EA006673B1 - Антитела против il-12 и способы их применения - Google Patents

Антитела против il-12 и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA006673B1
EA006673B1 EA200300137A EA200300137A EA006673B1 EA 006673 B1 EA006673 B1 EA 006673B1 EA 200300137 A EA200300137 A EA 200300137A EA 200300137 A EA200300137 A EA 200300137A EA 006673 B1 EA006673 B1 EA 006673B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
antibodies
human
cells
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200300137A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300137A1 (ru
Inventor
Джилл Джайлс-Комар
Дэвид М. Найт
Дэвид Перитт
Бернард Скэллон
Дэвид Шили
Original Assignee
Сентокор, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27397221&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA006673(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Сентокор, Инк. filed Critical Сентокор, Инк.
Publication of EA200300137A1 publication Critical patent/EA200300137A1/ru
Publication of EA006673B1 publication Critical patent/EA006673B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A61P23/02—Local anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к выделенному антителу против IL-12 млекопитающего, кодирующей его молекуле нуклеиновой кислоты, клеткам-хозяевам, содержащим такие молекулы нуклеиновой кислоты, композициям, включающим антитело против IL-12 млекопитающего, и способу диагностики или лечения связанного с IL-12 состояния в организме животного.

Description

Данное изобретение относится к антителам, включая определенные части или варианты, специфичные, по меньшей мере, по отношению к одному белку интерлейкина-12 (1Ь-12) или его фрагменту, а также к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие анти-1Ь-12-антитела, комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам, способам их получения и применения, включая приготовление терапевтических композиций, введение и устройства.
Область техники
Интерлейкин-12 (1Ь-12)является гетеродимерным цитокином, состоящим из гликозилированных полипептидных цепей с молекулярной массой 35 и 40 кД, которые связаны дисульфидной связью. Цитокин синтезируется и секретируется антигенпрезентирующими клетками, включая дендритные клетки, моноциты, макрофаги, В-клетки, клетки Лангерганса и кератиноциты, а также природные клеткикиллеры (ΝΚ). 1Ь-12 опосредует множество биологических процессов и был назван стимулирующим фактором ΝΚ-клеток (ΝΚ8Ε), стимулирующим фактором Т-клеток, фактором созревания цитотоксических Т-лимфоцитов и фактором линии В-клеток, трансформированных ЕВУ (СшТк, ТН.АД., с1 а1., С11шса1 М1стоЫо1оду Кс\зс\\ъ. 10:742-780 (1997)).
Интерлейкин-12 может связываться с рецептором 1Ь-12, экспрессированным на плазматической мембране клеток (например, Т-клеток, клеток ΝΚ), изменяя тем самым (например, инициируя, предотвращая) биологические процессы. Например, связывание 1Ь-12 с рецептором 1Ь-12 может стимулировать пролиферацию предварительно активированных Т-клеток и ΝΚ-клеток, усиливать цитолитическую активность цитотоксических Т-клеток (СТЬ), ΝΚ-клеток и клеток ЬАК (лимфокинактивированные клеткикиллеры), индуцировать продукцию гамма-интерферона (ΙΕΝ-гамма) Т-клетками и ΝΚ-клетками и индуцировать дифференцировку «нативных» клеток Т110 в клетки ТЫ, которые продуцируют ΙΕΝ-гамма и 1Ь2 (ТппсЫеп, О., Аппиа1 Ре\зе\\· о£ 1тшипо1оду, 13:251-276 (1995)). В частности, Ш-12 необходим для образования цитолитических клеток (например, ΝΚ, СТЬ) и для усиления клеточного иммунного ответа (например, иммунного ответа, опосредованного ТЫ-клетками). Таким образом, Ш-12 чрезвычайно важен для формирования и регуляции как защитного иммунитета (например, эрадикации инфекций), так и патологических иммунных ответов (например, аутоиммунитета) (Неабг/ак, I. А. апб Втипба, МД., ЬаЬота1оту 1пуеШда1юп, 72:619-637 (1995)).
Следовательно, иммунный ответ (например, защитный или патогенный) можно усилить, подавить или предотвратить, манипулируя биологической активностью Ш-12 ш у1уо, например, с помощью антитела.
Химерные, поликлональные (например, антисыворотка) и/или моноклональные антитела (мАт) и фрагменты (например, продукты их протеолитического расщепления или продукты гибридных белков) млекопитающего, отличного от человека, являются потенциальными терапевтическими средствами, которые исследуют в некоторых случаях, пытаясь лечить определенные заболевания. Однако такие антитела или фрагменты при введении человеку могут вызывать иммунный ответ. Такой иммунный ответ может приводить к опосредованному иммунными комплексами клиренсу антител или фрагментов из кровотока и делает повторное введение неприемлемым для терапии, тем самым снижая терапевтическую пользу для пациента и ограничивая повторное введение антитела или фрагмента. Например, повторное введение антител или фрагментов, содержащих части нечеловеческих антител, может приводить к сывороточной реакции и/или анафилаксии. Чтобы избежать указанных и других проблем, использовали ряд способов для того, чтобы уменьшить иммуногенность таких антител и их частей, включая химеризацию и гуманизацию, которые известны в данной области. Однако указанные и другие способы еще могут давать антитела или фрагменты, обладающие некоторой иммуногенностью, низкой аффинностью, низкой авидностью или вызывать проблемы, связанные с культивированием клеток, увеличением масштаба, продуктивностью и/или низкими выходами. Таким образом, такие антитела или фрагменты могут далеко не идеально подходить для производства или применения в качестве терапевтических белков.
Таким образом, существует потребность в получении анти-1Е-12-антител или фрагментов, которые позволяют преодолеть еще одну из указанных проблем, а также в улучшении известных антител или их фрагментов.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к выделенным химерным, гуманизированным и/или СОД-привитым анти-1Е-12-антителам человека, примата, грызуна, млекопитающего, иммуноглобулинам, продуктам расщепления и их другим конкретным частям или вариантам, а также композициям анти-1Е-12-антитела, кодирующим или комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам, композициям, составам, устройствам, трансгенным животным, трансгенным растениям и способам их получения и применения, которые описаны и объясняются в данной заявке в комбинации с тем, что известно в данной области.
- 1 006673
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному анти-1Ь-12-антителу, которое описано в данной заявке. Антитело согласно данному изобретению включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, без ограничения, такую как по меньшей мере одна гипервариабельная область (ΟΌΡ) тяжелой или легкой цепи или его лиганд-связывающая часть, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи, константная область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасная область или любая их часть, которая может быть включена в антитело согласно данному изобретению. Антитело согласно изобретению может включать или может быть получено из антитела любого млекопитающего, такого как человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат, или из любых их комбинаций и тому подобное, но не ограничено указанным.
В одном аспекте данное изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим, комплементарным или гибридизующимся с полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одно 1Ь-12-антиидиотипическое антитело, содержащее по меньшее мере одну специфичную последовательность, домен, часть или вариант указанного антитела. Данное изобретение, кроме того, относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие 1Ь12-антиидиотипическое антитело, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антиидиотипических антител, векторов и/или клеток-хозяев.
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела или 1Ь-12-антиидиотипического антитела в клетке-хозяине, включающему культивирование клетки-хозяина, которая описана в данной заявке, в условиях, при которых, по меньшей мере, одно анти-1Ь-12-антитело экспрессируется в регистрируемых и/или выделяемых количествах.
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей (а) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-1Ь-12-антитело, и/или антитело, которое описано в данной заявке; и (Ь) подходящий носитель или разбавитель. Носитель или разбавитель может быть необязательно фармацевтически приемлемым, в соответствии с известными носителями и разбавителями. Композиция дополнительно необязательно может содержать по меньшей мере одно дополнительное соединение, белок или композицию.
Данное изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному способу или композиции анти-1Ь-12-антитела для введения терапевтически эффективного количества, чтобы модулировать или лечить по меньшей мере одно связанное с 1Ь-12 состояние клетки, ткани, органа, животного или пациента перед и/или после, и/или во время связанного состояния, которое описано в данной заявке.
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела согласно данному изобретению.
Данное изобретение, кроме того, относится по меньшей мере к одному способу или композиции анти-1Ь-12-антитела для диагностики по меньшей мере одного связанного с 1Ь-12 состояния клетки, ткани, органа, животного или пациента до и/или после, и/или во время связанного состояния, как описано в данной заявке.
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки с целью диагностики по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела согласно данному изобретению.
Описание фигур
Фиг. 1А и 1В представляют собой графики, показывающие зависимое от концентрации связывание анти-1Ь-12-мАт с иммобилизованным 1Ь-12 человека. Анти-1Ь-12-антитела серийно разводили в 1% БСА/ФСБ и инкубировали на планшетах, покрытых тЫЬ-12, в течение 1 ч при 37°С. Планшеты дважды промывали 0,02% твином 20 (полиоксиэтилен(20)сорбитанмонолаурат), 0,15М физиологическим раствором и затем исследовали с помощью меченного пероксидазой хрена (НВР)антитела козы, специфичного против каппа 1дС человека, в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты снова промывали, проявляли с помощью субстрата орто-фенилендиамина (ΟΡΌ) и измеряли оптическую плотность (ΟΌ) каждой лунки при 490 нм.
Фиг. 2: Дорожки слева направо на фиг. А и В содержат ΙΌ-12 человека, р40 ΙΌ-12 человека, мышиный ΙΌ-12 и предварительно окрашенные маркеры молекулярной массы. На фиг. 2А показаны полосы окрашенного суммарного белка. Основные полосы для каждой дорожки представляют собой ΙΌ-12 человека (75 кД), р40 ΙΌ-12 человека (40 кД) и мышиный ΙΌ-12 (75 кД). На фиг. 2В показан вестерн-блот, полученный из геля, идентичного гелю, показанному на фиг. 2А. Блот подвергали реакции с С340, затем с меченным НРР антителом козы против Ι§Ο человека и специфично выявляли только ΙΌ-12 (мономер или мультимеры) и р40 ΙΌ-12 человека. На контрольном блоте (не показан), который подвергали реакции с меченным НРР антителом козы против Ι§Ο человека, не наблюдали никаких полос.
Фиг. 3: Анализ с помощью обратной транскрипции-ПЦР экспрессии гена ΙΡΝγ в РВЬ человека, обработанных ΙΌ-2, ΙΌ-12, ΙΕ-2+ΙΕ-12 в присутствии или без анти-Ш-Р-антитела С340, 8.6.2, изотипического контрольного антитела. Суммарную РНК обратно транскрибировали, амплифицировали в ПЦР,
- 2 006673 используя геноспецифичные праймеры. Также определяли уровень мРНК β-актина в каждом образце, который служил в качестве контроля целостности и содержания мРНК.
Фиг. 4 является гистограммой, показывающей, что анти-1Ь-12-мАт человека (С340) ингибирует продукцию интерферона-γ (ΙΤΝγ) истощенными по моноцитам мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) ί.Ό3+. стимулированным 1Ь-2 плюс 1Ь-12. РВМС культивировали в течение 5 ч в контрольных средах (без добавления цитокинов), средах с добавлением 1Ь-12 (0,1 нг/мл) плюс 1Ь-2 (50 Ιυ/мл) (1Ь-12/1Ь-2), контрольных средах, содержащих мАт С340 (10 мкг/мл) и 1Ь-12/1Ь-2-средах, содержащих мАт С340 (10 мкг/мл). Внутриклеточный ΙΡΝγ измеряли с помощью двойного иммунного окрашивания СЭ3-РЕ и ΙΕΝγ-ФИТЦ. Показаны данные для одного донора.
Фиг. 5 представляет собой график, на котором показано зависимое от дозы ингибирование секреции ΙΕΝγ лимфоцитами периферической крови, стимулированными 1Ь-2 плюс 1Ь-12, двумя разными партиями анти-1Е-12-мАт человека (С340). РВЬ человека (8 х 106/мл) культивировали в течение 24 ч с 10 υ/мл ΙΕ-2, ΙΕ-2 плюс 400 пг/мл ΙΕ-12 или ΙΕ-2 плюс ΙΕ-12 и мАт С340, как указано. Извлекали надосадки культур и анализировали в отношении ΙΕΝγ посредством ИФА.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму, на которой показано зависимое от дозы ингибирование клеточной цитотоксичности ЬЛК, индуцированной ΙΕ-12 плюс ΙΕ-2, с помощью анти-Ш-Р-мАт человека (С340). Эффекторные клетки ЬЛК (РВЬ человека, 8 х 106/мл) культивировали в течение 24 ч с ГО-12 (400 пг/мл) плюс ГО-2 (10 υ/мл) и мАт С340 (5000 нг/мл или 50 нг/мл, как указано). Эффекторные клетки ЬЛК промывали и культивировали с 51Сг-мечеными клетками-мишенями Кар в течение 4 ч при соотношении эффектор: мишень (Е:Т), равном 80:1, и измеряли количество 51Сг, высвободившегося в среду в результате лизиса клеток Ка_р. Результаты выражены в виде среднего значения для трех здоровых доноров стандартной ошибки. Позитивным в отношении ГО-12 контролем (ГО-12) являются эффекторные клетки, инкубированные с ГО-12 в отсутствие антитела. Фон (ВКСЭ) представляет собой эффекторные клетки, инкубированные без ГО-12 или антитела.
Фиг. 7 А и 7В являются гистограммами, показывающими, что индуцированная ГО-12 плюс ГО-2 экспрессия СЭ95 на мононуклеарных клетках периферической крови СГО3+ ингибируется анти-Ш-Р-мАт человека (С340). РВМС культивировали в течение 72 ч в средах, содержащих 0,1 нг/мл ГО-12 и субоптимальную дозу ГО-2 (50 Ιυ/мл), в присутствии или в отсутствие мАт С340 (10 мкг/мл). Экспрессию СГО95 измеряли проточной цитометрией клеток, окрашенных анти-СГО95-ФИТЦ. Пропускание осуществляли, используя анализ с двумя красителями (СГО3 или СГО56-РЕ по сравнению с СГО95-ФИТЦ) и прямое светорассеяние по сравнению с ортогональным.
Фиг. 8 представляет собой график, показывающий, что рекомбинантные антитела человека против ГО-12 человека (гС340) связываются с иммобилизованным ГО-12 таким образом, который не отличается от очищенного мАт С340. Определяли концентрацию гС340 в надосадке трех продуцирующих гС340 рекомбинантных клеточных линий, и надосадки оценивали в отношении связывания ГО-12 в ЕЫЗА. Планшеты покрывали 2 мкг/мл ГО-12 человека и инкубировали с очищенным мАт С340 из исходной гибридомы (стандарт) или с надосадками рекомбинантных клеточных линий. Связанное с ГО-12 антитело выявляли, используя конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело козы против Ι§Ο человека (тяжелая цепь + легкая цепь).
Фиг. 9А-9С представляют собой графики, на которых показаны кинетики роста и количество антитела, секретированного тремя независимо полученными субклонами рекомбинантных клеток, продуцирующих гС340 (фиг. 9А, субклон С379В; фиг. 9В, субклон С381А; фиг. 9С, субклон С389А). Рекомбинантные клетки высевали во флаконы Т75 при исходной плотности 2 х 105 клеток/мл в стандартных средах. В разных временных точках клетки ресуспендировали и определяли количество живых клеток и количество (мкг/мл) гС340 в средах.
Описание изобретения
Данное изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим анти-Ш-Рантителам человека, примата, грызуна, млекопитающего, химерным, гуманизированным или СГОКпривитым антителам и, кроме того, к ΙΕ-12-антиидиотипическим антителам, а также композициям и молекулам кодирующих нуклеиновых кислот, содержащим по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно анти-ГО-^-антитело или антиидиотипическое антитело. Данное изобретение, кроме того, включает, но не ограничено указанным, способы получения и применения таких нуклеиновых кислот и антител и антиидиотипических антител, включая диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства.
В используемом в данном описании смысле термины «антитело против интерлейкина-12», «антиΙΕ-12-антитело», «часть анти-ГО-^-антитела» или «фрагмент анти-ГО-^-антитела» и/или «вариант антиΙΕ-12-антитела» и тому подобное включают любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая включает по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, без ограничения, такую как по меньшей мере одна гипервариабельная область (СЭК) тяжелой или легкой цепи или его лиганд-связывающая часть, вариабельная область тяжелой цепи или легкой цепи, константная область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасная область или любая их часть, или по меньшей мере одна часть рецептора ГО-12 или
- 3 006673 связывающего белка, которая может быть включена в антитело согласно данному изобретению. Такое антитело дополнительно необязательно оказывает влияние на специфичный лиганд, без ограничения, такое как влияние, при котором такое антитело модулирует, уменьшает, увеличивает, оказывает антагонистическое действие, агонистическое действие, ослабляет, смягчает, блокирует, ингибирует, отменяет и/или препятствует по меньшей мере одной активности или связыванию 1Ь-12 или активности или связыванию рецептора 1Ь-12 ίη νίίτο, ίη δίΐιι и/или ίη νίνο. В качестве неограничивающего примера подходящее анти-1Т-12-антитело, специфичная часть или вариант согласно данному изобретению может связывать по меньшей мере один 1Ь-12 или его специфичные части, варианты или домены. Подходящее анти1Ь-12-антитело, специфичная часть или вариант также необязательно может влиять по меньшей мере на одну активность или функцию 1Ь-12, без ограничения, такую как синтез РНК, ДНК или белка, высвобождение 1Ь-12, передачу сигнала рецептора 1Ь-12, расщепление мембранного 1Ь-12, активность 1Ь-12, продукцию и/или синтез 1Ь-12. Кроме того, подразумевается, что термин «антитело» охватывает антитела, фрагменты расщепления, их специфичные части и варианты, включая антитело, имитирующее или содержащее части антител, которые имитируют структуру и/или функцию антитела или его специфичного фрагмента или части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с 1Ь-12 млекопитающих. Например, изобретение охватывает фрагменты антител, способные связываться с 1Ь-12 или его частями, включая, но не ограничиваясь указанным, фрагменты РаЬ (например, при расщеплении папаином), РаЬ' (например, при расщеплении пепсином и частичном восстановлении) и Р(аЬ')2 (например, при расщеплении пепсином), £асЬ (например, при расщеплении плазмином), рРс' (например, при расщеплении пепсином или плазмином), Р6 (например, при расщеплении пепсином, частичном восстановлении и повторной агрегации), Ρν или 5сРу (например, способами молекулярной биологии) (см., например, СоШдап. 1ттипо1оду. выше).
Указанные фрагменты можно получить ферментативным расщеплением, синтетическими или рекомбинантными способами, которые известны в данной области и/или описаны в данной заявке, антитела также можно получить в различных укороченных формах, используя гены антител, в которые были введены один или более стоп-кодонов выше естественного стоп-сайта. Например, можно сконструировать комбинированный ген, кодирующий часть тяжелой цепи Р(аЬ')2 включающую последовательности ДНК, кодирующие домен СН! и/или шарнирную область тяжелой цепи. Различные части антител можно химически соединять вместе обычными способами или можно получать в виде непрерывного белка, используя способы генной инженерии.
В используемом в данном описании смысле термин «антитело человека» относится к антителу, в котором по существу каждая часть белка (например, СОВ, каркас, домены Съ, Сн (например, Сн1, Сн2, Сн3), шарнир, (Уь, Ун) ) по существу не иммуногенна у человека и имеет только незначительные изменения последовательности или вариации. Подобным образом, антитела, называемые антителами приматов (обезьяна, бабуин, шимпанзе и т.д.), грызунов (мышь, крыса, кролик, морская свинка, хомячок и тому подобное) и других млекопитающих, обозначают антитела, специфичные для таких видов, подродов, родов, подсемейств, семейств. Кроме того, химерные антитела включают любую комбинацию указанных выше антител. Такие изменения или вариации необязательно и предпочтительно сохраняют или уменьшают иммуногенность у человека или других видов по сравнению с немодифицированными антителами. Таким образом, антитело человека отличается от химерного или гуманизированного антитела. Показано, что антитело человека может продуцироваться животным, отличным от человека, или прокариотической или эукариотической, клеткой, которая способна экспрессировать функционально реаранжированные гены иммуноглобулинов человека (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, в том случае, когда антитело человека является одноцепочечным антителом, оно может содержать линкерный пептид, который не встречается в нативных антителах человека. Например, Ρν может содержать линкерный пептид, такой как пептид, имеющий от двух до примерно восьми глицинов или других аминокислотных остатков, который связан с вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи. Считают, что такие линкерные пептиды имеет человеческое происхождение.
Также можно использовать биспецифичные, гетероспецифичные, гетероконъюгированные или сходные антитела, которые являются моноклональными, предпочтительно человеческими или гуманизированными антителами, которые обладают специфичностями связывания по отношению, по меньшей мере, к двум разным антигенам. В данном случае одна из специфичностей связывания относится, по меньшей мере, к одному белку 1Ь-12, а другая относится к любому другому антигену. Способы получения биспецифичных антител известны в данной области. Традиционно рекомбинантная продукция биспецифичных антител основана на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, в которых две тяжелые цепи обладают разными специфичностями (ΜίΠίοίη апб Сие11о, №1игс 305:537 (1983)). Вследствие случайной сортировки тяжелых и легких цепей иммуноглобулина указанные гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь из 10 разных молекул антител, из которых только одно имеет правильную биспецифичную структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий аффинной хроматографии, является довольно громоздкой, а выходы продукта низкими. Подобные методики описаны, например в XVО 93/08829, патентах США Νο
- 4 006673
6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, АО 91/00360, АО 92/00373, ЕР 03089, Тгаипескег е! а1., ЕМВО 1. 10:3655 (1991), 8иге511 е! а1., МеШобз ίη Епхуто1о§у 121:210 (1986), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Анти-1Е-12-антитела (также называемые 1Ь-12-антителами), применимые в способах и композициях согласно данному изобретению, необязательно могут характеризоваться высоко аффинным связыванием с 1Ь-12 и необязательно, но предпочтительно обладать низкой токсичностью. В частности, в данном изобретении применимо антитело, специфичный фрагмент или вариант согласно изобретению, в котором отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная область и каркас, отдельно и/или совместно необязательно, но предпочтительно обладают низкой иммуногенностью. Характерной особенностью антител, которые можно использовать в изобретении, необязательно является их способность оказывать лечебное действие на пациентов в течение длительных периодов времени при измеряемом ослаблении симптомов и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие подходящие свойства могут вносить вклад в достигаемые терапевтические результаты. «Низкую иммуногенность» в данном описании определяют как появление значительных ответов НАНА, НАСА или НАМА менее чем у 75% или предпочтительно менее чем у 50% пациентов, подвергаемых лечению, и/или появление низких титров у пациентов, подвергаемых лечению (примерно менее 300, предпочтительно примерно менее 100, при измерении в иммуноферментном анализе на основе двойных антигенов) (см. ΕΙΙϊοΐΐ е! а1., Ьапсе! 344:1125-1121 (1994), работа включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме).
Полезность
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению можно использовать для получения по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела или его специфичного варианта, который можно использовать для характеристики или воздействия на клетку, ткань, орган или животного (включая млекопитающих и людей), для того чтобы диагностировать, проводить мониторинг, модулировать, лечить, ослаблять, помогать, предотвращать появление или уменьшать симптомы по меньшей мере одного связанного с 1Ь-12 состояния, выбранного по меньшей мере из одного иммунного расстройства или заболевания, сердечно-сосудистого нарушения или заболевания, инфекционного, злокачественного и/или неврологического нарушения или заболевания или другого известного или установленного связанного с 1Ь12 состояния, но не ограниченного указанным.
Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в таком модулировании, лечении, ослаблении, предотвращении или снижении симптомов, эффектов или механизмов. Эффективное количество может составлять количество примерно от 0,001 до 500 мг/кг при однократном (например, болюсном) многократном или непрерывном введении, или достигать концентрации в сыворотке, составляющей 0,01-5000 мкг/мл при однократном, многократном или непрерывном введении, или любого эффективного предела или значения, которое получают и определяют, используя известные способы, которые описаны в данной заявке или известны в соответствующих областях техники.
Ссылки
Все цитированные в данном описании публикации или патенты включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме, так как они показывают существующий уровень техники на момент данного изобретения и/или для того, чтобы дать описание и объяснение данного изобретения. Публикации относятся к любым научным или патентным публикациям или любым другим источникам информации, доступным в любых формах средств информации, включая все записанные, электронные или печатные формы. В данное описание в виде ссылок в полном объеме включены следующие источники информации: АищЬеЕ е! а1., еб., Сиггеп! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1ш Абеу апб 8оп§, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (19872001); 8атЬтоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8ргш§ НатЬот, ΝΥ (1989); Наг1оте апб Ьапе, АпбЬоб1е8, а ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргш§ НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап, е! а1., ебз., Сиггеп! Рго!осо1з ш 1ттипо1оду, 1окп А11еу апб 8оп§, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е! а1., Сиггеп! Рго!осок ш Рго!еш 8с1епсе, 1окп А11еу апб 8оп§, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001).
Антитела согласно данному изобретению
По меньшей мере одно анти-1Е-12-антитело согласно данному изобретению необязательно может продуцироваться клеточной линией, смешанной линией клеток, иммортализованной клеткой или клональной популяцией иммортализованных клеток, которые известны в данной области. См., например, Аи8иЬе1, е! а1., еб., Сиггеп! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, боПп А11еу апб 8оп§, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); 8атЬгоок, е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8ргш§ НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1о\т апб Ьапе, апбЬоб1е8, а ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап, е! а1., ебз., Сиггеп! Рго!осок ш 1ттипо1оду, 1окп А11еу апб 8оп§, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1§ ш Рго!еш 8с1епсе, 1окп А11еу апб 8оп§, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001), при этом каждый источник информации включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
- 5 006673
Антитела человека, которые специфичны по отношению к белкам ГБ-12 человека или их фрагментам, могут вырабатываться против соответствующего иммуногенного антигена, такого как выделенный белок 1Б-12 и/или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Подобным образом могут продуцироваться другие специфичные или общие антитела млекопитающих. Получение иммуногенных антигенов и получение моноклональных антител можно выполнять, используя любой подходящий способ.
В одном способе получают гибридому путем слияния подходящей линии иммортализованных клеток (например, линии клеток миеломы, без ограничения, такой как 8р2/0, 8р2/0-АС14, N80. N81, N82, АЕ-1, Б.5, >243, Р3Х63А§8.653, 8р2 8А3, 8р2 МАГ, 8р2 881, 8р2 8А5, И937, МБА 144, АСТ IV, М0БТ4, ΌΑ-1, ШВКАТ, №ЕН1, К-562, С08, ВАЛ, ΝΙΗ 3Т3, НБ-60, МБА 144, \АМА1АА, ΝΕυΚΟ 2А или тому подобной, или гетеромиелом, продуктов их слияния или любой полученной из них клетки или слитой клетки, или любой другой подходящей линии клеток, известной в данной области, см., например, иии.а!сс.огд, \\л\лу.НГе1ес11.сот. и тому подобные) с антителопродуцирующими клетками, без ограничения, такими как выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови, лимфы, миндалины или другие клетки, содержащие иммунные или В-клетки, или любыми другими клетками, экспрессирующими константные или вариабельные, или каркасные, или СЭВ-последовательности тяжелой или легкой цепи, либо в виде эндогенной, либо в виде гетерологичной нуклеиновой кислоты, в виде рекомбинантной или эндогенной геномной ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальной ДНК или РНК, хлоропластной ДНК или РНК, гяРНК, мРНК, тРНК, одноцепочечной, двухцепочечной или трехцепочечной, гибридизующейся и тому подобной вирусов, бактерий, водорослей, прокариот, земноводных, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов, лошадей, баранов, коз, овец, приматов, эукариот или в виде любой их комбинации. См., например, Аи8иЬе1, выше, и СоШдап, 1ттипо1оду, выше, глава 2, включенные в данное описание в виде ссылок в полном объеме.
Клетки, продуцирующие антитела, также можно получить из периферической крови или предпочтительно селезенки или лимфатических узлов человека или других подходящих животных, которые были иммунизированы представляющим интерес антигеном. Также можно использовать любые другие подходящие клетки-хозяева для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, его специфичный фрагмент или вариант согласно данному изобретению. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки можно выделить, используя селективные условия культивирования или другие подходящие известные способы, и клонировать посредством лимитирующего разведения или сортировки клеток или другими известными способами. Клетки, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, можно отобрать посредством подходящего анализа (например, ЕБ18А).
Можно использовать другие подходящие способы получения или выделения антител требуемой специфичности, включая, но не ограничиваясь указанным, способы, в которых рекомбинантное антитело отбирают из пептидной или белковой библиотеки (например, без ограничения, из дисплейной библиотеки на основе бактериофагов, рибосом, олигонуклеотидов, РНК, кДНК или тому подобного, например, доступной из СатЬпбде аибЬобу Тесйпо1о§1е8, СатЬббдезЫге, иК; Мотрйо8у5, МаПш8ге1б/Р1апед§, ΌΕ; Вюуабоп, АЬегбееп, 8со!1апб, иК; ВюГпуеп!, Бцпб, 8иебеп; Оу ах Согр., Епхоп, АГГутах/Вюзйе; Хота, Вегке1еу, СА; Гхзуз. См., например, ЕР 368 684, РСТ/ОВ91/01134; РСТ/ОВ92/01755; РСТ/6В92/002240; РСТ/6В92/00883; РСТ/6В93/00605; и8 08/350260(5/12/94); РСТ/ОВ94/01422; РСТ/ОВ94/02662;
РСТ/ОВ97/01835; (САТ/МВС); №090/14443; №090/14424; №090/14430; РСТ/и894/1234; №092/18619; №096/07754; (8спрр5); ЕР 614989 (Могрйо8у5); №095/16027 (ВюГпуеп!); №088/06630; №090/3809 (Оуах); патент США 4704692 (Епхоп); РСТ/и891/02989 (АГГутах); №089/06283; ЕР 371998; ЕР 550400; (Хота); ЕР 229046; РСТ/и89107149 (Гхзуз); или стохастически созданные пептиды или белки - патенты США 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, №0 86/05803, ЕР 590689 (Гхзуз, пои Аррйеб Мо1еси1аг ЕуойШоп (АМЕ), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме), или способы, основанные на иммунизации трансгенных животных (например, мышей 8СГО, Мдиуеп е! а1., МютоЬюБ 1ттипо1. 41:901-907 (1997); 8апб1ш е! а1., Сгй. Веу. Вю!есйпо1. 16:95-118 (1996); Егеп е! а1., 1ттипо1. 93:154-161 (1998), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме, а также связанные патенты и заявки), которые способны продуцировать спектр антител человека, которые известны в данной области и/или описаны в данной заявке. Такие способы включают, но не ограничены указанным, рибосомный дисплей (Напез е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. 8сБ и8А, 94:4937-4942 (Мау 1997); Напез е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сБ и8А, 95:14130-14135 (Моу. 1998)); способы продуцирования антител отдельными клетками (например, способ продуцирования антител отобранными лимфоцитами («8БАМ») (патент США Мо. 5627052, №еп е! а1., 1. 1ттипо1. 17:887-892 (1987); ВаЬсоок е! а1., Ргос. №6. Асаб. 8сБ и8А 93:7843-7848 (1996)); способ на основе микрокапель геля и проточной цитометрии (Ро\уе11 е! а1., Вю!есйио1. 8:333-337 (1990); 0пе Се11 8уз!ет8, СатЬпбде, МА; Огау е! а1., 1. 1тт. Ме111. 182:155-163 (1995); Кеппу е! а1., Вю/Тесйпо1. 13:787-790 (1995)); селекцию В-клеток (8!еепЬаккегз е! а1., Мо1ес. Вю1. Веройз 19:125-134 (1994); 1опак е! а1., Ргодгезз Вю!есй, ^1. 5, 1п М!то Гтшцшхабоп ш НуЬпбота Тесйпо1оду, ВоггеЬаеск, еб., Е15е\зег 8с1епсе РиЬйзйегз В. V., Атзйтбат, Ме!йег1апб8 (1988)).
- 6 006673
Также можно применять способы конструирования или гуманизации нечеловеческих или человеческих антител, которые хорошо известны в данной области. Как правило, гуманизированное или сконструированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков из источника, который не является человеком, например, мышь, крыса, кролик, примат, отличный от человека, или другое млекопитающее, но не ограничен указанным.
Указанные аминокислотные остатки антитела человека часто называют «импортированными» остатками, которые обычно берут из «импортированного» вариабельного, константного или другого домена известной последовательности человека. Известные последовательности Гд человека описаны, например, в \у\у\у.псЫ.п1т.ш11.доу/сп1гс//с|исгу.Гсщ: \у\у\у.а1сс.огд/р11адс/11йЬ.1Ит1; \у\у\у.5ск|ис5Есот/; \у\у\у.аЬсат.сот/; \у\у\у.апиЬойугсюигсс.со1п/оп1тссо1пр.1111пк \у\у\у.риЫ|с.к-151а1е.ейи/~рейго/ге5еагс11 ЮоКЫтк \у\у\у.тдсп.иш11с1Йс1Ьсгд.йс/8И/1Т/1Т.1ит1; ууу.уйГгеетап.сот/|ттипо1оду/СН05/киЬу05.й1т; ууу.11Ьгагу.1Ыпкдис8Еогд/12429/Гттипс/АийЬойу.Йт1; \у\у\у.111ш1ког8/дгап15/1ес1игс5/1996/ук1Ь/;
\у\у\у.ра111.сат.ас.ик/~тгс7/т|ксппадс5.1ит1; \у\у\у.аиι^Ьоάу^с5ои^сс.со1η/;
тсЬ.йа^νа^ά.сάи/Β^о^^пк8/Гттиио1оду.йΐт1.ууу.^ттиио1оду1^пк.сот/; раΐйЬоx.уи8ΐ1.сάи/~йссиΐс^/^иάсx.йΐт1;
\у\у\у.Ыо1ес11Л1Гксйи/~11с1/; \у\у\у.рсЬю.сот/ра/340913/340913.1Пт1; \у\у\у.иа1.и5άа.доν/а\у^с/риЬ5/аиι^Ьоάу/;
\у\у\у.т.с1ите-и.ас.)р/~уаы.11Шо/ЕН5а.1ит1; ууу.Ь^оάс8^ди.сот/ΐаЬ1с.а8р;
\у\у\у.^сис^ик/аxр/Гас5/άаν^С5/I^ик5.1ит1; \у\у\у.Ью1сс11.иГксйи/~Гсс1/ргоЮсок1и1п1;
\у\у\уа5аспсЕогд/5Цс5 дсо.1Ит1; ах1т11дтЕиш-тагЬигд.йс/~гск/АЕР81ап.Ыт1;
Ьа8С^ν.ис^.кии.п1/~^^ааΐ8/1^пк81.йΐт1;
\у\у\у.гссаЬ.иш-11й. άс/^ттиио.Ьтс.иуи.сάи/; \у\у\у.тгс-срс.сат.ас.ик/пп1-йос/риЬНс/1НТЕО.1ит1; \у\у\уаЬЕипат.тх/у1г/У тюс.Ытк 1тд1.ст.15сТг:8104/; \у\у\у.Ыос11ст.ис1.ас.ик/~таг1т/аЬ5/тйсх.1ит1;
апиЬойу.ЬаШ.ас.ик/; аЬдси.сνт.ιати.сάи/1аЬ/\у\у\уаЬдси.1ит1; ууу.ип^ζй.сй/~йоисддс^/АНО8ст^иа^/81^άс01.йίт1;
\у\у\у.сгу5ЕЬЫ<.ас.ик/~иЬсд075/;
\у\у\у.штг. тгс.ас.ик/СХ7ссас\уд/ссас\уд.111т; ууу.раШ.сат.ас.ик/~тгс7/йиташ8а1юп/ТАННР.Ыт1; \у\у\уаЬЕшкшгтх/у1г/51гис1игс/51а1 апп.1Ит1;
\у\у\у.Ыо5скт155оип.сйи/5тЦ11др/тйсх.111т1; \у\у\у.сгу5ЕЫос.сат.ас.ик/~Гто1та/\УсЬ-раде5/Рер1/5роисс11.1ит1;
\у\у\у.)сппкс/Гг ргойисКЫт; ууу.рактзлЬт.сотЛЬт.Ытк
КаЬа1 с! а1., 8сс.|испсс5 оГ Ргокшк оГ Гттиио1од^са1 [Шегсь!. И.8. Иср1. НсаИй (1983), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме. Такие импортированные последовательности можно использовать для уменьшения иммуногенности или уменьшения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости связывания, скорости распада, авидности, специфичности, времени полужизни или любого другого подходящего свойства, которые известны в данной области. Как правило, часть или все нечеловеческие или человеческие последовательности СИЯ сохраняют, тогда как нечеловеческие последовательности вариабельных и константных областей заменяют человеческими или другими аминокислотами. Антитела также необязательно можно гуманизировать при сохранении высокой аффинности по отношению к антигену и других подходящих биологических свойств. Для достижения указанной цели гуманизированные антитела необязательно можно получать посредством способа анализа родительских последовательностей и различных умозрительных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и известны специалистам в данной области. Имеются компьютерные программы, которые иллюстрируют и представляют возможные трехмерные конформационные структуры выбранных для исследования последовательностей иммуноглобулинов. Просмотр указанных изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании выбранной для исследования последовательности иммуноглобулина, т.е. проанализировать остатки, которые влияют на способность выбранного для исследования иммуноглобулина связываться со своим антигеном. Таким образом, можно выбрать и комбинировать остатки РК. из консенсусной и импортированной последова
- 7 006673 тельностей так, чтобы получить требуемые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность по отношению к антигену(нам)-мишени. В общем, остатки СЭР прямо и в наиболее значительной степени оказывают влияние на связывание антигена. Гуманизацию или конструирование антител согласно данному изобретению можно выполнить, используя известный способ, без ограничения, такой как способы, описанные в Аш1ег (боиек еб а1., Чабиге 321:522 (1986); Ктесйшапи еб а1., Чабите 332:323 (1988); УегЬоеуеи еб а1., 8сбеисе 239:1534 (1988)), 811115 еб а1., б. 1ттиио1. 151:2296 (1993); СЬобЫа аиб Ьекк, б. Мо1. Вю1. 196:901 (1987), Сагбег еб а1., Ргос. Чаб1. Асаб. 8ск и.8.А. 89:4285 (1992); Ргекба еб а1., б. 1ттиио1. 151:2623 (1993), патентах США Чо: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, заявках РСТ/: И898/16280, И896/18978, И891/09630, И891/05939, И894/01234, СВ89/01334, СВ91/01134, СВ92/01755; АО90/14443, АО90/14424, АО90/14430, ЕР 229246, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме, включая цитированные в указанных работах ссылки.
Анти-1Е-12-антитело также необязательно можно получить посредством иммунизации трансгенного животного (например, мыши, крысы, хомячка, примата, отличного от человека, и тому подобное), способного продуцировать спектр антител человека, которые описаны в данной заявке и/или известны в данной области. Клетки, которые продуцируют анти-1Ь-12-антитело человека, можно выделить из организма таких животных и иммортализовать, используя подходящие способы, такие как способы, описанные в данной заявке.
Трансгенных мышей, которые могут продуцировать спектр антител человека, которые связываются с антигенами человека, можно получить известными способами (например, но не ограничиваясь указанным, патенты США № 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 и 5789650, выданные ЬоиЬегд еб а1.; бакоЬоуббк еб а1. АО 98/50433, бакоЬоуббк еб а1. АО 98/24893, ЬоиЬегд еб а1. АО 98/24884, ЬоиЬегд еб а1. АО 97/13852, ЬоиЬегд еб а1. АО 94/25585, Кискейарабе еб а1. АО 96/34096, Кискейарабе еб а1. ЕР 0463151 В1, Кискейарабе еб а1. ЕР 0710719 А1, патент СшА Чо. 5545807, выданный 8игаш еб а1., Вгиддетаии еб а1. АО 90/04036, Вгиддетаии еб а1. ЕР 0438474 В1, ЬоиЬегд еб а1. ЕР 0814259 А2, ЬоиЬегд еб а1. ОВ 2272440 А, ЬоиЬегд еб а1. Чабиге 368:856-859 (1994), Тау1ог еб а1., 1иб. бттииоб. 6(4)579-591 (1994), Огееи еб а1, Чабиге Оеиеббск 7:13-21 (1994), Меибех еб а1., Чабиге Оеиеббск 15:146-156 (1997), Тау1ег еб а1., Чисбебс Асббк Векеагск 20(23):6287-6295 (1992), ТиабИои еб а1., Ргос. Чаб1. Асаб. 8сб. И8А 90(8)3720-3724 (1993), ЬоиЬегд еб а1., 1иб Веу 1ттиио1 13(1):65-93 (1995) и Гщктеа1б еб а1., Чаб Вю1ес1шо1 14(7):845-851 (1996), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки во всей своей полноте). Как правило, указанные мыши содержат по меньшей мере один трансген, включающий ДНК, по меньшей мере, из одного локуса иммуноглобулина человека, который функционально реаранжирован, или который может подвергаться функциональной реаранжировке. Эндогенный локус иммуноглобулина у таких мышей может быть нарушен или делетирован, чтобы лишить животное способности продуцировать антитела, кодируемые эндогенными генами.
Скрининг антител в отношении специфичного связывания со сходными белками или фрагментами удобно можно проводить с использованием дисплейных библиотек пептидов. Указанный способ заключается в скрининге больших коллекций пептидов в отношении отдельных представителей, обладающих требуемой функцией или структурой. Скрининг антител в дисплейных библиотеках пептидов хорошо известен в данной области. Представляемые с помощью дисплея пептидные последовательности могут иметь длину от 3 до 5000 или более аминокислот, часто длиной 5-100 аминокислот и часто длиной примерно от 8 до 25 аминокислот. Кроме способов прямого химического синтеза для создания пептидных библиотек описано несколько способов рекомбинантной ДНК. Один вид дисплея представляет собой представление пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую конкретную представляемую с помощью дисплея пептидную последовательность. Такие способы описаны в РСТ патентных заявках 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278. Другие системы для создания библиотек пептидов используют подходы как химического синтеза би уббго, так и рекомбинантные способы. См. РСТ патентные заявки № 92/05258, 92/14843 и 96/19256. Также см. патенты США Чо. 5658754 и 5643768. Дисплейные библиотеки пептидов, вектор и наборы для скрининга коммерчески доступны от таких поставщиков, как биуббгодеи (СагкЬаб, СА) и СатЬйбде АиббЬобу Тескηо1од^е8 СатЬйбдекЫге, ИК). См., например, патенты США Чо. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, переуступленные Еп/ои; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, переуступленные Эуах, 5427 908, 5580717, переуступленные Айутах; 5885793, переуступленный СатЬйбде аиббЬобу Тескηо1од^е8; 5750373, переуступленный Оеиеибеск, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, переуступленные Хота, СоШдаи, выше; Аи8иЬе1, выше; или 8атЬгоок, выше, каждый из указанных выше патентов и публикаций включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Антитела согласно данному изобретению также можно получить, используя по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-1Ь-12-антитело, чтобы получить трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и тому подобное, которые продуцируют такие антитела в своем молоке. Таких животных можно получить, используя известные способы. См. не ограничивающие примеры в патентах США № 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362;
- 8 006673
5304489 и тому подобное, каждый из которых включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Антитела согласно данному изобретению, кроме того, можно получить с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-1Ь-12-антитело, чтобы получить трансгенные растения или культивируемые растительные клетки (например, но не ограничиваясь указанным, табак или кукурузу), которые продуцируют такие антитела, специфичные части или варианты в частях растения или в полученных из них культивируемых клетках. В качестве неограничивающего примера успешно использовали листья трансгенного табака, экспрессирующего рекомбинантные белки, чтобы получить большие количества рекомбинантных белков, используя, например, индуцируемый промотор. См., например, Сгатег е! а1., Сигг. Тор. МюгоЬюк 1ттипо1. 240:95-118 (1999) и цитированные в указанной работе ссылки. Также использовали трансгенную кукурузу, чтобы экспрессировать белки млекопитающих на коммерческом уровне продуктивности, с биологическими активностями, эквивалентными активностям, продуцируемым в других рекомбинантных системах или очищенными из природных источников. См., например, Ноой е! а1., Αάν. Ехр. Мей. Βίο1. 464:127-147 (1999) и цитированные в указанной работе ссылки. Антитела в больших количествах также получали из семян трансгенных растений, включая фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (δοΕν), включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Сопгай е! а1., Р1ап1 Мо1. Бю1. 38:101-109 (1998) и цитированные в указанной работе ссылки. Таким образом, антитела согласно данному изобретению также можно получить, используя трансгенные растения в соответствии с известными способами. См., например, также Изсйет е! а1., Вю1ескпо1. Арр1. Вюскет. 30:99-108 (Ос!., 1999); Ма е! а1., Тгепйз Бю!есйпо1. 13:522-7 (1995); Ма е! а1., Р1ап! РЬ.узю1. 109:341-6 (1995); \У1Ше1ат е! а1., Вюскет. 8ос. Тгапз. 22:940-944 (1994); и цитированные в указанной работе ссылки. Также см. вообще работы по экспрессии антител в растениях, не ограниваясь указанным. Каждый из указанных источников информации включен в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Антитела согласно изобретению могут связывать 1Ь-12 человека с широким диапазоном аффинности (Кс). В предпочтительном варианте по меньшей мере одно мАт человека согласно данному изобретению необязательно может связывать 1Й-12 человека с высокой аффинностью. Например, мАт человека может связывать 1Ь12 человека с Кс примерно равной или меньше 10-7 М, без ограничения, такой как 0,1-9,9 (или находиться в любом интервале, или иметь любое значение в указанном диапазоне) X 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, или находиться в любом интервале, или иметь любое значение в указанном диапазоне.
Аффинность или авидность антитела в отношении антигена можно определить экспериментально, используя любой подходящий способ. (См., например, ВегхоГзку. е! а1., «АпйЬойу-Апйдеп 1п!етасйопз,» 1п Еипйатеп!а1 1ттипо1о§у, Раи1, Е., Ей., Ватеп Ргезз: №\ν Уогк, ΝΥ (1984); КиЬу, .Ташз 1ттипо1о§у, \У.Н. Ргеетап апй Сотрапу: №\ν Υο^к, ΝΥ (1992); и способы, описанные в указанных публикациях). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьировать, если его измеряют в разных условиях (например, концентрация соли, рН). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена (например, Кс, Ка, Кй) предпочтительно осуществляют с использованием стандартизованных растворов антитела и антигена и стандартизованного буфера, такого как буфер, описанный в данной заявке.
Молекулы нуклеиновой кислоты
Используя представленную в данном описании информацию, такую как информация о нуклеотидных последовательностях, кодирующих по меньшей мере 70-100% смежных аминокислот по меньшей мере одной из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, специфичных фрагментов, вариантов или их консенсусных последовательностей, или депонированный вектор, содержащий по меньшей мере одну из указанных последовательностей, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, кодирующую по меньшей мере одно анти-1Т-12-антитело, с использованием способов, описанных в данной заявке или известных в данной области.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению могут быть в форме РНК, а именно мРНК, гяРНК, тРНК или в любой другой форме, или в форме ДНК, включая, но не ограничиваясь указанным, кДНК или геномной ДНК, полученной клонированием или полученной путем синтеза, или представлять собой любые их комбинации. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной или одноцепочечной, или представлять собой любые их комбинации. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также известной как смысловая цепь, или она может представлять собой некодирующую цепь, также называемую антисмысловой цепью.
Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению могут включать молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие открытую рамку считывания (ОРС), необязательно с одним или более нитронами, например, но не ограничиваясь указанным, по меньшей мере одну конкретную часть по меньшей мере одного СЭЯ, как, например, СБК.1, СЭК.2 и/или СЭК.3, по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1-3) или легкой цепи (например, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 4-6); молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность анти-1Т-12-антитела или вариабельной области (например, 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 7, 8) и молекулы нуклеиновой кислоты, которые содержат нуклеотидную последовательность в значительной степени отличную от последовательностей, описанных выше,
- 9 006673 но которая вследствие вырожденности генетического кода кодирует по меньшей мере одно анти-1Ь-12антитело, которое описано в данной заявке и/или известно в данной области. Конечно, генетический код хорошо известен в данной области. Таким образом, для специалиста в данной области обычной практикой будет создание таких вырожденных вариантов нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфичные анти-1Ь-12-антитела согласно данному изобретению. См., например, Ли8иЬе1, с1 а1., выше, и такие варианты нуклеиновой кислоты включены в данное изобретение.
Неограничивающие примеры выделенных молекул нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению включают БЕС ΙΌ N0: 10-15, соответствующие неограничивающим примерам нуклеиновой кислоты, кодирующей, соответственно НС СЭРЕ НС СЭЕ2. НС СЭРЗ, ЬС СЭРЕ ЬС СЭР2, ЬС СЭР3, вариабельную область НС и вариабельную область ЬС.
В другом аспекте изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим анти-1Ь-12-антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеиновой кислотой, находящейся в плазмиде, депонированной с названием клона___________и Νο. депозита АТСС_______, соответственно, депонированной__________.
Как указано в данном описании, молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-1Ь-12-антитело, могут включать, но не ограничены указанным, молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела; последовательность, кодирующую все антитело или его часть; кодирующую последовательность антитела, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одного сигнального, лидерного или слитого пептида, в присутствии или без вышеуказанных дополнительных кодирующих последовательностей, таких как по меньшей мере один интрон, вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая, но не ограничиваясь указанным, некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибируемые, нетранслируемые последовательности, которые играют роль в транскрипции, процессинге мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например - для связывания с рибосомой и стабильности мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, которые обеспечивают дополнительные функции. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого антитела, содержащего фрагмент или часть антитела.
Полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с описанным в данной заявке полинуклеотидом.
Данное изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые в выбранных условиях гибридизации гибридизуются с описанным в данной заявке полинуклеотидом. Таким образом, полинуклеотиды согласно данному варианту можно использовать для выделения, обнаружения и/или количественного анализа нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды согласно данному изобретению можно использовать для идентификации, выделения или амплификации частичных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке.
В некоторых вариантах полинуклеотиды представляют собой геномные или кДНКпоследовательности, выделенные или же комплементарные кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
Предпочтительно библиотека кДНК содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85% или 90% полноразмерных последовательностей и более предпочтительно по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК можно нормализовать, чтобы увеличить представление редких последовательностей. По отношению к последовательностям, имеющим более низкую идентичность последовательностей по сравнению с комплементарными последовательностями, обычно применяют условия гибридизации низкой или умеренной жесткости, но не только такие. Условия умеренной и высокой жесткости необязательно можно использовать в отношении последовательностей с более высокой идентичностью. Условия низкой жесткости позволяют проводить избирательную гибридизацию последовательностей, обладающих примерно 70% идентичностью последовательностей, и могут использоваться для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей.
Необязательно полинуклеотиды согласно данному изобретению будут кодировать по меньшей мере часть антитела, кодируемого описанными в данной заявке полинуклеотидами. Полинуклеотиды согласно данному изобретению охватывают последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для избирательной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело согласно данному изобретению. См., например, ЛщнЬек выше; СоШдап, выше, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Конструирование нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению можно получить, используя (а) способы рекомбинации, (Ь) способы синтеза, (с) способы очистки или их комбинацию, которые хорошо известны в данной области.
- 10 006673
Нуклеиновые кислоты в дополнение к полинуклеотиду согласно данному изобретению могут содержать подходящие последовательности. Например, в нуклеиновую кислоту можно встроить сайт множественного клонирования, содержащий один или более сайтов рестрикции эндонуклеазами, для облегчения выделения полинуклеотида. Также можно встроить транслируемые последовательности, способствующие выделению транслируемого полинуклеотида согласно данному изобретению. Например, маркерная последовательность гексагистидина обеспечивает удобный способ очистки белков согласно данному изобретению. Нуклеиновая кислота согласно данному изобретению, за исключением кодирующей последовательности, необязательно представляет собой вектор, адаптер или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида согласно данному изобретению.
К таким последовательностям для клонирования и/или экспрессии можно добавить дополнительные последовательности, чтобы оптимизировать их функции при клонировании и/или экспрессии, обеспечить выделение полинуклеотида или повысить введение полинуклеотида в клетку. Применение клонирующих векторов, экспрессирующих векторов, адаптеров и линкеров хорошо известно в данной области. (См., например, Ли8иЬе1, выше; или 8ашЬтоок, выше).
Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот
Композиции выделенных нуклеиновых кислот согласно данному изобретению, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любая их комбинация, можно получить из биологических источников с использованием ряда методик клонирования, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах используют олигонуклеотидные зонды, которые в жестких условиях избирательно гибридизуются с полинуклеотидами согласно данному изобретению, чтобы идентифицировать требуемую последовательность в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномных библиотек хорошо известно специалистам в данной области (См., например, Ли8иЬе1, выше; или 8ашЬтоок, выше).
Способы скрининга и выделения нуклеиновых кислот
Скрининг библиотеки кДНК или геномной библиотеки можно проводить, используя зонд, основанный на последовательности полинуклеотида согласно данному изобретению, такому как полинуклеотиды, описанные в данной заявке. Зонды можно использовать для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК, чтобы выделить гомологичные гены того же самого или других организмов. Специалистам в данной области будет понятно, что в анализе можно использовать гибридизацию разной степени жесткости; и жесткой может быть либо среда для гибридизации, либо среда для промывки. По мере того, как условия гибридизации становятся более жесткими, должна быть более высокая степень комплементарности между зондом и мишенью для того, чтобы происходило образование дуплекса. Степень жесткости можно контролировать одним или более условиями: температурой, ионной силой, рН и наличием частично денатурирующего растворителя, такого как формамид. Например, жесткость гибридизации соответствующим образом варьируют, изменяя полярность раствора реагента, например, манипулируя концентрацией формамида в пределах от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательностей), необходимая для регистрируемого связывания, будет варьировать в соответствии с жесткостью среды для гибридизации и/или среды для промывки. Степень комплементарности оптимально будет составлять 100 или 70-100%, или любой интервал или значение в указанном диапазоне. Однако следует понимать, что небольшие вариации последовательности в зондах и праймерах могут компенсироваться снижением жесткости среды для гибридизации и/или промывки.
Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в данной области и могут быть использованы согласно данному изобретению без ненужного экспериментирования на основании представленных в данном описании принципов и руководств.
Известные способы амплификации ДНК или РНК включают, но не ограничены указанным, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и сходные способы амплификации (см., например, патенты США № 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Ми11Ц, е1 а1.; 4795699 и 4921794 ТаЬог, е1 а1.; 5142033 1пищ; 5122464 ХУНюш е1 а1.; 5091310 1ппщ; 5066584 Оу11еп81еп, е1 а1.; 4889818 ОеИапй, е1 а1.; 4994370 811ует, е1 а1.; 4766067 Βί5\νπ5; 4656134 ВшдоИ) и амплификацию, опосредованную РНК, в которой используют антисмысловую РНК к последовательности-мишени в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238 Ма1ек, е1 а1., торговое название ΝΑ8ΒΑ), полное содержание указанных источников информации включено в данное описании в виде ссылки (См., например, Аи8иЬе1, выше; или 8ашЬгоок, выше).
Например, способ полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно использовать для амплификации. последовательностей полинуклеотидов согласно данному изобретению и родственных генов непосредственно из библиотек геномной ДНК или кДНК. ПЦР и другие способы амплификации ш уйго также могут быть применимы, например, для того, чтобы клонировать последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, которые необходимо экспрессировать, чтобы получить нуклеиновые кислоты для применения в качестве зондов для выявления наличия требуемой мРНК в образцах, для секвенирования нуклеиновых кислот или для других целей. Примеры способов, достаточных для того, чтобы сориентировать специалистов в способах амплификации ш уйго, встречаются в Вегдег, выше, 8ашЬтоок, выше и Аи8иЬе1, выше, а также в Ми1Й8, е1 а1., патент США № 4683202 (1987); и 1пш§, е1 а1., РСВ Рто1осок А Ошйе 1о
- 11 006673
Мс11юЙ5 апй Аррйсайопк, Ей§., Асайешк Рге§8 1пс., 8ап Όίοβο. СА (1990). Коммерчески доступные наборы для ПЦР-амплификации геномной ДНК известны в данной области. См., например, набор для ПЦР преимущественно СС-геномной ДНК (С1оп1ес11). Для повышения выхода длинных продуктов ПЦР, кроме того, можно, например, использовать белок 32 гена Т4 (Боейппдег Маппйе1ш).
Синтетические способы синтеза для конструирования нуклеиновых кислот
Выделенные нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению также можно получить прямым химическим синтезом известными способами (см., например, Аи8иЬе1, е1 а1., выше). Химический синтез, как правило, дает одноцепочечный олигонуклеотид, который можно превратить в двухцепочечную ДНК посредством гибридизации с комплементарной последовательностью или посредством полимеризации ДНК-полимеразой с использованием одной цепи в качестве матрицы. Специалисту в данной области будет понятно, что хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями длиной 100 или более оснований, более длинные последовательности можно получить лигированием более коротких последовательностей.
Рекомбинантные экспрессирующие кассеты
Данное изобретение, кроме того, относится к рекомбинантным экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту согласно данному изобретению. Последовательность нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, например, кДНК или геномную последовательность, кодирующую антитело согласно данному изобретению, можно использовать для конструирования рекомбинантной экспрессирующей кассеты, которую можно ввести по меньшей мере в одну требуемую клетку-хозяина. Рекомбинантная экспрессирующая кассета, как правило, будет содержать полинуклеотид согласно данному изобретению, функционально связанный с регуляторными последовательностями инициации транскрипции, которые будут управлять транскрипцией полинуклеотида в предназначенной для этого клеткехозяине. Можно использовать как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е. эндогенные) промоторы для управления экспрессией нуклеиновых кислот согласно данному изобретению.
В некоторых вариантах выделенные нуклеиновые кислоты, которые служат в качестве промотора, энхансера или других элементов, можно ввести в соответствующее положение (выше, ниже или в. интрон) негетерологичной формы полинуклеотида согласно данному изобретению, так чтобы осуществлять повышающую или понижающую регуляцию экспрессии полинуклеотида согласно данному изобретению. Например, эндогенные промоторы можно изменить ш νίνο или ш νίίτο посредством мутации, делеции и/или замены.
Векторы и клетки-хозяева
Данное изобретение также относится к векторам, которые содержат выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, клеткам-хозяевам, которые сконструированы генноинженерным способом с рекомбинатными векторами, и получению по меньшей мере одного анти-1Е-12антитела рекомбинантными способами, которые хорошо известны в данной области. См., например, ЗашЬгоок, еί а1., выше; Аи8иЬе1, еί а1., выше, каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Полинуклеотиды необязательно можно связывать с вектором, содержащим селектируемый маркер для размножения в клетке. Как правило, плазмидный вектор вводят в виде преципитата, такого, как преципитат фосфата кальция, или в комплексе с заряженными липидами. Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковать ш \йго с использованием соответствующей линии пакующих клеток и затем трансдуцировать в клетки-хозяева.
Вставка ДНК должна быть функционально связана с подходящим промотором. Экспрессирующие конструкции, кроме того, будут сдержать сайты инициации транскрипции, терминации транскрипции и в транскрибируемой области сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, предпочтительно будет содержать в начале кодон инициации трансляции и кодон терминации (например, ИАА, ИСА или ИАС), соответствующим образом расположенный на конце транслируемой мРНК, при этом для экспрессии в клетках млекопитающих или эукариот предпочтительны ИАА и ИАС.
Экспрессирующие векторы предпочтительно, но не обязательно будут содержать, по меньшей мере, один селектируемый маркер. Такие маркеры включают, но не ограничены указанным, ген устойчивости к мето.трексату (МТХ), ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ, патенты США № 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), устойчивости к ампициллину, неомицину (С418), микофенольной кислоте или ген глутаминсинтетазы (С8, патенты США № 5122464; 5770359; 5827739) для культуры эукариотических клеток, и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в случае Е. сой и других бактерий или прокариот (при этом указанные выше патенты включены в виде ссылки в полном объеме). Соответствующие среды для культивирования и условия для описанных выше клеток-хозяев известны в данной области. Подходящие векторы будут очевидны для специалистов в данной области. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять трансфекцией с фосфатом кальция, трансфекцией, опосредованной ЭЕАЕ-декстраном, трансфекцией, опосредованной катионными липидами, электропорацией, трансдукцией, инфицированием или другими известными спо
- 12 006673 собами. Такие способы описаны в данной области, а именно 8атЬтоок, выше, главы 1-4 и 16-18; АикиЬе1, выше, главы 1, 9, 13, 15, 16.
По меньшей мере одно антитело согласно данному изобретению можно экспрессировать в модифицированной форме, такой как слитый белок, и оно может содержать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, можно добавить к Ν-концу антитела, чтобы повысить стабильность и продолжительность существования в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующих манипуляций и хранении. Также пептидные фрагменты можно добавить к антителу согласно данному изобретению, чтобы облегчить очитку. Такие области могут быть удалены перед окончательным получением антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как 8атЬтоок, выше, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; АикиЬе1, выше, главы 16, 17 и 18.
Специалисты в данной области хорошо осведомлены относительно многочисленных экспрессирующих систем, имеющихся для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок согласно данному изобретению.
Альтернативно, нуклеиновые кислоты согласно данному изобретению можно экспрессировать в клетке-хозяине в результате введения в действие (посредством манипулирования) в клетке-хозяине, которая содержит эндогенную ДНК, кодирующую антитело согласно данному изобретению. Такие способы хорошо известны в данной области, например, способы, описанные в патентах США № 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761, включенных в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Иллюстративными культурами клеток, пригодными для продуцирования антител, его специфичных частей или вариантов, являются клетки млекопитающих. Системы клеток млекопитающих часто будут иметь форму монослоя клеток, хотя также можно использовать суспензии клеток млекопитающих или биореакторы с клетками млекопитающих. В данной области разработан ряд подходящих линий клетокхозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, и к ним относятся линии клеток СО8-1 (например, АТСС СКЬ 1650), СО8-7 (например, АТСС СКЬ-1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС СКЬ-10), СНО (например, АТСС СКБ 1610) и В8С-1 (например, АТСС СКЬ-26), клетки Сок7, клетки СНО, клетки Бер 02, Р3Х63Ад8.653, 8Р2/0-Л§14. клетки 293, клетки НеЬа и тому подобные, которые легко доступны, например, из Американской коллекции типов культур, Мапаккак, Уа (ет^ет.а!сс.отд). Предпочтительные клетки-хозяева включают клетки лимфоидного происхождения, такие как клетки миеломы и лимфомы. Особенно предпочтительными клетками являются клетки Р3Х63Ад8.653 (депозитарный номер АТСС СКЬ-1580) и клетки 8Р2/0-А§14 (депозитарный номер АТСС СКЬ-1851). В особенно предпочтительном варианте рекомбинантной клеткой является клетка Р3Х63АЬ8.653 или 8Р2/0-Ад14.
Экспрессирующие векторы для таких клеток могут включать одну или более из следующих регуляторных последовательностей экспрессии, без ограничения, такие, как начало репликации; промотор (например, поздний или ранний промоторы 8У40; промотор СМУ (патенты США № 5168062; 5385839), промотор 1к Н8У, промотор рдк (фосфоглицераткиназы), промотор ЕЕ-1 альфа (патент США № 5266491), по меньшей мере один промотор иммуноглобулина человека; энхансер и/или информационные сайты процессинга, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования (например, сайт присоединения поли А большого Т-Аг 8У40) и последовательности терминатора транскрипции. См., например, АикиЬе1 е! а1., выше; 8атЬтоок, е! а1., выше. Другие клетки, пригодные для получения нуклеиновых кислот или белков согласно данному изобретению, известны и/или доступны, например, по каталогу линий клеток и гибридом Американской коллекции типов культур (ет^ет.а!сс.огд) или других известных или коммерческих источников.
При использовании эукариотических клеток-хозяев последовательности полиаденилирования или терминации транскрипции обычно включают в состав вектора. Примером последовательности терминации является последовательность полиаденилирования гена гормона роста быка. Также можно включать последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером последовательности сплайсинга является интрон УР1 из 8У40 (8ртадие, е! а1., 1. Упо1. 45:773-781 (1983)). Дополнительно в вектор можно включать последовательности гена для регулирования репликации в клетке-хозяине, которые известны в данной области.
Очистка антитела
Анти-1Е-12-антитело можно извлечь и очистить из культур рекомбинантных клеток хорошо известными, способами, включая, но не ограничиваясь указанным, очистку с белком А, осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию на пектине. Для очистки также можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию («ВЭЖХ»). См., например, СоШдап, Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1оду, или Сиггеп! Рго!осо1к ίη РгоШи 8с1еисе, 1оБп \УИеу апб 8оик, ΝΥ, ΝΥ, (1997-2001), например главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, каждая из которых включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
- 13 006673
Антитела согласно данному изобретению включают продукты, очищенные из природных источников, продукты, полученные способами химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными способами из эукариотического хозяина, включая, например, клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. В зависимости от хозяина, используемого в рекомбинантном способе получения, антитело согласно данному изобретению может быть гликозилированным или может быть негликозилированным, при этом предпочтительно гликозилированное антитело. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как 8ашЬтоок, выше, разделы 17.37-17.42; Аи8иЬе1, выше, главы 10, 12, 13, 16, 18 и 20, СоШдап, Рто1еш 8с1епсе, выше, главы 12-14, все публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Анти-1Ь-12-антитела
Выделенные антитела согласно данному изобретению содержат антитело, кодируемое любым из полинуклеотидов согласно данному изобретению, которые более полно обсуждаются в данном описании, или любое выделенное или полученное антитело. Предпочтительно антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент связывает 1Ь-12 человека и при этом частично или в значительной степени нейтрализует, по меньшей мере, одну биологическую активность белка. Антитело, его специфичная часть или вариант, которое частично или предпочтительно в значительной степени нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность по меньшей мере одного белка 1Ь-12 или фрагмента, может связывать белок или фрагмент, тем самым ингибируя активности, опосредованные связыванием 1Ь-12 с рецептором 1Ь-12 или осуществляемые посредством других зависимых или опосредованных 1Ь-12 механизмов. В используемом в данном описании смысле термин «нейтрализующее антитело» относится к антителу, которое может ингибировать зависимую от 1Ь-12 активность примерно на 20-120%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более, в зависимости от анализа. Способность анти-1Ь-12-антитела ингибировать зависимую от 1Ь-12 активность предпочтительно исследуют по меньшей мере посредством одного подходящего анализа белка или рецептора 1Ь-12, как описано в данной заявке и/или известно в данной области. Антитело человека согласно изобретению может относиться к любому классу (1§С, ЦА, 1дМ, ЦЕ. Ι§ϋ и т.д.) или изотипу и может содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном варианте антитело человека содержит тяжелую цепь ЦС или определенный фрагмент, например по меньшей мере одного из изотипов ЦС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Антитела данного типа можно получить, используя трансгенную мышь или другое трансгенное млекопитающее, отличное от человека, содержащее по меньшей мере один трансген легкой цепи человека (например, 1дС, 1дА и 1дМ (например, γ1, γ2, γ3, γ4)), который описан в данной заявке и/или известен в данной области. В другом варианте антитело человека против 1Ь-12 человека содержит тяжелую цепь ЦС1 и легкую цепь 1дС1.
По меньшей мере одно антитело согласно изобретению связывает по меньшей мере один конкретный эпитоп, специфичный по меньшей мере для одного белка, субъединицы, фрагмента, части 1Ь-12, или их комбинации. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере одну область связывания антитела, которая включает по меньшей мере одну часть указанного белка, и указанный эпитоп предпочтительно состоит по меньшей мере из одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, наружной или цитоплазматической части указанного белка. По меньшей мере один конкретный эпитоп может содержать любую комбинацию по меньшей мере одной аминокислотной последовательности, по меньшей мере состоящую из от 1-3 аминокислот до полной конкретной части смежных аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0: 9.
Вообще, антитело человека или антигенсвязывающий фрагмент согласно данному изобретению будет содержать антигенсвязывающую область, которая включает по меньшей мере одну гипервариабельную область человека (СЭК.1, СЭК2 и СЭК.3), или вариант по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи и по меньшей мере одну гипервариабельную область человека (СЭК.1, СЭК2 и СЭК.3), или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. В качестве неограничивающего примера антитело или антигенсвязывающая часть или вариант, может содержать по меньшей мере один СЭК.3 тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, и/или СЭК3 легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 6. В конкретном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент может иметь антигенсвязывающую область, которая содержит по меньшей мере часть по меньшей мере одного СЭК. тяжелой цепи (т.е. СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК.3), имеющего аминокислотную последовательность соответствующего СЭК 1, 2 и/или 3 (например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, и/или 3). В другом конкретном варианте антитело или антигенсвязывающая часть или вариант может содержать по меньшей мере антигенсвязывающую область, которая включает по меньшей мере часть по меньшей мере одной СЭК легкой цепи (т.е. СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК.3), имеющей аминокислотную последовательность соответствующих СЭК. 1, 2 и/или 3 (например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 5 и/или 6). В предпочтительном варианте три СЭК. тяжелой цепи и три СЭК легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность соответствующей СЭВ по меньшей мере одного из мАт 12В75, С340 или любых других, которые описаны в данной заявке. Такие антитела можно получить посредством химического связывания друг с другом разных частей (например, СЭК., каркаса) антитела с использованием обычных способов, путем получения и экспрессии (например, одной
- 14 006673 или более) молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитело, используя обычные способы на основе технологии рекомбинантной ДНК или используя любой другой подходящий способ.
Анти-1Ь-12-антитело может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой или легкой цепи, имеющую определенную аминокислотную последовательность. Например, в предпочтительном варианте анти-1Ь-12-антитело содержит по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0: 7, и/или по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, необязательно имеющую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 8. Антитела, которые связываются с 1Ь-12 человека и которые содержат определенную вариабельную область тяжелой или легкой цепи, можно получить, используя подходящие способы, такие как фаговый дисплей (Ка18иЬе, У., е! а1., Ιη! 1. Мо1. Меб, 1(5):863-868 (1998)), или способы, в которых используют трансгенных животных, которые известны в данной области и/или описаны в данной заявке. Например, трансгенную мышь, содержащую функционально реаранжированный трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген, включающий ДНК из локуса легкой цепи иммуноглобулина человека, который может подвергаться функциональной реаранжировке, можно иммунизировать Ш-12 человека или его фрагментом, чтобы вызвать продуцирование антител. При желании антитело-продуцирующие клетки можно выделить и можно получить гибридомы или другие иммортализованные антитело-продуцирующие клетки, как описано в данной заявке и/или известно в данной области. Альтернативно, антитело, конкретную часть или вариант можно экспрессировать с использованием кодирующей нуклеиновой кислоты или ее части, в подходящей клетке-хозяине.
Изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, цепям иммуноглобулинов и СГОК, содержащим аминокислоты в последовательности, которая по существу является такой же, как аминокислотная последовательность, описанная в данной заявке. Предпочтительно такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты и антитела, содержащие такие цепи или СГОК, могут связывать 1Ь12 человека с высокой аффинностью (например, при Кс меньше или равном примерно 10-9 М). Аминокислотные последовательности, которые по существу являются такими же, как последовательности, описанные в данной заявке, включают последовательности, содержащие консервативные аминокислотные замены, а также делеции и/или инсерции аминокислот. Консервативные аминокислотные замены относятся к замене первой аминокислоты второй аминокислотой, которая обладает химическими и/или физическими свойствами (например, зарядом, структурой, полярностью, гидрофобностью/гидрофильностью), которые сходны со свойствами первой аминокислоты. Консервативные замены включают замену одной аминокислоты другой в пределах следующих групп: лизин (К), аргинин (К) и гистидин (Н); аспартат (Ό) и глутамат (Е); аспарагин (Ν), глутамин (О), серин (8), треонин (Т), тирозин (У); К, К, Η, Ό и Е; аланин (А), валин (V), лейцин (Ь), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (Е), триптофан (^), метионин (М), цистеин (С) и глицин (6); Е, и Υ; С, 8 и Т.
Коды аминокислот
Аминокислоты, которые составляют анти-1Е-12-антитела согласно данному изобретению, часто обозначают сокращенно. Названия аминокислот можно указывать, обозначая аминокислоту однобуквенным кодом, трехбуквенным кодом, наименованием или трехнуклеотидным кодоном(ами), которые хорошо известны в данной области (см., Л1Ьей8, В., е! а1., Мо1еси1аг Вю1оду о£ Тйе Се11, ТЫтб Еб., 6аг1апб РиЬЖЫпд, 1пс., Νονν Уогк, 1994):
- 15 006673
Анти-1Б-12-антитело согласно данному изобретению может содержать одну или более аминокислотных замен, делеций или добавлений, либо в результате естественных мутаций, либо в результате искусственных манипуляций, как описано в данной заявке.
Конечно, количество аминокислотных замен, которое сможет сделать специалист в данной области, зависит от многих факторов, включая факторы, описанные выше. Вообще говоря, количество аминокислотных замен, инсерций или делеций для любого данного белка, полученного из 1д против 1Б-12, фрагмента или варианта, не будет превышать 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, а именно, 1-30 или любой интервал или значение в указанном диапазоне, как описано в данной заявке.
Аминокислоты в анти-1Б-12-антителе согласно данному изобретению, которые необходимы для функционирования, можно идентифицировать способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или мутагенез на основе сканирования аланином (например, Ли8иЬе1, выше, главы 8, 15; СипптдЕаш апд ^е11з, 8е1епее 244:1081-1085 (1989)). Последняя методика заключается во введении одиночных аланиновых мутаций в каждом остатке молекулы. Затем полученные в результате мутантные молекулы тестируют в отношении биологической активности, такой как по меньшей мере одна активность, нейтрализующая 1Б-12, но не ограничиваясь указанным. Сайты, которые являются критическими для связывания антитела, также можно идентифицировать в результате структурного анализа, такого как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение (Бшн11, е) а1., I. Мо1. Βΐο1. 224:899-904 (1992) и де Уоз, е! а1., Бе1епее 255:306-312 (1992)).
Анти-1Б-12-антитела согласно данному изобретению могут включать, но не ограничены указанным, по меньшей мере одну часть, последовательность или комбинацию, выбранную из аминокислот в количестве от 5 до всех смежных аминокислот, по меньшей мере одной из БЕЦ ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6.
1Б-12-антитела или специфичные части или варианты согласно данному изобретению могут включать, но не ограничены указанным, по меньшей мере одну часть, последовательность или комбинацию, выбранную по меньшей мере из 3-5 смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 1, 5-17; смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 2, 5-10; смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 3, 5-11; смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 4, 57; смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 5; 5-9; смежных аминокислот БЕЦ ΙΌ N0: 6; Беи21, Буз76, Ме183, Бег85 БЕЦ ΙΌ N0: 7.
Анти-1Б-12-антитело дополнительно необязательно может содержать полипептид, имеющий, по меньшей мере, одну из последовательностей, составляющих 70-100% последовательности из 5, 17, 10, 11, 7, 9, 119 или 108 смежных аминокислот, по меньшей мере, одной из БЕС) ΙΌ N0: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8.
В одном варианте аминокислотная последовательность цепи иммуноглобулина или ее части (например, вариабельной области, СЭК) обладает примерно 70-100% идентичностью (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или любой интервал или значение в указанном диапазоне) с аминокислотной последовательностью соответствующей цепи по меньшей мере одной из БЕЦ ΙΌ N0: 7, 8. Например, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи можно сравнить с последовательностью БЕЦ ΙΌ N0: 8, или аминокислотную последовательность СЭК3 тяжелой цепи можно сравнить с БЕЦ ΙΌ N0: 3. Предпочтительно 70-100% идентичность аминокислот (т.е., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 или любой ин
- 16 006673 тервал или значение в указанном диапазоне) определяют с использованием подходящего компьютерного алгоритма, известного в данной области.
Примеры последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи представлены в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 и 8. Антитела согласно данному изобретению или их конкретные варианты могут содержать любое количество смежных аминокислотных остатков представляющего интерес антитела, причем это количество выбрано из группы целых чисел, составляющих 10-100% количества смежных остатков в анти-1Е-12-антителе. Необязательно указанная субпоследовательность смежных аминокислот составляет в длину, по меньшей мере, примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 или больше аминокислот, или любой интервал или значение в указанном диапазоне. Кроме того, количество таких субпоследовательностей может равняться любому целому числу, выбранному из группы, состоящей из от 1 до 20, а именно по меньшей мере 2, 3, 4 или 5.
Как будет понятно специалистам в данной области, данное изобретение включает по меньшей мере одно биологически активное антитело согласно данному изобретению. Биологически активные антитела имеют удельную активность, составляющую по меньшей мере 20, 30 или 40% и предпочтительно по меньшей мере 50, 60, или 70%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-100% активности нативного (несинтетического), эндогенного или родственного и известного антитела. Способы анализа и количественных измерений ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны специалистам в данной области.
В другом аспекте изобретение относится к антителам человека и антигенсвязывающим фрагментам, которые описаны в данной заявке, которые модифицируют посредством ковалентного связывания с органическим фрагментом. Такая модификация может давать антитело или антигенсвязывающий фрагмент с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным временем полужизни в сыворотке ίη νίνο). Органический фрагмент может представлять собой неразветвленную или разветвленную гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу эфира жирной кислоты. В конкретном варианте гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу, составляющую примерно от 800 до 120000 Да, и может являться полиалкангликолем (например, полиэтиленгликолем (ПЭГ), полипропиленгликолем (ИНГ)), углеводным полимером, полимером аминокислот или поливинилпирролидоном, и группа жирной кислоты или эфира жирной кислоты может содержать примерно от восьми до сорока атомов углерода.
Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно изобретению могут содержать один или более органических фрагментов, которые прямо или опосредованно ковалентно связаны с антителом. Каждый органический фрагмент, который связывают с антителом или антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению, независимо может представлять собой гидрофильную полимерную группу, группу жирной кислоты или группу эфира жирной кислоты. В используемом здесь смысле термин «жирная кислота» охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. «Гидрофильная полимерная группа» в качестве используемого в данном описании термина относится к органическому полимеру, который растворим в воде лучше, чем в октане. Например, полилизин лучше растворим в воде, чем в октане. Таким образом, данное изобретение охватывает антитело, модифицированное ковалентным связыванием с полилизином. Гидрофильные полимеры, подходящие для модифицирования антител согласно изобретению, могут быть неразветвленными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, ПЭГ, монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), ППГ и тому подобное), углеводы (например, декстран, целлюлоза, олигосахариды, полисахариды и тому подобное), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и тому подобное), оксиды полиалканов (например, оксид полиэтилена, оксид полипропилена и тому подобное) и поливинилпирролидон. Предпочтительно гидрофильный полимер, которым модифицируют антитело согласно данному изобретению, имеет молекулярную массу примерно от 800 до 150000 дальтон в виде отдельной молекулярной единицы. Например, можно использовать ПЭГ5000 и ПЭГ20000, где подстрочный индекс означает среднюю молекулярную массу полимера в дальтонах. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена одной-шестью алкильными группами, группами жирных кислот и эфиров жирных кислот. Гидрофильные полимеры, которые замещены группой жирной кислоты или эфира жирной кислоты, можно получить, используя подходящие способы. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно связать с карбоксилатом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, и активированный карбоксилат (например, активированный Ν,Ν-карбонилдиимидазолом) жирной кислоты или эфира жирной кислоты может быть связан с гидроксильной группой полимера.
Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, подходящие для модифицирования антител согласно изобретению, могут быть насыщенными или могут содержать одну или более единиц для насыщения. Жирные кислоты, которые подходят для модифицирования антител согласно изобретению, включают, например, н-додеканоат (С12, лаурат), н-тетрадеканоат (С14, миристат), н-октадеканоат (С18, стеарат), нэйкозаноат (С20, арахидат), н-докозаноат (С22, бегенат), н-триаконтаноат (С30), н-тетраконтаноат (С40), цис-Л9-октадеканоат (С18, олеат), полностью цис-Л5,8,11,14-эйкозатетраеноат (С20, арахидонат), октандикарбоновая кислота, тетрадекандикарбоновая кислота, октадекандикарбоновая кислота, докозандикарбоновая кислота и тому подобное. Подходящие эфиры жирных кислот включают моноэфиры дикарбоно
- 17 006673 вых кислот, которые содержат неразветвленную или разветвленную группу низшего алкила. Группа низшего алкила может содержать от одного до примерно двенадцати, предпочтительно от одного до примерно шести атомов углерода.
Модифицированные антитела человека и антигенсвязывающие фрагменты можно получить, используя подходящие способы, такие как реакцию с одним или более модифицирующими агентами. «Модифицирующий агент» в качестве используемого в данном описании термина относится к подходящей органической группе (например, гидрофильному полимеру, жирной кислоте, эфиру жирной кислоты), которая содержит активирующую группу. «Активирующая группа» означает химический фрагмент или функциональную группу, которая в соответствующих условиях может реагировать со второй химической группой, образуя при этом ковалентную связь между модифицирующим агентом и второй химической группой. Например, реагирующие с амином активирующие группы включают электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, иод), сложные Νгидроксисукцинимидные эфиры (ΝΗ8) и тому подобное. Активирующие группы, которые могут реагировать с тиолами, включают, например, малеимид, иодацетил, акрилолил, пиридилдисульфиды, тиол 5тиол-2-нитробензойной кислоты (ΊΝΒ-тиол) и тому подобное. Альдегидная функциональная группа может быть связана с молекулами, содержащими амин или гидразид, и азидная группа может реагировать с группой трехвалентного фосфора с образованием фосфорамидатной или фосфоримидной связей. Подходящие способы введения активирующих групп в молекулы известны в данной области (см., например, Негшапзоп, О.Т., ВюсопщдПе ТесНп14ие5, Асабешс Ргекк: 8ан П1едо, СА (1996)). Активирующая группа может быть связана непосредственно с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, эфиром жирной кислоты) или через линкерный фрагмент, например, дивалентную С1-С12-группу, в которой один или более атомов углерода могут быть замещены гетероатомом, таким как кислород, азот или сера. Подходящие линкерные фрагменты включают, например, тетраэтиленгликоль, -(СН2)3-, -ΝΗ-(ί.Ή2)6-ΝΗ- -(СН2)2-ЫН- и -СН2-О-СН2СН2-О-СН2-СН2-О-СН-ЫН-. Модифицирующие агенты, которые содержат линкерный фрагмент, можно, например, получить взаимодействием моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Вос диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитную Восгруппу можно удалить из продукта обработкой трифторуксусной кислотой (ТФУ), чтобы открыть первичный амин, который можно связать с другим карбоксилатом, которые описаны, или можно подвергнуть реакции с малеиновым ангидридом, и полученный в результате продукт циклизовать с получением активированного малеимидного производного жирной кислоты. (См., например, Ткотркоп, е! а1., ХУО 92/16221, инструкции, приведенные в указанной работе, включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме).
Модифицированные антитела согласно изобретению можно получить взаимодействием антитела человека или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, с антителом можно связать органические компоненты не сайт-специфичным образом, используя модифицирующий агент, реагирующий с амином, например, сложный ННЗ-эфир ПЭГ. Модифицированные антитела человека или антигенсвязывающие фрагменты также можно получить восстановлением дисульфидных связей (например, внутрицепочечных дисульфидных связей) антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Затем восстановленное антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно подвергнуть взаимодействию с модифицирующим агентом, реагирующим с тиолом, чтобы получить модифицированное антитело согласно изобретению. Модифицированные антитела человека или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органический компонент, который связывается со специфичными сайтами антитела согласно данному изобретению, можно получить, используя подходящие способы, такие как обратимый протеолиз (ЕЕсй е! а1., Вюсопщда!е Сйеш, 3:147-153 (1992); \Уег1еп е! а1., Вюсопщда!е Сйеш, 5:411-417 (1994); ^таип е! а1., Рто!ет 8сг 6(10):2233-2241 (1997); Ной е! а1., Вюогд. Скет., 24(1):59-68 (1996); Саре11ак е! а1., Вю1есЬпо1. Вюепд. 56(4):456-463 (1997)) и способы, описанные в Негтапкоп, О. Т. Вюсопщда!е Тесктсцгез, Асабетю Ргекк: 8ап П1едо, СА (1996).
Антиидиотипические антитела к белковым композициям, полученным из 1С против 1Ь-12
Кроме моноклональных или химерных анти-1Т-12-антител данное изобретение также относится к антиидиотипическому (анти-1б)-антителу, специфичному для таких антител согласно изобретению. Анти-1б-антитело представляет собой антитело, которое узнает уникальные детерминанты, обычно связанные с антигенсвязывающей областью другого антитела. Анти-1б можно получить иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, линии мышей), что и источник 1б-антитела, антителом или его областью, содержащей СЭК.. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела и продуцировать анти-1б-антитело. Анти-1бантитело также можно использовать в качестве «иммуногена», чтобы индуцировать иммунный ответ еще и у другого животного, продуцирующего так называемое анти-анти-1б-антитело.
Белковые композиции, полученные из 1С против 1Ь-12
Данное изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции анти-1Т-12-антитела, содержащей по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более анти-1Т-12-антител, которые описаны в данной заявке и/или известны в данной области, которые представлены композицией, смесью или фор
- 18 006673 мой неприродного происхождения. Такие композиции включают композиции неприродного происхождения, содержащие по меньшей мере один или два полноразмерных, С- или Ν-усеченных варианта, домены, фрагменты или специфические варианты аминокислотной последовательности анти-Л-Рантитела, выбранные из группы, состоящей из 70-100% смежных аминокислот 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 или их специфичных фрагментов, доменов или вариантов. Предпочтительно композиции полученного из анти-Л-Р белка, фрагмента или варианта включают по меньшей мере одну или две последовательности анти-Л-Р-антитела полной длины, фрагментов, доменов или вариантов, как например по меньшей мере одной части, содержащей СОК, составляющие 70-100% 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6 или их специфичных фрагментов, доменов или вариантов. Кроме того, предпочтительные композиции содержат 40-99% по меньшей мере одной из последовательностей, составляющей 70-100% 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6 или их специфичных фрагментов, доменов или вариантов. Процентное содержание таких композиций означает содержание по массе, объему, концентрации, молярности или моляльности в виде жидких или сухих растворов, смесей, суспензий, эмульсий или коллоидов, известных в данной области или описанных в данной заявке.
Композиции анти-ЕЕ-^-антитела согласно данному изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любого подходящего и эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, включающей по меньшей мере одно анти-Т-^-антитело, для клетки, ткани, органа, животного или пациента, который нуждается в таком модулировании, обработке или терапии, кроме того, необязательно дополнительно включающей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей по меньшей мере из одного ΤΝΕ-антагониста (например, ΤΝΕ-антитела или фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΕ или фрагмента, их слитых белков или малой молекулы ΤΝΕ-антагониста), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, натрий-тиомалата золота, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазальцина), миорелаксанта, наркотического, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (НПВС), анальгезирующего, анестезирующего, седативного средства, местного анестетика, нейромышечного блокатора, противомикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкового, противопаразитического, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, флурорхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, других противомикробных средств), противопсориазного средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, имеющего отношение к диабету, минерального, пищевого, тиреоидного средства, витамина, связанного с кальцием гормона, противодиарейного, противокашлевого, противорвотного, противоязвенного, слабительного, антикоагулянтного средства, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, 6-С8Е, неупоген), сарграмостима (6МС8Е, лейкин), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормона роста, гормонозамещающего лекарственного средства, модулятора рецептора эстрогена, мидриатического, расширяющего, алкилирующего агента, антиметаболита, ингибитора митотического деления, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического, анксиолитического, гипнотического, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, антиастматического средства, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназы альфа (пульмозим), цитокина или антагониста цитокина. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают, но не ограничены указанным, любой из интерлейкинов с ТС-1 по ΙΕ-23. Подходящие дозы известны в данной области. См., например, \Ус11к с! а1., сбк., РйагтасоЛсгару НапбЬоок, 2'1 Ебйюп, Лрр1с1оп апб Ьаиде, 81атГогб, СТ (2000); ΡΌΚ Ркагтасороаа, Тагаксоп Роекс! Ркагтасороаа 2000, Эс1ихс Еббюп, Тагаксоп РиЬНкЫпд, Ьота Ьшба, СА (2000), каждая из указанных публикаций включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Такие противораковые и антимикробные средства также могут включать молекулы токсинов, которые ассоциируют, связывают, готовят в виде совместной композиции или совместно вводят по меньшей мере с одним антителом согласно данному изобретению. Токсин необязательно может действовать, избирательно уничтожая патологическую клетку или ткань. Патологической клеткой может быть раковая клетка или другая клетка. Такие токсины могут быть представлены без ограничения очищенным или рекомбинантным токсином или фрагментом токсина, содержащим по меньшей мере один функциональный цитотоксичный домен токсина, например, выбранный по меньшей мере из одного рицина, дифтерийного токсина, змеиного токсина или бактериального токсина. Термин «токсин» также включает как эндотоксины, так и экзотоксины, продуцируемые любыми бактериями или вирусами природного происхождения, мутантными или рекомбинантными, которые могут вызывать любое патологическое состояние у людей и других млекопитающих, включая токсический шок, который может приводить к смерти. Такие токсины могут включать, но не ограничены указанным, термолабильный энтеротоксин энтеротоксигенной Е. Со11 (ЬТ), термостабильный энтеротоксин (8Т), цитотоксин 8Ыдс11а, энтеротоксины Асготопак, токсин 1 синдрома токсического шока (Т88Т-1), стафилококковый энтеротоксин А (8ЕА), В (8ЕВ) или С (8ЕС), стрептококковые энтеротоксины и тому подобное. Указанные бактерии включают, но не ограничены указанным, штаммы или виды энтеротоксигенной Е. сой (ЕТЕС), энтерогеморрагической Е. Сой (например, штаммы серотипа 0157:Н7), виды 81арНу1ососсик (например, 81арНу1ососсик аигсик, 81арНу1о
- 19 006673 соссиз руодепез), виды 8Ыде11а (например, 8Ыде11а йузейепае, 81иде11а Пехпегг 81иде11а Ьоуйи и 81иде11а зоппе1), виды 8а1топе11а (например, 8а1топе11а ίурЬ^, 8а1топе11а ско1егазшз, 8а1топе11а ейепйФз), виды С1озШйшт (например, С1оз1пйшт регГппдепз, С1оз1пйшт йШсйе, С1оз1пйшт ЬоФ1тит), виды СатрЫоЬас1ег (например, СатрН1оЬас1ег )ещпг СатрН1оЬас1ег Шиз), виды НеЕоЬас1ег (например, Не1юЬас1ег ру1оп), виды Аеготопаз (например, Аеготопаз зоЬпа, Аеготопаз куйгорЫ1а, Аеготопаз са^/ае), Р1е1зотопаз зЫде11о1йез, Уегзта ейегосоШюа, виды УФпоз (например, У1Ьпоз ско1егае, У1Ьпоз рагакето1уйсиз), виды К1еЬз1е11а, Рзеийотопаз аегидтоза и 81гер1ососсг См., например, 8(е1п, ей., ΙΝΤΕΚΝΆΣ МЕОК'.’ШЕ, 3гй ей., рр 1-13, Ьййе, Вгошп апй Со., ВозФп, (1990); Ενапз еί а1., ейз., Вас1епа1 ЕчГесЕопз оГ Нитапз: Ер1йетю1оду апй СогИгок 2й. Ей., рр 239-254, Р1епит Мей1са1 Воок Со., Νονν Уогк (1991); Мапйе11 еί а1., Рппсй р1ез апй Ргасйсе оГ Шесйоиз П1зеазез, 3й. Ей., СкигсЫ11 ЬМпдзФпе. Νονν Уогк (1990); Вегкош еί а1., ейз., Тке Мегск Мапиа1, 1611' еййюп, Мегск апй Со., Какшау, Ν.Ε, 1992; \Уоой еί а1., ЕЕМ8 М1сгоЫо1оду 1ттипо1оду, 76: 121-134 (1991); Маггаск еί а1., 8аепсе, 248:705-711 (1990), содержание каждой публикации включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Соединения, композиции или комбинации анти-1Ь-12-антитела согласно данному изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любых подходящих вспомогательных средств, без ограничения, таких как разбавитель, связывающий агент, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант и тому подобное. Предпочтительны фармацевтически приемлемые вспомогательные средства.
Неограничивающие примеры способов получения таких стерильных растворов хорошо известны в данной области, без ограничения, такие как способы, описанные Сеппаго, Ей., КепйпдЮп'з РНагтасеи11са1 8с1епсез, 181 Еййюп, Маск РиЬкзЫпд Со. (ЕазФп, РА) 1990. Обычным способом можно выбрать фармацевтически приемлемые носители, которые подходят для способа введения, растворимости и/или стабильности композиции анти-1Ь-12-антитела, фрагмента или варианта, которые хорошо известны в данной области или описаны в данной заявке.
Фармацевтические эксципиенты и добавки, пригодные в данной композиции, включают, но не ограничены указанным, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, зтерифицированные сахара, и тому подобное; и полисахариды или полимеры сахаров), которые могут присутствовать отдельно или в комбинации, составляя отдельно или в комбинации 1-99,99% по массе или объему. Примеры белковых эксципиентов включают сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека (Н8А), рекомбинантный альбумин человека (гНА), желатин, казеин и тому подобное. Типичные компоненты аминокислот/антитела, которые также могут функционировать в качестве средства, обладающего буферными свойствами, включают аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и тому подобное. Одной предпочтительной аминокислотой является глицин.
Углеводные эксципиенты, подходящие для применения в изобретении, включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и тому подобные; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и тому подобное; полисахариды, такие как раффиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и тому подобное; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит сорбит (глюцит), миоинозит и тому подобное. Предпочтительными углеводными эксципиентами для применения в данном изобретении являются маннит, трегалоза и раффиноза.
Композиции анти-1Ь-12-антитела также могут включать буфер или средство корректировки рН; обычно буфером является соль, полученная из органической кислоты или основания. Типичные буферы включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис-буфер, буфер на основе гидрохлорида трометамина или фосфатный буфер. Предпочтительными буферами для применения в данных композициях являются соли органических кислот, такие как цитрат.
Кроме того, композиции анти-1Ь-12-антитела согласно изобретению могут включать полимерные эксципиенты/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, отдушки, антимикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатические средства, поверхностноактивные вещества (например, полисорбаты, такие как «твин 20» и «твин 80»), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатирующие агенты (например, ЕОТА).
Указанные и дополнительные известные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, подходящие для применения в композициях анти-1Ь-12-антитела, части или варианта согласно изобретению, известны в данной области, например, перечислены в «КеттдФп: Тке 8с1епсе апй Ргасксе оГ Ркагтасу», 1911' ей., ХУйНатз апй ^1Шатз, (1995), и в «Ркузюап'з Эезк КеГегепсе», 52пй ей., Мейюа1 Есопоткз, Моп1νа1е, N1 (1998), описания которых в полном объеме включены в данное описание в виде ссылки. Пред- 20 006673 почтительными материалами носителей или эксципиентов являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитрат) или полимерные агенты.
Составы
Как указано выше, изобретение относится к стабильным составам, которые предпочтительно представляют собой фосфатный буфер с физиологическим раствором или выбранной солью, а также сохраняемые растворы и составы, содержащие консервант, а также составы с консервантом множественного применения, подходящие для фармацевтического или ветеринарного применения, содержащие по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело в фармацевтически приемлемом составе. Составы для хранения содержат по меньшей мере один известный консервант или необязательно консервант, выбранный из группы, состоящей по меньшей мере из одного фенола, мета-крезола, пара-крезола, орто-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, нитрита фенилртути, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобное), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей в водном разбавителе. Можно использовать любую подходящую концентрацию или смесь, которые известны в данной области, такие как 0,001-5%, или любой интервал или значение в указанном диапазоне, а именно, без ограничения, 0,001; 0,003; 0,005; 0,009; 0,01; 0,02; 0,03; 0,05; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0; 4,3; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9 или любой интервал или значение в указанном диапазоне. Неограничивающие примеры включают составы без консервантов, и составы, содержащие 0,12% мета-крезола (например, 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,9; 1,0%), 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5; 0,9; 1,1; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5%), 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005; 0,01), 0,001-2,0% фенола (например, 0,05; 0,25; 0,28; 0,5; 0,9; 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075; 0,0009; 0,001; 0,002; 0,005; 0,0075; 0,009; 0,01; 0,02; 0,05; 0,075; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75; 0,9; 1,0%) и тому подобное.
Как указано выше, изобретение относится к продукту производства, содержащему упаковочный материал и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного анти-1Ь-12антитела с входящими в рецептуру буферами и/или консервантами, необязательно в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал содержит метку, на которой указано, что такой раствор можно хранить в течение периода времени, равного 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 часам или более. Изобретение, кроме того, включает продукт производства, содержащий упаковочный материал, первый флакон, содержащий по меньшей мере одно лиофилизованное анти-1Ь-12-антитело, и второй флакон, содержащий водный разбавитель входящего в рецептуру буфера или консерванта, при этом указанный упаковочный материал имеет метку, в которой дана инструкция для пациента о том, как перерастворить по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело в водном разбавителе, чтобы получить раствор, который можно хранить в течение периода времени, равного двадцати четырем часам или более.
По меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело, используемое согласно данному изобретению, можно получить рекомбинантными способами, в том числе из клеток млекопитающих или трансгенных препаратов, или можно получить из других биологических источников, которые описаны в данной заявке или известны в данной области.
Диапазон по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела в продукте согласно данному изобретению, включает количества, которые при перерастворении в случае влажной/сухой системы дают концентрации примерно от 1,0 мкг/мл до примерно 1000 мг/мл, хотя пригодными являются более низкие и более высокие концентрации, которые зависят от запланированного носителя для доставки, например состав в виде растворов будет отличаться от композиций трансдермального пластыря, композиций для введения легочным, трансмукозальным или посредством осмотического или микронасоса.
Предпочтительно водный разбавитель дополнительно необязательно содержит фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительные консерванты включают консерванты, выбранные из группы, состоящей из фенола, мета-крезола, пара-крезола, орто-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобное), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в композиции, представляет собой концентрацию, достаточную для получения антимикробного эффекта. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и легко могут быть определены специалистом в данной области.
Необязательно, но предпочтительно к разбавителю можно добавлять другие эксципиенты, например агенты изотоничности, буферы, антиоксиданты, усилители консервантов. Агент изотоничности, такой как глицерин, широко используется в известных концентрациях. Предпочтительно добавляют физиологически допустимый буфер, чтобы обеспечить лучший контроль рН. Композиции могут охватывать широкие пределы рН, такие как примерно от рН 4 до рН 10, и предпочтительно находятся в пределах примерно от рН 5 до рН 9, и наиболее предпочтительно в пределах примерно от 6,0 до 8,0. Предпочтительно композиции согласно данному изобретению имеют значение рН примерно от 6,8 до 7,8. Предпочтительные буферы включают фосфатные буферы, наиболее предпочтительно фосфат натрия, особенно фосфатно-солевой буфер (ФСБ).
- 21 006673
Другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, подобные твину 20 (монолаурат полиоксиэтилен (20)сорбитана), твину 40 (монопальмитат полиоксиэтилен(20)сорбитана), твину 80 (моноолеат полиоксиэтилен(20)сорбитана), плюронику Е68 (блок-сополимер полиэксиэтилена и полиоксипропилена) и ПЭГ (полиэтиленгликоль), или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, Р1игошс® полил, другие блок-сополимеры и хелатирующие агенты, такие как ΕΌΤΑ и ЕСТА, необязательно можно добавлять в составы или композиции, чтобы уменьшить агрегацию. Указанные добавки особенно пригодны в случае использования для введения композиции насоса или пластмассовой емкости. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества уменьшает склонность белка к агрегации.
Композиции согласно данному изобретению можно получить с использованием методики, которая состоит в смешивании по меньшей мере одного анти-1Е-12-антитела и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, мета-крезола, пара-крезола, орто-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобное), хлорида бензалкония, хлорида бензэтония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела и консерванта в водном разбавителе выполняют, используя обычные методики растворения и смешивания. Например, чтобы получить подходящую композицию, измеренное количество по меньшей мере одного анти-1Е-12-антитела в забуференном растворе объединяют с требуемым консервантом в забуференном растворе в количествах, достаточных для обеспечения требуемых концентраций белка и консерванта. Специалисту в данной области будут понятны изменения указанной методики. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых готовят композицию, все это относится к факторам, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и способов введения.
Заявляемые композиции можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включая флакон по меньшей мере с одним лиофилизованным анти-1Е-12-антителом, которое перерастворяют во втором флаконе, содержащем воду, консервант и/или эксципиенты, предпочтительно фосфатный буфер и/или физиологический раствор, и выбранную соль, в водном разбавителе. Либо один флакон с раствором, либо два флакона, когда требуется перерастворение, можно повторно использовать множество раз, и они могут быть достаточными для однократного или многократных циклов лечения пациента и таким образом могут обеспечивать более удобную схему лечения, чем имеющаяся в настоящее время.
Заявляемые в пунктах формулы изобретения продукты производства применимы для введения в течение периода времени в диапазоне от немедленного введения до двадцати четырех часов или более. Следовательно, заявляемые в данном изобретении продукты производства предоставляют значительные преимущества для пациента. Композиции согласно изобретению необязательно могут безопасно храниться при температурах примерно от 2 до 40°С и сохранять биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, таким образом, допустима метка на упаковке, указывающая, что раствор можно хранить и/или использовать в течение периода времени, равного 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 часам или более. В том случае, если используют разбавитель с консервантом, то в такой метке может быть указано применение до 1-12 месяцев, полгода, полтора года и/или два года.
Растворы по меньшей мере одного анти-1Е-12-антитела согласно изобретению можно приготовить по методике, которая включает смешивание по меньшей мере одного антитела в водном разбавителе. Смешивание выполняют, используя обычные способы растворения и перемешивания. Например, для приготовления подходящий разбавитель, измеренное количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере смешивают в количествах, достаточных для обеспечения требуемых концентраций белка и необязательно консерванта или буфера. Специалисту в данной области будут понятны вариации данной методики. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых готовят композицию, все это относится к факторам, которые можно оптимизировать в отношении используемой концентрации и способов введения.
Заявляемые продукты можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов, либо в виде двух флаконов, включая флакон по меньшей мере с одним лиофилизованным анти-1Е-12-антителом, которое перерастворяют во втором флаконе, содержащем водный разбавитель. Либо один флакон с раствором, либо два флакона, когда требуется перерастворение, можно повторно использовать множество раз, и они могут быть достаточными для однократного или многократных циклов лечения пациента и таким образом могут обеспечивать более удобную схему лечения, чем имеющаяся в настоящее время.
Заявляемые продукты можно непосредственно предоставлять пациентам, поставляя в аптеки, клиники или другие подобные учреждения и заведения прозрачные растворы или пары флаконов, включая флакон по меньшей мере с одним лиофилизированным анти-1Е-12-антителом, которое перерастворяют во втором флаконе, содержащем водный разбавитель. Прозрачный раствор в данном случае может иметь объем до одного литра или даже больше, при условии большой емкости, из которой в аптеке или клинике можно брать небольшие части раствора по меньшей мере одного антитела один раз или множество раз для переноса в меньшие флаконы, и предоставлять их покупателям и/или пациентам.
- 22 006673
Общеизвестные устройства, содержащие такие системы отдельных флаконов, включают закрытые инжекторные устройства для доставки раствора, такие как ΒΌ Реик, ΒΌ Аи1о)сс1ог®, Нита)сс1с®·, ΝοуоРеп®, В-Э®Реп, Аи1оРси® и ОрИРеп®, 6епо1горшРсп®, Сспо1гопогт Реп®, Нита1го Реп®, Кесо-Реп®, КоГсгоп Реп®, В1о_)ес1ог®, 1Н)ес1®, безыгольный инжектор с 1-наконечником, ШРщсс!®, МсбМсс!®, например, производимые или разработанные Всс1оп Пккепкеп (ЕгапкНп Ьакск, Ν1, ууу.Ьсс1опй1сксп8оп.сот), ОЦйгошс (ВигдбогГ, §У17сг1апй, ууу.бЦйгошс.сот), В|о)сс1, Рогйапб, Огсдоп (\у\у\у.Ыо]сс1.сот); №Шопа1 Мсб1са1 РгойисЦ ХУсЦоп Мсб1са1 (Рс1сгЬогоидк, υκ, \у\у\у.\ус51оптеФсаксот), МебМес! Согр (МшпеароШ, М^ \у\у\у.тсШ]ссЕсот). Общеизвестные устройства, содержащие систему двойных флаконов, включают закрытые инжекторные системы для перерастворения лиофилизированного лекарственного средства в картридже для доставки перерастворенного раствора, такие как Нита1гоРсп®.
Продукты, описанные в данной заявке, включают упаковочный материал. На упаковочном материале кроме информации, требуемой органами государственного регулирования, указывают условия, при которых продукт можно использовать. Упаковочный материал согласно данному изобретению снабжен инструкциями для пациента о том, что следует перерастворить по меньшей мере одно анти-ΙΕантитело в водном разбавителе, чтобы получить раствор, и использовать раствор в течение периода времени, равного 2-24 ч или более в случае влажного/сухого продукта в двух флаконах. В случае продукта в виде раствора в одном флаконе метка указывает, что такой раствор можно использовать в течение периода времени, равного 2-24 ч или более. Описанные в данной заявке продукты пригодны для применения в качестве фармацевтического продукта для человека.
Композиции согласно данному изобретению можно приготовить по методике, которая включает смешивание по меньшей мере одного анти-Ш-Р-антитела и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного антитела и буфера в водном разбавителе выполняют, используя стандартные способы растворения и смешивания. Например, чтобы приготовить подходящую композицию, измеренное количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере объединяют с требуемым буферным агентом в воде в количествах, достаточных для обеспечения требуемых концентраций белка и буфера. Специалисту в данной области будут понятны вариации данной методики. Например, порядок добавления компонентов, использование дополнительных добавок, температура и рН, при которых готовят композицию, все это относится к факторам, которые можно оптимизировать для используемой концентрации и способов введения.
Заявляемые стабильные композиции или композиции с консервантами можно предоставлять пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включая флакон по меньшей мере с одним лиофилизированным анти-Ш-Р-антителом, которое перерастворяют во втором флаконе, содержащем консервант или буфер и эксципиенты в водном разбавителе. Либо один флакон с раствором, либо два флакона, когда требуется перерастворение, можно повторно использовать множество раз, и они могут быть достаточными для однократного или многократных циклов лечения пациента и таким образом обеспечивают более удобную схему лечения, чем имеющаяся в настоящее время.
По меньшей мере одно анти-Ш-Р-антитело либо в стабильных или содержащих консерванты композициях, либо в растворах, которые описаны в данной заявке, можно вводить пациенту согласно данному изобретению посредством множества способов доставки, включая п/к- или в/м-инъекцию; трансдермальный, легочный, трансмукозальный способы, имплантат, посредством осмотического насоса, картриджа, микронасоса или другими способами, которые понятны специалисту и хорошо известны в данной области техники.
Терапевтические применения
Данное изобретение также относится к способу модулирования или лечения по меньшей мере одного связанного с иммунной системой заболевания в клетке, ткани, органе, животном или у пациента, включая, но не ограничиваясь указанным, по меньшей мере, одно из следующих заболеваний - ревматоидный артрит, юношеский ревматоидный артрит, системный юношеский ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язва желудка, серонегативная артропатия, остеоартрит, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, иридоциклит/увеит/неврит зрительного нерва, идиопатический фиброз легких, системный васкулит/гранулематоз Вегенера, саркоидоз, орхит/процедуры обратной вазэктомии, аллергические/атопические заболевания, аллергический ринит, экзема, аллергический контактный дерматит, аллергический конъюнктивит, гиперчувствительный пневмонит, трансплантаты, отторжение трансплантата органа, реакция «трансплантат против хозяина», синдром системного воспалительного ответа, синдром сепсиса, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, сепсис при отрицательных результатах посева культуры, грибковый сепсис, нейтропеническая лихорадка, уросепсис, менингококкемия, травма/геморрагия, ожоги, воздействие ионизирующего излучения, острый панкреатит, респираторный дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит, индуцированный алкоголем гепатит, хронические воспалительные патологии, саркоидоз, патология Крона, серповидно-клеточная анемия, диабет, нефроз, атопические заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергический ринит, сенная лихорадка, кругло
- 23 006673 годичный ринит, конъюнктивит, эндометриоз, астма, крапивница, системная анафилаксия, дерматит, злокачественная анемия, гемолитическая болезнь, тромбоцитопения, отторжение трансплантата любого органа или ткани, отторжение трансплантата почки, отторжение трансплантата сердца, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата поджелудочной железы, отторжение трансплантата легкого, отторжение трансплантата костного мозга (ВМТ), отторжение аллотрансплантата кожи, отторжение трансплантата хряща, отторжение трансплантата кости, отторжение трансплантата тонкой кишки, отторжение трансплантата плодной вилочковой железы, отторжение трансплантата паращитовидной железы, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение аллотрансплантата, антирецепторные реакции гиперчувствительности, базедова болезнь, виброболезнь, инсулинзависимый диабет типа В, астма, бульбоспинальный паралич, опосредованная антителами цитотоксичность, реакции гиперчувствительности типа III, системная красная волчанка, синдром РОЕМ8 (полиневропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия, и синдром изменений кожи), полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммапатия, синдром изменений кожи, антифосфолипидный синдром, пемфигус, склеродерма, смешанное соединительно-тканное заболевание, идиопатическая Аддисонова болезнь, сахарный диабет, хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз печени, витилиго, васкулит, синдром постинфарктной кардиотомии, гиперчувствительность типа IV, контактный дерматит, гиперчувствительный пневмонит, отторжение аллотрансплантата, гранулема вследствие внутриклеточных организмов, чувствительность к лекарственным средствам, метаболическая/идиопатическая болезнь Вильсона, гемохроматоз, дефицит альфа-1-антитрипсина, диабетическая ретинопатия, тиреоидит Хашимото, остеопороз, оценка гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, первичный билиарный цирроз печени, тиреоидит, энцефаломиелит, кахексия, муковисцидозоз, хроническая легочная болезнь новорожденных, хроническое обструктивное легочное заболевание (СОРЭ), семейный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, дерматологические состояния, псориаз, алопеция, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный нефрит, острая почечная недостаточность, гемодиализ, уремия, токсичность, предэклампсия, ок!3-терапия, анти-сй3-терапия, терапия цитокинами, химиотерапия, лучевая терапия (например, включая, но не ограничиваясь указанным, астению, анемию, кахексию и тому подобное), хроническая интоксикация салицилатами и тому подобное. См., например, 1ке Мегск Мапиа1, 12!к-17!к ЕйШопз, Мегск апй Сотрапу, Яакгау, ΝΣ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), РкагтасоИегару НапйЬоок, ^е11з е! а1., ейз., 8есопй Еййюп, Арр1е!оп апй Ьапде, 81атГогй, Сопп. (1998, 2000), каждая публикация включена в виде ссылки в полном объеме.
Данное изобретение также относится к способу модулирования или лечения, по меньшей мере, одного сердечно-сосудистого заболевания на уровне клетки, ткани, органа, животного или у пациента, включая, но не ограничиваясь указанным, введением одновременно, и/или после, по меньшей мере, одного компонента, выбранного из группы, состоящей, по меньшей мере, из одного ΤΝΡ-антагониста (например, без ограничения, из ΤΝΡ-антитела или фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΡ или фрагмента, их слитых белков или малой молекулы ΤΝΡ-антагониста), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, натрий-тиомалата золота, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазальцина), миорелаксанта, наркотического, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (НПВС), анальтезирующего, анестезирующего, седативного средства, местного анестетика, нейромышечного блокатора, противомикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкового, противопаразитического, антивирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, флурорхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, других противомикробных средств), противопсориазного средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, имеющего отношение к диабету, минерального, пищевого, тиреоидного средства, витамина, связанного с кальцием гормона, средства против диареи, противокашлевого, противорвотного, противоязвенного, слабительного средства, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, С-С8Р, неупоген), сарграмостима (СМ-С8Р, лейкин), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормона роста, гормонозамещающего лекарственного средства, модулятора рецептора эстрогена, мидриатического, расширяющего, алкилирующего агента, антиметаболита, ингибитора митотического деления, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического, анксиолитического, гипнотического, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, антиастматического средства, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназы альфа (пульмозим), цитокина или антагониста цитокина. Подходящие дозы известны в данной области. См., например, ^е11з е! а1., ейз., РкагтасоИегару НапйЬоок, 2пй Еййюп, Арр1е!оп апй Ьапде, 81атГогй, СТ (2000); РОЯ Ркагтасорое1а, Тагазсоп Роске! Ркагтасорое1а 2000, Оекгхе Еййюп, Тагазсоп РиЬНзктд, Ьота Ьтйа, СА (2000), каждая из указанных публикаций включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Антагонисты ΊΝΕ, подходящие для композиций, комбинированной терапии, совместного введения, устройств и/или способов согласно данному изобретению (дополнительно содержащих по меньшей мере одно антитело, его специфичную часть и вариант согласно данному изобретению), включают, но не ограничены указанным, анти-ТИР-антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и молекулы рецепторов,
- 24 006673 которые специфично связываются с ΤΝΡ; соединения, которые предотвращают и/или подавляют синтез ΤΝΡ, высвобождение ΤΝΡ или его действие на клетки-мишени, такие как талидомид, тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипрам), агонисты рецептора аденозина А2Ь и усилители рецептора аденозина А2Ь; соединения, которые предотвращают и/или ингибируют передачу сигнала рецептором ΤΝΡ, такие как ингибиторы протеинкиназ, активируемых митогеном (МАР); соединения, которые блокируют и/или ингибируют расщепление мембранного ΤΝΡ, такие как ингибиторы металлопротеиназы; соединения, которые блокируют и/или ингибируют активность ΤΝΡ, такие как ингибиторы фермента превращения ангиотензина (АСЕ) (например, каптоприл); и соединения, которые блокируют и/или ингибируют продуцирование и/или синтез ΤΝΡ, такие как ингибиторы МАР-киназы.
В используемом в данном описании смысле «антитело фактора некроза опухоли», «ΤΝΡ-антитело» или фрагмент и тому подобное уменьшает, блокирует, ингибирует, отменяет или препятствует активности ΤΝΡ ш 1п!о, 1п кйи и/или предпочтительно ш у1уо. Например, подходящее ΤΝΡ-антитело человека согласно данному изобретению может связывать ΤΝΡα и включает анти-ΤΝΡ-антитела, их антигеновязывающие фрагменты и их специфичные мутанты или домены, которые специфично связываются с ΤΝΡα. Подходящее ΤΝΡ-антитело или фрагмент также может снижать, блокировать, отменять, препятствовать, предотвращать и/или ингибировать синтез РНК, ДНК или белка ΤΝΡ, высвобождение ΤΝΡ, передачу сигнала через рецептор ΤΝΡ, расщепление мембранного ΤΝΡ, активность ΤΝΡ, продуцирование и/или синтез ΤΝΡ.
Химерное антитело сА2 состоит из антигенсвязывающей вариабельной области высоко аффинного нейтрализующего 1дС1-антитела мыши против ΤΝΡα человека, обозначенного А2, и константных областей каппа иммуноглобулина 1дС1 человека. Ρс-область 1§С1 человека улучшает эффекторную функцию аллогенного антитела, увеличивает время полужизни в циркулирующей сыворотке и снижает иммуногенность антитела. Авидность и эпитопную специфичность химерного антитела сА2 получают благодаря вариабельной области мышиного антитела А2. В конкретном варианте предпочтительным источником нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область мышиного антитела А2, является линия клеток гибридомы А2.
Химерное антитело А2 (сА2) нейтрализует цитотоксическое действие как природного, так и рекомбинантного ΤΝΡα дозо-зависимым образом. На основании анализа связывания химерного антитела сА2 и рекомбинантного ΤΝΡα человека, рассчитали константу аффинности химерного антитела сА2, равную 1,04х1010 М-1.
Предпочтительные способы определения специфичности и аффинности моноклонального антитела посредством конкурентного ингибирования можно найти в Наг1оте, е! а1., апйЬоб1ек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рпп§ НагЬог, №\ν Уогк, 1988; СоШдап е! а1., ебк., Сиггеп! Рго!осо1к 1п 1ттипо1оду, Сгеепе РиЬНкЫпд Аккос, апб А11еу 1п!егкс1епсе, №\ν Уο^к. (1992-2000); КохЬог е! а1., 1ттипо1. Шбау, 4:72-79 (1983); АикиЬе1 е! а1., ебк. Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, А11еу 1п!егкаепсе, №\ν Уο^к (1987-2000); и Ми11ег, Ме!1. ЕпхутоК 92:589-601 (1983), указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
В конкретном варианте мышиное моноклональное антитело А2 продуцируется линией клеток, обозначенной с134А. Химерное антитело сА2 продуцируется линией клеток, обозначенной с168А.
Дополнительные примеры моноклональных анти-ΤNΡ-антител, которые можно использовать в данном изобретении, описаны в данной области (см., например, патент США № 5231024; Мб11ег, А. е! а1., Су!окте 2(3):162-169 (1990); заявку на выдачу патента США № 07/943852 (подана 11 сентября 1992); Ка!к)еп е! а1., международная публикация АО 91/02078 (опубликована 21 февраля 1991); КиЫп е! а1., патентная публикация ЕРО № 0218868 (опубликована 22 апреля 1987); Уοηе е! а1., патентная публикация ЕРО № 0288088 (26 октября 1988) Ыапд, е! а1., ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Сотт. 137:847-854 (1986); Меадег, е! а1., НуЬпбота 5:305-311 (1987); кепб1у е! а1., НуЬпбота 5:359-369 (1987); Вппдтап, е! а1., НуЬпбота 5:489-507 (1987); и Ниш, е! а1., б. 1ттипо1. Ме!1. 96:51-62 (1987), указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме).
Молекулы рецептора ΤΝΡ
Предпочтительными молекулами рецептора ΤΝΡ, применимыми в данном изобретении, являются молекулы, которые с высокой аффинностью связывают ΤΝΡ (см., например, Ее1бтапп е! а1., международная публикация АО 92/07076 (опубликована 30 апреля 1992); 8с1а11 е! а1., Се11 51:361-370 (1990); и Ьое!ксЬег е! а1., Се11 51:351-359 (1990), указанные публикации включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме) и необязательно обладают низкой иммуногенностью. В частности, в данном изобретении применимы рецепторы ΤΝΡ клеточной поверхности с молекулярной массой 55 кД (р55 ΤΝΡ-К) и 75 кД (р75 ΤΝΡ-К). Усеченные формы указанных рецепторов, содержащие внеклеточные домены (ЕСЭ) рецепторов или их функциональные части (см., например, Согсогап е! а1., Еиг. б. ВюсЬет. 223:831-840 (1994)), также применимы в данном изобретении. Усеченные формы рецепторов ΤΝΡ, содержащие ЕСЭ, обнаружены в моче и сыворотке в виде связывающих ингибирующих ΤΝΡ белков с молекулярной массой 30 кД и 40 кД (Епде1тапп, Н. е! а1., б. Вю1. СЬет. 255:1531-1536 (1990)). Мультимерные молекулы рецепторов ΤΝΡ и слитые молекулы иммунорецепторов ΤΝΡ и их производные и фрагменты или части
- 25 006673 являются дополнительными примерами молекул рецепторов ТЧЕ, которые применимы в способах и композициях согласно данному изобретению. Молекулы рецепторов ТЧЕ, которые можно использовать в изобретении, характеризуются тем, что ими можно лечить пациентов в течение длительных периодов времени, получая хорошее или отличное ослабление симптомов при низкой токсичности. Низкая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие неопределенные свойства, могут вносить вклад в достигаемые терапевтические результаты.
Мультимерные молекулы рецептора ТЧЕ, применимые в данном изобретении, содержат весь или функциональную часть ЕСЭ двух или более рецепторов ТЧЕ, связанные посредством одного или более полипептидных линкеров или других непептидных линкеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Мультимерные молекулы дополнительно могут содержать сигнальный пептид секретируемого белка, чтобы направлять экспрессию мультимерной молекулы. Указанные мультимерные молекулы и способы их получения описаны в заявке на выдачу патента США № 08/437533 (подана 9 мая 1995), содержание которой включено в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Слитые молекулы иммунорецепторов ТЧЕ, применимые в способах и композициях согласно данному изобретению, содержат, по меньшей мере, одну часть одной или более молекул иммуноглобулина и весь или функциональную часть одного или более рецепторов ТЧЕ.
Указанные слитые молекулы иммунорецепторов могут быть собраны в виде мономеров или гетероили гомомультимеров. Слитые молекулы иммунорецепторов также могут быть моновалентными или поливалентными. Примером такой слитой молекулы иммунорецептора ТЧЕ является слитый белок рецептор ТЧЕ/1дС. Слитые молекулы иммунорецептора ТЧЕ и способы их получения описаны в данной области (Ьекк1аиег еб а1., Еиг. б. 1ттиио1. 21:2883-2886 (1991); Ак11кег1а/1 еб а1., Ргос. Чай. Асаб. 8сб. И8А 88:10535-10539 (1991); Рерре1 еб а1., б. Ехр. Меб. 174:1483-1489 (1991); Ко11к еб а1., Ргос. Чаб1. Асаб. 8ск И8А 91:215-219 (1994); Виб1ег еб а1., Субокше 6(6):616-623 (1994); Вакег еб а1., Еиг. б. 1ттиио1. 24:20402048 (1994); ВеиЙег еб а1., патент США № 5447851; и заявка на выдачу патента США № 08/442133 (подана 16 мая 1995), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Способы получения слитых молекул иммунорецепторов также можно найти в Сарои еб а1., патент США № 5116964; Сарои еб а1., патент США № 5225538; и Сарои еб а1., Чабиге 337:525-531 (1989), каждая публикация включена в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Функциональный эквивалент, производное, фрагмент или область молекулы рецептора ТЧЕ относится к части молекулы рецептора ТЧЕ или части последовательности молекулы рецептора ТЧЕ, которая кодирует молекулу рецептора ТЧЕ, которая имеет достаточный размер и последовательности, чтобы функционально быть похожей на молекулы рецепторов ТЧЕ, которые можно использовать в данном изобретении (например, связывать ТЧЕ с высокой аффинностью и обладать низкой иммуногенностью). Функциональный эквивалент молекулы рецептора ТЧЕ также включает модифицированные молекулы рецептора ТЧЕ, которые функционально похожи на молекулы рецепторов ТЧЕ, которые можно использовать в данном изобретении (например, связывают ТЧЕ с высокой эффективностью и обладают низкой иммуногенностью). Например, функциональный эквивалент молекулы рецептора ТЧЕ может содержать «молчащий» кодон или одну или более аминокислотных замен, делеций или добавлений (например, замену одной кислой аминокислоты другой кислой аминокислотой; или замену одного кодона, кодирующего гидрофобную аминокислоту, другим кодоном, кодирующим ту же самую или другую гидрофобную аминокислоту). См., АикиЬе1 еб а1., Сиггеиб Ргобосо1к би Мо1еси1аг Вю1оду, Сгееие РиЬШЫид Аккос. аиб, Айеу-бибегксбеисе, Чете Уогк (1987-2000).
Цитокины включают любые известные цитокины. См., например, тетете.СоретеббЬСубоктек.сот. Антагонисты цитокинов включают, но не ограничены указанным, любое антитело, фрагмент или миметик, любой растворимый рецептор, фрагмент или миметик, любую малую молекулу антагониста или любую их комбинацию.
Терапевтические лечения
Любой способ согласно данному изобретению может включать способ лечения заболевания, опосредованного бЬ-12, включающий введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в таком модулировании, обработке или терапии. Такой способ необязательно может дополнительно включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения таких иммунных заболеваний, при которой введение указанного по меньшей мере одного анти1Ь-12-антитела, его специфичной части или варианта, кроме того, включает введение до, одновременно и/или после указанного введения по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из по меньшей мере одного антагониста ТЧЕ (например, без ограничения, из ТЧЕ-антитела или фрагмента, растворимого рецептора, ТЧЕ или фрагмента, их слитых белков или малой молекулы ТЧЕантагониста), противоревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, натрий-тиомалата золота, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазальцина), миорелаксанта, наркотического, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (НПВС), анальгезирующего, анестезирующего, седативного средства, местного анестетика, нейромышечного блокатора, противомикробного средства (например, аминогликозида, противогрибко
- 26 006673 вого, противопаразитического, антивирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, флурорхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого противомикробного средства), противопсориазного средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, имеющего отношение к диабету, минерального, пищевого, тиреоидного средства, витамина, связанного с кальцием гормона, противодиарейного, противокашлевого, противорвотного, противоязвенного, слабительного средства, антикоагулянта, зритропоэтина (например, эпоэтина альфа), филграстима (например, 6-С8Е, неупоген), сарграмостима (СМ-С8Е, лейкин), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормона роста, гормонозамещающего лекарственного средства, модулятора рецептора эстрогена, мидриатического, расширяющего, алкилирующего агента, антиметаболита, ингибитора митотического деления, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического, анксиолитического, гипнотического, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, антиастматического средства, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинефрина или аналога, дорназы альфа (пульмозим), цитокина или антагониста цитокина.
Обычно лечение патологических состояний осуществляют посредством введения эффективного количества или дозы по меньшей мере одной композиции анти-1Ь-12-антитела, которое всего в среднем составляет в пределах по меньшей мере примерно от 0,01 до 500 мг по меньшей мере одного анти-1Ь-12антитела на килограмм массы пациента на дозу и предпочтительно по меньшей мере примерно от 0,1 до 100 мг антитела/килограмм массы пациента при однократном или многократном введении в зависимости от удельной активности, входящей в композицию. Альтернативно, эффективная концентрация в сыворотке может иметь концентрацию 0,1-5000 мкг/мл в сыворотке при однократном или многократном введении. Подходящие дозы известны практикующим врачам и конечно будут зависеть от конкретного патологического состояния, удельной активности вводимой композиции и конкретного пациента, подвергаемого лечению. В некоторых случаях для того, чтобы достичь требуемого терапевтического количества, может быть необходимо повторное введение, т. е. многократные отдельные введения конкретной контролируемой или измеряемой дозы, при этом отдельные введения повторяют вплоть до достижения требуемой суточной дозы или эффекта.
Предпочтительные дозы необязательно включают 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и/или 100-500 мг/кг/введение, или любой диапазон, значение или долю; или дозу для достижения концентрации в сыворотке, равной 0,1; 0,5; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,5; 1,9; 2,0; 2,5; 2,9; 3,0; 3,5; 3,9; 4,0; 4,5; 4,9; 5,0; 5,5; 5,9; 6,0; 6,5; 6,9; 7,0; 7,5; 7,9; 8,0; 8,5; 8,9; 9,0; 9,5; 9,9; 10; 10,5; 10,9; 11; 11,5; 11,9; 20, 12,5; 12,9; 13,0; 13,5; 13,9; 14,0; 14,5; 4,9; 5,0; 5,5; 5,9; 6,0; 6,5; 6,9; 7,0; 7,5; 7,9; 8,0; 8,5; 8,9; 9,0; 9,5; 9,9; 10; 10,5; 10,9; 11; 11,5; 11,9; 12; 12,5; 12,9; 13,0; 13,5; 13,9; 14; 14,5; 15; 15,5; 15,9; 16; 16,5; 16,9; 17; 17,5; 17,9; 18; 18,5; 18,9; 19; 19,5; 19,9; 20; 20,5; 20,9; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 35; 40; 45; 50; 55; 60; 65; 70; 75; 80; 85; 90; 96; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800; 900; 1000; 1500; 2000; 2500; 3000; 3500; 4000; 4500 и/или 5000 мкг/мл в сыворотке при однократном или многократном введении, или любой диапазон, значение или долю указанной концентрации.
Альтернативно, вводимая доза может варьировать в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного агента и способ и путь его введения; возраст, состояние здоровья и масса реципиента; природа и степень проявления симптомов, вид одновременно проводимого лечения, частота лечения и требуемый эффект. Обычно доза активного ингредиента может составлять примерно от 0,1 до 100 мг на килограмм массы тела. Обычно доза от 0,1 до 50 и предпочтительно от 0,1 до 10 мг на килограмм на введение или поступающая в случае применения формы замедленного высвобождения является эффективной для получения требуемых результатов.
В качестве неограничивающего примера лечение людей или животных можно проводить в виде единовременной или периодической дозы по меньшей мере одного антитела согласно данному изобретению, составляющей от 0,1 до 100 мг/кг, а именно, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в сутки, по меньшей мере, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 дней, или альтернативно или дополнительно, по меньшей мере, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52 недель, или альтернативно или дополнительно, по меньшей мере, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 лет, или при любой комбинации указанного, используя однократные, инфузионные или многократные дозы.
Дозированные формы (композиция), подходящие для внутреннего введения, обычно содержат примерно от 0,1 до 500 мг активного ингредиента на единицу или емкость. В указанных фармацевтических композициях активный ингредиент, как правило, будет присутствовать в количестве, примерно составляющем 0,5-99,999% по массе, исходя из общей массы композиции.
- 27 006673
Для парентерального введения антитело можно приготовить в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка, приготовленного в ассоциации с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем, или отдельно. Примерами таких носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 1-10% сывороточный альбумин человека. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как жирные масла. Носитель или лиофилизованный порошок могут содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, манит) или химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Композиции стерилизуют известными подходящими способами.
Подходящие фармацевтические носители описаны в самом последнем выпуске Веш1пд!оп'8 Рйагшасеийса1 8с1епсе5, А. 0§о1, стандартном в данной области справочнике.
Альтернативное введение согласно данному изобретению можно использовать многие известные и разработанные способы введения фармацевтически эффективных количеств по меньшей мере одного анти-ГЬ-П-антитела согласно данному изобретению. Хотя в последующем описании используют легочное введение, можно использовать другие способы введения согласно данному изобретению с приемлемыми результатами.
ΙΕ-12-антитела согласно данному изобретению можно доставлять в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида или суспензии, или в виде сухого порошка, используя множество устройств и способов, подходящих для введения путем ингаляции или другими описанными в данной заявке способами или способами, известными в данной области.
Парентеральные композиции и введение
Композиции для парентерального введения могут содержать в качестве обычных эксципиентов стерильную воду или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и тому подобное. Водные или масляные суспензии для инъекции можно получить с использованием соответствующего эмульгатора или увлажнителя и суспендирующего средства согласно известным способам. Средствами для инъекции могут быть нетоксичные неперорально вводимые разбавляющие агенты, такие как водный раствор или стерильный инъекционный раствор или суспензия в растворителе. В качестве применяемого носителя или растворителя допустимы вода, раствор Рингера, физиологический раствор и т.д.; в качестве обычного растворителя или суспендирующего растворителя можно использовать стерильное нелетучее масло. С этой целью можно использовать любой вид нелетучего масла и жирной кислоты, включая природные или синтетические или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты; природные или синтетические или полусинтетические моно- или ди- или триглицериды. Парентеральное введение известно в данной области и включает, но не ограничено указанным, обычные способы инъекций, устройство для безигольной инъекции под давлением газа, которое описано в патенте США № 5851198, и лазерное перфорирующее устройство, которое описано в патенте США № 5839446, включенном в данное описание в виде ссылки в полном объеме.
Альтернативная доставка
Изобретение, кроме того, относится к введению по меньшей мере одного анти-Ш-Р-антитела парентеральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрисуставным, внутрибронхиальным, внутрибрюшинным, внутрикапсулярным, внутрихрящевым, внутриполостным, внутричревным, внутримозжечковым, интрацеребровентрикулярным способом, внутрь ободочной кишки, интрацервикальным, внутрижелудочным, внутрипеченочным, внутримиокрадиальным, внутрикостным, внутритазовым, внутриперикардиальным, внутрибрюшинным, внутриплевральным способом, внутрь простаты, внутрилегочным, внутриректальным, внутрипочечным, внутриретинальным, интраспинальным, интрасиновиальным, интраторакальным, внутриматочным, внутрипузырным, болюсным, вагинальным, ректальным, буккальным, подъязычным, интраназальным или трансдермальным способами. Можно приготовить по меньшей мере одну композицию анти-Ш-Р-антитела для применения при парентеральном (подкожном, внутримышечном или внутривенном) или любом другом введении, в частности, в форме жидких растворов или суспензий; для применения в вагинальном или ректальном введении, в частности, в полутвердых формах, таких как кремы и суппозитории, но не ограниченных ими; для буккального или подъязычного введения в таких формах, как таблетки или капсулы, но не ограниченных указанным; или интраназально в таких неограничивающих формах, как в форме порошков, назальных капель или аэрозолей или некоторых агентов; или трансдермально в таких неограничивающих формах, как гель, мазь, лосьон, суспензия или система доставки на основе пластыря с химическими усилителями, такими как диметилсульфоксид, чтобы либо модифицировать структуру кожи, либо увеличить концентрацию лекарственного средства в трансдермальном пластыре (.Типдтдег, е! а1. В «Эгид Регшеайоп ЕпБапсешеп!»; Илей Ό. 8., ЕЙ5., рр. 5990 (Магсе1 Иеккег, Ес. №\ν Уогк 1994, включенной в данное описание в виде ссылки в полном объеме), или с окислителями, которые позволяют наносить композиции, содержащие белки и пептиды, на кожу (\У0 98/53847), или с применением электрических полей, чтобы создать временные транспортные пути, а именно, посредством электропорации, или чтобы увеличить подвижность заряженных лекарственных средств через кожу, например, ионтофорезом, или с применением ультразвука, например, ультразвуково
- 28 006673 го фореза, (патенты США № 4309989 и 4767402) (указанные выше публикации и патенты включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме).
Легочное/назальное введение
Что касается легочного введения, предпочтительно по меньшей мере одну композицию анти-1Ь-12антитела доставляют в виде частиц такого размера, при котором эффективно достигаются нижние дыхательные пути легкого или синусы. Согласно изобретению по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело можно доставлять любым из множества устройств для ингаляции или назальных устройств, известных в данной области для введения терапевтического средства посредством ингаляции. Указанные устройства, способные депонировать аэрозольные композиции в полости синуса или альвеолах пациента, включают дозирующие ингаляторы, распылители, генераторы сухого порошка, разбрызгиватели и тому подобное. Другие устройства, подходящие для направленного легочного или назального введения антител, также известны в данной области. В случае всех указанных устройств можно использовать композиции, подходящие для введения дозируемого антитела в аэрозоле. Такие аэрозоли могут либо состоять из растворов (как водных, так и неводных), либо из твердых частиц. В дозирующих ингаляторах, подобных дозирующему ингалятору Усп1о11п®, обычно используют газ-вытеснитель, и их необходимо встряхивать во время вдыхания (см., например, νθ 94/16970, νθ 98/35888). Ингаляторы сухих порошков, подобные ТигЬийа1ег™ (Айга), Во1айа1ег® (61ахо), ИВкик® (61ахо), ингалятор 8р1гок™ (Иига), устройства, продаваемые 1н11а1е Тйегареийск, и порошковый ингалятор 8р1пНл1сг® (РВопк) приводятся в действие вдыханием смешанного порошка (патент США 4668218 Ак1га, ЕР 237507 АЧга, νθ 97/25086 61ахо, νθ 94/08552 Ища, патент США 5458135 Ιπίκι®, νθ 94/06498 Рщопк, которые включены в данное описание в виде ссылки в полном объеме). Распылители, подобные АЕВх™Агаб1дт, распылитель ИНгатеШ® (Ма11шскгоб1) и распылитель Асот II® (Мащией Меб1са1 Ргобиск) (патент США 5404871 АгаЛдт, νθ 97/22376), при этом указанные выше публикации включены в данное описание в виде ссылок в полном объеме, вырабатывают аэрозоли из растворов, тогда как дозирующие ингаляторы, ингаляторы сухих порошков и т.д. образуют аэрозоли, состоящие из мелких частиц. Имеется в виду, что указанные конкретные примеры коммерчески доступных устройств для ингаляции являются типичными примерами конкретных устройств, пригодных для практического применения данного изобретения, и не предназначены в качестве примеров, ограничивающих рамки изобретения. Предпочтительно композицию, содержащую по меньшей мере одно анти-1Е-12-антитело, доставляют с помощью ингалятора сухого порошка или распылителя. Имеется несколько требуемых параметров устройства для ингаляции для введения по меньшей мере одного антитела согласно данному изобретению. Например, доставка устройством для ингаляции преимущественно является надежной, воспроизводимой и точной. Устройство для ингаляции для обеспечения хорошего вдыхания необязательно может доставлять мелкие частицы сухого вещества, например, примерно менее 10 мкм, предпочтительно примерно 1-5 мкм.
Введение композиций 1Ь-12-антитела в виде спрея
Спрей, содержащий белковую композицию, содержащую ΙΕ-12-антитело, можно получить путем принудительной подачи суспензии или раствора по меньшей мере одного анти-1Е-12-антитела через выпускное отверстие под давлением. Можно выбрать размер и конфигурацию выпускного отверстия, применяемое давление и скорость подачи жидкости, чтобы добиться требуемого выхода и размера частиц. Электроспрей, например, можно получить с помощью электрического поля и подачи через капилляр или выходное отверстие. Преимущественно частицы по меньшей мере одного белка, составляющего анти-1Ь12-антитело, доставляемые с помощью разбрызгивателя, имеют размер частиц примерно меньше 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно от 1 до 5 мкм, и наиболее предпочтительно примерно от 2 до 3 мкм.
Составы по меньшей мере одной белковой композиции, включающей анти-1Е-12-антитело, подходящей для применения с использованием распылителя, обычно включают белковую композицию антитела в водном растворе в концентрации, составляющей примерно от 0,1 мг до 100 мг по меньшей мере одной белковой композиции анти-1Е-12-антитела на мл раствора или мг/г, или любой интервал или значение в указанном диапазоне, например, без ограничения 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20; 21; 22; 23; 24; 25; 26; 27; 28; 29; 30; 40; 45; 50; 60; 70; 80; 90 или 100 мг/мл или мг/г. Состав может включать такие агенты, как эксципиент, буфер, средство для изотоничности, консервант, поверхностно-активное вещество, и предпочтительно цинк. Состав также может включать эксципиент или средство для стабилизации белковой композиции антитела, такой как буфер, восстанавливающий агент, белок основной массы или углевод. Белки основной массы, используемые в белковой композиции антитела, включают альбумин, протамин и тому подобные. Типичными углеводами, используемыми в белковой композиции антитела, включают сахарозу, манит, лактозу, трегалозу, глюкозу и тому подобное. Белковая композиция антитела также может содержать поверхностноактивное вещество, которое может уменьшать или предотвращать поверхностно-индуцируемую агрегацию белковой композиции антитела, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные обычные поверхностно-активные вещества, такие как эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты и спирты и эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты. Количества, как правило, будут в пределах от 0,001 до 14% от массы композиции. Особенно предпочтительными поверх
- 29 006673 ностно-активными веществами для целей данного изобретения являются моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полисорбат 80, полисорбат 20 и тому подобное. В композицию также могут быть включены дополнительные агенты, известные в области приготовления белковых композиций, таких как 1Ь-12антитела, или их конкретные части или варианты.
Введение композиций 1Ь-12-антитела с помощью распылителя
Белковую композицию антитела можно вводить с помощью распылителя, такого как инжекторный распылитель или ультразвуковой распылитель. Обычно в инжекторном распылителе используют источник сжатого воздуха, чтобы создать высокоскоростную струю воздуха, проходящую через отверстие. По мере того, как газ расширяется за пределами выходного отверстия, создается область пониженного давления, которая втягивает раствор белковой композиции антитела через капиллярную трубку, связанную с емкостью с жидкостью. Поток жидкости из капиллярной трубки рассекается на нестойкие крупицы и капельки по мере того, как он выходит из трубки, создавая аэрозоль. Можно использовать ряд конфигураций, скоростей потока и типов рассекателя, чтобы получить требуемые эксплуатационные характеристики данного инжекторного распылителя. В ультразвуковом распылителе используют высокочастотную электрическую энергию, чтобы создать вибрационную, механическую энергию, обычно используя пьезоэлектрический преобразователь. Полученную энергию передают составу белковой композиции антитела либо непосредственно, либо через соединяющую жидкость, образуя аэрозоль, содержащий белковую композицию антитела. Преимущественно частицы белковой композиции антитела, доставляемые распылителем, имеют размер частиц примерно менее 10 мкм, предпочтительно в пределах примерно от 1 до 5 мкм, и наиболее предпочтительно примерно от 2 до 3 мкм.
Составы по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела, пригодные для применения с помощью распылителя, либо инжекторного, либо ультразвукового, обычно содержат по меньшей мере один белок анти-1Ь-12-антитела в концентрации примерно от 0,1 до 100 мг на мл раствора. Состав может включать агенты, такие как эксципиент, буфер, средство для изотоничности, консервант, поверхностно-активное вещество и предпочтительно цинк. Состав также может включать эксципиент или средство для стабилизации по меньшей мере одного белка, составляющего анти-1Ь-12-антитело, такое как буфер, восстанавливающий агент, белок основной массы или углевод. Белки основной массы, используемые при приготовлении состава одной белковой композиции анти-1Ь-12-антитела, включают альбумин, протамин и тому подобное. Типичными углеводами, используемыми при приготовлении композиций по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела, включают сахарозу, манит, лактозу, трегалозу, глюкозу и тому подобное. Состав, по меньшей мере, одного анти-1Ь-12-антитела также может содержать поверхностноактивное вещество, которое может уменьшать или предотвращать поверхностно-индуцируемую агрегацию, по меньшей мере, одного анти-1Ь-12-антитела, вызванную распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные подходящие поверхностно-активные вещества, такие как эфиры полиоксиэтилена и жирной кислоты и спирты и эфиры прлиоксиэтиленсорбита и жирной кислоты. Количества, как правило, будут в пределах от 0,001 до 4% от массы состава. Особенно предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей данного изобретении являются моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, полисорбат 80, полисорбат 20 и тому подобное. В состав также могут быть включены дополнительные агенты, известные в области приготовления составов белков, таких белок антитела.
Введение композиций ГЬ-12-антитела с помощью дозирующего ингалятора
В дозирующем ингаляторе (ΜΌΙ) газ-вытеснитель, по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело и любые эксципиенты или другие добавки находятся в контейнере в виде смеси, включая сжиженный сжатый газ. Приведение в действие дозирующего клапана высвобождает смесь в виде аэрозоля, предпочтительно содержащего частицы размером в пределах примерно менее 10 мкм, предпочтительно примерно от 1 до 5 мкм, и наиболее предпочтительно примерно от 2 до 3 мкм. Требуемый размер частиц аэрозоля можно получить, используя состав белковой композиции антитела, получаемый различными способами, известными специалистам в данной области, включая струйное измельчение, распылительную сушку, конденсацию в критической точке или тому подобное. Предпочтительные дозирующие ингаляторы включают ингаляторы, производимые 3М или О1ахо и использующие в качестве газа-вытеснителя гидрофторуглерод.
Составы, включающие по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело, для применения с помощью дозирующего ингаляторного устройства в основном будут содержать тонко диспергированный порошок, содержащий по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело в виде суспензии в неводной среде, например, суспендированное в газе-вытеснителе с помощью поверхностно-активного вещества. Газомвытеснителем может быть любое обычное вещество, используемое для этой цели, такое как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, НЕА-134а (гидрофторалкан-134а), НЕА227 (гидрофторалкан-227) или тому подобное. Предпочтительно газом-вытеснителем является гидрофторуглерод. Можно выбрать поверхностно-активное вещество, чтобы стабилизировать по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело в виде суспензии в газе-вытеснителе, чтобы защитить активный агент от химической деградации, и тому подобное. Подходящие поверхностно-активные вещества включают триолеат
- 30 006673 сорбитана, лецитин сои, олеиновую кислоту или тому подобное. В некоторых случаях предпочтительны аэрозоли на основе растворов с использованием таких растворителей, как этанол. В состав также можно включать дополнительные агенты, известные в области приготовления композиций, содержащих белки.
Специалисту в данной области будет понятно, что способы согласно данному изобретению можно осуществить при легочном введении композиций по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела с помощью устройств, не описанных в данной заявке.
Пероральные композиции и введение
Составы для перорального введения основаны на совместном введении адъювантов (например, резорцинов и неионных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтиленолеиловый эфир и эфир н-гексадецилполиэтилена), чтобы искусственно увеличить проницаемость стенок кишечника, а также на совместном введении ингибиторов ферментов (например, ингибиторов трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфата (ЭЕЕ) и тразилола), чтобы ингибировать ферментативную деградацию. Соединение активного компонента дозированной формы твердого типа для перорального введения можно смешать по меньшей мере с одним дополнительным компонентом, включая сахарозу, лактозу, целлюлозу, манит, трегалозу, раффинозу, мальтит, декстран, крахмалы, агар, аргинаты, хитины, хитозаны, пектины, трагакантовую камедь, аравийскую камедь, желатин, коллаген, казеин, альбумин, синтетический или полусинтетический полимер и глицерид. Указанные дозированные формы также могут содержать другой тип(пы) добавок, например неактивный разбавитель, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфатокоферол, антиоксидант, такой как цистеин, дезинтегратор, связывающее вещество, загуститель, буферное средство, подсластитель, корригент, отдушка и т.д.
Таблетки и пилюли, кроме того, можно приготовить в виде препаратов с кишечнорастворимым покрытием. Жидкие препараты для перорального введения включают препараты в виде эмульсии, сиропа, эликсира, суспензии и раствора, разрешенных для медицинского применения. Указанные препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые в указанной области, например, воду. В качестве систем доставки лекарственных средств для инсулина и гепарина описаны липосомы (патент США № 4239754). Недавно использовали микросферы искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноиды) для доставки фармацевтических препаратов (патент США № 4925673). Кроме того, в данной области известны соединения-носители, описанные в патенте США № 5879681 и патенте США № 55871753 и используемые для пероральной доставки биологически активных агентов.
Мукозальные составы и введение
Для всасывания через слизистые поверхности составы и способы введения по меньшей мере одного анти-1Ь-12-антитела включают эмульсию, содержащую множество субмикронных частиц, мукоадгезивную макромолекулу, биоактивный пептид и водную непрерывную фазу, которая стимулирует поглощение через слизистые поверхности при адгезии на слизистой оболочке частиц эмульсии (патент США № 5514670). Слизистые поверхности, подходящие для применения эмульсий согласно данному изобретению, могут включать введение через роговицу, конъюнктиву, буккальный, подъязычный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный пути введения. Составы для вагинального или ректального введения, например, суппозитории, могут содержать в качестве эксципиентов, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и тому подобное. Составы для интраназального введения могут быть твердыми и содержать в качестве эксципиентов, например, лактозу, или могут быть водными или масляными растворами для назальных капель. Эксципиенты для буккального введения включают сахара, стеарат кальция, стеарат магния, пептизированный крахмал и тому подобное (патент США № 5849695).
Трансдермальные составы и введение
Для трансдермального введения по меньшей мере одно анти-1Ь-12-антитело инкапсулируют в устройство для доставки, такое как липосома или полимерные наночастицы, микрочастица, микрокапсула или микросферы (вместе называемые микрочастицами, если не оговорено особо). Известен ряд подходящих устройств, включая микрочастицы, приготовленные из синтетических полимеров, таких как полигидроксикислоты, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и их сополимеры, сложные полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и природные полимеры, такие как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды и их комбинации (патент США № 5814599).
Пролонгированное введение и составы
Иногда требуется доставлять соединения согласно данному изобретению субъекту в течение длительных периодов времени, например, в течение периодов, составляющих от одной недели до одного года, при однократном введении. Можно использовать различные дозированные формы медленного высвобождения, депонируемые или имплантируемые формы. Например, дозированная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксичную соль соединений, которая имеет низкую степень растворимости в жидкостях организма, например, (а) кислотно-аддитивная соль с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинмоносульфокислоты или
- 31 006673 нафталиндисульфокислоты, полигалактуроновая кислота и тому подобное; (Ь) соль с катионом поливалентного металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и тому подобное, или с органическим катионом, образованным, например, из Ν,Ν'дибензилэтилендиамина или этилендиамина; или (с) комбинации (а) и (Ь), например, цинковую соль дубильной кислоты. Кроме того, соединения согласно данному изобретению, или предпочтительно сравнительно нерастворимую соль, такую как описанные выше соли, можно приготовить в виде композиции в геле, например, геле моностеарата алюминия, например, с кунжутным маслом, подходящим для инъекции. Особенно предпочтительными солями являются соли цинка, цинковые соли дубильной кислоты, соли памовой кислоты и тому подобные. Другой тип депонируемой композиции медленного высвобождения для инъекции будет содержать соединение или соль, диспергированную для инкапсулирования в медленно деградирующий нетоксичный неантигенный полимер, такой как полимер полимолочная кислота/полигликолевая кислота, который, например, описан в патенте США № 3773919. Соединения или предпочтительно сравнительно нерастворимые соли, такие как соли, описанные выше, также можно приготовить в виде композиции в силиконовых гранулах с холестериновым матриксом, в частности для применения на животных. Дополнительные депонируемые или имплантируемые составы медленного высвобождения, например, газообразные или жидкие липосомы, известны в литературе (патент США № 5770222 и «8и8!атей апй Соп1го11ей Ве1еа8е Эгид ОеНуегу 8ук!ет8», 1. В. ВоЬшкоп ей., Магсе1 Эеккег, 1пс., Ν.Υ., 1978).
После описания изобретения в общем, то же самое будет легче понять при обращении к следующим примерам, которые приведены с целью иллюстрации и не предназначены для ограничения.
Для экспрессии 1Ь-12-антитела используют вектор рС4. Плазмида рС4 является производной плазмиды р8У2-ййГг (депозитарный номер АТСС 37146). Плазмида содержит мышиный ген ΌΗΡΒ под контролем раннего промотора ЗУ40. Клетки яичника китайского хомячка или другие клетки, у которых отсутствует дигидрофолатная активность, которые трансфицируют указанными плазмидами, можно отобрать при выращивании клеток в селективной среде (например, МЕМ альфа минус, ЫГе Тесйио1од1е8, СаййегкЬигд, МО) с добавлением химиотерапевтического средства метотрексата. Амплификация генов ΌΗΡΒ в клетках, резистентных к метотрексату (МТХ), достаточно хорошо установлена (см., например, Р. У. АН, е! а1., 1. Вю1. Сйет. 253:1357-1370 (1978); 1. Ь. Натйп апй С. Ма, Вюсйет. е! Вюрйук. Ас!а 1097:107-143 (1990); и М. 1. Раде апй М. А. Зуйепйат, Вю!есйпо1оду 9:64-68 (1991)). В клетках, выращенных при возрастающих концентрациях МТХ, развивается резистентность к лекарственному средству за счет сверхпродуцирования фермента-мишени, ΌΗΡΒ, в результате амплификации гена ΌΗΡΒ. Если второй ген связан с геном ΌΗΡΒ, то он обычно совместно амплифицируется и сверхэкспрессируется. В данной области известно, что такой подход можно использовать для создания линий клеток, несущих более 1000 копий амплифицированного гена(ов). Потом, когда удаляют метотрексат, получают линии клеток, которые содержат амплифицированный ген, интегрированный в одну или более хромосом клетки-хозяина.
Плазмида рС4 содержит для экспрессии представляющего интерес гена сильный промотор длинного концевого повтора (ΕΤΒ) вируса саркомы Рауса (Си11еп, е! а1., Мо1ес. Се11. Вю1. 5:438-447 (1985)) плюс фрагмент, выделенный из энхансера предраннего гена цитомегаловируса человека (СМУ) (Вокйай, е! а1., Се11 41:521-530 (1985)). Ниже промотора имеются сайты расщепления ферментами рестрикции ВатШ, ХЬа1 и Акр718, которые обеспечивают интеграцию генов. После указанных сайтов клонирования плазмида содержит 3'-интрон и сайт полиаденилирования гена препроинсулина крысы. Для экспрессии также можно использовать другие высоко эффективные промоторы, например, промотор Ь-актина человека, ранний или поздний промоторы ЗУ40 или длинные концевые повторы из других ретровирусов, например, ШУ и ΗΤΕνί. Можно использовать системы экспрессии генов С1оп!есй'к Те!-ОГГ и Те!-Оп и подобные системы, чтобы контролируемым образом экспрессировать 1Й-12 в клетках млекопитающих (М. Соккеп, апй Η. Ви)агй, Ргос. №И. Асай. 8ск И8А 89:5547-5551 (1992)). Для полиаденилирования мРНК также можно использовать другие сигналы, например, из генов гормона роста или глобина человека. Стабильные линии клеток, несущих представляющий интерес ген, интегрированный в хромосомы, также можно отобрать после совместной трансфекции с селектируемым маркером, таким как др!, С418 или гигромицин. В начале предпочтительно использование более одного селектируемого маркера, например, С418 плюс метотрексат.
Плазмиду рС4 расщепляют ферментами рестрикции и затем дефосфорилируют с использованием фосфатазы кишечника теленка способами, известными в данной области. Затем вектор выделяют из 1% агарозного геля.
Используют последовательность ДНК, кодирующую полное 1Ь-12-антитело, которое представлено, например, в 8Еф ΙΌ ΝΟ: (вставка а/к-последовательности мАт 8Еф ΙΌ ΝΟ 1 и вставка а/кпоследовательности мАт 8Еф ΙΌ ΝΟ 2), соответствующих вариабельным областям НС и ЬС 1Й-12антитела согласно данному изобретению, осуществляя соответствующие стадии известных способов. В данной конструкции также используют выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую подходящую константную область человека (т.е. области НС и ЬС) (например, представленную в векторе р1351: (вставка инвентарного номера АТСС и дополнительных ΗС/^С-плазмид)).
- 32 006673
Затем выделенную ДНК, кодирующую вариабельную и константную области, и дефосфорилированный вектор лигируют ДНК-лигазой Т4. Затем трансформируют клетки Е. сой НВ 101 или ХЬ-1 В1ие и идентифицируют бактерии, которые содержат фрагмент, встроенный в плазмиду рС4, используя, например, анализ ферментами рестрикции.
Для трансфекции используют клетки яичника китайского хомячка (СНО), у которых отсутствует активный ген ЭНЕВ. 5 мкг экспрессирующей плазмиды рС4 совместно трансфицируют с 0,5 мкг плазмиды р8V2-ηео, используя липофектин. Плазмида р8V2ηео содержит доминантный селектируемый маркер, ген пео из Тп5, кодирующий фермент, который придает резистентность к группе антибиотиков, включая 0418. Клетки высевают в МЕМ альфа минус с добавлением 1 мкг/мл 0418. Через 2 дня клетки трипсинизируют и высевают в планшеты для клонирования гибридом (Отешет, Оегтаиу) в среду МЕМ альфа минус с добавлением 10, 25 или 50 нг/мл метотрексата плюс 1 мкг/мл 0418. Примерно спустя 10-14 дней трипсинизируют отдельные колонии и затем высевают в 6-луночные чашки Петри или флаконы объемом 10 мл, используя разные концентрации метотрексата (50, 100, 200, 400, 800 нМ). Затем клоны, растущие при самых высоких концентрациях метотрексата, переносят в новые 6-луночные чашки, содержащие еще более высокие концентрации метотрексата (1, 2, 5, 10, 20 мМ). Такую же процедуру повторяют вплоть до получения клонов, которые растут при концентрации 100-200 мМ. Анализируют экспрессию требуемого генного продукта, например, с помощью 8Э8-ПЛАГ и Вестерн-блота, или с помощью анализа обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Пример 2: Получение высоко аффинных моноклональных антител человека класса 1§С, реагирующих с 1Ь-12 человека, используя трансгенных мышей
Сущность
Использовали трансгенных мышей, которые содержат гены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека, чтобы получить высоко аффинные полностью человеческие моноклональные антитела, которые можно использовать в терапевтических целях, чтобы ингибировать действие ГЬ-12 в случае лечения одного или более заболеваний, опосредованных ГЬ-12. Гибридных мышей Е2 (СВА/1 х С57/ВБ6/.Г), содержащих трансгены вариабельной и константной областей антитела человека как тяжелой, так и легкой цепей, иммунизировали рекомбинантным ГЬ-12 человека (Тау1ог е! а1., 1п!1. 1шшипо1. 6:579-591 (1993); ЬопЬегд, е! а1., №!иге 368:856-859 (1994); №иЬег§ег, М., №!иге Вю!есй. 14: 826 (1996); ЕщйМ1б, е! а1., №Ш1ге Вю1есйпо1о§у 14: 845-851 (1996)). В результате нескольких слияний получали одну или более панелей полностью человеческих моноклональных антител класса 1§О, реагирующих с ГЬ-12 человека. Полностью человеческие анти-1Е-12-антитела характеризовали далее. Все антитела были 1§С 1 антителами. Обнаружено, что такие антитела имеют константы аффинности примерно от 1х109 до 9х1012. Неожиданно высокие аффинности полученных полностью моноклональных антител человека делают их подходящими кандидатами для терапевтического применения в случае связанных с 1Ь-12 заболеваний, патологий и нарушений.
Сокращения
БСА - бычий сывороточный альбумин
С02 - диоксид углерода
ДМСО - диметилсульфоксид
ИФА - иммуноферментный анализ
ЕВ8 - фетальная сыворотка теленка
Н202 - перекись водорода
НВР - пероксидаза хрена в/к - внутрикожное
1д - иммуноглобулин
ГЬ-12 - интерлейкин-12 в/б - внутрибрюшинное в/в - внутривенное мАт - моноклональное антитело 0Ό - оптическая плотность 0РЭ - дигидрохлорид о-фенилендиамина ПЭГ - полиэтиленгликоль
Р8А - пенициллин, стрептомицин, амфотерицин
КТ - комнатная температура п/к - подкожное об./об. - объем на объем мас./об. - масса на объем
Материалы и способы
Животные
Трансгенные мыши, которые могут экспрессировать человеческие антитела, известны в данной области и коммерчески доступны (например, из СепРйагт 1п!егпабопа1, 8ап 1о8е, СА; АЬдешх, Егеетоп!, СА и других), которые экспрессируют человеческие иммуноглобулины, но не экспрессируют мышиные
- 33 006673
1дМ или 1д. Например, такие трансгенные мыши содержат последовательности трансгенов человека, которые претерпевают УЩЦ-воссоединение, переключение синтеза классов тяжелых цепей и соматические мутации, создавая набор иммуноглобулиновых последовательностей человека (ЬопЬегд, е! а1., №1иге 368:856-859 (1994)). Трансген легкой цепи, например, можно частично получить из клона дрожжевой искусственной хромосомы, который включает почти половину У-области антитела человека гаметического типа. Кроме того, трансген тяжелой цепи может кодировать константные области, как μ, так и 1 человека (Е1кБЩ1б, е! а1., №11иге Вю!есБпо1оду 14:845-851 (1996)) и/или 3. Мышей, полученных из соответствующих генотипических родительских линий, можно использовать для иммунизации и процессов слияния для получения полностью человеческих моноклональных антител к ГБ-12.
Иммунизация
Можно использовать одну или более схем иммунизации, чтобы получить гибридомы, продуцирующие 1Б-12-антитело человека. Первые несколько слияний можно выполнить после следующего иллюстративного протокола иммунизации, хотя можно использовать другие подобные известные протоколы. Несколько самок и/или хирургически кастрированных трансгенных самцов мышей 14-20-недельного возраста иммунизируют в/б и/или в/к 1-1000 мкг рекомбинантного 1Б-12 человека, эмульгированного с равным объемом Т1ТЕКМАХ или полного адъюванта Фрейнда в конечном объеме 100-400 мкл (например, 200). Каждая мышь также может необязательно получать 1-10 мкг в 100 мкл физиологического раствора в каждое из 2 мест п/к-введения. Затем мышей можно иммунизировать через 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 и/или 21-34 дня в/б (1-400 мкг) и п/к (1-400 мкг х 2) 1Б-12, эмульгированным с равным объемом Т1ТЕКМАХ или неполного адъюванта Фрейнда. У мышей можно брать кровь через 12-25 и 25-40 дней посредством заглазничной пункции без антикоагулянта. Затем крови дают возможность свернуться при КТ в течение одного часа и сыворотку собирают и титруют с использованием ИФА-анализа 1Б-12 согласно известным способам. Слияния выполняют в том случае, когда повторные инъекции не вызывают увеличения титров. В это время мышам можно проводить конечную в/в-бустер-инъекцию 1-400 мкг 1Б-12, разведенного в 100 мкл физиологического раствора. Через три дня мышей можно забивать смещением шейных позвонков и стерильно извлечь селезенки и погрузить в 10 мл холодного фосфатно-солевого буфера (ФСБ), содержащего 100 и/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Р8А). Спленоциты собирают в результате стерильной перфузии селезенки Р8А-ФСБ. Клетки один раз промывают в холодном Р8А-ФСБ, подсчитывают, используя способ исключения с применением красителя трипанового синего, и ресуспендируют в среде КРМ1 1640, содержащей 25 мМ Нерек.
Слияние клеток
Слияние можно выполнять при соотношении от 1:1 до 1:10 мышиных клеток миеломы к жизнеспособным клеткам селезенки согласно известным способам, например, способами, известными в данной области. В качестве неограничивающего примера клетки селезенки и клетки миеломы можно вместе осадить. Затем осадок можно медленно ресуспендировать в течение 30 с в 1 мл 50% (мас./об.) растворе ПЭГ/ФСБ (ПЭГ с молекулярной массой 1450, 81дта) при 37°С. Затем слияние можно остановить медленным добавлением 10,5 мл среды КРМ1 1640, содержащей 25 мМ Нерек (37°С) в течение 1 мин. Слитые клетки центрифугируют в течение 5 мин при 500-1500 об/мин. Затем клетки ресуспендируют в среде НАТ (среда КРМ1 1640, содержащая 25 мМ Нерек, 10% фетальной сыворотки клона I (Нус1опе), 1 мМ пируват натрия, 4 мМ Ь-глутамин, 10 мкг/мл гентамицина, 2,5% добавки для культивирования Опдеп (ИкБег), 10% кондиционированной клетками 653 среды КРМ1 1640/Нерек, 50 мкМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкМ гипоксантин, 0,4 мкМ аминоптерин и 16 мкМ тимидин) и затем высевают по 200 мкл/лунка в пятнадцать 96-луночных планшетов для культур тканей с плоским дном. Затем планшеты помещают во влажный инкубатор при 37°С, содержащий 5% СО2 и 95% воздуха, на 7-10 дней.
Выявление анти-1Ь-12 антител человека класса 1§С в сыворотке мышей
Для скрининга сывороток мышей в отношении 1д0-антител человека, специфичных по отношению к 1Ь-12 человека, можно использовать твердофазный ИФА. Коротко, планшеты можно покрыть 1Б-12 при концентрации 2 мкг/мл в ФСБ в течение ночи. После промывки в 0,15М физиологическом растворе, содержащем 0,02% (об./об.) твина 20, лунки можно блокировать 1% (мас./об.) БСА в ФСБ 200 мкл/лунка в течение 1 ч при КТ. Планшеты используют сразу же или замораживают при -20°С для последующего использования. Разведения сыворотки мышей инкубируют в планшетах, покрытых 1Ь-12, при 50 мкл/лунка при КТ в течение 1 ч. Планшеты промывают и затем анализируют, добавляя 50 мкл/лунку меченного НКР антитела козы специфичного против Рс 1дО человека, разведенного 1:30000 в 1% БСАФСБ, в течение 1 ч при КТ. Планшеты можно снова промыть и добавить 100 мкл/лунка раствора субстрата в цитратно-фосфатном буфере (0,1М лимонная кислота и 0,2М фосфат натрия, 0,01% Н2О2 и 1 мг/мл ОРЭ) на 15 мин при КТ. Затем добавляют раствор, останавливающий реакцию (4Ν серная кислота) по 25 мкл/лунка и регистрируют ОЭ при 490 нм с помощью автоматизированного спектрофотометра для планшетов.
Регистрация полностью иммуноглобулинов человека в надосадках гибридом
Гибридомы с положительным ростом, секретирующие полностью иммуноглобулины человека, можно выявить с использованием подходящего ИФА. Коротко, 96-луночные планшеты с выступами
- 34 006673 (ννΚ, 610744) можно покрыть 10 мкг/мл антитела козы против Ес Ι§0 человека в натрий-карбонатном буфере в течение ночи при 4°С.
Планшеты промывают и блокируют 1% БСА-ФСБ в течение одного часа при 37°С и используют немедленно или замораживают при -20°С. Неразбавленные надосадки гибридом инкубируют в планшетах в течение одного часа при 37°С. Планшеты промывают и анализируют, добавляя меченное НКР антитело козы против каппа-цепи человека, разведенное 1:10000 в 1% БСА-ФСБ в течение одного часа при 37°С. Затем планшеты инкубируют с раствором субстрата как описано выше.
Выявление реакционной способности полностью против 1Ь-12 человека
Описанные выше гибридомы можно одновременно анализировать в отношении реакционной способности по отношению к ΙΕ-12, используя подходящий РИА или другой анализ. Например, надосадки инкубируют на планшетах с антителом козы против Ес Ι§6 человека, как указано выше, промывают и затем анализируют с помощью радиоактивно меченного ΙΕ-12 с подходящим счетом на лунку в течение 1 ч при КТ. Лунки дважды промывают ФСБ и определяют количество связанного радиоактивно меченного ΙΕ-12, используя подходящий счетчик.
Гибридомы, секретирующие Ι§01 против ΙΕ-12 человека, можно размножить в культуре клеток и серийно субклонировать с использованием лимитирующего разведения. Полученные в результате популяции клонов можно размножить и подвергнуть криоконсервации в среде для замораживания (95% ЕВ8, 5% ДМСО) и хранить в жидком азоте.
Изотипирование
Определение изотипов антител можно выполнить, используя ИФА в форме, подобной анализу, используемому для скрининга мышиных иммунных сывороток в отношении специфичных титров. ΙΕ-12 можно покрыть 96-луночные планшеты, как описано выше, и планшет можно инкубировать с очищенным антителом в концентрации 2 мкг/мл в течение одного часа при КТ. Планшет промывают и анализируют с помощью меченного НКР антитела козы против Ι§6| человека или меченного НКР антитела козы против Ι§63, человека, разбавленного 1:4000 в 1% БСА-ФСБ, в течение одного часа при КТ. Планшет снова промывают и инкубируют с раствором субстрата, как описано выше.
Кинетика связывания антител человека против 1Ь-12 человека с 1Ь-12 человека
Характеристики связывания антител можно соответствующим образом анализировать, используя, например, ИФА с захватом ΙΕ-12 и технологию В^сого. Градиентные концентрации очищенных ΙΕ-12антител человека можно исследовать в отношении связывания с планшетами для ИФА, покрытыми 2 мкг/мл ΙΕ-12, в анализе, который описан выше. Затем ΟΌ можно представить в виде полулогарифмических графиков, показывающих относительные эффективности связывания.
Количественные константы связывания можно, например, получить следующим образом, или любым другим известным подходящим способом. Чип ВIАсο^с СМ-5 (карбоксиметил) помещают в устройство ВМсого 2000. Через проточную ячейку чипа пропускают буфер НВ8 (0,01М НЕРЕ8, 0,15М №С1, 3 мМ ЕИТА, 0,005% об./об. поверхностно-активное вещество Р20, рН 7,4) со скоростью 5 мкл/мин вплоть до получения стабильной базовой линии. Раствор (100 мкл) 15 мг ЕИС (гидрохлорид №этил-Ы'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида) в 200 мкл воды добавляют к 100 мкл раствора 2,3 мг ИН8 (Νгидроксисукцинимид) в 200 мкл воды. Сорок (40) мкл полученного в результате раствора инъецируют в чип. Шесть мкл раствора ΙΕ-12 человека (15 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия, рН 4,8) инъецируют в чип, получая увеличение примерно на 500 регистрируемых единиц (КИ). Буфер заменяют на рабочий буфер ТВ8/Са/Мд/БСА (20 мМ трис, 0,15М хлорид натрия, 2 мМ хлорид кальция, 2 мМ ацетат магния, 0,5% тритон Х-100, 25 мкг/мл БСА, рН 7,4) и пропускают через чип в течение ночи, чтобы его уравновесить и гидролизовать или блокировать любые не прореагировавшие сложные эфиры сукцинимида.
Антитела растворяют в рабочем буфере в концентрации 33,33; 16,67; 8,33 и 4,17 нМ. Устанавливают скорость потока 30 мкл/мин и температуру прибора 25°С. Для выполнения кинетических исследований используют две проточных ячейки, одну, на которой был иммобилизован ΙΕ-12 (образец), а вторую недериватизированную проточную ячейку (пустой контроль). 120 мкл антитела в каждой концентрации инъецируют в проточные ячейки при скорости 30 мкл/мин (фаза ассоциации) с последующим непрерывным потоком буфера в течение 360 с (фаза диссоциации). Поверхность чипа регенерируют (диссоциируют комплекс интерлейкин-12/антитело) двумя последовательными инъекциями 2М тиоцианата гуанидина по 30 мкл каждая.
Анализ данных проводят, используя В ^-оценку 3.0 или СЬАМР 2.0, которые известны в данной области. Для каждой концентрации антитела сенсограмму пустого контроля вычитают из сенсограммы образца. Общую подгонку делают как для диссоциации (кб с-1), так и для ассоциации (ка, моль-1 с-1) и рассчитывают константу диссоциации (Кс, моль) (кб/ка). В том случае, когда аффинность антитела достаточно высока, так что число КИ, соответствующих захваченным антителам, составляет >100, прогоняют дополнительные разведения антитела.
- 35 006673
Результаты и обсуждение
Получение моноклональных антител против 1Ь-12 человека
Выполняют несколько слияний, и клетки от каждого слияния высевают в 15 планшетов (1440 лунок/слияние) с получением нескольких десятков антител, специфичных по отношению к 1Ь-12 человека. Обнаружено, что некоторые из них состоят из комбинации цепей 1д человека и мыши. Остальные гибридомы секретируют анти-1Ь-12-антитела, состоящие только из тяжелых и легких цепей антитела человека. Предполагается, что все гибридомы человека являются 1дС1-гибридомами.
Кинетики связывания антител человека против 1Ь-12 человека
Анализ ЕЬ18А подтверждает, что очищенное антитело из большинства или из всех полученных гибридом связывает 1Ь-12 зависимым от концентрации образом. На фиг. 1 и 2 показаны результаты определения относительной эффективности связывания для указанных антител. В данном случае измеряют авидность антитела по отношению к его родственному антигену (эпитопу). Следует отметить, что связывание 1Ь-12 непосредственно с планшетом для ИФА может вызывать денатурацию белка, и кажущиеся аффинности связывания не могут отражать связывание неденатурированного белка. В указанных пределах концентраций обнаружено пятидесятипроцентное связывание.
Количественные константы связывания получают с использованием анализа антител человека с помощью В1Асоге, который показывает, что несколько моноклональных антител человека обладают высокой аффинностью с Κ в пределах от 1х10-9 до 7х10-12.
Заключение
Выполняют несколько слияний, используя спленоциты от гибридных мышей, содержащих трансгены вариабельной и константных областей антитела человека, которых иммунизируют 1Ь-12 человека. Получают набор нескольких полностью человеческих 1дС-моноклональных антител изотипа 1дС1, реагирующих с 1Ь-12 человека. Полностью анти-1Ь-12-антитела человека характеризуют далее. Несколько полученных антител имеют константы аффинности, составляющие от 1х109 до 9х1012. Неожиданно высокие аффинности указанных полностью моноклональных антител человека делают их подходящими антителами для терапевтических применений в случае зависимых от 1Ь-12 заболеваний, патологий или аналогичных состояний.
Пример 3: С340 является нейтрализующим моноклональным антителом человека Показано, что биологическая активность 1Ь-12 нейтрализуется С340 в ряде анализов зависимой от 1Ь-12 активности. Так как 1Ь-12 усиливает продукцию ΙΕΝ-гамма ΝΚ-клетками и Т-лимфоцитами, исследовали влияние антитела С340 на повышающую регуляцию мРНК ΙΕΝ-гамма и влияние С340 на продуцирование белка ΙΕΝ-гамма (ТппсЫеп, О., Сштеп! Орпиоп ш Iтшино1оду, 9:17-23 (1997), Мотк, 8. С., е! а1., 1оита1 о£ [ттипо^ду, 152:1047-1056 (1994)). В этих исследованиях также изучали способность С340 нейтрализовать управляемую 1Ь-12 индукцию активируемых лимфокинами киллерных клеток (БАЮ) (ΚιΗ/η, 1. апб Мигакко, Ό. М., Мескашктк о£ Адетд апб Пеуе1ортеп!, 90:209-222 (1996), 8!ет, А. 8., е! а1., Ргосеебтдк о£ 1ке №1Нопа1 Асабету о£ 8с1епсек о£ !ке и. 8. А., 87:6808-6812 (1990)). Наконец, тестировали влияние С340 на опосредуемую 1Ь-12 повышающую регуляцию экспрессии СЭ95 на поверхности клеток на Т- и ΝΚ- клетках (Мебуебеу, А. Е., е! а1., Су!окте, 9:394-404 (1997)).
Ингибирование транскрипции мРНК ΙΕΝ-гамма
Чтобы определить, ингибирует ли С340 индуцированную 1Ь-12/1Ь-2 транскрипцию гена ΙΕΝ-гамма в РВЬ человека, выполняли анализ обратной транскрипции-ПЦР. Использовали специфичные праймеры для β-актина (контроль целостности и содержания мРНК) и ΙΕΝ-гамма, чтобы амплифицировать кДНК, полученную из стимулированных РВЬ человека. На фиг. 3 показано, что С340 оказывает понижающее действие на мРНК ΙΕΝ-гамма в I^-12/I^-2-активированных (2 ч) РВМС.
Ингибирование внутриклеточного ΙΕΝ-гамма, измеряемого проточной цитометрией
В ответ на различные сигналы и как меру активации Т-клетки и ΝΚ-клетки можно индуцировать так, что они будут секретировать цитокины. Более конкретно, в РВЬ, обработанных ΙΕ-2 и ΙΕ-12, в значительной степени инициируется синтез ΙΕΝ-гамма в пределах 4-8 ч после стимуляции. Указанную продукцию можно регистрировать в цитоплазме обработанных брефелдином А РВЬ с помощью проточной цитометрии. На фиг. 4 показано 60% снижение продукции ΙΕΝ-гамма в таких культурах в случае добавления С340 к ΙΕ-12 вместе с ΙΕ-12 в течение пяти часов.
Ингибирование индуцированной 1Ь-12 секреции ΙΕΝ-гамма
На фиг. 5 ясно показано, что две разных партии С340 ингибировали секрецию ΙΕΝ-гамма лимфоцитами периферической крови дозо-зависимым образом. Четыреста пикограмм ΙΕ-12 предварительно смешивали с разными количествами С340 и затем добавляли к стимулированным ΙΕ-2 культурам РВЬ. При измерении ΙΕΝ-гамма с помощью ИФА после 18-24 ч инкубации выявили заметно сниженные количества ΙΕΝ-гамма в присутствии всего 1 мкг/мл антитела С340.
Ингибирование индуцированной 1Ь-12 клеточной цитотоксичности ЬАК
Клетки Кар, линии клеток, полученной из чувствительной к ΙΕ-12 лимфомы Беркита, представляют собой устойчивую к ΝΚ-клеткам, чувствительную к ^14-1(.^4(04 клеточную линию. Клетки Ка_р в трех повторах культивировали в течение четырех часов с ^АΚ-клетками, которые были активированы 400 пг/мл ΙΕ-12 и 10 и/мл ΙΕ-2 в присутствии или в отсутствие моноклонального антитела человека С340
- 36 006673 (5000 нг/мл или 50 нг/мл). На фиг. 6 показаны результаты для трех нормальных здоровых доноров. Активация 1Ь-12 + 1Ь-2 эффекторных клеток приводила к повышенной цитотоксической активности по сравнению с активностью клеток, активированных только 1Ь-2. Антитело С340 ингибировало указанное зависимое от 1Ь-12 действие. Величина ингибирования была связана с концентрацией антитела, при этом самая высокая тестируемая концентрация снижала цитотоксичность до фоновых уровней.
Ингибирование повышающей регуляции СИ95
В сообщениях описана индуцированная 1Ь-12 повышающая регуляция СЭ95 на поверхности в высокой степени очищенных РВЬ СЭ56+. Как можно видеть на фиг. 7А и 7В, распределительный проточно-цитометрический анализ показал, что экспрессия ί.Ό95 в значительной степени повышена на Тклетках СЭ3+ и NК-клетках СЭ56+ после обработки 1Ь-12 плюс 1Ь-2 в течение 72 ч. Сопутствующая обработка анти-1Ь-12-антителом ингибировала экспрессию СЭ95 как на СЭ3+, так и на СЭ56+ популяциях. Ингибирование в клетках ί.Ό3+ составляло ~50% (фиг. 7А) , тогда как ингибирование в клетках ί.Ό56+ составляло ~85% (фиг. 7В), что подтверждалось пониженным индексом МЕ1 (процент выше, чем в нестимулированном контроле).
Пример 4: Клонирование и характеристика гена
Фрагменты геномной ДНК, содержащие либо ген тяжелой цепи С340, либо легкой цепи С340, клонировали и очищали. Геномную ДНК, очищенную из клеток гибридомы С340, частично расщепляли ферментом рестрикции 8аи3А и отбирали по размеру с помощью фракционирования центрифугированием через 10-40% градиент сахарозы. Фрагменты ДНК размером в пределах 15-23 т.п.н. клонировали в векторе на основе бактериофага ЕМВЬ3 [коммерчески доступен] и упаковывали в фаговые частицы. В результате несколько реакций упаковки получали библиотеку из 1 миллиона клонов бактериофага. Примерно 600000 клонов из библиотеки подвергали скринингу с помощью гибридизации бляшек, используя в качестве зонда 32Р-меченые фрагменты геномной ДНК, которые содержали либо последовательности константной области тяжелой цепи 1дО1 человека, либо последовательности константной области легкой цепи каппа человека. Выявлены тринадцать клонов тяжелой цепи и девять клонов легкой цепи. Из них три клона тяжелой цепи и четыре клона легкой цепи очищали посредством еще двух раундов скрининга. С помощью ПЦР-анализа ДНК бактериофагов показано, что один из клонов тяжелой цепи и два клона легкой цепи содержат 5'-и 3'-концы кодирующих последовательностей. Вставка ДНК в клоне тяжелой цепи (НС) Н4 имела размер 16 т.п.н. и включала 3,6 т.п.н. 5'-фланкирующей последовательности и по меньшей мере 2 т.п.н. 3'-фланкирующей последовательности. Вставка ДНК в клоне легкой цепи (ЬС) ЬС1 имела размер 15 т.п.н. и включала 4,4 т.п.н. 5'-фланкирующей и 6,0 т.п.н. 3'-фланкирующей последовательности. Полные вставки извлекали из вектора на основе бактериофага и виде 8а11-фрагментов и клонировали между сайтами Х1о1 и 8а11 плазмидного экспрессирующего вектора р1351, который снабжен селектируемым маркерным геном др! Поскольку в последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи, был внутренний сайт 8а11, необходимо было перенести два 8ай-фрагмента из бактериофага Н4 в экспрессирующий вектор р1351. Полученные в результате плазмиды, зкспрессирующие тяжелую и легкую цепь, назвали р1560 и р1558, соответственно. Определили ориентацию генов тяжелой и легкой цепей в указанных двух плазмидах по отношению к последовательностям вектора р1351, используя анализ ферментами рестрикции и ПЦР, соответственно. В обоих случаях ориентация была такой, что 5'-конец фрагмента гена Ат располагался проксимально по отношению к 3'-концу гена др! Секвенировали обе цепи кодирующих областей клонированных генов. Последовательности плазмид р1560 и р1558 представлены на фиг. 11А-11К и фиг. 13А-13Л, соответственно.
Пример 5: Получение линий рекомбинантных клеток
Плазмиду тяжелой цепи р1560 линеаризировали расщеплением ферментом рестрикции Руи1 и плазмиду легкой цепи р1558 линеаризировали, используя фермент рестрикции 8а11. Клетки р3Х63Ад8.653 (653) и 8Р2/0-Ад14 (8Р2/0) отдельно трансфицировали предварительно смешанными линеаризованными плазмидами с помощью электропорации и клетки культивировали, и трансфектанты подвергали селекции, используя микофенольную кислоту, как описано (КшдЫ, е! а1.. Мо1еси1аг 1ттипо1оду 30:1443 (1993)). Надосадки клеток из колоний, устойчивых к микофенольной кислоте, анализировали примерно через две недели в отношении 1дО человека (т.е., рекомбинантов С340 (гС340)). Для этого надосадки клеток инкубировали в 96-луночных планшетах для ЕЬ18А, которые покрывали антителами козы, специфичными по отношению к Ес-части 1дО человека. 1дО человека, который связан с покрытым планшетом, выявляли, используя конъюгированное со щелочной фосфатазой антитело козы против 1дО человека (тяжелая цепь + легкая цепь) и субстраты щелочной фосфатазы, как описано (КшдЫ, е! а1., Мо1еси1аг 1ттипо1оду 30:1443 (1993)). Клетки более высоко продуцирующих клонов переносили в 24луночные культуральные чашки в стандартные среды и размножали (1М0М, 5% ЕВ 8, 2 мМ глутамин, смесь для селекции микофенольной кислотой). Количество продуцируемого антитела (т.е. секретированного в среду истощенных культур) тщательно оценивали в ЕЬ18А, используя в качестве стандарта очищенное мАт С340. Отобранные клоны затем размножали во флаконах Т75 и количественно оценивали в ЕЬ18А продукцию 1дО человека указанными клонами. На основании полученных значений субклонировали шесть независимых трансфектантов 653 и три независимых трансфектанта 8Р2/0 (высевая в среднем одну клетку на лунку в 96-луночные планшеты), количество антител, продуцируемых субклонами, опре
- 37 006673 деляли посредством анализа (Е1.18А) надосадков отдельных колоний субклонов. Три субклона, трансфектант 653 19-20 (С379В) и трансфектанты 8Р2/0 84-81 (С381А) и 22-56 (С389А) отобрали для дальнейшего анализа.
Анализ связывания антигена гС340
Перед субклонированием отобранных линий клеток, которые описаны выше, надосадки клеток из трех родительских линий (клон 2 и клон 18 трансфектантов 653 и клон 1 трансфектанта 8Р2/0) использовали для тестирования параметров связывания антигена для гС340. Сначала определяли концентрации гС340 в трех образцах надосадков клеток с помощью ЕЫ8А. Затем титрованные количества образцов надосадков или позитивного контроля в виде очищенного С340 инкубировали в 96-луночных планшетах, покрытых 2 мкг/мл Ш-12 человека. Затем связанные мАт выявляли с помощью конъюгированного со щелочной фосфатазой антитела козы против 1цСт человека (тяжелая цепь + легкая цепь) и соответствующих субстратов щелочной фосфатазы. Как показано на фиг. 8, гС340 специфично связывается с II.-12 человека неотличимо от связывания исходного мАт С340.
Характеристика отобранных клеточных линий
Анализ кривых роста выполняли на С379В, С381А и С389А, высевая во флаконы Т75 при исходной плотности клеток 2 X 105 клеток/мл в стандартную среду или бессывороточную среду 8РМ-5 и затем ежедневно контролируя количество клеток и концентрацию гС340 вплоть до истощения культур. Результаты для культур в стандартной среде показаны на фиг. 9А-9С. Максимальные уровни продукции мАт С340 для С379В, С381А и С389А составляли 135 мкг/мл, 150 мкг/мл и 110 мкг/мл, соответственно. Попытки адаптировать клетки С379В к среде 8РМ-5 были безуспешными. Клетки С381А продуцировали такое же количество гС340 в среде 8РМ-5, как и в стандартной среде, тогда как клетки С389А продуцировали только половину гС340 в среде 8РМ-5 от количества в стандартной среде.
Стабильность продукции мАт гС340 в течение времени для трех субклонов анализировали при культивировании клеток в 24-луночных чашках со стандартной средой или стандартной средой без селекции микофенольной кислотой в течение различных периодов времени. Отмечено, что линии С379В и С381А стабильно продуцируют гС340 при наличии или отсутствии селекции в течение периода времени, равного 30 дням (максимальное тестируемое время) и 75 дням, соответственно. Линия С389А была нестабильной и через 43 дня культивирования продуцировала лишь 20% от количества антитела в начале исследования.
Будет очевидно, что изобретение можно применять на практике иначе, чем описано конкретно в вышеприведенном описании и примерах.
Возможны многочисленные модификации и вариации данного изобретения в свете приведенных выше инструкций, и поэтому они входят в рамки прилагаемой формулы изобретения.
Список последовательностей <11О 611е5-К0П»Г, Л11; РегШ, Οβνίά <12О> 1Ь-12-АНТИТЕЛА, КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И ПРИМЕНЕНИЯ <130 СЕЫ248 <160 15 <170* Патент, вер. 2.0 <210 1 <2Н> 5 <212> Белок · <213> Нотомршив <400 1
ТЬг Тут Τϊρ Ьеи О1у
5 <210 2 <211> 17 <212> Белок <213> НОЛЮ Яф1СШ <400 2
Пе Ме18ег Рго Уж1 Αφ 8ег Ахр Не Αι® Туг 8ег Рго Зет РЬе (Ян
5 10 15 <Э1у
- 38 006673
<210 3
<21 !> 10
<212> Белок
<213> Нотоецпеы
<400 3
Аг§ АцРгоО1у(31пО1уТугИ1в АцрРЬе
5 10 <210 4 <2П> И <212> Белок <213> Ншоо «φίρη>
<400 4
Аде А1а Зег ОШ Сйу Пе 8ег Зег Ώρ Ьеи А1а 1 5 10 <210 5 <211> 7 <212> Белок <213> Ното иреаз <400 5
- 39 006673
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
5 <210 б <211> 9 <212> Белок <213> Ното эархеиз <400 б
ОЬ ОЬ Туг Азп Пе Туг Рго Туг ТЬг
5 <210 7 <211> 119 <212> Белок <213> Ното зар^спз <400 7
ОЬ Уа! ОЬ Ьеи Уа! ОЬ Зег 0!у А1а ОЬ Уа! Ьув Ьув Рго 01у ОЬ 15 1015
Зег Ьеи Ьув Пе Зег Суз Ьуз 01у Зег 01у Туг Зег РЬе 1Ъг ТЬг Туг 20 2530
Тф Ьеи О1у Тф Уа1 Аф ОЬ Ме» Рго О1у Ьув С1у Ьеи Азр Тф Пе 35 4045 <31у Пе Ме» Зег Рго Уа! Азр Зег Азр Пе Аф туг Зег Рго Зег РЬе 50 5560
ОЬСИуОЬ Уа1ТЬМе» Зег Уа1 АзрЬуз ЗегПеТЬгТЬгАЬТуг
70 7580
Ьеи ОЬ Тф Ази Зег Ьеи Ьуз А1а Зег Авр ТЬг А1а Ме» Туг Туг Суз 85 9095
А1а Аф Аф Аф Рго О1у ОЬ О1у Туг РЬе Азр РЬе Тгр О1у ОЬ О1у 100 105110
ТЬг Ьеи УаНЪг Уа! Зег Зег
115 <210 8 <211> 108 <212> Белок <213> Ното зартеоз <400 8
Авр Не О1п МеС ТЬг <31п вег Рго вег вег Ьеи вег А1а вег Уа1 31у
1 5 10 15
Авр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Сув Агд А1а вег 01п О1у Не вег вег Тгр
20 25 30
Ьеи АЬа Тгр Туг Э1п 01п Ьув Рго 01и Ьув А1а Рго Ьув вег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а вег Зег Ьеи <31п вег <31у Уа1 Рго вег Агд РЬе вег <31у
50 55 60
- 40 006673
Зег 01у Зег 01у ТЬг Авр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Вег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
31и Авр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Сув 31п <31п Туг АЗП 11е Туг Рго Туг
85 90 95
ТЬг РЬе (31у С1п <31у ТЬг Ьуз Ьеи <31и Не Ьув Агд
100 105 <210 9 <211> 503 <212> Белок <213> Ното гаргепз <400 9
Агд 1 Азп Ьеи Рго Уа1 5 А1а ТЬг Рго Авр Рго 10 <31у Мек РЬе Рго Суз 15 Ьеи
Н18 ΗΪΒ Бег αΐη 20 Азп Ьеи Ьеи Агд А1а 25 Уа1 Зег Авп Мек Ьеи 30 (31п Ьув
А1а Агд <Э1п 35 ТЬг Ьеи <31и РЬе Туг 40 Рго Суз ТЫ Зег <31и 45 <31и 11е Авр
Н1в О1и 50 Азр 11е ТЬг Ьуз Азр 55 Ьув ТЬг Зег ты Уа1 60 (31и А1а Суз Ьеи
Рго 65 Ьеи <31и Ьеи ТЬг Ьуз 70 А8П <31и Зег Сув Ьеи 75 Авп Вег Агд (31и ТЫ во
Зег РЬе 11е ТЬг Аэп 85 С1у Зег Суз Ьеи А1а 90 Зег Агд Ьуз ТЫ Зег 95 РЬе
Мек Мек А1а Ьеи 100 Суз Ьеи Зег бег 11е 105 Туг С1и Азр Ьеи Ьуз 110 Мек Туг
<31П Уа1 б!и 115 РЬе Ьуз ТЬг Мек Авп 120 А1а Ьув Ьеи Ьеи Мек 125 Азр Рго Ьуз
Агд αΐη 130 11е РЬе Ьеи Аар <31п 135 Авп МеЬ Ьеи А1а Уа1 140 11е Авр О1и Ьеи
Мек 145 С1п А1а Ьеи Азп РЬе 150 Авп Зег <31и ТЫ Уа1 155 Рго <31п Ьув Зег Зег 160
Ьеи О1и <31и Рго Авр 165 РЬе Тух Ьув ТЬг Ьув 170 11е Ьуз Ьеи Сув 11е 175 Ьеи
Ьеи Н1в А1а РЬе 180 Агд 11е Агд А1а Уа1 185 ТЫ 11е Азр Агд Уа1 190 Мек Зег
Туг Ьеи Азп 195 А1а 8ег 11е Тгр <31и 200 Ьеи Ьуз Ьуз Азр Уа1 205 Туг Уа1 Уа1
О1и Ьеи 210 Азр Тгр туг Рго Азр 215 А1а Рго (31у 01и Мек 220 Уа1 Уа1 Ьеи ТЫ
Суз Азр ТЬг Рго О1и С1и Авр О1у 11е ТЫ Тгр ТЫ Ьеи Азр О1п Зег
225 230 235 240
- 41 006673
245 250 255
РЬе С1у Азр А1а 260 (31у С1п Туг ТЬг Сув 265 Н1в Ьув <31у <31у (31и 270 Уа1 Ьеи
Зег Н1в Бег 275 Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Нхв 280 Ьув Ьуз <31и Авр <31у 285 11е тгр Зег
ТЬг Авр 290 Не Ьеи Ьув Авр (31п 295 Ьуз О1и Рго Ьув Авп 300 Ьув ТЫ РЬе Ьеи
Агд Сув 305 <31и А1а Ьув Авп 310 Туг Бег О1у Агд РЬе 315 ТЫ Сув Тгр Тгр Ьеи 320
ТЫ ТЬг 11е Зег ТЬг 325 Авр Ьеи ТЫ РЬе Зег 330 Уа1 Ьув Зег Зег Агд 335 О1у
Зег Зег Азр Рго 340 <31п <31у Уа1 ты Сув 345 О1у А1а А1а ТЫ Ьеи 350 Зег А1а
<Э1и Агд Уа1 355 Агд 01у Авр Авп Ьув 360 31и Туг □1и Туг Зег 365 Уа1 О1и Сув
С1п (31и 370 Азр Зег А1а Сув Рго 375 А1а А1а (Пи 31и Зег 380 Ьеи Рго 11е <31и
Уа1 385 МеЬ Уа1 Азр А1а Уа1 390 Н18 Ьув Ьеи Ьув Туг 395 <31и Азп Туг ТЬг Зег 400
Зег РЬе РЬе 11е Агд 405 Авр 11е 11е Ьув Рго 410 Авр Рго Рго Ьув Азп 415 Ьеи
αΐη Ьеи Ьув Рго 420 Ьеи Ьув Авп Зег Агд 425 αΐη Уа1 О1и Уа1 Зег 430 Тгр <31и
Туг Рго Азр 435 ТЬг Тгр Зег ТЬг Рго 440 Н18 Вег Туг РЬе Бег 445 Ьеи ТЫ РЬе
сув νβΐ 450 αΐη Уа1 αΐη О1у Ьув 455 Зег Ьув Агд □1и Ьув 460 Ьув Авр Агд Уа1
РЬе 465 ТЬг Азр Ьув ТЬг Зег 470 А1а ТЫ Уа1 11е Сув 475 Агд Ьув АЗП А1а Зег 480
11е Бег Уа1 Агд А1а 485 <31п Авр Агд Туг туг 490 Зег Зег Бег Тгр Зег 495 С1и
Тгр А1а Зег Уа1 Рго Сув Зег
500 <210 10 <211> 15 <212> ДНК <213> Ното зареги <400 10 а&аШасЫ£сас 15 <210 11 <211> 51 <212> ДНК
- 42 006673 <213> Ното зарина <400 11
8йаШЮа1П8а188аавсаа1ааа1ас1ас81а8ас1сс818аа888с 31
<210 14 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното вадош <400 14
ДОвсаюса асоддос <210 15 <211> 27 <212> ДНК <213> Ното зарода <400 15
Садовски всаасВДсс X

Claims (20)

1. Выделенное антитело против 1Б-12 млекопитающего, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область, включающую по меньшей мере одну аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8ЕС ГО НО: 7 и одну аминокислотную последовательность легкой цепи 8ЕС ГО НО: 8, причем указанное антитело специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом, включающим от 1-3 аминокислот до полной последовательности 8ЕС ГО НО: 9.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.1.
3. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.2.
4. Композиция, включающая антитело по п.1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
5. Способ диагностики или лечения связанного с ГБ-12 состояния в организме животном, предусматривающий введение указанному животному композиции по п.4 в эффективном количестве.
6. Выделенное антитело против ГБ-12 млекопитающего, содержащее все аминокислотные последовательности гипервариабельных областей (СЭК) тяжелой цепи 8ЕС ГО ΝΌ: 1, 2 и 3 и/или все аминокислотные последовательности СЭК легкой цепи 8ЕС ГО ХО: 4, 5 и 6, причем указанное антитело специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом, включающим от 1-3 аминокислот до полной последовательности 8Е() ГО ХО: 9.
7. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.6.
8. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.7.
9. Композиция, включающая антитело по п.6 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
10. Способ диагностики или лечения связанного с ГБ-12 состояния в организме животного, предусматривающий введение указанному животному композиции по п.9 в эффективном количестве.
11. Выделенное антитело против ГБ-12 млекопитающего, содержащее по меньшей мере одну СПКпоследовательность тяжелой цепи 8ЕС ГО ХО: 1, 2 и 3 и/или по меньшей мере одну СПКпоследовательность легкой цепи 8ЕС ГО ХО: 4, 5 и 6, причем указанное антитело специфично связывается по меньшей мере с одним эпитопом, включающим от 1-3 аминокислот до полной последовательности 8Е() ГО Νη 9.
12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.11.
13. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.
14. Композиция, включающая антитело по п.11 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
- 43 006673
15. Способ диагностики или лечения связанного с ΙΕ-12 состояния в организме животного, предусматривающий введение указанному животному композиции по п.14 в эффективном количестве.
16. Выделенное антитело против ΙΕ-12 млекопитающего, которое связывается с тем же самым эпитопом белка ΙΕ-12, что и антитело по п.11.
17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.16.
18. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.17.
19. Композиция, включающая антитело по п.16 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
20. Способ диагностики или лечения связанного с ΙΕ-12 состояния в организме животного, предусматривающий введение указанному животному композиции по п.19 в эффективном количестве.
Фиг. 1 А
- 44 006673
Фиг. 2А
Фиг. 2В
Фиг. 3
- 45 006673
110η
100.
90.
Λ § 80а ο
1Ь-12/1Ь-2 Π.-12/1Ε-2 + С340
Условия культивирования
Фиг. 4
Фиг. 5
Η 5000 нг/мл
Фиг. 6
EA200300137A 2000-08-07 2001-08-07 Антитела против il-12 и способы их применения EA006673B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22335800P 2000-08-07 2000-08-07
US23682700P 2000-09-29 2000-09-29
US09/920,262 US6902734B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
PCT/US2001/024720 WO2002012500A2 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300137A1 EA200300137A1 (ru) 2003-08-28
EA006673B1 true EA006673B1 (ru) 2006-02-24

Family

ID=27397221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300137A EA006673B1 (ru) 2000-08-07 2001-08-07 Антитела против il-12 и способы их применения

Country Status (33)

Country Link
US (15) US6902734B2 (ru)
EP (5) EP3178934B1 (ru)
JP (4) JP4731094B2 (ru)
KR (1) KR100823576B1 (ru)
CN (2) CN101550190B (ru)
AR (1) AR030134A1 (ru)
AT (1) ATE431412T1 (ru)
AU (2) AU2001281137B2 (ru)
BR (1) BRPI0113109B8 (ru)
CA (1) CA2418961C (ru)
CL (1) CL2009000575A1 (ru)
CY (7) CY1109149T1 (ru)
DE (2) DE122009000025I1 (ru)
DK (4) DK2090657T3 (ru)
EA (1) EA006673B1 (ru)
ES (4) ES2647220T3 (ru)
FR (1) FR09C0021I2 (ru)
HK (1) HK1135991A1 (ru)
HR (1) HRP20030087B1 (ru)
HU (1) HU228009B1 (ru)
IL (1) IL154325A (ru)
LT (6) LT2305817T (ru)
LU (3) LU91584I2 (ru)
ME (1) ME00326B (ru)
MX (1) MXPA03001229A (ru)
MY (1) MY133377A (ru)
NL (1) NL300390I2 (ru)
NO (3) NO330903B1 (ru)
NZ (2) NZ524145A (ru)
PT (4) PT2090657T (ru)
RS (1) RS50477B (ru)
SI (4) SI1309692T1 (ru)
WO (1) WO2002012500A2 (ru)

Families Citing this family (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6706264B1 (en) * 1994-03-14 2004-03-16 Genetics Institute, Llc Use of IL-12 antagonists in the treatment of conditions promoted by an increase in levels of IFN-y
US7883704B2 (en) 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US6902734B2 (en) * 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US20050249735A1 (en) * 2000-08-07 2005-11-10 Centocor, Inc. Methods of treating ankylosing spondylitis using anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
WO2003082206A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040018195A1 (en) * 2002-03-26 2004-01-29 Griswold Don Edgar Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040033228A1 (en) * 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US7273889B2 (en) * 2002-09-25 2007-09-25 Innovative Drug Delivery Systems, Inc. NMDA receptor antagonist formulation with reduced neurotoxicity
NZ539271A (en) 2002-10-30 2008-12-24 Genentech Inc Inhibition of the production of proinflammatory cytokine interleukin-17 (IL-17) by T cells, using an antagonist of interleukin-23 (IL-23)
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
WO2004041862A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
US20100003253A1 (en) * 2002-11-08 2010-01-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
ES2466716T3 (es) * 2002-11-08 2014-06-11 Ablynx N.V. Anticuerpos de un solo dominio estabilizados
CN103880955A (zh) * 2003-07-18 2014-06-25 安姆根有限公司 肝细胞生长因子的特异性结合物
GB0329146D0 (en) * 2003-12-16 2004-01-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
ATE533502T1 (de) * 2004-02-17 2011-12-15 Schering Corp Verfahren zur modulation der il-23-aktivität; relevante reagenzien
DK1839120T3 (da) * 2004-12-21 2013-11-11 Janssen Biotech Inc Vektorer baseret på Anti-IL-12-antistoffer, værtsceller og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelser
EA016022B1 (ru) 2004-12-21 2012-01-30 Сентокор, Инк. Выделенное антитело млекопитающего против il-12 и способ изменения его активности
WO2006112838A1 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Xtl Biopharmaceuticals Ltd. Stabilized anti-hepatitis b (hbv) antibody formulations
CN103145840A (zh) * 2005-06-30 2013-06-12 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
JP2007172129A (ja) * 2005-12-20 2007-07-05 Sony Corp 不揮発性メモリアクセス制御装置および不揮発性メモリ制御システム
WO2007137328A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Apollo Life Sciences Limited An isolated il-12 molecule or chimeric molecules thereof
US20080138833A1 (en) * 2006-12-07 2008-06-12 Wyeth Methods and compositions for assessing il-12 or the neutralization of il-12 in a sample
KR20090100461A (ko) * 2007-01-16 2009-09-23 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
CN101679507A (zh) 2007-03-29 2010-03-24 艾博特公司 结晶抗人类il-12抗体
EP2205276A4 (en) * 2007-09-28 2012-08-15 Janssen Biotech Inc ANTI-IL-12 / 23P40 ANTIBODIES, EPITOPES, FORMULATIONS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
BRPI0819656A2 (pt) 2007-11-27 2015-06-23 Ablynx Nv Seqüências de aminoácidos contras citocinas heterodiméricas e/ou seus receptores e polipeptídeos compreendendo as mesmas
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
TW201513883A (zh) * 2008-03-18 2015-04-16 Abbvie Inc 治療牛皮癬的方法
EP2288382B1 (en) 2008-05-05 2018-08-29 NovImmune SA Anti- il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
US20100111853A1 (en) * 2008-10-20 2010-05-06 Abbott Laboratories, Inc. Antibodies that bind to il-12 and methods of purifying the same
CN104974251A (zh) * 2008-10-20 2015-10-14 Abbvie公司 在抗体纯化过程中的病毒灭活
CN104398471A (zh) * 2008-11-28 2015-03-11 Abbvie公司 稳定的抗体组合物和用于稳定其的方法
JP6053517B2 (ja) 2009-05-05 2016-12-27 ノヴィミュンヌ エスア 抗ｉｌ−１７ｆ抗体およびそれらの使用法
RU2012114854A (ru) * 2009-09-14 2013-10-27 Эбботт Лэборетриз Способы лечения псориаза
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA3162352A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Modernatx, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
TW201309330A (zh) * 2011-01-28 2013-03-01 Abbott Lab 包含糖基化抗體之組合物及其用途
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9428535B2 (en) 2011-10-03 2016-08-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
EP2791171A1 (en) 2011-12-16 2014-10-22 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243946A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
CN104583239B (zh) 2012-05-10 2018-09-18 生物蛋白有限公司 多特异单克隆抗体
EP2866833B1 (en) 2012-06-27 2019-05-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Crystalline anti-human il-23 antibodies
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CA2926218A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EA202193002A2 (ru) 2014-09-03 2022-03-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Соединение, нацеленное на ил-23a и фно-альфа, и его применение
US20180298340A1 (en) * 2015-04-24 2018-10-18 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
EP3365369A1 (en) * 2015-10-23 2018-08-29 Pfizer Inc Anti-il-2 antibodies and compositions and uses thereof
AU2017241776A1 (en) * 2016-03-29 2018-10-11 Janssen Biotech, Inc. Treating psoriasis with increased interval dosing of anti-IL12 and/or -23 antibody
WO2018024770A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Formycon Ag Production of biosimilar ustekinumab in cho cells
MA46861A (fr) 2016-11-16 2019-09-25 Janssen Biotech Inc Procédé de traitement du psoriasis avec un anticorps anti-il-23 spécifique
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CN117045784A (zh) 2016-12-14 2023-11-14 比奥拉治疗股份有限公司 使用利用可摄入装置释放的il-12/il-23抑制剂治疗胃肠道疾病
KR20240038146A (ko) 2017-01-30 2024-03-22 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 건선성 관절염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
WO2018147915A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibodies, compositions, and methods for the treatment of active ankylosing spondylitis
WO2018224673A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Zaklady Farmaceutyczne Polpharma S.A. Improved methods of cell culture
TW201922780A (zh) * 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
WO2019106206A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fyb 202 Project Gmbh Stable, low viscosity, high concentration liquid formulations of an anti-il-12/23p40 antibody
US11578124B2 (en) 2018-05-18 2023-02-14 Janssen Biotech, Inc. Safe and effective method of treating lupus with anti-IL12/IL23 antibody
TR201808283A2 (tr) * 2018-06-11 2018-07-23 Centurion Ilac San Ve Tic A S Sulu farmasöti̇k etenersept bi̇leşi̇mi̇
EP3810268A1 (en) 2018-06-20 2021-04-28 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20230009902A1 (en) 2018-06-20 2023-01-12 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue orginating from the endoderm
US20200061015A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Janssen Biotech, Inc. Lipase Degradation Resistant Surfactants for Use in Large Molecule Therapeutic Formulations
FI3883606T3 (fi) 2018-09-24 2023-09-07 Janssen Biotech Inc Turvallinen ja tehokas menetelmä haavaisen paksusuolitulehduksen hoitamiseksi anti-il12/il23-vasta-aineella
WO2020106754A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
BR112021009287A2 (pt) 2018-11-20 2021-10-26 Janssen Biotech, Inc. Método seguro e eficaz para tratar psoríase com anticorpo específico anti-il-23
AU2020208828A1 (en) 2019-01-15 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibody compositions and methods for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
EA202192038A1 (ru) 2019-01-23 2021-10-05 Янссен Байотек, Инк. Композиции антител к фно для применения в способах лечения псориатического артрита
US20220153830A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
WO2020183270A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Janssen Biotech, Inc. Methods for producing anti-tnf antibody compositions
CN113840837A (zh) 2019-03-14 2021-12-24 詹森生物科技公司 用于产生抗tnf抗体组合物的方法
WO2020188466A1 (en) * 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis in pediatric subjects with anti-il12/il23 antibody
AU2020279987A1 (en) 2019-05-23 2021-11-18 Janssen Biotech, Inc. Method of treating inflammatory bowel disease with a combination therapy of antibodies to IL-23 and TNF alpha
CN113939531A (zh) 2019-06-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 用于治疗银屑病关节炎的抗tnf抗体组合物和方法
KR20220030952A (ko) 2019-06-03 2022-03-11 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 강직성 척추염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
MX2022001305A (es) * 2019-07-30 2022-05-06 Akeso Biopharma Inc Anticuerpo de dominio proteínico p40 anti-humana y uso del mismo.
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
JP2023509373A (ja) 2019-12-20 2023-03-08 ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド 抗インターロイキン－２３ ｐ１９抗体およびそれの使用方法
WO2022024065A1 (en) * 2020-07-30 2022-02-03 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis in pediatric subjects with anti-il12/il23 antibody
US20230042465A1 (en) 2021-07-09 2023-02-09 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
KR20240034218A (ko) 2021-07-09 2024-03-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-tnf 항체 조성물을 생산하기 위한 제조 방법
US20240117030A1 (en) 2022-03-03 2024-04-11 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
US20240059799A1 (en) 2022-05-11 2024-02-22 Pfizer Inc. Anti-tl1a antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (179)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US122464A (en) 1872-01-02 Improvement in cheese-hoops
US941234A (en) 1909-02-25 1909-11-23 Frank De Clercq Syrup-percolator.
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE3590766C2 (ru) 1985-03-30 1991-01-10 Marc Genf/Geneve Ch Ballivet
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8517895D0 (en) 1985-07-16 1985-08-21 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
EP0545913B1 (en) 1986-08-18 1999-02-24 Emisphere Technologies, Inc. Delivery systems for pharmacological agents
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0832981A1 (en) 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988006630A1 (en) 1987-03-02 1988-09-07 Genex Corporation Method for the preparation of binding molecules
EP0288088B1 (en) 1987-04-24 1994-03-09 Teijin Limited Detection of tumor necrosis factor; monoclonal antibody and kit
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
JP2755395B2 (ja) 1987-09-23 1998-05-20 ブリストル―マイアーズ スクイブ コムパニー Ｈｉｖ感染細胞に殺作用する抗体異種結合体
JP2980626B2 (ja) 1988-01-11 1999-11-22 ゾーマ・コーポレーション ペクチン酸リアーゼのシグナル配列を含む新規プラスミドベクター
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
JP2893653B2 (ja) 1988-11-10 1999-05-24 ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド ナチュラルキラー細胞刺激因子
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5811523A (en) 1988-11-10 1998-09-22 Trinchieri; Giorgio Antibodies to natural killer stimulatory factor
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
DK0479909T3 (da) 1989-06-29 1997-04-07 Medarex Inc Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling
JP3443119B2 (ja) 1989-08-07 2003-09-02 ペプテック リミテッド 腫瘍壊死因子結合リガンド
DK0494955T3 (da) 1989-10-05 1998-10-26 Optein Inc Cellefri syntese og isolering af hidtil ukendte gener og polypeptider
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5780597A (en) 1989-12-22 1998-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Monoclonal antibodies to cytotoxic lymphocyte maturation factor
ATE366311T1 (de) 1989-12-22 2007-07-15 Hoffmann La Roche Zytotoxischer lymphozyten-reifefaktor 35kd untereinheit und monoklonale antikörper spezifisch dafür
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
TW212184B (ru) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ATE160818T1 (de) 1990-06-01 1997-12-15 Chiron Corp Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung von molekülen mit biologischer wirksamkeit
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
IE920562A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
SG89295A1 (en) 1991-03-15 2002-06-18 Amgen Inc Pegylation of polypeptides
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
JP3230056B2 (ja) 1991-07-02 2001-11-19 インヘイル・インコーポレーテッド 薬剤のエーロゾル化服用量を形成する装置
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5766886A (en) 1991-12-13 1998-06-16 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
SK279327B6 (sk) 1992-10-19 1998-10-07 Dura Pharmaceuticals Zariadenie na vytváranie aerosolu z práškového lie
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
EP0680451B1 (en) 1993-01-19 1998-11-04 Glaxo Group Limited Aerosol dispenser and method of manufacture
US5300478A (en) * 1993-01-28 1994-04-05 Zeneca Limited Substituted fused pyrazolo compounds
CN1119876A (zh) 1993-02-12 1996-04-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 被调节的靶向基因转录及其他生物学过程
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR950701934A (ko) * 1993-04-30 1995-05-17 아사이 잇뻬이 소수성 폴리펩티드의 정제방법(purification method for hydrophobic polypeptide)
DE4315127A1 (de) 1993-05-07 1994-11-10 Behringwerke Ag Arzneimittel enthaltend die Untereinheit p40 von Interleukin-12
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
AU692239B2 (en) 1994-03-07 1998-06-04 Medarex, Inc. Bispecific molecules having clinical utilities
ZA95960B (en) 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
KR100358271B1 (ko) 1994-04-22 2003-03-15 코릭사 코포레이션 보호성면역반응및il-12생산의자극과증강을위한화합물및방법
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5853697A (en) 1995-10-25 1998-12-29 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
EA001237B1 (ru) 1996-01-03 2000-12-25 Глаксо Груп Лимитед Ингаляционное устройство
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
ES2169299T3 (es) 1996-09-03 2002-07-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Procedimiento para la destruccion de celulas tumorales contaminantes en transplantes de celulas madre utilizando anticuerpos especificos.
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
WO1998034635A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 The Wistar Institute Methods and compositions for the inhibition of interleukin-12 production
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
PT1818343E (pt) 1998-01-23 2012-07-12 Hoffmann La Roche Anticorpos contra a il-12 humana
AU1843200A (en) 1998-12-09 2000-06-26 Protein Design Labs, Inc. Animal model for psoriasis for the prevention and treatment of psoriasis in humans
TR200603997T1 (tr) 1999-03-25 2010-01-21 Abbott Gmbh & Co. Kg Beşeri IL-12'yi bağlayan beşeri antikorlar ve bunları üretmek için yöntemler.
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU7127600A (en) 1999-09-17 2001-04-17 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
US6902734B2 (en) * 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
AU2003247411A1 (en) 2002-05-23 2003-12-12 Cognis Corporation NON-REVERTIBLE Beta-OXIDATION BLOCKED CANDIDA TROPICALIS
DE102007030072A1 (de) 2007-06-29 2009-01-02 BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH Elektrischen Antriebseinrichtung für ein Wasserführendes Haushaltsgerät
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9205258B2 (en) 2013-11-04 2015-12-08 ElectroCore, LLC Nerve stimulator system
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015061835A (ja) 2015-04-02
CY2018010I1 (el) 2018-09-05
CY1109149T1 (el) 2012-01-25
CN1468309A (zh) 2004-01-14
US20190248884A1 (en) 2019-08-15
LTC1309692I2 (lt) 2020-06-25
PT1309692E (pt) 2009-05-21
MEP44408A (en) 2011-02-10
LTPA2009002I1 (lt) 2020-03-25
US8329171B2 (en) 2012-12-11
JP2011173884A (ja) 2011-09-08
JP2012025779A (ja) 2012-02-09
CA2418961A1 (en) 2002-02-14
KR20030034133A (ko) 2003-05-01
NO2020005I1 (no) 2020-03-11
US20050196838A1 (en) 2005-09-08
CN101550190A (zh) 2009-10-07
HUP0302378A2 (hu) 2003-10-28
EP1309692B1 (en) 2009-05-13
SI2305817T1 (en) 2018-02-28
LT3178934T (lt) 2019-09-25
US8703141B2 (en) 2014-04-22
EP2090657A3 (en) 2011-12-28
RS50477B (sr) 2010-03-02
ES2323760T3 (es) 2009-07-24
CY1118901T1 (el) 2018-02-14
AR030134A1 (es) 2003-08-13
NZ535865A (en) 2007-01-26
PT2305817T (pt) 2017-10-26
US7887807B2 (en) 2011-02-15
FR09C0021I1 (ru) 2009-09-25
EP1309692A2 (en) 2003-05-14
US8084233B2 (en) 2011-12-27
ME00326B (me) 2011-05-10
WO2002012500A3 (en) 2003-01-03
JP4731094B2 (ja) 2011-07-20
US20180334500A1 (en) 2018-11-22
MXPA03001229A (es) 2003-10-15
CY2009007I2 (el) 2012-01-25
AU8113701A (en) 2002-02-18
SI3178934T1 (sl) 2019-10-30
LU91584I9 (ru) 2019-01-03
DK1309692T3 (da) 2009-06-15
US6902734B2 (en) 2005-06-07
US20130064760A1 (en) 2013-03-14
CY2020003I1 (el) 2020-05-29
ATE431412T1 (de) 2009-05-15
ES2647220T3 (es) 2017-12-20
KR100823576B1 (ko) 2008-04-21
LTPA2020001I1 (lt) 2020-02-10
BR0113109A (pt) 2004-02-03
NL300390I2 (en) 2010-03-01
LT2305817T (lt) 2017-11-27
NO330903B1 (no) 2011-08-15
BRPI0113109B1 (pt) 2017-02-07
US20090274707A1 (en) 2009-11-05
US20050214293A1 (en) 2005-09-29
US7166285B2 (en) 2007-01-23
US11078267B2 (en) 2021-08-03
SI2090657T1 (sl) 2017-06-30
JP2004527212A (ja) 2004-09-09
US20030124123A1 (en) 2003-07-03
CY1122505T1 (el) 2020-05-29
AU2001281137B2 (en) 2007-03-15
CA2418961C (en) 2009-11-03
NO20030614L (no) 2003-04-02
US10519231B2 (en) 2019-12-31
HRP20030087B1 (en) 2012-07-31
US9676848B2 (en) 2017-06-13
EP3178934A1 (en) 2017-06-14
LUC00145I2 (ru) 2021-08-13
US20140178295A1 (en) 2014-06-26
DK3178934T3 (da) 2019-09-30
NL300390I1 (en) 2009-07-01
US20200062841A1 (en) 2020-02-27
EP2305817B1 (en) 2017-09-27
IL154325A (en) 2010-12-30
US9409984B2 (en) 2016-08-09
LTC2305817I2 (lt) 2021-04-26
CY2009007I1 (el) 2012-01-25
MY133377A (en) 2007-11-30
EP2090657A2 (en) 2009-08-19
CN101550190B (zh) 2016-04-13
US20050112127A1 (en) 2005-05-26
US20080090290A1 (en) 2008-04-17
SI1309692T1 (sl) 2009-08-31
NO2011023I2 (no) 2011-10-04
US20170029496A1 (en) 2017-02-02
US20110082190A1 (en) 2011-04-07
NO2011023I1 (no) 2011-10-17
NZ524145A (en) 2004-11-26
US20050002937A1 (en) 2005-01-06
LT2090657T (lt) 2017-07-25
PT3178934T (pt) 2019-10-14
JP6076303B2 (ja) 2017-02-08
CY2020003I2 (el) 2020-05-29
PT2090657T (pt) 2017-05-03
IL154325A0 (en) 2003-09-17
EP2090657B1 (en) 2017-03-01
US10259867B2 (en) 2019-04-16
DE60138711D1 (de) 2009-06-25
US7560247B2 (en) 2009-07-14
CY1119650T1 (el) 2018-04-04
HU228009B1 (en) 2012-08-28
LUC00066I2 (ru) 2018-05-25
BRPI0113109B8 (pt) 2021-05-25
EP3597752A1 (en) 2020-01-22
DK2090657T3 (en) 2017-06-06
EP2305817A2 (en) 2011-04-06
ES2624502T3 (es) 2017-07-14
NO20030614D0 (no) 2003-02-07
DK2305817T3 (en) 2017-12-04
CL2009000575A1 (es) 2009-07-17
EA200300137A1 (ru) 2003-08-28
LUC00066I1 (ru) 2018-03-23
EP2305817A3 (en) 2011-12-28
ES2747573T3 (es) 2020-03-10
DE122009000025I1 (de) 2009-09-17
CY2018010I2 (el) 2018-09-05
FR09C0021I2 (fr) 2010-06-11
LTPA2018007I1 (lt) 2018-04-10
US7279157B2 (en) 2007-10-09
YU9303A (sh) 2006-05-25
PL360258A1 (en) 2004-09-06
LU91584I2 (fr) 2009-09-10
EP3178934B1 (en) 2019-07-24
HRP20030087A2 (en) 2005-10-31
US20120063998A1 (en) 2012-03-15
WO2002012500A2 (en) 2002-02-14
HK1135991A1 (zh) 2010-06-18
US7063964B2 (en) 2006-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006673B1 (ru) Антитела против il-12 и способы их применения
EA007617B1 (ru) Моноклональное антитело к двойному интегриновому белку и его фрагмент, фармацевтическая композиция и способ лечения
HU229523B1 (en) Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
JP2005512522A (ja) Ｉｌ−１３ムテインタンパク質、抗体、組成物、方法および使用
PL205786B1 (pl) Kwas nukleinowy, prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza, ssacze przeciwcia lo anty-IL-12 i kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowania
UA81100C2 (en) Isolated monoclonal human antibody that binds to human il-12

Legal Events

Date Code Title Description
ND4A Extension of term of a eurasian patent
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MK4A Patent expired

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM RU