ES2252032T3 - Modulacion de angiogenesis usando angiotensina-7 antiangiogenica y polinucleotidos codificantes para dicha sustancia para el tratamiento de tumores. - Google Patents
Modulacion de angiogenesis usando angiotensina-7 antiangiogenica y polinucleotidos codificantes para dicha sustancia para el tratamiento de tumores.Info
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Abstract
El uso de un polipéptido ANG -7 en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad en un sujeto necesitado de terapia anti-angiogénesis, en el que la enfermedad es un tumor, en el que el polipéptido ANG -7 es
Description
Modulación de angiogénesis usando
angiotensina-7 antiangiogénica y polinucleótidos
codificantes para dicha sustancia para el tratamiento de
tumores.
El comportamiento celular responsable del
desarrollo, mantenimiento y reparación de las células y tejidos
diferenciados está regulado, en gran parte, por señales intra
celulares transmitidas mediante factores de crecimiento y otros
ligandos y sus receptores. Los receptores de estas moléculas
señaladoras intracelulares se localizan sobre la superficie de las
células sensibles. Los factores de crecimiento y otros ligandos
enlazan con los receptores, produciendo de esta forma la
transducción de una señal a lo largo de la membrana celular. Dicha
señal de transducción se puede producir de muchas maneras, entre las
que se incluye la formación de poros y la fosforilación. La
fosforilación de tirosinas en las proteínas mediante las tirosina
quinasas es una de las maneras clave por las cuales se transducen
las señales a lo largo de la membrana celular. Ciertamente, algunos
genes de la proteína tirosina quinasa actualmente conocidos
codifican receptores transmembrana de los polipéptidos de factores
del crecimiento y de hormonas.
Se considera de manera general la angiogénesis
está fuertemente regulada por los factores de crecimiento y otros
ligandos. La angiogénesis, y el desarrollo y regeneración
concurrente del tejido, dependen de los procedimientos controlados
estrechamente de proliferación, migración, diferenciación y
supervivencia de las células endoteliales. Tanto los ligandos
estimuladores como los inhibidores parecen interactuar, directa o
indirectamente, con los receptores celulares durante estos
procedimientos. La angiogénesis comienza con la erosión del sustrato
de la membrana por enzimas liberados por las células endoteliales y
leucocitos. Las células endoteliales que conforman el lumen de los
vasos sanguíneos, sobresalen a continuación a través del sustrato de
la membrana. Los estimuladores angiogénicos inducen a las células
endoteliales a migrar a través del sustrato erosionado de la
membrana. A continuación las células que migran forman un
"brote" fuera del vaso sanguíneo padre, en el que las células
endoteliales experimentan la mitosis y proliferan. Los brotes
endoteliales emergen cada uno respecto del otro para formar anillos
de capilares, creando el nuevo vaso sanguíneo.
Se están comenzando a elucidar los ligandos y los
receptores implicados en la regulación celular. De manera
particular, se han descubierto los receptores del factor de
crecimiento endotelial y sus quinasas. Por ejemplo, fue
descrito por Partanen y col., (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:8913-17 (1990) un gen que codifica una
tirosina quinasa transmembrana de la célula endotelial. Este gen y
su proteína codificada se denominan "TIE" que es una
abreviatura para "tirosina quinasa con dominios de homología de Ig
y EGF" (Véase Partanen y col., Mol. Cell.
Biol. 12:1698-1707 (1992); Publicación de
Patente Internacional WO 99/15653): Se ha demostrado la expresión
mejorada de TIE durante la neovascularización para asociarse con el
desarrollo de los folículos ováricos y el tejido de granulación en
heridas de la piel (Véase Korhonen y col.,
Blood 80:2548-2555 (1992).). De esta manera,
se supone que la proteína TIE juega un papel similar en la
angiogénesis.
Se ha informado de dos receptores TIE de rata
estructuralmente relacionados y similares a las tirosina quinasas,
TIE-1 y TIE-2; estos receptores son
codificados por distintos genes. (Véase Maisonpierre y
col., Oncogene 8:1631-7 (1993).). Se
encontró que ambos genes se expresaban ampliamente en las células
endoteliales de tejidos embriónicos y postnatales. Niveles
significativos de transcriptos de TIE-2 estaban
también presentes en otras poblaciones de células embriónicas,
entre las que se incluyen epitelio del cristalino, epicardio del
corazón y regiones del mesénquima (Véase Maisonpierre y
col., supra). La expresión predominante de los
receptores TIE en el endotelio vascular sugiere que el TIE juega un
papel en el desarrollo y mantenimiento del sistema vascular, y de
manera particular en la
angiogénesis.
angiogénesis.
Se han caracterizado también los ligandos de los
receptores TIE. Se han identificado dos ligandos
TIE-2 de enlace, angiopoietina-1
(Ang-1) y angiopoietina-2
(Ang-2). El polipéptido Ang-1
interactúa con el receptor TIE-2 de la tirosina
quinasa. (Véase Maisonpierre y col., Science
277:55-60 (1997).) El polipéptido
Ang-2 es antagonista del polipéptido
Ang-1, evitando el enlace del ligando de activación
y bloqueando su capacidad para estimular la actividad de la quinasa
TIE-2 y la autofosforilación. Sin embargo
Ang-1 y Ang-2 no enlazan con
TIE-1. Ang-1 y Ang-2
son idénticos en aproximadamente un 60%; las secuencias de
aminoácidos de estos polipéptidos comparten una estructura de
dominios similar, con una región N terminal enrollada
helicoidalmente y un dominio similar al del fibrinógeno
C-terminal. Los análisis de Northern (ARN) muestran
que al ARN de ANG-1 se expresa bastante
ampliamente, pero que la expresión del ARN de
ANG-2 está muy limitada. El ARN de
ANG-2 está presente sólo en tejidos tales
como ovarios, útero y placenta, que experimentan remodelación
vascular. Se considera que Ang-1 es el mismo que el
ligando del receptor TIE humano "htie-2" o
"hTL-1" (Véase Publicación de Patente
Internacional WO 99/15653).
De manera reciente se identificaron otros
ligandos del receptor TIE-2. (Véase
Valenzuela y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96:1904-09 (1999)). Estos ligandos se denominan
TIE-3 (o angiopoietina-3
(Ang-3)) y el ligando TIE-4 (o
angiopoietina-4 (Ang-4)).
Ang-3, un polipéptido de ratón, parece ser
antagonista del receptor Tie-2 mientras que
Ang-4, un polipéptido humano, parece ser un
agonista. El papel fisiológico preciso de los polipéptidos
Ang-3 y Ang-4 resta por
elucidar.
Se han identificado también otros ligandos TIE
homólogos de los humanos, NL1 a NL6 y NL8. (Véanse las
Publicaciones de Patente Internacional WO 99/15653 y WO 99/15654).
Uno de estos homólogos, NL6, se identificó mediante selección en
una biblioteca de ADNc de las secuencias que codifican las señales
de secreción. El análisis subsiguiente del ADNc de NL6 de longitud
completa reveló la homología con los receptores del ligando TIE. Se
identificaron los otros homólogos, NL1-5 y NL8
mediante selección de las secuencias en una base de datos EST que
muestran similitudes con NL6. Basándose en su similitud con NL6,
NL1-5 y NL8, se propuso también que estaban
implicados en la angiogénesis. Se encontró que NL1 y NL8 eran
capaces de volver tumorigénicas a las células. (Véase la
Publicación de Patente Internacional WO 99/15653).
El número de ligandos TIE homólogos, entre los
que se incluyen de Ang-1 a Ang-4 y
la familia NL, sugiere que estos ligandos juegan papeles diversos
en la angiogénesis. La caracterización adicional de estos ligandos,
es, por tanto, un paso importante en la comprensión de sus papeles
en la angiogénesis. De manera particular, se produce la
angiogénesis sin regular, persistente, en una multiplicidad de
estados de enfermedad que incluyen metástasis de tumores y
crecimiento anormal por células endoteliales, y respalda el daño
patológico visto en estas dolencias. De esta manera, la
caracterización de los factores angiogénicos puede facilitar también
el desarrollo de tratamientos de las enfermedades relacionadas con
(y se teoriza que están relacionadas con) la angiogénesis. De esta
manera, los homólogos del ligando TIE que inhiben la angiogénesis
pueden proporcionar tratamientos terapéuticos para dichos
tumores.
En el presente documento se describe el uso de un
polipéptido Ang-7 aislado para tratar una enfermedad
en un sujeto que necesita una terapia de anti angiogénesis, en el
que la enfermedad es un tumor.
La presente invención se refiere al uso de
polipéptidos Ang-7 que tienen la secuencia de
aminoácidos de SEC DE ID Nº: 2.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso de ácidos nucleicos de ANG-7 aislados
que codifican los polipéptidos de Ang-7 de la
presente invención, que incluyen ARNm, ADN, ADNc y ADN genómico, así
como ácidos nucleicos de ANG-7 antisentido.
Dichos ácidos nucleicos incluyen la secuencia de ADNc de
ANG-7 que tiene la secuencia de nucleótidos
de la SEC DE ID Nº: 1.
Se describen también los procedimientos para
producir polipéptidos de Ang-7 mediante técnicas
recombinantes a través del uso de vectores recombinantes. Un
aspecto adicional de la presente invención se refiere a células
huésped procariotas y/o eucariotas recombinantes que comprenden una
secuencia de ácido nucleico de ANG-7 que
codifica un polipéptido de Ang-7. En un aspecto
relacionado, se proporcionan constructos de ácido nucleico que
expresan los ácidos nucleicos de ANG-7 y/o
los polipéptidos de Ang-7. Dichos constructos
incluyen de manera típica un promotor de transcripción y un
terminador de transcripción, cada uno enlazado de manera operativa
para la expresión del ácido nucleico de
ANG-7.
Otro aspecto se refiere a los procedimientos que
implican la expresión de los polipéptidos o polinucleótidos que
codifican los polipéptidos de la presente invención con objetivos de
terapia de genes. Tal como se usa en el presente documento, la
terapia de genes se define como el procedimiento de proporcionar
secuencias de ácido nucleico de origen exógeno para la expresión en
un individuo para el tratamiento de un estado de enfermedad de
dicho
individuo.
individuo.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de polipéptidos de Ang-7 de SEC DE ID
Nº 2, o polinucleótidos de ANG-7 de SEC DE ID Nº 1
para objetivos terapéuticos que implican la modulación de la
angiogénesis, para el tratamiento del cáncer. Dichos tratamientos
incluyen de manera adicional el uso de polipéptidos de
Ang-7 en la terapia de sustitución de proteínas y
proteínas miméticas.
Este y otros aspectos de la invención resultarán
evidentes tras referencia a la siguiente descripción y dibujos.
La Figura 1 representa la secuencia de
nucleótidos del ADNc de ANG-7.
La Figura 2 representa la secuencia de
aminoácidos del polipéptido Ang-7 humano. La
secuencia en el código de una letra de aminoácidos.
La Figura 3 representa un alineamiento de la
secuencia de aminoácidos de Ang-7 (SEC DE ID Nº: 2)
con aquellos de Ang-1 (SEC DE ID Nº:3),
Ang-2 (SEC DE ID Nº: 4), Ang-3 (SEC
DE ID Nº. 5), y Ang-4 (SEC DE ID Nº: 6). Se indican
en recuadros los aminoácidos idénticos.
La Figura 4 representa un perfil de expresión del
ARN de ANG-7 en tejidos humanos. Se muestran los
niveles de expresión del ARN de ANG-7 en diferentes
tejidos. A lo largo del eje horizontal, las referencias numéricas
identifican los siguientes tejidos:
\newpage
| 1-cerebro completo | 28-septum interventricular | 58-glándula adrenal |
| 2-córtex cerebral | 29-ápice del corazón | 59-glándula tiroidea |
| 3-lóbulo frontal | 30-esófago | 60-glándula salival |
| 4-lóbulo parietal | 31-estómago | 61-glándula mamaria |
| 5-lóbulo occipital | 32-duodeno | 62-leucemia HL-60 |
| 6-lóbulo temporal | 33-yeyuno | 63-HeLa s3 |
| 7-circunvoluciones | 34-íleon | 64-Leucemia K-562 |
| paracentrales del complejo | 35-ileocecal | 65-leucemia MOLT-4 |
| cerebral | 36-apéndice | 66 linfoma de Burkitt, Raji |
| 8-puente de Varolio | 37-cólon ascendente | 67-linfoma de Burkitt, Daudi |
| 9-cerebelo izquierdo | 38-cólon transversal | 68-adenocarc, coloreado, |
| 10-cerebelo derecho | 39-recto | SW-480 |
| 11-cuerpo calloso | 40-riñón | 69-carcinoma de pulmón |
| 12-amígdala | 41-músculo esquelético | A549 |
| 13-núcleo caudado | 42-bazo | 70-cerebro fetal |
| 14-hipocálamo | 43-timo | 71-corazón fetal |
| 15-bulbo raquídeo | 44-sangre periférica | 72-riñón fetal |
| 16-putamen | 45-nódulo linfático | 73-hígado fetal |
| 17-sustancia negra | 46-médula ósea | 74-bazo fetal |
| 18-nucleus accumbens | 47-tráquea | 75-timo fetal |
| 19-tálamo | 48-pulmón | 76-pulmón fetal |
| 20-glándula pituitaria | 50-placenta | |
| 21-médula espinal | 51-vejiga | |
| 22-corazón | 52-útero | |
| 23-aorta | 53-próstata | |
| 24-atrio izquierdo | 54-testículo | |
| 25-atrio derecho | 55-ovario | |
| 26-ventrículo izquierdo | 56-hígado | |
| 27-ventrículo derecho | 57-páncreas |
La Figura 5 representa los resultados de la
traducción in vitro del ARN de Ang-7. Hilera 1: los
marcadores de peso molecular de la proteína [^{14}C] metilada
Rainbow (Amerrsham, Little Chalfont Buckinghamshire, Inglaterra)
que contienen las siguientes proteínas: ovoalbúmina (46 kDA),
anhidrasa carbónica (30 kDA), inhibidor de la tripsina (21,5 kDA),
lisozima (14,3 kDA), y aprotinina (6,5 kDA). Hilera 2: Productos de
traducción in vitro del ARN de ANG-7
usando el promotor T7 del vector de expresión en mamíferos
pcADN3.1/Myc-His(-) (Invitrogen, Groningen,
Holanda). Hilera 3: Productos de traducción in vitro del ARN
usando el promotor SP6 del vector de expresión en mamíferos
pcADN3.1/Myc-His(-) (control negativo). Hilera 4:
control positivo del sistema de traducción in vitro
(Promega, Madison, USA).
La Figura 6 representa un análisis Western blot
del extracto celular de células CHO transfectadas de forma
estacionaria con un constructo de expresión
ANG-7. Hilera 1: marcadores de peso molecular
de proteínas. Hilera 2: células CHO (control negativo). Hilera 3:
células CHO transfectadas de forma estacionaria que expresan el
polipéptido Ang-7. La banda del polipéptido
Ang-7 está marcada por una flecha.
La Figura 7 representa un análisis Western blot
del polipéptido Ang-7 en el lisado celular de un
clon de células HEK293 transfectadas de manera estable. Hilera 1:
marcadores de peso molecular de proteínas. Hilera 2: lisado celular
de células HEK293 (control negativo). Hilera 3: lisado celular de
células HEK293 transfectadas de manera estable que expresan el
polipéptido Ang-7.
La Figura 8 representa un análisis Western blot
de medio acondicionado de un clon de células HEK293 transfectadas
de manera estable que expresan el polipéptido Ang-7.
Hilera 1: medio acondicionado procedente de células HEK293 (control
negativo). Hilera 2: medio acondicionado procedente del clon de
células HEK293 transfectada de manera estable que expresa el
polipéptido Ang-7.
Las Figuras 9A y 9B representan los resultados de
la purificación del polipéptido Ang-7 a partir de
medio acondicionado. Figura 9A: análisis Western blot; Figura 9B:
gel SDS teñido por Coomassie del polipéptido Ang-7
purificado. Las flechas en la Figura 9B indican la posición del
polipéptido Ang-7 recombinante. Para cada figura,
las Hileras 1-5 son fracciones 1-5
eluídas a partir de la columna de agarosa Ni-NTA. La
Hilera "C neg." Indica el control negativo (medio
acondicionado a partir de células HEK293). En la Figura 9B, las
bandas dobles representan de manera probable diferentes formas de
glicosilación del polipéptido Ang-7.
Antes de describir la invención con más detalle,
puede ser de ayuda para mayor comprensión de la misma describir las
definiciones de algunos términos tal como se usan a partir de ahora
en el presente documento.
A no ser que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado que entiende habitualmente alguien
normalmente experto en la técnica a la que pertenece esta búsqueda.
Se pueden usar otros procedimientos y materiales similares a los
descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la
presente invención; de esta manera, únicamente se describen
procedimientos y materiales de ejemplo. Para los objetivos de la
presente invención, se definen a continuación los siguientes
términos.
El término "angiogénesis" significa la
generación de nuevos vasos sanguíneos en un tejido u órgano. La
angiogénesis incluye la neovascularización y vascularización
colateral. "Angiogénesis normal" incluye, bajo condiciones
fisiológicas normales, la formación de nuevos vasos sanguíneos
asociada con la curación de la herida, el desarrollo fetal y
embrional y la formación del cuerpo lúteo, endometrio y placenta.
"Angiogénesis no deseada" se refiere a la angiogénesis que se
produce bajo condiciones fisiológicas anormales, tales como en una
enfermedad o dolencia clínica asociada con daño patológico
relacionado con la angiogénesis incontrolada. Por ejemplo, se
puede producir angiogénesis no deseada durante la formación del
tumor, en la que la neovascularización está presente en el interior
del tumor.
El término "ácidos nucleicos de
ANG-7"(es decir, con todas las
mayúsculas y en cursiva) se refiere a los polinucleótidos que
codifican los polipéptidos Ang-7, que incluyen ARNm,
ADN, ADNc, ADN genómico, así como ácidos nucleicos antisentido
El término "gen de
ANG-7" (es decir, con todas las
mayúsculas y en cursiva) se refiere a las secuencias de
codificación, interviniendo secuencias y elementos reguladores que
controlan la transcripción y/o la traducción.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se refieren a un polímero compuesto de una
multiplicidad de unidades de nucleótido (ribonucleótido o
desoxiribonucleótido o variantes estructurales relacionadas) que se
enlazan de manera típica mediante enlaces fosfodiéster. Un
polinucleótido o ácido nucleico pueden ser esencialmente de
cualquier longitud, típicamente entre aproximadamente seis (6)
nucleótidos y aproximadamente 10^{9} nucleótidos o más. Los
polinucleótidos o ácidos nucleicos incluyen ARN, ADNc, ADN genómico,
formas sintéticas, y polímeros mezclados, en cadenas sentido y
antisentido, y pueden ser química o bioquímicamente modificados o
pueden contener base de nucleótido no naturales o derivatizadas,
que se apreciarán fácilmente por el experto en la técnica. Dichas
modificaciones incluyen, por ejemplo, marcas, metilación,
sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de
manera natural con un análogo, modificaciones internucleótido tales
como enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos,
fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, y similares), enlaces
con carga (por ejemplo, fósforotioatos, fósforoditioatos, y
similares), fracciones pendientes (por ejemplo,
polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina,
psoralen, y similares), quelantes, alquilantes, y enlaces
modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, y
similares). También se incluyen moléculas sintéticas que mimetizan
los polinucleótidos en su capacidad para enlazar con una secuencia
de nucleótido designada mediante enlaces de hidrógeno y otras
interacciones químicas. Se conocen dichas moléculas en la técnica e
incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces
péptidos se sustituyen por enlaces fosfato en el esqueleto de la
molécula.
El término "oligonucleótido" se refiere a un
polinucleótido de entre aproximadamente seis (6) a aproximadamente
cien (100) nucleótidos, o más de longitud. De esta manera, los
oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos. Los
oligonucleótidos se pueden sintetizar en un sintetizador de
oligonucleótidos automatizado (por ejemplo, que los
fabricados por Applied ByoSystems (Foster City, CA)), de acuerdo con
las especificaciones proporcionadas por el fabricante.
El término "cebador" se refiere a un
polinucleótido, normalmente un oligonucleótido, que se produce tanto
en la naturaleza como por digestión enzimática, o se produce
sintéticamente in vitro, que actúa como un punto de
iniciación de la síntesis de polinucleótidos cuando se usa bajo
condiciones en las que se sintetiza un primer producto de
extensión.
El término "polipéptido
Ang-7" se refiere a los polipéptidos la secuencia
de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2.
El término "polipéptido" se refiere a un
polímero de aminoácidos y su equivalente y no se refiere a una
longitud específica del producto; de esta manera se incluyen dentro
de la definición los péptidos y oligopéptidos (es decir, los
fragmentos) y las proteínas de un polipéptido. Este término incluye
también los derivados del polipéptido Ang-7, por
ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y
similares. Están incluidos dentro de la definición, por
ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de
un aminoácido (por ejemplo, aminoácidos no naturales, y
similares), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como
diferentes modificaciones conocidas en la técnica, que se producen
de manera natural y no natural.
El término "biológicamente activo" se
refiere a la capacidad de una molécula para modular la angiogénesis,
tal como afectando la formación del tubo endotelial (por
ejemplo, usando el ensayo HUVEC del Ejemplo 9 (infra), o
que afectan el crecimiento o proliferación de las células del tumor
(usando por ejemplo, el ensayo de inhibición de crecimiento
de las células del tumor del Ejemplo 10 (infra). Moléculas
biológicamente activas pueden ser los polipéptidos
Ang-7; los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos Ang-7; y los anticuerpos anti
Ang-7, que modulan la angiogénesis (inhibiendo o
estimulando por ejemplo la formación del tubo endotelial) o
mediante la modulación del crecimiento o proliferación de las
células del tumor (inhibiendo o estimulando por ejemplo el
crecimiento de las células del tumor).
Los términos "terapéuticamente útil" o
“terapéuticamente efectivo” se refieren a una cantidad de una
molécula (por ejemplo, un polipéptido Ang-7,
anticuerpo anti Ang-7, o ácido nucleico de
ANG-7) que es suficiente para modular la
angiogénesis (inhibiendo o estimulando por ejemplo la
formación del tubo endotelial) o modular el crecimiento o
proliferación de las células del tumor (inhibiendo o estimulando
por ejemplo el crecimiento de las células del tumor) en un
sujeto tal como un paciente o un mamífero.
Los términos "diagnósticamente útil" o
"diagnósticamente efectivo" se refieren a una molécula (por
ejemplo, un polipéptido Ang-7, anticuerpo anti
Ang-7, o ácido nucleico de
ANG-7) para detectar la angiogénesis o la
inhibición de la angiogénesis en un sujeto. Estos términos incluyen
de manera adicional moléculas útiles para detectar enfermedades o
dolencias clínicas, o la susceptibilidad a enfermedades o dolencias
clínicas relacionadas con mutaciones en una secuencia de ácido
nucleico de ANG-7 de la presente invención y
para detectar la sobre expresión o subexpresión de los polipéptidos
Ang-7 codificados por dichas secuencias.
El término "compuestos de
Ang-7" o "compuestos antiangiogénicos de
Ang-7" se refiere a un polipéptido
Ang-7 biológicamente activo, a ácidos nucleicos de
ANG-7 biológicamente activos, y a ácidos
nucleicos de ANG-7 antisentido.
Los término "aminoácido", "residuo
aminoácido", o "residuo" se refieren a aminoácidos L o a
aminoácidos D que se producen de manera natural tal como se
describe de manera adicional a continuación. Los aminoácidos se
denominan en el presente documento tanto por sus símbolos comúnmente
conocidos de tres letras como por sus símbolos de una letra
recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical
Nomenclature Comisión. De manera similar, los aminoácidos se pueden
nombrar por sus códigos de letra única comúnmente aceptados.
(Véase, por ejemplo, Bruce Alberts y col.,
Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc, Nueva
York (3ª ed., 1994).
Los términos "idéntico" o "porcentaje
idéntico", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o
secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o
subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado
de nucleótidos o aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y
alinean para una correspondencia máxima, tal como se mide usando
uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o
mediante inspección visual.
El término "sustancialmente idéntico", en el
contexto de dos ácidos nucleicos o dos secuencias de polipéptido,
se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al
menos un 60%, típicamente un 80%, de manera más típica un
90-95% de identidad, cuando se comparan y alinean
para una correspondencia máxima, tal como se mide usando un
algoritmo de comparación de secuencias descrito a continuación, o
mediante inspección visual. Una indicación que dos secuencias de
polipéptido son "sustancialmente idénticas" es que un
polipéptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos
fabricados frente al segundo polipéptido.
"Similitud" o "porcentaje de similitud"
en el contexto de dos secuencias de polipéptido, se refiere a dos o
más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un
porcentaje especificado de residuos aminoácido o sustituciones
conservativas de los mismos, que son iguales, cuando se comparan y
alinean para una correspondencia máxima, tal como se mide usando
uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o
mediante inspección visual. Por medio de ejemplo, se puede
considerar similar una primera región de proteína a una región del
polipéptido Ang-7 humano cuando la secuencia de
aminoácidos de la primera región es al menos un 30%, 40%, 50%, 60%,
70%, 75%, 80%, 90%, o incluso un 95% idéntica, o sustituida de
manera conservativa por una región del polipéptido
Ang-7 cuando se compara con cualquier secuencia en
el polipéptido Ang-7 de un número igual de
aminoácidos como el número contenido en la primera región, o cuando
se compara con una secuencia alineada del polipéptido
Ang-7 que se ha alineado mediante un programa
informático de similitudes conocido en la técnica, tal como se ha
descrito anteriormente.
El término "similitud sustancial" en el
contexto de las secuencias de polipéptido, indica que el polipéptido
comprende una secuencia con al menos un 70% de identidad de
secuencia con una secuencia de referencia, o de manera preferible
un 80%, o de manera más preferible un 85% de identidad de secuencia
con la secuencia de referencia, o lo más preferible un 90% de
identidad sobre una ventana de comparación de aproximadamente
10-20 residuos aminoácidos. En el contexto de las
secuencias de aminoácidos, "similitud sustancial" incluye de
manera adicional las sustituciones conservativas de aminoácidos. De
esta manera, un polipéptido es sustancialmente similar a un segundo
polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren
únicamente en una o más sustituciones conservativas.
El término "sustitución conservativa",
cuando se describe un polipéptido, se refiere a un cambio en la
composición de aminoácidos del polipéptido que no altera de manera
sustancial la actividad del polipéptido. De esta manera, una
"sustitución conservativa" de una secuencia de aminoácidos
concreta se refiere a las sustituciones de aminoácidos de aquellos
aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína, o
a la sustitución de aminoácidos con otros aminoácidos que tienen
propiedades similares (por ejemplo, ácidas, básicas,
cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) tales
que las sustituciones de incluso aminoácidos críticos no alteran de
manera sustancial la actividad. Son bien conocidas en la técnica las
tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos con
funcionalidad similar. Los siguientes seis grupos contienen cada
uno aminoácidos que presentan sustituciones conservativas cada uno
respecto del otro:
1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2) Ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M),
Valina (V); y
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Trifptófano
(W)
(Véase también Creighton, Proteins,
W. H. Freeman y Compañía (1984). De manera adicional, las
sustituciones individuales, supresiones o adiciones que alteran,
añaden o suprimen un aminoácido único o un pequeño porcentaje de
aminoácidos en una secuencia codificada, son también
"sustituciones conservativas".
Para comparación de secuencias, típicamente una
secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se
comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de
comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las
secuencias de ensayo y de referencia, se designan las coordenadas y
se designan los parámetros del programa del algoritmo de
secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de
secuencias calcula el porcentaje de identidad de la secuencia para
la(s) secuencia(s) de ensayo relativa(s) a la
secuencia de referencia, basándose en los parámetros designados del
programa.
Se puede llevar a cabo el alineamiento óptimo de
las secuencias por comparación, por ejemplo, mediante el
algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Adv. Appl.
Math. 2:482 (1981)), mediante el algoritmo de alineamiento de
homología de Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443
(1979)), mediante la búsqueda del procedimiento de similitudes de
Pearson & Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444
(1988)), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos
(por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI), o mediante inspección visual (Véase
generalmente Ausebel y col., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nueva York
(1996)).
(1996)).
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP
crea un alineamiento de secuencia múltiple a partir de un grupo de
secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos, por
emparejamiento, para mostrar el porcentaje de identidad de la
secuencia. Traza también un árbol o dendograma que muestra las
relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento.
PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineamiento
progresivo de Feng & Doolitle (J. Mol. Evol.
35:351-360 (1987)). El procedimiento usado es
similar al procedimiento descrito por Higgins & Sharp
(CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede
alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de
5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento
múltiple comienza con el alineamiento por emparejamiento de dos
secuencias más similares, que producen un clúster de dos secuencias
alineadas. Este clúster se alinea a continuación con la secuencia
próxima más relacionada mediante una simple extensión del
alineamiento por emparejamiento de dos secuencias individuales. Se
consigue el alineamiento final mediante una serie de alineamientos
progresivos por emparejamiento. Se hace funcionar el programa
designado las secuencias específicas y sus aminoácidos o
coordinados de nucleótidos para las regiones de comparación de
secuencias y designando los parámetros del programa. Por
ejemplo, se puede comparar una secuencia de referencia con
otras secuencias de ensayo para determinar las relaciones del
porcentaje de identidad de la secuencia usando los siguientes
parámetros: intervalo de pesos por defecto (3,00), intervalos de
longitud de pesos por defecto (0,10) e intervalos finales
ponderados. Otro programa útil para el alineamiento múltiple de
secuencias es MEGALIGN^{TM} de Expert Sequence Analysis Software
(DNASTAR, Madison, Wisconsin).
Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para
determinar el porcentaje de identidad y la similitud de la
secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe por Altschul y
col. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)).
(Véase también Zhang y col., Nucleic. Acid.
Res. 26:3986-90 (1998); Altschul y col.,
Nucleic. Acid Res. 25:3389-402 (1997). El software
para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible
a través del National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica en
primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuación
(HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia
pedida, que pueden corresponder o satisfacer alguna puntuación T
con valor umbral positivo cuando se alinea con una palabra de la
misma longitud en la base de datos de secuencias. T se refiere al
umbral de puntuación de las palabras circundantes. (Altschul y
col., (1990), supra). Esta palabra circundante inicial
actúa como semilla para iniciar búsquedas de HSP de mayor longitud
que las contengan. Las palabras encontradas se extienden a
continuación en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia
tanto como pueda incrementarse el alineamiento acumulado. La
extensión de palabras encontradas en cada dirección se detiene
cuando: la puntuación de alineamiento acumulado se diferencia en la
cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada
llega a ser 0 o inferior, debido a la acumulación de uno o más
alineamientos residuales con puntuación negativa; o bien se alcanza
el fin de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X
determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa
BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz
de puntuación BLOSUM62 (Véase Henikoff & Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9
(1992)), lo alineamientos (B) de 50, la expectativa (E) de 10, M =
5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.
De manera adicional a calcular el porcentaje de
identidad de las secuencias, el algoritmo BLAST realiza también un
análisis estadístico de la semejanza entre dos secuencias
(Véase, por ejemplo Karlin & Altschul, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)). Una medida
de la semejanza que proporciona el algoritmo BLAST es la
probabilidad de suma más pequeña (P (N)), que proporciona una
indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad un
emparejamiento entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácido.
Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a
una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña
en una comparación entre el ácido nucleico de ensayo y el ácido
nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, de manera
más típica menos de aproximadamente 00,1, y lo más típico, menos de
0,001.
Otra indicación acerca de que dos secuencias de
ácido nucleico o de polipéptidos son sustancialmente idénticas es
que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene
reactividad cruzada inmunológica con el polipéptido codificado por
el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. De esta
manera, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un
segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos
difieren únicamente por sustituciones conservativas.
Los términos "transformación" o transfección
significan el procedimiento de alterar de manera estable el genotipo
de un huésped celular o microorganismo mediante la introducción de
polinucleótidos. Esto se detecta típicamente por un cambio en el
fenotipo del huésped celular u organismo. El término transformación
se aplica de manera general a los microorganismos, mientras que
transfección se usa para describir este procedimiento en células
derivadas de organismos multicelulares.
En las Patentes de los Estados Unidos N^{os}
4.683.202, 4.683.195 y 4.800.159 se describen de manera general las
metodologías para la reacción en cadena de la polimerasa
("PCR"). Otra nomenclatura usada en el presente documento y
muchos de los procedimientos de laboratorio de cultivo celular,
genética molecular y química e hibridación del ácido nucleico que
se describen a continuación son bien conocidos y comúnmente
empleados en la técnica. (Véase generalmente Ausebel y
col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, Nueva York (1996); Sambrook y col., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Nueva York 81989). Se usan técnicas
estándar para procedimientos de ácido nucleico recombinante,
síntesis de polinucleótidos, preparación de muestras biológicas,
preparación de fragmentos de ADNc, aislamiento de ARNm y similares.
De manera general, las reacciones enzimáticas y las etapas de
purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones de
los fabricantes.
La presente invención se proporciona para el
tratamiento de un tumor en un sujeto que necesita de terapia anti
angiogénesis, usando polipéptidos Ang-7
antiangiogénicos con la SEC de ID Nº 2.
La presente invención abarca de manera adicional
procedimientos para usar ácidos nucleicos de
ANG-7, descritos más completamente a
continuación para este objetivo. La presente invención abarca de
manera adicional el uso de polipéptidos Ang-7 y/o
ácidos nucleicos de ANG-7 para el tratamiento
del cáncer.
Se describen en el presente documento
polipéptidos que codifican Ang-7, que incluyen ARNm,
ADN, ADNc, ADN genómico así como ácidos nucleicos antisentido, y su
uso para modular la angiogénesis. Los ácidos nucleicos de
ANG-7 incluyen la secuencia de ADNc de
ANG-7 (por ejemplo, SEC DE ID
Nº:1).
Como por referencia, los ácidos nucleicos se
describen también aquí como hibridables con o complementarios de,
las secuencian anteriores. Dichos ácidos nucleicos incluyen ARNm,
ADN, ADNc, ADN genómico, así como ácidos nucleicos anti sentido y
biológicamente activos y fragmentos diagnóstica o terapéuticamente
útiles de variantes de los mismos. Se proporcionan también ácidos
nucleicos que comprenden un secuencia complementaria de al menos
10, 25, 50, 100, 200 o 250 nucleótidos o más de un gen de
ANG-7 o ADNc. En un aspecto, se proporciona
un ácido nucleico que es hibridable con un ácido nucleico de
ANG-7 (teniendo por ejemplo la
secuencia SEC de ID Nº: 1), bajo condiciones de mucha
restricción.
Por medio de ejemplo, y no de limitación, los
procedimientos que usan condiciones de mucha restricción son como
sigue: Se lleva a cabo la prehibridación de los filtros que
contienen el ADN durante 8 horas durante toda la noche a 65ºC en un
tampón compuesto por 6 x SSC, TRIS-HCl 50 mM (pH
7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,02%, y 500
(\mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado). Se hibridan
los filtros durante 48 horas a 65ºC en una mezcla de prehibridación
que contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado y 5-20 x 10^{6} cpm de una sonda
marcada con ^{32}P. El lavado de filtros se lleva a cabo a 37ºC
durante 1 hora en una solución que contiene 2 x SSC, PVP al 0,01%,
Ficoll al 0,01%, y BSA al 0,01%. Esto es seguido por un lavado en
0,1 x SSC a 50ºC durante 45 min antes de la autoradiografía. Otras
condiciones de mucha restricción que se pueden usar son bien
conocidas en la técnica (Véase generalmente Ausebel y
col., supra).
En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico
que es hibridable con un ácido nucleico de
ANG-7 bajo condiciones de moderada
restricción. Por medio de ejemplo, y no de limitación, los
procedimientos usando dichas condiciones de moderada restricción
son como sigue: La prehibridación de los filtros que contienen ADN
se lleva a cabo durante 8 horas durante la noche a 55ºC en un
tampón compuestos por 6 x SSC, Tris-HCl 50 mM (pH
7,5), EDTA 1 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,2%, BSA al 0,02% y 500
\mug de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Se hibridan los
filtros durante 24 horas a 55ºC en una mezcla de prehibridación que
contiene 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado
y 5-20 x 10^{6} cpm de una sonda marcada con
^{32}P. Se lleva a cabo el lavado de los filtros a 37ºC durante 1
hora en una solución que contiene 2xSSC, PVP al 0,01%, Ficoll al
0,01% y BSA al 0,01%.
En otro aspecto se proporciona un ácido nucleico
que se híbrida con un ácido nucleico de ANG-7
bajo condiciones de baja restricción. Por medio de ejemplo, y no de
limitación, los procedimientos usando dichas condiciones de baja
restricción son como sigue: Se pretratan los filtros que contienen
ADN durante 6 horas a 40ºC en una solución que contiene formamida
al 35%, 5 x SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM,
polivinilpirrolidona al 0,1% (PVP), Ficol al 0,1%, albúmina de
suero bovino (BSA) al 1%, y 500 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado. Las hibridaciones se llevan a cabo en la
misma solución con las siguientes modificaciones: PVP al 0,02%,
Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado sulfato de dextrano (p/vol.) al 10%, y
5-20 x 10^{6} cpm de una sonda marcada con
^{32}P. Los filtros se incuban en una mezcla de hibridación
durante 18-20 horas a 40ºC y a continuación se lavan
durante 1,5 horas a 55ºC en una solución que contiene 2 x SSC,
Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM, y SDS al 0,1%.
La solución de lavado se sustituye con solución fresca y se incuba
1,5 horas más. Los filtros se emborronan en seco y se exponen para
autoradiografía. Otras condiciones de baja restricción que se pueden
usar son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, aquellas
empleadas para hibridaciones de especies cruzadas) (Véase
también Shilo y Weinberg, Proc. Natl Acad. Sci. USA
78:6789-6792 (1981)).
Las condiciones de baja, moderada y mucha
restricción son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica
y variarán de manera predecible en la composición base de la
secuencia de ácido nucleico concreta y en el organismo específico
desde el cual se deriva la secuencia de ácido nucleico. Para guiar
en relación dichas condiciones Véase, por ejemplo,
Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory
Manual (Segunda Edición, Cold Spring Harbor Press, NY, pp.
9,47-9,57 (1989); y Ausebel y col.,
Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing
Associates and Wilkey Interscience, NY (1989)).
Las formas de realización específicas para la
clonación de un ácido nucleico de ANG-7,
presentadas como un ejemplo particular pero no por medio de
limitación, son como sigue.
Para la expresión de la clonación (una técnica
comúnmente conocida en la técnica), se construye una biblioteca de
expresión mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, se aísla el ARNm (por ejemplo, humano), se
prepara el ADNc y a continuación se liga en un vector de expresión
(por ejemplo, un derivado de bacteriófago) tal que es capaz
de ser expresado por el huésped celular en el que se introduce a
continuación. Se pueden usar a continuación diversos ensayos de
selección para seleccionar el polipéptido Ang-7
expresado. En una forma de realización, se pueden usar para la
selección anticuerpos anti Ang-7 específicos.
En otra forma de realización, se usa la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar la secuencia
deseada en una biblioteca genómica o de ADNc antes de la selección.
Los oligonucleótidos representan secuencias de
ANG-7 conocidas, seleccionadas por
ejemplo a partir de la SEC DE ID Nº: 1 se pueden usar como
cebadores en la PCR. En una forma de realización típica, el
oligonucleótido representa al menos parte de los segmentos
conservados de ANG-7 de la identidad de
secuencia entre ANG-7 de diferentes especies.
Se pueden utilizar los oligonucleótidos sintéticos como cebadores
para amplificar secuencias concretas dentro del gen de
ANG-7 mediante PCR usando ácidos nucleicos de
una fuente (ARN o ADN) mediante el uso de un variador térmico
Perkin-Elmer Cetus y la polimerasa Taq (gen Amp). EL
ADN que está siendo amplificado puede incluir ARNm o ADNc o ADN
genómico de cualquier especie eucariota. Una persona experta en la
técnica puede elegir sintetizar algunos cebadores degenerados
diferentes para uso en las reacciones de la PCR.
Es también posible variar la restricción de las
condiciones de hibridación usadas en el cebado de las reacciones
PCR, para permitir un mayor o menor grado de similitud de la
secuencia de nucleótidos entre la secuencia de
ANG-7 conocida y el ácido nucleico
relacionado que está siendo aislado. Para hibridación de especies
cruzadas, se usan de manera típica bajas condiciones de
restricción. Para la hibridación de las mismas especies, se usan de
manera más típica condiciones moderadamente restrictivas. Tras la
amplificación satisfactoria de un segmento de ácido nucleico de
Ang-7 relacionado, este segmento puede ser clonado y
secuenciado molecularmente, y utilizado para aislar un ADNc
completo o clon genómico. Esto, a la vez, puede permitir la
determinación de una secuencia de nucleótido completa, el análisis
de su expresión, y la producción de su producto de proteína para el
análisis funcional, tal como se describe más adelante. De
esta manera, se pueden identificar los ácidos nucleicos adicionales
que codifican los polipéptidos Ang-7 y las variantes
del polipéptido Ang-7.
Se entiende que los procedimientos anteriores no
limitan la descripción general siguiente de procedimientos por los
cuales se pueden obtener los ácidos nucleicos de
ANG-7. Cualquier célula eucariota puede
servir de manera potencial como fuente de ácido nucleico para la
clonación molecular de los ácidos nucleicos de
ANG-7. Se pueden aislar los ácidos nucleicos
que codifican el polipéptido Ang-7 a partir de
fuentes de vertebrados que incluyen fuentes de mamíferos tales
como, porcina, bovina, felina, avícola, equina, canina y humana así
como fuentes de primates adicionales. Se puede obtener el ADN
mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica a partir
de ADN clonado (por ejemplo, una biblioteca de ADN), mediante
síntesis química, mediante clonación del ADNc, o mediante la
clonación del ADN genómico, o fragmentos de los mismos, purificados
a partir de la célula deseada. (Véase, por ejemplo,
Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Glover, (ed.), DNA
Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd, Oxford, U. K.
Vol. I, II (1985)). Los clones derivados del AND genómico pueden
contener regiones de ADN intrón y reguladoras de manera adicional a
las regiones que codifican; los clones derivados de ADNc contendrán
típicamente únicamente secuencias exón. Cualquiera que sea la
fuente, el ácido nucleico puede ser clonado molecularmente en un
vector adecuado para la propagación del ácido nucleico.
En la clonación molecular de los ácidos nucleicos
de ANG-7 a partir de ADN genómico, se generan
fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen de
ANG-7. El ADN se puede romper en
emplazamientos específicos usando diversos enzimas de restricción.
De manera alternativa, se puede usar ADNasa en presencia de
manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede ser físicamente
cizallado, tal como por ejemplo, por sonicación. A
continuación, los fragmentos de ADN lineal se pueden separar de
acuerdo con el tamaño mediante técnicas estándar, incluyendo pero
no limitándose a, electroforesis en gel de poliacrilamida y agarosa
y cromatografía en columna.
Una vez se generan los fragmentos deseados de
ADN, se puede llevar a cabo por diversos medios la identificación
del fragmento de ADN específico que contiene el gen deseado. Por
ejemplo, se puede purificar y marcar una porción de un gen de
ANG-7, ADNc (de cualquier especie) o su ARN
específico, o un fragmento de los mismos; los fragmentos de ADN
generados se pueden seleccionar mediante hibridación del ácido
nucleico con una sonda marcada (Véase, por ejemplo,
Benton y Davis, Science 196:180 (1975); Grunstein y Hogness,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:3691 (1975). Aquellos
fragmentos de ADN con identidad sustancial con la sonda se
hibridarán. Es también posible identificar el fragmento apropiado
mediante digestión(es) con enzimas de restricción y
comparación de los tamaños de fragmentos con los esperados de
acuerdo con un mapa de restricción conocido, si está disponible. Se
puede llevar a cabo una selección adicional sobre la base de las
propiedades del gen.
De manera alternativa, se puede detectar la
presencia del gen mediante ensayos basados en las propiedades
físicas, químicas, o inmunológicas de su producto expresado. Por
ejemplo, se pueden seleccionar los clones de ADNc, o los clones
de ADN que seleccionan por hibridación los ARNm correctos, que
producen un polipéptido que, por ejemplo, tiene migración
electroforética, comportamiento isoeléctrico, mapas de digestión
proteolítica o propiedades antigénicas similares o idénticas que las
que se conocen para el polipéptido Ang-7. Se puede
usar el suero inmune de un anticuerpo que enlaza de manera
específica con el polipéptido Ang-7 para
identificar supuestamente el polipéptido Ang-7 que
sintetiza los clones mediante enlace en un procedimiento de tipo
ELISA (ensayo inmunosorbente de enlace con enzima).
Se pueden identificar también los ácidos
nucleicos de ANG-7 mediante selección de ARNm
por hibridación del ácido nucleico seguida por traducción in
vitro. En este procedimiento se usan los fragmentos para aislar
ARNm complementario mediante hibridación. Dichos fragmentos de ADN
representan normalmente ADN purificado disponible de otras especies
(por ejemplo, ser humano, ratón, y similares). Los análisis
de inmunoprecipitación o ensayos funcionales (por ejemplo,
inhibición de la angiogénesis, formación del tubo endotelial in
vitro, inhibición del tumor, o enlace con el receptor TIE) de
los productos de traducción in vitro de los ARNm aislados
identifican el ARNm y, por tanto los fragmentos de ADN
complementario que contienen las secuencias deseadas. De manera
adicional se puede seleccionar ARNm específico mediante adsorción de
polisomas aislados a partir de células para anticuerpos
inmovilizados de manera específica dirigidos contra el polipéptido
Ang-7. Se puede sintetizar un ADNc de
ANG-7 radiomarcado usando el ARNm (a partir
de los polisomas adsorbidos) como modelo. Se pueden usar El ARNm
radiomarcado o el ADNc como una sonda para identificar los
fragmentos de ácido nucleico de ANG-7 entre
otros fragmentos de ADN genómico.
Las alternativas para aislar el ADN genómico de
ANG-7 incluyen, pero no se limitan a,
sintetizar químicamente la secuencia propia del gen a partir de una
secuencia conocida, o fabricar ADNc y ARNm que codifiquen un
polipéptido de Ang-7. Por ejemplo, se puede aislar
el ARN para la clonación del ADNc del gen de
ANG-7 a partir de células que expresan el
polipéptido Ang-7. Son posibles otros
procedimientos.
A continuación se pueden insertar los ácidos
nucleicos de ANG-7 identificados y aislados
en un vector de clonación apropiado. Los vectores posibles
incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados. El
sistema vector se selecciona para ser compatible con una célula
huésped. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a,
bacteriófagos tales como derivados lambda, vectores centroméricos e
integradores de levaduras, plásmidos 2 \mu, y los derivados de
los mismos, o plásmidos tales como pBR322, pUC o pRSETC (InVitrogen,
San Diego, California), derivados de plásmidos o el vector
Bluescript (Stratagene, La Jolla, California), por nombrar unos
pocos. Se puede llevar a cabo la inserción de los ácidos nucleicos
de ANG-7 en un vector de clonación, por
ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que
tiene un término cohesivo complementario. Sin embargo, si los
emplazamientos de restricción complementarios usados para fragmentar
el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos
de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. De
manera alternativa, se puede producir cualquier emplazamiento
deseado ligando las secuencias de nucleótidos (ligantes) sobre el
término de ADN; estos ligantes ligados pueden comprender
oligonucleótidos sintetizados químicamente que codifican las
secuencias de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. Se
puede introducir también un emplazamiento de restricción mediante
amplificación PCR del ácido nucleico usando un(os)
cebador(es) que codifiquen el (los) emplazamiento(s)
de restricción
deseados(s). En un procedimiento alternativo, el vector roto y los ácidos nucleicos de ANG-7 se pueden modificar mediante residuos homopoliméricos. Se pueden introducir moléculas recombinantes en células huésped mediante transformación, transfección, infección, electroporación, y similares, de manera que se generen muchas copias de la secuencia del gen.
deseados(s). En un procedimiento alternativo, el vector roto y los ácidos nucleicos de ANG-7 se pueden modificar mediante residuos homopoliméricos. Se pueden introducir moléculas recombinantes en células huésped mediante transformación, transfección, infección, electroporación, y similares, de manera que se generen muchas copias de la secuencia del gen.
En otro procedimiento se puede identificar y
aislar el gen de ANG-7 tras la inserción de
un vector de clonación adecuado en una solución de tipo "escopeta
de tiro" Se puede realizar el enriquecimiento del gen de
ANG-7, por ejemplo, mediante
fraccionamiento de tamaño antes de la inserción en el vector de
clonación. En formas de realización específicas, la transformación
de las células huésped con moléculas de ADN recombinante que
incorporan el gen de ANG-7 aislado, ADNc, o
secuencias de ADN sintetizado permite la generación de múltiples
copias del gen. De esta manera, se puede obtener el gen en grandes
cantidades mediante transformantes del crecimiento, aislando las
moléculas de ADN recombinante a partir de los transformantes y,
cuando sea necesario, recuperando el gen insertado a partir del ADN
recombinante aislado.
En este caso específico, se aisló el ADNc de
ANG-7 por homología con otra angiopoietina
conocida, Ang-1. En breve, se aislaron fragmentos
de ADNc de ANG-7 mediante una búsqueda BLAST
(Altschul y col., Nucleic. Acids. Res.
25:3389-402 (1997) frente a la base de datos
Expresed Sequence Tag ("EST") (National Center for
Biotechnology Information) usando como referencia la secuencia de
aminoácidos deducida de Ang-1. Se aislaron dos EST
con secuencias solapantes. Se clonó un fragmento de ADNc de longitud
completa que codificaba el polipéptido Ang-7
mediante selección de una biblioteca de ADNc humano de longitud
completa usando un EST marcado radioactivamente. El análisis
subsiguiente del ADNc de ANG-7 humano (SEC DE ID Nº:
1) identificó un marco de lectura abierto de 493 aminoácidos (SEC
DE ID Nº: 2). La secuencia deducida de aminoácidos codifica un
polipéptido de aproximadamente 57 kDA. El análisis subsiguiente del
ADNc de ANG-7 confirma que este dirige la síntesis
de un polipéptido expresado de manera recombinante de peso molecular
aparente, tal como se determinó mediante SDS PAGE. El polipéptido
Ang-7 humano es un 23,9% y un 23,5% similar a los
polipéptidos Ang-1 y -2, de manera respectiva. La
conservación de los aminoácidos se distribuye a través de la
longitud de las dos proteínas. El perfil de expresión del
polipéptido Ang-7 indica que el polipéptido se
expresa en una variedad de tejidos fuertemente vascularizados,
entre los que se incluyen los tejidos del corazón, el útero,
glándulas mamarias y cuerpo calloso.
Un clon que hospeda el ADNc de
ANG-7, ANG-7.ADNc/pGEM, se
depositó en el DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH, Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweigm Alemania, el 26 de Junio de
2000 bajo Registro de Depósito Nº DSM 13562. Se hizo este depósito
bajo las condiciones del Budapest Treaty on the International
Recognition of the deposit of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure and the Regulation thereunder (Budapest Treaty).
Ang-7 Polypeptides, Fragments, variants,
derivatives and Analogs.
La invención se refiere de manera adicional a
polipéptidos Ang-7 y a su uso en la modulación de la
angiogénesis para el tratamiento de un tumor. El polipéptido
Ang-7 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC DE
ID Nº: 2. El polipéptido Ang-7 es biológicamente
activo. Un polipéptido Ang-7 biológicamente activo
se refiere a la capacidad de la molécula para modular la
angiogénesis tal como, por ejemplo, afectando la formación
del tubo endotelial, tal como describe, por ejemplo, el
ensayo HUVEC en el ejemplo 9 (más adelante) o afectando el
crecimiento o proliferación de las células del tumor (por
ejemplo, Véase el Ejemplo 10). De manera alternativa, se
pueden usar dichos polipéptidos que tienen la inmunogenicidad o
antigenicidad deseadas en inmunoensayos, para inmunización, para
inhibición de la actividad del polipéptido Ang-7, y
similares.
De manera adicional, los polipéptidos
Ang-7 se pueden sintetizar químicamente. Por
ejemplo, se puede sintetizar un péptido que corresponde a una
porción, o fragmento, de un polipéptido Ang-7, que
comprende un dominio deseado, o que media una actividad deseada
in vitro, mediante el uso de procedimientos sintéticos
químicos usando por ejemplo un sintetizador de péptidos
automatizado.
En una forma de realización, el polipéptido
Ang-7 es una proteína quimérica, o de fusión, que
comprende un polipéptido Ang-7 juntado a sus amino-
o carboxi-terminales mediante un enlace peptídico
con una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En una
forma de realización, dicha proteína quimérica se produce mediante
expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la
proteína. Se puede fabricar el producto quimérico ligando la
secuencia apropiada de ácido nucleico, que codifica las secuencias
de aminoácidos deseados cada una con la otra mediante
procedimientos conocidos en la técnica, en un marco de codificación
apropiado y expresando el producto quimérico mediante
procedimientos comúnmente conocidos en la técnica. De manera
alternativa, se puede fabricar el producto quimérico mediante
técnicas sintéticas de proteína (por ejemplo, mediante el
uso de un sintetizador de péptidos automatizado).
En una forma de realización adicional, las
células huésped comprenden un constructo que expresa un ácido
nucleico de ANG-7. Dicha célula huésped
puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de
mamífero, una célula eucariota inferior, tal como una célula de
levadura, o una célula procariota, y tal como una célula
bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped
puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio,
transfección mediada con DEAE-dextrano, o
electroporación (Davis y col., Basic Methods in Molecular
Biology, 2ª ed., Appleton y Lang, Paramount Publishing, East
Norwalk, Conn. (1994) transformación mediada con cloruro de calcio,
transformación mediada con acetato de litio y similares.
Los constructos en las células huésped se pueden
usar de manera convencional para producir el polipéptido
Ang-7. Se pueden emplear también sistemas de
translación libres de células para producir dichos polipéptidos
usando ARN derivado a partir del ácido nucleico de
ANG-7. De manera alternativa, el polipéptido
Ang-7 puede ser producido sintéticamente mediante
sintetizadores de péptidos convencionales.
Los ácidos nucleicos de
ANG-7 se pueden expresar en células de
mamíferos, levaduras, bacterias, insectos u otras células bajo el
control de promotores apropiados. Los vectores de expresión
representativos incluyen plásmidos, fagos y/o secuencias de vector
víricas, tales como aquellas descritas por Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Edición, Cold
Spring Harbor, NY, (1989)). Por ejemplo, los vectores adecuados
incluyen vectores adenovíricos, vectores retrovíricos que incluyen
vectores lentivíricos, vectores del virus vaccinia, vectores del
virus citomegalovirus, y vectores de baculovirus (Véase,
por ejemplo, Knops y col., J. Biol. Chem.
266:7285 (1991)), y similares. Se pueden usar las secuencias de ADN
derivadas del genoma vírico SV40, por ejemplo, origen SV40,
promotor temprano, mejorador, unir, y emplazamientos de
poliadenilación, para proporcionar los elementos genéticos no
transcritos requeridos. Los vectores útiles representativos
incluyen vectores pRc/CMV y pcADN3 (Invitrogen, San Diego,
Calif.).
Los promotores capaces de dirigir la
transcripción del ácido nucleico pueden ser promotores inducibles o
constitutivos, e incluyen promotores víricos y celulares. Para la
expresión en células huésped de mamíferos, los promotores víricos
adecuados incluyen el promotor del citomegaloviruas temprano
inmediato (Boshart y col., Cell
41:521-30 (1985) y el promotor del SV40 (Subramani
y col., Mol. Cell. Biol. 1:854-64
(1981)). Los promotores celulares adecuados para la expresión de
los ácidos nucleicos en células huésped de mamíferos incluyen, pero
no se limitan al promotor metalotionien-1 de ratón
(Palmiter y col., Patente de los Estados Unidos Nº
4.579.821), y el promotor que responde a tetraciclina (Gossen y
Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:5547-51 (1992); Pescini y col.,
Biochem. Biophys. Res. Comm. 202:1664-67
(1994)). Las señales de terminación de la transcripción se
localizan también normalmente corriente debajo de la secuencia de
codificación de interés. Las señales de terminación de la
transcripción incluyen las señales de poliadenilación antes o
después del SV40 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol.
2:1304-19 (1982)), la señal de poliadenilación
procedente de la región del Adenovirus 5 e1B, y el terminador del
gen de la hormona de crecimiento humana (DeNoto y col.,
Nucleic. Acid. Res. 9:3719-30 (1981)).
Se aumenta la transcripción de ácidos nucleicos
de ANG-7 en células de mamífero insertando
una secuencia de mejora en el vector. Los mejoradores son elementos
cis actuantes del ADN, comprendido normalmente entre 10 y
300 bp que actúan sobre un promotor para incrementar su
transcripción. Entre los ejemplos se incluyen el mejorador SV40 de
las cadenas secundarias del origen de replicación (bp 100 a 270), un
citomegalovirus mejorador del promotor temprano, un mejorador de
polioma de la cadena secundaria del origen de replicación, y
mejoradores de adenovirus.
Las células de mamíferos se pueden transfectar
por diferentes procedimientos entre los que se incluyen la
precipitación con fosfato de calcio (Véase, por
ejemplo Wigler y col., Cell 14: 725 (1978);
Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham
y Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)); lipofección
(Véase, por ejemplo, Felgner y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17 (1987)), y la
microinyección y electroporación (Véase, por ejemplo.
Neumann y col., EMBO J. 1: 841-45
(1982)). Las células de mamífero se pueden transducir con virus
tales como SV40, CMV y similares. En el caso de los vectores
víricos, las moléculas de ADN clonado se pueden introducir por
infección de células susceptibles con partículas víricas. Se
prefieren los vectores retrovíricos, incluyendo lentivíricos y los
adenovíricos para uso en la expresión de los ácido nucleicos de
ANG-7 en células de mamífero, especialmente
cuando se usan los ácidos nucleicos de ANG-7
en terapia génica.
Se usan habitualmente marcadores seleccionables
para identificar las células que contienen los ácidos nucleicos de
ANG-7. Los marcadores seleccionables se
introducen por lo general en células junto con las moléculas de ADN
clonado e incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos
tales como neomicina, higromicina y metotrexato. Los marcadores
seleccionables pueden también complementar auxotrofias en la célula
huésped. Otros marcadores seleccionables proporcionan también
señales detectables tales como
\beta-galactoxidasa, o proteína verde
fluorescente, para identificar las células que contienen los ácidos
nucleicos de ANG-7. Los marcadores
seleccionables se pueden amplificar. Dichos marcadores
amplificadores seleccionables se pueden usar para ampliar el número
de secuencias integradas en la célula huésped.
Se pueden emplear varios sistemas de cultivo de
células de mamífero para expresar los ácidos nucleicos de
ANG-7. Entre los ejemplos de sistemas de
expresión de mamíferos se incluyen las líneas COS-7
de fibroblasto de riñón de mono (Véase, por ejemplo,
Gluzman, Cell 23:175 (1981)) y otras línea celulares capaces
de expresar un vector compatible, tales como las líneas celulares
C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK, VERO, HeLa, MDCK, 293, WI38, HEK, HUVEC.
Una vez establecidas dichas líneas celulares pueden crecer en
cultivo. Los procedimientos para cultivar células humanas in
vitro y para inmortalizar células son conocidos del técnico
experto.
Para una producción a largo plazo con alto
rendimiento de polipéptidos recombinantes se prefiere una expresión
estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que
expresan de forma estable los constructos que contienen los ácidos
nucleicos de ANG-7. Mejor que usar vectores
de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, se
pueden transformar las células huésped con los ácidos nucleicos de
ANG-7 mediante elementos de control de
expresión adecuados (por ejemplo, secuencias de promotor y
mejorador, finalizadores de transcripción, emplazamientos de
poliadenilación, y similares), y un marcador seleccionable. Tras la
introducción de dicho vector de expresión en células de mamífero se
deja que las células diseñadas crezcan durante 1-2
días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio
selectivo. El marcador seleccionable del vector de expresión
confiere resistencia a la selección, y permite que las células
integren el vector de forma estable en el cromosoma y crezcan para
formar foci que a su vez se pueden clonar y expandirse en líneas
celulares.
Se pueden usar diferentes sistemas de selección
que incluyen pero no se limitan a la timidina quinasa del virus
herpes simple ("tk") (Véase, por ejemplo Wigler
y col., Cell 11:223 (1977)), la
hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa
("pret") (Véase, por ejemplo, Szybalski y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026, y los genes de
la adenina fosforibosil-transferasa ("aprt")
(Véase, por ejemplo, Lowy y col., Cell
22:817 (1980)) y se pueden emplear en las células tk^{-},
hgprt^{-} o aprt^{-}, de manera respectiva. Se puede usar
también la resistencia antimetabolito como la base de la selección
para dihidrofolato reductasa ("dhfr") que confiere resistencia
al metotrexato (Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77:3567 (1980); O'Hare y col., FEBS Lett.
210:731 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido
micofenólico (Mulligan y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78:2072. (1981)), neomicina, que confiere resistencia al
aminoglicósido G-148
(Colberre-Garaphin y col., J. Mol.
Biol. 150:1 (1981)); e higromicina, que confiere resistencia a
la higromicina (Santerre y col., Gene 30:147
(1984)).
Los ácidos nucleicos de
ANG-7, se pueden expresar también en
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
hongos filamentosos, y otros organismos simples multicelulares que
se pueden llevar a transformación y/o transfección. Los
procedimientos para expresar genes clonados en Saccharomyces
cerevisiae son generalmente conocidos en la técnica.
(Véase, por ejemplo, "Gene Expression Technology"
In Methods in Enzimology, Vol 185, Goeddel (ed.), Academic
Press, San Diego, CA (1990); "Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology" In Methods in Enzimology, Guthrie y
Fink (eds), Academic Press, San Diego, CA (1991). Se pueden usar
también hongos filamentosos (por ejemplo, cepas de
Aspergillus) para expresar los ácidos nucleicos de
ANG-7. Los procedimientos para expresar genes
heterólogos y ADNc en células de mamífero cultivadas y en E.
coli, se describen con detalle en Sambrook y col.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición,
Cold Spring Harbor, NY 1989)). Como será evidente para alguien
experto en la técnica, se pueden expresar los ácidos nucleicos de
ANG-7 en otras células huésped tales como células
avícolas, de insecto y de planta usando secuencias reguladoras,
vectores y procedimientos bien establecidos en la bibliografía.
Los vectores de expresión recombinante útiles
para la expresión en bacterias incluyen de manera típica los
orígenes de la replicación y marcadores seleccionables que permiten
la transformación de la célula huésped (por ejemplo, los
genes de resistencia a la ampicilina o tetraciclina de E.
coli o los genes TRP1 o URA3 de S.
cerevisiae), y un promotor derivado de un gen altamente
expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural
corriente abajo. Dichos promotores se pueden derivar de operones
que codifican los enzimas glicolíticos, tales como
3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor alfa,
fosfatasa ácida, proteínas de choque térmico, factor de elongación
de la translación, y similares. El ácido nucleico de
ANG-7 heterólogo se ensambla en fase
apropiada con la iniciación de la traducción y las secuencias de
terminación, y de manera preferible, una secuencia líder capaz de
dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio
periplásmico o medio extracelular. De manera opcional, la secuencia
heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un
péptido de identificación N terminal que imparte las
características deseadas (por ejemplo, estabilización o
purificación simplificada del producto recombinante expresado). Los
huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella
typhimurium y diversas especies dentro de los géneros
Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus,
aunque se pueden emplear otras como materia de elección
rutinaria.
Los vectores de expresión útil para uso
bacteriano comprenden un marcador seleccionable y un origen
bacteriano de replicación derivado de plásmidos que comprenden
elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322
(ATCC 37017). Otros vectores incluyen pero no se limitan a, vectores
pBLUESCRIPT (Stratagene), PKK223-3 (Pharmacia Fine
Chemicals, Upsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis.).
Estas secciones del "esqueleto" de PBR322 se combinan con un
promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a
expresar.
Los vectores de expresión útiles comprenden de
manera adicional u socio de fusión para facilitar la purificación
de un polipéptido deseado o para producir polipéptidos solubles. Los
ejemplos de vectores de fusión comerciales incluyen, pero no se
limitan a pET32a (Novagen, Madison Wis.),
pGEX-4T-2 (Pharmacia) y pCYB3 (New
Englands Biolabs, Beverly, Mass.). Se pueden construir también
vectores de expresión que evitan el uso de socios de fusión, de
manera particular para una expresión de alto nivel del polipéptido
Ang-7 en células bacterianas. Por ejemplo,
se pueden fabricar vectores para optimizar el acoplamiento de
traducción, tal como se describe Por Pilot-Matias
y col (Gene 128:219-225 (1993)). De manera
alternativa, un ácido nucleico de ANG-7 se
puede coexpresar con un plásmido accesorio separado que por si mismo
codifica una proteína o péptido que ayuda en la solubilización de
un polipéptido Ang-7 de interés (Véase,
por ejemplo, Makrides Microbiological Reviews 60:512
(1996)).
Tras la transformación de una cepa huésped
deseable y el crecimiento de la cepa huésped en una densidad de
células apropiada, el promotor seleccionado se deja de reprimir
mediante un medio apropiado (por ejemplo, cambio de
temperatura o inducción química), y las células se cultivan durante
un período adicional. Las células se cosechan de manera típica
mediante centrifugación, interrumpida por medios físicos o químicos,
y se retiene el extracto crudo resultante para purificación
adicional. Se pueden interrumpir las células microbianas empleadas
en la expresión de las proteínas mediante cualquier procedimiento
conveniente, que incluye, ciclos de congelación descongelación,
sonicación, interrupción mecánica, o uso de agentes lisantes de
células; dichos procedimientos son bien conocidos para el
normalmente experto en la técnica.
Se pueden aislar los polipéptidos
Ang-7 usando numerosos procedimientos establecidos,
tales como cromatografía de afinidad usando anticuerpos anti
Ang-7 acoplados con un soporte sólido y una
cromatografía específica de secuencia tal como se describe por
Lobanenkov y col. (Oncogene 5:1743-53
(1990)) y usando anticuerpos frente a un epítopo seleccionado del
polipéptido Ang-7 (por ejemplo,
anti-His_{4}, myc, FLAG, y similares). Los
procedimientos de aislamiento adicionales incluyen medios de
purificación tales como la cromatografía líquida, cromatografía
líquida de alta resolución, FPLC, centrifugación en gradiente y
electroforesis en gel, entre otros. Son conocidos en la técnica los
procedimientos de purificación de proteínas y se pueden aplicar a
la purificación de polipéptidos recombinantes descrita en el
presente documento (Véase generalmente, Scopes, Protein
Purification, Spriger-Verlag, NY (1982)).
En un ejemplo de referencia, se proporcionan
anticuerpos anti Ang-7 para el uso en la modulación
de la angiogénesis. Dichos anticuerpos puede enlazar con los
polipéptidos Ang-7.
Los polipéptidos Ang-7 para
establecer anticuerpos monoclonales o antisuero siguiendo, por
ejemplo, el procedimiento de Kohler y Milstein (Nature 256:495
(1975)). Dichos anticuerpos monoclonales pueden formar a
continuación la base para el tratamiento, uso terapéutico, o ensayo
diagnóstico.
Se puede llevar a cabo la producción de antisuero
no humano o anticuerpos monoclonales (por ejemplo, murina,
lagomorfos, porcino o equino) mediante, por ejemplo,
inmunización de un animal con polipéptidos Ang-7,
con o sin un coadyuvante. Para la producción de anticuerpos
monoclonales, se obtuvieron células productoras de anticuerpos a
partir de animales inmunizados, inmortalizados y seleccionados, o
seleccionados en primer lugar para la producción de los anticuerpos
que enlazan con el antígeno, y a continuación inmortalizados. Puede
ser deseable transferir las regiones de enlace del antígeno (por
ejemplo, F(ab'), F(ab')_{2}, Fv, o regiones
hipervariables) de anticuerpos no humanos en el marco de un
anticuerpo humano mediante técnicas de ADN recombinante para
producir una molécula sustancialmente humana. Los procedimientos
para producir dichas moléculas "humanizadas" son generalmente
bien conocidos y se describen en, por ejemplo, las Patentes
de los Estados Unidos N^{os} 4.816.567; 4.816.397; 5.693.762; y
5.712.120; la Publicación de patente Internacional WO 87/02671 y WO
90/00616; y la Publicación de Patente Europea 0.239.400; las
descripciones de las cuales se incorporan por referencia en el
presente documento). De manera alternativa, se puede identificar un
anticuerpo monoclonal humano o porciones del mismo seleccionando en
primer lugar una biblioteca de células B humanas de ADNc para las
moléculas de ADN que codifican los anticuerpos que enlazan de manera
específica con un polipéptido Ang-7 de acuerdo con
el procedimiento que se muestra de manera general por Huse y
col. (Science 246:1275-81 (1989)). Se
puede clonar y amplificar a continuación la molécula de ADN para
obtener secuencias que codifican el anticuerpo (o dominio de
enlace) de la especificidad deseada. La tecnología de despliegue de
fagos ofrece otra técnica para seleccionar anticuerpos que enlazan
con los polipéptidos Ang-7 (Véase, por
ejemplo las Publicaciones de Patente Internacional WO 91/17271 y
WO 92/01047), y Huse y col., más arriba).
Se pueden producir también anticuerpos mediante
inmunización genética usando vectores de expresión para dirigir la
expresión de los polipéptidos Ang-7. Se ha usado la
transferencia del gen mediada por bombardeo de partículas (Tang
y col., Nature 356:152-54 (1992);
Eisenbaum y col., DNA & Cell Biol.
12:791-97 (1993); Johnston y Tang, Meth. Cell.
Biol. 43 Pt.A:353-65 (1994); Vahlsing y
col., J. Immun. Meth. 175:11-22 (1994) y
la transferencia del gen retrovírico (Wang y col., DNA
& Cell. Biol. 12:799-805 (1993); Stover,
Curr. Opin. Inmunol. 6:568-71 (1994); Laube y
col., Human Gene Ther. 5:853-62 (1994)) para
generar respuestas de anticuerpo específico para las proteínas
codificadas mediante genes trasferidos. Estos procedimientos
permiten la producción de anticuerpos sin requerir purificación de
la proteína. Dichos procedimientos se pueden usar para producir
paneles de anticuerpos específicos a los polipéptidos
Ang-7. Se pueden generar también anticuerpos
monoclonales usando estos procedimientos.
Se pueden usar anticuerpos frente a polipéptidos
Ang-7 como reactivos para detectar polipéptidos
Ang-7 en muestras biológicas, tales como muestras
de biopsia de tumores, secciones de tejido y órgano, células
sanguíneas periféricas, y similares. Se pueden usar también dichos
anticuerpos en inmunoensayos para detectar y/o cuantificar, los
niveles de polipéptido Ang-7. Los inmunoensayos
adecuados para el uso en la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas, inmunoblots,
reacciones de inhibición o competición, ensayos sándwich,
radioinmunoprecipitación, y similares. (Véase, por
ejemplo, Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.642.285;
4.376.110; 4.016.043; 3.879.262; 3.852.157; 3.850.752; 3.839.153;
3.791.932; y Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Publications NY (1988)).
En un ensayo, los polipéptidos
Ang-7 se identifican y/o cuantifican usando
anticuerpos marcados, de manera preferible anticuerpos monoclonales
marcados. Los anticuerpos se hacen reaccionar con tejidos o células,
y a continuación los tejidos o células se examinan para determinar
si los anticuerpos enlazan de manera específica con el polipéptido
Ang-7 diana. Dichos ensayos se llevan a cabo de
manera típica bajo condicione que conducen a la formación del
complejo inmune. Se pueden usar anticuerpos primarios no marcados en
combinación con marcas que son reactivas con anticuerpos primarios
para detectar el polipéptido Ang-7. Por
ejemplo, se puede detectar el anticuerpo primario de manera
indirecta mediante un anticuerpo secundario marcado fabricado para
detectar de manera específica el anticuerpo primario. De manera
alternativa, se puede marcar de manera directa el anticuerpo anti
Ang-7. Se pueden emplear una amplia variedad de
marcas, tales radionucleidos, partículas (por ejemplo, oro,
ferritina, partículas magnéticas y glóbulos rojos), fluoróforos,
quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de
enzimas, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente
haptenos), y similares.
Se pueden usar polipéptidos anti
Ang-7 en un ensayo diagnóstico para detectar los
niveles de polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, en
diversos tejidos, puesto que la subexpresión de las proteínas en
comparación con las muestras normales de tejido de control puede
detectar la presencia de angiogénesis anormal, por ejemplo, un
tumor, Los ensayos usados para detectar los niveles de proteína en
una muestra derivada de un huésped son bien conocidos por aquellos
expertos en la técnica e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de
enlace competitivo, análisis Western blot, ensayos ELISA y ensayos
tipo "sándwich". Los ensayos diagnósticos incluyen también la
detección de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la
presente invención.
Los compuestos Ang-7 incluyen
polipéptidos Ang-7 con la SEC DE ID Nº: 2, tal como
se describe en el presente documento. Dichos compuestos
Ang-7 pueden incluir de manera adicional ácidos
nucleicos de ANG-7 que codifican el
polipéptido Ang-7 de la invención, tal como se
describe en el presente documento, y los ácidos nucleicos
antisentido de ANG-7, como se describe a
continuación de manera más completa. Los transtornos que implican a
la angiogénesis se pueden tratar mediante el uso de un compuesto
Ang-7 tal como se ha definido anteriormente que
inhibe la angiogénesis, tal como mediante la administración de
polipéptidos Ang-7 con la SEC DE ID Nº: 2 y/o
ácidos nucleicos de ANG-7. De manera similar,
los transtornos en los que la angiogénesis es deficiente o se desea
que se pueda tratar mediante la administración de un ácido nucleico
antisentido de ANG-7, o un polipéptido
Ang-7, que inhibe la función Ang-7
tal como se ha definido anteriormente.
Los compuestos se pueden administrar terapéutica
o profilácticamente. Se pueden poner en contacto con la célula
huésped in vivo, ex vivo, o in vitro, en una
cantidad efectiva, tal como se demuestra por los siguientes
ejemplos.
Los ácidos nucleicos de
ANG-7 que codifican los polipéptidos
Ang-7 de la presente invención se pueden usar en un
procedimiento de terapia génica. La terapia génica se refiere al
procedimiento de conseguir la expresión de secuencias de ácido
nucleico de origen exógeno en un sujeto, para el tratamiento de una
enfermedad o dolencia clínica que padece el sujeto. Dicha terapia
génica puede estar implicada en el tratamiento de una enfermedad o
dolencia clínica que puede incluir, pero no limitarse a, cáncer,
curación de una herida, retinopatías diabéticas, degeneración
macular, enfermedades cardiovasculares, y dolencias clínicas que
implican la angiogénesis en el sistema reproductivo, que incluyen
la regulación de la vascularización de la placenta o el uso como un
abortivo. La liberación de ácido nucleico en un sujeto puede ser
bien directa, en el caso que el paciente esté directamente expuesto
al ácido nucleico o vector transportador del ácido nucleico, o
indirecta, en cuyo caso las células se transforman en primer lugar
con el ácido nucleico in vitro, y a continuación se
transplantan en el paciente. Estas dos soluciones son conocidas, de
manera respectiva, como terapia génica in vivo o ex
vivo. Por ejemplo se puede expresar de manera recombinante el
polipéptido Ang-7 mediante células diseñadas con un
polinucleótido (de ADN o ARN) que codifica el polipéptido, fragmento
o variante ex vivo, las células diseñadas se suministran a
continuación a un paciente que se va a tratar con el polipéptido.
Se pueden diseñar también las células mediante procedimientos
conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula
retrovírica / lentivírica que contiene ARN que codifica el
polipéptido Ang-7. Se describen a continuación los
procedimientos de ejemplo.
Para revisiones generales de los procedimientos
de terapia génica, Véase Goldspiel y col. (Clinical
Pharmacy 12:488-505 (1993)); Wu y Wu
(Biotherapy 3:87-95 (1991)); Tolstoshev
(Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596
(1993)); Mulligan (Science 260:926-932
(1993)); Morgan y Anderson (Ann. Rev. Biochem.
62:191-217 (1993)); y May (TIBTECH
11:155-215 (1993)). Se pueden usar procedimientos
comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología del ADN
recombinante que incluyen aquellos descritos por Ausebel y
col., (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
& Sons, NY (1993)); Kriegler (Gene Transfer and Expression.
A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)); y las Patentes
de los Estados Unidos N^{os} 6.077.663; 6.077.835; 0. 077.705; y
6.075.012. Son también aplicables a la terapia génica los
procedimientos que usan otras secuencias exógenas para la terapia
génica usando ácidos nucleicos de ANG-7 (Véase,
por ejemplo la Patente de los Estados Unidos Nº 6.066.624).
Se conocen diversos procedimientos para
transferir genes potencialmente terapéuticos a poblaciones de
células definidas (Véase, por ejemplo, Mulligan,
Science 260:926-31 ((1993)). Estos
procedimientos incluyen:
1) Transferencia génica directa (Véase,
por ejemplo, Wolf y col., Science
247:1465-68 (1990)).
2) Transferencia de ADN mediada por liposomas
(Véase, por ejemplo, Caplen y col., Nature
Med. 3:39-46 (1995) Crystal, Nature Med.
1:15-17 (1995); Gao y Huang, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 179:289-85 (1991)).
3) Transferencia de ADN mediada por retrovirus.
(Véase, por ejemplo Kay y col., Science
262:117-19 (1993); Anderson, Science
256:808-13 (1992)). Los retrovirus a partir de los
cuales se pueden derivar los vectores de plásmidos retrovíricos
mencionados anteriormente en el presente documento incluyen los
lentivirus. Se incluyen de manera adicional, pero no se limitan a,
Virus de la Leucemia de la Murina de Moloney, virus de la necrosis
del bazo, retrovirus tales como el Virus del sarcoma de Rous, Virus
del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis de aves, virus de la
leucemia del gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, Virus del
Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor mamario. En una forma
de realización, el vector del plásmido retrovírico se deriva del
Virus de la Leucemia de Murina de Maloney. Los ejemplos que ilustran
el uso de vectores retrovíricos en la terapia de genes incluyen de
manera adicional los siguientes: Clowes y col., (J. Clin.
Invest. 93:644-651 (1994)); Kiem y col.,
(Blood 83:1467-1473 (1994)); Salmons y
Gunzberg (Human Gene Therapy 4:129-141
(1993)); y Grossman y Wilson (Curr. Opin. In Genetics and
Devel. 3:110-114 (1993)).
4) Transferencia de AND mediada con un virus con
ADN. Dichos virus con ADN incluyen adenovirus (de manera preferible
vectores basados en Ad-2 o Ad-5),
virus del herpes (de manera preferible vectores basados en el virus
del herpes simplex), y parvovirus (de manera preferible vectores
basados en parvovirus no autónomos o "defectuosos", de manera
más preferible vectores basados en virus adenso asociados, lo más
preferible vectores basados en AAV-2).
(Véase, por ejemplo, Ali y col., Gene
Therapy 1:367-84 (1994); y las Patentes de los
Estados Unidos N^{os} 4.797.368 y 5.139.941, las descripciones de
las cuales se incorporan en el presente documento por referencia).
Los adenovirus tienen la ventaja de que tienen un amplio intervalo
de huéspedes, pueden infectar células definitivamente diferenciadas
o latentes, tales como neuronas o hepatocitos, y parecen
esencialmente no oncogénicos. Los adenovirus no parecen integrarse
en el genoma del huésped. Debido a que existen
extracromosomalmente, el riesgo de mutagénesis insercional es muy
reducido. Los virus adenoasociados presentan ventajas similares a
los vectores basados en adenovirus. Sin embargo, los AAV presentan
una integración específica del emplazamiento en el cromosoma
humano
19.
19.
Kozarsky y Wilson (Current Opinión in Genetics
and development 3:499-503 (1993)) presentan una
revisión de la terapia de genes basada en adenovirus. Bout y
col., (Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)
demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes
al epitelio respiratorio de los monos rhesus. Herman y col.,
(Human Gene Therapy 10:1239-1249 (1999))
describen la inyección intraprostática en una próstata humana de un
adenovirus con replicación deficiente que contiene el gen de la
timidina quinasa del herpes simplex, seguido por la administración
intravenosa del profármaco ganciclovir en un ensayo clínico en fase
I. Otros ejemplos del uso de adenovirus en terapia génica se pueden
encontrar en Rosenfeld y col., (Science
252:431-434 (1991)); Rosenfeld y col.,
(Cell 68:143-155 (1992)); Mastrangeli y
col., (J. Clin. Invest. 91:225-234
(1993)); y Thompson (Oncol. Res. 11:1-8
(199)).
La elección del sistema de vector concreto para
transferir el gen de interés dependerá de una variedad de factores.
Un factor importante es la naturaleza de la población de células
diana. Aunque se han estudiado de manera extensa los vectores
retrovíricos usados en numerosas aplicaciones de terapia génica,
estos vectores no son generalmente adecuados para infectar células
que no están en división. De manera adicional, lo retrovirus tienen
el potencial para la oncogenicidad. Sin embargo, recientes
desarrollos en el campo de los vectores lentivíricos puede rodear
alguna de estas limitaciones. (Véase Naldini y col.,
Science 272:263-7 (1996)
La terapia génica con ADN que codifica un
polipéptido de la presente invención se proporciona a un sujeto
(por ejemplo un paciente o mamífero) que necesita de la
misma, concurrente con, o inmediatamente después de la diagnosis.
Los expertos en la técnica apreciarán que se puede usar cualquier
vector de terapia génica adecuado que contiene ADN que codifica un
polipéptido de la presente invención de acuerdo con la presente
invención. Son conocidas las técnicas para construir dichos vectores
(Véase, por ejemplo, Anderson, Nature 392
25-30 (1998); Verma, Nature 389
239-42 (1998). Se puede llevar a cabo la
introducción del vector en el emplazamiento diana usando técnicas
conocidas.
En una forma de realización, el ácido nucleico de
ANG-7 se inserta en un vector de expresión.
Los ácidos nucleicos de ANG-7 codifican un
polipéptido Ang-7 o proteína quimérica. De manera
particular, dicho constructo del vector de expresión comprende
normalmente un promotor operable enlazado con el ácido nucleico de
ANG-7 (por ejemplo ADNc o una porción
de la región de codificación), siendo el promotor inducible o
constitutivo, y, de manera opcional, específico del tejido.
En otra forma de realización, si un ácido
nucleico de ANG-7 es defectuoso, se pueden
sustituir las secuencias defectuosas mediante secuencias que
codifican ANG-7 exógeno y cualquier otra
secuencia deseada que esté flanqueada por regiones que promuevan la
recombinación homóloga en un emplazamiento deseado en el genoma,
proporcionando de esta manera la expresión intracromosómica del
ácido nucleico de ANG-7 (Véase, por
ejemplo, Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:8932-8935 (1989); Zijlstra y col.,
Nature 342:435-438 (1989)); Patentes de los
Estados Unidos N^{os} 5.631.153; 5.627.059; 5.487.992; y
5.464.764.).
Los ácidos nucleicos se pueden administrar
también en enlace con un péptido que se conoce por entrar en el
núcleo, administrando el ácido nucleico en enlace con un ligando
sujeto a la endocitosis mediada por receptor (Véase, por
ejemplo Wu y Wu, J. Biol. Chem.
262:4429-4432 (1987), que se puede usar para tipos
de células diana que expresan de manera específica los receptores y
similares. En otra forma de realización se puede formar un complejo
ácido nucleico-ligando en el que el ligando
comprende un péptido vírico fusogénico que interrumpe los
endosomas, permitiendo al ácido nucleico evitar la degradación
lisosómica.
En otra forma de realización más, el ácido
nucleico puede ser diana in vivo para la captación y
expresión específica de células, haciendo de diana un receptor
específico (Véase, por ejemplo, las Publicaciones de
Patentes Internacionales WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO
93/14188, y WO 93/20221). De manera alternativa, se puede
introducir el ácido nucleico intracelularmente e incorporar en el
interior del ADN de la célula huésped para la expresión mediante
recombinación de homólogos. (Véase, por ejemplo,
Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:8932-8935 (1989); Zijlstra y col.,
Nature 342:435-438 (1989); Patentes de los
Estados Unidos N^{os} 5.631.153; 5.627.059; 5.487.992; y
5,464.764).
En una forma de realización específica, se usa un
vector vírico que contiene el ácido nucleico de
ANG-7. Por ejemplo, se puede usar un vector
retrovírico (Véase Miller y col., Meth.
Enzymol. 17:581-599 (1993)). Estos vectores
retrovíricos se han modificado para borrar secuencias retrovíricas
que no son necesarias para el empaquetamiento del genoma vírico y la
integración en un ADN de la célula huésped. El ácido nucleico de
ANG-7 que se va a usar en la terapia génica se clona
en el vector, lo que facilita la liberación del gen en un paciente.
Se pueden encontrar más detalles acerca de los vectores retrovíricos
en Boesen y col. (Biotherapy 6:291-302
(1994)), que describe el uso de un vector retrovírico para liberar
el gen mdrl en las células hematopoiéticas de la corriente
con el fin de hacer a las células de la corriente más resistentes a
la quimioterapia.
Otras soluciones de la terapia génica implican
transferir un gen a células en un cultivo de tejido mediante
procedimientos tales como electroporación, lipofección, transfección
mediada con fosfato de calcio, o infección vírica. De manera
típica, el procedimiento incluye la transferencia de un marcador
seleccionable a las células. Las células se colocan a continuación
bajo selección para aislar aquellas células que han captado y están
expresando el gen trasferido. Las células seleccionadas se liberan a
continuación en un paciente.
Se conocen numerosas técnicas en la técnica para
la introducción de los genes anteriores en las células
(Véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, Meth.
Enzimol. 217:599-618 (1993); Cohen y
col., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993);
Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)) y se
pueden usar de acuerdo con la presente invención. La técnica se
proporciona de manera típica para la transferencia estable del ácido
nucleico en la célula, de tal manera que el ácido nucleico es
expresable por la célula y es heredable y expresable por su
progenie celular.
Las células recombinantes resultantes se pueden
liberar en un paciente por diversos procedimientos conocidos en la
técnica. De manera típica, las células se inyectan por vía
subcutánea. De manera alternativa, las células de la piel
recombinantes se pueden aplicar como un injerto de piel sobre el
paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo,
la corriente hematopoiética o las células del progenitor) se
administran de manera típica por vía intravenosa. La cantidad de
células previstas para el uso depende del efecto deseado, la
dolencia del paciente, y similares, y se puede determinar por una
persona experta en la técnica.
Las células en las que se introduce el ácido
nucleico con objetivos de terapia génica abarcan cualquier tipo
deseado de célula disponible, e incluyen pero no se limitan a,
células endoteliales, células de la próstata, células epiteliales,
queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos,
células de la sangre (tales como linfocitos T, linfocitos B,
monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos y
granulocitos, diversas células de la corriente o progenitoras (de
manera particular células de la corriente hematopoiética o
progenitoras, tales como aquellas obtenidas a partir de la médula
ósea, sanguíneas del cordón umbilical, sanguíneas periféricas,
hígado fetal, y similares). Las células usadas para la terapia
génica son generalmente autólogas en el paciente, pero se pueden
usar células heterólogas que se pueden caracterizar para la
compatibilidad con el paciente.
La invención proporciona la administración a un
sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto
Ang-7. Por ejemplo, se puede tratar o evitar
una angiogénesis no deseada mediante la administración de una
cantidad efectiva de polipéptido Ang-7. Dichos
polipéptidos se administran de manera terapéutica (incluyendo
profilácticamente) en enfermedades o dolencias clínicas,
específicamente tumores, que implican un aumento (relativa al normal
o deseado) de la angiogénesis, para inhibir por esta vía la
angiogénesis. En otra forma de realización, dichos polipéptidos se
pueden administrar por vía terapéutica (incluyendo
profilácticamente) en enfermedades o dolencias clínicas,
específicamente tumores, en las que la angiogénesis puede ser
relevante para la causalidad o tratamiento de la enfermedad o
dolencia clínica, con el fin de inhibir la enfermedad o dolencia
clínica.
Normalmente, el compuesto Ang-7
se purifica de manera sustancial antes de la formulación. El sujeto
puede ser un animal, incluyendo pero no limitándose a, vacas,
cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, y similares, y es
normalmente un mamífero, y en una forma de realización particular un
ser humano. En otra forma de realización específica, el sujeto es
un mamífero no humano. Se han descrito anteriormente las
formulaciones y procedimientos de administración que se pueden
emplear cuando el compuesto Ang-7 comprende un ácido
nucleico; las formulaciones apropiadas adicionales y las rutas de
administración se pueden seleccionar entre aquellas descritas a
continuación.
Se conocen y se pueden usar diversos sistemas de
liberación para administrar un compuesto Ang-7,
tales como, por ejemplo, encapsulación en liposomas,
micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de
expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor
(Véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem.
262:4429-4432 (1987), construcción de un vector de
expresión que comprende un ácido nucleico de
ANG-7 como parte de un vector retrovírico u
otro, y similares. Los procedimientos de introducción incluyen,
pero no se limitan a, vías intradérmicas, intramusculares,
intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, intranasales,
epidurales y orales. Los compuestos se pueden administrar por
cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o
inyección en bolo, mediante absorción a través de recubrimientos
epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa
rectal e intestinal) y similares, y se pueden administrar junto con
otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser
sistémica o local.
En una forma de realización específica, puede ser
deseable administrar un compuesto Ang-7 de manera
local en el área que necesita de tratamiento; esta administración
se puede conseguir mediante, por ejemplo, y no como medio de
limitación, infusión local durante cirugía, aplicación tópica
(por ejemplo, en conjunción con un apósito de herida tras
cirugía), mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de
un supositorio, o por medio de un implante, siendo el implante de
un material poroso, no poroso, o gelatinosos, que incluye membranas
tales como membranas sialásticas, o fibras. En una forma de
realización, la administración puede ser mediante inyección directa
en el emplazamiento (o emplazamiento anterior) de un tumor maligno o
tejido neoplástico o pre-neoplástico.
En otra forma de realización, el compuesto
Ang-7 se puede liberar en una vesícula, de manera
particular un liposoma (Véase Langer, Science
249:1527-1533 (1990); Treat y col., En
Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,
Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York,
pp. 353-365 (1989);
Lopez-Berenstein, más arriba, pp.
317-327); Patentes de los Estados unidos N^{os}
6.077.663 y 6.071.533).
En otra forma de realización más, el compuesto
Ang-7 se puede liberar en un sistema de liberación
controlada. En una forma de realización, se puede usar una bomba
(Véase Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref.
Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y col.,
Surgery 88:507 (1980); Saudek y col., N. Engl. J.
Med. 321:574 (1989)). En otra forma de realización, se pueden
usar materiales poliméricos (Véase, por ejemplo, Medical
Applications of Controlled Release, Langer y Wise (ed.), CRC
Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug
Biovailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y
Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Pepas, J.
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levy y
col., Science 228:190 (1985); During y col.,
Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y col., J.
Neurosurg. 71:105 (1989)). En otra forma de realización más, se
puede colocar un sistema de liberación controlada en la proximidad
de la diana terapéutica, requiriendo de esta manera únicamente una
fracción de la dosis sistémica (Véase, por ejemplo, Goodson,
en Medical Applications of Controlled Release, más
arriba, Vol. 2, pp. 115-138 (1984). Se
describen otros sistemas de liberación controlada en, por
ejemplo, la revisión por Langer (Science
249:1527-1533 (1990)).
Se describen también composiciones farmacéuticas
para administrar compuestos Ang-7. Dichas
composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de
un compuesto Ang-7 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa
aprobado por una agencia reguladora gobierno federal o estatal, o
relacionada en la U. S. Pharmacopeia u otra farmacopea generalmente
reconocida para uso en animales, y de manera más típica en seres
humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente,
coadyuvante, excipiente, estabilizador, o vehículo con cuyo
compuesto Ang-7 se formula para la
administración.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede
contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por
ejemplo, para estabilizar la composición o para aumentar o disminuir
la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente aceptable
puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa,
sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o
glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u
otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos
fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes
emulsificantes, agentes dispersantes o conservantes, que son
particularmente útiles para evitar el crecimiento o acción de los
microorganismos. Los vehículos incluyen de manera adicional líquidos
estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen
de petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de
cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y
similares. El agua es un vehículo típico cuando la composición
farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear
también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y
glicerol como vehículos líquidos, de manera particular para
soluciones inyectables. Son bien conocidos diversos conservantes e
incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Los excipientes
farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa,
sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice,
estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de
sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua,
etanol, y similares. Una persona experta en la técnica podrá
conocer que la elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable,
que incluye un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por
ejemplo, de la vía de administración del polipéptido y en particular
de las características físico químicas del polipéptido específico..
Por ejemplo, un vehículo fisiológicamente aceptable tal como un
monoestearato de aluminio o gelatina es particularmente útil como
agente retardante, que prolonga la velocidad de absorción de una
composición farmacéutica administrada a un sujeto. Se pueden
encontrar ejemplos adicionales de vehículos, estabilizantes o
coadyuvantes en Martín, Remington's Pharm. Sci. 15ª Ed. (Mack
Publ. Co., Easton, 1975), incorporado en el presente documento por
referencia. Se pueden incorporar también composiciones
farmacéuticas, si se desea, en liposomas, microesferas u otras
matrices de polímeros (Véase Gregoriadis, Liposome
Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Fla, 1984), que se
incorpora en el presente documento por referencia). Los liposomas,
por ejemplo, que están constituidos por fosfolípidos u otros
lípidos, son vehículos metabolizables y fisiológicamente aceptables
no tóxicos que son relativamente simples de hacer y
administrar.
administrar.
Cuando se practica in vivo, son bien
conocidos en la técnica los procedimientos para administrar una
composición farmacéutica que contiene el vector de esta invención e
incluyen, pero no se limitan a, administración por vía oral, intra
tumoral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. La
administración se puede efectuar de manera continua o intermitente
y variará con el sujeto y la dolencia que se va a tratar, por
ejemplo, como es el caso con otras composiciones terapéuticas
(Véase Landmann y col., J. Interferon Res.
12:103-111 (1992); Aulitzky y col., Eur.
J. Cancer 27:462-67 (1991); Lantz y col.,
Citokine 2:401-06 (1990); Supersaxo y
col., Pharm. Res. 5:472-76 (1988);
Demetri y col., J. Clin. Oncol.
7:1545-53 (1989); y Lemaitre y col.,
Lancet 337:1124-25 (1991)).
Las composiciones farmacéuticas pueden tomar la
forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos,
píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y
similares. La composición se puede formular como un supositorio,
con ligantes tradicionales y vehículos tales como triglicéridos. Las
formulaciones orales pueden incluir vehículos estándar tales como
calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y
similares.
Las composiciones farmacéuticas contendrán una
cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto
Ang-7, normalmente en forma purificada, junto con
una cantidad adecuada de vehículo con el fin de proporcionar una
formulación apropiada para la administración al paciente. La
formulación debería ajustarse al modo de administración.
En una forma de realización, la composición se
formula de acuerdo con los procedimientos de rutina como una
composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a
seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración
intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril.
Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un
agente solubilizante y un anestésico local para disminuir el dolor
en el emplazamiento de la inyección. Generalmente, los ingredientes
se suministran bien de manera separada o mezclados conjuntamente en
forma de dosificación unitaria. Por ejemplo, como un polvo
liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor
herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito indicando
la cantidad de compuesto Ang-7. Cuando la
composición es para administrar mediante infusión, se puede
dispensar con una botella de infusión que contiene agua de calidad
farmacéutica estéril o solución salina. Cuando la composición se
administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de
agua estéril para inyección o solución salina de tal manera que los
ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.
Los compuestos Ang-7 se pueden
formular en formas de sal o neutras. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales
como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético,
oxálico, tartárico y similares, y aquellos formados con grupos
carboxilo libres tales como aquellos derivados de sodio, potasio,
amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina,
2-etilamino etanol, histidina, procaína y
similares.
La cantidad de compuesto Ang-7
que será efectiva en el tratamiento de un trastorno o dolencia
particular como se indica por la modulación de la angiogénesis
dependerá de la naturaleza del trastorno o dolencia, y se puede
determinar mediante técnicas clínicas estándar. De manera adicional,
se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar
los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa del
compuesto Ang-7 que se va a emplear en la
formulación dependerá también de la vía de administración, y de la
gravedad de la enfermedad o trastorno, y deberá de decidirse de
acuerdo con el juicio del médico y de las circunstancias de cada
paciente. Los intervalos de dosificación adecuados para la
administración intravenosa son generalmente de aproximadamente
20-500 microgramos de compuesto
Ang-7 activo por kilogramo de peso corporal. Los
intervalos de dosificación adecuados para la administración
intranasal son generalmente de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso
corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Se pueden extrapolar las dosis
efectivas a partir de las curvas de respuesta de dosis derivadas
del sistema de ensayo del modelo animal in vitro. Los
supositorios contienen generalmente ingrediente activo en el
intervalo de un 0,5% a un 10% en peso; las formulaciones orales
contienen normalmente un 10% a un 95% de ingrediente activo.
La descripción proporciona también un pack o kit
farmacéutico que comprende uno o más contenedores rellenos con uno
o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Opcionalmente asociado con dicho(s)
contenedor(es) puede estar un prospecto en la forma prescrita
por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o
la venta de los productos farmacéuticos o biológicos, cuyo prospecto
refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta
para administración humana.
Tratamiento de las enfermedades relacionadas con
la angiogénesis. Los polipéptidos Ang-7 de SEC DE ID
Nº: 2 o ácidos nucleicos de ANG-7 que
codifican dichos polipéptidos, se pueden usar para tratar tumores
que pueden estar relacionados con la angiogénesis. Sin desear
quedar ligado por teoría concreta alguna, se cree que la iniciación
y/o progresión de muchas enfermedades es dependiente de la
angiogénesis. Por ejemplo, la formación del tumor está
claramente asociada con la angiogénesis. Dichos tumores incluyen
tumores sólidos, tales como rabdomiosarcomas, retinoblastoma,
sarcoma de Ewing, neuroblastoma, y osteosarcoma, y tumores benignos,
tales como neuroma acústico, neurofibroma, tracoma y granulomas
piógenos. De esta manera se puede tratar la formación o progresión
del tumor inhibiendo la angiogénesis; administrando polipéptidos
Ang-7 de SEC DE ID Nº: 2, o ácidos nucleicos de
Ang-7 al tumor, lo que inhibirá aún más el
crecimiento y/o progresión del tumor. De manera similar, se pueden
usar células que expresen los polipéptidos Ang-7
recombinantes de SEC DE ID Nº: 2, fragmento o variantes.
Se puede inhibir la función Ang-7
mediante el uso de ácidos nucleicos antisentido de
Ang-7. Se proporciona la presente invención para la
administración de ácidos nucleicos de al menos seis nucleótidos que
son antisentido para un gen o ADNc que codifica el polipéptido
Ang-7 o un fragmento o variante del mismo para
inhibir la función del polipéptido Ang-7. Un ácido
nucleico "antisentido" de ANG-7 tal como
se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico que
híbrida una porción de un ARN de ANG-7
(típicamente ARNm) en virtud de la complementariedad de algunas
secuencias. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario
con una región de codificación y/o sin codificación de un ARNm de
ANG-7. No se requiere sin embargo, aunque es
típica, la absoluta complementariedad. Una secuencia
"complementaria con al menos una porción de un ARN" tal como
se refiere en el presente documento, significa una secuencia que
tiene complementariedad suficiente para ser capaz de hibridarse con
el ARN, formando un dúplex estable. En el caso de ácidos nucleicos
antisentido de ANG-7 de doble cadena, se
puede ensayar una única cadena dúplex de ADN, o se puede ensayar la
formación de triples. La capacidad para hibridar dependerá del grado
de complementariedad y de la longitud del ácido nucleico
antisentido. Por lo general, cuanto más largo sea el ácido nucleico
hibridante, mayor número de bases desemparejadas contendrá, y sigue
formando un dúplex estable (o triplex según sea el caso). Una
persona experta en la técnica puede asegurar un grado tolerable de
desemparejamiento mediante el uso de procedimientos normalizados
para determinar el punto de fusión del complejo
hibridado.
hibridado.
Dichos ácidos nucleicos antisentido tienen
utilidad como agentes que inhiben la función Ang-7,
y se pueden usar en el tratamiento o prevención de enfermedades o
dolencias clínicas, tal como se describe más arriba. Los ácidos
nucleicos antisentido de la invención pueden ser oligonucleótidos
que son de cadena doble o de cadena única, ARN o ADN, o un derivado
del mismo, que se pueden administrar directamente a una célula, o
que se puede producir intracelularmente mediante transcripción de
las secuencias de ácido nucleico introducido exógeno.
El ácido nucleico antisentido de
ANG-7 proporcionado en el presente documento
se puede usar para evitar la angiogénesis.
Se describen también composiciones farmacéuticas
que comprenden una cantidad efectiva de ácidos nucleicos
antisentido de ANG-7 de la invención en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se describe más
arriba. En otra forma de realización, la invención se dirige a
procedimientos para inhibir la expresión de una secuencia de ácido
nucleico de ANG-7 en una célula eucariota que
comprende proporcionar la célula con una cantidad efectiva de una
composición que comprende un ácido nucleico antisentido de
ANG-7 de la invención. Se describen con
detalle a continuación los ácidos nucleicos antisentido de
ANG-7 y sus usos.
Los ácidos nucleicos antisentido de
ANG-7 son de al menos seis nucleótidos y son
típicamente oligonucleótidos (oscilando entre 6 y aproximadamente
50 nucleótidos o más), En un aspecto específico, el oligonucleótido
es al menos de 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos
100 nucleótidos, o puede ser al menos de 200 nucleótidos. Los
oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o
derivados de las mismas, y pueden ser de cadena única o de cadena
doble. Se puede modificar un derivado en la fracción base, fracción
azúcar, o esqueleto de fosfato, tal como se describe a
continuación. El derivado puede incluir otro grupos apéndices tales
como péptidos, o agentes que faciliten el transporte a lo largo de
la membrana celular (Véase, por ejemplo, Letsinger
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:6553-56 (1989); Lemaitre y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:648-52 (1987);
Publicación de Patente Internacional WO 88/09810) o barrera
hematoencefálica (Véase, por ejemplo, Publicación de
Patente Internacional WO 89/10134) agentes de rotura que
desencadenan la hibridación (Véase, por ejemplo, Krol
y col., BioTechniques 6:958-76
(1988)) o agentes intercalantes (Véase, por ejemplo,
Zon, Pharm. Res. 5:539-49 (1988)).
En una forma de realización, se proporciona un
oligonucleótido antisentido de ANG-7,
típicamente un ADN de cadena única. El oligonucleótido se puede
modificar en cualquier posición sobre su estructura con
sustituyentes generalmente conocidos en la técnica. El
oligonucleótido antisentido de ANG-7 puede
comprender al menos una fracción base modificada, tal como, por
ejemplo, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo, 5-clorouracilo,
5-iodouracilo, hipoxantina, xantina,
4-acetilcitosina,
5-(carboxi-hidroximetil)uracilo,
5-carboximetilaminoetil-2-tiouridina,
5-carboximetilamino-metiluracilo,
dihidrouracilo,
beta-D-galactosilqueosina, inosina,
N6-isopenteniladenina,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina,
2-metilguanina, 3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-adenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiaminometil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarboximetiluracilo, 5.metoxiuracilo,
2-metiltio-N-6-isopenteniladenina,
ácido uracil-5-oxiacético (v),
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, metil éster del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético (v),
5-metil-2-tiouracilo,
3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)
uracilo, 2,6-diaminopurina, y similares, En otra
forma de realización el oligonucleótido comprende al menos una
fracción azúcar modificada, tal como, por ejemplo, arabinosa,
2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.
En una forma de realización más, el
oligonucleótido comprende al menos un esqueleto de fosfato
modificado, tal como, por ejemplo, un fósforotioato, un
fósforoditioato, un fósforamidotioato, un fósforamidato, un
fósfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfo triéster, y un
formacetal o análogo del mismo.
En otra forma de realización más, el
oligonucleótido es un oligonucleótido
\alpha-anomérico. Un oligonucleótido
\alpha-anomérico forma híbridos de cadena doble
específicos con ARN complementario en el que, de manera contraria a
las unidades \beta usuales, las cadenas corren parelelas cada una
con la otra (Véase Gautier y col., Nucl. Acids
Res. 15:6625-41 (1987). Se puede conjugar el
oligonucleótido con otra molécula (por ejemplo, un péptido,
un agente de entrecruzamiento que desencadena la hibridación, un
agente de transporte, un agente de rotura que desencadena la
hibridación, y similares).
Se pueden sintetizar los oligonucleótidos
mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica (por
ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado
comercialmente disponible). Como ejemplos, se pueden sintetizar
oligonucleótidos de fósforotioato mediante el procedimiento de Stein
y col. (Véase Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)),y se
pueden preparar oligonucleótidos de metilfosfonato mediante el uso
de soportes de polímero de vidrio de tamaño de poro controlado
(Véase Sarin y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:7448-51 (1988)), y similares.
En una forma de realización específica, el
oligonucleótido antisentido de ANG-7
comprende ARN catalítico, o una ribozima (Véase, por
ejemplo publicación de Patente Internacional WO 90/11364; Sarver
y col., Science 247:1222-25 (1990)).
En otra forma de realización, el oligonucleótido es un
2'-0-metilribonucleótido
(Véase, por ejemplo, Inoue y col., Nucl.
Acids Res. 15:6131-48 (1987) o un análogo de
ARN-ADN quimérico (Véase, por ejemplo,
Inoue y col., FEBS Lett. 215:327-30
(1987)).
En una forma de realización alternativa, el ácido
nucleico antisentido de ANG-7 se produce
intracelularmente mediante transcripción a partir de una secuencia
exógena. Por ejemplo, se puede introducir un vector in
vivo tal que se pueda capturar por una célula, en el interior de
la cual se transcribe el vector o una porción del mismo,
produciendo un nucleótido antisentido (ARN) de la invención. El
vector contendría una secuencia que codifique el ácido nucleico
antisentido de ANG-7 o una porción del mismo.
Una vez en el interior de la célula, el vector puede permanecer
episómico o quedar integrado en el cromosoma, siempre que se pueda
transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Dichos
vectores se pueden construir por tecnología del ADN recombinante y
sus procedimientos estándar en la técnica. Los vectores pueden ser
plásmidos, víricos, u otros conocidos en la técnica, y usados para
la replicación y expresión en células de mamífero. La expresión de
la secuencia que codifica el ARN del ANG-7
antisentido se puede controlar por cualquier promotor conocido en
la técnica que actúe en células de mamífero, típicamente de seres
humanos. Los promotores pueden ser inducibles o constitutivos.
Entre los promotores inducibles se incluyen, pero no se limitan a la
región del promotor temprano SV40 (Véase Bernoist y Chambon,
Nature 290:304-10 (1981)), el promotor que
se contiene en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma
de Rous (Véase Yamamoto y col., Cell
22:787-97 (1980)), el promotor de la timidina
quinasa del herpes (Véase Wagner y col., Proc.
Natl. Acad, Sci. USA 78:1441-45 (1981)), las
secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Véase
Brinster y col., Nature 296:39-42
(1982)), y similares.
La descripción proporciona también modelos
animales. En un aspecto de referencia, se proporcionan modelos
animales para transtornos y enfermedades que implican angiogénesis.
Dicho modelo animal se puede producir inicialmente promoviendo la
recombinación homóloga entre un gen de ANG-7
en su cromosoma y un gen de ANG-7 exógeno
que se ha vuelto inactivo (típicamente, por inserción de una
secuencia heteróloga, por ejemplo, un gen de resistencia a
los antibióticos). Por ejemplo, la recombinación homóloga se
lleva a cabo transformando células sanguíneas (ES) embrioderivadas
que contienen el gen de ANG-7 inactivado de
forma que se puede insertar, de forma que dicha recombinación tiene
lugar, seguida por inyección de las célula ES en el interior de un
blastocito, e implantando el blastocito en una madre de alquiler,
seguido por el nacimiento de un animal quimérico ("knockout
animal") en el que se ha inactivado el gen de
ANG-7 (Véase, por ejemplo,
Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989);
Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.631.153; 5.627.059;
5.487.992; y 5.464.764). El animal quimérico se puede cuidar para
producir más animales knockout. Dichos animales pueden ser ratones,
hamster, ovejas, cerdos, ganado vacuno y similares, y son
típicamente mamíferos no humanos. En una forma de realización
específica se produce un ratón knockout. Los animales knockout se
espera que desarrollen o estén predispuestos a desarrollar
enfermedades o transtornos relacionados con los estados
hiperangiogénicos, y pueden ser útiles para seleccionar o ensayar
moléculas respecto de su capacidad de disminuir la angiogénesis y
por tanto para tratar dichas enfermedades y transtornos.
En otra forma de realización, los animales
transgénicos que han incorporado y sobreexpresado los genes de
ANG-7 han usado como modelos animales de
enfermedades y transtornos que implican hipoangiogénesis. Se espera
que los animales transgénicos desarrollen o estén predispuestos a
desarrollar condiciones hipoangiogénicas, o muestren mayor
resistencia a las enfermedades que necesitan angiogénesis, tales
como la formación de tumores. De esta forma, estos animales se
pueden usar como modelos animales de dichas enfermedades y
transtornos, o de resistencia a dichas enfermedades y estados.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como
ilustración pero no limitan la invención que se reivindica.
Para identificar miembros de la familia de los
ligandos de la angiopoietina se llevó a cabo una búsqueda BLAST
(Altschul y col., Nucleic Acids Res.
25:3389-402 (1997)) usando la base de datos de
secuencia expresada Tag (EST) procedente del National Center for
Biotechnology Information (NCBI). La secuencia de aminoácidos de
Ang-1 se usó como sonda. Esta búsqueda identificó un
EST humano (Número de Acceso AA773234).La secuencia de aminoácidos
correspondiente de este EST mostró una identidad de secuencia
significativa en el marco de lectura +2 respecto de
Ang-1. El valor de probabilidad (P) fue 4,4 x
10^{-28} lo que indica fuertemente que el EST identificado
codifica un fragmento de una proteína que pertenece a la familia de
las angiopoietinas. Se obtuvo una prueba adicional de que el EST
codifica un fragmento de una proteína de angiopoietina (que se
designó como "Ang-7") cuando una búsqueda BLAST
en la base de datos Swissprot se realizó usando la secuencia de
aminoácido deducida EST AA773234. Los valores de P obtenidos para
alineamientos de Ang-1 y Ang-2 con
la secuencia parcial de aminoácidos de Ang-7 fueron
3,2 x 10^{-32} y 2,6 x 10^{-34}, respectivamente.
Otra búsqueda de la base de datos EST identificó
otro EST (Número de Acceso AA255590), que también codifica una
porción del ADNc de ANG-7. El análisis de la
secuencia de ADN reveló que la secuencia de nucleótidos del EST
AA255590 se superpone sobre una porción de la secuencia EST
AA773234. Puesto que EST AA773234 no resulta fácilmente disponible,
se usó como sonda en los experimentos posteriores el ácido nucleico
de EST AA255590.
Para obtener el clon de ADNc de longitud completa
que codifica Ang-7 se usó EST AA255590 como sonda en
una biblioteca de ADNc humano. En breve EST AA255590 se localiza en
un vector pT7T3D-Pac (Pharmacia, Peapack, Nueva
Jersey) entre los emplazamientos de restricción de las endonucleasas
Not I y Eco RI. El plásmido se linealizó con la endonucleasa de
restricción Eco RI. Se generó una sonda de ARN antisentido marcada
radioactivamente con [^{32}P] usando un kit
Strip-EZ T3 (Ambion, Austin, Texas) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Se seleccionó una Biblioteca de
ADNc Humana Universal (HUCL) hibridando las membranas primarias HULC
(Stratagene, La Jolla, California, USA) con la sonda de ARN marcada
radioactivamente. La hibridación y el lavado se llevaron a cabo
según las recomendaciones del fabricante. (Véase el Manual
del Kit Strip Ez ). Tras el lavado, la membrana se expuso a una
pantalla de generación de imágenes por fosforescencia, se escaneó en
un escáner Fuji Bas-1500, y se evaluó la intensidad
de las señales radioactivas con el software TINA 2.0 (Raytest,
Staubenhardt, Alemania). El análisis del perfil de hibridación
reveló una señal en la posición L04. La correspondiente membrana
matriz secundaria se híbrido en las mismas condiciones. Se detectó
una señal de hibridación en la posición G19 de la membrana de
matriz secundaria. Se obtuvo del suministrador el clon individual
L04G19. El análisis del clon L04G19 reveló que contenía un inserto
de aproximadamente kilo bases ("cha"). El análisis de la
secuencia de ADN confirmó que este clon de ADNc contenía la
secuencia de codificación de longitud completa del ADNc de
ANG-7.
El análisis de la secuencia de ADN del ADNc
L04G19 reveló que dicho ADNc tiene 2.173 pares de bases ("bp")
de longitud, que incluye un residuo corto poli A. La secuencia ADNc
de ANG-7 se muestra en la Fig. 1 (SEC. ID Nº: 1). El ADNc
tiene un marco abierto de lectura de 1,432 bp. El marco abierto de
lectura codifica un polipéptido con 493 residuos de aminoácidos
(SEC. ID Nº: 2; Fig. 2). Se llevó a cabo un alineamiento de
similaridad de la secuencia de aminoácidos del ANG-7 con las
secuencias de las angiopoyetina-I humana (SEC. ID
Nº: 3), angiopoyetina-2 humana (SEC. ID Nº: 4),
angiopoyetina-3 humana (SEC. ID Nº: 5) y
angiopoyetina-4 humana (SEC. ID Nº: 6) usando el
software MEGALIGN^{TM} Expert Sequence Analysis (DNASTAR, Madison,
Wis.). Haciendo referencia a la Fig. 3, las porciones
N-terminal y C-terminal del
polipéptido ANG-7 contienen regiones características en
espiral doble y similares al fibrinógeno, que también se encuentran
en otras angiopoyetinas. El índice de similitud global entre el
polipéptido ANG-7 y los polipéptidos ANG-1 y -2 es del
23.9% y 23.5%, respectivamente. De forma importante, la mayor parte
de los residuos de aminoácido que se conservan entre las
angiopoyetinas conocidas también están presentes en el ANG-7
(Ver la Fig. 3). Esta conservación de secuencia de aminoácido
confirma que el clon ADNc L04G19 codifica un miembro de la familia
de la angiopoyetina.
Se examinó el perfil de expresión en el tejido
del gen ANG-7. En breve, el plásmido que codifica
EST AA255590 se linealizó con la endonucleasa de restricción EcoRI.
Se generó una sonda de ARN marcada radioactivamente con [32P]
usando un kit Strip-EZ T3 (Ambion, Austin, Tex.,
USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se hibridó
una matriz de expresión tisular múltiple humana (Clontech
Laboratories, Inc., Palo Alto, Calif., USA) con la sonda de ARN
marcada radioactivamente. La hibridación y el lavado se llevaron a
cabo según se recomendaba en el manual del kit
Strip-EZ T3. Tras el lavado, se expuso la membrana
la una pantalla de generación de imágenes fosforescentes, se
escaneó en un escáner Fuji Bas-1500, y se evaluó la
intensidad de la señal radioactiva con el software TINA 2,0
(Raytest, Straubenhardt, Alemania). El histograma resultante se
presenta en la Figura 4, y demuestra que el ARN de ANG-7 se
expresa fuertemente en los tejidos del corazón (atrio izquierdo y
derecho, ventrículo izquierdo y derecho), útero, glándula mamaria y
tejidos del cuerpo calloso. La expresión del ARN de ANG-7 en
estos tejidos, que están muy vascularizados, indica que el
polipéptido ANG-7, al igual que los polipéptidos
ANG-1 y -2, puede tener un papel en la angiogénesis.
Para ensayar si el ADNc de ANG-7 se
traduce al polipéptido ANG-7 y para determinar el peso
molecular del polipéptido ANG-7, se amplificó el ADNc de
ANG-7 mediante la reacción en cadena de la polimerasa
("PCR"). Para la amplificación por PCR, se usó un cebador 5'
(5' GCGAATTCACCATGAGGCCACTGTGCGT 3' (SEC. ID Nº: 7)) que es
complementario al extremo 5' del ADNc de ANG-7, en
combinación con un cebador 3' (5' GGAAGCTTATG
GAAGGTGTTGGGGTTCGG 3' (SEC. ID Nº: 8)), que es complementario del extremo 3' del ADNc de ANG-7. Para aumentar la eficiencia de traducción, se incluyó también una secuencia de consenso Kozak de inicio de traducción en el cebador 5'. Para facilitar la clonación posterior del fragmento PCR, se introdujeron secuencias de reconocimiento de restricciones para los enzimas de restricción Eco RI y Hind III en los cebadores 5' y 3', respectivamente. El ADNc amplificado se clonó en los emplazamientos de restricción Eco RI y Hind III del vector de expresión mamífero pcDNA3.1/Myc-His(-) (Invitrogen, Groningen, Holanda) para crear un pcDNA3.1/ANG7/mychis.
GAAGGTGTTGGGGTTCGG 3' (SEC. ID Nº: 8)), que es complementario del extremo 3' del ADNc de ANG-7. Para aumentar la eficiencia de traducción, se incluyó también una secuencia de consenso Kozak de inicio de traducción en el cebador 5'. Para facilitar la clonación posterior del fragmento PCR, se introdujeron secuencias de reconocimiento de restricciones para los enzimas de restricción Eco RI y Hind III en los cebadores 5' y 3', respectivamente. El ADNc amplificado se clonó en los emplazamientos de restricción Eco RI y Hind III del vector de expresión mamífero pcDNA3.1/Myc-His(-) (Invitrogen, Groningen, Holanda) para crear un pcDNA3.1/ANG7/mychis.
Los transcriptos de ARN de ANG-7 se
sintetizaron a partir del promotor T7 del
pcDNA3.1/ANG7/mychis, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se llevó a cabo la traducción in vitro usando un
lisato de reticulocito de conejo, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante (Promega, Madison, Wis., USA). Las proteínas
resultantes de la traducción in vitro se marcaron usando
[^{35}S] metionina. Las proteínas marcadas se separaron mediante
electroforesis en sulfato de docecilo sódico al 12% en gel de
poliacrilamida, y se visualizaron por autoradiografía. La Figura 5
representa los resultados de este experimento. De forma específica,
Hilera 1: marcador de peso molecular de proteína Rainbow
[^{14}C]metilada (Amersham, Little Chalfont
Buckinghamshire, Inglaterra) que incluía las siguientes proteínas:
ovoalbúmina (46 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de la
tripsina (21.5 kDa), lisozima (14.3 kDa), y aprotinina (6.5 kDa).
Hilera 2 contenía los productos de traducción in vitro del
ARN de ANG-7 usando el promotor T7 del vector de expresión
mamífero pcDNA3.1/Myc-His(-) (Invitrogen,
Groningen, Holanda). Hilera 3 contenía los productos de traducción
in vitro usando el promotor SP6 del vector de expresión
mamífero pcDNA3.1/Myc-His(-) (control negativo). La
Hilera 4 contenía un control positivo procedente del sistema de
traducción in vitro (Promega, Madison, USA).
Se detectó una banda principal de 60 kilodaltons.
La masa molecular observada de la banda principal fue ligeramente
mayor que la masa molecular calculada del polipéptido ANG-7
recombinante (57,1 kDa). Esta diferencia se puede explicar por la
glicosilación de varios posibles emplazamientos de glicosilación en
el polipéptido ANG-7.
Para determinar si el ADNc de ANG-7 se
puede expresar de forma recombinante en células eucariotas in
vivo, se clonó el ADNc de ANG-7 en tres vectores de
expresión eucariota, y se transfectaron con posterioridad a células
de cultivo de tejido.
El ADNc de ANG-7 se clonó en el vector de
expresión pcDNA3.1/Myc-His(-) (Invitrogen, Nº de
catálogo. V85520), según se ha descrito más arriba. El ADNc de
ANG-7 se clonó también en pIRES (Clontech, Nº de catálogo.
6060-1) y pZeo (Invitrogen, Nº de catálogo.
V850-01)). Para facilitar la detección y
purificación, se incluyó una marca de polihistidina en el
C-terminal de la región de codificación de cada
unidad de expresión.
Los constructos de expresión se transfectaron a
células de ovario de hámster chino ("CHO") usando el reactivo
de transfección liposomial DOSPER (Boehringer Mannheim, Nº de
catálogo. 1781995). Brevemente, 0,5 x 10^{6} células de CHO se
sembraron en cada uno de los pocillos de una placa de 6 pocillos en
medio basal (DMEM, Gibco/BRL, Nº de catálogo.
41965-039); Glutamina 2 mM L- (Gibco/BRL, Nº de
catálogo 25030-024), Penicilina/Estreptomicina
(1500 IU/ml) (Gibco/BRL, Nº de catálogo 15140-114),
y Suero fetal bovino al 10% (FBS, Sigma, Nº de catálogo. F2442)).
Tras incubación durante toda la noche a 37ºC., se retiró el medio y
se mezclaron 500 \mul de medio basal (sin FBS) con 5 \mug de
ADN y se añadieron 25 \mul de DOSPER a cada pocillo. Las placas se
incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, y a
continuación se añadieron 520 \mul/pocillo más de medio basal
(sin FBS). Las células se incubaron durante tres horas más a 37ºC.
Tras la incubación, se añadieron 3 ml/pocillo más de medio basal.
El día siguiente, se eliminó el medio, y se añadieron 3 ml/pocillo
de medio basal fresco. Las células se incubaron durante dos días
más, se cosecharon, y a continuación se analizó la expresión
citoplásmica del polipéptido ANG-7 en un Western blot usando
anticuerpos Tetra-His (Qiagen, Nº de catálogo
34670). El Western blot se llevó a cabo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, y contenía tres hileras. La Hilera 1
contenía el marcador de peso molecular de proteínas; la Hilera 2
contenía medio procedente de las células CHO (control negativo); y
la Hilera 3 contenía las células CHO transfectadas de forma no
estacionaria que expresaban el polipéptido ANG-7. El
análisis Western blot se muestra en la Figura 6, en la que la banda
del polipéptido ANG-7 está marcada con una flecha. Se observó
una banda de 57 kDa en las células de CHO transfectadas con el ADNc
de ANG-7, pero no en las células transfectadas solamente con
el vector (comparar las hileras 2 y 3). De esta forma, el
ADNc de ANG-7 se expreso de forma no estacionaria en células
de mamífero, y produjo un polipéptido con el peso molecular
esperado.
Para generar clones de células que expresen de
forma estable el polipéptido recombinante ANG-7, los clones
de ADNc de ANG-7 se transfectaron en una línea humana, y a
continuación se seleccionaron los transfectantes estables. En
breve, se transfectó una línea de hígado embrionario humano, HEK293,
con los vectores de expresión pcDNA3.1/ANG7/mychis o pIRES
que contenían el ADNc de ANG-7 bajo el promotor de
Citomegalovirus. La transfección se llevó a cabo como se describió
anteriormente en el Ejemplo 6. Después de la transfección, las
células se sembraron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en
medio de selección (medio basal más 0,75 mg/ml de Geneticina
(Gibco/BRL, Nº de catálogo 10131-027)).
Se detectó la expresión recombinante del
ANG-7 mediante tinción inmunofluorescente en portas de cámara
Lab-Tek (Nalgene Nunc, Nº de catálogo 154534)
usando un anticuerpo Tetra-His (Qiagen, Nº de
catálogo. 34670) y un anticuerpo secundario FITC marcado (conjugado
cabra anti ratón IgG-FITC (Dianova, Nº de catálogo
115-095-062)).Se sembraron
aproximadamente 4 x 10^{4} células por pocillo del porta
Lab-Tek, y se incubó durante toda la noche en una
incubadora de CO_{2}. El medio se descartó, y las células se
lavaron una vez con PBS (PBS de Dulbecco agua/aceite y bicarbonato
de calcio/ magnesio/ sodio (Gibco/BRL, Nº de catálogo
14190-094)). A continuación, las células se fijaron
por adición de 200 \mul/pocillo de metanol helado en hielo, y se
incubó a -20ºC. durante 10 min. Tras la fijación, las células se
lavaron 2 x con PBS que contenía BSA al 3%
(PBS-BSA), y se bloquearon a continuación durante
30 minutos con PBS-BSA a 37ºC. Tras el bloqueo, se
añadieron 100 \mul/pocillo de una disolución 1:50 del anticuerpo
Tetra-His en PBS-BSA. Las placas se
incubaron durante 2 horas a 37ºC. Tras incubación con el anticuerpo
primario, las células se lavaron 10 x con PBS, y a continuación se
añadieron 100 \mul/pocillo de una disolución 1:100 del anticuerpo
secundario (conjugado cabra anti ratón IgG-FITC).
Las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las placas se
lavaron 10x con PBS, se retiro la rejilla de separación del
pocillo, y a continuación las placas se recubrieron con el medio de
montaje antidesvanecimiento ROTI^{R} Histokit (Carl Roth, Nº de
catálogo 6638.1) y un cubre de vidrio. Tras endurecimiento del medio
de montaje (normalmente, toda la noche), las placas se observaron
en un microscopio de fluorescencia. Los clones positivos se
expandieron a placas de 24 pocillos, y el nivel de expresión de la
proteína recombinante se comparo analizando los lisatos de células
según un western blot según se ha descrito en el Ejemplo 6. El
análisis Western blot se representa en la Figura 7. La Hilera 1 del
Western blot contenía el marcador de peso molecular de proteínas;
la Hilera 2 contenía medio procedente de células HEK293 (control
negativo); y la Hilera 3 contenía células HEK293 transfectadas de
forma estable que contenían el polipéptido ANG-7. Los clones
positivos se seleccionaron para análisis posterior, tal como se
describe a continuación.
El polipéptido ANG-7 tiene una señal de
secreción en su término en N, lo que sugiere que es una proteína
secretada. Para determinar si el polipéptido ANG-7 se secreta
de forma recombinante por la células, se analizó medio procedente
del clon nº 62 de células HEK293 transfectadas de forma estable
buscando la presencia del polipéptido ANG-7. En breve, la
proteína se purificó parcialmente a partir de medio condicionado
usando una resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen, #
304050), como se describe más completamente en el Ejemplo 8. Las
fracciones eluidas de la columna se analizaron en un Western blot,
como se ha descrito anteriormente. El análisis Western blot se
muestra en la figura 8. La Hilera 1 del Western blot contenía medio
condicionado procedente de células HEK293 (control negativo); y la
Hilera 2 contenía medio acondicionado procedente de del clon
celular HEK293 transfectado de forma estable que expresa el
polipéptido ANG-7.
Haciendo referencia a la Figura 8, el medio
condicionado procedente de la línea celular HEK293 transfectado de
forma estable contenía un polipéptido que reaccionó con el
anticuerpo Tetra-His, mientras que el medio
condicionado procedente de células HEK293 no transformadas carece de
dicho polipéptido con reactividad cruzada. Este experimento
confirma que el polipéptido ANG-7 se secreta en el medio.
Para caracterizar de forma adicional el
polipéptido ANG-7, se purificó a partir de medio de cultivo
condicionado usando una resina de agarosa Ni-NTA
(Qiagen, # 304050). En breve, se recogió medio condicionado
procedente del clon 62 después de tres días, se añadió un
comprimido del inhibidor completo de la proteinasa (comprimidos
cocktail "completos" de inhibidor de la proteinasa Boehringer
Mannheim (Roche Diagnostics) Nº de catálogo. 1697498) a 50
ml de medio de recogida. Después, se añadió imidazol (Sigma; Nº
de catálogo. I-2399) hasta una concentración
final de 8 mM. El medio se centrifugó durante 10 min a 1600 x g. El
sobrenadante se transfirió a tubos frescos, y se añadieron 500
\mul de una suspensión al 50% de gel de agarosa
Ni-NTA a cada 50 ml de medio. Los tubos se agitaron
suavemente a 4ºC durante 60 min. La resina Ni-NTA se
recogió por centrifugación a 1600 x g durante 10 minutos, y se
descartó el sobrenadante. La resina se lavó dos veces con tampón de
lavado (NaH_{2} PO_{4}, 50 mM pH 8,0; NaCl 300 mM; Imidazol 10
mM) suspendiendo la resina en el tampón de ensayo, seguido por la
centrifugación en las mismas condiciones. Tras el lavado, la resina
se resuspendió de nuevo en tampón de lavado, y se transfirió a una
columna de 1 ml (0,5-1 ml de lecho de resina por
columna). El polipéptido ANG-7 enlazado se eluyó en
porciones de 500 \mul usando tampón de elución (NaH_{2}PO_{4},
50 mM pH 8,0; NaCl 300 mM; 250 mM imidazol). Las fracciones se
analizaron en un Western blot, como se ha descrito anteriormente.
El análisis Western blot se muestra en la figura 9A. Se analizó la
pureza de la proteína aislada en un gel SDS con tinción de
Coomassie, y este análisis se representa en la Figura 9B.
Haciendo referencia a la Fig. 9A, el Western blot
reveló un doblete de bandas a aproximadamente 62-64
kDa. La comparación del análisis por Western blot con el gel SDS
con tinción de Coomassie, reveló un doblete correspondiente con los
mismos pesos moleculares (Compare las figuras 9A y 9B). Las
presencia del doblete de polipéptidos ANG-7 sugiere que se
han secretado diferentes formas glicosiladas de ANG-7 por las
células transfectadas de forma estable.
El efecto del la expresión del gen de
ANG-7 sobre la formación de túbulos endoteliales se determinó
usando HUVEC con una pseudo organización capilar en Matrigel. Se
construyeron vectores de expresión de adenovirus que contenían ADNc
de ANG-7 rompiendo el ADNc de ANG-7 a partir de
pcDNA3.1/ANG7/mychis mediante digestión con Eco RV y Pme1.
El fragmento resultante se clono en los correspondientes
emplazamientos de pShuttle-CMV (He et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:2509-14 (1998)).
El pShuttle-CMV es un vector lanzadera de
adenovirus en el que el trasngen (es decir, ADNc de
ANG-7) está bajo el control del promotor del citomegalovirus
("CMV") Este constructo se transfirió a un esqueleto
adenovírico mediante recombinación en E. coli con el
plásmido pAdEasy ("AdEZ") (He et al., más arriba). El
recombinante resultante se linearizó con la endonucleasa de
restricción Pac 1 y se transfectó a continuación en las células
HEK293 (Microbix Inc, Ontario, Canadá) mediante procedimientos
normalizados. Diez días después de la transfección (tras la
aparición de placas víricas), las partículas de vector se
cosecharon de las células por ciclos múltiples de congelación
descongelación. Las partículas se usaron a continuación para
infectar 9121 células epiteliales (Introgene, Leiden, Holanda).
Para obtener suficiente vector para varios experimentos, se
realizaron tres rondas de paso de partículas virales a cultivos de
911 células cada vez más grandes. Este stock vírico se denominó
"Ad-ANG7." Este stock crudo se usó en el siguiente
experimento.
El HUVEC se plaqueó a razón de 1,25 x 10^{4}
células por pocillo en el día cero en una placa de 24 pocillos. Las
células se infectaron con una solución stock Ad-VEGF
(factor de crecimiento endotelial vascular). Se añadieron 200
\mul de cada solución stock vírica a los pocillos en el día cero.
Las placas se incubaron en CO_{2} al 5% a 37ºC durante 5 días. En
el día 6, las células se pasaron a una placa de 24 pocillos
recubierta con Matrigel a una densidad de 3 x 10^{4}
células/pocillo. Las placas recubiertas de Matrigel se prepararon
con sigue: La matriz de membrana cimiento de Matrigel (Becton
Dickinson) se descongeló durante toda la noche en hielo a 4ºC. Se
usaron pipetas, putas de pipeta, placas y tubos preenfriados. Se
usaron 0,3 \mul/pocillo de Matrigel (4ºC) para recubrir los
pocillos de una placa de 24 pocillos. El Matrigel se polimerizó 37ºC
durante 2 horas. Después de la adición de HUVEC a los pocillos
recubiertos con Matrigel, las placas se incubaron en CO_{2} al 5%
a 37ºC durante 24 horas. Todos los ensayos se realizaron en pocillos
triplicados. El volumen final de cada pocillo es 1 ml.
Después de incubar durante 24 horas en CO_{2}
al 5% a 37ºC, se comprobó cada pocillo bajo un microscopio de gran
aumento (microscopio invertido a 10X aumentos). Las placas se
tiñeron entonces con Diff-Quick, y se tomaron
imágenes para comparar los controles a diferentes
concentraciones.
Las siguientes tablas resumen el protocolo.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sin tratamiento con Matrigel (5 días) | Volumen | Volumen medio | |
| 1. | Control HUVEC (6 pocillos) | 0 | 1 ml |
| 2. | 911 sup. más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 3. | Ad-EZ más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 4. | Ad-VEGF más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 5. | Ad-ANG7 más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
| Sin tratamiento con Matrigel (día 6) | Volumen | Volumen medio | |
| 1. | Control HUVEC (6 pocillos) | 0 | 1 ml |
| 2. | 911 sup. más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 3. | Ad-EZ más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 4. | Ad-VEGF más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
| 5. | Ad-ANG7 más lisato de células | 200 \mul | 800 \mul |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados fueron como sigue, donde la
longitud de formación de túbulos se da en centímetros (SEM indica
el error estándar de la medida)
| Condición | Control | 911 Lys, | Ad-EZ | Ad-VEGF | Ad-ANG7 |
| Pocillo 1 | 68,22 | 82 | 60,8 | 78,6 | 35 |
| Pocillo 2 | 81,4 | 88,8 | 63,2 | 69,6 | 31,8 |
| Pocillo 3 | 70,56 | 75,2 | 89,4 | 68,8 | 36,2 |
| media | 73,39 | 82,00 | 71,13 | 72,33 | 34,33 |
| SEM | 4,06 | 4,81 | 9,16 | 3,14 | 1,31 |
Como puede verse a partir de este ejemplo, las
células de control y las células infectadas con el vector solo
(Ad-EZ) mostraron cantidades similares de formación
de tubuladuras. La expresión de VEGF produjo también niveles
similares de formación de tubuladuras. Por contra, la expresión del
polipéptido ANG-7 inhibió marcadamente la formación de
tubuladuras. De esta forma, este experimento demuestras que el
polipéptido ANG-7 inhibe la angiogéne-
sis.
sis.
Se examinó el efecto de la expresión in
vivo de ANG-7 en la metástasis del melanoma B16 de
murina. En breve, el ADNc de ANG-7 se liberó ex vivo
con un vector adenovírico (Ad-ANG-7) seguido por la
introducción de las células transfectadas en ratones. Se usaron 74
hembras C 57 B1/6, de 6-8 semanas de edad. Para la
administración ex vivo, se usaron tanto lisatos crudos
(preparados como se ha descrito anteriormente ene el Ejemplo 9) o
vectores purificados. Los vectores adenovíricos se purificaron como
sigue: el protocolo es una modificación de Fallux y col.
(Human Gene Therapy 7:215-22 (1996)). Para
purificación a gran escala, se plaquearon 911 células en una
Multi-tray Cell Factory (Nuclon. Dinamarca). Cuando
las células alcanzaron una confluencia de 85%, se infectaron con el
adenovirus recombinante. Tras la infección, aproximadamente
48-72 horas después de la infección, cuando las
células mostraron un efecto citopático, las células se cosecharon y
centrifugaron. El residuo celular se resuspendió en un pequeño
volumen de medio, se realizaron tres ciclos de congelamiento y
descongelamiento, y las células rotas se peletizaron para eliminar
los residuos celulares. Los sobrenadantes que contienen las
partículas víricas se dispersaron en un gradiente discontinuo de
cloruro de cesio (CsCl) compuesto por 1 ml a d = 1,4 g/ml cubierto
con 3 ml de d = 1,25 g/ml. Los gradientes de centrifugaron a
151.000 x g durante 2 horas. La banda opaca de partículas de virus,
en la frontera de densidades 1,25/1,4, se recogió y cargó en una
solución homogénea de CsCl de d = 1,3 g/ml. Este segundo gradiente
se centrifugó a 151.000 x g durante 18 horas. La única banda de
partículas de virus se recogió y dializó dos veces durante uno hora
frente a NaCl 0,135M, MgCl_{2} 1 mM, Tris 10 mM pH 7.5. El segunda
y última diálisis se llevó a cabo frente al mismo tampón, con la
adición de glicerol al 10%. Los títulos de la solución stock se
determinan mediante ensayo en placa usando 293 ó 911 células.
Las células B16.F10 procedentes de metástasis de
melanoma de murina, se infectaron durante 24 horas con uno de los
siguientes vectores de expresión de adenovirus:
Ad-E1 (control), Ad-ANG7 o
Ad-VEGF. Las células infectadas se inyectaron por
vía intravenosa en la cena lateral de la cola del ratón la final del
periodo de incubación de 24 horas. La concentración de células en
cada inyección fue de 2 x 10 ^{5} células en 0,2 ml de PBS. El
Día 0 fue la fecha de inyección a los ratones.
Los animales se pesaron dos días a la semana. Dos
animales del grupo 1 (control) se sacrificaron el día 14, se
recogieron los pulmones, y se determinó el número de metástasis.
Tras contar las metástasis, el resto de los animales (10 en cada
grupo) se sacrificaron en el día 14. En ese momento, se recogieron
los pulmones, se pesaron y se contó el número de metástasis.
La siguiente tabla resume el protocolo
experimental.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Número de animales | Infección de células | Sacrificados el |
| 1 | 10 | Ninguna | Día 14 (sólo 2 ratones) |
| 2 | 10 | AdEZ | Día 14 |
| 6 | 9 | Ad-VEGF | Día 14 |
| 8 | 9 | Ad-ANG-7 | Día 14 |
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente Tabla 5 resume el peso de los
pulmones de cada grupo SEM es el "error estándar de la
muestra"
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupo | Promedio | SEM | Media | |
| 1 (control) | 200,4 | 63,4 | 203,2 | |
| 2 (AdEz) | 219,0 | 69,3 | 222,5 | |
| 6 (Ad-VEGF) | 173,3 | 61,3 | 172,6 | |
| 8 (Ad-ANG7) | 168,6 | 56,2 | 168,6 |
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente Tabla 6 resume el número de
metástasis pulmonares en cada grupo. SEM es el "error estándar de
la muestra"
| Grupo | Promedio | SEM | Media | |
| 1 (control) | 50,9 | 12,3 | 39,5 | |
| 2 (AdEz) | 24,3 | 7,1 | 27,7 | |
| 6 (Ad-VEGF) | 48,3 | 10,0 | 47,1 | |
| 8 (Ad-ANG7) | 3,0 | 2,1 | 0,0 |
Como puede verse a partir de los daros, el peso
promedio de los pulmones en los ratones receptores de células
tumorales que sobreexpresan el ADNc de ANG-7 fue marcadamente
inferior que en los animales de control. El peso pulmonar medio en
los animales tratados con AD-VEGF y Ad-ANG7
fue similar. De forma más importante, y haciendo referencia a la
Tabla 6, el número promedio de metástasis en el pulmón fue más de 10
veces menos en las células tumorales que sobreexpresan el
polipéptido ANG-7, tal como se compara con los animales de
control y los tratados con VEGF. De esta forma, estos datos revelan
que la sobrexpresión de ADNc de ANG-7 inhibe el crecimiento
de células tumorales.
Se comprende que los ejemplos y formas de
realización que se describen en el presente documento son afectos
únicamente ilustrativos, y las personas expertas en la técnica
sugerirán diferentes modificaciones o cambios, que quedan incluidos
en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Bayer AG
\hskip1,075cmFriedrich, Gabi
\hskip1,075cmHagen, Gustav
\hskip1,075cmWick, Maresa
\hskip1,075cmZubov, Dmitry
\hskip1,075cmDubois-Stringfellow,
Nathalie A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA MODULAR LA
ANGIOGÉNESIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 17956A-000500PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 99113502.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
02-07-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<171> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2173
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 493
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 496
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 504
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaattcac catgaggcca ctgtgcgt
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagcttat ggaaggtgtt ggggttcgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. El uso de un polipéptido ANG-7 en la
preparación de un medicamento para tratar una enfermedad en un
sujeto necesitado de terapia anti-angiogénesis, en
el que la enfermedad es un tumor, en el que el polipéptido
ANG-7 es un ANG-7 humano con la SEC. ID Nº 2.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que el
sujeto o mamífero es un ser humano.
3. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho medicamento es para
administrar in vivo.
4. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que dicho medicamento
comprende un vehículo farmacéutico.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho medicamento es para
administrar ex vivo.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho
medicamento comprende además células transfectadas con un ácido
nucleico de ANG-7.
7. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido ANG-7 se
expresa de forma recombinante.
8. El uso de la reivindicación 7, en el que el
polipéptido ANG-7 se expresa de forma recombinante
cultivando una célula que contiene un ácido nucleico de ANG-7
en condiciones que dan como resultado la expresión del polipéptido,
y recubrir el polipéptido ANG-7 procedente del cultivo
celular.
9. El uso de la reivindicación 7 u 8, en el que
el polipéptido ANG-7 se expresa en células de mamífero,
células de levadura, células bacterianas, o células de insecto.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que el
polipéptido ANG-7 se expresa en E. Coli.
11. El uso de la reivindicación 9, en el que el
polipéptido ANG-7 se expresa en células de mamíferos.
12. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-11, en el que el ácido nucleico
de ANG-7 está enlazado de forma operativa a un promotor en un
vector de expresión.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que el
vector de expresión es un vector adenovírico, un vector
retrovírico, o un vector lentivírico.
14. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 8-13, en el que el ácido nucleico
de ANG-7 tiene la secuencia del ANG-7 humano (SEC. ID
Nº 1).
15. El uso de un polipéptido ANG-7, o una
sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la preparación de un
medicamento para inhibir el crecimiento de células tumorales, en el
que el polipéptido ANG-7 es ANG-7 humano con la SEC.
ID Nº 2.
Applications Claiming Priority (2)
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| EP99113502 | 1999-07-02 |
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