JPH11155585A

JPH11155585A - 新規化合物

Info

Publication number: JPH11155585A
Application number: JP10254497A
Authority: JP
Inventors: David Michalovich; デイビッド・ミカロビッチ
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 1999-06-15
Also published as: US6087169A; US6316239B1; CA2239267A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドおよびポリヌク
レオチド、ならびに組み換え法によりかかるポリペプチ
ドを製造する方法、ならびに、とりわけ、癌、炎症性疾
患、免疫性疾患およびウイルス性疾患の治療プロトコー
ルの設計ならびにかかる症状の診断におけるＨＫＡＢＹ
６０ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を提供
する。【解決手段】配列番号：２のポリペプチド配列に対し
て少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド、な
らびに配列番号：２のポリペプチドをコードしているヌ
クレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有
するヌクレオチド配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにそれらの製造に関する。より詳細に
は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以
下、ＨＫＡＢＹ６０という）は保存されたヘリックス−
ループ−ヘリックス遍在キナーゼファミリーに関連して
いる。また本発明は、かかるポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの阻害または活性化にも関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの保存されたヘリックス−ループ−
ヘリックス遍在キナーゼ（ＣＨＵＫ）は、最近になっ
て、核因子カッパ−Ｂ（ＮＦ−カッパＢ）転写アクチベ
ーターを活性化する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−インター
ロイキン−１（ＩＬ−１）シグナルトランスダクション
経路において作用することが示された（C. H. Regnier,
et al., Cell 90: 373-383, 1997）。マウスのＣＨＵ
Ｋも最近になって同定された（M. A. Connelly and K.
B. Marcu, Cell. Mol. Buiol. Res. 41: 537-549,199
5）。ＣＨＵＫは、ＮＦ−カッパ−Ｂの阻害剤Ｉ−カッ
パ−Ｂをリン酸化するように作用し、その阻害剤を分解
し、ＮＦ−カッパ−Ｂ媒介遺伝子活性化を引き起こすこ
とを目的とする。ＮＦ−カッパ−Ｂおよび関連蛋白は、
多くの免疫および炎症応答遺伝子ならびにウイルス遺伝
子の発現を制御し、さらに悪性細胞形質転換にも関与し
ている（P. A. Baeuerle and D. Baitimore, Cell 87:
13-20, 1996; P. A. Baeuerle and T. Henkel, Annu. R
ev. Immunol. 12: 141-179, 1995）。それゆえ、このシ
グナルトランスダクション経路を理解することは、生物
医学的に非常に重要である。このことは、保存されたヘ
リックス−ループ−ヘリックス偏在キナーゼファミリー
が治療標的として潜在的に使用可能であり、その結果、
当該ファミリーのさらなるメンバーの同定および特徴づ
けに対する必要性が存在する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】１の態様において、本
発明は、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドならびにその製造
のための組み換え物質および方法に関する。本発明のも
う１つの態様は、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドの使用方法に関する。かかる方法は、と
りわけ、癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス性
疾患の治療を包含する。さらにもう１つの態様におい
て、本発明は、本発明により提供される材料を用いるア
ンタゴニストおよびアゴニストの同定方法、ならびに同
定された化合物を用いるＨＫＡＢＹ６０のバランス不良
関連症状の治療方法に関する。さらにもう１つの態様
は、不適当なＨＫＡＢＹ６０活性またはレベルに関連し
た疾病の検出のための診断アッセイに関する。

【０００４】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
定義下記定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の
理解を容易にするためのものである。「ＨＫＡＢＹ６
０」は、とりわけ、配列番号：２に示すアミノ酸配列を
有するポリペプチド、またはその対立遺伝子変種をい
う。

【０００５】「受容体活性」または「受容体の生物学的
活性」は、該ＨＫＡＢＹ６０の代謝的または生理学的機
能をいい、類似の活性または改善された活性または望ま
しくない副作用を減じられたこれらの活性を包含する。
該ＨＫＡＢＹ６０の抗原性活性および免疫原性活性も含
まれる。

【０００６】「ＨＫＡＢＹ６０遺伝子」は、配列番号：
１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまた
はその対立遺伝子変種および／またはその相補物をい
う。

【０００７】本明細書の用語「抗体」は、ポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本鎖、ならび
にヒト化抗体、さらにはＦａｂフラグメントを包含し、
Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生
成物も包含する。

【０００８】「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変化させられた、すなわち、それが天然に存在
する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り除
く、またはその両方を行ったことを意味する。例えばポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で生
存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、同
一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に共
存する物質から分離されている場合は、本明細書に用い
る用語である、「単離」がなされている。

【０００９】「ポリヌクレオチド」とは、一般的には、
修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾さ
れたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、任意のポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
意味する。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本
鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本
鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖
領域の混合物でよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリ
ッド分子を意味するが、これに限定するものではない。
さらに、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ
もしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含
む三本鎖領域を意味する。用語「ポリヌクレオチド」
は、安定性またはその他の理由により、修飾された骨格
を有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびに修飾された骨格
を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾され
た」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンの
ごとき通常的でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮ
ＡおよびＲＮＡについて行われており、よって、「ポリ
ヌクレオチド」は、典型的に天然において見いだされる
ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾
された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤ
ＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポ
リヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称
する短いポリヌクレオチドを包含する。

【００１０】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個
またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは
蛋白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペ
プチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは２０種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然のプロセッシングにより修飾されたものが
含まれるが、当業者に周知の化学修飾技術によっても修
飾される。このような修飾は基礎的な参考書およびさら
に詳細な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載さ
れており、これらは当業者に周知である。修飾は、ペプ
チド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ
ル末端等のポリペプチドの任意の部位で行われうる。同
一の型の修飾は該ポリペプチドの幾つかの部位で、同一
または異なる程度で存在し得ることは理解されよう。ま
た、ポリペプチドは多くの型の修飾をも含み得る。ポリ
ペプチドは、ユビキチネーションの結果として分枝状で
あってもよく、分枝を伴うまたは伴わない環状のもので
あってもよい。環状、分枝状および分枝状かつ環状のポ
リペプチドは翻訳後の天然プロセッシングにより生じる
ものであってもよく、あるいは合成法により製造される
ものであってもよい。修飾には、アセチル化、アシル
化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結
合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、
環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、交差架橋共
有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホ
ルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、Ｇ
ＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリ
ストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシング、リン
酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結
合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル
化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノイル化、硫
酸化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介
の蛋白へのアミノ酸の添加、ならびにユビキチネーショ
ンなどがある。例えばProteins-Structure and Molecul
ar Properties、第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman
and Company、ニューヨーク（1993）およびPosttransla
tional Covalent Modification of Proteins、B.C.John
son編、アカデミックプレス、ニューヨーク（1983）のW
old,F.,Posttranslational Protein Modifications：Pe
rspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth.
Enzymol.182:626-646（1990）およびRattanら、Protein
Synthesis：Posttranslational Modifications and Ag
ing，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62（1992）参照。

【００１１】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
には、差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が全
体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよ
うに限定される。変種および対照ポリペプチドは、１ま
たはそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで
起こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換ま
たは挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードにより
コードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの変種は、例えば対立遺伝子
変種のような天然発生のものでよいか、または天然に発
生することが知られていない変種でよい。ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの非天然発生変種は、突然変異
技術、直接的合成、および当業者に既知のその他の組換
え技術により製造できる。

【００１２】「同一性」は、２つまたはそれ以上のポリ
ペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列間の関連性を反映するものであり、配列を比較
することにより決定される。一般的には、同一性は、比
較すべき配列の全長にわたる２つのポリヌクレオチドま
たは２つのポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌ
クレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応性をいう。
正確に対応しない配列について、「同一性％」を決定す
ることができる。一般的には、比較すべき２つの配列を
並置して、配列間において最大の関連性が得られるよう
にする。これには一方または両方の配列に「ギャップ」
を挿入して並置の程度を向上させることを用いてもよ
い。同一性％を比較すべき各配列の全長にわたって決定
してもよく（いわゆる全体並置）、同じまたは非常に近
似した長さの配列、より短い決まった長さの配列（いわ
ゆる部分並置）に特に適しており、等しくない長さの配
列に、より適している。２つまたはそれ以上の配列の同
一性の比較方法は当該分野においてよく知られている。
よって、例えば、Wisconsin Sequence Analysis Packag
e, version 9.1(Devereux J et al, Nucleic Acids Re
s, 12; 387-395, 1984、Genetics Computer Group, Mad
ison, Wisconsin, USAから利用可能)において利用可能
なプログラム、例えばプログラムBESTFITおよびGAPを用
いて２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド
配列間の同一性％を決定してもよい。BESTFITはSmith a
nd Watermanの「部分相同性」アルゴリズム(J. Mol. Bi
ol., 147: 195-197, 1981, Advances in Applied Mathe
matics, 2, 482-489, 1981)を用い、２つの配列間の単
一の最良の類似性領域を見つけるものである。BESTFIT
は、長さの異なる２つのポリヌクレオチドまたは２つの
ポリペプチド配列の比較に適し、そのプログラムは、短
いほうの配列が長いほうの配列の一部であると仮定する
ものである。比較において、GAPは２つの配列を並置
し、Needleman and Wunschのアルゴリズム（J. Mol. Bi
ol., 48, 443-453, 1970）に従って「最大類似性」を見
つけだすものである。GAPは、ほぼ同じ長さの配列の比
較に、より適しており、並置は全長にわたる。好ましく
は、各プログラムに使用されるパラメーター「Gap Weig
ht」および「Length Weight」はそれぞれ、ポリヌクレ
オチド配列については５０および３であり、ポリペプチ
ド配列については１２および４である。好ましくは、２
つの配列が比較され、最適な並置がされた場合に同一性
％が決定される。２つの配列間の同一性％の決定のため
の他のプログラムも、当該分野において知られており、
例えばBLASTファミリーのプログラム（Altschul S F et
al, J Mol Biol,215, 403-410, 1990、Altschul S F e
t al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997、Natio
nal Center for Biotechnology Infoemation (NCBI), B
ethesda, Maryland, USAから利用可能で、NCBIのホーム
ページwww.ncbi.nim.nih.govにより利用可能）およびFA
STA（Pearson W R, Methods in Enzymology, 183,63-9
9, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad
Aci USA, 85, 2444-2448, 1988、Wisconsin Sequence
Analysis Packageの一部として利用可能）がある。好ま
しくは、比較前にヌクレオチド配列がアミノ酸配列に翻
訳される場合を含めて、BLOSUM62アミノ酸置換マトリッ
クス（Henikoff S and Henikoff J G, Proc Nat Acad S
ci USA, 89, 10915-10919, 1992）をポリペプチド配列
比較に使用する。好ましくは、プログラムBESTFITを用
いて、本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列
に対して問題のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の
同一性％が決定され、上記のごとく問題の配列およびリ
ファレンス配列は最適に並置され、プログラムのパラメ
ーターは省略値にセットされる。

【００１３】本発明のポリペプチド１の態様において、本発明はＨＫＡＢＹ６０ポリペプチ
ド（ＨＫＡＢＹ６０蛋白）に関する。配列番号：２のポ
リペプチドは、全長のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのＮ
末端の２０１個のアミノ酸残基である部分ペプチドであ
る。本発明ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドは、配列番号：
２のポリペプチド；ならびに配列番号：２のアミノ酸配
列を含むポリペプチド；および配列番号：２に対して全
長にわたり少なくとも８０％の同一性、さらに好ましく
は少なくとも９０％の同一性、そのうえさらに好ましく
は配列番号：２に対して少なくとも９５％の同一性を有
するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。さら
にそのうえ、少なくとも９７〜９９％の同一性を有する
ものが非常に好ましい。また、配列番号：２のアミノ酸
配列を有するポリペプチドに対して全長にわたり少なく
とも８０％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９０
％の同一性、そのうえさらに好ましくは配列番号：２に
対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列
を有するポリペプチドもＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドに
包含される。さらにそのうえ、少なくとも９７〜９９％
の同一性を有するものが非常に好ましい。好ましくは、
ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドは、ＨＫＡＢＹ６０の生物
学的活性のうちの少なくとも１つを示す。

【００１４】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドは「成熟」蛋
白の形態であってもよく、あるいは融合蛋白のごとき大
型の蛋白の一部であってもよい。分泌またはリーダー配
列、プロ配列、複数のヒスチジン残基のごとき精製を促
進する配列、または組み換え生産を行っている間の安定
性のためのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を
含んでいることがしばしば有利である。

【００１５】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの生物学的に
活性のあるフラグメントも本発明に包含される。フラグ
メントは、前述のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのアミノ
酸配列のすべてではなく一部に対して全く同一であるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＨＫＡＢＹ６
０ポリペプチドについては、フラグメントは「独立して
存在するもの（free standing）」であるか、あるいは
より大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、その
中でフラグメントは一部分もしくは領域を形成してい
る。最も好ましくは、単一の連続した領域として、より
大きなポリペプチドに含まれる。本発明ポリペプチドフ
ラグメントの典型例は、例えば、ＨＫＡＢＹ６０ポリペ
プチドのアミノ酸番号約１〜２０、２１〜４０、４１〜
６０、６１〜８０、８１〜１００および１０１から末端
までからなるフラグメントを包含する。この意味におい
て、「約」とは、片方の端または両端において、示され
た数よりも数個、５個、４個、３個、２個または１個多
いかまたは少ない範囲を含む。

【００１６】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシ末端を
含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端でも
う一方がカルボキシ末端を含む２種の一連の残基が欠失
していること以外はＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を有する末端切断ポリペプチドを包含する。ま
た、構造的または機能的属性により特徴づけられるフラ
グメント、例えばアルファーヘリックスおよびアルファ
ーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベータシー
ト形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよ
びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、アルファ
ー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面
形成領域、基質結合領域、および高抗原性指標領域を含
むフラグメントなども好ましい。受容体活性を媒介す
る、生物学的に活性な領域も好ましく、類似の活性もし
くは改善された活性のある、または望ましくない活性を
減じたフラグメント等がある。動物、とりわけヒトにお
いて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた含まれ
る。

【００１７】好ましくは、これらのポリペプチドのすべ
ては、抗原的活性を包含する受容体の生物学的活性を保
持している。上記配列およびフラグメントの変種もこの
グループに含まれる。好ましい変種は、保存的アミノ酸
置換により変化したものであり、すなわち、同様の特徴
を有するアミノ酸により置換されているものである。典
型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩ
ｌｅ間：ＳｅｒおよびＴｈｒ間；ＡｓｐおよびＧｌｕ
間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；ならびに塩基性残基Ｌｙｓ
およびＡｒｇ間；あるいは芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙ
ｒ間におけるものである。数個、５ないし１０個、１な
いし５個、または１ないし２個のアミノ酸がいずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている変種が特
に好ましい。

【００１８】いずれの適当な方法でも本発明ＨＫＡＢＹ
６０ポリペプチドを製造することができる。かかるポリ
ペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組み換え法
によるポリペプチド、合成法によるポリペプチド、また
はこれらの方法の組み合わせによるポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの製造手段は当該分野におい
てよく理解されている。

【００１９】本発明のポリヌクレオチド本発明のもう１つの態様は、ＨＫＡＢＹ６０ポリヌクレ
オチドに関する。ＨＫＡＢＹ６０ポリヌクレオチドは、
ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドおよびフラグメントをコー
ドしている単離ポリヌクレオチド、ならびにそれらに密
接に関連しているポリヌクレオチドを包含する。より詳
細には、本発明ＨＫＡＢＹ６０ポリヌクレオチドは、配
列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドをコードして
いる配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチド、ならびに配列番号：１の特定の配列を有す
るポリヌクレオチドを包含する。さらにＨＫＡＢＹ６０
ポリヌクレオチドは、配列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポ
リペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対して
全長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号：１の配
列を有するポリヌクレオチドに対して全長にわたり少な
くとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含
む。この点において、詳細には、少なくとも９０％同一
であるポリヌクレオチドが好ましく、少なくとも９５％
同一であるものが特に好ましい。さらにそのうえ、少な
くとも９７％同一のものが非常に好ましく、少なくとも
９８−９９％同一のものが最も非常に好ましく、９９％
同一のものが最高に好ましい。配列番号：１に含まれる
ヌクレオチド配列に対して十分な同一性を有し、増幅に
使用可能であるかまたはプローブもしくはマーカーとし
て使用される条件下でハイブリダイゼーションするヌク
レオチド配列もＨＫＡＢＹ６０ポリヌクレオチドに包含
される。また本発明は、かかるＨＫＡＢＹ６０ポリヌク
レオチドに対して相補的なポリヌクレオチドも提供す
る。

【００２０】配列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチ
ドをコードしている配列番号：１のｃＤＮＡの配列決定
結果により示されるように、本発明ＨＫＡＢＹ６０は、
保存されたヘリックス−ループ−ヘリックス遍在キナー
ゼファミリーの他の蛋白に構造的に関連している。配列
番号：１のｃＤＮＡ配列は１つの読み枠（ヌクレオチド
番号１７３から７７５まで）を含んでおり、配列番号：
２に示す２０１個のアミノ酸からなる部分ポリペプチド
をコードしている。配列番号：２のアミノ酸配列は、ヒ
トＣＨＵＫ（C. H. Regnier et al., Cell, 90: 373-38
3, 1997）に対して２０１個のアミノ酸残基において約
６７％の同一性を有する（Smith-Watermanを用いた場
合）。さらにそのうえ、ＨＡＢＹ６０（配列番号：２）
は、２０１個のアミノ酸残基にわたってマウスＣＨＵＫ
（C. H. Regnier et al., Cell, 90: 373-383, 1997）
に対して６７％同一である。配列番号：１のヌクレオチ
ド配列は、マウスＣＨＵＫ（M. A. Connelly and K. B.
Marcu, Cell. Mol. Biol. Res. 41: 537-549, 1995）
に対して５６６個のヌクレオチドにおいて約６７．５％
の同一性を有する(Smith-Watermanを用いた場合)。よっ
て、本発明ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドおよびポリヌク
レオチドは、とりわけ、それらの相同的ポリペプチドお
よびポリペプチドに対して類似の生物学的機能／特性を
有すると考えられ、それらの有用性は当業者に明かであ
る。

【００２１】標準的クローニングおよびスクリーニング
を用い、樹枝状細胞起源、前立腺、皮膚、胎児肝臓およ
び脾臓細胞中のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーか
ら、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Adams,M.D.,et al.S
cience(1991)252:1651-1656;Adams,M.D.et al.,Nature
(1992)355:632-634;Adams,M.D.,et al.,Nature(1995)37
7 Supp:3-174）を用いて、ＨＫＡＢＹ６０をコードして
いる本発明の１のポリヌクレオチドを得てもよい。ゲノ
ムＤＮＡライブラリーのごとき天然起源から本発明ポリ
ヌクレオチドを得ることもでき、あるいはよく知られ市
販されている手段方法を用いて合成することもできる。

【００２２】配列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチ
ドをコードしているヌクレオチド配列は、配列番号：１
に含まれるポリペプチドコーディング配列（配列番号：
１のヌクレオチド番号１７３から７７５まで）と同一で
あってもよく、遺伝学的コードの縮重の結果生じる配列
であって配列番号：２のポリペプチドをコードしている
ものであってもよい。

【００２３】本発明ポリヌクレオチドをＨＫＡＢＹ６０
ポリペプチドの組み換え生産に用いる場合、ポリヌクレ
オチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよく；
あるいは他のコーディング配列を伴った読み枠中の成熟
ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を
含むものであってもよい。他のコーディング配列として
は、例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プ
レプロ蛋白配列をコードするコーディング配列、または
他の融合ペプチド部分が挙げられる。例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促すマーカー配列をコードしていても
よい。本発明のこの態様の１の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）
中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド（Ge
ntzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）
に記載される）またはＨＡタグ（Wilsonら、Cell，37:7
67（1984））である。また本発明のポリヌクレオチド
は、転写配列、非翻訳配列、スプライシングおよびポリ
アデニル化シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを
安定化する配列のごとき非コーディング５'および３'配
列を含有していてもよい。

【００２４】さらに好ましい具体例は、配列番号：２に
示すＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのアミノ酸配列を含む
ＨＫＡＢＹ６０変種をコードしているポリヌクレオチド
であり、数個、５ないし１０個、１ないし５個、１ない
し３個、１ないし２個または１個のアミノ酸残基がいず
れかの組み合わせで置換、欠失または付加されているも
のである。

【００２５】さらに本発明は、上記配列にハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドにも関する。この点に
おいて、特に本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレ
オチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド
に関連する。本明細書の用語「厳密な条件」とは、配列
間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより
好ましくは９７〜９９％の同一性がある場合にのみハイ
ブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００２６】配列番号：１に含まれるヌクレオチド配列
に対して同一または十分に同一である本発明ポリヌクレ
オチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いて、全長のｃＤＮＡおよ
びＨＫＡＢＹ６０をコードしているゲノムクローンを単
離し、またＨＫＡＢＹ６０遺伝子に対して高い類似性を
有する配列を有する他の遺伝子（他の種由来のホモログ
およびオーソログをコードしている遺伝子を包含）のｃ
ＤＮＡおよびゲノムクローンを単離してもよい。かかる
ハイブリダイゼーション法は当業者に知られている。典
型的には、これらのヌクレオチド配列は、対照に対して
８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同
一性を有する。一般的には、プローブは少なくとも１５
個のヌクレオチドを含むであろう。好ましくは、かかる
プローブは少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少
なくとも５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特
に好ましいプローブは３０ないし５０個の範囲のヌクレ
オチドを含む。

【００２７】１の具体例において、ＨＫＡＢＹ６０ポリ
ペプチドをコードしているポリヌクレオチドを得ること
は、配列番号：１の配列またはそのフラグメント配列を
有する標識プローブを用いて厳密なハイブリダイゼーシ
ョン条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、
次いで、該ポリヌクレオチド配列を含有する全長のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む。よっ
て、もう１つの態様において、本発明ＨＫＡＢＹ６０ポ
リヌクレオチドは、厳密な条件下で配列番号：１を有す
るヌクレオチド配列またはそのフラグメントにハイブリ
ダイゼーションするヌクレオチド配列を含むヌクレオチ
ド配列を包含する。上記ハイブリダイゼーション条件に
より得られるヌクレオチド配列によってコードされるア
ミノ酸配列を含むポリペプチドも、ＨＫＡＢＹ６０ポリ
ペプチドに包含される。かかるハイブリダイゼーション
法は当業者によく知られている。厳密なハイブリダイゼ
ーション条件は上で定義したものであるか、または５０
％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、
１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハーツ溶液、１０％
デキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌの
変性剪断サケ・精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一
晩、次いで、約６５℃において０．１ｘＳＳＣ中での洗
浄といった条件であってもよい。本発明ポリヌクレオチ
ドおよびポリペプチドを、動物およびヒトの疾病の治療
および診断のための研究試薬および材料として用いても
よい。

【００２８】ベクター、宿主細胞、発現本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作される宿主細胞ならびに組換え法による本発明のポ
リペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構築物由来
のＲＮＡを用いて、無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を
製造することもできる。組換え体を製造するために、宿
主細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一
部、または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことが
できる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例え
ば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology（1
986）；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory
Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク（1989）のごとき多くの標準的な実験
マニュアルに記載される方法により行うことができ、例
えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ
−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベ
クション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒
介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入、スクレープ負荷（scrape loading）、バリステ
ィック導入（ballistic introduction）および感染等が
ある。

【００２９】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtii
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞例えばＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３お
よびボウズ（Bows）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞
等がある。

【００３０】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来
するベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファ
ージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコス
ミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物には
発現を制御および引き起こす調節領域を含有できる。通
常、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現
するのに、および／またはポリペプチドを発現するのに
適した任意の系またはベクターを、この点に関する発現
に使用できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技術
により、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入でき、例えば
Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual
（上記）に記載されている。

【００３１】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルであって
もよい。

【００３２】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドをスクリーニ
ングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細
胞表面にポリペプチドを生産させるのが好ましい。この
場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集
めてもよい。ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドが培地中に分
泌される場合、培地を回収し、ポリペプチドを回収し精
製することができる。細胞内に生成される場合、まず細
胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを回収しなければな
らない。

【００３３】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドは周知の方法
により、組換え細胞培養物から回収および精製でき、そ
の方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈
殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体クロマ
トグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペ
プチドが単離および／または精製中に変性した場合、再
び活性な立体配座にするために、蛋白再生のための周知
の技法を用いることができる。

【００３４】診断アッセイ本発明は、診断試薬としての本発明ＨＫＡＢＹ６０ポリ
ヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関連した変
異形態のＨＫＡＢＹ６０遺伝子の検出は、ＨＫＡＢＹ６
０の発現不足、過剰発現または変化した発現から生じる
疾病またはかかる疾病に対する感受性を決定するための
診断的手段を提供するであろう。ＨＫＡＢＹ６０遺伝子
における変異を有する個体を、種々の方法によりＤＮＡ
レベルで検出してもよい。診断用の核酸は、感染個体の
細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料
から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用しても
よく、あるいは分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅法
を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡま
たはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との
比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失およ
び挿入を検出することができる。増幅ＤＮＡを標識ＨＫ
ＡＢＹ６０ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーション
させることにより点突然変異を同定することができる。
ＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差により、完
全に対合した配列を誤対合二重らせんから区別すること
ができる。ＤＮＡ配列の相違はまた、変性物質含有また
は不含のゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動
度の変化を検出することにより、または直接的なＤＮＡ
配列決定により検出できる。例えばMeyers et.al.Scien
ce，230:1242（1985）参照。特異的な位置での配列の変
化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアー
ゼおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らか
にすることができる。例えばCotton et al.Proc.Natl.A
cad.Sci.,USA，85:4397-4401（1985）参照。もう１つの
具体例において、ＨＫＡＢＹ６０ヌクレオチドまたはそ
のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのア
レイ（array）を構築して、例えば遺伝学的変異の効果
的なスクリーニングを行うことができる。アレイ法はよ
く知られており、広い適用範囲を有し、遺伝子発現、遺
伝学的連関、および遺伝学的変異可能性を包含する分子
遺伝学における種々の問題を調べるために用いられうる
（例えば、M.Chee et al.,Science.Vol 274,pp 610-613
(1996)参照）。

【００３５】診断アッセイは、本明細書記載の方法によ
りＨＫＡＢＹ６０遺伝子の変異を検出することにより、
癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス性疾患の診
断方法またはかかる疾病に対する感受性の診断方法を提
供する。

【００３６】さらに、対象由来の試料の異常に上昇また
は低下したＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドまたはＨＫＡＢ
Ｙ６０ｍＲＮＡレベルを調べることを特徴とする方法
によって、癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス
性疾患を診断することができる。ＨＫＡＢＹ６０ポリヌ
クレオチドの発現の増加または低下を、ポリヌクレオチ
ドの定量法として当該分野で周知の方法の任意の方法、
例えば増幅、ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノ
ーザンブロッティングおよびその他のハイブリダイゼー
ション法を用いてＲＮＡレベルで測定することができ
る。宿主由来の試料中のＨＫＡＢＹ６０蛋白レベルを決
定するために用いることができるアッセイ法は当業者に
周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびＥＬＩＳＡアッセイ等がある。

【００３７】よって、もう１つの態様において、本発明
は、癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス性疾患
の診断またはかかる疾病に対する感受性の診断のあめの
キットに関し、該キットは、（ａ）ＨＫＡＢＹ６０ポリヌクレオチド、好ましくは配
列番号：１のヌクレオチド配列、またはそのフラグメン
ト；（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列に対して相捕的なヌク
レオチド配列；（ｃ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド、好ましくは配列番
号：２のポリペプチド、またはそのフラグメント；また
は（ｄ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドに対する抗体、好ま
しくは配列番号：２のポリペプチドに対する抗体を含む。かかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）または（ｄ）が重要成分を含んでいてもよいこと
が理解されるであろう。

【００３８】染色体アッセイ本発明ヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標
的とし、これにハイブリダイゼーションしうる。本発明
による重要な配列の染色体へのマッピングは、それらの
配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第１工程であ
る。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、
染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと
関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.
McKusick,Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopki
ns University Welch Medical Libraryからオンライン
で利用できる）に見いだされる。次いで、連関（物理的
に近接した遺伝子の同時遺伝）の分析により、同じ染色
体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定
する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいく
つかまたは全部において変異が観察されるが正常個体に
おいては観察されない場合、その変異は疾病の原因であ
る可能性がある。

【００３９】組織局在化本発明ヌクレオチド配列は組織局在化に関しても価値が
ある。かかる方法は、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドをコ
ードしているｍＲＮＡを検出することにより、組織にお
けるＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの発現パターンの決定
を可能にする。これらの方法は、in situハイブリダイ
ゼーション法およびヌクレオチド増幅法、例えばＰＣＲ
を用いる。かかる方法は当該分野においてよく知られて
いる。これらの研究結果は、生物中でのポリペプチドの
正常な機能を示す。さらに、ＨＫＡＢＹ６０ｍＲＮＡ
の正常発現パターンを変異ＨＫＡＢＹ６０遺伝子により
コードされるｍＲＮＡの発現パターンと比較する研究に
より、変異ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの役割、あるい
は疾病における正常ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの不適
切な発現の役割についての貴重な洞察が得られる。かか
る不適切な発現は、一時的、空間的または単に量的な性
質のものであるかもしれない。

【００４０】抗体本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞を免疫原として用いて、ＨＫＡＢＹ
６０ポリペプチドに対して免疫特異的な抗体を製造する
こともできる。用語「免疫特異的」は、先行技術の他の
関連ポリペプチドに対するアフィニティーよりも、本発
明ポリペプチドに対するアフィニティーが実質的に大き
いことを意味する。ポリペプチドまたはエピトープが付
いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは
ヒトはでない動物に通常の実験法を用いて投与すること
により、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドに対して生じる抗
体を得ることができる。連続的細胞系培養により産生さ
れる抗体を提供する、当業者周知の技術を用いて、モノ
クローナル抗体を調製することができる。実例として
は、ハイブリドーマ法（Kohler,G. and Milstein,C.，N
ature，256:495-497（1975））；トリオーマ法（Kozbor
et al.Immunology Today，4:72（1983））；およびＥＢ
Ｖ−ハイブリドーマ法（Cole et al.Monoclonal Antibo
dies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,77-96頁
（1985））に記載されるような種々の技法がある。

【００４１】一本鎖抗体の産生のために記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を
包含する他の生物を用いてヒト化抗体を発現させてもよ
い。上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現するクロー
ンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニティ
ークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製しても
よい。

【００４２】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドに対する抗体
を用いて、とりわけ、癌、炎症性疾患、免疫性疾患およ
びウイルス性疾患を治療してもよい。

【００４３】ワクチン本発明のもう１つの態様は、哺乳動物における免疫学的
反応を誘起する方法に関し、該方法は、抗体および／ま
たはＴ細胞を産生させるに十分なＨＫＡＢＹ６０または
そのフラグメントを哺乳動物に接種して、とりわけ、
癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス性疾患から
該動物を防御することを特徴とする。本発明のさらにも
う１つの態様は、哺乳動物における免疫学的応答を誘導
する方法に関し、該方法は、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチ
ドをインビボで発現させるための核酸ベクターを送達し
て、かかる免疫学的応答を誘導し、該動物を疾患から保
護する抗体を生じさせることを特徴とする。

【００４４】本発明のさらなる態様は免疫学的ワクチン
処方（組成物）に関し、それは、哺乳動物宿主中に導入
された場合、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドに対する哺乳
動物の免疫学的応答を誘導する。該組成物はＨＫＡＢＹ
６０ポリペプチドまたはＨＫＡＢＹ６０遺伝子を含んで
なる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいて
もよい。ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドは胃で分解される
可能性があるので、好ましくは非経口投与する（皮下、
筋肉内、静脈、皮内等への注射を包含）。非経口投与に
適した処方は、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および
処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでい
てもよい水性または非水性滅菌注射用溶液；ならびに懸
濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水性
滅菌懸濁液を包含する。処方を１回量または複数回量と
して容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプ
ルおよびバイアルに入れて提供してもよく、また使用直
前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態
として保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系
および当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原
性を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。
用量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験
により容易に決定することができる。

【００４５】スクリーニングアッセイ本発明受容体ポリペプチドに結合してこれを活性化（ア
ゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物に
ついてのスクリーニングプロセスにおいて本発明ＨＫＡ
ＢＹ６０ポリペプチドを用いてもよい。よって、本発明
ポリペプチドを用いて、例えば細胞、無細胞調製物、化
学ライブラリーおよび天然産物混合物中において、小型
分子基質およびリガンドの結合を評価してもよい。これ
らの基質およびリガンドは天然の基質およびリガンドで
あってもよく、あるいは構造または機能を模倣したもの
であってもよい。Coligan et al.,Current Protocols i
nImmunology 1(2):Chapter5(1991)参照。

【００４６】ＨＫＡＢＹ６０蛋白は、１またはそれ以上
の病理を包含する１またはそれ以上の生物学的機能に関
与している。したがって、ＨＫＡＢＹ６０を刺激する化
合物および薬剤、あるいはまたＨＫＡＢＹ６０を阻害し
うる化合物または薬剤を見いだすことが望まれる。一般
的には、癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウイルス性
疾患のごとき症状を治療または予防するためにアゴニス
トが用いられる。癌、炎症性疾患、免疫性疾患およびウ
イルス性疾患のごとき症状の種々の治療または予防のた
めにアンタゴニストを用いてもよい。

【００４７】一般的には、かかるスクリーニング手順
は、細胞表面に本発明受容体ポリペプチドを発現する適
当な細胞を製造することを含む。かかる細胞は、哺乳動
物由来の細胞、酵母、DrosophilaまたはE.coliを包含す
る。次いで、受容体発現細胞（または発現されたポリペ
プチドを含む細胞膜）を試験化合物と接触させて、結合
または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。ＨＫ
ＡＢＹ６０活性に関して、候補化合物と接触した細胞の
能力を、接触していない同じ細胞と比較する。

【００４８】アッセイは候補化合物の結合を試験するだ
けでよく、候補化合物に直接的または間接的に結合した
標識を用いることにより、あるいは標識競争物質との競
争を用いるアッセイにより、受容体を有する細胞への付
着を検出する。さらに、これらのアッセイにおいて、受
容体を表面に有する細胞に適する検出系を用いて、受容
体活性化により発生するシグナルを候補化合物が生じる
かどうかを試験してもよい。一般的には、活性化に対す
る阻害剤を、既知アゴニスト存在下においてアッセイし
て、アゴニストによる活性化に対する候補化合物の存在
の影響を観察する。

【００４９】さらに、簡単には、アッセイは、候補化合
物をＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド含有溶液と混合して混
合物を得て、混合物中のＨＫＡＢＹ６０活性を測定し、
ＨＫＡＢＹ６０活性を標準と比較することを含むもので
あってもよい。

【００５０】ＨＫＡＢＹ６０ｃＤＮＡ、蛋白および蛋
白に対する抗体を用いて、細胞におけるＨＫＡＢＹ６０
ｍＲＮＡおよび蛋白の生成に対する添加化合物の影響
を調べるためのアッセイを構築してもよい。例えば、当
該分野で知られた標準的方法によりモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体を用いてＨＫＡＢＹ６０蛋白の分
泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためにＥＬＩ
ＳＡを構築してもよく、これを用いてＨＫＡＢＹ６０の
生成を阻害または促進しうる作用剤（それぞれ、アンタ
ゴニストまたはアゴニストと呼ばれる）を、適当に加工
された細胞または組織から見いだすことができる。

【００５１】当該分野で知られた標準的な受容体結合法
により、ＨＫＡＢＹ６０蛋白を用いて膜結合または可溶
性受容体（存在するならば）を同定してもよい。これら
には、リガンド結合およびクロスリンキングアッセイを
包含するが、それらに限定されない。クロスリンキング
アッセイにおいて、ＨＫＡＢＹ６０は放射性標識（例え
ば１２５Ｉ）、化学修飾（例えば、ビオチン化）、また
は検出もしくは精製に適したペプチド配列に融合され、
受容体と推定されるもの（細胞、細胞膜、細胞上清、組
織抽出物、体液）の源とともにインキュベーションされ
る。他の方法は、表面プラスモン共鳴および分光学的測
定のごとき物理学的方法を包含する。受容体の精製およ
びクローニングに用いる以外に、これらの結合アッセイ
を用いて、受容体へのＨＫＡＢＹ６０の結合に競合する
ＨＫＡＢＹ６０のアゴニストおよびアンタゴニストを同
定することができる（存在する場合には）。スクリーニ
ングアッセイを行うための標準的方法は当該分野におい
てよく知られている。

【００５２】潜在的なＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのア
ンタゴニストの例は、抗体、あるいはいくつかの場合に
はオリゴヌクレオチドまたはＨＫＡＢＹ６０ポリペプチ
ドのリガンド、基質、受容体、酵素等に密接に関連した
蛋白（例えば、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのリガン
ド、基質、受容体、酵素等のフラグメント）、または受
容体に結合するが応答を誘発せず、その結果受容体活性
を妨害する小型分子を包含する。

【００５３】よって、もう１つの態様において、本発明
は、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドについてのアゴニス
ト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素
等；あるいはＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの生成を抑制
または促進する化合物を同定するためのキットであっ
て、（ａ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド、好ましくは配列番
号：２のポリペプチド；（ｂ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド、好ましくは配列番
号：２のポリペプチドを発現する組み換え細胞；（ｃ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド、好ましくは配列番
号：２のポリペプチドを発現する細胞膜；または（ｄ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド、好ましくは配列番
号：２のポリペプチドに対する抗体を含むキットに関する。かかるキットにおいて（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要成分を含んでいても
よいことが理解されよう。

【００５４】予防および治療方法本発明は、過剰または不十分な量のＨＫＡＢＹ６０活性
に関連する異常な状態、例えば癌、炎症性疾患、免疫性
疾患およびウイルス性疾患の治療方法を提供する。ＨＫ
ＡＢＹ６０活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いる
ことができる。１の方法は、有効量の錠阻害剤化合物
（アンタゴニスト）を医薬上許容される担体とともに対
象に投与して、ＨＫＡＢＹ６０へのリガンドの結合をブ
ロックすることあるいは第２のシグナルを阻害すること
により活性化を阻害し、そのことにより異常な症状を改
善することを特徴とする。もう１つのアプローチにおい
て、内在性ＨＫＡＢＹ６０と競争してリガンドに結合す
る能力をやはり有している可溶性形態のＨＫＡＢＹ６０
ポリペプチドを投与してもよい。かかる競争物質の典型
的な具体例はＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのフラグメン
トを含む。

【００５５】さらにもう１つの方法において、発現ブロ
ック法を用いて内在性ＨＫＡＢＹ６０をコードしている
遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成した、あ
るいは別個に投与されたアンチセンス配列を、かかる知
られた方法に使用する。例えば、Oligodeoxynucleotide
s as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRCPr
ess,Boca Raton, FL(1988)中、O'Coccor,J.Neurochem(1
991)56:560参照。別法として、遺伝子とともに三重らせ
んを形成するオリゴヌクレオチドを用いてもよい。例え
ば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Coone
y et al.,Science(1988)241:456;Dervan et al.,Scienc
e(1991)251:1360参照。これらのオリゴヌクレオチドは
それ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマー
をインビボで発現させることもできる。

【００５６】ＨＫＡＢＹ６０およびその活性の発現不足
に関連する異常な症状の治療には、いくつかの方法が用
いられる。１の方法は、ＨＫＡＢＹ６０を活性化する治
療上有効量の化合物（すなわち上記アゴニスト）を医薬
上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常
な症状を改善することを特徴とする。別法として、遺伝
子治療を用いて、対象中の細胞によるＨＫＡＢＹ６０の
細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記
のごとく本発明ポリヌクレオチドを処理加工して複製欠
損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにして
もよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、
本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含むレト
ロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケー
ジング細胞中に導入して、今度はパッケージング細胞が
目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成するように
してもよい。インビボでの細胞の処理加工およびインビ
ボイでのポリペプチドの発現のために、これらのプロデ
ューサー細胞を対象に投与してもよい。遺伝子治療の概
説としては、Human Molecular Genetics,T.Strachan an
d A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd(1986)
中、第２０章、Gene Therapy and other Molecular Gen
etic-based Therapeutic Approaches（およびその中の
引用文献）参照。もう１つのアプローチは、適当な医薬
担体と混合して治療量のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドを
投与することである。

【００５７】処方および投与可溶性形態のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドのごときペプ
チド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチ
ドまたは小型分子を、適当な医薬担体と組み合わせて処
方してもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプ
チドまたは化合物、および医薬上許容される担体または
賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライ
ン、緩衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロ
ール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられる
が、これらに限らない。処方は投与経路に適したものと
すべきであり、当業者によく知られている。さらに本発
明は、上記本発明成分の１種またはそれ以上を充填し
た、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パック
およびキットにも関する。

【００５８】本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。

【００５９】必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、
処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断
による。しかしながら、適当な用量は対象の体重１ｋｇ
あたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしな
がら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざ
まな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと
思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用
量が必要であると考えられる。当該分野においてよく知
られた最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。

【００６０】しばしば「遺伝子治療」と称される上記治
療方法において、治療に使用するポリペプチドを対象中
において生成させることもできる。よって、例えば、ポ
リペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡのごと
きポリヌクレオチドを用いて、例えばレトロウイルスプ
ラスミドベクターを用いることによりエクスビボにおい
て対象由来の細胞を処理加工してもよい。次いで、細胞
を対象に導入する。

【００６１】本明細書に引用されたすべての刊行物（特
許および特許出願を包含するが、これらに限らない）
を、参照によりそれぞれの全体が本明細書に記載されて
いるものとみなす。

【００６２】配列の情報配列番号：１ 1 GNAAGTGTTTGAGGAAGTCGCGCCGCGCTGCCCGCGTTAAGATTCCCGCATTTTAATGTT 61 TTCAGGGGGGTGTCATAGCCCCGGGTTTGGCCGCCCCAGCCCCGCCTTCCCCGCCCCGGG 121 GAGCCCGCCCCCTGCCCCGCGTCCCTGCCGACAGAGTTAGCACGACATCAGTATGAGCTG 181 GTCACCTTCCCTGACAACGCAGACATGTGGGGCCTGGGAAATGAAAGAGCGCCTTGGGAC 241 AGGGGGATTTGGAAATGTCATCCGATGGCACAATCAGGAAACAGGTGAGCAGATTGCCAT 301 CAAGCAGTGCCGGCAGGAGCTCAGCCCCCGGAACCGAGAGCGGTGGTGCCTGGAGATCCA 361 GATCATGAGAAGGCTGACCCACCCCAATGTGGTGGCTGCCCGAGATGTCCCTGAGGGGAT 421 GCAGAACTTGGCGCCCAATGACCTGCCCCTGCTGGCCATGGAGTACTGCCAAGGAGGAGA 481 TCTCCGGAAGTACCTGAACCAGTTTGAGAACTGCTGTGGTCTGCGGGAAGGTGCCATCCT 541 CACCTTGCTGAGTGACATTGCCTCTGCGCTTAGATACCTTCATGAAAACAGAATCATCCA 601 TCGGGATCTAAAGCCAGAAAACATCGTCCTGCAGCAAGGAGAACAGAGGTTAATACACAA 661 AATTATTGACCTAGGATATGCCAAGGAGCTGGATCAGGGCAGTCTTTGCACATCATTCGT 721 GGGGANCCTGCAGTACCTGGCCCCAGAGCTACTGGAGCAGCAGAAGTACACAGTG

【００６３】配列の情報配列番号：２ 1 MSWSPSLTTQTCGAWEMKERLGTGGFGNVIRWHNQETGEQIAIKQCRQELSPRNRERWCL 61 EIQIMRRLTHPNVVAARDVPEGMQNLAPNDLPLLAMEYCQGGDLRKYLNQFENCCGLREG 121 AILTLLSDIASALRYLHENRIIHRDLKPENIVLQQGEQRLIHKIIDLGYAKELDQGSLCT 181 SFVGXLQYLAPELLEQQKYTV

【００６４】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：SmithKline Beecham plc （ｉｉ）発明の名称：新規化合物（ｉｉｉ）配列の数：２（ｖｉ）連絡先：（Ａ）宛て名：SmithKline Beecham, Corporate Intell
ectual Property （Ｂ）通り名：Two New Horizons Court （Ｃ）都市名：Brentford （Ｄ）州名：Middlesex （Ｅ）国名：UK （Ｆ）ＺＩＰ：TW8 9EP （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体タイプ：ディスケット（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル（Ｃ）作動システム：ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：Windows用FastSEQバージョン２.
０

【００６５】（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７７５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： GNAAGTGTTT GAGGAAGTCG CGCCGCGCTG CCCGCGTTAA GATTCCCGCA TTTTAATGTT 60 TTCAGGGGGG TGTCATAGCC CCGGGTTTGG CCGCCCCAGC CCCGCCTTCC CCGCCCCGGG 120 GAGCCCGCCC CCTGCCCCGC GTCCCTGCCG ACAGAGTTAG CACGACATCA GTATGAGCTG 180 GTCACCTTCC CTGACAACGC AGACATGTGG GGCCTGGGAA ATGAAAGAGC GCCTTGGGAC 240 AGGGGGATTT GGAAATGTCA TCCGATGGCA CAATCAGGAA ACAGGTGAGC AGATTGCCAT 300 CAAGCAGTGC CGGCAGGAGC TCAGCCCCCG GAACCGAGAG CGGTGGTGCC TGGAGATCCA 360 GATCATGAGA AGGCTGACCC ACCCCAATGT GGTGGCTGCC CGAGATGTCC CTGAGGGGAT 420 GCAGAACTTG GCGCCCAATG ACCTGCCCCT GCTGGCCATG GAGTACTGCC AAGGAGGAGA 480 TCTCCGGAAG TACCTGAACC AGTTTGAGAA CTGCTGTGGT CTGCGGGAAG GTGCCATCCT 540 CACCTTGCTG AGTGACATTG CCTCTGCGCT TAGATACCTT CATGAAAACA GAATCATCCA 600 TCGGGATCTA AAGCCAGAAA ACATCGTCCT GCAGCAAGGA GAACAGAGGT TAATACACAA 660 AATTATTGAC CTAGGATATG CCAAGGAGCT GGATCAGGGC AGTCTTTGCA CATCATTCGT 720 GGGGANCCTG CAGTACCTGG CCCCAGAGCT ACTGGAGCAG CAGAAGTACA CAGTG 775

【００６６】（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Ser Trp Ser Pro Ser Leu Thr Thr Gln Thr Cys Gly Ala Trp Glu 1 5 10 15 Met Lys Glu Arg Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Ile Arg Trp 20 25 30 His Asn Gln Glu Thr Gly Glu Gln Ile Ala Ile Lys Gln Cys Arg Gln 35 40 45 Glu Leu Ser Pro Arg Asn Arg Glu Arg Trp Cys Leu Glu Ile Gln Ile 50 55 60 Met Arg Arg Leu Thr His Pro Asn Val Val Ala Ala Arg Asp Val Pro 65 70 75 80 Glu Gly Met Gln Asn Leu Ala Pro Asn Asp Leu Pro Leu Leu Ala Met 85 90 95 Glu Tyr Cys Gln Gly Gly Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Gln Phe Glu 100 105 110 Asn Cys Cys Gly Leu Arg Glu Gly Ala Ile Leu Thr Leu Leu Ser Asp 115 120 125 Ile Ala Ser Ala Leu Arg Tyr Leu His Glu Asn Arg Ile Ile His Arg 130 135 140 Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu 145 150 155 160 Ile His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly 165 170 175 Ser Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Xaa Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu 180 185 190 Leu Leu Glu Gln Gln Lys Tyr Thr Val

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者デイビッド・ミカロビッチイギリス、シーエム19・５エイダブリュー、エセックス、ハーロウ、サード・アベニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイエンス・パーク・サウス、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポリペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列に対してその全
長にわたり少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオ
チド配列を含む単離ポリヌクレオチド；または該単離ポ
リヌクレオチドに対して相捕的なヌクレオチド配列。
【請求項２】該ポリヌクレオチドが配列番号：２のＨ
ＫＡＢＹ６０ポリペプチドをコードしている配列番号：
１に含まれるヌクレオチド配列を含むものである請求項
１のポリヌクレオチド。
【請求項３】該ポリヌクレオチドが配列番号：１のヌ
クレオチド配列に対してその全長にわたり少なくとも８
０％同一であるヌクレオチド配列を含むものである請求
項１のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号：１のポリヌクレオチドである
請求項３のポリヌクレオチド。
【請求項５】ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１のポ
リヌクレオチド。
【請求項６】適合する宿主細胞中に存在する場合に、
配列番号：２のポリペプチドに対して少なくとも８０％
の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＫＡＢＹ６０ポ
リペプチドを生成しうる発現系を含むＤＮＡまたはＲＮ
Ａ分子。
【請求項７】請求項６の発現系を含む宿主細胞。
【請求項８】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの生成に十
分な条件下で請求項７の宿主を培養し、次いで、培地か
ら該ポリペプチドを回収することを含む、ＨＫＡＢＹ６
０ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】請求項６の発現系で宿主細胞を形質転換
またはトランスフェクションして、適当な培養条件下で
宿主細胞がＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドを生成するよう
にすることを含む、ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドを生成
する細胞の製造方法。
【請求項１０】配列番号：２のアミノ酸配列に対して
その全長にわたり少なくとも８０％同一であるアミノ酸
配列を含むＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド。
【請求項１１】配列番号：２のアミノ酸配列を含む請
求項１０のポリペプチド。
【請求項１２】請求項１０のＨＫＡＢＹ６０ポリペプ
チドに対して免疫特異的な抗体。
【請求項１３】請求項１０のＨＫＡＢＹ６０ポリペプ
チドの活性または発現の増強を必要とする対象の治療方
法であって、（ａ）該ポリペプチドに対する治療上有効量のアゴニス
トを対象に投与すること；および／または（ｂ）インビ
ボにおいて該ポリペプチド活性を生じさせる形態の、配
列番号：２のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドをコードして
いるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一
性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
ド；または該ヌクレオチド配列に対して相捕的なヌクレ
オチド配列を対象に与えることを含む方法。
【請求項１４】請求項１０のＨＫＡＢＹ６０ポリペプ
チドの活性または発現の阻害を必要とする対象の治療方
法であって、（ａ）該ポリペプチドに対する治療上有効量のアンタゴ
ニストを対象に投与すること；および／または（ｂ）該
ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の発現
を阻害する核酸分子を対象に投与すること；および／ま
たは（ｃ）リガンド、基質、または受容体を求めて該ポ
リペプチドと競争する治療上有効量のポリペプチドを対
象に投与することを含む方法。
【請求項１５】対象中の請求項１０のＨＫＡＢＹ６０
ポリペプチドの発現または活性に関連した、対象におけ
る疾病または疾病に対する感受性の診断方法であって、（ａ）対象のゲノム中の該ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド
をコードしているヌクレオチド配列中の変異の存在また
は不存在を決定すること；および／または（ｂ）該対象
由来の試料中のＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドの発現の存
在または量を分析することを含む方法。
【請求項１６】請求項１０のＨＫＡＢＹ６０ポリペプ
チドを阻害する化合物（アンタゴニスト）または促進す
る化合物（アゴニスト）の同定方法であって、（ａ）ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドを発現あるいはＨＫ
ＡＢＹ６０ポリペプチドに応答する細胞（またはＨＫＡ
ＢＹ６０ポリペプチドを発現またはＨＫＡＢＹ６０ポリ
ペプチドに応答する細胞膜）に候補化合物を接触させ；
次いで（ｂ）結合、または機能的応答の刺激もしくは阻
害を観察し、あるいはＨＫＡＢＹ６０ポリペプチド活性
に関して、候補化合物と接触した細胞（または細胞膜）
の能力を接触しなかった同じ細胞と比較することを含む
方法。
【請求項１７】請求項１６の方法により同定されるア
ゴニスト。
【請求項１８】請求項１６の方法により同定されるア
ンタゴニスト。
【請求項１９】ＨＫＡＢＹ６０ポリペプチドを発現す
る、請求項９の方法により製造される組み換え宿主細胞
またはその膜。