DE60122389T2

DE60122389T2 - Polynukleotide die für humane meltrin beta (adam19) metalloendopeptidasen kodieren

Info

Publication number: DE60122389T2
Application number: DE60122389T
Authority: DE
Inventors: Wade D. Spring WALKE; L. Nathaniel Texas WILGANOWSKI; Johan Carl The Woodlands FRIDDLE
Original assignee: Lexicon Genetics Inc
Current assignee: Lexicon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-11-01
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2021-10-31
Also published as: AU3087502A; ATE336571T1; DE60122389D1; US20020161214A1; US20050049409A1; CA2427828A1; EP1390477A2; AU2002230875B2; WO2002036759A3; JP2004531211A; WO2002036759A2; EP1390477B1

Description

1. EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und Charakterisierung von neuen humanen Polynucleotiden, welche Proteine codieren, die Sequenzähnlichkeit mit homologen Meltrin-beta/ADAM 19-Metalloproteasen des Menschen aufweisen. Die Erfindung umfasst die beschriebenen Polynucleotide, die Expressionssysteme der Wirtszellen, die codierten Proteine, Fusionsproteine, Polypeptide und Peptide, die Antikörper für die codierten Proteine und Peptide und gentechnisch behandelte nicht humane Tiere, denen die offenbarten Sequenzen fehlen oder die sie überexprimieren, Antagonisten und Agonisten der Proteine sowie andere Verbindungen, welche die Expression oder Aktivität der von den offenbarten Polynucleotiden codierten Proteine modulieren, die für die Diagnose, das Screening von Arzneimitteln, die Überwachung von klinischen Tests, die Behandlung von Krankheiten und Störungen sowie für kosmetische oder Neutriceutical-Anwendungen eingesetzt werden können.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteasen spalten Proteinsubstrate als Teil des Abbaus, der Reifung und der sekretorischen Stoffwechselwege im Körper. Proteasen sind u.a. mit der Steuerung des Wachstums, Diabetes, Fettsucht, Unfruchtbarkeit, der Modulation des Zellvorgangs und mit Infektionskrankheiten in Zusammenhang gebracht worden.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entdeckung, Identifizierung und Charakterisierung von neue menschliche Proteine codierenden Nucleotiden sowie die entsprechenden Aminosäuresequenzen dieser Proteine. Die hier zum ersten Mal beschriebenen neuen humanen Proteine (NHPs) teilen eine strukturelle Ähnlichkeit mit tierischen Proteasen und insbesondere mit Metalloproteasen und Disintegrinen wie Meltrin-beta und ADAM 19.
Die hier beschriebenen neuen humanen Nucleinsäuresequenzen (cDNA) codieren Proteine/offene Leseraster (ORFs) von einer Länge von 926, 918, 963 und 955 Aminosäuren (siehe die SEQ ID NOs 2, 4, 6 bzw. 8).
Die Erfindung umfasst auch Agonisten und Antagonisten der beschriebenen NHPs, einschließlich kleiner Moleküle. großer Moleküle, Mutanten-NHPs oder Abschnitte derselben, die mit einem nativen NHP konkurrieren, Peptide und Antikörper sowie Nucleotidsequenzen, die dazu verwendet werden können, die Expression der beschriebenen NHPs zu hemmen (z.B. Antisense- und Ribozym-Moleküle, sowie offene Leseraster oder regulatorische Konstrukte zum Genaustausch) oder die Expression der beschriebenen NHP-Sequenzen zu erhöhen (z.B. Expressionskonstrukte, welche die beschriebene Sequenz unter die Kontrolle eines starken Promotorsystems stellen) sowie nicht humane transgene Tiere, welche NHP-Transgene exprimieren oder "Knock-Outs" (die bedingt sein können), die kein funktionales NHP exprimieren. KO-Mäuse lassen sich auf verschiedenen Wegen gewinnen, von denen einer den Einsatz von embryonalen Stammzelllinien ("ES-Zellen") der Maus betrifft, welche in einem Mäusehomologen von mindestens einem der beschriebenen NHPs Gene-trap-Mutationen enthalten. Werden die in den SEQ ID NOs: 1–9 beschriebenen einzigartigen NHP-Sequenzen einem "Knock-out" unterzogen, liefern sie sowohl ein Verfahren zur Identifizierung einer phänotypischen Expression des besonderen Gens als auch ein Verfahren zur Bestimmung der Funktion von zuvor unbekannten Genen. Darüber hinaus bilden nicht humane Tiere, in welchen die in den SEQ ID NOs: 1–9 beschriebenen einzigartigen NHP-Sequenzen einem "Knock-out" unterzogen worden waren, eine einzigartige Quelle, in welcher Antikörper gegen homologe und orthologe Proteine gebildet werden, die zuvor von dem Immunsystem nicht als "körpereigen" angesehen worden wären und daher keine signifikanten Antikörper-Reaktionen ausgelöst hätten. ES-Zellen sind in Mäusehomologen der beschriebenen NHPs erzeugt worden.
Zusätzlich sind die in den SEQ ID NOs 1–9 beschriebenen einzigartigen NHP-Sequenzen zur Identifizierung einer Protein codierenden Sequenz und zu Kartierung eines einzigartigen Gens auf einem besonderen Chromosom von Nutzen (das Gen, welches die beschriebenen NHPs codiert wird offensichtlich auf dem Chromosom 5 des menschen codiert, siehe GENBANK-Hinterlegungs-Nr. AC008676). Diese Sequenzen identifizieren aktuelle, biochemisch relevante Exon-Spleiß-Verknüpfungen im Gegensatz zu denjenigen, die bioinformatorisch aus der Genom-Sequenz allein vorausgesagt worden wären. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch als zusätzliche DNA-Marker für die Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse (RFLP) sowie in der forensischen Biologie von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche modulieren, d.h. als Agonisten oder Antagonisten der NHP-Expression und/oder der Aktivität des NHP-Produkts fungieren, welche gereinigte Präparationen der beschriebenen NHPs und/oder NHP-Produkte verwenden, oder Zellen welche sie exprimieren. Solche Verbindungen können als Therapeutika für die jeweilige Behandlung eines Symptoms aus der weiten Bandbreite von Symptomen, die mit biologischen Erkrankungen oder Unausgewogenheiten einhergehen eingesetzt werden.
4. BESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS UND DER FIGUREN
Das Sequenzprotokoll zeigt die Sequenzen von einigen NHP-ORFs, welche die beschriebenen NHP-Aminosäuresequenzen codieren. SEQ ID NO: 9 gibt ein NHP-ORF sowie flankierende Sequenzen wieder.
5. GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hier zum ersten Mal beschriebenen NHP-Sequenzen sind neuartige Proteine, welche u.a. in menschlichen Zelllinien, Fötushirn des Menschen, Hirn, Hypophyse, Kleinhirn, Rückenmark, Thymus, Milz, Lymphknoten, Knochenmark, Luftröhre, Lunge, Niere, fötaler Leber, Leber, Prostata, Hoden, Schilddrüse, Nebenniere, Pankreas, Speicheldrüse, Magen, Dünndarm, Skelettmuskel, Herz, Uterus, Plazenta, Milchdrüse, Haut, Fett, Speiseröhre, Blase, Hals, Rektum, Hypothalamus, Eierstock, Fötusniere, Gallenblase, Zunge, Karzinomzellen, Nabelvene, Endothel und fötalen Lungenzellen exprimiert werden können.
Die beschriebenen Sequenzen wurden aus cDNA-Klonen, Genomsequenzen und von cDNAs gewonnen, die von MRNAs von menschlichen Lymphknoten, der Schilddrüse, von fötalem Hirn, von Knochenmark, der Luftröhre der Niere und der Milchdrüse stammen (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD und Clontech, Palo Alto, CA). Die vorliegende Erfindung umfasst die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotide, solche Nucleotide exprimierende Wirtszellen, die Expressionsprodukte solcher Nucleotide und: (a) Nucleotide, welche die Säugerhomologe der beschriebenen Gene einschließlich der speziell beschriebenen NHPs und die NHP-Produkte codieren; (b) Nucleotide, die einen oder mehr den funktionellen Domänen entsprechende Abschnitte eines NHP codieren, sowie die durch solche Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber nicht ausschließlich, der neuen Abschnitte jeder aktiven Domäne(n); (c) isolierte Nucleotide, die gentechnisch veränderte oder natürlich vorkommende Mutantenversionen der beschriebenen NHPs codieren, in welcher alle oder ein Teil von zumindest einer Domäne zerstört oder verändert ist sowie die durch solche Nucleotidsequenzen spezifizierten Polypeptidprodukte einschließlich, aber nicht ausschließlich, der löslichen Proteine und Peptide, in welchen die gesamte oder ein Teil der Signalsequenz zerstört ist; (d) Nucleotide, die chimäre Fusionsproteine codieren, welche den gesamten oder einen Teil eines codierenden Abschnitts eines NHP oder eine seiner Domänen enthalten (z.B. eine Rezeptor- oder Liganden-Bindungsdomäne, akzessorische Protein/Selbstassoziierungs-Domäne, usw.), welche an ein anderes Peptid oder Polypeptid fusioniert sind oder (e) therapeutische oder diagnostische Derivate der beschriebenen Polynucleotide wie z.B. Oligonucleotide, Antisense-Polynucleotide, Ribozyme, dsRNA oder gentherapeutische Konstrukte mit einer Sequenz, die zum ersten Mal im Sequenzprotokoll offenbart wird.
Wie oben beschrieben, umfasst die vorliegende Erfindung: (a) die im Sequenzprotokoll angegebenen humanen DNS-Sequenzen (und diese enthaltende Vektoren) und befasst sich zusätzlich mit jeder Nucleotidsequenz, welche ein benachbartes offenes Leseraster (ORF) oder eine zum ersten Mal im Sequenzprotokoll beschriebene benachbarte Exon-Spleißverbindung codiert, das an eine im Sequenzprotokoll angegebene komplementäre DNA-Sequenz unter hoch stringenten Bedingungen hybridisiert, z.B. Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO₄, 75 Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel F. M. et al., Hrg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Band X, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York auf Seite 2.10.3), und ein funktionell äquivalentes Genprodukt kodiert. Zusätzlich befasst sich die Erfindung mit jeder Nucleotidsequenz, die an die komplementäre DNA-Sequenz hybridisiert, welche eine im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäuresequenz unter mäßig stringenten Bedingungen, z.B. Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, supra), codiert und exprimiert und immer noch ein ein funktionell äquivalentes NHP-Produkt codiert. Funktionelle Äquivalente eines NHP umfassen in anderen Arten enthaltene natürlich vorkommende NHPs sowie mutante NHPs, unabhängig davon, ob sie natürlich vorkommen oder gentechnisch verändert wurden (durch zielgerichtete Mutagenese, Gen-shuffling, gerichtete Evolution, wie z.B. im US-Patent 5,837,458 beschrieben). Die Erfindung umfasst auch degenerierte Nucleinsäurevarianten der offenbarten NHP-Polynucleotidsequenzen.
Zusätzlich befasst sich die Erfindung mit ein NHP-ORF codierenden Polynucleotiden oder dessen funktionellen Äquivalenten, die von Polynucleotidsequenzen codiert werden, welche eine etwa 99-, 95-, 90- oder 85-prozentige Ähnlichkeit oder Identität mit entsprechenden Abschnitten der Nucleotidsequenzen des Sequenzprotokolls aufweisen (ermittelt mit der BLAST-Sequenz-Vergleichsanalyse unter Verwendung von z.B. dem GCG-Sequenzanalyse-Programmpaket mit standardmäßig eingestellten Mängeln).
Die Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle, vorzugsweise DNA-Moleküle, die an die beschriebenen Nucleotidsequenzen des NHP-Gens hybridisieren und daher komplementär zu letzteren sind. Solche Hybridisierungsbedingungen können, wie oben beschrieben, hoch stringent oder weniger hoch stringent sein. In Fällen, wo die Nucleinsäuremoleküle Desoxyoligonucleotide ("DNA-Oligos") sind, sind solche Moleküle im Allgemeinen ca. 16 bis ca. 100 Basen lang oder ca. 20 bis ca. 80 oder ca. 34 bis ca. 45 Basen lang oder jede Variation oder Kombination von darin vorkommenden Größen, die einen im Sequenzprotokoll zuerst offenbarten benachbarten Sequenzabschnitt enthalten. Solche Oligonucleotide können zusammen mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) dazu verwendet werden, Büchereien zu durchsuchen, Clone zu isolieren und Klonierungs- und Sequenzierungsmatrizen herzustellen usw.
Alternativ können solche NHP-Oligonucleotide als Hybridisierungssonden zum Durchsuchen von Büchereien und zum Bewerten von Genexpressionsmustern verwendet werden (besonders unter Verwendung eines Mikroarray- oder "Chip"-Formats mit hohem Durchsatz). Zusätzlich kann eine Reihe der beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen oder deren komplementäre Sequenzen verwendet werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen NHP-Sequenzen wiederzugeben. Eine in mindestens einem Teil der Sequenz-SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen kann zusammen mit einem Matrix/Substrat-Feststoffträger (Harze, Kügelchen, Membranen, Kunststoffe, Polymere, Metall- oder metallisierte Substrate, kristalline oder polykristalline Substrate, usw.) als eine Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Von besonderer Bedeutung sind räumliche ansteuerbare Arrays (d.h. Genchips, Mikrotiterplatten, usw.) von Oligonucleotiden und Polynucleotiden oder entsprechenden Oligonucleotiden und Polynucleotiden, wobei mindestens eines der auf dem räumlichen ansteuerbaren Array vorkommenden Biopolymere eine Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenz, die zuerst in mindestens einer der Sequenzen SEQ ID NOs 1–9 offenbart wurde oder eine von diesen codierte Aminosäuresequenz. aufweist. Verfahren zur Anheftung von Biopolymeren a oder zur Synthese von Biopolymeren auf Festkörpermatrizes und die Durchführung von Bindungsstudien darauf werden u.a. in den US-Patenten 5,700,637, 5,556,752, 5,744,305, 4,631,211, 5,445,934, 5,252,743, 4,713,326, 5,424,186, und 4,689,405 beschrieben.
Ansteuerbare Assays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen lassen sich einsetzen, um die zeit- und gewebsspezifische Expression eines Gens zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese ansteuerbaren Arrays enthalten genügend lange Oligonucleotidsequenzen, um die erforderliche Spezifität zu verleihen, liegen aber noch innerhalb der durch die Produktionstechnologie bestimmten Grenzen. Die Länge dieser Sonden liegt im Bereich von etwa 8 bis etwa 2000 Nucleotide. Die Sonden bestehen vorzugsweise aus 60 Nucleotiden und mehr bevorzugt aus 25 Nucleotiden der zuerst in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen.
Beispielsweise kann eine Reihe der beschriebenen Oligonucleotidsequenzen oder komplementären Sequenzen davon in einem Chip-Format verwendet werden, um alle oder einen Teil der beschriebenen Sequenzen zu repräsentieren. Die Oligonucleotide, typischerweise mit einer Länge zwischen etwa 16 bis etwa 40 (oder jeder ganzen Zahl im angegebenen Bereich) Oligonucleotiden können teilweise miteinander überlappen und/oder die Sequenz kann durch Oligonucleotide repräsentiert sein, die nicht überlappen. Dementsprechend sollen die beschriebenen Polynucleotidsequenzen typischerweise mindestens zwei oder drei unterschiedliche Oligonucleotidsequenzen mit einer Länge von mindestens ca. 8 Nucleotiden umfassen, von denen jede zuerst in dem beschriebenen Sequenzprotokoll offenbart wurde. Derartige Oligonucleotidsequenzen können an jedem in einer Sequenz im Sequenzprotokoll vorkommenden Nucleotid beginnen und entweder in Sense-Richtung (5' zu 3') gegenüber der beschriebenen Sequenz oder in Antisense-Richtung fortschreiten.
Mit auf Mikroarrays basierender Analyse lässt sich eine weite Bandbreite genetischer Aktivität aufklären, welche zu einem neuen Verständnis der Genfunktionen führt und eine neue und unerwartete Einsicht in die Transkriptionsprozesse und biologischen Mechanismen schafft. Der Einsatz von ansteuerbaren Arrays mit zuerst in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen liefert eine genaue Information über Transkriptionsänderungen, die bei einem spezifischen Stoffwechselweg eine Rolle spielt und möglicherweise zur Identifizierung neuer Komponenten oder Genfunktionen führt, die sich selbst als neue Phänotypen erweisen.
Sonden, die aus den zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen bestehen lassen sich auch bei der Identifizierung, Selektion und Validität von neuen molekularen Zielen für die Entdeckung von Arzneimitteln verwenden. Mit dem Einsatz dieser einzigartigen Sequenzen kann man Ziele von Arzneimitteln und von Arzneimitteln abhängige Veränderungen bei der Genexpression direkt feststellen, die über Stoffwechselwege moduliert werden, welche sich von dem für das Arzneimittel beabsichtigten Ziel unterscheiden. Diese einzigartigen Sequenzen kommen daher bei der Abgrenzung und Überwachung von sowohl der Arzneimittelwirkung als auch der Toxizität zum Einsatz.
Als Beispiel für einen Einsatz können die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen in Mikroarrays oder anderen Assay-Formaten zum Screening von Sammlungen von Genmaterial aus Patienten mit besonderem medizinischem Befinden verwendet werden. Diese Untersuchungen können auch unter Verwendung der zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen in silico durchgeführt werden und indem zuvor gesammelte genetische Datenbanken und die offenbarten Sequenzen unter Einsatz von dem Fachmann bekannter Computer-Software verglichen werden.
Somit lassen sich die zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarten Sequenzen einsetzen, um mit einer besonderen Krankheit einhergehende Mutationen zu identifizieren und auch als ein diagnostischer oder prognostischer Assay.
Obwohl die hier beschriebenen Sequenzen speziell unter Verwendung der Nucleotidsequenz beschrieben wurden, sollte beachtet werden, dass jede der Sequenzen einzeln beschrieben werden kann, indem jedes aus breiten Spektrum der verschiedenen zusätzlichen strukturellen Attribute oder Kombinationen derselben herangezogen wird. Beispielsweise lässt sich eine gegebene Sequenz durch die Nettozusammensetzung der in einem gegebenen Abschnitt der Sequenz vorkommenden Nucleotide zusammen mit dem Vorkommen einer oder mehrerer zum ersten Mal in den SEQ ID NOs 1–9 offenbarter spezifischer Oligonucleotidsequenzen beschreiben. Alternativ können eine Restriktionskarte, welche die relativen Positionen der Stellen für einen Verdau mit Restriktionsendonucleasen genau angibt, oder verschiedene Palindrome oder andere spezifische Oligonucleotidsequenzen verwendet werden, um eine gegebene Sequenz strukturell zu beschreiben. Solche Restriktionskarten, welche typischerweise von in breitem Umfang zur Verfügung stehenden Computerprogramman (z.B. das GCG-Sequenzanalysepaket der Universität von Wisconsin SEQUENCHER 3.0, Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, usw.) erstellt werden, können wahlweise zusammen mit einer oder mehreren diskreten in der Sequenz vorkommenden Nucleotidsequenzen verwendet werden, die sich durch die relative Position der Sequenz relativ zu einer oder mehreren zusätzlichen Sequenzen oder einem oder mehreren in der offenbarten Sequenz vorkommenden Restriktionsstellen beschreiben lassen.
Für Oligonucleotidsonden kommen hoch stringente Bedingungen in Betracht, z.B. Waschen in 6 × SSC/0,06% Natriumpyrophosphat bei 37°C (für Oligos von 14 Basen), bei 48°C (für Oligos von 17 Basen), bei 55°C (für Oligos von 20 Basen) und bei 60°C (für Oligos von 23 Basen). Diese Nucleinsäuremoleküle können Antisensemoleküle der NHP-Sequenz codieren oder als solche fungieren, welche z.B. für eine Regulierung der NHP-Sequenz brauchbar sind (für und/oder als Antisense-Primer in Amplifizierungsreaktionen von Nucleinsäuresequenzen des NHP). Bezüglich der Regulierung der NHP-Sequenz können solche Techniken eingesetzt werden, um biologische Funktionen zu regulieren. Ferner können solche Sequenzen als Teil eines Ribozyms und/oder als Tripelhelixsequenzen verwendet werden, welche ebenfalls für die Regulierung der NHP-Sequenz brauchbar sind.
Inhibitorische Antisense- oder Doppelstrang-Oligonucleotide können zusätzlich mindestens einen modifizierten Basenrest aufweisen, der ausgewählt ist, jedoch nicht ausschließlich, aus der Gruppe 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-Carboxymethylamino-methyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-isopentenyladenin, 1-Metnylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, S-Methycytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil. beta-D-Mannosylqueosin, 5'-ethoxycarboxymethyluracil.
5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, .(acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Die Antisense-Oligonucleotide können auch mindestens einen modifizierten Zuckerrest enthalten, ausgewählt, aber nicht ausschließlich, aus der Gruppe Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die Antisense-Oligonucleotide ein Rückgrat mit mindestens einem modifizierten Phosphat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester und einem Formacetal oder einem Analogen davon.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Oligonucleotid ein α-anomeres Oligonucleotid. Ein α-anomeres Oligonucleotid bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride, in welchen im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625–6641). Das Oligonucleotid ist ein 2'-0-Methylribonucleotid (Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analoges (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327–330). Alternativ kann doppelsträngige RNA verwendet werden, um die Expression und Funktion eines Ziel-NHP zu unterbrechen.
Die Oligonucleotide der Erfindung lassen sich nach im Stand der Technik bekannten Standardverfahren synthetisieren, z.B. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers (wie er im Handel von Biosearch, Applied Biosystems usw. bezogen werden kann). Beispielsweise können Phosphorthioat-Oligonucleotide nach dem Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids res. 16: 3209) synthetisiert werden und Methylphosphonat-Oligonucleotide lassen sich unter Verwendung von Polymerträgern des Typs Controlled Pore Glass herstellen (Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448–7451), usw.
Niedrig stringente Bedingungen sind dem Fachmann gut bekannt und variieren in voraussagbarer Weise je nach den speziellen Organismen, von welchen die Bücherei und die markierten Sequenzen stammen. Für eine Anleitung zur Schaffung solcher Bedingungen siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (and periodic Updates thereof), Cold Springs Harbor Press, N. Y.; sowie Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y.
Alternativ können geeignete markierte NHP-Nucleotidsonden eingesetzt werden, um eine humane Genombibliothek unter Einsatz von ausreichend stringenten Bedingungen oder mittels PCR zu durchsuchen. Die Identifizierung und Charakterisierung von menschlichen Genomklonen ist zur Identifizierung von Polymorphismus hilfreich (einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von Nucleotid-Repeats, Mikrosatelliten-Allelen, Einzelnucleotid-Polymorphismus oder codierender Einzelnucleotid-Polymorphismus), zur Ermittlung der Genomstruktur eines gegebenen Locus/Allels und zur Planung diagnostischer Tests. Beispielsweise lassen sich Sequenzen, die von Abschnitten abstammen, welche den Intron/Exon-Grenzen des Humangens benachbart sind, zur Entwicklung von Primern für die Verwendung in Amplifikationsassays einsetzen, um in den Exons, Introns, Spleißorten (z.B. an der Spleißakzeptor- und/oder Donorstelle) Mutationen aufzuspüren usw., welche in der Diagnose und Pharmakogenetik zum Einsatz kommen können.
Die vorliegenden Sequenzen können z.B. in der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verwendet werden, um spezifische Individuen zu identifizieren. In dieser Technik wird die Genom-DNA eines Individuums mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen verdaut und auf einem Southern-Blot sondiert, um eigenheitliche Bande zur Identifizierung zu erhalten (wie dies allgemein in dem US-Patent 5,272,057 beschrieben wird, welches hiermit als Referenz eingeführt wird). Darüber hinaus lassen sich die Sequenzen der vorliegenden Erfindung einsetzen, um Reagenzien aus Polypeptiden zur Verfügung zu stellen, z.B. Primer für die PCR, die auf spezifische Orte im menschlichen Genom zielen, welche die Verlässlichkeit von forensischen Identifizierungen erhöhen, indem sie z.B. einen anderen "Marker zur Identifizierung" zur Verfügung stellen (d.h. eine andere DNA-Sequenz, die für ein besonderes Individuum einmalig ist). Eine aktuelle Information über die Basensequenz kann zur Identifizierung als eine richtige Alternative zu Mustern benutzt werden, die durch von Restriktionsenzymen erzeugte Fragmente gebildet werden.
Ferner lässt sich ein NHP-Homologes aus Nucleinsäuren von einem in Frage kommenden Organismus isolieren, indem eine PCR durchgeführt wird, in welcher zwei degenerierte oder "Wobble" Oligonucleotidprimer-Pools verwendet werden, die auf Grundlage der Aminosäuresequenzen in den hier offenbarten NHP-Produkten entworfen wurden. Die Matrize für die Reaktion kann Gesamt-RNA, mRNA und/oder cDNA sein, welche durch reverse Transcription von mRNA erhalten wurde, welche z.B. aus humanen oder nicht humanen Zelllinien oder von Gewebe erhalten wurde, von dem angenommen wird, dass es ein Allel einer NHP-Sequenz exprimiert. Das PCR-Produkt kann subcloniert und sequenziert werden, um sicher zu gehen, dass die amplifizierten Sequenzen die Sequenz des gewünschten NHP-Gens darstellen. Das PCR-Fragment kann sodann verwendet werden, um mit verschiedenen Methoden einen cDNA-Klon mit voller Länge zu isolieren. Beispielsweise kann das amplifizierte Fragment markiert und dazu verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek wie z.B. eine Bakteriophagen-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen. Alternativ kann das markierte Fragment dazu verwendet werden, über das Durchsuchen einer Genombibliothek genomische Klone zu isolieren.
Die PCR-Technologie lässt sich auch zur Isolierung einer cDNA-Sequenz in vollständiger Länge einsetzen. Beispielsweise kann RNA aus einer geeigneten Quelle aus Zellen oder Gewebe nach Standardverfahren isoliert werden (d.h. aus einer Quelle wie z.B. Hodengewebe, von der man weiß oder annimmt, dass sie eine NHP-Sequenz exprimiert). An der RNA wird eine Reaktion mit reverser Transkriptase (RT) durchgeführt, wobei ein Oligonucleotid-Primer verwendet wird, der für die meisten 5'-Enden des amplifizierten Fragments für das Priming der Synthese des ersten Strangs spezifisch ist. Das erhaltene RNA/DNA-Hybrid kann dann "zurechtgestutzt" werden, indem man eine Standardreaktion mit terminaler Transferase verwendet, das Hybrid kann mit RNase verdaut werden und die Synthese des zweiten Strangs kann dann mit einem komplementären Primer geprimt werden. Somit lassen sich cDNA-Sequenzen stromauf zum amplifizierten Fragment isolieren. Für einen Überblick über die Klonierungsstrategien, die eingesetzt werden können, siehe Sambrook et al., 1989, supra.
Durch Einsatz der PCR kann z.B. eine mutierte NHP-Sequenz codierende cDNA isoliert werden. In diesem Falle kann der erste cDNA-Strang synthetisiert werden, indem ein Oligo-dT-Oligonucleotid an eine mRNA anhybridisiert wird, welche aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es in einem Individuum exprimiert wird, welches vermeintlich ein mutiertes NHP-Allel trägt, und indem der neue Strang mit reverser Transkriptase verlängert wird. Der zweite Strang der cDNA wird sodann synthetisiert, indem ein Oligonucleotid eingesetzt wird, welches spezifisch an das 5'-Ende des normalen Gens hybridisiert. Unter Einsatz dieser beiden Primer wird das Produkt sodann mit der PCR amplifiziert, wahlweise in einen geeigneten Vektor cloniert und mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des mutierten NHP-Allels mit der eines entsprechenden normalen NHP-Allels kann (können) die Mutation(en) ermittelt werden, die für den Verlust oder die Änderung der Funktion des mutierten NHP-Genprodukts verantwortlich sind.
Alternativ lässt sich eine Genombibliothek aufbauen, indem eine DNA eingesetzt wird, die aus einem Individuum gewonnen wurde, von dem angenommen wird oder bekannt ist, dass es ein mutiertes NHP-Allel trägt (z.B. eine Person, die einen auf NHP zurückzuführenden Phänotyp aufweist, wie z.B. Fettsucht, hoher Blutdruck, Arthritis, Bindgewebskrankheiten, Unfruchtbarkeit usw.), oder es lässt sich eine cDNA-Bibliothek aufbauen, indem RNA aus einem Gewebe eingesetzt wird, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel exprimiert. Eine normale NHP-Sequenz oder ein geeignetes Fragment davon kann sodann markiert werden und als Sonde zur Identifizierung des entsprechenden mitierten NHP-Allels in solchen Büchereien eingesetzt werden. Klone mit mutierten NHP-Sequenzen können sodann gereinigt und nach dem Fachmann bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse unterzogen werden.
Zusätzlich kann eine Expressionsbücherei aufgebaut werden, indem cDNA eingesetzt wird, welche z.B. aus RNA synthetisiert wurde, die aus einem Gewebe isoliert wurde, von dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es ein mutiertes NHP-Allel exprimiert in einem Individuum, von dem angenommen wird oder bekannt ist, dass es solch ein mutiertes Allel trägt. Auf diese Weise können aus dem vermeintlich mutierten Gewebe gewonnene Genprodukte exprimiert und unter Verwendung von standardisierten Antikörper-Screeningtechniken zusammen mit, wie unten beschrieben, gegen ein normales NHP-Produkt gerichteten Antikörpern gescreent werden. (Zu Screeningtechniken siehe z.B: Harlow, E. und Lane, Hrg., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor).
Zusätzlich kann das Screening erfolgen, indem markierte NHP-Fusionsproteine wie z.B. alkalische Phosphatase-NHP oder alkalische NHP-Phosphatase-Fusionsproteine gescreent werden. In Fällen, wo eine Mutation der NHP zu einem Genprodukt mit veränderter Funktion führt (z.B. als Ergebnis einer Missense-Mutation oder einer Mutation in Folge einer Rasterverschiebung), gehen gegen NHP gerichtete polyklonale Antikörper wahrscheinlich mit einem entsprechenden mutierten NHP-Sequenzprodukt eine Kreuzreaktion ein. Klone aus Büchereien, die über ihre Reaktion mit solchen markierten Antikörpern aufgefunden wurden können gereinigt und nach im Stand der Technik bekannten Verfahren einer Sequenzanalyse unterzogen werden.
Die Erfindung umfasst auch (a) DNA-Vektoren, die jede der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen und/oder der komplementären (d.h. Antisense-) Sequenzen enthalten; (b) DNA-Expressionsvektoren, die jede der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, welches die Expression der codierenden Sequenzen lenkt (z.B. ein Baculo-Virus, wie es im US-Patent 5,869,336 beschrieben wird, welches hiermit als Referenz eingeführt wird); (c) gentechnisch bearbeitete Wirtszellen, die jede der vorgenannten NHP codierenden Sequenzen enthalten, die mit einem regulatorischen Element assoziiert sind, welches die Expression der codierenden Sequenzen in der Wirtszelle lenkt und (d) gentechnisch veränderte Wirtszellen, die eine endogene NHP-Sequenz unter der Kontrolle eines exogen eingeführten regulatorischen Elements (d.h. Genaktivierung) exprimieren. Unter dem hier verwendeten Begriff regulatorische Elemente werden, jedoch nicht ausschließlich, induzierbare und nicht induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere dem Fachmann bekannte Elemente verstanden, welche die Expression steuern und kontrollieren. Solche regulatorischen Elemente sind, jedoch nicht ausschließlich, das unmittelbar frühe Gen des humanen Cytomegalovirus (hCMV), regulierbare virale Elemente (insbesondere LTR-Promotoren von Retroviren), die frühen oder späten Promotoren des SV40-Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, die hauptsächlichen Operator- und Promotorabschnitte des Lambdaphagen, die Kontrollabschnitte des fd-Kapsidproteins, die Promotoren der sauren Phosphatase sowie die Promotoren der Alpha Mating Faktoren aus Hefe.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Antikörper und antiidiotypische Antikörper (einschließlich Fab-Fragmente), Antagonisten und Agonisten der NHP sowie Verbindungen oder Nucleotidkonstrukte, welche die Expression einer NHP-Sequenz inhibieren (Inhibitoren des Transskriptionsfaktors, Antisense- und Ribozymmoleküle oder eine Sequenz mit offenem Lesetraster oder Konstrukte für den Ersatz einer regulatorischen Sequenz) oder die Expression eines NHP begünstigen (z.B. Expressionskonstrukte, in denen die NHP codierende Sequenz operativ an die Expression von Kontrollelementen wie z.B. Promotoren, Promotoren/Enhancern usw. gekoppelt ist).
Die NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen, -Antikörper, -Antagonisten und -Agonisten können für den Nachweis von mutierten NHPs oder unvollständig exprimierten NHPs für die Diagnose von Krankheiten nützlich sein. Die NHPs oder NHP-Peptide, NHP-Fusionsproteine, NHP-Nucleotidsequenzen, Wirtszellexpressionssysteme, Antikörper, Antagonisten, Agonisten und gentechnisch bearbeiteten Zellen und Tiere können zum Screening nach Arzneimitteln verwendet werden (oder zum Screening von kombinatorischen Büchereien mit großem Durchsatz), welche für die Behandlung der symptomatischen oder phänotypischen Symptome einer Störung der normalen Funktion von NHP im Körper wirksam sind. Die Verwendung von gentechnisch veränderten Wirtszellen und/oder Tieren kann insofern einen Vorteil bieten, als solche Systeme nicht nur die Identifizierung von Verbindungen berücksichtigen, die an einen endogenen Rezeptor für NHP binden, sondern auch Verbindungen identifizieren, die NHP vermittelte Aktivitäten oder Stoffwechselwege auslösen.
Schließlich können die NHP-Produkte als Therapeutika Verwendung finden. Beispielsweise können lösliche Derivate wie z.B. einem NHP entsprechende NHP- Peptide/Domänen, Proteinprodukte einer Fusion mit NHP (insbesondere NHP-IG-Fusionsproteine, d.h. Fusionen eines NHP oder einer Domäne eines NHP an ein IgFc), NHP-Antikörper oder antiidiotypische Antikörper (einschließlich Fab-Fragmente), Antagonisten oder Agonisten (einschließlich Verbindungen, welche in einem NHP vermittelten Stoffwechselweg modulieren oder auf stromab gelegene Ziele einwirken) zur direkten Behandlung von Krankheiten oder Störungen eingesetzt werden. Beispielsweise könnte die Verabreichung einer wirksamen Menge eines löslichen NHP oder eines NHP-IgFc-Fusionsproteins oder eines antiidiotypischen Antikörpers (oder dessen Fab), der ein NHP nachahmt, den endogenen NHP-Rezeptor aktivieren oder wirksam antagonisieren. Nucleotid-Konstrukte, die solche NHP-Produkte codieren können eingesetzt werden, um Wirtszellen zur Expression solcher Produkte in vivo gentechnisch zu behandeln; diese gentechnisch behandelten Zellen wirken im Körper als "Bioreaktoren", welche einen kontinuierlichen Strom eines NHP, eines NHP-Pepetids oder eines NHP-Fusionsproteins liefern. Nucleotidkonstrukte, die ein funktionelles NHP, mutierte NHPs sowie Antisense- und Ribozym-Moleküle codieren können auch in Ansätzen einer "Gentherapie" für die Modulation der NHP-Expression eingesetzt werden. Somit umfasst die Erfindung auch pharmazeutische Formulierungen und Verfahren zur Behandlung von biologischen Störungen.
Verschiedene Aspekte der Erfindung werden nun genauer in den folgenden Unterabschnitten beschrieben.
5.1 DIE NHP-SEQUENZEN
Die cDNA-Sequenzen und die entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen der beschriebenen NHPs sind im Sequenzprotokoll dargestellt. Die NHP-Sequenzen wurden aus humanen cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Sonden und/oder Primern erhalten, die aus einer menschlichen Genomsequenz gewonnen wurden. Eine Expressionsanalyse bewies, dass sich das beschriebene NHP in vielen menschlichen Zellen exprimieren lässt.
Es wurden verschiedene Polymorphismen identifiziert, einschließlich einem A/G-Polymorphismus an der Nucleotidposition, die z.B. durch Position 313 der SEQ ID NO: 1 wiedergegeben wird (welcher an der entsprechenden Aminosäure (aa)-Position 105 von z.B SEQ ID NO: 2 zu einem Thr oder Ala führen kann), einem A/T an der Nucleotidposition 1670 (was an der aa-Position 557 zu einem Asp oder Val führen kann), einem A/G in Position 1864 (was an der aa-Position 622 zu einem Asp oder Asn führen kann) sowie einem T/C an der Nucleotidposition 1915 (was an der aa-Position 639 zu einem Phe oder Leu führen kann).
Eine zusätzliche Anwendung der beschriebenen neuen menschlichen Polynucleotidsequenzen ist ihre Verwendung bei der molekularen Mutagenese/Evolution von Proteinen, die mindestens zum Teil von den beschriebenen neuen Sequenzen codiert werden, indem z.B. das Polynucleotid-Shuffling oder eine verwandte Methodik eingesetzt werden. Derartige Ansätze werden z.B. in den US-Patenten 5,830,721 und 5,837,458 beschrieben.
Die NHP-Gen-Produkte lassen sich auch in transgenen Tieren exprimieren. Tiere jeder Spezies, einschließlich, aber nicht ausschließlich, Würmer, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen, Schweine, Micro-Pigs, Vögel, Ziegen und nicht humane Primaten wie z.B. Paviane, Affen und Schimpansen können verwendet werden, um NHP-transgene Tiere zu erzeugen.
Es kann jede im Stand der Technik bekannte Technik eingesetzt werden, um ein NHP-Transgen in Tiere einzuführen, um die Founderlinien der transgenen Tiere zu gewinnen. Solche Techniken sind, jedoch nicht ausschließlich, die Pronucleus-Mikroinjektion (Hoppe, P. C. and Wagner, T. E., 1989, US Patent 4,873,191); der Retrovirus-vermittelte Gentransfer in Keimbahnen (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6148–6152); das Gene-Targeting in embryonale Stammzellen (Thompson et al., 1989, Cell 55: 313–321) electroporation of embryos (Lo, 1983, Mol. Cell Biol. 3: 1803–1814) und der Sperma-vermittelte Gentransfer (Lavitrano et 1989, Cell 57: 717–723) usw. Für einen Überblick über derartige Techniken siehe Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115: 171–229.
Die vorliegende Erfindung stellt sowohl transgene Tiere zur Verfügung, die in allen ihren Zellen das NHP-Transgen besitzen als auch Tiere, die das Transgen in einigen aber nicht allen ihren Zellen aufweisen, d.h. Mosaik-Tiere oder transgene Tiere mit somatischen Zellen. Das Transgen kann als einzelnes Transgen oder in Concatamere integriert sein, z.B. Kopf-Kopf-Tandems oder Kopf-Schwanz-Tandems. Das Transgen kann auch gemäß z.B. der Lehre von Lasko et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232–6236 selektiv in einen besonderen Zelltyp eingeführt und aktiviert werden. Die für eine derartige Zelltyp-spezifische Aktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen hängen von dem besonderen in Frage stehenden Zelltyp ab und sind dem Fachmann geläufig.
Wenn es erwünscht ist, dass ein NHP-Transgen in die chromosomale Stelle des endogenen NHP-Gens integriert wird, ist das Gene-Targeting bevorzugt. Kurz gesagt, wenn eine derartige Technik eingesetzt wird, werden Vektoren mit einigen zu dem endogenen NHP-Gen homologen Nucleotidsequenzen zu dem Zweck konzipiert, dass sie über eine homologe Rekombination mit chromosomalen Sequenzen in die Nucleotidsequenz des endogenen NHP-Gens integriert werden und dessen Funktion unterbinden (d.h. es werden KO-Tiere geschaffen).
Das Transgen lässt sich auch nach z.B. der Lehre von Gu et al., 1994, Science, 265: 103–106. selektiv in einen besonderen Zelltyp einführen, wobei es das endogene NHP-Gen nur in diesem Zelltyp inaktiviert. Die für eine derartige Zelltyp-spezifische Inaktivierung benötigten regulatorischen Sequenzen hängen von dem besonderen in Frage stehenden Zelltyp ab und sind dem Fachmann geläufig.
Sind transgene Tiere erst einmal erzeugt, kann die Expression des rekombinanten NHP-Gens mit Standardtechniken untersucht werden. Das anfängliche Screening kann mit einer Southern-Blot-Analyse oder mit Hilfe von PCR-Techniken erfolgen, um die Gewebe der Tiere darauf hin zu untersuchen, ob eine Integration des Transgens stattgefunden hat. Es kann auch das Ausmaß der mRNA-Expression der Transgene in den Geweben der nicht humanen transgenen Tiere ermittelt werden, indem Techniken eingesetzt werden, wie z.B. die Northern-Blot-Analyse von aus dem Tier erhaltenen Gewebeproben. die in-situ-Hybridisierungsanalyse und die RT-PCR. Proben von Gewebe, welches das NHP-Gen exprimiert, können auch immunocytochemisch mit Antikörpern ausgewertet werden, die spezifisch auf das NHP-Transgen-Produkt reagieren.
5.2 NHPS UND NHP-POLYPEPTIDE
Die NHPs, NHP-Polypeptide, NHP-Peptidfragmente, mutierten, eingekürzten oder deletierten Formen der NHPs und/oder NHP-Fusionsproteine können für verschiedene Verwendungen gewonnen werden. Diese Verwendungen sind, jedoch nicht ausschließlich, die Erzeugung von Antikörpern, als Reagenzien in diagnostischen Assays, zur Identifizierung von anderen mit einem NHP verwandten Genprodukten, als Reagenzien in Assays zum Sceening nach Verbindungen, die als pharmazeutische Reagenzien eingesetzt werden können, welche bei der Behandlung von mentalen, biologischen oder medizinischen Erkrankungen und Krankheiten von Nutzen sind. Die beschriebenen NHPs weisen eine Ähnlichkeit mit verschiedenen Proteasen auf, einschließlich aber nicht ausschließlich, Disintegrinen, ADAMs und Fertilinen.
Das Sequenzprotokoll zeigt die von den beschriebenen NHP-Polynucleotiden codierten Aminosäuresequenzen. Die NHPs weisen Initiations-Methionine in DNA-Sequenzkontexten auf, die mit Translations-Initiations-Stellen übereinstimmen und die ORFs zeigen signalähnliche Sequenzen, welche darauf hinweisen können, dass die Beschriebenen NHP-PRFs ausgeschiedene Proteine sind oder mit Membranen assoziiert sein können.
Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen für die NHPs umfassen sowohl die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen als auch Analoga und Derivate davon. Ferner werden von der Erfindung die entsprechenden NHP-Analogen aus anderen Species mit umfasst. Daher liegt jedes von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierte NHP-Protein mit im Schutzumfang der Erfindung sowie jede neue Polynucleotidsequenz, die alle oder irgend einen neuen Abschnitt einer im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenz codiert. Es ist bekannt, dass der genetische Code degeneriert ist und entsprechend steht jede im Sequenzprotokoll angegebene Aminosäure generisch für das bekannte Nucleinsäure-"Triplett"-Codon oder in vielen Fällen Codons, welche die Aminosäure codieren können. Die im Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäuresequenzen als solche sollen im Zusammenhang mit dem genetischen Code (siehe z.B. Table 4-1 auf Seite 109 von "Molecular Cell Biology", 1986, J. Darnell et al. Hrg. Scientific American Books, New York, NY, welche hiermit als Referenz eingeführt wird) generisch für alle verschiedenen Permutationen und Kombinationen von Nucleinsäure-sequenzen stehen, welche solche Aminosäuresequenzen codieren können.
Die Erfindung umfasst auch Proteine, die funktionell den von den hier beschriebenen Nucleotidsequenzen codierten NHPs äquivalent sind, beurteilt nach jeder Anzahl von Kriterien einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der Fähigkeitein ein Substrat eines NHP zu binden und zu spalten, oder der Fähigkeit, einen identischen oder komplementären stromab gelegenen Weg zu bewirken oder eine Änderung im Zellmetabolismus (z.B. proteolytische Aktivität, Ionenfluss, Phosphoryierung des Tyrosins usw.). Solche funktionell äquivalenten NHP-Proteine sind, aber nicht ausschließlich, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten in der von den oben beschriebenen NHP-Nucleotidsequenzen codierten Aminosäuresequenz, die aber zu einer stillen Änderung führen, indem sie ein funktionell äquivalentes Expressiansprodukt liefern.
Substitutionen von Aminosäuren können auf Basis einer Ähnlichkeit in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilizität und/oder der amphipatischen Natur der betroffenen Reste erfolgen. Beispielsweise sind nicht polare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin; polare neutrale Aminosäuren sind Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin; positiv geladene (basische) Aminosäuren sind Arginin, Lysin und Histidin; und negativ geladene saure Aminosäuren sind Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Es können verschiedene Wirts-Expressions-Vektorsysteme eingesetzt werden, um die NHP-Nucleotidsequenzen der Erfindung zu exprimieren. Wenn, wie im vorliegenden Fall, das NHP-Peptid oder ein NHP-Polypeptid ein lösliches oder ausgeschiedenes Molekül sein soll, kann das Peptid oder Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Derartige Expressionssysteme umfassen auch manipulierte Wirtszellen, welche in situ NHP oder funktionell gleichwertige Stoffe exprimieren. Die Reinigung oder Anreicherung eines NHP aus solchen Expressionssystemen kann erfolgen, indem geeignete Detergentien und Lipidmicellen und dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden. Es können jedoch solche gentechnisch bearbeiteten Wirtszellen selbst in Situationen eingesetzt werden, wo es wichtig ist, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des NHP zu bewahren, aber die biologische Aktivität zu beurteilen, z.B. in Screeningassays für Arzneimittel.
Die Expressionssysteme, die sich für die Zwecke der Erfindung einsetzen lassen sind, jedoch nicht ausschließlich, Mikroorganismen wie z.B. Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis), die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren aus Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert wurden; Hefe (z.B. Saccharomyces Pichia), die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden Expressionsvektoren aus Hefe transformiert wurde; Insektenzellsysteme, die mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinanten Expressionsvektoren aus Viren (z.B. Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Expressionsvektoren aus Viren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert oder mit NHP-Nucleotidsequenzen enthaltenden rekombinaten Plasmidexpressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid) transformiert wurden; oder Säugerzellsysteme (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), die rekombinante Expressions-Konstrukte beherbergen, welche von dem Säugerzellen-Genom stammende Promotoren (z.B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren stammende Promotoren (z.B. der Adenovirus-Late-Promotor; der Vacciniavirus-7,5K-Promotor) enthalten.
Aus bakteriellen Systemen lässt sich vorteilhafterweise je nach der beabsichtigten Verwendung für das zu exprimierende NHP-Produkt eine Anzahl von Expressionsvektoren auswählen. Ist beispielsweise eine große Menge eines solchen Proteins zur Erzeugung von pharmazeutischen Zusammensetzungen herzustellen, die aus NHP bestehen und/oder ein NHP enthalten, oder zur Erzeugung von Antikörpern gegen ein NHP, können Vektoren erwünscht sein, die eine große Menge an leicht zu reinigenden Fusionsproteinprodukten steuern. Solche Vektoren sind, jedoch nicht ausschließlich, der Expressionsvektor pUR278 Von E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), in welchem eine NHP-codierende Sequenz im richtigen Raster mit dem lacZ codierenden Abschnitt einzeln in den Vektor ligiert ist, so dass ein Fusionsprotein entsteht; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 251: 5503–5509); und dergl.. pGEX-Vektoren können ebenfalls eingesetzt werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und lassen sich mittels Adsorption an Gluththion-Agarose-Kügelchen gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem Glutathion leicht von lysierten Zellen reinigen. Die pGEX-Vektoren sind so beschaffen, dass sie Schnittstellen für Thrombin oder die Faktor Xa-Protease aufweisen, so dass das geklonte Zielsequenzprodukt vom GST-Rest befreit werden kann.
In einem Insektensystem wird das Autographa-Californica-Nuclear-Polyhydrosis-Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression von fremden Polynucleotidsequenzen eingesetzt. Das Virus wächst in Zellen von Spodoptera frugiperda. Eine NHP codierende Sequenz kann einzeln in nicht essentielle Abschnitte (z.B. das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z.B. des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der NHP codierenden Sequenz führt zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und der Produktion von einem nackten rekombinanten Virus (d.h. einem Virus ohne Proteinhülle, die von dem Polyhedrin-Gen codiert wird). Diese rekombinanten Viren werden sodann benutzt, um Zellen von Sodoptera frugiperda zu infizieren, in welchen die insertierte Sequenz exprimiert wird (siehe z.B. Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patent 4,215,051).
In Wirtszellen von Säugern lässt sich eine Anzahl von auf Viren beruhenden Expressionssystemen einsetzen. In den Fällen, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die in Frage stehende Nucleotidsequenz an einen Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex, z.B. die Late Promotor- und Tripartite-Leader-Sequenz des Adenovirus ligiert sein. Diese chimäre Sequenz kann sodann mittels in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Genom des Adenoviorus insertiert sein. Die Insertion in einen nicht essentiellen Abschnitt des viralen Genoms (z.B. Abschnitt E1 oder E3) führt zu einem rekombinaten Virus, das lebensfähig und in der Lage ist, in infizierten Wirten ein NHP-Produkt zu exprimieren (siehe z.B. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655–3659). Für eine wirkungsvolle Translation von insertierten NHP-Nucleotidsequenzen können auch spezifische Initiationssignale erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiationscodon und angrenzende Sequenzen. In den Fällen, wo eine ganze NHP-Sequenz oder cDNA einschließlich des eigenen Initiationscodons und der angrenzenden Sequenzen in einen passenden Expressionsvektor insertiert wird, sind keine zusätzlichen Kontrollsignale für die Translation nötig. In Fällen jedoch, wo nur ein Teil einer NHP codierenden Sequenz insertiert wird, müssen exogene Kontrollsignale für die Translation einschließlich vielleicht des ATG-Initiationscodons zur Verfügung gestellt werden. Außerdem muss das Initiationscodon in Phase mit dem Leseraster der gewünschten codierenden Sequenz sein, um eine Translation des gesamten Insertionselements sicher zu stellen. Diese exogenen Kontrollsignale für die Translation und die Initiationscodons können verschiedenen, entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Die Effizienz der Expression lässt sich durch Einbeziehung geeigneter Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminatoren usw. steigern (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516–544).
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgesucht werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert oder das Expressionsprodukt auf die gewünschte spezifische Weise modifiziert und weiterbehandelt. Solche Modifikationen (z.B. eine Glykosylierung) und Weiterbehandlungen (z.B. eine Spaltung) der Proteinprodukte können für die Funktion des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Weiterbehandlung und Modifikation von Proteinen und Expressionsprodukten auf. Es können passende Zelllinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Weiterbehandlung des exprimierten Fremdproteins sicher zu stellen. Hierfür lassen sich eukaryotische Wirtszellen einsetzen, die über die zelluläre Maschinerie für eine richtige Weiterbehandlung des Primärtranskripts, die Glykosylierung und die Phosphorylierung des Expressionsprodukts verfügen. Solche Wirtszellen von Säugern sind, jedoch nicht ausschließlich, CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK-, 293-, 3T3-, WI38- und insbesondere menschliche Zelllinien.
Für eine langzeitige Produktion rekombinanter Proteine mit hoher Ausbeute ist eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, welche die oben beschriebenen NHP-Sequenzen exprimieren, gentechnisch bearbeitet werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Ursprünge der Replikation enthalten, lassen sich Wirtszellen mit DNA transformieren, die von geeigneten Expressions-Kontrollelementen (z.B. Promotoren, Enhancer-Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.) und einem auswählbaren Marker kontrolliert werden. Nach Einführung der Fremd-DNA werden gentechnisch behandelte Zellen 1–2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen gelassen und sodann in ein selektives Medium überführt. Die auswählbaren Marker in dem rekombinanten Plasmid verleihen gegenüber einer Selektion Resistenz und bringen die Zellen dazu, das Plasmid in ihre Chromosomen stabil zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die ihrerseits geklont werden können und sich zu Zelllinien vermehren. Dieses Verfahren lässt sich vorteilhaft einsetzen, um Zelllinien gentechnisch zu verändern, welche das Genprodukt exprimieren. Solche gentechnisch bearbeiteten Zelllinien sind vorteilhaft beim Screening und der Auswertung von Verbindungen zu gebrauchen, welche die endogene Aktivität des NHP-Produkts beeinflussen.
Es kann eine Anzahl von Selektionssystemen eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich, die Thymidinkinase aus Herpes simplex (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adenosin-Phosphoribosyltransferasegene (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817), welche jeweils in tk^–-, hgprt^–- oder aprt^–-Zellen eingesetzt werden können. Auch Resistenz gegen Antimetaboliten kann für die folgenden Gene als Basis für eine Selektion verwendet werden: dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527), gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1) und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147).
Alternativ lässt sich jedes Fusionsprotein leicht reinigen, indem ein für das exprimierte Fusionsprotein spezifischer Antikörper verwendet wird. Beispielsweise lässt sich mit einem von Janknecht et al. beschriebenen System ein in menschlichen Zelllinien exprimiertes nicht denaturiertes Fusionsprotein leicht reinigen (Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–8976). In diesem System wird die betreffende Sequenz in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subcloniert, so dass das offene Leseraster translational an ein aus sechs Histidinresten bestehendes aminoendständiges Tag fusioniert wird. Die Extrakte aus mit rekombinantem Vaccinia-Virus infizierten Zellen werden auf Ni²⁺-Nitriloessigsäure-Agarose-Säulen aufgetragen und die Proteine mit freien Histidinenden selektiv mit Imidazol enthaltenden Puffern eluiert.
Von der vorliegenden Erfindung werden auch Fusionsproteine umfasst, welche das NHP zu einem Zielorgan lenken und/oder den Transport durch die Membran in das Cytosol erleichtern. Die Konjugation von NHPs an Antikörpermoleküle oder deren Fab-Fragmente könnte ausgenutzt werden, um besondere Epitope tragende Zellen an das Ziel zu bringen.
Ein Anheften der passenden Signalsequenz an das NHP würde das NHP auch an den gewünschten Ort innerhalb der Zelle transportieren. Alternativ könnte eine Zielausrichtung von NHP oder von dessen Nucleinsäuresequenz erreicht werden, indem Übertragungssysteme auf Basis von Liposomen oder Lipid-Komplexen eingesetzt werden. Derartige Technologien werden in "Liposomes: A Practical Approach", neue RRC-Ausgabe, Oxford University Press, New York und in den US-Patenten. 4,594,595, 5,459,127, 5,948,767 und 6,110,490 sowie in deren entsprechenden Offenbarungen beschrieben. Eine zusätzliche Ausführungsform stellen neue Protein-Konstrukte dar, die gentechnisch so behandelt wurden, dass sie den Transport des NHP an den Zielort oder das gewünschte Organ erleichtern, wobei sie die Zellmembran und/oder den Kern durchqueren, wo das NHP seine funktionelle Aktivität entfalten kann. Dieses Ziel kann erreicht werden, indem das NHP an ein Cytokin oder einen anderen Liganden gekoppelt wird, der für eine zielgerichtete Spezifität sorgt, und/oder an eine ein Protein transduzierende Domäne (siehe allgemein die US-Anmeldungen 60/111, 701 und 60/056,713 als Beispiele für derartige transduzierende Sequenzen), um den Durchtritt durch Zellmembranen zu erleichtern und es kann wahlweise gentechnisch so bearbeitet werden, dass es Sequenzen für eine Lokalisierung im Kern enthält.
5.3 ANTIKÖRPER GEGEN NHP-PRODUKTE
Antikörper, welche spezifisch ein oder mehr Epitope eines NHP oder Epitope von konservierten Varianten eines NHP oder Peptidfragmente eines NHP erkennen, werden ebenfalls umfasst. Solche Antikörper umfassen, jedoch nicht ausschließlich, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), humanisierte oder chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, mit einer Fab-Expressionsbücherei hergestellte Fragmente, antiidiotypische (anti-Id) Antikörper und an ein Epitop bindende Fragmente von jedem der obigen Vertreter.
Die Antikörper der Erfindung können z.B. zum Nachweis von NHP in einer biologischen Probe eingesetzt werden und können daher als Teil einer diagnostischen oder prognostischen Technik Verwendung finden, in denen Patienten auf anomale Mengen von NHP getestet werden können. Solche Antikörper können z.B., wie unten in Abschnitt 5.5 beschrieben, zusammen mit Screeningverfahren von Verbindungen eingesetzt werden, um die Wirkung von Testverbindungen auf die Expression und/oder Aktivität eines NHP-Expressionsprodukts zu ermitteln. Zusätzlich lassen sich solche Antikörper im Verein mit einer Gentherapie z.B. dazu verwenden, die normalen und/oder gentechnisch veränderten NHP exprimierenden Zellen vor ihrer Einführung in den Patienten zu begutachten. Solche Antikörper können zusätzlich als eine Methode zur Inhibition von anomaler NHP-Aktivität verwendet werden. Somit lassen sich solche Antikörper daher als Teil von Behandlungsmethoden einsetzen.
Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem NHP, einem NHP-Peptid (z.B. eines, das einer funktionellen Domäne auf einem NHP entspricht), verkürzten NHP-Polypeptiden (NHP, in welchem eine oder mehr Domänen zerstört worden sind), funktionellen Äquivalenten des NHP oder mutierten Varianten des NHP immunisiert werden. Solche Wirtstiere können sein, aber nicht ausschließlich, Schweine, Kaninchen, Mäuse, Ziegen und Ratten, um nur einige zu nennen. Es können verschiedene Adjuvantien eingesetzt werden, um je nach Wirtsspezies die Immunantwort zu steigern, wie z.B., aber nicht ausschließlich, das Freundsche Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralsalze wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, Chitosan, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen und potentiell brauchbare menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Alternativ könnte die Immunantwort durch Kombination und/oder Kopplung mit Molekülen wie das Hämocaynin der Napfschnecke, das Tetanus-Toxoid, das Diphtherie-Toxoid, Ovalbumin, das Cholera-Toxin oder Fragmente derselben gesteigert werden. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die von den Seren der immunisierten Tiere stammen.
Monoklonale Antikörper, welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, lassen sich nach jeder Technik erhalten, welche über kontinuierliche Zelllinien in Kultur für die Produktion von Antikörpermolekülen sorgt. Dies sind, jedoch nicht ausschließlich, die Hybridoma-Technik von Köhler und Milstein (1975, Nature 255: 495–497 und US-Patent 4,376,110), die humane B-Zellen-Hybridoma-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridoma-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., SS 77–96). Solche Antikörper können von jeder Immunoglobulin-Klasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder ihrer Unterklassen. Die Hybridoma, welche die mAbs dieser Erfindung produzieren können in vitro oder in vivo kultiviert werden. Die Produktion von hohen Titern an mAbs in vivo macht diese Methode zum derzeit bevorzugten Produktionsverfahren.
Darüber hinaus können Techniken eingesetzt werden, die für die Produktion von "chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci, 51: 6851–6855; Neuberger et al., 1984. Nature, 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452–454) entwickelt wurden, indem die Gene von einem Maus-Antikörpermolekül mit passender Antigenspezifität zusammen mit Genen eines humanen Antikörpermoleküls mit passender biologischer Aktivität gespleißt werden (siehe US-Patente 5,877,397 und 6,075,181). Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, in welchem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierarten stammen wie solche, die eine von einem mAb der Maus stammende variable Region und eine konstante Region aus humanem Immunglobulin aufweisen. Solche Technologien sind in den US-Patenten 6,075,181 und 5,877,397 beschrieben. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die wie im US-Patent 6,150,584, das hier vollständig als Referenz eingeführt wird, und entsprechenden Offenbarungen beschriebene Verwendung von vollständig humanisierten monoklonalen Antikörpern.
Alternativ können für die Produktion von einkettigen Antikörpern beschriebene Techniken (US-Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423–426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 55: 5879–5883 und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–546) übernommen werden, um einkettige Antikörper gegen NHP-Expressionsprodukte zu produzieren. Einkettige Antikörper werden gebildet, indem das schwere und leichte Kettenfragment der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke miteinander verbunden werden, was zu einem einkettigen Polypeptid führt.
Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, lassen sich mit bekannten Techniken erzeugen. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, aber nicht ausschließlich, die F(ab')₂-Fragmente, welche sich mittels Pepsinverdau des Antikörpermoleküls gewinnen lassen sowie die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken erstellt werden (Huse et al., 1989, Science, 245: 1275–1281), damit monoklonale Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität schnell und leicht identifiziert werden können.
Umgekehrt können Antikörper gegen NHP eingesetzt werden, um unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Techniken antiidiotypische Antikörper zu erzeugen, welche ein gegebenes NHP "nachahmen". (Siehe z.B. Greenspan & Bona, 1993, FASEB J 7 (5): 437–444 und Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429–2438). Beispielsweise können Antikörper, die an eine NHP-Domäne binden und die Bindung von NHP an seinen angestammten Rezeptor kompetitiv hemmen, dazu verwendet werden, um Antiidiotypen zu erzeugen, welche ein NHP "imitieren" und daher an einen Rezeptor binden und ihn aktivieren oder neutralisieren. Solche antiidiotypischen Antikörper oder Fab-Fragmente von solchen Antiidiotypen lassen sich in therapeutischen Diäten einsetzen, wo ein NHP-Signalweg eine Rolle spielt.
Angesichts des hohen Grades an Verwandschaft unter den NHPs von Säugern, sind darüber hinaus die derzeit beschriebenen KO-Mäuse (welche NHP niemals gesehen haben und somit niemals gegen NHP immunisiert worden sind) von einzigartigem Nutzen, da sie vorteilhafterweise eingesetzt werden können, um Antikörper gegen das offenbarte NHP von Säugern zu erzeugen (d.h. NHP ist in den NHP-KO-Tieren immunogen).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2, 4, 6 und 8.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die: (a) für die Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist; und (b) unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder dem Komplement davon hybridisiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für SEQ ID NO: 2 kodiert.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für SEQ ID NO: 4 kodiert.
Polypeptid, das durch eine wie in einem der Ansprüche 1–4 beanspruchte Nukleinsäure kodiert wird.
Antikörper, der spezifisch ein oder mehrere Epitope eines Polypeptids wie in Anspruch 5 beansprucht erkennt oder ein Epitop-bindendes Fragment oder ein Derivat des Antikörpers, zum Beispiel ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, ein einsträngiger Antikörper, ein Fab-Fragment, ein F(ab')2, ein Fragment, hergestellt mittels einer Fab-Expressions-Bibliothek, oder ein anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper.
Eine gentechnisch manipulierte Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure wie in einem der Ansprüche 1–4 beansprucht, operativ assoziiert mit einem regulatorischen Element, welches die Expression der Nukleinsäure in der Wirtszelle steuert.
Ein nicht-humanes, transgenes Tier, welches eine Nukleinsäure wie in einem der Ansprüche 1–4 beansprucht exprimiert oder welches ein „knock-out"-Tier ist, das kein funktionelles Polypeptid wie in Anspruch 5 beansprucht exprimiert.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, eines Polypeptids wie in Anspruch 5 beansprucht, eines Antikörpers wie in Anspruch 6 beansprucht, einer genetisch manipulierten Wirtszelle wie in Anspruch 7 beansprucht, oder eines nicht-humanen Tieres wie in Anspruch 8 beansprucht, in einem Screening-Verfahren nach Wirkstoffen, die bei der Behandlung des Symptomatischen wirksam sind oder nach der Fähigkeit die phenotypischen Manifestationen von Störungen der Normalfunktion einer isolierten Nukleinsäure wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht oder eines Polypeptids wie in Anspruch 5 beansprucht zu modulieren.