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Die
vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung 60/156,685, welche am 29.
September 1999 eingereicht wurde und hiermit in ihrer Gesamtheit
als Referenz eingeführt
wird.
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1. EINLEITUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neuen humanen Polynucleotiden, welche Proteine
codieren, die Sequenzähnlichkeit
mit tierischen Proteasen aufweisen. Die Erfindung umfasst die beschriebenen
Polynucleotide, die Expressionssysteme der Wirtszellen, die codierten
Proteine, Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide, die Antikörper für die codierten
Proteine und Peptide und gentechnisch veränderte Tiere, denen die offenbarten
Gene fehlen oder sie überexprimieren,
Antagonisten und Agonisten der Proteine sowie andere Verbindungen,
welche die Expression oder Aktivität der von den offenbarten Sequenzen
codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose, das Screening
von Arzneimitteln, die Beobachtung von klinischen Tests und die
Behandlung von physiologischen Krankheiten eingesetzt werden können.
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2. HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Proteasen
sind Enzyme, die Polypeptidsequenzen spalten. Carboxypeptidasen
sind Proteasen, welche die Peptidbindungen am carboxyterminalen
Ende einer Kette von Aminosäuren
hydrolysieren und sind in einem breiten Spektrum von Zelltypen und
Tieren identifiziert worden. Peptidasen sind mit einem breiten Spektrum
von biologischen Prozessen in Zusammenhang gebracht worden einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
Verdauung, Koagulation, Diabetes, Prostatakrebs, gynäkologischen
Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen und Fettsucht. Dementsprechend
stellen Peptidasen wichtige Ziele für die regulatorische Kontrolle einer
Vielzahl von physiologischen Prozessen und Stoffwechselwegen dar.
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3. ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und
Charakterisierung von neue menschliche Proteine codierenden Nucleotiden
sowie die entsprechenden Aminosäuresequenzen
dieser Proteine. Die hier zum ersten Mal beschriebenen neuen humanen
Proteine (NHPs) teilen eine strukturelle Ähnlichkeit mit tierischen Proteasen
und insbesondere Carboxypeptidasen. Als solches stellen die beschriebenen NHPs
eine neue Familie von mit Proteasen verwandten Proteinen dar mit
einem Bereich von Homologen und Orthologen, welche über Ordnungen
und einen weiten Bereich von Stämmen
hinausgehen.
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Die
hier beschriebenen neuen humanen Nucleinsäuresequenzen codieren Proteine/offene
Leseraster (ORFs, Open Reading Frames) von einer Länge von
437 Aminosäuren
(siehe SEQ ID NO: 10. Die SEQ ID NO 2, 4, 6, 8 und 12 sind nur als
Beispiele wiedergegeben und bezeichnen nicht die Erfindung.
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Die
Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen
NHPs, einschließlich
kleiner Moleküle.
großer
Moleküle,
Mutanten-NHPs oder Abschnitte derselben, die mit einem nativen NHP
konkurrieren, Peptide und Antikörper
sowie Nucleotidsequenzen, die dazu verwendet werden können, die
Expression der beschriebenen NHPs zu inhibieren (z.B. Antisense-
und Ribozym-Moleküle, sowie
Gene oder regulatorische Konstrukte zum Genaustausch) oder die Expression
der beschriebenen NHP-Sequenzen zu erhöhen (z.B. Expressionskonstrukte,
welche die beschriebene Sequenz unter die Kontrolle eines starken
Promotorsystems stellen) sowie transgene Tiere, welche NHP-Transgene exprimieren
oder "Knock-Outs" (die bedingt sein
können),
die kein funktionales NHP exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung
von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten
der NHP-Expression und/oder der Aktivität des NHP-Produkts fungieren,
welche gereinigte Präparationen
der beschriebenen NHPs und/oder NHP-Produkte verwenden, oder Zellen
welche sie exprimieren. Solche Verbindungen können als Therapeutika für die jeweilige
Behandlung eines Symtoms aus der weiten Bandbreite von Symptomen,
die mit biologischen Erkrankungen oder Unausgewogenheiten einhergehen
eingesetzt werden.
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4. BESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
UND DER FIGUREN
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Das
Sequenzprotokoll zeigt die Sequenzen von 6 zu Proteasen gehörenden ORFs,
welche die beschriebenen NHP-Aminosäuresequenzen codieren.
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5. GENAUE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
hier zum ersten Mal beschriebenen NHPs sind neue Proteine, die u.a.
in menschlichen Zelllinien sowie im Hirn, der Hypophyse, dem Rückenmark,
dem Thymus, der Milz, den Lymphknoten, dem Knochenmark, der Luftröhre, der
Lunge, der Niere, der Prostata, den Hoden, der Schilddrüse, der
Nebenniere, dem Magen, dem Dünndarm,
dem Skelettmuskel, dem Uterus, der Brustdrüse, der Harnblase und den Halszellen
des Menschen exprimiert werden. Die beschriebenen Sequenzen wurden
aus in Gene eingebundenen cDNAs sowie einem Klon gewonnen, der aus
einer menschlichen cDNA-Bibliothek der Prostata isoliert wurde (Ege
Biosystems, Gaithersburg, MD). Die vorliegende Erfindung umfasst
die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotide, solche Nucleotide
exprimierende Wirtszellen, die Expressionsprodukte solcher Nucleotide
und: (a) Nucleotide, welche die Säugerhomologe der beschriebenen
Gene einschließlich
der speziell beschriebenen NHPs und die NHP-Produkte codieren; (b)
Nucleotide, die einen oder mehr den funktionellen Domänen entsprechende
Abschnitte der NHPs codieren, sowie die durch solche Nucleotidsequenzen
spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber nicht ausschließlich, der
neuen Abschnitte jeder aktiven Domäne(n); (c) isolierte Nucleotide,
die gentechnisch veränderte
oder natürlich
vorkommende Mutantenversionen der beschriebenen NHPs codieren, in
welcher alle oder ein Teil von zumindest einer Domäne zerstört oder
verändert ist
sowie die durch solche Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte
einschließlich,
aber nicht ausschließlich,
der löslichen
Proteine und Peptide, in welchen die gesamte oder ein Teil der Signalsequenz zerstört ist;
(d) Nucleotide, die chimäre
Fusionsproteine codieren, welche den gesamten oder einen Teil eines codierenden
Abschnitts eines NHP oder eine seiner Domänen enthalten (z.B. eine Rezeptor/Liganden-Bindungsdomäne, akzessorische
Protein/Selbstassoziierungs-Domäne,
usw.), welche an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusioniert sind
oder (e) therapeutische oder diagnostische Derivate der beschriebenen
Polynucleotide wie z.B. Oligonucleotide, Antisense-Polynucleotide,
Ribozyme, dsRNA oder gentherapeutische Konstrukte mit einer Sequenz,
die zum ersten Mal im Sequenzprotokoll offenbart wird.
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Wie
oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung: (a) die im
Sequenzprotokoll angegebenen humanen DNS-Sequenzen (und diese enthaltende
Vektoren) und befasst sich zusätzlich
mit jeder Nucleotidsequenz, welche ein benachbartes offenes Leseraster
(ORF) codiert, das an eine im Sequenzprotokoll angegebene komplementäre DNA-Sequenz
unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung an
filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 75
Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1%
SDS bei 68°C
(Ausubel F. M. et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular
Biology, Band X, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New
York auf Seite 2.10.3), und ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert.
Zusätzlich
befasst sich die Erfindung mit jeder Nucleotidsequenz, die an die
komplementäre
DNA-Sequenz hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll angegebene
Aminosäuresequenz
unter mäßig stringenten
Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel
et al,. 1989, supra), codiert und exprimiert und immer noch ein
funktionell äquivalentes
NHP-Produkt codiert. Funktionelle Äquivalente eines NHP umfassen
in anderen Arten enthaltene natürlich
vorkommende NHPs sowie mutante NHPs, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen
oder gentechnisch verändert
wurden (durch zielgerichtete Mutagenese, Gen-shuffling, gerichtete
Evolution, wie z.B. im US-Patent 5,837,458 beschrieben). Die Erfindung
umfasst auch degenerierte Nucleinsäurevarianten der offenbarten
NHP-Polynucleotidsequenzen.
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Zusätzlich befasst
sich die Erfindung mit NHP-ORFs codierenden Polynucleotiden oder
deren funktionellen Äquivalenten,
die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche eine etwa
99-, 95-, 90- oder 85-prozentige Ähnlichkeit
mit entsprechenden Abschnitten von SEQ ID NO: 1 aufweisen (ermittelt
mit der BLAST-Sequenz-Vergleichsanalyse unter Verwendung von z.B.
dem GCG-Sequenzanalyse-Programmpaket mit vorgegebenen Parametern).
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Die
Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise
DNA-Moleküle, die
an die beschriebenen Nucleotidsequenzen des NHP-Gens hybridisieren
und daher komplementär
zu letzteren sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können, wie
oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein. In
Fällen,
wo die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide
("DNA-Oligos") sind, sind solche
Moleküle
im Allgemeinen ca. 16 bis ca. 100 Basen lang oder ca. 20 bis ca.
80 oder ca. 34 bis ca. 45 Basen lang oder jede Variation oder Kombination
von darin vorkommenden Größen, die
einen im Sequenzprotokoll zuerst offenbarten benachbarten Sequenzabschnitt
enthalten. Solche Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR) dazu verwendet werden, Bücherein
zu durchsuchen, Clone zu isolieren und Klonierungs- und Sequenzierungsmatrizen
herzustellen usw..
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Alternativ
können
solche NHP-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden zum Durchsuchen
von Büchereien
und zum Bewerten von Genexpressionsmustern verwendet werden (besonders
unter Verwendung eines Mikroarray- oder "Chip"-Formats mit hohem
Durchsatz). Zusätzlich
kann eine Reihe der beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen oder deren
komplementäre
Sequenzen verwendet werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen
NHP-Sequenzen wiederzugeben. Die Oligonucleotide, welche typischerweise
zwischen etwa 16 bis etwa 40 (oder jede ganze Zahl im angegebenen
Bereich) Nucleotide lang sind, können
teilweise untereinander überlappen
und/oder die NHP-Sequenz kann unter Verwendung von Oligonucleotiden
dargestellt werden, die nicht überlappen.
Demgemäß sollen
die beschriebenen NHP-Polynucleotidsequenzen typischerweise mindestens
etwa zwei oder drei unterschiedliche Oligonucleotidsequenzen mit
einer Länge
von mindestens etwa 18, und vorzugsweise etwa 25 Nucleotiden umfassen,
welche erstmals in dem beschriebenen Sequenzprotokoll offenbart
werden. Solche Oligonucleotidsequenzen können an jedem in einer Sequenz im
Sequenzprotokoll vorkommenden Nucleotid beginnen und entweder in
(5'-3')-Richtung gegenüber der
beschriebenen Sequenz oder in entgegengesetzter Richtung fortschreiten.
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Für Oligonucleotidsonden
kommen hoch stringente Bedingungen in Betracht, z.B. Waschen in
6 × SSC/0,06%
Natriunpyrophosphat bei 37°C
(für Oligos
von 14 Basen), bei 48°C
(für Oligos
von 17 Basen), bei 55°C
(für Oligos
von 20 Basen) und bei 60°C
(für Oligos
von 23 Basen). Diese Nucleinsäuremoleküle können Antisensemoleküle der NHP-Sequenz
codieren oder als solche fungieren, welche z.B. für eine Regulierung
der NHP-Sequenz brauchbar sind (für und/oder als Antisense-Primer
in Amplifizierungsreaktionen von Nucleinsäuresequenzen des NHP). Bezüglich der
Regulierung der NHP-Sequenz können
solche Techniken eingesetzt werden, um biologische Funktionen zu
regulieren. Ferner können
solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder als Tripelhelixsequenzen
verwendet werden, welche ebenfalls für die Regulierung der NHP-Sequenz
brauchbar sind.
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Inhibitorische
Antisense- oder Doppelstrang-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten
Basenrest aufweisen, der ausgewählt
ist, jedoch nicht ausschließlich,
aus der Gruppe 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine,
5-Carboxymethylamino-methyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin,
Inosin, N6-isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin,
2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin,
S-Methycytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil.
beta-D-Mannosylqueosin,
5'-ethoxycarboxymethyluracil.
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5-Methoxyuracil,
2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v),
Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil,
2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester,
Uracil-5-oxyessigsäure
(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil,.(acp3)w und 2,6-Diamino-purin.
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Die
Antisense-Oligonucleotide können
auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest enthalten, ausgewählt, aber
nicht ausschließlich,
aus der Gruppe Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
umfassen die Antisense-Oligonucleotide ein Rückgrat mit mindestens einem
modifizierten Phosphat, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat,
einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat,
einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal
oder einem Analogen davon.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres
Oligonucleotid bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride,
in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel
zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:
6625–6641).
Das Oligonucleotid ist ein 2'-0-Methylribonucleotid
(Inoue et al., 15: 6131–6148)
oder ein chimäres
RNA-DNA-Analoges (Inoue et al,, 1987 FEBS Lett. 215: 327–330). Alternativ
kann doppelsträngige
RNA verwendet werden, um die Expression und Funktion eines Ziel-NHP
zu unterbrechen.
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Die
Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach im Stand der Technik
bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Verwendung
eines automatischen DNA-Synthesizers (wie er im Handel von Biosearch,
Applied Biosystems usw. bezogen werden kann). Beispielsweise können Phosphorthioat-Oligonucleotide nach
dem Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids res. 16: 3209)
synthetisiert werden und Methylphosphonat-Oligonucleotide lassen
sich unter Verwendung von Polymerträgern des Typs Controlled Pore Glass
herstellen (Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448–7451),
usw.
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Niedrig
stringente Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und variieren
in voraussagbarer Weise je nach den speziellen Organismen, von welchen
die Bücherei
und die markierten Sequenzen stammen. Für eine Anleitung zur Schaffung
solcher Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (and periodic Updates thereof), Cold
Springs Harbor Press, N.Y.; sowie Ausubel et al., 1989, Current
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und
Wiley Interscience, N.Y.
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Alternativ
können
geeignete markierte NHP-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um eine
humane Genombibliothek unter Einsatz von ausreichend stringenten
Bedingungen oder mittels PCR zu durchsuchen. Die Identifizierung
und Charakterisierung von menschlichen Genomklonen ist zur Identifizierung
von Polymorphismus hilfreich (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von
Nucleotid-Repeats, Mikrosatelliten-Allelen, Einzelnucleotid-Polymorphismus
oder codierender Einzelnucleotid-Polymorphismus), zur Ermittlung
der Genomstruktur eines gegebenen Locus/Allels und zur Planung diagnostischer
Tests. Beispielsweise lassen sich Sequenzen, die von Abschnitten
abstammen, welche den Intron/Exon-Grenzen des Humangens benachbart sind,
zur Entwicklung von Primern für
die Verwendung in Amplifikationsassays einsetzen, um in den Exons, Introns,
Spleißorten
(z.B. an der Spleißakzeptor-
und/oder Donorstelle) Mutationen aufzuspüren usw., welche in der Diagnose
und Pharmakogenetik zum Einsatz kommen können.
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Ferner
lässt sich
ein NHP-Sequenzhomologes aus Nucleinsäuren von einem in Frage kommenden
Organismus isolieren, indem eine PCR durchgeführt wird, in welcher zwei degenerierte
oder "Wobble" Oligonucleotidprimer-Pools
verwendet werden, die auf Grundlage der Aminosäuresequenzen in den hier offenbarten NHP-Produkten
entworfen wurden. Die Matrize für
die Reaktion kann Gesamt-RNA,
mRNA und/oder cDNA sein, welche durch reverse Transcription von
mRNA erhalten wurde, welche z.B. aus humanen oder nicht humanen
Zelllinien oder von Gewebe erhalten wurde, von dem angenommen wird,
dass es ein Allel einer NHP-Sequenz exprimiert.
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Das
PCR-Produkt kann subcloniert und sequenziert werden, um sicher zu
gehen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten
NHP-Gens darstellen. Das PCR-Fragment kann sodann verwendet werden,
um mit verschiedenen Methoden einen cDNA-Klon mit voller Länge zu isolieren.
Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment markiert und dazu
verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek
zu durchsuchen. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet werden, über das
Durchsuchen einer Genombibliothek genomische Klone zu isolieren.
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Die
PCR-Technologie lässt
sich auch zur Isolierung einer cDNA-Sequenz in vollständiger Länge einsetzen.
Beispielsweise kann RNA aus einer geeigneten Quelle aus Zellen oder
Gewebe nach Standardverfahren isoliert werden (d.h. aus einer Quelle
wie z.B. Hodengewebe, von der man weiß oder annimmt, dass sie eine
NHP-Sequenz exprimiert). An der RNA wird eine Reaktion mit reverser
Transkriptase (RT) durchgeführt, wobei
ein Oligonucleotid-Primer verwendet wird, der für die meisten 5'-Enden des amplifizierten
Fragments für das
Priming der Synthese des ersten Strangs spezifisch ist. Das erhaltene
RNA/DNA-Hybrid kann dann "zurechtgestutzt" werden, indem man
eine Standardreaktion mit terminaler Transferase verwendet, das
Hybrid kann mit RNase verdaut werden und die Synthese des zweiten
Strangs kann dann mit einem komplementären Primer geprimt werden.
Somit lassen sich cDNA-Sequenzen stromauf zum amplifizierten Fragment
isolieren. Für
einen Überblick über die
Klonierungsstrategien, die eingesetzt werden können, siehe Sambrook et al., 1989,
supra.
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Durch
Einsatz der PCR kann z.B. eine eine mutierte NHP-Sequenz codierende
cDNA isoliert werden. In diesem Falle kann der erste cDNA-Strang
synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an eine mRNA
anhybridisiert wird, welche aus einem Gewebe isoliert wurde, von
dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es in einem Individuum
exprimiert wird, welches vermeintlich ein mutiertes NHP-Allel trägt, und
indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird.
Der zweite Strang der cDNA wird sodann synthetisiert, indem ein
Oligonucleotid eingesetzt wird, welches spezifisch an das 5'-Ende des normalen
Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt
sodann mit der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten Vektor
cloniert und mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind einer
DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des
mutierten NHP-Allels mit der eines entsprechenden normalen NHP-Allels
kann (können)
die Mutation(en) ermittelt werden, die für den Verlust oder die Änderung der
Funktion des mutierten NHP-Sequenzprodukts verantwortlich sind.
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Alternativ
lässt sich
eine Genombibliothek aufhauen, indem eine DNA eingesetzt wird, die
aus einem Individuum gewonnen wurde, von dem angenommen wird oder
bekannt ist, dass es ein mutiertes NHP-Allel trägt (z.B. eine Person, die einen
auf NHP zurückzuführenden
Phänotyp
aufweist, wie z.B. Fettsucht, hoher Blutdruck, usw.), oder es lässt sich
eine cDNA-Bibliothek ausbauen, indem RNA aus einem Gewebe eingestzt wird,
von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel
exprimiert. Eine normale NHP-Sequenz oder ein geeignetes Fragment
davon kann sodann markiert werden und als Sonde zur Identifizierung
des entsprechenden mitierten NHP-Allels in solchen Büchereien
eingestzt werden. Klone mit mutierte NHP codierenden Sequenzen können sodann
gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
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Zusätzlich kann
eine Expressionsbücherei
aufgebaut werden, indem cDNA eingesetzt wird, welche z.B. aus RNA
synthetisiert wurde, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem
bekannt ist oder angenommen wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel
exprimiert in einem Individuum, von dem angenommen wird oder bekannt
ist, dass es solch ein mutiertes Allel trägt. Auf diese Weise können aus
dem vermeintlich mutierten Gewebe gewonnene Genprodukte exprimiert
und unter Verwendung von standardisierten Antikörper-Screeningtechniken zusammen
mit, wie unten beschrieben, gegen ein normales NHP-Produkt gerichteten
Antikörpern
gescreent werden. (Zu Screeningtechniken siehe z.B: Harlow, E. und
Lane, Hrg., 1988, "Antibodies:
A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor.)
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Zusätzlich kann
das Screening unter Verwendung von markierten NHP-Fusionsproteinen
wie z.B. alkalischer Phosphatase-NHP oder alkalischen NHP-Phosphatase-Fusionsproteinen
erfolgen. In Fällen,
wo eine Mutation der NHP zu einem Genprodukt mit veränderter
Funktion führt
(z.B. als Ergebnis einer Missense-Mutation oder einer Mutation in
Folge einer Rasterverschiebung), gehen gegen NHP gerichtete polyklonale Antikörper wahrscheinlich
mit einem entsprechenden mutierten NHP-Sequenzprodukt eine Kreuzreaktion
ein. Klone aus Büchereien,
die über
ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern aufgefunden wurden können gereinigt
und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse
unterzogen werden.
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Die
Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen und/oder der komplementären (d.h.
Antisense-) Sequenzen enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die jede
der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem
regulatorischen Element assoziiert sind, welches die Expression
der codierenden Sequenzen lenkt (z.B. ein Baculo-Virus, wie es im
US-Patent 5,869,336 beschrieben wird, welches hiermit als Referenz
eingeführt
wird); (c) gentechnisch bearbeitete Wirtszellen, die jede der vorgenannten
NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem regulatorischen Element
assoziiert sind, welches die Expression der codierenden Sequenzen
in der Wirtszelle lenkt und (d) gentechnisch veränderte Wirtszellen, die eine
endogene NHP-Sequenz unter der Kontrolle eines exogen eingeführten regulatorischen
Elements (d.h.. Genaktivierung) exprimieren. Unter dem hier verwendeten
Begriff regulatorische Elemente werden, jedoch nicht ausschließlich, induzierbare
und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere
dem Fachmann bekannte Elemente verstanden, welche die Expression steuern
und kontrollieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch
nicht ausschließlich,
das unmittelbar frühe
Gen des humanen Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare virale Elemente
(insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren)., die frühen oder
späten
Promotoren des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System,
das TRC-System, die hauptsächlichen
Operator- und Promotorabschnitte des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte
des fd-Kapsidproteins, die Promotoren der sauren Phosphatase sowie
die Promotoren der Alpha Mating Faktoren aus Hefe.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einscjließlich Fab-Fragmente),
Antagonisten und Agonisten der NHP sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte,
welche die Expression einer NHP-Sequenz inhibieren (Inhibitoren
des Transskriptionsfaktors, Antisense- und Ribozymmoleküle oder
Konstrukte zum Ersatz eines Gens oder einer regulatorischen Sequenz)
oder die Expression eines NHP begünstigen (z.B. Expressionskonstrukte,
in denen die NHP codierende Sequenz operativ an die Expression von
Kontrollelementen wie z.B. Promotoren, Promotoren/Enhancern usw.
gekoppelt ist).
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Die
NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
-Antikörper,
-Antagonisten und -Agonisten können
für den
Nachweis von mutierten NHPs oder unvollständig exprimierten NHPs für die Diagnose
von Krankheiten nützlich
sein. Die NHP-Proteine oder -Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen,
Wirtszellex-pressionssysteme, Antikörper, Antagonisten, Agonisten
und gentechnisch bearbeiteten Zellen und Tiere können zum Screening nach Arzneimitteln
verwendet werden (oder zum Screening von kombinatorischen Bücherein
mit großem
Durchsatz), welche für
die Behandlung der symptomatischen oder phänotypischen Symptome einer
Störung
der normalen Funktion von NHP im Körper wirksam sind. Die Verwendung
von gentechnisch veränderten
Wirtszellen und/oder Tieren kann insofern einen Vorteil bieten,
als solche Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen
berücksichtigen,
die an einen endogenen Rezeptor/Liganden von NHP binden, sondern
auch Verbindungen identifizieren, die eine von NHP vermittelte Aktivität auslösen.
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Schließlich können die
NHP-Produkte als Therapeutika Verwendung finden. Beispielsweise
können lösliche Versionen
oder Derivate eines NHP oder einem NHP entsprechende Peptide/Domänen, Proteinprodukte
einer Fusion mit NHP (insbesondere NHP-IG-Fusionsproteine, d.h.
Fusionen eines NHP oder einer Domäne eines NHP an ein IgFc),
NHP-Antikörper
oder antiidiotypische Antikörper
(einschließlich
Fab-Fragmente), Antagonisten oder Agonisten (einschließlich Verbindungen,
welche in einem NHP vermittelten Stoffwechselweg modulieren oder
auf stromab gelegene Ziele einwirken) zur direkten Behandlung von
Krankheiten oder Störungen
eingesetzt werden. Beispielsweise könnte die Verabreichung einer
wirksamen Menge eines löslichen
NHP oder eines NHP-IgFc-Fusionsproteins oder eines antiidiotypischen
Antikörpers
(oder dessen Fab), der das NHP nachahmt, die NHP-Funktion aktivieren
oder wirksam antagonisieren. Nucleotid-Konstrukte, die solche NHP-Produkte codieren
können
eingesetzt werden, um Wirtszellen zur Expression solcher Produkte
in vivo gentechnisch zu behandeln; diese gentechnisch behandelten
Zellen wirken im Körper
als "Bioreaktoren", welche einen kontinuierlichen
Strom eines NHP, eines NHP-Pepetids oder eines NHP-Fusionsproteins liefern. Nucleotidkonstrukte,
die funktionelle NHPs, mutierte NHPs sowie Antisense- und Ribozym-Moleküle codieren können auch
in Ansätzen
einer "Gentherapie" für die Modulation
der NHP-Expression eingesetzt werden. Somit umfasst die Erfindung
auch pharmazeutische Formulierungen und Verfahren zur Behandlung
von biologischen Störungen.
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Verschiedene
Aspekte der Erfindung werden nun genauer in den folgenden Unterabschnitten
beschrieben.
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5.1 DIE NHP-SEQUENZEN
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Die
cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen
der beschriebenen NHPs sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Die
NHP-Sequenzen wurden
aus einer cDNA-Bibliothek der humanen Prostata unter Verwendung
von Sonden und/oder Primern erhalten, die aus im menschlichen Gen enthaltenen
Sequenzstücken
gewonnen wurden. Eine Expressionsanalyse bewies, dass sich die beschriebenen
NHPs z.B. in unterschiedlichen menschlichen Zelltypen exprimieren
lassen und dass die beschriebenen NHPs eine beachtliche Ähnlichkeit
mit verschiedenen Proteasen haben, insbesondere mit der Carboxypeptidase
B oder der Carboxypeptidase A von u.a. Menschen, Mäusen und
Ratten.
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In
SEQ ID NO: 13 ist ein NHP-ORF in voller Länge mit flankierenden 5'- und 3'-Sequenzen wiedergegeben.
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5.2 NHPs UND NHP-POLYPEPTIDE
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NHPs,
Polypeptide, Peptidfragmente, mutierte, gekürzte oder einer Deletion unterzogene
Formen der NHPs und/oder Fusionsproteine können für verschiedene Verwendungen
hergestellt werden. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht ausschließlich, die
Erzeugung von Antikörpern,
als Reagenzien in diagnostischen Assays, für die Identifizierung von anderen
mit NHP in Verbindung stehenden Zellgenprodukten, als Reagenzien
in Assays zum Screening von Verbindungen, die als pharmazeutische
Reagenzien bei der therapeutischen Behandlung von mentalen, biologischen
oder medizinischen Störungen
und Krankheiten von Nutzen sein können. Einige Verwendungen und
Anwendungen für
Plasma-Carboxypeptidasen ähnlich den
hier beschriebenen werden in dem US-Patent 5,593,674 beschrieben,
dessen vollständige
Offenbarung hiermit als Referenz eingeführt wird.
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Das
Sequenzprotokoll zeigt die von den beschriebenen NHP-Polynucleotiden
codierten Aminosäuresequenzen.
Die NHPs weisen Initiations-Methionine in DNA-Sequenzkontexten auf,
die mit einer Translations-Initiations-Stelle übereinstimmen und in der Nähe des N-terminalen
Proteinabschnitts befindet sich eine hydrophobe Signal-ähnliche
Sequenz. Die hier vorgelegten Sequenzdaten zeigen, dass alternativ
gespleißte Formen
der NHPs vorkommen (die gewebsspezifisch sein können oder auch nicht).
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Die
erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
für die
NHPs umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotid-
und Aminosäuresequenzen
als auch Analoga und Derivate davon. Ferner werden von der Erfindung
die entsprechenden NHP-Analogen aus anderen Species mit umfasst.
Daher liegt jedes von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen
codierte NHP-Protein
mit im Schutzumfang der Erfindung sowie jede neue Polynucleotidsequenz,
die alle oder irgend einen neuen Abschnitt einer im Sequenzprotokoll
angegebenen Aminosäuresequenz
codiert. Es ist bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist
und entsprechend steht jede im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäure generisch
für das
bekannte Nucleinsäure-"Triplett"-Codon oder in vielen
Fällen
Codons, welche die Aminosäure
codieren können.
Die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen als solche sollen
im Zusammenhang mit dem genetischen Code (siehe z.B. Table 4-1 auf
Seite 109 von "Molecular
Cell Biology", 1986,
J. Darnell et al. Hrg. Scientific American Books, New York, NY,
welche hiermit als Referenz eingeführt wird) generisch für alle verschiedenen
Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäure-sequenzen stehen, welche
solche Aminosäuresequenzen
codieren können.
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Die
Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell den von den hier
beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NHPs äquivalent sind, beurteilt nach
jeder Anzahl von Kriterien einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der
Fähigkeiten
ein Substrat eines NHP zu binden und zu spalten, oder der Fähigkeit,
einen identischen oder komplementären stromab gelegenen Weg zu
bewirken oder eine Änderung
im Zellmetabolismus (z.B. proteolytische Aktivität, Ionenfluss, Phosphoryierung
des Tyrosins usw.). Solche funktionell äquivalenten NHP-Proteine sind,
aber nicht ausschließlich,
Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der von den oben
beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierten Aminosäuresequenz,
die aber zu einer stillen Änderung
führen,
indem sie ein funktionell äquivalentes
Genprodukt liefern. Substitutionen von Aminosäuren können auf Basis einer Ähnlichkeit
in der Polarität,
der Ladung, der Löslichkeit,
der Hydrophobizität, der
Hydrophilizität
und/oder der amphipatischen Natur der betroffenen Reste erfolgen.
Beispielsweise sind nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin;
polare neutrale Aminosäuren
sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin;
positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin und
Histidin; und negativ geladene saure Aminosäuren sind Asparaginsäure und
Glutaminsäure.
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Es
können
verschiedene Wirts-Expressions-Vektorsysteme eingesetzt werden,
um die NHP-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Die
hier beschriebenen NHPs ähneln
der Plasma-Carboxypeptidase B und sind ähnlich lösliche Proteine. Ist das zu
exprimierende NHP-Peptid oder-Polypeptid ein lösliches NHP-Protein oder ein
aus einer im Wesentlichen nicht hydrophoben Domäne eines NHP stammendes NHP-Peptid
oder ein verkürztes
oder einer Deletion unterzogenes NHP, kann das Peptid oder Polypeptid
aus der Kultur gewonnen werden, d.h. in Fällen, wo das NHP-Peptid oder-Polypeptid
nicht ausgeschieden wird, oder aus dem Kulturmedium in Fällen, wo
das NHP-Peptid oder-Polypeptid von den Zellen ausgeschieden wird.
Solche Expressionssysteme umfassen jedoch auch gentechnisch bearbeitete
Wirtszellen, die ein NHP oder ein funktionelles Äquivalent in situ, d.h. in
der Zellmembran verankert, exprimieren. Die Reinigung oder Anreicherung
eines NHP aus solchen Expressionssystemen kann erfolgen, indem geeignete
Detergentien und Lipidmicellen und dem Fachmann bekannte Verfahren
eingesetzt werden. Es können
jedoch solche gentechnisch bearbeiteten Wirtszellen selbst in Situationen
eingesetzt werden, wo es wichtig ist, die strukturellen und funktionellen
Eigenschaften des NHP zu bewahren, aber die biologische Aktivität zu beurteilen,
z.B. in Screeningassays für
Arzneimittel.
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Die
Expressionssysteme, die sich für
die Zwecke der Erfindung einsetzen lassen sind, jedoch nicht ausschließlich, Mikroorganismen
wie z.B. Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden
rekombinanten Expressionsvektoren aus Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA
oder Cosmid-DNA
transformiert wurden; Hefe (z.B. Saccharomyces Pichia), die mit
NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden Expressionsvektoren aus Hefe transformiert wurde; Insektenzellsysteme,
die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren
aus Viren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme,
die mit rekombinanten Expressionsvektoren aus Viren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV;
Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit NHP-Nucleotidsequenzen
enthaltenden rekombinaten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid)
transformiert wurden; oder Säugerzellsysteme
(z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte
beherbergen, welche von dem Säugerzellen-Genom stammende
Promotoren (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren
stammende Promotoren (z.B. der Adenovirus-Late-Promotor; der Vacciniavirus-7,5 K-Promotor) enthalten.
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Aus
bakteriellen Systemen lässt
sich vorteilhafterweise je nach der beabsichtigten Verwendung für das zu
exprimierende NHP-Produkt eine Anzahl von Expressionsvektoren auswählen. Ist
beispielsweise eine große
Menge eines solchen Proteins zur Erzeugung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen herzustellen, die aus NHP bestehen oder NHP enthalten,
oder zur Erzeugung von Antikörpern
gegen ein NHP, können
Vektoren erwünscht
sein, die eine große
Menge an leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten steuern.
Solche Vektoren sind, jedoch nicht ausschließlich, der Expressionsvektor
pUR278 Von E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem
eine NHP-codierende Sequenz im richtigen Raster mit dem lacZ codierenden Abschnitt
einzeln in den Vektor ligiert ist, so dass ein Fusionsprotein entsteht;
pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985,
Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109;
Van Heeke & Schuster,
1989, J. Biol. Chem. 254: 5503–5509);
und dergl.. pGEX-Vektoren können
ebenfalls eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine
mit Glutathion-S-Transferase
(GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine
löslich
und lassen sich mittels Adsorption an Gluththion-Agarose-Kügelchen
gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion leicht
von lysierten Zellen reinigen. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen,
dass sie Schnittstellen für
Thrombin oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das geklonte
Zielsequenzprodukt vom GST-Rest befreit werden kann.
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In
einem Insektensystem wird das Autographa-Californica-Nuclear-Polyhydrosis-Virus (AcNPV) als Vektor
zue Erxpression von fremden Sequenzen eingestzt. Das Virus wächst in
Zellen von Spodoptera frugiperda. Eine NHP codierende Sequenz kann
einzeln in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen) des
Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (t.B.
des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion
der NHP codierenden Sequenz führt
zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und der Produktion von
einem nackten rekombinanten Virus (d.h. einem Virus ohne Proteinhülle, die von
dem Polyhedrin-Gen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden
sodann benutzt, um Zellen von Sodoptera frugiperda zu infizieren,
in welchen die insertierte Sequenz exprimiert wird (siehe z.B. Smith
et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051).
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In
Wirtszellen von Säugern
lässt sich
eine Anzahl von auf Viren beruhenden Expressions-systemen einsetzen.
In den Fällen,
wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die
in Frage stehende Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex,
z.B. die Late Promotor- und
Tripartite-Leader-Sequenz des Adenovirus ligiert sein. Diese chimäre Sequenz
kann sodann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination in das
Genom des Adenoviorus insertiert sein. Die Insertion in einen nicht
essentiellen Abschnitt des viralen Genoms (z.B. Abschnitt E1 oder
E3) führt
zu einem rekombinaten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in
infizierten Wirten ein NHP-Produkt zu exprimieren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659).
Für eine
wirkungsvolle Translation von insertierten NHP-Nucleotidsequenzen können auch spezifische Initiationssignale
erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon
und angrenzende Sequenzen. In den Fällen, wo eine ganze NHP-Sequenz
oder cDNA einschließlich
des eigenen Initiationscodons und der angrenzenden Sequenzen in
einen passenden Expressionsvektor insertiert wird, sind keine zusätzlichen
Kontrollsignale für
die Translation nötig.
In Fällen
jedoch, wo nur ein Teil einer NHP codierenden Sequenz insertiert
wird, müssen
exogene Kontrollsignale für
die Translation einschließlich
vielleicht des ATG-Initiationscodons zur Verfügung gestellt werden. Außerdem muss
das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten
codierenden Sequenz sein, um eine Translation des gesamten Insertionselements
sicher zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation
und die Initiationscodons können
verschiedenen, entweder natürlichen
oder synthetischen Ursprungs sein. Die Effezienz der Expression
lässt sich
durch Einbeziehung geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren
usw. steigern (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:
516–544).
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Zusätzlich kann
ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten
Sequenzen moduliert oder das Sequenzprodukt auf die gewünschte spezifische
Weise modifiziert und weiterbehandelt. Solche Modifikationen (z.B.
eine Glykosylierung) und Weiterbehandlungen (z.B. eine Spaltung)
der Proteinprodukte können
für die
Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen weisen
charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Weiterbehandlung
und Modifikation von Proteinen und Genprodukten auf. Es können passende
Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte
Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten Fremdproteins
sicher zu stellen. Hierfür
lassen sich eukaryotische Wirtszellen einsetzen, die über die
zelluläre
Maschinerie für
eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung
und die Phosphorylierung des Genprodukts verfügen. Solche Wirtszellen von
Säugern
sind, jedoch nicht ausschließlich,
CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3-, WI38- und insbesondere
menschliche Zelllinien.
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Für eine langzeitige
Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist eine stabile
Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, welche die
oben beschriebenen NHP-Sequenzen exprimieren, gentechnisch bearbeitet
werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale
Ursprünge
der Replikation enthalten, lassen sich Wirtszellen mit DNA transformieren,
die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen (z.B. Promotoren,
Enhancer-Sequenzen,
Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einem
auswählbaren
Marker kontrolliert werden. Nach Einführung der Fremd-DNA werden gentechnisch
behandelte Zellen 1–2
Tage in einem angereicherten Medium wachsen gelassen und sodann
in ein selektives Medium überführt. Die
auswählbaren
Marker in dem rekombinanten Plasmid verleihen gegenüber einer
Selektion Resistenz und bringen die Zellen dazu, das Plasmid in
ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu
bilden, die ihrerseits geklont werden können und sich zu Zelllinien
vermehren. Dieses Verfahren lässt
sich vorteilhaft einsetzen, um Zelllinien gentechnisch zu verändern, welche
das Genprodukt exprimieren. Solche gentechnisch bearbeiteten Zelllinien
sind vorteilhaft beim Screening und der Auswertung von Verbindungen
zu gebrauchen, welche die endogene Aktivität des NHP-Produkts beeinflussen.
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Es
kann eine Anzahl von Selektionssystemen eingesetzt werden, einschließlich, aber
nicht ausschließlich,
die Thymidinkinase aus Herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell
11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenosin-Phosphoribosyltransferasegene
(Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) können jeweils in tk–-,
hgprf– -oder aprt–-Zellen
eingesetzt werden. Auch Resistenz gegen Antimetaboliten kann für die folgenden
Gene als Basis für
eine Selektion verwendet werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat
verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht
(Mulligan & Berg
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen
das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981,
J. Mol. Biol. 150: 1) und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin
verleiht (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147).
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Alternativ
lässt sich
jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein für das exprimierte
Fusionsprotein spezifischer Antikörper verwendet wird. Beispielsweise
lässt sich
mit einem von Janknecht et al. beschriebenen System ein in menschlichen
Zelllinien exprimiertes nicht denaturiertes Fusionsprotein leicht
reinigen (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
8972–8976).
In diesem System wird die betreffende Sequenz in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid
subcloniert, so dass das offene Leseraster translational an ein aus
sechs Histidinresten bestehendes aminoendständiges Tag fusioniert wird.
Die Extrakte aus mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen
werden auf Ni2+-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen aufgetragen
und die Proteine mit freien Histidinenden selektiv mit Imidazol
enthaltenden Puffern eluiert.
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5.3 ANTIKÖRPER GEGEN
NHP-PRODUKTE
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Antikörper, welche
spezifisch ein oder mehr Epitope eines NHP oder Epitope von konservierten
Varianten eines NHP oder Peptidfragmente eines NHP erkennen, werden
ebenfalls von der Erfindung umfasst. Solche Antikörper umfassen,
jedoch nicht ausschließlich,
polyklonale Antikörper,
monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte
oder chimäre
Antikörper,
Einzelketten-Antikörper,
Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, mit einer Fab-Expressionsbücherei hergestellte
Fragmente, antidiotypische (anti-Id) Antikörper und an ein Epitop bindende
Fragmente von jedem der obigen Vertreter. Antikörper, und Anwendungen sind
Verwendungen derselben, ähnlich
den hier ins Auge gefassten werden im US-Patent 5,474,901 beschrieben,
dessen vollständige
Offenbarung hiermit als Referenz eingeführt wird.
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Die
Antikörper
der Erfindung können
z.B. zum Nachweis von NHP in einer biologischen Probe eingesetzt
werden und können
daher als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik
Verwendung finden, in denen Patienten auf anomale Mengen von NHP
getestet werden können.
Solche Antikörper
können
z.B., wie unten in Abschnitt 5.5 beschrieben, zusammen mit Screeningverfahren
von Verbindungen eingesetzt werden, um die Wirkung von Testverbindungen
auf die Expression und/oder Aktivität eines NHP-codierenden Sequenzprodukts
zu ermitteln. Zusätzlich
lassen sich solche Antikörper
im Verein mit einer Gentherapie z.B. dazu verwenden, die normalen
und/oder gentechnisch veränderten
NHP exprimierenden Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu begutachten.
Solche Antikörper
können
zusätzlich
als eine Methode zur Inhibition von anomaler NHP-Aktivität verwendet
werden. Somit lassen sich solche Antikörper daher als Teil von Behandlungs-methoden
einsetzen.
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Für die Herstellung
von Antikörpern
können
verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem NHP, einem NHP-Peptid
(z.B. eines, das einer funktionellen Domäne auf einem NHP entspricht),
verkürzten
NHP-Polypeptiden (NHP, in welchem eine oder mehr Domänen zerstört worden
sind), funktionellen Äquivalenten
des NHP oder mutierten Varianten des NHP immunisiert werden. Solche
Wirtstiere können
sein, aber nicht ausschließlich,
Schweine, Kaninchen, Mäuse,
Ziegen und Ratten, um nur einige zu nennen. Es können verschiedene Adjuvantien
eingesetzt werden, um je nach Wirtsspezies die Immunantwort zu steigern,
wie z.B., aber nicht ausschließlich,
das Freundsche Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralsalze
wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, oberflächenaktive
Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen
und potentiell brauchbare menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacillus
Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Alternativ könnte die
Immunantwort durch Kombination und/oder Kopplung mit Molekülen wie
das Hämocaynin
der Napfschnecke, das Tetanus-Toxoid, das Diphtherie-Toxoid, Ovalbumin,
das Cholera-Toxin oder Fragmente derselben gesteigert werden. Polyklonale
Antikörper
sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der
immunisierten Tiere stammen.
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Monoklonale
Antikörper,
welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes
Antigen sind, lassen sich nach jeder Technik erhalten, welche über kontinuierliche
Zelllinien in Kultur für
die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt.
Dies sind, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridoma-Technik
von Köhler
und Milstein (1975, Nature 255: 495–497 und US-Patent 4,376,110),
die humane B-Zellen-Hybridoma-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology
Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030) und
die EBV-Hybridoma-Technik
(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan
R. Liss, Inc., SS 77–96).
Solche Antikörper
können
von jeder Immunoglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD
und jeder ihrer Unterklassen. Die Hybridoma, welche die mAbs dieser
Erfindung produzieren können
in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen
Titern an mAbs macht diese Methode zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren.
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Darüber hinaus
können
Techniken eingesetzt werden, die für die Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al.,
1984, Proc. Natl. Acad. Sci, 51: 6851–6855; Neuberger et al., 1984.
Nature, 312: 604–608;
Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452–454) entwickelt wurden, indem
die Gene von einem Maus-Antikörpermolekül mit passender
Antigenspezifität
zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit passender biologischer
Aktivität
gespleißt
werden. Ein chimärer
Antikörper
ist ein Molekül,
in welchem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierarten
stammen wie solche, die eine von einem mAb der Maus stammende variable
Region und eine konstante Region aus humanem Immunglobulin aufweisen.
Solche Technologien sind in den US-Patenten 6,075,181 und 5,877,397 beschrieben,
deren vollständige
Offenbarungen hiermit als Referenz eingeführt werden.
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Alternativ
können
für die
Produktion von einkettigen Antikörpern
beschriebene Techniken (US-Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science
242: 423–426;
Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 55: 5879–5883 und
Ward et al., 1989, Nature 334: 544–546) übernommen werden, um einkettige
Antikörper
gegen NHP-Sequenzprodukte
zu produzieren. Einkettige Antikörper
werden gebildet, indem das schwere und leichte Kettenfragment der
Fv-Region über
eine Aminosäurebrücke miteinander
verbunden werden, was zu einem einkettigen Polypeptid führt.
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Antikörperfragmente,
die spezifische Epitope erkennen, lassen sich mit bekannten Techniken
erzeugen. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, aber nicht ausschließlich, die
F(ab')2-Fragmente,
welche sich mittels Pepsinverdau des Antikörpermoleküls gewinnen lassen sowie die
Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Dislfidbrücken der F(ab')2-Fragmente
erzeugt werden können.
Alternativ können
Fab-Expressionsbibliotheken erstellt werden (Huse et al., 1989,
Science, 245: 1275–1281),
damit monoklonale Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität schnell
und leicht identifiziert werden können.
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Umgekehrt
können
Antikörper
gegen NHP eingesetzt werden, um unter Einsatz von dem Fachmann bekannten
Techniken antiidiotypische Antikörper
zu erzeugen, welche ein gegebenes NHP "nachahmen". (Siehe z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASEB
J 7(5): 437–444
und Nissinoff 1991, J. Immunol. 147(8): 2429–2438). Beispielsweise können Antikörper, die
an eine NHP-Domäne
binden und die Bindung von NHP an seinen angestammten Rezeptor/Liganden
kompetitiv hemmen, dazu verwendet werden, um Antiidiotypen zu erzeugen, welche
das NHP "imitieren" und daher an einen
Rezeptor, Cofaktor, Liganden oder Bindungspartner binden und ihn
aktivieren oder neutralisiseren. Solche antiidiotypischen Antikörper oder
Fab-Fragmente von solchen Antiidiotypen lassen sich in therapeutischen
Diäten
einsetzen, wo ein NHP-vermittelter Stoffwechselweg eine Rolle spielt.
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Die
vorliegende Erfindung wird in ihrem Umfang durch die hier beschriebenen
speziellen Ausführungsformen
nicht eingeschränkt,
welche als einzelne Veranschaulichungen von individuellen Aspekten
der Erfindung gedacht sind und funktionell gleichwertige Verfahren
und Komponenten liegen im Umfang der Erfindung. Verschieden Abwandlungen
der Erfindung zusätzlich
zu den hier gezeigten und beschriebenen liegen für den Fachmann aus der vorigen
Beschreibung auf der Hand. Solche Abwandlungen sollen mit in den
Schutzbereich der anhängenden
Ansprüche
fallen. Alle angeführten
Veröffentlichungen,
Patente und Patentanmeldungen werden hiermit vollständig als
Referenz eingeführt.
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