7-Polypeptiden
  • Die Erfindung stellt die Verabreichung einer effektiven Menge einer Ang-7-Verbindung an ein Subjekt bereit. Eine nicht erwünschte Angiogenese kann z.B. durch Verabreichung einer effektiven Menge des Ang-7-Polypeptids behandelt oder verhindert werden. Solche Polypeptide werden therapeutisch (einschließlich prophylaktisch) bei Erkrankungen oder klinischen Zuständen, nämlich Tumoren, verabreicht, die eine erhöhte (relativ zur normalen oder gewünschten) Angiogenese involvieren, um dadurch die Angiogenese zu inhibieren. In einer anderen Ausführungsform sollen solche Polypeptide therapeutisch (einschließlich prophylaktisch) bei Erkrankungen oder klinischen Zuständen, nämlich Tumoren, verabreicht werden, bei denen die Angiogenese für die Auslösung oder Behandlung der Erkrankungen oder den klinischen Zustand relevant sein kann, um die Erkrankung oder den klinischen Zustand zu inhibieren.
  • Typischerweise wird die Ang-7-Verbindung vor der Formulierung im wesentlichen gereinigt. Das Subjekt kann ein Tier sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde und ähnliches und ist typischerweise ein Säuger und in einer besonderen Ausführungsform menschlich. Gemäß einer anderen spezifischen Ausführungsform ist ein nicht-menschlicher Säuger das Subjekt. Formulierungen und Verabreichungsverfahren, die verwendet werden können, wenn die Ang-7-Verbindung eine Nukleinsäure umfasst, wurden oben beschrieben; zusätzliche geeignete Formulierungen und Verabreichungswege können aus den unten beschriebenen gewählt werden.
  • Es sind verschiedene Zufuhrsysteme bekannt und können verwendet werden, um eine Ang-7-Verbindung zu verabreichen, wie z.B. Verkapselung in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln, rekombinante Zellen, die die Verbindung exprimieren können, durch ein rezeptorvermittelte Endozytose (siehe z.B. Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987)), durch Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine ANG-7-Nukleinsäure umfasst, als Teil eines retroviralen oder anderen Vektors und ähnliche. Verfahren zur Einführung beinhalten den intradermalen, intramuskulären, intraperitonealen, intravenösen, subkutanen, intranasalen, epiduralen und oralen Weg, sind jedoch nicht darauf begrenzt. Die Verbindungen können auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, z.B. durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption durch Epithel- oder mukocutane Auskleidungen (z.B. orale Mukosa, rektale und intestinale Mukosa) und ähnliche und können zusammen mit anderen biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal geschehen.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, eine Ang-7-Verbindung lokal einem Bereich zu verabreichen, der einer Behandlung bedarf; diese Verabreichung kann z.B. durch lokale Infusion während einer Chirurgie, topische Anwendung (z.B. zusammen mit einem Wundverband nach einer Chirurgie), durch Injektion, durch einen Katheter, durch ein Suppositorium oder ein Implantat erreicht werden, wobei das Implantat ein poröses, nicht poröses oder gelatineartiges Material sein kann, einschließlich Membranen wie sialastische Membranen oder Fasern, ist jedoch nicht darauf begrenzt. In einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an der Stelle (oder früheren Stelle) eines malignen Tumors oder eines neoplastischen oder prä-neoplastischen Gewebes geschehen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Ang-7-Verbindung in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom, zugeführt werden (siehe Langer, Science 249: 1527–1533 (1990); Treat et al., In Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, Seiten 353–365 (1989); Lopez-Berestein, supra, Seiten 317–327); US-Patente Nrn. 6,077,663 und 6,071,533).
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Ang-7-Verbindung in einem System zur kontrollierten Freisetzung zugefügt werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (siehe Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (siehe z.B. Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (Hrsg.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 (1983); Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)). In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein System zur kontrollierten Freisetzung in Nachbarschaft zu dem therapeutischen Ziel platziert werden, so dass nur eine Fraktion der systemischen Dosis notwendig ist (siehe z.B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, Band 2, Seiten 115–138 (1984)). Andere Systeme für die kontrollierte Freisetzung werden z.B. in der Übersicht von Langer (Science 249: 1527–1533 (1990)) diskutiert.
  • Ebenfalls werden pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verabreichung von Ang-7-Verbindungen beschrieben. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch effektive Menge einer Ang-7-Verbindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Bezeichnung "pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet von einer regulatorischen Behörde der staatlichen Regierungen anerkannt oder in der U.S. Pharmacopeia oder einer anderen generell anerkannten Pharmacopeia zur Verwendung bei Tieren und insbesondere typischerweise beim Menschen aufgeführt. Die Bezeichnung "Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Exzipienz, einen Stabilisator oder ein Vehikel, mit dem die Ang-7-Verbindung für die Verabreichung formuliert wird.
  • Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann eine physiologisch akzeptable Verbindung enthalten, die z.B. so wirkt, dass sie die Zusammensetzung stabilisiert oder die Absorption des Mittels erhöht oder vermindert. Eine physiologisch akzeptable Verbindung kann z.B. Kohlenhydrate beinhalten, wie z.B. Glukose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidanzien, wie z.B. Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, niedrigmolekulare Proteine oder andere Stabilisatoren oder Exzipienzien. Andere physiologisch akzeptable Verbindungen beinhalten Benetzungsmittel, Emulgatoren, Dispersionsmittel oder Konservierungsmittel, die insbesondere für die Verhinderung des Wachstums oder der Wirkung von Mikroorganismen geeignet sind. Träger beinhalten weiterhin sterile Flüssigkeiten wie Wasser und Öle, einschließlich diejenigen aus Petroleum, von tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie z.B. Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und ähnliche. Wasser ist ein typischer Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose und Glycerinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Verschiedene Konservierungsmittel sind wohlbekannt und beinhalten z.B. Phenol und Ascorbinsäure. Geeignete pharmazeutische Exzipienzien beinhalten Stärke, Glukose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silikagel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumchlorid, getrocknete entfettete Milch, Glycerin, Propylen, Glykol, Wasser, Ethanol und ähnliche. Der Fachmann würde wissen, dass die Wahl eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers, einschließlich einer physiologisch akzeptablen Verbindung z.B. vom Verabreichungsweg des Polypeptids und den besonderen physikochemischen Eigenschaften des spezifischen Polypeptids abhängt. Zum Beispiel ist ein physiologisch akzeptabler Träger wie z.B. Aluminiummonostearat oder Gelatine insbesondere als Verzögerungsmittel geeignet, das die Rate der Absorption einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einem Subjekt verabreicht wird, verlängert. Weitere Beispiele für Träger, Stabilisatoren oder Adjuvantien können in Martin, Remington's Pharm. Sci., 15.
  • Auflage (Mack Publ. Co., Easton, 1975), das hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist, angetroffen werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch, falls gewünscht, in Liposomen, in Mikrosphären oder andere polymere Matrizes inkorporiert werden (siehe Gregoriadis, Liposome Technology, Band 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla. 1984), das hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist)). Liposomen, die z.B. aus Phospholipiden oder anderen Lipiden bestehen, sind nicht toxisch, physiologisch akzeptabel und verstoffwechselbare Träger, die in der Herstellung und Verabreichung relativ einfach sind.
  • Wenn Sie in vivo durchgeführt werden, sind die Verfahren zur Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend den Vektor dieser Erfindung, auf dem Gebiet wohlbekannt und beinhalten eine orale, intratumorale, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung, sind jedoch nicht auf diese begrenzt. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder intermittierend geschehen und wird je nach Subjekt und behandeltem Zustand variieren, z.B. wie in dem Fall mit anderen therapeutischen Zusammensetzungen (siehe Landmann et al., J. Interferon Res. 12: 103–111 (1992); Aulitzky et al., Eur. J. Cancer 27: 462–67 (1991); Lantz et al., Cytokine 2: 402–06 (1990); Supersaxo et al., Pharm. Res. 5: 472–76 (1988); Demitri et al., J. Clin. Oncol. 7: 1545–53 (1989); und LeMaistre et al., Lancet 337: 1124–25 (1991)).
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, einer Emulsion, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung und ähnliches annehmen. Die Zusammensetzung kann als Suppositorien mit traditionellen Bindemitteln und Trägern, wie z.B. Triglyceriden, formuliert werden. Orale Formulierungen können Standardträger wie z.B. Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliche vom pharmazeutischen Grad beinhalten.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen werden eine therapeutisch effektive Menge der Ang-7-Verbindung enthalten, typischerweise in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Trägermenge, um eine Formulierung, die für die Verabreichung an den Patienten geeignet ist, bereitzustellen. Die Formulierung sollte der Verabreichungsweise entsprechen.
  • In einer Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß Routineverfahren als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die an eine intravenöse Verabreichung an Menschen angepasst ist. Typischerweise sind Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichungen Lösungen in einem sterilen isotonischen wässrigen Puffer. Wenn nötig, kann die Zusammensetzung auch ein löslichmachendes Mittel und ein Lokalanästhetikum beinhalten, um Schmerzen an der Stelle der Injektion zu vermindern. Allgemein werden die Bestandteile entweder separat oder vermischt in Einheitsdosierungsformen zugeführt. Zum Beispiel als trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch versiegelten Behälter wie z.B. einer Ampulle oder einem Beutel, wobei die Menge der Ang-7-Verbindung angegeben ist. Wenn die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, enthaltend steriles Wasser vom pharmazeutischen Grad oder Salzlösung, verabreicht werden. Wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für die Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung vermischt werden können.
  • Die Ang-7-Verbindungen können als neutrale oder Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze beinhalten diejenigen, die mit freien Aminogruppen gebildet werden, wie z.B. die von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure und ähnlichen abgeleiteten und diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet werden, wie z.B. die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisenhydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnlichen abgeleiteten.
  • Die Menge der Ang-7-Verbindung, die für die Behandlung einer bestimmten Störung oder eines Zustandes effektiv sein wird, wie indiziert durch Modulation der Angiogenese, wird von der Natur der Störung oder des Zustandes abhängen und kann durch klinische Standardverfahren bestimmt werden. Zusätzlich können optional in vitro Assays verwendet werden, um die Identifikation der optiomalen Dosierungsbereiche zu unterstützen. Die präzise Dosis der Ang-7-Verbindung, die in der Formulierung verwendet werden soll, wird auch von dem Verabreichungsweg und der Ernsthaftigkeit der Erkrankung oder der Störung abhängen und sollte gemäß der Beurteilung des praktischen Arztes und den Umständen von jedem Patienten entschieden werden. Geeignete Dosierungsbereiche für die intravenöse Verabreichung liegen allgemein bei ungefähr 20 bis 500 μg der aktiven Ang-7-Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche für die intranasale Verabreichung liegen allgemein bei ungefähr 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Effektive Dosierungen können aus der Dosisreaktionskurve, abgeleitet von in vitro- oder Tiermodell-Testsystemen extrapoliert werden. Suppositorien enthalten allgemein den Wirkstoff in einem Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten typischerweise 10 bis 95 Gew.-% Wirkstoff.
  • Die Beschreibung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit bereit, umfassend ein oder mehr Behälter, gefüllt mit einem oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung. Optional mit einem solchen Behälter (Behältern) assoziiert, kann eine Notiz in der von der Regierungsbehörde vorgeschriebenen Form, die die Herstellung, Verwendung oder der Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, enthalten sein, wobei die Notiz die Anerkennung durch die Behörde für die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf zur menschlichen Verabreichung reflektiert.
  • Behandlung von mit Angiogenese in Beziehung stehenden Erkrankungen
  • Ang-7-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2 oder ANG-7-Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, können für die Behandlung von Tumoren verwendet werden, die mit der Angiogenese in Beziehung stehen. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass die Initiation und/oder das Fortschreiten vieler Erkrankungen von der Angiogenese abhängt. Die Tumorbildung ist z.B. eng mit der Angiogenese assoziiert. Solche Tumoren beinhalten feste Tumoren wie Rhabdomyosarkome, Retinoblastom, Ewing-Sarkom, Neuroblastom und Osteosarkom und gutartige Tumoren wie z.B. das akustische Neurom, Neurofibrom, Trachom und pyogene Granulome. So kann die Tumorbildung oder das Fortschreiten durch Inhibition der Angiogenese behandelt werden; Verabreichung von Ang-7-Polypeptiden gemäß SEQ ID NO: 2 oder ANG-7-Nukleinsäuren an den Tumor wird das weitere Tumorwachstum und/oder sein Fortschreiten inhibieren. Auf ähnliche Weise können Zellen, die rekombinante Ang-7-Polypeptide gemäß SEQ ID NO: 2 exprimieren, Fragmente oder Varianten verwendet werden.
  • Antisinn-Regulation der ANG-7-Expression:
  • Die Ang-7-Funktion kann durch Verwendung von ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren inhibiert werden. Die vorliegende Erfindung stellt die Verabreichung von Nukleinsäuren mit mindestens sechs Nukleotiden bereit, die Antisinn zu einem Gen oder einer cDNA ausgebildet sind, kodierend das Ang-7-Polypeptid oder ein Fragment oder eine Variante davon zur Inhibition der Funktion des Ang-7-Polypeptids. Ein ANG-7-"Antisinn"-Nukleinsäure, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die mit einem Teil einer ANG-7-RNA (typischerweise mRNA) durch Sequenzkomplementarität hybridisiert. Die Antisinn-Nukleinsäure kann zu einem kodierenden und/oder nicht kodierenden Bereich einer ANG-7-mRNA komplementär sein. Absolute Komplementarität wird jedoch, obwohl sie typisch ist, nicht notwendigerweise benötigt. Eine Sequenz, "die zu mindestens einem Teil einer RNA komplementär ist", wie hier genannt, bedeutet eine Sequenz mit einer ausreichenden Komplementarität, damit sie mit der RNA unter Bildung eines stabilen Duplexes hybridisieren kann. Im Fall von doppelsträngigen ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren kann ein Einzelstrang der Duplex-DNA getestet oder eine Triplex-Formation kann überprüft werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung wird von sowohl dem Grad der Komplementarität als auch der Länge der Antisinn-Nukleinsäure abhängen. Allgemeiner wird die hybridisierende Nukleinsäure je länger sie ist, desto mehr Basenfehlpaarungen enthalten und immer noch einen stabilen Duplex (oder Triplex, je nach Fall) bilden. Der Fachmann kann ein tolerables Maß an Fehlpaarungen durch Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes sicherstellen.
  • Solche Antisinn-Nukleinsäuren finden Verwendung als Mittel, die die Ang-7-Funktion inhibieren und können für die Behandlung oder Prävention von Erkrankungen oder klinischen Zuständen, wie oben beschrieben, verwendet werden. Die Antisinn-Nukleinsäuren der Erfindung können Oligonukleotide sein, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein können, RNA oder DNA oder ein Derivat davon, das direkt an eine Zelle verabreicht werden kann oder die intrazellulär durch Transkription exogener, eingeführter Nukleinsäuresequenzen erzeugt werden.
  • Die ANG-7-Antisinn-Nukleinsäure, die hier bereitgestellt wird, kann zur Verhinderung der Angiogenese verwendet werden. Ebenfalls beschrieben werden pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine effektive Menge der ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren der Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie oben beschrieben. In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung auf Verfahren zur Inhibition der Expression einer ANG-7-Nukleinsäuresequenz in einer eukaryontischen Zelle gerichtet, umfassend die Bereitstellung der Zelle mit einer effektiven Menge einer Zusammensetzung, umfassend eine ANG-7-Antisinn-Nukleinsäure der Erfindung. Die ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren und ihre Verwendungen werden im Detail unten beschrieben.
  • Die ANG-7-Antisinn-Nukleinsäuren enthalten mindestens sechs Nukleotide und sind typischerweise Oligonukleotide (in einem Bereich von 6 bis ungefähr 50 Nukleotiden oder mehr). In spezifischen Aspekten hat das Oligonukleotid mindestens 10, mindestens 15, mindestens 100 oder mindestens 200 Nukleotide. Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimäre Mischungen oder Derivate davon sein und können einzel- oder doppelsträngig sein. Ein Derivat kann am Basenbestandteil, Zuckerbestandteil oder Phosphatrückgrat, wie unten beschrieben, modifiziert sein. Das Derivat kann andere Anhangsgruppen beinhalten wie z.B. Peptide oder Mittel, die den Transport über die Zellmembran erleichtern (siehe z.B. Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553: 56 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648–52 (1987); internationale Patentveröffentlichung WO 88/09810) oder über die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B. internationale Patentveröffentlichung WO 89/(10134), außerdem hybridisierungsgetriggerte Spaltungsmittel (siehe z.B. Krol et al., BioTechniques 6: 958–76 (1988)) oder interkalierende Mittel (siehe z.B. Zon, Pharm. Res. 5: 539–49 (1988)).
  • In einer Ausführungsform wird ein ANG-7-Antisinn-Oligonukleotid typischerweise als einzelsträngige DNA bereitgestellt. Das Oligonukleotid kann an jeder Position auf seiner Struktur mit allgemein bekannten Substituenten modifiziert werden. Das ANG-7-Antisinn-Oligonukleotid kann mindestens einen modifizierten Basenbestandteil umfassen, wie z.B. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylamino-methyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N-6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, 2,6-Diaminopurin und ähnliche. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens einen modifizierten Zuckerbestandteil, wie z.B. Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid mindestens ein modifiziertes Phosphatrückgrat wie z.B. ein Phosphorthioat, ein Phosphordithioat, ein Phosphoramidothioat, ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, einen Alkylphosphotriester und ein Formacetal oder Analog davon.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein α-anomeres Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, worin, anders als bei den üblichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (siehe Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15: 6625–41 (1987)). Das Oligonukleotid kann mit einem anderen Molekül konjugiert werden (z.B. einem Peptid, einem Hybridisierungs-getriggerten Vernetzungsmittel, Transportmittel, einem Hybridisierungs-getriggerten Spaltungsmittel und ähnlichen).
  • Die Oligonukleotide können durch Standardverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, synthetisiert werden (z.B. durch Verwendung eines kommerziell zur Verfügung stehenden automatisierten DNA-Synthetisierers). Als Beispiele können Phosphorthioatoligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. (siehe Nucl. Acids. Res 16: 3209 (1988)) synthetisiert werden und Methylphosphonatoligonukleotide können durch die Verwendung von kontrollierten Porenglaspolymerträgern (siehe Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448–51 (1988)) hergestellt werden und ähnliches.
  • In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das ANG-7-Antisinn-Oligonukleotid katalytische RNA oder ein Ribozym (siehe z.B. internationale Patentveröffentlichung WO 90/11364; Sarver et al., Science 247: 1222–25 (1990)). In einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid 2'-O-Methylribonukleotid (siehe z.B. Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131–48 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (siehe z.B. Inoue et al., FEBS Lett. 215: 327–30 (1987)).
  • In einer alternativen Ausführungsform wird die ANG-7-Antisinn-Nukleinsäure intrazellulär durch Transkription von einer exogenen Sequenz erzeugt. Es kann z.B. ein Vektor in vivo eingeführt werden, so dass er durch eine Zelle aufgenommen wird, worin der Vektor oder ein Teil davon transkribiert wird, wodurch er eine Antisinn-Nukleinsäure (RNA) der Erfindung erzeugt. Der Vektor würde eine Sequenz enthalten, die die ANG-7-Antisinn-Nukleinsäure oder einen Teil davon kodiert. Sobald er innerhalb der Zelle ist, kann der Vektor episomal verbleiben oder chromosomal integriert werden, solange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisinn-RNA zu erzeugen. Solche Vektoren können durch rekombinante DNA-Technologieverfahren, die auf dem Gebiet Standard sind, konstruiert werden. Die Vektoren können ein Plasmid sein, viral oder andere auf dem Gebiet bekannte, die für die Replikation und Expression in Säugerzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die die ANG-7-Antisinn-RNA kodiert, kann durch jeden auf dem Gebiet bekannten Promotor, von dem man weiß, dass er in Säuger-, typischerweise menschlichen Zellen wirkt, kontrolliert werden. Die Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Induzierbare Promotoren beinhalten den SV40-frühen Promotorbereich (siehe Bernoist und Chambon, Nature 290: 304–10 (1981)), den Promotor, der im 3'-langen terminalen Repeat des Rous-Sarkom-Virus enthalten ist (siehe Yamamoto et al., Cell 22: 787–97 (1980)), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (siehe Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441–45 (1981)), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (siehe Brinster et al., Nature 296: 39–42 (1981)) und ähnliche, sind jedoch nicht hierauf begrenzt.
  • Tiermodelle:
  • Die Beschreibung stellt auch Tiermodelle bereit. In einem Referenzaspekt werden Tiermodelle für Erkrankungen und Störungen, die eine Angiogenese involvieren, bereitgestellt. Solch ein Tier kann anfänglich durch Unterstützung der homologen Rekombination zwischen einem ANG-7-Gen in seinem Chromosom und einem exogenen ANG-7-Gen, das biologisch inaktiviert wurde (typischerweise durch Insertion einer heterologen Sequenz wie z.B. einem Antibiotikaresistenzgen), erzeugt werden. Die homologe Rekombination kann beispielsweise durch Transformation von von Embryo abgeleiteten Stamm-(ES)-Zellen mit einem Vektor durchgeführt werden, der das insertionsinaktivierte ANG-7-Gen enthält, so dass eine homologe Rekombination auftritt, gefolgt von einer Injektion der ES-Zellen in einen Blastozysten und Implantation des Blastozysten in eine Stiefmutter, gefolgt von der Geburt des chimären Tiers (Knockout-Tier), worin ein ANG-7-Gen inaktiviert wurde (siehe z.B. Capecchi, Science 244: 1288–1292 (1989); US-Patente Nrn. 5,631,153; 5,627,059; 5,487,992 und 5,464,764). Das chimäre Tier kann so gezüchtet werden, dass es zusätzliche Knockout-Tiere erzeugt. Solche Tiere können Mäuse, Hamster, Schafe, Schweine, Rinder und ähnliche sein und sind typischerweise nicht menschliche Säuger. In einer spezifischen Ausführungsform wird eine Knockout-Maus erzeugt. Knockout-Tiere sollten Erkrankungen oder Störungen entwickeln oder dafür prädisponiert sein, die mit hyperangiogenen Zuständen assoziiert sind und können nützlich sein, um auf Testmoleküle im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Verminderung der Angiogenese zu screenen und so solche Erkrankungen und Störungen zu behandeln oder zu verhindern.
  • In einer anderen Ausführungsform können die transgenen Tiere, die ANG-7-Gene inkorporiert aufweisen und diese überexprimieren, als Tiermodelle für Erkrankungen und Störungen verwendet werden, die eine Hypoangiogenese involvieren. Transgene Tiere sollten hypoangiogene Bedingungen entwickeln oder dafür prädisponiert sein oder eine erhöhte Resistenz gegenüber Erkrankungen aufweisen, die eine Angiogenese benötigen wie z.B. einer Tumorbildung. So können diese Tiere als Tiermodelle für solche Erkrankungen und Störungen verwendet werden oder für die Resistenz gegenüber solchen Erkrankungen und Störungen.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele werden illustrativ, jedoch nicht begrenzend für die beanspruchte Erfindung angeboten.
  • Beispiel 1:
  • Um Mitglieder der Angiopoietin-Ligandenfamilie zu identifizieren, wurde eine BLAST-Suche (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389–402 (1997)) unter Verwendung der exprimierten Sequenz-Tag (EST) -Datenbank vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) durchgeführt. Die Aminosäuresequenz von Ang-1 wurde als Sonde verwendet. Diese Suche identifizierte ein menschliches EST (Zugangsnummer AA773234). Die korrespondierende Aminosäuresequenz dieses EST zeigte eine signifikante Sequenzidentität im +2-Leserahmen zu Ang-1. Der Wahrscheinlichkeits-(P)-Wert betrug 4,4 × 10–28, was deutlich anzeigt, dass das identifizierte EST ein Fragment eines Proteins kodiert, das zu der Familie der Angiopoietine gehört. Ein weiterer Beweis, dass das EST ein Fragment eines Angiopoietinproteins kodiert (das als Ang-7 bezeichnet wurde) wurde durch Durchführung einer BLAST-Suche einer Swissprot-Datenbank erhalten, wobei die deduzierte Aminosäuresequenz von EST AA773234 verwendet wurde. Die P-Werte, die für die Ausrichtungen von Ang-1 und Ang-2 mit der Teilaminosäuresequenz von Ang-7 erhalten wurden, lagen bei 3,2 × 10–32 bzw. 2,6 × 10–34.
  • Eine weitere Suche in der EST-Datenbank identifizierte ein weiteres EST (Zugangsnummer AA255590), das ebenfalls einen Teil der ANG-7-cDNA kodierte. Die DNA-Sequenzanalyse ergab, dass die Nukleotidsequenz von EST AA255590 mit einem Teil der Sequenz von EST AA773234 überlappt. Da EST AA773234 nicht einfach zur Verfügung stand, wurde die EST AA255590 Nukleinsäure als Sonde in den darauffolgenden Experimenten verwendet.
  • Beispiel 2:
  • Um einen Gesamtlängen-cDNA-Klon zu erhalten, kodierend Ang-7, wurde EST AA255590 als Sonde für eine menschliche cDNA-Bibliothek verwendet. Kurz gefasst ist EST AA255590 in dem Vektor pT7T3D-Pac (Pharmacia, Peapack, New Jersey) zwischen den Not I- und Eco RI-Restriktionsendonukleasestellen lokalisiert. Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease EcoRI linearisiert. Eine Antisinn [32P]-radioaktiv markierte RNA-Sonde wurde unter Verwendung eines Strip-EZ T3-Kits (Ambion, Austin, Texas) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Eine menschliche Universal-cDNA-Bibliothek (HUCL) wurde durch Hybridisieren von HUCL-Primärmembranen (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) mit der radioaktiv markierten RNA-Sonde einem Screening unterzogen. Die Hybridisierung und das Waschen wurden, wie vom Hersteller empfohlen, durchgeführt. (Siehe Strip-EZ Kit Manual). Nach dem Waschen wurde die Membran mit einem Phosphorimager Screen belichtet, auf einem Fuji Bas-1500 Scanner gescannt und die Intensität der radioaktiven Signale wurde mit der TINA 2,0 Software (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) bewertet. Die Analyse des Hybridisierungsprofils ergab ein Signal an Position L04. Die korrespondierende sekundäre Array-Membran wurde unter denselben Bedingungen hybridisiert. Ein Hybridisierungssignal wurde auf der sekundären Array-Membran an Position G19 nachgewiesen. Der individuelle Klon L04G19 wurde vom Verkäufer zur Verfügung gestellt. Die Analyse des L04G19-Klons ergab, dass er ein Insert mit ungefähr 2,2 Kilobasen (kb) enthielt. Eine DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass dieser cDNA-Klon die Gesamtlängen kodierende Sequenz der ANG-7-cDNA enthielt.
  • Beispiel 3:
  • Eine DNA-Sequenzanalyse der L04G19-cDNA ergab, dass die cDNA 2.173 Basenpaare (bp) lang ist, was einen kurzen Poly-A-Schwanz beinhaltet. Die ANG-7-cDNA-Sequenz ist in 1 dargestellt (SEQ ID NO: 1). Die cDNA weist einen offenen Leserahmen mit 1.432 bp auf. Der offene Leserahmen kodiert ein Polypeptid mit 493 Aminosäureresten (SEQ ID NO: 2, 2). Eine Ähnlichkeitsausrichtung der Aminosäuresequenz von Ang-7 mit den Sequenzen von menschlichem Angiopoietin-1 (SEQ ID NO: 3), menschlichem Angiopoietin-2 (SED ID NO: 4), menschlichem Angiopoietin-3 (SEQ ID NO: 5) und menschlichem Angiopoietin-4 (SEQ ID NO: 6) wurde unter Verwendung der MEGALIGNTM Expert Sequence Analysis Software in dem LASERGENETM Software Package (DNASTAR, Madison, Wisconsin) durchgeführt. Unter Bezugnahme auf 3 enthalten die N-terminalen und C-terminalen Bereiche des Ang-7-Polypeptids charakteristische aufgewundene Spulen (coiled-coil) und Fibrinogen-ähnliche Domänen, die auch bei anderen Angiopoietinen angetroffen werden. Der Gesamtähnlichkeitsindex zwischen dem Ang-7-Polypeptid und den Ang-1- und Ang-2-Polypeptiden beträgt 23,9% bzw. 23,5%. Insbesondere sind die meisten der Aminosäurereste, die zwischen den bekannten Angiopoietinen konserviert sind, ebenfalls in Ang-7 anzutreffen (siehe 3). Diese Aminosäuresequenzkonservierung bestätigt, dass der L04G19-cDNA-Klon ein Mitglied der Antiopoietinfamilie kodiert.
  • Beispiel 4:
  • Das Gewebe-Expressionsprofil des ANG-7-Gens wurde überprüft. Kurz gefasst wurde das Plasmid, kodierend EST AA255590 mit der Restriktionsendonuklease EcoRI linearisiert. Eine Antisinn-[32P]-radioaktiv markierte RNA-Sonde wurde unter Verwendung eines Strip-EZ T3-Kits (Ambion, Austin, Texas, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Ein menschlicher multipler Gewebeextraktionsarray (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Kalifornien, USA) wurde mit der radioaktiv markierten RNA-Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung und das Waschen wurden wie in dem Strip-EZ-Kit Manual empfohlen, durchgeführt. Nach dem Waschen wurde die Membran einem Phosphorimagerscreen ausgesetzt, auf einem Fuji Bas-1500-Scanner gescannt und die Intensität der radioaktiven Signale wurde mit der TINA 2.0 Software (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) bewertet. Das resultierende Histogramm ist in 4 dargestellt und demonstriert, dass die ANG-7-RNA stark in Herzgeweben exprimiert wird (linkes und rechtes Atrium, linker und rechter Ventrikel), im Uterus, der Brustdrüse und den Corpus callosum-Geweben. Die Expression der ANG-7-RNA in diesen Geweben, die stark vaskularisiert sind, zeigt an, dass das Ang-7-Polypeptid, wie das Ang-1- und -2-Polypeptid eine Rolle in der Angionese spielen könnte.
  • Beispiel 5:
  • Um zu überprüfen, ob die ANG-7-cDNA in das Ang-7-Polypeptid translatiert wird, und das Molekulargewicht des Ang-7-Polypeptids zu bestimmen, wurde die ANG-7-cDNA durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert. Für die PCR-Amplifikation wurde ein 5'-Primer (5' GCGAATTCACCATGAGGCCACTGTGCCGT 3' (SEQ ID NO: 7)), der komplementär zum 5'-Ende der ANG-7-cDNA ist, in Kombination mit einem 3'-Primer (5' GGAAGCTTATGGAAGGTGTTGGGGTTCGG 3' (SEQ ID NO: 8)) verwendet, der komplementär zum 3'-Ende der ANG-7-cDNA ist. Um die Translationseffizienz zu erhöhen, wurde auch eine Kozak-Translationsinitiations-Konsensussequenz in den 5'-Primer eingeschlossen. Um die darauffolgende Klonierung des PCR-Fragments zu erleichtern, wurden Restriktionserkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII in die 5'- bzw. 3'-Primer eingeführt. Die amplifizierte cDNA wurde in die EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen des Säugerexpressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(–) (Invitrogen, Groningen, Niederlande) zur Erzeugung von pcDNA3.1/ang7/mychis kloniert.
  • ANG-7-RNA-Transkripte wurden aus dem T7-Promotor von pcDNA3.1/ang7/mychis gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die in vitro-Translation wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytenlysats gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega, Madison, Wisconsin, USA) durchgeführt. Die resultierenden Proteine, die durch die in vitro-Translation erzeugt wurden, wurden unter Verwendung von [35S]-Methionin markiert. Die markierten Proteine wurden durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat-12% Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Autoradiografie sichtbar gemacht. 5 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Spezifisch zeigt Spur 1: Rainbow [14C]-methylierte Proteinmolekulargewichtsmarker (Amersham, Little Chalfont Buckingshamshire, England), der die folgenden Proteine beinhaltete: Ovalbumin (46 kDa), Carboanhydrase (30 kDa), Trypsininhibitor (21,5 kDa), Lysozym (14,3 kDa) und Aprotinin (6,5 kDa). Spur 2 enthielt die in vitro-Translationsprodukte der ANG-7-RNA unter Verwendung des T7-Promotors des Säuger-Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(–) (Invitrogen, Groningen, Niederlande). Spur 3 enthielt die in vitro-Translationsprodukte unter Verwendung des SP6-Promotors des Säuger-Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(–) (negative Kontrolle). Spur 4 enthielt eine positive Kontrolle des in vitro-Translationssystems (Promega, Madison, USA).
  • Eine Hauptbande mit ~60 Kilodalton wurde nachgewiesen. Die beobachtete Molekularmasse der Hauptbande war etwas größer als die berechnete Molekularmasse des rekombinanten Ang-7-Polypeptids (57,1 kDa). Dieser Unterschied kann durch Glykosylierung etlicher potenzieller Glykosylierungsstellen im Ang-7-Polypeptid erklärt werden.
  • Beispiel 6:
  • Um zu bestimmen, ob die ANG-7-cDNA rekombinant in vivo in eukaryontischen Zellen exprimiert werden kann, wurde die ANG-7-cDNA in drei eukaryontische Expressionsvektoren kloniert und darauffolgend in Gewebekulturzellen transfiziert.
  • Die ANG-7-cDNA wurde in den Expressionsvektor pcDNA3.1/Myc-His(–) (Invitrogen, Katalog Nr. V85520), wie oben beschrieben, kloniert. Die ANG-7-cDNA wurde auch in pIRES (Clontech, Kalalog Nr. 6060-1) und pZeo (Invitrogen, Katalog Nr. V850-01) kloniert. Um den Nachweis und die Reinigung zu erleichtern, wurde ein Polyhistidin-tag in den C-terminalen kodierenden Bereich von jeder Expressionseinheit eingeschlossen.
  • Die Expressionskonstrukte wurden in chinesische Hamster-Ovar (CHO)-Zellen unter Verwendung des DOSPER-liposomalen Transfektionsreagenzes (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1781995) transfiziert. Kurz gefasst wurden 0,5 × 106 CHO-Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in Basalmedium (DMEM, Gibco/BRL, Katalog Nr. 41965-039), 2 mM L-Glutamin (Gibco/BRL, Katalog Nr. 25030-024), Penicillin/Streptomycin (1500 IU/ml) (Gibco/BRL, Katalog Nr. 15140-114) und 10%igem fötalem Rinderserum (FBS, Sigma, Katalog Nr. F2442) ausgesät. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurde das Medium verworfen und 500 μl Basalmedium (ohne FBS) wurde mit 5 μg DNA vermischt und 25 μl DOSPER wurden jeder Vertiefung zugefügt. Die Platten wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden zusätzliche 520 μl pro Vertiefung des Basalmediums (ohne FBS) zugefügt. Die Zellen wurden für zusätzliche 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden zusätzliche 3 ml pro Vertiefung des Basalmediums zugefügt. Am nächsten Tag wurde das Medium verworfen und 3 ml pro Vertiefung frisches Basalmedium wurde zugefügt. Die Zellen wurden für zusätzliche 2 Tage inkubiert, geerntet und dann wurde die zytoplasmatische Expression des Ang-7-Polypeptids in einem Western Blot unter Verwendung von Tetra-His-Antikörpern (Qiagen, Katalog Nr. 34670) analysiert. Der Western Blot wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt und enthielt drei Spuren. Spur 1 enthielt die Proteinmolekulargewichtsmarker; Spur 2 enthielt Medien von CHO-Zellen (negative Kontrolle) und Spur 3 enthielt die transient transfizierten CHO-Zellen, die das Ang-7-Polypeptid exprimierten. Die Western Blot-Analyse ist in 6 dargestellt, wobei die Ang-7-Polypeptidbande durch einen Pfeil markiert ist. Eine Bande mit ungefähr 57 kDa wurde in CHO-Zellen beobachtet, die mit der ANG-7-cDNA transfiziert waren, jedoch nicht in Zellen, die mit dem Vektor allein transfiziert waren (vergleiche Spuren 2 und 3). So wurde die ANG-7-cDNA transient in Säugerzellen exprimiert und erzeugte ein Polypeptid mit dem erwarteten Molekulargewicht.
  • Beispiel 7:
  • Um Zellklone zu erzeugen, die stabil rekombinantes Ang-7-Polypeptid exprimierten, wurden die ANG-7-cDNA-Klone in eine menschliche Zelllinie transfiziert und dann wurden stabile Transfektanden selektiert. Kurz gefasst wurde eine menschliche embryonale Nieren-Zelllinie, HEK293, mit den Expressionsvektoren pcDNA3.1/ang-7/mychis oder pIRES, enthaltend die ANG-7-cDNA, unter Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors transfiziert. Die Transfektion wurde, wie oben für Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Folgend auf die Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät und in Selektionsmedien kultiviert (Basalmedium plus 0,75 mg/ml Geneticin (Gibco/BRL, Katalog Nr. 10131-027)).
  • Die rekombinante Expression von Ang-7 wurde durch Immunofluoreszenzfärbung auf Lab-Tek-Kammerslides (Nalgene Nunc, Katalog Nr. 154534) unter Verwendung eines Tetra-His-Antikörpers (Qiagen, Katalog Nr. 34670) und eines FITC-markierten sekundären Antikörpers (Ziegen-anti-Maus IgG-FITC-Konjugat (Dianova, Katalog Nr. 115-095-062)) nachgewiesen. Ungefähr 4 × 104 Zellen wurden pro Vertiefung des Lab-Tek-Trägers ausgesät und über Nacht in einem CO2-Inkubator inkubiert. Das Medium wurde verworfen und die Zellen wurden einmal mit PBS (PBS Dulbecco's w/o Calcium/Magnesium/Natriumbicarbonat (Gibco/BRL, Katalog Nr. 14190-094)) gewaschen. Die Zellen wurden dann durch Zugabe von 200 μl pro Vertiefung eiskaltem Methanol und Inkubation bei –20°C für 10 Minuten fixiert. Nach dem Fixieren wurden die Zellen zweimal mit PBS, enthaltend 3% BSA (PBS-BSA) gewaschen und dann 30 Minuten mit PBS-BSA bei 37°C blockiert. Folgend auf das Blockieren wurden 100 μl pro Vertiefung einer 1:50-Verdünnung des Tetra-His-Antikörpers in PBS-BSA zugefügt. Die Träger wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Inkubation mit dem primären Antikörper wurden die Zellen 10× mit PBS gewaschen und dann wurden 100 μl pro Vertiefung einer 1:100-Verdünnung des sekundären Antikörpers (Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC-Konjugat) zugefügt. Die Träger wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Träger wurden 10× mit PBS gewaschen, das die Vertiefung trennende Raster wurde entfernt und dann wurden die Träger mit dem Anti-Verblassungs-Mounting-Medium ROTIRHistokit (Carl Roth, Katalog Nr. 6638.1) und einem Abdeckglas abgedeckt. Nach Härten des Mounting-Mediums (in der Regel über Nacht) wurden die Träger in einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Positive Klone wurden in Platten mit 24 Vertiefungen expandiert und das Expressionsniveau von rekombinantem Protein wurde durch Analyse von Zelllysaten auf einem Western Blot, wie oben in Beispiel 6 beschrieben, verglichen. Die Western Blot-Analyse ist in 7 dargestellt. Spur 1 des Western Blots enthielt die Protein-Molekulargewichtsmarker; Spur 2 enthielt Medien von HEK293-Zellen (Negativkontrolle) und Spur 3 enthielt stabil transfizierte HEK293-Zellen, die Ang-7-Polypeptid exprimierten. Positive Klone wurden für die weitere Analyse, wie unten beschrieben, selektiert.
  • Das Ang-7-Polypeptid hat ein Sekretionssignal am N-Terminus, was nahelegt, das es sich um ein sezerniertes Protein handelt. Um zu bestimmen, ob rekombinant exprimiertes Ang-7-Polypeptid durch Zellen sezerniert wird, wurden konditionierte Medien von einem stabil transfizierten HEK293-Zellklon, Nummer 62, im Hinblick auf die Gegenwart des Ang-7-Polypeptids hin analysiert. Kurz gefasst wurde das Protein teilweise aus den konditionierten Medien unter Verwendung eines Ni-NTA-Agaroseharzes (Qiagen, # 304050) gereinigt, wie vollständiger in Beispiel 8 beschrieben. Die eluierten Säulenfraktionen wurden auf einem Western Blot, wie oben beschrieben, analysiert. Die Western Blot-Analyse ist in 8 dargestellt. Spur 1 des Western Blots enthielt konditionierte Medien von HEK293-Zellen (Negativkontrolle) und Spur 2 enthielt konditionierte Medien des stabil transfizierten HEK293-Zellklons, der das Ang-7-Polypeptid exprimierte.
  • Unter Bezugnahme auf 8 enthielten konditionierte Medien von der stabil transfizierten HEK293-Zelllinie ein Polypeptid, das mit dem Tetra-His-Antikörper regierte, während konditionierte Medien von nicht transformierten HEK293-Zellen ein solches kreuzreagierendes Polypeptid fehlte. Dieses Experiment bestätigt, dass das Ang-7-Polypeptid in die Medien sezerniert wird.
  • Beispiel 8:
  • Um das Ang-7-Polypeptid weiter zu kennzeichnen, wurde es aus konditionierten Kulturmedien unter Verwendung von Ni-NTA-Harz (Qiagen, # 304050) gereinigt. Kurz gefasst wurden konditionierte Medien von Klon 62 nach drei Tagen gesammelt. Eine Tablette eines "kompletten" Proteinaseinhibitors ("komplette" Proteinaseinhibitor-Cocktailtabletten; Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics), Katalog Nr. 1697498) wurde zu jeweils 50 ml der gesammelten Medien zugefügt. Danach wurde Imidazol (Sigma; Katalog Nr. I-2399) zu einer Endkonzentration von 8 mM zugefügt. Die Medien wurden 10 Minuten bei 1600 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in frische Röhrchen übertragen und 500 μl einer 50%igen Aufschlämmung Ni-NTA-Agarose wurden zu je 50 ml Medium zugefügt. Die Röhrchen wurden leicht bei 4°C für 60 Minuten bewegt. Das Ni-NTA-Harz wurde durch Zentrifugation bei 1600 × g für 10 Minuten gesammelt und der Überstand verworfen. Das Harz wurde zweimal mit Waschpuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) gewaschen, indem das Harz in dem Waschpuffer suspendiert wurde, gefolgt von Zentrifugation unter denselben Bedingungen. Nach dem Waschen wurde das Harz wiederum in Waschpuffer resuspendiert und auf eine 1 ml Säule (0,5 bis 1 ml Harzbett pro Säule) übertragen. Gebundenes Ang-7-Polypeptid wurde in vier 500 μl Teilen unter Verwendung von Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol) eluiert. Die Fraktionen wurden durch Western Blot unter Verwendung des Tetra-His-Antikörpers, wie oben beschrieben, analysiert. Die Western Blot-Analyse ist in 9A dargestellt. Die Reinheit des isolierten Proteins wurde auf einem Coomassie-gefärbten SDS-Gel analysiert und diese Analyse ist in 9B dargestellt.
  • Unter Bezugnahme auf 9A ergab der Western Blot ein Doublet von Banden bei ungefähr 62–64 kDa. Der Vergleich der Western Blot-Analyse mit dem Coomassie-gefärbten SDS-Gel ergab ein korrespondierendes Doublet mit denselben Molekulargewichten (vgl. 9A und 9B). Die Gegenwart des Doublets der Ang-7-Polypeptide legt nahe, dass unterschiedlich glykosylierte Formen von Ang-7 durch stabil transfizierte Zellen sezerniert werden.
  • Beispiel 9:
  • Die Wirkung der ANG-7-Genexpression auf die Endothel-Rohrbildung wurde durch Überprüfung der HUVEC-kapillarähnlichen Organisation in Matrigel bestimmt. Adenovirus-Expressionsvektoren, die ANG-7-cDNA enthielten, wurden konstruiert, indem ANG-7-cDNA aus pcDNA3.1/ang7/mychis durch Verdau mit EcoRV und Pme1 ausgeschnitten wurde. Das resultierende Fragment wurde in die korrespondierenden Stellen des pShuttle-CMV (He et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 2509–14 (1998)) kloniert. pShuttle-CMV ist ein Adenovirus-Shuttle-Vektor, worin das Transgen (d.h. ANG-7-cDNA) sich unter der Kontrolle des Cytomegalievirus (CMV)-Promotors befindet. Dieses Konstrukt wurde auf ein Adenovirus-Grundgerüst durch Rekombination in E. coli mit dem Plasmid pADEasy (AdEZ) (He et al., supra) transferiert. Der resultierende Rekombinant wurde mit der Restriktionsendonuklease Pac1 linearisiert und dann durch Standardverfahren in HEK293-Zellen (Microbix Inc, Ontario, Kanada) transfiziert. Zehn Tage nach der Transfektion (nach dem Auftreten von viralen Plaques) wurden Vektorpartikel aus den Zellen durch multiple Runden von Einfrieren und Auftauen geerntet. Die Partikel wurden dann verwendet, um 911 Epithelzellen (Invitrogene, Leiden, Niederlande) zu infizieren. Um ausreichend Vektoren für mehrfache Experimente zu erhalten, wurden drei Runden der Passage der viralen Partikel in sukzessiv größere Kulturen von 911 Zellen durchgeführt. Dieser virale Grundstock wurde als Ad-Ang7 bezeichnet. Dieser Rohstock wurde im folgenden Experiment verwendet.
  • HUVEC wurden mit 1,25 × 104 Zellen pro Vertiefung am Tag null in eine Platte mit 24 Vertiefungen plattiert. Die Zellen wurden mit Ad-Ang7-Stocklösung infiziert oder mit dem Kontrollvektor Ad-Ez oder dem Ad-VEGF-Stock (vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor). 200 μl von jeder viralen Grundlösung wurden den Vertiefungen am Tag 0 zugefügt. Die Platten wurden in 5% CO2 bei 37°C für 5 Tage inkubiert. Am Tag 6 wurden die Zellen auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die mit Matrigel beschichtet war, in einer Dichte von 3 × 104 Zellen/Vertiefung übertragen. Die Matrigel-beschichteten Platten wurden wie folgt hergestellt: Eine Matrigel-Grundlagenmembranmatrix (Becton Dickinson) wurde auf Eis über Nacht bei 4°C getaut. Vorher abgekühlte Pipetten, Pipettenspitzen, Platten und Röhrchen wurden verwendet. Es wurden 0,3 μl/Vertiefung Matrigel (bei 4°C) verwendet, um die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen zu beschichten. Das Matrigel wurde für 2 Stunden bei 37°C polymerisiert. Folgend auf die Zugabe von HUVEC zu den Matrigel-beschichteten Vertiefungen wurden die Platten 24 Stunden mit 5% CO2 und bei 37°C inkubiert. Alle Tests wurden in Triplikatvertiefungen durchgeführt. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 1 ml.
  • Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde jede Vertiefung unter einem Mikroskop bei geringer Vergrößerung (invertiertes Mikroskop mit ×10 Kraft) überprüft. Die Platten wurden dann mit Diff-Quick gefärbt und es wurden Bilder aufgenommen, um die Kontrollen mit den unterschiedlichen Konzentrationen zu vergleichen.
  • Die folgenden Tabellen fassen das Protokoll zusammen.
  • Tabelle 1: Kein Matrigel
    Figure 00750001
  • Tabelle 2: Matrigel-Behandlung
    Figure 00750002
  • Die Ergebnisse waren wie folgt, wobei die Länge der Rohrbildung in Zentimetern angegeben ist (SEM zeigt den Standardfehler vom Mittel an).
  • Tabelle 3: Endothelrohrbildung
    Figure 00750003
  • Wie aus diesem Beispiel ablesbar ist, zeigten die Kontrollzellen und Zellen, die mit dem Vektor allein (Ad-EZ) infiziert waren, ähnliche Mengen einer Rohrbildung. Die Expression von VEGF erzeugte ebenfalls ähnliche Niveaus der Rohrbildung. Demgegenüber inhibierte die Expression des Ang-7-Polypeptids die Rohrbildung deutlich. So demonstriert dieses Experiment, dass das Ang-7-Polypeptid die Angiogenese inhibiert.
  • Beispiel 10:
  • Die Wirkung der in vivo-Expression von ANG-7 bei der B16 murinen Melanommetastase wurde überprüft. Kurz gefasst wurde die ANG-7-cDNA ex vivo mit einem Adneovirusvektor (Ad-Ang-7) zugeführt, gefolgt von Einführung der transfizierten Zellen in Mäuse. Es wurden 74 weibliche C 57 B1/6 Mäuse in einem Alter von 6 bis 8 Wochen verwendet. Für die ex vivo-Verabreichung wurden entweder Rohlysate (hergestellt wie beschrieben oben in Beispiel 9) oder gereinigte Vektoren verwendet. Die adenoviralen Vektoren wurden wie folgt gereinigt: Das Protokoll ist eine Modifikation von Fallux et al. (Human Gene Therapy 7: 215–22 (1996)). Für eine Reinigung in großem Stil wurden 911 Zellen in einer Multi-tray Cell Factory (Nuclon, Dänemark) plattiert. Wenn die Zellen eine 85%ige Konfluenz erreichten, wurden sie mit dem rekombinanten Adenovirus infiziert. Folgend auf die Infektion, ungefähr 48 bis 72 Stunden nach der Infektion, wurden die Zellen, wenn sie einen zytopathischen Effekt zeigten, geerntet und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in einem geringen Volumen Medium resuspendiert, es wurden drei Zyklen eines Einfrierens und Auftauens durchgeführt und die aufgebrochenen Zellen wurden pelletisiert, um Zellabfall zu entfernen. Die virale Partikel enthaltenden Überstände wurden auf einem diskontinuierlichen Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten geschichtet, bestehend aus 1 ml bei d = 1,4 g/ml, überschichtet mit 3 ml mit d = 1,25 g/ml. Die Gradienten wurden bei 151.000 × g 2 Stunden zentrifugiert. Die opake Bande der Virusteilchen, bei der 1,25/1,4 Dichtegrenze, wurde gesammelt und auf eine homogene CsCl-Lösung mit d = 1,3 g/ml geladen.
  • Dieser zweite Gradient wurde bei 151.000 × g für 18 Stunden zentrifugiert. Die einzelne Bande der Virusteilchen wurde gesammelt und zweimal für eine Stunde gegen 0,135 M NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM Tris pH 7,5, dialysiert. Die zweite und endgültige Dialyse wurde gegen denselben Puffer unter Zugabe von 10% Glycerin durchgeführt. Grundtiter wurden durch Plaque-Assay unter Verwendung von 293 oder 911 Zellen bestimmt.
  • B16.F10-Zellen von einer murinen Melanommetastase wurden 24 Stunden mit einem der folgenden Adenovirus-Expressionsvektoren infiziert: Ad-E1 (Kontrolle), Ad-Ang7 oder Ad-VEGF. Die infizierten Zellen wurden intravenös in die laterale Schwanzvene der Mäuse nach Abschluss der 24-stündigen Inkubationsperiode injiziert. Die Zellkonzentration von jeder Infektion betrug 2 × 105 Zellen in 0,2 ml PBS. Tag 0 war der Injektionstag in die Mäuse.
  • Die Tiere wurden zweimal pro Woche gewogen. Zwei Tiere von Gruppe 1 (Kontrolle) wurden am Tag 14 geopfert, die Lungen gesammelt und die Anzahl der Metastasen bestimmt. Folgend auf das Auszählen der Metastasen wurde der Rest der Tiere (10 in jeder Gruppe) am Tag 14 geopfert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Lungen gesammelt, gewogen und die Anzahl der Metastasen gezählt.
  • Die folgende Tabelle fasst das experimentelle Protokoll zusammen.
  • Tabelle 4:
    Figure 00780001
  • Die folgende Tabelle 5 fasst das Lungengewicht für jede Gruppe zusammen. SEM ist der Standardfehler vom Mittel.
  • Tabelle 5: Lungengewicht
    Figure 00780002
  • Die folgende Tabelle 6 fasst die Zahl der Lungenmetastasen für jede Gruppe zusammen. SEM ist der Standardfehler vom Mittel.
  • Tabelle 6: Lungenmetastasen
    Figure 00780003
  • Wie aus diesen Daten abgelesen werden kann, war das durchschnittliche Lungengewicht bei Mäusen, die Tumorzellen erhielten, die ANG-7-cDNA überexprimierten, deutlich niedriger als bei Kontrolltieren. Das durchschnittliche Lungengewicht bei AD-VEGF und Ad-Ang7-behandelten Tieren war ähnlich. Noch wichtiger lag unter Bezugnahme auf Tabelle 6 die durchschnittliche Zahl der Lungenmetastasen bei über 10mal weniger bei den Tumorzellen, die das Ang-7-Polypeptid überexprimierten im Vergleich mit Kontroll- und VEGF-behandelten Tieren. So zeigen diese Daten, dass die Überexpression der ANG-7-cDNA das Tumorzellwachstum inhibiert.
  • Es sollte verstanden werden, dass die Beispiele und Ausführungsformen, die hier beschrieben werden, nur illustrativen Zwecken dienen und das verschiedene Modifikationen oder Veränderungen im Hinblick darauf durchgeführt werden können und dem Fachmann nahe liegen werden und im Umfang der beigefügten Ansprüche enthalten sein sollen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001

Claims (15)

  1. Verwendung eines Ang-7-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung bei einem Subjekt, das einer Anti-Angiogenesetherapie bedarf, wobei die Erkrankung ein Tumor ist, wobei das Ang-7-Polypeptid ein menschliches Ang-7 mit SED ID NO: 2 ist.
  2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei das Subjekt oder der Säuger menschlich ist.
  3. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Medikament in vivo verabreicht werden soll.
  4. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medikament einen pharmazeutischen Träger umfasst.
  5. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Medikament ex vivo verabreicht werden soll.
  6. Verwendung gemäss Anspruch 5, wobei das Medikament weiterhin Zellen umfasst, die mit einer Ang-7-Nukleinsäure transfiziert sind.
  7. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Ang-7-Polypeptid rekombinant exprimiert wird.
  8. Verwendung gemäss Anspruch 7, wobei das Ang-7-Polypeptid rekombinant exprimiert wird durch Kultivieren einer Zelle, enthaltend eine Ang-7-Nukleinsäure, unter Bedingungen, die zu einer Expression des Polypeptids führen, und Gewinnen des Ang-7-Polypeptids aus der Zellkultur.
  9. Verwendung gemäss Anspruch 7 oder 8, wobei das Ang-7-Polypeptid in Säugerzellen, Hefezellen, bakteriellen Zellen oder Insektenzellen exprimiert wird.
  10. Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das Ang-7-Polypeptid in E. coli exprimiert wird.
  11. Verwendung gemäss Anspruch 9, wobei das Ang-7-Polypeptid in Säugerzellen exprimiert wird.
  12. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Ang-7-Nukleinsäure operabel an einen Promotor in einem Expressionsvektor gebunden ist.
  13. Verwendung gemäss Anspruch 12, wobei der Expressionsvektor ein adenoviraler Vektor, ein retroviraler Vektor oder ein lentiviraler Vektor ist.
  14. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Ang-7-Nukleinsäure die Sequenz von menschlichem Ang-7 (SEQ ID NO: 1) aufweist.
  15. Verwendung eines Ang-7-Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung des Tumorzellwachstums, wobei das Ang-7-Polypeptid menschliches Ang-7 mit SEQ ID NO: 2 ist.
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