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1. EINLEITUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neuen humanen Polynucleotiden, welche Proteine
codieren, die Sequenzähnlichkeit
mit Proteasenvon Säugern
aufweisen. Die Erfindung umfasst die beschriebenen Polynucleotide,
die Expressionssysteme der Wirtszellen, die codierten Proteine,
Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide, die Antikörper für die codierten
Proteine und Peptide und gentechnisch behandelte nicht humane Tiere,
denen die offenbarten Sequenzen fehlen oder die sie überexprimieren,
Antagonisten und Agonisten der Proteine sowie andere Verbindungen,
welche die Expression oder Aktivität der von den offenbarten Polynucleotide
codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose, das Screening
von Arzneimitteln, die Überwachung
von klinischen Tests, die Behandlung von Krankheiten und Störungen sowie
für kosmetische
oder Neutriceutical-Anwendungen eingesetzt werden können.
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2. HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Proteasen
spalten Proteinsubstrate als Teils des Abbaus, der Reifung und der
sekretorischen Stoffwechselwege im Körper. Proteasen sind u.a. mit
der Steuerung des Wachstums, Diabetes, Fettsucht, Unfruchtbarkeit,
der Modulation des Zellvorgangs und mit Infektionskrankheiten in
Zusammenhang gebracht worden. Proteasen sind im Stand der Technik
bekannt, so beschreiben z.B. Bor Luen Trang et al., 1999 FEBS letters,
445 (26): 223–225
die ADAMTS-Familie der Proteasen, in der WO 01 59133 wird ein mit
Protein-1 (Larcap-1) als einer vermeintlichen Protease assoziierter
Kehlkopfkrebs beschrieben und in der WO 01 83782 eine Anzahl von
vermeintlichen menschlichen Proteasen.
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3. ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neue menschliche Proteine codierenden Nucleotiden
sowie die entsprechenden Aminosäuresequenzen
dieser Proteine. Die hier zum ersten Mal beschriebenen neuen humanen
Proteine (NHPs) teilen eine strukturelle Ähnlichkeit mit tierischen Proteasen
und insbesondere Zink-Metalloproteasen.
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Die
hier beschriebenen neuen humanen Nucleinsäuresequenzen (cDNA) codieren
Proteine/offene Leseraster (ORFs) von einer Länge von 451, 297, 486,1222,
1219, 1216, 1213, 1235, 1232, 1252 und 1249 Aminosäuren (siehe
die SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 bzw. 22).
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Die
Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen
NHPs, einschließlich
kleiner Moleküle.
großer
Moleküle,
Mutanten-NHPs oder Abschnitte derselben, die mit einem nativen NHP
konkurrieren, Peptide und Antikörper
sowie Nucleotidsequenzen, die dazu verwendet werden können, die
Expression der beschriebenen NHPs zu inhibieren (z.B. Antisense-
und Ribozym-Moleküle, sowie
offene Leseraster oder regulatorische Konstrukte zum Genaustausch)
oder die Expression der beschriebenen NHP-Sequenzen zu erhöhen (z.B.
Expressionskonstrukte, welche die beschriebene Sequenz unter die
Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen) sowie nicht humane
transgene Tiere, welche NHP-Transgene exprimieren oder "Knock-Outs" (die bedingt sein
können),
die kein funktionales NHP exprimieren. KO-Mäuse lassen sich auf verschiedenen
Wegen gewinnen, von denen einer den Einsatz von embryonalen Stammzelllinien
("ES-Zellen") der Maus betrifft,
welche in einem Mäusehomologen
von mindestens einem der beschriebenen NHPs Gene-trap-Mutationen
enthalten. Werden die in den SEQ ID NOs: 1–23 beschriebenen einzigartigen
NHP-Sequenzen einem "Knock-out" unterzogen, liefern
sie sowohl ein Verfahren zur Identifizierung einer phänotypischen
Expression des besonderen Gens als auch ein Verfahren zur Bestimmung
der Funktion von zuvor unbekannten Genen. Darüber hinaus bilden nicht humane
Tiere, in welchen die in den SEQ ID NOs: 1–23 beschriebenen einzigartigen
NHP-Sequenzen einem "Knock-out" unterzogen worden
waren, eine einzigartige Quelle, in welcher Antikörper gegen.
homologe und orthologe Protei ne gebildet werden, die zuvor von dem Immunsystem
nicht als "körpereigen" angesehen worden
wären und
daher keine signifikanten Antikörper-Reaktionen
ausgelöst
hätten.
ES-Zellen sind in Mäusehomologen
der beschriebenen NHPs erzeugt worden.
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Zusätzlich sind
die in den SEQ ID NOs 1–23
beschriebenen einzigartigen NHP-Sequenzen
zur Identifitierung einer Protein codierenden Sequenz und zu Kartierung
eines einzigartigen Gens auf einem besonderen Chromosom von Nutzen.
Diese Sequenzen identifizieren aktuelle, biochemisch relevante Exon-Spleiß-Verknüfungen im
Gegensatz zu denjenigen, die bioinformatorisch aus der Genom-Sequenz
allein vorausgesagt worden wären.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten
der NHP-Expression
und/oder der Aktivität
des NHP-Produkts fungieren, welche gereinigte Präparationen der beschriebenen
NHPs und/oder NHP-Produkte verwenden, oder Zellen welche sie exprimieren.
Solche Verbindungen können
als Therapeutika für
die jeweilige Behandlung eines Symtoms aus der weiten Bandbreite
von Symptomen, die mit biologischen Erkrankungen oder Unausgewogenheiten
einhergehen eingesetzt werden.
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4. BESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
UND DER FIGUREN
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Das
Sequenzprotokoll zeigt die Sequenzen von einigen NHP-ORFs, welche
die beschriebenen NHP-Aminosäuresequenzen
codieren. SEQ ID NO gibt ein NHP-ORF
sowie flankierende Sequenzen wieder.
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5. GENAUE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
hier zum ersten Mal beschriebenen NHP-Sequenzen sind neue Proteine,
die u.a. in menschlichen Zelllinien sowie im menschlichen Rückenmark,
den Lymph knoten, dem Knochenmark, der Luftröhre, der Brustdrüse, den
Skelettmuskeln, dem Herzbeutel, dem Speicherfett, der Speiseröhre, der
Harnblase, der fötalen Niere
und den fötalen
Lungenzellen exprimiert werden (SEQ ID NOs 1–23).
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Die
beschriebenen Sequenzen wurden aus cDNA-Klonen, genomischen Sequenzen
und cDNAs gewonnen, die von mRNAs aus menschlichen Lymphknoten,
der Schilddrüse,
fötalem
Hirn, Knochenmark, der Luftröhre,
der Niere und der Milchdrüse
stammen. (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD, and Clontech, Palo Alto.
CA). Die vorliegende Erfindung umfasst die im Sequenzprotokoll angegebenen
Nucleotide, solche Nucleotide exprimierende Wirtszellen, die Expressionsprodukte
solcher Nucleotide und: (a) Nucleotide, welche die Säugerhomologe
der beschriebenen Gene einschließlich der speziell beschriebenen
NHPs und die NHP-Produkte
codieren; (b) Nucleotide, die einen oder mehr den funktionellen
Domänen
entsprechende Abschnitte eines NHP codieren, sowie die durch solche
Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
der neuen Abschnitte jeder aktiven Domäne(n); (c) isolierte Nucleotide,
die gentechnisch veränderte
oder natürlich
vorkommende Mutantenversionen der beschriebenen NHPs codieren, in welcher
alle oder ein Teil von zumindest einer Domäne zerstört oder verändert ist sowie die durch solche
Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
der löslichen Proteine
und Peptide, in welchen die gesamte oder ein Teil der Signalsequenz
zerstört
ist; (d) Nucleotide, die chimäre
Fusionsproteine codieren, welche den gesamten oder einen Teil eines
codierenden Abschnitts eines NHP oder eine seiner Domänen enthalten
(z.B. eine Rezeptor- oder Liganden-Bindungsdomäne, akzessorische Protein/Selbstassoziierungs-Domäne, usw.),
welche an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusioniert sind oder
(e) therapeutische oder diagnostische Derivate der beschriebenen
Polynucleotide wie z.B. Oligonucleotide, Antisense-Polynucleotide,
Ribozyme, dsRNA oder gentherapeutische Konstrukte mit einer Sequenz, die
zum ersten Mal im Sequenzprotokoll offenbart wird.
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Wie
oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung: (a) die im
Sequenzprotokoll angegebenen humanen DNS-Sequenzen (und diese enthaltende
Vektoren) und befasst sich zusätzlich
mit jeder Nucleotidsequenz, welche ein benachbartes offenes Leseraster
(ORF) oder eine zum ersten Mal im Sequenzprotokoll beschriebene
benachbarte Exon-Spleißverbindung
codiert, das an eine im Sequenzprotokoll angegebene komplementäre DNA-Sequenz
unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung
an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4,
75 Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 68°C
(Ausubel F. M. et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Band X, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New
York auf Seite 2.10.3), und ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert.
Zusätzlich
befasst sich die Erfindung mit jeder Nucleotidsequenz, die an die komplementäre DNA-Sequenz
hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäuresequenz
unter mäßig stringenten
Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel
et al., 1989, supra), codiert und exprimiert und immer noch ein
ein funktionell äquivalentes
NHP-Produkt codiert. Funktionelle Äquivalente
eines NHP umfassen in anderen Arten enthaltene natürlich vorkommende
NHPs sowie mutante NHPs, unabhängig
davon, ob sie natürlich
vorkommen oder gentechnisch verändert
wurden (durch zielgerichtete Mutagenese, Gen-shuffling, gerichtete
Evolution, wie z.B. im US-Patent
5,837,458 beschrieben). Die Erfindung umfasst auch degenerierte
Nucleinsäurevarianten
der offenbarten NHP-Polynucleotidsequenzen.
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Zusätzlich befasst
sich die Erfindung mit ein NHP-ORF codierenden Polynucleotiden oder
dessen funktionellen Äquivalenten,
die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche eine etwa
99-, 95-, 90- oder 85-prozentige Ähnlichkeit oder Identität mit entsprechenden
Abschnitten der Nucleotidsequenzen des Sequenzprotokolls aufweisen
(ermittelt mit der BLAST-Sequenz-Vergleichsanalyse unter Verwendung
von z.B. dem GCG-Sequenzanalyse-Programmpaket mit standardmäßig eingestellten
Mängeln).
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Die
Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise
DNA-Moleküle, die
an die beschriebenen Nucleotidsequenzen des NHP-Gens hybridisieren
und daher komplementär
zu letzteren sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können, wie
oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein. In
Fällen,
wo die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide
("DNA-Oligos") sind, sind solche
Moleküle
im Allgemeinen ca. 16 bis ca. 100 Basen lang oder ca. 20 bis ca.
80 oder ca. 34 bis ca. 45 Basen lang oder jede Variation oder Kombination
von darin vorkommenden Größen, die
einen im Sequenzprotokoll zuerst offenbarten benachbarten Sequenzabschnitt
enthalten. Solche Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR) dazu verwendet werden, Bücherein
zu durchsuchen, Clone zu isolieren und Klonierungs- und Sequenzierungsmatrizen
herzustellen usw.
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Alternativ
können
solche NHP-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden zum Durchsuchen
von Büchereien
und zum Bewerten von Genexpressionsmustern verwendet werden (besonders
unter Verwendung eines Mikroarray- oder "Chip"-Formats mit hohem
Durchsatz). Zusätzlich
kann eine Reihe der beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen oder deren
komplementäre
Sequenzen verwendet werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen
NHP-Sequenzen wiederzugeben. Eine in mindestens einem Teil der Sequenz-SEQ
ID NOs 1–27
offenbarten Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen kann zusammen
mit einem Matrix/Substrat-Feststoffträger (Harze, Kügelchen,
Membranen, Kunststoffe, Polymere, Metall- oder metallisierte Substrate,
kristalline oder polykristalline Substrate, usw.) als eine Hybridisierungssonde
eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung sind räumliche
ansteuerbare Arrays (d.h. Genchips, Mikrotiterplatten, usw.) von
Oligonucleotiden und Polynucleotiden oder entsprechenden Oligonucleotiden
und Polynucleotiden, wobei mindestens eines der auf dem räumlichen
ansteuerbaren Array vorkommenden Biopolymere eine Oligonucleotid-
oder Polynucleotidsequenz, die zuerst in mindestens einer der Sequenzen
SEQ ID NOs 1–23
offenbart wurde oder eine von diesen codierte Aminosäuresequenz.
aufweist. Verfahren zur Anheftung von Biopolymeren a oder zur Synthese
von Biopolymeren auf Festkörpermatrizes
und die Durchführung
von Bindungsstudien darauf werden u.a. in den US-Patenten 5,700,637,
5,556,752, 5,744,305, 4,631,211, 5,445,934, 5,252,743, 4,713,326, 5,424,186,
und 4,689,405 beschrieben.
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Ansteuerbare
Assays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen lassen
sich einsetzen, um die zeit- und gewebsspezifische Expression eines
Gens zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese ansteuerbaren
Arrays enthalten genügend
lange Oligonucleotidsequenzen, um die erforderliche Spezifität zu verleihen,
liegen aber noch innerhalb der durch die Produktionstechnologie
be stimmten Grenzen. Die Länge
dieser Sonden liegt im Bereich von etwa 8 bis etwa 2000 Nucleotide.
Die Sonden bestehen vorzugsweise aus 60 Nucleotiden und mehr bevorzugt
aus 25 Nucleotiden der zuerst in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen.
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Beispielsweise
kann eine Reihe der beschriebenen Oligonucleotidsequenzen oder komplementären Sequenzen
davon in einem Chip-Format verwendet werden, um alle oder einen
Teil der beschriebenen Sequenzen zu repräsentieren. Die Oligonucleotide,
typischerweise mit einer Länge
zwischen etwa 16 bis etwa 40 (oder jeder ganzen Zahl im angegebenen
Bereich) Oligonucleotiden können
teilweise miteinander überlappen und/oder
die Sequenz kann durch Oligonucleotide repräsentiert sein, die nicht überlappen.
Dementsprechend sollen die beschriebenen Polynucleotidsequenzen
typischerweise mindestens zwei oder drei unterschiedliche Oligonucleotidsequenzen
mit einer Länge
von mindestens ca. 8 Nucleotiden umfassen, von denen jede zuerst in
dem beschriebenen Sequenzprotokoll offenbart wurde. Derartige Oligonucleotidsequenzen
können
an jedem in einer Sequenz im Sequenzprotokoll vorkommenden Nucleotid
beginnen und entweder in Sense-Richtung
(5' zu 3') gegenüber der
beschriebenen Sequenz oder in Antisense-Richtung fortschreiten.
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Mit
auf Mikroarrays basierender Analyse lässt sich eine weite Bandbreite
genetischer Aktivität
aufklären,
welche zu einem neuen Verständnis
der Genfunktionen führt
und eine neue und unerwartete Einsicht in die Transkriptionsprozesse
und biologischen Mechanismen schafft. Der Einsatz von ansteuerbaren
Arrays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen liefert
eine genaue Information über
Transkriptionsänderungen,
die bei einem spezifischen Stoffwechselweg eine Rolle spielt und
möglicherweise
zur Identifizierung neur Komponenten oder Genfunktionen führt, die
sich selbst als neue Phänotypen
erweisen.
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Sonden,
die aus den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen bestehen
lassen sich auch bei der Identifizierung, Selektion und Validität von neuen
molekularen Zielen für
die Entdeckung von Arzneimitteln verwenden. Mit dem Einsatz dieser
einzigartigen Sequenzen kann man Ziele von Arzneimitteln und von
Arzneimitteln abhängige
Veränderungen
bei der Genexpression di rekt feststellen, die über Stoffwechselwege moduliert
werden, welche sich von dem für
das Arzneimittel beabsichtigten Ziel unterscheiden. Diese einzigartigen
Sequenzen kommen daher bei der Abgrenzung und Überwachung von sowohl der Arzneimittelwirkung
als auch der Toxizität
zum Einsatz.
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Als
Beispiel für
einen Einsatz können
die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen in
Mikroarrays oder anderen Assay-Formaten zum Screening von Sammlungen
von Genmaterial aus Patienten mit besonderem medizinischem Befinden
verwendet werden. Diese Untersuchungen können auch unter Verwendung
der zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten Sequenzen in
silico durchgeführt werden
und indem zuvor gesammelte genetische Datenbanken und die offenbarten
Sequenzen unter Einsatz von dem Fachmann bekannter Computer-Software
verglichen werden.
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Somit
lassen sich die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–23 offenbarten
Sequenzen einsetzen, um mit einer besonderen Krankheit einhergehende
Mutationen zu identifizieren und auch als ein diagnostischer oder
prognostischer Assay.
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Obwohl
die hier beschriebenen Sequenzen speziell unter Verwendung der Nucleotidsequenz
beschrieben wurden, sollte beachtet werden, dass jede der Sequenzen
einzeln beschrieben werden kann, indem jedes aus breiten Sperktrum
der verschiedenen zusätzlichen
strukturellen Attribute oder Kombinationen derselben herangezogen
wird. Beispielsweise lässt
sich eine gegebene Sequenz durch die Nettozusammensetzung der in
einem gegebenen Abschnitt der Sequenz vorkommenden Nucleotide zusammen
mit dem Vorkommen einer oder mehrerer zum ersten Mal in den SEQ
ID NOs 1–23
offenbarter spezifischer Oligonucleotidsequenzen beschreiben. Alternativ
können
eine Reastriktionskarte, welche die relativen Positionen der Stellen für einen
Verdau mit Restriktionsendonucleasen genau angibt, oder verschiedene
Palindrome oder andere spezifische Oligonucleotidsequenzen verwendet
werden, um eine gegebene Sequenz strukturell zu beschreiben. Solche
Restriktionskarten, welche typischerweise von in breitem Umfang
zur Verfügung
stehenden Computerprogramman (z.B. das GCG-Sequenzanalysepaket der Universität von Wisconsin
SEQUENCHER 3.0, Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, usw.) erstellt
werden, können
wahlweise zusammen mit einer oder mehreren diskreten in der Sequenz
vorkommenden Nucleotidsequenzen verwendet werden, die sich durch
die relative Position der Sequenz relativ zu einer oder mehreren
zusätzlichen
Sequenzen oder einem oder mehreren in der offenbarten Sequenz vorkommenden
Restriktionsstellen beschreiben lassen.
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Für Oligonucleotidsonden
kommen hoch stringente Bedingungen in Betracht, z.B. Waschen in
6 × SSC/0,06%
Natriunpyrophosphat bei 37°C
(für Oligos
von 14 Basen), bei 48°C
(für Oligos
von 17 Basen), bei 55°C
(für Oligos
von 20 Basen) und bei 60°C
(für Oligos
von 23 Basen). Diese Nucleinsäuremoleküle können Antisensemoleküle der NHP-Sequenz
codieren oder als solche fungieren, welche z.B. für eine Regulierung
der NHP-Sequenz brauchbar sind (für und/oder als Antisense-Primer
in Amplifizierungsreaktionen von Nucleinsäuresequenzen des NHP). Bezüglich der
Regulierung der NHP-Sequenz können
solche Techniken eingesetzt werden, um biologische Funktionen zu
regulieren. Ferner können
solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder als Tripelhelixsequenzen
verwendet werden, welche ebenfalls für die Regulierung der NHP-Sequenz
brauchbar sind.
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Inhibitorische
Antisense- oder Doppelstrang-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten
Basenrest aufweisen, der ausgewählt
ist, jedoch nicht ausschließlich,
aus der Gruppe 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine,
5-Carboxymethylamino-methyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-isopentenyladenin, 1-Metnylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin,
2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin,
S-Methycytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil,
beta-D-Mannosylqueosin,
5'-ethoxycarboxymethyluracil.
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5-Methoxyuracil,
2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil,
2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
Uracil-5-oxyessigsäure
(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, .(acp3)w und 2,6-Diamino-purin.
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Die
Antisense-Oligonucleotide können
auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest enthalten, ausgewählt, aber
nicht ausschließlich,
aus der Gruppe Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
umfassen die Antisense-Oligonucleotide ein Rückgrat mit mindestens einem
modifizierten Phosphat, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat,
einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat,
einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal
oder einem Analogen davon.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres
Oligonucleotid bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride,
in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
6625–6641).
Das Oligonucleotid ist ein 2'-0-Methylribonucleotid
(Inoue et al., 15: 6131–6148)
oder ein chimäres
RNA-DNA-Analoges
(Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330). Alternativ kann doppelsträngige RNA
verwendet werden, um die Expression und Funktion eines Ziel-NHP zu unterbrechen.
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Die
Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach im Stand der Technik
bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Verwendung
eines automatischen DNA-Synthesizers (wie er im Handel von Biosearch,
Applied Biosystems usw. bezogen werden kann). Beispielsweise können Phosphorthioat-Oligonucleotide
nach dem Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids res. 16:
3209) synthetisiert werden und Methylphosphonat-Oligonucleotide
lassen sich unter Verwendung von Polymerträgern des Typs Controlled Pore Glass
herstellen (Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448–7451),
usw.
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Niedrig
stringente Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und variieren
in voraussagbarer Weise je nach den speziellen Organismen, von welchen
die Bücherei
und die markierten Sequenzen stammen. Für eine Anleitung zur Schaffung
solcher Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (and periodic Updates thereof), Cold
Springs Harbor Press, N.Y.; sowie Ausubel et al., 1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und
Wiley Interscience, N.Y.
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Alternativ
können
geeignete markierte NHP-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um eine
humane Genombibliothek unter Einsatz von ausreichend stringenten
Bedingungen oder mittels PCR zu durchsuchen. Die Identifizierung
und Charakterisierung von menschlichen Genomklonen ist zur Identifizierung
von Polymorphismus hilfreich (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von
Nucleotid-Repeats,
Mikrosatelliten-Allelen, Einzelnucleotid-Polymorphismus oder codierender
Einzelnucleotid-Polymorphismus), zur Ermittlung der Genomstruktur
eines gegebenen Locus/Allels und zur Planung diagnostischer Tests.
Beispielsweise lassen sich Sequenzen, die von Abschnitten abstammen,
welche den Intron/Exon-Grenzen
des Humangens benachbart sind, zur Entwicklung von Primern für die Verwendung
in Amplifikationsassays einsetzen, um in den Exons, Introns, Spleißorten (z.B.
an der Spleißakzeptor-
und/oder Donorstelle) Mutationen aufzuspüren usw., welche in der Diagnose
und Pharmakogenetik zum Einsatz kommen können.
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Ferner
lässt sich
ein NHP-Homologes aus Nucleinsäuren
von einem in Frage kommenden Organismus isolieren, indem eine PCR
durchgeführt
wird, in welcher zwei degenerierte oder "Wobble" Oligonucleotidprimer-Pools verwendet
werden, die auf Grundlage der Aminosäuresequenzen in den hier offenbarten NHP-Produkten entworfen
wurden. Die Matrize für
die Reaktion kann Gesamt-RNA, mRNA und/oder cDNA sein, welche durch
reverse Transcription von mRNA erhalten wurde, welche z.B. aus humanen
oder nicht humanen Zelllinien oder von Gewebe erhalten wurde, von
dem angenommen wird, dass es ein Allel einer NHP-Sequenz exprimiert. Das PCR-Produkt
kann subcloniert und sequenziert werden, um sicher zu gehen, dass
die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten NHP-Gens darstellen.
Das PCR-Fragment kann sodann verwendet werden, um mit verschiedenen
Methoden einen cDNA-Klon mit voller Länge zu isolieren. Beispielsweise
kann das amplifizierte Fragment markiert und dazu verwendet werden,
eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen.
Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwen det werden, über das
Durchsuchen einer Genombibliothek genomische Klone zu isolieren.
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Die
PCR-Technologie lässt
sich auch zur Isolierung einer cDNA-Sequenz in vollständiger Länge einsetzen.
Beispielsweise kann RNA aus einer geeigneten Quelle aus Zellen oder
Gewebe nach Standardverfahren isoliert werden (d.h. aus einer Quelle
wie z.B. Hodengewebe, von der man weiß oder annimmt, dass sie eine
NHP-Sequenz exprimiert). An der RNA wird eine Reaktion mit reverser
Transkriptase (RT) durchgeführt, wobei
ein Oligonucleotid-Primer verwendet wird, der für die meisten 5'-Enden des amplifizierten
Fragments für das
Priming der Synthese des ersten Strangs spezifisch ist. Das erhaltene
RNA/DNA-Hybrid kann dann "zurechtgestutzt" werden, indem man
eine Standardreaktion mit terminaler Transferase verwendet, das
Hybrid kann mit RNase verdaut werden und die Synthese des zweiten
Strangs kann dann mit einem komplementären Primer geprimt werden.
Somit lassen sich cDNA-Sequenzen stromauf zum amplifizierten Fragment
isolieren. Für
einen Überblick über die
Klonierungsstrategien, die eingesetzt werden können, siehe Sambrook et al., 1989,
supra.
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Durch
Einsatz der PCR kann z.B. eine eine mutierte NHP-Sequenz codierende
cDNA isoliert werden. In diesem Falle kann der erste cDNA-Strang
synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an eine mRNA
anhybridisiert wird, welche aus einem Gewebe isoliert wurde, von
dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es in einem Individuum
exprimiert wird, welches vermeintlich ein mutiertes NHP-Allel trägt, und
indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird.
Der zweite Strang der cDNA wird sodann synthetisiert, indem ein
Oligonucleotid eingesetzt wird, welches spezifisch an das 5'-Ende des normalen
Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt
sodann mit der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten Vektor
cloniert und mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind einer
DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des
mutierten NHP-Allels mit der eines entsprechenden normalen NHP-Allels
kann (können)
die Mutation(en) ermittelt werden, die für den Verlust oder die Änderung der
Funktion des mutierten NHP-Genprodukts
verantwortlich sind.
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Alternativ
lässt sich
eine Genombibliothek aufbauen, indem eine DNA eingesetzt wird, die
aus einem Individuum gewonnen wurde, von dem angenommen wird oder
bekannt ist, dass es ein mutiertes NHP-Allel trägt (z.B. eine Person, die einen
auf NHP zurückzuführenden
Phänotyp
aufweist, wie z.B. Fettsucht, hoher Blutdruck, Arthritis, Bindgewebskrankheiten,
Unfruchtbarkeit usw.), oder es lässt
sich eine cDNA-Bibliothek aufbauen, indem RNA aus einem Gewebe eingestzt
wird, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es ein mutiertes
NHP-Allel exprimiert. Eine normale NHP-Sequenz oder ein geeignetes
Fragment davon kann sodann markiert werden und als Sonde zur Identifizierung
des entsprechenden mitierten NHP-Allels in solchen Büchereien
eingestzt werden. Klone mit mutierten NHP-Sequenzen können sodann
gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
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Zusätzlich kann
eine Expressionsbücherei
aufgebaut werden, indem cDNA eingesetzt wird, welche z.B. aus RNA
synthetisiert wurde, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem
bekannt ist oder angenommen wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel
exprimiert in einem Individuum, von dem angenommen wird oder bekannt
ist, dass es solch ein mutiertes Allel trägt. Auf diese Weise können aus
dem vermeintlich mutierten Gewebe gewonnene Genprodukte exprimiert
und unter Verwendung von standardisierten Antikörper-Screeningtechniken zusammen
mit, wie unten beschrieben, gegen ein normales NHP-Produkt gerichteten
Antikörpern
gescreent werden. (Zu Screeningtechniken siehe z.B: Harlow, E. und
Lane, Hrg., 1988, "Antibodies:
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
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Zusätzlich kann
das Screening erfolgen, indem markierte NHP-Fusionsproteine wie
z.B. alkalische Phosphatase-NHP oder alkalische NHP-Phosphatase-Fusionsproteine gescreent
werden. In Fällen,
wo eine Mutation der NHP zu einem Genprodukt mit veränderter
Funktion führt
(z.B. als Ergebnis einer Missense-Mutation oder einer Mutation in Folge
einer Rasterverschiebung), gehen gegen NHP gerichtete polyklonale
Antikörper
wahrscheinlich mit einem entsprechenden mutierten NHP-Sequenzprodukt
eine Kreuzreaktion ein. Klone aus Büchereien, die über ihre
Reaktion mit solchen markierten Antikörpern aufgefunden wurden können gereinigt
und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
-
Die
Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen und/oder der komplementären (d.h.
Antisense-)Sequenzen enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die jede
der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem
regulatorischen Element assoziiert sind, welches die Expression
der codierenden Sequenzen lenkt (z.B. ein Baculo-Virus, wie es im
US-Patent 5,869,336 beschrieben wird, welches hiermit als Referenz
eingeführt
wird); (c) gentechnisch bearbeitete Wirtszellen, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem regulatorischen Element
assoziiert sind, welches die Expression der codierenden Sequenzen
in der Wirtszelle lenkt und (d) gentechnisch veränderte Wirtszellen, die eine
endogene NHP-Sequenz unter der Kontrolle eines exogen eingeführten regulatorischen
Elements (d.h.. Genaktivierung) exprimieren. Unter dem hier verwendeten
Begriff regulatorische Elemente werden, jedoch nicht ausschließlich, induzierbare
und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere
dem Fachmann bekannte Elemente verstanden, welche die Expression steuern
und kontrollieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch
nicht ausschließlich,
das unmittelbar frühe
Gen des humanen Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare virale Elemente
(insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren), die frühen oder
späten
Promotoren des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System,
das TAC-System,
das TRC-System, die hauptsächlichen
Operator- und Promotorabschnitte des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte
des fd-Kapsidproteins, die Promotoren der sauren Phosphatase sowie
die Promotoren der Alpha Mating Faktoren aus Hefe.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einscjließlich Fab-Fragmente),
Antagonisten und Agonisten der NHP sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte,
welche die Expression einer NHP-Sequenz
inhibieren (Inhibitoren des Transskriptionsfaktors, Antisense- und
Ribozymmoleküle
oder eine Sequenz mit offenem Lesetraster oder Konstrukte für den Ersatz
einer regulatorischen Sequenz) oder die Expression eines NHP begünstigen
(z.B. Expressionskonstrukte, in denen die NHP codierende Sequenz
operativ an die Expression von Kontrollelementen wie z.B. Promotoren,
Promotoren/Enhancern usw. gekoppelt ist).
-
Die
NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
-Antikörper,
-Antagonisten und -Agonisten können
für den
Nachweis von mutierten NHPs oder unvollständig exprimierten NHPs für die Diagnose
von Krankheiten nützlich
sein. Die NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
Wirtszellex-pressionssysteme, Antikörper, Antagonisten, Agonisten
und gentechnisch bearbeiteten Zellen und nicht humane Tiere können zum
Screening nach Arzneimitteln verwendet werden (oder zum Screening
von kombinatorischen Bücherein
mit großem
Durchsatz), welche für
die Behandlung der symptomatischen oder phänotypischen Symptome einer
Störung
der normalen Funktion von NHP im Körper wirksam sind. Die Verwendung
von gentechnisch veränderten
Wirtszellen und/oder Tieren kann insofern einen Vorteil bieten,
als solche Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen
berücksichtigen,
die an einen endogenen Rezeptor für NHP binden, sondern auch
Verbindungen identifizieren, die NHP vermittelte Aktivitäten oder
Stoffwechselwege auslösen.
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Schließlich können die
NHP-Produkte als Therapeutika Verwendung finden. Beispielsweise
können lösliche Derivate
wie z.B. einem NHP entsprechende NHP-Peptide/Domänen, Proteinprodukte einer
Fusion mit NHP (insbesondere NHP-IG-Fusionsproteine, d.h. Fusionen eines
NHP oder einer Domäne
eines NHP an ein IgFc), NHP-Antikörper oder antiidiotypische
Antikörper
(einschließlich
Fab-Fragmente),
Antagonisten oder Agonisten (einschließlich Verbindungen, welche
in einem NHP vermittelten Stoffwechselweg modulieren oder auf stromab
gelegene Ziele einwirken) zur direkten Behandlung von Krankheiten
oder Störungen
eingesetzt werden. Beispielsweise könnte die Verabreichung einer
wirksamen Menge eines löslichen
NHP oder eines NHP-IgFc-Fusionsproteins oder eines antiidiotypischen
Antikörpers
(oder dessen Fab), der ein NHP nachahmt, dden endogenen NHP-Rezeptor
aktivieren oder wirksam antagonisieren. Nucleotid-Konstrukte, die solche
NHP-Produkte codieren können
eingesetzt werden, um Wirtszellen zur Expression solcher Produkte
in vivo gentechnisch zu behandeln; diese gentechnisch behandelten
Zellen wirken im Körper
als "Bioreaktoren", welche einen kontinuierlichen
Strom eines NHP, eines NHP-Pepetids oder eines NHP-Fusionsproteins
liefern. Nucleotidkonstrukte, die ein funktionelles NHP, mutierte
NHPs sowie Antisense- und Ribozym-Moleküle codieren können auch
in Ansätzen
einer "Gentherapie" für die Modulation
der NHP-Expression eingesetzt werden. Somit umfasst die Erfindung
auch pharmazeutische Formulierungen und die offenbarten Verfahren
zur Behandlung von biologischen Störungen.
-
Verschiedene
Aspekte der Erfindung werden nun genauer in den folgenden Unterabschnitten
beschrieben.
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5.1 DIE NHP-SEQUENZEN
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Die
cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der beschriebenen NHPs sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Die
NHP-Sequenzen wurden
aus humanen cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Sonden und/oder
Primern erhalten, die aus einer menschlichen Genomsequenz gewonnen
wurden. Eine Expressionsanalyse bewies, dass sich das beschriebene
NHP in vielen menschlichen Zellen exprimieren lässt.
-
Es
wurden verschiedene Polymorphismen identifiziert, einschließlich einem
A/G an der Nucleotidposition, die z.B. durch Position 58 der SEQ
ID NO: 7 wiedergegeben wird (welcher an der entsprechenden Aminosäure (aa)-Position
20 von z.B SEQ ID NO: 8 zu einem Thr oder Ala führen kann), einem A/C an der
Nucleotidposition 1538 (was an der aa-Position 513 zu einem Pro
oder Gln führen
kann), einem C/T in Position 1796 (was an der aa-Position 590 zu
einem Pro oder Leu führen
kann) sowie einem C/G an der Nucleotidposition 1899 (was an der
aa-Position 633
zu einem Ser oder Arg führen
kann).
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Eine
zusätzliche
Anwendung der beschriebenen neuen menschlichen Polynucleotidsequenzen
ist ihre Verwendung bei der molekularen Mutagenese/Evolution von
Proteinen, die mindestens zum Teil von den beschriebenen neuen Sequenzen
codiert werden, indem z.B. das Polynucleotid-Shuffling oder eine
verwandte Methodik eingesetzt werden. Derartige Ansätze werden
z.B. in den US-Patenten 5,830,721 und 5,837,458 beschrieben.
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Die
NHP-Gen-Produkte lassen sich auch in nicht humanen transgenen Tieren
exprimieren. Tiere jeder Spezies, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Würmer, Mäuse, Ratten,
Kaninchen, Meerschweinchen, Schweine, Micro-Pigs, Vögel, Ziegen
und nicht humane Primaten wie z.B. Paviane, Affen und Schimpansen können verwendet
werden, um NHP-transgene Tiere zu erzeugen.
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Es
kann jede im Stand der Technik bekannte Technik eingesetzt werden,
um ein NHP-Transgen in Tiere einzuführen, um die Founderlinien
der transgenen Tiere zu gewinnen. Solche Techniken sind, jedoch
nicht ausschließlich,
die Pronucleus-Mikroinjektion
(Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989, US Patent 4,873,191); der
Retrovirus. vermittelte Gentransfer in Keimbahnen (Van der Putten
et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148–6152);
das Gene-Targeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., 1989,
Cell 55: 313–321) electroporation
of embryos (Lo, 1983, Mol. Cell Biol. 3: 1803–1814) und der Sperma-vermittelte
Gentransfer (Lavitrano et 1989, Cell 57: 717–723) usw. Für einen Überblick über derartige
Techniken siehe Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol.
115: 171–229.
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Die
vorliegende Erfindung stellt sowohl nicht humane transgene Tiere
zur Verfügung,
die in allen ihren Zellen das NHP-Transgen besitzen als auch Tiere,
die das Transgen in einigen aber nicht allen ihren Zellen aufweisen,
d.h. nicht humane Mosaik-Tiere oder nicht humane transgene Tiere
mit somatischen Zellen. Das Transgen kann als einzelnes Transgen
oder in Concatamere integriert sein, z.B. Kopf-Kopf-Tandems oder Kopf-Schwanz-Tandems.
Das Transgen kann auch gemäß z.B. der
Lehre von Lasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232– 6236 selektiv
in einen besonderen Zelltyp eingeführt und aktiviert werden. Die
für eine
derartige Zelltyp-spezifische Aktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen
hängen
von dem besonderen in Frage stehenden Zelltyp ab und sind dem Fachmann
geläufig.
-
Wenn
es erwünscht
ist, dass ein NHP-Transgen in die chromosomale Stelle des endogenen NHP-Gens
integriert wird, ist das Gene-Targeting bevorzugt. Kurz gesagt,
wenn eine derartige Technik eingesetzt wird, werden Vektoren mit
einigen zu dem endogenen NHP. Gen homologen Nucleotidsequenzen zu
dem Zweck konzipiert, dass sie über
eine homologe Rekombination mit chromosomalen Sequenzen in die Nucleotidsequenz
des endogenen NHP-Gens integriert werden und dessen Funktion unterbinden
(d.h. es werden KO-Tiere geschaffen).
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Das
Transgen lässt
sich auch nach z.B. der Lehre von Gu et al., 1994, Science, 265:
103–106.
selektiv in einen besonderen Zelltyp einführen, wobei es das endogene
NHP-Gen nur in diesem Zelltyp inaktiviert. Die für eine derartige Zelltyp-spezifische Inaktivierung
benötigten
regulatorischen Sequenzen hängen
von dem besonderen in Frage stehenden Zelltyp ab und sind dem Fachmann
geläufig.
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Sind
nicht humane transgene Tiere erst einmal erzeugt, kann die Expression
des rekombinanten NHP-Gens mit Standardtechniken untersucht werden.
Das anfängliche
Screening kann mit einer Southern-Blot-Analyse oder mit Hilfe von
PCR-Techniken erfolgen,
um die Gewebe der nicht humanen Tiere darauf hin zu untersuchen,
ob eine Integration des Transgens stattgefunden hat. Es kann auch
das Ausmaß der
mRNA-Expression der Transgene in den Geweben der nicht humanen transgenen
Tiere ermittelt werden, indem Techniken eingesetzt werden, wie z.B.
die Northern-Blot-Analyse von aus dem Tier erhaltenen Gewebeproben.
die in-situ-Hybridisierungsanalyse und die RT-PCR. Proben von Gewebe,
welches das NHP-Gen exprimiert, können auch immunocytochemisch
mit Antikörpern
ausgewertet werden, die spezifisch auf das NHP-Transgen-Produkt
reagieren.
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5.2 NHPS UND NHP-POLYPEPTIDE
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Sind
nicht humane transgene Tiere erst einmal erzeugt, kann die Expression
des rekombinanten NHP-Gens mit Standardtechniken untersucht werden.
Das anfängliche
Screening kann mit einer Southern-Blot-Analyse oder mit Hilfe von
PCR-Techniken erfolgen,
um die Gewebe der nicht humanen Tiere darauf hin zu untersuchen,
ob eine Integration des Transgens stattgefunden hat. Es kann auch
das Ausmaß der
mRNA-Expression der Transgene in den Geweben der nicht humanen transgenen
Tiere ermittelt werden, indem Techniken eingesetzt werden, wie z.B.
die Northern-Blot-Analyse von aus dem Tier erhaltenen Gewebeproben.
die in-situ-Hybridisierungsanalyse und die RT-PCR. Proben von Gewebe,
welches das NHP-Gen exprimiert, können auch immunocytochemisch
mit Antikörpern
ausgewertet werden, die spezifisch auf das NHP-Transgen-Produkt
reagieren.
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5.2 NHPS UND NHP-POLYPEPTIDE
-
Die
NHPs, NHP-Polypeptide, NHP-Peptidfragmente, mutierten, eingekürzten oder
deletierten Formen der NHPs und/oder NHP-Fusionsproteine können für verschiedene
Verwendungen gewonnen werden. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht
ausschließlich,
die Erzeugung von Antikörpern,
als Reagenzien in diagnostischen Assays, zur Identifizierung von
anderen mit einem NHP verwandten Genprodukten, als Reagenzien in Assays
zum Sceening nach Verbindungen, die als pharmazeutische Reagenzien
eingesetzt werden können, welche
bei der Behandlung von mentalen, biologischen oder medizinischen
Erkrankungen und Krankheiten von Nutzen sind. Die beschriebenen
NHPs weisen eine Ähnlichkeit
mit verschiedenen Proteasen auf, einschließlich aber nicht ausschließlich Proteasen
mit Thrombospondin-Repeats, Disintegrine, Aggrecanasen, Prokollagen
I-N-Proteinase und
Metalloproteinsasen (insbesondere Zink-Metalloproteinasen der ADAMTS-Familie).
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Das
Sequenzprotokoll zeigt die von den beschriebenen NHP-Polynucleotiden
codierten Aminosäuresequenzen.
Die NHPs weisen Initiations-Methionine in DNA-Sequenzkontexten auf, die mit Translations-Initiations-Stellen übereinstimmen
und die ORFs zeigen signalähnliche
Sequenzen, welche darauf hinweisen können, dass die Beschriebenen
NHP-PRFs ausgeschiedene Proteine sind oder mit Membranen assoziiert
sein können.
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Die
erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
für die
NHPs umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen
als auch Analoga und Derivate davon. Ferner werden von der Erfindung
die entsprechenden NHP-Analogen
aus anderen Species mit umfasst. Daher liegt jedes von den oben beschriebenen
NHP-Nucleotidsequenzen codierte NHP-Protein mit im Schutzumfang
der Erfindung sowie jede neue Polynucleotidsequenz, die alle oder
irgend einen neuen Abschnitt einer im Sequenzprotokoll angegebenen
Aminosäurese quenz
codiert. Es ist bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist
und entsprechend steht jede im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäure generisch
für das
bekannte Nucleinsäure-"Triplett"-Codon oder in vielen
Fällen
Codons, welche die Aminosäure
codieren können.
Die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen als solche sollen
im Zusammenhang mit dem genetischen Code (siehe z.B. Table 4-1 auf
Seite 109 von "Molecular
Cell Biology", 1986,
J. Darnell et al. Hrg. Scientific American Books, New York, NY,
welche hiermit als Referenz eingeführt wird) generisch für alle verschiedenen
Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäure-sequenzen stehen, welche
solche Aminosäuresequenzen
codieren können.
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Die
Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell den von den hier
beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NHPs äquivalent sind, beurteilt nach
jeder Anzahl von Kriterien einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der
Fähigkeitein
ein Substrat eines NHP zu binden und zu spalten, oder der Fähigkeit,
einen identischen oder komplementären stromab gelegenen Weg zu
bewirken oder eine Änderung
im Zellmetabolismus (z.B. proteolytische Aktivität, Ionenfluss, Phosphoryierung
des Tyrosins usw.). Solche funktionell äquivalenten NHP-Proteine sind,
aber nicht ausschließlich,
Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der von den oben
beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierten Aminosäuresequenz,
die aber zu einer stillen Änderung
führen,
indem sie ein funktionell äquivalentes
Expressionsprodukt liefern. Substitutionen von Aminosäuren können auf
Basis einer Ähnlichkeit
in der Polarität,
der Ladung, der Löslichkeit,
der Hydrophobizität,
der Hydrophilizität
und/oder der amphipatischen Natur der betroffenen Reste erfolgen
Beispielsweise sind nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin;
polare neutrale Aminosäuren
sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin;
positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin und
Histidin; und negativ geladene saure Aminosäuren sind Asparaginsäure und
Glutaminsäure.
-
Es
können
verschiedene Wirts-Expressions-Vektorsysteme eingesetzt werden,
um die NHP-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Wenn,
wie im vorliegenden Fall, das NHP-Peptid oder ein NHP-Polypeptid
ein lösliches
oder ausgeschiedenes Molekül
sein soll, kann das Peptid oder Polypeptid aus dem Kul turmedium
gewonnen werden. Die Reinigung oder Anreicherung eines NHP aus solchen
Expressionssystemen kann erfolgen, indem geeignete Detergentien
und Lipidmicellen und dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt
werden. Es können
jedoch solche gentechnisch bearbeiteten Wirtszellen selbst in Situationen
eingesetzt werden, wo es wichtig ist, die strukturellen und funktionellen
Eigenschaften des NHP zu bewahren, aber die biologische Aktivität zu beurteilen,
z.B. in Screeningassays für
Arzneimittel.
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Die
Expressionssysteme, die sich für
die Zwecke der Erfindung einsetzen lassen sind, jedoch nicht ausschließlich, Mikroorganismen
wie z.B. Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden
rekombinanten Expressionsvektoren aus Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA
oder Cosmid-DNA
transformiert wurden; Hefe (z.B. Saccharomyces Pichia), die mit
NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden Expressionsvektoren aus Hefe transformiert wurde; Insektenzellsysteme,
die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren
aus Viren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme,
die mit rekombinanten Expressionsvektoren aus Viren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV;
Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden rekombinaten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid)
transformiert wurden; oder Säugerzellsysteme
(z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte
beherbergen, welche von dem Säugerzellen-Genom
stammende Promotoren (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren
stammende Promotoren (z.B. der Adenovirus-Late-Promotor; der Vacciniavirus-7,5K-Promotor)
enthalten.
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Aus
bakteriellen Systemen lässt
sich vorteilhafterweise je nach der beabsichtigten Verwendung für das zu
exprimierende NHP-Produkt eine Anzahl von Expressionsvektoren auswählen. Ist
beispielsweise eine große
Menge eines solchen Proteins zur Erzeugung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen herzustellen, die aus NHP bestehen und/oder ein
NHP enthalten, oder zur Erzeugung von Antikörpern gegen ein NHP, können Vektoren
erwünscht
sein, die eine große
Menge an leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten steuern.
Solche Vektoren sind, jedoch nicht ausschließlich, der Expressionsvektor
pUR278 Von E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem
eine NHP-codierende Sequenz im richti gen Raster mit dem lacZ codierenden
Abschnitt einzeln in den Vektor ligiert ist, so dass ein Fusionsprotein
entsteht; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye,
1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989,
J. Biol. Chem. 254: 5503–5509);
und dergl.. pGEX-Vektoren können
ebenfalls eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine
mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen
sind solche Fusionsproteine löslich
und lassen sich mittels Adsorption an Gluththion-Agarose-Kügelchen
gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion leicht
von lysierten Zellen reinigen. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen, dass
sie Schnittstellen für
Thrombin oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das geklonte
Zielsequenzprodukt vom GST-Rest befreit werden kann.
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In
einem Insektensystem wird das Autographa-Californica-Nuclear-Polyhydrosis-Virus (AcNPV) als Vektor
zue Erxpression von fremden Polynucleotidsequenzen eingesetzt. Das
Virus wächst
in Zellen von Spodoptera frugiperda. Eine NHP codierende Sequenz
kann einzeln in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen)
des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors
(z.B. des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Eine erfolgreiche
Insertion der NHP codierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des
Polyhedrin-Gens und der Produktion von einem nackten rekombinanten
Virus (d.h. einem Virus ohne Proteinhülle, die von dem Polyhedrin-Gen
codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden sodann benutzt, um
Zellen von Sodoptera frugiperda zu infizieren, in welchen die insertierte
Sequenz exprimiert wird (siehe z.B. Smith et al., 1983, J. Virol.
46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051).
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In
Wirtszellen von Säugern
lässt sich
eine Anzahl von auf Viren beruhenden Expressions-systemen einsetzen.
In den Fällen,
wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die
in Frage stehende Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex,
z.B. die Late Promotor- und Tripartite-Leader-Sequenz des Adenovirus
ligiert sein. Diese chimäre
Sequenz kann sodann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination
in das Genom des Adenoviorus insertiert sein. Die Insertion in einen
nicht essentiellen Abschnitt des viralen Genoms (z.B. Abschnitt
E1 oder E3) führt
zu einem rekombinaten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in
infizierten Wirten ein NHP-Produkt zu exprimie ren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659).
Für eine
wirkungsvolle Translation von insertierten NHP-Nucleotidsequenzen
können
auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Diese Signale
umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In
den Fällen,
wo eine ganze NHP-Sequenz oder cDNA einschließlich des eigenen Initiationscodons
und der angrenzenden Sequenzen in einen passenden Expressionsvektor
insertiert wird, sind keine zusätzlichen
Kontrollsignale für
die Translation nötig.
In Fällen
jedoch, wo nur ein Teil einer NHP codierenden Sequenz insertiert
wird, müssen
exogene Kontrollsignale für
die Translation einschließlich
vielleicht des ATG-Initiationscodons
zur Verfügung
gestellt werden. Außerdem
muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten
codierenden Sequenz sein, um eine Translation des gesamten Insertionselements
sicher zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation
und die Initiationscodons können
verschiedenen, entweder natürlichen
oder synthetischen Ursprungs sein. Die Effezienz der Expression
lässt sich
durch Einbeziehung geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren
usw. steigern (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:
516–544).
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Zusätzlich kann
ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten
Sequenzen moduliert oder das Expressionsprodukt auf die gewünschte spezifische
Weise modifiziert und weiterbehandelt. Solche Modifikationen (z.B.
eine Glykosylierung) und Weiterbehandlungen (z.B. eine Spaltung)
der Proteinprodukte können
für die
Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen weisen
charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Weiterbehandlung
und Modifikation von Proteinen und Expressionsprodukten auf. Es
können
passende Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte
Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten Fremdproteins
sicher zu stellen. Hierfür
lassen sich eukaryotische Wirtszellen einsetzen, die über die
zelluläre
Maschinerie für
eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung
und die Phosphorylierung des Expressionsprodukts verfügen. Solche
Wirtszellen von Säugern
sind, jedoch nicht ausschließlich,
CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3-, WI38- und insbesondere
menschliche Zelllinien.
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Für eine langzeitige
Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist eine stabile
Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, welche die
oben beschriebenen NHP-Sequenzen exprimieren, gentechnisch bearbeitet
werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale
Ursprünge
der Replikation enthalten, lassen sich Wirtszellen mit DNA transformieren,
die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen (z.B. Promotoren,
Enhancer-Sequenzen,
Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einem
auswählbaren
Marker kontrolliet werden. Nach Einführung der Fremd-DNA werden
gentechnisch behandelte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten
Medium wachsen gelassen und sodann in ein selektives Medium überführt. Die
auswählbaren
Marker in dem rekombinanten Plasmid verleihen gegenüber einer
Selektion Resistenz und bringen die Zellen dazu, das Plasmid in
ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu
bilden, die ihrerseits geklont werden können und sich zu Zelllinien
vermehren. Dieses Verfahren lässt
sich vorteilhaft einsetzen, um Zelllinien gentechnisch zu verändern, welche
das Genprodukt exprimieren. Solche gentechnisch bearbeiteten Zelllinien
sind vorteilhaft beim Screening und der Auswertung von Verbindungen
zu gebrauchen, welche die endogene Aktivität des NHP-Produkts beeinflussen.
-
Es
kann eine Anzahl von Selektionssystemen eingesetzt werden, einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
die Thymidinkinase aus Herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell
11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenosin-Phosphoribosyltransferasegene
(Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817), welche jeweils in tk–-,
hgprt–-
oder aprt–-Zellen
eingesetzt werden können.
Auch Resistenz gegen Antimetaboliten kann für die folgenden Gene als Basis
für eine
Selektion verwendet werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat
verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht
(Mulligan & Berg
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen
das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981,
J. Mol. Biol. 150: 1) und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin
verleiht (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147).
-
Alternativ
lässt sich
jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein für das exprimierte
Fusionsprotein spezifischer Antikörper verwendet wird. Beispielsweise
lässt sich
mit einem von Janknecht et al. beschriebenen System ein in menschlichen
Zelllinien exprimiertes nicht denaturiertes Fusionsprotein leicht
reinigen (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8972–8976).
In diesem System wird die betreffende Sequenz in ein Vaccinia-Rkombinationsplasmid
subcloniert, so dass das offene Leseraster translational an ein aus
sechs Histidinresten bestehendes aminoendständiges Tag fusioniert wird.
Die Extrakte aus mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen
werden auf Ni2+-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen aufgetragen
und die Proteine mit freien Histidinenden selektiv mit Imidazol
enthaltenden Puffern eluiert.
-
Von
der vorliegenden Erfindung werden auch Fusionsproteine umfasst,
welche das NHP zu einem Zielorgan lenken und/oder den Transport
durch die Membran in das Cytosol erleichtern. Die Konjugation von NHPs
an Antikörpermoleküle oder
deren Fab-Fragmente könnte
ausgenutzt werden, um besondere Epitope tragende Zellen an das Ziel
zu bringen. Ein Anheften der passenden Signalsequenz an das NHP
würde das NHP
auch an den gewünschten
Ort innerhalb der Zelle transportieren. Alternativ könnte eine
Zielausrichtung von NHP oder von dessen Nucleinsäuresequenz erreicht werden,
indem Übertragungssysteme
auf Basis von Liposomen oder Lipid-Komplexen eingesetzt werden.
Derartige Technologien werden in "Liposomes: A Practical Approach", neue RRC-Ausgabe,
Oxford University Press, New York und in den US-Patenten. 4,594,595, 5,459,127,
5,948,767 und 6,110,490 sowie in deren entspechenden Offenbarungen
beschrieben. Eine zusätzliche
Ausführungsform
stellen neue Protein-Konstrukte dar, die gentechnisch so behandelt
wurden, dass sie den Transport des NHP an den Zielort oder das gewünschte Organ
erleichtern, wobei sie die Zellmembran und/oder den Kern durchqueren,
wo das NHP seine funktionelle Aktivität entfalten kann. Dieses Ziel
kann erreicht werden, indem das NHP an ein Cytokin oder einen anderen
Liganden gekoppelt wird, der für
eine zielgerichtete Spezifität
sorgt, und/oder an eine ein Protein transduzierende Domäne (als
Beispiele für
derartige transduzierende Sequenzen), um den Durchtritt durch Zellmembranen
zu erleichtern und es kann wahlweise gentechnisch so bearbeitet
werden, dass es Sequenzen für
eine Lokalisierung im Kern enthält.
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5.3 ANTIKÖRPER GEGEN
NHP-PRODUKTE
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Antikörper, welche
spezifisch ein oder mehr Epitope eines NHP oder Epitope von konservierten
Varianten eines NHP oder Peptidfragmente eines NHP erkennen, werden
ebenfalls offenbart. Solche Antikörper umfassen, jedoch nicht
ausschließlich,
polyklonale Antikörper,
monoklonale Antikörper
(mAbs), humanisierte oder chimäre
Antikörper,
Einzelketten-Antikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, mit einer Fab-Expressionsbücherei hergestellte
Fragmente, antidiotypische (anti-Id)
Antikörper
und an ein Epitop bindende Fragmente von jedem der obigen Vertreter.
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Die
Antikörper
der Erfindung können
z.B. zum Nachweis von NHP in einer biologischen Probe eingesetzt
werden und können
daher als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik
Verwendung finden, in denen Patienten auf anomale Mengen von NHP
getestet werden können.
Solche Antikörper
können
z.B., wie unten in Abschnitt 5.5 beschrieben, zusammen mit Screeningverfahren
von Verbindungen eingesetzt werden, um die Wirkung von Testverbindungen
auf die Expression und/oder Aktivität eines NHP-Expressionsprodukts
zu ermitteln. Zusätzlich
lassen sich solche Antikörper
im Verein mit einer Gentherapie z.B. dazu verwenden, die normalen
und/oder gentechnisch veränderten
NHP exprimierenden Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu begutachten.
Solche Antikörper
können
zusätzlich
als eine Methode zur Inhibition von anomaler NHP-Aktivität verwendet
werden. Somit lassen sich solche Antikörper daher als Teil von Behandlungsmethoden
einsetzen.
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Für die Herstellung
von Antikörpern
können
verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem NHP, einem NHP-Peptid
(z.B. eines, das einer funktionellen Domäne auf einem NHP entspricht),
verkürzten
NHP-Polypeptiden (NHP, in welchem eine oder mehr Domänen zerstört worden
sind), funktionellen Äquivalenten
des NHP oder mutierten Varianten des NHP immunisiert werden. Solche
Wirtstiere können
sein, aber nicht ausschließlich,
Schweine, Kaninchen, Mäuse,
Ziegen und Ratten, um nur einige zu nennen. Es können verschiedene Adjuvantien
eingesetzt werden, um je nach Wirtsspezies die Immunantwort zu steigern,
wie z.B., aber nicht ausschließlich,
das Freundsche Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralsalze
wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, Chitosan, oberflächenaktive
Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen
und potentiell brauchbare menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacillus
Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Alternativ könnte die
Immunantwort durch Kombination und/oder Kopplung mit Molekülen wie
das Hämocaynin
der Napfschnecke, das Tetanus-Toxoid, das Diphtherie-Toxoid, Ovalbumin,
das Cholera-Toxin oder Fragmente derselben gesteigert werden. Polyklonale
Antikörper
sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der
immunisierten Tiere stammen.
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Monoklonale
Antikörper,
welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes
Antigen sind, lassen sich nach jeder Technik erhalten, welche über kontinuierliche
Zelllinien in Kultur für
die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt.
Dies sind, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridoma-Technik
von Köhler
und Milstein (1975, Nature 255: 495–497 und US-Patent 4,376,110),
die humane B-Zellen-Hybridoma-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology
Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030) und
die EBV-Hybridoma-Technik
(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., SS 77–96).
Solche Antikörper
können
von jeder Immunoglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD
und jeder ihrer Unterklassen. Die Hybridoma, welche die mAbs dieser
Erfindung produzieren können
in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen
Titern an mAbs in vivo macht diese Methode zum derzeit bevorzugten
Produktionsverfahren.
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Darüber hinaus
können
Techniken eingesetzt werden, die für die Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al.,
1984, Proc. Natl. Acad. Sci, 51: 6851–6855; Neuberger et al., 1984.
Nature, 312: 604–608;
Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452–454) entwickelt wurden, indem
die Gene von einem Maus-Antikörpermolekül mit passender
Antigenspezifität
zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit passender biologischer
Aktivität
gespleißt
werden (siehe US-Patente 5,877,397 und 6,075,181). Ein chimärer Antikörper ist
ein Molekül,
in welchem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierarten
stammen wie solche, die eine von einem mAb der Maus stammende variable
Region und eine konstante Region aus humanem Immunglobulin aufweisen.
Solche Technologien sind in den US-Patenten 6,075,181 und 5,877,397
beschrieben. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die wie im US-Patent
6,150,584 und entsprechenden Offenbarungen beschriebene Verwendung
von vollständig
humanisierten monoklonalen Antikörpern.
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Alternativ
können
für die
Produktion von einkettigen Antikörpern
beschriebene Techniken (US-Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science
242: 423–426;
Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 55: 5879–5883 und
Ward et al., 1989, Nature 334: 544–546) übernommen werden, um einkettige
Antikörper
gegen NHP-Expressionsprodukte
zu produzieren. Einkettige Antikörper
werden gebildet, indem das schwere und leichte Kettenfragment der
Fv-Region über
eine Aminosäurebrücke miteinander
verbunden werden, was zu einem einkettigen Polypeptid führt.
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Antikörperfragmente,
die spezifische Epitope erkennen, lassen sich mit bekannten Techniken
erzeugen. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, aber nicht ausschließlich, die
F(ab')2-Fragmente,
welche sich mittels Pepsinverdau des Antikörpermoleküls gewinnen lassen sowie die
Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Dislfidbrücken der F(ab')2-Fragmente
erzeugt werden können.
Alternativ können
Fab-Expressionsbiliotheken erstellt werden (Huse et al., 1989, Science,
245: 1275–1281),
damit monoklonale Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität schnell
und leicht identifiziert werden können.
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Umgekehrt
können
Antikörper
gegen NHP eingesetzt werden, um unter Einsatz von dem Fachmann bekannten
Techniken antiidiotypische Antikörper
zu erzeugen, welche ein gegebenes NHP "nachahmen". (Siehe z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASEB
J 7(5): 437–444
und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429–2438). Beispielsweise können Antikörper, die
an eine NHP-Domäne
binden und die Bindung von NHP an seinen angestammten Rezeptor kompetitiv
hemmen, dazu verwendet werden, um Antiidiotypen zu erzeugen, welche
ein NHP "imitieren" und daher an einen
Rezeptor binden und ihn aktivieren oder neutralisieren. Solche antiidiotypischen
Antikörper
oder Fab-Fragmente von solchen Antiidioty pen lassen sich in therapeutischen
Diäten
einsetzen, wo ein NHP-Signalweg eine Rolle spielt.
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Angesichts
des hohen Grades an Verwandschaft unter den NHPs von Säugern, sind
darüber
hinaus die derzeit beschriebenen KO-Mäuse (welche NHP niemals gesehen
haben und somit niemals gegen NHP immunisiert worden sind) von einzigartigem
Nutzen, da sie vorteilhafterweise eingesetzt werden können, um
Antikörper
gegen das offenbarte NHP von Säugern
zu erzeugen (d.h. NHP ist in den NHP-KO-Tieren immunogen).
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