MX2012001283A - Polipeptidos que se enlazan al inhibidor de tejidos de metaloproteinasa tipo tres (timp-3) composiciones y metodos. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe composiciones y métodos de enlace de la proteína TIMP-3 para producir dichas composiciones, y métodos para utilizar dichas composiciones, incluyendo el tratamiento de varios padecimientos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE SE ENLAZAN AL INHIBIDOR DE TEJIDOS DE METALOPROTEINASA TIPO TRES (TIMP-3K COMPOSICIONES Y MÉTODOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de acuerdo con el título 35 §119 del Código de los Estados Unidos de América sobre la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana Serie No. 61/230,445, presentada en Julio 31, 2009, y la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana Serie No. 61/366,783, presentada en Julio 22, 2010, las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia.

Referencia a la Lista de Secuencias La presente solicitud está siendo presentada junto con una Lista de Secuencias en formato electrónico. La Lista de Secuencias se proporciona como un archivo titulado A-1487-WO-PCT_Seq_List.txt, creado en Julio 27, 2010, el cual tiene un tamaño de 39.9 KB. La información en el formato electrónico de la Lista de Secuencias está incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a inhibidores de metaloprotei nasa y a proteínas que se enlazan a los mismos. En particular, la presente invención se refiere a inhibidores de tejido de metaloproteinasa 3 ("TIMP-3") y su capacidad para enlazar a un receptor limpiador de proteína 1 relacionada con la lipoproteína de baja densidad ("LRP-1").

Antecedentes de la Invención Los tejidos conectivos y de cartílago articular son mantenidos en un equilibrio dinámico por efectos que se oponen de la síntesis de matriz extracelular y degradación. La degradación de la matriz se atrae aproximadamente de manera principal por la acción enzimática de las metaloproteinasas, incluyendo metaloproteinasas de matriz (MMPs) y metaloproteinasas de desintegrina con patrones de tromboespondina (ADAMTSs). Aunque estas enzimas son importantes en muchos procesos naturales (incluyendo el desarrollo, la morfogénesis, la remodelación del hueso, la curación de lesiones y la angiogénesis), se considera que los niveles elevados juegan un rol en las enfermedades degenerativas del tejido conectivo, incluyendo la artritis reumatoide y la osteoartritis, así como en padecimientos de cáncer y cardiovasculares.

Los inhibidores endógenos de metaloproteinasas incluyen el plasma alfa2-macroglobulina e inhibidores de tejido de metaloproteinasas (TIMPs), de los cuales existen cuatro que se conoce que son codificados en el genoma humano. Los inhibidores TIMP-3 de todas la metaloproteasas degradantes principales del cartílago, y líneas múltiples de evidencia indican que protegen el cartílago. La adición de la proteína a los explantes de cartílago evita la degradación inducida por la citocina, y la inyección ¡ntra-articular reduce el daño al cartílago en el modelo de rotura de menisco medio de la rata de osteoartritis. Sin embargo, el desarrollo de TIMP-3 como un inhibidor terapéutico de la actividad de MMP ha sido obstaculizado por sus retos en la producción y la vida corta promedio de las formas recombinantes del inhibidor TIMP-3.

La proteína 1 relacionada con el receptor de LDL (LRP-1) es un miembro de la familia del gen receptor de lipoproteína (LDL) de baja densidad con diversos roles biológicos, incluyendo los roles en las homeostasis de las proteinasas y los inhibidores de proteinasa. Similar a otros miembros de la familia del gen receptor LDL, la estructura del LRP-1 es formada por cuatro unidades estructurales comunes en el dominio extracelular, cada una de las cuales está compuesta además de dominios de repetición más pequeños, incluyendo repeticiones ricas en cisteína, y el factor de crecimiento de la epidermis, las repeticiones ricas en cisteína similares al receptor. La información más detallada sobre la estructura de este receptor de limpieza se consigue, por ejemplo, en la publicación de Herz y Stríckland, en J. Clin. Invest. 108: página 779 (2001).

El LRP-1 ha mostrado ser el portador de la disociación endocítica del complejo Pro-MMP-2/TIMP-2 (Emonard y asociados, J. Biol. Chem. 279: página 54944; 2004).

Adicionalmente, una xilopiranosa sulfatada químicamente proveniente del beechwood al que nos referimos como CaPPS ha mostrado aumentar los niveles de cartílagos de las TIMP-3 (Troeberg y asociados FASEB J 22: página 3515; 2008). Se sugirió que este efecto es debido a la endocitosis del bloqueo de la TIMP-3 por medio del receptor LRP-1 debido a su similitud a los efectos de las proteínas asociadas con el receptor (RAP), un inhibidor general del LRP-1, el cual también aumenta los niveles de TIMP-3 en el medio de las células condrocíticas cultivadas. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de determinar si la TIMP-3 interactúa directamente con el LRP-1, y para definir cualquiera de dichas interacciones con una precisión suficiente para permitir una determinación de los efectos de cualquier enlace entre el receptor LRP-1 y la proteína TIMP-3 en la actividad biológica de la proteína TIMP-3. Existe una necesidad adicional de identificar agentes que puedan actuar específicamente en dicha interacción para aumentar la cantidad de TIMP-3, en particular, sin afectar de manera adversa la actividad biológica de la proteína TIMP-3.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una proteína de enlace de TIMP-3 que se enlaza a la TIMP-3 e inhibe la internalización de la TIMP-3 por el LRP-1. La proteína de enlace TIMP-3 puede ser un anticuerpo o un péptido LRP-1. En un aspecto, la proteína de enlace TIMP-3 disminuye la inhibición de MMP-13 por medio de la TIMP-3 en menos de un 30% (por ejemplo, exhibe relativamente poca interferencia con la capacidad de la TIMP-3 para inhibir el MMP-13).

La presente invención proporciona además un método para el aumento de la TIMP-3 en una matriz extracelular poniendo en contacto la TIMP-3 con una proteína de enlace TIMP-3 que enlaza la TIMP-3 e inhibe la internalización de la TIMP-3 por medio del LRP-1. La proteína de enlace TIMP-3 puede ser un anticuerpo o un péptido LRP-1. En un aspecto, la proteína de enlace TIMP-3 de la presente invención disminuye la inhibición de MMP-13 por la TIMP-3 en menos de un 30% (por ejemplo, exhibe relativamente poca interferencia con la capacidad de la TIMP-3 para inhibir el MMP-13). La TIMP-3 se pone en contacto con la proteína de enlace TIMP-3 in vivo, ex vivo o in vitro; ponerla en contacto con la proteína de enlace TIMP-3 in vivo se puede lograr administrando la proteína de enlace TIMP-3 a un mamífero.

La presente invención también proporciona un método de tratamiento de un mamífero afligido con un padecimiento en el cual las metaloproteinasas de la matriz juegan un rol perjudicial, que comprende la administración de una proteína de enlace TIMP-3 que inhibe la internalización de la TIMP-3 por medio del LRP-1 en un mamífero. La proteína de enlace TIMP-3 puede ser un anticuerpo o un péptido LRP-1. En un aspecto, la proteína de enlace TIMP-3 disminuye la inhibición de MMP-13 por la TIMP-3 en menos de un 30% (por ejemplo, exhibe relativamente poca interferencia con la capacidad de la TIMP-3 para inhibir el MMP-13). El padecimiento puede ser seleccionado del grupo consistente de inflamación, cáncer, y un padecimiento caracterizado por la degradación excesiva de la matriz extracelular; por ejemplo, el padecimiento puede ser seleccionado del grupo consistente de osteoartritis y falla congestiva del corazón.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona composiciones, equipos, y métodos que se relacionan con los polipéptidos que se enlazan a la TIMP-3, tales como polipéptidos que ocurren de manera natural (por ejemplo, polipéptidos LRP-1) y fragmentos de los mismos, anticuerpos anti-TIMP-3, fragmentos de anticuerpos, y derivados de anticuerpos. También se proporcionan ácidos nucleicos, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de un polipéptido que se enlaza a una TIMP-3, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica todas o parte de dichas proteínas de enlace de TIMP-3, plásmidos y vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos, y células o líneas de células que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores y plásmidos. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para elaborar, identificar, o aislar moléculas que se enlazan a las proteínas TIMP-3, tales como los anticuerpos anti-TIMP-3, los métodos para determinar si una molécula se enlaza a una proteína TIMP-3, métodos para determinar si una molécula agoniza o antagoniza con la actividad de la proteína TIMP-3, así como métodos para determinar si una molécula facilita la acumulación de la proteína TIMP-3 (por ejemplo, en cultivos de células similares a condrocitos o líneas de células o en explantes de cartílago ex vivo).

La proteína TIMP-3 es expresada por diferentes células o tejidos en un mamífero y se encuentra presente en la matriz extracelular; la proteína TIMP-3 que es expresada de esta manera es a la que nos referimos en la presente descripción como proteína TIMP-3 "endógena". Existen numerosos padecimientos en los cuales sería provechoso aumentar, elevar o mejorar la cantidad de proteína TIMP-3 endógena en un mamífero. Por consiguiente, aquí también se proporcionan métodos para elaborar composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una molécula que se enlaza a la proteína TIMP-3, y métodos para administrar una composición que comprende una molécula que se enlaza a la proteína TIMP-3 en un sujeto, por ejemplo, métodos para el tratamiento de un padecimiento facilitando la acumulación de la proteína TIMP-3, aumentando la cantidad endógena de la proteína TIMP-3, inhibiendo el enlace de la proteína TIMP-3 a las células, disminuyendo la internalización de la proteína TIMP-3, y/o agonizando con una actividad biológica de la proteína TIMP-3, in vivo, ex vivo o in vitro.

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos son indicadas utilizando abreviaturas estándar de una o tres letras. A menos que se indique lo contrario, cada secuencia de polipéptido tiene una terminal amino a la izquierda y una terminal carboxi a la derecha; cada secuencia de ácido nucleico de un solo hilo, y el hilo superior de cada secuencia de ácido nucleico de hilo doble, tienen una terminal 5' a la izquierda y una terminal 3' a la derecha. Una secuencia de polipéptido o polinucleótido particular también puede ser descrita explicando la forma en que difiere de una secuencia de referencia.

A menos que se defina lo contrario en la presente descripción, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que son entendidos generalmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares deberán incluir los plurales, y los términos plurales deberán incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivos de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácido nucleico y técnicas de hibridación aquí descritas son aquellas bien conocidas y generalmente utilizadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención generalmente se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como los describen en las diferentes referencias generales y más específicas que son citadas y explicadas completamente en la presente especificación a menos que se indique de otra manera. Consultar por ejemplo, el libro de Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y el libro de Ausubel y asociados, "Protocolos Actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing Associates (1992), y también el libro de Harlow y Lañe, "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio" (Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), los cuales están incorporados a la presente descripción como referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes, y generalmente se llevan a cabo en la técnica o en la forma que aquí se describen. La terminología utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica aquí descritos son aquellos bien conocidos y generalmente utilizados en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para la síntesis química, análisis químico, preparaciones farmacéuticas, formulación, y administración, y tratamiento de pacientes.

Los términos siguientes, a menos que se indique lo contrario, deberá quedar entendido que tienen los siguientes significados: Los términos "molécula aislada" (en donde la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido, o un anticuerpo) es una molécula que en virtud de su origen o fuente de derivación (1) no se encuentra asociada con los componentes asociados naturalmente que la acompañan en su condición natural, (2) es substancialmente libre de otras moléculas de la misma especie, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza sin la intervención humana. De este modo, una molécula que es sintetizada químicamente, o sintetizada en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, será "aislada" de sus componentes asociados naturalmente. Una molécula también se puede hacer substancialmente libre de componentes asociados naturalmente por medio de aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en el arte. La pureza y homogeneidad de la molécula se pueden evaluar por un número de medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede ser ensayada utilizando la electroforesis de gel de poliacrilamida y la tinción del gel para visualizar el polipéptido utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Para ciertos propósitos, se puede proporcionar una resolución más alta utilizando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para la purificación.

Un "agonista de TIMP-3" como se usa en la presente descripción es una molécula que aumenta de manera detectable por lo menos una función de la proteína TIMP-3, por ejemplo, aumentando la cantidad de la proteína TIMP-3 (acumulación) in vitro, ex vivo o in vivo, sin disminuir de manera importante la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir una o más metaloproteinasas. Cualquier ensayo de una función de la proteína TIMP-3 puede ser utilizado, cuyos ejemplos se proporcionan aquí. Los ejemplos de las funciones de la proteína TIMP-3 que pueden ser aumentadas mediante un agonista de TIMP-3 incluyen la inhibición de las metaloproteinasas de matriz, incluyendo la MMP-13. Por ejemplo, un agonista de la proteína TIMP-3 puede aumentar la MMP-13 inhibiendo la actividad de un explante de cartílago, o un cultivo de células de condrocitos, o puede mejorar el nivel de la proteína TIMP-3 in vivo, aumentando de esta manera la actividad de inhibición de la MMP-13 in vivo. Los ejemplos de los tipos de los agonistas de la proteína TIMP-3 incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de enlace a la proteína TIMP-3 tales como polipéptidos derivados de LRP-1, así como proteínas de enlace al antígeno (por ejemplo, proteínas de enlace al antígeno de TIMP-3), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y derivados de anticuerpos.

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se refieren cada uno a una molécula que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos entre ellos por medio de enlaces péptidos. Estos términos comprenden, por ejemplo, proteínas naturales y artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos (tales como muteínas, variantes, y proteínas de fusión) de una secuencia de proteínas así como posteriores a la traducción, o de otra manera proteínas modificadas de manera covalente o no covalente. Un péptido, polipéptido, o proteína pueden ser monoméricos o poliméricos.

Los términos "fragmento de polipéptido" como se usan en la presente descripción, se refieren a un polipéptido que tiene una eliminación de la terminal amino y/o la terminal carboxi comparada con una proteína de longitud completa correspondiente. Los fragmentos pueden ser, por ejemplo, de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Los fragmentos también pueden ser, por ejemplo, cuando mucho de 1,000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, ó 10 aminoácidos de longitud. Un fragmento puede comprender además en cualquiera o ambos de sus extremos, uno o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína que ocurre naturalmente diferente (por ejemplo, un dominio de cierre de leucina o Fe) o una secuencia artificial de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia del enlazador artificial o una proteína de etiqueta).

Los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que han sido modificados de cualquier manera o por cualquier razón, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación, (3) alterar la afinidad de enlace para la formación de complejos de proteína, (4) alterar la afinidad de enlace, y (5) conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, substituciones simples o múltiples de aminoácidos (por ejemplo, substituciones conservadoras de aminoácidos) se pueden hacer en la secuencia que ocurre de manera natural (por ejemplo, en la porción del polipéptido afuera de los contactos intermoleculares formadores del dominio). Las secuencias de consenso se pueden utilizar para seleccionar los residuos de aminoácidos para la substitución; aquellos expertos en la técnica reconocerán que también pueden ser substituidos los residuos adicionales de aminoácidos.

Una "substitución conservadora de aminoácidos" es una que no cambia substancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe de tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan la secuencia de origen o que son necesarias para su funcionalidad). Los ejemplos de los polipéptidos reconocidos en la técnica de estructuras secundarias y terciarias se describen en los libros "Proteínas, Estructuras, y Principios Moleculares" (Proteins, Structures and Molecular Principies) (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); "Introducción a la Estructura de las Proteínas" (I ntroduction to Protein Structure) (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y en la publicación de Thornton y asociados, en Nature 354: página 105 (1991), los cuales están todos incorporados a la presente descripción como referencia.

La presente invención también proporciona análogos no péptidos de los polipéptidos de enlace de TIMP-3. Los análogos no polipéptidos son utilizados generalmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a aquellas del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no péptidos son denominados "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos", ver, por ejemplo, las publicaciones de Fauchere, en J. Adv. Drug Res. 15: página 29 (1986); Veber y Freidinger, en TINS página 392 (1985); y Evans y asociados, en J. Med. Chem. 30: páginas 1229 (1987), las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia. Los miméticos de péptidos que son estructu ral mente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente.

Generalmente, los peptldomi méticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (por ejemplo, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica deseada o una actividad farmacológica), tales como un anticuerpo humano, pero que tiene uno o más enlaces péptidos opcional mente reemplazados por los enlaces seleccionados del grupo consistente de: -CH2NH-, -CH2S--, --CH2-CH2--, --CH = CH-(cis y trans), --COCH2--, -CH(OH)CH2--, y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso por un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también puede ser utilizada para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consenso substancialmente idéntica se pueden generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, en Ann. Rev. Biochem. 61: página 387 (1992), incorporada a la presente descripción como referencia), por ejemplo, agregando residuos internos de cisteína con capacidad para formar los puentes disulfuro intramoleculares los cuales ciclan el péptido.

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son insertados dentro, eliminados de y/o substituidos dentro de la secuencia de aminoácidos relativa a otra secuencia de polipéptidos. Las variantes de la presente invención incluyen proteínas de fusión.

Un "derivado" de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que ha sido modificado químicamente, por ejemplo, por medio de la conjugación a otra porción química (tal como, por ejemplo, polietilénglicol o albúmina, por ejemplo, albúmina de suero humana), fosforilación, y/o glicosilación. A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos, y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describirán más adelante.

Una "proteína de enlace al antígeno" es una proteína que comprende una porción que se enlaza a un antígeno y, opcionalmente, una plataforma o porción de estructura que permite que la porción de enlace al antígeno adopte una conformación que promueva el enlace de la proteína de enlace al antígeno. Los ejemplos de las proteínas de enlace al antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, una porción de enlace al antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpos, y análogos de anticuerpos. La proteína de enlace al antígeno puede comprender, por ejemplo, una plataforma alternativa de proteína o una plataforma artificial con derivados CDRs o CDR injertados. Dichas plataformas incluyen, pero no están limitadas a, mutaciones que comprenden plataformas derivadas de anticuerpos introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de enlace al antígeno así como las plataformas completamente sintéticas que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Ver, por ejemplo, el libro de Korndorfer y asociados, 2003, "Proteínas: Estructura, Función, y Bioinformática" (Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics), Volumen 53, Emisión 1: páginas 121 a 129; la publicación de Roque y asociados 2004, en Biotechnol. Prog. 20: páginas 639 a 654. Además, los miméticos de anticuerpos péptidos ("PAMs") pueden ser usados, así como las plataformas basadas en miméticos de anticuerpos utilizando componentes de fibronección como una plataforma.

Una proteína de enlace al antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de inmunoglobulina que ocurre de manera natural. Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina que ocurre de manera natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kDa). La porción de la terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción de la terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectuadora. Las cadenas ligeras humanas son clasificadas como cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas pesadas son clasificadas como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen un isotipo de anticuerpo como Ig , IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante son unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Revisar generalmente, el libro "Inmunología Fundamental" (Fundamental Immunology) Capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a edición, Raven Press, N.Y. (1989)) (incorporada en su totalidad para todos los propósitos como referencia a la presente descripción). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman un sitio de enlace del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de enlace.

Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina que ocurren de manera natural exhiben la misma estructura de las regiones de estructura relativamente conservada (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones de determinación de complementaridad o CDRs. De la terminal-N a la terminal-C, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR 1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat y asociados, en el libro "Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico" (Seqruences oí Proteins oí Immunological Interest), 5a Edición., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos de América, Publicación PHS, NIH, NIH No. 91-3242, 1991. Otros sistemas de numeración para los aminoácidos en las cadenas de inmunoglobulina incluyen IMGT® (el sistema de información internacional ImMunoGeneTics; la publicación de Lefranc y asociados, en Dev. Comp. Immunol. 29: páginas 185 a 203; 2005) y la publicación de AHo (Honegger y Pluckthun, en J. Mol. Biol. 309(3): páginas 657 a 670; 2001).

Los anticuerpos pueden ser obtenidos de fuentes tales como el suero o plasma que contienen inmunoglobulinas que tienen especificidad antigénica variada. Si dichos anticuerpos son sometidos a purificación por afinidad, pueden ser enriquecidos para una especificidad antigénica particular. Dichas preparaciones de anticuerpos enriquecidas generalmente se hacen de menos de aproximadamente el 10% del anticuerpo que tiene una actividad de enlace específica para el antígeno particular. Sometiendo estas preparaciones a varias rondas de purificación por afinidad se puede aumentar la proporción del anticuerpo que tiene una actividad de enlace específica para el antígeno. Los anticuerpos preparados de esta manera con frecuencia son a los que nos referimos como "monoespecíficos". Las preparaciones de anticuerpos monoespecíficos se pueden hacer hasta de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 99.9% de anticuerpo que tiene una actividad de enlace específica para el antígeno particular.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de enlace al antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por el enlace específico, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de enlace al antígeno pueden ser producidas por técnicas de ADN recombinante o por medio de disociación enzimática o química de los anticuerpos intactos. Las porciones de enlace al antígeno incluyen, entre otros, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs), y fragmentos de región de determinación de complementaridad (CDR), fragmentos de región variable, anticuerpos de una sola cadena (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir un enlace al antígeno específico al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento de enlace al antígeno de un dominio VH o VL (Patentes Norteamericanas Nos. 6,846,634, 6,696,245, Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 05/0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward y asociados, Nature 341: páginas 544 a 546, 1989).

Un anticuerpo de una sola cadena (scFv) es un anticuerpo en el cual una región VL y VH son unidas por medio de un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en donde el enlazador es lo suficientemente largo para permitir que la cadena de proteína se doble de regreso sobre si misma y forme un sitio de enlace al antígeno monovalente (consultar, por ejemplo, las publicaciones de Bird y asociados, 1988, en Science 242: páginas 423 a 426 y Huston y asociados, 1988, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: páginas 5879 a 5883). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas de polipéptidos, en donde cada cadena de polipéptidos comprende dominios VH y VL unidos por un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre dos dominios de la misma cadena, permitiendo por lo tanto que cada dominio se acople con un dominio complementario en otra cadena de polipéptido (ver, por ejemplo, las publicaciones de Holliger y asociados, 1993, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: páginas 6444 a 6448, y Poljak y asociados 1994, en Structure 2: páginas 1121 a 1123). Si las dos cadenas de polipéptidos de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su acoplamiento tendrá dos sitios de enlace al antígeno idénticos. Las cadenas de polipéptidos que tienen secuencias diferentes pueden ser utilizadas para formar un diacuerpo con dos sitios de enlace al antígeno diferentes. De un modo similar, los triacuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres o cuatro cadenas de polipéptidos, respectivamente, y que forman tres o cuatro sitios de enlace al antígeno, respectivamente, los cuales pueden ser el mismo o diferentes.

Las regiones de determinación de complementaridad (CDRs) y las regiones de estructura (FR) de un anticuerpo determinado pueden ser identificadas utilizando el sistema descrito por Kabat y asociados, mencionado anteriormente; Lefranc y asociados, mencionado anteriormente y/o Honegger y Pluckthun, mencionado anteriormente. Uno o más CDRs pueden ser incorporados en una molécula ya sea de una manera covalente o no covalente para hacerla una proteína de enlace al antígeno. Una proteína de enlace al antígeno puede incorporar los CDR(s) como parte de una cadena más grande del polipéptidos, y puede enlazarse covalentemente a los CDR(s) a otra cadena de polipéptidos, o puede incorporar los CDR(s) de manera no covalente. Los CDRs permiten que las proteínas de enlace al antígeno se enlacen específicamente con un antígeno de interés particular.

Una proteína de enlace al antígeno puede tener uno o más sitios de enlace. Si son más de un sitio de enlace, los sitios de enlace pueden ser idénticos entre ellos o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana que ocurre de manera natural generalmente tiene dos sitios de enlace idénticos, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de enlace diferentes.

Los términos "anticuerpo humano" incluyen todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una modalidad, todos los dominios variables y constantes son derivados de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo totalmente humano). Estos anticuerpos pueden ser preparados de una variedad de modos, cuyos ejemplos se describen más adelante, incluyendo a través de la inmunización con un antígeno de interés de un ratón que es genéticamente modificado para expresar anticuerpos derivados de los genes que codifican la cadena pesada y/o ligera humana.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana por una o más substituciones, eliminaciones, y/o adiciones de aminoácidos, de modo que el anticuerpo humanizado es menos probable que induzca una respuesta inmune, y/o induzca una respuesta inmune menos severa, comparada con el anticuerpo de la especie no humana, cuando es administrado a un sujeto humano. En una modalidad, ciertos aminoácidos de la estructura y los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos de especies no humanas son mutados para producir el anticuerpo humanizado. En otra modalidad, los dominios constantes de un anticuerpo humano son fusionados con un dominio variable de una especie no humana. En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos en una o más secuencias CDR de un anticuerpo no humano son cambiados para reducir probablemente la inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando es administrado a un sujeto humano, en donde los residuos de aminoácidos cambiados ya sea que no son críticos para el enlace inmunoespecífico del anticuerpo a su antígeno, o los cambios a la secuencia de aminoácidos que se hicieron son cambios conservadores, de modo que el enlace del anticuerpo humanizado al antígeno no es significativamente peor que el enlace de un anticuerpo no humano al antígeno. Los ejemplos de cómo se hacen los anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293.

Los términos "anticuerpo quimérico" se refieren a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En una modalidad, uno o más de los CDRs son derivados de un anticuerpo anti-TIMP-3 humano. En otra modalidad, todos los CDRs son derivados de un anticuerpo anti-TIMP-3 humano. En otra modalidad, los CDRs de más de uno de los anticuerpos anti-TI MP-3 humanos son mezclados y unidos en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender un CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-TIMP-3 humano, un CDR2 y un CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-TIMP-3 humano, y los CDRs de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-TIMP-3. Son posibles otras combinaciones y están incluidas dentro de las modalidades de la presente invención.

Además, las regiones de la estructura pueden ser derivadas de uno de los mismos anticuerpos anti-TIMP-3, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con, homologa a, o derivada de un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras el resto de la cadena es idéntica, homologa a, o derivada de un anticuerpo(s) de otras especies o que pertenece a otra clase o subclases de anticuerpos. También están incluidos los fragmentos de dichos anticuerpos que exhiben la actividad biológica deseada (por ejemplo, la capacidad de enlazarse al TIMP-3 específicamente). Consultar, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,816,567 y la publicación de Morrison, 1985, en Science 229: páginas 1202 a 1207.

Un "anticuerpo inhibitorio de LRP-1" es un anticuerpo que inhibe la interacción de la proteína TIMP-3 con el LRP-1 cuando un exceso del anticuerpo anti-TIMP-3 reduce la cantidad de interacción por al menos aproximadamente el 20% utilizando un ensayo tal como los aquí descritos en los Ejemplos. En varias modalidades, la proteína de enlace al antígeno reduce la interacción de la proteína TIMP-3 con las proteínas LRP-1 TIMP-3 por al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, y 99.9%. En otras modalidades, la proteína de enlace al antígeno aumenta la acumulación de la proteína TIMP-3 por al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, y 99.9%.

Algunos anticuerpos inhibitorios de LRP-1 pueden inhibir el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1, y también interfiere con la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs. Sin embargo, algunos anticuerpos inhibitorios de LRP-1 inhiben el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1, sin afectar de manera adversa la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs; dichos anticuerpos son a los que aquí nos referimos como anticuerpos que "agonizan" o son "agónicos". Los anticuerpos agónicos generalmente resultarán en menos del 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o menos del 1% de disminución de la actividad inhibitoria de los MMP.

Los fragmentos o análogos de anticuerpos pueden ser fácilmente preparados por aquellos expertos en la técnica siguiendo las enseñanzas de esta descripción y utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Las terminales amino y carboxi de los fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados por la comparación de los datos de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o de propiedad. Los métodos de comparación computarizados pueden ser usados para identificar patrones de secuencia o confirmación de proteínas pronosticadas de los dominios que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas que se duplican en las estructuras tridimensionales son conocidos. Ver, por ejemplo, la publicación de Bowie y asociados, 1991, en Science 253: página 164.

Un "anticuerpo injertado con CDR" es un anticuerpo que comprende uno o más CDRs derivados de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y la estructura de otro anticuerpo de una especie o isotipo diferente o igual.

Un "anticuerpo multiespecífico" es un anticuerpo que reconoce más de un epítopo en uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un "anticuerpo biespecíf ico" que reconoce dos epítopos diferentes en los mismos antígenos o en antígenos diferentes.

Una proteína de enlace al antígeno "se enlaza específicamente" a un antígeno (por ejemplo, una proteína TIMP-3 humana) si se enlaza al antígeno con una constante de disociación de un nanomolar o menor.

Un "dominio de enlace al antígeno", "región de enlace al antígeno", o "sitio de enlace al antígeno" es una porción de una proteína de enlace al antígeno que contiene residuos de aminoácidos (u otras porciones) que interactúan con un antígeno y contribuyen a la especificidad de la proteína de enlace al antígeno y la afinidad para el antígeno. Para un anticuerpo que se enlaza específicamente a su antígeno, este incluirá al menos parte de al menos uno de los dominios CDR.

Un "epítopo" es la porción de una molécula que está enlazada a una proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, por un anticuerpo). Un epítopo puede comprender porciones no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polipéptido, residuos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, o están lo suficientemente cerca entre ellas para ser enlazadas por una proteína de enlace al antígeno). Los epítopos también pueden ser utilizados cuando nos referimos a la porción de una molécula que está enlazada por una proteína de enlace diferente a una proteína de enlace al antígeno, y puede comprender de manera similar porciones lineales, contiguas, o no contiguas de la molécula.

El análisis de las secuencias de proteína y estructuras tridimensionales ha revelado que muchas proteínas están compuestas de un número de unidades separadas a las que nos referimos como "dominios de monómero." La mayor parte de las proteínas de dominio de monómero separado son partes extracelulares o constituyen las proteínas enlazadas a la membrana.

Una característica importante de un dominio del monómero separado es su capacidad para duplicarse independientemente o con alguna asistencia limitada. La asistencia limitada puede incluir la asistencia de un chaperón (por ejemplo, una proteína (RAP) asociada con el receptor). La presencia de iones de metal también ofrece una asistencia limitada. La capacidad para duplicarse independientemente previene la duplicación equivocada del dominio cuando es insertado dentro de un nuevo ambiente de proteína. Esta característica ha permitido que los dominios de monómero separado sean móviles evolucionalmente. Como resultado, los dominios separados se ha esparcido durante la evolución y ahora ocurren de otra manera en proteínas no relacionadas. Algunos dominios, incluyendo los dominios de fibronectina de tipo III y el dominio similar a la inmunoglobulina, ocurren en numerosas proteínas, mientras que otros dominios son solamente encontrados en un número limitado de proteínas.

Las proteínas que contienen estos dominios están comprendidas en una variedad de procesos, tales como transportadores celulares, movimiento de colesterol, transducción de señal y funciones de señalización las cuales están comprendidas en el desarrollo y la neurotransmisión. Consultar la publicación de Herz, en Trends in Neurosciences 24: página 193 (2001); y la publicación de Goldstein y Brown, en Science 292: página 1310 (2001). La función del dominio de monómero separado con frecuencia es específica pero también contribuye a la actividad general de la proteína o polipéptido. Por ejemplo, el dominio del receptor LDL de la clase A (al que también nos referimos como módulo de clase A, un complemento de tipo de repetición o un dominio A) está comprendido en el enlace del ligando mientras que el dominio del ácido gamma-carboxiglumático (Gla) el cual es encontrado en las proteínas de coagulación de la sangre dependiente de la vitamina K está involucrado en el enlace de alta afinidad a membranas fosfolípidas. Otros dominios de monómero separado incluyen, por ejemplo, el dominio similar al factor de crecimiento de la epidermis (EGF) en el activador del plasminógeno de tipo de tejido el cual es el portador del enlace a las células del hígado, y por lo tanto regula la disociación de esta enzima fibrinolítica de la circulación y la cola citoplásmica del receptor de LDL el cual está involucrado en la endocitosis portada por el receptor.

Las proteínas individuales pueden poseer uno o más dominios separados del monómero. Estas proteínas con frecuencia son denominadas proteínas de mosaico. Por ejemplo, los miembros de la familia del receptor de LDL contienen cuatro dominios estructurales principales: las repeticiones del dominio A rico en cisteína, las repeticiones similares al precursor del factor de crecimiento de la epidermis, un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico.

La familia receptora de LDL incluye miembros que: 1) son receptores de la superficie celular; 2) reconocen ligandos extracelulares; y 3) los internalizan para la degradación por parte de los lisosomas. Ver, la publicación de Hussain y asociados, en Annu. Rev. Nutr. 19: página 141 (1999). Por ejemplo, algunos miembros incluyen receptores de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL-R), el receptor 2 de apolipoproteína E, proteína relacionada con el LDLR (LRP o LRP-1) y megalina. Los miembros de la familia que tienen las siguientes características: 1) expresión de la superficie de la célula; 2) enlace del ligando extracelular consistente de las repeticiones del dominio A; 3) requerimiento de calcio para el enlace del ligando; 4) reconocimiento de la proteína y apolipoproteína asociada con el receptor (apo) E; 5) el dominio de homología precursora que contiene repeticiones YWTD del factor de crecimiento de la epidermis (EGF); 6) regiones de extensión una sola membrana; y 7) endocitosis portada por el receptor de diferentes ligandos. Ver la publicación de Hussain, mencionada anteriormente. Sin embargo, los miembros se enlazan a varios ligandos diferentes estructuralmente.

Los "polipéptidos LRP-1" o "péptidos LRP-1" son utilizados en la presente descripción como polipéptidos (o péptidos que están relacionados con los LRP-1 siendo fragmentos de LRP-1, por ejemplo, fragmentos del dominio extracelular (o "ectodominio") del LRP-1. Los polipéptidos pueden comprender una (o más) agrupaciones de enlace al ligando de LRP-1 (ver, por ejemplo, la publicación de Herz y Strickland, mencionada anteriormente, y los Ejemplos de esta descripción). Los polipéptidos (o péptidos) pueden comprender una porción del agrupamiento de enlace del ligando, por ejemplo, un dominio de monómero separado tal como un dominio A. Los polipéptidos pueden consistir además de multímeros (por ejemplo, dímeros o trímeros, o multímeros de orden más alto) de dominios de monómeros separados tales como un dominio A. Los multímeros pueden incluir más de un dominio de monómero diferente estructuralmente (por ejemplo, que tiene secuencias diferentes de aminoácidos), o pueden incluir repeticiones múltiples de un solo dominio de monómero, o pueden incluir tanto los dominios de monómero de repetición múltiple como los dominios diferentes estructuralmente.

Un "polipéptido inhibitorio LRP-1" es un polipéptido que inhibe la interacción de la proteína TIMP-3 con LRP-1 cuando un exceso del polipéptido reduce la cantidad de interacción por lo menos aproximadamente el 20% utilizando un ensayo tal como los aquí descritos en los Ejemplos. En varias modalidades, el polipéptido reduce la interacción de la proteína TIMP-3 con LRP-1 por al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, y 99.9%. En otras modalidades, el polipéptido aumenta la acumulación de la proteína TIMP-3 por al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, y 99.9%.

Algunos polipéptidos inhibitorios de LRP-1 pueden inhibir el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1, y también interfieren con la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs. Sin embargo, algunos polipéptidos inhibitorios de LRP-1 inhiben el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1, sin afectar de manera adversa la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs; dichos polipéptidos es a los que nos referimos en la presente descripción como polipéptidos "agonizantes" o "agónicos". Los polipéptidos agónicos generalmente resultarán en menos del 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o menos del 1% de disminución de la actividad inhibitoria del MMP.

El "porcentaje de identidad" de dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos es determinada comparando las secuencias utilizando un programa de cómputo GAP (una parte del Paquete GCG Wisconsín, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) utilizando sus parámetros por omisión (default).

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido" y "ácido nucleico" son utilizados de manera intercambiable en toda la descripción e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, cADN o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, mARN), análogos del ADN o ARN generado utilizando los análogos de nucleótidos (por ejemplo, los ácidos nucleicos de péptidos y análogos de nucleótidos que ocurren de manera que no es natural), e híbridos de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser de un solo hilo o de hilo doble. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención comprenden un cuadro de lectura abierta contigua que codifica un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína, o variante del mismo, de la presente invención.

Dos polinucleótidos de un solo hilo son "el complemento" entre ellos si sus secuencias pueden ser alineadas en una orientación antiparalela de modo que cada nucleótido en uno de los polinucleótidos es opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de aberturas, y sin nucleótidos no acoplados en el extremo 5' o el extremo 3' de cualquier secuencia. Un polinucleótido es "complementario" a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridar entre ellos bajo condiciones moderadamente severas. Por lo tanto, un polinucleótido puede ser complementario de otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un "vector" es un ácido nucleico que puede ser utilizado para introducir otro ácido nucleico enlazado al mismo dentro de una célula. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a una molécula de ADN de hilo doble circular o lineal dentro de la cual se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, la duplicación de retrovirus defectuosos, adenovirus y virus asociados con adeno), en donde los segmentos adicionales de ADN pueden ser introducidos dentro del genoma viral. Ciertos vectores tienen la capacidad de la duplicación autónoma en la célula huésped dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, los vectores bacteriales que comprenden un origen de duplicación bacterial y vectores de episoma de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores que no son del episoma de mamífero) son integrados dentro del genoma de una célula huésped al momento de la introducción dentro de la célula huésped, y por lo tanto son duplicados junto con el genoma huésped. Un "vector de expresión" es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido seleccionado.

Una secuencia de nucleótidos es "enlazada de manera operable" a una secuencia regulatoria si la secuencia regulatoria afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, temporización, o localización de expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una "secuencia regulatoria" es un ácido nucleico que afecta la expresión (por ejemplo, el nivel, temporización, o ubicación de expresión) de un ácido nucleico al cual está enlazado de manera operable. La secuencia regulatoria puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente en el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más de otras moléculas (por ejemplo, polipéptidos que se enlazan a la secuencia regulatoria y/o al ácido nucleico). Los ejemplos de las secuencias regulatorias incluyen promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Los ejemplos adicionales de las secuencias regulatorias se describen, por ejemplo, en el libro de Goeddel, 1990, "Tecnología de Expresión del Gen: Métodos en Enzimología 185" (Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185), Academic Press, San Diego, CA y la publicación de Barón y asociados 1995, en Nucleic Acids Res. 23: páginas 3605 a 3606.

Una "célula huésped" es una célula que puede ser usada para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la presente invención. Una célula huésped puede ser un procariote, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariote, por ejemplo, un eucariote de una sola célula (por ejemplo, una levadura u otro hongo), una célula de una planta (por ejemplo, una célula de una planta de tabaco o tomate), una célula de un animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón, o una célula de insecto) o un hibridoma. Los ejemplos de las células huésped incluyen la línea COS-7 de las células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (ver la publicación de Gluzman y asociados, 1981, Cell 23: página 175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster Chino (CHO) o sus derivados tales como CHO Veggie y líneas de células relacionadas las cuales crecen en medios libres de suero (ver, la publicación de Rasmussen y asociados 1998, en Cytotechnology 28: página 31) o la cepa DX-B11 de la célula CHO, la cual es deficiente en DHFR (ver la publicación de Urlaub y asociados, 1980, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77: páginas 4216 a 4220), las células HeLa, líneas de células BHK (ATCC CRL 10), la línea de células CV1/EBNA derivada de las células de riñon CV1 de mono verde Africano (ATCC CCL 70) (ver la publicación de McMahan y asociados, 1991, en EMBO J. 10: página 2821), células de riñon embrionario humano tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células A431 de la epidermis humana, células Colo205 humanas, otras líneas de células transformadas de primate, células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivos in vitro de tejidos primarios, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. Generalmente, una célula huésped es una célula cultivada que puede ser transformada o transfectada con un polipéptido que codifica el ácido nucleico, el cual puede entonces ser expresado en la célula huésped. La frase "célula huésped recombinante" puede ser usada para indicar una célula huésped que ha sido transformada o transfectada con un ácido nucleico que va a ser expresado. Una célula huésped también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico pero que no lo expresa en un nivel deseado a menos que una secuencia regulatoria sea introducida dentro de la célula huésped de modo que se convierta en una célula enlazada de manera operable con el ácido nucleico. Deberá quedar entendido que los términos célula huésped se refieren no solamente a la célula sujeto particular sino también a la progenie o progenie potencia de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones siguientes debidas a, por ejemplo, influencia de mutación o ambiental, dicha progenie no puede, de hecho, ser idéntica, a la célula de origen, pero todavía puede ser incluida dentro del alcance del término como aquí se utiliza.

Proteínas de Enlace al Antíaeno En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de enlace al antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivados de anticuerpo, muteínas de anticuerpo, y variantes de anticuerpo) que se enlazan a la proteína TIMP-3, por ejemplo, una proteína TIMP-3 humana.

Las proteínas de enlace al antígeno diferentes se pueden enlazar a dominios diferentes o epítopos de proteínas TIMP-3 o actuar mediante mecanismos de acción diferentes. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a las proteínas de enlace al antígeno que interfieren con la capacidad de la proteína TIMP-3 J para enlazar el LRP-1 o que inhiben la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs. Los ejemplos adicionales incluyen proteínas de enlace al antígeno que interfieren con la capacidad de la proteína TIMP-3 para enlazar el LRP-1 pero no inhiben la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs (por ejemplo, agonistas TIMP-3). Las explicaciones en esta descripción de mecanismos de acción particulares para las proteínas de enlace al antígeno que enlazan la proteína TIMP-3 en el tratamiento de enfermedades particulares son solamente ilustrativas, y los métodos aquí presentados no están comprometidos por los mismos.

Otros derivados de los anticuerpos anti-TIMP-3 dentro del alcance de la presente invención incluyen conjugados agregativos o covalentes de los anticuerpos anti-TIMP-3, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a la terminal-N o la terminal-C de un polipéptido del anticuerpo anti-TIMP-3. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heteróloga (o líder), por ejemplo, un líder de levadura de factor alfa, o un péptido tal como una etiqueta del epítopo. La proteína de enlace al antígeno que contiene las proteínas de fusión puede comprender péptidos agregados para facilitar la purificación o identificación de la proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, poli-His). Una proteína de enlace al antígeno también puede ser enlazada al péptido FLAG® Asp-Ty r-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID No: 2) como lo describen Hopp y asociados, en Bio/Technology 6: página 1204, 1988, y la Patente Norteamericana No. 5,011,912. El péptido FLAG® es altamente antigénico y proporciona un epítopo enlazado de manera reversible por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), haciendo posible un ensayo rápido y la purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar las proteínas de fusión en las cuales el péptido FLAG® es fusionado a un polipéptido determinado se consiguen comercialmente (Sigma-Aldrich, St. Louis MO).

Los oligómeros que contienen una o más proteínas de enlace al antígeno pueden ser empleados como agonistas de la proteína TIMP-3. Los oligómeros pueden ser en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros más altos enlazados de manera covalente o no covalente. Los oligómeros que comprenden dos o más proteínas de enlace al antígeno son contemplados para usarse, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una modalidad está enfocada a oligómeros que comprenden múltiples proteínas de enlace al antígeno unidas por medio de interacciones covalentes o no covalentes entre las porciones péptidas fusionadas a las proteínas de enlace al antígeno. Dichos péptidos pueden ser enlazadores péptidos (separadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los zippers de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de las proteínas de enlace al antígeno adheridas a los mismos, como se describirán con mayor detalle más adelante.

En modalidades particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de enlace al antígeno. Las proteínas de enlace al antígeno del oligómero pueden ser en cualquier forma, tales como cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferentemente, los oligómeros comprenden proteínas de enlace al antígeno que tienen actividad de enlace a la proteína TIMP-3.

En una modalidad, un oligómero es preparado utilizando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de las proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diferentes porciones de los polipéptidos derivados del anticuerpo (incluyendo el dominio Fe) se han descrito en la literatura, por ejemplo, consultar las publicaciones de Ashkenazi y asociados, 1991, PNAS EUA 88: página 10535; Byrn y asociados, 1990, Nature 344: página 677; y Hollenbaugh y asociados, 1992 "Construcción de Proteínas de Fusión de I nmunoglobulina" (Construction of I mmunoglobulin Fusión Protein), en Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, páginas 10.19.1 a 10.19.11.

Una modalidad de la presente invención está enfocada a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas mediante la fusión de un fragmento de enlace de la proteína TIMP-3 de un anticuerpo anti-TIMP-3 a la región Fe de un anticuerpo. El dímero se puede hacer, por ejemplo, insertando un gen de fusión que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión apropiado, expresando la fusión del gen en las células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se parezca mucho a las moléculas del anticuerpo, en donde los enlaces disulfuro inter-cadena se forman entre las porciones Fe para producir el dímero.

Los términos "polipéptido Fe" como se usan en la presente descripción incluyen formas naturales y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fe de un anticuerpo. Las formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región de articulación que promueve la dimerización también están incluidas. Las proteínas de fusión que comprenden las porciones Fe (y los oligómeros formados de las mismas) ofrecen la ventaja de la purificación fácil por medio de cromatografía de afinidad sobre las columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido Fe adecuado, descrito en la Solicitud PCT documento No. WO 93/10151 (incorporado a la presente descripción como referencia), es un polipéptido de una sola cadena que se extiende desde la región de articulación de la terminal-N a la terminal-C natural de la región Fe de un anticuerpo lgG1 humano. Otro polipéptido Fe útil es la muteína Fe descrita en la Patente Norteamericana No. 5,457,035 y en la publicación de Baum y asociados, 1994, en EMBO J. 13: páginas 3992 a 4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fe natural presentada en el documento No. WO 93/10151, excepto que el aminoácido 19 ha sido cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 ha sido cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 ha sido cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para los receptores de Fe.

En otras modalidades, la porción variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-TIMP-3 puede ser substituida para la porción variable de un anticuerpo de cadena pesada y/o ligera.

Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples proteínas de enlace al antígeno, con o sin enlazadores péptidos (péptidos separadores). Entre los enlazadores péptidos adecuados se encuentran aquellos que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,751,180 y 4,935,233.

Otro método para preparar las proteínas de enlace al antígeno oligoméricas comprende el uso del zipper de leucina.

Los dominios del zipper de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales son encontrados. Los zippers de leucina fueron identificados originalmente en varias proteínas de enlace del ADN (Landschulz y asociados, 1988, Science 240: página 1759), y han sido encontrados en una variedad de proteínas diferentes. Entre los zippers de leucina conocidos se encuentran los péptidos que ocurren de manera natural y derivados de los mismos que dimerizan o se trimerizan. Los ejemplos de los dominios del zipper de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la Publicación PCT documento No. WO 94/10308, y el zipper de leucina derivado de la proteína D del tensioactivo de pulmón (SPD) descrito en la publicación de Hoppe y asociados, 1994, en FEBS Letters 344: página 191, incorporado a la presente descripción como referencia. El uso de un zipper de leucina modificado que permita la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada al mismo se describe en la publicación de Fanslow y asociados, 1994, en Semin. Immunol. 6: páginas 267 a 278. En un método, las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-TI MP-3 o derivado fusionado a un péptido de zipper de leucina son expresados en una célula huésped adecuada, y los fragmentos del anticuerpo anti-TIMP-3 oligomérico soluble o derivados que se forman son recuperados del sobrenadante del cultivo.

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de enlace al antígeno que interfieren con el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1. Dichas proteínas de enlace al antígeno pueden ser hechas contra la proteína TIMP-3, o un fragmento, variante o derivado de la misma, y seleccionados en ensayos convencionales por su capacidad para interferir con el enlace de la proteína TIMP-3 al LRP-1. Los ejemplos de los ensayos adecuados aquí se describen, e incluyen ensayos que prueban las proteínas de enlace al antígeno por su capacidad para inhibir el enlace al LRP-1, o que prueban las proteínas de enlace al antígeno por su capacidad para aumentar la cantidad de la proteína TIMP-3, por ejemplo en cultivo o ex vivo. Los ensayos adicionales que prueban las proteínas de enlace al antígeno incluyen aquellas que comparan cualitativa o cuantitativamente el enlace de una proteína de enlace al antígeno a un polipéptido TIMP-3 al enlace de una proteína de enlace al antígeno conocida a un polipéptido TIMP-3, de los cuales varios ejemplos se encuentran descritos en este documento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de enlace al antígeno que demuestra la selectividad de especies. En una modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza a una o más proteínas TIMP-3 de mamífero, por ejemplo, a proteínas TIMP-3 humanas y a una o más de proteínas de ratón, rata, cobayo, hámster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, y proteína TIMP-3 de primate no humano. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza a una o más proteínas TIMP-3 de primate, por ejemplo, a la proteína TIMP-3 humana y una o más de proteínas TIMP-3 del mono cinomolgo, mono titi, mono resus, mono titi o chimpancé. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza específicamente a proteínas TIMP-3 de humano, cinomolgo, mono titi, resus, titi o chimpancé. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no se enlaza a una o más de las proteínas TIMP-3 de ratón, rata, cobayo, hámster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, y primate no humano. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no se enlaza a las especies de monos del Nuevo Mundo tales como el mono titi.

En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no exhibe enlace específico a cualquier proteína que ocurre de manera natural que no sea la proteína TIMP-3. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no exhibe enlace específico a cualquiera de las proteínas que ocurren de manera natural que no sean la proteína TIMP-3 de mamífero. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no exhibe enlace específico a cualquier proteína que ocurre de manera natural diferente a la proteína TIMP-3 de primate. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno no exhibe enlace específico a cualquier proteína que ocurre de manera natural que no sea la proteína TIMP-3 humana. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza específicamente a la proteína TIMP-3 desde por lo menos un primate no humano, por ejemplo, mono cinomolgo, y la proteína TIMP-3 humana. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza específicamente a la proteína TIMP-3 de primate no humano, mono cinomolgo, y humana con una afinidad de enlace similar. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno bloquea una actividad de la proteína TIMP-3 de primate no humano, mono cinomolgo, y humana. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno tiene un IC50 o EC50 similar contra la proteína TIMP-3 de primate no humano, mono cinomolgo, y humana en un ensayo aquí descrito.

Se puede determinar la selectividad de una proteína de enlace al antígeno para una proteína TIMP-3 utilizando métodos bien conocidos en la técnica y siguiendo las enseñanzas de la especificación. Por ejemplo, se puede determinar la selectividad utilizando los análisis Western blot, FACS, ELISA o RIA.

Los fragmentos de enlace al antígeno de las proteínas de enlace al antígeno de la presente invención pueden ser producidos por técnicas convencionales. Los ejemplos de dichos fragmentos incluyen, pero no están limitados a, los fragmentos Fab y F(ab')2. También están contemplados fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por medio de técnicas de ingeniería genética.

Las modalidades adicionales incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, múridos). Dichos anticuerpos humanizados pueden ser preparados mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos son administrados a los humanos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo múrido (o todo o parte del sitio de enlace al antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de enlace al antígeno de un anticuerpo monoclonal múrido y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de enlace al antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y diseñados adicionalmente incluyen aquellos que se describen en las publicaciones de Riechmann y asociados, 1988, en Nature 332: página 323, Liu y asociados, 1987, en Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 84: página 3439, Larrick y asociados, 1989, en Bio/Technology 7: página 934, y Winter y asociados, 1993, en TIPS 14: página 139. En una modalidad, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo injertado de CDR. Las técnicas para humanizar los anticuerpos se explican, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/194,975 (publicada en Febrero 27, 2003), las Patentes Norteamericanas Nos. 5,869,619, 5,225,539, 5,821,337, 5,859,205, la publicación de Padlan y asociados, 1995, en FASEB J. 9: páginas 133 a 139, y la publicación de Tamura y asociados, 2000, en J. Immunol. 164: páginas 1432 a 1441.

Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos humanos o parcialmente humanos en animales no humanos. Por ejemplo, los ratones en los cuales uno o más genes de inmunoglobulina endógena han sido desactivados mediante la preparación de diferentes medios. Los genes de inmunoglobulina humana han sido introducidos en los ratones para reemplazar los genes de ratón desactivados. Los anticuerpos producidos en las cadenas de polipéptido de inmunoglobulina humana son codificados mediante la introducción del material genético humano en el animal. En una modalidad, un animal no humano, tal como un ratón transgénico, es inmunizado con el polipéptido TIMP-3, de modo que los anticuerpos dirigidos contra el polipéptido TIMP-3 son generados en el animal. Un ejemplo de un inmunógeno adecuado es una proteína TIMP-3 soluble humana, tal como un polipéptido que comprende un dominio de enlace de LRP-1 de la proteína TIMP-3, u otro fragmento inmunogénico de la proteína TIMP-3. Otro ejemplo de un inmunógeno adecuado son las células que expresan niveles altos de la proteína TIMP-3, o las preparaciones de la membrana celular de las mismas.

Los ejemplos de las técnicas de producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,814,318, 5,569,825, y 5,545,806, en el libro de Davis y asociados, 2003, "Producción de Anticuerpos Humanos de Ratones Transgénicos en las Ediciones Lo" (Production of Human Antibodies from Transgenic Mice in Lo, ed). "Ingeniería de Anticuerpos: Métodos y Protocolos" (Antibody Engineering: Methods and Protocols), Humana Press, NJ: páginas 191 a 200, Kellermann y asociados, 2002, en Curr Opin Biotechnol. 13: páginas 593 a 97, Russel y asociados, 2000, en Infect Immun. 68: páginas 1820 a 1826, Gallo y asociados, 2000, en Eur J Immun. 30: páginas 534 a 540, Davis y asociados, 1999, en Cáncer Metástasis Rev. 18: páginas 421 a 425, Green, 1999, en J Immunol Methods. 231: páginas 11 a 23, Jakobovits, 1998, en Adv Drug DeNv Rev 31: páginas 33 a 42, Green y asociados, 1998, en J Exp Med. 188: páginas 483 a 495, Jakobovits A, 1998, en Exp. Opin. Invest. Drugs. 7: páginas 607 a 614, Tsuda y asociados, 1997, en Genomics 42: páginas 413 a 421, Méndez y asociados, 1997, en Nat Genet. 15: páginas 146 a 156, Jakobovits, 1994, en Curr Biol. 4: páginas 761 a 763, Arbones y asociados, 1994, en Immunity. 1: páginas 247 a 260, Green y asociados, 1994, en Nat Genet. 7: páginas 13 a 21, Jakobovits y asociados, 1993, en Nature 362: páginas 255 a 258, Jakobovits y asociados, 1993, en Proc Nati Acad Sci EUA. 90: páginas 2551 a 2555. Chen, J. y asociados, 1993, en Int Immunol 5: páginas 647 a 656, Choi y asociados, 1993, en Nature Genetics 4: páginas 117 a 123, Fishwild y asociados, 1996, en Nat Biotechnol 14: páginas 845 a 851, Harding y asociados, 1995, en Ann NY Acad Sci, Lonberg y asociados, 1994, en Nature 368: páginas 856 a 859, Lonberg, 1994, "Métodos Transgénicos para Anticuerpos Monoclonales Humanos" (Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies) en el "Manual de Farmacología Experimental 113" (Handbook of Experimental Pharmacology 113): páginas 49 a 101, Lonberg y asociados, 1995, en Int Rev Immunol 13: páginas 65 a 93, Neuberger, 1996, en Nat Biotechnol 14: página 826, Taylor y asociados, 1992, en Nucleic Acids Research 20: páginas 6287 a 6295, Taylor y asociados, 1994, en Int Immunol 6: páginas 579 a 591, Tomizuka y asociados, 1997, en Nat Gen 16: páginas 133 a 143, Tomizuka y asociados, 2000, en Proc Nati Acad Sci EUA. 97: páginas 722 a 727, Tuaillon y asociados, 1993, en Proc Nati Acad Sci EUA. 90: páginas 3720 a 3724, y Tuaillon y asociados, 1994, en J Immunol 152: páginas 2912 a 2920. Estos y otros ejemplos también son explicados en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007-0098715, publicada en Mayo 3, 2007.

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se enlazan a la proteína TIMP-3. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando cualesquiera técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, inmortalizando las células del bazo recolectadas del animal transgénico después de completar el programa de inmunización. Las células del bazo pueden ser inmortalizadas utilizando cualquiera de las técnicas conocidas en el arte, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para utilizarse en los procedimientos de fusión de producción de hibridomas preferentemente son células que no producen anticuerpos, que tienen alta eficiencia de fusión, y deficiencias de la enzima que las hacen incapaces de cultivarse en ciertos medios selectivos los cuales soportan la proliferación de solamente las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de las líneas de células adecuados para utilizarse en las fusiones de ratón incluyen células Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, M PC 11 -X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; los ejemplos de las líneas de células usadas en las fusiones de rata incluyen las células R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas de células útiles para las fusiones de células son las líneas U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

En una modalidad, una línea celular de hibridoma es producida inmunizando a un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de la proteína TIMP-3; recolectando las células del bazo del animal inmunizado; fusionando las células del bazo recolectadas a una línea de células de mieloma, generando de esta manera células de hibridoma; estableciendo líneas de células de hibridoma de las células de hibridoma, e identificando una línea de células de hibridoma que produce un anticuerpo que se enlaza al polipéptido TI P-3. Dichas líneas de células de hibridoma, y los anticuerpos monoclonales anti-TIMP-3 producidos por ellos, están comprendidos por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea de células de hibridoma pueden ser purificados usando cualquier técnica conocida en el arte. Los hibridomas o mAbs pueden ser seleccionados adicionalmente para identificar los mAbs con propiedades particulares, tales como la capacidad para bloquear una actividad inducida por la proteína TIMP-3. Los ejemplos de dichas selecciones se proporcionan en los ejemplos siguientes.

Los anticuerpos monoclonales también pueden ser producidos usando un proceso al que nos referimos como inmunización genética. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el antígeno de interés puede ser incorporado en un vector viral (tal como un vector adenoviral). El vector resultante es entonces usado para desarrollar una respuesta inmune contra el antígeno de interés en un animal huésped adecuado (por ejemplo, un ratón o NOD, diabético no obeso). Esta técnica es substancialmente descrita por Ritter y asociados, en Biodrugs 16(1): páginas 3 a 10 (2002), cuya descripción está incorporada al presente documento como referencia.

En un aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de enlace al antígeno de un anticuerpo anti-TI P-3 de la presente invención. Dichos fragmentos pueden consistir completamente de secuencias derivadas del anticuerpo o pueden comprender secuencias adicionales. Los ejemplos de los fragmentos de enlace al antígeno incluyen fragmentos Fab, F(ab')2, anticuerpos de una sola cadena, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y anticuerpos de dominio. Otros ejemplos se proporcionan en la publicación de Lunde y asociados, 2002, en Biochem. Soc. Trans. 30: páginas 500 a 506.

Los anticuerpos de una sola cadena pueden ser formados enlazando fragmentos del dominio variable de cadena pesada y ligera (región Fv) por medio del puente de aminoácidos (enlazador péptido corto), dando como resultado una sola cadena de polipéptidos. Dicha sola cadena Fvs (scFvs) ha sido preparada fusionando el ADN que codifica un enlazador péptido entre los ADNs que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes se pueden volver a duplicar en ellos mismos para formar monómeros de enlace al antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, o tetrámeros), dependiendo de la longitud de un enlazador flexible entre los dos dominios variables (Kortt y asociados, 1997, Prot. Eng. 10: página 423; Kortt y asociados, 2001, Biomol. Eng. 18: páginas 95 a 108). La combinación de polipéptidos diferentes que comprenden VL y VH, se pueden formar los scFvs multiméricos que se enlazan a diferentes epítopos (Kriangkum y asociados, 2001, Biomol. Eng. 18: páginas 31 a 40). Las técnicas desarrolladas por la producción de anticuerpos de una sola cadena incluyen aquellos descritos en la Patente Norteamericana No. 4,946,778; en las publicaciones de Bird, 1988, en Science 242: página 423; Huston y asociados, 1988, en Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: página 5879; Ward y asociados, 1989, en Nature 334: página 544, de Graaf y asociados, 2002, en Methods Mol Biol. 178: páginas 379 a 387.

Las proteínas de enlace al antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y derivados de anticuerpo) de la presente invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una de las regiones constantes de cadena pesada de tipo alfa, delta, epsilon, gamma, o mu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, epsilon, gamma, o mu humana. En una modalidad, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante, o muteína de una región constante que ocurre de manera natural.

Se conocen técnicas para derivar un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, por ejemplo, el cambio de subclase. Por lo tanto, los anticuerpos, IgG pueden ser derivados de un anticuerpo IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de anticuerpos nuevos que poseen las propiedades de enlace al antígeno de un anticuerpo determinado (el anticuerpo de origen), pero también exhiben propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del anticuerpo de origen. Se pueden emplear técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos del anticuerpo particular puede ser empleado en dichos procedimientos, por ejemplo, el ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Consultar también la publicación de Lantto y asociados, 2002, en Methods Mol. B i o 1.178 : páginas 303 a 316. Además, si se desea un lgG4, también puede ser deseable introducir una mutación del punto (CPSCP -> CPPCP) en la región de articulación como lo describen Bloom y asociados, 1997, en Protein Science 6: página 407, incorporada como referencia a la presente descripción) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro de cadena intra-H que puede conducir a la heterogeneidad de los anticuerpos lgG4.

Además, las técnicas para calcular las proteínas de enlace al antígeno que tienen diferentes propiedades (por ejemplo, afinidades variables para el antígeno al cual se enlazan) también son conocidas. Una de dichas técnicas, a la que nos referimos como mezcla de cadenas, comprende el despliegue de los repertorios del gen del dominio variable de inmunoglobulina en la superficie de bacteriófagos filamentosos, a los que con frecuencia nos referimos como despliegue de fagos. La mezcla de cadena ha sido utilizada para preparar anticuerpos de alta afinidad para el hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como lo describen Marks y asociados, 1992, en BioTechnology , 10: página 779.

La evolución molecular de las regiones determinantes de complementaridad (CDRs) en el centro del sitio de enlace del anticuerpo también ha sido utilizada para aislar los anticuerpos con afinidad aumentada, por ejemplo, anticuerpos que tienen afinidad aumentada para las células c-erbB-2, como lo describen Schier y asociados, 1996, en J. Mol. Biol. 263: página 551. Por consiguiente, dichas técnicas son útiles para preparar los anticuerpos para la proteína TIMP-3.

En una modalidad, la presente invención proporciona una proteína de enlace al antígeno que tiene una constante baja de disociación de la proteína TIMP-3. En una modalidad, la proteína de enlace al antígeno tiene un Kd de 100 pM o menor.

En otra modalidad, el Kd es de 10 pM o menor; en otra modalidad, es de 5 pM o menor, o es de 1 pM o menor. En otra modalidad, el Kd es substancialmente el mismo como un anticuerpo aquí descrito en los Ejemplos. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno se enlaza a la proteína TIMP-3 substancialmente con el mismo Kd como un anticuerpo aquí descrito en los Ejemplos.

La presente invención proporciona además proteínas de enlace al antígeno multiespecíficas, por ejemplo, proteínas de enlace al antígeno biespecíficas, por ejemplo, proteínas de enlace al antígeno que se enlazan a dos epítopos de la proteína TIMP-3 diferentes, o a un epítopo de la proteína TIMP-3 y un epítopo de otra molécula, por medio de dos sitios de enlace al antígeno o regiones diferentes. Además, la proteína de enlace al antígeno biespecífica como aquí se describe puede comprender un sitio de enlace a la proteína TIMP-3 de uno de los anticuerpos aquí descritos y una segunda región de enlace a la proteína TIMP-3 de otro de los anticuerpos aquí descritos, que incluye aquellos descritos en la presente descripción como referencia a otras publicaciones. Alternativamente, una proteína de enlace al antígeno biespecífica puede comprender un sitio de enlace al antígeno de uno de los anticuerpos aquí descritos y un segundo sitio de enlace al antígeno de otro de los anticuerpos TIMP-3 que es conocido en la técnica, o que es proveniente de un anticuerpo que es preparado por métodos conocidos o por métodos aquí descritos.

Se conocen en la técnica numerosos métodos para la preparación de anticuerpos biespecíficos, y se explican en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 09/839,632, presentada en Abril 20, 2001 (incorporada como referencia a la presente descripción). Dichos métodos incluyen el iso de hibridomas híbridos como los describen Milstein y asociados, 1983, en Nature 305: página 537, y otros (la Patente Norteamericana No. 4,474,893, la Patente Norteamericana No. 6,106,833), y el acoplamiento químico de los fragmentos de anticuerpo (Consultar las publicaciones de Brennan y asociados, 1985, en Science 229: página 81; Glennie y asociados, 1987, en J. Immunol. 139: página 2367; y la Patente Norteamericana No. 6,010,902). Además, los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos por medios recombinantes, por ejemplo, utilizando las porciones de zipper de leucina (es decir, de las proteínas Fos y Jun, las cuales forman preferentemente heterodímeros; Kostelny y asociados, 1992, J. Immunol. 148: página 1547) u otras estructuras del dominio de cierre y clave interactiva como lo describen en la Patente Norteamericana No. 5,582,996. Las técnicas útiles adicionales incluyen aquellas descritas por la publicación de Kortt y asociados, 1997, mencionada anteriormente; la Patente Norteamericana No.5, 959, 083; y la Patente Norteamericana No. 5,807,706.

Usos de las Proteínas de Enlace TIMP-3 Las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser usadas, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia de la proteína TIMP-3 o células que expresan la proteína TIMP-3, ya sea in vitro o in vivo. Las proteínas de enlace TIMP-3 también pueden ser empleadas para purificar las proteínas TIMP-3 mediante cromatografía de inmunoafinidad. Aquellas proteínas de enlace TIMP-3 que adicionalmente pueden bloquear la interacción de LRP-1 y TIMP-3 pueden ser usadas para aumentar la acumulación de proteína TIMP-3, y/o aumentar los niveles de proteína TIMP-3 endógena, in vitro, ex vivo o in vivo. Las proteínas de enlace TIMP-3 que aumentan la acumulación de proteína TIMP-3 sin afectar adversamente la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir los MMPs pueden ser utilizadas para aumentar la actividad biológica de la proteína TIMP-3 (por ejemplo, como un agonista de TIMP-3). Las proteínas de enlace TIMP-3 que funcionan como agonistas de TIMP-3 pueden ser empleadas en el tratamiento de cualquier padecimiento en el cual se desea un nivel mayor de la actividad de la proteína TIMP-3 (por ejemplo, condiciones en las cuales los MMPs y/u otras proteinasas que son inhibidas por las proteínas TIMP-3 juegan un rol), incluyendo pero sin limitarse a condiciones inflamatorias. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal anti-TIMP-3 humano generado por los procedimientos que comprenden la inmunización del ratón transgénico se emplea en el tratamiento de dichos padecimientos.

Las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser empleadas en un procedimiento in vitro, o administradas in vivo para aumentar la acumulación de la proteína TIMP-3, para elevar los niveles endógenos de la proteína TIMP-3 y/o aumentar la actividad biológica inducida por la proteína TIMP-3. Por lo tanto, pueden ser tratadas las enfermedades ocasionadas o exacerbadas (directa o indirectamente) por las proteinasas que se pueden inhibir de una proteína TIMP-3, cuyos ejemplos aquí se proporcionan. En una modalidad, la presente invención proporciona un método terapéutico que comprende la administración in vivo de una proteína de enlace TIMP-3 agonista a un mamífero que la necesita en una cantidad efectiva para aumentar una actividad biológica inducida por la proteína TIMP-3. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método terapéutico que comprende la administración in vivo de una proteína de enlace TIMP-3 agonista a un mamífero que lo necesita en una cantidad efectiva para elevar los niveles endógenos de proteína TIMP-3.

Las proteínas de enlace TIMP-3 de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales parcialmente humanos o completamente humanos así como polipéptidos o péptidos LRP-1. Una modalidad está enfocada a un anticuerpo monoclonal humano que por lo menos agoniza parcialmente con una actividad de la proteína TIMP-3. En una modalidad, los anticuerpos son generados inmunizando los ratones transgénicos con un inmunogeno de la proteína TIMP-3. En otra modalidad, el inmunogeno es un polipéptido TIMP-3 humano (por ejemplo, una célula transformada o transfectada para expresar la proteína TIMP-3, o una célula que expresa naturalmente la proteína TIMP-3). También se proporcionan aquí, las líneas de células de hibridoma derivadas de dichos ratones inmunizados, en donde el hibridoma secreta un anticuerpo monoclonal que se enlaza a la proteína TIMP-3.

Aunque son adecuados los anticuerpos humanos, parcialmente humanos o humanizados para muchas aplicaciones, particularmente aquellas que comprenden la administración del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de anticuerpos serán adecuados para ciertas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la presente invención pueden ser, por ejemplo, derivados de cualquier animal que produzca anticuerpos, tales como ratones, ratas, conejos, cabras, burros, o primate no humano (tales como monos (por ejemplo, mono cinomolgo o resus) o mono (por ejemplo, chimpancé)).

Los anticuerpos no humanos de la presente invención pueden ser utilizados, por ejemplo, en aplicaciones basadas en cultivos de células y aplicaciones in vitro, o en cualquier aplicación en donde no ocurre una respuesta inmune al anticuerpo de la invención, es insignificante, que pueda ser evitada, no es una preocupación, o se desea. En una modalidad, el anticuerpo no humano de la presente invención es administrado a un sujeto no humano. En otra modalidad, el anticuerpo no humano no promueve una respuesta inmune en el sujeto no humano. En otra modalidad, el anticuerpo no humano es de la misma especie que el sujeto no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón de la presente invención es administrado a un ratón.

Un anticuerpo de una especie particular se puede hacer, por ejemplo, inmunizando un animal de esa especie con el ¡nmunógeno deseado (por ejemplo, células que expresan la proteína TIMP-3, o un polipéptido soluble en la proteína TIMP-3) o utilizando un sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (por ejemplo, un sistema basado en el despliegue bacterial o de fagos para generar anticuerpos de una especie particular), o convirtiendo un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie reemplazando, por ejemplo, la región constante del anticuerpo por una región constante de otra especie, o reemplazando uno o más residuos de aminoácidos del anticuerpo de modo que se asemeje más cercanamente a la secuencia de un anticuerpo de otra especie. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpos de dos o más especies diferentes.

Las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser preparadas por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden ser purificadas de células que los expresan de manera natural (por ejemplo, un anticuerpo puede ser purificado de un hibridoma que lo produce), o producido en sistemas de expresión recombinante, utilizando cualquier técnica conocida en el arte. Ver, por ejemplo, el libro "Anticuerpos Monoclonales, Hibridomas: Una Nueva Dimensión de Análisis Biológico" (Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biológica! Analyses), Kennet y asociados, (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y "Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio" (Antibodies: A Laboratory Manual), de Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

Cualquier sistema de expresión conocido en la técnica puede ser utilizado para hacer los polipéptidos recombinantes de la presente invención. En general, las células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que comprende el ADN que codifica el polipéptido deseado. Entre las células huésped que pueden ser empleadas se encuentran las células procarióticas, de levadura o eucarióticas más altas. Los procariotes incluyen organismos gram positivos o gram negativos, por ejemplo E. coli o bacilli. Las células eucarióticas más altas incluyen células de insectos y líneas de células establecidas de origen de mamífero. Los ejemplos de las líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea de células COS-7 de las células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y asociados, 1981, Cell 23: página 175), las células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y las líneas de células CVI/EBNA derivadas de CVI de líneas de células de riñon de mono verde Africano (ATCC CCL 70) como lo describen McMahan y asociados, 1991, en EMBO J. 10: página 2821. La clonación apropiada de los vectores de expresión para utilizarse con huéspedes celulares bacteriales, micóticos, de levadura y mamífero se describen en el libro de Pouwels y asociados, "Vectores de Clonación: Un Manual de Laboratorio" (Cloning Vectors: A Laboratory Manual), Elsevier, Nueva York, 1985).

Las células transformadas pueden ser cultivadas bajo condiciones que promueven la expresión de cualquier polipéptido, y el polipéptido recuperado por procedimientos de purificación convencionales de proteína. Dicho procedimiento de purificación incluye el uso de cromatografía de afinidad, por ejemplo, sobre una matriz que tiene toda o una porción de la proteína TIMP-3 enlazada a la misma. Los polipéptidos contemplados para utilizarse en la presente invención incluyen polipéptidos de enlace de la proteína TIMP-3 de mamífero recombinante substancialmente homogéneas y substancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.

Las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser preparadas, y seleccionadas por sus propiedades deseadas, por cualquier número de técnicas conocidas. Ciertas de las técnicas comprenden el aislamiento de un ácido nucleico que codifica una cadena de polipéptidos (o una porción de la misma) de una proteína de enlace TIMP-3 de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-TI MP-3), y manipulando el ácido nucleico a través de la tecnología de ADN recombinante. El ácido nucleico puede ser fusionado a otro ácido nucleico de interés, o alterado (por ejemplo, mediante mutagénesis u otras técnicas convencionales) para agregar, eliminar, o substituir, por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos.

En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de enlace TIMP-3 que agoniza con una actividad de la proteína TIMP-3, por ejemplo, aumentando la acumulación de la proteína TIMP-3 o elevando los niveles de la proteína TIMP-3 endógena. En otra modalidad, la proteína de enlace al antígeno agoniza con una actividad de la proteína TIMP-3 en substancialmente la misma cantidad que un anticuerpo aquí descrito en los Ejemplos.

En una modalidad, las proteínas de enlace TIMP-3 de la presente invención tienen una afinidad aparente para la proteína TIMP-3 de 1000 pM o menor. En otras modalidades, la proteína de enlace TIMP-3 exhibe una afinidad aparente de 500 pM o menor, 200 pM o menor, 100 pM o menor, o 80 pM o menor. En otra modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 exhibe una afinidad aparente substancialmente igual a la de un anticuerpo o péptido LRP aquí descrito en los Ejemplos.

En otra modalidad, la presente invención proporciona una proteína de enlace TIMP-3 que compite por el enlace de la proteína TIMP-3 con una proteína de enlace TIMP-3 aquí descrita. Dicha capacidad competitiva puede ser determinada por métodos que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la competición en el enlace de la proteína TIMP-3 en un ensayo tal como una prueba de ELISA, o por la competición de otro ensayo aquí descrito. En un aspecto, una proteína de enlace TIMP-3 que compite por el enlace a la proteína TIMP-3 con un polipéptido aquí descrito se enlaza al mismo epítopo o a un epítopo de traslape (o adyacente) como el polipéptido. En otro aspecto, la proteína de enlace TIMP-3 que compite por el enlace a la proteína TIMP-3 con un polipéptido aquí descrito agoniza con una actividad de la proteína TIMP-3.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína de enlace TIMP-3 que tiene una vida promedio de por lo menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando es administrada a un sujeto humano). En una modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 tiene una vida promedio de por lo menos tres días. En otra modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 tiene una vida promedio de cuatro días o más larga. En otra modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 tiene una vida promedio de ocho días o más larga. En otra modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 es derivada o modificada de modo que tiene una vida promedio más larga comparada con la proteina de enlace TIMP-3 no derivada o no modificada. En otra modalidad, la proteína de enlace TIMP-3 contiene una o más mutaciones de punto para aumentar la vida promedio en el suero, tal como la que se describe en el documento No. WO 00/09560, publicado en Febrero 24, 2000, incorporado a la presente descripción como referencia.

En otro aspecto, el polipéptido (incluye proteínas de enlace al antígeno) de la presente invención comprende derivados de un polipéptido. El polipéptido derivado puede comprender cualquier molécula o substancia que imparte una propiedad deseada al polipéptido, tal como una vida promedio aumentada en un uso particular. El polipéptido derivado puede comprender, por ejemplo, una porción que se puede detectar (o etiquetación) (por ejemplo, una molécula radioactiva, colorimétrica, antigénica, o enzimática, una cuenta que se puede detectar (tal como una cuenta magnética o electrodensa (por ejemplo, de oro)), o una molécula que se enlaza a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), una porción terapéutica o de diagnóstico (por ejemplo, una porción radioactiva, citotóxica, o farmacéuticamente activa), o una molécula que aumenta la adaptabilidad del polipéptido para un uso particular (por ejemplo, la administración al sujeto, tal como a un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). En uno de dichos ejemplos, el polipéptido es derivado con un ligando que se enlaza específicamente a un tejido del cartílago articular, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2008063291 y/o la publicación de Rothenfluh y asociados, Nature Materials 7: página 248 (2008).

Los ejemplos de moléculas que pueden ser utilizadas para derivar un polipéptido incluyen la albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humana) y polietilénglicol (PEG). Los derivados enlazados a albúmina o PEG i lados de los polipéptidos pueden ser preparados utilizando técnicas bien conocidas en el arte. En una modalidad, el polipéptido es conjugado o de otra manera enlazado a la transtiretina (TTR) o variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede ser químicamente modificada con, por ejemplo, un químico seleccionado del grupo consistente de dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilénglicoles, homopolímeros de propilénglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcoholes polivinílicos (Solicitud de Patente Norteamericana No. 20030195154).

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos de selección para una molécula que se enlaza a la proteína TIMP-3 utilizando las proteínas de enlace TIMP-3 de la presente invención. Se pueden utilizar cualesquiera técnicas de selección adecuadas. En una modalidad, una molécula TIMP-3, o un fragmento de la misma a la cual la proteína de enlace TIMP-3 de la presente invención se enlaza, se pone en contacto con una proteína de enlace TIMP-3 de la invención y con otra molécula, en donde la otra molécula se enlaza a la proteína TIMP-3 si reduce el enlace de la proteína de enlace TIMP-3 a la proteína TIMP-3. El enlace de la proteína de enlace TIMP-3 puede ser detectado usando cualquier método adecuado, por ejemplo, un análisis de ELISA. La detección del enlace de la proteína de enlace TIMP-3 a la proteína TIMP-3 puede ser simplificada etiquetando de manera que se pueda detectar la proteína de enlace TIMP-3, como se explicó anteriormente. En otra modalidad, la molécula de enlace TIMP-3 es analizada adicionalmente para determinar si agoniza con una actividad de la proteína TIMP-3 (por ejemplo, aumenta la acumulación de proteína TIMP-3 y/o aumenta los niveles endógenos de proteína TIMP-3).

Composiciones También están comprendidas por la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de productos polipéptídos de la presente invención junto con diluyentes, conservadores, solubilizadores, emulsificadores, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables útiles en la terapia de proteína TIMP-3 (por ejemplo, padecimientos en los cuales son útiles niveles endógenos crecientes de proteína TIMP-3). Dichas composiciones incluyen diluyentes de varios contenidos de regulador (por ejemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato), pH y resistencia iónica; aditivos tales como detergentes y agentes de solubilización (por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80), anti-oxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metasulfito de sodio), conservadores (por ejemplo, Timersol, alcohol bencílico) y substancias de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol); el enlace covalente de polímeros tales como polietilénglicol a la proteína (como se explicaron anteriormente, consultar, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,179,337 incorporada a la presente descripción como referencia); incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. Dichas composiciones influirán en la condición física, estabilidad, cantidad de liberación m_ vivo, y cantidad de disociación in_ vivo de las proteínas de enlace TIMP-3. Consultar, por ejemplo, el libro de Remington "Ciencias Farmacéuticas" (Remington's Pharmaceutical Sciences), 18a Edición. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712 el cual está incorporado a la presente descripción como referencia.

Generalmente, una cantidad efectiva de los polipéptidos presentes será determinada por la edad, peso y condición o severidad de la enfermedad del receptor. Consultar el libro de Remington "Ciencias Farmacéuticas" (Remington's Pharmaceutical Sciences), mencionado anteriormente, en las páginas 697 a 773, incorporado a la presente descripción como referencia. Generalmente, se puede utilizar una dosificación de entre aproximadamente 0.001 g/kg de peso corporal a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, pero más o menos, puede utilizarse como podrá ser reconocida por un practicante experimentado. Para las aplicaciones locales (por ejemplo, no sistémicas), tales como las aplicaciones tópicas o intra-articulares, la dosificación puede ser entre aproximadamente 0.001 g/cm2 hasta aproximadamente 1 g/cm2. La dosificación puede ser una o más veces al día, o menos frecuentemente, y puede ser en conjunto con otras composiciones aquí descritas. Se deberá observar que la presente invención no está limitada a las dosificaciones aquí mencionadas.

Como se podrá entender en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la presente invención son administradas a un sujeto de una manera apropiada para la indicación. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitarse a, parenteralmente, tópicamente, o mediante inhalación. Si es inyectada, la composición farmacéutica puede ser administrada, por ejemplo, por ruta intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, por medio de inyección de bolo, o infusión continua. La administración localizada, está contemplada, por ejemplo, en el sitio de la enfermedad o lesión, como son contempladas la administración transdérmica y la liberación sostenida de los implantes. La administración mediante inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, la inhalación de una forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen gotas para los ojos; preparaciones orales incluyendo pildoras, jarabes, pastillas y chicles; y las preparaciones tópicas tales como lociones, geles, rocíos, y ungüentos.

Una pluralidad de agentes actúa en concierto con el objeto de mantener el equilibrio dinámico de la matriz extracelular y los tejidos. En el tratamiento de padecimientos en donde el equilibrio es sesgado, uno o más de otros agentes pueden ser usados en conjunto con los presentes polipéptidos. Estos otros agentes pueden ser coadministrados o administrados en serie, o en una combinación de los mismos. Generalmente, estos otros agentes pueden ser seleccionados de la lista consistente de las metaloproteinasas, proteasas de serina, inhibidores de enzimas degradadoras de la matriz, enzimas intracelulares, reguladores de adhesión de células, y factores que regulan la expresión de las proteinasas degradantes de la matriz extracelular y sus inhibidores. Aunque los ejemplos específicos se encuentran en la lista siguiente, un experto en la técnica reconocerá que otros agentes que realizan funciones equivalentes, incluyendo agentes adicionales, u otras formas de los agentes de la lista (tales como aquellos producidos sintéticamente, por medio de técnicas de ADN recombinante, y análogos y derivados).

Otros inhibidores de degradación también pueden ser usados si se aumenta o se desea una prevención más específica de la degradación de la matriz extracelular. Los inhibidores pueden ser seleccionados del grupo consistente de alfa2 macroglobulina, proteína de la zona de embarazo, ovostatina, inhibidor de alfa-1 -proteinasa, alfa2-antiplasmina, aprotinina, proteasa nexina-1, inhibidor del activador del plasminógeno (PAI)-1, PAI-2, TIMP-1, y TIMP-2. Se pueden utilizar otros como lo podrá reconocer un experto en la técnica.

Las enzimas intracelulares también se pueden utilizar en conjunto con los polipéptidos actuales. Las enzimas intracelulares también pueden afectar la degradación de la matriz extracelular e incluir enzimas de lisosoma, glucosidasas, y catepsinas.

También se pueden utilizar reguladores de adhesión de la célula en combinación con los polipéptidos presentes. Por ejemplo, se puede desear regular la adhesión de la célula a la matriz extracelular antes de, durante, o después de la inhibición de la degradación de la matriz extracelular utilizando los polipéptidos actuales. Las células que han exhibido adhesión de la célula a la matriz extracelular incluyen osteoclastos, macrófagos, neutrófilos, eosinofílos, células T exterminadoras y células madre. Los reguladores de adhesión de la célula incluyen péptidos que contienen un patrón "RGD" o análogo o antagonistas o agonistas miméticos.

Los factores que regulan la expresión de las proteinasas de degradación de la matriz extracelular y sus inhibidores incluyen citocinas, tales como IL-1 y TNF-alfa, TGF-beta, glucocorticoides, y retinoides. Otros factores de crecimiento que afectan la proliferación celular y/o la diferenciación pueden también ser utilizados si el efecto deseado es inhibir la degradación de la matriz extracelular utilizando los polipéptidos presentes, en conjunto con dichos efectos celulares. Por ejemplo, durante la inflamación, se puede desear mantener el mantenimiento de la matriz extracelular (por medio de la inhibición de la actividad enzimática), y todavía desear la producción de neutrófilos; y por lo tanto se puede administrar el G-CSF. Otros factores incluyen la eritropoyetina, los miembros de la familia de interleucina, miembros de la familia SCF, M-CSF, IGF-I, IGF-II, EGF, FGF tales como KGF, PDGF, y otros. Se puede desear adicionalmente la actividad de los interferones, tales como el interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, o interferón de consenso. Los agentes intracelulares incluyen las proteínas-G, la cinasa de proteína C y las fosfatasas de inositol. El uso de los polipéptidos actuales puede proporcionar beneficios terapéuticos con uno o más agentes involucrados en la terapia inflamatoria.

También se pueden usar agentes de tráfico de células. Por ejemplo, la inflamación comprende la degradación de la matriz extracelular, y el movimiento, o tráfico de células al sitio de la lesión. La prevención de la degradación de la matriz extracelular puede prevenir el tráfico de dicha célula. El uso de los polipéptidos presentes en conjunto con agonistas o antagonistas de los agentes reguladores de tráfico de células puede por lo tanto ser deseado en el tratamiento de la inflamación. Los agentes reguladores de tráfico de células pueden ser seleccionados de la lista consistente de receptores de superficie de célula del endotelio (tales como E-selectinas e integrinas); receptores de leucocitos de superficie celular (L-selectinas); quimiocinas y quimioatrayentes. Para una revisión de las composiciones comprendidas en la inflamación, ver la publicación de Carlos y asociados, en Immunol. Rev. 114: páginas 5 a 28 (1990), la cual está incorporada a la presente descripción como referencia.

Además, las composiciones pueden incluir factores de nueva diferenciación, "NDF", y los métodos de tratamiento pueden incluir la administración de los NDF antes, simultáneamente con, o después de la administración de la proteína TIMP-3. Los factores NDF se ha descubierto que estimulan la producción de la proteína TIMP-2, y la combinación de NDF, TIMP-1, -2 y/o -3 puede proporcionar beneficios en el tratamiento de tumores.

Los productos polipéptidos de la presente invención pueden ser "etiquetados" mediante la asociación con una substancia marcadora que se puede detectar (por ejemplo, radioetiquetados con 25l) para producir reactivos útiles en la detección y cuantificación de la proteína TIMP-3 en un tejido sólido y muestras de fluido tales como la sangre u orina. Los productos de ácido nucleico de la presente invención también pueden ser etiquetados con marcadores que se pueden detectar (tales como radioetiquetas y etiquetas no isotópicas como biotinas) y empleados en procesos de hibridación, por ejemplo, para identificar los genes importantes.

Las composiciones de enlace de la proteína TIMP-3 aquí descrita modifican la patogénesis y proporcionan una terapia benéfica de las enfermedades o padecimientos caracterizados por la degradación de la matriz y/o inflamación, por ejemplo, aquellas en las cuales las metaloproteinasas juegan un rol perjudicial. Las composiciones de enlace de la proteína TIMP-3 pueden ser utilizadas solas o en conjunto con uno o más agentes utilizados en el tratamiento de dichos padecimientos. Por consiguiente, las composiciones de enlace a la proteína TIMP-3 actuales pueden ser útiles en el tratamiento de cualquier enfermedad en donde lá pérdida excesiva de la matriz es ocasionada por la actividad de la metaloproteinasa. Las proteínas de enlace TIMP-3 de la invención son útiles, solas o en combinación con otros fármacos, en el tratamiento de varias enfermedades relacionadas con la sobreproducción de colagenasa, agrecanasa, u otras enzimas promotoras de inflamación o degradantes de la matriz, incluyendo la epidermiolisis bullosa distrófica, osteoartritis, el síndrome de Reiter, pseudogota, artritis reumatoide incluyendo artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante, escleroderma , enfermedad periodontal, ulceración incluyendo de la córnea, epidermis, o ulceración gástrica, curación de heridas después de la cirugía, y restenosis. Otros padecimientos patológicos en los cuales puede jugar un rol el colágeno excesivo y/o la degradación del proteoglicano y por lo tanto en donde las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser aplicadas, incluyen enfisema, la enfermedad de hueso de Paget, osteoporosis, escleroderma, atrofia de la presión del hueso o tejidos como en escaras, colesteatomas, y curación anormal de heridas. Las proteínas de enlace TIMP-3 pueden ser aplicadas adicionalmente como un adjunto para otros promotores de curación de las lesiones, por ejemplo, para regular la rotación de colágeno durante el proceso de curación.

Muchas metaloproteinasas también exhiben actividad proinflamatoria, por consiguiente; las modalidades adicionales incluyen métodos de tratamiento de la inflamación y/o enfermedades autoinmunes, en donde la enfermedad incluye, pero no está limitada a, inflamación del cartílago, y/o degradación del hueso, artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide pauciarticular, artritis reumatoide poliarticular, artritis reumatoide de presentación sistémica, espondilitis anquilosante, artritis enteropática , artritis reactiva, el Síndrome de Reiter, el Síndrome de SEA (Síndrome de Seronegatividad, Entesopatía, Artropatía), dermatomiositis, artritis psoriática, escleroderma , lupus eritomatoso sistémico, vasculitis, escleroderma , lupus eritomatoso sistémico, vasculitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, osteoartritis, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, arteritis, polimialgia reumática, sarcoidosis, escleroderma, esclerosis, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, síndrome de Sjogren, soriasis, soriasis de placa, soriasis de gotata, soriasis inversa, soriasis postular, soriasis eritrodérmica, dermatitis, dermatitis atópica, ateroesclerosis, lupus, enfermedad de Still, Lupus Eritomatoso Sistémico (SLE), myasthenia gravis, enfermedad inflamatoria del intestino delgado, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, enfermedad Celiaca (esprue no tropical), enteropatía asociada con artropatías cero negativas, colitis colagenosa o microscópica, gastroenteritis eosinofílica o floración abdominal resultante después de la proctocolectomía y la anastomosis ileoanal, pancreatitis, diabetes melitus dependiente de la insulina, mastitis, colecistitis, colangitis, pericolangitis, esclerosis múltiple (MS), asma (incluyendo asma extrínseca e intrínseca, así como padecimientos inflamatorios crónicos relacionados o hiper-capacidad de respuesta, de las vías aéreas), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC, por ejemplo, bronquitis crónica, enfisema). Síndrome de enfermedad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de agotamiento respiratorio, fibrosis quística, hipertensión pulmonar, vasoconstricción pulmonar, lesión aguda del pulmón, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía hipersensibilidad, neumonía eosinofílica, bronquitis, bronqu ¡etasis de bronquitis alérgica, tuberculosis, neumonitis hipersensibilidad, asma ocupacional, enfermedades similares al asma, sarcoide, síndrome reactivo de enfermedad de las vías aéreas (o disfunción), bisinosis, enfermedad intersticial del pulmón, síndrome hiper-eosinofílico, rinitis, sinusitis y enfermedad parásita del pulmón, hipercapacidad de respuesta de las vías aéreas asociadas con padecimientos inducidos por virus (por ejemplo, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de parainfluenza (PIV), rinovirus (RV) y adenovirus), la enfermedad de Guillain-Barre, la enfermedad de Graves, la enfermedad de Addison, el fenómeno de Raynaud, hepatitis autoinmune, GVHD y similares.

Las proteínas de enlace TIMP-3 también tienen aplicación en casos en donde los niveles relativos disminuidos de la proteína TIMP-3 (por ejemplo, una disminución en la proporción de la proteína TIMP-3 endógeno a las metaloproteasas, la cual puede ser un resultado de la cantidad disminuida de proteína TIMP-3 o cantidades aumentadas de metaloproteasas) están asociadas con efectos patológicos, por ejemplo, en la isquemia al miocardio, lesión por reperfusión y durante el progreso para la falla congestiva del corazón.

Basados en la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir la degradación del tejido conectivo, agonizando con las proteínas de enlace de la proteína TIMP-3 tiene aplicación en casos en donde la inhibición de la angiogénesis es útil, por ejemplo, para prevenir o retardar el desarrollo de un tumor, y la prevención de la invasión de parásitos. Por ejemplo, en el campo de la invasión de tumor y metástasis, el potencial metastásico de algunos tumores en particular se correlaciona con la capacidad aumentada para sintetizar y secretar colagenasas, y con la inhabilidad para sintetizar y secretar cantidades importantes del inhibidor de metaloproteinasa. Las proteínas de enlace TIMP-3 también tienen aplicación terapéutica para inhibir la diseminación de las células del tumor durante la remoción de tumores primarios, durante la quimioterapia y terapia de radiación, durante la recolección de médula ósea contamida o durante la desviación de ascitos carcinomatosos. En cuanto al diagnóstico, la correlación entre la ausencia de reproducción de proteína TIMP-3 en una muestra de un tumor y su potencial metastásico es útil como un indicador de pronóstico, así como un indicador para la terapia de prevención posible.

Además, las composiciones presentes y métodos pueden ser aplicables para propósitos cosméticos, en los que la inhibición localizada de la rotura del tejido conectivo puede alterar la apariencia del tejido.

Los MMPs también actúan en la lámina basal y las proteínas de unión estrecha en el cerebro, como parte de la trayectoria para la apertura de la barrera de sangre-cerebro (BBB), facilitando la entrada de células y portadores solubles de inflamación dentro del cerebro. Por consiguiente, las composiciones actuales y métodos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso, caracterizadas por la impermeabilización excesiva o inapropiada de la BBB. Adicionalmente, la degradación de las proteínas de la matriz alrededor de las neuronas puede dar como resultado la pérdida de contacto y la muerte de la célula; por lo tanto, las composiciones de enlace de la proteína TI P-3 pueden proteger las células nerviosas del daño conservando la membrana de la base que rodea las células de los nervios. Las composiciones de enlace de la proteína TIMP-3 de la invención son útiles en el tratamiento o alivio de la respuesta neuroinflamatoria a las lesiones, por ejemplo, la isquemia cerebral. Las composiciones aquí descritas también pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas en donde la inflamación es una causa subyacente de la enfermedad, por ejemplo, la esclerosis múltiple así como en el tratamiento de varias formas de neuropatías y/o miopatías, lesiones de la columna vertebral y esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Por consiguiente, los usos de las composiciones de la presente invención pueden comprender la coadministración con BDNG, NT-3, NGF, CNTF, NDF, SCF u otros factores de crecimiento de células de los medios o regulación de la proliferación.

Como se describió anteriormente, las proteínas de enlace TIMP-3 actuales tienen una amplia aplicación en una variedad de enfermedades. Por lo tanto, otra modalidad aquí contemplada es un equipo que incluye los polipéptidos actuales y opcionalmente una o más de las composiciones adicionales descritas anteriormente para el tratamiento de un trastorno que comprende la degradación de la matriz extracelular. Una modalidad adicional es un artículo de manufactura que comprende un material de empaque y un agente farmacéutico dentro de dicho material de empaque, donde el material de empaque contiene el polipéptido de la presente invención, y donde dicho material de empaque comprende una etiqueta la cual indica que dicho agente farmacéutico puede ser utilizado para una indicación seleccionada del grupo que consiste de: cáncer, inflamación, artritis (osteoartritis y sus similares), epidermólisis bulosa distrófica, enfermedad periodontal, ulceración, enfisema, trastornos de huesos, escleroderma , sanación de heridas, deficiencia de eritrocitos, reconstrucción de tejido cosmético, fertilización o modulación del implante de embriones y enfermedades de las células nerviosas. Este artículo de manufactura puede opcionalmente incluir otras composiciones o descripciones de etiqueta de otras composiciones.

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el propósito de ilustrar las modalidades específicas o características de la presente invención y no limitan su alcance.

Ejemplo 1 Este ejemplo describe la internalización de la proteína TIMP-3 exógena examinada por el microscopio confocal. Las células A549 (una línea de célula de tumor continua de un carcinoma de pulmón humano con propiedades de células del epitelio alveolar del tipo II, ya sea de tipo natural o las células A549 que carecen del gen LRP-1) fueron incubadas generalmente con 1 microG/ml de proteína TIMP-3 durante 30 minutos a una temperatura de 4 grados, con o sin diferentes tratamientos previos (incluyendo heparina) luego lavadas, fijadas y teñidas con anticuerpo anti-TIMP-3 etiquetado de manera fluorescente, o lavadas y luego incubadas a una temperatura de 4 ó 37 grados antes de la fijación y tinción. Se analizaron las células para la acumulación de proteína TIMP-3 en el medio de cultivo por medio de análisis Western blot o ELISA, sustancialmente como aquí se describieron.

Se encontró que las células que carecen de LRP-1 acumulaban la proteína TIMP-3 en el medio para un grado mayor que las células de tipo natural. El análisis microscópico confocal mostró que la proteína TIMP-3 se enlaza a la superficie de la célula, desaparece rápidamente cuando las células son incubadas a una temperatura de 36 grados pero no a 4 grados, y se acumula dentro de la célula y si son previamente calentadas con cloroquina, para la degradación de lisosoma. Además, el enlace de la proteína TIMP-3 a la superficie de la célula fue determinado en la presencia de heparina.

Ejemplo 2 Este ejemplo describe la preparación y purificación de péptidos LRP-1. Varios péptidos del ecto dominio de LRP-1 fueron expresados en E.coli , purificados como se describe más adelante probados por el enlace de la proteína TIMP-3 por ambos ensayos de enlace basados en placa o en cuentas. La secuencia de aminoácidos de la LRP-1 se muestra en la SEQ ID NO: 1; la Tabla 1 siguiente es una lista de diferentes péptidos que fueron expresados, haciendo referencia a la secuencia de aminoácidos de la LRP-1. A los péptidos nos referimos en la presente descripción como monómero (por ejemplo, LA3, LA4, LA5 y otros péptidos diseñados por un solo número) o multímero (por ejemplo LA3-5, LA5-7, LA8-10, y otros péptidos designados por múltiples números).

Tabla 1 : Péptidos LRP-1 Los péptidos LRP-1 son preparados utilizando técnicas estándar de proteína recombinante en las bacterias de E.coli. Un cultivo es inoculado de una sola colonia transformada de E.coli para cada péptido de interés, en 3 mL del medio 2xYT (un medio de crecimiento rico nutricionalmente para las cepas recombinantes de E.coli) que contiene 40m¡croG/ml de Kanamicina y cultivados hasta la saturación, durante la noche a una velocidad de 300rpm a una temperatura de 37°C. A la mañana siguiente, son inoculados 1.8 mL del cultivo de la noche en un matraz de agitación de 500 mL de 2xYT que contiene 40microG/ml de Kanamicina y cultivados con agitación a una velocidad de 300rpm a una temperatura de 37°C hasta que el OD6oo es entre 0.8 y 1.0 (aproximadamente de 3 horas).

Los cultivos son inducidos con 500 microL de IPTG 1 M (un mM final de isopropil-beta-D-tiogalactosida) y el cultivo continuó con agitación a 300 rpm a una temperatura de 37°C durante 3 horas. Luego los cultivos fueron transferidos a botellas Nalgene de 500 mi (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY) y centrifugados durante 12 minutos a una velocidad de 8000 rpm para granular las células. El sobrenadante es removido y los gránulos se vuelven a suspender en 20 mL de regulador de lavado/enlace/equilibrado (20 mM de Tris, pH 7.5, 20 mM de imidazol, 1 mM de CaCI2, 300 mM de NaCI). Las células que se volvieron a suspender son transferidas a un tubo de centrífuga de Oak Ridge de 30 mL (VWR, West Chester, PA) y lisados mediante el calentamiento en un baño de agua a 80°C durante 15 minutos. Las células Usadas son enfriadas en baño de agua por aproximadamente 10 minutos y luego centrifugadas durante 30 minutos a una velocidad de 18,000 rpm a una temperatura de 4°C.

Se prepara suficiente agarosa Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA) para 1.5 mL de agarosa por péptido (volumen total 3 mL incluyendo regulador) lavando tres veces la agarosa con regulador de lavado/enlace/equilibrado para removerle el etanol. Después de la tercera lavada, la agarosa Ni-NTA se vuelve a suspender a su volumen original con el mismo regulador. Luego, se agregan 3 mLs de mezcla de agarosa/regulador a 50 mL de tapa plana, tubos de polipropileno de tapón atornillado (Falcon™ disponible en BD Biosciences, San José, CA). Después de granular las células Usadas, cada sobrenadante de proteína es removido y agregado a un tubo que contiene 3 mL de agarosa Ni-NTA lavada.

Se permite que la proteína se enlace a la agarosa Ni-NTA por un período de 0.5 horas a temperatura ambiente con agitación. Luego la resina Ni-NTA más la proteína enlazada es transferida a columnas de gravedad desechables (Clontech, Mountain View, CA) montadas en un múltiple de vacío (Qiagen). Luego, la resina Ni-NTA con la proteína enlazada es lavada con al menos 30 volúmenes de la columna del regulador de lavado/enlace/equilibrado sin permitir que la resina se seque durante el lavado. Las columnas que contienen la resina lavada entonces son colocadas en la parte superior de los tubos de recolección de polipropileno de 15 mL limpios (Falcon™), y la proteína es eluída con 2 mL dos veces (total de 4 mL), del regulador de elución Ni-NTA (20 mM Tris pH 7.5, 200 mM de imidazol, 1 mM de CaCI2, 300 mM de NaCI). Las proteínas eluídas entonces son dializadas dentro del regulador que contiene el reactivo redox [20 mM de Tris pH 7.5, 50 mM de NaCI, 1mM de CaCI2 más 1 mM de 2-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 250 microM de disulfuro de 2-hidroxietilo (Sigma-Aldrich) durante la noche a una temperatura de 4°C. al día siguiente, las proteínas son dializadas en el regulador sin los reactivos redox (20 mM Tris pH 7.5, 50 mM de NaCI, 1 mM de CaCI2) durante 3 horas a una temperatura de 4°C. Esto se repite entonces. Las proteínas son filtradas utilizando un filtro de 0.2 mieras (Pall Corporation, East Hills NY) y almacenadas a una temperatura de 4°C hasta el siguiente paso de purificación.

Para el paso siguiente, se agregó 1.3 mL de una pasta de Q-Sepharose™ (una resina de cromatografía de intercambio de iones con una unión de amonio cuaternario fuerte; ~ 1 mL de resina; GE Healthcare, Piscataway, NJ) por péptido es agregado a 15 mL de columnas desechables de gravedad (Clontech). Las columnas son equilibradas con 10 mL 2 veces de regulador de equilibrio (20 mM Tris pH 7.5, 1 mM de CaCI2, 50 mM de NaCI) y se permite que se drene con la gravedad. Posteriormente, se agregaron suavemente -3.9 mL de proteína Ni-NTA purificada a la resina de Q-Sepharose™ y el flujo es recolectado en 15 mL de tubos de polipropileno (BD Falcon™, BD Biosciences, San José, CA). La resina es lavada 5 veces con 5 mL del regulador de lavado (20 mM Tris pH 7.5, 1 mM de CaCI2, 50 mM de NaCI). La proteína es eluída de la resina con un gradiente de sal de NaCI utilizada para las formas de monómero o ultímeros de los péptidos LRP-1 (ver a continuación) y fueron recolectados en placas de polipropileno de 2 mL de 96 depósitos. La elución se hizo con 1.3 mL x 2 fracciones por proteína por cada concentración de NaCI. El gradiente NaCI para formas de monómero fue: [80 mM, 110 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 250 mM] y para formas de ultímero fue: [100 mM, 150 mM, 180 mM, 220 mM, 250 mM, 300 mM]. Una vez que la proteína es eluída, un ensayo Bradford es llevada a cabo con el objeto de seleccionar las fracciones que contengan la proteína. Se opera un gel de fracciones seleccionadas de purificación - 5 microL/depósito de la proteína de carga purificada Ni-NTA y 10 microL/depósito de fracciones de Q-Sapharose™ eluídas. Las fracciones que contiene la proteína son seleccionadas, conmutadas y almacenadas a una temperatura de 4°C (a corto plazo) o -80°C (a largo plazo).

Ejemplo 3 Este ejemplo describe el enlace de los péptidos LRP-1 a la proteína TIMP-3 recombinante humana y de ratón tal y como fue evaluado utilizando el ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) y AlphaScreen®.

Prueba de enlace de ELISA de la proteína TIMP-3 cubierta directamente Una placa MaxiSorp™ ( una placa de poliestireno de 96 depósitos con alta afinidad para las moléculas con dominios hidrofílico/hidrofóbico mezclados; Nunc Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca) es cubierta con 100 microL/depósito de 100 nM de proteína TIMP-3 humana o de ratón diluida en el regulador de recubrimiento (TBS [pH 7.5], 1 mM de CaCI2) e incubado durante la noche a una temperatura de 4°C. Después de la incubación, la solución recubierta es removida y reemplazada por 250 microL/depósito de regulador de bloqueo (BSA al 1%, TBS [pH 7.5], 1 mM de CaCI2) e incubado con una agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas son entonces lavadas tres veces con 200 microL/depósito con un amortiguador de lavado 1 (TBS [pH 7.5], 1 mM CaCI2). Los péptidos LRP-1 son triturados en el regulador de ensayo (BSA al 0.1%, TBS [pH 7.5], 1mM de CaCI2, Tween-20 al 0.02%) en una placa con 96 depósitos de polipropileno de fondo redondo no tratada separada (BD Falcon™) que inicia a una concentración de 1 microM y entonces es diluida 4 veces de forma serial durante 8 puntos, encontrándose regulador en el último punto. Posteriormente, 100 microL/depósito de la trituración del péptido LRP-1 diluido es agregado a la placa recubierta con TIMP-3 y se permite que se enlace durante 1.5 horas a temperatura ambiente con agitación. Después de la incubación, la placa es lavada tres veces con 200 microL/depósito del regulador de lavado 2 (TBS [pH 7.5], 1 mM de CaCI2, Tween-20 al 0.02%). Una dilución de 1:5K de 100 microG/mL anti-HA de rata (clon3F 10)-H RP (un anticuerpo monoclonal de rata con alta afinidad que reconoce una secuencia de péptido derivada de la proteína de hemaglutinina de influenza, conjugado con peroxidasa de rábano; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) es agregado a 100 microL/depósito diluido en un regulador de ensayo e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placa. La placa de ensayo es entonces lavada 3 veces con 200 microL/depósito con un regulador de lavado 2. La placa es llevada a cabo al agregar 100 microL/depósito de 1:1 de una mezcla de TMB y H202 (Pierce, Fisher Thermo Scientific, Rockford IL), la reacción es detenida al agregar 100 microL/depósito de H2S04 2N(VWR) y leída en un lector de microplaca SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a OD450 nm que utiliza un software SOFTmax Pro versión 3.1.2. Los datos fueron analizados utilizando un software GraphPad Prism 4.01. El enlace de los péptidos LRP-1 a la proteína TIMP-3 es expresado como la proteína de enlace EC50.

Enlace indirecto de ELISA con la proteína TIMP-3 presentado mediante un anticuerpo de neutralización anti-TIMP-3 Una placa MaxiSorp™ es recubierta con 100 microL/depósito de 10 nM de un anticuerpo TIMP-e antihumano de ratón (R & D Systems, Minneapolis, MN, que neutraliza el anticuerpo del clon 277128, el cual no se enlaza a la proteína TIMP-3 del ratón) diluido en el regulador de recubrimiento (TBS [pH 7.5]/ 1 mM CaCI2) e incubado durante la noche a 4°C. Después de la incubación, los contenidos de la placa son desechados y 250 microL/depósito del regulador de bloqueo (BSA al 1%, TBS [pH 7.5], 1 mM de CaCI2) es agregado a la placa que es incubada con una agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa es entonces lavada tres veces con 200 microL/depósito con el regulador de lavado 1 (TBS [pH 7.5], 1 mM de CaCI2) seguido por la agregación de 100 microL de 20 nM de la proteína TIMP-3 de recombinante humano. La placa es incubada a temperatura ambiente durante 1 hora. Los péptidos LRP-1 son triturados tal y como fue descrito anteriormente, y 100 microL/depósito del péptido LRP-1 diluido triturado es agregado a la placa recubierta con TIMP-3 y se permite que se enlace durante 1.5 horas a temperatura ambiente con agitamiento. Después de la incubación, la placa es lavada y la prueba de ELISA es sustancialmente llevada a cabo tal y como fue descrito anteriormente para la prueba ELISA de enlace directo.

Prueba de enlace de la proteína TIMP-3 AlphaScreen Los péptidos también fueron evaluados por AlphaScreen® (Prueba Homogénea de Proximidad Luminiscente Amplificada; PerkinElmer, Waltham, MA), una tecnología de prueba homogénea no radioactiva sensible que permite la visualización de un amplio rango de interacciones y actividades biológicas, sustancialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, todas las diluciones son hechas en un Regulador de AlphaScreen®: [40 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCI, 1 mM CaCI2, BSA al 0.1%, Tween-20 al 0.05%]. Los péptidos LRP-1 son triturados en una placa de 96 depósitos de polipropileno separada (Falcon) que inicia con una concentración de 4 microM y es entonces diluida 3 veces de forma serial durante 12 puntos, encontrándose regulador en el último punto. Primero, 2 microL/depósito de la curva de trituración de proteína es agregado a una placa de prueba de 384 depósitos, blanco de volumen pequeño (Greiner Bio-One, Stonehouse, RU) de forma duplicada. Después, 2 microL de la proteína TIMP-3 de humano o de ratón recombinante biotinilado es agregado a 12 nM (o 3nM de una prueba final de concentración) a la placa de prueba. Finalmente, en una luz disminuida, 4 microL de una mezcla de cuentas de donante de estreptavidina, cuentas aceptoras de IgG anti-ratón (PerkinElmer) ambas diluidas a 20 microG/mL (una concentración final de prueba de 10 microG/mL) y 2 nM (1 nM de concentración final) un anti-HA de rata (clon3F10)-HRP (Roche Diagnostics) es agregado a las placas. Las placas contienen un volumen final de prueba e 8 microL son cubiertas con TopSeal A (para prevenir la evaporación), giradas rápidamente a 1000 rpm, e incubadas durante la noche (cubiertas con lámina para prevenir una exposición a la luz) antes de leerlas en el lector de placa Fusión (PerkinElmer) utilizando parámetros AlphaScreen® (una excitación de 680 nM y una emisión de 520 a 620 nm). Los datos son analizados utilizando un software GraphPad Prism 4.01. El enlace a la proteína TIMP-3 es reportado como una señal total (cps). Los resultados de los varios experimentos son mostrados en las Tablas 2 y 3 a continuación.

Tabla 2: Enlace de los péptidos LRP-1 mediante la prueba ELISA y/o AlphaScreen® ELISA de Enlace AlphaScreen® ND: No Hecho Tabla 3: EC50 de los Péptidos LRP-1 en la proteína TIMP-3 que se enlaza a la prueba ELISA Los múltiples péptidos de ecto dominio LRP-1 enlazados a la proteína TIMP-3 con una afinidad sub-micromolar, incluyendo el Grupo II (el cual contiene 8 dominios de enlace de ligando) y partes del Grupo IV. Los péptidos que se enlazan a la proteína TIMP-3 fueron probados por su interferencia con la inhibición de la proteína TIMP-3 de MMP-13, utilizando un substrato de extinción de fluorescencia, y para la promoción de la acumulación de la proteína TIMP-3 en los cultivos celulares HTB-94, tal y como será descrito a continuación.

Ejemplo 4 Este ejemplo describe las Pruebas de Inhibición de MMP-13 útiles para medir los efectos de las proteínas de enlace TIMP-3 (a las que nos referimos también como moléculas de prueba, incluyendo los péptidos LRP-1 y los anticuerpos TIMP-3) en la capacidad de las proteínas TIMP-3 para inhibir el MMP-13. Primero, es llevada a cabo una trituración de las proteínas TIMP-3 para inhibir el MMP-13, para determinar de forma empírica el IC50 de la proteína TIMP-3. Generalmente, el IC50 de la proteína TIMP-3 al MMP-13 es de 0.5 nM a 1 nM, y es utilizada para seleccionar la concentración utilizada para caracterizar las moléculas de prueba. Brevemente, las moléculas de prueba son trituradas en un regulador de prueba y agregadas a una placa de prueba de 96 ó 384 depósitos de poliestireno negro (Griener Bio-One, Alemania). Las concentraciones de las moléculas de prueba dependen en la actividad de la molécula: por ejemplo, las trituraciones pueden comenzar en 1000, 2000 ó 3000 nM y utilizar cinco veces diluciones para la trituración, aunque otros ripos de trituraciones pueden ser utilizadas o una sola concentración puede ser probada. Entonces, la proteína recombinante TIMP-3 es diluida en el regulador de prueba (20 mM Tris, 10 mM de CaCI2, 10 uM ZnCI2, Brij 35 al 0.01% (Calbiochem/EMD, San Diego, CA), pH 7.5) a una concentración previamente determinada (por ejemplo, el IC70 de la proteína TIMP-3, siendo 3 nM una concentración típica), agregado a las moléculas de prueba y girado durante 10 minutos a temperatura ambiente. El MMP-13 activo (Calbiochem/EMD) es diluido en el regulador de prueba para proporcionar una concentración final de prueba de 1.46 nM agregado a la trituración de la molécula de prueba/mezcla de la proteína TIMP-3, e incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente en un volumen final de 50 microL. Como alternativa, el pro MMP-13 (R & D Systems, Minneapolis, MN) es activado con acetato mercúrico de aminofenilo (APMA; Calbiochem/EMD) durante 2 horas a 37 grados C, y utilizado en la prueba.

Un substrato fluorogénico tal como el Substrato MMP Fluorogénico Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 o el Substrato de Péptido Fluorogénico Mca-KPLGL-Dpa-AR-NH2 (R & D Systems) es preparado a una concentración de prueba final de 20 microM en el regulador de prueba, y agregado a la enzima MMP- 3/huTIMP-3/solución de la molécula de prueba. La actividad del MMP-13 es medida de forma cinética durante 20 minutos utilizando un lector de placa fluorescente de Molecular Devices. El efecto de las moléculas que están siendo probadas es expresado como el porcentaje de inhibición máxima de la proteína TIMP-3, y el mínimo esperado de la actividad enzimática del MMP-13.

Las moléculas de prueba también son analizadas para una inhibición directa de la actividad de MMP-13 en una prueba sustancialmente similar a la descrita anteriormente, pero con la ausencia de la proteína TIMP-3. Las trituraciones de las moléculas de prueba en el regulador de prueba pueden comenzar en 1000 nM y utilizar diluciones de cinco veces para la trituración, aunque otros tipos de trituración pueden ser utilizadas o una sola concentración puede ser probada. El MMP-13 activo es diluido en el regulador de prueba para proporcionar una concentración de prueba final de 1.46 nM, agregado a la trituración de la molécula de prueba e incubado durante 10 minutos a temperatura ambiente en un volumen final de 50 microL. Un substrato fluorogénico es preparado a una concentración de prueba final de 20 microM en un regulador de prueba, y agregado a la enzima MMP-13/solución de molécula de prueba. La actividad del MMP-13 es medida de forma cinética durante 20 minutos utilizando un lector de placa fluorescente de Molecular Devices. El efecto de las moléculas probadas es expresado como una disminución porcentual de la actividad enzimática del MMP-13.

La tabla 4 a continuación presenta los resultados de un conjunto de experimentos que comparan el efecto de varios péptidos LRP-1 en la inhibición de la proteína TIMP-3 del MMP-13, así como su efecto directo en la actividad del MMP-13. Los péptidos que demostraron una inhibición mayor al 90% que ocurrió sólo con la proteína TIMP-3 sola fueron observados como que no afectan de forma significativa la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir a la enzima MMP- 3; los péptidos que disminuyeron la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir el MMP-13 al 10% o más (por ejemplo, aquellos que rindieron 90% o menos de la actividad inhibidora observada con la proteína TIMP-13 sola), fueron observados como que tienen un efecto negativo en la capacidad inhibidora de la proteína TIMP-3. Los péptidos que por sí mismos disminuyeron la actividad del MMP-13 al 10% o más fueron observados como que afectan de forma significativa la actividad del MMP-13.

Tabla 4: El efecto de los péptidos LRP-1 en la inhibición de la proteína TIMP-3 del MMP-13 y/o en la actividad del MMP-13 ND: No hecho Nota: ciertos péptidos parecieron aumentar la actividad del MMP-13; estos son mostrados con un número negativo en la columna del % de disminución.

Las secuencias del grupo IV sustancialmente dañaron la inhibición de la proteína TIMP-3 del MMP-13, pero el grupo II tuvo un efecto mínimo en esta actividad inhibidora.

Ejemplo 5 Este ejemplo describe una prueba para evaluar la acumulación de la proteína TIMP-3 en el medio de células cultivadas. Las células HTB-94™ (una línea celular condrocítica disponible en American Type Culture Collection, Manassas, VA) son colocadas en placas de cultivo de tejido de 24 depósitos en 1X10a5 células por depósito en 1mL de un medio de crecimiento (RPMI 1640, FBS al 10%, PSG al 1%), e incubadas a 37°C, y 5% de C02 durante la noche. Las células fueron entonces lavadas una vez con PBS, y los depósitos fueron rellenados con 250 microL de un medio libre de suero (RPMI 1640, PSG al 1%; SF designado en las tablas a continuación) al cual es agregado el polipéptido que está siendo probado o un control (por ejemplo, un medio que contiene heparina, 1 mg/ml). Las proteínas que serán probadas son diluidas a concentraciones apropiadas, por ejemplo tal y como es mostrados en las tablas a continuación, y agregadas a las células. Las células son entonces incubadas a 37°C, 5% de C02 durante dos días adicionales, las muestras del medio acondicionado del día 2 (CM) son recolectadas y clarificadas mediante centrifugación (por ejemplo, durante 5 minutos a 10K RPM) y el fluido sobrenadante es recolectado y almacenado a -20°C hasta que es probado. El análisis es llevado a cabo en muestras de 100 microL CM, ya sea por una prueba Western blot o mediante el uso de una prueba ELISA de la proteína TIMP-3 humana estándar, tal y como fue señalado por el protocolo del fabricante (R & D Systems INC., Minneapolis, MN).

El análisis realizado por la prueba Western blot indicó que los polipéptidos del Grupo II (C II) de la acumulación mejorada de LRP-1 de la proteína TIMP-3 en un medio acondicionado de las células HTB-94TM, los polipéptidos del Grupo I, del Grupo II, del Grupo III y del Grupo IV no resultaron con una acumulación significativa. Los CM también fueron probados por la prueba ELISA, y las concentraciones aproximadas de la proteína TIMP-3 determinadas por los valores de comparación a una curva estándar; los resultados de los varios experimentos son mostrados en las Tablas de la 5 a la 7 presentadas a continuación.

Tabla 5: Acumulación de la proteína TIMP-3 en la presencia del Grupo I de LRP-1 y polipéptidos del dominio del Grupo II.

Tabla 6: Acumulación de la proteína TIMP-3 Tabla 7: Acumulación de la proteína TIMP-3 en la presencia de los péptidos LRP-1 en la presencia de los péptidos LRP-1 (2 microM) (2 microM) TIMP-3 TIMP-3 Varios péptidos del Grupo II resultaron en la acumulación de la proteína TIMP-3 en los cultivos de las células HTB-94 comparables con los observados en la presencia de heparina, la cual se cree que previene que la proteína TIMP-3 se enlace a la superficie de la célula.

Ejemplo 6: Preparación de Anticuerpos Monoclonales Fueron generados anticuerpos completamente humanos para la proteína TIMP-3 inmunizando las cepas de ratones transgénicas XenoMouse™ utilizadas, incluyendo XMG2-KL y XMG4-KL. (Méndez MJ y asociados., en Nat Gen, 1997, y Kellerman y asociados., en Curr Opin Biotech 2002). Los ratones fueron inmunizados con una proteína TIMP3-His soluble durante un tiempo suficiente y con inmunizaciones suficientes para exhibir respuestas inmunoespecíficas (por ejemplo, aproximadamente 2.5 meses completos con refuerzos bisemanales en las primeras cuatro semanas, utilizando rutas de inyección alternas, inyecciones intra-peritoneales dentro del abdomen o inyecciones subcutáneas en la base de la cola, seguido por un refuerzo semanal durante las últimas seis semanas utilizando las mismas rutas alternas de inyección). El título de suero fue monitoreado por una prueba inmunoabsorbente enlazada a la enzima (ELISA) que utiliza placas recubiertas con TIMP-3pHis. Los ratones que exhibieron respuestas inmunes anti TIMP-3 fueron sacrificados y utilizados para una generación de anticuerpos.

Los anticuerpos que se enlazan de forma específica a la proteína TIMP-3 fueron identificados utilizando una selección de enlace de ELISA. Para esta prueba las placas ELISA con 384 depósitos son recubiertas con 10 microG/ml de neutravadina (una forma desglicosilada de estreptavidina, disponible en Pierce Fisher Thermo Scientific), durante la noche a 4°C. Las placas son entonces cargadas con 1 microG/ml de TIMP3pHis biotinilado. Los sobrenadantes identificados como positivos para enlazarse a la proteína TIMP-3 (86 sobrenadantes de enlace positivos de la campaña de inmunización de la proteína ????-3-poliHis y 33 sobrenadantes de enlace positivos de la campaña de inmunización de la proteína TI P-3pH¡s/KLH) fueron evaluados y clasificados en diferentes pruebas, incluyendo la interferencia con la inhibición de MMP13 por TIMP-3, la cuantificación relativa de la concentración de IgG específico, y la afinidad relativa de la proteína TIMP-3 en una configuración baja en antígenos. Los anticuerpos también fueron evaluados por su efecto en la acumulación de la proteína TIMP-3 en un sobrenadante de cultivo sustancialmente fluido como en el Ejemplo 5; los resultados son mostrados a continuación.

Tabla 8: Acumulación de la proteína TIMP3 en la presencia de los anticuerpos ????-3-específicos Cuando son probados para la interferencia con la capacidad para que la proteína TIMP-3 inhiba el MMP-13 utilizando una prueba similar a la descrita anteriormente, el anticuerpo 10A7 exhibió relativamente poca interferencia, mientras que los anticuerpos restantes exhibieron una mayor interferencia. Los anticuerpos 8F1, 8C5 y 10A7 también exhibieron la internalización de la proteina TIMP-3 tal y como es observada por el microscopio sustancialmente confocal descrita anteriormente.

Ejemplo 7: Preparación de Anticuerpos Monoclonales Fueron identificados anticuerpos monoclonales adicionales contra la proteína TIMP-3 humana a partir de los conjuntos de hibridomas previamente descritos, utilizando una prueba ELISA con, ya sea la proteína TIMP-3 ligeramente cubierta o la proteína TIMP-3 anclada mediante un anti-TIMP-3 MAB9731 (R & D Systems). Los anticuerpos que resultaron positivos en la prueba ELISA también fueron probados para una acumulación de la proteína TIMP-3, utilizando una prueba tal y como se describió anteriormente. Veintiséis hibridomas fueron identificados como anticuerpos secretores que facilitan la acumulación de la proteína TIMP-3 cuando el sobrenadante de hibridoma fluido gastado fue evaluado en una prueba de acumulación de la proteína TIMP-3 (después del intercambio de regulador dentro del medio libre de suero para reducir los efectos del fondo anteriores en la prueba de acumulación de la proteína TIMP-3). Cuatro de estos hibridomas fueron perdidos durante la sub-clonación, pero los 22 restantes fueron cultivados a una mayor escala, y los anticuerpos monoclonales fueron purificados y evaluados, para la acumulación de la proteína TIMP-3 y los posibles efectos de la proteína TIMP-3 en la inhibición del MMP-13 (así como cualquier efecto directo en el MMP-13).

Ninguno de los 22 anticuerpos evaluados afectó de forma adversa la capacidad de la proteína TIMP-3 de inhibir al MMP-13, tampoco tuvieron un efecto en el MMP-13. En la prueba de acumulación de la proteína TIMP-3, los anticuerpos fueron evaluados para un aumento reproducible y triturable en la acumulación de la proteína TIMP-3 en el fluido del sobrenadante a niveles de al menos 1.5 veces mayor que los observados con un anticuerpo de control negativo. Cuatro anticuerpos fueron seleccionados para un análisis adicional y un desarrollo de línea celular; los resultados de una prueba de acumulación de la proteína TIMP-3 y la prueba de inhibición de MMP-13 en estos anticuerpos son mostrados a continuación. La prueba de inhibición de MMP-13 utilizó 1.5 nM de MMP-14 (CalBiochem), 0.25 nM de la proteína TIMP-3 purificada (que resultó en una inhibición al 54% de la actividad del MMP-13 en la ausencia de cualquier anticuerpo), y 20 microM de un Substrato de Péptido Fluorogénico Mca-KPLGL-Dpa-AR-NH2 (substrato ES010, R & D Systems) en una prueba con un volumen de 100 microL. Para la prueba de inhibición del MMP- 13, el anticuerpo 10A7 fue incluido como un control Ab que se sabe que compromete la inhibición de la proteína TIMP-3 del MMP-13, al menos en cierto grado.

Tabla 9: Efecto de los anticuerpos anti-TIMP-3 en la inhibición de MMP-13 por la proteína TIMP-3 Estos resultados indican que los anticuerpos 16A1.1, 18H1.1, 17A4.1 y 18C1.1 no disminuyeron de forma significativa la capacidad de la proteína TIMP-3 para inhibir el MMP-13, a concentraciones de hasta aproximadamente 80 veces de exceso molar de anticuerpo.

Tabla 10: Efecto de los anticuerpos anti-TIMP-3 en la Acumulación de la proteína TIMP-3 Estos resultados indican que los anticuerpos 16A1.1, 18H1.1, 17A4.1 y 18C1.1 conducen a una acumulación de la proteína TIMP-3 en el fluido del sobrenadante. El análisis subsecuente indicó que los anticuerpos 17A4 y 18C1 tuvieron la misma secuencia de aminoácidos. Los 16 clones restantes fueron almacenados para una posible evaluación adicional en el futuro.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de enlace TIMP-3 que se enlaza a la proteína TIMP-3, e inhibe la internalización de la proteína TIMP-3 mediante el LRP-1.

2. La proteína de enlace TIMP-3 tal y como se describió en la reivindicación 1 , caracterizada porque es un anticuerpo o un péptido LRP-1.

3. La proteína de enlace TIMP-3 tal y como se describió en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, caracterizada porque disminuye la inhibición del MMP-13 por la proteína TIMP-13 al menos en un 30%.

4. Un método para aumentar la proteína TIMP-3 en una matriz extracelular al contactar la proteína TIMP-3 con una proteína de enlace TIMP-3, tal y como se describió en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.

5. El método, tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína TIMP-3 es contactada con la proteína de enlace TIMP-3 in vivo, ex vivo o in vi tro.

6. El método, tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína TIMP-3 es contactada con la proteína de enlace TIMP-3 in vivo al administrar la proteína de enlace TIMP-3 a un mamífero.

7. Un método para tratar un mamífero afligido con un padecimiento en donde la matriz de metaloproteinasas juega un rol pernicioso, que comprende administrar una proteína de enlace TIMP-3 a un mamífero, tal y como se describe en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.

8. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el padecimiento es seleccionado del grupo que consiste de inflamación, cáncer y una condición caracterizada por una degradación excesiva de la matriz extracelular.

9. El método, tal y como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque el padecimiento es seleccionado del grupo que consiste de osteoartritis y falla cardíaca congestiva.