NL1022371C2 - Nieuwe metallo-proteasen met trombospondine domeinen en daarvoor coderende nucle´nezuur samenstellingen. - Google Patents

Description

Nieuwe metallo-proteasen met trombospondine domeinen en daardoor coderende nuclelnezuur samenstellingen 5 Dit is een afsplitsing van NL· 1022252.

Het gebied van de uitvinding betreft proteaseo, in het bijzonder metallo-proteasen met trombospondine domeinen.

De kraakbeen matrix bestaat naar drooggewicht van het weefsel voor 70% uit collageen en voor 20-30% uit proteoglycanen. De proteoglycaan bestanddelen verlenen 10 mechanische flexibiliteit aan belaste weefsels en verleent het kraakbeen zijn visco- elastische eigenschappen. Verlies ervan leidt snel tot structurele schade, zoals bijzonder vaak wordt waargenomen in artritische aandoeningen van het gewricht en gewrichtsbeschadiging.

Aggrecaan is een belangrijk proteoglycaan van kraakbeen. Aggrecaan is een groot 15 eiwit van 210 kDa met drie globulaire domeinen, G1, G2 en G3. Het G1 en G2 domein van het eiwit liggen dicht bij de amino-terminus van het eiwit en het tussengelegen inter-globulaire domein heeft plaatsen die gevoelig zijn voor proteolyse. Het gebied tussen G2 en G3 is zwaar geglycosyleerd en verbonden met oligosachariden en glycosaminoglycanen (GAG's), waardoor het mature proteoglycaan gevormd wordt. In 20 artritisch kraakbeen werden kern eiwit fragmenten waargenomen van 55 kDa en er wordt aangenomen dat deze het resultaat zijn van klieving van het kern eiwit in het G1 en G2 inter-globulaire domein, tussen asparagine 341 en fenylalanine 342. Deze klieving kan door vele matrix metallo-proteïnasen als MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9 en -13 worden veroorzaakt, Bovendien werden 60 kDa aggrecaan fragmenten met een -COOH terminus 25 van glutaminezuur geïdentificeerd, die indicatief zijn voor een kliefplaats tussen glutaminezuur 373 en alanine 374. Matrix metallo-proteasen zijn niet in staat op deze plaats te klieven. De unieke endopeptidase activiteit die voor deze klieving verantwoordelijk is werd "aggrecanase" genoemd.

Het G1 domein van het kern eiwit vormt stabiele temaire complexen door binding 30 aan hyaluronzuur en verbindt eiwitten in de matrix. Elke enzymatische klieving in dit gebied destabiliseert de structuur van de kraakbeen matrix, wat leidt tot verlies van het belangrijkste proteoglycaan aggrecaan, en blootstelling van type II collageen aan collagenasen, wat verlies van kraakbeen tot gevolg heeft en daardoor leidt tot de 1 0223 71 - 2 ontwikkeling van aandoeningen aan het gewricht. Omdat veel van de anti-artritis geneesmiddelen niet gericht zijn op het aggrecanase, en niet in staat zijn de klieving van aggrecaan te blokkeen, speelt de aggrecanase kliefplaats een sleutelrol in de proteolytische aibraak van aggrecaan.

5 Aggrecaan als zodanig wordt beschouwd als een belangrijk doelwit voor geneesmiddelen voor artritis. Aggrecaan fragmenten die vrijkomen in de synoviale vloeistof vormen de eerste detecteerbare gebeurtenis in de ontwikkeling van reumatoïde-en osteo-artritis. Er is intensief naar dit protease gezocht. Ondanks de getrooste inspanningen is de zoektocht naar het humane aggrecanase vergeefs geweest.

10 Er is grote belangstelling voor de identificatie het aggrecanase als zodanig, evenals voor het gen dat voor deze activiteit codeert.

De volgende verwijzingen hebben betrekking op dit vakgebied. U.S. Patents 5.872,209 en 5.427.954, en WO 99/0900; WO 98/55643; WO 98/51665; en WO 97/18207.

15 Andere vewijzingen omvatten: Abbasdale, "Cloning and characterization of ADAMTS11, an aggrecanase from the ADAMTS family," J. Biol. Chem. (aug.1999) 274: 23443-50; Amer et al., "Generation and Characterization of Aggrecanase. A soluble, cartilage- derived aggrecan- degrading activity," J Biol Chem (5 maart 1999) 274(10):6594-6601; Amer et al., "Cytokine- induced cartilage proteoglycan degradation 20 is mediated by aggrecanase," Osteoarthritis Cartilage (mei 1998) 6(3):214-28;

Billington et al., 'An aggrecan-degrading activity associated with chondrocyte membranes," Biochem J (15 nov 1998 ) 336 ( Pt 1):207-12; Buttner et al., "Membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) cleaves the recombinant aggrecan substrate rAgglmut at the "aggrecanase" and the MMP sites. Characterization of MT1-25 MMP catabolic activities on the interglobular domain of aggrecan," Biochem J (1 juli 1998) 333 ( Pt 1): 159-65; Flannery et al., "Expression of ADAMTS homologues in articular cartilage," Biochem. Biophys. Res. Commun. (july 1999)260:318-22; Hurskainen et al., "ADAM-TS5, ADAM-TS6, and ADAM-TS7, Novel members of a New Family of Zinc Metalloproteases," J. Biol. Chem. (sept. 1999) 274: 25555-25563 30 Hughes et al., "Differential expression of aggrecanase and matrix metalloproteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartilage," J Biol Chem (13 nov 1998) 273(46):30576-82; Die et al., "Characterization of aggrecan i n '/ /· / ' o

J

retained and lost from the extracellular matrix of articular cartilage. Involvement of carboxyl-terminal processing in the catabolism of aggrecan," J Biol Chem (10 juli1998) 273(28):17451-8; Kuno et al., "ADAMTS-1 is an active metalloproteinase associated with the extracellular matrix" J. Biol. Chem. (Juni 1999) 274:18821-6; Kuno et al., 5 " AD AMTS-1 protein anchors at the extracellular matrix through the thrombospondin type I motifs and its spacing region," J. Biol. Chem. (mei 1998) 273:13912-7; Kuno et al., "The exon/intron organization and chromosomal mapping of the mouse AD AMTS-1 gene encoding and ADAM family protein with TSP motifs," Genomics (dec. 1997) 46:466-71; Kuno et al., "Molecular cloning of a gene encoding a new type of 10 metalloproteinase-disintegrin family protein with thombospondin motifs as an inflammation associated gene," J. Biol Chem. (jan. 1997) 272: 556-62; Sandy et al., "Chondrocyte- mediated catabolism of aggrecan: aggrecanase- dependent cleavage induced by interleukin-1 or retinoic acid can be inhibited by glucosamine," Biochem J (1 okt. 1998) 335 ( Pt l):59-66; Tang & Hong, "ADAMTS: a novel family of proteases 15 with ADAM protease domain and thrombospondin 1 repeats," FEBS Lett. (feb. 1999) 445:223-5; Tortorella et al., Purification and cloning of aggrecanase-1: a member of the ADAMTS family of proteins," Science (juni 1999) 284:1664-6; Vankemmelbeke et al., "Coincubation of bovine synovial or capsular tissue with cartilage generates a soluble 'Aggrecanase' activity," Biochem Biophys Res Commun (24 febl999) 255(3):686-91; en 20 Vasquez et al., "METH- 1, a human ortholog of ADAMTS- 1, and METH-2 are members of a new family of proteins with angio -inhibitory activity," J. Biol. Chem. (aug. 1999) 274:23349 57.

De onderhavige uitvinding is gericht op nieuwe metallo-proteïnasen met trombospondine domein(en) (MPTS eiwitten) en polypeptiden die daaraan verwant zijn, 25 evenals op nucleïnezuur samenstellingen die deze coderen, waarin wordt voorzien. De onderhavige polypeptide en nucleïnezuur samenstellingen die hier het onderwerp zijn, kunnen toepassing vinden in een verscheidenheid aan applicaties, waaronder diagnostische toepassingen, in tests op een therapeutisch agens, evenals therapeutische toepassingen voor een verscheidenheid aan aandoeningen. Ook wordt voorzien in 30 methoden voor de behandeling van ziekten die geassocieerd zijn met de activiteit van het aggrecanase, b.v. aandoeningen die worden gekenmerkt door aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, als bij reumatoïde- en osteo-artritis.

' ·' ; 7 ï 4

Hierna volgt een korte beschrijving van de Figuren:

Figuur IA toont de sequentie van een nucleïnezuur dat codeert voor MPTS-15, een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding. Figuur 1B toont de aminozuur sequentie van MPTS-15. Figuur 1C toont de rangschikking van de aminozuur sequentie van het 5 onderhavige MPTS-15, met de aminozuur sequentie van ADAMTS-6, een sequentie die wordt beschreven in Hurskainen et al., J. Biol. Chem. (sept 1999) 274:25555-25563.

Figuur 2A toont de sequentie van een nucleïnezuur dat codeert voor MPTS-10, een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding. Figuur 1B toont de aminozuur sequentie van MPTS-10 10 Figuur 3 A toont de sequentie van een nucleïnezuur dat codeert voor MPTS-19, een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding. Figuur 3B toont de aminozuur sequentie van MPTS-19.

Figuur 4A toont de sequentie van een nucleïnezuur dat codeert voor MPTS-20, een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding. Figuur 4B toont de aminozuur sequentie van 15 MPTS-20.

Ook wordt hier voorzien in nieuwe MPTS eiwitten en in daarmee verwante polypeptiden, evenals in nucleïnezuur samenstellingen die daarvoor coderen. De onderhavige polypeptide en/of nucleïnezuur samenstellingen vinden toepassing in een verscheidenheid aan verschillende applicaties, waaronder research, tests op/ontdekking 20 van/bereiding van, diagnostische en therapeutische agentia. Ook wordt voorzien in methoden voor het behandelen van aandoeningen die geassocieerd zijn met MPTS, waaronder de aggrecanase functie, b.v. ziekten die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, als reumatoïde- en osteo-artritis.

Ook wordt voorzien in metallo-proteïnasen met trombospondine domein(en) (ook 25 MPTS eiwit, ADAMTS eiwitten of aggrecanase eiwitten genaamd), evenals in daaraan verwante polypeptide samenstellingen. Als de term polypeptide samenstellingen wordt hier gebruikt, dan wordt verwezen naar eiwit van zowel volledige lengte, als naar delen of fragmenten daarvan. Ook zijn in die term alle variaties op het van nature voorkomende eiwit vervat, als hieronder meer in detail wordt beschreven. In de navolgende beschrijving van de ,022 3 71 5 onderhavige uitvinding, wordt de term "MPTS" gebruikt om niet alleen de specifiek humane MPTS eiwitten die hier worden beschreven (d.i. MPTS-10; MPTS-15; MPTS-19; MPTS-20) aan te duiden, maar is eveneens an toepassing op homologen daarvan die tot expressie worden gebracht in niet-humane species als b.v. de muis, rat en andere soorten zoogdieren.

5 Specifieke belangwekkende humane MPTS eiwitten zijn MPTS-10, MPTS-15, MPTS- 19, en MPTS-20. MPTS-15 heeft een aminozuur sequentie die in Fig. 1B wordt getoond en wordt geïdentificeerd door SEQ ID NO:l. MPTS-10 heeft een aminozuur sequentie die in Fig. 2B wordt getoond en wordt geïdentificeerd door SEQ ID NO:03. MPTS-19 heeft een aminozuur sequentie die in Fig. 3B wordt getoond en wordt geïdentificeerd door SEQ ID 10 NO:05. MPTS-20 heeft een aminozuur sequentie die in Fig. 4B wordt getoond en wordt geïdentificeerd door SEQ Π) NO:07. De onderhavige MPTS eiwitten hebben, gebaseerd op hun aminozuur sequentie, een molecuulgewicht van tenminste ongeveer 90 kDa, waarbij het molecuulgewicht gebaseerd op de aminozuur sequentie in bepaalde uitvoeringen substantieel hoger kan zijn. Het ware molecuulgewicht van de onderhavige MPTS eiwitten kan variëren 15 vanwege glycosylatie en/of andere post-translationele modificaties.

Ook wordt door de onderhavige uitvinding voorzien in MPTS polypeptide samenstellingen. De term polypeptide samenstellingen verwijst, zoals hier gebruikt, naar eiwitten van volledige lengte en naar delen of fragmenten daarvan. De term omvat ook variaties van de natuurlijk voorkomende eiwitten, waar zulke variaties homoloog of 20 grotendeels overeenkomend zijn met het natuurlijk voorkomend eiwit, waarbij het natuurlijk voorkomend eiwit het humaan eiwit, muizen eiwit of eiwit van enig andere species kan zijn die van nature een MPTS eiwit tot expressie brengt, gewoonlijk een zoogdier species. Een kandidaat homoloog eiwit komt grotendeels overeen met een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding, en id derhalve een MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding, als 25 het kandidaat eiwit een sequentie heeft die voor tenminste 35%, gewoonlijk tenminste ongeveer 45%, en gebruikelijker is tenminste ongeveer 60% sequentie overeenkomst heeft met het MPTS eiwit, als bepaald met het MegAlign DNAstar (1998) clustal algoritme als beschreven in D. G. Higgins en P. M. Sharp, "Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer," (1989) Cabios, 5 151-153 (De gebruikte parameters zijn -. --. ·? 1 ' ί 6 ktupl 1, gpa penalty 3, window 5 en opgeslagen diagonalen 5). In de navolgende beschrijving van de onderhavige uitvinding verwijst de term "MPTS eiwit" niet alleen naar de humane MPTS eiwitten, maar ook naar homologen daarvan die in niet-humane species, b.v. muis, rat en andere zoogdier species, tot expressie worden gebracht.

5 Ook wordt voorzien in MPTS eiwitten die grotendeels identiek zijn aam de beschreven eiwitten, waarbij met grotendeels identiek wordt bedoeld dat het eiwit een overeenkomst heeft in de aminozuur sequentie, met die van één van de beschreven eiwitten van tenminste 60%, gewoonlijk tenminste ongeveer 65%, en meer algemeen tenminste ongeveer 70%. In vele uitvoeringen die de voorkeur hebben is de overeenkomst in de sequentie tenminste 10 ongeveer 90%, gewoonlijk tenminste ongeveer 95% en meer algemeen is tenminste ongeveer 99%, over de gehele lengte van het eiwit.

In veel uitvoeringen zijn de eiwitten van de onderhavige uitvinding enzymen, in het bijzonder proteasen, en meer in het bijzonder metallo-proteïnasen. Het onderhavige eiwit van deze uitvoeringen wordt gekenmerkt door het feit dat het agrecanase activiteit heeft. De 15 onderhavige eiwitten zijn als zodanig in staat om aggrecaan te klieven in een inter-globulair domein, in het bijzonder tussen de G1 en G2 domeinen, en meer in het bijzonder op de GIu373-AIa374 binding van humaan aggrecaan, waardoor een klievingsproduct wordt geproduceerd met de N-terminale sequentie ARGSVIL.

Behalve de hierboven beschreven eiwitten wordt ook voorzien in homologen of 20 eiwitten (of fragmenten daarvan) van andere species als andere dieren- of planten species, waarbij zulke homologen van eiwitten afkomstig kan zijn van een diversiteit aan typen species, gewoonlijk zoogdieren., b.v. knaagdieren als de muis; huisdieren, b.v. paard, koe, hond, kat; en van de mens. Met homoloog wordt bedoeld dat een eiwit een overeenkomst heeft in de aminozuur sequentie van tenminste ongeveer 35%, gewoonlijk tenminste 25 ongeveer 40% en meer algemeen is tenminste ongeveer 60%, met één van de specifieke humane MPTS eiwitten als hierboven geïdentificeerd (d.i. een eiwit met een aminozuur sequentie van SEQ ED NO:01, 03, 05 of 07), waarbij de bepaling van de overeenkomst in aminozuur sequentie als supra beschreven is.

- - ' > / ,j 7

De eiwitten van de onderhavige uitvinding zijn aanwezig in een niet-natuurlijke voorkomende omgeving, b.v. ze worden gescheiden van de omgeving waarin ze van nature voorkomen. In bepaalde uitvoeringen bevinden de onderhavige eiwitten zich in een samenstelling die verrijkt is aan het onderhavige eiwit, dit in vergelijking met de omgeving 5 waarin het van nature voorkomt. Er wordt bijvoorbeeld voorzien in een gezuiverd eiwit, waarbij gezuiverd betekend dat het eiwit aanwezig is in een samenstelling die grotendeels vrij is van niet-MPTS eiwitten, waarbij grotendeels vrij betekend dat minder dan 90%, gewoonlijk minder dan 60% en algemener is minder dan 50% van de samenstelling bestaat uit niet-MPTS eiwitten. De eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook als isolaat 10 aanwezig zijn, waarmee wordt bedoeld dat het eiwit grotendeels vrij is van andere eiwitten en andere van nature voorkomende biologische moleculen als oligosachariden, polynucleotiden en fragmenten daarvan, en dergelijke, waarbij met de term "grotendeels vrij" wordt bedoeld dat tenminste 70%, gewoonlijk minder dan 60% en meer algemeen is minder dan 50% van de samenstelling die het geïsoleerde eiwit bevat, uit een ander van nature 15 voorkomend biologisch molecuul bestaat. In bepaalde uitvoeringen zijn de eiwitten in grotendeels zuivere vorm, aanwezig, waarbij "grotendeels zuivere vorm" betekend dat het tenminste voor 95%, gewoonlijk tenminste 97% en meer algemeen is tenminste 99%, zuiver is.

Behalve in natuurlijk voorkomende eiwitten, wordt ook voorzien in polypeptiden die 20 afwijken van het natuurlijk voorkomend eiwit, b.v. MPTS polypeptiden. Met MPTS

polypeptide wordt een aminozuur sequentie bedoeld die wordt gecodeerd door een open leesraam (ORF) van het gen dat codeert voor het MPTS, dat hieronder gedetailleerder besproken zal worden, inclusief het eiwit van volledige lengte, als fragmenten daarvan, in het bijzonder biologisch actieve fragmenten en/of fragmenten die corresponderen met 25 functionele domeinen, b.v. het protease domein, trombospondine domein, en dergelijke, en inclusief fusies van de onderhavige polypeptiden aan andere eiwitten of delen daarvan. Belangwekkende fragmenten zullen kenmerkend een lengte hebben van ongeveer 10 az, gewoonlijk tenminste ongeveer 50 az, en kunnen wel 300 az, of langer zijn, maar overschrijden gewoonlijk de 1000 az in lengte niet, waarbij het fragment een aaneengesloten ' 0 2 2 3 71 8 reek aminozuren die identiek is met het onderhavige eiwit van tenminste ongeveer 10 az, gewoonlijk tenminste ongeveer 15 az, en in veel uitvoeringen van tenminste ongeveer 50 az in lengte. Waar het fragment een MPTS-15 fragment betreft, omvat dit bij voorkeur een groot deel van het protease domein van het wildtype eiwit, waarbij een groot deel tenminste 5 50%, gewoonlijk tenminste 60% en meer algemeen is tenminste 70% van de sequentie van dit domein van het MPTS-15 eiwit bevat. Het MPTS-15 fragment omvat bijvoorbeeld gewoonlijk een sequentie, die na rangschikking met de sequentie residuen van het protease domein van de wildtype sequentie, een overeenkomst vertoont met het gerangschikte gebied van de wildtype sequentie van tenminste 50%, gewoonlijk tenminste 60% en meer algemeen 10 is tenminste 70% , waarbij in veel uitvoeringen het percentage overeenkomst veel hoger kan zijn, b.v. 75, 80, 85, 90 Of 95%, of hoger, b.v. 99%.

De onderhavige eiwitten en polypeptiden kunnen uit natuurlijke bronnen worden verkregen, of synthetisch worden geproduceerd. De eiwitten kunnen bijvoorbeeld afkomstig zijn uit biologische bronnen die de eiwitten tot expressie brengen, als synoviocyten, 15 chondrocyten, kraakbeen en dergelijke De onderhavige eiwitten kunnen ook afkomstig zijn uit synthetische bron, bijvoorbeeld door expressie in een geschikte gastheer van een gen dat codeert voor het belangwekkende eiwit,, als hieronder gedetailleerder wordt besproken.

Elke geschikte eiwit zuiveringsmethode kan worden gebruikt, waarbij geschikte methoden voor eiwitzuivering worden beschreven in de Guide to Protein Purification, (Deuthser red.) 20 (Academic Press, 1990). Er kan bijvoorbeeld van de oorspronkelijke bron, b.v.

chondrocyten of een expressie gastheer, een lysaat worden bereid dat wordt gezuiverd met HPLC, exclusie chromatografie, gel elektroforese, affiniteitschromatografie, en dergelijke Er wordt ook voorzien in nucleïnezuur samenstellingen die coderen voor MPTS eiwitten, of fragmenten daarvan, evenals voor de MPTS homologen van de onderhavige 25 uitvinding. Met nucleïnezuur samenstelling wordt een samenstelling bedoeld die een sequentie DNA omvat met een open leesraam dat codeert voor een MPTS polypeptide van de onderhavige uitvinding, d.i. een mpts gen, en dat in staat is, onder de juiste omstandigheden, tot expressie te worden gebracht als MPTS. Ook omvat deze term nucleïnezuren die homoloog of grotendeels overeenkomend of identiek zijn aan de i 'V ; v v "·'· v ' f i.

9 nucleïnezuren die coderen voor MPTS eiwitten. Zo voorziet de onderhavige uitvinding in genen die coderen voor het humane MPTS eiwit van de onderhavige uitvinding, en homologen daarvan. Het humane MPTS 15 gen wordt in Fig. IA getoond, waarbij de sequentie die in Fig. IA wordt getoond wordt geïdentificeerd als SEQ ID NO:02, infra. Het 5 humane MPTS 10 gen wordt in Fig. 2 A getoond, waarbij de sequentie die in Fig. 2A wordt getoond wordt geïdentificeerd als SEQ ID NO:04, infra. Het humane MPTS19 gen wordt in Fig. 3 A getoond, waarbij de sequentie die in Fig. 3 A wordt getoond wordt geïdentificeerd als SEQ ID NO;06, infra. Het humane MPTS20 gen wordt in Fig. 4A getoond, waarbij de sequentie die in Fig. 4A wordt getoond wordt geïdentificeerd als SEQ ID NO:08, infra.

10 Elke species kan als bron dienen van homologe genen, b.v. primaat species, in het bijzonder de mens; knaagdieren als raten en muizen, hondachtigen, katachtigen, runderen, schapen, paarden, gist, nematoden, etc. Tussen zoogdier species, b.v. de mens en de muis, moeten homologen een grote overeenkomst in sequentie vertonen, b.v. tenminste 75% overeenkomst in sequentie, gewoonlijk tenminste 90% en meer algemeen is tenminste 95% 15 overeenkomst in nucleotide sequentie. De overeenkomst in sequentie wordt berekend op basis van een referentie sequentie, die kan bestaan uit een sub-set van een grotere sequentie, zoals een geconserveerd motief, een coderend gebied, een flankerend gebied, etc. Een referentie sequentie zal gewoonlijk tenminste ongeveer 18 nt lang zijn, gebruikelijker is tenminste ongeveer 30 nt lang, en kan zich uitstrekken tot de gehele sequentie die wordt 20 vergeleken. De algoritmen voor sequentie analyse zijn in de wetenschap bekend, zoals BLAST, beschreven door Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215-403-10 (met basis instellingen, d.w.z. parameters w = 4 en T= 17). De sequenties waarin hierin wordt voorzien zijn essentieel voor de herkenning van MPTS in gegevens bestanden, en omvatten aggrecanase, verwante en homologe eiwitten, en de nucleïnezuren die daarvoor coderen. In 25 het bijzonder zijn in bepaalde uitvoeringen nucleïnezuren die grotendeels even lang zijn als de nucleïnezuren die worden geïdentificeerd door SEQ ED NO.02, 04, 06 en 08, en die over de gehele lengte va het nucleïnezuur een sequentie overeenkomst hebben met één van die sequenties van tenminste ongeveer 99%.

- / t 10

Nucleïnezuren die coderen voor de eiwitten en polypeptiden van de onderhavige uitvinding kunnen cDNA of genomisch DNA of fragmenten daarvan zijn. Met de term "MPTS gen" wordt een open leesraam bedoeld dat codeert voor specifieke MPTS eiwitten en polypeptiden, en introns, evenals voor de 5' en 3' niet-coderende nucleotide sequenties die 5 betrokken zijn bij de regulatie en expressie, tot ongeveer 20 kb na het coderende gebied, maar mogelijk verder in elk van de richtingen. Het gen kan in een geschikte vector worden ingebracht als extra-chromosomaal element, of voor integratie in het genoom van een gastheer.

De term "cDNA" omvat zoals hier gebruikt, alle nucleïnezuren die de rangschikking 10 van sequentie elementen die in natieve mature mRNA species worden gevonden delen, waarbij de sequentie elementen de exonen en de 5' en 3' niet-coderende gebieden zijn. In het algemeen hebben mRNA species bij verwijdering, door splicing van het RNA in de kem, van eventueel aanwezige introns, aaneengesloten exonen, wat een doorlopend open leesraam dat voor het MPTS eiwit codeert creëert.

15 Een belangwekkende genomische sequentie omvat het nucleïnezuur dat tussen het startcodon en het stopcodon aanwezig is, zoals hier gedefinieerd in de sequentie lijst, wat alle introns die gewoonlijk in een natief chromosoom aanwezig zijn omvat. Verder kan dit de 5' en 3' niet-vertaalde gebieden omvatten die in het mature mRNA voorkomen. Verder kan dit specifieke transcriptioneel en translationeel regulerende sequenties omvatten, zoals 20 promotors, enhancers, etc, waaronder ongeveer 1 kb, maar mogelijk meer, flankerend genomisch DNA aan het 5' of 3' uiteinde van het afgeschreven gebied. Het genomisch DNA kan worden geïsoleerd als fragment van 100 kbp of kleiner, en grotendeels vrij van flankerende chromosomale sequenties. Het genomisch DNA dat het coderende gebied aan de 3' of 5' kant flankeert, of de interne regulerende sequenties die soms in introns worden 25 gevonden, bevatten sequenties die benodigd zijn voor de juiste weefsel- en stadium-specifieke expressie.

De nucleïnezuur samenstellingen van de onderhavige uitvinding kan coderen voor het gehele, of voor een deel van het MPTS eiwit. Er kunnen enkel- of dubbelstrengs fragmenten van de DNA sequentie worden verkregen door het met standaard methoden, door restrictie i 022371 .....

η enzym digestie, door PCR amplificatie, etc, chemisch synthetiseren van ofigonucieotiden.

Het grootste deel van de DNA fragmenten zal tenminste 15 nt, gewoonlijk minstens 18 nt of 25 nt, en kan minstens 50 nt groot zijn.

De onderhavige genen worden geïsoleerd en verkregen in grotendeels zuivere vorm, in 5 het algemeen anders dan als intact chromosoom. Gewoonlijk zal het DNA worden verkregen in een vorm die grotendeels vrij is van andere nucleïnezuur sequenties die geen MPTS gen sequentie of fragment daarvan bevatten, in het algemeen voor tenminste 50%, gewoonlijk tenminste ongeveer 90% zuiver, en het is kenmerkend ''recombinant”, d.w.z. dat het wordt geflankeerd door één of meer nucleotiden die normaal niet met het van nature 10 voorkomen chromosoom geassocieerd zijn.

Behalve de veelheid aan toepassingen die in de navolgende onderdelen gedetailleerder worden besproken, vinden de onderhavige nucleïnezuur samenstellingen toepassing bij de bereiding van alle, of een deel van de MPTS polypeptiden, als hierboven beschreven. Er wordt gebruik gemaakt van het polynucleotide waarin wordt voorzien (b.v. een 15 polynucleotide met een sequentie van SEQ ID NO:02, 04, 06 of 08), het corresponderende cDNA, of het gen van volledige lengte, voor de expressie van een deel, of van het geheel van het genproduct. Constructen van polynucleotiden met de sequenties SEQ Π) NOs:02, 04, 06 of 08 kunnen synthetisch worden gegenereerd. Als alternatief worden eenstaps assemblage van een gen en totaal plasmide uit grote hoeveelheden 20 oligodeoxyribonucleotiden beschreven door b.v. Stemmer et al, Gene (Amsterdam) (1995) 164(1) :49-53. In deze methode wordt de assemblage PCR (de synthese van lange DNA sequenties vanuit grote hoeveelheden oligodeoxyribonucleotiden (oligo's)) beschreven. De methode stamt af van DNA shuffling (Stemmer, Nature (1994) 370:389-391), en is niet afhankelijk van het DNA ligase, maar maakt in plaats daarvan gebruik van DNA polymerase, 25 voor het opbouwen tijdens het assemblageproces, van steeds langere DNA fragmenten. De juiste polynucleotide constructen worden met standaard recombinant DNA technieken gezuiverd, als bijvoorbeeld beschreven in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2“ druk, (1989) Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY, / i 12 en onder de huidige regelgeving beschreven in United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research

Polynucleotide moleculen die een polynucleotide sequentie omvatten waarin hierin wordt voorzien, worden vermenigvuldigd door het molecuul in een vector in te brengen. Er 5 worden virale en niet-virale vectoren, waaronder plasmiden, gebruikt. De keuze van het plasmide is afhankelijk van het celtype waarin de vermenigvuldiging gewenst is, en het doel van de vermenigvuldiging. Bepaalde vectoren zijn bruikbaar voor amplificatie en bereiding van grote hoeveelheden van de gewenste DNA sequentie. Andere vectoren zijn geschikt voor overdracht en expressie in cellen in een intact dier of persoon. De keuze van de juiste 10 vector ligt binnen de competentie van de vakman. Er zijn in de handel vele vectoren verkrijgbaar. Het gedeeltelijke of complete polynucleotide wordt in een vector ingebracht, kenmerkend door DNA ligase bevestiging van een gekliefd fragment aan een gekliefde restrictieplaats in de vector. Als alternatief kan de gewenste nucleotide sequentie in vivo door homologe recombinatie worden ingebracht. Kenmerkend komt dit tot stand door 15 bevestiging van gebieden met homologie met de vector, aan de flanken van de gewenste nucleotide sequentie. Homologe gebieden worden bijvoorbeeld door ligatie van oligonucleotiden, of door de polymerase ketenreactie met primers die zowel het homologe gebied als een deel van de gewenste nucleotide sequentie omvatten, toegevoegd.

Voor het tot expressie brengen kan een expressiecassette worden gebruikt. Het 20 genproduct dat wordt gecodeerd door een polynucleotide van de uitvinding wordt in enig geschikt expressiesysteem, bijvoorbeeld bacteriële, gist, insecten, amfibie en zoogdier systemen, tot expressie gebracht. Geschikte vectoren en gastheer cellen worden beschreven inU. S. Patent No. 5.654.173. In de expressievector wordt een voor eenMPTS coderend polynucleotide, b.v. als beschreven door SEQ ID NO:02, 04, 06 en 08, aan een regulerende 25 sequentie gekoppeld, zodanig, dat de juiste expressie eigenschappen worden verkregen. Deze kunnen promotors (bevestigd aan de 5' kant van de coderende sequentie of aan de 3' kant van de niet-coderende sequentie), enhancers, terminators, operators, repressors en inductoren omvatten. De promotors kunnen gereguleerd, of constitutief zijn. In sommige gevallen kan het wenselijk zijn conditioneel actieve promotors te gebruiken, zoals weefsel- : / -J - 13 specifieke of ontwikkelingsstadium-specifieke promotors. Deze worden aan de gewenste nucleotide sequentie gekoppeld met hierboven beschreven technieken voor koppeling aan vectoren. Elke in de wetenschap bekende techniek kan worden gebruikt. Met andere woorden, de expressie vector zal voorzien in een transcriptioneel en translationeel 5 initiatiegebied, dat induceerbaar of constitutief kan zijn, waarbij het coderende gebied operationeel wordt gekoppeld, onder transcriptionele controle van het transcriptioneel initiatiegebied, en een transcriptioneel en translationeel terminatie gebied. Deze controlerende gebieden kunnen natief voor het onderhavige MPTS gen zijn, of kunnen uit exogene bron afkomstig zijn.

10 Expressievectoren hebben over het algemeen handzame restrictieplaatsen die gelokaliseerd zijn vlakbij de promotor sequentie, om te voorzien in de insertie van nucleïnezuur sequenties die coderen voor heterologe eiwitten Er kan een in de expressie gastheer werkzame selectiemarker aanwezig zijn. Expressievectoren kunnen worden gebruikt voor de productie van fusie eiwitten, waarbij het exogene fusie peptide voorziet in 15 aanvullende functionaliteit, d.i. verhoogde eiwitsynthese, stabiliteit, reactiviteit met gedefinieerde sera, een enzym marker, b.v. β-galactosidase, etc.

Er kunnen expressiecassettes worden gemaakt die een translatie initiatie gebied, het gen of een fragment daarvan, en een translatie stop gebied omvatten. In het bijzonder is het gebruik van sequenties van belang die de expressie van functionele epitopen of domeinen, 20 gewoonlijk tenminste ongeveer 8 aminozuren, gebruikelijker is tenminste ongeveer 15 aminozuren in lengte, tot ongeveer 25 aminozuren tot het gehele open leesraam van het gen, mogelijk maken. Na inbrengen van het DNA worden de cellen die het construct bevatten geselecteerd door middel van een selectie marker, de cellen worden geëxpandeerd en daarna voor expressie gebruikt.

25 De MPTS eiwitten en polypeptiden kunnen afhankelijk van het doel van de expressie met bekende procedures tot expressie worden gebracht in prokaryoten of eukaryoten. Voor grootschalige productie kan een eencellig organisme als E. coli, B. subtitis, S. cerevisiae, insectencellen in combinatie met baculovirus vectoren, of cellen van en hoger organisme als vertebraten, in het bijzonder zoogdieren, b.v. COS 7 cellen, HEK 293, CHO, Xenopus 1 0223 71 14 oöcyten etc., als expressie gastheer cellen worden gebruikt. In sommige situaties is het wenselijk het gen in eukaryote cellen tot expressie te brengen, waarbij het tot expressie gebrachte eiwit zal profiteren van de natieve vouwing en post-translatïonele modificaties. Kleine peptiden kunnen ook in het laboratorium worden vervaardigd. Polypeptiden die sub-5 sets vormen van de complete eiwit sequentie kunnen ook worden gebruikt voor het identificeren en onderzoeken van delen van het eiwit die belangrijk zijn voor het functioneren ervan.

Specifieke belangwekkende expressiesystemen omvatten van bacteriën, gist, insectencellen en zoogdier cellen afgeleide expressiesystemen. representatieve systemen voor 10 elk van deze categorieën worden hieronder gegeven:

Bacteriën: Expressiesystemen in bacteriën omvatten degenen die worden beschreven in Chang et al., Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281:544; Goeddel et al, Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; EP 0 036.776; U.S. Patent No. 4.551.433; De Boer et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA) (1983) 80:21-25; en Siebenlist et al., Cell (1980) 15 20:269.

Gist. Expressie systemen in gist omvatten degenen die worden beschreven in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad Sci. (USA) (1978) 75:1929; Ito et al, J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et ai, Mol. Cell. Biol. (1986) 6.142; Kunze et al, J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Gleeson et al, J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet.

20 (1986) 02:302; Das ei al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt et al., J.

Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Berg et al, Bio/Technology (1990) 8:135; Kunze et al, J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Cregg et al, Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376; U.S. Patent Nos. 4.837.148 en 4.929.555; Beach en Nurse, Nature (1981) 300:706; Davidow et al,

Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballance et al., 25 Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-289; Tilbum et al, Gene (1983) 26:205-22 1; Yelton et al, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) (1984) 81:1470-1474; Kelly and Hynes, EMBOJ. (1985) 4:475479; EP 0 244.234; en WO 91/00357.

'· · > / J

15

Insectencellen De expressie van heterologe genen in insecten, kan plaatsvinden als beschreven in U.S. Patent No. 4.745.05 1; Friesen et al, "The Regulation ofBaculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler, red ); EP 0 127.839; EP 0.155.476; en Vlak et al., J. Gen. Virol (1988) 69:765-776; Miller et al, 5 Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonell et al, Gene (1988) 73:409; Maeda et al., Nature (1985) 315:592-594; Lebacq-Verheyden et al, Mol Cell Biol. (1988) 8:3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8844; Miyajima et al., Gene (1987) 58:273; en Martin et al, DNA (1988) 7:99. Vele baculovirale stammen en varianten en de corresponderende permissieve insecten gastheer-cellen van gastheren, worden beschreven in 10 Luckow et al, Bio/Technology (1988) 6:47-55, Miller et ai, Generic Engineering (1986) 8:277-279, en Maeda et al, Nature (1985) 315:592-594.

Zoogdierceüen Zoogdier expressie kan plaatsvinden als beschreven in Dijkema et al, EMBOJ (1985) 4:761, Gorman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:6777, Boshart et al, Cell (1985) 41:521, en U.S. Patent No. 4.399.216. Andere kenmerken van 15 zoogdier expressie worden toegelicht en beschreven in Ham en Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, Barnes en Sato, Anal Biochem. (1980) 102:255, U.S. Patent Nos 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.762; WO 90/103430; WO 87/00195 en U.S. RE 30.985.

Bij gebruik van een van de bovenstaande gastheer cellen, of andere geschikte gastheer cellen of organismen, voor replicatie en/of expressie van de polynucleotiden van de 20 uitvinding, dan valt het resulterende gerepliceerde nucleïnezuur, RNA, tot expressie gebracht eiwit of polypeptide, binnen het bestek van de onderhavige uitvinding als product van de gastheer cel of het organisme, et product kan met elk in de wetenschap bekend middel worden gewonnen.

Wanneer een gen dat correspondeert met een geselecteerd polynucleotide wordt 25 geïdentificeerd, dan kan de expressie ervan in de cel waarin het gen natief is worden gereguleerd. Een endogeen gen van een cel kan bijvoorbeeld worden gereguleerd door een exogene regulerende sequentie, als beschreven in U.S. Patent No. 5.641.670.

De onderhavige polypeptide en nucleïnezuur samenstellingen vinden toepassing in een verscheidenheid aan applicaties, waaronder algemene applicaties, diagnostische applicaties s- , - 16 en research, tests op/ontdekking van/bereiding van therapeutische samenstellingen, en methoden voor het gebruik ervan.

De onderhavige nucleïnezuur samenstellingen vinden toepassing in een verscheidenheid aan algemene applicaties. Belangwekkende algemene applicaties omvatten: 5 de identificatie van MPTS homologen; als bron van nieuwe promotor elementen; identificatie van MPTS expressie regulerende factoren; als probes en primers in hybridisatie applicaties, b.v. PCR; de identificatie van expressiepatronen in biologische specimen; de bereiding van cellen of diermodellen voor de MPTS functie; het maken van in vitro modellen voor de MPTS functie; etc.

10 Homologen van de onderhavige genen kunnen met een aantal methoden worden

geïdentificeerd. Een fragment van het cDNA waarin wordt voorzien kan als hybridisatie probe tegen een cDNA bank van het doelwit organisme waarin men belang stelt worden gebruikt. De probe kan een groot fragment zijn, of één of meer kortere gedegenereerde primers. Nucleïnezuren met sequentie overeenkomst worden door hybridisatie onder laag 15 stringente omstandigheden gedetecteerd, bijvoorbeeld op 50°C en 6xSSC (0,9 M

natriumchloride/0,09 M natriumcitraat) en blijven gebonden spoelen op 55°C in lxSSC (0,15 M natriumchloride/0,15 M natriumcitraat). De sequentie identiteit kan worden bepaald door hybridisatie onder stringente omstandigheden, bijvoorbeeld op 50°C of hoger en met 0,lxSSC (15 mM natriumchloride/15 mM natriumcitraat). Nucleïnezuren met een gebied 20 met substantiële overeenkomst met de sequenties waarin wordt voormen, b.v. allelische varianten, genetisch gemodificeerde versies van het gen, etc., binden onder stringente hybridisatie omstandigheden aan de sequenties waarin wordt voorzien. Door gebruik te maken van probes, in het bijzonder van gelabelde probes van de DNA sequentie, kan men homologe of verwante genen isoleren.

25 De sequentie van het 5' flankerende gebied kan worden gebruikt voor promotor elementen waaronder enhancer bindingsplaatsen, die voorzien in ontwikkelingsregulatie in weefsels waarin het onderhavige MPTS gen tot expressie wordt gebracht. De weefsel-specifieke expressie is bruikbaar bij het bepalen van het expressiepatroon, en om te voorzien in promotors die het natieve expressiepatroon imiteren. De in het promotorgebied van nature 1 022 3 71 17 voorkomende polymorfieën zijn bruikbaar bij de bepaling van de natuurlijke variatie in de expressie, in het bijzonder diegenen die met ziekten geassocieerd kunnen zijn.

Als alternatief kunnen mutaties in het promotorgëbied worden gemaakt, om te bepalen wat het effect is van veranderde expressie in experimenteel gedefinieerde systemen. De 5 methoden voor de identificatie van specifieke DNA motieven die de binding van transcriptie factoren betreffen, zijn in de wetenschap bekend, b.v. sequentie overeenkomst met bekende bindingsmotieven, gel retardatie onderzoek, etc. Zie, bijvoorbeeld, Blackwell et al, (1995) Mol. Med. 1:194-205; Mortlock et al, (1996), Genome Res. 6:327-33; en Joulin en Richard-Foy (1995), Eur. J. Biochem. 232:620-626.

10 De regulerende sequenties kunnen worden gebruikt voor de identificatie van cis werkzame sequenties die nodig zijn voor transcriptie of translatie regulatie van de MPTS gen expressie, in het bijzonder in verschillende weefsels of ontwikkelingsstadia, en voor de identificatie van cis werkzame sequenties en trans werkzame factoren die de MPTS gen expressie reguleren of mediëren. Zulke-transcriptie of translatie regulerende gebieden 15 kunnen operabel worden gekoppeld aan een MPTS gen om de expressie van wildtype of veranderd MPTS of andere eiwitten waarin men belang stelt in gekweekte cellen of in embryonale foetale of adulte weefsels te bevorderen, en voor gentherapie.

Kleine DNA fragmenten zijn bruikbaar als primers voor PCR, hybridisatie test-probes, etc. Grotere DNA fragmenten, d.i. groter dan 100 nt, zijn bruikbaar voor de productie van 20 het gecoderde polypeptide, zoals in het vorige onderdeel werd beschreven. Voor gebruik in geometrische amplificatie reacties als geometrische PCR, zal een primer-paar worden gebruikt De exacte samenstelling van de primer sequenties is niet cruciaal voor de uitvinding maar voor de meeste toepassingen zullen de primers onder stringente omstandigheden met de onderhavige sequentie hybridiseren, zoals in de wetenschap bekend 25 is. Het heeft de voorkeur indien een primer-paar wordt gekozen dat een amplificatieproduct zal genereren van tenminste 50 nt, bij voorkeur tenminste ongeveer lOOnt. De algoritmen voor de selectie van primer sequenties zijn algemeen bekend en zijn te koop in inde handel verkrijgbare software pakketten. Amplificatie primers hybridiseren met complementaire strengen DNA en zullen de reactie in een richting naar elkaar toe aanzetten.

18

Het DNA kan ook worden gebruikt voor de identificatie van het gen in een biologisch specimen. De wijze waarop met de cellen met een probe test op aanwezigheid van bepaalde nucleotide sequenties als genomisch DNA of RNA, is uit de literatuur bekend. In het kort, uit een cel monster wordt DNA of mRNA geïsoleerd. Het mRNA kan voor de vorming van 5 een complementaire DNA streng met revers transcriptase worden geamplificeerd door RT-PCR, gevolgd door polymerase ketenreactie amplificatie met primers die specifiek zijn voor de onderhavige DNA sequentie. Als alternatief kan het mRNA monster door gel elektroforese worden gescheiden, overgebracht worden op een geschikte drager, b.v. nitrocellulose, nylon, etc., en dan met een probe worden getest die een fragment is van het 10 onderhavige DNA. Ook kunnen andere technieken als oligonucleotide ligatie tests, in situ hybridisaties en hybridisatie aan DNA probes die op een vaste chip zijn gerangschikt, worden toegepast. Detectie van mRNA dat met de onderhavige sequentie hybridiseert is indicatief voor de MPTS gen expressie in een monster.

De sequentie van het MPTS gen, inclusief de flankerende promotor gebieden en 15 coderende gebieden kan, op verschillende manieren die in de wetenschap bekend zijn, worden gemuteerd om doelgerichte veranderingen te maken in de kracht van de promotor, sequentie van het gecodeerde eiwit, etc. De DNA sequentie of het eiwit product van zulk een mutatie zal gewoonlijk substantieel overeen komen met de sequenties waarin hierin wordt voorzien, d.w.z. zal in tenminste respectievelijk één nucleotide of aminozuur afwijken, 20 en kan afwijken in tenminste twee, maar niet meer dan ongeveer tien nucleotiden of aminozuren. De sequentie veranderingen kunnen substituties, inserties, deleties, of een combinatie daarvan betreffen. Deleties kunnen grotere veranderingen omvatten, zoals deletie van een domein of een exon. Andere belangwekkende modificaties omvatten het merken van een epitoop, b.v. met het FLAG systeem, HA, etc. Voor onderzoek aan de sub-cellulaire 25 lokalisatie kunnen fusie eiwitten met groen fluorescente eiwitten (GFP) worden gebruikt.

De technieken voor in vitro mutagenese van gekloneerde genen zijn bekend. Voorbeelden van protocollen voor plaatsgerichte mutagenese kunnen worden teruggevonden in Gustin et al (1993), Biotechniques 14:22; Barany (1985), Gene 29:303- 13. Colicelli et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9; enPrentski et al. (1984), Gene 19 29:303-13. Methoden voor plaatsgerichte mutagenese kunnen worden teruggevonden in Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pag. 15.3-15.108; Weiner et al. (1993), Gene 126:35-41; Sayers etal (1992), Biotechniques 13:592-6; Jones en Winistorfer (1992), Biotechniques 12:528-30; Barton et al, (1990), Nucleic 5 Acids Res 18:7349-55; Marotti en Tomich (1989), Gene Anal Tech. 6:67-70; en Zhu (1989), Anal Biochem 177:120-4. Zulke gemuteerde genen kunnen worden gebruikt om de structuur-functie verbanden van een MPTS eiwit te onderzoeken of om de eigenschappen van het eiwit die zijn functie of regulatie beïnvloeden, te veranderen.

De onderhavige nucleïnezuren kunnen worden gebruikt om transgene, niet humane 10 dieren of specifieke gen-modificaties in alle cellijnen te genereren. Transgene dieren kunne worden gemaakt door middel van homologe recombinatie, waarbij het endogene locus verander wordt. Als alternatief wordt een nucleïnezuur construct willekeurig in het genoom geïntegreerd. De vectoren voor stabiele integratie omvatten plasmiden, retrovirussen, en andere virussen, YAC's, en dergelijke.

15 De gemodificeerde cellen of dieren zijn bruikbaar in onderzoek naar de MPTS functie en regulatie. Het gebruik van de onderhavige genen is van belang voor de constructie van transgene diermodellen van aan MPTS gerelateerde aandoeningen, waaronder aan aggrecanase gerelateerde aandoeningen, b.v. aandoeningen die verband houden met de agrecanase activiteit als artritis. Zulke transgene diermodellen van de onderhavige uitvinding 20 omvatten endogeen MPTS gen knock-outs, waarbij de expressie van endogeen MPTS op zijn minst wordt gereduceerd of geëlimineerd, waarbij de dieren ook kenmerkend een MPTS peptide van de onderhavige uitvinding, b.v. de specifieke MPTS eiwitten van de onderhavige uitvinding, of een fragment daarvan, tot expressie brengen. Wanneer een nucleïnezuur met een sequentie die in het humane MPTS gen wordt gevonden wordt ingebracht, dan kan het 25 ingebrachte nucleïnezuur de complete, of een gedeelte van de sequentie van het MPTS gen zijn. Er kan een detecteerbare markering als lac Z in de MPTS locus worden ingébracht, waarbij op-regulatie van de gen-expressie zal resulteren in makkelijk te detecteren verandering in het fenotype. Men kan ook expressie van het gen of varianten daarvan laten 1 0223 ?! 20 plaatsvinden in cellen of weefsels waarin het gewoonlijk niet tot expressie wordt gebracht, op een niveau dat in zulke cellen of weefsels gewoonlijk niet wordt gerealiseerd.

De DNA constructen voor homologe recombinatie zullen tenminste een deel van een MPTS gen van de onderhavige uitvinding omvatten, waarbij het gen de gewenste 5 modificatie(s) omvatten, en die gebieden van homologie met het doelwit locus bevatten. De DNA constructen voor willekeurige integratie hoeven voor het tot stand brengen van recombinatie geen homologe gebieden te bevatten. Voor het gemak worden markeringen voor positieve en negatieve selectie opgenomen. Methoden voor het maken van cellen met door middel van homologe recombinatie gerichte gen-modificaties, zijn in de wetenschap 10 bekend. Voor diverse technieken voor de transfectie van zoogdiercellen, zie Keown et al. (1990). Meth. Enzymol. 185:527-537.

Voor embryonische stam (ES) cellen, kan een ES cellijn worden gebruikt, of de embryonische cellen kunnen vers uit de gastheer worden verkregen, b.v. uit de muis, rat, cavia, etc. Zulke cellen worden op een toepasselijke fibroblast voedingslaag gegroeid in 15 aanwezigheid van de leukemie remmende factor (LEF). Als de ES of embryonische cellen getransformeerd rijn, dan kunnen ze worden gebruikt voor de productie van transgene dieren. Na transformatie worden de cellen in het juiste medium op een voedingslaag uitgeplaat. Cellen die het construct bevatten kunnen door gebruik te maken van een selectief medium worden gedetecteerd. Na het verstrijken van voldoende tijd om kolonies te laten 20 groeien worden deze opgepikt en geanalyseerd op het feit of homologe recombinatie of integratie van het construct heeft plaatsgevonden. De positieve kolonies kunnen dan worden gebruikt voor embiyo-manipulatie en blastocyst-injectie. De blastocysten worden verkregen van 4-6 weken oude super-ovulerende vrouwtjes. De ES cellen worden getrypsiniseerd, en de gemodificeerde cellen worden in de blastocoel of blastocyste ingespoten. Na injectie 25 worden de blastocysten teruggeplaatst in de hoorn van de uterus van schijnzwangere vrouwtjes. Daarna laat men de vrouwtjes de zwangerschap voldragen en het resulterend nageslacht wordt op construct getest. Wanneer werd voorzien in een afwijkend fenotype van de blastocyste en de genetisch gemodificeerde cellen, dan kan het chimaere nageslacht makkelijk worden gedetecteerd.

•3 0 2 2 : , 21

De chimaere dieren worden op aanwezigheid van het gemodificeerde gen getest en men laat de mannetjes en vrouwtjes met de modificatie met elkaar paren voor de productie van homozygoot nageslacht. Als de veranderingen in het gen op enig punt in de ontwikkeling letaal zijn, dan kunnen de weefsels of organen als allogene of congene 5 transplantaten, of in in vitro worden gehandhaafd. De transgene dieren kunnen elk niet-humaan zoogdier zijn, zoals laboratorium dieren, huisdieren, etc. De transgene dieren kunnen worden gebruikt voor functioneel onderzoek, testen van geneesmiddelen, etc., b.v. om het effect van een kandidaat geneesmiddel op de aggrecanase activiteit te bepalen.

Ook wordt voorzoen in methoden voor het diagnosticeren van aandoeningen die 10 gebaseerd zijn op de waargenomen niveau's van een MPTS eiwit of op het niveau van de expressie van het gen in een belangwekkend biologisch monster., Zoals hier gebruikt omvat de term monsters biologische vloeistoffen als bloed, cerebrospinale vloeistof, traanvocht, speeksel, lymfe, dialyse vloeistof, en dergelijke, organen of van weefselkweek afkomstige vloeistoffen. De cellen kunnen worden gedissocieerd, in het geval van vaste weefsels, of er 15 kunnen weefselcoupes worden geanalyseerd. Als alternatief kan van de cellen een lysaat worden gemaakt.

Er zijn een aantal methoden beschikbaar voor het bepalen van het niveau van de expressie van een gen of eiwit in een bepaald monster. De diagnose op ontbreken of het voorkomen van veranderde hoeveelheden normaal of abnormaal MPTS in het monster van 20 een patiënt kan met een aantal methoden worden uitgevoerd. Bij de detectie kan bijvoorbeeld gebruik worden gemaakt van kleuring van de cellen of histologische coupes met gelabelde antilichamen, uitgevoerd volgens bestaande methoden. De cellen worden voor het kleuren van cytoplasmatische moleculen gepermeabiliseerd. De belangwekkende antilichamen worden aan het celmonster toegevoegd, en voor een tijdsduur die volstaat om 25 binding van de epitoop mogelijk te maken, gewoonlijk tenminste ongeveer 10 minuten, geïncubeerd. Het antilichaam kan met radio-isotopen, enzymen, fluorescenten, chemoluminescenten of andere labels voor directe detectie gelabeld worden. Als alternatief wordt een tweede antilichaam stap gebruikt om het signaal te amplificeren. Zulke reagentia zijn in de wetenschap bekend. Het primaire antilichaam kan bijvoorbeeld aan biotine zijn 22 geconjugeerd, waarbij aan mierikswortel peroxidase geconjugeerd avidine als reagens voor de tweede stap wordt toegevoegd. Als alternatief kan het tweede antilichaam geconjugeerd worden aan een fluorescerende verbinding, b.v. fluoresceïne, rhodamine, Texas red, etc. De uiteindelijke detectie vindt plaats met een substraat dat bij aanwezigheid van het peroxidase 5 een kleurverandering ondergaat. Het ontbreken of optreden van binding van het antilichaam kan met diverse methoden worden vastgesteld, waaronder flow-cytometrie van losse cellen, microscopie, radiografie, scintillatie telling, etc.

Als alternatief kan men zde aandacht richten op de expressie van het MPTS gen. Om vast te stellen of sequentie polymorfie in een MPTS coderend gebied of in controle gebieden 10 met een riekte geassocieerd is kan biochemisch onderzoek worden uitgevoerd. Met aandoeningen geassocieerde polymorfieën kunnen deletie of afknotting van het gen, mutaties die het niveau van de expressie beïnvloeden, die de activiteit van het eiwit beïnvloeden, etc. omvatten.

Veranderingen in de promotor of enhancer sequentie die de niveau's van de expressie 15 van MPTS beïnvloeden, kunnen op verschillende manieren die in de wetenschap bekend rijn worden vergeleken met de niveau's van expressie van het normale allel. Methoden voor het bepalen van de kracht van de promotor of enhancer omvatten de kwantificering van het tot expressie gebrachte natuurlijke eiwit; insertie van een variant van een controle element in en vector met een reporter gen als β-galactosidase, ludferase, chlooramfenicol, 20 acetyltransferase, etc. die een makkelijke kwantificering mogelijk maken, en dergelijke.

Voor het analyseren van nucleïnezuren op aanwezigheid van een specifieke sequentie, b.v. een met riekte geassocieerde polymorfie, staat een aantal methoden ter beschikking. Wanner men de beschikking heeft over grote hoeveelheden DNA beschikt, dan wordt genomischDNA direct gebruikt. Als alternatief wordt het belangwekkende gebied in een 25 geschikte vector gekloneerd en tot voor analyse voldoende hoeveelheden gegroeid. De cellen die een MPTS eiwit tot expressie brengen kunnen als bron van mRNA worden gebruikt, dat direct kan worden getest, of voor analyse revers kan worden afgeschreven tot cDNA. Het nucleïnezuur kan met conventionele technieken als de polymerase ketenreactie (PCR) worden geamplificeerd om voldoende hoeveelheden voor analyse te verkrijgen. Het 10 22 3 7) 23 gebruik van de polymerase ketenreactie wordt beschreven in Saiki et al. (1985), Science 239:487, en een overzicht van technieken kan worden gevonden in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory manual. CHS Press 1989, pag. 14.2-14.33. Als alternatief kent de wetenschap diverse methoden die gebruik maken van oligonucleotide ligatie als 5 middel voor de detectie van polymorfieën, zie bijvoorbeeld Riley et al (1990), Nucl. Acids Res. 18:2887-2890; en Delahunty et al. (1996), Am. J. Hum. Genet. 58:1239-1246.

In de amplificatiereactie kan ook een detecteerbaar label opgenomen worden.

Geschikte labels omvatten fluorochromen, b.v. fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), rhodamine, Texas Red, fyco-eiytrine, allofycocyanine, 6-carboxyfluoresceïne (6-FAM), 2',7'-10 dimethoxy-4',5'-dichloor-6-carboxyfluoresceïne (JOE), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 6-carboxy-2’,4',7',4,7,-hexachloorfluoreceïne (HEX), 5-carboxyfluoresceme (5-FAM) of N,N,N',N,-tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA), radio-actieve labels als b.v. 32P, 35S, 3H; etc. Het label kan deel uitmaken van een twee-staps systeem, waarbij het geamplificeerde DNA aan biotine, haptenen, etc. wordt geconjugeerd die een 15 bindingspartner met hoge affiniteit hebben, b.v. avidine, specifieke antilichamen, etc., waarbij de bindingspartner aan een detecteerbaar label geconjugeerd is. Het label kan aan één of aan beide primers geconjugeerd worden. Als alternatief wordt de pool nucleotiden die in de amplificatie wordt gebruikt, worden gelabeld, zodat het label in het amplificatieproduct wordt ingebouwd.

20 Het nucleïnezuur monster, b.v. het geamplificeerde of gekloneerde fragment, wordt met een van de in de wetenschap bekende methoden geanalyseerd. Het nucleïnezuur kan met de dideoxy-,of met een andere methode, worden gesequenst, en de basesequentie wordt met een wildtype gensequentie vergeleken. Ook kan hybridisatie door middel van Southern blots, dot blots, etc. met de variante sequentie worden gebruikt om de aanwezigheid ervan vast te 25 stellen. Het hybridisatiepatroon van een controle en een variante sequentie met gerangschikte oligonucleotide probes die op een vaste drager zijn geïmmobiliseerd, als beschreven in U.S. 5.445.934, of in WO 95/35505, kan ook als middel voor detectie van de aanwezigheid van varianten worden gebruikt. Er wordt enkelstrengs conformationele polymorfie (SSCP) analyse, denaturerende gradiënt gelelektroforese (DGGE) en : *^ 1 i' i 24 heteroduplex analyse in gel matrices gebruikt om conformationele veranderingen die in de DNA sequentie zijn aangebracht door de DNA sequentie variatie, te detecteren als verandering in de elektroforetische mobiliteit. Als alternatief kan men, wanneer een polymorfie een herkenningsplaats voor een restrictie-endonuclease creëert of vernietigt, het 5 monster met dat endonuclease digesteren en het product op grootte fractioneren, om vast te stellen of het fragment werd gedigesteerd. Fractionering wordt uitgevoerd door gel- of capillair elektroforese, in het bijzonder met acrylamide of agarose gelen.

Test op mutaties in het MPTS kunnen gebaseerd zijn op de functionele of antigene kenmerken van het eiwit. Eiwit afknottingsests zijn bruikbaar voor het detecteren van 10 deleties die van invloed zijn op de biologische activiteit van het eiwit. In de test kunnen verschillende immuuntests die ontworpen zijn voor detectie van polymorfieën in MPTS eiwitten worden gebruikt. Wanneer veel verschillende genetische mutaties aanleiding geven tot een bepaald ziek fenotype, dan is gebleken dat functionele eiwit tests een effectief testmiddel zijn. De activiteit van het gecodeerde MPTS eiwit kan door vergelijking met het 15 wildtype eiwit worden bepaald.

De diagnostische methoden van de onderhavige uitvinding waarin het niveau van de expressie van het MPTS gen waarin men belang stelt wordt bepaald, zal kenmerkend de vergelijking van de MPTS nuclemezuur abundantie in een monster waarin men belang stelt met dat van een controlewaarde met zich meebrengen, om relatieve verschillen te bepalen, 20 waarbij het verschil kwantitatief en/of kwalitatief kan worden bepaald, waarbij het verschil wordt gerelateerd aan de aanwezigheid of het ontbreken van een abnormaal MPTS gen expressiepatroon. De vakman zal bekend zijn met een diversiteit aan methoden voor het bepalen van de nucleïnezuur abundantie in een monster, waarbij bepaalde belangwekkende methoden diegenen omvatten die beschreven zijn in Pietu et al., Genome Res. (juni 1996) 6: 25 492-503; Zhao et al., Gene (24 april 1995)m 156:207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol.

(oktober 1997) 8:542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (november 1994) 32:125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (1 februari 1994) 216:299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol (december 1996) 6: 225-230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2:907; en 25

McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298. Ook van belang zij de methoden die worden beschreven in WO 97/27317, waarvan de beschrijving hier onder verwijzing is opgenomen.

De onderhavige polypeptiden vinden toepassing in diverse testmethoden die ontworpen zijn om therapeutische agentia te detecteren. Er kunnen in vitro tests worden 5 gebruikt waarin de activiteit van het MPTS polypeptide, b.v. de aggrecanase activiteit van een MPTS polypeptide, wordt bepaald in aanwezigheid van een kandidaat therapeutisch agens, en wordt vergeleken met een controle, d.i. de activiteit bij ontbreken van het kandidaat therapeutisch agens. De activiteit kan op een aantal verschillende manieren worden bepaald, waarbij de activiteit in het algemeen wordt bepaald als het vermogen 10 aggrecaan, of op zijn minst een fragment daarvan, te klieven, evenals een recombinant polypeptide dat de aggrecaan kliefjplaats bevat, als hierboven beschreven. Zulke tests worden beschreven in U.S. Patent No. 5.872.209 en WO 99/05921, evenals in Amer et al., J. Biol. Chem. (maart 1999) 274: 6594-6601.

In tests zijn ook niet-humane transgene dieren die functioneel MPTS tot expressie 15 brengen van belang, waarbij zulke dieren als hieiboven beschreven zijn. In veel uitvoeringen ontbreekt bij de dieren endogeen MPTS. Bij gebruik van zulke dieren voor toepassing in tests, wordt een testverbinding(en) aan het dier toegediend en worden de resulterende veranderingen in het fenotype, b.v. de aanwezigheid van aggrecaan dat wordt geproduceerd door klieving van de Glu373-Ala374 binding, vergeleken met een controle.

20 Als alternatief kan in in vitro modellen de bindingsactiviteit van MPTS en kandidaat MPTS-modulerende agentia worden bepaald.

In de tests kan een verscheidenheid aan andere reagentia worden opgenomen, afhankelijk van het specifieke testprotocol dat wordt gebruikt. Deze omvatten reagentia als zouten, natuurlijke eiwitten, b.v. albumine, detergentia, etc., die worden gebruikt om 25 optimale eiwit-eiwit binding en/of de reductie van niet-specifieke of achtergrond interacties te vergemakkelijken. Men kan reagentia die de efficiëntie van de test verbeteren, zoals protease-remmers, nuclease-remmers, anti-microbiële agentia etc., gebruiken.

1022371 26

Met de bovenstaande methoden kan een verscheidenheid aan verschillende kandidaat therapeutische agentia, die dienst doen als MPTS agonisten of antagonisten, worden getest. De kandidaat agentia omvatten vele chemische klassen, alhoewel ze typerend organische moleculen zijn, bij voorkeur kleine organische verbindingen met een molecuulgewicht van 5 meer dan 50, en minder dan ongeveer 2.500 dalton. Kandidaat agentia hebben functionele groepen die noodzakelijk zijn voor de structurele interactie met eiwitten, in het bijzonder waterstof-binding, en hebben kenmerkend tenminste een amine-, carbonyl-, hydroxyl- of carboxylgroep, bij voorkeur tenminste twee van de functionele chemische groepen. De kandidaat agentia omvatten vaak cyclische koolstof of heterocyclische structuren, en/of 10 aromatische of poly-aromatische structuren die gesubstitueerd zijn met één of meer van de bovenstaande functionele chemische groepen. Kandidaat agentia komen ook voor onder de biomoleculen, waaronder peptiden, sachariden, vetzuren, steroïden, purines, pyrimidines, en derivaten, structurele analogen, of combinaties daarvan.

De kandidaat agentia werden verkregen uit een breed scala aan bronnen, waaronder 15 banken van synthetische of natuurlijke verbindingen. Er zijn bijvoorbeeld middelen beschikbaar voor willekeurige en gerichte synthese van een breed scala aan organische verbindingen en bio-moleculen, waaronder het tot expressie brengen van gerandomiseerde oligonucleotiden en oligopeptiden. Als alternatief zijn banken natuurlijke verbindingen in de vorm van bacteriële, schimmel, planten en dieren extracten beschikbaar, of deze kunnen 20 makkelijk worden samengesteld. Bovendien kunnen natuurlijke of synthetisch geproduceerde banken en verbindingen makkelijk met conventionele chemische, fysische en biochemische middelen worden gemodificeerd, en worden gebruikt voor de productie van gecombineerde banken.. Op bekende farmacologische agentia kan gerichte of toevalsgewijze chemische modificatie als acylering, alkylering, verestering, amidificatie etc. worden 25 toegepast, voor de productie van structurele analogen.

In veel uitvoeringen zijn testmethoden die agentia identificeren die selectief moduleren, d.i. het onderhavige MPTS enzym, maar niet andere proteasen, remmen, in het bijzonder van belang.

" O ΐ li " 27

De nucleïnezuur samenstelling van de onderhavige uitvinding vinden ook toepassing als therapeutische als therapeutische agentia in situaties waarin men de MPTS activiteit van de gastheer wil versterken. De MPTS genen, gen fragmenten of gecodeerde eiwitten of eiwit fragmenten zijn bruikbaar in gentherapie voor de behandeling an aandoeningen die met 5 MPTS defecten geassocieerd zijn, waaronder aggrecanase defecten. Er kunnen expressievectoren worden gebruikt voor het inbrengen van het gen in een cel. Zulke vectoren hebben in het algemeen handzame restrictieplaatsen die vlakbij de promotor sequentie gelokaliseerd zijn, om de insertie van nucleïnezuur sequentie mogelijk te maken.

Er kunnen transcriptie cassettes worden gemaakt die een transcriptie initiatie gebied, het 10 doelwit gen of fragment daarvan, en een transcriptie terminatie gebied omvatten. De transcriptie cassette kan met een verscheidenheid aan vectoren worden ingebracht, b.v. plasmide; retrovirus, lentivirus; adenovirus, en dergelijke, waarbij de vectoren in staat kortdurend of stabiel in de cellen gehandhaafd te blijven, gewoonlijk voor een tijdsduur van tenminste ongeveer een dag, gebruikelijker is een tijdsduur van tenminste ongeveer 15 verscheidene dagen tot verscheidene weken.

Het gen of eiwit kan via een aantal routes in weefsels en gastheer cellen worden ingebracht, waaronder virale infectie, micro-injectie of fusie van blaasjes. Voor intramusculaire toediening kan ook jet-injectie worden gebruikt, als beschreven door Furth et al (1992), Anal. Biochem. 205:365-368. Het DNA kan op gouden micro-partikels 20 worden gecoat, en intradermaal door een partikel bombardement apparaat of een "genenpistool" worden toegediend, als in de literatuur beschreven (zie bijvoorbeeld, Tang et al (1992), Nature 356:152-154), waarbij gouden micro-projectielen met het DNA werden gecoat die daarna in huidcellen werden in-gebombardeerd.

De onderhavige uitvinding voorziet in methoden voor het moduleren van MPTS, en in 25 veel uitvoeringen van aggrecanase activiteit in de cel, waaronder methoden voor het verhogen van de MPTS activiteit (b.v. methoden voor versterking), evenals in methoden voor het reduceren of remmen van de MPTS activiteit, b.v. methoden voor het stoppen of beperken van de klieving van aggrecaan. In zulke methoden wordt een effectieve hoeveelheid van een modulerend agens met de cel in contact gebracht.

J

28

Er wordt ook voorzien in methoden voor het moduleren, waaronder het versterken en het remmen, van de MPTS activiteit in een gastheer. In zulke methoden wordt een effectieve hoeveelheid actief reagens dat de activiteit van een MPTS eiwit in vivo moduleert, b.v. een agens dat gewoonlijk de doelwit MPTS activiteit versterkt of remt, aan de gastheer 5 toegediend. Het actieve agens kan bestaan uit een verscheidenheid aan verschillende verbindingen, waaronder natuurlijk voorkomende of synthetische verbindingen met kleine moleculen, een antilichaam, fragment of derivaat daarvan, en een antisense verbinding, en dergelijke.

In het bijzonder van belang zijn in bepaalde uitvoeringen agentia die de MPTS 10 activiteit reduceren, waaronder agentia die de aggrecanase activiteit, b.v. aggrecaan-klieving, met tenminste een 10-voud, gewoonlijk tenminste ongeveer 20-voudig, en gebruikelijker is tenminste ongeveer 35-voudig, reduceren, als bepaald met de test die wordt beschreven in Amer et al (1999) supra. In veel uitvoeringen die in het bijzonder van belang zijn wordt het gebruik van verbindingen die de agrecanase activiteit met minstens een 100-15 voud reduceren, vergeleken met een controle.

Ook is het gebruik van agentia van belang die, terwijl ze zorg dragen voor een reductie van MPTS, waaronder de agrecanase activiteit, de activiteit van andere proteasen niet substantieel, als ze dat al doen, reduceren. Zo zijn de agentia in deze uitvoering selectieve remmers van MPTS. Een agens wordt geacht selectief te zijn indien het voor 20 bovengenoemde reductie in de aggrecanase activiteit zorgt, maar de activiteit van andere proteasen, of in ieder geval één protease, niet substantieel reduceert, waarbij met substantieel wordt bedoeld minder dan een 10-voudige reductie, gewoonlijk minder dan een 5-voudige reductie, en in veel gevallen minder dan een enkelvoudige reductie, waarbij de activiteit wordt bepaald als beschreven in Amer et al., (1999) supra 25 Van nature voorkomende, of synthetische verbindingen met kleine moleculen omvatten vele chemische klassen, alhoewel ze typerend organische moleculen zijn, bij voorkeur kleine organische verbindingen met een molecuulgewicht van meer dan 50, en minder dan ongeveer 2.500 dalton. Kandidaat agentia hebben functionele groepen die noodzakelijk zijn voor de structurele interactie met eiwitten, in het bijzonder waterstof- 29 binding, en hebben kenmerkend tenminste een amine-, carbonyl- hydroxyl- of carboxylgroep, bij voorkeur tenminste twee van de functionele chemische groepen. De kandidaat agentia omvatten vaak cyclische koolstof of heterocyclische structuren, en/of aromatische of poly-aromatische structuren die gesubstitueerd zijn met één of meer van de 5 bovenstaande functionele chemische groepen. Kandidaat agentia komen ook voor onder de biomoleculen, waaronder peptiden, sachariden, vetzuren, sterolden, purines, pyrimidines, en derivaten, structurele analogen, of combinaties daarvan.

Als actieve agentia zijn ook antilichamen van belang die het doelwit MPST, b.v. aggrecanase activiteit, in de gastheer zo niet remmen, dan toch reduceren. Geschikte 10 antilichamen worden verkregen door het immuniseren van een gastheer dier met peptiden die het geheel, of een deel van het doelwit eiwit omvatten, b.v. MPTS-15, MPTS-19, of MPTS-120. Geschikte gastheer dieren omvatten de muis, rat, schaap, geit, hamster, konijn, etc. De bron van het eiwit immunogeen kan de mui, mens, rat, aap, etc. zijn. Het gastheer dier zal in het algemeen van een andere species zijn dan het immunogeen, b.v. humaan MPTS wordt 15 gebruikt voor immunisatie van de muis, etc.

Het immunogeen kan het gehele eiwit betreffen, of fragmenten en derivaten daarvan. Immunogenen die de voorkeur hebben omvatten het geheel, of een deel van MPTS, waarbij de residuen die post-translationele modificaties als glycosilaties dragen, op het natieve doelwit eiwit worden gevonden. Immunogenen die het extra-cellulaire domein omvatten 20 worden op een verscheidenheid aan manieren die in de wetenschap bekend zijn geproduceerd, b.v. door expressie van gekloneerde genen met conventionele recombinant methoden, isolatie uit HEC, etc.

Voor de bereiding van polyldonale antilichamen is de eerste stap de immunisatie van het gastheer dier, waarbij het doelwit eiwit bij voorkeur in grotendeels zuivere vorm zal zijn, 25 met een verontreiniging van minder dan ongeveer 1%. Het immunogeen uit kan het gehele doelwit eiwit, fragmenten of derivaten daarvan bestaan. Om de immuunrespons van het gastheer dier te versterken kan het doelwit eiwit worden gecombineerd met een adjuvans, waarbij geschikte adjuvantia aluin, dextraan, sulfaat, grote polymere anionen, olie & water emulsies, b.v. Freund's adjuvant, Freund's complete adjuvant, en dergelijke omvatten. Het 1022371 30 doelwit eiwit kan ook aan synthetische drager-eiwitten of synthetische antigenen worden geconjugeerd. Voor de productie van polyklonale antilichamen kan een verscheidenheid aan gastheren worden geïmmuniseerd. Zulke gastheren omvatten konijnen, cavia's, knaagdieren, b.v. muizen, ratten, schapen, geiten, en dergelijke. Het doelwit eiwit wordt gewoonlijk 5 intradermaal aan de gastheer toegediend, gevolgd door één of meer, gewoonlijk tenminste twee, extra booster doseringen. Na immunisatie kan het bloed van de gastheer worden gewonnen, gevolgd door scheiding van serum en bloedcellen. Het in het resulterende antiserum aanwezige Ig moet verder worden geffactioneerd met methoden die bekend zijn, als ffactionering met ammoniumzout, DEAE chromatografie en dergelijke.

10 Monoklonale antilichamen worden met conventionele technieken bereid. In het algemeen vormen de milt, en/of lymfeknopen van een geïmmuniseerde gastheer de bron van plasmacellen. Voor productie van hybridoma cellen worden de plasmacellen geïmmortaliseerd door fusie met myeloma cellen, De kweeksupematant van afzonderlijke hybridoma's wordt met standaard technieken getest, om diegenen te identificeren die 15 antilichamen produceren met de gewenste specificiteit. Geschikte dieren voor de productie van monoklonale antilichamen tegen het humane eiwit omvatten de muis, rat, cavia, etc. Om antilichamen op te wekken tegen het muizen eiwit, zal het dier over het algemeen een hamster, cavia konijn etc. zijn. Het antilichaam kan met conventionele technieken uit de kweeksupematanten of ascites vloeistof worden opgezuiverd, b.v. met 20 aifiniteitschromatografie met aan een onoplosbare drager gebonden MPTS, proteïne A sepharose, etc. Het is derhalve een doel van de uitvinding te voorzien in monoklonale antilichamen die specifiek aan MPTS eiwitten van de onderhavige uitvinding binden, meer in het bijzonder de antilichamen die de aggrecanase activiteit remmen, en de antilichamen die humaan, of gehumaniseerd zijn.

25 Het antilichaam kan, in plaats van de gebruikelijke multimere structuur, als enkele keten worden geproduceerd. Enkel-ketenige antilichamen worden beschreven in Jost et al. (1994) J.B.C. 269:26267-73., en andere. De DNA sequenties die coderen voor het variabele gebied van de zware keten en voor het variabele gebied van de lichte keten worden geligeerd aan een spacer die codeert voor tenminste ongeveer 4 aminozuren van kleine neutrale 31 aminozuren, waaronder glycine en/of serine. Het eiwit dat door deze fusie wordt gecodeerd maakt assemblage mogelijk van een functioneel variabel gebied dat de specificiteit en affiniteit van het oorspronkelijke antilichaam behouden heeft.

Voor in vitro gebruik, in het bijzonder voor injectie in de mens, is het wenselijk de 5 antigeniteit van het antilichaam te verminderen. Een immuunrespons van een recipiënt tegen het blokkerend agens zal potentieel de tijdsduur dat de therapie effectief is bekorten. De methoden voor het humaniseren van antilichamen zijn in de wetenschap bekend. Het gehumaniseerde antilichaam kan het product zijn van een dier met transgene humane immuunglobuline constant gebied genen (zie bijvoorbeeld WO 90/10077 en WO 90/04036).

10 Als alternatief kan het belangwekkende antilichaam met recombinant DNA technieken worden gemanipuleerd om de CH1, CH2,CH3, schanier domeinen en/of het framework domein met de corresponderende humane sequenties te substitueren (zie WO 92/02190).

Het gebruik van Ig cDNA voor de constructie van chimaere immuunglobuline genen is in de wetenschap bekend (Liu et al (1987) P.N.A.S. 84:3439 en (1987) J, Immunol.

15 139:3521). Uit een hybridoma of andere cel die het antilichaam produceert wordt mRNA

geïsoleerd en voor de productie van cDNA gébruikt. Het betreffende cDNA kan met de polymerase ketenreactie met specifieke primers worden geamplificeerd (U.S. Patent Nos 4.683.195 en 4.683.202). Als alternatief wordt een genenbank geconstrueerd en getest op de belangwekkende sequentie. De sequenties van humane constant gebied genen kan worden 20 teruggevonden in Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloaical Interest.

N.I.H. publicatie no. 91-3242. Genen voor het humane C gebied zijn makkelijk uit klonen te verkrijgen. De keus van het iso-type zal worden bepaald door de gewenste effector functies, zoals complement fixatie of activiteit in antilichaam-afhankelijke cellulaire cyto-toxiciteit. Isotypen die de voorkeur hebben zijn IgGl, IgG3 en IgG4. Van de humane lichte keten 25 constante gebieden kan en het kappa of lambda worden gebruikt. Het chimaere, gehumaniseerde antilichaam wordt daarna met conventionele methoden tot expressie gebracht.

In nog andere uitvoeringen kunnen de antilichamen volledig humane antilichamen zijn. Er kunnen bijvoorbeeld xenogene antilichamen die identiek zijn aan de humane antilichamen 32 worden gebruikt. Met xenogene antilichamen worden antifichamen bedoeld die overeenkomen met humane antilichamen, d.w.z. het zijn geheel humane antilichamen, behalve dat ze worden geproduceerd in een niet-humane gastheer die genetisch gemanipuleerd is tot expressie van humane antilichamen, b.v. WO 98/50433; WO 98/24893 5 en WO 99/53049.

Antilichaam fragmenten als Fv, F(ab')2 en Fab kunnen worden bereid door klieving van het intacte eiwit b.v. door een protease of door chemische klieving. Een chimaer gen dat codeert voor een del van het F(ab')2 fragment zou bijvoorbeeld DNA sequenties omvatten die coderen voor het CH1 domein en schaniergebied van de H keten, gevolgd door een 10 translatie stopcodon, wat het afgeknotte molecuul oplevert.

Voor de constructie van oligonucleotiden voor gebruik als primers voor introductie van nuttige restrictieplaatsen in het J gebied, voor navolgende koppeling van V gebied segmenten aan de humane C gebied segmenten kunnen de consensus sequenties van H en J gebieden worden gebruikt. C gebied DNA kan door middel van plaastgerichte mutagenese 15 worden gemodificeerd om een restrictieplaats te maken op de analoge positie in de humane sequentie.

Expressievectoren omvatten plasmiden, retrovirussen, YAC's, van EBV afkomstige episomen, en dergelijke. Een handzame vector is er een die codeert voor een functionele complete humaan CH of CL immuunglobuline sequentie, met de juiste restrictieplaatsen 20 zodanig gemanipuleerd dat elke VH of VL sequentie makkelijk kan worden ingebracht en tot expressie kan worden gebracht. In zulke vectoren vindt splicing gewoonlijk plaats tussen de splice donorplaats in het ingebrachte J gebied, en de splice acceptorplaats die vooraf gaat aan het humane C gebied, en ook op de splice gebieden die binnen de humane CH exonen voorkomen. Poly-adenylatie en transcriptie terminatie vinden plaats op natieve 25 chromosomale plaatsen stroomafwaarts van het coderende gebieden. Het resulterende chimaere antilichaam kan aan een sterke promotor worden gekoppeld, waaronder de retrovirale LTR's, b.v. de SV-40 vroege promotor (Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280), Rous sarcoom virus LTR (Gorman el al. (1982) P.N.A.S. 79:6777), en moloney 33 muizen myeloma leukemie virus LTR (Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885): natieve Ig promotors, etc.

In nog andere uitvoeringen van de uitvinding is het actieve agens een agens dat de expressie van het gen dat codeert voor het doelwit eiwit in de gastheer moduleert, en in het 5 algemeen down-reguleert. Er kunnen bijvoorbeeld antisense moleculen worden gebruikt om de expressie van MPTS in cellen down te reguleren. Het antisense reagens kan bestaan uit antisense oligonucleotiden (ODN), in het bijzonder synthetische ODN, met chemische modificaties van natieve nucléïnezuren, of nucleïnezuur constructen die zulk een antisense molecuul als RNA tot expressie brengen. De antisense sequentie is complementair met het 10 mRNA van het doelwit gen, en remt de expressie van de doelwit genproducten. Antisense moleculen remmen de genexpressie door diverse mechanismen, b.v. door het reduceren van de voor translatie beschikbare hoeveelheid mRNA, door activering van RNAse H, of door sterische hindering. Er kan één, of een combinatie van antisense moleculen worden toegediend, waarbij een combinatie meerdere verschillende sequenties kan omvatten.

15 Antisense moleculen kunnen worden geproduceerd door expressie van het geheel, of van een deel van de doelwit gen sequentie in een toepasselijke vector, waarbij de translatie oriëntatie zo is georiënteerd dat een antisense streng als RNA molecuul wordt geproduceerd. Als alternatief kan het antisense molecuul een synthetisch oligonucleotide zijn. Antisense oligonucleotiden zullen in het algemeen tenminste ongeveer 7, gewoonlijk 20 tenminste ongeveer 12, gebruikelijker is tenminste ongeveer 20 nucleotiden in lengte zijn, en niet meer dan ongeveer 500, gewoonlijk niet meer dan ongeveer 50, en gebruikelijker niet meer dan 35 nucleotiden in lengte zijn, waarbij de lengte afhankelijk is van de efficiëntie van de remming, specificiteit, waaronder het ontbreken van kruis-reactiviteit, en dergelijke. Er werd gevonden dat korte oligonucleotiden van 7 tot 8 basen in lengte sterke en selectieve 25 remmers zijn van de genexpressie (zie Wagner et al. (1996), Natural Biotechnol. 14:840-844).

Er wordt een specifiek gebied van de endogene sense streng mRNA sequentie gekozen om te worden gecomplementeerd door de antisense sequentie. Voor de selectie van een specifieke sequentie voor het oligonucleotide kan men een empirische methode

; Kf c t- o ƒ I

34 gebruiken, waarbij diverse kandidaat sequenties op remming van de expressie van het doelwit gen in een in vitro of diermodel worden getest. Ook kan een combinatie van sequenties worden gebruikt, waarbij voor antisense compiementering diverse gebieden van de mRNA sequentie worden gekozen.

5 Antisense oligonucleotiden kunnen chemisch worden gesynthetiseerd met methoden die in de wetenschap bekend zijn (zie Wagner et al (1993), supra, en Milligan et ai, supra.). Oligonucleotiden die de voorkeur hebben worden van de natieve fosfodiëster structuur chemisch gemodificeerd, om hun intra-cellulaire stabiliteit en bindingsafimiteit te verhogen. In de literatuur werd een aantal van zulke modificaties die de chemie van het skelet, de 10 suikers of de heterocyclische basen veranderen beschreven.

Bruikbare veranderingen in de chemie van het skelet zijn fosforthioaten; fosfordithioaten, waarbij beide niet-brugvormende zuurstoffen vervangen zijn door zwavel; fosforamidieten; alkyfosfotriësters en boraanfosfaten. A-chirale fosfaat derivaten omvatten 3'-0'-5'-S-fosforthioaat, 3'-S-5'-0-fosforthioaat, 3'-CH2-5'-0-fosfonaat en 3'-NH-5'-0-15 fosforamidaat. Peptide nucleïnezuren vervangen het totale ribose fosfodiëster skelet door een peptide binding. Ook worden suiker modificaties toegepast om de stabiliteit en affiniteit te verbeteren. De tt-anomeer van deoxyribose kan worden gebruikt, waarbij de base met betrekking tot de natuurlijke β -anomeer is omgedraaid. De 2'-OH van de ribose suiker kan worden veranderd om 2-O-methyl of 2-O-allyl suikers te vormen, wat resistentie oplevert 20 tegen afbraak, zonder de affiniteit te beïnvloeden. Bij modificaties van de heterocyclische basen moet de juiste baseparing behouden blijven. Bruikbare substituties omvatten deoxyuridine voor deoxythymidine; 5-methyl-2'-deoxycitidine en 5-broom-2'-deoxycytidine voor deoxycytidine. Van 5-propynyl-2'-deoxyuridine en 5-propynyl-2'-deoxycytidine werd aangetoond dat ze de affiniteit en biologische activiteit bij substitutie voor respectievelijk 25 deoxythymidine en deoxycytidine, doen toenemen.

Als alternatief voor anti-sense remmers kunnen katalytische nucleïnezuur verbindingen, b.v. ribozymen, antisense conjugaten, etc. worden gebruikt om de genexpressie te remmen. Ribozymen kunnen in vitro worden gesynthetiseerd en aan de patiënt worden toegediend, of kunnen worden gecodeerd op een expressievector waarvan i 7 ΐ 35 het ribozym in de doelwit cel wordt gesynthetiseerd (zie bijvoorbeeld International patent application WO 9523225, en Beigelman et al. (1995). Nucl Acids Res. 23:4434-42) Voorbeelden van oligonucleotiden met katalytische activiteit worden beschreven in WO 9506764. Conjugaten van antisense ODN met een metaalcomplex, b.v. terpyridyl Cu (II), 5 dat in staat is mRNA hydrolyse te mediëren, worden beschreven in Bashkine et al. (1995), Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56.

Het is derhalve een doel van de uitvinding om te voorzien in een methode voor het moduleren van de activiteit van het MPTS in een gastheer, waarbij genoemde methode omvat: het toedienen van een werkzame hoeveelheid van een MPTS-modulerend agens aan 10 genoemde gastheer, en specifieker, zulk een methode waarin genoemd modulerend agens een klein molecuul is, een antilichaam, of een nucleïnezuur.

Zoals hierboven reeds vermeld, wordt een werkzame hoeveelheid van het actieve agens aan de gastheer toegediend, waarbij "werkzame hoeveelheid" een dosering betekend die volstaat om een gewenst resultaat te behalen. In het algemeen is het gewenste resultaat 15 tenminste een versterking of reductie in MPTS, b.v. aggrecanase, activiteit, als bepaald aan de hand van de productie van aggrecaan klievingsproduct, in vergelijking met een controle.

In de onderhavige methoden kan het actieve agens (agentia) met elk handzaam middel dat in staat is als resultaat de gewenste modulatie van MPTS activiteit, b.v. de gewenste reductie in de productie van aggrecaan klievingsproduct te bewerkstelligen, worden 20 gebruikt. Het agens kan voor therapeutische toediening in een verscheidenheid aan formuleringen worden opgenomen. Meer in het bijzonder kunnen de agentia van de onderhavige uitvinding in farmaceutische samenstellingen worden geformuleerd door combinatie met de juiste farmaceutisch aanvaardbare dragers of verdunmiddelen, en kunnen in preparaten als vaste, semi-vaste, vloeibare of gasvormige vormen als tabletten, capsules, 25 poeders, granules, zalven, oplossingen, suppositoria, injecties, inhalatiemiddelen en aërosolen worden geformuleerd.

De toediening van de agentia als zodanig kan via diverse wegen plaatsvinden, waaronder orale, buccale, rectale, parenterale, intraperitoneale, intradermale, transdermale, intracheale, etc. toediening.

'· , · 36

In farmaceutische doseervormen kunnen de agentia worden toegediend in de vorm van hun farmaceutisch aanvaardbare zouten, of ze kunnen afzonderlijk, of in de juiste associatie, evenals in combinatie met andere farmaceutisch actieve verbindingen worden toegediend.

Voor orale preparaten kunnen de agentia afzonderlijk, of in combinatie met 5 toepasseli jke additieven voor het maken van tabletten, poeders, granules of capsules worden gebruikt, bijvoorbeeld met conventionele additieven als lactose, mannitol, maïs zetmeel, of aardappel zetmeel; met bindmiddelen als kristallijne cellulose, cellulose derivaten, acacia, maïs zetmeel of gelatines; met desintegrantia als maïs zetmeel, aardappel zetmeel of natriumcarboxymethylcellulose; met smeermiddelen als talk, magnesiumstearaat; en, indien 10 gewenst, verdunmiddelen, bufferende agentia, bevochtigers, preserveermiddelen en smaakstoffen.

De agentia kunnen voor injectie worden geformuleerd door ze op te lossen, suspenderen of emulgeren in een waterig of niet-waterig oplosmiddel als plantaardige of gelijkwaardige oliën, synthetische alifatische glyceriden, esters of hogere alifatische zuren of 15 propyleenglycol; en, indien gewenst, met conventionele additieven als solubiliseermiddelen, isotone agentia, suspenderende agentia, emulgerende agentia, stabilisatoren en preserveermiddelen.

De agentia kunnen in een aërosol formulering worden toegediend door inhalatie. De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen in onder druk staande drijfmiddelen als 20 dichloordifluormethaan, propaan, stikstof en dergelijke worden geformuleerd.

Bovendien kunnen van de agentia suppositoria worden gemaakt door deze te mengen met een emulgerende basis of water-oplosbare basis. De verbindingen van de onderhavige uitvinding kunnen rectaal in de vorm van een supposïtorium worden toegediend. Het suppositorium kan vehiculae als cacaoboter, carbo-wassen en polyethyleenglycolen 25 omvatten die bij lichaamstemperatuur smelten, maar op kamertemperatuur vast zijn..

Er kan worden voorzien in eenheid doseervormen voor orale en rectale toediening, zoals siropen, elixers en suspensies, waarbij elke doseer eenheid, bijvoorbeeld een theelepel, eetlepel, tablet of suppositorium een vooraf bepaalde hoeveelheid van de samenstelling bevat die één of meer remmers bevat. Op dezelfde wijze kunnen doseervormen voor injectie of 1 0 2 2 3 71 37 intraveneuze toediening de remmers bevatten in een samenstelling als een oplossing in steriel water, fysiologisch zout of een andere farmaceutisch aanvaardbare drager.

De term "eenheid doseervorm" verwijst, zoals hier gebruikt, naar fysiek discrete eenheden die geschikt zijn als eenheidsdosering voor de menselijke en dierlijke individuen, 5 waarbij elke eenheid een vooraf bepaalde hoeveelheid van de verbindingen van de onderhavige uitvinding bevat die is berekend in een hoeveelheid die voldoende is om het gewenste effect te produceren, samen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunmiddel, drager of vehiculum. De specificaties voor de nieuwe eenheid doseervorm van de onderhavige uitvinding is afhankelijk van de specifiek gebruikte verbinding en het effect dat 10 men wil bereiken, en de farmaco-dynamica die met elke verbinding in de gastheer geassocieerd is.

Voor het publiek zijn farmaceutisch aanvaardbare exdpiëntia als vehiculae, adjuvantia, dragers of verdunmiddelen makkelijk te verkrijgen. Bovendien zijn voor het publiek farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen als pH bijstellende en bufferende agentia, tonïciteit 15 bijstellende agentia, stabilisatoren, bevochtigers en degelijke, makkelijk te verkrijgen.

Wanneer het agens een polypeptide, polynucleotide, analoog of mimeticum daarvan is, b.v. een anti-sense samenstelling, kan het in weefsels of gastheer cellen worden ingebracht via een aantal routes, onder andere door virale infectie, micro-injectie of fusie van blaasjes. Voor intramusculaire toediening kan ook jet-injectie worden gebruikt, als beschreven door 20 Furth et al. (1992), Anal. Biochem. 205:365-368. Het DNA kan op gouden micropartikels worden gecoat en intradermaal worden toegediend met een partikel bombardeer apparaat, of "genenpistool", als in de literatuur beschreven (zie bijvoorbeeld Tang et al. (1992), Nature 356:152-154), waarbij gouden micro-projectiele met therapeutisch DNA worden gecoat, en daarna in cellen van de huid worden gebombardeerd.

25 Het zal de vakman duidelijk zijn dat de hoogte van de dosis kan variëren als functie van de specifieke verbinding, ernst van de symptomen en de gevoeligheid van het individu voor bijverschijnselen. Doseringen die de voorkeur hebben voor een gegeven verbinding kunnen door de vakman met een verscheidenheid aan middelen makkelijk worden bepaald.

1 ···< A O i l 38

De onderhavige methoden vinden toepassing in de behandeling van een verscheidenheid aan aandoeningen waarbij MPTS activiteit betrokken is, waaronder aandoeningen waarbij de aggrecanase activiteit betrokken is. In het bijzonder van belang is de toepassing van de onderhavige methoden bij de behandeling van aandoeningen die 5 worden gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, in het bijzonder de 60 kDa aggrecaan klievingsproducten met een ARGS N-terminus. Specifieke ziekten die worden gekenmerkt door de aanwezigheid van zulke methoden omvatten: reumatoïde artritis, osteo-artritis, infectueuze artritis, jichtige artritis, psoriatische artritis, spondolysis, sportletsel, trauma aan gewrichten, longziekten, fibrose, en dergelijke.

10 Met behandeling wordt bedoeld dat er tenminste verlichting optreed van de symptomen die geassocieerd zijn met de pathologische toestand waarmee de patiënt behept is, waarbij verlichting in brede betekenis wordt gebruikt om te verwijzen naar tenminste een reductie in de magnitude van een parameter, b.v. een symptoom dat geassocieerd is met de pathologische staat die wordt behandeld, zoals hyperfosfatemie. Behandeling omvat als 15 zodanig situaties waarbij de pathologische conditie, of tenminste de daarmee geassocieerde symptomen, geheel worden geremd, b.v. dat wordt voorkomen dat ze optreden, of worden gestopt, b.v. beëindigd, zodat de gastheer niet langer aan de pathologische conditie, of tenminste aan de voor de pathologische conditie kenmerkende symptomen, lijdt.

Met de onderhavige methoden is een verscheidenheid aan gastheren te behandelen. In 20 het algemeen zijn zulke gastheren "zoogdieren" of "zoogdierachtig", waarbij deze termen breed worden gebruikt om organismen te beschrijven die binnen de klasse van de mammalia vallen, inclusief de orden der carnivoren (b.v. honden en katten), knaagdieren (b.v. de muizen cavia's en raten) en primaten (b.v. de mens, chimpansees en apen). In veel uitvoeringen zullen de gastheren mensen zijn.

25 Er wordt voorzien in sets met eenheidsdoses van het actieve agens, gewoonlijk in orale of injecteerbare doses. In zulke sets zal, behalve de houders die de eenheidsdoses bevatten, een bijsluiter worden opgenomen die het gebruik en de voordelen van het geneesmiddel in de behandeling van het belangwekkende ziektebeeld beschrijven. De verbindingen en eenheidsdoses die de voorkeur hebben zijn als hierboven werd beschreven.

39

Tenslotte is doel van de onderhavige uitvinding: (i) Een testmethode voor de identificatie van MPTS-modulerende agentia, waarbij genoemde methode omvat: het in contact brengen van MPTS eiwitten als hierin gedefinieerd, met een substraat, in 5 aanwezigheid van een potentieel modulerend agens; en het bepalen van het effect van genoemd modulerend agens op de activiteit van genoemd eiwit.

(ii) De methode als gedefinieerd in (i), waarbij genoemd substraat een glu-ala binding bevat.

10 (iii) De methode als gedefinieerd in (ii), waarbij genoemd substraat aggrecaan of een fragment daarvan is.

Bovendien is een doel van de uitvinding een methode voor het behandelen van een gastheer die lijdt aan een ziektebeeld dat geassocieerd is met de activiteit van MPTS, 15 specifiek het ziektebeeld dat wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan. klievingsprpducten, waarbij genoemde methode omvat: het toedienen aan genoemde gastheer van een MPTS-moduIerend agens, specifiek een antagonist, en het gebruik van een MPTS-modulerend agens, dat verkrijgbaar is, of werd verkregen, met de methode die hier werd beschreven voor het bereiden van een medicament 20 voor de behandeling van en ziektebeeld dat geassocieerd in met MPTS activiteit specifiek daar waar genoemd ziektebeeld wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, als artritis.

Voorbeelden 25 Voorbeeld 1

Er werd een gerangschikt nucleïnezuur met 699 bekende metallo-proteïnase genen en nieuwe EST's die in openbaar en commerciële databanken beschikbaar zijn geconstrueerd. Deze sequenties op de rangschikking werden geselecteerd door een zoekactie met een begin-set bekende metallo-protease eiwit sequenties van alle species. Deze eiwit sequenties i n 9 o 7 i 'J λ. L O ƒ 6 40 werden gebruikt om overeenkomende sequenties te vinden in humane nucleotide op het eiwit (codon) niveau. Overbodige sequenties werden geëlimineerd en de overblijvende sequenties werden geassembleerd en geclusterd, en de unieke reeks van 699 sequenties werd gerangschikt.

5 De resulterende rangschikking werd gebruikt om in primaire kweken van chondrocyten tot expressie gebrachte genen te testen. Er werd een redelijk aantal metallo-proteïnasen, waarvan bekend was dat ze door deze cellen tot expressie werden gebracht, geïdentificeerd. Ook werd echter een aantal EST's voor nieuwe eiwitten geïdentificeerd. Met deze EST's werden daarna bij onderzoek van databanken en in PCR protocollen, vier 10 verschillende MPTS eiwitten geïdentificeerd, d.i. MPTS15, MPTS10, MPTS19, MPTS20.

Voorbeeld 2

Expressie van MPTS-10

Het COS-7 zoogdiercel systeem is een voorbeeld van een systeem voor het tot 15 expressie brengen van mpts-10. De nucleotide sequentie die codeert voor mpts-10, inclusief de secretie signaalsequentie, werd in een pcDNA3.1 plasmide (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) geligeerd. Van het resulterende plasmide werd 2 microgram gecombineerd met lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Daarna werd het mengsel toegevoegd aan COS-7 cellen die in 6-well platen tot een dichtheid van ongeveer 90% 20 confluentie waren gegroeid. Na 6 uur werd aan de cellen vers medium toegevoegd, en na 24 uur werden de cellen gespoeld en werd vers, serum-vrij medium mer runder aggrecaan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) toegevoegd. De cellen werden nog 48 uur geïncubeerd. Uit elke well werd 500 microliter cultuur vloeistof genomen en 10-voudig geconcentreerd. Er werd twee microliter chondroïtinase ABC en keratinase (10u/ml, Sigma, St. Louis, MO, 25 USA) aan de monsters toegevoegd, en er werd overnacht op 37°C geïncubeerd. De monsters werden in SDS-PAGE loadingbuffer gekookt, geëlektroforeerd op een polyacrylamide gel, en overgebracht naar een PVDF membraan. Er werd een Western blot met een antiserum tegen een neo-epitoop die werd gegenereerd door klieving van aggrecaan door aggrecanase, uitgevoerd.

(i i» 41

Een ander voorbeeld van een systeem voor expressie van mpts-10 is het baculovirus expressie systeem. De DNA sequentie die de coderende sequentie voor mpts-10 bevatte (inclusief de sequenties die coderen voor de secretie signaalsequentie) en die in de pcDNA3.1 vector was gekloneerd, werd door middel van PCR zodanig gemodificeerd dat 5 de coderende sequentie en het translatie stopcodon werden geflankeerd door Not-1 (N-terminale zijde) en Sfi-1 (C-terminale zijde). De voor het N-terminale uiteinde gebruikte primer was GATCGCGGCCGCTATGGTGGACACGTGGCCTCTATGGCTCC, en de primer die voor het C-terminale uiteinde werd gebruikt was TGAGGCCTTCAGGGCCGATCACTGTGCAGAGCACTCACCCCAT Na 10 amplificatie met standaard PCR methoden werd het fragment gedigesteerd met Not 1 en Sfc-1. Het gedigesteerde fragment werd in vector pVL1392-U, die ook met Not 1 en Sfi-1 was gedigesteerd, geligeerd. PVL1392-U is een derivaat van het baculovirale overdracht plasmide pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA) waarin de meervoudige kloneerplaats zodanig was gemodificeerd dat ze Not-1 en Sfi-1 bevatte. De overhangende 15 uiteinden die door digestie met Not 1 en Sfi 1 waren gegenereerd, waren complementair met de overhangende uiteinden van met Not 1 en Sfi 1 gedigesteerd PCR geamplificeerd DNA. Het geligeerde DNA werd overgebracht naar bacteriecellen en er werd een kloon geselecteerd die het plasmide en de correcte mpts-10 sequentie bevatte. Het plasmide werd geproduceerd en gezuiverd. De mpts-10 sequentie werd met standaard technieken 20 (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual van David O'Reilly, Lois Miller en

Verne Luckow, W.H. Freeman and Co., New York, USA) overgebracht naar een baculovirus vector. Uit het vims preparaat werden vijf plaques gezuiverde virus preparaten bereid. In suspensie groeiende Sf9 cellen werden met elk van de plaque-gezuiverde virus preparaten geïnfecteerd, met een multiplidteit van 0,5. Drie dagen na infectie werd de 25 cultuurvloeistof geoogst. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma,

St. Louis, MO, USA)op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een / J'·· 42 antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

Een andere methode voor het tot expressie brengen van mpts-10 was het drosophila expressiesysteem. Het DNA fragment dat de sequenties die codeerden voor het mpts-10, 5 geflankeerd door Not-1 en Sfi-1 die door middel van PCR (zie hierboven) waren gegenereerd, bevatte, werd in plasmide Cmk 33 gekloneerd. Cmk33 is een plasmide dat is afgeleid van pMK33/pMtHy (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64), zodanig dat Not-1 en Sfi-1 ach op de kloneerplaats bevinden. De overhangende uiteinden die door digestie van dit plasmide waren ontstaan, zijn compatibel met de overhangende uiteinden die waren 10 ontstaan in het gedigesteerde DNA dat het mpts-10 fragment bevatte (zie hierboven). Een plasmide dat de correcte sequentie van mpts-10 bevatte werd geamplificeerd en gezuiverd. Met standaard technieken (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64) werden Drosophila (S2) cellen met het plasmide getransformeerd. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA) op aggrecanase activiteit getest bij een 15 concentratie van 0,1 mg/ml. De kweekvloeistof werd 2 dagen na infectie gewonnen. De monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

20

Voorbeeld 3

Expressie van MPTS-15

Het COS-7 zoogdiercel systeem is een voorbeeld van een systeem voor het tot expressie brengen van mpts-15. De nucleotide sequentie die codeert voor mpts-15, inclusief 25 de secretie signaalsequentie, werd in een pcDNA3.1 plasmide (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) geligeerd. Van het resulterende plasmide werd 2 microgram gecombineerd met lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Daarna werd het mengsel toegevoegd aan COS-7 cellen die in 6-welI platen tot een dichtheid van ongeveer 90% confluentie waren gegroeid. Na 6 uur werd aan de cellen vers medium toegevoegd, en na 24 1 022 3 71 43 uur werden de cellen gespoeld en werd vers, serum-vrij medium mer runder aggrccaan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) toegevoegd. De cellen werden nog 48 uur geïncubeerd. Uit elke well werd 500 microliter cultuur vloeistof genomen en 10-voudig geconcentreerd. Er werd twee microliter chondroïtinase ABC en keratinase (10u/ml, Sigma, St. Louis, MO, 5 USA) aan de monsters toegevoegd, en er werd overnacht op 37°C geïncubeerd. De monsters werden in SDS-PAGE loadingbuffer gekookt, geëlektroforeerd op een polyacrylamide gel, en overgebracht naar een PVDF membraan. Er werd een Western blot met een antiserum tegen een neo-epitoop die werd gegenereerd bij klieving van aggrccaan door aggrecanase, uitgevoerd.

10 Een ander voorbeeld van een systeem voor expressie van mpts-15 is het baculovirus expressie systeem. De DNA sequentie die de coderende sequentie voor mpts-15 bevatte (inclusief de sequenties die coderen voor de secretie signaalsequentie) en die in de pcDNA3.1 vector was gekloneerd, werd door middel van PCR zodanig gemodificeerd dat de coderende sequentie en het translatie stopcodon werden geflankeerd door Not-1 (N-15 terminale zijde) en Sfi-1 (C-terminale zijde). De voor het N-terminale uiteinde gebruikte primer was GATCGCGGCCGCTATGGAAATTTTGTGGAAGACGTTG, en de primer die voor het C-terminale uiteinde werd gebruikt was TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTTAAAGCAAAGTTTCTTTTGGT. Na amplificatie met standaard PCR methoden werd het fragment gedïgesteerd met Not 1 en Sfc-1. Het 20 gedigesteerde fragment werd in vector pVL1392-U, die ook met Not 1 en Sfi-1 was gedigesteerd, geligeerd. PVL1392-U is een derivaat van het baculovirale overdracht plasmide pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA) waarin de meervoudige kloneerplaats zodanig was gemodificeerd dat ze Not-1 en Sfi-1 bevatte. De overhangende uiteinden die door digestie met Not 1 en Sfi 1 waren gegenereerd, waren complementair met 25 de overhangende uiteinden van met Not 1 en Sfi 1 gedigesteerd PCR geamplificeerd DNA. Het geligeerde DNA werd overgebracht naar bacteriecellen en er werd een kloon geselecteerd die het plasmide en de correcte mpts-15 sequentie bevatte. Het plasmide werd geproduceerd en gezuiverd. De mpts-15 sequentie werd met standaard technieken (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual van David O'Reilly, Lois Miller en ' ; i' . I [ 44

Veme Luckow, W.H. Freeman and Co., New York, USA) overgebracht naar een baculovirus vector. Uit het virus preparaat werden vijf plaques gezuiverde virus preparaten bereid. In suspensie groeiende Sf9 cellen werden met elk van de plaque-gezuiverde virus preparaten geïnfecteerd, met een multipliciteit van 0,5. Drie dagen na infectie werd de 5 cultuurvloeistof geoogst. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA)op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan 10 door agrecanase, getest.

Een andere methode voor het tot expressie brengen van mpts-15 was het drosophila expressiesysteem. Het DNA fragment dat de sequenties die codeerden voor het mpts-15, geflankeerd door Not-1 en Sfi-1 die door middel van PCR (zie hierboven) waren gegenereerd, bevatte, werd in plasmide Cmk 33 gekloneerd. Cmk33 is een plasmide dat is 15 afgeleid van pMK33/pMtHy (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64), zodanig dat Not-1 en Sfi-1 zich op de kloneerplaats bevinden. De overhangende uiteinden die door digestie van dit plasmide waren ontstaan, zijn compatibel met de overhangende uiteinden die waren ontstaan in het gedigesteerde DNA dat het mpts-15 fragment bevatte (zie hierboven). Een plasmide dat de correcte sequentie van mpts-15 bevatte werd geamplificeerd en gezuiverd. 20 Met standaard technieken (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64) werden Drosophila (S2) cellen met het plasmide getransformeerd. De kweekvloeistof werd 2 dagen na infectie gewonnen De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA) op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC ai keratinase (10 u/ml). 25 Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

i! . ·- · .

II \ j / 45

Voorbeeld 4

Expressie van MPTS-19

Het COS-7 zoogdiercel systeem is een voorbeeld van een systeem voor het tot 5 expressie brengen van mpts-l(). De nucleotide sequentie die codeert voor mpts-l(J, inclusief de secretie signaalsequentie, werd in een pcDNA3.1 plasmide (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) geligeerd. Van het resulterende plasmide werd 2 microgram gecombineerd met lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Daarna werd het mengsel toegevóegd aan COS-7 cellen die in 6-well platen tot een dichtheid van ongeveer 90% 10 confluentie waren gegroeid. Na 6 uur werd aan de cellen vers medium toegevoegd, en na 24 uur werden de cellen gespoeld en werd vers, serum-vrij medium mer runder aggrecaan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) toegevoegd. De cellen werden nog 48 uur geïncubeerd. Uit elke well werd 500 microliter cultuur vloeistof genomen en 10-voudig geconcentreerd. Er werd twee microliter chondroïtinase ABC en keratinase (10u/ml, Sigma, St. Louis, MO, 15 USA) aan de monsters toegevoegd, en er werd overnacht op 37°C geïncubeerd. De monsters werden in SDS-PAGE loadingbuffer gekookt, geëlektroforeerd op een polyacrylamide gel, en overgebracht naar een PVDF membraan. Er werd een Western blot met een antiserum tegen een neo-epitoop die werd gegenereerd bij klieving van aggrecaan door aggrecanase, uitgevoerd.

20 Een ander voorbeeld van een systeem voor expressie van mpts-19 is het baculovirus expressie systeem. De DNA sequentie die de coderende sequentie voor mpts-19 bevatte (inclusief de sequenties die coderen voor de secretie signaalsequentie) en die in de pcDNA3.1 vector was gekloneerd, werd door middel van PCR zodanig gemodificeerd dat de coderende sequentie en het translatie stopcodon werden geflankeerd door Not-1 (N-25 terminale zijde) en Sfi-1 (C-terminale zijde). De voor het N-terminale uiteinde gebruikte primer was GATCGCGGCCGCTATGCCCGGCGGCCCCAGTCCCCG. en de primer die voor het C-terminale uiteinde werd gebruikt was TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTCAGCGGCGGGCAACCCGCTG Na amplificatie met standaard PCR methoden werd het fragment gedigesteerd met Not 1 en Sfc-1. Het 1 022371 46 gedigesteerde fragment werd in vector pVL1392-U, die ook met Not 1 en Sfi-1 was gedigesteerd, geligeerd. PVL1392-U is een derivaat van het baculovirale overdracht plasmide pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA) waarin de meervoudige kloneerplaats zodanig was gemodificeerd dat ze Not-1 en Sfi-1 bevatte. De overhangende 5 uiteinden die door digestie met Not 1 en Sfi 1 waren gegenereerd, waren complementair met de overhangende uiteinden van met Not 1 en Sfi 1 gedigesteerd PCR geamplificeerd DNA. Het geligeerde DNA werd overgebracht naar bacteriecellen en er werd een kloon geselecteerd die het plasmide en de correcte mpts-19 sequentie bevatte. Het plasmide werd geproduceerd en gezuiverd. De mpts-19 sequentie werd met standaard technieken 10 (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual van David O'Reilly, Lois Miller en

Veme Luckow, W.H. Freeman and Co., New York, USA) overgebracht naar een baculovirus vector. Uit het virus preparaat werden vijf plaques gezuiverde virus preparaten bereid. In suspensie groeiende Sf9 cellen werden met elk van de plaque-gezuiverde virus preparaten geïnfecteerd, met een multipliciteit van 0,5. Drie dagen na infectie werd de 15 cultuurvloeistof geoogst. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma,

St. Louis, MO, USA)op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan 20 door agrecanase, getest.

Een andere methode voor het tot expressie brengen van mpts-19 was het drosophila expressiesysteem. het DNA fragment dat de sequenties die codeerden voor het mpts-19, geflankeerd door Not-1 en Sfi-1 die door middel van PCR (zie hierboven) waren gegenereerd, bevatte, werd in plasmide Cmk 33 gekloneerd. Cmk33 is een plasmide dat is 25 afgeleid van pMK33/pMfHy (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64), zodanig dat Not-1 en Sfi-1 zich op de kloneerplaats bevinden. De overhangende uiteinden die door digestie van dit plasmide waren ontstaan, zijn compatibel met de overhangende uiteinden die waren ontstaan in het gedigesteerde DNA dat het mpts-19 fragment bevatte (zie hierboven). Een plasmide dat de correcte sequentie van mpts-19 bevatte werd geamplificeerd en gezuiverd.

47

Met standaard technieken (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64) werden Drosophila (S2) cellen met het plasmide getransformeerd. De kweekvloeistof werd 2 dagen na infectie gewonnen De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA) op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters 5 werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

10 Voorbeeld 5

Expressie van MPTS-20

Het COS-7 zoogdiercel systeem is een voorbeeld van een systeem voor het tot expressie brengen van mpts-20. De nucleotide sequentie die codeert voor mpts-10, inclusief de secretie signaalsequentie, werd in een pcDNA3.1 plasmide (In Vitrogen, Carlsbad, CA, 15 USA) geligeerd. Van het resulterende plasmide werd 2 microgram gecombineerd met lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA). Daarna werd het mengsel toegevoegd aan COS-7 cellen die in 6-well platen tot een dichtheid van ongeveer 90% confluentie waren gegroeid. Na 6 uur werd aan de cellen vers medium toegevoegd, en na 24 uur werden de cellen gespoeld en werd vers, serum-vrij medium mer runder aggrecaan (0,1 20 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) toegevoegd. De cellen werden nog 48 uur geïncubeerd. Uit elke well werd 500 microliter cultuur vloeistof genomen en 10-voudig geconcentreerd. Er werd twee microliter chondroïtinase ABC en keratinase (10u/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) aan de monsters toegevoegd, en er werd overnacht op 37°C geïncubeerd. De monsters werden in SDS-PAGE loadingbuffer gekookt, geëlektroforeerd op een 25 polyacrylamide gel, en overgebracht naar een PVDF membraan. Er werd een Western blot met een antiserum tegen een neo-epitoop die werd gegenereerd bij klieving van aggrecaan door aggrecanase, uitgevoerd.

Een ander voorbeeld van een systeem voor expressie van mpts-20 is het baculovirus expressie systeem. De DNA sequentie die de coderende sequentie voor mpts-20 bevatte ; l 48 (inclusief de sequenties die coderen voor de secretie signaalsequentie) en die in de pcDNA3.1 vector was gekloneerd, werd door middel van PCR zodanig gemodificeerd dat de coderende sequentie en het translatie stopcodon werden geflankeerd door Not-1 (N-terminale zijde) en Sfi-1 (C-terminale zijde). De voor het N-terminale uiteinde gebruikte 5 primer was GATCGCGGCCGCTGCGCTGTGATGAGTGTGCCTG, en de primer die voor het C-terminale uiteinde werd gebruikt was TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTTATAAAGGCCTTGAGAAAACAG· Na amplificatie met standaard PCR methoden werd het fragment gedigesteerd met Not 1 en Sfc-1. Het gedigesteerde fragment werd in vector pVL1392-U, die ook met Not 1 en Sfi-1 10 was gedigesteerd, geligeerd. PVL1392-U is een derivaat van het baculovirale overdracht plasmide pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA USA) waarin de meervoudige kloneerplaats zodanig was gemodificeerd dat ze Not-1 en Sfi-1 bevatte. De overhangende uiteinden die door digestie met Not 1 en Sfi 1 waren gegenereerd, waren complementair met de overhangende uiteinden van met Not 1 en Sfi 1 gedigesteerd PCR geamplificeerd DNA.

15 Het geligeerde DNA werd overgebracht naar bacteriecellen en er werd een kloon geselecteerd die het plasmide en de correcte mpts-20 sequentie bevatte. Het plasmide werd geproduceerd en gezuiverd. De mpts-20 sequentie werd met standaard technieken (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual van David O'Reilly, Lois Miller en Veme Luckow, W.H. Freeman and Co., New York, USA) overgebracht naar een 20 baculovirus vector. Uit het virus preparaat werden vijf plaques gezuiverde virus preparaten bereid. In suspensie groeiende Sf9 cellen werden met elk van de plaque-gezuiverde virus preparaten geïnfecteerd, met een multipliciteit van 0,5. Drie dagen na infectie werd de cultuurvloeistof geoogst. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA)op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De 25 monsters werden overnacht op 37 °C geïncubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml). Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

1022371 49

Een andere methode voor het tot expressie brengen van mpts-20 was het drosophila expressiesysteem. het DNA fragment dat de sequenties die codeerden voor het mpts-20. geflankeerd door Not-1 en Sfi-1 die door middel van PCR (zie hierboven) waren gegenereerd, bevatte, werd in plasmide Cmk 33 gekloneerd. Cmk33 is een plasmide dat is 5 afgeleid van pMK33/pMtHy (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64), zodanig dat Not-1 en Sfi-1 zich op de kloneerplaats bevinden. De overhangende uiteinden die door digestie van dit plasmide waren ontstaan, zijn compatibel met de overhangende uiteinden die waren ontstaan in het gedigesteerde DNA dat het mpts-10 fragment bevatte (zie hierboven). Een plasmide dat de correcte sequentie van mpts-10 bevatte werd geamplificeerd en gezuiverd.

10 Met standaard technieken (Li, Bin et al Biochem J (1996) 313, 57-64) werden Drosophila (S2) cellen met het plasmide getransformeerd. De kweekvloeistof werd 2 dagen na infectie gewonnen. De monsters werden na incuberen met runder aggrecaan (Sigma, St. Louis, MO, USA) op aggrecanase activiteit getest bij een concentratie van 0,1 mg/ml. De monsters werden overnacht op 37 °C gemcubeerd met chondroïtinase ABC en keratinase (10 u/ml).

15 Daarna werden de monsters door middel van Western blotting met een antilichaam dat reageert met een neo-epitoop die ontstaat door klieving van het aggrecaan door agrecanase, getest.

Voorbeeld 6 20 Zuivering van mpts-10. 15. 19 en 20:

Mpts-10, 15, 19 en 20 werden met de bovenstaande chromatografische procedures uit de cultuurvloeistof van de expressiesystemen opgezuiverd. De cultuurvloeistof werd bijvoorbeeld bijgesteld met betrekking tot de pH, gefilterd en daarna op een kolom gebracht die was gepakt met sulfopropyl sepharose FF (Amersham-Pharmacia Biotech, Puscataway, 25 NJ, USA). Na wassen met een buffer die bestaat 10 mM CaCL^ 0,1 M NaCl, en 0,05%

Brij35 bij een pH die resulteert in retentie van de mpts-en op de kolom die werden geëlueerd met een 0,1 M tot 1,0 M NaCl gradiënt. De fracties van de kolom werden getest op aanwezigheid van aggrecanase activiteit als hierboven beschreven en opgetekend. Voor de zuivering kan ook een kolom met phenylsepharose of Sephacryl S-200 worden gebruikt.

50

SEQUENT1ELIJST

<110> Hoffman-La Roche AG

< · * · <120> Nieuwe Metailo-proteasen met trombospondine domeinerren nucleïnezuur ' 5 samenstellingen die daarvoor coderen.

<130> 20594 <150> 60/184.152 10 <151> 18-02-2000 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4,0 15 <210> 1 <211> 959 <212> PRT <213> humaan 20 <220> <223> Xaa op 909 kan elk aminozuur zijn <223> Xaa op 921 kan elk aminozuur zijn <223> Xaa op 928 kan elk aminozuur zijn 25 <223> Xaa kan elk aminozuur zijn 51 <400> 1

Met Glu lie Leu Trp Lys Thr Leu Thr Trp He Leu Ser Leu lie Met 15 10 15

Ala Ser Ser Glu Phe His Ser Asp His Arg Leu Ser Tyr Ser Ser Gin 5 20 25 30

Glu Glu Phe Leu Thr Tyr Leu Glu His Tyr Gin Leu Thr He Pro He 35 40 45

Arg Val Asp Gin Asn Gly Ala Phe Leu Ser Phe Thr Val Lys Asn Asp 50 55 60 10 Lys His Ser Arg Arg Arg Arg Ser Met Asp Pro lie Asp Pro Gin Gin 65 70 75 80

Ala Val Ser Lys Leu Phe Phe Lys Leu Ser Ala Tyr Gly Lys His Phe 85 90 95

His Leu Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Phe Val Ser Lys His Phe Thr 15 100 105 110

Val Glu Tyr Trp Gly Lys Asp Gly Pro Gin Trp Lys His Asp Phe Leu 115 120 125

Asp Asn Cys His Tyr Thr Gly Tyr Leu Gin Asp Gin Arg Ser Thr Thr 130 135 140 20 Lys Val Ala Leu Ser Asn Cys Val Gly Leu His Gly Val He Ala Thr 145 150 155 160

Glu Asp Glu Glu Tyr Phe He Glu Pro Leu Lys Asn Thr Thr Glu Asp 165 170 175

Ser Lys His Phe Ser Tyr Glu Asn Gly His Pro His Val He Tyr Lys 25 180 185 190

Lys Ser Ala Leu Gin Gin Arg His Leu Tyr Asp His Ser His Cys Gly 195 200 205

Val Ser Asp Phe Thr Arg Ser Gly Lys Pro Trp Trp Leu Asn Asp Thr 210 215 220 30 Ser Thr Val Ser Tyr Ser Leu Pro He Asn Asn Thr His He His His 225 230 235 240

Arg Gin Lys Arg Ser Val Ser He Glu Arg Phe Val Glu Thr Leu Val 245 250 255

Val Ala Asp Lys Met Met Val Gly Tyr His Gly Arg Lys Asp He Glu 35 260 265 270

His Tyr He Leu Ser Val Met Asn He Val Ala Lys Leu Tyr Arg Asp 275 280 285

Ser Ser Leu Gly Asn Val Val Asn lie lie Val Ala Arg Leu He Val 290 295 300 1 0 223 71 52

Leu Thr Glu Asp Gin Pro Asn Leu Glu He Asn His His Ala Asp Lys 305 310 315 320

Ser Leu Asp Ser Phe Cys Lys Trp Gin Lys Ser lie Leu Ser His Gin 325 330 335 5 Ser Asp Gly Asn Thr lie Pro Glu Asn Gly He Ala His His Asp Asn 340 345 350

Ala Val Leu He Thr Arg Tyr Asp He Cys Thr Tyr Lys Asn Lys Pro 355 360 365

Cys Gly Thr Leu Gly Leu Ala Ser Val Ala Gly Met Cys Glu Pro Glu 10 370 375 380

Arg Ser Cys Ser lie Asn Glu Asp He Gly Leu Gly Ser Ala Phe Thr 385 390 395 400 lie Ala His Glu lie Gly His Asn Phe Gly Met Asn His Asp Gly lie 405 410 415 15 Gly Asn Ser Cys Gly Thr Lys Gly His Glu Ala Ala Lys Leu Met Ala 420 425 430

Ala His He Thr Ala Asn Thr Asn Pro Phe Ser Trp Ser Ala Cys Ser 435 440 445

Arg Asp Tyr He Thr Ser Phe Leu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Cys Leu 20 450 455 460

Asp Asn Glu Pro Pro Lys Arg Asp Phe Leu Tyr Pro Ala Val Ala Pro 465 470 475 480

Gly Gin Val Tyr Asp Ala Asp Glu Gin Cys Arg Phe Gin Tyr Gly Ala 485 490 495 25 Thr Ser Arg Gin Cys Lys Tyr Gly Glu Val Cys Arg Glu Leu Trp Cys 500 505 510

Leu Ser Lys Ser Asn Arg Cys Val Thr Asn Ser lie Pro Ala Ala Glu 515 520 525

Gly Thr Leu Cys Gin Thr Gly Asn lie Glu Lys Gly Trp Cys Tyr Gin 30 530 535 540

Gly Asp Cys Val Pro Phe Gly Thr Trp Pro Gin Ser lie Asp Gly Gly 345 550 555 560

Trp Gly Pro Trp Ser Leu Trp Gly Glu Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly 565 570 575 35 Gly Val Ser Ser Ser Leu Arg His Cys Asp Ser Pro Ala Pro Ser Gly 580 585 590

Gly Gly Lys Tyr Cys Leu Gly Glu Arg Lys Arg Tyr Arg Ser Cys Asn 595 600 605

Thr Asp Pro Cys Pro Leu Gly Ser Arg Asp Phe Arg Glu Lys Gin Cys 40 610 615 620

U

53

Ala Asp Phe Asp Asn Met Pro Phe Arg Gly Lys Tyr Tyr Asn Trp Lys 625 630 635 640

Pro Tyr Thr Gly Gly Gly Val Lys Pro Cys Ala Leu Asn Cys Leu Ala 645 650 655 5 Glu Gly Tyr Asn Phe Tyr Thr Glu Arg Ala Pro Ala Val lie Asp Gly 660 665 670

Thr Gin Cys Asn Ala Asp Ser Leu Asp lie Cys lie Asn Gly Glu Cys 675 680 685

Lys His Val Gly Cys Asp Asn lie Leu Gly Ser Asp Ala Arg Glu Asp 10 690 695 700

Arg Cys Arg Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Thr Cys Asp Ala He Glu 705 710 715 720

Gly Phe Phe Asn Asp Ser Leu Pro Arg Gly Gly Tyr Met Glu Val Val 725 730 735 15 Gin lie Pro Arg Gly Ser Val His lie Glu Val Arg Glu Val Ala Met 740 745 750

Ser Lys Asn Tyr. He Ala Leu Lys Ser Glu Gly Asp Asp Tyr Tyr He 755 760 765

Asn Gly Ala Trp Thr He Asp Trp Pro Arg Lys Phe Asp Val Ala Gly 20 770 775 780

Thr Ala Phe His Tyr Lys Arg Pro Thr Asp Glu Pro Glu Ser Leu Glu 785 790 795 800

Ala Leu Gly Pro Thr Ser Glu Asn Leu He Val Met Val Leu Leu Gin 805 810 815 25 Glu Gin Asn Leu Gly He Arg Tyr Lys Phe Asn Val Pro lie Thr Arg 820 825 830

Thr Gly Ser Gly Asp Asn Glu Val Gly Phe Thr Trp Asn His Gin Ser 835 840 845

Trp Ser Glu Cys Ser Ala Thr Cys Ala Gly Gly Lys Met Pro Thr Arg 30 850 855 860

Gin Pro Thr Gin Arg Ala Arg Trp Arg Thr Lys His He Leu Ser Tyr 865 870 875 880

Ala Leu Cys Leu Leu Lys Lys Leu He Gly Asn lie Ser Cys Arg Phe 885 890 895 35 Ala Ser Ser Cys Asn Leu Pro Lys Glu Thr Leu Leu Xaa Leu Tyr Tyr 900 905 910

He Pro Phe Val Phe Asn Leu Met Xaa Phe Val Gin He Cys Trp Xaa 915 920 925

Asn Thr Ser Trp His Asn Glu Cys Leu Cys Trp Cys Phe Ser Gin Asp 40 930 935 940 |j I i i

'J \d- C*. V. I

54

Tyr Leu Glu Gly Gly Leu Phe Ala Phe Arg Glu His He Leu Gly 945 950 955 <210> 2 5 <211> 2879

<212> DNA

<213> humaan <400> 2 10 atggaaattt tgtggaagac gttgacctgg attttgagcc tcatcatggc ttcatcggaa 60 tttcatagtg accacaggct ttcatacagt tctcaagagg aattcctgac tcatcttgaa 120 cactaccagc taactattcc aataagggtt gatcaaaatg gagcatttct cagctttact 15 iso gtgaaaaatg ataaacactc aaggagaaga cggagtatgg accctattga tccacagcag 240 gcagtatcta agttattttt taaactttca gcctatggca agcactttca tctaaacttg 300 20 actctcaaca cagattttgt gtccaaacat tttacagtag aatattgggg gaaagatgga 360 ccccagtgga aacatgattt tttagacaac tgtcattaca caggatattt gcaagatcaa 420 cgtagtacaa ctaaagtggc tttaagcaac tgtgttgggt tgcatggtgttattgctaca 25 480 gaagatgaag agtattttat cgaaccttta aagaatacca cagaggattc caagcatttt 540 agttatgaaa atggccaccc tcatgttatt tacaaaaagt ctgcccttca acaacgacat 600 30 ctgtatgatc actctcattg tggggtttcg gatttcacaa gaagtggcaa accttggtgg 660 ctgaatgaca catccactgt ttcttattca ctaccaatta acaacacaca tatccaccac 720 agacagaaga gatcagtgag cattgaacgg tttgtggaga cattggtagt ggcagacaaa 35 780 atgatggtgg gctaccatgg ccgcaaagac attgaacatt acattttgag tgtgatgaat 840 attgttgcca aactttaccg tgattccagc ctaggaaacg ttgtgaatat tatagtggcc 900 1022371 55 cgcttaattg ttctcacaga agatcagcca aacttggaga taaaccacca tgcagacaag 960 tccctcgata gcttctgtaa atggcagaaa tccattctct cccaccaaag tgatggaaac 1020 5 accattccag aaaatgggat tgcccaccac gataatgcag ttcttattac tagatatgat 1080 atctgcactt ataaaaataa gccctgtgga acactgggct tggcctctgt ggctggaatg 1140 tgtgagcctg aaaggagctg cagcattaat gaagacattg gcctgggttc agcttttacc 10 1200 attgcacatg agattggtca caattttggt atgaaccatg atggaattgg aaattcttgt 1260 gggacgaaag gtcatgaagc agcaaaactt atggcagctc acattactgc gaataccaat 1320 15 cctttttcct ggtctgcttg cagtcgagac tacatcacca gctttctaga ttcaggccgt 1380 ggtacttgcc ttgataatga gcctcccaag cgtgactttc tttatccagc tgtggcccca 1440 ggtcaggtgt atgatgctga tgagcaatgt cgtttccagt atggagcaac ctcccgccaa .

20 1500 tgtaaatatg gggaagtgtg tagagagctc tggtgtctca gcaaaagcaa ccgctgtgtc 1560 accaacagta ttccagcagc tgaggggaca ctgtgtcaaa ctgggaatat tgaaaaaggg 1620 25 tggtgCtatc agggagattg tgttcctttt ggcacttggc cccagagcat agatgggggc 1680 tggggtccct ggtcactatg gggagagtgc agcaggacct gcgggggagg cgtctcctca 1740 tccctaagac actgtgacag tccagcacct tcaggaggtg gaaaatattg ccttggggaa 30 1800 aggaaacggt atcgctcctg taacacagat ccatgccctt tgggtccccg agattttcga 1860 gagaaacagt gtgcagactt tgacaatatg cctttccgag gaaagtatta taactggaaa 1920 35 ccctatactg gaggtggggt aaaaccttgt gcattaaact gcttggctga aggttataat 1980 ttctacactg aacgtgctcc tgcggtgatc gatgggaccc agtgcaatgc ggattcactg 2040 gatatctgca tcaatggaga atgcaagcac gtaggctgtg ataatatttt gggatctgat 40 2100 'f !i ·;. .4 'J ( ! 56 gctagggaag atagatgtcg agtctgtgga ggggacggaa gcacatgtga tgccattgaa 2160 gggttcttca atgattcact gcccagggga ggctacatgg aagtggtgca gataccaaga 2220 5 ggctctgttc acattgaagt tagagaagtt gccatgtcaa agaactatat tgctttaaaa 2280 tctgaaggag atgattacta tattaatggt gcctggacta ttgactggcc taggaaattt 2340 gatgttgctg ggacagcttt tcattacaag agaccaactg atgaaccaga atccttggaa 10 2400 gctctaggtc ctacctcaga aaatctcatc gtcatggttc tgcttcaaga acagaatttg 2460 ggaattaggt ataagttcaa tgttcccatc actcgaactg gcagtggaga taatgaagtt 2520 15 ggctttacat ggaatcatca gtcttggtca gaatgctcag ctacttgtgc tggaggtaag 2580 atgcccacta ggcagcccac ccagagggca agatggagaa caaaacacat tctgagctat 2640 gctttgtgtt tgttaaaaaa gctaattgga aacatttctt gcaggtttgc ttcaagctgt 20 2700 aatttaccaa aagaaacttt gctttaatta tattatattc catttgtttt caacctcatg 2760 taatttgtgc agatttgttg gtaaaataca tcttggcaca atgagtgtct ctgctggtgc 2820 25 ttctcccaag actatcttga aggtgggctg tttgcctttc gtgaacacat tcttggtat 2879 <210> 3

<211> 947 30 <212> PRT

<213> humaan <400> 3

Met Ala Pro Ala Cys Gin lie Leu Arg Trp Ala Leu Ala Leu Gly Leu 35 1 5 10 15

Gly Leu Met Phe Glu Val Thr His Ala Phe Arg Ser Gin Asp Glu Phe 20 25 30

Leu Ser Ser Leu Glu Ser Tyr Glu He Ala Phe Pro Thr Arg Val Asp 35 40 45

Uj's, , 57

His Asn Gly Ala Leu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Pro Pro Arg Arg Gin 50 55 60

Arg Arg Gly Thr Gly Ala Thr Ala Glu Ser Arg Leu Phe Tyr Lys Val 65 70 75 80 5 Ala Ser Pro Ser Thr His Phe Leu Leu Asn Leu Thr Arg Ser Ser Arg 85 90 95

Leu Leu Ala Gly His Val Ser Val Glu Tyr Trp Thr Arg Glu Gly Leu 100 105 110

Ala Trp Gin Arg Ala Ala Arg Pro His Cys Leu Tyr Ala Gly His Leu 10 115 120 125

Gin Gly Gin Ala Ser Ser Ser His Val Ala lie Ser Thr Cys Gly Gly 130 135 140

Leu His Gly Leu lie Val Ala Asp Glu Glu Glu Tyr Leu lie Glu Pro 145 150 155 160 15 Leu His Gly Gly Pro Lys Gly Ser Arg Ser Pro Glu Glu Ser Gly Pro 165 170 175

His Val Val Tyr Lys Arg Ser Ser Leu Arg His Pro His Leu Asp Thr 180 185 190

Ala Cys Gly Val Arg Asp Glu Lys Pro Trp Lys Gly Arg Pro Trp Trp 20 195 200 205

Leu Arg Thr Leu Lys Pro Pro Pro Ala Arg Pro Leu Gly Asn Glu Thr 210 215 220

Glu Arg Gly Gin Pro Gly Leu Lys Arg Ser Val Ser Arg Glu Arg Tyr 225 230 235 240 25 Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Lys Met Met Val Ala Tyr His Gly 245 250 255

Arg Arg Asp Val Glu Gin Tyr Val Leu Ala He Met Asn lie Val Ala 260 265 270

Lys Leu Phe Gin Asp Ser Ser Leu Gly Ser Thr Val Asn He Leu Val 30 275 280 285'

Thr Arg Leu He Leu Leu Thr Glu Asp Gin Pro Thr Leu Glu He Thr 290 295 300

His His Ala Gly Lys Ser Leu Asp Ser Phe Cys Lys Trp Gin Lys Ser 305 310 315 320 35 He Val Asn His Ser Gly His Gly Asn Ala He Pro Glu Asn Gly Val 325 330 335

Ala Asn His Asp Thr Ala Val Leu lie Thr Arg Tyr Asp He Cys lie 340 345 350

Tyr Lys Asn Lys Pro Cys Gly Thr Leu Gly Leu Ala Pro Val Gly Gly 40 355 360 365 1022371 58

Met Cys Glu Arg Glu Arg Ser Cys Ser Val Asn Glu Asp He Gly Leu 370 375 380

Ala Thr Ala Phe Thr lie Ala His Glu lie Gly His Thr Phe Gly Met 385 390 395 400 5 Asn His Asp Gly Val Gly Asn Ser Cys Gly Ala Arg Gly Gin Asp Pro 405 410 415

Ala Lys Leu Met Ala Ala His He Thr Met Lys Thr Asn Pro Phe Val 420 425 430

Trp Ser Ser Cys Ser Arg Asp Tyr lie Thr Ser Phe Leu Asp Ser Gly 10 435 440 445

Leu Gly Leu Cys Leu Asn Asn Arg Pro Pro Arg Gin Asp Phe Val Tyr 450 455 460

Pro Thr Val Ala Pro Gly Gin Ala Tyr Asp Ala Asp Glu Gin Cys Arg 465 470 475 480 15 Phe Gin His Gly Val Lys Ser Arg Gly Leu Gin Arg Ala Val Val Ser 485 490 495

Glu Gin Glu Gin Pro Val His His Gin Gin His Pro Gly Arg Arg Gly 500 505 510

His Ala Val Pro Asp Ala His His Arg Gin Gly Val Val Leu Gin Thr 20 515 520 525

Gly Leu Cys Pro Leu Trp Val Ala Pro Arg Gly Cys Gly Arg Ser Leu 530 535 540

Gly Ala Val Asp Ser Met Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly 545 550 555 560 25 Val Ser Ser Ser Ser Arg His Cys Asp Ser Pro Arg Pro Thr lie Gly 565 570 575

Gly Lys Tyr Cys Leu Gly Glu Arg Arg Arg His Arg Ser Cys Asn Thr 580 585 590

Asp Asp Cys Pro Pro Gly Ser Gin Asp Phe Arg Glu Val Gin Cys Ser 30 595 600 605'

Glu Phe Asp Ser lie Pro Phe Arg Gly Lys Phe Tyr Lys Trp Lys Thr 610 615 620

Tyr Arg Gly Gly Gly Val Lys Ala Cys Ser Leu Thr Cys Leu Ala Glu 625 630 635 640 35 Gly Phe Asn Phe Tyr Thr Glu Arg Ala Ala Ala Val Val Asp Gly Thr 645 650 655

Pro Cys Arg Pro Asp Thr Val Asp lie Cys Val Ser Gly Glu Cys Lys 660 665 670

His Val Gly Cys Asp Arg Val Leu Gly Ser Asp Leu Arg Glu Asp Lys 40 675 680 685 ' i Ο ί i 5'9

Cys Arg Val Cys Gly Gly Asp Gly Ser Ala Cys Glu Thr lie Glu Gly 690 695 700

Val Phe Ser Pro Ala Ser Pro Gly Ala Gly Tyr Glu Asp Val Val Trp 705 710 715 720 5 lie Pro Lys Gly Ser Val His lie Phe lie Gin Asp Leu Asn Leu Ser 725 730 735

Leu Ser His Leu Ala Leu Lys Gly Asp Gin Glu Ser Leu Leu Leu Glu 740 745 750

Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gin Pro His Arg Leu Pro Leu Ala Gly Thr 10 755 760 765

Thr Phe Gin Leu Arg Gin Gly Pro Asp Gin Val Gin Ser Leu Glu Ala 770 775 780

Leu Gly Pro He Asn Ala Ser Leu lie Val Met Val Leu Ala Arg Thr 785 790 795 800 15 Glu Leu Pro Ala Leu Arg Tyr Arg Phe Asn Ala Pro He Ala Arg Asp 805 810 815

Ser Leu Pro Pro Tyr Ser Tip His Tyr Ala^ Pro Trp Thr Lys Cys Ser 820 825 830

Pro Ser Val Gin Ala Val Ala Arg Cys Arg Arg Trp Ser Ala Ala Thr 20 835 840 845

Lys Leu Asp Ser Ser Ala Val Ala Pro His Tyr Cys Ser Ala His Ser 850 855 860

Lys Leu Ala Gin Lys Gin Ala Arg Leu Gin His Gly Ala Leu Pro Gin 865 870 875 880 25 Asp Trp Val Val Gly Thr Val Ala Leu Gin Pro Gin Leu Ala Met Gin 885 890 895

Gly Val Arg Ser Arg Ser Val Val Cys Gin Ala Pro Arg Leu Cys Arg 900 905 910

Glu Glu Lys Ala Leu Asp Asp Ser Ala Cys Pro Gin Pro Arg Pro Pro 30 915 920 925'

Val Leu Arg Pro Ala Thr Ala Pro Leu Ala Leu Arg Ser Gly Gly Pro 930 935 940

Arg Leu Val 945 35 <210> 4 <211> 3263 <212> DNA <213> humaan 60 <400> 4 ttccatccta atacgactca ctatagggct cgagcggccg cccgggcagg tgtggacacg 60 5 tggcctctat ggctcccgcc tgccagatcc tccgctgggc cctcgccctg gggctgggcc 120 tcatgttcga ggtcacgcat gccttccggt ctcaagatga gttcctgtcc agtctggaga 180 gctatgagat cgccttcccc acccgcgtgg accacaacgg ggcactgctg gccttctcgc 10 240 cacctcctcc ccggaggcag cgccgcggca cgggggccac agccgagtcc cgcctcttct 300 acaaagtggc ctcgcccagc acccacttcc tgctgaacct gacccgcagc tcccgtctac 360 15 tggcagggca cgtctccgtg gagtactgga cacgggaggg cctggcctgg cagagggcgg 420 cccggcccca ctgcctctac gctggtcacc tgcagggcca ggccagcagc tcccatgtgg 480 ccatcagcac ctgtggaggc ctgcacggcc tgatcgtggc agacgaggaa gagtacctga 20 540 ttgagcccct gcacggtggg cccaagggtt ctcggagccc ggaggaaagt ggaccacatg 600 tggtgtacaa gcgttcctct ctgcgtcacc cccacctgga cacagcctgt ggagtgagag 660 25 atgagaaacc gtggaaaggg cggccatggt ggctgcggac cttgaagcca ccgcctgcca 720 ggcccctggg gaatgaaaca gagcgtggcc agccaggcct gaagcgatcg gtcagccgag 780 agcgctacgt ggagaccctg gtggtggctg acaagatgat ggtggcctat cacgggcgcc 30 840 gggatgtgga gcagtatgtc ctggccatca tgaacattgt tgccaaactt ttccaggact 900 cgagtctggg aagcaccgtt aacatcctcg taactcgcct catcctgctc acggaggacc 960 35 agcccactct ggagatcacc caccatgccg ggaagtccct ggacagcttc tgtaagtggc 1020 agaaatccat cgtgaaccac agcggccatg gcaatgccat tccagagaac ggtgtggcta 1080 accatgacac agcagtgctc atcacacgct atgacatctg catctacaag aacaaaccct 40 1140 b /·, 61 gcggcacact aggcctggcc ccggtgggcg gaatgtgtga gcgcgagaga agctgcagcg 1200 tcaatgagga cattggcctg gccacagcgt tcaccattgc ccacgagatc gggcacacat 1260 5 tcggcatgaa ccatgacggc gtgggaaaca gctgtggggc ccgtggtcag gacccagcca 1320 agctcatggc tgcccacatt accatgaaga ccaacccatt cgtgtggtca tcctgcagcc 1380 gtgactacat caccagcttt ctagactcgg gcctggggct ctgcctgaac aaccggcccc 10 1440 ccagacagga ctttgtgtac ccgacagtgg caccgggcca agcctacgat gcagatgagc 1500 aatgccgctt tcagcatgga gtcaaatcgc gaggtctgca gcgagctgtg gtgtctgagc 1560 15 aagagcaacc ggtgcatcac caacagcatc ccggccgccg agggcacgct gtgccagacg 1620 cacaccatcg acaaggggtg gtgctacaaa cgggtctgtg tccccCttgg gtcgcgccca 1680 gagggtgtgg acggagcctg ggggccgtgg actccatggg ggactgcagc cggacctgtg 20 1740 gcggcggcgt gtcctcttct agccgtcact gcgacagccc caggccaacc atcgggggca 1800 agtactgtct gggtgagaga aggcggcacc gctcctgcaa cacggatgac tgtccccctg 1860 25 gctcccagga cttcagagaa gtgcagtgtt ctgaatttga cagcatccct ttccgtggga 1920 aattctacaa gtggaaaacg taccggggag ggggcgtgaa ggcctgctcg ctcacgtgcc 1980 tagcggaagg cttcaacttc tacacggaga gggcggcagc cgtggtggac gggacaccct 30 2040 gccgtccaga cacggtggac atttgcgtca gtggcgaatg caagcacgtg ggctgcgacc 2100 gagtcctggg ctccgacctg cgggaggaca agtgccgagt gtgtggcggt gacggcagtg 2160 35 cctgcgagac catcgagggc gtcttcagcc cagcctcacc tggggccggg tacgaggatg 2220 tcgtctggat tcccaaaggc tccgtccaca tcttcatcca ggatctgaac ctctctctca 2280 gtcacttggc cctgaaggga gaccaggagt ccctgctgct ggaggggctg cctgggaccc 40 2340 >022371 62 cccagcccca ccgtctgcct ctagctggga ccacctttca actgcgacag gggccagacc 2400 aggtccagag cctcgaagcc ctgggaccga ttaatgcatc tctcatcgtc atggtgctgg 2460 5 cccggaccga gctgcctgcc ctccgctacc gcttcaatgc ccccatcgcc cgtgactcgc 2520 tgccccccta ctcctggcac tatgcgccct ggaccaagtg ctcgcccagt gtgcaggcgg 2580 tagccaggtg caggcggtgg agtgccgcaa ccaagctgga cagctccgcg gtcgcccccc 10 2640 actactgcag tgcccacagc aagcttgccc aaaagcaagc gcgcctgcaa cacggagcct 2700 tgcctcaaga ctgggttgta ggaactgtcg ctctgcagcc gcagcttgcg atgcaaggcg 2760 15 tgcgcagccg ctcggtcgtg tgccaagcgc cgcgtctctg ccgcgaagaa aaggcgctgg 2820 acgacagcgc atgcccgcag ccgcgcccac ctgtactgag gcctgccacg gccccacttg 2880 ccctccggag tggcggccct cgactggtct gagtgcaccc ccagctgcgg gccgggcctc 20 2940 cgccaccgcg tggtcctttg caagagcgca gaccaccgcg ccacgctgcc cccggcgcac 3000 tgctcacccg ccgccaagcc accggccacc atgcgctgca acttgcgccg ctgccccccg 3060 25 gcccgctggg tggctggcga gtggggtgag tgctctgcac agtgcggcgt cgggcagcgg 3120 cagcgctcgg tgcgctgcac cagccacacg ggccaggcgt cgeacgagtg cacggaggcc 3180 ctgcggccgc cgactagtaa gcttcgtcga cccgggaatt aattccggac cggtacctgc 30 3240 aggcgtacca gctttcccta tag 3263 <210> 5 35 <211> 1690 <212> PRT <213> liumaan O i· t 63 <400> 5

Pro Val Pro Ala Met Pro Gly Gly Pro Ser Pro Arg Ser Pro Ala Pro 15 10 15

Leu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Ala Pro Gly Ala 5 20 25 30

Pro Gly Pro Ala Pro Gly Arg Ala Thr Glu Gly Arg Ala Ala Leu Asp 35 40 45 lie Val His Pro Val Arg Val Asp Ala Gly Gly Ser Phe Leu Ser Tyr 50 55 60 10 Glu Leu Trp Pro Arg Ala Leu Arg Lys Arg Asp Val Ser Val Arg Arg 65 70 75 80

Asp Ala Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Gin Tyr Arg Gly Arg Glu Leu Arg 85 90 95

Phe Asn Leu Thr Ala Asn Gin His Leu Leu Ala Pro Gly Phe Val Ser 15 100 105 110

Glu Thr Arg Arg Arg Gly Gly Leu Gly Arg Ala His lie Arg Ala His 115 . 120 125

Thr Pro Ala Cys His Leu Leu Gly Glu Val Gin Asp Pro Glu Leu Glu 130 135 140 20 Gly Gly Leu Ala Ala He Ser Ala Cys Asp Gly Leu Lys Gly Val Phe 145 150 155 160

Gin Leu Ser Asn Glu Asp Tyr Phe lie Glu Pro Leu Asp Ser Ala Pro 165 170 175

Ala Arg Pro Gly His Ala Gin Pro His Val Val Tyr Lys Arg Gin Ala 25 180 185 190

Pro Glu Arg Leu Ala Gin Arg Gly Asp Ser Ser Ala Pro Ser Thr Cys 195 200 205

Gly Val Gin Val Tyr Pro Glu Leu Glu Pro Arg Arg Glu Arg Trp Glu 210 215 220 30 Gin Arg Gin Gin Trp Arg Arg Pro Arg Leu Arg Arg Leu His Gin Arg 225 230 235 240

Ser Val Ser Lys Glu Lys Trp Val Glu Thr Leu Val Val Ala Asp Ala 245 250 255

Lys Met Val Glu Tyr His Gly Gin Pro Gin Val Glu Ser Tyr Val Leu 35 260 265 270

Thr lie Met Asn Met Val Ala Gly Leu Phe His Asp Pro Ser lie Gly 275 280 285

Asn Pro lie His lie Thr He Val Arg Leu Val Leu Leu Glu Asp Glu 290 295 300 64

Glu Glu Asp Leu Lys lie Thr His His Ala Asp Asn Thr Pro Lys Ser 305 310 315 320

Phe Cys Lys Trp Gin Lys Ser lie Asn Met Lys Gly Asp Ala His Pro 325 330 335 5 Leu His His Asp Thr Ala lie Leu Leu Thr Arg Lys Asp Leu Cys Ala 340 345 350

Thr Met Asn Arg Pro Cys Glu Thr Leu Gly Leu Ser His Val Ala Gly 355 360 365

Met Cys Gin Pro His Arg Ser Cys Ser He Asn Glu Asp Thr Gly Leu 10 370 375 380

Pro Leu Ala Phe Thr Val Ala His Glu Leu Gly His Ser Phe Gly lie 385 390 395 400

Gin His Asp Gly Ser Gly Asn Asp Cys Glu Pro Val Gly Lys Arg Pro 405 410 415 15 Phe He Met Ser Pro Gin Leu Leu Tyr Asp Ala Ala Pro Leu Thr Trp 420 425 430

Ser Arg Cys Ser Arg Gin Tyr He Thr Arg Phe Leu Asp Arg Gly Trp 435 440 445

Gly Leu Cys Leu Asp Asp Pro Pro Ala Lys Asp He He Asp Phe Pro 20 450 455 460

Ser Val Pro Pro Gly Val Leu Tyr Asp Val Ser His Gin Cys Arg Leu 465 470 475 480

Gin Tyr Gly Ala Tyr Ser Ala Phe Cys Glu Asp Met Asp Asn Val Cys 485 490 495 25 His Thr Leu Trp Cys Ser Val Gly Thr Thr Cys His Ser Lys Leu Asp 500 505 510

Ala Ala Val Asp Gly Thr Arg Cys Gly Glu Asn Lys Trp Cys Leu Ser 515 520 525

Gly Glu Cys Val Pro Val Gly Phe Arg Pro Glu Ala Val Asp Gly Gly 30 530 535 540

Trp Ser Gly Trp Ser Ala Trp Ser lie Cys Ser Arg Ser Cys Gly Met 545 550 555 560

Gly Val Gin Ser Ala Glu Arg Gin Cys Thr Gin Pro Thr Pro Lys Tyr 565 570 575 35 Lys Gly Arg Tyr Cys Val Gly Glu Arg Lys Arg Phe Arg Leu Cys Asn 580 585 590

Leu Gin Ala Cys Pro Ala Gly Arg Pro Ser Phe Arg His Val Gin Cys 595 600 605

Ser His Phe Asp Ala Met Leu Tyr Lys Gly Arg Leu His Thr Trp Val 40 610 615 620 65

Pro Val Val Asn Asp Val Asn Pro Cys Glu Leu His Cys Arg Pro Ala 625 630 635 640

Asn Glu Tyr Phe Ala Glu Lys Leu Arg Asp Ala Val Val Asp Gly Thr 645 650 655 5 Pro Cys Tyr Gin Val Arg Ala Ser Arg Asp Leu Cys lie Asn Gly Ile 660 665 670

Cys Lys Asn Val Gly Cys Asp Phe Glu lie Asp Ser Gly Ala Met Glu 675 680 685

Asp Arg Cys Gly Val Cys His Gly Asn Gly Ser Thr Cys His Thr Val 10 690 695 700

Ser Gly Thr Phe Glu Glu Ala Glu Gly Leu Gly Tyr Val Asp Val Gly 705 710 715 720

Leu lie Pro Ala Gly Ala Arg Glu Ile Arg Ile Gin Glu Val Ala Glu 725 730 735 15 Ala Ala Asn Phe Leu Ala Leu Arg Ser Glu Asp Pro Glu Lys Tyr Phe 740 745 750

Leu Asn Gly Gly Trp Thr Ile Gin Trp Asn Gly Asp Tyr Gin Val Ala 755 760 765

Gly Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Arg Arg Gly Asn Trp Glu Asn Leu Thr 20 770 775 780

Ser Pro Gly Pro Thr Lys Glu Pro Val Trp Ile Gin Leu Leu Phe Gin 785 790 795 800

Glu Ser Asn Pro Gly Val His Tyr Glu Tyr Thr Ile His Arg Glu Ala 805 810 815 25 Gly Gly His Asp Glu Val Pro Pro Pro Val Phe Ser Trp His Tyr Gly 820 825 830

Pro Trp Thr Lys Cys Thr Val Thr Cys Gly Arg Gly Val Gin Arg Gin 835 840 845

Asn Val Tyr Cys Leu Glu Arg Gin Ala Gly Pro Val Asp Glu Glu His 30 850 855 860

Cys Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Asp Gin Gin Arg Lys Cys Ser Glu 865 870 875 880

Gin Pro Cys Pro Ala Arg Trp Trp Ala Gly Glu Trp Gin Leu Cys Ser 885 890 895 35 Ser Ser Cys Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg Arg Ala Val Leu Cys Ile 900 905 910

Arg Ser Val Gly Leu Asp Glu Gin Ser Ala Leu Glu Pro Pro Ala Cys 915 920 925

Glu His Leu Pro Arg Pro Pro Thr Glu Thr Pro Cys Asn Arg His Val 40 930 935 940 1 022371' 66

Pro Cys Pro Ala Thr Trp Ala Val Gly Asn Trp Ser Gin Cys Ser Val 945 950 955 960

Thr Cys Gly Glu Gly Thr Gin Arg Arg Asn Val Leu Cys Thr Asn Asp 965 970 975 5 Thr Gly Val Pro Cys Asp Glu Ala Gin Gin Pro Ala Ser Glu Val Thr 980 985 990

Cys Ser Leu Pro Leu Cys Arg Trp Pro Leu Gly Thr Leu Gly Pro Glu 995 1000 1005

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser His Glu Leu Phe Asn Glu Ala Asp 10 1010 1015 1020

Phe lie Pro His His Leu Ala Pro Arg Pro Ser Pro Ala Ser Ser Pro 1025 1030 1035 1040

Lys Pro Gly Thr Met Gly Asn Ala lie Glu Glu Glu Ala Pro Glu Leu 1045 1050 1055 15 Asp Leu Pro Gly Pro Val Phe Val Asp Asp Phe Tyr Tyr Asp Tyr Asn 1060 1065 1070

Phe lie Asn Phe His Glu Asp Leu Ser Tyr Gly Pro Ser Glu Glu Pro 1075 1080 1085

Asp Leu Asp Leu Ala Gly Thr Gly Asp Arg Thr Pro Pro Pro His Ser 20 1090 1095 1100

Arg Pro Ala Ala Pro Ser Thr Gly Ser Pro Val Pro Ala Thr Glu Pro 1105 1110 1115 1120

Pro Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ser Pro 1125 1130 1135 25 Trp Pro Ser Gin Ala Gly Arg Ser Pro Pro Pro Pro Ser Glu Gin Thr 1140 1145 1150

Pro Gly Asn Pro Leu lie Asn Phe Leu Pro Glu Glu Asp Thr Pro lie 1155 1160 1165

Gly Ala Pro Asp Leu Gly Leu Pro Ser Leu Ser Trp Pro Arg Val Ser 30 1170 1175 1180

Thr Asp Gly Leu Gin Thr Pro Ala Thr Pro Glu Ser Gin Asn Asp Phe 1185 1190 1195 1200

Pro Val Gly Lys Asp Ser Gin Ser Gin Leu Pro Pro Pro Trp Arg Asp 1205 1210 1215 35 Arg Thr Asn Glu Val Phe Lys Asp Asp Glu Glu Pro Lys Gly Arg Gly 1220 1225 1230

Ala Pro His Leu Pro Pro Arg Pro Ser Ser Thr Leu Pro Pro Leu Ser 1235 1240 1245

Pro Val Gly Ser Thr His Ser Ser Pro Ser Pro Asp Val Ala Glu Leu 40 1250 1255 1260 /.. H ?' il " 67

Trp Thr Gly Gly Thr Val Ala Trp Glu Pro Ala Leu Glu Gly Gly Leu 1265 1270 1275 1280

Gly Pro Val Asp Ser Glu Leu Trp Pro Thr Val Gly Val Ala Ser Leu 1285 1290 1295 5 Leu Pro Pro Pro lie Ala Pro Leu Pro Glu Met Lys Val Arg Asp Ser 1300 1305 1310

Ser Leu Glu Pro Gly Thr Pro Ser Phe Pro Ala Pro Gly Pro Gly Ser 1315 1320 1325

Trp Asp Leu Gin Thr Val Ala Val Trp Gly Thr Phe Leu Pro Thr Thr 10 1330 1335 1340

Leu Thr Gly Leu Gly His Met Pro Glu Pro Ala Leu Asn Pro Gly Pro 1345 1350 1355 1360

Lys Gly Gin Pro Glu Ser Leu Ser Pro Glu Val Pro Leu Ser Ser Arg 1365 1370 1375 15 Leu Leu Ser Thr Pro Ala Trp Asp Ser Pro Ala Asn Ser His Arg Val 1380 1385 1390

Pro Glu Thr Gin Pro Leu Ala Pro Ser Leu Ala Glu Ala Gly Pro Pro 1395 1400 1405

Ala Asp Pro Leu Val Val Arg Asn Ala Ser Trp Gin Ala Gly Asn Trp 20 1410 1415 1420

Ser Glu Cys Ser Thr Thr Cys Gly Leu Gly Ala Val Trp Arg Pro Val 1425 1430 1435 1440

Arg Cys Ser Ser Gly Arg Asp Glu Asp Cys Ala Pro Ala Gly Arg Pro 1445 1450 1455 25 Gin Pro Ala Arg Arg Cys His Leu Arg Pro Cys Ala Thr Trp His Ser 1460 1465 1470

Gly Asn Trp Ser Lys Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Ser Ser Val 1475 1480 1485

Arg Asp Val Gin Cys Val Asp Thr Arg Asp Leu Arg Pro Leu Arg Pro 30 1490 1495 1500

Phe His Cys Gin Pro Gly Pro Ala Lys Pro Pro Ala His Arg Pro Cys 1505 1510 1515 1520

Gly Ala Gin Pro Cys Leu Ser Trp Tyr Thr Ser Ser Trp Arg Glu Cys 1525 1530 1535 35 Ser Glu Ala Cys Gly Gly Gly Glu Gin Gin Arg Leu Val Thr Cys Pro 1540 1545 1550

Glu Pro Gly Leu Cys Glu Glu Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Arg Pro 1555 1560 1565

Cys Asn Thr His Pro Cys Thr Gin Trp Val Val Gly Pro Trp Gly Gin 40 1570 1575 1580 68

Cys Ser Ala Pro Cys Gly Gly Gly Val Gin Arg Arg Leu Val Lys Cys 1585 1590 1595 1600

Val Asn Thr Gin Thr Gly Leu Pro Glü Glu Asp Ser Asp Gin Cys Gly 1605 1610 1615 5 His Glu Ala Trp Pro Glu Ser Ser Arg Pro Cys Gly Thr Glu Asp Cys 1620 1625 1630

Glu Pro Val Glu Pro Pro Arg Cys Glu Arg Asp Arg Leu Ser Phe Gly 1635 1640 1645

Phe Cys Glu Thr Leu Arg Leu Leu Gly Arg Cys Gin Leu Pro Thr lie 10 1650 1655 1660

Arg Thr Gin Cys Cys Arg Ser Cys Ser Pro Pro Ser His Gly Ala Pro 1665 1670 1675 1680

Ser Arg Gly His Gin Arg Val Ala Arg Arg 1685 1690 15 <210> 6 <211> 5338 · <212> DNA <213> humaan 20 <400> 6 ccggttcctg ccatgcccgg cggccccagt ccccgcagcc ccgcgccttt gctgcgcccc 60 ctcctcctgc tcctctgcgc tctggctccc ggcgcccccg gacccgcacc aggacgtgca 25 120 accgagggcc gggcggcact ggacatcgtg cacccggttc gagtcgacgc ggggggctcc 180 ttcctgtcct acgagctgtg gccccgcgca ctgcgcaagc gggatgtatc tgtgcgccga 240 30 gacgcgcccg ccttctacga gctacaatac cgcgggcgcg agctgcgctt caacctgacc 300 gccaatcagc acctgctggc gcccggcttt gtgagcgaga cgcggcggcg cggcggcctg 360 ggccgcgcgc acatccgggc ccacaccccg gcctgccacc tgcttggcga ggtgcaggac 35 420 cctgagctcg agggtggcct ggcggccatc agcgcctgcg acggcctgaa aggtgtgttc 480 cagctctcca acgaggacta cttcattgag cccctggaca gtgccccggc ccggcctggc 540 69 cacgcccagc cccatgtggt gtacaagcgt caggccccgg agaggctggc acagcggggt 600 gattccagtg ctccaagcac ctgtggagtg caagtgtacc cagagctgga gcctcgacgg 660 5 gagcgttggg agcagcggca gcagtggcgg cggccacggc tgaggcgtct acaccagcgg 720 tcggtcagca aagagaagtg ggtggagacc ctggtggtag ctgatgccaa aatggtggag 780 taccacggac agccgcaggt tgagagctat gtgctgacca tcatgaacat ggtggctggc 10 840 ctgtttcatg accccagcat tgggaacccc atccacatca ccattgtgcg cctggtcctg 900 ctggaagatg aggaggagga cctaaagatc acgcaccatg cagacaacac cccgaagagc 960 15 ttctgcaagt ggcagaaaag catcaacatg aagggggatg cccatcccct gcaccatgac 1020 actgccatcc tgctcaccag aaaggacctg tgtgcaacca tgaaccggcc ctgtgagacc 1080 ctgggactgt cccatgtggc gggcatgtgc cagccgcacc gcagctgcag catcaacgag 20 1140 gacacgggcc-tgccgctggc cttcactgta gcccacgagc tcgggcacag ttttggcatt 1200 cagcatgacg gaagcggcaa tgactgtgag cccgttggga aacgaccttt catcatgtct 1260 25 ccacagctcc tgtacgacgc cgctcccctc acctggtccc gctgcagccg ccagtatatc 1320 accaggttcc ttgaccgtgg gtggggcctg tgcctggacg accctcctgc caaggacatt 1380 atcgacttcc cctcggtgcc acctggcgtc ctctatgatg taagccacca gtgccgcctc 30 1440 cagtacgggg cctactctgc cttctgcgag gacatggata atgtctgcca cacactctgg 1500 tgctctgtgg ggaccacctg tcactccaag ctggatgcag ccgtggacgg cacccggtgt 1560 35 ggggagaata agtggtgtct cagtggggag tgcgtacccg tgggcttccg gcccgaggcc 1620 gtggatggtg gctggtctgg ctggagcgcc tggtccatct gctcacggag ctgtggcatg 1680 ggcgtacaga gcgccgagcg gcagtgcacg cagcctacgc ccaaatacaa aggcagatac 40 1740 1 022 3 71 70 tgtgtgggtg agcgcaagcg cttccgcctc tgcaacctgc aggcctgccc tgctggccgc 1800 ccctccttcc gccacgtcca gtgcagccac tttgacgcca tgctctacaa gggccggctg 1860 5 cacacatggg tgcccgtggt caatgacgtg aacccctgcg agctgcactg ccggcccgcg 1920 aatgagtact ttgccgagaa gctgcgggac gccgtggtcg atggcacccc ctgctaccag 1980 gtccgagcca gccgggacct ctgcatcaac ggcatctgta agaacgtggg cfcgtgacttc 10 2040 gagattgact ccggtgctat ggaggaccgc tgtggtgtgt gccacggcaa cggctccacc 2100 tgccacaccg tgagcgggac cttcgaggag gccgagggcc tggggtatgt ggatgtgggg 2160 15 ctgatcccag cgggcgcacg cgagatccgc atccaagagg ttgccgaggc tgccaacttc 2220 ctggcactgc ggagcgagga cccggagaag tacttcctca atggtggctg gaccatccag 2280 tggaacgggg actaccaggt ggcagggacc accttcacat acgcacgcag gggcaactgg 20 2340 gagaacctca cgtccccggg tcccaccaag gagcctgtct ggatccagct gctgttccag 2400 gagagcaacc ctggggtgca ctacgagtac accatccaca gggaggcagg tggccacgac 2460 25 gaggtcccgc cgcccgtgtt ctcctggcat tatgggccct ggaccaagtg cacagtcacc 2520 tgcggcagag gtgtgcagag gcagaatgtg tactgcttgg agcggcaggc agggcccgtg 2580 gacgaggagc actgtgaccc cctgggccgg cctgatgacc aacagaggaa gtgcagcgag 30 2640 cagccctgcc ctgccaggtg gtgggcaggt gagtggcagc tgtgctccag ctcctgcggg 2700 cctgggggcc tctcccgccg ggccgtgctc tgcatccgca gcgtggggct ggatgagcag 2760 35 agcgccctgg agccacccgc ctgtgaacac cttccccggc cccctactga aaccccttgc 2820 aaccgccatg taccctgtcc ggccacctgg gctgtgggga actggtctca gtgctcagtg 2880 acatgtgggg agggcactca gcgccgaaat gtcctctgca ccaatgacac cggtgtcccc 40 2940 71 tgtgacgagg cccagcagcc agccagcgaa gtcacctgct ctctgccact ctgtcggtgg 3000 cccctgggca cactgggccc tgaaggctca ggcagcggct cctccagcca cgagctcttc 3060 5 aacgaggctg acttcatccc gcaccacctg gccccacgcc cttcacccgc ctcatcaccc 3120 aagccaggca ccatgggcaa cgccattgag gaggaggctc cagagctgga cctgccgggg 3180 cccgtgtttg tggacgactt ctactacgac tacaatttca tcaatttcca cgaggatctg 10 3240 tcctacgggc cctctgagga gcccgatcta gacctggcgg ggacagggga ccggacaccc 3300 ccaccacaca gccgtcctgc tgcgccctcc acgggtagcc ctgtgcctgc cacagagcct 3360 15 cctgcagcca aggaggaggg ggtactggga ccttggtccc cgagcccttg gcctagccag 3420 gccggccgct ccccaccccc accctcagag cagacccctg ggaacccttt gatcaatttc 3480 ctgcctgagg aagacacccc cataggggcc ccagatcttg ggctccccag cctgtcctgg 20 3540 cccagggttt ccactgatgg cctgcagaca cctgccaccc ctgagagcca aaatgatttc 3600 ccagttggca aggacagcca gagccagctg ccccctccat ggcgggacag gaccaatgag 3660 25 gttttcaagg atgatgagga acccaagggc cgcggagcac cccacctgcc cccgagaccc 3720 agctccacgc tgcccccttt gtcccctgtt ggcagcaccc actcctctcc tagtcctgac 3780 gtggcggagc tgtggacagg aggcacagtg gcctgggagc cagctctgga gggtggcctg 30 3840 gggcctgtgg acagtgaact gtggcccact gttggggtgg cttctctcct tcctcctccc 3900 atagcccctc tgccagagat gaaggtcagg gacagttccc tggagccggg gactccctcc 3960 35 ttcccagccc caggaccagg ctcatgggac ctgcagactg tggcagtgtg ggggaccttc 4020 ctccccacaa ccctgactgg cctcgggcac atgcctgagc ctgccctgaa cccaggaccc 4080 aagggtcagc ctgagtccct cagccctgag gtgcccctga gctctaggct gctgtccaca 40 4140 72 ccagcttggg acagccccgc caacagccac agagtccctg agacccagcc gctggctccc 4200 agcctggctg aagcggggcc ccccgcggac ccgttggttg tcaggaacgc cagctggcaa 4260 5 gcgggaaact ggagcgagtg ctctaccacc tgtggcctgg gtgcggtctg gaggccggtg 4320 cgctgtagct ccggccggga tgaggactgc gcccccgctg gccggcccca gcctgcccgc 4380 cgctgccacc tgcggccctg tgccacctgg cactcaggca actggagtaa gtgctcccgc 10 4440 agctgcggcg gaggttcctc agtgcgggac gtgcagtgtg tggacacacg ggacctccgg 4500 ccactgcggc ccttccattg tcagcccggg cctgccaagc cgcctgcgca ccggccctgc 4560 15 ggggcccagc cctgcctcag ctggtacaca tcttcctgga gggagtgetc cgaggcctgt 4620 ggcggtggtg ageageageg tctagtgacc tgcccggagc caggcctctg egaggaggeg 4680 ctgagaccca acaccacccg gccctgcaac acccacccct gcacgcagtg ggtggtgggg 20 4740 ccctggggcc agtgctcagc cccctgtggt ggtggtgtcc agcggcgcct ggtcaagtgt 4800 gtcaacaccc agacagggct gcccgaggaa gacagtgacc agtgtggcca cgaggcctgg 4860 25 cctgagagct cccggccgtg tggcaccgag gattgtgagc ccgtcgagcc tccccgctgt 4920 gagcgggacc gcctgtcctt cgggttctgc gagacgctgc gcctactggg ccgctgccag 4980 ctgcccacca tccgcaccca gtgctgccgc tcgtgctctc cgcccagcca cggcgccccc 30 5040 tcccgaggcc atcagcgggt tgcccgccgc tgactgtgcc aggatgcaca gaccgaccga 5100 cagacctcag tgcccaccac gggctgtggc ggagctcccg ccccctgcgc cctaatggtg 5160 35 ctaaccccct ctcactaccc ageageagge tggggacctc ctccccctca aaaaaggtat 5220 ttttttattc taacagtttg tgtaacattt attatgattt tacataaatg agcatctacc 5280 attccaaagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 40 5338 / 1 73 <210> 7 <211> 947 <212> PRT 5 <213> humaan <400> 7

Met Gin Phe Val Ser Trp Ala Thr Leu Leu Thr Leu Leu Val Arg Asp 15 10 15 10 Leu Ala Glu Met Gly Ser Pro Asp Ala Ala Ala Ala Val Arg Lys Asp 20 25 30

Arg Leu His Pro Arg Gin Val Lys Leu Leu Glu Thr Leu Ser Glu Tyr 35 40 45

Glu He Val Ser Pro lie Arg Val Asn Ala Leu Gly Glu Pro Phe Pro 15 50 55 60

Thr Asn Val His Phe Lys Arg Thr Arg Arg Ser lie Asn Ser Ala Thr 65 70 75 80

Asp Pro Trp Pro Ala Phe Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser 85 90 95 20 Gin Ala His Tyr Arg Leu Ser Ala Phe Gly Gin Gin Phe Leu Phe Asn 100 105 110

Leu Thr Ala Asn Ala Gly Phe He Ala Pro Leu Phe Thr Val Thr Leu 115 120 125

Leu Gly Thr Pro Gly Val Asn Gin Thr Lys Phe Tyr Ser Glu Glu Glu 25 130 135 140

Ala Glu Leu Lys His Cys Phe Tyr Lys Gly Tyr Val Asn Thr Asn Ser 145 150 155 160

Glu His Thr Ala Val He Ser Leu Cys Ser Gly Met Leu.Gly Thr Phe 165 170 175 30 Arg Ser His Asp Gly Asp Tyr Phe lie Glu Pro Leu Gin Ser Met Asp 180 185 190

Glu Gin Glu Asp Glu Glu Glu Gin Asn Lys Pro His lie He Tyr Arg 195 200 205

Arg Ser Ala Pro Gin Arg Glu Pro Ser Thr Gly Arg His Ala Cys Asp 35 210 215 220

Thr Ser Glu His Lys Asn Arg His Ser Lys Asp Lys Lys Lys Thr Arg 225 230 235 240

Ala Arg Lys Trp Gly Glu Arg He Asn Leu Ala Gly Asp Val Ala Ala 245 250 255 1022371 74

Leu Asti Ser Gly Leu Ala Thr Glu Ala Phe Ser Ala Tyr Gly Asn Lys 260 265 270

Thr Asp Asn Thr Arg Glu Lys Arg Thr His Arg Arg Thr Lys Arg Phe 275 280 285 5 Leu Ser Tyr Pro Arg Phe Val Glu Val Leu Val Val Ala Asp Asn Arg 290 295 300

Met Val Ser Tyr His Gly Glu Asn Leu Gin His Tyr He Leu Thr Leu 305 310 315 320

Met Ser lie Val Ala Ser lie Tyr Lys Asp Pro Ser lie Gly Asn Leu 10 325 330 335 lie Asn lie Val lie Val Asn Leu He Val He His Asn Glu Gin Asp 340 345 350

Gly Pro Ser He Ser Phe Asn Ala Gin Thr Thr Leu Lys Asn Phe Cys 355 360 365 15 Gin Trp Gin His Ser Lys Asn Ser Pro Gly Gly lie His His Asp Thr 370 375 380

Ala Val Leu Leu Thr Arg Gin Asp lie Cys Arg Ala His Asp Lys Cys 385 390 395 400

Asp Thr Leu Gly Leu Ala Glu Leu Gly Thr lie Cys Asp Pro Tyr Arg 20 405 410 415

Ser Cys Ser He Ser Glu Asp Ser Gly Leu Ser Thr Ala Phe Thr lie 420 425 430

Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Asn Asn 435 440 445 25 Lys Cys Lys Glu Glu Gly Val Lys Ser Pro Gin His Val Met Ala Pro 450 455 460

Thr Leu Asn Phe Tyr Thr Asn Pro Trp Met Trp Ser Lys Cys Ser Arg 465 470 475 480

Lys Tyr lie Thr Glu Phe Leu Asp Thr Gly Tyr Gly Glu Cys Leu Leu 30 485 490 495

Asn Glu Pro Glu Ser Arg Pro Tyr Pro Leu Pro Val Gin Leu Pro Gly 500 505 510

He Leu Tyr Asn Val Asn Lys Gin Cys Glu Leu lie Phe Gly Pro Gly 515 520 525 35 Ser Gin Val Cys Pro Tyr Met Met Gin Cys Arg Arg Leu Trp Cys Asn 530 535 540

Asn Val Asn Gly Val His Lys Gly Cys Arg Thr Gin His Thr Pro Trp 545 550 555 560

Ala Asp Gly Thr Glu Cys Glu Pro Gly Lys His Cys Lys Tyr Gly Phe 40 565 570 575 \ f 75

Cys Val Pro Lys Glu Met Asp Val Pro Val Thr Asp Gly Ser Trp Gly 580 585 590

Ser Trp Ser Pro Phe Gly Thr Cys Ser Arg Thr Cys Gly Gly Gly lie 595 500 605 5 Lys Thr Ala lie Arg Glu Cys Asn Arg Pro Glu Pro Lys Asn Gly Gly 610 615 620

Lys Tyr Cys Val Gly Arg Arg Met Lys Phe Lys Ser Cys Asn Thr Glu 625 630 635 640

Pro Cys Leu Lys Gin Lys Arg Asp Phe Arg Asp Glu Gin Cys Ala His 10 645 650 655

Phe Asp Gly Lys His Phe Asn lie Asn Gly Leu Leu Pro Asn Val Arg 660 665 670

Trp Val Pro Gin Tyr Ser Gly lie Leu Met Lys Asp Arg Cys Lys Leu 675 680 685 15 Phe Cys Arg Val Ala Gly Asn Thr Ala Tyr Tyr Gin Leu Arg Asp Arg 690 695 700

Val lie Asp Gly Thr Pro Cys Gly Gin Asp Thr Asn Asp lie Cys Val 705 710 715 720

Gin Gly Leu Cys Arg Gin Ala Gly Cys Asp His Val Leu Asn Ser Lys 20 725 730 735

Ala Arg Arg Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys 740 745 750

Lys Thr Val Ala Gly Thr Phe Asn Thr Val His Tyr Gly Tyr Asn Thr 755 760 765 25 Val Val Arg lie Pro Ala Gly Ala Thr Asn lie Asp Val Arg Gin His 770 775 780

Ser Phe Ser Gly Glu Thr Asp Asp Asp Asn Tyr Leu Ala Leu Ser Ser 785 790 795 800

Ser Lys Gly Glu Phe Leu Leu Asn Gly Asn Phe Val Val Thr Met Ala 30 805 810 ' 815

Lys Arg Glu lie Arg lie Gly Asn Ala Val Val Glu Tyr Ser Gly Ser 820 825 830

Glu Thr Ala Val Glu Arg lie Asn Ser Thr Asp Arg He Glu Gin Glu 835 840 845 35 Leu Leu Leu Gin Val Leu Ser Val Gly Lys Leu Tyr Asn Pro Asp Val 850 855 860

Arg Tyr Ser Phe Asn lie Pro lie Glu Asp Lys Pro Gin Gin Phe Tyr 865 870 875 880

Trp Asn Ser His Gly Pro Trp Gin Ala Cys Ser Lys Pro Cys Gin Gly 40 885 890 895 76

Glu Arg Lys Arg Lys Leu Val Cys Thr Arg Glu Ser Asp Gin Leu Thr 900 905 910

Val Ser Asp Gin Arg Cys Asp Arg Leu Pro Gin Pro Gly His Ile Thr 915 920 925 5 Glu Pro Cys Gly Thr Asp Cys Asp Leu Arg Trp Ala Thr Val Phe Ser 930 935 940

Arg Pro Leu 945 10 <210> 8 <211> 4086 <212> DNA <213> humaan 15 <400> 8 ggtcgtggtg ctggagttta agttgagtag taggaatgcg gtagtagtta ggataatata 60 aatagttaaa ttaagaatgg ttatgttagg gttgtacggt agaactgcta ttattcatcc 120 20 tatgtgggta attgaggagt atgctaagat tttgcgtagc tgggtttggt ttaatccacc 180 tcaactgcct gctatgatgg ataagattga gagagtgagg agaaggctta cgtttagtga 240 gggagagatt tggtatatga ttgagatggg ggctagtttt tgtcatgtga gaagaagcag 25 300 gccggatgtc agaggggtgc cttgggtaac ctctgggact cagaagtgaa agggggctat 360 tcctagtttt attgctatag ccattatgat tattaatgat gagtattgat tggtagtatt 420 30 ggttatggtt cattgtccgg agagtatatt gttgaagagg atagctatta gaaggattat 480 ggatgcggtt acttgcgtga ggaaatactt gatggcagct tctgtggaac gagggtctat 540 ttttttggtt agaactggaa taaaagctag catgtttatt tctaggccta ctcaggtaaa 35 600 aaatcagtgc gagcttagcg ctgtgatgag tgtgcctgca aagatggtag agtagatgac 660 gggggagggg tgggaagcac catgcagttt gtatcctggg ccacactgct aacgctcctg 720 ' 0 2 23 71 - 77 gtgcgggacc tggccgagat ggggagccca gacgccgcgg cggccgtgcg caaggacagg 780 ctgcacccga ggcaagtgaa attattagag accctgagcg aatacgaaat cgtgtctccc 840 5 atccgagtga acgctctcgg agaacccttt cccacgaacg tccacttcaa aagaacgcga 900 cggagcatta actctgccac tgacccctgg cctgccttcg cctcctcctc ttcctcctct 960 acctcctccc aggcgcatta ccgcctctct gccttcggcc agcagtttct atttaatctc 10 1020 accgccaatg ccggatttat cgctccactg ttcactgtca ccctcctcgg gacgcccggg 1080 gtgaatcaga ccaagtttta ttccgaagag gaagcggaac tcaagcactg tttctacaaa 1140 15 ggctatgtca ataccaactc cgagcacacg gccgtcatca gcctctgctc aggaatgctg 1200 ggcacattcc ggtctcatga tggggattat tttattgaac cactacagtc tatggatgaa 1260 caagaagatg aagaggaaca aaacaaaccc cacatcattt ataggcgcag cgccccccag 20 1320 agagagccct caacaggaag gcatgcatgt gacacctcag aacacaaaaa taggcacagt 1380 aaagacaaga agaaaaccag agcaagaaaa tggggagaaa ggattaacct ggctggtgac 1440 25 gtagcagcat taaacagcgg cttagcaaca gaggcatttt ctgcttatgg taataagacg 1500 gacaacacaa gagaaaagag gacccacaga aggacaaaac gttttttatc ctatccacgg 1560 tttgtagaag tcttggtggt ggcagacaac agaatggttt cataccatgg agaaaacctt 30 1620 caacactata ttttaacttt aatgtcaatc gtagcctcta tctataaaga cccaagtatt 1680 ggaaatttaa ttaatattgt tattgtgaac ttaattgtga ttcataatga acaggatggg 1740 35 ccttccatat cttttaatgc tcagacaaca ttaaaaaact tttgccagtg gcagcattcg 1800 aagaacagtc caggtggaat ccatcatgat actgctgttc tcttaacaag acaggatatc 1860 tgcagagctc acgacaaatg tgatacctta ggcctggctg aactgggaac catttgtgat 40 1920 C' l \ / i! ! !; / / 78 ccctatagaa gctgttctat tagtgaagat agtggattga gtacagcttt tacgatcgcc 1980 catgagctgg gccatgtgtt taacatgcct catgatgaca acaacaaatg taaagaagaa 2040 5 ggagttaaga gtccccagca tgtcatggct ccaacactga acttctacac caacccctgg 2100 atgtggtcaa agtgtagtcg aaaatatatc actgagtttt tagacactgg ttatggcgag 2160 tgtttgctta acgaacctga atccagaccc taccctttgc ctgtccaact gccaggcatc 10 2220 ctttacaacg tgaataaaca atgtgaattg atttttggac caggttctca ggtgtgccca 2280 tatatgatgc agtgcagacg gctctggtgc aataacgtca atggagtaca caaaggctgc 2340 15 cggactcagc acacaccctg ggccgatggg acggagtgcg agcctggaaa gcactgcaag 2400 tatggatttt gtgttcccaa agaaatggat gtccccgtga cagatggatc ctggggaagt 2460 tggagtccct ttggaacctg ctccagaaca tgtggagggg gcatcaaaac agccattcga 20 2520 gagtgcaaca gaccagaacc aaaaaatggt ggaaaatact gtgtaggacg tagaatgaaa 2580 tttaagtcct gcaacacgga gccatgtctc aagcagaagc gagacttccg agatgaacag 2640 25 tgtgctcact ttgacgggaa gcattttaac atcaacggtc tgcttcccaa tgtgcgctgg 2700 gtccctcaat acagtggaat tctgatgaag gaccggtgca agttgttctg cagagtggca 2760 gggaacacag cctactatca gcttcgagac agagtgatag atggaactcc ttgtggccag 30 2820 gacacaaatg atatctgtgt ccagggcctt tgccggcaag ctggatgcga tcatgtttta 2880 aactcaaaag cccggagaga taaatgtggg gtttgtggtg gcgataattc ttcatgcaaa 2940 35 acagtggcag gaacatttaa tacagtacat tatggttaca atactgtggt ccgaattcca 3000 gctggtgcta ccaatattga tgtgcggcag cacagtttct caggggaaac agacgatgac 3060 aactacttag ctttatcaag cagtaaaggt gaattcttgc taaatggaaa ctttgttgtc 40 3120 79 acaatggcca aaagggaaat tcgcattggg aatgctgtgg tagagtacag tgggtccgag 3180 actgccgtag aaagaattaa ctcaacagat cgcattgagc aagaactttt gcttcaggtt 3240 5 ttgtcggtgg gaaagttgta caaccccgat gtacgctatt ctttcaatat tccaattgaa 3300 gataaacctc agcagtttta ctggaacagt catgggccat ggcaagcatg cagtaaaccc 3360 tgccaagggg aacggaaacg aaaacttgtt tgcaccaggg aatctgatca gcttactgtt 10 3420 tctgatcaaa gatgcgatcg gctgccccag cctggacaca ttactgaacc ctgtggtaca 3480 gactgtgacc tgaggtgggc cactgttttc tcaaggcctt tataaatgaa ttgtgagagt 3540 15 cttgcaggag gtcccagcag gagaagcaaa aggaggggat gccggtcttt agttcccctt 3600 tcttgtgttt cagtgaaata agctttaacc aattctccat ccctctggaa ctgattatcc 3660 aagacataca tgtgcagatt tcttgttcac ctaagaatta aaaatagcta atagagtatg 20 3720 gcacttgcca aaaaaaattc agttgatcct cacmacttgc tgggtaggta ttagcattat 3780 gattgagtca cattgtacgt gaaaacttgt tttgaaagtc aaaagaaaag agggagaacc 3840 25 tcatccctca aagtacccat aatgacctat atctaccgag agtgtatacc acccagtaga 3900 agaactccta cacacctgaa agttgcagta cactaaggta gcgtcatgga agaaacaaga 3960 agaaaatgta tatatggatg tytgagatat tcaaacaatt ctgtgtttaa gaaaaaaaaa 30 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaa&aa agtactctgc gttgttacca ctgcttgccc tatagtgagt 4080 cgtatt 4086 35 <210> 9 <211> 41

<212> DNA

<213> Kunstmatige sequentie 80 <220> <223> primer 5 <400> 9 gatcgcggcc gctatggtgg acacgtggcc tctatggctc c 41 <210> 10 10 <211> 43

<212> DNA

<213> Kunstmatige sequentie <220> 15 <223> primer <400> 10 tgaggccttc agggccgatc actgtgcaga gcactcaccc cat 43 20 1022 3 71

Claims (16)

1. Een MPTS-20 eiwit in een andere dan in zijn natuurlijke omgeving.

2. Het eiwit overeenkomstig conclusies 1, waarbij genoemd eiwit een aminozuur 5 sequentie heeft die identiek is met SEQ ID NO:07.

3. Een nucleïnezuur dat aanwezig is in een andere dan zijn natuurlijke omgeving, waarbij genoemd nucleïnezuur een nucleotide sequentie heeft die codeert voor een MPTS-20 eiwit. 10

4. Een nucleïnezuur overeenkomstig conclusie 3, waarbij genoemd nucleïnezuur een nucleïnezuur sequentie heeft die gelijk is aan, of substantieel identiek is aan, de nucleotide sequentie van SEQ ID NO:08.

5. Een expressiecassette die een transcriptie initiatie gebied bevat dat functioneel 15 is in een expressie gastheer, een nucleotide sequentie overeenkomstig de conclusies 3 of 4, onder transcriptie regulatie van genoemd transcriptie initiatie gebied, en een transcriptie terminatie gebied dat functioneel is in genoemde expressie gastheer bevat.

6. Een cel die een expressiecassette overeenkomstig conclusie 5 bevat, als onderdeel 20 van een extra-chromosomaal element of, door het inbrengen van genoemde expressie cassette in genoemde gastheer cel, geïntegreerd in het genoom van een gastheer cel.

7. Het cellulaire nageslacht van de gastheer cel overeenkomstig conclusie 6.

8. Een monoklonaal antilichaam dat specifiek bindt aan een MPTS eiwit overeenkomstig conclusie 1.

9. Een methode voor het produceren van een MPTS eiwit, waarbij genoemde methode omvat: het groeien van een cel overeenkomstig conclusie 6, waarbij genoemd eiwit tot expressie wordt gebracht; en . ".j j 1 het isoleren van genoemd eiwit dat substantieel vrij is van andere eiwitten.

10. Een MPTS eiwit als in conclusie 1 of 2, wanneer dit door een proces overeenkomstig conclusie 9 wordt geproduceerd. 5

11. Een methode voor het testen voor identificatie van MPTS-modulerende agentia, waarbij genoemde methode omvat: het in contact brengen van MPTS eiwit overeenkomstig conclusie 1, met een substraat in aanwezigheid van een potentieel modulerend agens; en het bepalen van het effect van genoemd modulerend agens op de activiteit van genoemd eiwit.

12. De methode overeenkomstig conclusie 11, waarbij genoemd substraat een glu-ala binding bevat.

13. De methode overeenkomstig conclusie 12, waarin genoemd substraat aggrecaan is of een fragment daarvan.

14. Een methode voor het behandelen van een gastheer die lijdt aan een ziektebeeld dat geassocieerd is met MPTS-activiteit, specifiek daar waar genoemd ziektebeeld wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, waarbij 20 genoemde methode omvat: het toedienen aan genoemde gastheer van een MPTS-modulerend agens, specifiek een antagonist.

15. Het gebruik van een MPTS-modulerend agens, verkrijgbaar of verkregen met de methode van conclusie 11, voor de bereiding van een medicament voor de behandeling 25 van een ziektebeeld dat geassocieerd is met MPTS-activiteit, specifiek dar waarin genoemd ziektebeeld wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van aggrecaan klievingsproducten, zoals artritis.

16. De uitvinding zoals hiervoor hierin beschreven. J