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1. EINFÜHRUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung eines neuen menschlichen Polynucleotids, das Proteine
codiert, welche mit Phospholipasen von Säugern Sequenzähnlichkeit
aufweisen. Die Erfindung umfasst die beschriebenen Polynucleotide,
die Expressionssysteme von Wirtszellen, die codierten Proteine,
Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide sowie genetisch veränderte Tiere,
denen die beschriebenen Polynucleotide, Antagonisten und Agonisten
der Proteine sowie andere Verbindungen fehlen oder die sie überexprimieren,
welche die Expression oder Aktivität der von den beschriebenen
Polynucleotiden codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose,
das Medikamentenscreening, die Überwachung klinischer
Versuche und die Behandlung von Krankheiten und Beschwerden eingesetzt
werden können.
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2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Phospholipasen
hydrolysieren Phospholipide und können bei der Zellaktivierung
und Signaltransduktion eine Schlüsselrolle
spielen. Als solche sind Phospholipasen u.a. mit der Entwicklung,
Entzündung,
Infektionskrankheiten und Krebs in Zusammenhang gebracht worden.
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3. ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von Nucleotiden, welche neue menschliche Proteine
codieren, sowie die entsprechenden Aminosäuresequenzen dieser Proteine.
Die hier zum ersten Mal beschriebenen neuartigen menschlichen Proteine
(NHPs) weisen mit tierischen Phospholipasen Strukturähnlichkeit
auf, einschließlich
der Phospholipase C delta 4.
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Die
hier beschriebenen neuen menschlichen Nucleinsäure (cDNA)-Sequenzen codieren
Proteine/offene Leseraster (ORFs) von 239, 329, 351, 149, 239, 261,
762, 69, und 272 Aminosäuren
Länge (siehe
SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 bzw. 19).
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Die
Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen
NHPs, einschließlich
kleine Moleküle,
große
Moleküle,
Mutanten-NHPs oder Abschnitte derselben, welche mit nativem HHP,
Peptiden und Antikörpern
konkurrieren sowie Nucleotidsequenzen, die eingesetzt werden können, um
die Expression der beschriebenen NHPs zu hemmen (z.B. Antisense-
und Ribozymmoleküle
sowie Ersatz-Konstrukte für Gene
oder regulatorische Sequenzen) oder um die Expression der beschriebenen
NHP-Polynucleotide
zu unterstützen
(z.B. Expressions-Konstrukte, welche die beschriebenen Polynucleotide
unter die Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen) sowie
transgene Tiere, welche ein NHP-Transgen exprimieren oder "Knock-outs" (die bedingt sein
können),
welche kein funktionelles NHP exprimieren. KO-Mäuse lassen sich auf verschiedene
Weise produzieren, von denen eine den Einsatz von Stammzelllinien
von Mäuseembryonen ("ES-Zellen") betrifft, welche
in einem Mäusehomologen
von zumindest einem der beschriebenen NHPs gene-trap-Mutationen
enthält.
Wenn die in SEQ ID NOs: 1-20 beschriebenen Unique-NHP-Sequences "ausgeknockt" werden, liefern
sie sowohl ein Verfahren zur Identifizierung der Expression des
Phänotyps
des besonderen Gens als auch ein Verfahren, das zuvor unbekannten
Genen eine Funktion zuordnet. Darüber hinaus sind die in SEQ
ID NOs: 1-20 beschriebenen Unique-NHP-Sequences für die Identifizierung
der codierenden Sequenz und das Mapping eines nur einmal vorkommenden
Gens auf einem besonderen Chromosom von Nutzen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner auch Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten
der NHP-Expression
und/oder der NHP-Aktivität
wirken, wobei gereinigte Präparate
der beschriebenen NHPs und/oder NHP-Produkte oder von diese exprimierenden Zellen
eingesetzt werden. Solche Verbindungen lassen sich als therapeutische
Mittel für
die Behandlung eines breiten Spektrums von mit biologischen Beschwerden
oder Unausgewogenheiten einhergehenden Symptomen einsetzen.
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4. BESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
UND DER FIGUREN
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Das
Sequenzprotokoll gibt die Sequenzen der die beschriebenen NHP-Aminosäuresequenzen
codierenden beschriebenen NHP-ORFs wieder. SEQ ID NO: 13 und 20
beschreiben Nucleotide, welche ein NHP-ORF mit Abschnitten einer
flankierenden Sequenz codieren.
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5. GENAUE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
hier zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-13 beschriebenen NHPs sind
neuartige Proteine, welche offensichtlich u.a. in Zelllinien des
Menschen, im Hirn eines menschlichen Fötus, im Hirn, im Kleinhirn,
im Rückenmark,
im Thymus, in der Milz, im Hoden, in der Schilddrüse, in der
Nebenniere, im Dünndarm,
im Dickdarm, in der Plazenta, im Fett, im Rektum sowie in gene-trapped-Zellen
exprimiert werden. Die beschriebenen Sequenzen wurden aus gene-trapped-cDNas,
einer Genomsequenz des Menschen und aus Klonen zusammengestellt,
die aus einer cDNA-Bibliothek von Gehirnen menschlicher Föten isoliert
wurden (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). Die hier zum ersten
Mal in den SEQ ID NOs: 14-20 beschriebenen NHPs sind neuartige Proteine,
welche offensichtlich u.a. in Zelllinien des Menschen, im Hirn menschlicher
Föten,
im Hirn, im Hoden, im Skelettmuskel, im Herzbeutel, in der Luftröhre sowie
in gene-trapped-Zellen exprimiert werden. Die beschriebenen Sequenzen
wurden aus gene-trapped-cDNAs,
einer Genomsequenz des Menschen und aus Klonen zusammengestellt,
die aus einer cDNA-Bibliothek von einer Luftröhre des Menschen isoliert wurden (Edge
Biosystems, Gaithersburg, MD).
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Die
vorliegende Erfindung umfasst die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen
Nucleotide, die derartige Nucleotide exprimierenden Wirtszellen,
die Expressionsprodukte von solchen Nucleotiden und: (a) Nucleotide,
welche menschliche Homologe der beschriebenen Polynucleotide codieren
sowie die beschriebenen spezifischen NHPs und die NHP-Produkte; (b) Nucleotide,
welche einen oder mehrere Abschnitte der NHPs codieren, die den
funktionellen Domänen
entsprechen, sowie die Polypeptidprodukte, welche durch derartige Nucleotidsequenzen
spezifiziert werden, einschließlich,
aber nicht ausschließlich, die
neuen Regionen von jeder (allen) aktiven Domäne(n); (c) isolierte Nucleotide,
welche gentechnisch veränderte
oder natürlich
vorkommende mutierte Versionen der beschriebenen NHPs codieren,
in welchen die ganze oder ein Teil von mindestens einer Domäne zerstört oder
verändert
ist, sowie die durch derartige Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte,
einschließlich
aber nicht ausschließlich
lösliche
Proteine und Peptide, in welchen die ganze oder ein Teil der Signalsequenz
(oder der hydrophoben Transmembransequenz) zerstört ist; (d) Nucleotide, welche
chimäre
Fusionsproteine codieren, welche die ganze oder einen Abschnitt
der codierenden Region für ein
NHP oder eine von deren Domänen
(z.B. eine Rezeptor- oder Liganden-Bindungsdomäne, eine zusätzliche
Protein/Selbstassoziierungs-Domäne
usw.) enthalten, welche an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusioniert
sind; oder (e) therapeutische oder diagnostische Derivate der beschriebenen
Polynucleotide, wie z.B. Oligonucleotide, Antisense- Polynucleotide,
Ribozyme, dsRNA oder Konstrukte für die Gentherapie mit einer zuerst
im Sequenzprotokoll beschriebenen Sequenz. Wie oben beschrieben
umfasst die vorliegende Erfindung: (a) die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen
DNA-Sequenzen des
Menschen (sowie Vektoren, welche diese umfassen) und zusätzlich jede
Nucleotidsequenz, welche ein angrenzendes offenes Leseraster (ORF) für NHP codiert,
das an eine Komplementärsequenz
einer im Sequenzprotokoll wiedergegebenen DNA-Sequenz unter hoch stringenten Bedingungen
hybridisiert, z.B. eine Hybridisierung an filtergebundene DNA in
0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS),
1 mM EDTA bei 65°C
und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 68°C
(Ausubel, F.M., et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular
Bioliogy, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New
York auf S. 2.10.3). und ein funktionell äquivalentes Genprodukt codiert.
Zusätzlich
ist jede Nucleotidsequenz ins Auge gefasst, die an die Komplementärsequenz
einer DNA-Sequenz hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll
unter moderat stringenten Bedingungen angegebene Aminosäuresequenz
codiert und exprimiert, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel
et al., 1989, supra) und immer noch ein funktionell äquivalentes
NHP-Produkt codiert. Funktionelle Äquivalente eines NHP umfassen
in anderen Spezies natürlich
vorkommende NHPs und NHP Mutanten, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen
oder gentechnisch manipuliert wurden (durch ortsgerichtete Mutagenese, Gene
Shuffling, oder gerichtete Evolution wie z.B. in dem US-Patent 5,837,458
beschrieben). Die Erfindung umfasst auch degenerierte Nucleinsäure-Varianten
der beschriebenen NHP-Polynucleotidsequenzen.
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Zusätzlich ins
Auge gefasst sind Polynucleotide, welche NHP-ORFs oder deren funktionelle Äquivalente
codieren, die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche
zu etwa 99, 95, 90 oder etwa 85% ähnlich oder identisch mit entsprechenden
Regionen der Polynucleotidsequenzen des Sequenzprotokolls sind (gemessen
mit der BLAST-Sequenzvergleichs-Analyse unter Verwendung von z.B.
dem GCG-Sequenzanalyse-Softwarepaket
mit standardisiertem Default-Setting).
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Die
Erfindung enthält
auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise
DNA-Moleküle,
welche an die beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen hybridisieren
und daher deren Komplementärsequenzen
darstellen. Derartige Hybridisierungsbedingungen können, wie
oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein.
In Fällen,
wo die Nucleinsäuremoleküle Deoxyoligonucleotide
("DNA-Oligos") sind, sind die
Moleküle
im Allgemeinen etwa 16 bis etwa 100 Basen oder etwa 20 bis etwa
80 oder etwa 34 bis 45 lang oder jede Variation oder Kombination
der angegeben Größen, welche
eine angrenzende Region einer zuerst im Sequenzprotokoll offenbarten
Sequenz umfassen. Derartige Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR) zum Durchsuchen von Bibliotheken, zur Isolierung von Klonen
und zur Herstellung von Klonierungs- und Sequenzierungs-Matrizen
usw. verwendet werden.
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Alternativ
lassen sich derartige NHP-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden
zum Durchsuchen von Bibliotheken und zur Bewertung von Genexpressionsmustern
(insbesondere unter Einsatz eines Mikroarrays oder "Chip"-Formats mit hohem
Durchsatz) verwenden. Darüber
hinaus kann eine Reihe der beschriebenen NHP-Oligonucleotidsequenzen
oder deren Komplementärsequenzen
dazu benutzt werden, die ganzen oder einen Abschnitt der beschriebenen
NHP-Sequenzen darzustellen. Eine zuerst in mindestens einem Abschnitt
von einer oder mehreren der Sequenzen der SEQ ID NOs: 1-20 offenbartes Oligonucleotid
oder Polynucleotid kann zusammen mit einer (einem) festen Trägermatrix/Substrat
(Harze, Kügelchen,
Membranen, Kunststoffe, Polymere, metallische oder metallisierte
Substrate, kristalline oder polykristalline Substrate usw.) als
Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung
sind räumlich
ansteuerbare Arrays (d.h. Gen-Chips, Mikotiterplatten usw.) von
Oligonucleotiden und Polynucleotiden oder die entsprechenden Oligopeptide
und Polypeptide, wobei mindestens ein auf dem räumlich ansteuerbaren Array
vorkommendes Biopolymer eine zuerst in mindestens einer der Sequenzen
der SEQ ID NOs: 1-20 wiedergegebene Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenz
oder eine von denen codierte Aminosäuresquenz umfasst. Verfahren
zum Anheften von Biopolymeren an oder zur Synthese von Biopolymeren
auf festen Trägermatrizes
und die Durchführung
von Bindungsstudien darauf werden u.a. in den US-Patenten 5,700,637,
5,556,752, 5,744,305, 4,631,211, 5,445,934, 5,252,743, 4,713,326,
5,424,186 und 4,689,405 beschrieben.
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Ansteuerbare
Arrays mit zuerst in den SEQ ID NOs: 1-20 wiedergegebenen Sequenzen
können
zur Identifizierung und Charakterisierung der zeitlichen und gewebsspezifischen
Expression eines Gens benutzt werden. Diese ansteuerbaren Arrays
enthalten Oligonucleotidsequenzen von ausreichender Länge, um
die geforderte Spezifität
zu erbringen, die aber immer noch innerhalb der von der Produktionstechnik
auferlegten Grenzen liegt. Die Länge
dieser Sonden liegt im Bereich von ca. 8 bis ca. 2000 Nucleotiden.
Vorzugsweise bestehen die Sonden aus 60 Nucleotiden und mehr bevorzugt
aus 25 Nucleotiden von den zuerst in den SEQ ID NOs: 1-20 beschriebenen
Sequenzen.
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Beispielsweise
kann eine Reihe der beschriebenen Oligonucleotidsequenzen oder deren
Komplementärsequenzen
im Chip-Format benutzt werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen
Sequenzen darzustellen. Die Oligonucleotide, typischerweise mit
einer Länge
von ca. 16 bis ca. 40 Nucleotiden (oder jeder ganzen Zahl zwischen
dem angegebenen Bereich), können
sich teilweise überlappen
und/oder die Sequenz kann durch Einsatz von sich nicht überlappenden
Oligonucleotiden dargestellt werden. Entsprechend sollen die beschriebenen
Polynucleotidsequenzen typischerweise mindestens zwei oder drei
voneinander verschiedene Oligonucleotidsequenzen von mindestens
8 Nucleotiden Länge
umfassen, die jeweils zum ersten Mal in dem beschriebenen Sequenzprotokoll
offenbart werden. Solche Oligonucleotidsequenzen können an
jedem Nucleotid beginnen, das in einer Sequenz im Sequenzprotokoll
vorkommt und entweder in Sense-Richtung (5'- nach 3') gegenüber der
beschriebenen Sequenz oder in Antisense-Richtung fortschreiten.
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Mit
einer auf Mikroarrays basierenden Analyse lässt sich ein breites Spektrum
von genetischer Aktivität
entdecken, was zu einem neuen Verständnis der Genfunktionen und
dem Gewinnen neuer und unerwarteter Einsichten in die Prozesse der
Transkription sowie die biologischen Mechanismen führt. Der
Einsatz von ansteuerbaren Arrays mit den zum ersten Mal in den SEQ
ID NOs: 1-20 offenbarten Sequenzen liefert eine genaue Information über in einem
spezifischen Stoffwechselweg eine Rolle spielende Veränderungen
bei der Transkription, was möglicherweise
zur Identifizierung neuer Komponenten oder Genfunktionen führt, die
sich selbst als neue Phänotypen
zu erkennen geben.
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Sonden,
die aus zuerst in den SEQ ID NOs: 1-20 offenbarten Sequenzen bestehen,
können
auch zur Identifizierung, Auswahl und Bestätigung von neuen molekularen
Zielen für
die Entdeckung von Arzneimitteln verwendet werden. Die Verwendung
von diesen nur einmal vorkommenden Sequenzen erlaubt die direkte
Bestätigung
von Arzneimittelzielen und die Erkennung von arzneimittelabhängigen Veränderungen
bei der Genexpression, welche über
Stoffwechselwege moduliert werden, die sich von dem beabsichtigten
Ziel für
das Arzneimittel unterscheiden. Diese nur einmal vorkommenden Sequenzen
sind daher auch für
die Definition und Überwachung
von sowohl der Arzneimittelwirkung als auch der Toxizität von Nutzen.
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Als
Beispiel für
ihre Nützlichkeit
können
die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-20 offenbarten Sequenzen
in Mikroarrays oder anderen Array-Formaten Verwendung finden, um
Sammlungen genetischen Materials von Patienten, welche in einer
besonderen medizinischen Verfassung sind, zu durchsuchen. Diese
Untersuchungen können
auch durchgeführt
werden, indem die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-20 offenbarten
Sequenzen in silico eingesetzt werden und indem zuvor gesammelte
genetische Datenbanken und die offenbarten Sequenzen mit Hilfe einer
dem Fachmann bekannten Computer-Software miteinander verglichen werden
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Somit
lassen sich die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs: 1-20 offenbarten
Sequenzen zur Identifizierung von mit einer besonderen Krankheit
einhergehenden Mutationen sowie als diagnostischer oder prognostischer
Assay einsetzen.
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Obwohl
die hier beschriebenen Sequenzen speziell unter Verwendung ihrer
Nucleotidsequenz beschrieben worden sind, sollte darauf hingewiesen
werden, dass sich jede der Sequenzen auch allein durch Verwendung
eines breiten Spektrums von zusätzlichen
strukturellen Attributen oder Kombinationen derselben beschreiben
lässt.
Beispielsweise lässt
sich eine gegebene Sequenz durch die Nettozusammensetzung der in einer
vorgegebenen Region der Sequenz vorkommenden Nucleotide zusammen
mit einer oder mehreren der in den SEQ ID NOs: 1-20 offenbarten
Sequenz(en) beschreiben.
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Alternativ
kann eine Restriktionskarte, welche die relativen Positionen der
Orte für
einen Verdau mit einem Restriktionsenzym angibt oder verschiedene
Palindromsequenzen oder andere spezifische Sequenzen herangezogen
werden, um die Struktur einer gegebenen Sequenz zu beschreiben.
Derartige Restriktionskarten, die typischerweise von in breitem
Umfang zur Verfügung
stehenden Computerprogrammen erstellt werden (z.B. das GCG-Sequenz-Analyse-Paket
der Universität
von Wisconsin, das SEQUENCHER 3.0 von der Gene Codes Corp., Ann
Arbor, MI usw.) können
wahlweise zusammen mit einer oder mehreren diskreten Nucleotidsequenz(en)
verwendet werden, die in der Sequenz vorkommen, welche durch die
relative Position der Sequenz in Bezug auf eine oder mehrere zusätzliche
Sequenz(en) oder einen oder mehrere in der offenbarten Sequenz vorkommende
Restriktionsorte beschrieben werden kann.
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Für Oligonucleotid-Sonden
können
sich hoch stringente Bedingungen z.B. auf das Waschen in 6 × SSC/0,05%
Natriumpyrophosphat bei 37°C
(für Oligos
von 14 Basen), 48°C
(für Oligos
von 17 Basen), 55°C (für Oligos
von 20 Basen) und 60°C
(für Oligos
von 23 Basen) beziehen. Diese Nucleinsäuren können Moleküle codieren oder als Antisense-Moleküle des NHP-Gens
wirken, welche z.B. für
die Regulation des NHP-Gens von Nutzen sind (für und/oder als Antisense-Primer
in Amplifikationsreaktionen der Nucleinsäuresequenzen des NHP.Gens).
Bezüglich
der Regulation des NHP-Gens können
solche Techniken Verwendung finden, um biologische Funktionen zu
regulieren. Ferner können
derartige Sequenzen als Teil der Ribozym- und/oder der Tripelhelixsequenzen
verwendet werden, die ebenfalls für die Regulation des NHP-Gens
von Nutzen sind.
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Inhibitorische
Antisense- oder Doppelstrang-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten
Basenanteil umfassen, der ausgewählt
ist aus der Gruppe mit einschließlich, aber nicht ausschließlich, 5-Fluoruracil,
5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil,
5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin,
5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin,
2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil,
5-Methoxyaminoethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin,
5'-Methoxycarboxymethyluracil,
5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil,
2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
Uracil-5-oxyessigsäure
(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil,
(acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
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Die
Antisense-Oligonucleotide können
auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest umfassen, der ausgewählt ist
aus der Gruppe mit einschließlich
aber nicht ausschließlich,
Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
umfasst das Antisense-Oligonucleotid mindestens ein modifiziertes
Phosphatgrundgerüst,
das ausgewählt
ist aus der Gruppe Phosphordithionat, Phosphordithioat, Phosphoramidat,
Phosphordiamidat, Methylphosphonat, Alkylphosphotriester und Formacetal
oder Analoge derselben.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres
Oligonucleotid bildet mit komplentärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride,
in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
6625-6641). Das
Oligonucleotid ist ein 2'-O-Methylribonucleotid
(Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analoges
(Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330). Alternativ kann doppelsträngige RNA
eingesetzt werden, um die Expression und Funktion eines anvisierten
NHP zu unterbrechen.
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Die
Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach den im Stand der
Technik bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Einsatz
eines automatischen Syntheseapparates (wie er im Handel von Biosearch,
Applied Biosystems, usw. erworben werden kann). Beispielsweise lassen
sich Phosphorthioat-Oligonucleotide nach dem Verfahren von Stein
et al. synthetisieren (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) und Methylphosphonat-
Oligonucleotide können
durch Einsatz von Polymerträgern
mit porösem
Glas (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7448-7451),
usw. synthetisiert werden.
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Niedrig
stringente Bedingungen sind dem Fachmann wohl bekannt und sie variieren
in voraussagbarer Weise, je nach den spezifischen Organismen, aus
denen die Bibliothek und die markierten Sequenzen stammen. In Bezug
auf Anleitungen für
solche Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (sowie periodische Updates davon), Cold Spring
Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols
in Molecular Biology, Green Publishing Associates an Wiley Interscience,
N.Y.
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Alternativ
können
geeignet markierte NHP-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um unter
Verwendung von passend stringenten Bedingungen oder mittels der
PCR eine menschliche Genom-Bibliothek zu durchsuchen. Zur Identifizierung
von Polymorphismen (einschließlich
aber nicht ausschließlich
von Nucleotid-Repeats, Mikrosatelliten-Allelen, einzelnen Nucleotid-Polymorphismen
oder codierenden einzelnen Nucleotid-Polymorphismen) ist die Identifizierung
und Charakterisierung von menschlichen Genom-Klonen, die Ermittlung der Genomstruktur
eines gegebenen Locus/Allels und das Konzipieren von diagnostischen
Tests hilfreich. Sequenzen, die z.B. aus Regionen stammen, welche
neben den Intron/Exon-Grenzen des menschlichen Gens liegen, können dazu
verwendet werden, Primer zur Verwendung in Amplifikationstests zu
entwerfen, um in den Exons, Introns, Spleißorten (z.B. Spleißakzeptor-
und/oder -donorstellen) usw. Mutationen nachzuweisen, was in der
Diagnostik und den Pharmacogenomics verwendet werden kann.
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Ferner
kann aus der Nucleinsäure
von einem betreffenden Organismus das Homologe eines NHP-Gens isoliert
werden, indem unter Verwendung von zwei degenerierten oder "Wobble"-Oligonucleotid-Primer-Pools,
welche auf Grundlage der Aminosäuresequenzen
innerhalb der hier offenbarten NHP-Produkte konzipiert wurden, eine
PCR durchgeführt
wird. Die Matrize für
die Reaktion kann eine Gesamt-RNA, -mRNA und/oder -cDNA sein, welche
mittels reverser Transkription von mRNA erhalten wurden, die aus
humanen oder nicht humanen Zelllinien oder Geweben gewonnen wurde,
von denen bekannt war oder vermutet wurde, dass sie ein Allel eines
NHP-Gens exprimieren.
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Das
PCR-Produkt kann subkloniert und sequenziert werden, um sicher zu
stellen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten
NHP-Gens darstellen. Das PCR-Fragment
kann dazu verwendet werden, nach verschiedenen Verfahren einen cDNA-Klon
in voller Länge
zu isolieren. Das amplifizierte Fragment kann z.B. markiert und
dazu benutzt werden, um eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-
cDNA- Bibliothek
zu durchsuchen. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet
werden, über das
Screening einer Genom-Bibliothek genomische Klone zu isolieren.
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Die
PCR-Technologie kann auch eingesetzt werden, um cDNA-Sequenzen in
voller Länge
zu isolieren. RNA lässt
sich z.B. mit Standardverfahren aus einer passenden Zell- oder Gewebequelle
(d.h. eine von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie ein
NHP-Gen exprimiert) isolieren. Auf der RNA lässt sich eine Reaktion mit
reverser Transkription (RT) durchführen, indem ein Oligonucleotid-Primer
eingesetzt wird, der für das
5'-Ende des amplifizierten
Fragments zum Priming der Synthese des ersten Stranges spezifisch
ist. Unter Einsatz einer Standardreaktion mit terminaler Transferase
kann dann das erhaltene RNA/DNA-Hybrid mit einem "Schwanz" versehen werden,
das Hybrid kann mit RNAse H verdaut werden und das Priming der Synthese
des zweiten Stranges kann dann mit einem komplementären Primer
erfolgen. Somit lassen sich upstream zu dem amplifizierten Fragment
gelegene cDNA-Sequenzen isolieren. Zu einem Überblick über die Klonierungsstrategien,
die eingesetzt werden können,
siehe z.B. Sambrook et al., 1989, supra.
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Eine
ein mutantes NHP-Gen codierende cDNA lässt sich z.B. durch Einsatz
der PCR isolieren. In diesem Falle kann der erste DNA-Strang synthetisiert
werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an mRNA hybridisiert wird,
die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt war oder vermutet
wurde, dass es in einem Individuum exprimiert wird, das vermutlich
ein mutiertes NHP-Allel aufweist, und indem der neue Strang mit
reverser Transkriptase verlängert
wird. Der zweite Strang der cDNA wird sodann unter Einsatz eines
Oligonucleotids synthetisiert, das spezifisch an das 5'-Ende des normalen
Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt
dann mittels der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten
Vektor kloniert und mit dem Fachmann vertrauten Verfahren einer
DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des
mutierten NHP-Allels mit der eines entsprechenden normalen NHP-Allels
lässt (lassen) sich
die Mautation(en) feststellen, die verantwortlich für den Verlust
oder die Veränderung
der Funktion des Produkts des mutaierten NHP-Gens ist (sind).
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Alternativ
lässt sich
eine Genom-Bibliothek unter Einsatz einer DNA aufbauen, die aus
einem Individuum erhalten wurde, von dem vermutet wurde oder bekannt
war, dass es ein mutiertes NHP-Allel aufweist (z.B. eine Person
mit einem NHP-assoziierten Phänotyp
wie z.B. einer Fettleibigkeit, hohem Blutdruck, Bindegwebserkrankungen,
Infertilität
usw.) oder eine cDNA-Bibliothek kann aufgebaut werden, indem eine
RNA aus einem Gewebe eingesetzt wird, von dem bekannt war oder vermutet
wurde, dass es ein mutiertes NHP-Allel
exprimiert. Ein normales NHP-Gen oder jedes geeignete Fragment desselben
kann sodann markiert und als Sonde eingesetzt werden, um in derartigen
Bibliotheken das entsprechende mutierte NHP-Allel zu identifizieren.
Mutierte NHP-Gensequenzen enthaltende Klone können dann gereinigt und nach
dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse unterzogen
werden.
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Darüber hinaus
lässt sich
eine Expressions-Bibliothek erstellen, indem eine cDNA verwendet
wird, die z.B. aus einer RNA synthetisiert wird, welche aus einem
Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt war oder vermutet wurde,
dass es ein mutiertes NHP-Allel
in einem Individuum exprimiert, von dem vermutet wurde oder bekannt
war, dass es ein derartiges mutiertes NHP-Allel aufweist. Auf diese
Weise können
von dem vermeintlich mutierten Gewebe produzierte Genprodukte exprimiert
und unter Einsatz von standardisierten Antikörper-Screening Techniken zusammen
mit, wie weiter unten beschrieben, gegen ein normales NHP-Produkt
gerichteten Antikörpern
einem Screening unterzogen werden (Zu den Screening-Techniken siehe
z.B. Harlow E. und Lane, Hrg., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Press, Cold Sprin Harbor, NY).
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Zusätzlich kann
das Screening durch ein Screening mit markierten NHP-Fusionsproteinen
wie z.B. alkalische Phosphatase-NHP oder den Fusionsproteinen von
NHP-alkalischer Phosphatase erfolgen. In den Fällen, wo eine NHP Mutation
zu einem exprimierten Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z.B.
als Ergebnis einer Missense- oder Frameshift-Mutation), gehen gegen
ein NHP gerichtete Antikörper
mit einem entsprechenden mutierten NHP-Genprodukt wahrscheinlich
eine Kreuzreaktion ein. Die über
ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern nachgewiesenen Bibliotheks-Klone
können
gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
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Die
Erfindung umfasst auch: (a) DNA-Vektoren, die eine der vorstehenden
NHP-codierenden
Sequenzen und/oder deren Komplementärsequenzen (d.h. Antisense) enthalten;
(b) DNA-Expressionsvektoren, welche eine der vorstehenden NHP-codierenden
Sequenzen enthalten, die funktionsfähig mit einem regulatorischen
Element assoziiert sind, das die Expression der codierenden Sequenzen
lenkt (z.B. ein Baculovirus, wie im US-Patent 5,869,336 beschrieben); (c) gentechnisch
veränderte
Wirtszellen, welche eine der vorstehenden NHP-codierenden Sequenzen
enthalten, die funktionsfähig
mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, das in der Wirtszelle
die Expression der codierenden Sequenzen lenkt; und (d) gentechnisch
veränderte
Wirtszellen, welche ein endogenes NHP-Gen unter der Kontrolle eines
exogen eingeführten
regulatorischen Elements exprimieren (d.h. Genaktivierung). Der
hier verwendete Begriff regulatorische Elemente umfasst, jedoch nicht
ausschließlich,
induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren
und andere dem Fachmann bekannte Elemente, welche die Expression
begünstigen
und regulieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch nicht
ausschließlich,
das Immidiate Early Gene des Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare
Viruselente (insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren), der Early-
oder Late-Promotor des SV40 Adenovirus, das lac-System, das trp-System,
das TAC-System, das TRC-System, der Hauptoperator- und -promotorabschnitt
des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte des fd-Coat-Proteins, der
Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase (PGK), die Promotoren der sauren
Phosphatase und die Promotoren der α-Mating-Faktoren der Hefe.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einschließlich der Fab-Fragmente),
Antagonisten und Agonisten eines NHP sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte,
welche die Expression eines NHP-Gens hemmen (Inhibitoren des Transkriptionsfaktors,
Antisense- und Ribozymmoleküle
oder Konstrukte für
den Ersatz von Genen oder regulatorischen Sequenzen) oder die Expression
eines NHP begünstigen
(z.B. Expressionskonstrukte, in denen die NHP-codierenden Sequenzen
funktionsfähig mit
Kontrollelementen der Expression wie z.B. Promotoren, Promotor/Enhancern
usw. assoziiert sind).
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Die
NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
Antikörper,
Antagonisten und Agonisten können
für den
Nachweis mutierter NHPs oder ungeeignet exprimierter NHPs für die Diagnose
einer Krankheit von Nutzen sein. Die NHP-Proteine oder -Peptide,
NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen, Wirtszellen-Expressionssysteme,
Antikörper,
Antagonisten, Agonisten und gentechnisch manipulierte Zellen und
Tiere können
zum Auffinden von Arzneimitteln (oder dem mit hohem Durchsatz erfolgenden
Screening von kombinatorischen Bibliotheken) zum Einsatz kommen,
die bei der Behandlung von symptomatischen oder phänotypischen
Anzeichen einer Störung
der normalen NHP-Funktion im Körper
wirksam sind. Der Einsatz von gentechnisch manipulierten Wirtszellen
und/oder Tieren kann insofern von Vorteil sein, als sich mit ihnen
nicht nur Verbindungen identifizieren lassen, die sich an den endogenen
Rezeptor für
ein NHP binden, sondern auch Verbindungen identifizieren lassen,
die NHP-vermittelte
Aktivitäten
oder Stoffwechselwege auslösen.
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Schließlich können die
NHP-Produkte als Therapeutika verwendet werden. Beispielsweise können lösliche Derivate
wie den NHPs entsprechende NHP-Peptide/Domänen, Produkte von NHP-Fusionsproteinen (insbesondere
NHP-Ig-Fusionsproteine, d.h. Fusionen eines NHP oder einer Domäne eines
NHP an ein IgFc), NHP-Antikörper
und antiidiotypische Antikörper
(einschließlich
Fab-Fragmente), Antagonisten oder Agonisten (einschließlich Verbindungen,
die in einem NHP-vermittelten Stoffwechselweg modulieren oder auf downstream
gelegene Ziele einwirken) verwendet werden, um Krankheiten oder
Beschwerden direkt zu behandeln. Beispielsweise könnte die
Verabreichung einer wirksamen Menge eines löslichen NHP oder eines NHP-IgFc-Fusionsproteins
oder eines antiidiotypischen Antikörpers (oder dessen Fab), welcher
das NHP nachahmt, den endogenen NHP-Rezeptor aktivieren oder ihm
effektiv entgegenwirken. Nucleotid-Konstrukte, die derartige NHP-Produkte
codieren, können
dazu verwendet werden, Wirtszellen gentechnisch zu manipulieren,
um solche Produkte in vivo zu exprimieren; diese gentechnisch manipulierten
Zellen wirken im Körper als "Bioreaktoren", indem sie einen
kontinuierlichen Strom von NHP, eines NHP-Peptids oder eines NHP-Fusionsproteins an
den Körper
abgeben. Nucleotid-Konstrukte, welche funktionelle NHPs, mutierte
NHPs sowie Antisense- und Ribozymmoleküle codieren, lassen sich auch
in Versuchen einer "Gentherapie" für die Modulation
der NHP-Expression verwenden.
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Verschiedene
Aspekte der Erfindung werden genauer weiter unten in den Unterabschnitten
beschrieben.
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5.1 DIE NHP-SEQUENZEN
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Die
cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der beschriebenen NHPs werden im Sequenzprotokoll wiedergegeben.
SEQ ID NOs: 13 und 20 geben sowohl die NHP-ORFs als auch die flankierenden
Abschnitte wieder. Die NHP-Nucleotide
wurden aus menschlichen cDNA-Bibliotheken erhalten, indem aus menschlichen
gene-trapped Sequence Tags gewonnene Sonden und/oder Primer eingesetzt
wurden. Eine Expressionsanalyse lieferte den Nachweis, dass einige
der beschriebenen NHPs in großem
Umfang exprimiert wurden (SEQ ID NOs: 1-13) und einige der beschriebenen
NHPs (SEQ ID NOs: 14-20) ein ziemlich bescheidenes Expressionsmuster
aufweisen, einschließlich
solchen, die mit der Phospholipase C delta-4 eine Strukturähnlichkeit
teilen. Angesichts der Bedeutung der Phospholipasen sind ähnliche
Moleküle und
Aktivitäten
zum Gegenstand beträchrlichr
wissenschaftlicher Untersuchungen geworden, wie dies in den US-Patenten
5,859,222 und 5,587,306 gezeigt wird, in welchen sowohl Moleküle beschrieben
werden, die Phospholipase-Aktivitäten codieren, welche ähnlich denen
der offenbarten NHPs sind, als auch verschiedene Verwendungen und
Anwendungen, welche für
die beschriebenen NHPs in Frage kommen.
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5.2 NHPs UND NHP-POLYPEPTIDE
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NHPs,
Polypeptide, Peptidfragmente, mutierte, eingekürzte oder zerstörte Formen
von NHPs und/oder NHP-Fusionsproteine lassen sich für verschiedene
Verwendungen herstellen. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht ausschließlich, die
Erzeugung von Antikörpern,
die Verwendung als Reagenzien in diagnostischen Assays, die Identifizierung
von anderen mit einem NHP in Zusammenhang stehenden zellulären Genprodukten,
die Verwendung als Reagenzien in Assays zum Screening nach Verbindungen,
die als pharmazeutische Reagenzien bei der therapeutischen Behandlung
von mentalen, biologischen oder medizinischen Erkrankungen oder
Krankheiten von Nutzen sein können.
Wegen der Information über
die Ähnlichkeit
und der Daten über
die Expression können
die beschriebenen NHPs als Ziel dienen (für Arzneimittel, Oligos, Antikörper usw.),
um eine Krankheit zu behandeln oder um die Wirksamkeit von z.B.
bei der Behandlung von Brust- oder Prostatakrebs eingesetzten chemotherapeutischen
Agenzien therapeutisch zu steigern.
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Das
Sequenzprotokoll gibt die von den beschriebenen NHP-Polynucleotiden
codierten Aminosäuresequenzen
wieder. Die NHPs verfügen
typischerweise über
Initiations-Methionine
in DNA-Sequenz-Kontexten, welche mit einer Initiationsstelle für die Translation übereinstimmen.
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Die
NHP-Aminosäuresequenzen
der Erfindung umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll wiedergegebene
Aminosäuresequenz
als auch Analoge und Derivate derselben. Ferner werden von der Erfindung
auch entsprechende NHP-Homologe von anderen Spezies mit umfasst.
Faktisch liegt jedes von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen
codierte NHP-Protein im Geltungsbereich der Erfindung so wie alle
neuen Polynucleotidsequenzen, die alle oder jeden neuen Abschnitt
einer im Sequenzprotokoll wiedergegebenen Aminosäuresequenz codieren. Die degenerierte
Natur des genetischen Codes ist gut bekannt und entsprechend steht
für jede
im Sequenzprotokoll wiedergegebene Aminosäure generisch das bekannte "Triplett"-Codon für die Aminosäure oder
in vielen Fällen
Codons, welche die Aminosäure
codieren können.
Als solche sollen die im Sequenzprotokoll wiedergegebenen Aminosäuresequenzen
zusammen mit dem genetischen Code (siehe z.B. Tabelle 4-1 auf Seite
109 von "Molecular
Cell Biology", 1986,
J. Darnell et al., Hrg., Scientific American Books, New York) generisch
für alle
verschiedenen Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen
stehen, welche derartige Aminosäuresequenzen
codieren.
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Die
Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell zu den von den
gerade beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NHPs äquivalent
sind, wenn sie jeweils nach einer Anzahl von Kriterien beurteilt
werden, einschließlich,
aber nicht ausschließlich,
der Fähigkeit,
ein Substrat des NHP zu binden oder zu spalten, oder der Fähigkeit,
einen identischen oder komplementären downstream gelegenen Stoffwechselweg
oder eine Veränderung
im Zellmetabolismus zu bewirken (z.B. proteolytische Aktivität, Ionenfluss,
Phosphorylierung von Tyrosin usw.). Solche funktionell äquivalenten
NHP-Proteine umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Additionen oder Substitutionen
von Aminosäureresten
in der von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierten
Aminosäuresequenz,
die aber zu einer stillen Veränderung
führen
und so ein funktionell äquivalentes Genprodukt
produzieren. Die Substitutionen an Aminosäuren können auf Grundlage einer ähnlichen
Polarität, Ladung,
Löslichkeit,
Hydrophobizität,
Hydrophilizität
und/oder der amphipathischen Natur der betroffenen Reste erfolgen.
Nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren
sind z.B. Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin,
Tryptophan und Methionin; polare neutrale Aminosäuren sind Glycin, Serin, Threonin,
Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; positiv geladene (basische)
Aminosäuren
sind Arginin, Lysin und Histidin und negativ geladene (saure) Aminosäuren sind
Asparaginsäure
und Glutaminsäure.
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Verschieden
Wirtsexpressions-Vektorsysteme können
eingesetzt werden, um die NHP-Nucleotidsequenz
der Erfindung zu exprimieren. Wo wie im vorliegenden Fall das NHP-Peptid oder-Polypeptid
ein Membranprotein sein soll, können
die hydrophoben Abschnitte des Proteins herausgeschnitten werden
und das erhaltene lösliche
Peptid oder Polypeptid kann aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
Solche Expressionssysteme umfassen auch gentechnisch mänipulierte
Wirtszellen, die ein NHP oder ein funktionelles Äquivalent in situ exprimieren.
Die Reinigung oder Anreicherung eines NHP aus solchen Expressionssystemen
kann unter Verwendung von geeigneten Detergentien und Lipidmizellen
sowie mit dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen. Solche gentechnisch
manipulierten Wirtszellen selbst können jedoch in Situationen
verwendet werden, wo es wichtig ist, nicht nur die strukturellen
und funktionellen Eigenschaften von NHP beizubehalten, sondern auch
die biologische Aktivität
zu bestimmen, z.B. in Screening Assays für Arzneimittel.
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Die
Expressionssysteme, die für
die Zwecke der Erfindung verwendet werden können, umfassen, jedoch nicht
ausschließlich,
Mikroorganismen wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), welche
mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden Expressionsvektoren aus
rekombinanter Bakteriophagen. DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert
worden sind; Hefe (z.B. Saccharomyces, Pichia), welche mit NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert
worden ist; Systeme aus Insektenzellen, die mit NHP-Sequenzen enthaltenden
rekombinanten Expressionsvektoren von Viren (z.B. Baculovirus) infiziert
worden sind; Zellsysteme aus Pflanzen, die mit NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren von Viren (z.B. das
Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; das Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert
oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid)
transformiert worden sind; oder Zellsysteme aus Säugern (z.B.
COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte
beherbergen, welche Promotoren enthalten, die aus dem Genom von
Säugerzellen
(z.B. der Metallothionein-Promotor)
oder aus Säuger-Viren
(z.B. der späte
Adenovirus-Promotor; der 7,5K-Promotor
des Vaccinia-Virus) stammen.
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Bei
Bakteriensystemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhafterweise
in Abhängigkeit von
der für
das zu exprimierende NHP-Produkt beabsichtigten Verwendung ausgewählt werden.
Wenn z.B. eine große
Menge solcher Proteine für
die Gewinnung von pharmazeutischen Zusammensetzungen aus NHP oder
von NHP enthaltenden Zusammensetzungen oder zur Vermehrung von Antikörpern gegen
ein NHP produziert werden soll, können Vektoren erwünscht sein,
welche die Expression von hohen Spiegeln von leicht zu reinigenden
Fusionsproteinprodukten lenken. Solche Vektoren sind, jedoch nicht
ausschließlich,
der E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO
J. 2: 1791), in welchem eine NHP-codierende Sequenz individuell
in den Vektor im Raster mit dem lacZ-codierenden Abschnitt ligiert
sein kann, so dass ein Fusionsprotein entsteht; pIN-Vekltoren (Inouye & Inouye, 1985,
Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:
5503-5509); und dergl. pGEX-Vektoren (Pharmacia oder American Type Culture
Collection) können
auch eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine
mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Derartige Fusionsproteine
sind im Allgemeinen löslich
und lassen sich leicht mittels Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen
gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion aus
lysierten Zellen reinigen. Die PGEX-Vektoren sind so konzipiert,
dass sie Spaltstellen für Thrombin
oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das klonierte Zielgenprodukt
aus dem GST-Rest freigesetzt werden kann.
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In
einem Insektensystem wird der Autographa californica-Polyhidrosis-Virus
(AcNPV) als Vektor eingesetzt, um Fremdgene zu exprimieren. Das
Virus wächst
in Spodoptera frugiperda-Zellen. Eine NHP-codierende Sequenz kann
individuell in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen)
des Virus kloniert werden, und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors
(z.B. des Polyhedrin-Promotors) gebracht werden. Eine erfolgreiche
Insertion der NHP-codierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung
des Polyhedrin-Gens und der Produktion eines nicht umhüllten rekombinanten
Virus (d.h. eines Virus, dem die vom Polyhedrin-Gen codierte Proteinhülle fehlt).
Diese rekombinanten Viren werden dann benutzt, um Spodoptera frugiperda-Zellen
zu infizieren, in welchen die insertierte Sequenz exprimiert wird
(z.B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051).
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In
Wirtszellen von Säugern
kann eine Anzahl von auf Viren basierenden Expressionssystemen verwendet
werden. In den Fällen,
wo ein Adenovirus als Expressionsvektor eingesetzt wird kann die
fragliche NHP-Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontroll-Komplex
des Adenovirus ligiert sein, z.B. den späten Promotor und die dreiteilige
Leader-Sequenz. Dieses chimäre
Gen kann dann mittels einer in vitro- oder in vivo-Rekombination
in das Genom des Adenovirus insertiert werden. Eine Insertion in
eine nicht essentielle Region des viralen Genoms (z.B. in Region
E1 oder E2) führt
zu einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in
infizierten Wirten ein NHP-Produkt zu exprimieren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659). Für eine effektive Translation
von insertierten NHP-Nucleotidsequenzen
können
auch spezifische Initiationssignale benötigt werden. Diese Signale
umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In
Fällen,
wo ein ganzes NHP-Gen oder eine cDNA, einschließlich deren eigenen Initiationscodons
und der angrenzenden Sequenzen, in den passenden Expressionsvektor
insertiert wird, brauchen keine zusätzlichen Kontrollsignale für die Translation
benötigt
zu werden. In Fällen
jedoch, wo nur ein Abschnitt einer NHP-codierenden Sequenz insertiert
wird, müssen
exogene Kontrollsignale der Translation, einschließlich vielleicht
des Initiationscodons, zur Verfügung
gestellt werden. Ferner muss das Initiationscodon in Phase mit dem
Leseraster der gewünschten
codierenden Sequenz sein, um die Translation des gesamten Insertionsstücks sicher
zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation sowie die
Initiationscodons können
aus verschiedenen sowohl natürlichen
als auch synthetischen Quellen stammen. Durch Einschluss von passenden
Enhancerelementen der Expression, Transkriptions-Terminatoren usw.
lässt sich
die Effizienz der Expression steigern (siehe Bitter et al., 1987,
Methods in Enzymol. 153: 516-544).
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Zusätzlich kann
ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten
Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der spezifischen gewünschten
Weise modifiziert oder weiter verarbeitet. Derartige Modifikationen
(z.B. Glykosylierung) und Weiterverarbeitung (z.B. Spaltung) von
Proteinprodukten können
für die
Funktion des Proteins wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen
haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die Weiterbehandlung
und Modifikation von Proteinen und Genprodukten nach der Translation.
Es lassen sich geeignete Zelllinien und Wirtssysteme aussuchen,
um die korrekte Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten
Fremdproteins sicher zu stellen. Hierzu können eukaryotische Wirtszellen
eingesetzt werden, die über
die Zellmaschinerie für
eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung
und Phosphorylierung des Genprodukts verfügen. Derartige Säuger-Wirtszellen sind,
jedoch nicht ausschließlich,
CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 und insbesondere Zelllinien
vom Menschen.
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Für eine Langzeit-Produktion
mit hoher Ausbeute an rekombinanten Proteinen ist eine stabile Expression
bevorzugt. Zelllinien, welche die oben beschriebenen NHP-Sequenzen
stabil exprimieren, können
z.B. gentechnisch manipuliert werden. Eher als Expressionsvektoren
zu verwenden, welche Replikationsursprünge von Viren enthalten, können Wirtszellen
mit einer DNA transformiert werden, die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen
(z.B. Promotor, Enhancersequenzen, Terminatoren der Transkription,
Polyadenylierungsstellen usw.) sowie einem auswählbaren Marker kontrolliert
wird. Nach Einführung
der Fremd-DNA kann man die gentechnisch manipulierten Zellen 1-2
Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen und sie dann
in ein Selektivmedium überführen. Der
auswählbare
Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht gegen die Selektion
Resistenz und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen
zu integrieren und zu wachsen, um Foki zu bilden, die ihrerseits
geklont und in Zelllinien expandiert werden können. Dieses Verfahren lässt sich
vorteilhafterweise einsetzen, um Zelllinien gentechnisch zu manipulieren,
welche das NHP-Produkt exprimieren. Solche gentechnisch manipulierten
Zelllinien können
beim Screening und der Beurteilung von Verbindungen von besonderem
Nutzen sein, welche die endogene Aktivität des NHP-Produkts beeinflussen.
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Es
lässt sich
eine Anzahl von Selektionssystemen einsetzen, einschließlich, aber
nicht ausschließlich, das
Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus (Wigler et al., 1977,
Cell 11: 223), das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen
(Szybalska & Szybalski,
1962, Proc. Natl. Sci. USA 48: 2026 und das Adenin-Phosphoribosyltransferase-Gen
(Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) können in tk–-,
hgprt–-
bzw. aprt–-Zellen verwendet
werden. Als Grundlage für
eine Selektion kann auch Resistenz gegen Antimetabolite für die folgenden
Gene genutzt werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht
(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77: 3567); O'Hare et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 1527); gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht
(Mulligan & Berg,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen
das Aminoglykosid G-418 verleiht (Bolberre-Garapin et al., 1981,
J. Mol. Biol. 140: 1); und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin
verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
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Alternativ
lässt sich
jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein Antikörper eingesetzt
wird, der spezifisch für
das gerade exprimierte Fusionsprotein ist. Mit einem von Janknecht
et al. beschriebenen System lassen sich z.B. in menschlichen Zelllinien
exprimierte nicht denaturierte Fusionsproteine leicht reinigen (Janknecht
et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976). In diesem
System wird das fragliche Gen so in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid
subcloniert, dass das offene Leseraster des Gens mittels einer Translation
an ein aus 6 Histidinresten bestehendes aminoendständiges tag
fusioniert wird. Die Extrakte aus mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus
infizierten Zellen werden auf Ni2+-Nitrilessigsäure-Agarose-Säulen gepackt
und die Histidin-tagged Proteine werden selektiv mit Imidazol enthaltenden
Puffern eluiert.
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Von
der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst sind Fusionsproteine,
welche das NHP zu einem Zielorgan lenken und/oder den Transport
durch die Membran in das Cytosol erleichtern. Die Konjugation von NHPs
an Antikörpermoleküle oder
deren Fab-Fragmente könnte
benutzt werden, um Zellen, die ein besonderes Epitop tragen, anzusteuern.
Die Anheftung der passenden Signalfrequenz an das NHP würde das
NHP ebenfalls an den gewünschten
Ort innerhalb der Zelle transportieren. Alternativ könnte das
Ansteuern von NHP oder dessen Nucleinsäuresequenz erreicht werden,
indem Abgabesystem auf Basis von Liposomen oder Lipidkomplexen eingesetzt
werden. Derartige Technologien werden in Liposomes: A Practical
Approach, New, RRC Hrg., Oxford University Press, New York und in
den US-Patenten 4,594,595, 5,459,127, 5,948,767 und 6,110,490 beschrieben.
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Zusätzlich umfasst
sind neue Protein-Konstrukte, die gentechnisch so verändert wurden,
dass sie den Transport von NHP an den Zielort oder das gewünschte Organ
erleichtern. Dies kann erreicht werden, indem das NHP an ein Cytokin
oder an einen anderen Liganden gekoppelt wird, der für eine Zielspezifität sorgt, und/oder
an eine Protein transduzierende Domäne (siehe allgemein die US-Anmeldungen
60/111,701 und 60/056,713 als Beispiele für solche transduzierenden Sequenzen),
um, falls nötig,
die Passage durch die Zellmembran zu erleichtern und sie kann wahlweise
gentechnisch verändert
werden, um, falls erwünscht,
Sequenzen für
eine Lokalisierung im Kern zu enthalten.
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5.3 ANTIKÖRPER GEGEN
NHP-PRODUKTE
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Antikörper, die
spezifisch ein oder mehrere Epitope eines NHP erkennen oder Epitope
von konservierten Varianten eines NHP oder Peptidfragmente eines
NHP werden ebenfalls von der Erfindung umfasst. Derartige Antikörper sind,
jedoch nicht ausschließlich,
polyklonale Antikörper,
monoklonale Antikörper
(mAbs), humanisierte oder chimäre
Antikörper,
Einzelketten-Antikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, von einer Fab-Expressionsbibliothek
produzierte Fragmente, antiidiotypische Antikörper (anti-Id) und Epitop-bindende Fragmente
von jedem der obigen Vertreter.
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Die
Antikörper
der Erfindung können
z.B. beim Nachweis von NHP in einer biologischen Probe eingesetzt
werden und können
daher als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik
zum Einsatz kommen, wodurch Patienten auf anomale Mengen von NHP
hin untersucht werden können.
Solche Antikörper
können
z.B. auch zusammen mit Programmen zum Screening von Verbindungen
zur Beurteilung der Wirkung von Testverbindungen auf die Expression
und/oder Aktivität
eines NHP-Genprodukts Verwendung finden. Zusätzlich können solche Antikörper zusammen
mit einer Gentherapie zum Einsatz kommen, um z.B. normale und/oder
gentechnisch veränderte
NHP-exprimierende Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu begutachten.
Derartige Antikörper
können
zusätzlich
als ein Verfahren zur Hemmung einer anomalen NHP-Aktivität verwendet
werden. Somit lassen sich solche Antikörper daher als Teil von Behandlungsmethoden
einsetzen.
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Zur
Gewinnung von Antikörpern
können
verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit einem NHP, einem NHP-Peptid
(z.B. einem, das einer funktionellen Domäne eines NHP entspricht), gekürzten NHP-Polypeptiden (NHP,
in welchem eine oder mehrere Domänen
zerstört
worden sind), funktionellen Äquivalenten
des NHPs oder mutierten Varianten von NHP immunisiert werden. Derartige
Wirtstiere umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Schweine, Kaninchen,
Mäuse,
Schafe und Ratten, um nur einige wenige zu nennen. Je nach der Wirtsspezies
lassen sich verschiedene Adjuvantien einsetzen, um die Immunantwort
zu verstärken,
einschließlich,
jedoch nicht ausschließlich,
das (komplette und nicht komplette) Freund-Adjuvans, Mineralsalze wie
Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin,
Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, sowie potentiell
nützliche
menschliche Adjuvantien wie BCG (Bazillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium
parvum. Alternativ könnte
die Immunantwort durch Kombination und/oder Kopplung mit Molekülen wie
dem Hämocyanin
der Schlüssellochschnecke,
dem Tetanus-Toxoid, dem Diphtherie-Toxoid, dem Ovalbumin, dem Cholera-Toxin
oder Fragmenten derselben gesteigert werden. Polyklonale Antikörper sind
heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der
immunisierten Tiere stammen.
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Monoklonale
Antikörper,
welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein besonderes
Antigen sind, können
mit Hilfe jeder Technik erhalten werden, welche durch kontinuierliche
Zelllinien in Kultur für die
Produktion von Antikörpermolekülen sorgt.
Diese sind, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridoma-Technik von
Köhler
und Milstein (1975, Nature 256: 495-497 und das US-Patent 4,376,110);
die humane B-Zell-Hybridoma-Technik
(Kosbor et al., 1083, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) und die EBV-Hybridoma-Technik
(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., SS. 77-96). Solche Antikörper können von jeder Immunoglobulin-Klasse
sein, einschließlich IgG,
IgM, IgE, IgA, IgD und von jeder Subklasse davon. Die die mABs dieser
Erfindung produzierenden Hybridome lassen sich in vitro oder in
vivo kultivieren. Die Produktion hoher Titer in vivo machen dieses
zum derzeitig bevorzugten Produktionsverfahren.
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Darüber hinaus
können
Techniken zum Einsatz kommen, welche für die Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al.,
1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984,
Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) durch
Spleißen
der Gene eines Antikörpermoleküls der Maus
von geeigneter Antigenspezifität
zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls von geeigneter Aktivität entwickelt
wurden. Ein chimärer
Antikörper
ist ein Molekül,
in welchem unterschiedliche Abschnitte von unterschiedlichen Tierspezies
stammen, wie z.B. solche mit einer von einem mAb der Maus stammenden
variablen Region und einer konstanten Region von einem Immunglobulin
des Menschen. Solche Technologien werden in den US-Patenten 6,075,181
und 5,877,397 beschrieben. Von der vorliegenden Erfindung wird auch
die Verwendung von vollständig
humanisierten monoklonalen Antikörpern
umfasst, wie sie im US-Patent 6,150,584 beschrieben wird.
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Alternativ
können
Techniken übernommen
werden, die für
die Produktion von Einzelketten-Antikörpern (US-Patent 4,946,778;
Bird, 1988, Science 242: 426-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 und Ward et al., 1989, Nature 341:
544-546) beschrieben wurden, um Einzelketten-Antikörper gegen
NHP-Genprodukte
herzustellen. Einzelketten-Antikörper
werden durch Verbindung der schweren und leichten Kettenfragmente
der Fv-Region über
eine Aminosäurebrücke gebildet,
was zu einem Einzelketten-Polypeptid führt.
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Antikörper-Fragmente,
welche spezifische Epitope erkennen, lassen sich mit bekannten Techniken
erzeugen. Solche Fragmente umfassen z.B., jedoch nicht ausschließlich, die
F(ab)2-Fragmente, welche sich durch Pepsin-Verdau
des Antikörpermoleküls gewinnen
lassen sowie die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der
F(ab)2-Fragmente
erzeugt werden können.
Alternativ lassen sich Fab-Expressionsbibliotheken konstruieren
(Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281), um eine schnelle und
leichte Identifizierung der monoklonalen Fab-Fragmente mit der gewünschten
Spezifität
zu ermöglichen.
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Antikörper gegen
ein NHP lassen sich ihrerseits unter Verwendung von dem Fachmann
bekannten Techniken einsetzen, um antiidiotypische Antikörper zu
erzeugen, welche ein vorgegebenes NHP "nachahmen". (siehe z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASEB
J. 7(5): 437-444 und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429-2438).
Beispielsweise können
Antikörper
verwendet werden, die an eine NHP-Domäne binden und die Bindung von
NHP an dessen zugehörigen
Rezeptor hemmen, um Antiidiotypen zu erzeugen, die das NHP nachahmen
und daher an einen Rezeptor binden und ihn aktivieren oder neutralisieren.
Solche antiidiotypischen Antikörper
oder die Fab-Fragmente von solchen Antiidiotypen können in
therapeutischen Diäten
verwendet werden, bei denen ein NHP-vermittelter Stoffwechselweg eine Rolle
spielt.
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