-
1. EINLEITUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neuen humanen Polynucleotiden, welche Proteine
codieren, die Sequenzähnlichkeit
mit tierischen Neurexin-Proteinen aufweisen. Die Erfindung umfasst
die beschriebenen Polynucleotide, die Expressionssysteme der Wirtszellen, die
codierten Proteine, Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide, die
Antikörper
für die
codierten Proteine und Peptide und gentechnisch behandelte Tiere,
denen die offenbarten Sequenzen fehlen oder die sie überexprimieren,
Antagonisten und Agonisten der Proteine sowie andere Verbindungen,
welche die Expression oder Aktivität der von den offenbarten Sequenzen
codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose, das Screening von
Arzneimitteln, die Überwachung
von klinischen Tests, die Behandlung von Krankheiten und Störungen oder
für kosmetische
Anwendungen oder Anwendungen in der Ernährung eingesetzt werden können.
-
2. HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Neurexine
sind u.a. mit der Vermittlung von Nervenprozessen, epileptischen
Anfällen,
mit der Verständigung,
der Exozytose, Krebs und der Entwicklung in Zusammenhang gebracht
worden. Neurexine können auch
als Rezeptoren für
Latrotoxine dienen.
-
3. ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neuen menschliche Proteine codierenden Nucleotiden
sowie die entsprechenden Aminosäuresequenzen
dieser Proteine. Die hier zum ersten Mal beschriebenen neuen humanen
Proteine (NHPs) teilen eine strukturelle Ähnlichkeit mit Neurexin-Proteinen.
-
Die
hier beschriebenen neuen humanen Nucleinsäuresequenzen codieren Proteine/offene
Leseraster (ORFs, Open Reading Frames) von einer Länge von
1.307, 1.259, 35,250,279,582,534,745,697,839,791,1.298 und 1.175
Aminosäuren
siehe SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 bzw.
26).
-
Die
Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen
NHPs, einschließlich
kleiner Moleküle.
großer
Moleküle,
Mutanten-NHPs oder Abschnitte derselben, die mit einem nativen NHP
konkurrieren, Peptide und Antikörper
sowie Nucleotidsequenzen, die dazu verwendet werden können, die
Expression der beschriebenen NHPs zu inhibieren (z.B. Antisense-
und Ribozym-Moleküle,
sowie Gene oder regulatorische Konstrukte zum Genaustausch) oder
die Expression der beschriebenen NHP-Sequenzen zu erhöhen (z.B.
Expressionskonstrukte, welche die beschriebene Sequenz unter die
Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen) sowie transgene
Tiere, welche NHP-Transgene exprimieren oder "Knock-Outs" (die bedingt sein können), die kein funktionales
NHP exprimieren.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten
der NHP-Expression
und/oder der Aktivität
des NHP-Produkts fungieren, welche gereinigte Präparationen der beschriebenen
NHPs und/oder NHP-Produkte verwenden, oder Zellen welche sie exprimieren.
Solche Verbindungen können
als Therapeutika für
die jeweilige Behandlung eines Symtoms aus der weiten Bandbreite
von Symptomen, die mit biologischen Erkrankungen oder Unausgewogenheiten
einhergehen eingesetzt werden.
-
4. BESCHREIBUNG
DES SEQUENZPROTOKOLLS UND DER FIGUREN
-
Das
Sequenzprotokoll zeigt die Sequenzen von der beschriebenen NHP-ORFs,
welche die beschriebenen NHP-Aminosäuresequenzen codieren. SEQ
ID NO: 27 beschreibt einen NHP-ORF und flankierende Abschnitte.
-
5. GENAUE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
hier zum ersten Mal beschriebenen NHPs sind neue Proteine, die u
.a. in menschlichen Zelllinien sowie im menschlichen fötalen Hirn,
Hirn, Kleinhirn, Hoden, Nebenniere, Rückenmark, Dünndarm, Hypothalamus sowie
humane Zellen, die einem gene-trapping unterzogen worden waren.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst die im Sequenzprotokoll angegebenen
Nucleotide, solche Nucleotide exprimierende Wirtszellen, die Expressionsprodukte
solcher Nucleotide und: (a) Nucleotide, welche die Säugerhomologe
der beschriebenen Gene einschließlich der speziell beschriebenen
NHPs und die NHP-Produkte codieren; (b) Nucleotide, die einen oder
mehr den funktionellen Domänen
entsprechende Abschnitte der NHPs codieren, sowie die durch solche
Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
der neuen Abschnitte jeder aktiven Domäne(n); (c) isolierte Nucleotide,
die gentechnisch veränderte
oder natürlich
vorkommende Mutantenversionen der beschriebenen NHPs codieren, in
welcher alle oder ein Teil von zumindest einer Domäne zerstört oder
verändert
ist sowie die durch solche Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte
einschließlich,
aber nicht ausschließlich,
der löslichen
Proteine und Peptide, in welchen die gesamte oder ein Teil der Signalsequenz
zerstört
ist; (d) Nucleotide, die chimäre
Fusionsproteine codieren, welche den gesamten oder einen Teil eines
codierenden Abschnitts eines NHP oder eine seiner Domänen enthalten
(z.B. eine Rezeptor- oder Liganden-Bindungsdomäne, akzessorische Protein/Selbstassoziierungs-Domäne, usw.),
welche an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusioniert sind oder
(e) therapeutische oder diagnostische Derivate der beschriebenen
Polynucleotide wie z.B. Oligonucleotide, Antisense-Polynucleotide,
Ribozyme, dsRNA oder gentherapeutische Konstrukte mit einer Sequenz, die
zum ersten Mal im Sequenzprotokoll offenbart wird.
-
Wie
oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung: (a) die im
Sequenzprotokoll angegebenen humanen DNS-Sequenzen (und diese enthaltende
Vektoren) und befasst sich zusätzlich
mit jeder Nucleotidsequenz, welche ein benachbartes offenes Leseraster
(ORF) codiert, das an eine im Sequenzprotokoll angegebene komplementäre DNA-Sequenz unter hoch
stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung an filtergebundene
DNA in 0,5 M NaHPO4, 75 Natriumdodecylsulfat
(SDS), 1 mM EDTA bei 65°C
und Waschen in 0,1 × SSC/0,1
% SDS bei 68°C
(Ausubel F.M. et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Band X, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New
York auf Seite 2.10.3), und ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert.
Zusätzlich
befasst sich die Erfindung mit jeder Nucleotidsequenz, die an die
komplementäre
DNA-Sequenz hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll angegebene
Aminosäuresequenz
unter mäßig stringenten
Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel
et al., 1989, supra), codiert und exprimiert und immer noch ein
ein funktionell äquivalentes
NHP-Produkt codiert. Funktionelle Äquivalente
eines NHP umfassen in anderen Arten enthaltene natürlich vorkommende
NHPs sowie mutante NHPs, unabhängig
davon, ob sie natürlich
vorkommen oder gentechnisch verändert
wurden (durch zielgerichtete Mutagenese, Gen-shuffling, gerichtete
Evolution, wie z.B. in den US-Patenten 5,837,458 und 5,723,323 beschrieben,
welche hiermit beide vollständig
als Referenz eingeführt
werden). Die Erfindung umfasst auch degenerierte Nucleinsäurevarianten
der offenbarten NHP-Polynucleotidsequenzen.
-
Zusätzlich befasst
sich die Erfindung mit NHP-ORFs codierenden Polynucleotiden oder
deren funktionellen Äquivalenten,
die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche eine etwa
99-, 95-, 90- oder 85-prozentige Ähnlichkeit oder Identität mit entsprechenden
Abschnitten von SEQ ID NO: 1 aufweisen (ermittelt mit der BLAST-Sequenz-Vergleichsanalyse
unter Verwendung von z.B. dem GCG-Sequenzanalyse-Programmpaket mit standardisierter Voreinstellung).
-
Die
Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise
DNA-Moleküle,
die an die beschriebenen Nucleotidsequenzen des NHP-Gens hybridisieren
und daher komplementär
zu letzteren sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können, wie
oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein. In
Fällen,
wo die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide
("DNA-Oligos") sind, sind solche
Moleküle
im Allgemeinen ca. 16 bis ca. 100 Basen lang oder ca. 20 bis ca.
80 oder ca. 34 bis ca. 45 Basen lang oder jede Variation oder Kombination
von darin vorkommenden Größen, die
einen im Sequenzprotokoll zuerst offenbarten benachbarten Sequenzabschnitt
enthalten. Solche Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR) dazu verwendet werden, Bücherein
zu durchsuchen, Clone zu isolieren und Klonierungs- und Sequenzierungsmatrizen
herzustellen usw.
-
Alternativ
können
solche NHP-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden zum Durchsuchen
von Büchereien
und zum Bewerten von Genexpressionsmustern verwendet werden (besonders
unter Verwendung eines Mikroarray- oder "Chip"-Formats mit hohem
Durchsatz). Zusätzlich
kann eine Reihe der beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen oder deren komplementäre Sequenzen
verwendet werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen NHP-Sequenzen
wiederzugeben. Eine in mindestens einem Teil der Sequenz-SEQ ID
NOs 1–27
offenbarten Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen kann zusammen
mit einem Matrix/Substrat-Feststoffträger (Harze, Kügelchen,
Membranen, Kunststoffe, Polymere, Metall- oder metallisierte Substrate,
kristalline oder polykristalline Substrate, usw.) als eine Hybridisierungssonde
eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung sind räumliche
ansteuerbare Arrays (d.h. Genchips, Mikrotiterplatten, usw.) von
Oligonucleotiden und Polynucleotiden oder entsprechenden Oligonucleotiden
und Polynucleotiden, wobei mindestens eines der auf dem räumlichen
ansteuerbaren Array vorkommenden Biopolymere eine Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenz,
die zuerst in mindestens einer der Sequenzen SEQ ID NOs 1–27 offenbart
wurde oder eine von diesen codierte Aminosäuresequenz. aufweist. Verfahren
zur Anheftung von Biopolymeren a oder zur Synthese von Biopolymeren
auf Festkörpermatrizes
und die Durchführung
von Bindungsstudien darauf werden u.a. in den US-Patenten 5,700,637,
5,556,752, 5,744,305, 4,631,211, 5,445,934, 5,252,743, 4,713,326, 5,424,186,
und 4,689,405 beschrieben, welche hiermit vollständig als Referenz eingeführt werden.
-
Ansteuerbare
Assays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen lassen
sich einsetzen, um die zeit- und gewebsspezifische Expression eines
Gens zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese ansteuerbaren
Arrays enthalten genügend
lange Oligonucleotidsequenzen, um die erforderliche Spezifität zu verleihen,
liegen aber noch innerhalb der durch die Produktionstechnologie
bestimmten Grenzen. Die Länge
dieser Sonden liegt im Bereich von etwa 8 bis etwa 2000 Nucleotide.
Die Sonden bestehen vorzugsweise aus 60 Nucleotiden und mehr bevorzugt
aus 25 Nucleotiden der zuerst in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen.
-
Beispielsweise
kann eine Reihe der beschriebenen Oligonucleotidsequenzen oder komplementären Sequenzen
davon in einem Chip-Format verwendet werden, um alle oder einen
Teil der beschriebenen Sequenzen zu repräsentieren. Die Oligonucleotide,
typischerweise mit einer Länge
zwischen etwa 16 bis etwa 40 (oder jeder ganzen Zahl im angegebenen
Bereich) Oligonucleotiden können
teilweise miteinander überlappen und/oder
die Sequenz kann durch Oligonucleotide repräsentiert sein, die nicht überlappen.
Dementsprechend sollen die beschriebenen Polynucleotidsequenzen
typischerweise mindestens zwei oder drei unterschiedliche Oligonucleotidsequenzen
mit einer Länge
von mindestens ca. 8 Nucleotiden umfassen, von denen jede zuerst in
dem beschriebenen Sequenzprotokoll offenbart wurde. Derartige Oligonucleotidsequenzen
können
an jedem in einer Sequenz im Sequenzprotokoll vorkommenden Nucleotid
beginnen und entweder in Sense-Richtung (5' zu 3') gegenüber der beschriebenen Sequenz
oder in Antisense-Richtung fortschreiten.
-
Mit
auf Mikroarrays basierender Analyse lässt sich eine weite Bandbreite
genetischer Aktivität
aufklären,
welche zu einem neuen Verständnis
der Genfunktionen führt
und eine neue und unerwartete Einsicht in die Transkriptionsprozesse
und biologischen Mechanismen schafft. Der Einsatz von ansteuerbaren
Arrays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen liefert
eine genaue Information über
Transkriptionsänderungen,
die bei einem spezifischen Stoffwechselweg eine Rolle spielt und
möglicherweise
zur Identifizierung neuer Komponenten oder Genfunktionen führt, die
sich selbst als neue Phänotypen
erweisen.
-
Sonden,
die aus den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen bestehen
lassen sich auch bei der Identifizierung, Selektion und Validität von neuen
molekularen Zielen für
die Entdeckung von Arzneimitteln verwenden. Mit dem Einsatz dieser
einzigartigen Sequenzen kann man Ziele von Arzneimitteln und von
Arzneimitteln abhängige
Veränderungen
bei der Genexpression direkt feststellen, die über Stoffwechselwege moduliert
werden, welche sich von dem für
das Arzneimittel beabsichtigten Ziel unterscheiden. Diese einzigartigen
Sequenzen kommen daher bei der Abgrenzung und Überwachung von sowohl der Arzneimittelwirkung
als auch der Toxizität
zum Einsatz.
-
Als
Beispiel für
einen Einsatz können
die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen in
Mikroarrays oder anderen Assay-Formaten zum Screening von Sammlungen
von Genmaterial aus Patienten mit besonderem medizinischem Befinden
verwendet werden. Diese Untersuchungen können auch unter Verwendung
der zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten Sequenzen in
silico durchgeführt werden
und indem zuvor gesammelte genetische Datenbanken und die offenbarten
Sequenzen unter Einsatz von dem Fachmann bekannter Computer-Software
verglichen werden.
-
Somit
lassen sich die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–27 offenbarten
Sequenzen einsetzen, um mit einer besonderen Krankheit einhergehende
Mutationen zu identifizieren und auch als ein diagnostischer oder
prognostischer Assay.
-
Obwohl
die hier beschriebenen Sequenzen speziell unter Verwendung der Nucleotidsequenz
beschrieben wurden, sollte beachtet werden, dass jede der Sequenzen
einzeln beschrieben werden kann, indem jedes aus breiten Spektrum
der verschiedenen zusätzlichen
strukturellen Attribute oder Kombinationen derselben herangezogen
wird. Beispielsweise lässt
sich eine gegebene Sequenz durch die Nettozusammensetzung der in
einem gegebenen Abschnitt der Sequenz vorkommenden Nucleotide zusammen
mit dem Vorkommen einer oder mehrerer zum ersten Mal in den SEQ
ID NOs 1–27
offenbarter spezifischer Oligonucleotidsequenzen beschreiben. Alternativ
können
eine Reastriktionskarte, welche die relativen Positionen der Stellen
für einen
Verdau mit Restriktionsendonucleasen genau angibt, oder verschiedene
Palindrome oder andere spezifische Oligonucleotidsequenzen verwendet
werden, um eine gegebene Sequenz strukturell zu beschreiben. Solche
Restriktionskarten, welche typischerweise von in breitem Umfang
zur Verfügung
stehenden Computerprogrammen (z.B. das GCG-Sequenzanalysepaket der Universität von Wisconsin
SEQUENCHER 3.0, Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, usw.) erstellt
werden, können
wahlweise zusammen mit einer oder mehreren diskreten in der Sequenz
vorkommenden Nucleotidsequenzen verwendet werden, die sich durch
die relative Position der Sequenz relativ zu einer oder mehreren
zusätzlichen
Sequenzen oder einem oder mehreren in der offenbarten Sequenz vorkommenden
Restriktionsstellen beschreiben lassen.
-
Für Oligonucleotidsonden
kommen hoch stringente Bedingungen in Betracht, z.B. Waschen in 6xSSC/0,06%
Natriumpyrophosphat bei 37°C
(für Oligos
von 14 Basen), bei 48°C
(für Oligos
von 17 Basen), bei 55°C
(für Oligos
von 20 Basen) und bei 60°C
(für Oligos
von 23 Basen). Diese Nucleinsäuremoleküle können Antisensemoleküle der NHP-Sequenz
codieren oder als solche fungieren, welche z.B, für eine Regulierung
der NHP-Sequenz brauchbar sind (für und/oder als Antisense-Primer
in Amplifizierungsreaktionen von Nucleinsäuresequenzen des NHP). Bezüglich der
Regulierung der NHP-Sequenz können
solche Techniken eingesetzt werden, um biologische Funktionen zu
regulieren. Ferner können
solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder als Tripelhelixsequenzen
verwendet werden, welche ebenfalls für die Regulierung der NHP-Sequenz
brauchbar sind.
-
Inhibitorische
Antisense- oder Doppelstrang-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten
Basenrest aufweisen, der ausgewählt
ist, jedoch nicht ausschließlich,
aus der Gruppe 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-Carboxymethylamino-methyluracil,
Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-isopentenyladenin, 1-Metnylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin,
2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin,
S-Methycytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil.
beta-D-Mannosylqueosin,
5'-ethoxycarboxymethyluracil.
-
5-Methoxyuracil,
2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil,
2-Thiouracil, 4-Thiouracil,
5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, .(acp3)w
und 2,6-Diamino-purin.
-
Die
Antisense-Oligonucleotide können
auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest enthalten, ausgewählt, aber
nicht ausschließlich,
aus der Gruppe Arabinose, 2-Fluorarabinose,
Xylulose und Hexose.
-
In
noch einer anderen Ausführungsform
umfassen die Antisense-Oligonucleotide ein Rückgrat mit mindestens einem
modifizierten Phosphat, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat,
einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat,
einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal
oder einem Analogen davon.
-
In
noch einer anderen Ausführungsform
ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres
Oligonucleotid bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride,
in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
6625–6641).
Das Oligonucleotid ist ein 2'-0-Methylribonucleotid
(Inoue et al., 15: 6131–6148)
oder ein chimäres
RNA-DNA-Analoges
(Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330). Alternativ kann doppelsträngige RNA
verwendet werden, um die Expression und Funktion eines Ziel-NHP
zu unterbrechen.
-
Die
Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach im Stand der Technik
bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Verwendung
eines automatischen DNA-Synthesizers
(wie er im Handel von Biosearch, Applied Biosystems usw. bezogen
werden kann). Beispielsweise können
Phosphorthioat-Oligonucleotide nach dem Verfahren von Stein et al.
(1988, Nucl. Acids res. 16: 3209) synthetisiert werden und Methylphosphonat-Oligonucleotide
lassen sich unter Verwendung von Polymerträgern des Typs Controlled Pore Glass
herstellen (Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448–7451),
usw.
-
Niedrig
stringente Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und variieren
in voraussagbarer Weise je nach den speziellen Organismen, von welchen
die Bücherei
und die markierten Sequenzen stammen. Für eine Anleitung zur Schaffung
solcher Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (and periodic Updates thereof), Cold
Springs Harbor Press, N.Y.; sowie Ausubel et al., 1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und
Wiley Interscience, N.Y.
-
Alternativ
können
geeignete markierte NHP-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um eine
humane Genombibliothek unter Einsatz von ausreichend stringenten
Bedingungen oder mittels PCR zu durchsuchen. Die Identifizierung
und Charakterisierung von menschlichen Genomklonen ist zur Identifizierung
von Polymorphismus hilfreich (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von
Nucleotid-Repeats, Mikrosatelliten-Allelen, Einzelnucleotid-Polymorphismus
oder codierender Einzelnucleotid-Polymorphismus),
zur Ermittlung der Genomstruktur eines gegebenen Locus/Allels und
zur Planung diagnostischer Tests. Beispielsweise lassen sich Sequenzen,
die von Abschnitten abstammen, welche den Intron/Exon-Grenzen des
Humangens benachbart sind, zur Entwicklung von Primern für die Verwendung
in Amplifikationsassays einsetzen, um in den Exons, Introns, Spleißorten (z.B.
an der Spleißakzeptor-
und/oder Donorstelle) Mutationen aufzuspüren usw., welche in der Diagnose
und Pharmakogenetik zum Einsatz kommen können.
-
Ferner
lässt sich
ein NHP-Sequenzhomologes aus Nucleinsäuren von einem in Frage kommenden
Organismus isolieren, indem eine PCR durchgeführt wird, in welcher zwei degenerierte
oder "Wobble" Oligonucleotidprimer-Pools
verwendet werden, die auf Grundlage der Aminosäuresequenzen in den hier offenbarten NHP-Produkten
entworfen wurden. Die Matrize für
die Reaktion kann Gesamt-RNA, mRNA und/oder cDNA sein, welche durch
reverse Transcription von mRNA erhalten wurde, welche aus humanen
oder nicht humanen Zelllinien oder von Gewebe erhalten wurde, von
dem angenommen wird, dass es ein Allel eines NHP-Gens exprimiert.
-
Das
PCR-Produkt kann subcloniert und sequenziert werden, um sicher zu
gehen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten
NHP-Gens darstellen. Das PCR-Fragment kann sodann verwendet werden,
um mit verschiedenen Methoden einen cDNA-Klon mit voller Länge zu isolieren.
Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment markiert und dazu
verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek
zu durchsuchen. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet werden, über das
Durchsuchen einer Genombibliothek genomische Klone zu isolieren.
-
Die
PCR-Technologie lässt
sich auch zur Isolierung einer cDNA-Sequenz in vollständiger Länge einsetzen.
Beispielsweise kann RNA aus einer geeigneten Quelle aus Zellen oder
Gewebe nach Standardverfahren isoliert werden (d.h. aus einer Quelle,
von der man weiß oder
annimmt, dass sie eine NHP-Sequenz exprimiert). An der RNA wird
eine Reaktion mit reverser Transkriptase (RT) durchgeführt, wobei
ein Oligonucleotid-Primer verwendet wird, der für die meisten 5'-Enden des amplifizierten
Fragments für
das Priming der Synthese des ersten Strangs spezifisch ist. Das
erhaltene RNA/DNA-Hybrid kann dann "zurechtgestutzt" werden, indem man eine Standardreaktion
mit terminaler Transferase verwendet, das Hybrid kann mit RNase
verdaut werden und die Synthese des zweiten Strangs kann dann mit
einem komplementären
Primer geprimt werden. Somit lassen sich cDNA-Sequenzen stromauf
zum amplifizierten Fragment isolieren. Für einen Überblick über die Klonierungsstrategien,
die eingesetzt werden können,
siehe Sambrook et al., 1989, supra.
-
Durch
Einsatz der PCR kann z.B. eine eine mutierte NHP-Sequenz codierende
cDNA isoliert werden. In diesem Falle kann der erste cDNA-Strang
synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an eine mRNA
anhybridisiert wird, welche aus einem Gewebe isoliert wurde, von
dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es in einem Individuum
exprimiert wird, welches vermeintlich ein mutiertes NHP-Allel trägt, und
indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird.
Der zweite Strang der cDNA wird sodann synthetisiert, indem ein
Oligonucleotid eingesetzt wird, welches spezifisch an das 5'-Ende des normalen
Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt
sodann mit der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten Vektor
cloniert und mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind einer
DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des
mutierten NHP-Allels mit der eines entsprechenden normalen NHP-Allels
kann (können)
die Mutation(en) ermittelt werden, die für den Verlust oder die Änderung der
Funktion des mutierten NHP-Sequenzprodukts verantwortlich sind.
-
Alternativ
lässt sich
eine Genombibliothek aufbauen, indem eine DNA eingesetzt wird, die
aus einem Individuum gewonnen wurde, von dem angenommen wird oder
bekannt ist, dass es ein mutiertes NHP-Allel trägt (z.B. eine Person, die einen
auf NHP zurückzuführenden
Phänotyp
aufweist, wie z.B. Fettsucht, Sehstörungen, hoher Blutdruck, Depressionen,
epileptische Anfälle,
Unfruchtbarkeit usw.), oder es lässt
sich eine cDNA-Bibliothek aufbauen, indem RNA aus einem Gewebe eingesetzt
wird, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es ein mutiertes
NHP-Allel exprimiert. Eine normale NHP-Sequenz oder ein geeignetes
Fragment davon kann sodann markiert werden und als Sonde zur Identifizierung
des entsprechenden mutierten NHP-Allels in solchen Büchereien
eingesetzt werden. Klone mit mutierte NHP codierenden Sequenzen
können
sodann gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer
Sequenzanalyse unterzogen werden.
-
Zusätzlich kann
eine Expressionsbücherei
aufgebaut werden, indem cDNA eingesetzt wird, welche z.B. aus RNA
synthetisiert wurde, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem
bekannt ist oder angenommen wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel
exprimiert in einem Individuum, von dem angenommen wird oder bekannt
ist, dass es solch ein mutiertes Allel trägt. Auf diese Weise können aus
dem vermeintlich mutierten Gewebe gewonnene Genprodukte exprimiert
und unter Verwendung von standardisierten Antikörper-Screeningtechniken zusammen
mit, wie unten beschrieben, gegen ein normales NHP-Produkt gerichteten
Antikörpern
gescreent werden. (Zu Screeningtechniken siehe z.B: Harlow, E. und
Lane, Hrg., 1988, "Antibodies:
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.) Zusätzlich kann
das Screening erfolgen, indem mit markierten NHP-Fusionsproteinen
wie z.B. der alkalische Phosphatase-NHP oder den alkalischen NHP-Phosphatase-Fusions-proteinen
gescreent wird. In Fällen,
wo eine Mutation der NHP zu einem Genprodukt mit veränderter
Funktion führt
(z.B. als Ergebnis einer Missense-Mutation oder einer Mutation in
Folge einer Rasterverschiebung), gehen gegen NHP gerichtete polyklonale
Antikörper
wahrscheinlich mit einem entsprechenden mutierten NHP-Sequenzprodukt eine
Kreuzreaktion ein. Klone aus Büchereien,
die über
ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern aufgefunden wurden können gereinigt
und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
-
Die
Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen und/oder der komplementären (d.h.
Antisense-) Sequenzen enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die jede
der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem
regulatorischen Element assoziiert sind, welches die Expression
der codierenden Sequenzen lenkt (z.B. ein Baculo-Virus, wie es im
US-Patent 5,869,336
beschrieben wird, welches hiermit als Referenz eingeführt wird);
(c) gentechnisch bearbeitete Wirtszellen, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem regulatorischen Element
assoziiert sind, welches die Expression der codierenden Sequenzen
in der Wirtszelle lenkt und (d) gentechnisch veränderte Wirtszellen, die eine
endogene NHP-Sequenz unter der Kontrolle eines exogen eingeführten regulatorischen
Elements (d.h. Genaktivierung) exprimieren. Unter dem hier verwendeten
Begriff regulatorische Elemente werden, jedoch nicht ausschließlich, induzierbare
und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere
dem Fachmann bekannte Elemente verstanden, welche die Expression steuern
und kontrollieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch
nicht ausschließlich,
das unmittelbar frühe
Gen des humanen Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare virale Elemente
(insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren)., die frühen oder
späten
Promotoren des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System,
das TAC-System, das TRC-System, die hauptsächlichen Operator- und Promotorabschnitte
des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte des fd-Kapsidproteins,
die Promotoren der sauren Phosphatase sowie die Promotoren der Alpha
Mating Faktoren aus Hefe.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einscjließlich Fab-Fragmente),
Antagonisten und Agonisten der NHP sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte,
welche die Expression einer NHP-Sequenz inhibieren (Inhibitoren
des Transskriptionsfaktors, Antisense- und Ribozymmoleküle oder
Konstrukte zum Ersatz eines Gens oder einer regulatorischen Sequenz)
oder die Expression eines NHP begünstigen (z.B. Expressionskonstrukte,
in denen die NHP codierende Sequenz operativ an die Expression von
Kontrollelementen wie z.B. Promotoren, Promotoren/Enhancern usw.
gekoppelt ist).
-
Die
NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
-Antikörper,
-Antagonisten und -Agonisten können
für den
Nachweis von mutierten NHPs oder unvollständig exprimierten NHPs für die Diagnose
von Krankheiten nützlich
sein. Die NHP-Proteine oder -Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
Wirtszellex-pressionssysteme, Antikörper, Antagonisten, Agonisten
und gentechnisch bearbeiteten Zellen und nicht menschliche Tiere
können
zum Screening nach Arzneimitteln verwendet werden (oder zum Screening
von kombinatorischen Bücherein
mit großem
Durchsatz), welche für
die Behandlung der symptomatischen oder phänotypischen Symptome einer
Störung
der normalen Funktion von NHP im Körper wirksam sind. Die Verwendung
von gentechnisch veränderten Wirtszellen
und/oder nicht menschlichen Tieren kann insofern einen Vorteil bieten,
als solche Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen berücksichtigen,
die an einen endogenen Rezeptor/Liganden von NHP binden, sondern
auch Verbindungen identifizieren, die eine von NHP vermittelte Aktivität auslösen.
-
Schließlich können die
NHP-Produkte als Therapeutika Verwendung finden. Beispielsweise
können lösliche Derivate
wie z.B. den NHPs entsprechende NHP-Peptide/Domänen, ausgeschiedene Formen
von NHP, Proteinprodukte einer Fusion mit NHP (insbesondere NHP-IG-Fusionsproteine,
d.h. Fusionen eines NHP oder einer Domäne eines NHP an ein IgFc),
NHP-Antikörper
oder antiidiotypische Antikörper
(einschließlich Fab-Fragmente),
Antagonisten oder Agonisten (einschließlich Verbindungen, welche
downstream gelegene Ziele in einem NHP vermittelten Stoffwechselweg
modulieren oder auf sie einwirken) zur direkten Behandlung von Krankheiten
oder Störungen
eingesetzt werden. Beispielsweise könnte die Verabreichung einer
wirksamen Menge eines löslichen
NHP oder eines NHP-IgFc-Fusionsproteins
oder eines antiidiotypischen Antikörpers (oder dessen Fab), der
das NHP nachahmt, den endogenen NHP-Rezeptor aktivieren oder wirksam
antagonisieren. Nucleotid-Konstrukte, die solche NHP-Produkte codieren
können
eingesetzt werden, um Wirtszellen zur Expression solcher Produkte
in vivo gentechnisch zu behandeln; diese gentechnisch behandelten Zellen
wirken im Körper
als "Bioreaktoren", welche einen kontinuierlichen
Strom eines NHP, eines NHP-Pepetids oder eines NHP-Fusionsproteins liefern.
Nucleotidkonstrukte, die funktionelle NHPs, mutierte NHPs sowie Antisense-
und Ribozym-Moleküle
codieren können
auch in Ansätzen
einer "Gentherapie" für die Modulation der
NHP-Expression eingesetzt werden. Somit umfasst die Erfindung auch
pharmazeutische Formulierungen und Verfahren zur Behandlung von
biologischen Störungen.
-
Verschiedene
Aspekte der Erfindung werden nun genauer in den folgenden Unterabschnitten
beschrieben.
-
5.1 DIE NHP-SEQUENZEN
-
Die
cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der beschriebenen NHPs sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Die
NHP-Nucleotide wurden aus gebündelten
menschlichen Genen, die einem gene trapping unterzogen worden waren,
aus ESTs und aus cDNAs erhalten, die aus dem Hiern des Menschen,
aus dem Hirn eines Fötus,
aus dem Kleinhirn und aus Bibliotheken von Hypothalamus-cDNA isoliert worden
waren. Die beschriebenen Sequenzen teilen eine begrenzte strukturelle Ähnlichkei mit
verschiedenen Proteinen, einschließlich aber nicht ausschließlich mit
Neurexinen/einschließlich
der sekretierten Typen) und mit Contactin-assoziierten Proteinen.
Es wurde ein Polymorphismus identifiziert, der z.B. bei der dem
Nucleotid 812 der SEQ ID NO: 1 entsprechenden Position zu einer
Transition von C oder T führt, was
zur Folge hat, dass z.B in der Aminosäureposition 271 der SEQ ID
NO: 2 Ser oder Leu vorkommt.
-
5.2 NHPs UND NHP-POLYPEPTIDE
-
NHPs,
Polypeptide, Peptidfragmente, mutierte, gekürzte oder einer Deletion unterzogene
Formen der NHPs und/oder Fusionsproteine können für verschiedene Verwendungen
hergestellt werden. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht ausschließlich, die
Erzeugung von Antikörpern,
als Reagenzien in diagnostischen Assays, für die Identifizierung von anderen
mit NHP in Verbindung stehenden Zellgenprodukten, als Reagenzien
in Assays zum Screening von Verbindungen, die als pharmazeutische
Reagenzien bei der therapeutischen Behandlung von mentalen, biologischen
oder medizinischen Störungen
und Krankheiten von Nutzen sein können. In Anbetracht der Information über die Ähnlichkeit
und der Daten über
die Expression können
die beschriebenen NHPs als Ziel (für Arzneimittel, Oloigos, Antikörper usw.)
dienen, um eine Krankheit zu behandeln oder um die Wirksamkeit von
therapeutischen Mitteln zu steigern.
-
Das
Sequenzprotokoll zeigt die von den beschriebenen NHP-Polynucleotiden
codierten Aminosäuresequenzen.
Die NHPs weisen Initiations-Methionine in DNA-Sequenzkontexten auf, die mit einer
Translations-Initiations-Stelle übereinstimmen sowie
Signalsequenzen, die für
eine Membran oder ausgeschiedene Proteine charakteristisch sind.
-
Die
erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
für die
NHPs umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen
als auch Analoga und Derivate davon. Ferner werden von der Erfindung
die entsprechenden NHP-Analogen aus anderen Species mit umfasst.
Daher liegt jedes von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierte NHP-Protein
mit im Schutzumfang der Erfindung sowie jede neue Polynucleotidsequenz,
die alle oder irgend einen neuen Abschnitt einer im Sequenzprotokoll
angegebenen Aminosäuresequenz
codiert. Es ist bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist
und entsprechend steht jede im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäure generisch
für das
bekannte Nucleinsäure-"Triplett"-Codon oder in vielen
Fällen
Codons, welche die Aminosäure
codieren können.
Die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen als solche sollen
im Zusammenhang mit dem genetischen Code (siehe z.B. Table 4-1 auf
Seite 109 von "Molecular
Cell Biology", 1986,
J. Darnell et al. Hrg. Scientific American Books, New York, NY,
welche hiermit als Referenz eingeführt wird) generisch für alle verschiedenen
Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäure-Sequenzen stehen, welche
solche Aminosäuresequenzen
codieren können.
-
Die
Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell den von den hier
beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NHPs äquivalent sind, beurteilt nach
jeder Anzahl von Kriterien einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der
Fähigkeitein
ein Substrat eines NHP zu binden und zu spalten, oder der Fähigkeit,
einen identischen oder komplementären stromab gelegenen Weg zu
bewirken oder eine Änderung
im Zellmetabolismus (z.B. proteolytische Aktivität, Ionenfluss, Phosphoryierung
des Tyrosins usw.). Solche funktionell äquivalenten NHP-Proteine sind,
aber nicht ausschließlich,
Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der von den oben
beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierten Aminosäuresequenz,
die aber zu einer stillen Änderung
führen,
indem sie ein funktionell äquivalentes
Genprodukt liefern. Substitutionen von Aminosäuren können auf Basis einer Ähnlichkeit
in der Polarität,
der Ladung, der Löslichkeit,
der Hydrophobizität, der
Hydrophilizität
und/oder der amphipatischen Natur der betroffenen Reste erfolgen.
Beispielsweise sind nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin;
polare neutrale Aminosäuren
sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin;
positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin und
Histidin; und negativ geladene saure Aminosäuren sind Asparaginsäure und
Glutaminsäure.
-
Es
können
verschiedene Wirts-Expressions-Vektorsysteme eingesetzt werden,
um die NHP-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Wo,
wie im vorliegenden Fall, die NHP-Peptide oder -Polypeptide Membranproteine
sein sollen, können
die hydrophoben Abschnitte des Proteins auf der Ebene der Proteine oder
Nucleinsäure
herausgeschnitten werden (d.h. der z.B. in der SEQ ID NO. 2 annähernd von
der Aminosäureposition
1.240 bis zur Aminosäureposition
1.265 reichende hydrophobe Abschnitt) und die erhaltenen löslichen
Peptide oder Polypeptide können
aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Solche Expressionssysteme
umfassen auch gentechnisch bearbeitete Wirtszellen, die ein NHP
oder ein funktionelles Äquivalent in
situ exprimieren. Die Reinigung oder Anreicherung eines NHP aus
solchen Expressionssystemen kann erfolgen, indem geeignete Detergentien
und Lipidmicellen und dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden.
Es können
jedoch solche gentechnisch bearbeiteten Wirtszellen selbst in Situationen
eingesetzt werden, wo es wichtig ist, die strukturellen und funktionellen
Eigenschaften des NHP zu bewahren, aber die biologische Aktivität zu beurteilen,
z.B. in Screeningassays für
Arzneimittel.
-
Die
Expressionssysteme, die sich für
die Zwecke der Erfindung einsetzen lassen sind, jedoch nicht ausschließlich, Mikroorganismen
wie z.B. Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden
rekombinanten Expressionsvektoren aus Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA
oder Cosmid-DNA transformiert wurden; Hefe (z.B. Saccharomyces Pichia),
die mit NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden Expressionsvektoren aus Hefe transformiert wurde; Insektenzellsysteme,
die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren
aus Viren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme,
die mit rekombinanten Expressionsvektoren aus Viren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV;
Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinaten
Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert wurden; oder
Säugerzellsysteme
(z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte
beherbergen, welche von dem Säugerzellen-Genom
stammende Promotoren (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren
stammende Promotoren (z.B. der Adenovirus-Late-Promotor; der Vacciniavirus-7,5K-Promotor)
enthalten.
-
Aus
bakteriellen Systemen lässt
sich vorteilhafterweise je nach der beabsichtigten Verwendung für das zu
exprimierende NHP-Produkt eine Anzahl von Expressionsvektoren auswählen. Ist
beispielsweise eine große
Menge eines solchen Proteins zur Erzeugung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen herzustellen, die aus NHP bestehen oder NHP enthalten,
oder zur Erzeugung von Antikörpern
gegen ein NHP, können
Vektoren erwünscht
sein, die eine große
Menge an leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten steuern.
Solche Vektoren sind, jedoch nicht ausschließlich, der Expressionsvektor
pUR278 Von E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), in welchem
eine NHP-codierende Sequenz im richtigen Raster mit dem lacZ codierenden Abschnitt
einzeln in den Vektor ligiert ist, so dass ein Fusionsprotein entsteht;
pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985,
Nucleic Acids Res. 13:3101–3109;
Van Heeke & Schuster,
1989, J. Biol. Chem. 254:5503–5509);
und dergl. pGEX-Vektoren (Pharmacia oder American Type Culture Collection)
können
ebenfalls eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine
mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen
sind solche Fusionsproteine löslich
und lassen sich mittels Adsorption an Gluththion-Agarose-Kügelchen
gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion leicht
von lysierten Zellen reinigen. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen,
dass sie Schnittstellen für
Thrombin oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das geklonte
Zielsequenzprodukt vom GST-Rest befreit werden kann.
-
In
einem Insektensystem wird das Autographa-Californica-Nuclear-Polyhydrosis-Virus
(AcNPV) als Vektor zue Erxpression von fremden Sequenzen eingestzt.
Das Virus wächst
in Zellen von Spodoptera frugiperda. Eine NHP codierende Sequenz
kann einzeln in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen) des
Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (t.B.
des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion
der NHP codierenden Sequenz führt
zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und der Produktion von
einem nackten rekombinanten Virus (d.h. einem Virus ohne Proteinhülle, die von
dem Polyhedrin-Gen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden
sodann benutzt, um Zellen von Sodoptera frugiperda zu infizieren,
in welchen die insertierte Sequenz exprimiert wird (siehe z.B. Smith
et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051).
-
In
Wirtszellen von Säugern
lässt sich
eine Anzahl von auf Viren beruhenden Expressions-systemen einsetzen.
In den Fällen,
wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die
in Frage stehende Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex,
z.B. die Late Promotor- und Tripartite-Leader-Sequenz des Adenovirus
ligiert sein. Diese chimäre
Sequenz kann sodann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination
in das Genom des Adenoviorus insertiert sein. Die Insertion in einen
nicht essentiellen Abschnitt des viralen Genoms (z.B. Abschnitt
E1 oder E3) führt
zu einem rekombinaten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in
infizierten Wirten ein NHP-Produkt zu exprimieren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659).
Für eine
wirkungsvolle Translation von insertierten NHP-Nucleotidsequenzen
können
auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Diese Signale
umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In
den Fällen,
wo eine ganze NHP-Sequenz oder cDNA einschließlich des eigenen Initiationscodons
und der angrenzenden Sequenzen in einen passenden Expressionsvektor
insertiert wird, sind keine zusätzlichen
Kontrollsignale für
die Translation nötig.
In Fällen
jedoch, wo nur ein Teil einer NHP codierenden Sequenz insertiert
wird, müssen
exogene Kontrollsignale für
die Translation einschließlich
vielleicht des ATG-Initiationscodons zur Verfügung gestellt werden. Außerdem muss
das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten
codierenden Sequenz sein, um eine Translation des gesamten Insertionselements
sicher zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation
und die Initiationscodons können
verschiedenen, entweder natürlichen
oder synthetischen Ursprungs sein. Die Effezienz der Expression
lässt sich
durch Einbeziehung geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren
usw. steigern (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:
516–544).
-
Zusätzlich kann
ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten
Sequenzen moduliert oder das Sequenzprodukt auf die gewünschte spezifische
Weise modifiziert und weiterbehandelt. Solche Modifikationen (z.B.
eine Glykosylierung) und Weiterbehandlungen (z.B. eine Spaltung)
der Proteinprodukte können
für die
Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische
und spezifische Mechanismen für
die posttranslationale Weiterbehandlung und Modifikation von Proteinen
und Genprodukten auf. Es können
passende Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte
Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten Fremdproteins
sicher zu stellen. Hierfür
lassen sich eukaryotische Wirtszellen einsetzen, die über die
zelluläre
Maschinerie für
eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung
und die Phosphorylierung des Genprodukts verfügen. Solche Wirtszellen von
Säugern
sind, jedoch nicht ausschließlich,
CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3-, WI38- und insbesondere
menschliche Zelllinien.
-
Für eine langzeitige
Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist eine stabile
Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, welche die
oben beschriebenen NHP-Sequenzen exprimieren, gentechnisch bearbeitet
werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale
Ursprünge
der Replikation enthalten, lassen sich Wirtszellen mit DNA transformieren,
die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen (z.B. Promotoren,
Enhancer-Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw)
und einem auswählbaren
Marker kontrolliet werden. Nach Einführung der Fremd-DNA werden
gentechnisch behandelte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten
Medium wachsen gelassen und sodann in ein selektives Medium überführt. Die
auswählbaren
Marker in dem rekombinanten Plasmid verleihen gegenüber einer
Selektion Resistenz und bringen die Zellen dazu, das Plasmid in
ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu
bilden, die ihrerseits geklont werden können und sich zu Zelllinien
vermehren. Dieses Verfahren lässt
sich vorteilhaft einsetzen, um Zelllinien gentechnisch zu verändern, welche
das Genprodukt exprimieren. Solche gentechnisch bearbeiteten Zelllinien
sind vorteilhaft beim Screening und der Auswertung von Verbindungen
zu gebrauchen, welche die endogene Aktivität des NHP-Produkts beeinflussen.
-
Es
kann eine Anzahl von Selektionssystemen eingesetzt werden, einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
die Thymidinkinase aus Herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell
11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenosin-Phosphoribosyltransferasegene
(Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) können jeweils in tk–-,
hgprt–-oder aprt–-Zellen
eingesetzt werden. Auch Resistenz gegen Antimetaboliten kann für die folgenden
Gene als Basis für
eine Selektion verwendet werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat
verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht
(Mulligan & Berg
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen
das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol.
150: 1) und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre,
et al., 1984, Gene 30: 147).
-
Alternativ
lässt sich
jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein für das exprimierte
Fusionsprotein spezifischer Antikörper verwendet wird. Beispielsweise
lässt sich
mit einem von Janknecht et al. beschriebenen System ein in menschlichen
Zelllinien exprimiertes nicht denaturiertes Fusionsprotein leicht
reinigen (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8972–8976).
In diesem System wird das betreffende Gen in ein Vaccinia-Rkombinationsplasmid
subcloniert, so dass das offene Leseraster translational an ein
aus sechs Histidinresten bestehendes aminoendständiges Tag fusioniert wird.
Die Extrakte aus mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen
werden auf Ni2+-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen aufgetragen
und die Proteine mit freien Histidinenden selektiv mit Imidazol
enthaltenden Puffern eluiert.
-
Von
der vorliegenden Erfindung werden auch Fusionsproteine umfasst,
welche das NHP zu einem Zielorgan lenken und/oder den Transport
durch die Membran in das Cytosol erleichtern. Die Konjugation von NHPs
an Antikörpermoleküle oder
deren Fab-Fragmente
könnte
ausgenutzt werden, um besondere Epitope tragende Zellen an das Ziel
zu bringen. Ein Anheften der passenden Signalsequenz an das NHP
würde das NHP
auch an den gewünschten
Ort innerhalb der Zelle transportieren. Alternativ könnte eine
Zielausrichtung von NHP oder von dessen Nucleinsäuresequenz erreicht werden,
indem Übertragungssysteme
auf Basis von Liposomen oder Lipid-Komplexen eingesetzt werden.
Derartige Technologien werden in Liposomes: A Practical Approach,
Neue RRC-Ausgabe, Oxford University Press, New York und in den US-Patenten. 4,594 595, 5,459,127,
5,948,767 und 6,110,490 sowie in deren entsprechenden Offenbarungen
beschrieben, welche hiermit in voller Länge als Referenz eingeführt werden.
Eine zusätzliche
Ausführungsform
stellen neue Protein-Konstrukte
dar, die gentechnisch so behandelt wurden, dass sie den Transport
des NHP an den Zielort oder das gewünschte Organ erleichtern, wobei
sie die Zellmembran und/oder den Kern durchqueren, wo das NHP seine
funktionelle Aktivität
entfalten kann. Dieses Ziel kann erreicht werden, indem das NHP
an ein Cytokin oder einen anderen Liganden gekoppelt wird, der für eine zielgerichtete
Spezifität
sorgt, und/oder an eine ein Protein transduzierende Domäne (siehe
allgemein die US-Anmeldungen 60/111, 701 und 60/056,713, welche hiermit
beide als Referenz für
z.B. derartige transduzierenden Sequenzen eingeführt werden), um den Durchtritt
durch Zellmembranen zu erleichtern und es kann wahlweise gentechnisch
so bearbeitet werden, dass es Sequenzen für eine Lokalisierung im Kern
enthält.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
