EA011504B1 - Антитела, связывающие клеточные полипептиды са 125/0772р, и способы их применения - Google Patents

Антитела, связывающие клеточные полипептиды са 125/0772р, и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA011504B1
EA011504B1 EA200500647A EA200500647A EA011504B1 EA 011504 B1 EA011504 B1 EA 011504B1 EA 200500647 A EA200500647 A EA 200500647A EA 200500647 A EA200500647 A EA 200500647A EA 011504 B1 EA011504 B1 EA 011504B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
pta
atcc
antibody fragment
fragment
Prior art date
Application number
EA200500647A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200500647A1 (ru
Inventor
Ирл Ф. Элбон
Дэниел А. Солтис
Original Assignee
Еуро-Селтик С. А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32110191&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA011504(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Еуро-Селтик С. А. filed Critical Еуро-Селтик С. А.
Publication of EA200500647A1 publication Critical patent/EA200500647A1/ru
Publication of EA011504B1 publication Critical patent/EA011504B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение описывает антитела и фрагменты антител, связывающих антигены, синтетические полипептиды и аналоги, избирательно связывающие клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми полипептидами СА 125/0772Р. Настоящее изобретение также описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных заболеваниями, связанными с СА 125/0772Р. В частности, настоящее изобретение заключает в себе методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных заболеваниями, связанными с пролиферацией клеток, такими, как рак (например, рак яичника). Далее, настоящее изобретение описывает методы диагностики заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или предрасположенности к подобным заболеваниям, а также методы идентификации антител, избирательно связывающих клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми полипептидами СА 125/0772Р.

Description

1. Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение описывает антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, синтетические полипептиды и аналоги, избирательно связывающие клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми полипептидами СА 125/0772Р, а также методы выявления и получения подобных антител и фрагментов антител, связывающих антигены. Настоящее изобретение также описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных заболеваниями, связанными с СА 125/0772Р. В частности, настоящее изобретение описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных заболеваниями, связанными с пролиферацией клеток. Например, настоящее изобретение описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных раком. В предпочтительном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение относится к методам предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов рака яичника. Настоящее изобретение также содержит описание химических составов и изделий, используемых для предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления одного или нескольких симптомов, вызванных заболеваниями, связанными с СА 125/0772Р, например онкологических (в частности, рака яичника). Кроме того, настоящее изобретение содержит описание методов диагностики заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или предрасположенности к подобным заболеваниям.
2. Предпосылки создания изобретения
Высокомолекулярные полипептиды, называемые СА 125, обнаруживаются примерно у 80% пациентов, страдающих раком яичника (см. Кабават и др., Ат. 1. С1т. Ра11ю1. 79:98-104 (1983); а также Гадуччи и др., 6упесо1. Опсо1. 44:147-154 (1992)). СА 125 присутствуют на поверхности опухолевых клеток, и обладающие повышенной секрецией (культивируемые) формы СА 125 обнаруживаются у 80-90% пациентов с раком яичника.
Антитела, направленные против СА 125, были получены и использованы для определения концентраций СА 125, а также для выделения СА 125 из среды клеточной культуры. См., например, Баст и др., 1. С11п. 1пуе81. 68(5):1331-1337 (1981); Кранц и др., 1. Се11. Вюсйет. (Прилож.), 12(Е):139 (1988); патенты США № 4921790, 5059680 и 5976818; а также ДР 11014626.
В дополнение к антителам, контролирующим наличие СА 125, патенты США № 5858361 и 6241985 описывают использование в качестве терапевтических средств антиидиотипических антител анти-СА 125.
Несмотря на вышесказанное, заболевания, связанные с СА 125/0772Р, такие как рак яичника, остаются важной проблемой. В связи с этим сохраняется высокая потребность в разработке методов производства и химических составов лекарств для лечения подобных заболеваний.
Цитирование или ссылки на какие-либо документы в настоящем или в последующих разделах не следует толковать как подтверждение того, что информация, содержащаяся в данных документах, использовалась в качестве прототипа настоящего изобретения.
3. Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение основано, в частности, на том факте, что события, которые приводят к образованию культивируемого СА 125/0772Р, также оставляют часть внеклеточного участка аминокислотной последовательности СА 125/0772Р в клеточной форме, т.е. также приводят к образованию клеточного СА 125/0772Р. Далее, настоящее изобретение основано, в частности, на предположении о том, что можно получить антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, избирательно связывающие клеточные СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми СА 125/0772Р, и что данные антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, можно использовать, например, для предотвращения возникновения, контроля, лечения и снижения интенсивности заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, либо одного или нескольких симптомов подобных заболеваний, например, связанных с пролиферацией клеток, таких как рак (например, рак яичника).
Настоящее изобретение, в первую очередь, описывает отдельное антитело или фрагмент антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Кроме того, описывается отдельное антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые связываются с пептидом, показанным на фиг. 1. Подобные антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, являющиеся предметом изобретения, применяются для различных терапевтических, профилактических, диагностических целей, а также для целей выделения и рассматриваются в настоящем документе.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, связывают пептид в последовательности № 1 или в последовательности № 2, а также избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р. В одном из подобных вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, связывают неповторяющийся участок, показанный в последовательности № 1 или в последовательности № 2. Еще в одном варианте осуществления изобретения
- 1 011504 антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, связывают повторяющийся участок, показанный в последовательности № 1 или в последовательности № 2.
В первом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, показывают при проведении сравнительных испытаний методом ЕЬ18А (иммуноферментного твердофазного анализа) менее приблизительно 25%, менее приблизительно 20%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 10% или менее приблизительно 5% ингибирования связывания с пептидом, изображенным на фиг. 1 (последовательность № 1), в присутствии 25-кратного (по весу) превышения культивируемого СА 125/0772Р в сравнении с пептидом, показанным на фиг. 1 (последовательность № 1).
Во втором варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, показывают при проведении сравнительных испытаний методом проточного цитометрического анализа 1С50 (подсчет процентного количества положительных клеток) не менее 0,05 мг/мл, не менее 0,25 мг/мл, не менее 0,5 мг/мл, не менее 0,75 мг/мл или не менее 1,0 мг/мл культивированного СА 125/0772Р.
В третьем варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, связывают пептид, изображенный на фиг. 1, но не осуществляют очевидного связывания культивированного полипептида СА 125/0772Р.
Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, удовлетворяющее одному из перечисленных выше трех случаев, является антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, которое избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р.
Среди антител и фрагментов антител, связывающих антигены, являющихся предметом изобретения, имеются антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые связывают пептид, изображенный на фиг. 1 (последовательность № 1), с Кб не более примерно 100 нМ, не более примерно 10 нМ, не более примерно 1 нМ, не более примерно 100 пМ или не более примерно 10 пМ; данная величина измеряется методом анализа сходства В1Асоге, который описывается в разделе 6.4 настоящего документа.
К предпочтительным вариантам антител или фрагментов антител, связывающим антигены, являющихся предметом изобретения, относятся антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые являются промежуточным звеном лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при зависящем от антител анализе клеточной цитотоксичности (АЭСС).
К подобным антителам или фрагментам антител, связывающим антигены, относятся антитела или их фрагменты служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10% лизиса СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток при анализе АЭСС, при соотношении эффектор: мишень, равном 50:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем при 20% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор:объект, равном 50:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем при 20% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор:мишень, равном 50:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем при 10% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор:мишень, равном 25:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем при 10% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор: мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем при 10% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор: мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 0,5 мкг/мл); или служащие промежуточным звеном не менее чем при 10% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АЭСС при соотношении эффектор:мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающих антигены, 50· 10-9 кг/мл).
К предпочтительным вариантам осуществления изобретения относятся также антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые служат промежуточным звеном лизиса СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток при анализе комплементзависящей цитотоксичности (СЭС). К подобным антителам и фрагментам антитела, связывающим антигены, относятся, например, те антитела и фрагменты, которые служат промежуточным звеном лизиса в интервале примерно от 15% лизиса при концентрации антител или фрагментов антител 5 мкг/мл и примерно до 95% лизиса при концентрации антител или фрагментов антител 0,1 мкг/мл.
- 2 011504
К предпочтительным вариантам осуществления изобретения относятся также антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые ингибируют опухолевый рост СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, являющееся предметом изобретения, представляет собой моноклональное антитело, вырабатываемое гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), либо гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), либо гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), либо гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), либо гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), либо гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), либо гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), либо гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), либо гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), либо гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), либо гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), либо гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), либо гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), либо гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), либо гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), либо гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), либо гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), либо гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), либо гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), либо гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), либо гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), либо гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), либо гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124), либо гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
В другом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, представляют собой антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которое конкурирует с моноклональным антителом, вырабатываемым гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), либо гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), либо гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), либо гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), либо гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), либо гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), либо гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), либо гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), либо гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), либо гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), либо гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), либо гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), либо гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), либо гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), либо гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), либо гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), либо гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), либо гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), либо гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), либо гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), либо гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), либо гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), либо гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124), либо гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570), для связи с клеточными СА 125/0772Р.
Антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, считаются конкурирующими при связывании, если они конкурируют при связывании при проведении анализа методом перекрестной конкуренции ЕЫ8Л и/или методом перекрестной конкуренции с использованием РЛС8 (активируемого флюоресценцией анализатора клеток). Антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, считаются конкурирующими при связывании при анализе методом перекрестной конкуренции ЕЫ8Л и/или методом перекрестной конкуренции с использованием РЛС8, если концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмент антитела, связывающего антиген, не превышает примерно 100-кратной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, не превышает примерно 10-кратной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, не превышает примерно эквимолярной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген.
В другом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 117.1 полипептидов переменной длины (117.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, описываемой как последовательность № 27 (117.1Ь).
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 117.1 полипептидов переменной длины (117.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, описываемой как последовательность № 28 (117.1 Н).
- 3 011504
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, описываемой как последовательность № 27 (117.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, описываемой как последовательность № 28 (117.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 368.1 полипептидов переменной длины (368.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1Ь)
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 368.1 полипептидов переменной длины (368.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 501.1 полипептидов переменной длины (501.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 31 (501.1Ь).
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 501.1 полипептидов переменной длины (501.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 32 (501.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, обозначенной как последовательность № 31 (501.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 32 (501.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 776.1 полипептидов переменной длины (776.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1Ь).
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 776.1 полипептидов переменной длины (776.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 34 (776.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 34 (776.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 725.1 полипептидов переменной длины (725.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54.
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 725.1 полипептидов переменной длины (776.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 53.
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54, и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 53.
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 16Н9 полипептидов переменной длины (16Н9Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 56.
- 4 011504
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 16Н9 полипептидов переменной дпины (16Н9), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 55.
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, обозначенной как последовательность № 56, и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 55.
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 27 (117.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 31 (501.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54 (725.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1 Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (16Н9Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
К антителам, описываемым в настоящем изобретении, относятся, без ограничения, поликлональные антитела, моноклональные антитела, химерные антитела, очеловеченные антитела, биспецифические антитела, триспецифические антитела, мультиспецифические антитела, бивалентные и тривалентные антитела, однонитевые антитела или антиидиотипические аутоантитела. В предпочтительном варианте в изобретении описывается моноклональное антитело, избирательно связывающее клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р.
Антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, описываемые в изобретении, могут содержать без ограничения фрагменты РаЬ, фрагменты Р(аЬ')2, дисульфидсвязанные Ρν8, однониточные Ρν8, (УЬ)-содержащие фрагменты легкой цепи полипептида переменной длины, (УН)-содержащие фрагменты тяжелой цепи полипептида переменной длины или (СОР)-содержащие фрагменты, комплиментарно определяющие участок, а также фрагменты любого из перечисленных выше антител, составляющих предмет изобретения.
Далее, антитела или фрагмент антитела, связывающие антигены, являющиеся предметом изобретения, могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов. Например, антитела, описываемые в изобретении, могут относиться к классу антител 1дС. 1дМ, 1дЕ, Ι§Ό, 1дА или 1дУ. Кроме того, антитела, описываемые в изобретении, могут быть любого изотипа. Например, антитело, являющееся предметом изобретения, может иметь изотип тяжелой цепи 1дС|, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА1 или 1дА2.
- 5 011504
Кроме того, антитела, являющиеся предметом изобретения, могут, например, образовывать участок легкой цепи переменной длины, такой как участок легкой цепи к или λ переменной длины, участок тяжелой цепи переменной длины либо, соответственно, СЭР, вставляемый в обрамляющий участок. Например, антитело, являющиеся предметом изобретения, может содержать константный участок Су1 или Су4.
Еще одной стороной настоящего изобретения являются клетки гибридомы, которые вырабатывают моноклональные антитела, являющиеся предметом изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения гибридомой, являющейся предметом настоящего изобретения, была гибридома 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридома 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридома 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридома 7Е10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридома 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридома 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридома 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), гибридома 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридома 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридома 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), гибридома 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридома 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридома 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), гибридома 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридома 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), гибридома 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридома 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридома 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридома 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридома 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридома 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридома 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридома 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридома 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
В другом варианте осуществления изобретения гибридомой, являющейся предметом изобретения, была гибридома, вырабатывающая моноклональные антитела, которые конкурировали с моноклональным антителом, вырабатываемым гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридомой 7Е10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570) для связи с клеточными СА 125/0772Р.
Антитела считаются конкурирующими при связывании, если они конкурируют в процессе связывания при сравнительном анализе методом ЕЬ18А и/или при сравнительном анализе методом ЕАС8. Антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, считается конкурирующим при связывании при сравнительном анализе ЕЫ8А или при сравнительном анализе ЕАС8, если концентрация 1С50 для антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, выступающего в роли конкурента, превышает концентрацию антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, не более чем примерно в 100 раз. В более предпочтительном варианте концентрация 1С50 для антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, выступающего в роли конкурента, превышает концентрацию антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, не более чем примерно в 10 раз. И, наконец, в наиболее предпочтительном варианте концентрация 1С50 для антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, выступающего в роли конкурента, равна примерно эквимолярной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген.
Еще одним предметом настоящего изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, которая образует нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, составляющих предмет изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение описывает синтетический полипептид, состоящий из антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, являющихся предметом изобретения, т.е. избирательно связывающий клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми полипептидами СА 125/0772Р, и образующий рабочую связь с гетерологичным агентом. В одном из вариантов синтетического полипептида, являющегося предметом изобретения, антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, и гетерологичный агент образуют рабочую ковалентную связь, например пептидную или дисульфидную. Имеется вариант синтетического полипептида, являющегося предметом изобретения, когда антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, и гетерологичный агент образуют рабочую нековалентную связь. Имеется вариант синтетического полипептида, являющегося предметом изобретения, когда гетерологичный агент образует аминокислотную последовательность или радиоизо
- 6 011504 топ. В различных неограниченных вариантах гетерологичный агент синтетического полипептида, являющегося предметом изобретения, содержит цитотоксичный агент или выявляемый, например, визуализируемый агент.
Частью изобретения являются также аналоги антител, фрагментов антител, связывающих антигены, и синтетические полипептиды, которые избирательно связывают клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с полипептидами культивируемого СА 125/0772Р. В одном из вариантов осуществления изобретения подобный аналог проявляет повышенное сходство с клеточным полипептидом СА 125/0772Р в сравнении с соответствующим предварительно модифицированным антителом, фрагментами антител, связывающих антигены, и синтетическим полипептидом. В другом варианте осуществления изобретения подобный аналог демонстрирует повышенное время полужизни сыворотки в сравнении с соответствующим предварительно модифицированным антителом, фрагментами антител, связывающх антигены, и синтетическим полипептидом.
Например, к аналогам предмета изобретения относятся аналоги моноклонального антитела, вырабатываемого гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), или гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), или гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), или гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), или гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), или гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), или гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), или гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), или гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), или гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), или гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), или гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), или гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), или гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), или гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), или гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), или гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), или гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), или гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), или гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), или гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), или гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), или гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124), или гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
Еще одной стороной настоящего изобретения является фармацевтический состав, включающий в себя антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог предмета изобретения, который избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р, а также приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель.
Еще одной стороной настоящего изобретения является метод приготовления фармацевтического состава на основе примешивания антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, к приемлемому с фармацевтической точки зрения носителю.
Еще одной стороной настоящего изобретения является изделие, состоящее из упаковочного материала и фармацевтического состава, являющегося предметом изобретения, в форме, пригодной для назначения пациентам, предпочтительно людям. В одном из вариантов изделие дополнительно содержит печатные инструкции и/или этикетку, на которых указана информация о применении фармацевтического состава. Инструкции и/или этикетка могут, например, содержать информацию о дозировании средства для предотвращения или подавления отдельных симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, в частности заболеваний, связанных с пролиферацией клеток, такими как рак (например, рак яичника, матки, молочной железы или легких) и др.
Кроме этого, настоящее изобретение описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р. Эти методы включают в себя прием лицом, нуждающимся в подобном предотвращении возникновения, контроле, лечении и уменьшении интенсивности проявления симптомов, антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, в количестве, достаточном для предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления симптомов заболеваний, связанных с пролиферацией клеток, в случаях, когда упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающего антигены, избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р.
В одном из вариантов осуществления изобретения подобные методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявления симптомов заболевания, связанных с пролиферацией клеток. В другом варианте осуществления изобретения подобные методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявления симптомов рака. Еще в одном варианте осуществления изобретения подобные методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявления симптомов рака шейки матки, рака матки, рака молочной железы или рака легких. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подобные методы, являющиеся предметом изобретения,
- 7 011504 относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявления симптомов рака яичника.
В одном из вариантов осуществления изобретения подобных методов, являющихся предметом изобретения, назначаемое для приема антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, представляет собой моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, связывающего антиген. В другом варианте осуществления изобретения методов, являющихся предметом изобретения, антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, назначается для приема в концентрации примерно от 5 мкг/кг до 10 мг/кг, в более предпочтительной концентрации от 20 мкг/кг до 5 мг/кг либо в наиболее предпочтительной концентрации примерно от 100 мкг/кг до 5 мг/кг.
Еще в одном варианте осуществления изобретения подобных методов, являющихся предметом изобретения, данные методы используются как часть комплексной терапии при лечении рака. Подобная комплексная терапия при лечении рака может включать в себя, например, прием химиотерапевтических препаратов, таких как паклитаксель или цисплатин. Подобная комплексная терапия при лечении рака может при необходимости включать и лучевую терапию, отнюдь не ограничиваясь только данным видом лечения.
Еще одной стороной настоящего изобретения является метод содействия выявлению антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, которое избирательно связывает СА 125/0772Р в сравнении с СА 125/0772Р в культуральной жидкости. В одном из вариантов осуществления изобретения метод содействия выявлению антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, которое избирательно связывает СА 125/0772Р, заключается в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р (например, клеточный полипептид СА 125/0772Р либо даже полипептид СА 125/0772Р полной длины) в присутствии культивируемого СА 125/0772Р (предпочтительно в избыточных количествах (соотношение вес/вес) культуры) при условиях, разрешающих связывание антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, либо с упомянутым выше пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р, либо с культивируемым СА 125/0772Р. После выдержки культивируемый СА 125/0772Р (независимо от наличия или отсутствия связи с антителом или фрагментом антитела, связывающего антиген) и несвязанное антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, удаляются и измеряется сила связи антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, полученные в результате применения данного метода, удовлетворяют одному из трех перечисленных выше вариантов избирательного связывания, это означает, что упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающего антиген, избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение культивируемого СА 125/0772Р и клеточного СА 125/0772Р в реагирующей смеси составляет примерно 25:1 (по весу). Разновидностью данного метода является иммобилизация клеточного СА 125/0772Р на твердой поверхности, например при выполнении анализа методом ЕЬ18А.
Еще в одном варианте осуществления изобретения описан метод содействия выявлению антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, которое избирательно связывает СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р. Этот метод, заключается в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающего антиген, с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р и культивируемый СА 125/0772Р (предпочтительно в избыточных количествах (соотношение вес/вес) культуры), например при соотношении по весу примерно 25:1, при условиях, разрешающих связывание пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, с антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, удаление несвязанного пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, измерение количество пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, которое было связано антителом или фрагментом антитела, связывающими антигены, и сравнение значения, полученного при измерениях, с количеством пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, которое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, при отсутствии данного (т.е. меньшего) количества культивируемого СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, полученные в результате данного метода, удовлетворяют одному из трех перечисленных выше вариантов избирательного связывания, это означает, что упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Разновидностью данного метода является иммобилизация антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, на твердой поверхности, например при выполнении анализа методом ЕЫ8Л.
Еще в одном варианте осуществления изобретения описан метод содействия выявлению антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которое избирательно связывает СА 125/0772Р. Этот метод заключается в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, с клеткой, которая в явном виде содержит СА 125/0772Р, и в присутствии культивируемого СА 125/0772Р в количестве, например, не менее приблизительно 0,05 мг/мл (предпочтительно в присутствии избыточного количества (по весу) культуральной жидкости), при условиях, разрешающих связывание СА 125/0772Р, с антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, удаление несвязанных
- 8 011504 клеток, измерение количества клеток с явно выраженным СА 125/0772Р, связанным антителом или фрагментом антитела, связывающими антигены, и сравнение значения, полученного при измерениях, с количеством клеток с явно выраженным СА 125/0772Р, которое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, связывает при отсутствии данного (т.е. меньшего) количества культивируемого СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, полученные в результате данного метода, удовлетворяют одному из трех перечисленных выше вариантов избирательного связывания, это означает, что упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Данный метод может, например, применяться при выполнении измерений методом проточного цитометрического анализа, в том числе с применением ЕАС8 (активируемого флюоресценцией анализатора клеток).
Кроме перечисленных выше сведений, настоящее изобретение содержит описание методов диагностики заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, а также предрасположенности к упомянутым заболеваниям.
3.1. Терминология.
В настоящем документе термин аналог с точки зрения антитела или фрагмента антитела, связывающие антиген, либо синтетического полипептида, являющихся предметом изобретения, означает антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, или синтетический полипептид, модифицированные относительно соответствующего антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, или синтетического полипептида (называемыми в данном документе предварительно модифицированными антителами, фрагментами антител, связывающих антиген, или синтетическими полипептидами) до появления модификации в аналоге, которые продолжают избирательно связывать клеточные СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р.
Сходство (Кд) антитела или фрагмента антитела, являющегося предметом изобретения, определяется по результатам анализа сходства, описываемого в разделе 6.4.
Термин антитело, являющееся предметом изобретения, используемый в настоящем документе, обозначает антитело, избирательно связывающее клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р.
Аналогично, термин фрагмент антитела, связывающего антиген, являющийся предметом изобретения, используемый в настоящем документе, обозначает фрагмент антитела, связывающего антиген, избирательно связывающий клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, рассматриваются как антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, даже в том случае, если они связывают полипептид СА 125/0772Р, т.е. полипептид СА 125/0772Р до помещения его в культуральную жидкость, при условии, что подобное антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, тем не менее, будут избирательно связывать клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Поскольку, как показано ниже, клеточный СА 125/0772Р до его культивирования является частью полипептида СА 125/0772Р до помещения его в культуральную жидкость, следует отметить, что антитела, избирательно связывающие клеточный СА 125/0772Р, могут также связывать и СА 125/0772Р до культивирования. Таким образом, независимо от того, будет или не будет антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, связывать СА 125/0772Р, данное антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, будут считаться предметом изобретения до тех пор, пока они удовлетворяют определяемому в настоящем документе ниже критерию избирательного связывания полипептида СА 125/0772Р в сравнении с СА 125/0772Р. Далее следует отметить, что, если не указано иное, термины антитело и иммуноглобулин являются взаимозаменяющими.
Термин анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (анализ ЛОСС). используемый в данном документе, относится к анализу АЭСС, описанному в разделе 6.5. По существу, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются промежуточным звеном при лизисе СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АПСС, являются тем же самым антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, что и признанные положительными при выполнении анализа АЭСС, описанного в разделе 6.5.
Термин примерно, используемый в данном документе, если не указано иное, относится к значению, которое не более чем на 10% отклоняется в ту или иную сторону от значения, около которого указан данный термин. При изменении значения, указывающего длину последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, результирующее измененное значение будет представлять собой целое число, которое не более чем на 10% выше или ниже первоначального значения длины. Далее, в тех случаях, когда изменение длины на 10% в соответствии с данным условием приводит к значению, которое должно быть меньше 1, очевидно, что модифицированная длина приблизительно равна 1 остатку нуклеотида или аминокислоты, а не исходному значению, что и используется в настоящем документе.
Термин связывается с, используемый в настоящем документе, в контексте связывания антитела и антигена, например антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р, относится к антителам или фрагментам антител, связывающим анти
- 9 011504 ген, для определенного антигена (например, клеточного СА 125/0772Р) и не осуществляет специфического связывания с прочими антигенами. Предпочтительно антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, должны связывать СА 125/0772Р со специфичностью не ниже 5 ΘΌ/мкг антитела (данный показатель определяется при анализе специфичности методом ЕЬ18А) либо быть отнесены к положительным результатам анализа специфичности методом проточной цитометрии. Пептид или полипептид, связывающий антиген, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низким сходством, что определяется в результате проведения иммунологического анализа, анализа методом В1Асоге или 8са1сйагб или анализа другими современными методами.
Антитела или их фрагменты, специфически связывающиеся с антигеном, могут обладать перекрестной реактивностью по отношению к соответствующим антигенам.
Предпочтительно, чтобы антитела или фрагменты, связывающиеся с антигеном, не вступали в перекрестные реакции с другими антигенами. Обсуждение вопросов, касающихся специфичности антител, приводится, например, в работе Фундаментальная иммунология, 2-е изд., Раи1, еб.. Расеп Ргезз (1989), с. 332-336. Предпочтительно, чтобы антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, связывали бы пептид, изображенный на фиг. 1, с Кб, не превышающим примерно 100 нМ, и, что более предпочтительно, связывали бы пептид, изображенный на фиг. 1, с Кб, не превышающим примерно 5 нМ; все эти значения измеряются методом анализа сходства В1Асоге, который описан в разделе 6.4. Отмечено, что антитело, избирательно связывающее клеточный СА 125/0772Р, может также представлять собой антитело, избирательно связывающее СА 125/0772Р, в том числе СА 125/0772Р в культуральной жидкости, в сравнении с другими антигенами, не относящимися к СА 125/0772Р. Наконец, следует отметить, что, если не указано иное, термины антитело и иммуноглобулин являются взаимозаменяющими.
Анализ специфичности методом ЕЬ18А.
Данный метод анализа в настоящем документе означает метод анализа ЕЫ8А, описываемый в разделе 6.2. Антитело (или фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным (т.е. специфическим для СА 125/0772Р) при проведении анализа данным методом, если он демонстрирует поглощение не менее 5-30 ΘΌ/мкг антитела.
Анализ специфичности методом проточной цитометрии.
Данный метод анализа в настоящем документе означает анализ методом проточной цитометрии, описываемый в разделе 6.2. Антитела (или фрагменты антитела, связывающие антиген) считаются положительными (т.е. специфическими для СА 125/0772Р), если при проведении анализа методом проточной цитометрии они демонстрируют результат в пределах следующих диапазонов клеток: не менее 5% положительных клеток ΝΙΗ/3Τ3 и не менее 60% положительных клеток ΝΙΗ/3Τ3, производящих последовательность № 2 полипептида, и/или не менее 25% положительных клеток 8К-ОУ3 и не менее 80% положительных клеток ОУСАК-3.
Термины конкурирует при связывании и конкурирует с в данном документе применительно к двум видам антител или фрагментов антител, связывающих антигены, (или их комбинаций) являются взаимозаменяемыми. Первое из антител или фрагментов антител, связывающих антигены, считается конкурирующим со вторым антителом или фрагментом антитела, связывающими антигены, если первое антитело или фрагмент антитела конкурируют со вторым при проведении анализа перекрестной конкуренции методом ЕЬ18А и/или методом РАС8.
Анализ перекрестной конкуренции методом ЕЬ18А.
Данный вид анализа, упоминаемого в настоящем документе, относится к анализу методом ЕЬ18А, который описывается в раздел 7. Антитело или фрагмент антитела, связывающие антигены, считаются конкурирующими при связывании при проведении анализа данным методом, если концентрация 1С50 антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которое выступает в роли конкурента, превышает концентрацию антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, не более чем примерно в 100 раз.
Анализ перекрестной конкуренции методом ЕЬ18А.
Данный вид анализа, упоминаемого в настоящем документе, относится к анализу методом ЕЬ18А, который описывается в раздел 7. Антитело или фрагмент антитела, связывающие антигены, считаются конкурирующими при связывании при проведении анализа данным методом, если концентрация 1С50 антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которое выступает в роли конкурента, превышает концентрацию антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, не более чем примерно в 100 раз.
Термин СА 125/0772Р или полипептид СА 125/0772Р, используемый в настоящем документе, относится к трансмембранному полипептиду СА 125/0772Р до культивации, который, будучи культивированным, производит культивированный полипептид СА 125/0772Р и клеточный полипептид СА 125/0772Р. В последнее время были получены факты, доказывающие, что аминокислотная последовательность, называемая в литературе последовательностью полипептида СА 125/0772Р полной длины, не является в действительности отражением последовательности СА 125/0772Р полной длины. В частности, см., например, \¥О 02/06317 (РСТ/И801/22635) и И8 2003/0124140, в которых описывается полипептид, обозначаемый как 0772Р. Последовательность аминокислот 0772Р имеет продолжение, которое
- 10 011504 ранее считалось СА 125 полной длины. Поскольку полипептид называется в документах СА 125 или 0772Р, в настоящем документе он обозначается как СА 125/0772Р.
Термин заболевание, связанное с СА 125/0772Р, используемый в настоящем документе, обозначает заболевание, которое подразумевает или характеризуется отличающимся уровнем клеточного СА 125/0772Р в сравнении с нормальным состоянием и/или избытком культивированного СА 125/0772Р в сравнении с соответствующим нормальным состоянием. Например, в случае рака яичника наблюдается повышенный уровень клеточного или культивированного СА 125/0772Р по сравнению с уровнем, наблюдаемым в нормальном (неканцерогенном) состоянии. Различный уровень клеточного и/или культивированного СА 125/0772Р может являться причиной или свидетельством заболевания.
Термин клеточный СА 125/0772Р в настоящем документе обозначает вид внеклеточного полипептида СА 125/0772Р, который сохраняется в клеточной форме только временно, например перед закручиванием, после высвобождения части СА 125/0772Р до культивирования в качестве культивированного СА 125/0772Р. Например, клеточный вид СА 125/0772Р представляет собой вид внеклеточного полипептида СА 125/0772Р, который сохраняется в клеточной форме на поверхности клеток клеточной линии ОУСАК-3 (НТВ-161; АТСС®) или клеток выпота человека после удаления части полипептида СА 125/0772Р в качестве культивированного СА 125/0772Р. Вид клеточного полипептида СА 125/0772Р присутствует в остатках аминокислот с 1 по 708 последовательности № 1 и в остатках аминокислот с 1 по 711 последовательности № 2. Кроме того, СА 125/0772Р можно расщепить на участок гидролиза протеазы, расположенный в аминокислотных остатках 659-665 последовательности № 2. См. О'Брайан и др., Биология новообразований. 23(3):154-169 (2002). Сам по себе указанный участок клеточного полипептида СА 125/0772Р может содержать остатки аминокислот 659-711 последовательности № 2.
Термин анализ комплементзависимой цитотоксичности (анализ СЭС), используемый в настоящем документе, обозначает анализ СЭС, описываемый в разделе 6.5. Само по себе антитело или фрагмент антитела, содержащего антиген, который играет промежуточную роль при лизисе опухолевых клеток при анализе методом СЭС, считается положительным при анализе методом СЭС, описываемым в разделе 6.5.
В настоящем документе термины заболевание и болезнь являются взаимозаменяющими и описывают состояние пациента.
В настоящем документе термин фрагмент в выражении фрагмент антитела, связывающего антиген обозначает пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность длиной не менее приблизительно 5, не менее приблизительно 10, не менее приблизительно 15, не менее приблизительно 20, не менее приблизительно 25, не менее приблизительно 40, не менее приблизительно 50, не менее приблизительно 60, не менее приблизительно 70, не менее приблизительно 80, не менее приблизительно 90, не менее приблизительно 100, не менее приблизительно 110 или не менее приблизительно 120 смежных остатков аминокислотной последовательности другого полипептида, например антитела, избирательно связывающего клеточный СА 125/0772Р.
Термин клетка-хозяин в настоящем документе обозначает отдельную клетку, в том числе клетку молочной железы, или другие эукариотные или прокариотные клетки, например клетки, видоизмененные или трансфицированные молекулой нуклеиновой кислоты либо инфицированные вирусами, фагемидом или бактериофагом, а также потомство или потенциальное потомство данных клеток. Потомство подобной клетки не будет идентично родительской клетке, трансфицированной нуклеиновой кислотой вследствие мутаций либо влияния окружающей среды или дополнительных манипуляций с рекомбинантным геном, которые могут произойти в последующих поколениях, а также встраивания молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.
В настоящем документе термин гибридизация при жестких условиях относится к условиям гибридизации и промывания, при которых последовательности нуклеотидов, идентичные друг другу не менее чем на 75%, обычно остаются гибридизированными до комплемента друг друга. Подобные жесткие условия известны специалистам. Их можно найти в Текущих протоколах по молекулярной биологии, авторы Аусубель и др., еЙ8., 1о1т ^Иеу&8оп8 (1989-2002), разделы 6.3.1-6.3.6. В одном из примеров, не являющемся исчерпывающим, жесткие условия гибридизации включают в себя гибридизацию в хлориде натрия/цитрате натрия 6Х (88С) при температуре примерно 45°С, после которой выполняется несколько промывок в 0,1Х88С, 0,2% 8Ό8 при температуре примерно 68°С. В предпочтительном примере, не являющемся исчерпывающим, жесткие условия гибридизации включают в себя гибридизацию в хлориде натрия/цитрате натрия 6Х88С при температуре примерно 45°С, после которой выполняется несколько промывок в 0,1Х88С, 0,1% 8Ό8 при температуре 50-65°С (т.е. одна или несколько промывок при температуре 50, 55, 60 или 65°С). Очевидно, что в отдельных случаях нуклеиновые кислоты, являющиеся предметом изобретения, не включают в себя молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются при данных условиях, образуя последовательность нуклеотидов, состоящую только из нуклеотидов А или Т.
- 11 011504
Термин изолированный, встречающийся в данном документе по отношению к пептиду, полипептиду, синтетическому белку, антителу или фрагменту антитела, связывающих антиген, обозначает пептид, полипептид, синтетический белок, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, практически свободный от клеточного материала или содержащий белки из клетки или участка ткани, из которого они получены или происходят, либо практически свободный от химических предшественников или других химических веществ в том случае, если белок синтезируется химически. Выражение практически свободный от клеточного материала или инфицирующих белков относится к препаратам пептидов, полипептидов, синтетических белков, антител или фрагментов антител, связывающих антиген, в которых пептид, полипептид, синтетический белок, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, отделены от клеточных компонентов клетки, от которой они изолированы или получены рекомбинантно. Таким образом, пептид, полипептид, синтетический белок, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, практически свободные от клеточного материала или инфицирующего белка, содержат препараты пептида, полипептида, синтетического белка, антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, содержание в которых другого белка не превышает примерно 30, примерно 20, примерно 10 или примерно 5% (по сухому весу).
Когда пептид, полипептид, синтетический белок, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, производятся рекомбинантно, они также избирательно практически свободны от культуральной среды, т.е. объем культуральной среды не превышает примерно 20, примерно 10 или примерно 5% объема белкового препарата. В том случае, когда пептид, полипептид, синтетический белок, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, производятся методом химического синтеза, они избирательно практически свободны от химических предшественников или других химических веществ, т.е. они отделены от химических предшественников или других химических веществ, участвующих в синтезе пептида, полипептида, синтетического белка, антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген. Соответственно, содержание в подобных препаратах пептида, полипептида, синтетического белка, антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, химических предшественников или соединений, отличных от пептидов, полипептидов, синтетического белка, антител или фрагментов антител, связывающих антиген, не превышает примерно 30, примерно 20, примерно 10, примерно 5% (по сухому весу).
Термин изолированный, встречающийся в данном документе по отношению к молекулам нуклеиновых кислот, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в естественном клеточном источнике молекул нуклеиновой кислоты. Кроме того, изолированная молекула нуклеиновой кислоты, например молекула сДНК, может практически не содержать другого клеточного материала, или культуральной среды, если она получена рекомбинантным методом, либо практически не содержать химических предшественников в случае химического синтеза.
Термины контролировать, контролируемый и контроль в данном документе относятся к положительным результатам, которые связаны с действующим веществом, например антителом, фрагментом антитела, связывающего антиген, синтетическим полипептидом или аналогом предмета изобретения, которые не приводят к излечению заболевания. В отдельных случаях течение заболевания регулируется одним или несколькими действующими веществами, которые позволяют контролировать течение заболевания, предотвращая или замедляя прогрессирование заболевания или ухудшение состояния.
Термин моноклональное тело, используемый в настоящем документе, относится к антителу, полученному из одного клеточного клона, в том числе любого эукариотического, прокариотического клона или клона бактериофага, независимо от методов, которым данное антитело получено. Таким образом, название моноклональное антитело относится к соединению, содержащему популяцию антител, каждое из которых связано с единым эпитопом, при этом упомянутое соединение испытывает недостаток антител, связывающихся с эпитопом, отличным от единого эпитопа, с которым связывается популяция антител. Естественно, отмечено, что в некоторых случаях единый эпитоп присутствует в полипептиде на многих участках. В подобных случаях, несмотря на то, что моноклональное тело может быть связано с несколькими участками, оно, тем не менее, считается связанным с единым эпитопом.
Термины нуклеиновые кислоты и последовательности нуклеотидов, используемые в настоящем документе, относятся к молекулам ДНК (например, сДНК или геномной ДНК), молекулам РНК (например, тРНК), комбинациям молекул ДНК и РНК или гибридным молекулам ДНК/РНК, а также к аналогам молекул ДНК или РНК. Подобные аналоги получают, используя, например, аналоги нуклеотидов, включая, не ограничиваясь ими, ионизиновые или трифенилметильные основания. Подобные аналоги могут также содержать молекулы ДНК или РНК с измененными основаниями, которые передают молекулам полезные свойства, например стойкость нуклеазы или повышенную способность поперечным клеточным мембранам. Нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеотидов могут быть однонитевыми, двунитевыми, могут содержать как однонитевые, так и двунитевые участки, а также могут содержать трехнитевые участки, однако в большинстве случаев представляют собой двунитевые ДНК.
- 12 011504
Термин рабочая связь в данном документе по отношению к синтетическому полипептиду обозначает любое ковалентное или нековалентное взаимодействие, соединяющее антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, с гетерологичным агентом. Рабочая связь может быть прямой или косвенной.
Например, между антителом (или фрагментом антитела, связывающего антиген) и гетерологичным агентом может присутствовать аминокислотная последовательность.
В настоящем документе антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид или аналог, который избирательно связывает клеточный СА 125/0772Р, избирательно связывает клеточный полипептид СА 125/0772Р, избирательно связывает клеточный СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р или избирательно связывает полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р, обозначает антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, который признан положительным при проведении сравнительного анализа методом ЕЫ8А или сравнительного анализа методом потоковой цитометрии, как описано в настоящем документе. Предпочтительно антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, должны признаваться положительными как при проведении сравнительного анализа методом ЕЫ8А, так и при проведении сравнительного анализа методом потоковой цитометрии, как описано в настоящем документе.
Сравнительный анализ методом ЕЫ8А.
Данный метод анализа, упоминаемый в настоящем документе, обозначает анализ методом ЕЫ8А, описанный в разделе 6.3. Антитело (или фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным при проведении анализа данным методом (т.е. избирательно связывающим клеточный СА 125/0772Р), если оно демонстрирует не более чем примерно 25% ингибирование связывания при 25-кратном превышении по весу культивированного СА 125/0772Р по сравнению с пептидом, показанным на фиг. 1 (последовательность № 1).
Сравнительный анализ методом потоковой цитометрии.
Данный метод анализа, упоминаемый в настоящем документе, обозначает анализ методом потоковой цитометрии, описанный в разделе 6.3 ниже. Антитело (или фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным (т.е. избирательно связывающим клеточный СА 125/0772Р), если оно демонстрирует 1С50, измеренную в процент-положительных клетках, не ниже 0,05 мг на 1 мл культивированного СА 125/0772Р, т.е. если для уменьшения наполовину числа процент-положительных клеток при сравнительном анализе потоковой цитометрии требуется не менее 0,05 мг/мл культивируемого СА 125/0772Р.
В настоящем документе термины предотвращать, предотвращение и предотвращающий относятся к предотвращению рецидивов или появления заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или проявлению одного или нескольких симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, у пациента.
В настоящем документе термин протокол обозначает дозирование и режимы приема лекарств. Протоколы в данном документе описывают способы применения и бывают профилактическими и терапевтическими.
В настоящем документе термин культивируемый полипептид СА 125/0772Р обозначает внеклеточный полипептид СА 125/0772Р, который выделен и отделен из полипептидов СА 125/0772Р, выраженных на поверхности клеток, выражающих СА 125/0772Р, и при этом оставляет на некоторое время клеточные виды СА 125/0772Р на поверхности клетки. В настоящем документе данный термин обозначает виды культивируемого СА 125/0772Р, обнаруженные в серозной жидкости человека, и/или культуру клеточной линии супернатанта ОУСАК.-3 (НТВ-161, АТСС). Подобные культивируемые полипептиды СА 125/0772Р можно получить посредством протокола, описанного де лос Фрайлесом и др., Биология новообразований, 14(1): 18-29 (1993), используя перитонеальный выпот или супернатант ОУСАК.-3 человека. Кроме того, культивируемые полипептиды СА 125/0772Р производятся и промышленностью, такими компаниями, как Бй/дегаН 1пби51пс5 1и1егиа1юиа1 (Конкорд, Массачусетс), Бепррк БаЬога1опе5 (Ла Джолла, Калифорния) или ИиДеб 81а1е8 Вюс11е11йса1 Согр (Кливленд, Огайо).
В данном документе термины объект и пациент являются взаимозаменяющими. В настоящем документе термины объект или объекты обозначают животное, предпочтительно млекопитающее, как не являющееся приматом (например, коровы, свиньи, лошади, ослы, козы, верблюды, кошки, собаки, морские свинки, крысы, мыши, овцы), так и приматы (например, обезьяны, такие как павианы, гориллы, шимпанзе, а также человек). В некоторых случаях под объектом подразумевают пациента, страдающего раковым заболеванием, например раком яичника.
В данном документе термины лечение и лечить обозначают уменьшение интенсивности проявления заболевания, связанного с СА 125/0772Р, если подобное уменьшение вызвано воздействием одного или нескольких антител, фрагментов антител, связывающих антиген, синтетических полипептидов или аналогов.
Термин фармацевтически пригодный в данном документе означает состав, например переносчик, наполнитель или соль, разрешенный к применению Федеральным правительством или администрацией штата либо внесенный в Фармакопею США или в другую официально признанную фармакопею для применения на животных, а также на людях.
- 13 011504
4. Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Изображена аминокислотная последовательность СА 125/0772Р, 3 повторения (последовательность № 1).
Выделенные курсивом остатки, начиная с аминокислоты 14 и до аминокислоты 452, представляют собой повторяющиеся участки. Каждое из трех повторений в пределах повторяющегося участка 14-452 выделено подчеркиванием и стрелками. Неподчеркнутые остатки представляют собой трансмембранный проксимальный неповторяющийся участок.
Последовательность, идущая после неподчеркнутых остатков, не является частью СА 125/0772Р и включает в себя карбоксильную-Мус-Ηίδ метку.
Фиг. 2. Изображена аминокислотная последовательность СА 125/0772Р, 3 повторения ТМ (последовательность № 2).
Выделенные курсивом и неподчеркнутые остатки, начиная с аминокислоты 14 и до аминокислоты 452, представляют собой повторяющиеся участки. Каждое из трех повторений в пределах повторяющегося участка 14-452, выделено вертикальными линиями и стрелками. Неподчеркнутые остатки, начиная с аминокислоты 453 и до аминокислоты 711, представляют собой трансмембранный проксимальный неповторяющийся участок. Выделенные курсивом и неподчеркнутые остатки, начиная с аминокислоты 712 и до аминокислоты 738, представляют собой трансмембранный домен. Остатки, выделенные жирным шрифтом, начиная с аминокислоты 739 и до аминокислоты 769, представляют собой эндоплазматический участок. Последовательность, идущая после неподчеркнутых остатков, не является частью СА 125/0772Р и включает в себя карбоксильную-Мус-Нщ метку.
Фиг. 3. Изображен типовой график зависимости концентраций культивируемого СА 125/0771Р, полученных при сравнительном анализе методом РЛС8, с процентом положительных клеток для антитела 117.1 (в данном случае) и контроля антитела М11 (прямоугольники).
Как видно из фиг. 3, М11 может конкурировать при связывании с клетками ОУСАЯ-3 даже при низких концентрациях культивируемого СА 125/0772Р (1С50=0,003 мг/мл), тогда как 117.1 не будет конкурировать даже при высоких концентрациях культивируемого СА 125/0772Р (1С50 более 1 мг/мл).
Фиг. 4. Изображен типовой график зависимости процента лизиса от концентрации антитела 117.1 (усредненные данные по анализам для 4 отдельных доноров), построенный по результатам анализа методом АЭСС.
Как показано на фиг. 4, антитело 117.1 выполняет роль промежуточного звена при специфическом лизисе клеток ОУСАЯ-3 в зависимости от дозы.
Фиг. 5 А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 35), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 117.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 5В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 36), которая отражает участок тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 117.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 5С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 27) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 117.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СОЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 5Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 28) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 117.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СОЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 6А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 37), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 368.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 6В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 38), которая отражает участок тяжелой цепи переменной 368.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 6С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 29) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 368.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СОЯ
- 14 011504 выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 6Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 30) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 368.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 7А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 39), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклинального антитела 501.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 7В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 40), которая отражает участок тяжелой цепи переменной 501.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 7С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 31) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 501.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 7Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 32) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 501.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 8А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 41), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 776.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 8В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 42), которая отражает участок тяжелой цепи переменной 776.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 8С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 33) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 776.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 8Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 34) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 776.1. Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 9А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 52), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 725.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 9В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 57), которая отражает участок тяжелой цепи переменной 725.1.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СИЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 9С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 54) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 725.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 9Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 53) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 725.1.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, последовательности СИЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 10А. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 59), которая отражает участок легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 16Н9.
- 15 011504
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 10В. Изображена последовательность нуклеотидов (последовательность № 58), которая отражает участок тяжелой цепи переменной 16Н9.
Последовательность нуклеотидов, соответствующая лидирующей последовательности, выделена двойным подчеркиванием, а последовательности нуклеотидов, отражающие последовательности СОЯ, выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 10С. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 56) участка легкой цепи переменной длины моноклонального антитела 16Н9.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СОЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 10Ό. Изображена аминокислотная последовательность (последовательность № 55) участка тяжелой цепи переменной длины моноклонального антитела 16Н9.
Лидирующая последовательность выделена двойным подчеркиванием, а последовательности СОЯ выделены подчеркиванием одной чертой.
Фиг. 11. Изображены результаты вестерн-блот-анализа супернатантов ОУСАЯ-3.
Концентрация и обнаружение антител указаны в рабочем примере, представленном ниже, в разделе 6.7. 3 Яр! Ρΐη (3 повторяющихся образца) в каждом блоте относятся к полосам, содержащим 3 повторяющихся рекомбинантных полипептида 0772Р; остаток полос в каждом блоте содержит выделенный ОУСАЯ-3 или контрольную среду. В нижней части каждого блока указывается конкретное испытываемое антитело (например, антитела М11, ОС125, 776.1 и 368.1). Слева от фигуры указываются отметки молекулярной массы.
Фиг. 12. Оценка 1311-помеченого 776.1 ίη νίνο.
Мыши с ЫСЯ пи/пи, являющиеся носителями опухолевых клеток ОУСАЯ-3, получали физиологический раствор, 100 мкС1 [131Ι]776.1 1§61, 300 мкС1 [131Ι]776.1 1дС1 или 17 нг немеченого 776.1 1дС1 (количество белка то же, что и в группе 300 мкС1 [131Ι]776.1 ΙβΟ1). Лечение заключалось в однократном внутривенном введении дозы в день 0. Специфическая активность [131Ι]776.1 составила 15 МС1/мг при иммунореактивности, равной 51% после мечения. Результаты представлены в виде среднего объема опухоли +Α8Ό для группы из 10 мышей. Средний размер опухоли в начале лечения составлял 199 мм3 для всех групп.
5. Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано, в частности, на том факте, что события, которые приводят к образованию культивируемого СА 125/0772Р, также оставляют часть внеклеточного участка аминокислотной последовательности СА 125/0772Р в клеточной форме, т.е. также приводят к образованию клеточного СА 125/0772Р. Изобретение, описываемое подробно в данном документе, основано, в частности, на предположении о том, что можно получить антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, избирательно связывающие клеточные СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми СА 125/0772Р, и что данные антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, синтетические полипептиды и аналоги можно использовать, например, для предотвращения возникновения, контроля, лечения и снижения интенсивности заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, либо одного или нескольких симптомов подобных заболеваний, например связанных с пролиферацией клеток, таких как рак (например, рак яичника).
Как обсуждается на протяжении всего документа, антитела и фрагменты антител, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р. Аналогичным образом синтетические полипептиды и аналоги изобретения также избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р. Как уже отмечалось в данном документе, благодаря тому факту, что клеточный СА 125/0772Р еще до культивирования СА 125/0772Р присутствует как часть СА 125/0772Р до культивирования, было замечено, что антитела, фрагменты антител, связывающие антигены, синтетические полипептиды и аналоги изобретения могут также связывать и СА 125/0772Р до культивирования. Таким образом, хотя и нежелательно быть связанным каким-либо конкретным механизмом или теорией, вытекающими из указанного факта, следует все же отметить, что методы, описываемые в данном разделе, могут быть применены при связывании применяемых для лечения антител, фрагментов антител, связывающих антигены, синтетических полипептидов и аналогов с СА 125/0772Р до культивирования дополнительно или вместо их связывания с клеточным СА 125/0772Р.
5.1. Антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, являющиеся предметом изобретения.
Во-первых, настоящее изобретение описывает изолированное антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые избирательно связывают клеточные полипептиды СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми полипептидами СА 125/0772Р. Подобные антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, являющиеся предметом изобретения, используются для ряда терапевтических, профилактических, диагностических целей, а также целей выделения, описываемых в настоящем документе.
- 16 011504
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, связывают последовательность № 1 или последовательность № 2 и избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р. В одном из конкретных вариантов осуществления данного изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, связывают неповторяющийся участок, указанный в последовательности № 1 или в последовательности № 2. Еще в одном из вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения, связывают повторяющийся участок, указанный в последовательности № 1 или в последовательности № 2.
В первом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, показывают при проведении сравнительных испытаний методом ЕЬ18А (иммуноферментного твердофазного анализа) менее приблизительно 25%, менее приблизительно 20%, менее приблизительно 15%, менее приблизительно 10% или менее приблизительно 5% ингибирования связывания с пептидом, изображенным на фиг. 1 (последовательность № 1), в присутствии 25-кратного (по весу) превышения культивируемого СА 125/0772Р в сравнении с пептидом, показанным на фиг. 1 (последовательность № 1).
Во втором варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, показывают при проведении сравнительных испытаний методом проточного цитометрического анализа 1С50 (подсчет процентного количества положительных клеток) не менее 0,05 мг/мл, не менее 0,25 мг/мл, не менее 0,5 мг/мл, не менее 0,75 мг/мл или не менее 1,0 мг/мл культивированного СА 125/0772Р.
В третьем варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, связывают пептид, изображенный на фиг. 1, но не осуществляют очевидного связывания культивированного полипептида СА 125/0772Р. Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, удовлетворяющие одному из трех перечисленных вариантов осуществления изобретения, представляют собой антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые будут избирательно связывать клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р.
Среди антител и фрагментов антител, связывающих антигены, являющиеся предметом изобретения, имеются антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые связывают пептид, изображенный на фиг. 1 (последовательность № 1) с Кд не более примерно 100 нМ, не более примерно 10 нМ, не более примерно 1 нМ, не более примерно 100 пМ или не более примерно 10 пМ; данная величина измеряется методом анализа сходства В1Асоге, который описывается ниже, в разделе 6.4 настоящего документа.
К предпочтительным вариантам антител или фрагментов антител, связывающих антигены, являющихся предметом изобретения, относятся антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые являются промежуточным звеном лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при зависящем от антител анализе клеточной цитотоксичности (АЭСС').
К подобным антителам или фрагментам антител, связывающим антигены, относятся антитела или их фрагменты служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10%, не менее чем примерно при 20%, не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно при 40% или не менее чем примерно при 50% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АОСС при соотношении эффектор: мишень, равном 50:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающие антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10%, не менее чем примерно при 20%, не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно при 40% или не менее чем примерно при 50% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АОСС при соотношении эффектор: объект, равном 25:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающие антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10%, не менее чем примерно при 20%, не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно при 40% или не менее чем примерно при 50% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АОСС при соотношении эффектор: мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающие антигены, 5 мкг/мл);
служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10%, не менее чем примерно при 20%, не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно при 40% или не менее чем примерно при 50% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АОСС при соотношении эффектор: мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающие антигены, 0,5 мкг/мл); либо служащие промежуточным звеном не менее чем примерно при 10%, не менее чем примерно при 20%, не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно при 40% или не менее чем примерно при 50% лизиса СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе АОСС при соотношении эф
- 17 011504 фектор: мишень, равном 12,5:1 (концентрация антитела или фрагментов антитела, связывающие антигены, 5 нг на мл).
К предпочтительным вариантам осуществления изобретения относятся также антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые служат промежуточным звеном лизиса СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток при анализе комплементзависящей цитотоксичности (СЭС). К подобным антителам и фрагментам антител, связывающим антигены, относятся, например, те антитела и фрагменты, которые служат промежуточным звеном лизиса в интервале примерно от 15% лизиса при концентрации антител или фрагментов антител 5 мкг/мл и примерно до 95% лизиса при концентрации антител или фрагментов антител 0,1 мкг/мл.
К предпочтительным вариантам осуществления изобретения относятся также антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые ингибируют опухолевый рост СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток. Например, к подобным антителам или фрагментам антител, связывающим антигены, относятся антитела и фрагменты антител, которые избирательно ингибируют рост СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток экспериментальных моделей на животных, например, описанных в работах Трескса и др., Еиг. 1. Сапсег. 30А(2): 183-187 (1994); Ахмада и др., Опсо1. Кек. 11(6):273-280 (1999); а также Киевита и др., Ιηΐ. 1. ΚαάίαΙ. Опсо1. Бю1. Рйук. 38(2):419-428 (1997), а также экспериментальных моделей животных для исследования опухолевых клеток ксенотрансплантата ОУСАК-3, которые описаны в разделе 6.8.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, являющееся предметом изобретения, представляет собой моноклональное антитело, вырабатываемое гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), либо гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), либо гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), либо гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), либо гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), либо гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), либо гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), либо гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), либо гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), либо гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), либо гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), либо гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), либо гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), либо гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), либо гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), либо гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), либо гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), либо гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), либо гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), либо гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), либо гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), либо гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), либо гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124), либо гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
В другом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, представляют собой антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которое конкурирует с моноклональным антителом, вырабатываемым гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), либо гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), либо гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), либо гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), либо гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), либо гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), либо гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), либо гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), либо гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), либо гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), либо гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), либо гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), либо гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), либо гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), либо гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), либо гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), либо гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), либо гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), либо гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), либо гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), либо гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), либо гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), либо гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124), либо гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570) для связи с клеточными СА 125/0772Р.
Антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, считаются конкурирующими при связывании, если они конкурируют при связывании при проведении анализа методом перекрестной конкуренции ЕЫ8А и/или методом перекрестной конкуренции с использованием РАС8 (активируемого флюоресценцией анализатора клеток). Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, считаются конкурирующими при связывании при анализе методом перекрестной конкуренции ЕЫ8А и/или методом перекрестной конкуренции с использованием РАС8, если концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмента антитела, связывающие антиген, не превышает
- 18 011504 примерно 100-кратной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, не превышает примерно 10-кратной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация 1С50 конкурирующего антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, не превышает примерно эквимолярной концентрации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген.
В другом варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 27 (117.1 Ь).
Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 28 (117.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 27 (117.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 28 (117.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1Ь)
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 31 (501.1Ь).
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 32 (501.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 31 (501.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 32 (501.1Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1Ь).
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 34 (776.1Н).
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 34 (776.1 Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 725.1 полипептидов переменной длины (725.1Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54.
- 19 011504
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 725.1 полипептидов переменной длины (776.1Н), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 53.
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54, и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 53.
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи 16Н9 полипептидов переменной длины (16Н9Ь), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 56.
Кроме того, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок тяжелой цепи 16Н9 полипептидов переменной длины (16Н9), состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 55.
И, наконец, имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, обозначенной как последовательность № 56, и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 55.
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 27 (117.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 29 (368.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 31 (501.1Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (776.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 54 (725.1 Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1 Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
Имеется вариант осуществления изобретения, в котором антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, включают в себя участок легкой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 33 (16Н9Ь), и участок тяжелой цепи полипептидов переменной длины, состоящий из аминокислотной последовательности, указанной на последовательности № 30 (368.1Н), № 32 (501.1Н), № 34 (776.1Н), № 53 (725.1Н) или № 55 (16Н9Н).
В одном отдельном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, образуют участок легкой цепи переменной длины, состоящий из одного, двух или трех УЬ СПЯ, приведенных в табл. 1-6. В другом отдельном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся пред
- 20 011504 метом изобретения, образуют участок тяжелой цепи переменной длины, состоящий из одного, двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 1-6. Еще в одном отдельном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, образуют участок легкой цепи переменной длины, состоящий из одного, двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 1-6, и участок тяжелой цепи переменной длины, состоящий из одного, двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 1-6.
В предпочтительном варианте изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, образуют участок легкой цепи переменной длины, состоящий из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 1, либо любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 2, либо любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 3, либо любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 4, либо любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 5, либо любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 6.
В другом предпочтительном варианте изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, образуют участок тяжелой цепи переменной длины, состоящий из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 1, либо любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 2, либо любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 3, либо любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 4, либо любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 5, либо любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 6.
Еще в одном предпочтительном варианте изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, образуют участок легкой цепи переменной длины и участок тяжелой цепи переменной длины, упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 1, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 1; либо упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 2, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 2; упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 3, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 3; упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 4, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 4; упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 5, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 5; упомянутый участок легкой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УЪ СОЯ, приведенных в табл. 6, и упомянутый участок тяжелой цепи переменной длины состоит из любых двух или трех УН СОЯ, приведенных в табл. 6.
Например, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ1, состоящий из любых УЪ1 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ2, состоящий из любых УЪ2 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; либо антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ3, состоящий из любых УЪ3 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ1 и домен УЪ2, состоящий из любых УЪ1 СОЯ и УЪ2 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ1 и домен УЪ3, состоящий из любых УЪ1 СОЯ и УЪ3 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ2 и домен УЪ3, состоящий из любых УЪ2 СОЯ и УЪ3 СОЯ, приведенных в табл. 1-6; и, наконец, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут образовывать домен УЪ1, домен УЪ2 и домен УЬ3, состоящий из любых УЬ1 СОЯ, УЪ2 СОЯ, и УЬ3 СОЯ, приведенных в табл. 1-6.
Таблица 1. Последовательности СОЯ из 117.1
СОК Последовательность № последовательности
νΗ1 <3Ε81_3ΤΡ(3Μ<3ν6 3
УН2 ΗΜΜ/00ΡΚΚ0ΝΡΑΙΚ8 4
νΗ3 νοοΝΡί-δννΥΕον 5
νΐ.1 Ρδ80δΙ.νΗ8Ν6ΝΤΥΙ.Η 6
νΐ.2 ΚΧ/δΝΚΡδ 7
νΐ-3 δΟδΡΥΥΡΕΤ 9
- 21 011504
СОК νΗ1 νΗ2 УНЗ νι_ι У1.2 νΐ_3
Таблица 2. Последовательности СЭК из 368.1
Последовательность
6Υ8ΡΤΘΡΥΜΗ
Υν30ΥΤΘΑΤΤΥΤαΚΡΚ6
ΕΘϋΥΥβΜϋΡ
Κ83Ο31_ΕΚΤΝΘΤ8πΎ1_Η
Κν83ΚΡ3
ЗОТТНСРРТ № последовательности
СОК νΗ1 ΨΗ2 νΗ3 νΐ-1 νΐ_2 νΐ_3
Таблица 3. Последовательности СОК из 501.1
Последовательность № последовательности ΘΥΙΡΤϋΥΘΜΝ οιντυτ6ετιυ8οορκ6
ΘΝΥΚϋΑΙϋΥ
ΚΑ300ΙΚ3Υ1.8
ΥΑΤΤΙ-ΑΟ
1ЛРЮЕ8РРТ сок νΗ1 УН2
Таблица 4. Последовательности СОК из 776.1
Последовательность № последовательности 6ΥΤΡΤ0ΥΝΙΗ
ΥΙΥΡΥΝΘνδϋΥΝΟΝΡ νΗ3 νίΐ νί2
Υί3
Κνν0Ρ(38(3ΥΥΓ0Υ
КА858У1УМС етзтьдз ОСМ/ЗЗЫРРТ
СОК νΗ1 νΗ2 νΗ3 νι_ι νΐ.2 ν<_3 сок νΗ1 νΗ2 νΗ3 νΐ_1 ν{_2 νΐ-3
Таблица 5. Последовательности СОК из 725.1
Последовательность
ΘΥ3ΡΤΝΥ6ΜΝ ννίΝΑΥΙΘΕΡΤΥΑΟϋΡΚΟ ΟΟΝδίΟΡ ΚΑ38δν38ΙΗ ΑΤ3ΝΙΑ3 ОаУУЗЮРАТ № последовательности
Таблица 6. Последовательности СОК из 16Н9
Последовательность № последовательности ΘΡΝΙΚϋΤΥΜΗ
ΡΙΟΡΑΝΟΝΤΚΥΟΡΚΡΟΟ
3ϋΙΥΥΟΝΡΘΟΡΑΥ ΤΑ838ν883ΥΙ-Η 3Τ8ΝΙΛ3 ΗΟΥΗΡ3ΡΕΤ
Антитела и фрагменты антител, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, не являются и в общем случае не конкурируют с ОС 125-подобными антителами, М11-подобными антителами или антителом ОУ 197, как установлено в работе Нустада и др., Биология новообразований, 17:196:219 (1996). В одном из вариантов осуществления изобретения антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, не являются и в общем случае не конкурируют с ОС 125-производными или УК-8-производными однонитевыми антителами, описываемыми в \УО 03/076465.
К антителам, описываемым в настоящем изобретении, относятся, без ограничения, поликлональные антитела, моноклональные антитела, химерные антитела, очеловеченные антитела, антитела человека, биспецифические антитела, триспецифические антитела, мультиспецифические антитела, однонитевые антитела, Ρν8 с дисульфидной связью, однонитевые или антиидиотипические аутоантитела. В предпочтительном варианте в изобретении описывается моноклональное антитело, избирательно связывающее клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р.
Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными к различным эпитопам клеточного СА 125/0772Р либо быть специфичными как к эпитопу клеточного СА 125/0772Р, так и к гетерологичному эпитопу, например к гетерологичному полипептиду или твердому материалу подложки. См., например, Тутт и др., 1. 1ттипо1. 147(1):60-69 (1991); Костельный и др., 1. 1ттипо1. 148(5): 1547-1553 (1992); а
- 22 011504 также патенты США № 4474893, 4714681, 4925648, 5573920, 5601819, 5798229, 5855866, 5869620, 5897861, 5959084, 6106833, 6248332, 6258358, 6303755 и 6420140.
Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, описываемые в изобретении, могут содержать без ограничения фрагменты РаЬ, фрагменты Р(аЬ')2, (УЪ)-содержащие фрагменты легкой цепи полипептида переменной длины, (УН)-содержащие фрагменты тяжелой цепи полипептида переменной длины или (СЭЯ)-содержащие фрагменты, комплиментарно определяющие участок.
Далее, антитела или фрагменту антитела, связывающие антигены, являющиеся предметом изобретения, могут принадлежать к любому классу иммуноглобулинов. Например, антитела, описываемые в изобретении, могут относиться к классу антител 1дС. 1дМ, 1дЕ, Ι§Ό, 1дА или 1дУ. Кроме того, антитела, описываемые в изобретении, могут быть любого изотипа. Например, антитело, являющееся предметом изобретения, может иметь изотип тяжелой цепи Ι§6ι, 1д62, 1д63, 1д64, 1дА1 или 1дА2.
Кроме того, антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут содержать одну или несколько СОЯ, последовательности СОЯ, описываемые в настоящем документе, которые включаются в естественно образующиеся или обрамляющие участки, являющиеся общими типичными элементами структуры, предпочтительно в человеческие обрамляющие участки.
Далее, антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, являющиеся предметом изобретения, могут содержать легкую цепь переменной длины, такую как участок легкой цепи к или λ переменной длины, и/или участок тяжелой цепи переменной длины, описываемой в настоящем документе, которые включаются в естественно образующиеся или обрамляющие участки, являющиеся общими типичными элементами структуры, предпочтительно в человеческие обрамляющие участки. Подобные обрамляющие участки, хорошо известные специалистам, могут, например, содержать константный участок Су1 или Су4.
Антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, избирательно связывающие клеточный СА 125/0772Р, могут быть любого животного происхождения, в том числе могут быть взяты у птиц, например цыплят, или млекопитающих, как не являющихся приматами (коровы, свиньи, лошади, ослы, козы, верблюды, кошки, собаки, морские свинки, крысы, мыши, овцы), так и приматов (обезьяны, такие как павианы, гориллы, шимпанзе, а также человек). Предпочтительно антитела и фрагменты антител, связывающие антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, являются химерическими, человеческими или очеловеченными антителами, в том числе это могут быть моноклональные антитела или фрагменты антител, связывающие антиген. Используемые в целях данного изобретения человеческие антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, включают в себя антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, которые имеют аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина и содержат, например, антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или полученные от мышей, вырабатывающих антитела из генов человека.
С другой стороны, настоящее изобретение описывает клетки гибридомы, которые вырабатывают моноклональное антитело, являющееся предметом изобретения. В одном варианте осуществления изобретения в качестве гибридомы используется гибридома 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридома 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридома 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридома 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридома 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридома 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридома 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), гибридома 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридома 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридома 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), гибридома 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридома 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридома 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), гибридома 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридома 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567) гибридома 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридома 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридома 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридома 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридома 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридома 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридома 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридома 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридома 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
В другом варианте осуществления изобретения гибридома, являющаяся предметом изобретения, представляет собой гибридому, вырабатывающую моноклональные антитела, которые конкурируют с моноклональным антителом, вырабатываемым гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107),
- 23 011504 гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570), для связи с клеточными СА 125/0772Р.
5.2. Синтетические полипептиды, являющиеся предметом изобретения.
Кроме вышеизложенного, настоящее изобретение описывает синтетический полипептид, содержащий антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения и которые избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р, образуя рабочую связь с гетерологичным агентом. Синтетические полипептиды, являющиеся предметом изобретения, также избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р. В одном из вариантов осуществления изобретения синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, а также гетерологичный агент образует рабочую ковалентную связь, например пептидную или дисульфидную. В другом варианте осуществления изобретения синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, а также гетерологичный агент образуют рабочую нековалентную связь. Гетерологичный агент может образовывать связь с аминовыми окончаниями, карбоксильными окончаниями или любой точкой в непрерывной последовательности антител или фрагментов антител, связывающих антиген. Рабочая связь не обязательно должна быть прямой связью между антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, и гетерологичным агентом. Это может быть, например, связь между линкером или разделяющим агентом либо последовательностью.
В одном из вариантов осуществления изобретения синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, содержит аминокислотную последовательность или радиоизотоп. Гетерологичный агент синтетического полипептида, являющегося предметом изобретения, может содержать цитотоксичный агент или выявляемый агент.
Синтетические полипептиды, являющиеся предметом изобретения, можно, например, использовать для получения антител или фрагментов антител, связывающих антигены, которые являются предметом изобретения. Кроме того, синтетические полипептиды можно использовать как часть способов предотвращения или лечения, описываемых в настоящем документе. Далее, синтетические полипептиды, являющиеся предметом изобретения, можно использовать в качестве составляющих иммунологического анализа ίη νίνο и ίη νίίτο, а также методов обеззараживания, применяя известные методики. См., например, публикацию РСТ АО 93/21232; патенты США № 5314995, 5474981, 5514558, 6362317 и 640769; Накамура и др., Записки по иммунологии, 39(1):91-99 (1993); Джиллис и др., Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. США. 89(4): 1428-1432 (1992); а также Фелл и др., I. 1ттипо1. 146(7):2446-2452 (1991).
В случаях, когда гетерологическим агентом является полипептид, гетерологический агент обычно представляет собой не менее приблизительно 5, не менее приблизительно 10, не менее приблизительно 20, не менее приблизительно 30, не менее приблизительно 40, не менее приблизительно 50, не менее приблизительно 70, не менее приблизительно 80, не менее приблизительно 90 или не менее приблизительно 100 аминокислот.
В одном из вариантов изобретения синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, содержит антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р, образуя рабочую связь с гетерологичным агентом, создающим потенциальный терапевтический эффект. Например, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р, могут образовывать рабочую связь с терапевтическими функциональными группами, такими как цитотоксин, например цитостатический агент или агент, разрушающий клетки, либо с радиоактивными ионами, например альфаизлучателями. См., например, патенты США № 5624827, 5643573, 5789554, 5824782, 5994151, 6042829, 6074644,6099842, 6132722, 6187287,6197299 и 6207805.
Цитотоксин или цитотоксический агент - это любой агент, который является пагубным для роста клеток или их жизнеспособности. В качестве примеров цитотоксинов или цитотоксических агентов можно привести следующие вещества (список не является исчерпывающим): паклитаксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокисидантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаины, тетракаин, лидокаин, анаприлин и пуромицин, а также аналоги или гомологи перечисленных выше средств. К другим средствам, обладающим потенциальным терапевтическим эффектом, относятся следующие вещества (список не является исчерпывающим): антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие препараты (например, мехлорэтамин, тиоэпа хлорамбуцил, мельфадан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССЫИ), циклотосфамид, бусульфан, дибромомманитол, стрептоцотоцин, митомицин С и цисдихлордамин платины (II) (ПОР) цисплатин), антрациклины (напри
- 24 011504 мер, даунорубицин (ранее называвшийся дауномицином) и доксорубицин); антибиотики (например, дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)); майтансиноиды и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин), а также радиоактивные материалы, к которым относятся следующие вещества (список не является исчерпывающим): висмут (213Βί), углерод (14С), хром (51Сг), кобальт (57Со), фтор (18Ρ), гадолиний (153Сй, 159Сй), галлий (68Са, 67Са), германий (68Се), гольмий (166Но), индий (115Ιη, 113Ιη, 112Ιη, 111Ιη), йод (131Ι, 125Ι, 123Ι, 121Ι), лантан (140Ьа), литий (177Ьи), марганец (54Μη), молибден (99Мо), палладий (103Рй), фосфор (32Р), празеодим (142Рг), прометий (149Рт), рений (186Ве, 188Ве), родий (105КК), рутений (97Вц), самарий (1538т), скандий (478с), селен (75 8е), стронций (858г), сера (358), технеций (99Тс), таллий (201Τί), олово (1138η, 117δη), тритий (3Н), ксенон (133Хе), иттербий (169УЬ, 175УЬ), иттрий (90Υ) и цинк (65Ζη).
Далее, антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, можно конъюгировать с терапевтическим средством или с лекарственной функциональной группой. Не следует сужать толкование понятия терапевтический агент или лекарственная функциональная группа, ограничиваясь классическими химическими терапевтическими веществами. Например, лекарственной терапевтической группой может быть белок или полипептид, обладающие требуемой биологической активностью. К подобным белкам относятся, например, такие токсины, как агглютинин, рицин А, синегнойный экзотоксин (например, РЕ-40) или дифтеротоксин, рицин, гелонин и антивирусный белок лаконоса, белок, являющийся фактором некроцитоза опухолевых клеток, интерфероны, в том числе (список ниже не является исчерпывающим), α-интерферон (ΙΡΝ-α), β-интерферон (ΙΡΝ-β), фактор роста нервов (Ν6Ρ), фактор роста, производный от тромбоцитов (ΡΌΟΡ), активатор тканевого плазмогена (ТРА), апоптотический агент (например, ΤΝΡ-α, ΤΝΡ-β, ΑΙΜ Ι, как описано в публикации РСТ νϋ 97/33899), ΑΙΜ ΙΙ (см. публикацию РСТ \νϋ 97/34911), Ра5 Ыдапб (Такахаси и др., 1. Iттиηο1, 6:1567-1574, 1994), а также νΕΕΟΙ (публикация РСТ νϋ 99/23105), тромбический агент или антиангиогенный агент (например, антистатин или эндостатин) либо модификатор биологической реакции, такой как лимфокин (например, интерлейкин-1 (ЕС-1), интерлейкин-2 (ΙΕ-2), интерлейкин-6 (ΙΕ-6), фактор, стимулирующий рост колоний макрофагов зернистых лейкоцитов (СМ-С8Р), и фактор, стимулирующий рост колоний зернистых лейкоцитов (СС8Ρ)); фактор, стимулирующий рост колоний макрофагов (М-С8Р) или фактор роста (например, гормон роста (СН)); протеазы или РНКазы.
Синтетические полипептиды, являющиеся предметом изобретения, могут также использоваться в диагностических целях, в частности для контроля хода развития или прогрессирования онкологического заболевания или опухоли при клинических испытаниях, например для определения эффективности выбранной схемы лечения, когда антитело связывается с выявляемым агентом. К примерам выявляемых агентов относятся различные энзимы, простетические группы, флюоресцирующие вещества, люминесцентные вещества, биологические люминесцентные вещества, радиоактивные вещества, металлы, излучающие позитроны, а также ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. Выявляемый агент может связываться или конъюгироваться либо прямым способом, непосредственно с антителом, либо косвенно, через промежуточный агент (например, через известные линкеры) при помощи известных методов. См., например, патенты США № 4741900, 5693764, 5776095, 6008002, 6013531, 6110750, 6124105, 619523 и 6225050.
К числу подходящих энзимов, которые могут конъюгировать с антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, являющимися предметами изобретения, относятся следующие вещества (список не является исчерпывающим): β-лактамазы, β-галактозидазы, фосфатазы, пероксидазы, редуктазы, эстеразы, гидролазы, изомеразы и протеазы, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или ацетилхолинэстераза; обширный перечень примеров подходящих комплексов простетических групп включает в себя ηοη-1^ΐίη§ ехатр1е§ о£ 8ийаЬ1е ргокШейс дгоир сотр1ехе§ тс1ийе стрептавидин/биотин и авидин/биотин. Обширный перечень примеров подходящих флуоресцентных материалов включает в себя ыШаЫе ДцогексеШ та1епа15 тс1ийе умбеллиферон, флуоресцеин, изоцианат фруоресцина, родамин, флуоресцин дихлоротриазиниламина, зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, хлорид данзила или фикоэритрин; обширный перечень люминесцентных материалов включает в себя люминал. Обширный перечень биологических люминесцентных материалов включает в себя люциферазу, люциферин и аэкуорин; в качестве примеров подходящих радиоактивных материалов можно привести 125Ι, 131Ι, Π1Ιη, 99тТс или 90Υ.
Настоящее изобретение также относится к антителам или фрагментам антител, связывающим антиген, которые избирательно связывают синтезированный клеточный СА 125/0772Р с маркерными последовательностями, например пептидами, что облегчает выделение. Например, в качестве маркерной аминокислотной последовательности, среди прочих последовательностей, выпускаемых промышленностью, может использоваться пептид гексагистидина, например метка, имеющаяся в векторе рОЕ (О!АСЕН Шс., 9259 ЕЮп Атегше, С’йа^уоПк СА, 91311). В частности, как описано в работе Генца и др., Ргос. Асай. 8сг И8А. 86(3):821-824 (1989), гистидин, например гексагистидин, применяется в подходящем процессе выделения синтетического белка. К числу прочих меток пептидов, применяемых для выделения, относится, среди прочих, метка гемагглютинина НА, которая соответствует эпитопу, получаемому
- 25 011504 из белка гемагглютинина вируса гриппа (Уилсон и др., Се11. 37(31):767-778 (1984)), и метка флага (Бриззард и др., Биотехнологии. 16(4):730-735 (1994)). По возможности подобные метки или маркерные последовательности выделяются из синтетического полипептида до его использования, например, в качестве составляющей терапевтического метода.
Антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывающий клеточный СА 125/0772Р, может также, например, образовывать рабочие связи со вторым антителом, образуя гетероконъюгат, как описано в патенте США № 4676980 (все эти работы перечислены в данном документе для ссылки на работу в целом.).
Методики образования рабочих связей функциональных групп с антителами хорошо известны. См., например, работы Арнона и др., Моноклональные антитела для определения иммунологических целей лекарственных препаратов, применяемых при лечении онкологических заболеваний, в сборнике Моноклональные антитела и лечение онкологических заболеваний, Рейсфельд и др., изд. А1ап Я. Ь188, 1пс. (1985), с. 243-256; Хельмсторм и др., Отпуск препаратов, содержащих антитела, в сборнике Контролируемый отпуск лекарственных средств (2-е изд.), Робинсон и др., изд. Магсе1 Эеккег. 1пс. (1987), с. 623-653; Торп, Переносчики антител цитотоксичных агентов при лечении онкологических заболеваний: Обзор, в сборнике Моноклональные антитела '84: биологическое и химическое применение, Пинчера и др., изд. ЕбПпсе Кигйз (1985), с. 475-506; Ордер и др., Анализ, результаты и перспективы терапевтического применения антител, меченых радиоизотопами, при лечении онкологических заболеваний, в сборнике Моноклональные антитела для диагностики и лечения онкологических заболеваний, Болдуин и др., изд. Асабеппс Ргезз (1985), с. 303-316; Торп и др., Иммунологический обзор. 62:119158 (1982); а также патенты США № 5639879, 5744119, 5773001 и 6441163.
Методы синтеза или конъюгирования полипептидов в константные участки антител хорошо известны. См., например, патенты США № 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5648218, 5723125, 5783181, 5908626, 5844095, 5112946, 6030613, 6086875, 6194177, 6238667, 6262026 и 6277375; ЕР 307434; ЕР 367166; ЕР 394827; публикацию РСТ \УО 91/06570; Ашкенази и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А. 88(23): 10535-10539 (1991); Траунекер и др., ХаИие. 331(6151):84-86 (1988); Зенг и др., 1. 1ттипо1. 154(10): 5590-5600 (1995) и Ви и др., Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. И8А. 89(23): 11337-11341 (1992), которые полностью включены в настоящий документ для справки.
5.3. Аналоги изобретения.
Кроме антител, фрагментов антител, связывающих антигены, и синтетических полипептидов, которые являются предметом изобретения, аналоги включают в себя антитело, фрагменты антитела, связывающего антигены, и синтетический полипептид, избирательно связывающий клеточный СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р. Например, к аналогам изобретения относятся аналоги моноклонального антитела, вырабатываемого гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридомой 7Р10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридомой 7010 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА-5115), гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА-5118), гибридомой 809 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570), а также аналоги фрагментов антител, связывающих антиген, которые перечислены выше.
Подобный аналог обладает хотя бы одной из перечисленных ниже особенностей структуры:
(a) наличием аминокислотной последовательности, которая избирательно не менее чем примерно при 30%, не менее чем примерно 35%, не менее чем примерно 40%, не менее чем примерно 45%, не менее чем примерно 50%, не менее чем примерно 55%, не менее чем примерно 60%, не менее чем примерно 65%, не менее чем примерно 70%, не менее чем примерно 75%, не менее чем примерно 80%, не менее чем примерно 85%, не менее чем примерно 90%, не менее чем примерно 95% или не менее чем примерно 99% идентична аминокислотной последовательности предварительно модифицированного антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген или синтетического полипептида;
(b) кодируется последовательностью нуклеотидов, которая гибридизируется при строгих условиях до комплемента последовательности нуклеотидов, кодирующей не менее 5, не менее чем примерно 10, не менее чем примерно 15, не менее чем примерно 20, не менее чем примерно 25, не менее чем примерно 40, не менее чем примерно 50, не менее чем примерно 60, не менее чем примерно 70, не менее чем примерно 80, не менее чем примерно 90, не менее чем примерно 100, не менее чем примерно 110 либо не менее чем примерно 120 соседних аминокислотных остатков аминокислотной последовательности анти
- 26 011504 тела, фрагмента антитела, связывающего антиген или синтетического полипептида до модификации; либо (с) кодируется последовательностью нуклеотидов, которая не менее чем примерно 30%, не менее чем примерно 35%, не менее чем примерно 40%, не менее чем примерно 45%, не менее чем примерно 50%, не менее чем примерно 55%, не менее чем примерно 60%, не менее чем примерно 65%, не менее чем примерно 70%, не менее чем примерно 75%, не менее чем примерно 80%, не менее чем примерно 85%, не менее чем примерно 90%, не менее чем примерно 95% или не менее чем примерно 99% идентична последовательности нуклеотидов, кодирующей антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, или синтетического полипептида до модификации.
В одном из вариантов осуществления изобретения аналог антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, или синтетического полипептида, избирательно связывающего клеточный СА 125/0772Р, содержит аминокислотную последовательность, которая избирательно не менее чем
примерно при 35%, не менее чем примерно 40%, не менее чем примерно 45%, не менее чем
примерно 50%, не менее чем примерно 55%, не менее чем примерно 60%, не менее чем
примерно 65%, не менее чем примерно 70%, не менее чем примерно 75%, не менее чем
примерно 80%, не менее чем примерно 85%, не менее чем примерно 90%, не менее чем
примерно 95% или не менее чем примерно 99% идентична аминокислотной последовательности, вырабатываемой гибридомой 4Е7 (дополнение АТСС® № РТА-5109), гибридомой 7А11 (дополнение АТСС® № РТА-5110), гибридомой 7С6 (дополнение АТСС® № РТА-5111), гибридомой 7Е10 (дополнение АТСС® № РТА-5112), гибридомой 7610 (дополнение АТСС® № РТА-5245), гибридомой 7Н1 (дополнение АТСС® № РТА-5114), гибридомой 8А1 (дополнение АТСС® № РТА- 5115), гибридомой 8В5 (дополнение АТСС® № РТА-5116), гибридомой 8С3 (дополнение АТСС® № РТА-5246), гибридомой 8Е3 (дополнение АТСС® № РТА- 5118), гибридомой 869 (дополнение АТСС® № РТА-5119), гибридомой 15С9 (дополнение АТСС® № РТА-5106), гибридомой 16С7 (дополнение АТСС® № РТА-5107), гибридомой 16Н9 (дополнение АТСС® № РТА-5108), гибридомой 117.1 (дополнение АТСС® № РТА-4567), гибридомой 325.1 (дополнение АТСС® № РТА-5120), гибридомой 368.1 (дополнение АТСС® № РТА-4568), гибридомой 446.1 (дополнение АТСС® № РТА-5549), гибридомой 501.1 (дополнение АТСС® № РТА-4569), гибридомой 621.1 (дополнение АТСС® № РТА-5121), гибридомой 633.1 (дополнение АТСС® № РТА-5122), гибридомой 654.1 (дополнение АТСС® № РТА-5247), гибридомой 725.1 (дополнение АТСС® № РТА-5124) или гибридомой 776.1 (дополнение АТСС® № РТА-4570).
Избирательно аналоги содержат менее приблизительно 25, менее приблизительно 20, менее приблизительно 15, менее приблизительно 10, менее приблизительно 5, менее приблизительно 4, менее приблизительно 3 или менее приблизительно 2 аминокислотных замещений, добавлений, делений или их комбинаций в сравнении с исходной молекулой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения аналоги содержат консервативные аминокислотные замещения, состоящие из одного или нескольких аминокислотных остатков, которые считаются несущественными (т.е. аминокислотных остатков, которые не являются важными для антитела при специфичном и избирательном связывании клеточных СА 125/0772Р). Консервативное аминокислотное замещение - это замещение, в котором аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имитатором или аналогом, имеющим побочную цепь с аналогичным зарядом или полярностью. В литературе имеются определения семейства аминокислотных остатков, имеющих побочные цепи со схожими зарядами. Данные семейства включают в себя аминокислоты с основными побочными цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными побочными цепями (например, аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), полярными побочными цепями, не несущими зарядов (например, глицин, аспаргин, глютамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными побочными цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвляющимися побочными цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими побочными цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Далее, аналоги предмета изобретения могут включать в себя добавки и/или быть получены, хотя бы частично, в результате делений в сравнении с исходной молекулой. Добавления и/или деления могут быть любого вида или комбинацией видов при условии соблюдения критерия, связанного со структурой, который описан для аналогов изобретения выше.
Для определения процента сходства двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот последовательности совмещаются для оптимизации процесса сравнения (например, в первую аминокислотную последовательность или в последовательность нуклеиновой кислоты следует добавить пробелы, чтобы обеспечить оптимальное совмещение со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравниваются аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих позициях аминокислот или нуклеотидов. Если определенная позиция первой последовательности занята тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующая позиция второй последовательности, это означает, что молекулы, находящиеся в данных позициях, идентичны. Процент, определяющий сходство двух последовательностей, является функцией количества идентичных позиций, имеющихся в обеих последовательностях (т.е.
- 27 011504 % сходства = количеству идентичных позиций, деленному на общее число позиций и умноженному на 100%). В одном варианте осуществления изобретения последовательности имеют одинаковую длину.
Процент сходства двух последовательностей можно также определять, используя математический алгоритм. В качестве предпочтительного примера математического алгоритма (применение которого не является обязательным), используемого для сравнения двух последовательностей, можно привести алгоритм, предложенный Карлиным и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 87(6):2264-2268 (1990), впоследствие модифицированным Карлиным и др., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А. 90(12):5873-5877 (1993). Аналогичный алгоритм используется в программах ВЬА8Т№ и ВЬА8ТХ, описанных Альтшулем и др., 1. Мо1. В1о1. 215(3):403-410 (1990). Поиск нуклеотидов программой ВЬА8Т может осуществляться с использованием набора параметров программы нуклеотидов ВЬА8Т№, например, когда множество=100, длина слова=12, для получения последовательностей нуклеотидов, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, являющихся предметом настоящего изобретения. Поиск белков программой ВЬА8Т может осуществляться с использованием набора параметров программы ВЬА8ТХ, например, когда множество=50, длина слова=3, для получения последовательностей нуклеотидов, гомологичных молекулам белков, являющихся предметом настоящего изобретения. Для совмещения с использованием пробелов, необходимого для целей сравнения, используется программа барреб ВЬА8Т, как описано в работе Альтшуля и др., Остатки нуклеиновых кислот. 25(17):3389-3402 (1997). Кроме того, можно использовать программу Р81-ВЬА8Т для выполнения итерационного поиска, при котором определяются отдаленные взаимосвязи между молекулами (1б.). При использовании программ ВЬА8Т, барреб ВЬА8Т или Р81-В1151 можно применять параметры соответствующих программ (например, ВЬА8ТХ и ВЬА8Т№), используемые по умолчанию. Еще одним предпочтительным примером математического алгоритма (применение которого не является обязательным) является математический алгоритм сравнения последовательностей, разработанный Майерсом и Миллером (Майерс и др., Биохимические компьютерные приложения 4(1): 11-17 (1988)). Данный алгоритм реализован в программе АЬ16№ (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения 6С6 для определения совмещения последовательностей. При использовании программы АЬ16№ для сравнения аминокислотных последовательностей необходимо применять таблицу весов остатков РАМ120, коэффициент длины промежутка 12 и коэффициент промежутка 4.
Процент сходства двух последовательностей можно определить, используя методики, аналогичные тем, что описаны выше, как разрешающие использование промежутков или пробелов, так и не допускающих их применение. При вычислении процента сходства обычно учитываются только точные совпадения.
Аналог можно также определить как антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген или синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, который модифицируется в результате связывания, например ковалентного связывания, молекулой любого типа с соответствующим предварительно модифицированным антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, и который продолжает избирательно связывать клеточный СА 125/0772Р. Например (не ради ограничения), антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, или синтетический полипептид могут быть модифицированы путем гликозилирования, ацетилирования, алкилирования, эстерификации, липидирования, введения радикала НСО, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, получения производных защитных/блокирующих групп, протеолитического гидролиза, связи с клеточными лигандами или другим белком и т. д. Далее, аналог может содержать одну или несколько неклассических аминокислот. К неклассическим аминокислотам относятся, не ограничиваясь перечисленными ниже аминокислотами, Ό-изомеры общих аминокислот, α-аминоизомасляная кислота, 4-аминоизомасляная кислота (4-АЬи), 2-аминомасляная кислота (2-АЬи), 6-аминокапроновая кислота (6-Айх), 2-аминоизомасляная кислота (2-А1Ь), 3-аминопропионовая кислота, орнитбин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, метиламиноуксусная кислота, карбамидоаминовалериановая кислота, цистеиновая кислота, ΐ-бутилглицин, ΐ-бутилаланин, фунилглицин, циклогексааланин, β-аланин, фтораминокислоты, синтезированные аминокислоты, например, такие как Р-метиламинокислоты, Са-метиламинокислоты, №а-метиламинокислоты, и аналоги аминокислот в целом. В одном варианте осуществления изобретения аналог предмета изобретения проявляет повышенное сродство с клеточным СА 125/0772Р в сравнении с полипептидом соответствующего предварительно модифицированного антитела, фрагмента антитела, связывающего антигены, или синтетического полипептида. В другом специфическом варианте осуществления изобретения антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, или синтетический полипептид, избирательно связывающий клеточный СА 125/0772Р, обладают увеличенным сроком полужизни сыворотки в сравнении с соответствующим предварительно модифицированным антителом, фрагментами антител, связывающими антигены, и синтетическим полипептидом. Например, аналог может проявлять в клетках животных, приматов и в особенности человека время полужизни, превышающее примерно 1 день, превышающее примерно 2 дня, превышающее примерно 3 дня, превышающее примерно 7 дней, превышающее примерно 10 дней, в особенности превышающее примерно 15 дней, превышающее примерно 25 дней, превышающее примерно 30 дней, превышающее примерно 35 дней, превышающее примерно 40 дней или превышающее примерно 45 дней.
- 28 011504
Для продления циркуляции серозной жидкости антител, фрагментов антител, связывающих антиген, или синтетических полипептидов ίη νίνο молекулы инертных полимеров, такие как обладающие большим весом молекулы полиэтиленгликоля (РЕС), можно присоединить к антителам, фрагментам антител, связывающих антиген, или синтетическим полипептидам как с образованием, так и без образования многофункционального линкера либо через сайт-специфичную конъюгацию РЕС с амино- или карбоксильными окончаниями антител, фрагментов антител, связывающих антиген, или синтетических полипептидов, так и посредством эпсилон-аминогрупп, присутствующих в остатках лизина. Предпочтительно получение производных линейного или разветвленного полимера, вызывающее минимальные потери биологической активности. Степень конъюгации можно постоянно контролировать с помощью 8Э8-РАСЕ и масс-спектрометрии, чтобы обеспечить надлежащее конъюгирование молекул РЕС в антитела. Непрореагировавший РЕС можно отделить от конъюгатов антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, или конъюгатов синтетического полимера методом исключения размера или ионообменной хроматографии. Можно проверить как активность при связывании РЕС-производных антител, фрагментов антител, связывающих антигены, и синтетических полипептидов, так и их действенность ίη νίνο, используя известные специалистам методы, например методы иммунологического анализа, описываемые в данном документе.
Антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, обладающие повышенным временем полужизни ίη νίνο, можно также получить, вводя одну или более модификаций аминокислот (например, замещения, вставки или удаления) в константный домен 1дС или в связывающий фрагмент РсКп указанного домена (предпочтительно в фрагмент домена Рс или узловой Рс). См., например, публикацию РСТ \УО 98/23289 и патент США № 6277375; каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом.
5.4. Молекулы нуклеиновых кислот, являющиеся предметом изобретения.
Еще одним предметом настоящего изобретения является изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеиновую последовательность, кодирующую антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или их аналоги, являющиеся предметом изобретения.
В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся предметом изобретения, кодирует антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или их аналоги, образуя не менее одной, а предпочтительно две или три СОЕ с легкими цепями, перечисленные в табл. 1-6. Например, молекула нуклеиновой кислоты, являющейся предметом изобретения, может включать в себя последовательность нуклеотидов № 35, 37, 39, 41, 52 или 59, которая кодирует по меньше мере одну, а в более предпочтительном варианте две или три упомянутые СОЕ с легкими цепями.
В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся предметом изобретения, кодирует антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или их аналоги, образуя не менее одной, а предпочтительно две или три СОК с тяжелыми цепями, перечисленные в табл. 1-6. Например, молекула нуклеиновой кислоты, являющейся предметом изобретения, может включать в себя последовательность нуклеотидов № 36, 38, 40, 42, 57 или 58, которая кодирует по меньше мере одну, а в более предпочтительном варианте две или три упомянутые СОК с тяжелыми цепями.
Еще в одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся предметом изобретения, кодирует антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или их аналоги, образуя последовательность полипептидов с легкими цепями переменной длины, показанную на фиг. 5С, 6С, 7С, 8С, 9С или 10С. Например, молекула нуклеиновой кислоты, являющейся предметом изобретения, может включать в себя последовательность нуклеотидов № 35 (117.1), 37 (368.1), 39 (501.1), 41 (776.1), 52 (725.1) или 59 (16Н9).
Еще в одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся предметом изобретения, кодирует антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или их аналоги, образуя последовательность полипептидов с тяжелыми цепями переменной длины, показанную на фиг. 5Ό, 6Ό, 7Ό, 8Ό, 9Ό или 10Ό. Например, молекула нуклеиновой кислоты, являющейся предметом изобретения, может включать в себя последовательность нуклеотидов № 36 (117.1), 38 (368.1), 40 (501.1), 42 (776.1), 57 (725.1) или 58 (16Н9).
Среди молекул нуклеиновых кислот, являющихся предметом изобретения, имеются молекулы нуклеиновых кислот, представляющие собой вырождающиеся варианты, или молекулы, гибридизируемые при строгих условиях, образуя комплемент молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения.
Например, в одном из вариантов осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты, являющаяся предметом изобретения, - это молекула, которая гибридизируется при строгих условиях, образуя комплемент последовательности № 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 52, 57, 58 или 59. Подобные гибридизируемые молекулы нуклеиновой кислоты избирательно кодируют антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые являются предметом изобретения.
- 29 011504
5.5. Фармацевтические составы предмета изобретения.
В определенном отношении настоящее изобретение описывает фармацевтические составы, содержащие антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид, аналог или молекулу нуклеиновой кислоты, являющиеся предметом изобретения, а также фармацевтически допустимый носитель.
Предпочтительно фармацевтический состав, являющийся предметом изобретения, включает в себя антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид, аналог или молекулу нуклеиновой кислоты, являющиеся предметом изобретения, которые демонстрируют Кд не менее чем примерно 100 нМ, не менее чем приблизительно 10 нМ, не менее чем примерно 1 нМ, не менее чем примерно 100 пМ или не менее чем примерно 10 пМ для пептида, показанного на фиг. 1 (последовательность № 1), измеренный методом анализа сходства В1Асоге, который описан в разделе 6.4. С другой стороны, фармацевтический состав, являющийся предметом изобретения, может содержать антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид, аналог или молекулу нуклеиновой кислоты, являющиеся предметом изобретения, которые выполняют промежуточную роль при лизисе СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток. Наиболее предпочтительным будет фармацевтический состав, являющийся предметом изобретения, который включает в себя антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид, аналог или молекулу нуклеиновой кислоты, являющиеся предметом изобретения, и который кодирует полипептид, ингибирующий рост СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток либо сам по себе, либо будучи конъюгированным с цитотоксическим агентом.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, синтетический полипептид или их аналоги конъюгируются с цитотоксичным агентом, приносящим пользу при лечении клеточных пролиферативных заболеваний, например с цитотоксичными агентами, перечисленными в разделе 5.2. В частном варианте осуществления изобретения цитотоксическим агентом является радиоизотоп. В другом частном варианте выбирается радиоизотоп из группы, в которую входят 1251, 1311, ш1и, 99тТс и 90Υ.
Термин носитель обозначает разбавляющий, активирующий (например, адъювант Фрейнда (полный или неполный)), инертный, стабилизирующий агент, антикоагулянты, связывающие вещества или транспортные средства для управления антителом, фрагментом антитела, связывающим антиген, синтетическим полипептидом или аналогом предмета изобретения. Фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, например вода или масла, в том числе имеющие нефтяное, животное, растительное или синтетическое происхождение, такие как ореховое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и аналогичные виды масел. Вода является предпочтительным носителем в том случае, когда фармацевтический состав вводится внутривенно. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут использоваться в качестве жидких носителей, в частности растворов, вводимых при помощи инъекций. Подходящими фармацевтическими инертными наполнителями являются крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеролмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, полипропилен, гликоль, вода, этанол и т. п. вещества. При необходимости состав может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих веществ либо буферных агентов рН. Подобные составы могут быть в форме растворов, взвесей, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т. п. Составы для приема внутрь могут содержать стандартные носители, например фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата марганца, сахарина натрия, целлюлозы, карбонат магния и т.д. Примеры применяемых фармацевтических носителей описаны в работе Ремингтона: Наука и практика фармацевтики, 20-е изд., Сеииаго. ей., ЫрртсоИ (2000).
В предпочтительном варианте изобретения фармацевтические составы стерильны и используются в форме, пригодной для воздействия на объект, как правило на подопытное животное, более предпочтительно на примата и в наиболее предпочтительном варианте на человека.
В специфическом варианте осуществления изобретения может оказаться желательным применение фармацевтических составов, являющихся предметом изобретения, местно, на участке, где необходимо провести лечение. Подобное применение достигается в результате (не ограничиваясь перечисленными ниже методами) местного вливания, путем инъекции или при в виде имплантата; упомянутый имплантат выполняется из пористого, непористого или желеобразного материала, в том числе мембран, например сиаластичных мембран или волокон. По возможности, при применении фармацевтических составов необходимо соблюдать осторожность и использовать лишь те материалы, которые не поглощают антител, фрагментов антител, связывающих антигены, синтетических полипептидов или аналогов, входящих в фрамацевтический состав или составы. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтический состав может быть представлен и доставлен в везикуле, в частности в липосоме (см., например, Лангер, 8с1еисе, 249(4976): 1527-1533 (1990); Трит и др., в сборнике Липосомы в терапии инфекционных и онкологических заболеваний, Лопес-Берештейн и др., редакция, Ь188 (1989), с. 353-365; Лопес-Берештейн и др., 1Ый., с. 317-327; Лопес-Берештейн и др., 1Ый., общий случай; а также патенты США № РЕ35338, 5662931, 5759519, 5879713, 6027726, 6099857, 6132764, 6245427, 6284375, 6350466 и
- 30 011504
6417326).
Еще в одном варианте осуществления изобретения фармацевтический состав может быть представлен и доставлен с помощью системы контролируемого высвобождения или замедленного высвобождения. В одном из вариантов осуществления изобретения для контролируемого или замедленного высвобождения применяется насос (см., например, Лангер, 8с1епсе, 249(4976):1527-1533 (1990); Сефтон, Критический обзор биомедицинских технологий, 14(3):201-40 (1987); Бухвальд и др., Хирургия. 88(4):507516 (1980); Содек и др., N. Еп§1. 1. Мей. 321(9):574-579 (1989); а также патенты США № 5720720 и 6352683).
Еще в одном варианте осуществления изобретения для контролируемого или замедленного высвобождения антител, фрагментов антител, содержащих антиген, синтетических полипептидов или аналогов веществ, описываемых в данном документе, применяются полимерные материалы (см., например, Варианты применения в медицине контролируемого высвобождения, Лангер и Вайс (редакция), СЯС Рге5.. Воса Яа1оп, Нопба (191%). Варианты применения в медицине контролируемого высвобождения, Лангер и др., ред., СЯС Рге55 (1974); Контролируемая биологическая усвояемость лекарств, Разработка и производство лекарственных препаратов, Смолен и др., ред., ^11еу (1984); Ранджер и др., 1. Масгото1. 8с1. Яеу. Масгото1. С1ет. 23:61 (1983); Леви и др., 8аепсе. 228(4696): 190-192 (1985); Льюринг и др., Апп. №ша1. 25(4):351-356 (1989); Ховард и др., 1. №шо8шд. 71(1):105-112 (1989); патенты США № 5128326, 5679377, 5863985, 5912015, 5916597, 5989463, 5994492, 6011011, 6020004, 6066325, 6180608, 6190702, 6214966,6221958,6221977, 6267981, 6362276, 6365173, 6375985, 6394997 и 6399103; а также публикация РСТ XV О 99/20253). В качестве примеров полимеров, используемых в формулировках с замедленным высвобождением, можно перечислить следующие полимеры (список не является исчерпывающим): поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), поли(этиленковинилацетат), поли(метакриловая кислота), полигликолиды (РЬС), полиангидриды, поли(№винилпирролидон), поливиниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (РЬА), поли(лактид-ко-гликолиды) (РЯСА), а также полиортоэфиры.
Фармацевтический состав предмета изобретения формулируется таким образом, чтобы обеспечивать совместимость с предполагаемым методом применения. К числу способов применения относятся, без ограничения, например, парентеральный (например, внутривенный, внутрикожный, внутримышечный, подкожный), пероральный, интраназальный, ингаляции, трансдермальный (местный), трансмускульный и ректальный способы. В специфическом варианте осуществления изобретения состав формулируется в зависимости от предполагаемого способа применения, т.е. фармацевтический состав изменяется в зависимости от выбранного способа применения для лечения людей - внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или локального. В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтический состав формулируется в соответствии с принятыми методами подкожного введения в организм человека. Как правило, составы для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильной изотонической водной среде. При необходимости состав может также включать в себя солюбилизирующий компонент и местный анестетик, снижающие болевые ощущения в месте инъекции.
Если препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, должны применяться местно, они выпускаются в форме мази, крема, трансдермальных пластырей, лосьона, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии, или прочих форм, применяемых специалистами. См., например, Ремингтон: Наука и практика фармацевтики, 20-е изд., беппаго, ред., ЫрртсоИ (2000). В нераспыляемых формах для местного применения, вязких, полутвердых или твердых формах обычно применяется носитель либо один или несколько инертных наполнителей, позволяющих применять препарат местно, при этом динамическая вязкость должна быть выше динамической вязкости воды. К подходящим формулировкам относятся, не ограничиваясь данным перечнем, растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, линименты, бальзамы и аналогичные лекарственные формы, которые при необходимости могут быть стерильными либо могут быть смешаны со вспомогательными веществами (например, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими веществами, буферными веществами или солями), что позволяет оказывать влияние на различные свойства, такие как осмотическое давление. К другим лекарственным формам препаратов для местного применения относятся разбрызгиваемые аэрозольные препараты, у которых активная составляющая, предпочтительно в сочетании с твердым или жидким инертным носителем, упаковывается в виде смеси с находящимся подавлением летучим веществом (например, с газообразным распыляющим веществом типа фреона) либо расфасовывается в пластмассовые бутыли с пульверизаторами. При необходимости к фармацевтическому составу или лекарственной форме могут также быть добавлены увлажняющие или смачивающие вещества. Подобные дополнительные компоненты подробно описаны в литературе.
Если препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, должны применяться интраназально, они выпускаются в форме аэрозоля, спрея либо в форме капель. В частности, агенты для применения в соответствии с настоящим изобретением могут поставляться в удобной форме в виде арозолей в герметизировнаных упаковках или аэрозольных аппаратах; в этом случае в качестве распыляющего вещества используются, например, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортет
- 31 011504 рафторэтан, диоксид углерода или другой подходящий газ. Для аэрозолей в упаковках под давлением необходимо предусмотреть наличие дозатора с клапаном, позволяющим отмерять нужно количество. Капсулы и ампулы, например, из желатина, для применения в ингаляторах или инсуффляторах, могут изготавливаться с применением порошковой смеси требуемого вещества и подходящей порошковой основы, например лактозы или крахмала.
Если препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, должны применяться перорально, они выпускаются в виде таблеток, капсул, облаток, желатиновых капсул, растворов, взвесей и т. д. Таблетки или капсулы готовятся традиционными способами, с применением фармацевтически допустимых инертных наполнителей, таких как связывающие вещества (например, желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропиловая метилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или дикальций-фосфат); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или двуокись кремния); агенты, вызывающие дезинтеграцию (например, картофельный крахмал или или натриевый гликолат крахмала); или увлажняющие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут иметь оболочку, наносимую традиционными способами. Жидкие препараты для перорального приема могут быть в форме растворов, сиропов или суспензий либо выпускаться в виде сухих веществ, разбавляемых перед применением водой или другими носителями. Подобные жидкие препараты готовятся традиционными методами с использованием фармацевтически разрешенных добавок, таких как суспендирующие средства (например, сироп сорбитола, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие вещества (например, лецитин или гуммиарабик); неводные носители (например, миндальное масло, эфиры масел, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропил-роксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также содержать буферные соли, красители, ароматизаторы и подслащивающие вещества. Препараты для перорального приема могут иметь составы, обеспечивающие медленное, контролируемое или замедленное высвобождение профилактического или терапевтического вещества или веществ.
Препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, могут выпускаться в виде, предусматривающем парентеральное введение путем инъекций, например для инъекций ударной дозы вещества или непрерывного вливания. Составы для инъекций могут выпускаться в разовом дозированном виде, например в ампулах или в емкостях, рассчитанных на несколько доз, с добавлением консервантов. Фармацевтические составы могут выпускаться в виде суспензий, растворов или эмульсий, с использованием наполнителей на масляной или водной основе, а также могут содержать рецептообразующие средства, например суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Кроме того, активный компонент может выпускаться в форме порошка, разбавляемого перед применением подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой.
Препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, могут выпускаться в виде, предусматривающем их ректальное применение, например, при помощи суппозиториев или удерживающих клизм. Формулы подобных препаратов содержат, как правило, стандартные основы для суппозиториев, такие как кокосовое масло или другие глицериды.
Кроме формул препаратов, описанных выше, препараты, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, могут иметь формулы, обеспечивающие их пролонгированное действие. Подобные формы препаратов, рассчитанные на пролонгированное действие, могут вводиться методом имплантирования (например, подкожного или внутримускульного) либо путем внутримышечных инъекций. При этом, например, фармацевтические составы могут включать в себя соответствующие полимерные или гидрофобные материалы (например, в виде эмульсий в соответствующем масле) либо ионообменные смолы или их умеренно растворимые производные, такие как умеренно растворимые соли.
В общем случае компоненты препаратов, фармацевтический состав которых является предметом изобретения, поставляются либо отдельно, либо в смешанном виде в случае поставки в виде разовых доз. Например, препарат поставляется в виде сухого лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметически закрытой емкости (ампуле или пакете), на которой указывается количество активного вещества. При введении препарата путем вливания он разводится в емкости, используемой при вливании, в которой находится стерильная вода фармацевтической категории или физиологический раствор. Если фармацевтический состав вводится путем инъекции, он может поставляться в комплекте с ампулами, содержащими стерильную воду или физиологический раствор для инъекций. В этом случае компоненты смешиваются непосредственно перед инъекцией.
Для антител, фрагментов антител, связывающих антиген, синтетических полипептидов и аналогов изобретения определение доз, вводимых пациенту, обычно определяется из расчета от примерно 5 мкг/кг до примерно 10 мг/кг, более предпочтительной является доза от примерно 20 мкг/кг до примерно 5 мг/кг веса пациента; наиболее предпочтительной является доза от примерно 100 мкг/кг до примерно 5 мг/кг. Данную дозировку следует использовать в течение примерно 6 курсов лечения, составляющих недели или месяцы, в зависимости от назначений лечащего врача. Как правило, человеческие антитела обладают более длительным временем полужизни в организме человека по сравнению с антителами, полученными от других видов, что связано с иммунной реакцией на чужеродные полипептиды. Таким образом, ис- 32 011504 пользование человеческих антител позволяет снизить дозировки препаратов и частоту введения. Кроме того, дозировки и частота введения антител или фрагментов антител, являющихся предметом изобретения, могут быть уменьшены в результате улучшения поглощения и внутритканевого поглощения антител при их модифицировании, например липидировании.
Точная доза, используемая в формуле препарата, будет также зависеть от способа введения препарата, тяжести заболевания. Доза должна выбираться лечащим врачом с учетом конкретного состояния отдельного пациента и опубликованных данных клинических исследований. Эффективные дозы могут определяться на основании кривых доза-эффект, полученных с помощью систем проведения испытаний ίη νίΐΓΟ или на экспериментальных животных.
В одном варианте осуществления изобретения препарат, фармацевтический состав которого является предметом изобретения, фасуют в герметичные емкости (ампулы или пакеты), на которых указывается количество антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога. В другом варианте осуществления изобретения препарат, фармацевтический состав которого является предметом изобретения, поставляется в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка или не содержащего воды концентрата в герметической упаковке. Впоследствии данный порошок или концентрат восстанавливаются путем разбавления водой или физиологическим раствором перед введением препарата пациенту. Еще в одном варианте осуществления изобретения фармацевтический состав образует взвесь в жидкости и поставляется в герметических емкостях, на которых указывается количество и концентрация антител, фрагментов антител, связывающих антиген, синтетических полипептидов или аналогов.
Еще в одном варианте осуществления изобретения препарат, фармацевтический состав которого является предметом изобретения, поставляется в герметических емкостях, содержащих разовые дозы не менее приблизительно 5 мг, более предпочтительную составляющую не менее приблизительно 1 мг, более предпочтительную составляющую не менее приблизительно 2, 5, 10, 15, 25, 35, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 или 500 мг. При поставке в жидком виде препарат может быть расфасован в герметизированные емкости. Концентрация препарата при этом составляет не менее 1 мг/мл.
Настоящее изобретение также описывает метод приготовления фармацевтического состава, являющегося предметом изобретения, в том числе описание метода примешивания антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога изобретения к фармацевтически применимому носителю.
5.6. Готовые изделия, являющиеся предметом изобретения.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является описание готовых изделий, включающих в себя упаковочный материал и фармацевтический состав, являющийся предметом изобретения, который содержится в данном упаковочном материале; при этом фармацевтический состав находится либо в форме, пригодной для введения пациенту, предпочтительно человеку, либо в форме, которая затем разбавляется или восстанавливается перед непосредственным введением пациенту. В одном варианте осуществления изобретения готовые изделия включают в себя, кроме прочего, печатные инструкции и/или этикетки, содержащие информацию по применению или введению фармацевтического состава. Инструкции и/или этикетки могут, например, содержать рекомендации по дозированию препарата в целях предотвращения возникновения или лечения одного или нескольких симптомов, вызванных заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, таким как клеточно-пролиферативное заболевание, например рак (в частности, рак яичника, матки, молочной железы или легких). Таким образом, инструкции и/или этикетка должны содержать информацию, которая поможет врачу, специалисту или пациенту правильно применять препарат для предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, либо одного или нескольких симптомов упомянутого заболевания, например клеточно-пролиферативного заболевания, такого как рак (в частности, рак яичника).
Как и для любой другой фармацевтической продукции, упаковочный материал и емкости для готовых изделий, являющихся предметом изобретения, предназначены для обеспечения стабильности состояния продукции во время хранения и поставки. Точнее сказать, предмет изобретения представляет собой готовые изделия, включающие в себя упаковочные материалы, такие как коробки, сосуды, тюбики, флаконы, емкости, пульверизаторы, инсуффляторы, баллоны для внутривенных (ί.ν.) вливаний, пакеты и т.д.; в любом из перечисленных видов упаковок содержится по меньшей мере одна доза фармацевтического состава, являющегося предметом изобретения.
5.7. Методы идентификации антител и фрагментов антител, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р.
Настоящее изобретение описывает метод, помогающий идентифицировать антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р в сравнении с культивируемыми СА 125/0772Р. В одном варианте осуществления изобретения метод идентификации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, состоит в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р в присутствии культивируемого СА 125/0772Р при условиях, которые разрешают связывание антитела или фрагмента антитела, связы
- 33 011504 вающих антиген, с любым упомянутым выше пептидом, включающим в себя клеточный СА 125/0772Р или культивируемый СА 125/0772Р. После выдержки культивируемый СА 125/0772Р (как при наличии, так и при отсутствии антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген) и несвязанное антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, удаляются, после чего измеряется количество антител или фрагментов антитела, связывающих антиген, связанных с пептидом, содержащихся в клеточном СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, идентифицированные данным методом, удовлетворяют одному из трех вариантов осуществления изобретения, описанных выше, по избирательному связыванию, в этом случае упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. В предпочтительном варианте осуществления изобретения отношение культивируемого СА 125/0772Р к культивируемому СА 125/0772Р в реагирующей смеси составляет примерно 25:1 (по весу). Как часть данного метода, клеточный СА 125/0772Р можно иммобилизировать на поверхности твердого тела. Например, данный метод можно использовать в формате ЕЬ18А.
В другом варианте осуществления изобретения метод идентификации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, состоит в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, с пептидом, входящим в клеточный СА 125/0772Р и культивируемый СА 125/0772Р (например, примерно в 25-кратном (по весу) избыточном количестве), при условиях, которые разрешают связывание антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, с любым упомянутым выше пептидом, включающим в себя клеточный СА 125/0772Р, удаление несвязанного пептида, входящего в состав клеточного СА 125/0772Р, измерение количества клеточного СА 125/0772Р, содержащего пептид, которое было связано антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, и сравнение измеренного количества с количеством пептидосодержащего клеточного СА 125/0772Р, которое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, могут связать при отсутствии данного количества культивируемого СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, идентифицированные данным методом, удовлетворяют одному из трех вариантов осуществления изобретения, описанных выше, по избирательному связыванию, в этом случае упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Как часть данного метода, клеточный СА 125/0772Р можно иммобилизировать на поверхности твердого тела. Например, данный метод можно использовать в формате ЕЬ18А. Основные положения, содержащиеся в настоящем документе, которые связаны со стандартными методиками, широко известными специалистам, применяются при использовании подобных методов в практических целях, для идентификации антител или фрагментов антител, связывающих антигены, которые являются предметом изобретения. Например, к методам анализа, позволяющим идентифицировать подобные антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, относится сравнительный анализ методом ЕЬ18А, описываемый в разделе 6 и соответствующих пунктах.
Еще в одном варианте осуществления изобретения метод идентификации антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, состоит в контактировании антитела или фрагмента антитела, связывающих антиген, с клеткой, выражающей СА 125/0772Р, а также с культивируемым СА 125/0772Р в количестве, например, не ниже примерно 0,05 мг/мл при условиях, которые разрешают связывание СА 125/0772Р с антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, удаление несвязанных клеток, измерение количества клеток, представляющих СА 125/0772Р, которое было связано антителом или фрагментом антитела, связывающими антиген, и сравнение измеренного количества с количеством клеток, представляющих СА 125/0772Р, которое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, связывает при отсутствии данного количества культивируемого СА 125/0772Р. Если антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, идентифицированные данным методом, удовлетворяют одному из трех вариантов осуществления изобретения, описанных выше по избирательному связыванию, в этом случае упомянутое антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым полипептидом СА 125/0772Р. Данный метод можно, например, использовать при выполнении измерений методом проточной цитометрии, в том числе, например, сортировки клеток, активированных флуоресценцией. Основные положения, содержащиеся в настоящем документе, которые связаны со стандартными методиками, широко известными специалистам, применяются при использовании подобных методов в практических целях, для идентификации антител или фрагментов антител, связывающих антигены, которые являются предметом изобретения. Например, к методам анализа, позволяющим идентифицировать подобные антитела или фрагменты антител, связывающие антиген, относится сравнительный анализ методом проточной цитометрии, описываемый в разделе 6 и соответствующих пунктах.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя антитела и фрагменты антител, связываемые антигенами, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р и которые являются специфичными для СА 125/0772Р. Антитела, специфичные для СА 125/0772Р, можно без затруднений идентифицировать, например, методами анализа специфичности ЕЬ18А или проточной цитометрии, ко
- 34 011504 торые описаны в разделе 6 и соответствующих пунктах. Само по себе настоящее изобретение также описывает методы идентификации антител и фрагментов антител, связывающих антиген, которые являются специфичными для СА 125/0772Р и избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р. В одном из подобных вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, являющиеся специфичными для СА 125/0772Р, идентифицируются, например, методами анализа специфичности ЕЬ18А и/или проточной цитометрии. Затем антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, проверяются на наличие способности избирательно связывать клеточные СА 125/0772Р; при этом используется один из методов, описываемых в настоящем документе.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя антитела и фрагменты антител, связываемые антигенами, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р и которые связывают пептид, изображенный на фиг. 1 (последовательность № 1) с Кд, не превышающим примерно 100 нМ, не превышающим примерно 10 нМ, не превышающим примерно 1 нМ, не превышающим примерно 100 пМ или не превышающим примерно 10 пМ; эти значения измеряются методом сходства В1Асоге, который описан в разделе 6.4. Подобные антитела можно без затруднений идентифицировать, например, методом анализа сходства ЕЬ18А, который описан в разделе 6 и соответствующих подпунктах. Само по себе настоящее изобретение также описывает методы идентификации антител и фрагментов антител, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, а также избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р, обладающие, по меньшей мере, определенным минимальным уровнем сходства. В одном из подобных вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, избирательно связывающие клеточный СА 125/0772Р, идентифицируются, например, одним из методов, описанных в данном документе. Затем антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, проверяются на наличие способности связывать клеточные СА 125/0772Р (или пептид, содержащий клеточный СА 125/0772Р) с Кд, не превышающим примерно 100 нМ, не превышающим примерно 10 нМ, не превышающим примерно 1 нМ, не превышающим примерно 100 пМ или не превышающим примерно 10 пМ; при этом используется один из методов, описываемых в настоящем документе.
Варианты осуществления настоящего изобретения также включают в себя антитела и фрагменты антител, связываемые антигенами, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р и которые способны выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных клеток, например опухолевых клеток. Подобные антитела и фрагменты антител, содержащие антигены, можно без затруднений идентифицировать, например, методами анализа АЭСС и/или СЭС. которые описаны в разделе 6 и соответствующих пунктах. Само по себе настоящее изобретение также описывает методы идентификации антител и фрагментов антител, связывающих антиген, которые избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р и которые способны выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных клеток. В одном из подобных вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, избирательно связывающие СА 125/0772Р, идентифицируются, например, одним из методов, описанных в данном документе. Затем антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, проверяются на наличие способности выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных клеток; при этом используется метод анализа АЭСС или СЭС, описываемый в настоящем документе.
Варианты осуществления настоящего изобретения также включают в себя антитела и фрагменты антител, связываемые антигенами, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р и которые способны ингибировать или замедлять рост СА 125/О772Р-положительных клеток. Подобные антитела и фрагменты антител, содержащие антигены, можно без затруднений идентифицировать, например, методами анализа ίη νίνο, описанными ранее, например, в работах Трескеса и др., Еиг. 1. Сапсег. 30А(2): 183187 (1994); Ахмада и др., Опсо1. Век. 11(6):273-280 (1999) и Киевита и др., Ιηΐ. 1. ΡαάίαΙ. Опс. ΒίοΙ. РНук. 38(2):419-428 (1997), каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом. Само по себе настоящее изобретение также описывает методы идентификации антител или фрагментов антител, связывающих антиген, которые избирательно связывают СА 125/0772Р и которые способны ингибировать или замедлять рост СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток. В одном из подобных вариантов осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела, избирательно связывающие СА 125/0772Р, идентифицируются, например, одним из методов, описанных в данном документе. Затем антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, проверяются на наличие способности ингибировать или замедлять рост СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток; при этом антитело или фрагмент антитела, связывающие антиген, проверяются в системе, аналогичной одной из систем ίη νίνο, описанных в документах, указанных для справки выше.
5.8. Методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р.
Настоящее изобретение описывает методы предотвращения возникновения, лечения или контроля заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или уменьшения интенсивности проявления симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р. В частности, настоящее изобретение описывает методы предотвращения возникновения, контроля, лечения и уменьшения интенсивности проявления симптомов клеточных пролиферативных заболеваний за счет применения пациентом, нуждающимся в подобном предотвраще
- 35 011504 нии возникновения, контроле, лечении и уменьшении интенсивности проявления симптомов, определенного количества антител, фрагментов антител, связывающих антиген, либо аналогов, действие которых ведет к желательному для пациента результату.
Как обсуждается на протяжении всего документа, антитела и фрагменты антител, связывающие антигены, которые являются предметом изобретения, избирательно связывают клеточные СА 125/0772Р. Аналогичным образом синтетические полипептиды и аналоги изобретения также связывают клеточные СА 125/0772Р. Как уже отмечалось в данном документе, благодаря тому, что клеточный СА 125/0772Р до культивирования СА 125/0772Р уже присутствует или является частью СА 125/0772Р, было отмечено, что антитела, фрагменты антител, связывающие антиген, синтетические полипептиды и аналоги изобретения также могут связывать СА 125/0772Р. Таким образом, даже при отсутствии желания устанавливать связь с каким-либо конкретным механизмом или теорией, следует отметить, что методы, описываемые в данном разделе, могут быть применены, пусть даже частично, в целях связывания используемым для лечения антителом, фрагментами антитела, связывающего антиген, синтетическими полипептидами либо аналогами изобретения в отношении СА 125/0772Р до культирования, дополнительно к связыванию клеточного СА 125/0772Р после культивирования.
В одном из вариантов осуществления изобретения методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявлений симптомов онкологических заболеваний. Например, данные методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявлений симптомов онкологических заболеваний или расстройств, вызванных онкологическими заболеваниями, в том числе карциномами, саркомами, миеломами, лейкемиями, лимфомами и онкологическими заболеваниями смешанного типа (данный перечень не является исчерпывающим). В конкретном варианте осуществления изобретения подобные методы, являющиеся предметом изобретения, относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявлений симптомов рака яичника, рака шейки матки, рака матки, рака молочной железы или рака легких. В предпочтительном варианте осуществления изобретения подобные методы относятся к предотвращению возникновения, контролю, лечению и уменьшению интенсивности проявлений симптомов рака яичника.
В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение описывает метод лечения заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или уменьшения интенсивности проявления симптомов данного заболевания. Метод лечения заключается в проведении для пациента, нуждающегося в лечении, курса лечения антителами, фрагментами антител, связывающими антиген, синтетическими полипептидами или аналогами изобретения в количестве, достаточном для лечения заболеваний, связанных с пролиферацией клеток, либо для уменьшения интенсивности проявления симптомов указанных заболеваний. Заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, может быть, например, заболевание, связанное с пролиферацией клеток, такое как рак; к числу подобных заболеваний относятся, например, рак яичника, рак шейки матки, рак матки, рак молочной железы или рак легких. Данный вариант осуществления изобретения предпочтительно использовать в тех случаях, когда антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог изобретения конъюгируются с цитотоксическим агентом, применяемым при лечении заболеваний, связанных с пролиферацией клеток; подобные агенты указаны в разделе 5.2. В конкретном варианте осуществления изобретения цитотоксическим агентом является радиоизотоп. При дальнейшем развитии данного варианта осуществления изобретения радиоизотоп выбирается из группы, включающей в себя 1251,1311, ш1п, 99тТс апб 90Υ. Данный вариант осуществления изобретения можно применять как часть комбинированной терапии при онкологическом заболевании в сочетании, например, с лечением химиотерапевтическими средствами, такими как паклитаксель или цисплатин, либо лучевой терапией. Еще в одном варианте осуществления изобретения настоящее изобретение описывает метод предотвращения заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или проявления симптомов заболеваний, связанных с СА 125/0772Р. Этот метод включает в себя проведения для пациента, нуждающегося в лечении, курса лечения антителами, фрагментами антител, связывающими антиген, синтетическими полипептидами или аналогами изобретения в количестве, достаточном для предотвращения заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, или проявления симптомов указанных заболеваний. Заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, может быть, например, заболевание, связанное с пролиферацией клеток, такое как рак; к числу подобных заболеваний относятся, например, рак яичника, рак шейки матки, рак матки, рак молочной железы или рак легких.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак костей, например саркома Юинга, остеосаркома, рабдомиосаркома или другие виды саркомы мягких тканей.
Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является опухоль головного мозга, например олигодендроглиома, эпендимома, мененгиома, лимпома, невринома или гранулобластома. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак молочной железы, например карцинома из эпителия протоков ίη δίΐιι молочной железы. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак эндокринной системы, например надпочечников, поджелудочной железы, пара
- 36 011504 щитовидной железы, гипофиза или щитовидной железы. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак желудочно-кишечного тракта, например рак заднего прохода, прямой кишки, пищевода, желчного пузыря, желудка, печени, поджелудочной железы или тонкого кишечника. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак органов женской половой системы, например рак шейки матки, эндометрия, матки, фаллопиевой трубы, гестациозная трофобластическая опухоль, хориокарцинома, рак яичника, влагалища или наружных половых органов. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак головы и шеи, например гортани, ротоглотки, паращитовидной или щитовидной железы. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является лейкемия, например острый лимфолейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический лимфолейкоз, хронический миелогенный лейкоз, лейкоз ворсистых клеток или миелопролиферативные нарушения. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак легких, например мезотелиома, мелкоклеточный или крупноклеточный рак легкого. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является лимфома, например лимфома, вызванная ВИЧ-инфекцией, кожная лимфома Тклеток, хроническая или острая болезнь Ходжкина. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является метастатический рак. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является миелома, например множественная миелома. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является педиатрический рак, например опухоль головного мога, саркома Юинга, лейкемия (например, острый лимфолейкоз, острый миелогенный лейкоз), рак печени, лимфома (например, хроническая или острая болезнь Ходжкина), нейробластома, ретинобластома, саркома (например, остеосаркома, рабдомиосаркома или другие виды саркомы мягких тканей) или нефрома. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак мужского полового члена. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак простаты. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак кожи, например кожная лимфома Т-клеток, грибовидная гранулема, саркома Капоши или меланома. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является тестикулярный рак. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак щитовидной железы, например папиллярная карцинома, фолликулярная карцинома, медуллярная карцинома, недифференцированный мелкоклеточный рак или недифференцированная карцинома щитовидной железы. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является рак мочевыводящих путей, например мочевого пузыря, почки или уретры. Еще в одном варианте осуществления изобретения заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, или состоянием, вызванным онкологическим заболеванием, является атаксиятелеангиэктазия, карцинома неизвестного первичного происхождения, синдром Ли-Фраумени или тимома.
В одном из вариантов данных методов, являющихся предметом изобретения, для лечения применяется антитело или фрагмент антитела, связывающие антигены, которое является предметом изобретения. В другом варианте осуществления изобретения для лечения используется моноклональное антитело или фрагмент антитела, связывающие антигены. Как правило, в целях лечения антитело или фрагмент антитела, связывающие антигены, используются в дозах, обеспечивающих концентрацию примерно от 5 мкг/кг до примерно 10 мг/кг, более предпочтительно от примерно 20 мкг/кг до примерно 5 мг/кг и наиболее предпочтительно от примерно 100 мкг/кг до примерно 5 мг/кг веса тела пациента.
В общем случае методы, описываемые в настоящем документе, можно применять посредством применения фармацевтических составов, являющихся предметом изобретения. Токсичность и/или эффективность составов, применяемых в соответствии с конкретными применяемыми методами и графиками, которые являются частью настоящего изобретения, можно определить с помощью стандартных фармацевтических методик для клеточных культур или в ходе испытаний на подопытных животных, проводимых с целью, например, определения ЬП50 (доза, летальная для 50% популяции) и ΕΌ50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз, приводящих к летальному и терапевтическому эффекту, называется терапевтическим индексом и может быть представлено в виде отношения ΕΌ50/ΕΌ50. Предпочтительными являются терапевтические составы с более высокими терапевтическими индексами. Несмотря на то что возможно применение терапевтических составов, создающих побочные токсические эффекты, в подобных случаях желательно использовать способ введения лекарства, позволяющий доставить препарат непосредственно в пораженные ткани, например яичника, и тем самым снизить побочные эффекты.
Данные, полученные в результате анализа клеточных культур и проведения экспериментов на животных, используются для определения формул препаратов и доз для применения их при лечении людей. Наиболее предпочтительная дозировка препаратов в подобном случае ограничивается интервалом, обеспечивающим циркулирование концентраций, соответствующих ΕΌ50, практически при отсутствии токсичности. В пределах данного интервала дозы могут варьироваться в зависимости от применяемой ле
- 37 011504 карственной формы и способа введения лекарства. Первоначальную оценку терапевтически эффективной дозы для любого агента, используемого в методах, являющихся предметом изобретения, можно выполнить, используя результаты анализа клеточных культур. Нужную дозировку можно определить на моделях животных, чтобы обеспечить интервал концентрации при циркулировании в плазме, который включал бы в себя 1С50 (т.е. концентрацию компонента, обеспечивающую половинное по сравнению с максимальным ингибирование одного или нескольких симптомов), определенную в результате анализа клеточных культур, например анализа пролиферации. Данная информация может использоваться для более точного определения доз, используемых для лечения человека. Уровни содержания в плазме можно измерить, например методом высокоэффективной жидкофазной хроматографии.
Существуют различные системы доставки препаратов, которые можно применять при лечении антителами, фрагментами антител, связывающими антигены, синтетическими полипептидами или аналогами изобретения, например инкапсуляция в липосомы (см., например, Лангер, 8с1еисе 249(4976):15271533 (1990); Трит и др., в сборнике: Липосомы в терапии инфекционных и онкологических заболеваний, Лопец-Берештейн и др., ред., Ь188 (1989), с. 353-365), микрочастицы, микрокапсулы или рекомбинантные клетки, способные выражать антитела, фрагменты антител, связывающие антигены, синтетические полипептиды или аналоги изобретения.
Методы применения антител, фрагментов антител, связывающих антигены, синтетических полипептидов или аналогов изобретения либо фармацевтического состава, содержащего перечисленные выше вещества, включают в себя без ограничения парентеральное (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное введение), эпидуральное или через слизистую оболочку (например, интраназальное и пероральное) введение. См., например, патенты США № 5679377, 5702727, 5783193, 5817624, 6074689, 6156731, 6174529, 6187803, 6331175 и 6387406. В специфическом варианте осуществления изобретения антитела, фрагменты антител, связывающие антигены, синтетические полипептиды или аналоги изобретения, а также фармацевтические составы на их основе вводятся внутримышечно, внутривенно или поверхностно. Препараты могут применяться любым удобным способом, например путем вливания или инъекции ударной дозы вещества, рассасыванием через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, заднего прохода или желудочно-кишечного тракта и т.д.), а также могут вводиться одновременно с другими биологически активными веществами. Применение может быть системным или общим. Кроме того, может также использоваться введение через легкие, например, с помощью ингалятора или распылителя, если формула препарата содержит распыляющее средство. См., например, патенты США № ЯЕ37525, 5290540, 5855913, 5874064, 5934272, 5985309, 5985320, 6019968, 6165463, 6358530 и 6402733, а также публикацию РСТ \УО 99/66903; каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом. В одном варианте осуществления изобретения антитело, синтетический белок, конъюгированная молекула или фармацевтический состав могут вводиться с помощью зарегистрированной пульмональной технологии введения лекарственных средств А1кегте§ А1Я™ (А1кегте§, 1пс., Кэмбридж, Массачусетс).
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения фармацевтический состав формулируется в соответствии с принятыми методами, так что его можно использовать для внутривенного введения в организм человека. Как правило, фармацевтические составы для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буферном растворе. При необходимости состав может также включать в себя солюбилизирующий компонент и анестезирующее средство местного действия для облегчения боли в месте введения.
В другом специфическом варианте осуществления изобретения желательно применять фармацевтические составы, являющиеся предметом изобретения, в том месте, где они необходимы. Этого можно достигнуть путем местных вливаний, инъекций либо с помощью имплантата; последний может выполняться из пористого, непористого или желатинозного материала.
Еще в одном варианте осуществления изобретения применяемые методы являются частью комплексной терапии, например комплексной терапии онкологического заболевания. Подобная комплексная терапия при лечении онкологических заболеваний может включать в себя, например, применение химеотерапевтических средств, таких как цисплатин, ифосфамид, паклитаксель, таксаны, топоизомераный Ι ингибитор (например, СРТ-11, топотекан, 9-АС или 66-211), гемцитабин, митомицин, эмитин, этопсид, тенопсид, винкристин, розевин, колхицин, доксорубицин, дауномицин, диоксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, винорелбин, оксалиплатин, 5-фторурацил (5-РИ), лейковорен, темодал или таксол. Подобная комбинированная терапия онкологических заболеваний может дополнительно включать в себя лучевую терапию.
Применение термина комплексная терапия или комплексная терапия онкологических заболеваний не накладывает ограничений на порядок введения необходимых средств или препаратов лицу, страдающему заболеванием, связанным с СА 125/0772Р. Например, вещества, применяемые для комплексной терапии, могут вводиться одновременно, последовательно в любом порядке или периодически. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пациенту одновременно вводится два или более компонентов, входящих в комплексную терапию. Термин одновременно не означает введение двух или нескольких лекарств обязательно в один и тот же момент времени; он лишь означает, что препараты вво
- 38 011504 дятся последовательно в течение промежутка времени, когда они могут действовать одновременно, в результате чего достигается более эффективное действие этих препаратов по сравнению с введением их другим способом.
Средства, применяемые как часть комплексного терапевтического метода, могут, например, вводиться пациенту в одном и том же фармацевтическом составе. Эти же средства, применяемые как часть комплексного терапевтического метода, могут вводиться пациенту и в отдельных фармацевтических составах. При этом можно использовать как одинаковые, так и различные способы применения данных средств.
5.9. Методы диагностирования заболеваний, связанных с СА 125/0772Р.
Еще одной стороной настоящего изобретения является описание методов диагностирования заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, либо предрасположенности к заболеваниям, связанным с СА 125/0772Р. В одном из вариантов осуществления изобретения меченые антитела, фрагменты антител, связывающие антиген, синтетические полипептиды и аналоги изобретения могут применяться в диагностических целях, для обнаружения, диагностики или контроля заболеваний, связанных с СА 125/0772Р, например онкологических заболеваний.
Например, антитела, фрагменты антител, связывающие антиген, синтетические полипептиды и аналоги изобретения могут быть использованы для анализа уровней клеточного СА 125/0772Р биологического образца, в котором применяются классические иммуногистологические методы, например, описываемые в настоящем документе или широко известные специалистам (см., например, Ялканен и др., 1. Се11. Бю1. 101(3):976-984 (1985); Ялканен и др., 1. Се11. Βίο1. 105(6, часть 2):3087-3096 (1987)). К числу других методов, основанных на применении антител, которые позволяют обнаруживать экспрессию генов белков, относится иммуноанализ, например иммуносорбентный анализ связанного энзима (ЕЬ18А) или радиоиммунологический анализ (Я1А). Известны применяемые метки анализа антител, включающие в себя, например, метки энзимов, таких как щелочная фосфатаза, оксидаза глюкозы; радиоизотопы, такие как йод (1251,1311), углерод (14С), сера (358), тритий (3Н), индий (ш1п) и технеций (99тТс); люминсцентные метки, такие как люминол, и флюоресцентные, такие как флуоресцин и родамин.
Одним из аспектов изобретения является обнаружение и диагностика предрасположенности человека к онкологическим заболеваниям, в частности к раку яичника. В одном из вариантов осуществления изобретения диагностика включала в себя:
a) введение (например, парентерально, поверхностно или внутрибрюшинно) пациенту определенного количества меченого антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога, который избирательно связывает клеточный СА 125/0772Р; и
b) обнаружение меченого антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога в теле пациента для проведения упомянутой диагностики.
В соответствии с данным вариантом осуществления изобретения антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог избирательно отмечаются в изображаемой ткани и их присутствие можно определить с помощью стандартных средств визуализации. Фоновый уровень можно определять различными способами, в том числе сравнением обнаруженной меченой молекулы со стандартным значением, определенным ранее для конкретной системы.
Присутствие меченой молекулы в теле пациента можно определить с помощью стандартных методов сцинтиграфии ίη νίνο. Эти методы определяются применяемым типом метки. Опытные лаборанты могут самостоятельно выбрать наиболее подходящий метод обнаружения определенной метки. К числу методов, которые можно использовать в диагностических методах, являющихся предметом изобретения, относятся следующие методы (список не является исчерпывающим): компьютерная томография (СТ), сканирование тела пациента в целом, например, с помощью позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ), ядерно-спиновой томографии (МЯ1) или ультразвуковой эхографии.
В специфическом варианте осуществления изобретения молекула помечается радиоизотопом и ее присутствие в теле пациента обнаруживается с помощью сканирующего инструмента с ответным ионизирующим излучением (см., например, патент США № 5441050). В другом варианте осуществления изобретения молекула помечается флуоресцентным веществом, которое затем обнаруживается в теле пациента с помощью сканирующего инструмента с ответным флуоренсцентным излучением. Еще в одном варианте осуществления изобретения молекула помечается позитронно-активным металлом и затем обнаруживается в теле поциента с помощью РЕТ. Еще в одном варианте осуществления изобретения молекула помечается парамагнитной меткой и обнаруживается методом МЯ1.
Очевидно, что тип и размер функциональной группы, дающей изображение, которое необходимо для получения необходимых диагностических изображений, будут определяться как размером и весом пациента, так и типом используемой системы получения изображения. В случае применения функцио99т нальной группы радиоизотопа, содержащей Тс, для исследований тела человека нормальный диапазон составляет примерно от 5 до 20 мкюри. Меченое антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог будут затем избирательно накапливаться в местах нахождения клеток, которые демонстрируют клеточный полипептид СА 125/0772Р. Изображение опухоли ίη νίνο описано в работе Буршеля и др., Иммунофармакокинетика антител, имеющих радиоактивную метку, и
- 39 011504 их фрагментов, в сборнике: Изображения опухолей: Радиохимические методы обнаружения рака, Буршеля и др. ред. Майкоп РиЬБкЫпд 1пс. (1982), глава 13.
В зависимости от ряда переменных, таких как тип используемой метки и способ введения препарата, промежуток времени между введением препарата и обнаружением меченых молекул, избирательно сконцентрированных в определенных местах тела пациента, а также для снижения несвязанных меченых молекул до фонового уровня может потребоваться примерно от 6 до 48 ч, или от 6 до 24 ч, или от 6 до 12 ч. В другом варианте осуществления изобретения промежуток времени после введения составляет примерно от 5 до 20 дней либо от 5 до 10 дней.
В одном из вариантов осуществления изобретения контроль заболевания, связанного с СА 125/0772Р, например рака, может выполняться методом визуализации несколько раз, например через один месяц после первоначальной диагностики, через шесть месяцев после первоначальной диагностики и/или через один год после первоначальной диагностики и т.д.
Предмет изобретения содержит методы диагностирования или контроля рака, заключающиеся во введении пациенту, нуждающемуся в подобной диагностике или контроле, меченого антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога, избирательно связывающих клеточный СА 125/0772Р, в количестве, достаточном для обнаружения, и обнаружение меченого антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога в органе или ткани пациента. Далее, настоящее изобретение описывает методы обнаружения клеточного СА 125/0772Р в биологическом образце, имевшем контакт с меченым антителом, фрагментом антитела, связывающего антиген, синтетическим полипептидом или аналогом, которые избирательно связывают клеточный СА 125/0772Р, а также обнаружение антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога, связанных в образце.
В данных вариантах осуществления изобретения количество меченых молекул, связываемых с клеточным СА 125/0772Р, может затем сравниваться со стандартным значением или с количеством, ранее наблюдавшимся у пациента в более ранее время.
5.10. Методы получения антител.
Антитела, являющиеся предметом изобретения, можно получать любым известным способом синтеза антител, например, используя технологию гибридомы, метод химического синтеза или, что более предпочтительно, методы рекомбинантной экспрессии генов.
Поликлональные антитела можно получать любыми известными способами. Например, человеческий СА 125/0772Р, содержащий клеточный полипептид СА 125/0772Р, можно вводить различным животным-хозяевам, в том числе кроликам, мышам, крысам и лошадям, вызывая образование содержащих серозную жидкость поликлональных антител, специфических для антигена человека. Для усиления иммунологической реакции можно использовать различные адъюванты, в зависимости от видов-хозяев, в том числе, не ограничиваясь ниже перечисленными, адъюванты Фрейнда (полные или неполные), минеральные гели, например гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы ПАВ для РУО, инвертные эмульсии и газообразные системы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, собственные удерживающие гемоцианины, а также потенциально применимые адъюванты человека, такие как бактерия Кальметта-Гверина и СогупеЬас1егшт рагуит. Подобные адъюванты также широко известны.
Моноклональные антитела можно получать, используя различные известные методы, в том числе используя гибридомы, рекомбинанты и методы индикации бактериофагов, а также комбинации перечисленных методов. Например, моноклональные антитела можно получать, применяя технологии гибридомы, в том числе те, что были описаны в работе Харлоу и др., Антитела: лабораторное руководство, 2-е изд., Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк (1988) или Хаммерлинга и др., Моноклональные антитела и гибридомы Т-клеток, Е15е\зег (1981), с. 563-681; каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом.
Методы получения и скрининга специфических антител с помощью технологии гибридомы являются стандартными и широко применяются. Можно привести краткое описание одного из примеров, когда мыши иммунизируются полипептидом СА 125/0772Р, например клеточным полипептидом СА 125/0772Р, и после обнаружения иммунной реакции в серозной жидкости мышей, например антител, специфичных к антигену, у мышей изымается селезенка и выделяются спленоциты. Затем спленоциты встраиваются с помощью хорошо известных методик в любые подходящие клетки миеломы, например клетки клеточной линии 8Р2/0-Ад14, полученные из АТСС (добавление № СКЕ-1581). Гибридомы выбираются и клонируются путем ограничения разбавления. Клоны гибридом затем анализируются известными методами на наличие клеток, содержащих антитела, способные связывать клеточный СА 125/0772Р. Жидкость перитонеального выпота, которая, как правило, содержит высокие уровни антител, можно получить, вводя мышам положительные клоны гибридомы.
Соответственно, настоящее изобретение описывает методы получения моноклональных антител, а также антител, получаемых подобными методами, включающими в себя культивирование выработки клеткой гибридомы антитела, являющегося предметом изобретения, тогда как предпочтительно гибридома образуется в результате встраивания спленоцитов, выделенных у мыши, иммунизированной поли
- 40 011504 пептидом 125/0772Р, например клеточным полипептидом СА 125/0772Р, в клетки миеломы и затем скрининг гибридом, полученных в результате слияния с клонами гибридомы, производящими антитела, способные связываться с полипептидом СА 125/0772Р, например с клеточным полипептидом СА 125/0772Р.
Фрагменты антител, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены любым известным способом. Например, фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 предмета изобретения могут быть получены протеолитическим гидролизом молекул иммуноглобулина с использованием энзимов, таких как папаин (для получения фрагментов ЕаЬ) или пепсин (для получения фрагментов Е(аЬ')2). Фрагменты Е(аЬ')2 содержат переменный участок, константный участок легкой цепи и домен СН1 тяжелой цепи. Далее, антитела, являющиеся предметом настоящего изобретения, можно также получать, используя различные известные методы изображения бактериофагов.
При использовании методов отображения бактериофагов функциональные домены антител отображаются на поверхности частиц бактериофагов, которые содержат кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Бактериофаг, выражающий домен, связывающий антиген, который связывается с антигеном полипептида СА 125/0772Р, можно выбрать или идентифицировать с помощью антигена, например, используя меченый антиген или антиген, связанный или поглощенный твердой поверхностью или зерном. К примерам метода отображения бактериофагов, которые можно изменить соответствующим образом, чтобы получить или идентифицировать антитела, являющиеся предметом изобретения, относятся методы, описанные в работах Бринкманна и др., 1. 1ттипо1. Мебюбк. 182(0:41-50 (1995); Эймса и др., 1. 1ттипо1. Мебюбк. 184(2): 177-186 (1995); Кеттельборо и др., Еиг. 1. 1ттипо1. 24(4):952-958 (1994); Персика и др., 6епе. 187(14:9-18 (1997); Бартона и др., Α6ν. 1ттипо1. 57:191-280 (1994); в публикации РСТ АО 91/10737 АО 95/15982; ЕР 853661, а также в патентах США № 5223409, 5403484, 5427908, 5516637, 5571698, 5580717, 5658727, 5667988, 5698426, 5712089, 5733743, 5780225, 5789208, 5821047, 5885793, 5969108, 6096551, 6140470, 6376170, 6265150 и 6335163; каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом.
Как описано в перечисленных выше работах, указанных для справки, после выбора бактериофага можно выделить из него участки, кодирующие антитело, которые затем используют для получения целых антител, в том числе антител человека, либо требуемых фрагментов, связывающих антиген, и выразить в клетках хозяев, в том числе в клетках приматов, животных, растений, дрожжей и бактерий, например, как описано ниже. Методики рекомбинантного получения фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2 можно также использовать, применяя известные методы, например, те, что описаны в патентах США № 5595898, 5698417 и 6204023; работах Муллинакса и др., Биотехнологии, 12(6):864-869 (1992); Савай и др., Ат. 1. Кергоб. 1ттипо1. 34(1):26-34 (1995); а также Беттера и др., 8с1епсе. 240(4855): 1041-1043 (1988); каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом.
Для получения целых антител можно использовать затравки РСК, в том числе последовательности нуклеотидов УН или УЪ, ограниченный участок и фланговые последовательности для защиты ограниченного участка, для того чтобы усилить последовательности УН или УЪ в клонах ксЕ,,. Применяя стандартные методики клонирования, можно клонировать РСК-усиленные домены УН в векторы, выражающие константный участок УН, а РСК-усиленные домены УЪ - в векторы, выражающие константный участок УЪ, например, человеческие к- или λ-константные участки. Векторы, представляющие домены УН или УЪ, предпочтительно должны включать в себя ЕЕ-1а стимулятор, сигнал секрета, участок клонирования для переменного домена, константные домены, а также маркер выбора, например неомицин. Домены УН и УЪ могут также быть клонированы в один вектор, представляющий необходимые константные участки. Векторы, представляющие тяжелые цепи, и векторы, представляющие легкие цепи, затем взаимно трансфицируются в клеточные линии для получения стабильных или переходных клеточных линий, представляющих антитела полной длины, например 1д6, в результате применения известных методик.
В некоторых случаях, в частности, при использовании антител ΐη νί\Ό в организме человека и анализе с целью обнаружения, проводимом ίη νίνΌ, более предпочтительным бывает использование химерных, очеловеченных или полностью человеческих антител. Химерное антитело - это молекула, у которой различные участки антитела происходят от молекул иммуноглобулинов различных видов. В качестве примера, не являющегося исчерпывающим, можно привести химерное антитело, которое может иметь переменные участки легких и/или тяжелых цепей, полученные из мышиного антитела, а также константные участки легких и/или тяжелых цепей, полученные из человеческого иммуноглобулина. Методы получения химерных антител широко известны. См., например, работы Моррисона, 8с1епсе. 229(4719): 1202-1207 (1985); Ой и др., ВюТес11пк|ие8. 4(31):214-221 (1986); Джиллеса и др., 1. 1ттипо1. МеЛобк. 125(1-2), 191-202 (1989); а также патенты США № 4816397, 4816567 и 5807715, каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом.
Очеловеченное антитело - это антитело, которое содержит человеческую основу, в том числе человеческий константный участок, а также одну или несколько СОК из антитела других видов, например мышиных. Подобные очеловеченные антитела получают стандартными методами, используя различные
- 41 011504 широко известные технологии, например СОК-трансплантацию (ЕР 239400; публикация РСТ АО 91/09967; а также патенты США № 5225539, 5530101, 5585089, 5766886, 5859205, 6180370 и 6407213), маскирование или возобновление покрытия (патент США № 5639641; ЕР 519596; Падлан, Молекулярная иммунология, 28(4/5):489-498 (1991); Студничка и др., Белковая инженерия, 7(6):805814 (1994); а также Рогуска и др., Ргос. №аб. Асаб. 8ск И8А. 91(3):969-973 (1994)) и линейное соединение двух или более клеток (патенты США № 5565332 и 6455253). В предпочтительном варианте изобретения очеловеченные антитела включают в себя СОК, содержащую одну из аминокислотных последовательностей СОК, перечисленных в табл. 1-6, а также участки человеческой основы. Часто остатки основы на участках основы замещаются соответствующими остатками из антитела донора СОК, изменяя, предпочтительно улучшая, связывание антигена. Подобные замещения основы определяются хорошо известными методами, например моделирование взаимодействий СОК и остатков основы для идентификации остатков основы, важных для связывания антигена, а также сравнение последовательности для выявления необычных остатков основы, находящихся в определенных позициях. См., например, патенты США № 5585089, 5770196 и 5869619; а также работу Рейхманна и др., №а!иге. 332(6162):323-327 (1988), каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом. Полностью человеческие антитела требуются для терапевтического лечения людей. Человеческие антитела можно получать различными известными способами, в том числе методами отображения бактериофагов, описанными выше, с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей человеческих иммуноглобулинов. См. также патенты США № 4444887, 4716111, 5916771, 5939598, 6075181, 6,114,598, 6150584, 6162963, 6235883; публикацию РСТ АО 98/46645; и ЕР 463151; каждая из этих работ указана в данном документе для ссылки на работу в целом. Человеческие антитела можно также получить, используя трансгенных мышей, которые не способны выражать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут обнаруживать гены человеческих иммуноглобулинов. Например, генные комплексы человеческих иммуноглобулинов с легкими и тяжелыми цепями могут быть введены произвольно или посредством гомологичной рекомбинации в зародышевые стволовые клетки мышей. Или же человеческий переменный участок, константный участок и разнородный участок можно ввести в зародышевые стволовые клетки мышей дополнительно к человеческим генам легких и тяжелых цепей. Мышиные гены иммуноглобулина тяжелых и легких цепей могут оказаться нефункциональными отдельно или одновременно с введением участка человеческого иммуноглобулина посредством гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготное удаление участка ΙΗ предотвращает производство эндогенных антител. Модифицированные зародышевые клетки разрастаются и микроинъецируются в бластоциты, приводя к появлению химерных мышей. Химерные мыши затем произодят гомозиготное потомство, вырабатывающее человеческие антитела. Трансгенные мыши иммунизированы обычным способом к отдельному антигену, например к части или целому полипептиду СА 125/0772Р, например клеточному полипептиду СА 125/0772Р. Моноклональные антитела, направленные против антигена, можно получить от иммунизированных трансгенных мышей, используя стандартную гибридомную технологию. Трансгены человеческого иммуноглобулина, сохраняемые трансгенными мышами, перегруппируются во время клеточной дифференцировки В и впоследствие подвергаются изменению класса и соматической мутации. Таким образом, используя данную методику, можно производить применяемые в терапевтических целях антитела 1д6, 1дА, 1дМ и 1дЕ. Описание применения данной технологии для производства человеческих антител можно найти в работе Лонберга и др., Ιηΐ. Кеу. 1ттипо1. 13(1):65-93 (1995). Подробное обсуждение данной технологии для получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител, а также протоколы получения подобных антител см., например, патенты США № 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318, 5939598, 6075181, 6091001, 6114598, 6150584 и 6162963, которые указаны в данном документе для ссылки на работу в целом. Кроме того, к производству человеческих антител, направленных против определенного антигена, используя технологию, схожую с той, что описана выше, могут быть привлечены такие компании, как АЬдешх, 1пс. (Фремонт, Калифорния) и бепрйатт (Сан-Хосе, Калифорния).
Полностью человеческие антитела, которые распознают отдельный эпитоп, могут быть получены с помощью метода, называемого направленный выбор. При использовании данного подхода отдельное нечеловеческое моноклональное антитело, например антитело мыши, используется для руководства выбором полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп. См., например, работу Джеспера и др., Вю/Тесйпо1о§у. 12(4):899-903(1994).
Далее, антитела, специфически связывающиеся в антигеном, могут, в свою очередь, использоваться для получения антиидиотипических антител, которые имитируют антиген, используя известные и широкораспространенные методики, и, таким образом, можно получить антиидиотипические антитела, которые связываются с антигеном. См., например, работы Гринспана и др., РА8ЕВ 1. 7(5):437-444 (1993) и Нисонов, 1. 1ттипо1. 147(8):2429-2438 (1991).
- 42 011504
5.11. Рекомбинантная экспрессия антител и полипептидов.
Рекомбинантная экспрессия антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога, избирательно связывающего клеточный СА 125/0772Р, может быть получена в результате использования вектора экспрессии, состоящего из полинуклеотида, который кодирует антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог, являющиеся предметом изобретения. После того как будет получен полинуклеотид, кодирующий антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог, являющиеся предметом изобретения, можно получить вектор для производства антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога, являющегося предметом изобретения, с помощью широко известной технологии рекомбинантной ДНК. См., например, патенты США № 4816567, 5545405 и 6331415, которые указаны в данном документе для ссылки на работу в целом.
Для получения векторов экспрессии, содержащих кодовые последовательности антител, фрагментов антитела, связывающих антиген, синтетических полипептидов или аналогов и соответствующих сигналов трансляционного контроля, используются широко известные методы. К этим методам относятся, например, методики рекомбинантных ДНК ίη ν 11го, комбинированные методики, а также генетическая рекомбинация ίη νίνο. Таким образом, изобретение описывает воспроизводимые векторы, включающие в себя последовательность нуклеотидов, которая кодирует антитело, являющееся предметом изобретения, фрагмент антитела, связывающего антиген, являющийся предметом изобретения, синтетический полипептид, являющийся предметом изобретения, или аналог предмета изобретения, тяжелую или легкую цепь антитела или его части либо тяжелую или легкую цепь СОК, имеющую рабочую связь со стимулятором. Подобные векторы могут также включать в себя последовательность нуклеотидов, кодирующую константный участок молекулы антитела (см., например, ЕР 216846, ЕР 323997 и патент США № 5122464), а переменный домен антитела может быть клонирован в подобный вектор для выражения тяжелой цепи в целом, легкой цепи в целом либо как легкой, так и тяжелой цепей в целом.
Вектор экспрессии передается клетке-хозяину обычными способами, а трансформированные или трансфицированные - традиционными методами при условиях, которые способствуют или разрешают получение антител, фрагментов антител, связывающих антиген, синтетических полипептидов или аналогов изобретения. Таким образом, предмет изобретения включает в себя ячейки-хозяева, содержащие вектор или полинуклеотид, кодирующий антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог изобретения или его фрагмент, либо его тяжелую или легкую цепь, либо отдельную цепь антитела, являющегося предметом изобретения, молекула полинуклеотида которой имеет рабочую связь с гетерологичным стимулятором. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения для экспрессии антител с двойными цепями в клетку-хозяина может производиться одновременная экспрессия векторов, кодирующих как легкую, так и тяжелую цепь, для выражения молекулы иммуноглобулина в целом, как подробно описано ниже.
Для выражения антител, фрагментов антител, связывающих антиген, синтетических полипептидов или аналогов изобретения (см., например, патент США № 5807715) могут использоваться разнообразные системы векторов экспрессии хозяина. Подобные системы экспрессии хозяина представляют собой средства, при помощи которых можно получить и впоследствии выделить требуемые кодовые последовательности, которые могут, будучи трансформированными или трансфицированными соответствующими нуклеотидными кодовыми последовательностями, выражать антитела, фрагменты антител, связывающих антиген, синтетические полипептиды или аналоги изобретения ίη κίΐιι. К подобным системам относятся, не ограничиваясь перечисленным ниже, микроорганизмы, например бактерии (такие как Е.со11 или В.киЬйШк), трансформированные векторами экспрессии рекомбинантной ДНК бактериофага, ДНК плазмида или ДНК космида, содержащими антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналогичную кодовую последовательность; дрожжи (например, 8ассйаготусек сег\'Ыае. РюЫарайопк или РюЫа таейапойса), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналогичную кодовую последовательность; клеточные системы насекомых, трансфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, бакуловирусным вектором), содержащими антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналогичную кодовую последовательность; клеточные системы растений, трансфицированные рекомбинантными векторами экспрессии вирусов (например, мозаичным вирусом цветной капусты, СаМУ; вирусом табачной мозаики или ТМУ) или трансформированные рекомбинантными веркторами экспрессии плазмидов (например, Т1 плазмида), содержащими антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналогичную кодовую последовательность; либо клеточные системы млекопитающих (например, клетки СО8, СНО, ВНК, 293, N80 или 3Т3), собирающие конструкции экспрессии рекомбинант, содержащие стимуляторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, металлотионеиновый стимулятор) или из вирусов млекопитающих (например, поздний стимулятор аденовируса или стимулятор 7,5К вируса коровьей оспы). Предпочтительно для экспрессии молекулы антитела рекомбинанта используются клетки бактерий, таких как ЕксйепсЫа со11, либо, что более предпочтительно, эукариотические клетки, особенно для экспрессии молекулы антитела рекомбинанта в целом. Клетки
- 43 011504 млекопитающих, например клетки яичника китайского хомяка (СНО), вместе с вектором, таким как, например, главный промежуточный элемент раннего стимулятора гена, полученный из вируса цитомегалии человека, представляют собой эффективную систему экспрессии для антител (Фекинг и др., Сепе. 45(1):101-105 (1986), а также Кокетт и др., Вю/ТесЬпо1оду. 8(7):662-667 (1990)). В определенном варианте осуществления изобретения экспрессия последовательности нуклеотидов, кодирующих антитела, фрагменты антител, связывающие антиген, синтетические полипептиды или аналоги изобретения регулируются конститутивным стимулятором, индуцибельным стимулятором, стимулятором, зависящим от типа клетки или ткани.
В бактериальных системах ряд векторов экспрессии следует выбирать преимущественно в зависимости от предполагаемого применения выражаемого антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептида или аналога. Например, в тех случаях, когда будет производиться большое количество подобного белка, например при производстве фармацевтических составов, включающих в себя молекулы антител, наиболее желательными могут оказаться векторы, которые руководят экспрессией высоких уровней легко очищаемых белковых продуктов. К подобным векторам относятся, не ограничиваясь перечисленным ниже, вектор экспрессии Е.со11 рИВ278 (Рутер и др., ЕМВО 1. 2(10): 1791-1794 (1983)), в котором кодовая последовательность антитела может быть лигирована индивидуально в вектор основы с кодовым участком 1ас2, так что в результате получается синтетический белок; векторы рГЫ (Иноуи и др., Остатки нуклеиновых кислот. 13(9):3101-3110 (1985); Ван Хике и др., 1. Вю1. СНет. 264(10):8803-8809 (1989)) и др. Векторы рСЕХ также могут использоваться для экспрессии посторонних полипептидов как синтетических белков с 5-трансферазой глютатиона (С8Т) (Хейкс и др., Апа1. ВюсНет. 202(2):293-298 (1992)). В целом, подобные синтетические белки являются растворимыми и могут быть легко выделены из клеток, подвергающихся лизису, путем абсорбции и связывания с матричными зернами агарозы глютатиона в результате элюирования в присутствии свободного глютатиона. Векторы рСЕХ предназначены для учета тромбина или коэффициента Ха в местах лизиса протеазы, так что можно получить клонированный заданный генный продукт из функциональной группы С8Т.
В системе насекомых в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов используется вирус нуклеарного полигедрозиса АнЮдгарНа (АсХРУ). Вирус развивается в клетках 8ройор1ега Ггид|регйа. Кодовая последовательность антитела может быть клонирована отдельно в несущественные участки (например, ген полигедрина) вируса и размещена под контролем стимулятора АсХРУ (например, стимулятора полигедрина). См., например, работу Кумара и др., Вюкск Вер. 19(3):227-234 (1999).
В клетках-хозяевах млекопитающих могут использоваться различные, основанные на вирусах системы экспрессии. Если в качестве вектора экспрессии используется аденовирус, кодовая последовательность антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, синтетического полипептид или аналога может быть лигирована в контрольный комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, например запаздывающий стимулятор и тройную ведущую последовательность. Данный химерный ген может затем быть вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации ш νίΙΐΌ или ш у1уо. Вставка в несущественный участок генома вируса (например, участок Е1 или Е3) приводит к появлению жизнеспособного рекомбинантного вируса, который способен выражать инфицированные клетки-хозяина молекулы антитела (см., например., работу Логана и др., Ргос. Хай. Асай. 8с1. И8А. 81(12):3655-3659 (1984)). Для эффективной трансляции вставляемых кодовых последовательностей могут также потребоваться специфические сигналы инициации. Данные сигналы включают в себя инициирующий кодон АТС и соседние последовательности. Кроме того, инициирующий кодон должен находиться в структуре вместе с читающей структурой нужной кодовой последовательности, чтобы обеспечить трансляцию всего вставляемого участка. Подобные экзогенные транслирующие управляющие сигналы и инициирующие кодоны могут происходить из различных источников: как естественных, так и синтетических. Эффективность экспрессии можно повысить, включая соответствующие элементы энхансеров транскрипции, терминаторы транскрипции и т.д. (см., например, работу Биттера и др., Методы энзимологии, 153:516-544 (1987)).
Дополнительно можно использовать фильтр ячеек-хозяев, который модулирует экспрессию вставляемых последовательностей либо модифицирует и обрабатывает генный продукт специфическим требуемым образом. Подобные модификации (например, гликозилирование) и обработка (например, гидролиз) белковых материалов могут быть важными для функции белка. Различные клетки-хозяева обладают характеристиками и специфическими механизмами посттрансляционной обработки и модификации белков и генных материалов. Можно выбрать клеточные линии или системы хозяев, необходимые для обеспечения надлежащей модификации и обработки выражаемых чужеродных белков. С этой целью могут использоваться эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточным механизмом, который позволяет надлежащим образом обрабатывать первичный транскрипт, выполнять гликолизирование и фосфорилирование генного материала. К подобным клеткам-хозяевам (млекопитающих) относятся, не ограничиваясь перечисленным ниже, клетки СНО, УЕВО, ВНК, Не1а, СО8, МОСК, 293, 3Т3, ^138, ВТ483, Н§578Т, НТВ2, ВТ20 и Τ47Ό, Х8О (клеточная линия миеломы мышиных, которая не приводит к эндогенному образованию каких-либо цепей иммуноглобулинов), СВЕ7О3О и Н5878В51.
- 44 011504
Для длительного и высокопроизводительного получения рекомбинантных белков предпочтительной является стабильная экспрессия белков. Например, могут быть созданы клеточные линии, стабильно выражающие молекулу антитела. Вместо того чтобы использовать векторы экспрессии, содержащие источники реплицируемых вирусов, могут быть трансформированы клетки хозяев под ДНК-контролем со стороны соответствующих элементов, управляющих экспрессией (например, последовательностей стимуляторов, последовательностей энхансеров, терминаторов транскрипций, сайтов аденилации и т. д.), а также выбираемого маркера. После введения чужеродной ДНК необходимо выращивать создаваемые клетки в течение 1-2 дней в обогащенной среде и затем перенести их в селективную среду. Выбираемый маркер в рекомбинантном плазмиде придает стойкость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмид в свои хромосомы и расти, образовывая очаг, который, в свою очередь, может быть клонирован и встроен в клеточные линии. Данный метод преимущественно используют для получения клеточных линий, стабильно выражающих молекулу антитела.
Можно использовать различные системы селекции, в том числе, не ограничиваясь перечисленным ниже, гены тимидинкиназы вируса герпетической лихорадки (Виглер и др., Се11. 11(1):223-232 (1977)), фосфорибосилтрансферазы аминооксипурина (Спринг и др., ВюсЫт. ВюрБуз. Ас!а. 2118(2):158-162 (1994)) и фосфорибосилтрансферазы аденина (Лоуи и др., Се11. 22(3):817-823 (1980)), которые можно использовать, соответственно, в клетках !к-, Бдрй- или арй-. Кроме того, стойкость к антиметаболитам можно использовать как основу для селекции следующих генов: ДЫг, который придает стойкость к метотрексату (Виглер и др., Ргос. №111. АсаД. 8с1. И8А. 77(6):3567-3570 (1980); О'Наге е! а1., Ргос. №И1. АсаД. 8с1. И8А. 78(3): 1527-1531 (1981)); др!, который придает стойкость к микофенолкислоте (Муллиган и др., Ргос. №111. АсаД. δα. И8А. 78(4):2072-2076 (1981)); пео, который придает стойкость к аминогликозиду 6-418 (Ву и др., Биотерапия. 3(1):87-95 (1991); Толстошев, Ежегодный обзор фармацевтической токсикологии. 33:573-596 (1993); Муллиган, 8аепсе. 260(5110):926-932 (1993) и Морган и др., Ежегодный биохимический обзор. 62:191-217 (1993)); и Будто, который придает стойкость к гидромицину (Сантерре и др., Ген 30(1-3):147-156 (1984)). Для выбора требуемого рекомбинантного клона можно использовать известные методы технологии рекомбинантной ДНК; подобные методы, например, описаны в Современных трудах по молекулярной биологии, работах Аусубеля и др., ред., 1оЬп \УПеу&8оп5 (1989-2002); Криглера, Передача и экспрессия генов, лабораторное руководство, 8ЮскЮп Ргезз (1990); главы 12 и 13 Современных трудов по генетике человека, Дракополи и др., ред., 1оЬп ^11еу&8опз (1994) и КольбераГарапина и др., 1. Мо1. Вю1. 150(1):1-14 (1981), которые указаны в данном документе для ссылки на работу в целом.
Уровни экспрессии антитела, фрагмента антитела, связывающего антиген, или молекулы синтетического полипептида можно повысить за счет амплификации вектора (подробности см. работу Беббингтона и др., Применение векторов, основанных на амплификации гена, для экспрессии клонированных генов в клетки млекопитающих при клонировании ДНК, Том 3, АсаДетю Ргезз (1987)). Если маркер в векторной системе, выражающей антитело, является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет приводить к повышению числа копий маркерного гена. Поскольку амплифицируемый участок связан с геном антитела, количество вырабатываемого антитела также будет повышаться (Круз и др., Мо1. Се11. Вю1. 3(2):257-266(1983)).
Клетка хозяина может котрансфицироваться двумя векторами экспрессии, являющимися предметом изобретения; первый вектор кодирует полипептид, производимый тяжелой цепью, а второй вектор кодирует полипептид, производимый легкой цепью. Два вектора могут содержать идентичные выбираемые маркеры, которые разрешают в равной степени экспрессию полипептидов как легкой, так и тяжелой цепей. Кроме того, можно использовать отдельный вектор, который кодирует и способен выражать полипептиды как тяжелой, так и легкой цепей. В подобных ситуациях легкая цепь должна по возможности размещаться перед тяжелой цепью, чтобы не допустить избытка тяжелой цепи, не содержащей токсинов (Праудфут, Ыа!иге. 322(6079):562-565 (1986) и Кохлер, Ргос. Ыа!1. АсаД. δα. И8А. 77(4):2197-2199 (1980)). Кодовые последовательности для тяжелой и легкой цепей могут включать в себя сДНК, геномную ДНК или их комбинацию.
После того как антитело, фрагмент антитела, связывающего антиген, синтетический полипептид или аналог изобретения будут получены методом рекомбинантной экспрессии, их следует очистить любым способом, применяемым для выделения молекул иммуноглобулинов, например с помощью хроматографии (например, ионообменной, сходства, в частности для определения сходства со специфическим антигеном СА 125/0772Р после начального выделения белка А, а также колоночной хроматографии для определения размера), центрифугирования, дифференциальной растворяемости либо при помощи любого другого стандартного способа выделения белков. Кроме того, антитела, являющиеся предметом настоящего изобретения, или фрагменты данных антител можно синтезировать для получения гетерологичных последовательностей полипептидов, описанных в настоящем документе, или использовать другим известным способом для облегчения выделения.
- 45 011504
Примеры ниже приведены только для иллюстрации, а не в качестве ограничения объема изобретения.
6. Примеры.
Результаты, содержащиеся в настоящем документе, показывают, что внеклеточная часть СА 125/0772Р остается в клеточной форме после высвобождения части полипептида СА 125/0772Р ро1урерНбе в виде культивируемого СА 125/0772Р. В частности, присутствие клеточного СА 125/0772Р подтверждается успешной генерацией и определением характеристик нескольких антител, избирательно связывающих клеточные виды в сравнении с культивируемыми видами СА 125/0772Р. Кроме избирательного связывания, представленные в данном документе результаты описывают антитела, которые демонстрируют высокую степень специфичности к СА 12510112Р и сходство с антигеном клеточного СА 125/0772Р. Далее, результаты, содержащиеся в настоящем документе, показывают, что подобные антитела могут выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток.
6.1. Генерация антител.
Эксперименты, проводимые в настоящем документе, описывают генерацию антител, действие которых направлено против внеклеточной части СА 125/0772Р. Как будет показано в последующих пунктах, к числу антител, генерируемых подобными методами, относятся антитела, специфичные к СА 125/0772Р, избирательно связывающие клеточный СА 125/0772Р, демонстрирующие высокую степень сходства с клеточным СА 125/0772Р и способные выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток.
Антиген и компоненты, выражающие антиген.
Компоненты экспрессии были получены для выражения антигена СА 125/0772Р, применяемого для выработки антител. Первый антиген, обозначаемый как 0772Р с тремя повторениями (фиг. 1; последовательность № 1), должен выражаться, включая наиболее карбоксильные из трех двойных повторений внеклеточного домена СА 125/0772Р, вплоть до трансмембранной последовательности СА 125/0772Р, не включая, однако, эту последовательность. Второй антиген, обозначаемый как 0772Р с тремя повторениями ТМ (фиг. 2; последовательность № 2), должен выражаться, включая наиболее карбоксильные из трех двойных повторений внеклеточного домена СА 125/0772Р, а также трансмембранную и эндоплазматическую последовательность, изображенную на фиг. 2. В частности, последовательности, кодирующие каждый из антигенов, были субклонированы в векторы р8есТад2В (шуйгодеп). Вектор кодирует последовательность сигналов 1дк для секреции, а также метки тус и 6хЫ§ для обнаружения и выделения выраженных белков.
Экспрессия антигена.
Рекомбинантный антиген был произведен временно трансфицированными клетками суспензии СНО-К1 с добавлением компонентов, описанных выше. В качестве среды для трансфицирования использовали РгоСНО СЭМ (Вю\У1Ш1акег 1пс., Уокервилль, Мэриленд) с добавками С8 (1ЯН Вюкшепсек Ьепеха, Канзас). Для получения 1 л материала 2 мг реагента для трансфицирования С1опГес1юп™ (С1оп1есй, Пало Альто, Калифорния) было регидратировано, разбавлено в 24 мл среды для трансфицирования и выдержано в течение 15 мин при добавлении 125 мкг ДНК в ту же самую среду. Смесь для трансфицирования была добавлена к 450 мл среды для трансфицирования, содержащей 1,25 х109 клеток суспензии СНО-К1, и выдерживания в течение 4 ч при температуре 37°С на орбитальном встряхивающем столике. После выдерживания 500 мл РгоСНО 4-СОМ с добавками С8, пенициллин-стрептомицином и 10% сверхнизкого 1дС РВ8 (ЫГе ТесЬпо1од1е8, Роквилль, Мэриленд) было добавлено к трансфицированным клеткам и культура была помещена во вращающиеся колбы. Отбор проб производился на 3-й день, культуры были готовы на 7-й день.
Выделение антигена.
Из трансфицирующего супернатанта был получен концентрат в объеме 250 мл с помощью системы М1Шроге РеШсоп с перекрывающей мембраной 50К. 2 мл смолы Та1оп (С1оп1есй, Пало-Альто, Калифорния), взятой из набора реактивов выделения ТА^ОN (№ по каталогу К1253-1), было помещено в лабораторную колонку объемом 2 мл и промыто 20 мл промывочного/экстрагирующего буферного раствора IX (поставляется в комплекте, рН 7,0). Затем образец концентрата загружали в лабораторную колонку со скоростью потока 1 мл/мин. Затем колонку промыли 15 мл экстрагирующего/промывочного буферного раствора. Связанный белок затем был элюирован 4x1 мл буферного раствора для элюирования (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ №С1, 150 мМ имидизола, рН 7,0). 0,5 мл фракций отбирали и анализировали методом 808-РАСЕ, а также визуализировали с помощью ярко-синего Гумасси С-250. Фракции, содержащие 0772Р с тремя повторения рекомбинантного белка, подверглись дальнейшему выделению методом хроматографии Соп А.8ер11аго5е. 1 мл Соп А.8ерНаго5е (УесЮг ЬаЬога1опе8, 1пс., № по каталогу АС-1003, № партии К0425) был помещен в трубку конической центрифуги объемом 15 мл и промыт 10 мл фосфат-буферного физиологического раствора IX (РВ8), рН 7,2.
- 46 011504
Промывочный буферный раствор был удален центрифугированием. Фракции, полученные при выделении ТАЬОЫ, содержащие белок 0772Р с тремя повторениями, были разбавлены в пропорции 1:1 буферным раствором IX ΡΒ8, рН 7,2, затем добавлены к промытому Соп А.ЗерНагоке и ротированы в течение ночи при температуре 4°С. Шлам смолы затем был перенесен в гравитационную колонку объемом 5 мл и промыт 10 мл буферного раствора IX ΡΒ8, рН 7,2. Образцы были элюированы 0,6 М метил а-Э-маннопиранозидом в IX ΡΒ8, рН 7,2, фракциями по 0,5 мл при общем объеме 6 мл. Фракции были проанализированы методом Ж^-ГАСЕ и визуализированы с помощью ярко-синего Гумасси С-250. Фракции, содержащие чистый белок 0772Р с тремя повторениями, были объединены, вновь подвергнуты диализу с использованием 2Ь IX ΡΒ8, рН 7,2, после чего хранились при температуре 4°С.
Иммунизация.
Мыши ΒΑ^Β/с были иммунизированы внутрибрюшинно (1.р.) на 0-, 21-, 42- и 63-й день. При первой инъекции вводились клетки МН:ОУСАР-3 (АТСС НТВ-161), при последующих инъекциях вводился белок 0772Р с тремя повторениями, не имеющий трансмембранного домена. При первой инъекции белка использовался полный адъювант Фрейнда, при повторных инъекциях использовался неполный адъювант Фрейнда. Сбор серозной жидкости производился на 35-, 56- и 77-й день и анализировался методом ЕЫ8А и проточной цитометрии, описанными ниже. Были отобраны мыши с лучшими титрами серозной жидкости для синтеза клеток. За 1 и за 2 дня перед синтезом отобранные мыши стимулировались выраженным белком млекопитающих 0772Р с тремя повторениями 1.р. и внутривенно (ί.ν.). За 1 день перед синтезом мыши стимулировались ί.ν.
Получение гибридомы.
У мыши была удалена селезенка, из которой были отобраны клетки селезенки путем измельчения хирургическими щипцами и фильтрации клеток через микрофильтр. Клетки были дважды промыты в среде ΜΌΜ, после чего был произведен подсчет клеток. Были отобраны клетки (АТСС СЯЬ-1580) миеломы мыши Ρ3X63Αд8.653 в стадии регистрируемого роста, промыты дважды в среде ГМЭМ, после чего был произведен подсчет клеток. Клетки селезенки и клетки миеломы были перемешаны в соотношении 5:1 и центрифугированы при 200хд в течение 5 мин. После отсасывания гранула была разрыхлена путем постукивания по дну трубки. В течение 30 с по капле добавлялся 50% раствор полиэтиленгликоля (т.те. 1450), после чего гранула в течение 30 с осторожно перемешивалась пипеткой. Полученной суспензии дали отстояться еще в течение 30 с. Затем в течение 90 с добавили 5 мл [МЭМ. после чего сразу же добавили еще 5 мл. Результирующей суспензии клеток дали отстояться в течение 5 мин. После центрифугирования были повторно использованы для образования суспензии в среде НАТ ДМОМ, содержащий 10% ΡΒ8, 2 мМ Ь-глютамина, 0,6% 2-меркаптоэтанола (раствор 0,04%), гидроксантин, аминоптерин, тимидин и 10% фактора клонирования гибридомы ОЯЮЕЫО (ЮЕЫ Iηΐетаί^οηа1, Гейтсбург, Мэриленд)) с концентрацией 5х103 клеток на 1 мл и посеяны при 0,2 мл или 1х 105 клеток на чашку в 96 чашек Петри. Чашки были помещены в инкубатор с температурой воздуха 37°С, в атмосферу, содержащую 7% СО2, при 100% влажности. Через 7 дней после синтеза среда была удалена и заменена ^ЭМ, содержащим 10% ΡΒ8, 2 мМ Ь-глютамина, 0,6% штамма 2-меркаптоэтанола (0,04%), гипоксантин и тимидин. Через 10-14 дней после синтеза из чашек с выращенными колониями гибридомы был взят супернатант и проверен на связывание с СА 125/0772Р, как описано в данном документе.
Выделение антител из супернатантов гибридомы.
0,5 мл смолы белка С (81дта, Сент-Льюис, Миссури) поместили в одноразовую колонку на 5 мл (Βίο-Яай, Геркулес, Калифорния). Колонка была предварительно приведена в равновесное состояние с помощью 20 мл связываюего буферного раствора (20 мМ ΡΒ8, рН 7,0). Супернатант гибридомы был помещен в колонку при скорости потока, не превышающей 0,5 мл/мин. Затем колонка была промыта 20 мл связывающего буферного раствора при скорости потока 1 мл/мин. Кроме этого, использовались предварительно подготовленные колонки белка С (АтеткРат ΡΡ;·ιπη;·ιοί;·ι Βίοίοοίι). Антитело затем было элюировано с помощью 3 мл буферного раствора для элюирования (0,1 М глицина, рН 2,7). Фракции объемом 0,5 мл были собраны в трубки на 1 мл, содержащие 50 мкл 1 М Тг1к, рН 9,0. Образцы были подвергнуты диализу с использованием ΡΒ8 (0,5 л) и подвергнуты концентрированию до содержания белка около 1 мг/мл.
Концентрации антител в супернатантах гибридомы.
Концентрации антител определялись с помощью набора реактивов Еаку-ТРет Мойке ^С (Пегое Β^οΐесРηο1οду, Рокфорд, Иллинойс). Вкратце, молекулярный стандарт Мойке ^С (Пегое Β^οΐесРηο1оду, Рокфорд, Иллинойс) был разведен до концентрации 500 нг/мл в буферном растворе для разбавления (поставляется вместе с набором). Данный стандарт был последовательно разбавлен в отношении 1:2 шесть раз в буферном растворе для разбавления для получения кривой стандартов. 20 мкл каждого из стандартов были добавлены в соответствующие чашки планшетов на 96 чашек. Разведения супернатанта гибридомы (20 мкл) также были добавлены в чашки. Для каждого стандарта и образца были выполнены дублирующие чашки. В каждую чашку было добавлено 20 мкл зерен полистирола (поставляются вместе с набором реактивов), образцы были перемешаны, планшет был закрыт и помещен на встряхивающий столик и выдержан на нем в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем в каждую чашку добавили
- 47 011504
100 мкл блокирующего реактива из набора реактивов. Планшет снова встряхивали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем был измерен коэффициент поглощения при длине волны 405 нм на спектрофотометре для прочтения планшетов Утах (Мо1еси1аг Ωονίοοδ Согр., Саннивэйл, Калифорния) и для получения кривой стандарта использовалось согласие по 4 параметрам.
6.2. Специфичность к СА 125/0772Р.
Представленные в настоящем документе результаты показывают, что получение антител с помощью метода, описанного выше, приводит к генерации антител, специфичных к СА 125/0772Р.
Методы анализа специфичности ЕЫ8Л.
планшетов с чашками были выдержаны и покрыты 100 мкл (на чашку) белка 1 мкг/мл 0772Р с тремя повторениями (последовательность № 1) (аффинно выделены) в двууглекислом буферном растворе (0,2 М №ьС’О3,/№НС’О3,. рН 9,6, §1§та) в течение ночи при температуре 4°С. На следующий день чашки были промыты 200 мкл 1хРВ8Т (1х фосфато-буферный физиологический раствор (РВ8), 0,05% Т\уееп 20) 3 раза и блокированы 100 мкл 1хРВ8Т, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (В8Л) в течение 2 ч при 37°С. После трехкратной промывки планшетов 1хРВ8Т на планшеты (в отдельные чашки) были добавлены антитела, произведенные гибридомой, выделенной мышиным анти-СА 125/0772Р (0,04 мг/мл). После выдерживания в течение 1 ч при температуре 37°С планшеты были 3 раза промыты 1хРВ8Т. Для обнаружения сигнала в каждую чашку было добавлено 100 мкл НКР (пероксидаза хрена обыкновенного) - конъюгированного овечьего антимышиного 1дС (разведение 1:2000 в 1хРВ8Т+1% В8Л; Лтегкйат Вюкшепсек), после чего они были выдержаны в течение 1 ч при температуре 37°С. Затем планшеты были снова 3 раза промыты 1 хРВБТ. И, наконец, в каждую чашку было добавлено 100 мкл смеси субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) и Н2О2 (в пропорции 1:1, КРЬ К1гкдиагб Репу ЬаЬога1опе§) и после выдерживания в течение 5 мин был измерен коэффициент поглощения при длине волны 405 нм; измерение производилось спектрофотометром для прочтения планшетов (Мо1еси1аг Эе,1се5 Согр., Саннивэйл, Калифорния). Анализ был повторен трижды для каждого выделенного антитела 0772Р, произведенного гибридомой. Полученные данные были проанализированы методом динамического анализа как результаты, полученные за период времени длительностью 5 мин. Затем были вычислены и представлены усредненные значения. В каждый из экспериментов были также включены средства контроля для холостых и отдельных реактивов.
Результаты.
В табл. 7 представлены результаты анализа специфичности ЕЫ8Л для четырех выделенных антител СА 125/0772Р, произведенных гибридомой (117.1, 368.1, 501.1, 776.1). В таблице также приведены результаты анализа специфичности ЕЫ8Л для двух производимых промышленно антител СА 125/0772Р (ОС125 и М11, Пако Согр., Карпинтерия, Калифорния). При проведении подобного анализа антитело (фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным (т.е. специфичным к СА 125/0772Р), если оно демонстрирует поглощение от не менее 5 до более 30 ΟΌ/мкг антитела. Эти результаты показывают, что каждое из проверенных антител является специфичным к СА 125/0772Р. Как показано ниже, несмотря на то, что ОС125 и М11 считаются специфичными к СА 125/0772Р, ни одно из данных антител не связывает избирательно клеточный СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р. 8Ό = стандартное отклонение.
Таблица 7
Название антитела Поглощение (Οϋ) 8ϋ Поглощение (Οϋ) / мкг антитела
ОС 125 0.73 0.003 18
М11 0.974 0.008 24
117.1 0.619 0.033 15
368.1 1.293 0.004 32
501.1 0.856 0.005 21
776.1 1.178 0.043 29
Результаты табл. 8 показывают данные о поглощении для 20 дополнительных антител, генерированных с помощью метода, описанного выше. Как видно из данных о поглощении, каждое из этих антител также специфично к СА 125/0772Р.
- 48 011504
Таблица 8
Название антитела Поглощение (ОО)мкг АЬ
325.1 24
446.1 27
621.1 27
633.1 18
654.1 22
725.1 25
869 22
7Р10 19
8А1 18
8СЗ 23
15С9 28
8ЕЗ 18
8В5 18
7610 20
16С7 22
7С6 23
7Н1 26
16Н9 22
7А11 22
4Е7 19
Анализ специфичности методом потоковой цитометрии.
Метод.
Клетки ОУСАК-3 (АТСС дополнение № НТВ-161), 8К-ОУ3 (АТСС дополнение № НТВ-77), ΝΙΗ/3Τ3 (АТСС дополнение № СКЬ-1658) и клетки ΝΙΗ/3Τ3, трансфицированные последовательностью, выражающей белок 0772Р, повторяющийся 3 раза (последовательность № 2), были удалены из планшетов культур посредством ферментации трипсином (0,25%). Был произведен подсчет клеток и оценка их жизнеспособности методом исключения трипановым синим (0,2%). Затем клетки были центрифугированы (500/д, 5 мин) и повторно возвращены во взвешенное состояние буферным раствором РАС8 (1/ЭРВ8. содержащий 1% В8А и 0,1% азида натрия) с концентрацией около (5-10)/107 клеток/мл. Затем клетки были распределены в объеме 100 мкл/чашку в планшетах с круглым дном на 96 чашки, центрифугированы при 500/д в течение 3 мин. Супернатант антитела был удален отсасыванием, а 50 мкл супернатантов гибридомы были разведены до 1 и 0,5 мкг/мл в буферном растворе РАС8 и добавлены в каждую чашку, содержащую клетки. Для отрицательного подтверждающего контроля был добавлен мышиный 1д61 каппа (81дта, Сент-Льюис, Миссури) (2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мкг/мкл), а для положительного подтверждающего контроля - ОС 125 и М11 (ΌΛΚΟ Согр, Карпинтерия, Калифорния). Планшеты выдерживали в течение 30 мин при температуре 4°С с вибрацией. Затем клетки последовательно промыли 2 раза буферным раствором РАС8 (200 мкл/чашку) с центрифугированием и отсасыванием после каждой промывки буферного раствора. Козий антимышиный 1д6 (Рс)-биотин (81дта, Сент-Льюис, Миссури) был разведен в пропорции 1:1000 в буферном растворе РАС8 и добавлен в объеме 50 мкл в каждую чашку, содержащую клетки. Планшеты выдерживались в течение 30 мин при температуре 4°С с вибрацией. Затем клетки были промыты буферным раствором РАС8, как описано выше. 81тер1ауИш-А1еха-Роиг 488 (Мо1еси1аг РтоЬек, Эуген, Орегон) был разведен в пропорции 1:1000 в буферном растворе РАС8 и добавлен в объеме 50 мкл в каждую чашку, содержащую клетки. Затем планшеты выдерживались в течение 30 мин при температуре 4°С с промывкой. Затем клетки были промыты буферным раствором РАС8, как описано выше. Затем клетки были вновь возвращены во взвешенное состояние в 1 мл буферного раствора РАС8, перенесены в трубки Ра1соп 2052 и подвергнуты анализу в потоковом цитометре РАС8Са11Ьиг производства компании Вес1оп-Э1скш8оп 1ттцпосу1оте1ту Зуйетк (Сан-Хосе, Калифорния).
Результаты.
В табл. 9 представлены результаты анализа специфичности методом потоковой цитометрии для четырех выделенных антител СА 125/0772Р, произведенных гибридомой (117.1, 368.1, 501.1, 776.1). В таблице также приведены результаты анализа специфичности методом потоковой цитометрии для производимых промышленно антител ОС 125 и М11. Было установлено, что клетки ΝΙΗ/3Τ3 и клетки 8К-ОУ3 (клеточная линия рака яичника) являются факторами отрицательного подтверждающего контроля, поскольку ни одна из них не производит СА 125/0772Р.
- 49 011504
Антитела (или фрагменты антител, связывающие антиген) считаются положительными (т.е. специфичными к СА 125/0772Р), если результаты анализа специфичности методом потоковой цитометрии находятся в следующих пределах положительных клеток: не более примерно 5% положительных клеток МН/3Т3 и не менее приблизительно 60% положительных клеток N14/343. производящих последовательность № 2 полипептидов; либо не более примерно 25% положительных клеток 8К-ОУ3 и не менее приблизительно 80% положительных клеток ОУСАЯ-3 (пб - значение не определено).
Эти результаты подтверждают, что каждое из проверенных антител является специфичным к СА 125/0772Р. Следует отметить, как показано ниже, что, несмотря на то, что ОС 125 и М11 считаются специфичными к СА 125/0772Р, ни одно из этих двух антител не связывает избирательно клеточный СА 125/0772Р в сравнении с СА 125/0772Р.
Таблица 9
Антитело % положительных ΝΙΗ/3Τ3 О772Р 3повторения % положительных ΝΙΗ/3Τ3 % положительных ОУСАК-З % положительных ЗК-ОУЗ
ОС 125 (1 мкг/мл) пб пб 98 16
ОС125(0,1 мкг/мл) пб пб 85 10
М11 (1 мкг/мл) 84 0.1 98 17
М11 (0,1 мкг/мл) ηΰ пб 91 11
117.1 (2 мкг/мл) 83 0.1 93 6
117.1 (0,5 мкг/мл) 63 0 пб пб
368.1 (2 мкг/мл) 86 0.2 89 5
368.1 (0,5 мкг/мл) 75 0.2 пс! пб
501.1 (2 мкг/мл) 89 0 95 5
501.1 (0,5 мкг/мл) 85 0.2 пб пб
776.1 (2 мкг/мл) 86 0 94 9
776.1 (0,5 мкг/мл) 84 0 пб пб
Результаты, приведенные в табл. 10 и представляющие собой данные ОУСАЯ-3/8К-ОУ3 для 20 дополнительных антигенов, генерированных, как было описано выше, показывают, что эти антитела также являются специфичными для СА 125/0772Р.
Таблица 10
- 50 011504
6.3. Методы сравнительного анализа демонстрируют успешное производство антител, избирательно связывающих СА 125/0772Р.
Результаты, представленные ниже, показывают, что антитела, полученные методами, описанными выше, могут генерировать антитела, избирательно связывающие клеточный СА 125/0772Р в сравнении с культивируемым СА 125/0772Р. Возможность генерации подобных антител также доказывает, вопервых, факт существования клеточных полипептидов СА 125/0772Р, т.е. то, что внеклеточная часть СА 125/0772Р сохраняется в клеточной форме, но лишь временно, после высвобождения части полипептида СА 125/0772Р в виде культивируемого СА 125/0772Р.
Метод сравнительного анализа ЕЫ8А.
чашек планшета были покрыты 100 мкл (на одну чашку) полипептида 0772Р с тремя повторениями с концентрацией 1 мкг/мл (последовательность № 1) (аффинно выделенного) в буферном растворе гидрокарбоната (0,2 М №2СО3^аНСО3, рН 9,6, 81дта) и выдержаны в течение одной ночи при температуре 4°С. На следующий день чашки были трижды промыты 200 мкл 1хРВ8Т (1хфосфато-буферный физиологический раствор (РВ8), 0,05% Т\теег1 20) и блокированы 100 мкл 1 хРВ8Т, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) в течение 2 ч при температуре 37°С. После трехкратного промывания 1хРВ8Т выделенные анти-СА 125/0772Р антитела, произведенные гибридомой, в указанной концентрации (например, 0,04 мкг/мл) были добавлены в чашки, которые были перед этим выдержаны в течение 20-30 мин с избыточными количествами (например, 10-50-кратными по весу) культивированного СА 125/0772Р (РИ/дегаН Ми^пек Iηΐетаΐ^οηа1, Конкорд, Массачусетс; 8спрр5 ЬаЬога1опе8, Ла Джолла, Калифорния и/или ШЛей 81а1е5 Вю1одюа1 Согр.). После выдерживания в течение 1 ч при температуре 37°С планшеты были три раза промыты 1хРВ8Т. Для обнаружения сигнала в каждую чашку было добавлено 100 мкл НКР-конъюгированного овечьего антимышиного !дС (разбавление 1:2000 в 1хРВ8Т+1% В8А, Атегккат Вю5с1ег1се5) и выдержано в течение 1 ч при температуре 37°С. Затем планшеты вновь были три раза промыты 1хРВ8Т. Наконец, в каждую чашку было добавлено 100 мкл смеси ТМВ субстрата и спектрофотометром для прочтения планшетов (Мо1еси1аг Оетюек Согр., Саннивэйл, Калифорния) было измерено поглощение при длине волны 405 нм. Анализ был повторен трижды для каждого выделенного антитела, после чего были вычислены и представлены средние значения. Исходя из средних значений, был вычислен процент ингибирования в сравнении со случаем отсутствия конкуренции. В каждый из экспериментов были также включены средства контроля для холостых и отдельных реактивов.
Результаты.
В табл. 11 представлены результаты сравнительного анализа методом ЕЫ8А для четырех выделенных антител СА 125/0772Р, произведенных гибридомой (117.1, 368.1, 501.1, 776.1). В таблице также представлены результаты сравнительного анализа методом ЕЫ8А для производимых промышленностью антител СА 125/0772Р (ОС125; ЭАКО Согр., Карпентерия, Калифорния). Антитело (или фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным при проведении данного анализа (т.е. избирательно связывающим клеточный СА 125/0772Р), если он демонстрирует ингибирование, не превышающее примерно 25% при связывании 25-кратного (по весу) избытка культивируемого СА 125/0772Р. Данные результаты показывают, что каждое из антител 117.1, 368.1, 501.1 и 776.1 избирательно связывает клеточный СА 125/0772Р. Данные результаты также показывают, что антитело ОС 125 не выполняет избирательного связывания клеточного СА 125/0772Р (8Ό - стандартное отклонение).
Таблица 11
Антитело Поглощение 5ϋ Поглощение при наличии культивируемого конкурента СА 125/О772Р (25тикратный избыток по весу) δϋ Процент ингибирования или Поглощение при наличии 3-хкратно повторяемого конкурента О772Р (10ти кратный избыток по весу) 3ϋ Процент ингибирования или
ОС 125 0.73 0.074 0.003 0.001 95 0.047 0.002 99
117.1 0.619 0.554 0.033 0.007 11 0.071 0.001 94
368.1 1.293 1.333 0.004 0.009 0 0.915 0.016 30
501.1 0.856 0.735 0.005 0.008 15 0.065 0.002 96
776.1 1.178 0.977 0.043 0.01 17 0.077 0.001 96
- 51 011504
Результаты, приведенные в табл. 12, отражающие данные конкурента СА 125/0772Р для 20 дополнительных антител, полученные методами, описанными выше, показывают, что данные антитела также являются антителами, избирательно связывающими клеточный СА 125/0772Р.
Таблица 12
8ЕЗ 4
8В5 6
7(310 3
16С7 3
7С6 2
7Н1 4
16Н9 0
7А11 5
4Е7 7
Сравнительный анализ методом потоковой цитометрии.
Клетки Ы1Н:ОУСАК-3 (дополнение АТСС № НТВ-161) были удалены из планшетов культур методом ферментации трипсином (0,25%). Затем был произведен подсчет клеток, а их жизнеспособность была определена методом исключения трипановым синим (0,2%). Затем клетки центрифугировались (500хд, 5 мин) и возвращались во взвешенное состояние в буферном растворе ЕАС8 (1χΌΡΒ8, содержащем 1% В8А и 0,1% азида натрия) с концентрацией примерно (5-10)х107 клеток/мл. Затем клетки были распределены (100 мкл/чашка) в планшеты на 96 чашек с круглым дном и центрифугированы при 500хд в течение 3 мин. Супернатанты были удалены отсасыванием. Супернатанты гибридомы были разбавлены до 0,2 мкг/мл антитела в буферном растворе ЕАС8. СА 125 (И/дегаИ ИЛикИзек 1п1егпайопа1, Конкорд, Массачусетс) был разведен до 1000, 500, 200, 60, 20, 6 или 2 мкг/мл в буферном растворе ЕАС8. 30 мкл раствора антитела было выдержано с 30 мкл разбавленного СА 125 или чистого буферного раствора в течение 30 мин при температуре 4°С. В каждую чашку, содержащую клетки, было добавлено 50 мкл смеси. Для положительного и отрицательного подтверждающего контроля были добавлены, соответственно, мышиный 1дС1 каппа (81дта, Сент-Льюис, Миссури) и М11 (ЭЛКО Согр., Карпинтерия, Калифорния). Планшеты выдерживались в течение 30 мин при температуре 4°С при наличии вибрации. Затем клетки были последовательно промыты 2 раза буферным раствором ЕАС8 (200 мкл/чашка), при этом после каждой промывки производилось центрифугирование и отсасывание. Козий антимышиный 1дО (Ес)-биотин (81дта, Сент-Льюис, Миссури) был разбавлен в пропорции 1:1000 в буферном растворе ЕАС8 и в каждую чашку, содержащую клетки, было добавлено 50 мкл раствора. Планшеты выдерживались 30 мин при температуре 4°С при наличии вибрации. Затем клетки были промыты в буферном растворе ЕАС8, как описано выше. 81гер1ау1йш-А1еха-Еоиг 488 (Мо1еси1аг РгоЬек, Эуген, Орегон) был разбавлен в пропорции 1:1000 буферным раствором ЕАС8 и в каждую чашку, содержащую клетки, было добавлено 50 мкл раствора. Планшеты выдерживались 30 мин при температуре 4°С при наличии вибрации. Затем клетки были промыты в буферном растворе ЕАС8, как описано выше. Затем клетки были воз
- 52 011504 вращены во взвешенное состояние разбавлением в 1 мл буферного раствора РАСЗ, перенесены в трубки Ра1соп 2052 и подвергнуты анализу в потоковом цитометре РАСЗСаБЬиг производства компании ВесФп-Эюкткоп 1ттипосу1оте1гу Зуйетк (Сан Хосе, Калифорния). Процент положительных клеток был построен на графике как функция концентрации СА 125/0772Р программой вывода данных на графопостроитель бгарйРаб. Определения 1С50, выраженных в виде концентрации культивируемых СА 125/0772Р, при которых наблюдалось 50% ингибирование связывания, были сделаны с помощью линейно-регрессионного анализа.
Результаты.
На фиг. 3 показан образец графика зависимости концентрации культивируемого СА 125/0772Р от процента положительных клеток, например, при контроле антитела 117.1 и антитела М11 (прямоугольники).
В табл. 13 представлены общие результаты сравнительного анализа методом потоковой цитометрии. Антитело (или фрагмент антитела, связывающего антиген) считается положительным (т.е. избирательно связывающим клеточный СА 125/0772Р), если оно демонстрирует 1С50, измеренное по процентположительным клеткам, не ниже примерно 0,05 мг/мл клеточного СА 125/0772Р.
Результаты, приведенные в табл. 13, показывают, что каждое из антител 117.1, 501.1, 776.1, 8С3, 16Н9, 325.1, 633.1 и 725.1 избирательно связывает клеточный СА 125/0772Р. Следует отметить, что результаты, приводимые в таблице, также подтверждают, что антитела ОС 125 и М11 не производят избирательного связывания клеточного СА 125/0772Р.
Таблица 13
6.4. Анализ сходства.
Результаты, представленные в данном документе, показывают, что среди генерированных тел, избирательно связывающих СА 125/0772Р, имеются антитела, демонстрирующие высокую степень сходства с клеточным СА 125/0772Р.
Методы анализа сходства В1Асоге.
В измерительный прибор В1Асоге X была установлена микросхема биодатчика 6М5 В1Асоге и активирована 55 мкл ΝΗδ/ЕПС в пропорции 1:1 при комнатной температуре. Белки 3-кратно повторяющегося участка 0772Р и ВЗА при концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М буферного раствора ацетата, рН 4,5, были иммобилизованы, соответственно, на проточных клетках РС1 и РС2 активированной микросхемы при скорости потока 5 мкл/мин для достижения резонансной характеристики 1000-2000 ЯИ. Затем микросхема была блокирована введением 55 мкл этаноамина-НС1, рН 8,5 и после чего последовала 5-кратная промывка 50 мМ Ν0Η-1 М №С1. Для измерения связывания анти-0722Р тАЬк с 3-кратно повторяющимся участком 0772Р, иммобилизованным на микросхеме, на поверхность датчика при скорости потока
- 53 011504 мкл/мин было введено 30 мкл анти-0722Р тАЬ§ в различных концентрациях, в рабочем буферном растворе В1Асоге (НВ8-ЕР, № по каталогу 1001-080, В1Асоге, Паскэтуэй, Нью-Джерси). После завершения фазы введения в рабочем буферном растворе В1Асоге осуществлялся контроль разъединения при указанной скорости потока в течение 360 с. В промежутке между инъекциями поверхность была регенерирована 30 мкл 50 мМ ЫаОН-1 М ЫаС1. Отдельные сенсограммы анализировались с помощью В1Аеуа1иа1юп.
Анализ сходства В1Асоге.
Результаты.
В табл. 14 представлены общие результаты анализа сходства В1Асоге для антител 117.1,368.1,501.1 и 776.1, а также для антител М11 и ОС 125. Как показано в таблице, каждое из антител 117.1, 368.1,
501.1, 776.1, 4Е7, 7С6, 7Е10, 7010, 7Н1, 8А1, 8В5, 8С3, 8Е3, 15С9, 16С7, 16Н9, 325.1, 621.1, 633.1 и 725.1 связывается с высокой степенью сходства с полипептидом СА 125/0772Р.
Таблица 14
Название антитела Ка (НМ)
М11 1,6
ОС125 4
117.1 12
368.1 0,7
501.1 70
776.1 0,4
4Е7 30
7А11 пб
7С6 73
7Е10 3,7
7610 47
7Н1 69
8А1 2,8
8В5 32
8СЗ 5,0
8ЕЗ 33
869 14
15С9 14
16С7 44
16Н7 3,9
325.1 15
446.1 пб
621.1 40
633.1 26
654.1 190
725.1 2,6
6.5. Методы функционального анализа.
Представленные здесь результаты показывают, что среди генерированных антител, избирательно связывающих клеточный СА 125/0772Р, имеются антитела, которые могут выполнять роль промежуточного звена при лизисе СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток.
Метод анализа АЭСС.
Лейкоциты человека были выделены из периферической крови обычных доноров методом плавного центрифугирования Н|51орас.|ие-1077 (81§та Со., Сент-Льюис, Миссури) и использованы в качестве клеток эффекторов. В планшетах с И-образным дном на 96 чашек клетки-мишени ОУСАЯ-3 (5х103/чашку) были смешаны с выделенными с помощью НМорасще лейкоцитами человека с соотношениями эффектор:мишень (Е/Т) от 12,5:1 до 50:1 в присутствии или при отсутствии различных концентраций моноклональных антител в общем объеме 120 мкл ЯРМ1 1640, дополненном 10% ЕВ8. Планшеты выдерживались при температуре 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки-мишени и клетки-эффекторы при отсутствии проверки антител использовались как средства отрицательного подтверждающего контроля. После 16-18 ч выдерживания было отобрано 50 мкл аликвоты культуры супернатанта и подвергнуто анализу на активность лактатдегидрогеназы в планшетах на 96 чашек с плоским дном. При этом использовался набор нерадиоактивных реактивов для анализа на цитотоксичность
- 54 011504
Сукокох 96 (Рготеда Со., Мэдисон, Висконсин). Набор реактивов применялся в соответствии с инструкциями производителя. Процент лизиса опухолевых клеток определялся по следующей формуле:
% цитотоксичности = (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение эффектора спонтанное высвобождение мишени)/(максимальное высвобождение мишени - спонтанное высвобождение мишени)х100.
Результаты были представлены как средний процент лизиса ±8Ό по результатам повторных выборок. Результаты.
На фиг. 4 показан образец графика зависимости процента лизиса от концентрации антител для антитела 117.1 (среднее значение для 4 доноров). Как показано на фигуре, антитело выполняет роль промежуточного звена при лизисе 117.1 клеток рака яичника ОУСАК-3, при этом способ, которым оно выполняет данную роль, зависит от дозы.
Анализ СОС.
В планшетах на 96 чашек с И-образным дном клетки-мишени ОУСАК-3 (2х104/чашку) смешиваются с комплементом человека или морской свинки в разбавлении 15:1, 20:1, 25:1 в присутствии или при отсутствии различных концентраций антитела в общем объеме 120 мкл КРМ1 1640, дополненным 10% РВ8. Планшеты выдерживались при температуре 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Клетки-мишени и клетки-эффекторы при отсутствии проверки антител использовались как средства отрицательного подтверждающего контроля. После 4 ч выдерживания было отобрано 50 мкл аликвоты культуры супернатанта и подвергнуто анализу на активность лактатдегидрогеназы в планшетах на 96 чашек с плоским дном. При этом использовался набор нерадиоактивных реактивов для анализа на цитотоксичность СуЮЮх 96 (Рготеда Со., Мэдисон, Висконсин). Набор реактивов применялся в соответствии с инструкциями производителя. Процент лизиса опухолевых клеток определялся по следующей формуле:
% цитотоксичности = (экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение эффектора спонтанное высвобождение мишени)/(максимальное высвобождение мишени - спонтанное высвобождение мишени)х100.
Результаты были представлены как средний процент лизиса ±8Ό по результатам повторных выборок.
6.6. Последовательности антител, избирательно связывающие клеточные СА 125/0772Р.
Результаты, представленные здесь, определяют последовательности аминокислот и нуклеотидов для различных участков шести монклональных антител, описываемых в данном документе: 117.1, 368.1,
501.1, 776.1, 725.1 и 16Н9, в том числе последовательности СОК.
Методы.
Были отобраны клетки гибридомы, которые были гранулированы при скорости вращения 1800 об/мин в течение 10 мин при температуре 4°С. На 107 клеток был добавлен 1 мл ТЕ1хо1 (^ην^к^οдеη), после чего была обработана РНК в целом. Было добавлено 200 мкл хлороформа на 1 мкл реактива ТШхок после чего смесь энергично трясли вручную в течение 15 с и затем центрифугировали при 12000хд в течение 15 мин при температуре 4°С. Водная фаза, содержащая РНК, была перенесена в чистую пробирку и осаждена добавлением 500 мкл изопропилового спирта на 1 мл реактива ТЕПок используемого для начальной гомогенизации. Гранула РНК была промыта один раз в 70% ЕкОН и быстро высушена на воздухе, прежде чем из нее была получена повторно взвесь в воде ПЕРС. 3 мкг от общего количества РНК было обработано 10 единицами интестинальной фосфатазы теленка (С1Р) в течение 1 ч при температуре 50°С для удаления фосфатов 5'. Данный шаг исключил усеченные тРНК и не-тРНК из последующих операций. Дефосфорилируемая РНК была обработана 0,5 единицами пирофосфатазы табачной кислоты (ТАР) в течение 1 ч при 37°С для удаления колпачной структуры 5' из здоровой тРНК полной длины. СепеКасег ^А О11до (5'-ССАСиССАССАССАССАСАСиСАСАиССАСиСААССАСиАСААА-3'; последовательность № 43) была лигирована с окончанием 5' тРНК при использовании 5 единиц Т4 РНК лигазы в течение 1 ч при температуре 37°С. Лигированная ιηΕΝΛ была обратно транскрибирована при использовании 5 единиц 5 АМУ-ренверсивной транскриптазы и затравки СепеКасег О11до бТ Рптег (5'-ССТСТСААССАТАСССТАССТААССССАТСАСАСТС(Т)18-3'; последовательность № 44) в течение 1 ч при температуре 42°С для создания сДНК с известными затравочными сайтами в окончаниях 5' и 3'. Окончания 5' были амплифицированы с помощью ген-специфической затравки 3', находящейся в константном участке нужного гена (тяжелая цепь 5'-А¥СТССАСАСАСАССККССАСТССАТАСАС; последовательность № 45, легкая цепь
5'-ССАТАСАСТТССТССАССАТС-3'; последовательность № 46) и затравки СепеКасег 5', гомологичной к СепеКасег КNА ОИдо (5'-ССАСТССАССАССАССАСАСТСА-3'; последовательность № 47). Реакция РСК была проведена с использованием 2 мкл сДНК денатурированием шаблона при 94°С в течение 5 мин и последующим денатурированием при 94°С в течение 30 с, ренатурированием при 55°С в течение 30 с, вытягиванием при 72°С в течение 1 мин при 30 циклах и вытягиванием во время финального цикла при 72°С в течение 7 мин в системе СепеАтр 9700 РСК. Особый интерес представлял гель, выделенный применением набора реактивов для выделения геля 01адеп и клонированный с помощью набора реакти
- 55 011504 вов для клонирования ТОРО-4 (нкйгодеп). Результирующие изолированные колонии были отсортированы с помощью РСК для помещения нужного размера в машину 6епеАтр 9700. РСК выполнялся посредством лизинга бактерии при 94°С в течение 8 мин, затем проводилось денатурирование при температуре 94°С в течение 30 с, ренатурирование при температуре 55°С в течение 30 с, вытягивание при температуре 72°С в течение 1-4 мин на протяжении 25 циклов и вытягивание во время финального цикла при 72°С в течение 7 мин. В качестве затравок, используемых для сортировки, использовались: смысловые 5'-АТТААСССТСАСТААА666А-3' (последовательность № 48) или 5'-ТААТАС6АСТСАСТАТА666-3' (последовательность № 49), затравки константных участков антисмысловой тяжелой или легкой цепи (см. выше). Для амплифицирования клона в течение ночи в 4 мл культуры были выращены положительные клоны и был выполнен δΝΆΓ М1шртер (йт'йгодеп). Затем клоны были упорядочены с помощью химического состава В1дИуе (Реткт Е1тег) в системе 6епеАтр 9700 РСК в течение 25 циклов путем денатурирования ДНК в течение 10 с при температуре 94°С, ренатурирования затравки 5'-АТТААСССТСАСТААА666А-3' (последовательность № 50) или 5'-ТААТАС6АСТСАСТАТА666-3' (последовательность № 51) при 50°С в течение 5 с и вытягивания затравки в течение 4 мин при температуре 72°С. Затем реакции были перенесены в колонку ЭуеЕх Со1итп (01адеп) и упорядочены на автоматизированном секвенсоре ДНК модели АррНеб Вюкуйетк 310.
Результаты.
Были получены последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие переменные участки шести моноклональных антител, избирательно связывающих клеточные СА 125/0772Р; они показаны на фиг. 5-10. В частности, на фиг. 5А, 6А, 7А, 8А, 9А и 10А изображены нуклеиновые последовательности, кодирующие переменные участки легких цепей моноклональных антител 117.1, 368.1, 501.1, 776.1, 725.1 и 16Н9 соответственно, тогда как на фиг. 5В, 6В, 7В, 8В, 9В и 10В изображены нуклеиновые последовательности, кодирующие переменные участки тяжелвых цепей моноклональных антител 117.1, 368.1,
501.1, 776.1, 725.1 и 16Н9 соответственно. Последовательности нуклеотидов, кодирующие лидирующие последовательности, подчеркнуты двойными линиями, а последовательности нуклеотидов, кодирующие последовательности СОК, подчеркнуты одной чертой.
Были получены аминокислотные последовательности, кодирующие переменные участки шести моноклональных антител; СА 125/0772Р; они показаны на фиг. 5-10. В частности, на фиг. 5С, 6С, 7С, 8С, 9С и 10С изображены аминокислотные последовательности переменных участков легких цепей моноклональных антител 117.1, 368.1, 501.1, 776.1, 725.1 и 16Н9 соответственно, тогда как на фиг. 5Ό, 6Ό, 7Ό, 8Ό, 9Ό и 10Ό изображены аминокислотные последовательности переменных участков тяжелых цепей моноклональных антител 117.1, 368.1, 501.1, 776.1, 725.1 и 16Н9 соответственно. Лидирующие последовательности подчеркнуты двойными линиями, последовательности СОК подчеркнуты одной чертой. Следует отметить, что лидирующие последовательности не являются частью развившихся антител и поэтому не считаются частью переменных участков антител.
6.7. Анализ методом вестерн-блоттинга супернатантов ОУСАК-3.
В приводимом рабочем примере анализ методом вестерн-блоттинга позволяет непосредственно проверять способность антител 368.1 или 776.1 связывать культивируемый СА 125/0772Р. Представленные ниже данные показывают, что ни антитело 368.1, ни антитело 776.1 не распознают видов, обладающих большим молекулярным весом, соответствующих культивируемому СА 125/0772Р. В отличие от упомянутых антител антитела ОС 125 и М11 распознавали упомянутые виды с большим молекулярным весом, несмотря на то, что все проверенные антитела связываются строго с контрольным рекомбинантным полипептидом 0772Р, содержащим 3 повторения. Таким образом, эти данные являются абсолютным подтверждением того факта, что антитела 368.1 и 776.1 избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р.
Методы.
Из культивированных клеток ОУСАК-3 была удалена среда (КРМ1 с добавлением 10% зародышевой бычьей сыворотки) и заменена свежей дополнительной средой. Аликвоты среды, приведенной в требуемое состояние, удалялись на 1, 6, 24, 48 и 72 ч. Дополнительная среда использовалась в момент отсчета времени 0.
Гель 4-12% В|5-Тп5 (ттйгодеп) вместе с 10 мкл среды, приведенной в требуемое состояние, отбираемой в установленный момент времени, загружался в аппарат и подвергался разделению электрофорезом в течение 45 мин при 200 В. Выделенный полипептид 0772Р с тремя повторениями загружался как средство положительного подтверждающего контроля при 100, 10 и 1,0 нг.
Протеины передавались нитроцеллюлозной мембране на 1 ч при 30 В и затем блокировались на ночь в нежирном молоке при температуре 4°С. Первичные антитела были внесены в 400 мкг/мл в РВ8 и затем разбавлены в пропорции 1:1000 в нежирном молоке (ОС 125 Иако № М3519, М11 Иако № М3520). Блоты были промыты РВ8/Тетееп 3 раза в течение 10 мин. Вторичное антитело (антимышиное 1д6 Рс-специфическое, 81дта № В-7410) было разбавлено в пропорции 1:1000 в нежирном молоке и выдержано в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывки производились, как описано выше. №и1гаАт1Йй1-НРР (Мо1еси1аг РтоЬек № А-2664) был разбавлен в пропорции 1:1000 в РВ8/Т\тееп и вы
- 56 011504 держан при комнатной температуре в течение 15 мин. Блоты промывались в большом объеме РВ8/Тетееп и визуализировались при помощи хемилюминесценции (выдержка 30 с).
Результаты.
Для определения, будет ли антитело 368.1 или 776.1 избирательно связывать клеточный полипептид СА 125/0772Р, был проведен анализ методом вестерн-блоттинга супернатанта культивируемых клеток ОУСАК-3, которые известны культивируемому СА 125/0772Р с поверхности данных клеток. Данный вид анализа проверяет способность антител связывать клеточный СА 125/0772Р непосредственно.
Как показано на фиг. 11, результаты вестерн-блоттинг анализа подтверждают, что ни антитело
368.1, ни антитело 776.1 не распознают видов, обладающих большим молекулярным весом, соответствующих культивируемому СА 125/0772Р. В отличие от упомянутых антител антитела ОС 125 и М11, т.е. антитела, не связывающие избирательно клеточный СА 125/0772Р, распознавали упомянутые виды с большим молекулярным весом. Все четыре проверенных антитела связываются строго с контрольным рекомбинантным полипептидом 0772Р, содержащим 3 повторения 0772Р, который имеет внеклеточные последовательности доменов, располагающиеся непосредственно рядом с трансмембранным доменом СА 125/0772Р. Таким образом, эти данные являются абсолютным подтверждением того факта, что антитела 368.1 и 776.1 избирательно связывают клеточный полипептид СА 125/0772Р.
6.8. Меченое радиоизотопом антитело 776.1 замедляет рост опухолевых клеток.
Представленные здесь результаты показывают, что меченое радиоизотопом антитело 776.1 успешно замедляет рост опухолевых клеток рака яичника человека в моделях животных.
Методы.
Животные.
Исследования проводились на женских особях бестимусных мышей ЫСг пи/пи (Тасошс Еагтк, Германтаун, Нью-Йорк) возрастом 6-7 недель. Все животные получали пищу и воду аб НЬИит.
Имплантация опухолевых клеток.
В целях проведения действенных исследований в модели рака яичника человека была использована клеточная линия карциномы яичника человека ОУСАК-3. Клеточная линия ОУСАК-3 (Гамильтон и др., Сапсег Кек. 43:5379-5389 (1983)) была получена из аденокарциномы яичника человека и была приобретена у АТСС (№ по каталогу НТВ-161). Клетки ОУСАК-3 хранились в КРМ1-1640 с добавлением 10% ЕВ8 при температуре 37°С в 5% СО2. ОУСАК-3 выражала СА 125/0772Р, связанный с опухолью, на поверхности клетки. Ксенотрансплантаты ОУСАК-3 были трансплантированы поверхностно и росли как эктопические опухолевые клетки в бестимусной мыши ЫСг с иммунной недостаточностью. Основным критерием роста поверхностных опухолевых ОУСАК-3 было достижение объема опухоли 150-250 мм3 в течение двух недель после имплантации, после чего начинала проводиться экспериментальная терапия.
Для облегчения процесса образования поверхностной опухоли линия ОУСАК-3 была серийно распространена ш νί\Ό в брюшинные полости мышей ЫСг пи/пи (Барбридж и др., 1п1.1. Опсо1. 15: 1155-1162 (1999); Гучард и др., С1ш. Сапсег Кек. 7: 3222-3228 (2001)). До поверхностной имплантации мышам ЫСг пи/пи было введено 1.р. 10х106 культурированных ш νίΙΐΌ клеток ОУСАК-3 (проход 32) в 0,9% физиологическом растворе (проход 1). Через семь недель опухолевые клетки были отобраны методом перитонеального смыва и 5х106 клеток были введены новой партии реципиентов (проход 2). Через четыре недели опухолевые клетки были отобраны методом перитонеального смыва и переданы еще раз и 5х106 клеток были введены новой партии реципиентов (проход 3). Через три недели были отобраны клетки прохода 3 и для этих клеток был проведен анализ экспрессии и жизнеспособности СА 125/0772Р.
В целях радиоиммунотерапевтических исследований клетки прохода 3 были имплантированы для поверхностного роста опухоли. Клетки прохода 3, как правило, более чем на 95% жизнеспособны и сохраняют высокие уровни экспрессии СА 125/0772Р, что подтверждено проточной циклометрией. Для роста эктотопических солидных опухолей клетки были возвращены в состояние взвеси с окончательной концентрацией 15х106 клеток/мл в смеси Ма1пде1 (Ма1пде1, ΒΌ Вюкаепсек: партия № 005002, 14,6 мг/мл) и 0,9% физиологического раствора; при этом окончательная концентрация Ма1пде1 составила 7,3 мг/мл. Мышам было введено 0,2 мл взвеси отмытых клеток в окончательной дозировке 3х106 клеток. Взвеси отмытых клеток вводились поверхностно с вентральной стороны брюшной области иглой 23 калибра. Место инъекции сохранялось асептическим путем протирания стерильной марлей, смоченной в 70% этиловом спирте.
Примерно через 10 дней после имплантации пальпируемые образования были измерены электронными циркулями (ЕоМег 1пк1гнтеп1к) в двух перпендикулярных направлениях. Мыши были рассортированы по десяткам в зависимости от объема опухоли. Во всех исследуемых группах не было существенных различий между средними размерами опухолей. Измерения опухолей и запись результатов проводились дважды в неделю. Объем опухоли определялся по стандартной формуле (длинахширина2)х0,5.
Связь 776.1 и 1311.
Мышиный 1д6| 776.1 был йодирован Регкш-Е1тег с применением модифицированного метода ЮПО-6ЕЫ (Виссер и др., 1. Ыис1. Меб. 42: 509-519 (2001)), который представляет собой эффективное средство связывания больших доз 1311 с моноклональным антителом с одновременной минимизацией как
- 57 011504 химических, так и лучевых повреждений. 10 мкл раствора аскорбиновой кислоты с концентрацией 1,41 мг/мл и рН 5,0 были добавлены к 10 мдюймам3 131Ι и смесь выдерживалась в течение 1 мин. После этого было добавлено 100 мкл фосфата 0,5 М, рН 7,4. Затем было добавлено 0,5 мг 776.1 тАЬ (вычислено с использованием концентрации антитела, необходимой для получения требуемого объема). Затем было добавлено 35 мкл раствора йодогена в ацетонитриле с концентрацией 1 мг/мл. После выдерживания в течение 3 мин было добавлено100 мкл раствора аскорбиновой кислоты (25 мг/мл, рН 5,0). Еще через 5 мин было добавлено 100 мкл 0,1% мышиного сывороточного альбумина (М8А) в 50 мМ РВ8. Еще через 4-минутной выдержки инкорпорирование 131Ι было проанализировано методом мгновенной тонкослойной хроматографии (1ТЬС) в обычном физиологическом растворе. Неинкорпорированный йод был удален методом хроматографического разделения с помощью ЗерНабех 6-25 и колонок №АР-10 (Атег8Йат-РЬагтас1а), заполненных РВ8 с 0,1% М8А, который используется в качестве буферного раствора. Все операции выполнялись при комнатной температуре. Выделенный тАЬ был подвергнут анализу на наличие свободного йода с помощью ГГЬС и был признан допустимым, если содержание свободно го йода не превышало 5% от общего количества йода.
Определение иммунореактивности меченых радиоизотопом антител 776.1 методом ЕЬГ8А.
Иммунореактивность меченого радиоизотопом антитела 776.1 была определена методом анализа ЕЫ8А. Планшеты с 96 чашками 1ттип1оп 4 (Эупа1есН) были покрыты (100 мкл/чашку) 0772Р с тремя повторениями и меткой гемагглютинина (НА) (аффинно выделенной) с концентрацией в ЭРВ8 1 мкг/мл и оставлены на ночь при температуре 4°С. На следующий день планшеты были блокированы внесением в каждую чашку 200 мкл блокирующего раствора (1хРВ8 с 1% В8А) на 1 ч при комнатной температуре. Немеченые и меченые радиоизотопом антитела 776.1 были разбавлены до 3 мкг/мл в блокирующем буферном растворе и добавлены в первый ряд блокированного планшета в трехкратном размере, составляющем 150 мкл/чашку; 100 мкл блокирующего буферного раствора было добавлено в оставшиеся чашки. Антитела затем троекратно разбавлялись, в общей сложности число разбавлений составило 7. Планшет был выдержан в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего три раза промыт ЭРВЗ, содержащим 0,05% Тетееп-20 (РВ8Т; 200 мкл/чашку). Для обнаружения сигнала в каждую чашку было добавлено 100 мкл НКР-конъюгированного козьего антимышиного 1д6 (Атегкйат Вюкаепсек Пискетэвай, Нью-Джерси), разбавленного в пропорции 1:2000, после чего чашки были выдержаны в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты были промыты три раза РВ8Т и НКР-конъюгат был обнаружен в результате добавления смеси субстрата ТМВ (КРЬ) и Н2О2 (в пропорции 1:1; 100 мкл/чашку). Планшеты выдерживались в течение 10 мин, после чего с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов (Мо1еси1аг Эеу1се5) измерялось поглощение при длине волны 650 нм. Иммунореактивность была определена сравнением концентраций меченого изотопом и немеченого антитела при достижении 50% насыщения.
Однократная радиоиммуннотерапия (КГТ) с применением [131Ι] 776.1.
Проводилось лечение мышей с развившимися опухолями ОУСАК-3 (предположительно с объемом опухолей от 150 до 250 мм3) однократным внутривенным введением [131Ι] 776.1 (мышиный 1дС|) в 0,2 мл 0,9% хлорида натрия. При проведении всех исследований группы из 10 мышей получали 100 или 300 мдюймов3 [131Ι] 776.1 в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Контрольные группы состояли из мышей, которым вводили только хлорид натрия или немеченый 776.1 в дозе, эквивалентной дозе белка, вводимой в группе, получающей высокую дозу меченого радиоизотопом антитела 776.1. Измерение размера опухолей проводилось дважды в неделю. Мыши погибали, когда размер опухоли превышал 10% от веса их тела.
Результаты.
Антитело [131Ι] 776.1 Ι§6ι, применяемое однократно и вводимое внутривенно в ксенотрансплантат ную модель опухоли ОУСЛК-3 рака яичника человека, эффективно замедляло рост опухоли по сравнению с приемом Ι§6| в трех экспериментах при дозе 300 мкдюйм3 и в двух из трех экспериментов при дозе 100 мкдюйм3; см. фиг. 12, на котором обобщены результаты одного из экспериментов. В сравнении с применением физиологического раствора [131Ι] 776.1 Ι§61 эффективно замедлял рост опухоли в двух из трех экспериментов как при дозе 100, так и при дозе 300 мкдюйм3. В двух из трех экспериментов [131Ι] 776.1 Ι§6ι при дозе 300 мкдюйм3 демонстрировал обратное развитие опухоли, определяемое как достижение среднего размера опухоли, меньшего по сравнению с начальным размером опухоли до начала эксперимента. В одном из экспериментов статистическое замедление роста опухоли не наблюдалось ни для одной из групп, получавших лечение [131Ι] 776.1 Ι§61 в сравнении с контрольными группами, получавшими физиологический раствор, при этом не наблюдалось обратное развитие опухоли для группы, получавшей дозу [131Ι] 776.1 Ι§61, равную 300 мкдюйм3. Начальные средние размеры опухолей в данном отдельном эксперименте были, однако, значительно больше, чем в остальных двух экспериментах.
Аналогичные результаты были получены с использованием меченого радиоизотопом антитела [90Υ]
776.1. В частности, наблюдалось значительное уменьшение роста опухоли (р<0,05). В трех из четырех экспериментов значительное снижение роста опухоли наблюдалось как при дозе антитела 50, так и при дозе 150 мкдюйм3. В этих же трех экспериментах обратное развитие роста опухоли наблюдалось при
- 58 011504 наивысшей дозе [90Υ] 776.1 и воздействие на рост опухоли было аналогичным или более эффективным воздействию трех доз цисплатина (из расчета 6 мг/кг).
7. Методы сравнительного анализа антител/фрагментов антител, связывающих антиген
Перекрестный сравнительный анализ методом ЕЫ8А.
Проверяемые антитела биотинилируются с помощью набора реактивов Ζ-Ьшк 8и1Го-ХН8-ЬСВюйпу1айоп Κίΐ (Р1егсе Вю1есйпо1оду, Рокфорд, Иллинойс) в соответствии с инструкциями производителя, после чего производится удаление непрореагировавшего реагента биотинилирования посредством диализа с использованием 1 л фосфат-буферного физиологического раствора и двумя заменами раствора при 4°С в течение 48 ч. Планшеты с 96 чашками покрываются 100 мкг (на каждую чашку) 0772Р с тремя повторениями с концентрацией 1 мкг/мл бикарбонатного буферного раствора (0,2 М Ха2СО3/ХаНСО3, рН 9,6, 81дта) и выдерживаются в течение ночи при 4°С.
На следующий день планшеты промываются три раза 200 мл 1хРВ8Т (1хфосфат-буферный физиологический раствор (РВ8), 0,05% Т\гееп 20) и блокируются 100 мкл 1хРВ8Т, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (В8А) в течение 1 ч при комнатной температуре. После 3-кратной промывки 1хРВ8Т титрование описывает кривую 0-1000-кратного превышения антитела конкурента (в сравнении с меченым антителом, добавляемым позже) в 95 мкл 1хРВ8Т+1% В8А, которые добавляются к отдельным чашкам планшета, выдерживаются в течение 1 ч при температуре 37°С. Биотинилированное антитело затем добавляется к 5 мкл 1хРВ8Т+1% В8А и выдерживается еще 1 ч при комнатной температуре. Концентрация добавляемого биотинилированного антитела представляет собой концентрацию, при которой 70% максимального связывания белка 0772Р с тремя повторениями достигается в отсутствие конкурента при использовании условий обнаружения, описанных ниже. Добавляемое количество антитела зависит от характеристик связывания и, как правило, устанавливается эмпирическим методом на этапе предварительных исследований.
Планшеты затем трижды промываются 1хРВ8Т. Для обнаружения сигнала 100 мкл 81гер1а\зйшНКР (разбавление 1:4000-1:8000 в 1хРВ8Т+1% В8А, 8ои1Нет Вю1ес11по1оду А88ос1а1е8, 1пс. (Бирмингем, Алабама)) добавляется в каждую чашку, которые выдерживаются в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты затем трижды промываются 1хРВ8Т. Наконец, в каждую чашку добавляется смесь 100 мкг субстрата ТМВ и Н2О2 (в пропорции 1:1, КРЬ) и измеряется поглощение при длине волны 405 нм с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов (Мо1еси1аг Эсуюс^ Согр., 8ииηуνа1е, СА). Анализ повторяется трижды для каждого антитела, после чего вычисляются средние значения.
Неспецифическая конкуренция определяется с использованием нормального мышиного 1дС| вместо специфического конкурента. Каждый из экспериментов включает в себя холостые и индивидуальные реактивы, а также автоконкуренцию. Определяется процент ингибирования (за вычетом неспецифической конкуренции), строится как функция сравнения с конкурентом и 1С50 или концентрации конкурента, при которой наблюдается 50% конкуренция.
Перекрестный сравнительный анализ БАС8.
Проверяемые антитела биотинилируются с помощью набора реактивов Е2-Ьшк 8и1Го-ХН8-ЬСВюйпу1айоп К11 (Р1егсе Вю1есйпо1оду, Рокфорд, Иллинойс) в соответствии с инструкциями производителя, после чего производится удаление непрореагировавшего реагента биотинилирования посредством диализа с использованием 1 л фосфат-буферного физиологического раствора и двумя заменами раствора при 4°С в течение 48 ч. Культивированные клетки ОУСАК-3 извлекаются и промываются в буферном растворе РАС8 (1хфосфат-буферный физиологический раствор Дульбекко (ОРВ8), 0,05% 2%
В8А). Препараты для сравнительного анализа помещаются в планшеты на 96 чашек общим объемом 50 мкл.
Титры избытка (от 0 до 1000-кратного) немеченого антитела конкурента (в сравнении с биотинилированным антителом, добавляемым позже) в 20 мкл добавляются к 25 мкл клеток ОУСАК-3 (4х105), взвешенных в буферном растворе БАС8 (в отдельных чашках), тщательно перемешиваются, распределяются по 96 чашкам планшета и выдерживаются при комнатной температуре в течение 30 мин. 5 мкл биотинилированного антитела в буферном растворе БАС8 затем добавляется в каждую чашку, содержащую клетки, тщательно перемешивается и выдерживается при комнатной температуре еще 30 мин. Количество используемого антитела представляет собой концентрацию, при которой обеспечивает максимальное связывание клеток ОУСАК-3, выражаемых как процентно-положительные клетки. Количество добавляемого антитела зависит от характеристик связывания и, как правило, определяется эмпирически в ходе предварительных исследований.
Затем были отобраны клетки, которые дважды промыли в 200 мкл буферного раствора БАС8. Для обнаружения сигнала клетки выдерживаются в 50 мкл МТС-конъюгированного стрептавидина, имеющего концентрацию 1 мкг/мл (готовится вместе с буферным раствором БАС8, Мо1еси1аг РгоЬек, Эуген, Орегон), в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания дважды в 200 мкл буферного раствора БАС8 клетки из отдельных чашек вновь доводятся до состояния смеси в 400 мкл буферного раствора БАС8 и подвергаются анализу БАС8. Анализ БАС8 проводился в соответствии с инструкциями производителя, с использованием аппаратуры БАС8сап и программного обеспечения Се110не51 (Вес1оп
- 59 011504
Оюкпъоп). Данные, полученные при каждом из экспериментов, отражают 10000 событий. Каждый из экспериментов включает в себя холостые и индивидуальные реактивы, а также автоконкуренцию. Определяется процент ингибирования (за вычетом неспецифической конкуренции) или уменьшение процента положительно окрашенных клеток ОУСАЯ-3, строится на графике как функция сравнения с конкурентом и 1С50 или концентрации конкурента, при которой наблюдается 50% конкуренция.
Антитело считается конкурирующим, если 1С50 для конкурента имеет концентрацию, не более чем в 100 раз превышающую концентрацию меченого антитела. Более предпочтительно считать антитело конкурирующим, если концентрация 1С50 конкурента не более чем в 10 раз превышает концентрацию меченого антитела. Наиболее предпочтительно считать антитело конкурирующим, если концентрация 1С50 не превышает примерно эквимолярной концентрации меченого антитела.
8. Хранилища гибридом
Гибридома 117.1, выделяющая моноклональное антитело 117.1, была сохранена 2 августа 2002 г., в Американском собрании типовых культур (АТСС®), 10801 Университетский бульвар, Манассас, Виргиния 20110-2209), в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-4567.
Гибридома 368.1, выделяющая моноклональное антитело 368.1, была сохранена 2 августа 2002 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-4568.
Гибридома 501.1, выделяющая моноклональное антитело 501.1, была сохранена 2 августа 2002 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-4569.
Гибридома 776.1, выделяющая моноклональное антитело 776.1, была сохранена 2 августа 2002 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-4570.
Гибридома 15С9, выделяющая моноклональное антитело 15С9, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5106.
Гибридома 16С7, выделяющая моноклональное антитело 165С7, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5107.
Гибридома 16Н9, выделяющая моноклональное антитело 16Н9, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5108.
Гибридома 4Е7, выделяющая моноклональное антитело 4Е7, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5109.
Гибридома 7А11, выделяющая моноклональное антитело 7А11, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5110.
Гибридома 7С6, выделяющая моноклональное антитело 7С6, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5111.
Гибридома 7Р10, выделяющая моноклональное антитело 7Р10, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5112.
Гибридома 7610, выделяющая моноклональное антитело 7610, была сохранена 4 июня 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения 5245.
Гибридома 7Н1, выделяющая моноклональное антитело 7Н1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5114.
Гибридома 8А1, выделяющая моноклональное антитело 8А1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5115.
Гибридома 8В5, выделяющая моноклональное антитело 8В5, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5106.
Гибридома 8С3, выделяющая моноклональное антитело 8С3, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения 5246.
- 60 011504
Гибридома 8Е3, выделяющая моноклональное антитело 8Е3, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5118.
Гибридома 869, выделяющая моноклональное антитело 869, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5119.
Гибридома 325.1, выделяющая моноклональное антитело 325.1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5120.
Гибридома 621.1, выделяющая моноклональное антитело 621.1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5121.
Гибридома 633.1, выделяющая моноклональное антитело 633.1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5122.
Гибридома 654.1, выделяющая моноклональное антитело 654.15, была сохранена 4 июня 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения 5247.
Гибридома 725.1, выделяющая моноклональное антитело 725.1, была сохранена 3 апреля 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5124.
Гибридома 446.1, выделяющая моноклональное антитело 446.1, была сохранена 25 сентября 2003 г., в АТСС®, в соответствии с положениями Будапештского соглашения о международном признании хранилища микроорганизмов для целей выдачи патентов, и ей был присвоен № дополнения РТА-5549.
Объем настоящего изобретения не ограничивается отдельными вариантами осуществления изобретения, описанными в настоящем документе. Возможно, приведенное выше описание и цифры позволят специалистам вносить свои дополнения и изменения. Предполагается, что подобные модификации входят в объем прилагаемых формул изобретения.
Любые публикации, патенты и варианты применения патентов, описываемые в данной спецификации, указаны в данном документе для справки в той степени, в которой каждая отдельная публикация, патент или вариант применения патента были конкретно и в индивидуальном порядке упомянуты при включении в документ для справки. Цитирование или обсуждение ссылок, имеющихся в данном документе, не следует рассматривать как признание факта, что подобная информация была известна до настоящего изобретения.
- 61 011504
Список последовательностей <110> ЕУРО-СЕЛТИК С.А.
<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ КЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ СА 125/0772Р, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> 6750-214-228 <140> Подлежат передаче <141> 2003-10-15 <150> 60/485,986 <151> 2003-07-10 <150> 60/418,828 <151> 2003-10-12 <160> 71 <170> ЕазЬЗЕО Еог И1пРоиз УегзБоп 4.0 <210> 1 <211> 748 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СА 125/0772Р 3-гереаЬ <400> 1
А1а 1 А1а С1п Рго А1а Агд Агд А1а Агд Агд ТЬг Ьуз Ъеи РЬе ТЬг 15 Н1з
5 10
Агд Зег Зег Уа1 Зег ТЬг ТЬг Зег ТЬг Рго 21у ТЬг Рго ТЬг Уа1 Туг
20 25 30
Ьеи 61 у А1а Зег Буз ТЬг Рго А1а Зег Не РЬе 61 у Рго Зег А1а А1а
35 40 45
Зег ΗΪ5 Пей Ьеи Не Беи РЬе ТЬг Беи Азп РЬе ТЬг 11е ТЫ Азп Беи
50 55 60
Агд Туг Й1и С1и Азп Мер Тгр Рго С1у Зег Агд Буе РЬе Азп ТЬг ТЬг
65 70 75 80
С1и Агд Уа1 Беи С1п С1у Беи Беи Агд Рго Беи РЬе Буз АЗП ТЫ Зег
85 90 95
νεα С1у Рго Беи Туг Зег С1 у Суз Агд Беи ТЬг Беи Беи Агд Рго 61и
100 105 но
Ьуз Азр б!у 61 и А1а ТЬг 01 у Уа1 Азр А1а 11е Суз ТЬг Низ Агд Рго
115 120 125
Азр Рго ТПг С1у Рго С1 у Беи Азр Агд С1 и 01п Беи Туг Беи 61и Беи
130 135 140
Зег 61п Ьеи ТЬг ΗΪ3 Зег 11е ТЬг <31и Беи 61у Рго Туг ТЬг Беи Азр
145 150 155 160
Агд Азр Зег Беи Туг Уа1 Азп 61у РЬе ТЬг ΗΪ3 Агд Зег Зег Уа1 Рго
165 170 175
ТЬг ТЬг ЗёГ ТЬг б1у Уа1 Уа1 Зег С1и С1и Рго РЬе ТЬг Беи Азп РЬе
180 185 190
ТЬг Не Азп Азп Беи Агд Туг МеЬ А1а Азр Меи О1у С1п Рго 01у Зег
195 200 205
Беи Буз РЬе Азп 11е ТЬг Азр Азп Уа1 МеЬ Буз НБз Беи Беи Зег Рго
210 215 220
Беи РЬе е1п Агд Зег Зег Беи С1у А1а Агд Туг ТЬг С1у Суз Агд Уа1
- 62 011504
225 230 235 240
Не А1а Беи Агд Зег νβΐ Буз Азп 51у А1а С1и ТЬг Агд Уа1 Азр Беи
245 250 255
Беи Суз ТЬг Туг Беи Й1п Рго Беи 5ег 31 у Рго О1у Беи Рго 11е Буз
260 265 270
01 п Уа1 РЬе Н1з С1и Беи Зег С1п 01л ТЫ Нхз С1 у Де ТЬг Агд Беи
275 280 285
С1у Рго Туг Зег Беи Азр Буз Азр Зег Беи Туг Беи АЗП 61у Туг Азп
290 295 300
С1и Рго С1у Рго Азр С1и Рго Рго ТЬг ты Рго Буз Рго А1а ТЬг ТЬг
305 310 315 320
РЬе Беи Рго Рго Беи Зег С1и А1а ТЬг ТЬг А1а МеЬ С1у Туг Н15 Беи
325 330 335
Буз та г Беи ТЬг Беи Азп РЬе ТЬг 11е Зет А$П Беи С1п Туг Зег Рго
340 345 350
Азр МеБ С1у Ьу5 €1у $ег А1а ТЬг РЬе А5Л 5ег ТЬг С1и О1у ν31 Беи
355 360 365
С1п Нлз Беи Беи Агд Рго Беи РЬе С1п Буз 5ег Зег Д: 61 у Рго РЬе
370 375 380
Туг Беи С1у Суз ΰΐη Беи 11е Зег Беи Агд Рго 01 и Буз Азр С1у А1а
385 390 395 400
А1а таг С1у Уа1 Азр ТЬг ТЬг Суз ТЬг Туг Н13 Рго Азр Рго Уа1 С1у
405 410 415
Рго 01у Беи Азр Не С1п С1п Беи Туг Тгр С1и Беи Зег 61п Беи ТЬг
420 425 430
Н13 01у Уа1 таг С1п Беи 61у РЬе Туг Уа1 Беи Авр Агд Азр 5ег Беи
435 440 445
РЬе 11е А5П С1 у Туг А1а Рго С1п Азп Беи 8ег Не Агд О1у С1и Туг
450 455 460
С1п 11е АЗП РЬе Н15 11е Уа1 Азп Тгр Азп Беи Зег Аеь Рго Азр Рго
465 470 475 480
ТЬс Зег 5ег 01и Туг 11е ТЬг Беи Беи Агд Азр 11е С1п Азр Буз ν^ι
495 4 90 495
ТЫ таг Беи Туг Буз С1у Зег £1п Беи Н13 Азр ТЬг РЬе Агд РЬе Суз
500 505 510
Беп Уа1 ТЬг Азп Беи ТЫ Ме£ Азр Зег Уа1 Беи Уа1 ТЬг Уа1 Буз А1а
515 520 525
Геи РЬе 5ег Зег Азп Беи Азр Рго Зег Беи Уа1 С1и С1п Уа1 РЬе Беи
530 535 540
Азр Буз ТЬГ Беи Азп А1а Зег РЬе Н13 Тгр Беи 01у Зег ТЬг Туг 31л
545 550 555 560
Беи Уа1 Азр 11е Н1з Уа1 ТЬг С1и МеЬ С1и Зег Зег Уа1 Туг С1п Рго
565 570 575
ТЬг Зег Зег Зег Зег ТЬг С1п Н13 РЬе Туг Беи Азп РЬе ТЬг 11е ТЬг
580 5Θ5 590
Аз η Беи Рго Туг Зег С1п Азр Буе А1а О1п Рго С1у ТЬг ТЬг Азп Туг
595 600 605
01 η Агд А.5П Буз Агд Азп 11е С1и Азр А1а Беи Азп 01 п Беи РЬе Агд
610 615 620
Аз η Зег 5ег Не Буз Зег Туг РЬе Зег Азр Суз 01п Уа1 Зег ТЬг РЬе
625 530 635 640
Агд Зег ν&ι Рго Азп Агд Н13 Нез ТЬг С1у Уа1 Азр Зег Беи Суз Азп
645 650 655
РЬе Зег Рго Теи А1а Агд Агд Уа1 Азр Агд Уа1 А1а 11е Туг С1и С1и
660 665 670
РЬе Беи Агд МеС ТЬг Агд Азп С1у ТЬг С1П Беи 61п Азп РЬе ТЬг Беи
675 680 685
Азр Агд Зег Зег ν&1 Беи ν&ι Азр 61у Туг Зег Рго Азп Агд Азп 31и
6 90 695 700
Рго Беи ТЫ С1 у Азп Зег А1а Азр Т1е С1п Нез Зег С1у 01 у Агд 5ег
705 710 715 720
- 63 011504
8ех‘ Ьеи 31и С1у Рго Агд РНе С1и С1п 725 Ьуз 730 Ьеи Не 5ег 61и С1и Азр 735
Ьеи Азп Мен Ηΐδ ТНг С1у Н15 ΗΪ5 Н15 ΗΪ3 ΗΪ5 ΗΪ8
740 745 <210> 2 <211> 809 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> СА 125/0772Р 3-гереаТ ТМ
<400> 2
А1а А1а С1п Рго А2а Агд Агд А1а Агд Агд ТНг ЬуЗ Ьеи РНе ТНг ΗΪ3
1 5 10 15
Агд Зег Зег ν&ι Зег ТНг ТНг Зег ТЬг Рго С1у ТНг Рго ТНг Уа1 Туг
20 25 30
Ьеи С1у А1а Зег Ьуз ТНг Рго А1а Бег Не РНе С1у Рго Зег А1а А1а
35 40 45
Зег Ехз Ьеи Ьеи Не Ьеи РНе ТНг Ьеи Азп РНе ТНг Не ТНг Азп Ьеи
50 55 60
Агд Туг 61и С1и Азп Ме5 Тгр Рго С1у Зег Агд Ьуз РНе Азп ТНг тнг
65 70 75 80
61 и Агд ν^ι Ьеи С1п С1у Ьеи Ьеи Агд Рго Ьеи РНе Ьуз Азп ТНг Зег
85 90 95
7аЬ С1у Рго Ьеи Туг Зег 01у Суз Агд Ьеи ТНг Ьеи Ьеи Агд Рго С1и
100 105 110
Ьуз Азр С1у С1и А1а ТЬг 51 у Уа1 Азр А1а Не Суз ТНг Н15 Агд Рго
115 120 125
Азр Рго ТЬг С1у Рго 61у Ьеи Азр Агд С1и С1п Ьеи Туг Ьеи С1и Ьеи
130 135 140
Зег С1п Ьеи ТЬг Н15 Зег Не ТНг С1и Ьеи С1у Рго Туг ТНг Ьеи Азр
14 5 150 155 160
Агд Азр Зег Ьеи Туг Уа1 Азп С1у РНе ТНг Н15 Агд Зег Зег \Га1 Рго
165 170 175
ТНг ТНг Зег ТНг С1у Уа1 νβΐ Зег 61и 01и Рго РНе ТНг Ьеи Азп РНе
180 185 190
ТНг Не Аэп Азп Ьеи Агд Туг МеН А1а Азр Мер С1у 61 п Рго 61у Зег
195 200 205
Ьеи Ьуз РНе Азп Не ТЬг Азр Азп Уа1 Мер Ьуз Нхз Ьеи Ьеи Зег Рго
210 215 220
Ьеи РНе С1П Агд Зег Зег Ьеи 51у А1а Агд Туг ТНг С1у Суз Агд Уа1
225 230 235 240
Не А1а Ьеи Агд Зег Уа1 Ьуз Азп О1у А1а 61и ТНг Агд Уа1 Азр Ьеи
245 250 255
Ьеи Суз ТНг Туг Ьеи С1п Рго Ьеи Зег С1у Рго С1у Ьеи Рго Не Ьуз
260 265 270
С1п Уа1 РНе Ηίβ С1и Ьеи Зег С1Л С1п ТНг Н1з С1у Не ТНг Агд Ьеи
275 280 285
С1у Рго Туг Зег Ьеи Азр Ьуз Азр Зег Ьеи Туг Ьеи АЗП 61у Туг Азп
290 295 300
С1и Рго С1у Рго Азр 61 и Рго Рго ТНг ТНг Рго Ьуз Рго А1а ТНг ТНг
305 310 315 320
РНе Ьеи Рго Рго Ьеи Зег С1и А1а ТНг ТНг А1а МеН Я1у Туг Н1з Ьеи
325 330 335
Ьуз ТЬг Ьеи ТЬг Ьеи Ά5ΙΪ РНе ТНг 11е Зег Азп Ьеи С1п Туг Зег Рго
340 345 350
Азр МеЬ 31у Ьуз 61у Зег А1а ТНг РНе Азп Зег ТНг <31и С1у νβΐ Ьеи
355 360 365
- 64 011504
Е1п Н1В Геи Ьеи Агд Рго Ьеи РЬе С1п Ьуз 375 Зег Зег 380 Мер 61у Рго РЬе
37 0
Тут Ьеи 61 у Суз 61п Ьеи Не Зег Ьеи Агд Рго 61и Ьуз Азр 61у А1а
395 390 395 400
А1а ТЬг 61у Уа1 Авр ТЬг ТЬг Суз ТЬг Туг Нив Рго Азр Рго Уа1 61 у
405 410 415
Рго 61 у Ьеи Авр 11е 61п С1п Ьеи Туг Тгр 61и Ьеи Зег 61п Ьеи ТЬг
420 425 430
Н1В 61у Уа1 ТЬг 61 η Ьеи 61у РЬе Туг Уа1 Ьеи Авр Агд Азр Зег Ьеи
435 440 445
РЬе Не Азп 61 у Туг А1а Рго 61 η Азп Ьеи Зег Не Агд 61у 61и Туг
450 455 460
61 η Не Азп РЬе Н13 Не Уа1 Азп Тгр Азп Ьеи Зег Азп Рго Азр Рго
465 470 475 480
ТЬг Зег Зег 61и Туг Не ТЬг Ьеи Ьеи Агд Авр Не 61 п Азр Ьув Уа1
485 4 90 495
ТЬг ТЬг Ьеи Туг Ьуз 61у Зег 61п Ьеи Н13 Азр ТЬг РЬе Агд РЬе Суз
500 505 510
Ьеи Уа1 ТЬг Азп Реи ТЬг МеГ Авр Зег Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Ьуз А1а
515 520 525
Ьеи РЬе Зег Зег Азп Ьеи Авр Рго Зег Ьеи Уа1 61и 61п Уа1 РЬе Ьеи
530 535 540
Авр Ьуз ТЬг Ьеи Азп А1а Зег РЬе Н13 Тгр Ьеи 61у Зег ТЬг Туг С1п
545 550 555 560
Ьеи Уа1 Азр Не Н13 Уа1 ТЬг 61и Мер 61и Зег Зег Уа1 Туг 61п Рго
565 570 575
ТЬг Зег Зег Зег Зег ТЬг 61 η Н15 РЬе Туг Ьеи Азп РЬе ТЬг Не ТЬг
580 585 590
Азп Ьеи Рго Туг Зег 61п Аар Ьуз А1а С1п Рго С1у ТЬг ТЬг Авп Туг
595 600 605
61 η Агд АВП Ьуз Агд Азп Не 61и Аар А1а Ьеи Авп 61п Ьеи РЬе Агд
610 615 620
Азп Зег Зег Не Ьуз Зег Туг РЬе Зег Азр Суз С1п Уа1 Зег ТЬг РЬе
62 5 630 635 640
А1 д Зег Уа1 Рго Азл Агд Н13 Н13 ТЬг 61 у Уа1 Азр Зег Ьеи Суа Азп
645 650 655
РЬе Зег Рго Ьеи А1а Агд Агд Уа1 Азр Агд Т/а1 А1а Не Туг 61и 61 и
660 665 670
РЬе Ьеи Агд Мер ТЬг Агд Авп 61 у ТЬг 61п Ьеи 61п Азп РЬе ТЬг Ьеи
675 680 685
Азр Агд Зег Зег Уа1 Ьеи Уа1 Авр 61у Туг Зег Рго Авп Агд АЗП 61 и
690 695 700
Рго Ьеи ТЬг 61 у Азп Зег Авр Ьеи Его РЬе Тгр А1а Уа1 Не Ьеи Не
705 710 715 720
61у Ьеи А1а 61 у Ьеи Ьеи 61у Ьеи Не ТЬг Суз Ьеи Не Суз С1у Уа1
725 730 735
Ьеи Уа1 тьг ТЬг Агд Агд Агд Ьуз ьуз С1и 61у 61 и Туг Азп Уа1 61п
740 745 750
61п 61п Суз Рго 61 у Туг Туг 61п Зег Н15 Ьеи Азр Ьеи 61и Авр Ьеи
755 760 7 65
61п Ав η Зег А1а Авр 11е С1П Н13 Зег <31у 61у Агд Зег Зег Ьеи 61и
770 775 780
61 у Рго Агд РЬе 61Ώ 61п Ьуз Ьеи 11е Зег 61 и 61и Азр Ьеи Авп меь
785 790 795 800
Нтз ТЬг 61 у Н1В НТВ Н15 Н1з Н13 Н13
805
<210> 3 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность
- 65 011504 <22 0>
<223> 117.1 νΗΙ СОВ
<400> 3
С1у РЬе Зег Ьеи 5ег ТЬг Рго С1у Μβΐ. <31у Уа1 С1у
1 5 10
<21 0> 4
<2 1> 16
<2 ί2> Белок
<2ί3> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 УН2 СБК <400> 4
Ηι= 11е Тгр Тгр Авр Азр РЬе Ьуз Агд Азр Азп Рго А1а Ьеи Ьуз Зег
10 15 <210> 5 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 УНЗ С№
<4 00> 5 Уа1 Азр С1у Асп РЬе Ъеи Зег Тгр Туг РЬе Айр 7а1
1 5 10
<210> 6
<211 > 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<2 23> 117.1 УБ1 С ГР <400> 6
Агд Зег Зег 31п Зег Беп Уа1 Н15 Зег Асп (51 у Азп ТЬг Туг Ьеи Н15
10 15 <210> 7 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<’23> 117.1 УЬ2 СОЕ <400> 7
Ьуз Уа1 Зег Азп Агд ₽Ье Зег
5
- 66 011504 <2ί0> 8 <211> 9 <2 12> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 703 СБК
<400> 8
Бес 61п Бег Агд Туг 7=1 Рго С1и ТНг
1 5
<210> 9 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 νΗΙ СОН
<400> 9
С1у Туг Бег РНе ТЬг С1у РЬе Туг Мей Н15
1 5 10
<210> 10 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 УН2 С БК
<400> 10
Туг Уа1 Зег Суз Туг ТНг С1у А1а ТЬг ТЬг Туг ТЬг С1п Ьуз РЬе Ьуз
1 5 10 15
<31 у
<210> 11 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368 1 νΗ3 СОЙ
<400> 11
61 и 61у Αερ Туг Туг 5ег Мей Азр РЬе
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
- 67 011504
<223> 368.1 УЫ СОИ
<400> 12
Агд 5ег 5ег С1П 5ег Ьеи 31 и Агд ТЬг Азп <31у Азп ТЬг Туг Ьеи Ηϊξ
1 5 10 15
<210 13
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 Ό СЭК
<400> 13
Ъуз Уа1 Зег Зег Агд РЬе Зег
1 5
<2ί0> 14
<2 11> 9
<2 12> Белок
<213> Искусственная последовательность <220 <223> 368.1 УЬЗ СОК <400> 14
Зег С1п ТЬг Т!1г Ηί3 61у Рго Рго ТЬг
5 <210 15 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 УН1 СБК <400 15
Й1у Туг Не РИе ТЬг Азр Туг 61у Мер Азп
5 10 <210 16 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 7.42 СОК <400 16
Суз Не Азп Ю Туг ТЬг С1у <31и ТЬг Не Туг Зег Азр Азр РЬе Агд
10 15 у
- 68 011504 <210> 17 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 УНЗ СОР.
<400> 17
01у Авп Туг Агд Авр А1а Не Авр Туг
1' 5
<210> 18
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 VII СОК
<400> 18
Ьув А1а Зег С1п Авр 11е Ьуз Зег Туг Ъеи Зег
15 10
<210> 19
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность се <220>
<223> 501.1 УЬ2 СОК
<400> 19
Туг А1а ТНг ТПг Ьеи А1а Авр
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 VI3 СОК <400> 20
Ьеи Н15 Н15 Аар С1и Зег Рго РЬе ТЬг
5 <210> 21 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 УН1 СОК <400> 21
- 69 011504
61у Туг Ткг РЬе Ткг Азр Туг Азп Не Нхз
10 <2 10> 22 <2 ί1> 15 <212> Белок <2 13> Искусственная последовательность <220>
<223> 176.1 таг СБК
<400> 22
Тус Не Туг Рго Туг Аз г. С1у Уа1 5ег Азр Туг Азп 61η Азп РЬе
1 5 10 15
<210> 23
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 УНЗ СБР
<400> 23
Агд Тгр Азр РНе 61у Зег 61у Туг Туг Рпе Азр Туг
15 10
<210> 24
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 УЫ СОК
<400> 24
Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 Не Туг Ме1 Суз
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 νΐ.2 СБН
<400> 25
63 у ТНг Зег ТЪг Ьеи А1а Зег
и. 5
<210> 26
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
- 70 011504 <220>
<223> 776.1 71.3 СОК
<400> 26
21п 61п Тгр Зег 5ег Азп Рго РЬе ТЬг
1 5
<210> 27
<211> 131
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (117.1Б) <400> 27
Мес Буз Беи Рго Уа1 Агд Беи Беи Уа1 Беи МеЬ РЬе Тгр Не Рго 61у
1 5 10 15
Зег Зег Зег Азр А1а Уа1 Мес ТЬг С1п ТЬг Рго Беи Зег Беи Рго Уа1
20 25 30
Зе г Беи 61у Азр 61п А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Беи
35 40 45
Уа1 НБз Зег Азп 61у Азп ТЬг Туг Беи Ηίε Тгр Туг Беи С1п Буз Рго
50 55 60
е1у С1п Зег Рго Буе Беи Беи Не Туг Буз Уа1 Зег Азп Агд РЬе Зег
65 70 75 80
<31 у Уа1 Рго Азр Агд РЬе Зег 61у Зег С1у Зег Б1у ТЬг Азр РЬе ТЬг
85 90 95
Беи Агд Не Зег Агд Уа1 С1и А1а 61и Αερ Беи С1у Уа1 Туг РЬе Суз
100 105 110
Зег С1п 5ег Агд Туг Уа1 Рго Тгр ТЬг РЬе С1у С1у <31 у ТЬг Б уз Беи
115 120 125
С1и Не Буе
130
<210> 28 <211> 141 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (117.1Н) <400> 2Θ
Мер 61у Агд Беи ТЬг Зег Зег РЬе Беи Беи Беи Не Уа1 Рго А1а Туг
1 5 10 15
Уа1 Беи Зег 61п Уа1 ТЬг Беи Буз 61и Зег 61у Рго 61у Не Беи 61п
20 25 30
Рго Зег 61 п ТЬг Беи Зег Беи ТЬг Суз Зег РЬе Зег 61 у РЬе Зег Беи
35 40 45
Зег ТЬг Рго 61у Мер 61у Уа1 С1у Тгр Не Агд 61п Рго Зег С1у Буз
50 55 60
<31у Беи 61и Тгр Беи А1а НБз Не Тгр Тгр Азр Азр РЬе Буз Агд Азр
65 70 75 80
Азп Рго А1а Беи Буз Зег Агд Беи ТЬг Не Зег Буз Азр ТЬг Еег Зег
85 90 95
Зег 61 п Уа1 РЬе Беи Б уз Не А1а Зег Уа1 Азр ТЬг А1а Азр ТЬг А1а
- 71 011504
100 105 110
ТЬг Туг Туг Суз ’.'а1 Агд Уа1 Азр 61у Азп РЬе Беи Зег Тгр Туг РЬе
115 120 125
Азр 7а1 Тгр Й1у А1а С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
130 135 140
-.210> 29 <211> 131 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (368.11·) <400> 29
Мет 1 Туэ Ъеи Рго Уа1 5 Агд Беи Беи Уа1 Беи 10 Мер РЬе Тгр Не Рго 15 А1а
Зег Зег Зег Авр Уа1 Уа1 МеЬ ТЬг С1п ТЬг Рго Беи Зег Беи Рго Уа1
20 25 30
Зег Теи 61у Аар С1п А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег 61 η Зег Беи
35 40 45
31а Агд ТЬг Азп Й1у Азп ТЬг Туг Беи Н1з Тгр Туг Беи 61п Буз Рго
50 55 60
С1у 31П Зег Рго Буз Беи Беи Не Туг Буз Уа1 Зег Зег Агд РЬе Зег
65 70 75 80
С1у Уа1 Рго Азр Агд РЬе 5ег 61 у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг
85 90 95
Беи Буе 11е Зег Агд Уа1 61 и А1а б1и Азр Беи Й1у 11е Туг рье Суз
100 105 110
Зег С1п ТЬг ТЬг Н15 Й1у Рго Рго ТЬг Суз 61 у 61 у 61 у ТЬг Буз Беи
115 120 125
61и Не ЬуЗ
130
<210> 30 <211> 137 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (368.1н) <400> 30
Мер 61 у Тгр Не Тгр 11е РЬе Беи РЬе Беи Беи Зег 61у ТЬг А1а 61 у
1 5 10 15
Уа1 Н13 Зег С1и Уа1 С1п Беи С1п С1п Зег С1у Рго 61 и Беи Уа1 Агд
20 25 30
ТБ г Й1у А1а Зег Уа1 Буз 11е Зег Суз Буз А1а Зег 61у Туг Зег РЬе
35 40 45
ТЬг 61у РЬе Туг меь Н1з Тгр Уа1 Буз С1п Зег Беи Й1у Буз Зег Беи
50 55 60
61и Тгр Не 61 у Туг Уа1 Зег Суз Туг ТЬг 61у А1а ТНг ТЬг Туг ТЬг
65 70 75 80
6.1 η БУЗ РЬе Буз Й1у Буз А1а ТНг РЬе ТЬг Уа1 Авр ТЬг Зег Зег Зег
85 90 95
ТБ г А1а Туг Мер 61п Беи Азп Зег Беи ТЬг Зег Й1и Азр Зег А1а Уа1
- 72 011504
100 105110
Туг Туг Суз А1а Агд б1и С1у Азр Туг Туг Зег Мер Азр РЬе Тгр С1у
115 120125
С1п 61 у ТЬг Бег Уа1 ТЬг 7а1 Зег Зег
130135 <210> 31 <211> 128 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (501.11.) <400> 31
МеТ Азр Мео Агд А1а Рго А1а 21п РЬе РЬе С1у Не Ъеи Ъеи Ъеи Тгр
1 5 10 15
РЬе Рго С1у Не Агд Суз Азр Не Ъуз Мес ТЬг 61П Зег Рго Зег Зег
• 20 25 30
Не Туг А1а Зег Ъеи б1у 61и Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Ъуз А1а Зег
35 40 45
61п Азр Не Ъуз Зег Туг Ъеи Бег Тгр Туг С1п 61П Ъуз Рго Тгр Ъуз
50 55 60
Зе г Рго Ьуз ТЬг Ъеи Не Туг Туг А1а ТЬг ТЬг Ъеи А1а Азр 61у ча1
65 70 75 80
Ргс Зег Агд РЬе Зег С1у Зег 61у Зег С1у С1п Азр Туг Зег Ъеи Не
85 90 95
11 = Азл Бег Ъеи С1и Зег Азр Азр Не А1а ТЬг Туг РЬе Суз Ъеи Низ
100 105 110
Н13 Азр С1и Зег Рго РЬе ТЬг РЬе С1у Зег С1у ТЬг Ъуз Ъеи С1и Не
115 120 125
<210> 32 <211> 137 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (5О1.1Н) <400> 32
МеЪ 1 А1а Тгр Уа1 Тгр 5 ТЬг Ъеи Ъеи РЬе Ъеи МеС А1а А1а А1а 61п Бег
10 15
А1а 61л А1а С1л Не С1л Ъеи Уа1 61п Зег 61у Рго 61и Ъеи Ъуз Ъуз
20 25 30
Рг о 61 у С1и ТЫ Уа1 61л Не Зег Суз Ъуз А1а 5ег 61у Туг Не РЬе
35 40 45
ТЬг Азр Туг С1у МеЬ Азп Тгр Уа1 Ъуз С1п А1а Рго С1у Ъуз б1у Ъеи
50 55 60
Ъуз Тгр Мел С1у Суз Не Азл ТЬг Туг ТЬг С1у 61и ТЬг Не Туг Бег
65 70 75 80
Азр Азр РЬе Агд С1у Агд РЬе А1а Не Зег Ъеи С1и ТЬг Бег А1а Бег
85 90 95
ТЬг А1а РЬе Не εΐη Не Азл Азп Ъеи Ъуз Αεη 61и Азр А1а А1а ТЬг
100 105 110
Туг РЬе Суз А1а Агд 61у Азп Туг Агд Азр А1а Не Азр Туг Тгр С1у
- 73 011504
115 120 125
61п 61у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
130 135 <210> 33 <211> 127 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (776.1Ь) <400> 33
Ме1 Азр РЬе С1п Уа1 С1п Не РЬе Зег РЬе Ьеи Ьеи Не Зег А1а Зег
1 5 10 15
V®! 11е Мер Зег Агд С1у С1п Не Уа1 Ьеи Зег εΐη Зег Рго А1а Не
20 25 30
Беи РЬе А1а Зег Рго С1у 61 и ТЬг Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз Агд А1а Зег
35 40 45
Зет Зег Уа1 Не Туг Мер Суз Тгр Азп 61п С1п Ьуз Рго С1у Зег Зег
50 55 60
Рго Ьуз Рго Тгр Не Туг 61 у ТЬг Зег ТЬг 1еи А1а Зег 61 у Уа1 Рго
65 70 75 80
ТЬг Агд РЬе Зег 61у Зег <31 у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не
85 90 95
Зег Агд Уа1 61и А1а С1и А®р А1а А1а ТЬг Туг Туг Су® С1п 61п Тгр
100 105 110
Зег Зег Азп Рго РЬе ТЬг РЬе Й1у Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи 61и Не
115 120 125
<2 Ю> 34 <2 ί1> 139 <212> Белок <2 ί3> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (776.1Н) <400> 34
МеЬ 61у Тгр Зег Тгр Не РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег С1у ТЬг А1а 61у
1 5 10 15
Уа1. Η1Ξ Зег 61 и Уа1 61п Ьеи 61п 61п Зег 61у Рго С1и Ьеи νθΐ Ьуз
20 25 30
Рго 61у А1а Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег 61 у Туг ТЬг РЬе
35 40 45
ТЬг Авр Туг Азп Не Н13 Тгр Уа1 Ьуз 61п Зег Н13 61у Ьуз Не Ьеи
50 55 60
61 и Тгр Не 61 у Туг Не Туг Рго Туг Азп 61у νβΐ Зег Азр Туг Азп
65 70 75 80
61п Азп РЬе Ьу® Зег Ьу® А1а ТЬг Ьеи Не Ча1 Азр Азп Зег Зег Азп
85 90 95
ТЫ А1а Туг МеС 61 и Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Агд Тгр Азр РЬе 61 у Зег 61 у Туг Туг РЬе Азр Туг
115 120 125
Тгр 61у 61п 61у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
130 135
- 74 011504 <210> 35 <2110 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <2 20>
<223> 117.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (117. И) <400> 35 аСдаадГЕдс сГдГСаддсВ дИддГдсСд а1дИс1дда ДДсс£ддХ£с садсадбдаЪ60 дсСдВдаСда сссааасгсс асСсСсссВд ссВдСсадСс ССддадаСса ддссСссаГс120
СсССдсадаД сСадДсадад ссСВдбасас адТаабддаа асассЬаСН. асаТХддСас180 сСдсадаадс саддссадСс ВссаааасСС с^даВсСаса аадШ^ссаа ссдаЕДЬТс!240 ддддСсссад асаддСГ-сад ТддсадГдда Ъсадддасад аВ1Ъсасас6 саддаЪсадс300 ададСддадд сДдаддаЬсТ дддадТТВаЬ ТСсТдсВсЛс ааадВадаВа ОдО^ссдСдд360 асдЫсддТд даддсассаа дсВддаааВс ааа393 <21О> 36 <211> 423 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 117.1 Переменный участок -тяжелой цепи полипептидов (117.1Н) <400> 36 аОдддсаддс Г.асИгИс а11сс1дс1а сЬдаСЬдСсс сВдсаГаГдС ссГдСсссад60 дТЛасИсГда аададСсВдд сссСдддаГа ВВдсадсссС сссадасссб. садистдас!12 0 бдДТсбТбсб сбдддЬДМс асбдадсасВ ссТддДаДдд д!дЬаддс1д даЫсдбсад180 ссаЬсаддда адддбсДдда д1ддс!.ддса сасаСС^ддС дддасдагвс саадсдсдаб240 ааГссадссс 11аададссд ассдас1а£с ГсДааддаГа ссЮсадсад ссаддДДДДс300 сбсааааЮд ссадСдТдда сасТдсадаЬ асДдссасаВ аДТасДдТдТ ДсдадОдда!360 дд1аасС1сс СсГссСддВа 1ТВсдаСдДс СддддсдсСд ддассасдд! сассд-ЬсЮс420
1са423 <210> 37 <211> 393 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 368.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (368.11.) <400> 37 аВдаадДВдс сСдИГаддс! дСВддЬдсЪд аКдЫсвдда ЬДссГдсСТс садсадВдаД60 дВВдВдаВда сссааасЬсс асбсбсссВд ссЪдбсадбс ЪДддадабса адссЬссаЬс120
Ссвддсадаь с1ад!садад сс!5даасдс ас(:аа1.ддаа асассташ аса11дд1ас180 сТдсадаадс саддссадГс т.ооаааасТс сбдабсВаса аадбТВссад ссдаШДЬсД24 0 ддддГсссад аСаддГСсад СддсадДдда Дсадддасад а!ДДсасасД саадаЪсадТ300 ададДддадд ссдадда^ст дддааШаТ 1Гс1дС5сТс ааас^асаса 1дд±сс6ссд360 асдбдсддГд даддсассаа дсГддааа'Ьс ааа393 <210> 38 <211> 411 <212> ДНК <'213> Искусственная последовательность <220>
- 75 011504 <223> 368.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (368.1Н) <400> 38 аРдддаРдда РсРддаРсРР РсРсРРссРс сРдРсаддаа срдсаддрдр ссасРсРдад60 дрссадсрдс адсадРсРдд ассРдадРРа дРдаддасРд дддсРРсадР даадаРайсс120
РдсааддсРР сйддРРасРс аРРсасРддй РРсРасаРдс асРдддРсаа дсададссРР180 ддааададсс ррдадрддар рддаРаРдРР адРРдРРаса сРддРдсРас РассРасасс240 садаадРРса адддсааддс сасаРРРасР дррдасасар ссРссадсас адссРасаРд300 саасРсааса дссРдасаРс РдаадасРсР дсддРсРаРР асйдрдсаад адааддддаР360
РасРаРРсРа РддасРРсРд дддРсаадда ассРсадРса ссдРсРссРс а411 <210> 39 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<22 3> 501.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (501.1Д) <400> 39 аРддасаРда дддссссРдс РсадРРРРРР дддаРсРРдР 1 дсРсрддрр РссаддРаРс60 адаРдРдаса РсаадаРдас ссадРсРсса РсдРссаРРР аРдсаРсдсР дддадададд120 дРсасРаРаа сРРдсааддс дадрсаддас арРаааадсР аРРРаадсРд дРассаасад180 ааасссрдда ааРсРссраа дасссРдаРс РаРРаРдсаа саассРРддс адарддддрс240 ссаРсаадар Рсадрддсад РддаРсРддд саадаррарр сРсРааРсаР саасадссРд300 дадРсРдасд айаРадсйас РРаРРРсРдР сйасассаРд айдададссс аРРсасдРРс360 дссРсдддда сааааРРдда ааРааа386 <210> 40 <211> 411 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 501.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (501.1Н) <400> 40 арддсррддд рдРддассРР дсРдРРссрд айддсадсрд сссааадрдс ссаадсасад60 аРссадРРдд РдсадРСРдд ассрдадсрд аадаадссРд дададасадр ссадаРсРсс120
РдсааддсРР сРддсРаРаР срйсасадас РарддааРда асрдддрдаа асаддсРсса180 ддааадддрр РааааРддаР дддсйдРаРа аасассРаса срддададас ааРаРаРадР240 даРдасРРСа ддддасддРР РдссаРсРсР РРддааассР сРдссадсас РдссйРРайР300 садаРсааса ассрсааааа йдаддасдсд дсаасайайй рсрдрдсаад дддаааРРас360 адддайдсРа ррдасраррд дддРсаадда ассРсадРса ссдРсРссйс а411 <210> 41 <211> 383 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> 776.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (776.11>) <400> 41 айддаРРРРс аадрдсадай РРРсадсРРс сРдсРааРса дРдсРРсадР саРааРдРсс60 ададдасааа РРдРРсРсРс ссадрсрсса дсааРссРдР РРдсаРсРсс аддддадасд120 дрсасаайда сррдсадддс садррсаадр дРаайРРаса рдрдррддаа Рсадсадаад180 ссаддаРссР сссссааасс сРддаРРРаР ддсасаРсса сссрддсрйс РддадРсссР240 асРсдсРРса дрддсадрдд дРсРдддасс рсрРасйсРс РсасааРсад сададрадад300 дсРдаадаРд СРдссасРРа РРасРдссад садрддадра дйаасссаРР сасдййсддс360
- 76 011504
7сддддасаа ад77ддааа7 ааа 383 <23 0> 42 <231> 417 <2 3 2> ДНК <23 3> Искусственная последовательность <220>
<223> 776.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (776.1Н) <400> 42 а!ддда7дда дс7дда7с71 7с7с77сс7с сРдРсаддаа сСдсаддсд! ссасбсГдад60 д7ссадс77с адсадГсадд асс7дадсрд д7дааасс7д дддсс1сад7 даадаЬаЮс120
РдсааддсИ с7дда7асас аМсасЪдас 1асааса71с асЬдддОдаа асададсса!180 ддааадаЛсс ИдадСддаС Г.дда1а1а71 1а7сс71а7а а7дд7д171с 7дас7асаас24 0 садаа777са ададсааддс саса77да77 д1адасаа77 ссГссаасас адсс7аса7д300 даасрссдса дсс7даса!с 7даддас7с7 дсад7с7аТ1 аМдТдсаад а!дддасС7с360 дд7ад7ддс7 асСас777да с7ас!ддддс сааддсасса с7с7сасад! сОссЮа417 <210> 43 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ргыпег (аее гесНоп 6.6) <400 43
гсдасиддад сасдаддаса сидасаидда сидааддади адааа 45
<210 44
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ришег (гее гесЪюп 6»б)
<400 44
дскдксаасд а7асдс7асд 7аасддса7д асадкдгш ΐΐΛΐ. 54
<210> 45 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ргипег (зее зес11оп 6.6) <400> 45 аусЬссасас асаддггсса дСддаСадас 30 <210> 46 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ргыпег (зее зескюп 6.6) <400> 46
- 77 011504 дда^асади ддГдсадсак с 21 <210> 47 <211> 23 <21 2> ДНК <21 3> Искусственная последовательность <220 <223> ршпег (зее зесРХол 6.6) <400> 47 сдасТддадс асдаддасас 5да 23 <210> 48 <211> 20 <2 12> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ргдшег (зее зесИол 6.6) <4Э0> 48 аССаасссГс асВаааддда 20 <210 49 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>
<223> рг!тег (еее зесСтоп 6.6} <400> 49
ЬааЬасдас! сасРаРаддд 20 <210 50 <211> 20 <212> ДНК<213> Искусственная последовательность <220 <223> ргттег (зее еесМоп 6.6} <400> 50 аТТааессСс аст.аааддда 20 <210 51 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> рг1тег (зее зесОоп 6.6) <400 51
ЬааВасдасТ сасСа^аддд 20 <210> 52 <211> 383 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 78 011504 <22О>
<22 3> 725.1 Переменный участок легкой цепи полипептидов (725.1Ь) <400> 52 аПдсаЦтЬс аадЬдсадаЬ СТЬсадсЬСс сРдсЬааЬса дЬдсЫсадЬ саЪааДдГсс60 ададдасааа ГЬаРЬсГсТс ссадЪсИсса дсааТссРдС сРдсаЬсЬсс аддддадаад120 дГсасааРда сГРдсадддс садЫсаадЬ дЬаадЬЬсса Ысас1.дд(:а ссадсадаад180 ссадааСсс! сссссааасс сРддаЬРЬас дссасаСсса ассбддсЬСс РддадРсссЬ240 дИзсдс-ЬРса дрддсадбдд дРсЬдддасс РсбТаРасГс РсасааЬсад садааТддад300 дсЬдсадаЬд срдссасЫа ЦТасСдссад садИддадГа РТдаТссадс сасдРРсдда360 ддддддасса адсГддаааЬ ааа383 <210> 53 <211> 135 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (725.1Н) <400> 53
Ме£ А1а 1 Тгр Уа1 Тгр 5 ТЬг Ьеи Беи РЬе Ъеи Μβί. А1а 10 А1а А1а 61П 15 Зег
А1а С1п А1а 61п Не С1п Ьеи Уа1 61п Зег 61у Рго 61и Ьеи Ьуз Ьуз
20 25 30
Ею 01у 61и ТЬг Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуа А1а Зег 61у Туг Зег РЬе
35 40 45
ТНг А ап Туг 61 у МеТ Азп Тгр Уа1 Ьуз 61 п А1а Рго <31 у Ьуз 51у Ьеи
50 55 60
Ьув Тгр Мер С1у Тгр Не Аз η А1а Туг Не С1у С1и Рго ТЬг Туг А1а
65 70 75 80
Авр Азр РЬе Ьуз С1у Агд РЬе А1а РЬе Зег Ьеи 61 и А1а Зег ТЬг Н13
85 90 95
Т11Г А1а Туг Ьеи 61п Не Азп Зег Ьеи Бу 5 Зег 61 и Азр ТЬг А1а ТЬг
100 105 110
Туг РНе Суз А1а Зег 51 у 21 у АЗП Зег Ьеи Азр РЬе Тгр 61у 61п 61 у
115 120 125
ТНг ТЫ Ьеи ТЬт Уа1 Зег Зег
130 135
<210> 54 <211> 127 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (725.11.) <400> 54
РеД 1 Азр РЬе 61п Уа1 5 61п Не РЬе Зег РЬе Ьеи 10 Ьеи Не Зег А1а 15 Зег
Уа1 Не МеТ Зег Агд 61у 61п Не Не Ьеи 5ег С1п Зег Рго А1а Не
20 25 30
Ьеи Зег А1а Зег Рго 61у 61 и Ьуа Уа1 ТЬг Μβΐ: ТНг Суз Агд А1а Зег
35 40 45
Бег Зег Уа1 Зег Зег Не Н13 Тгр Туг 61п С1п ьуз Рго 61и Зег Зег
50 55 60
- 79 011504
Рго Буз Рго Тгр Не Туг А1а ТЬг Зег Азп Беи А1а Зег 61у Уа1 Рго
65 70 75 80
Ча1 Агд РЬе Зег С1у Зег 61 у Зег 61У ТЬг Зег Туг ТЬг Беи ТЬг Не
65 90 95
Зег Агд МеЬ. 61 и А1а А1а Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз 61п 61п Тгр
100 105 но
Зег Не Азр Рго А1а ТЬг РЬе 61 у <31у 61 у ТЬг Буз Беи 61и 11е
115 120 125
<2 10> 55 <211> 141 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Η9 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (16Н9Н}
<401 Э> 55
МеЬ Буз Суз Зег Тгр Уа1 Не РЬе РЬе Беи Не! А1а Уа1 Ча1 ТЬг 61у
1 5 10 15
Уа1 Азп Зег С1и Уа1 61п Беи 61 η 61л Зег 61у А1а 61 и Беи Ча1 Буз
20 25 30
Рго С1у А1а Зег Ча1 Буз Беи Зег Суз ТЬг А1а Зег 61 у РЬе Азп 11е
35 40 45
Буз Азр ТЬг Туг МеЬ Н1з Тгр Уа1 Б уз С1п Агд Рго 61 и 61П 61у Беи
50 55 60
61 и Тгр Не 61 у Агд Не Азр Рго А1а Азп 61у Азп ТЬг Буз Туг Азр
65 70 75 80
Рго Буз РЬе 61п 61у Буз А1а ТЬг Не ТЬг А1а Азр ТЫ Зег Зег Азп
85 90 95
ТТ г А1а Туг Ча1 61п Беи Зег Зег Беи ТЬг Зег 61и Азр ТЬг А1а Ча1
100 105 110
Туг Туг Суз А1а Зег Зег Азр Не Туг Туг 61у Азп Рго 61у 61 у РЬе
115 120 125
А1 а Туг Тгр 61 у 61п 61у ТЬг Беи Уа1 ТЬг Ча1 Зег А1а
130 135 140
<210> 56 <211> 129 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 Переменный участок легкой цепи полипептидов (16Н9Б) <400> 56
Мер Азр 1 РЬе 61 п Ча1 5 61п Не РЬе Зег РЬе 10 Беи Беи 11е Зег А1а 15 Зег
Ча1 Не МеЬ Зег Агд С1у С1п Не Ча1 Беи ТЬг С1п Зег Рго А1а Не
20 25 30
МеБ Зег А1а Зег Беи. С1у С1и Агд Ча1 ТЬг МеЬ ТЬг Суз ТЬг А1а Зег
35 40 45
Зег Зег Ча1 Зег Зег Зег Туг Беи Низ Тгр Туг 61п 61 п Буэ Рго 61 у
50 55 60
Зег Зег Рго Буз Беи Тгр Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Беи А1а Зег 61 у
65 70 75 80
Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег 61у Зег 61у Зег 61у ТЬг Зег туг Зег Беи
- 80 011504
85 90 95
ТЬ: Не Зег Зег мер С1и А1а С1и Аар А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Н15
100 105 110
61п Туг Нез Агд Зег Рго РЬе ТЬг РЬе Й1у Зег С1у ТЬг Ьуз Ьеи 51и
115 120 125
Не <210> 57 <211> 406 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (725.1Н) <400> 57 аЬддсЬЬддд ЬдЬддассЬР дсЬаЬЬссЬд аЬддсадсРд сссааадДдс ссаадсасад60 аДссадСДдд ДдсадЬсСдд ассДдаасДд аадаадсскд дададасадЬ саадаРсЬсс120
ДдсааддсЬИ сДддаДаДРс сЬЬсасааас ьаЬддааКда асЛдддЬдаа дсаддсксса180 дддаадддЫ ЬааадЬддаЬ дддсСддаЬа аасдссСаса ЬСддададсс ааса^аЬдсЬ240 даДдасьЬса адддасдаЬЬ ЬдссДЬсДсЬ сЬддаадссЬ сЬасссасас ЬдссЬаСЬЬд300 садаЬсааса дссЬсаааад Сдаддасасд дсЬаса^аД^ ЬсЬдлдсаад ЬдддддЬаас360
РсссЬДдасР Редддддсса аддсассасб сЬсасадЬср ссТсад406 <210> 58 <211> 423 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 Переменный участок тяжелой цепи полипептидов (16Н9Н) <400> 58 аЬдаааЬдса дсЬдддЬгаД сЬЬсЬЬссЬд аДддсадДдд ДДасаддддД сааЬЬсадад60 дЬЬсадсЬдс адсад£с1дд ддсададсГЬ дГдаадссад дддссЬсад! саадЬДдЬсс120
ЬдсасадсДД сдддсЬЬсаа сарЛааадас ассСараЛдс асЬдддЬдаа дсададдссЬ180 даасадддсс ЬддадЬддаД РддааддаЬб даРссРдсда аДддбаасас ЬаааДаЬдас24 0 ссдаадЬЬсс адддсааддс сасЬаЬааса дсадасасаЬ ссГссаасас адссЬасдрд300 садсЬсадса дссЬдасаЬс ЬдаддасасЬ дссдЬсЬаЬЛ асЬдЬдсЬад ЬадДдасаДс360
1ас1а1дд6а ассссддддд сИгсс^ас Ьддддссаад ддасДссддр сасбдДсДсб420 дса423 <210> 59 <211> 389 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 Переменный участок легкой цепи полипептидов (16Н9Д) <400> 59 аЬддаЬЬЪРс ададдасааа дбсассаСда садаадссад дЬсссадсЬс акддаддсСд ДДсддсДсдд аддЬдсадаЬ СДдЬДсЪсас ссьдсасддс даЬссЬсссс дсДЬсадДдд аадаЬдсЬдс ддасааадДЪ
ЬЬДсадсЬЬс сДдсДааЬса дСдссЬсадЬ саДааДдДсс 60 ссадЬсЬсса дсааСсаЬдЛ сСдсаДсДсД аддддаасдд 120 садсьсаадь дЬаадкбсса дЬЬассьдса срддДассад 160 сааасЬсрдд аЫЬаЬадса сабссаасср ддсЪДсОдда 240 садРдддЪсГ дддассЬсГЬ асЬсГсксас ааРсадсадс 300 сасЫаЬЬас ЬдссассадЬ аЬсаЬсд£Ьс сссаЬЬсасд 360 ддаааДааа 389
- 81 011504 <21 0> 60 <211> 10 <21 2> Белок <21 3> Искусственная последовательность <22 0>
<223> 725.1 УН1 СЭК
<400> 60
51 у Туг Зег РЬе ТЬг Авп Туг 51 у Мер Аз1
15 10
<21 0> 61
<21 1> 17
<21 2> Белок
<21 3> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 УН2 СБК
<400> 61
Тгр Не Азп А1а Туг Не С1у 51и Рго ТЬг Туг А1а Аер Азр РЬе Ьуз
1 5 10 15
С1у
<22 0> 62 <21 1> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <2?0>
<223> 725.1 УНЗ СОВ
<400> 62
С1у 51у Азп Зег Ьеи Азр РЬе
1 5
<21 0> 63
<21 1> 10
<21 2> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 V!.! СБК
<400> 63 Агд А1а Зег Зег Зег 7а1 Зег Зег Не Н13
1 5 10
<2 Ю> 64
<2 И> 7
<2 ί2> Белок
<2ί3> Искусственная последовательность <220>
- 82 011504
<223> 725.1 VI2 СОК
<400> 64
А1а ТИг Зег Азп Беи А1а Зег
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 725.1 νΐ3 СОК
<400> 65
61η 61п Тгр Зег Не Азр Рго А1а ТЬг
1 5
<210> 66
<211> 10
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 УН! СОР.
<400> 66 у РЬе Азп Не Ъуз Азр Гиг Туг Мер Нхз
5 10 <210> 67 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 νΗ2 СОК <400> 67
Агд Не Азр Рго А1а Азп 61у Αεη ТЬг Буз Туг Азр Рю Буз РЬе 61п 15 10 15
С1у <210> 68 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 УНЗ СОН <400> 6Θ
Зэг Азр Не Туг Туг 61у Азп Рго С1у С1у РЬе А1а Туг
10
- 83 011504 <210> 69 <211> 12 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 VII СОР <400> 69
ТЫ А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег Туг Беи НАз
10 <210> 70 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 16Н9 УС2 СОР.
<400> 70
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег
5 <210> 71 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> 16Н9 УБЗ СОР <4 00> 71
Η1Ϊ 51П Туг НАз Агд Зег Рго РЬе ТЬг

Claims (64)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированное моноклональное антитело или фрагмент антитела, избирательно связывающие клеточный полипептид СА 125/0772Р по сравнению с культуральным полипептидом СА 125/0772Р, причем антитело или его фрагмент связывают повторяющийся участок указанного полипептида, представленный аминокислотами 14-452 в последовательности полипептида 8ЕР Ш № 1.
  2. 2. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, которые при проведении сравнительного анализа методом конкурентного ЕЫ8А демонстрируют менее чем 25, менее чем 20, менее чем 15, менее чем 10 или менее чем 5% ингибирования связывания указанного повторяющегося участка в присутствии 25-кратного (по весу) избытка культурального СА 125/0772Р по сравнению с клеточным СА 125/0772Р.
  3. 3. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, которые при проточном цитометрическом анализе демонстрируют 1С50, измеренную по проценту ингибирования положительных клеток, при концентрации культурального СА 125/0772Р не менее 0,05, не менее 0,25, не менее 0,5, не менее 0,75 или не менее 1,0 мг/мл.
  4. 4. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, которые связывают клеточный полипептид с последовательностью 8 Ер № 1, без поддающегося обнаружению связывания культурального СА 125/0772Р.
  5. 5. Изолированное антитело по п.1, являющееся антителом класса 1дС, предпочтительно изотипа 1§С1.
  6. 6. Изолированное антитело по п.1, являющееся химерным моноклональным антителом.
  7. 7. Изолированное антитело по п.6, содержащее константные участки Су1 или Су4.
  8. 8. Изолированное антитело по п.1, являющееся гуманизированным моноклональным антителом.
  9. 9. Изолированное антитело по п.1, являющееся человеческим моноклональным антителом.
  10. 10. Изолированное антитело по п.1, являющееся биспецифическим или мультиспецифическим антителом.
  11. 11. Изолированное антитело по п.1, являющееся химерным антителом.
  12. 12. Изолированное антитело по п.1, являющееся одноцепочечным антителом, дисульфидсвязанным Εν3, однониточным Εν3 или антиидиотипическим антителом.
  13. 13. Фрагмент антитела по п.1, являющийся фрагментом ЕаЬ, фрагментом Е(аЬ')2, фрагментом, содержащим УЪ, фрагментом, содержащим УН, или фрагментом, содержащим комплементарно определяющий участок (СОЯ).
    - 84 011504
  14. 14. Антитело по п.1, продуцируемое гибридомой 4Е7 (АТСС® № РТА-5109), 7А11 (АТСС® № РТА-5110), 7С6 (АТСС® № РТА-5111), 7Е10 (АТСС® № РТА-5112), 7610 (АТСС® № РТА-5245), 7Н1 (АТСС® № РТА-5114), 8А1 (АТСС® № РТА-5115), 8В5 (АТСС®№ РТА-5116), 8С3 (АТСС® № РТА-5246), 8Е3 (АТСС® № РТА-5118), 869 (АТСС® № РТА-5119), 15С9 (АТСС® № РТА-5106), 16С7 (АТСС® № РТА-5107), 16Н9 (АТСС® № РТА-5108), 117.1 (АТСС® № РТА-4567), 325.1 (АТСС® № РТА-5120), 368.1 (АТСС® № РТА-4568), 446.1 (АТСС® № РТА-5549), 501.1 (АТСС® № РТА-4569),
    621.1 (АТСС® № РТА-5121), 633.1 (АТСС® № РТА-5122), 654.1 (АТСС® № РТА-5247), 725.1 (АТСС® № РТА-5124) или 776.1 (АТСС® № РТА-4570).
  15. 15. Гибридома, продуцирующая антитело по п.1, выбранная из группы, включающей 4Е7 (АТСС® № РТА-5109), 7А11 (АТСС® № РТА-5110), 7С6 (АТСС® № РТА-5111), 7Е10 (АТСС® № РТА-5112), 7610 (АТСС® № РТА-5245), 7Н1 (АТСС® № РТА-5114), 8А1 (АТСС® № РТА-5115), 8В5 (АТСС® № РТА-5116), 8С3 (АТСС® № РТА-5246), 8Е3 (АТСС® № РТА-5118), 869 (АТСС® № РТА-5119), 15С9 (АТСС® № РТА-5106), 16С7 (АТСС®№ РТА-5107), 16Н9 (АТСС® № РТА-5108), 117.1 (АТСС® № РТА-4567), 325.1 (АТСС® № РТА-5120), 368.1 (АТСС® № РТА-4568), 446.1 (АТСС® № РТА-5549),
    501.1 (АТСС® № РТА-4569), 621.1 (АТСС® № РТА-5121), 633.1 (АТСС® № РТА-5122), 654.1 (АТСС® № РТА-5247), 725.1 (АТСС® № РТА-5124), 776.1 (АТСС® № РТА-4570).
  16. 16. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8Е6 ΙΌ № 27, 29, 31, 33, 54 или 56.
  17. 17. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8Е6 ΙΌ № 28, 30, 32, 34, 53 или 55.
  18. 18. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 27, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 28.
  19. 19. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 29, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 30.
  20. 20. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 31, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 32.
  21. 21. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 33, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 34.
  22. 22. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 54, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 53.
  23. 23. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.16, 17, содержащие вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 56, и вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность № 55.
  24. 24. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой или тяжелой цепи антитела или фрагмента антитела по любому из пп.16, 17.
  25. 25. Молекула нуклеиновой кислоты по п.24, содержащая нуклеотидные последовательности № 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 52, 57, 58 или 59.
  26. 26. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, связывающее клеточный полипептид с последовательностью 8Е6 № 1, с Кд менее приблизительно 100, менее приблизительно 10, менее приблизительно 1 нм, менее приблизительно 100 или менее приблизительно 10 пм, по измерению методом анализа аффинности В1Асоге.
  27. 27. Антитело или фрагмент антитела по п.1, модифицированные аминокислотными заменами, удалениями или добавлениями либо их комбинацией и обладающие одинаковой или повышенной аффинностью к клеточному СА 125/0772Р по сравнению с соответствующими немодифицированными антителом или фрагментом антитела.
  28. 28. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, модифицированные аминокислотными заменами, удалениями или добавлениями либо их комбинацией и демонстрирующие аналогичное или повышенное время полужизни в сравнении с соответствующими немодифицированными антителом или фрагментом антитела.
  29. 29. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, опосредующие лизис СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток при анализе методом АЭСС.
  30. 30. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.29, опосредующие не менее чем 10%-ный лизис СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе методом АЭСС при отношении эффектор: мишень 50:1, отношении эффектор: мишень 25:1 или отношении эффектор:мишень 12,5:1 при концентрации антитела или фрагмента антитела 5,0 мкг/мл.
    - 85 011504
  31. 31. Изолированное антитело или фрагмент антитела по любому из пп.29, 30, опосредующие не менее чем 10%-ный лизис СА 125/0772Р-положительных опухолевых клеток при анализе методом АЭСС при отношении эффектор: мишень 12,5:1 при концентрации антитела или фрагмента антитела 50,0 нг/мл.
  32. 32. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, опосредующие лизис СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток при анализе комплементзависящей цитотоксичности (СЭС).
  33. 33. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.32, опосредующие лизис в диапазоне от 15% при концентрации антитела или фрагмента антитела 5 мкг/мл до 95% при концентрации антитела или фрагмента антитела 0,1 мкг/мл.
  34. 34. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, ингибирующие рост СА 125/0772Рположительных опухолевых клеток.
  35. 35. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент антитела по п.2 и фармацевтически приемлемый носитель.
  36. 36. Изделие, включающее в себя упаковочный материал и фармацевтическую композицию по п.35 в форме, пригодной для введения пациенту.
  37. 37. Слитый полипептид, содержащий антитело или фрагмент антитела по п.1, функционально связанные с гетерологичным агентом.
  38. 38. Способ идентификации антитела или фрагмента антитела по п.1, включающий:
    (a) инкубирование антитела или фрагмента антитела с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р, в присутствии культурального СА 125/0772Р в условиях, обеспечивающих связывание антитела или фрагмента антитела с указанным пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р, или культуральным СА 125/0772Р;
    (b) удаление культурального СА 125/0772Р и антитела или фрагмента антитела, не связанных с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р;
    (c) измерение количества антитела или фрагмента антитела, связанных с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р; и (ά) сравнение количества антитела или фрагмента антитела, полученного согласно (с), с количеством антитела или фрагмента антитела, связывающих пептид, содержащий клеточный СА 125/0772Р, в отсутствие культурального СА 125/0772Р.
  39. 39. Способ по п.38, в котором пептид, содержащий клеточный СА 125/0772Р, иммобилизован на твердой поверхности.
  40. 40. Способ по п.39, выполняемый в формате ЕЫ8А.
  41. 41. Способ по п.38, в котором культуральный СА 125/0772Р и пептид, содержащий клеточный СА 125/0772Р, используют в соотношении 25:1 (по весу) культурального СА 125/0772Р к пептиду, содержащему клеточный СА 125/0772Р.
  42. 42. Способ идентификации антитела или фрагмента антитела по п.1, включающий:
    (a) обеспечение контактирования антитела или фрагмента антитела с пептидом, содержащим клеточный СА 125/0772Р, в присутствии культурального СА 125/0772Р в условиях, обеспечивающих связывание пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, с антителом или фрагментом антитела;
    (b) удаление несвязанного пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р;
    (c) измерение количества пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, связанного антителом или фрагментом антитела, и (ά) сравнение количества пептида, полученного на стадии (с), с количеством пептида, содержащего клеточный СА 125/0772Р, которое антитело или фрагмент антитела связывают в отсутствие культурального СА 125/0772Р.
  43. 43. Способ по п.42, в котором количество культурального СА 125/0772Р является приблизительно 25-кратным (по весу) избыточным количеством.
  44. 44. Способ по п.42, в котором антитело или фрагмент антитела иммобилизированы на твердой поверхности.
  45. 45. Способ по п.44, выполняемый в формате ЕЫ8А.
  46. 46. Способ идентификации антитела или фрагмента антитела по п.1, включающий:
    (a) обеспечение контактирования антитела или фрагмента антитела с клеткой, экспрессирующей СА 125/0772Р, в присутствии определенного количества культурального СА 125/0772Р в условиях, обеспечивающих связывание СА 125/0772Р с антителом или фрагментом антитела;
    (b) удаление несвязанных клеток;
    (c) измерение количества клеток, экспрессирующих СА 125/0772Р, связанных антителом или фрагментом антитела, и (ά) сравнение количества клеток согласно (с) с количеством клеток, экспрессирующих СА 125/0772Р, которые связались с антителом или фрагментом антитела в отсутствие указанного определенного количества культурального СА 125/0772Р.
  47. 47. Способ по п.46, в котором количество культурального СА 125/0772Р составляет не менее 0,5 мг/мл.
    - 86 011504
  48. 48. Способ по п.46, в котором измерения выполняют методом проточной цитометрии или сортировки клеток, активированных флуоресценцией.
  49. 49. Гибридома, продуцирующая антитело по п.1.
  50. 50. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.1, конъюгированные с цитотоксическим агентом.
  51. 51. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.50, в котором цитотоксический агент является радиоизотопом.
  52. 52. Изолированное антитело или фрагмент антитела по п.51, в котором радиоизотоп выбран из группы, состоящей из 1251, 1311, ш1п, 99тТс и 90Υ.
  53. 53. Моноклональное антитело по п.14, конъюгированное с цитотоксическим агентом.
  54. 54. Моноклональное антитело по п.53, в котором цитотоксический агент является радиоизотопом.
  55. 55. Моноклональное антитело по п.54, в котором радиоизотоп выбран из группы, состоящей из 1251, 1311, ш1п, 99тТс и 90Υ.
  56. 56. Фармацевтическая композиция по п.35, в которой антитело или фрагмент конъюгированы с цитотоксическим агентом.
  57. 57. Фармацевтическая композиция по п.56, в которой цитотоксическим агентом является радиоизотоп.
  58. 58. Фармацевтическая композиция по п.57, в которой радиоизотоп выбран из группы, состоящей из 1251, 1311, П11п, 99тТс и 90Υ.
  59. 59. Моноклональное антитело по п.1, выбранное из группы, состоящей из 325.1 (АТСС® № РТА-5120), 621.1 (АТСС® № РТА-5121), 633.1 (АТСС® № РТА-5122), 654.1 (АТСС® № РТА-5247),
    725.1 (АТСС® № РТА-5124), 869 (АТСС® № РТА-5119), 7Е10 (АТСС® № РТА-5112), 8А1 (АТСС® № РТА-5115), 8С3 (АТСС® № РТА-5246), 15С9 (АТСС® № РТА-5106), 8Е3 (АТСС® № РТА-5118), 8В5 (АТСС® № РТА-5116), 7610 (АТСС® № РТА-5245), 16С7 (АТСС® № РТА-5107), 7С6 (АТСС® № РТА-5111), 7Н1 (АТСС® № РТА-5114), 16Н9 (АТСС® № РТА-5108), 7А11 (АТСС® № РТА-5110), 4Е7 (АТСС® № РТА-5109), 117.1 (АТСС® № РТА-4567), 368.1 (АТСС® № РТА-4568), 446.1 (АТСС® № РТА-5540), 501.1 (АТСС® № РТА-4509) и 776.1 (АТСС® № РТА-4570), или фрагмент данного антитела.
  60. 60. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по п.59 либо связывающий антиген фрагмент данного антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
  61. 61. Применение антитела или фрагмента антитела по п.1 для изготовления лекарства для лечения заболеваний, связанных с СА 125/0772Р.
  62. 62. Применение по п.61, при котором заболеванием, связанным с СА 125/0772Р, является заболевание, связанное с пролиферацией клеток.
  63. 63. Применение по п.61, при котором антитело выбрано из группы, состоящей из 325.1, 621.1, 633.1,
    654.1, 725.1, 869, 7Е10, 8А1, 8С3, 15С9, 8Е3, 8В5, 7610, 16С7, 7С6, 7Н1, 16Н9, 7А11, 4Е7, 117.1, 368.1,
    446.1, 501.1 и 776.1.
  64. 64. Применение по любому из пп.61-63, при котором антитело или фрагмент антитела конъюгированы с цитотоксическим агентом.
EA200500647A 2002-10-16 2003-10-15 Антитела, связывающие клеточные полипептиды са 125/0772р, и способы их применения EA011504B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41882802P 2002-10-16 2002-10-16
US48598603P 2003-07-10 2003-07-10
PCT/US2003/032945 WO2004035537A2 (en) 2002-10-16 2003-10-15 Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200500647A1 EA200500647A1 (ru) 2006-02-24
EA011504B1 true EA011504B1 (ru) 2009-04-28

Family

ID=32110191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200500647A EA011504B1 (ru) 2002-10-16 2003-10-15 Антитела, связывающие клеточные полипептиды са 125/0772р, и способы их применения

Country Status (29)

Country Link
US (7) US7429382B2 (ru)
EP (5) EP2301965B1 (ru)
JP (3) JP4988201B2 (ru)
KR (2) KR101388611B1 (ru)
CN (1) CN101812134A (ru)
AR (2) AR041650A1 (ru)
AT (1) ATE502051T1 (ru)
AU (1) AU2003294232A1 (ru)
BR (1) BR0315270A (ru)
CA (1) CA2502367C (ru)
CL (1) CL2010001209A1 (ru)
CY (2) CY1111966T1 (ru)
DE (1) DE60336406D1 (ru)
DK (3) DK2891666T3 (ru)
EA (1) EA011504B1 (ru)
ES (3) ES2363221T3 (ru)
HK (3) HK1086283A1 (ru)
HU (1) HUE034378T2 (ru)
IL (1) IL168058A (ru)
LT (1) LT2891666T (ru)
MX (1) MXPA05003884A (ru)
MY (1) MY139767A (ru)
NO (1) NO20052395L (ru)
NZ (1) NZ563328A (ru)
PT (3) PT2891666T (ru)
RS (1) RS20050300A (ru)
SI (3) SI1551876T1 (ru)
UY (1) UY28028A1 (ru)
WO (1) WO2004035537A2 (ru)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1536814A4 (en) * 2002-07-03 2006-02-15 Immunogen Inc ANTIBODIES AGAINST MUC1 AND MUC16 NOT RELEASED AND USES THEREOF
CA2502367C (en) 2002-10-16 2013-12-10 Euro-Celtique S.A. Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof
US20090226367A1 (en) * 2005-03-11 2009-09-10 Euro-Celtique S.A. Compositions comprising an anti-ca125 antibody and a cytotoxic compound and their use for the treatment of cancer
USRE47223E1 (en) 2005-06-20 2019-02-05 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2611778C (en) 2005-06-20 2012-11-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CN101595130B (zh) * 2005-06-20 2012-05-16 健泰科生物技术公司 用于肿瘤诊断和治疗的组合物和方法
PT2298815E (pt) 2005-07-25 2015-07-16 Emergent Product Dev Seattle Moléculas de ligaçao especificas para cd37 e especificas para cd20
FI118735B (fi) * 2005-09-13 2008-02-29 Kemira Oyj Menetelmä peroksihappojen valmistamiseksi
US7420040B2 (en) * 2006-02-24 2008-09-02 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of TROP-2
MX2008015524A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Trubion Pharmaceuticals Inc Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora.
WO2008073578A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant genes involved in nitrate uptake and metabolism
PE20090245A1 (es) 2007-05-08 2009-03-17 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugados de anticuerpos y farmacos
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
EP2419451A4 (en) 2009-04-14 2012-11-14 Proscan Rx Pharma Inc ANTIBODIES DIRECTED AGAINST THE PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN
CA2774260C (en) 2009-09-16 2018-10-09 Immunomedics, Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
WO2013040358A2 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Assays and compositions for detection of agr2
CN104662044B (zh) 2012-08-24 2018-10-30 加利福尼亚大学董事会 用于治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
CN105164159A (zh) * 2013-02-22 2015-12-16 施特姆森特克斯股份有限公司 新的抗体缀合物及其用途
EP3639841B1 (en) 2013-03-27 2023-09-06 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a
EP4105236A1 (en) 2013-07-19 2022-12-21 Cedars-Sinai Medical Center Anti-tl1a (tnfsf15) antibody for treatment of inflammatory bowel disease
CN105848671B (zh) 2013-08-28 2019-12-13 艾伯维施特姆森特克斯有限责任公司 位点特异性抗体缀合方法和组合物
MX2016010677A (es) 2014-02-21 2017-04-10 Abbvie Stemcentrx Llc Conjugados de anticuerpos anti-drosophila similar a delta 3 (anti-dll3) y medicamentos para usarse en el tratamiento contra melanoma.
PE20170289A1 (es) 2014-08-19 2017-04-05 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti tigit
US20190119385A1 (en) * 2015-03-27 2019-04-25 University Of Southern California Hla-g as a novel target for car t-cell immunotherapy
WO2016160618A2 (en) 2015-03-27 2016-10-06 University Of Southern California Car t-cell therapy directed to lhr for the treatment of solid tumors
AU2016307845B2 (en) 2015-08-14 2020-10-15 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-TIGIT antibodies
MY197562A (en) 2015-09-21 2023-06-23 Aptevo Res & Development Llc Cd3 binding polypeptides
WO2017161342A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing inflammatory bowel disease through rnaset2
MX2018016330A (es) 2016-06-27 2020-02-17 Univ California Combinaciones para tratamiento del cáncer.
SI3515487T1 (sl) 2016-09-23 2023-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecifična protitelesa proti-MUC16-CD3 in konjugati zdravil proti-MUC16
MY191324A (en) 2016-10-26 2022-06-15 Cedars Sinai Medical Center Neutralizing anti-tl1a monoclonal antibodies
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
AU2019247511A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
WO2019209995A2 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Precision Ibd, Inc. Optimized anti-tl1a antibodies
CA3156803A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-nrp2 antibodies
BR112022007720A2 (pt) 2019-10-24 2022-08-23 Prometheus Biosciences Inc Anticorpos humanizados para ligante 1a tnf-like (tl1a) e seus usos
CN112500488B (zh) * 2021-02-03 2021-05-04 盛誉乔 一种癌症检测试剂盒
CN117567634B (zh) * 2024-01-12 2024-03-26 北京纳百生物科技有限公司 一种犬胰脂肪酶单克隆抗体在检测试剂中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693762A (en) * 1988-12-28 1997-12-02 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO2002006317A2 (en) * 2000-07-17 2002-01-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer

Family Cites Families (226)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US2002A (en) * 1841-03-12 Tor and planter for plowing
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6225050B1 (en) 1986-04-18 2001-05-01 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
EP0257956B2 (en) 1986-08-19 2000-11-22 Genentech, Inc. Use of polypeptide growth factors and cytokines for the manufacture of a device and of a dispersion
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5059680A (en) * 1986-11-24 1991-10-22 Centocor, Inc. Method of isolating ca 125 antigen
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4921790A (en) * 1987-04-24 1990-05-01 Research Corporation Tumor specific assay for CA125 ovarian cancer antigen
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0377657A1 (en) 1987-08-19 1990-07-18 Centocor, Inc. Human ovarian tumor-associated antigen specific for monoclonal antibody ov-tl3
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
US6013531A (en) 1987-10-26 2000-01-11 Dade International Inc. Method to use fluorescent magnetic polymer particles as markers in an immunoassay
US5688657A (en) 1988-03-31 1997-11-18 International Bio-Immune Systems, Inc. Monoclonal antibodies against human colon carcinoma-associated antigens and uses therefor
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
US6156731A (en) 1989-05-10 2000-12-05 G. D. Searle & Co. Polypeptide composition for oral administration
US5897861A (en) 1989-06-29 1999-04-27 Medarex, Inc. Bispecific reagents for AIDS therapy
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
AU6031090A (en) * 1989-07-31 1991-03-11 University Of British Columbia, The Monoclonal antibodies against a tumor-associated antigen
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5532135A (en) 1990-02-02 1996-07-02 Cancer Research Fund Of Contra Costa Solid-phase competitive assay utilizing a fusion protein
US5091188A (en) 1990-04-26 1992-02-25 Haynes Duncan H Phospholipid-coated microcrystals: injectable formulations of water-insoluble drugs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6197299B1 (en) 1990-07-20 2001-03-06 Pharmacia & Upjohn Ab Antibody conjugates
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US6248332B1 (en) 1990-10-05 2001-06-19 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US6099842A (en) 1990-12-03 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
JP3431140B2 (ja) 1991-04-26 2003-07-28 サーフィス・アクティブ・リミテッド 抗体およびその使用方法
USRE37525E1 (en) 1991-05-01 2002-01-22 Henry M. Jackson Foundation Method for treating infectious respiratory diseases
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
JPH06508371A (ja) 1991-06-21 1994-09-22 ユニバーシティー オブ シンシナティ 経口投与できる治療用タンパク質及びその製法
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US6136310A (en) * 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
US5366866A (en) * 1991-07-25 1994-11-22 Duke University Method of diagnosing ovarian and endometrial cancer with monoclonal antibodies OXA and OXB
RU2142015C1 (ru) 1991-09-06 1999-11-27 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Фрагмент днк, кодирующий белок гелонина, и способ его получения, вектор, обеспечивающий экспрессию белка гелонина, рекомбинантный штамм e.coli - продуцент белка гелонина
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5976818A (en) 1991-12-16 1999-11-02 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Monoclonal antibodies which identify the glycoprotein carrying the CA 125 epitope
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
WO1993017715A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
JPH08501085A (ja) 1992-08-26 1996-02-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0661989T3 (da) 1992-09-21 1998-03-02 Upjohn Co Proteinsammensætninger med vedvarende frigivelse
US6277410B1 (en) 1992-10-08 2001-08-21 Supratek Pharma Inc. Copolymer compositions for oral delivery
US5441050A (en) 1992-12-18 1995-08-15 Neoprobe Corporation Radiation responsive surgical instrument
US5863985A (en) 1995-06-29 1999-01-26 Kinerton Limited Ionic molecular conjugates of biodegradable polyesters and bioactive polypeptides
US6221958B1 (en) 1993-01-06 2001-04-24 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Ionic molecular conjugates of biodegradable polyesters and bioactive polypeptides
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US5648218A (en) 1993-02-12 1997-07-15 Sealite Sciences, Inc. Preparation of photoprotein conjugates and methods of use thereof
EP0684814B1 (en) 1993-02-22 1998-06-17 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
JPH06247842A (ja) 1993-02-23 1994-09-06 Green Cross Corp:The リポソーム組成物の製造方法
US5556623A (en) 1993-03-30 1996-09-17 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5428156A (en) 1993-04-02 1995-06-27 Associated Universities, Inc. Synthesis of macrocyclic polyaminocarboxylates and their use for preparing stable radiometal antibody immunoconjugates for therapy, spect and pet imaging
US5744119A (en) 1993-05-11 1998-04-28 Sterling Winthrop Preparation of a radioconjugate formulation
ATE189122T1 (de) 1993-05-27 2000-02-15 Uwe Dr Med Wagner Monoklonale anti-idiotypische anti - ca125 antikörper und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzung
UA40577C2 (ru) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Биспецифическая молекула, которая используется для лизиса опухолевых клеток, способ ее получения, моноклональное антитело (варианты), фармацевтический препарат, фармацевтический набор (варианты), способ удаления опухолевых клеток
WO1995005864A1 (en) 1993-08-27 1995-03-02 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Convection-enhanced drug delivery
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
ATE243745T1 (de) 1994-01-31 2003-07-15 Univ Boston Bibliotheken aus polyklonalen antikörpern
ATE203274T1 (de) 1994-02-01 2001-08-15 Nasa Fusionierte proteine die antikörper-teile und nicht-antikörper-teile enthalten
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5596081A (en) 1994-03-11 1997-01-21 University Of Kentucky Research Foundation Nucleotide or nucleoside photoaffinity compound modified antibodies, methods for their manufacture and use thereof as diagnostics and therapeutics
MXPA96004705A (es) 1994-04-14 2004-08-19 Adcock Ingram Ltd Metodo para detectar la presencia de una especie de microbacteria y un juego de implementos y anticuerpos para su uso en ese aspecto.
AU2589095A (en) 1994-05-16 1995-12-05 Washington University Cell membrane fusion composition and method
US5994151A (en) 1994-05-17 1999-11-30 Richard-James, Inc. Selenium carrier conjugates
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
ATE306930T1 (de) 1994-08-12 2005-11-15 Immunomedics Inc Für b-zell-lymphom und leukämiezellen spezifische immunkonjugate und humane antikörper
EP0706799B1 (en) 1994-09-16 2001-11-14 MERCK PATENT GmbH Immunoconjugates II
WO1996010585A1 (en) 1994-09-30 1996-04-11 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
US6376170B1 (en) 1994-10-03 2002-04-23 The Scripps Research Institute Ligand capture-directed selection of antibody
AU700903B2 (en) 1994-10-12 1999-01-14 Focal, Inc. Targeted delivery via biodegradable polymers
US5690935A (en) 1995-01-13 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Biotherapy of cancer by targeting TP-3/P80
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
WO1996022111A1 (en) 1995-01-19 1996-07-25 Sound Science Limited Partnership Local delivery and monitoring of drugs
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
GB9506946D0 (en) 1995-04-04 1995-05-24 Univ Strathclyde Microgels
SE9501302D0 (sv) 1995-04-07 1995-04-07 Bioinvent Internatioal Ab Antibodies for use in cancertherapy and diagnosis
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
KR19980703876A (ko) 1995-04-14 1998-12-05 스티븐 엘. 허스트 분산성이 개선된 분말화된 약학적 조성물
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5817624A (en) 1995-06-05 1998-10-06 Alza Corporation Permeation enhancer compositions for increased absorption of therapeutic proteins through the colonic membrane
US5817789A (en) 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US5759519A (en) 1995-06-07 1998-06-02 Gen-Probe Incorporated Method for the intracellular delivery of biomolecules using thiocationic lipids
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5879712A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sri International Method for producing drug-loaded microparticles and an ICAM-1 dosage form so produced
CA2224381A1 (en) 1995-06-27 1997-01-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing sustained-release preparation
US6140470A (en) 1995-06-30 2000-10-31 Yale University Human monoclonal anti-tumor antibodies
US5871941A (en) * 1995-07-28 1999-02-16 Univ British Columbia Method of testing expression of CA125 antigen in cultured ovarian surface epithelial cells to identify and monitor individuals having a predisposition to develop ovarian cancer
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
DE69629580D1 (de) 1995-10-13 2003-09-25 Us Gov Health & Human Serv Immunotoxin enthaltend ein disulfid-stabilisiertes antikörperfragment
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6194177B1 (en) 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
WO1997035563A2 (en) 1996-03-28 1997-10-02 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation and its production
ATE273320T1 (de) 1996-04-11 2004-08-15 Univ British Columbia Fusogene liposomen
WO1997042973A1 (en) 1996-05-15 1997-11-20 Altarex, Corp. Method and composition for reconforming multi-epitopic antigens to initiate an immune response
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5800421A (en) 1996-06-12 1998-09-01 Lemelson; Jerome H. Medical devices using electrosensitive gels
US6110750A (en) 1996-06-28 2000-08-29 Sugden; Edward A. Rapid detection method of Mycobacterium bovis by fluorescence polarization
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6066325A (en) 1996-08-27 2000-05-23 Fusion Medical Technologies, Inc. Fragmented polymeric compositions and methods for their use
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US6420140B1 (en) 1996-10-11 2002-07-16 Abgenix, Inc. Production of multimeric protein by cell fusion method
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6284375B1 (en) 1996-10-18 2001-09-04 Tuo Jin Lipid vesicle system
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US5968895A (en) 1996-12-11 1999-10-19 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulations for sustained drug delivery
ATE233088T1 (de) 1996-12-20 2003-03-15 Takeda Chemical Industries Ltd Verfahren zur herstellung einer zusammensetzung mit verzoegerter abgabe
JPH10212246A (ja) 1997-01-30 1998-08-11 Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd 経口投与用製剤
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US7227002B1 (en) 1997-04-14 2007-06-05 Micromet Ag Human antibodies that bind human 17-A1/EpCAM tumor antigen
US6020004A (en) 1997-04-17 2000-02-01 Amgen Inc. Biodegradable microparticles for the sustained delivery of therapeutic drugs
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
AU7274898A (en) 1997-05-07 1998-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Recombinant antibody-enzyme fusion proteins
JP3779798B2 (ja) 1997-06-26 2006-05-31 シスメックス株式会社 Ｃａ１２５の測定方法
US6207805B1 (en) 1997-07-18 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Prostate cell surface antigen-specific antibodies
US6238667B1 (en) 1997-09-19 2001-05-29 Heinz Kohler Method of affinity cross-linking biologically active immunogenic peptides to antibodies
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
US6008002A (en) 1997-09-29 1999-12-28 Bodey; Bela Immunomagnetic detection and isolation of cancer cells
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
KR20010031713A (ko) 1997-11-03 2001-04-16 벤슨 로버트 에이치. 맥관형성 및 종양 성장 억제제인 맥관 내피 세포 성장억제제
US6197523B1 (en) 1997-11-24 2001-03-06 Robert A. Levine Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer and/or hematologic progenitor cells in whole blood
US6362276B1 (en) 1998-01-07 2002-03-26 Debio Recherche Pharmaceutique S.A. Degradable heterobifunctional poly(ethylene glycol) acrylates and gels and conjugates derived therefrom
US6074689A (en) 1998-03-10 2000-06-13 Immucell Corporation Colonic delivery of protein or peptide compositions
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US6962980B2 (en) * 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6488931B1 (en) * 1998-12-17 2002-12-03 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) * 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) * 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6528253B1 (en) * 1998-12-17 2003-03-04 Corixa Corporation Compositions and methods for diagnosis of ovarian cancer
US6699664B1 (en) * 1998-12-17 2004-03-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6670463B1 (en) * 1998-12-17 2003-12-30 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
KR100288103B1 (ko) 1998-12-26 2001-05-02 윤덕용 폴리에테르가 그라프트된 생분해성 지방족 폴리에스테르 및 그의 제조방법
US6365173B1 (en) 1999-01-14 2002-04-02 Efrat Biopolymers Ltd. Stereocomplex polymeric carriers for drug delivery
US6362317B1 (en) 1999-07-12 2002-03-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-γ-H2A antibody, fusion proteins thereof and method and kit for determining DNA double-stranded breaks
US6376654B1 (en) 1999-08-13 2002-04-23 Molecular Discoveries, Llc Myeloma cell and ovarian cancer cell surface glycoproteins, antibodies thereto, and uses thereof
EP1248800A2 (en) 1999-11-30 2002-10-16 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
US20020081609A1 (en) 1999-11-30 2002-06-27 Dillon Davin C. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
AU3483001A (en) * 2000-02-04 2001-08-14 Corixa Corp Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030008299A1 (en) * 2000-02-04 2003-01-09 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2001060860A2 (en) 2000-02-17 2001-08-23 Millennium Predictive Medicine, Inc. Genes differentially expressed in human prostate cancer and their use
AU2001252917A1 (en) 2000-03-17 2001-10-03 Human Genome Sciences, Inc. 7 human ovarian and ovarian cancer associated proteins
US20030165831A1 (en) 2000-03-21 2003-09-04 John Lee Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
AU2001253140A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
JP2003532687A (ja) 2000-05-11 2003-11-05 アルタレックス コーポレイション 抗原−抗体複合体化および樹状細胞による提示を利用する治療法および組成物
AU2001266787A1 (en) 2000-06-07 2002-01-08 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001276018A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Regents Of The University Of Minnesota Radiolabeled immunotoxins
AU2002258518A1 (en) 2001-03-14 2002-09-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
CA2440747A1 (en) 2001-03-15 2002-09-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2002335932B2 (en) 2001-03-21 2007-11-01 Altarex Medical Corp. Therapeutic compositions that alter the immune response
US7309760B2 (en) 2001-04-17 2007-12-18 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the CA125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
JP5232350B2 (ja) * 2001-04-17 2013-07-10 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー Ｃａ１２５遺伝子のリピート配列並びに診断および治療的介入のためのその使用
AU2002344326A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, ca125, and uses thereof
US7205142B2 (en) * 2001-05-11 2007-04-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, CA125, and uses thereof
EP1256354A1 (en) 2001-05-11 2002-11-13 Schering Corporation Methods for treating cancer
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
DE10210239A1 (de) 2002-03-08 2003-09-25 Cellcontrol Biomedical Lab Ag Spezifische Ab1'-Antikörper gegen das Tumor-assoziierte Antigen CA125
CA2420494A1 (en) 2003-02-28 2004-08-28 Universite De Sherbrooke Ca 125 tumor antigen function and therapeutic uses thereof
EP1536814A4 (en) * 2002-07-03 2006-02-15 Immunogen Inc ANTIBODIES AGAINST MUC1 AND MUC16 NOT RELEASED AND USES THEREOF
CA2502367C (en) 2002-10-16 2013-12-10 Euro-Celtique S.A. Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof
WO2004045553A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
CA2747029C (en) 2003-10-24 2013-11-26 Cleveland Gas Systems Llc Spinning impingement multiphase contacting device

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5693762A (en) * 1988-12-28 1997-12-02 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO2002006317A2 (en) * 2000-07-17 2002-01-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer

Also Published As

Publication number Publication date
EP2298806A1 (en) 2011-03-23
MXPA05003884A (es) 2005-10-05
KR20050083774A (ko) 2005-08-26
HUE034378T2 (en) 2018-02-28
CY1119551T1 (el) 2018-03-07
SI2301965T1 (sl) 2015-07-31
EP1551876A4 (en) 2005-12-14
US20050064518A1 (en) 2005-03-24
ES2363221T3 (es) 2011-07-27
JP5480212B2 (ja) 2014-04-23
US20130281673A1 (en) 2013-10-24
KR101388611B1 (ko) 2014-04-23
ES2641525T3 (es) 2017-11-10
EP2301965B1 (en) 2015-02-25
IL168058A0 (en) 2011-08-01
CA2502367A1 (en) 2004-04-29
NZ563328A (en) 2009-08-28
EP2301965A1 (en) 2011-03-30
JP2010189392A (ja) 2010-09-02
EP1551876A2 (en) 2005-07-13
JP2012034692A (ja) 2012-02-23
CY1111966T1 (el) 2015-11-04
DK1551876T3 (da) 2011-06-14
US20180105601A1 (en) 2018-04-19
EP2891666B1 (en) 2017-06-28
HK1086283A1 (en) 2006-09-15
NO20052395L (no) 2005-05-18
US9676866B2 (en) 2017-06-13
BR0315270A (pt) 2005-08-30
JP4988201B2 (ja) 2012-08-01
ATE502051T1 (de) 2011-04-15
PT2891666T (pt) 2017-09-22
WO2004035537A3 (en) 2004-11-04
EA200500647A1 (ru) 2006-02-24
ES2535742T3 (es) 2015-05-14
CL2010001209A1 (es) 2011-04-01
US20110158904A1 (en) 2011-06-30
SI1551876T1 (sl) 2011-07-29
DK2301965T3 (en) 2015-04-27
EP1551876B1 (en) 2011-03-16
EP2891666A1 (en) 2015-07-08
JP5109031B2 (ja) 2012-12-26
EP3301114A1 (en) 2018-04-04
KR20120053067A (ko) 2012-05-24
PT1551876E (pt) 2011-06-27
US8124086B2 (en) 2012-02-28
US20120149892A1 (en) 2012-06-14
RS20050300A (en) 2007-08-03
UY28028A1 (es) 2004-05-31
AR041650A1 (es) 2005-05-26
SI2891666T1 (sl) 2017-11-30
WO2004035537A8 (en) 2005-05-06
DE60336406D1 (de) 2011-04-28
PT2301965E (pt) 2015-05-20
HK1253243A1 (zh) 2019-06-14
CA2502367C (en) 2013-12-10
MY139767A (en) 2009-10-30
WO2004035537A2 (en) 2004-04-29
HK1208472A1 (en) 2016-03-04
DK2891666T3 (en) 2017-10-02
CN101812134A (zh) 2010-08-25
US8299230B2 (en) 2012-10-30
AR085874A2 (es) 2013-10-30
AU2003294232A1 (en) 2004-05-04
LT2891666T (lt) 2017-10-10
US20190106508A1 (en) 2019-04-11
JP2006508181A (ja) 2006-03-09
IL168058A (en) 2013-05-30
US20150094454A1 (en) 2015-04-02
US7429382B2 (en) 2008-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011504B1 (ru) Антитела, связывающие клеточные полипептиды са 125/0772р, и способы их применения
Jones et al. Assessment of aldehyde dehydrogenase in viable cells
EA026990B1 (ru) Антитела, связывающиеся с человеческой клеткой dec-205
CN1894275B (zh) 模仿人epo的铰链核心模仿体、组合物、方法和用途
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
FI75363C (fi) Foerfarande foer framstaellning av en monoklonal antikropp mot maenniskans hjaelpar-t-celler, medelst en ny hybridcellinje.
UA104130C2 (ru) Антитело, которое специфически связывается с il-4 и il-13 и способ лечения астмы у млекопитающего с помощью такого антитела
US6579692B1 (en) Method of screening apoptosis inducing substances
EA010594B1 (ru) Слитые белки taci-иммуноглобулина
EA020465B1 (ru) ИЗОЛИРОВАННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ErbB3, НАБОРЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИХ СОДЕРЖАЩИЕ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
HU229523B1 (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
EA024701B1 (ru) Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение
EA007617B1 (ru) Моноклональное антитело к двойному интегриновому белку и его фрагмент, фармацевтическая композиция и способ лечения
EA023555B1 (ru) АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ c-fms ЧЕЛОВЕКА
EA006673B1 (ru) Антитела против il-12 и способы их применения
EA030313B1 (ru) СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ IgM, IgG И IgA У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ЭТОГО СПОСОБА
EA023032B1 (ru) Человеческие антитела, связывающие ген активации лимфоцитов-3 (lag-3), и их применение
UA127584C2 (uk) Антитіла для лікування ракових захворювань, при яких експресується клаудин 6
EA014229B1 (ru) Антитело против мср-1, содержащие его композиции и способы применения антитела и композиций
RO117110B1 (ro) POLIPEPTIDA LIGAND mpl, ACID NUCLEIC, CARE O CODIFICA, VECTOR DE EXPRESIE, PROCEDEU PENTRU PRODUCEREA POLIPEPTIDEI LIGAND, SI COMPOZITIE FARMACEUTICA CU ACEASTA
UA117446C2 (uk) Гуманізоване антитіло до cxcr5
JPH01501388A (ja) 標的細胞の死滅を目的とするエフエクター細胞の生体外活性化
EA019636B1 (ru) Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения
UA103297C2 (ru) Способ лечения заболевания, связанного с иммунитетом, путем одновременного нацеливания на il-17a и il-17f антител-антагонистов
EA016342B1 (ru) АНТИ-αβ-АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU