JP6076303B2 - 抗il−12抗体、組成物、方法および使用 - Google Patents
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Description
発明の分野
この出願は、引用によって本明細書に完全に組み入れられている各々2000年8月7日提出の米国暫定出願第60/223,358号および2000年9月29日提出の同第60/236,827号に一部分基づいており、そしてこれに対する優先権を請求する。
インターロイキン12(IL−12)は、ジスルフィド結合されている30と40kDのグリコシル化ポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体のサイトカインである。サイトカインは、樹状細胞、単球、マクロファージ、B細胞、ランゲルハンス細胞および角化細胞ならびにナチュラルキラー(NK)細胞を含む抗原提示細胞によって合成され、そして分泌される。IL−12は、種々の生物学的プロセスを媒介し、そしてNK細胞刺激因子(NKSF)、T細胞刺激因子、細胞障害Tリンパ球成熟因子およびEBV−形質転換されたB細胞系因子(非特許文献1)として言及されてきた。
ラキシーをもたらすことがある。これらおよび他の問題を回避するために、多数のアプローチが、当該技術分野で周知であるような、キメラ化およびヒト化を含むそのような抗体およびその部分の免疫原性を低下されるために取られてきた。しかしながら、これらおよび他のアプローチは、なお、若干の免疫原性、低親和性、低活性を有するか、または細胞培養、スケールアップ、生産および/または低収量における問題を有する抗体もしくはフラグメントをもたらす。かくして、抗体もしくはフラグメントは、治療タンパク質としての製造もしくは使用のために理想的に適しているとは言えない。
本発明は、単離したヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類、キメラ、ヒト化および/またはCDR移植した、抗IL−12抗体、免疫グロブリン、切断産物および他の特定部分およびその改変体、ならびに抗IL−12抗体組成物、エンコーディングもしくは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、用具、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、および当該技術分野において既知であるものと組み合わせて、本明細書に記述され、そして可能にされるような、それらの作成および使用方法を提供する。
とを含む、宿主細胞において、少なくとも1つのIL−12抗体、またはIL−12抗イディオタイプ抗体を発現するための少なくとも1つの方法を提供する。
本発明は、単離された、組み換えおよび/または合成の、抗IL−12ヒト、霊長類、齧歯類、哺乳類の、キメラ、ヒト化またはCDR移植した、抗体、およびそれに対するIL−12抗イディオタイプ抗体、ならびに少なくとも1つの抗IL−12抗体もしくは抗イディオタイプ抗体をコードしている少なくとも1つのポリヌクレオチドを含んでなる組成物およびエンコーディング核酸分子を提供する。さらに、本発明は、限定するものではないが、診断および治療組成物、方法および用具を含む、そのような核酸および抗体および抗イディオタイプ抗体の作成および使用方法を包含する。
b(例えばプラスミン消化による)、pFc’(例えばペプシンもしくはプラスミン消化による)、Fd(例えばペプシン消化、部分還元および再集合による)、FvもしくはscFv’(例えば分子生物学技術による)フラグメントを含む、IL−12またはその部分に結合できる抗体フラグメントは本発明によって包含される(参照、例えば、Colligan,Immunology,前出)。
部分をコードしている組み合わせ遺伝子は、重鎖のCH1ドメインおよび/またはヒンジ
部をコードしているDNA配列を含むように消化することができる。抗体の種々の部分は、慣用の技術によって化学的に一緒に結合できるか、または遺伝子工学技術を用いて隣接するタンパク質として生産することができる。
ンジ、(VL,VH)も、わずかな配列の変化もしくは改変のみを含んで、実質的にヒトにおいて非免疫原性である抗体を指す。同様に、霊長類(サル、ヒヒ、チンパンジーなど)、齧歯類(マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど)および他の哺乳類を指名された抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科に特異的な抗体を指す。さらに、キメラ抗体は、上記のすべての組み合わせを含む。そのような変化もしくは改変は、場合によっては、そして好ましくは、非改変抗体に較べてヒトもしくは他の種における免疫原性を保持しているか、または低下している。かくして、ヒト抗体は、キメラもしくはヒト化抗体とは異なっている。ヒト抗体が、機能的に再配列したヒト免疫グロブリン(例えば、重鎖および/または軽鎖)遺伝子を発現可能である非ヒト動物または原核もしくは真核細胞によって生産できることが指摘される。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、それは、本来のヒト抗体には見いだされないリンカーペプチドを含有することができる。例えば、Fvは、リンカーペプチド、例えば2〜約8個のグリシンもしくは他のアミノ酸残基を含有でき、これが重鎖の可変部と軽鎖の可変部を結合している。そのようなリンカーペプチドはヒト起源をもつと考えられる。
et al.,Methods in Enzymology 121:210(1986)において開示されており、各々は引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
疫原性を保持している場合には、本発明において有用である。本発明において使用できる抗体は、場合によっては、症候の相当な緩和と、低いおよび/または許容できる毒性とともに、長期間患者を治療する能力を特徴とする。低いまたは許容できる免疫原性および/または高い親和性、ならびに他の適当な性質は、達成される治療結果に貢献できる。「低い免疫原性」は、治療される患者の約75%未満、または好ましくは約50%未満において有意なHAHA、HACAもしくはHAMA応答を起こすこと、そして/または治療される患者において低いタイターを起こすこと(二重抗原酵素イムノアッセイで測定される約300未満、好ましくは約100未満)(例えば、引用によって本明細書に完全に組み入れられているElliot et al.,Lancet 344:1125−1127(1994)、参照)として本明細書で定義される。
本発明の単離した核酸は、少なくとも1つの抗IL−12抗体もしくはその特定の改変体の生産のために使用することができ、これらは、限定されるものではないが、少なくとも1つの免疫障害もしくは疾患、心臓血管障害もしくは疾患、感染性、悪性および/または神経学的障害もしくは疾患、または他の既知もしくは特定のIL−12関連症状から選ばれる、少なくとも1つのIL−12症状の発生を診断、モニター、調整、治療、緩和、予防するか、その症候を軽減するように、細胞、組織、臓器もしくは動物(哺乳類およびヒトを含む)において測定するか、または影響を与えるために使用できる。
本明細書で引用されるすべての出版物もしくは特許は、それらが、本発明の時点における技術の状態および/または本発明の記述および可能性を提供することを示すように、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。出版物は、すべての科学的もしくは特許出版物、またはすべての記録された電子もしくは印刷フォーマットを含むすべての媒体フォーマットにおいて利用できるすべての他の情報を指す。次の引用文献は、引用によって本明細書に完全に組み入れられている:Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(1987−2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Habor,NY(1989);Harlow and Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Habor,NY(1989);Colligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994−2001);Colligan,et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,Inc.,NY、NY(1997−2001)。
本発明の少なくとも1つの抗IL−12抗体は、場合によっては、当該技術分野におい
て周知であるように、細胞系、混合細胞系、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって生産することができる。参照、例えば、各々引用によって本明細書に完全に組み入れられている、Ausubel,et al.,Current Protocols
in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY,NY(1987−2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Habor,NY(1989);Harlow and Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Habor,NY(1989);Colligan,et
al.,eds.,Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1994−2001);Colligan,et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,Inc.,NY、NY(1997−2001)。
、「インポート(import)」残基と呼ばれ、これらは、典型的には、既知のヒト配列の「インポート」可変、定常もしくは他のドメインから取られる。既知のヒトIg配列は、下記に開示されていて、各々引用によって本明細書に完全に組み入れられている:
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi:www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;
www.public.iastate.edu/〜pedro/research_tools.html:www.mgen.uni−
heidelberg.de/SD/IT/IT.html;www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;
www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/mikeimages.html;
www.antibodyresource.com/;
mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/;
pathbox.wustl.edu/〜hcenter/index.html;www.biotech.ufl.edu/〜hcl/;
www.pebio.com/pa/340913/340913.html;
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;
www.m.ehime−u.ac.jp/〜yasuhito/Elisa.html;www.biodesign.com/table.asp;
www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;www.biotech.ufl.edu/〜fccl/protocol.html;www.isac−net.org/sites_geo.html;aximt1.imt.uni−marburg.de/〜rek/AEPStart.html;
baserv.uci.kun.nl/〜jraats/links1.html;www.recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;
www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html;www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;www.biochem.ucl.ac.uk/〜martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;
abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;
www.unizh.ch/〜honegger/AHOseminar/Slide01.html;www.cryst.bbk.ac.uk/〜ubcg07s/;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/humanisation/TAHHP.html;
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;
www.cryst.bioc.cam.ac.uk/〜fmolina/Web−pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabatetal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.
S.Dept.Health(1983),そのようなインポート配列は、当該技術分野において周知であるように、免疫原性を減少させるか、または結合性、親和性、オン・レート(on−rate)、オフ・レート(off−rate)、結合活性、特異性、半減期またはすべての他の適当な特性を減少、増進もしくは改変するために使用できる。一般に、非ヒトもしくはヒトCDR配列の一部もしくは全部は、可変および定常部の非ヒト配列がヒトもしくは他のアミノ酸と置換される間にも維持される。また、抗体は、場合によっては、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質の保持とともにヒト化できる。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、場合によっては、親の配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いる、親の配列および種々の概念上のヒト化生成物の解析方法によって作成することができる。三次元の免疫グロブリンモデルは、通常は、当業者にとって利用可能であり、そして周知である。選ばれた候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配置構造を描き、そして表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示の検査は、候補の免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の解析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響する残基の解析を可能にする。この点において、FR残基は、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対して増強した親和性が達成されるように、共通およびインポート配列から選択および組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を与える上で直接に、そしてもっとも本質的に必要である。本発明の抗体のヒト化もしくは構築は、限定されるものではないが、下記のようなすべての既知の方法を用いて行うことができる:Winter(Jones et al.,Nature 321:522(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);Verhoeyen et al.,Sience 239:1534(1988),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(19939;Chothia and Lesk,J,Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4289(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993)、米国特許第5723323号、同第5976862号、同第5824514号、同第5817483号、同第5814476号、同第5763192号、同第5723323号、同第5766886号、同第5714352号、同第6204423号、同第6180370号、同第5693762号、同第5530101号、同第5585089号、同第5225539号、同第4816567号、PCT/:US98/16280,US96/18978,US91/09630,US91/05939,US94/01234,GB89/01334,GB91/01134,GB92/01755,WO90/14443,WO90/14424,WO90/14430,欧州特許第229246号、各々、そこに引用される引用を含む、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
et al.による米国特許第5,770,428号、同第5,569,825号、同第5,545,806号、同第5,625,126号、同第5,625,825号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,789,650号;Jakobovits et al.WO98/50433,Jet al.WO98/248
93、Lonberg et al.WO98/24884,Lonberg et al.WO97/13852、Lonberg et al.WO94/25585,Kucherlapate et al.WO96/34096,Kucherlapate
et al.欧州特許出願公開第0463 151号,Kucherlapate et al.欧州特許出願公開第0710 719号,Surani et al.米国特許第5,545,807号,Bruggemann et al.WO90/04036,Bruggemann et al.欧州特許出願公開第0438 474号,Lonberg et al.欧州特許出願公開第0814 259号,Lonberg et
al.ドイツ特許出願公開第2 274 440号,Lonberg et al.Nature 368:856−859(1994)、Taylor et al.Int.Immunol.6(4)579−591(1994)、Green et al.Nature Genetics 7:13−21(1994),Mendez et al.Nature Genetics 15:146−156(1997),Taylor et al.Nucleic Acids Reserch 20(23):6287−6295(1992),Tauillon et al.,Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720−3724(1993)、Lonberg
et al.Int Rev Immunol 13(1):65−93(1995)およびFishwald et al.Natl Biotechnol 14(7):845−851(1996)、これらは各々引用によって本明細書に完全に組み入れられている)。一般に、これらのマウスは、機能的に再配列されるか、または機能的再配列を受け入れることができる少なくとも1つのヒト免疫グロブリン座からのDNAを含んでなる少なくとも1つのトランスジーンを含有する。そのようなマウスにおける内因性の免疫グロブリン座は、内因性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を除去するために破壊もしくは欠失することができる。
5793号;Genentechに譲渡された同第5750373号;Xomaに譲渡された同第5618920号、同第5595898号、同第5576195号、同第5698435号、同第5693493号、同第5698417号、Colligan,前出;Ansubel,前出;またはSambrook,前出、上記特許および出版物の各々は引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
実施態様では、本発明の少なくとも1つのヒトmAbは、場合によっては、高い親和性によりヒトIL−12に結合することができる。例えば、ヒトmAbは、約10-7Mに等しいか、それ未満、例えば限定されるものではないが0.1−9.9(またはそこでのすべての範囲もしくは値)X10-7,10-8,10-9,10-10,10-11,10-12,10-13もしくはそこでのすべての範囲もしくは値のKDによりヒトIL−12に結合できる。
nology,Paul,W.E.,Ed.Raven Press:New York,NY(1984);Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,NY(1992);およびそこに記述される方法)。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件(例えば、塩濃度、pH)下で測定された場合には変わることがある。かくして、親和性および他の抗原結合パラメーター(例えば、KD,Ka,Kd)の測定は、好ましくは、抗体およ
び抗原の標準溶液、および標準バッファー、例えば本明細書に記述されるバッファーを用いて行われる。
本明細書で提供される情報、例えば、配列番号:1,2,3,4,5,6,7,8の少なくとも1つの隣接するアミノ酸の少なくとも70−100%においてコードしているヌクレオチド配列、特定のフラグメント、改変体もしくはその共通配列、またはこれらの配列の少なくとも1つを含んでなる寄託ベクターを使用して、少なくとも1つの抗IL−12抗体をコードしている本発明の核酸分子は、本明細書に記述されるか、または当該技術分野において既知である方法を用いて得ることができる。
体、フラグメントもしくは部分、ならびに前記さらなるコーディング配列、例えば少なくとも1つのイントロンを含んでも含まなくても、限定されるものではないが、非コーディング5’および3’配列、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル(例えば−mRNAのリボソーム結合と安定化)を含む、転写、mRNAプロセッシングにおいて役割を演じる転写されるが、翻訳されない配列を含む、さらなる非コーディング配列とともに、少なくとも1つのシグナルリーダーもしくは融合ペプチドのコーディング配列のようなさらなる配列のコーディング配列;さらなるアミノ酸配列、例えばさらなる機能を提供するアミノ酸配列をコードしているさらなるコーディング配列を包含してもよい。かくして、抗体をコードしている配列は、マーカー配列、例えば抗体フラグメントもしくは部分を含有する融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードしている配列、に融合されてもよい。
本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対して選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離された核酸を提供する。かくして、本実施態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含んでなる核酸を単離、検出および/または定量するために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託ライブラリー中の部分的または全長クローンを、同定、単離または増幅するために使用されてもよい。ある実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトもしくは哺乳類の核酸ライブラリーから単離されたゲノムもしくはcDNA配列であるか、またはライブラリーからのcDNAに相補的である。
本発明の単離された核酸は、当該技術分野で周知のように、(a)組み換え法、(b)合成技術、(c)精製技術、またはそれらの組み合わせを用いて作成することができる。
ってもよい。
本発明の単離した核酸組成物、例えばRNA、cDNA、ゲノムDNAまたはそのすべての組み合わせ物は、当業者には既知のあらゆる数のクローニング法を用いて生物起源から得ることができる。ある実施態様では、本発明のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、cDNAもしくはゲノムDNAライブラリー中の所望の配列を同定するために使用される。RNAの単離、およびcDNAおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者には周知である。(参照、例えば、Ausubel,前出;またはSambrook,前出)
cDNAまたはゲノムライブラリーは、本明細書に開示されるような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブは、ゲノムDNAもしくはcDNA配列にハイブリダイズさせて同じか異なる生物体中の相同遺伝子を単離するために使用できる。当業者は、ハイブリダイゼーションの種々の度合いのストリンジェンシーがアッセイにおいて使用でき;そしてハイブリダイゼーションまたは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントでもよいことを理解できる。ハイブリダイゼーションの条件がよりストリンジェントになるにつれて、生じる二重らせん形成のためには、プローブと標的間の相補性の程度がより大きくならねばならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、pH、およびホルムアミドのような部分変性溶媒の存在の1つ以上によって調節することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、便利には、例えば、範囲0%〜50%内のホルムアミド濃度の操作を介して反応物溶液の極性を変化させることによって変えられる。検出しうる結合に必要な相補性(配列同一性)の程度は、ハイブリダイゼーション媒質および/または洗浄媒質のストリンジェンシーにより変えられる。相補性の程度は、場合によっては、100%、または70−100%、またはそこでのすべての範囲もしくは値であってもよい。しかしながら、プローブおよびプライマーにおける小さい配列改変は、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄媒質のストリンジェンシーを低下させることによって補償できることを理解すべきである。
8号;Silverに対する同第4,994,370号;Biswasに対する同第4,766,067号;Ringoldに対する同第4,656,134号)、および二本鎖DNA合成のための鋳型としての標的配列に対してアンチセンスRNAを使用するRNA媒介増幅(商標名NASBAをもつ、Malekに対する米国特許第5,130,238号)を含み、これらの引用文献の全内容は引用によって本明細書に組み入れられている。(参照、例えば、Ausubel,前出;またはSambrook,前出)
また、本発明の単離した核酸は、既知の方法による直接化学合成によって作成できる(参照、例えば、Ausubel,et al.,前出)。化学合成は、一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成し、これが相補的配列とのハイブリダイゼーションによるか、または鋳型として一本鎖を使用するDNAポリメラーゼによる重合によって、二本鎖DNAに変換することができる。当業者は、DNAの化学合成が約100以上の塩基の配列に限定されるので、より長い配列は比較的短い配列の連結によって得られることを認識できる。
本発明は、さらに、本発明の核酸を含んでなる組み換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列、例えば本発明の抗体をコードしているcDNAもしくはゲノム配列は、少なくとも1つの所望される宿主細胞中に導入できる組み換え発現カセットを構築するために使用できる。組み換え発現カセットは、典型的には、意図する宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を指示する転写開始調節配列に操作可能に結合された本発明のポリヌクレオチドを含有する。両異種および非異種(すなわち内因性)のプロモーターが、本発明の核酸の発現を導くために用いることができる。
また本発明は、本発明の単離した核酸を含んでいるベクター、組み換えベクターにより遺伝的に操作される宿主細胞、および当該技術分野において周知である組み換え技術によ
る少なくとも1つの抗IL−12抗体の生産に関する。参照、例えば、各々、引用によって本明細書に完全に組み入れられているSambrook,et al.,前出:Ausubel,et al.,前出。
特許第5,580,734号、同第5,641,670号、同第5,733,746号および同第5,733,761号において記述されるように、当該技術分野においては周知である。
抗IL−12抗体は、限定されるものではないが、タンパク質A精製、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法によって組み換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)もまた精製のために使用できる。参照、例えば、Colligan,Current Protocols in I
mmunology,またはCurrent Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,(1997−2001)、例えばChapters 1,4,6,8,9,10、各々、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
Science,前出,Chapters 12−14に記述されており、すべては、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
本発明の単離された抗体は、本明細書においてより完全に議論されている本発明のポリヌクレオチドのいすれか1つによってコードされている抗体、またはすべての単離されるか調製された抗体を含む。好ましくは、ヒト抗体もしくは抗原結合フラグメントはヒトIL−12を結合し、それによってタンパク質の少なくとも1つの生物活性を部分的もしくは実質的に中和する。少なくとも1つのIL−12タンパク質もしくはフラグメントの少なくとも1つの生物活性を部分的もしくは好ましくは実質的に中和する抗体、または特定部分もしくはその改変体は、タンパク質もしくはフラグメントを結合し、それによって、IL−12受容体へのIL−12の結合を介してか、または他のIL−12依存性もしくは介在メカニズムを介して媒介される活性を抑制する。本明細書で使用されるように、用語「中和抗体」は、IL−12に依存する活性を、アッセイに応じて約20−120%、好ましくは少なくとも約10,20,30,40,50,55,60,65,70,75,80,85,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100%またはそれ以上抑制できる抗体を指す。IL−12に依存する活性を抑制する抗IL−12抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記述され、そして/または当該技術分野において既知のように、少なくとも1つの適当なIL−12タンパク質もしくは受容体アッセイによって調査される。本発明のヒト抗体は、いずれかのクラス(IgG,IgA,IgM,IgE,IgDなど)またはイソタイプに属し、そしてκもしくはλ軽鎖を含有してもよい。1つの実施態様では、ヒト抗体は、例えば、少なくとも1つのイソタイプ、IgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4におけるIgG重鎖もしくは特定フラグメントを含有する。このタイプの抗体は、本明細書に記述され、そして/または当該技術分野において既知のように、少なくとも1つのヒト軽鎖(例えば、IgG,IgAおよびIgM(例えば、γ1,γ2,γ3,γ4)トランスジーンを含んでなるトランスジェニックマウスもしくは他のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いることによって調製することができる。その他の実施態様では、抗ヒトIL−12ヒト抗体は、IgG1重鎖およびIgG1軽鎖を含有する。
実質的に同じであるアミノ酸配列は、同類アミノ酸置換、ならびにアミノ酸欠失および/または挿入を含んでなる配列を含む。同類アミノ酸置換は、第1のアミノ酸の性質に類似する化学的および/または物理的性質(例えば。電荷、構造、極性、疎水性、親水性)を有する第2のアミノ酸による第1のアミノ酸の置換を指す。同類置換は、次のグループ内
の1つのアミノ酸のその他による置換を含む:リジン(K)、アルギニン(R)およびヒスチジン(H);アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E);アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、チロシン(Y)、K,R,H,DおよびE;アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I),プロリン(P),フェニルアラニン(F),トリプトファン(W),メチオニン(M),システイン(C)およびグリシン(G);F,WおよびY;C,SおよびT。
本発明の抗IL−12抗体を形成するアミノ酸は、しばしば短縮される。アミノ酸の指定は、当該技術分野においてよく理解されているように、その単一の文字コード、その3文字コード、名称、または3ヌクレオチドコドンによってアミノ酸を指名することによって示すことができる(参照、Alberts,B.,et al.,Molecular
Biology of The Cell,Third Ed.,Garland Publishing,Inc.,New York,1994):
って同定することができる(例えば、Ausbel,前出,Chapters8,15,;Cunningham and Wells,Science 244:1081−1085(1989))。後者の操作は、分子中の残渣毎に単一のアラニン変異を導入する。得られる変異分子は、次に、生物学的活性、例えば限定されるものではないが、少なくとも1つのIL−12中和活性について試験される。また、抗体結合のために決定的である部位は、構造解析、例えば結晶化、核磁気共鳴もしくはフォトアフィニティーラベリングによって同定することもできる(Smith,et al.,J.Mol.Biol.224:899−904(1992)およびde Vos,et al.,Science 255:306−312(1992))。
性ポリマー基は、1〜約6個のアルキル、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル基により置換できる。脂肪酸もしくは脂肪酸エステル基により置換される親水性ポリマーは、適当な方法を用いて生成することができる。例えば、アミン基を含んでなるポリマーは、脂肪酸もしくは脂肪酸エステルのカルボキシレ−トに結合でき、そして脂肪酸もしくは脂肪酸エステルにおける活性化したカルボキシレ−ト(例えば、N,N,−カルボニルジイミダゾールにより活性化される)がポリマー上のヒドロキシル基に結合することができる。
キル基を含有するジカルボン酸のモノエステルを含む。低級アルキル基は、1〜約12、好ましくは1〜約6個の炭素原子を含有してもよい。
ンカー部分は、例えば、テトラエチレングリコール、−(CH2)3−,−NH−(CH2
)6−NH−,−(CH2)3−NH−および−CH2−O−CH2−CH2−O−CH2−C
H2−O−CH−NH−を含む。リンカー部分を含有する改変剤は、例えば、モノ−Bo
c−アルキルジアミン(例えばモノ−Boc−エチレンジアミン、モノ−Boc−ジアミノヘキサン)を1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と反応させて遊離アミノと脂肪酸カルボキシレートとの間にアミド結合を形成させることによって生成できる。Boc保護基は、前記その他のカルボキシレートに結合できる第1級アミンを露出させるためにトリフルオロ酢酸(TFA)との処理によって生成物から除去できるか、または無水マレイン酸と反応させ、そして得られる生成物を環化して脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成できる。(参照、例えば、Tompson,et al.,WO92/16221、この全ては引用によって本明細書に組み入れられている。)
を用いて作成されてもよい。
モノクローナルまたはキメラ抗IL−12抗体に加えて、本発明は、また、そのような本発明の抗体に特異的な抗イディオタイプ(抗Id)抗体に対向される。抗Id抗体は、一般にその他の抗体の抗原結合領域に関わる独特な決定基を認識する抗体である。抗Idは、Id抗体の起源と同じ種および遺伝子型の動物(例えばマウス株)を、抗体またはそのCDR含有領域により免疫化することによって作成できる。免疫化した動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、そして応答でき、そして抗Id抗体を産生する。また、抗Id抗体は、まだその他の動物において免疫応答を惹起する「免疫原」として使用されてもよく、そしていわゆる抗−抗Id抗体を産生する。
また本発明は、天然に存在しない組成物、混合物もしくは形態において提供される、本明細書に記述され、そして/または当該技術分野において既知であるように、それの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つまたはそれ以上の抗IL−12抗体を含んでなる少なくとも1つの抗IL−12抗体組成物を提供する。そのような組成物は、配列番号:1,2,3,4,5,6,7もしくは8の隣接するアミノ酸の70−100%からなる群から選ばれる抗IL−12抗体アミノ酸配列、またはその特定フラグメント、ドメインもしくは改変体の、少なくとも1つもしくは2つの全長、C−および/またはN末端の欠落した改変体、ドメイン、フラグメントもしくは特定改変体を含んでなる天然に存在しない組成物を含有する。好適な抗IL−12由来タンパク質、フラグメントもしくは改変体組成物は、配列番号:1,2,3,4,5,6の70−100%の抗IL−12抗体配列、またはその特定フラグメント、ドメインもしくは改変体の、少なくとも1つのCDR含有部分としての少なくとも1つもしくは2つの全長、フラグメント。ドメインもしくは改変体を含む。さらなる好適な組成物は、配列番号:1,2,3,4,5,6の70−100%、または特定フラグメント、ドメインもしくはその改変体の、少なくとも1つの40−99%を含有する。そのような組成物のパーセンテージは、当該技術分野において既知であり、そして/または本明細書に記述されるように、重量、容量、濃度、質量モル濃度、または液体もしくは乾物溶液、混合液、懸濁液、乳濁液もしくはコロイドとしての質量モル濃度による。
ュレーター、散瞳薬、毛様筋麻酔薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経興奮薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼα(プルモザイム)、サイトカインもしくはサイトカインアンタゴニストから選ばれる少なくとも1つを含有することができる。そのようなサイトカインの非限定例は、限定されるものではないが、IL−1〜IL−23のいずれをも含む。適当な用量は当該技術分野において周知である。参照、例えば、Wells et al.,eds.,Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition,Appleton and Lange,Stamford,CT(200);PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia
2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)、これらの各々は引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
sonnei))、サルモネラ種(例えば、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・コレラ−スイス(Salmonella cholera−suis)、サルモネラ・エンテリチヂス(Salmonella enteritidis))、クロストリジウム種(例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ジフィシレ(Clostridium dificile)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum))、カンフロバクター種(例えば、カンフロバクター・ジェジュニ(Camphlobacter jejuni)、カンフロバクター・フェタス(Camphlobacter fetus))、ヘリオバクター種(例えば、ヘリオバクター・ピロリ(Heliobacter pylori))、エアロモナス種(例えば、エアロモナス・ソブリア(Aeromonas sobria)、エアロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、エアロモナス・カビアエ(Aeromonas caviae))、プレイソモナス・シゲロイデス(P
leisomonas shigelloides),イエルジナ・エンテロコリチカ(Yersina enterocolitica)、ビブリオ種(例えば、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリチカス(Vibrio parahemolyticus)、クレブジーラ(Klebsiella)種、シュードモナス・エルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、および連鎖球菌(Streptococci)の菌株を含む。参照、例えば、Stein,ed.,INTERNAL MEDICINE,3rd ed.,pp1−13,Little,Brown and Co.,Boston,(1990);Evans et al.,eds.,Bacterial Infections of Humans:Epidemiology and Control,2d.Ed.,pp239−254,Plenum Medical Book Co.,New York(1991);Mandell et al.,Principles and Ptactice of Infectious Diseases,3d.Ed.,Churchill Livingstone,New York(1990);Berkow et al,eds.,THe Merck Mannual,16th edition,Merck
and Co.,Rahway,N.J.,1992;Wood et al.,FEMS Microbiology Immunology,76:121−134(1991);Marrack et al.,Science,248:705−711(1990)、これらの引用文献の内容は、引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
のために好適な炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
先に指摘したように、本発明は、安定な製剤を提供するが、これは、製薬的に許容しうる製剤中に少なくとも1つの抗IL−12抗体を含んでなる、好ましくは、食塩水もしくは選ばれた塩を含むリン酸バッファー、ならびに医薬もしくは獣医薬用途のために適当な保存剤ならびに多用途保存製剤を含有する保存溶液および製剤である。保存製剤は、水性希釈剤中、少なくとも1つの既知であるか、または場合によっては、少なくとも1つのフェノール、m−クレゾール、p−クレゾール、o−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば6水和物)、アルキルパラベン(メチル、エチル、プロピル、ブチルなど)、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはそれらの混合物から選ばれる保存剤を含有する。当該技術分野において既知であるように、0.001−5%またはその中のすべての範囲もしくは値、例えば限定されるものではないが、0.001,0.003,0.005,0.009,0.01,0.02.0.03,0.05,0.09,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.3,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9またはその中のすべての範囲もしくは値のような、いかなる適当な濃度または混合液も使用することができる。非限定の例は、保存剤無添加、0.1−2%m−クレゾール(例えば、0.2,0.3,0.4,0.5,0.9,1.0%)、0.1−3%ベンジルアルコール(例えば、0.5,0.9,1.1,1.5
,1.9,2.0,2.5%)、0.001−0.5%チメロサール(例えば、0.005,0.01)、0.001−2.0%フェノール(例えば、0.05,0.25,0.28,0.5,0.9,1.0%)、0.0005−1.0%アルキルパラベン(例えば、0.00075,0.0009,0.001,0.002,0.005,0.0075,0.009,0.01,0.02,0.05,0.075,0.09,0.1,0.2,0.3,0.5,0.75,0.9,1.0%)などを含む。
およびPEG(ポリエチレングリコール)または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート20もしくは80またはポロキサマー184もしくは188、PluronicR
polyls、他のブロックコポリマーのような製薬的に許容しうる可溶化剤、およびEDTAおよびEGTAのようなキレーターが、場合によっては凝集を低下させるために製剤または組成物に添加されてもよい。これらの添加物は、ポンプもしくはプラスチック容器が製剤を投与するために使用される場合には、特に有用である。製薬的に許容しうる界面活性剤の存在は、タンパク質の凝集する傾向を軽減する。
は再構成を要する2本のバイアルであっても、いずれも複数回反復使用することができ、そして1回もしくは複数回の患者の治療周期のために満足させることができ、かくして、現在得られるよりも一層便利な治療処方を提供できる。
umajectR,NovoPenR,B−DR Pen,AutoPenR,およびOpt
iPenR,GenotropinPenR,HumatroPenR,Reco−PenR,Roferon BiojectorR,ijecR,J−tip Needle−Free InjectorR,IntrajectR,Medi−jectRを含み、例えば
Becton Dickensen(Franklin Lakes,NJ,www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf,Switzerland,www.disetronic.com;Bioject,Portland,Oregon(www.bioject.com);National
Medical Products,Weston Medical(Peterborough,UK,www.weston−medical.com),Medi−Ject Corp(Mineapolis,MN,www.mediject.com)によって作成されるかまたは開発されている。2本のバイアル系を含有する認知された用具は、再構成溶液を送達するためにカートリッジ中の凍結乾燥薬物を再構成するためのこれらのペンインジェクター系、例えばHumatroPenRを含む。
中に保存剤もしくはバッファーおよび賦形剤を含有する第2のバイアルを用いて再構成される凍結乾燥した少なくとも1つの抗IL−12抗体のバイアルを含む2本のバイアルとして、患者に提供することができる。単一溶液であっても再構成を要する2本のバイアルであっても、いずれも複数回反復使用することができ、そして1回もしくは複数回の患者の治療周期のために満足させることができ、かくして、現在得られるよりも一層便利な治療処方を提供できる。
また、本発明は、細胞、組織、臓器、動物もしくは患者における、下記の疾病を含む少なくとも1つの免疫関連疾患を緩和もしくは治療する方法を提供する:限定されるものではないが、少なくとも1つの、リウマチ様関節炎、若年性リウマチ様関節炎、全身性初期若年性リウマチ様関節炎、乾癬関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清陰性関節症、骨関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全真性紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎/葡萄膜炎/視神経炎、自然発生性肺繊維症、全身性脈管炎/ヴェグナー肉芽腫症、類肉腫症、睾丸炎/精管切断再生法、アレルギー性/アトピー性疾患、喘息、アトピー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、感覚過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶、移植片対宿主拒絶、全身性炎症性応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、好中球減少症熱、尿性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷/出血、火傷、電離線曝露、急性膵炎、成人呼吸困難症候群、類リウマチ関節炎、アルコール誘導性肝炎、慢性炎症病、類肉腫症、クローン氏病、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー疾患、感覚過敏反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、多年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、すべての臓器もしくは組織の移植拒絶、腎移植拒絶、心臓移植拒絶、肝移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植(BMT)拒絶、皮膚同種移植拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、副甲状腺移植拒絶、すべての臓器もしくは組織の異種移植拒絶、同種移植拒絶、抗受容体感覚過敏反応、グレーブス病、レイノー病、B型インシュリン耐性糖尿病、喘息、重症性筋無力症、抗体媒介細胞障害、III型感覚過敏反応、全身性紅斑性狼瘡、POEMS症候群(多発神経病、オルガノメガリー、内分泌病、モノクローナルガンモパシー、および皮膚交換症候群)、多発神経病、オルガノメガリー、内分泌病、モノクローナルガンモパシー、皮膚交換症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織疾患、自然発生性アジソン病、真性糖尿病、慢性活性肝炎、原発胆汁性肝硬変、白斑、脈管炎、MI心臓切開後症候群、IV型感覚過敏、接触性皮膚炎、感覚過敏性肺炎、同種移植拒絶、細胞内生物による肉芽種、薬物敏感性、代謝性/自然発生性疾患、ウィルソン病、血色素症、α−1−アンチトリプシン欠損、糖尿性網膜症、ハシモト甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性繊維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、家族性食血細胞性リンパ組織球症、皮膚科学症状、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、ネフローゼ、糸球体性ネフローゼ、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、okt3療法、抗cd3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法(例えば、限定されるものではないが、無力症、尿毒症、悪液質などを含む)、慢性サリチル酸中毒および類するもの。参照、例えば、the Merck Mannual,12th−17th Editions,Merck & Company,Rahway,NJ(1972,1977,1982,1987,1992,1999),Pharmacotherapy Handbook,Wells et
al.,eds.,Second Edition,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(1998,2000)、各々、引用によって完全に組み入れられている。
同時に、および/または後に、少なくとも1つのTNFアンタゴニスト(例えば、限定されるものではないが、TNF抗体もしくはフラグメント、可溶性TNF受容体もしくはフラグメント、その融合タンパク質、または低分子TNFアンタゴニスト)、抗リウマチ薬、(例えば、メトトレキセート、アウラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、チオマレイン酸金ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン)、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局部麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤(例えば、アミノグリコシド、抗カビ剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオルキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルフォンアミド、テトラサイクリン、その他の抗微生物剤)、抗乾癬薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、鎮吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝血薬、エリトロポイエチン(例えば、エポエチンα)、フィルグラスチン(例えば、G−CSF、ノイポゲン)、サルグラモスチン(GM−CSF、ロイキン)、免疫感作薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤(例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ)、成長ホルモン、ホルモン代用薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋麻酔薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経興奮薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼα(プルモザイム)、サイトカインもしくはサイトカインアンタゴニストから選ばれる少なくとも1つを
適当な用量は当該技術分野において周知である。参照、例えば、Wells et al.,eds.,Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition,Appleton and Lange,Stamford,CT(200);PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,CA(2000)、これらの文献の各々は引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
RNA、DNAもしくはタンパク質合成、TNF放出、TNF受容体シグナリング、膜TNF切断、TNF活性、TNF生産および/または合成を低下、遮断、撤廃、干渉、妨害および/または抑制することができる。
et al.,国際特許公開WO91/02078(1991年2月21日提出);Rubin et al.,EPO特許公開第0 218 868号(1987年4月22日提出);Yone et al.,EPO特許公開第0 288 088号(1988年10月26日提出);Liang et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.137:847854(1986);Meager et al.,Hybridoma 6:305−311(1987);Fendly et al.,Hybridoma 6:359−369(1987);Bringman,et al
.,Hybridoma 6:489−507(1987);およびHirai,et al.,J.Immunol.Meth.96:57−62(1987)、これらの参考文献は、引用によって本明細書に完全に組み入れられている)。
本発明において有用な好適なTNF受容体分子は、高親和性によりTNFを結合し(参照、例えば、Feldman et al.,国際特許公開WO92/07076(1992年4月30日公開);Schall et al.,Cell 61:361−370(1990);およびLoetscher et al.,Cell 61:351−359(1990)、これらの参考文献は、引用によって本明細書に完全に組み入れられている)、そして場合によっては低い免疫原性を保持する受容体分子である。特に、55kDa(p55TNF−R)および75kDa(p75TNF−R)TNF細胞表面受容体は本発明において有用である。受容体もしくはその機能性部分の細胞外ドメイン(ECD)を含有するこれらの受容体の末端切断型(参照、例えば、Corcoran et al.,Eur.J.Biochem.223:831−840(1994))もまた本発明において有用である。ECDを含有するTNF受容体の末端切断型は、30kDaおよび40kDaTNF抑制性結合タンパク質として尿および血清中に検出されている(Engelmann,H.et al.,J.Biol.Chem.265:1531−1536(1990))。TNF受容体多量体分子およびTNFイムノレセプター融合分子、およびその誘導体およびフラグメントもしくは部分は、本発明の方法および組成物において有用であるTNF受容体分子のさらなる例である。本発明において使用できるTNF受容体分子は、症候の優れた緩和と低い毒性について良好である、長期間の患者の治療能力を特徴とする。低い免疫原性および/または高親和性、ならびに他の未特定の性質が、達成される治療成績に貢献できる。
al.,Cytokine 6(6):616−623(1994);Baker et al.,Eur.J.Immunol.24:2040−2048(1994);Beutler et al.,米国特許第5,447,851号および米国特許出願第08/442,133号(1995年5月16日提出)、これらの参考文献の各々は引用によって本明細書に完全に組み入れられている)。また、イムノレセプター融合分子の生産
方法は、Capon et al.,米国特許第5,116,964号;Capon et al.,米国特許第5,225,538号;およびCapon et al.,Nature 337:525−531(1989)において見いだされ、これらの参考文献は引用によって本明細書に完全に組み入れられている
本発明のすべての方法は、そのような緩和、処置もしくは治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物もしくは患者に対して少なくとも1つの抗IL−12抗体を含んでなる組成物もしくは製薬組成物の有効量を投与することを含む、IL−12媒介疾患を治療する方法を含んでもよい。そのような方法は、場合によってはさらに、そのような免疫疾患を治療するための同時投与または組み合わせ療法を含んでもよく、この場合、該少なくとも1つの抗IL−12抗体、特定部分もしくはその改変体の投与は、さらに、少なくとも1つのTNFアンタゴニスト(例えば、限定されるものではないが、TNF抗体もしくはフラグメント、可溶性TNF受容体もしくはフラグメント、その融合タンパク質、または低分子TNFアンタゴニスト)、抗リウマチ薬、(例えば、メトトレキセート、アウラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、チオマレイン酸金ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン)、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局部麻酔薬、神経筋遮断薬、抗微生物剤(例えば、アミノグリコシド、抗カビ剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオルキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルフォンアミド、テトラサイクリン、その他の抗微生物剤)、抗乾癬薬、コルチコステロイド、タンパク同化ステロイド、糖尿病関連薬、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、鎮吐薬、抗潰瘍薬、緩下薬、抗凝血薬、エリトロポイエチン(例えば、エポエチンα)、フィルグラスチン(例えば、G−CSF、ノイポゲン)、サルグラモスチン(GM−CSF、ロイキン)、免疫感作薬、免疫グロブリン、免疫抑制剤(例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ)、成長ホルモン、ホルモン代用薬、エストロゲン受容体モジュレーター、散瞳薬、毛様筋麻酔薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂インヒビター、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安薬、催眠薬、交感神経興奮薬、刺激薬、ドネペジル、タクリン、喘
息薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエンインヒビター、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼα(プルモザイム)、サイトカインもしくはサイトカインアンタゴニストから選ばれる少なくとも1つを、前に、同時に、および/または後に、投与することを含む。
0,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,45,50,60,70,80,90もしくは100mg/kg/1日の、1回もしくは周期用量として、1,2,3.4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,もしくは40日目の少なくとも1日において、あるいは、その代わりにまたは追加的に、1,2,3.4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,もしくは52週目の少なくとも1週において、あるいは、その代わりにまたは追加的に、1,2,3.4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,もしくは20年目の少なくとも1年に、あるいはそのすべての組み合わせにおいて、単回、注入もしくは反復用量を用いて提供することができる。
多くの既知の、そして開発された方式が、本発明による少なくとも1つの抗IL−12抗体の製薬的に有効な量を投与するために、本発明にしたがって使用することができる。肺投与が次の記述において使用されるが、他の投与方式が適当な成績を有して本発明にしたがって使用できる。
非経口投与のための製剤は、共通の賦形剤として無菌水もしくは生理食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含有できる。注射のための水性もしくは油性懸濁剤は、既知の方法にしたがって、適当な乳化剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いることによって調製することができる。注射のための薬剤は、無毒の、非経口投与可能な希釈剤、例えば水溶液または溶媒中の無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁液であってもよい。使用できる媒質もしくは溶媒として
、水、リンゲル液、等張生理食塩水などが可能である;通常の溶媒もしくは懸濁用溶媒として、無菌の不揮発性油が使用できる。これらの目的のために、いかなる種類の不揮発性油および脂肪酸も使用でき、これらは、天然もしくは合成もしくは半合成の脂肪油もしくは脂肪酸;天然もしくは合成もしくは半合成のモノ−もしくはジ−もしくはトリグリセリドを含む。非経口投与は当該技術分野において既知であり、そして限定されるものではないが、慣用の注射手段、米国特許第5,851,198号に記述されるようなガス圧無針注射用具および米国特許第5,839,446号に記述されるような比較的大きいパーフォレーター用具を含み、これらの特許は引用によって本明細書に完全に組み入れられている。
さらに、本発明は、非経口的、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腹腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、丸薬、膣、肛門、頬、舌下、鼻内もしくは経皮手段による、少なくとも1つの抗IL−12抗体の投与に関する。少なくとも1つの抗IL−12抗体組成物は、特に液剤もしくは懸濁剤の形態において非経口(皮下、筋肉内もしくは静脈内)またはすべての他の投与での使用のために;特に半固形形態、例えば限定されるものではないが、クリーム剤および坐剤において膣もしくは肛門投与の使用のために;例えば限定されるものではないが、錠剤もしくはカプセル剤の形態において頬もしくは舌下投与のために;または鼻内的、例えば限定されるものではないが、散剤、鼻滴下剤もしくはエアゾル剤またはある種の薬剤の形態のために;または経皮的、例えば限定されるものではないが、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、懸濁剤、または皮膚構造を改変したり、経皮パッチにおける薬物濃度増加するための化学的促進剤、例えばジメチルスルホキシドを含有する(Junginger et al.,In”Drug Permeation Enhancement”;D.S.,Eds.,pp59−90(Marcel
Deckker,Inc.New York 1994,これは引用によって本明細書に完全に組み入れられている)か、または皮膚へのタンパク質およびペプチドを含有する製剤の適用を可能にする酸化剤を含有する(WO98/53847)、パッチ送達システム、または一過性移送経路、例えばエレクトロポレーションを作成するため、または皮膚をとおして荷電薬物の移動、例えばイオントホレシスを増加するための電場の適用、または超音波の適用、例えばソノホレシス(米国特許第4,309,989号および同第4,767,402号)(上記出版物および特許は引用によって本明細書に完全に組み入れられている)のための使用のために作成することができる。
肺投与では、好ましくは、少なくとも1つの抗IL−12抗体組成物は、肺もしくは洞の末端気道に到達するために有効な粒径において送達される。本発明によれば、少なくとも1つの抗IL−12抗体は、吸入による治療剤の投与のために当該技術分野において既知のすべての種々の吸入もしくは鼻用具によって送達できる。患者の洞空洞もしくは肺胞中にエアゾル化した製剤を蓄積することが可能なこれらの用具は、定量式用量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末生成器、噴霧器などを含む。抗体の肺もしくは鼻投与を導くのに適当な他の用具は、また当該技術分野において既知である。すべてのそのような用具は、エアゾルにおいて抗体の分配のための投与に適当な製剤を使用できる。そのようなエアゾル剤は、溶液(水性および非水性の両方)または固形粒子のいずれからなってもよい。定量式用量吸入器、例えばVentolinR定量式用量吸入器は、典型的には、噴射ガスを
使用し、そして呼吸の間の作動を必要とする(参照、例えば、WO94/16970,WO98/35888)。乾燥粉末吸入器、例えばTurbuhalerTM(Astra)、RotahalerR(Glaxo)、DiskusR(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therpeuticsにより市販される用量、お
よびSpinhalerR粉末吸入器(Fisons)は、混合粉末の胸の作動を使用する(米国特許第4668218号Astra、欧州特許第237507号Astra、WO97/25086Glaxo、WO94/22376Dura、米国特許第5458135号Inhale、WO94/06498Fisons、これらは引用により本明細書に完全に組み入れられている。ネブライザー、例えばAERxTMAradigm、UltraventRネブライザー(Mallinckrodt)およびAcornIIRネブライザー(Marquest Medical Products)(米国特許第5404871号Aradigm、WO97/22376)(上記引用文献は引用によって本明細書に完全に組み入れられている)は、液剤からエアゾルを作成するのに対して、定量式用量吸入器、乾燥粉末吸入器などは小粒子エアゾルを生成する。これらの特別な市販される吸入用具の例は、本発明の実施に適当な特別な用具の提示を意図し、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。好ましくは、少なくとも1つの抗IL−12抗体を含んでなる組成物は、乾燥粉末吸入器もしくは噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも1つの抗体を投与するための吸入用具のいくつかの望ましい特徴が存在する。例えば、吸入用具による送達は、有利には、信頼性があり、再現性があり、そして正確である。吸入用具は、場合によっては、良好な呼吸性のために、例えば約10μm未満、好ましくは約1−5μmの小さい乾燥粒子を送達してもよい。
IL−12抗体組成物タンパク質を含有する噴霧剤は、圧力下のノズルをとおして少なくとも1つの抗IL−12抗体の懸濁液もしくは溶液を噴出させることによって作成できる。ノズルサイズおよび配置、適用圧力、および液体フィード速度は、所望の出力および粒径を達成するように選択することができる。エレクトロスプレーは、例えば、毛管もしくはノズルフィードと結合させて電場によって作成できる。有利には、噴霧器によって送達される少なくとも1つの抗IL−12抗体組成物タンパク質の粒子は、粒径約10μm未満、好ましくは範囲約1μm〜約5μm、もっとも好ましくは約2μm〜約3μmを有する。
おいて既知のさらなる薬剤が製剤中に含有されてもよい。
抗体組成物タンパク質は、ネブライザー、例えばジェットネブライザーもしくは超音波ネブライザーによって投与することができる。典型的には、ジェットネブライザーでは、圧縮空気起源がオリフィスをとおして高速度の空気ジェットを作成するために使用される。気体がノズルを越えて拡散する際に、液体貯蔵器に結合された毛管をとおして抗体組成物タンパク質溶液を引き出す低圧域が生じる。毛管からの液流は、それがチューブを出る際に不安定なフィラメントおよび小滴にせん断され、エアゾルを生成する。配置、流速およびバッフル形式の範囲は、与えられるジェットネブライザーからの所望の性能特性を達成するように用いられる。超音波ネブライザーでは、高周波電気エネルギーが使用されて、圧電気変換器を用いて振動の機械エネルギーを生成する。このエネルギーが、直接か、またはカップリング液をとおして抗体組成物タンパク質に伝達され、抗体組成物タンパク質を含有するエアゾルを生じる。有利には、ネブライザーによって送達される抗体組成物タンパク質の粒子は、粒径約10μm未満、好ましくは範囲約1μm〜約5μm、もっとも好ましくは約2μm〜約3μmを有する。
定量式用量吸入器(MDI)では、噴射剤、少なくとも1つの抗IL−12抗体、およびいずれかの賦形剤もしくは他の添加物が、液化圧縮ガスを含有する混合液として缶中に含有されている。定量バルブの作動が、好ましくは、粒径約10μm未満、好ましくは範囲約1μm〜約5μm、もっとも好ましくは約2μm〜約3μmの粒子を含有するエアゾルとして混合液を放出する。所望のエアゾル粒径は、ジェット粉砕、スプレードライ、臨界点濃縮などを含む、当業者には既知の種々の方法によって作成される抗体組成物タンパク質の製剤を用いることによって得られる。好適な定量式用量吸入器は、3MもしくはGlaxoによって製造され、そしてハイドロフルオロカーボン噴射剤を用いる吸入器を含む。
て少なくとも1つの抗IL−12抗体を含有する微粉砕末を含有する。噴射剤は、この目的で使用されるすべての慣用の材料、例えばクロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、またはトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよび1,1,1,2−テトラフルオロエタン、HFA−134a(ハイドロフルオロアルカン−134a)、HFA−227(ハイドロフルオロアルカン−227)などを含む炭化水素であってもよい。好ましくは、噴射剤はハイドロフルオロカーボンである。界面活性剤は、化学的変性などに対して活性薬剤を保護するために、噴射剤中の懸濁液として少なくとも1つの抗IL−12抗体を安定化させるよう選択することができる。適当な界面活性剤は、ソルビタントリオレエート、大豆レシチン、オレイン酸などを含む。ある場合には、溶液エアゾルは、エタノールのような溶媒を用いるのが好適である。また、タンパク質のようなタンパク質製剤のための当該技術分野において既知のさらなる薬剤が製剤中に含まれてもよい。
経口用製剤は、腸壁の浸透性を人為的に増加するためのアジュバント(例えば、レゾルシノールおよび非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサデシルポリエチレンエーテル)の同時投与、ならびに酵素的分解を阻害するための酵素阻害剤(例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFF)およびトラシロール)の同時投与に頼る。経口投与のための固形用量剤形の活性成分化合物は、スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成高分子、およびグリセリドを含む、少なくとも1つの添加物とともに混合することができる。また、これらの用量剤形は、他の種類の添加物、例えば、不活性な希釈剤、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、パラベン、保存剤、例えばソルビン酸、アスコルビン酸、α−トコフェロール、抗酸化剤、例えばシステイン、崩壊剤、結合剤、粘稠剤、緩衝剤、甘味剤、芳香剤、着香剤などを含有してもよい。
粘膜表面をとおしての吸収のために、少なくとも1つの抗IL−12抗体を投与する組成物および方法は、多数のミクロン以下の粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチド、および水性連続相を含んでなる乳液を含み、これらは乳濁粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面をとおしての吸収を促進する(米国特許第5,514,670号)。本発明の乳剤の適用に適する粘膜表面は、角膜、結膜、頬、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸および肛門の投与経路を含む。膣もしくは肛門投与のための製剤、例えば坐剤は、賦形剤、例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、ココアバターなどを含有してもよい。鼻内投
与のための製剤は、固形であり、そして賦形剤、例えばラクトースを含有してもよく、または鼻滴下剤の水性もしくは油性溶液であってもよい。頬投与では、賦形剤は、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、pregelinatined澱粉などを含む(米国特許第5,849,695号)。
経皮投与のためには、少なくとも1つの抗IL−12抗体は、送達デバイス、例えばリポソームまたはナノ粒子、ミクロ粒子、ミクロカプセルもしくはミクロスフェア(別に言及しなければ一括してミクロ粒子と呼ばれる)中に被包化される。合成ポリマー、例えば、ポリヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸およびそのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリドおよびポリホスファゼン、および天然高分子、例えばコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミンおよび他のタンパク質、アルギン酸塩および他の多糖、およびそれらの組み合わせ物からなるミクロ粒子を含む、多くの適当なデバイスが知られている(米国特許第5,814,599号)。
本発明の化合物を被験者に長期間、例えば1回投与から1週〜1年の間送達することが、時には望ましいことがある。種々の徐放、デポもしくは植込み用量剤形が利用できる。例えば、用量剤形は、体液中で低い溶解度をもつ化合物の製薬的に許容しうる無毒の塩、例えば、(a)多塩基酸、例えばリン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ−もしくはジ−スルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの酸付加塩;(b)多価金属陽イオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなど、または例えばN,N’−ジベンジル−エチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩;または(c)(a)と(b)の組み合わせ物、例えばタンニン酸亜鉛塩を含有してもよい。さらに、本発明の化合物または好ましくは前記のような比較的難溶な塩は、注射のために適当な、例えばゴマ油とのゲル、例えばモノステアリン酸アルミニウムゲルにおいて製剤化されてもよい。特に好適な塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。注射のための徐放性デポ剤形のその他の種類は、徐々に崩壊する無毒の、非抗原性ポリマー、例えば米国特許第3,773,919号に記述されているようなポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマー中に被包化された、分散された化合物もしくは塩を含有できる。化合物または好ましくは前記のような比較的難溶な塩は、また、特に動物において使用するために、コレステロールマトリックスシラスティック(silastic)ペレットにおいて製剤化されてもよい。さらなる徐放、デポもしくは植込み製剤、例えば気体もしくは液体リポソームが文献において知られている(米国特許第5,770,222号および”Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”,J.R.Robinson ed.,Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,1978)。
遺伝子の増幅は十分に報告されている(参照、例えば、F.W.Alt,et al.,J.Biol.Chem.253:1357−1370(1978);J.L.Hamlin and C.Ma,Biochem.et Biophys.Acta 1097:107−143(1990);およびM.J.Page and M.A.Sydenham,Biotechnology 9:64−68(1991))。MTXの濃度を増加して増殖した細胞は、DHFR遺伝子の増殖の結果として、標的酵素を過剰に生産することによって薬物に対する耐性を発達する。第2の遺伝子がDHFR遺伝子に結合される場合、それは、通常、同時に増殖され、そして過剰発現される。このアプローチが増殖した遺伝子の1,000コピー以上を保持する細胞系を開発するために使用できることは当該技術分野においては周知である。その後、メトトレキセートが取り去られた場合、宿主細胞の1つ以上の染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞系が得られる。
HC/LCプラスミドにおいて与えられるように)において使用される。
ランスフェクションのために使用される。5gの発現プラスミドpC4が、0.5gのプラスミドpSV2−neoとともにリポフェクチンを用いてコ・トランスフェクションされる。プラスミドpSV2−neoは、有力な選択可能マーカー、G418を含む1群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードしているTn5由来のneo遺伝子を含有する。細胞は、G418 1g/mlを補足したalpha minus MEMに植えられる。2日後、細胞はトリプシン処理され、そしてメトトレキセート10,25もしくは50ng/ml+G418 1g/mlを補足したalpha minus MEMにおけるハイブリドーマクローニングプレート(Greiner,Germany)に植えられる。約10−14日後、単一クローンがトリプシン処理され、次いで、種々のメトトレキセート濃度(50nM,100nM,200nM,400nM,800nM)を用いて、6穴ペトリ皿もしくは10mlフラスコに植えられる。最高濃度のメトトレキセートにおいて増殖するクローンが、次に、さらに高い濃度のメトトレキセート(1mM,2mM,5mM,10mM,20mM)を含有する新しい6穴プレートに移植される。濃度100−200mMにおいて増殖するクローンが得られるまで、同じ操作が繰り返される。所望の遺伝子産物の発現は、例えば、SDS−PAGEおよびウエスタンブロットによるか、または逆相HPLC分析によって分析される。
トランスジェニックマウスを用いる、ヒトIL−12と反応性の高親和性ヒトIgGモノクローナル抗体の生成
概要
1つ以上のIL−12媒介疾患の治療のために、IL−12の作用を抑制するよう治療的に使用できる高親和性の、完全にヒトのモノクローナル抗体を生成するために、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスが使用された。両重鎖および軽鎖についてのヒト可変および定常部抗体トランスジーンを含有する(CBA/JxC57/BL6/J)F2ハイブリッドマウスが、ヒト組み換えIL−12によ
り免疫化される(Taylor et al.,Intl.Immunol.6:579−591(1993);Lonberg et al.,Nature 368:856−859(1994);Neuberger,M.,Nature Biotech.14:826(1996);Fishwild,et al.,Nature Biotechnology 14:845−851(1996))。数種の融合物が、完全にヒトのIL−12反応性IgGモノクローナル抗体の1つ以上のパネルを生成した。完全にヒトの抗IL−12抗体は、さらに特性決定される。すべてIgG1である。そのような抗体は、親和性定数約1x109〜9x1012を有することが分かった。これらの完全にヒ
トのモノクローナル抗体の予期しなかった高親和性は、それらをしてIL−12関連疾患、疾病もしくは障害における治療適用のための適当な候補にさせる。
BSA − ウシ血清アルブミン
CO2 − 二酸化炭素
DMSO − ジメチルスルホキシド
EIA − 酵素イムノアッセイ
FBS − 胎児ウシ血清
H2O2 − 過酸化水素
HRP − セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ
ID − 皮膚内
Ig − 免疫グロブリン
IL−12 − インターロイキン−12
IP − 腹腔内
IV − 静脈内
Mab − モノクローナル抗体
OD − 光学濃度
OPD − o−フェニレンジアミン二塩酸塩
PEG − ポリエチレングリコール
PSA − ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン
RT − 室温
SQ − 皮下
v/v − 容量/容量
w/v − 重量/容量
動物
ヒト抗体を発現できるトランスジェニックマウスは、当該技術分野において既知であり、市販されている(例えば、GenPharm International,San Jose,CA;Abgenix,Freemont,CA,から、そしてマウスIgMもしくはIgでないヒト免疫グロブリンを発現する他のもの)。例えば、そのようなトランスジェニックマウスは、V(D)J結合、重鎖クラススイッチおよび染色体変異を受けてヒト配列免疫グロブリンのレパートリーを生成するヒト配列トランスジーンを含有している(Lonberg et al.,Nature 368:856−859(1994))。軽鎖トランスジーンは、例えば、一部は、生殖系列ヒトV領域のほぼ半分を含む酵母の人工的染色体クローンから得られる。さらに、重鎖トランスジーンは、両ヒトμおよびヒト1(Fishwild,et al.,Nature Biotechnology 14:845−851(1996))および/または3定常部をコードできる。適当な遺伝子型系統由来のマウスは、免疫化および融合プロセスにおいて使用でき、IL−12に対する完全にヒトのモノクローナル抗体を生成する。
1回以上の免疫化スケジュールが使用されて、抗IL−12ヒトハイブリドーマを生成することができる。最初のいくつかの融合は、次に示す代表的免疫化プロトコールの後に実施できるが、他の類似の既知のプロトコールが使用されてもよい。数頭の14−20週齢のメスおよび/または外科的に去勢されたオスのマウスが、最終容量100−400μl(例えば200)中に等容量のTITERMAXもしくは完全Freundアジュバントとともに乳化された組み換えヒトIL−12の1−1000μgによりIPおよび/またはIDで免疫化される。また、各マウスは、場合によっては、各2SQ部位において生理的食塩水100μl中1−10μgを受けてもよい。次いで、マウスは、1−7,5−12,10−18,17−25および/または21−34日後に、等容量のTITERMAXもしくは不完全Freundアジュバントとともに乳化されたIL−12によりIP(1−400μg)およびSQ(1−400μgx2)で免疫化されてもよい。マウスは、12−25および25−40日後に、抗凝血剤なしに眼窩後穿刺によって採血される。次いで、血液は、RTで1時間凝固させられ、そして血清が回収され、そして既知の方法にしたがってIL−12 EIAアッセイを用いて滴定される。反復注射が力価の増加を惹起しない時点で融合が実施される。この時点で、マウスは、100μl生理的食塩水中に希釈されたIL−12 1−400μgの最終IVブースター注射を与えられる。3日後、マウスは、頸部脱臼によって安楽死され、そして脾臓が無菌的に採取され、そして100U/ml ペニシリン、 100μg/ml ストレプトマイシン、および0.25μg/ml アンホテリシンB(PSA)を含有する冷リン酸バッファー食塩水(PBS)10ml中に浸漬される。脾細胞は、PSA−PBSにより無菌的に脾臓を潅流することによって収穫される。細胞は、冷PSA−PBSにおいて1回洗浄され、トリパンブルー染料排除を用いてカウントされ、そして25mMHepesを含有するRPMI 1640培地に再懸濁される。
融合は、当該技術分野において既知である、既知の方法にしたがってマウス骨髄腫細胞対生存脾細胞の1:1〜1:10比において実施できる。非限定例として、脾細胞および骨髄腫細胞が一緒にペレット化される。次いで、ペレットが、37℃において50%(w/v)PEG/PBS溶液(PEG分子量1,450、Sigma)1ml中に30秒かけて徐々に再懸濁される。次いで、融合は、25mMHepesを含有するRPMI 1640培地(37℃)10.5mlを1分かけて徐々に添加することによって停止される。融合された細胞は500−1500rpmで5分間遠心される。次いで、細胞は、HAT培地(25mMHepes、10%胎児クローンI血清(Hyclone),1mMピルビン酸ナトリウム、4mML−グルタミン、10μg/mlゲンタマイシン、2.5%Origen培養補足剤(Fisher)、10%653−順化RPMI 1640/Hepes培地、50μM2−メルカプトエタノール、100μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよび16μMチミジンを含有するRPMI 1640培地)に再懸濁され、次いで、15個の96穴平底組織培養プレートにおいて200μl/ウェルでプレーティングされる。プレートは、次に、5%CO2および95%空気を含有する加湿さ
れた37℃培養器中に7−10日間置かれる。
固相EIAは、ヒトIL−12に特異的なヒトIgG抗体についてマウス血清をスクリーニングするために使用できる。簡単に言えば、プレートがPBS中で一夜2μg/mlにおいてIL−12によりコーティングされる。0.02%(v/v)Tween20を含有する0.15M生理食塩水中で洗浄後、ウェルは、PBS中1%(w/v)BSA200μl/ウェルによりRTで1時間ブロックされる。プレートは直ちに使用されるか、または将来の使用のために−20℃において凍結される。マウス血清希釈液は、IL−12コーティングされたプレートにおいてRTで1時間50μl/mlにおいてインキュベートされる。プレートは洗浄され、次いで、1%BSA−PBS中1:30,000に希釈された特異的な、HRP標識されたヤギ抗ヒトIgG Fc50μl/mlによりRTで1時間プローブされる。プレートは再び洗浄され、そしてクエン酸−リン酸基質溶液(0.1Mクエン酸および0.2Mリン酸ナトリウム、0.01%H2O2およびOPD1mg/ml)100μl/ウェルがRTで15分間添加される。次いで、停止溶液(4N硫酸)が25μl/ウェルにおいて添加され、そしてODが、自動プレート分光光度計により490nmにおいて読み取られる。
完全にヒトの免疫グロブリンを分泌する増殖ポジティブなハイブリドーマが適当なEIAを用いて検出できる。簡単に言えば、96穴ポップ・アウトプレート(VWR,610744)が、炭酸ナトリウムバッファー中ヤギ抗ヒトIgG Fc 10μl/mlにより4℃で一夜コーティングされる。プレートは洗浄され、そして1%BSA−PBSにより37℃で1時間ブロックされ、そして直ちに使用されるか、または−20℃で凍結される。未希釈のハイブリドーマ上澄液はプレート上で1時間37℃でインキュベートされる。プレートは洗浄され、そして1%BSA−PBS中1:10,000に希釈されたHRP標識されたヤギ抗ヒトκにより37℃で1時間プローブされる。次いで、プレートは前記基質溶液とインキュベートされる。
前記ハイブリドーマが、適当なRIAもしくは他のアッセイを用いてIL−12に対する反応性について同時にアッセイされる。例えば、上澄液が前記ヤギ抗ヒトIgG Fcプレート上でインキュベートされ、洗浄され、次いで、ウェル当たり適当なカウントをもつ放射能標識IL−12でRTで1時間プローブされる。ウェルはPBSで2回洗浄され
、そして結合した放射能標識IL−12は適当なカウンターを用いて定量される。
抗体のイソタイプ決定は、比力価についてマウス免疫血清をスクリーニングするために使用されたものと同じ形式でEIAを用いて実施できる。IL−12が、前記96穴プレート上にコーティングされ、そして2μg/mlにおける精製抗体が、RTで1時間プレート上でインキュベートされる。プレートは洗浄され、そして1%BSA−PBS中1:4000に希釈されたHRP標識されたヤギ抗ヒトIgG1もしくはHRP標識されたヤ
ギ抗ヒトIgG3によってRTで1時間プローブされる。プレートは再び洗浄され、そし
て前記基質溶液とインキュベートされる。
抗体の結合特性は、例えば、IL−12捕捉EIAおよびBIAcore技術を用いて適当に調査できる。段階濃度の精製ヒトIL−12抗体は、前記アッセイにおけるIL−12 2μg/mlでコーティングされたEIAプレートへの結合について調査される。次いで、ODが相対結合効率を示す半対数プロットとして提示できる。
,sec-1)および会合(ka,mol-1sec-1)のために実施され、そして解離定数(kD,mol)が計算される(Kd/Ka)。抗体親和性が、捕捉された抗体のRUが>
100であるように十分に高い場合、抗体のさらなる希釈液が流される。
抗ヒトIL−12モノクローナル抗体の生成
数回の融合が遂行され、そして各融合物が、15プレートに接種され(1440ウェル/融合物)、これがヒトIL−12に特異的な数ダースの抗体を生成する。これらの中で、若干のものは、ヒトおよびマウスIg鎖の組み合わせ物からなることが見いだされる。残りのハイブリドーマは、ヒト重鎖および軽鎖のみからなる抗ヒトIL−12抗体を分泌する。ヒトハイブリドーマのすべてがIgG1であることが期待される。
ELISA解析は、これらのハイブリドーマのほとんどまたは全部が濃度依存様式でIL−12を結合することを確認する。図1−2は、これらの抗体の相対結合効率の結果を示す。この場合、その同族体抗原(エピトープ)に対する抗体の結合力が測定される。EIAプレートへ直接IL−12を結合させることはタンパク質の変性を惹起し、そして見掛けの結合親和性が未変性タンパク質への結合を反映とはならないことを注意すべきである。50%結合は濃度範囲を越えて見いだされる。
いくつかの融合が、ヒトIL−12で免疫化されるヒト可変部および定常部抗体トランスジーンを含有するハイブリッドマウス由来の脾細胞を利用して行われる。IgG1イソタイプのいくつかの完全にヒトのIL−12反応性IgGモノクローナル抗体の1組が生成される。さらに、完全にヒト抗IL−12抗体は特性決定される。生成抗体のいくつかは、1x109〜7x1012の親和性定数を有する。これらの完全にヒトモノクローナル
抗体の予期せぬ高い親和性は、それらを、IL−12依存性疾患、疾病もしくは関連症状における治療適用のために適するものにさせる。
C340は中和性ヒトモノクローナル抗体である
IL−12の生物活性は、種々のIL−12依存活性のアッセイにおいてC340によって中和されることが示された。IL−12は、NK細胞およびTリンパ球によるIFNγ産生を増進するので、IFNγmRNAの上方調節に及ぼすC340抗体の影響およびIFNγタンパク質の産生に及ぼすC340の影響が試験された(Trinchieri,G.,Current Opinion in Immunology,9:17−23(1997),Morris,S.C.et al.,Journal of Immunology,152:1047−1056(1994))。また、リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞活性のIL−12推進誘発を中和するC340の能力がこれらの研究において研究された(Kutza,J.and Murasko,D.M.,Mechnisms of Ageing and Development,90:209−222(1996)、Stern,A.S.,et al.,Proceedings of the National Academy of Science of the U.S.A.,87:6808−6812(1990))。最後に、TおよびNK細胞におけるCD95細胞表面発現のIL−12媒介上方調節に及ぼすC340の影響が試験された(Medvedev,A.E.,et al.,Cytokine,9:394
−404(1997))。
C340がヒトPBLにおいてIL−12 IL−2誘導IFNγ遺伝子転写を抑制するか否かを決定するために、逆転写−PCRアッセイが行われた。β−アクチン(mRNAの完全性および含有量に対する制御)およびIFNγの特異的プライマーが使用されて、刺激されたヒトPBLから得られるcDNAを増幅した。図3は、C340がIL−12/IL−2活性化(2時間)PBMCにおいてIFNγmRNAを下方調節することを示す。
種々のシグナルに対する応答において、そして活性化の測定として、T細胞およびNK細胞はサイトカインを分泌するために誘発される。より具体的には、IL−2およびIL−12で処理されたPBLは、刺激後4−8時間内にIFNγの合成を実質的に開始する。この生産は、フローサイトメトリーによってBrefeldin−A処理PBLの細胞質において検出できる。図4は、C340IL−12がIL−12と一緒に5時間添加された場合、そのような培養においてIFNγ生産の60%低下を例証している。
図5は、明らかに、C340の2つの異なるロットが、用量依存様式で末梢血リンパ球によるIFNγの分泌を抑制することを示している。IL−12の400pgがC340の変化する量とともに前混合され、次いで、PBLのIL−2刺激された培養物に添加された。IFNγは18−24時間後EIAによって測定され、顕著に減少したIFNγ量がC340抗体1?g/mlと同じくらい少量検出された。
Raji細胞、IL−12感受性バーキットリンパ腫由来細胞系は、NK細胞耐性、LAK細胞感受性の細胞系である。Raji細胞は、3並列で、ヒトモノクローナル抗体C340(5000ng/mlもしくは50ng/ml)の存在もしくは不在下で、IL−12 400pg/mlおよびIL−2 10U/mlにより活性化されたLAK細胞とともに4時間培養された。図6は、3人の正常、健康なドナーからの結果を示す。エフェクター細胞のIL−12+IL−2活性化は、IL−2のみで活性化された細胞を超える細胞障害活性の増大をもたらした。C340抗体はこのIL−12依存性効果を抑制した。抑制の大きさは抗体濃度に関係し、試験された最高濃度では細胞障害をバックグラウンドレベルまで低下させた。
報告では、高度に精製されたCD56+PBLの表面におけるCD95のIL−12誘発上方調節が記述されている。図7Aおよび7Bに示されるように、分配型フローサイトメトリー分析は、CD95発現が、IL−12+IL−2による72時間の処理後、CD3+T細胞およびCD56+NK細胞において有意に上方調節されることを明らかにした。共存する抗IL−12処理は、両CD3+およびCD56+集団においてCD95発現を抑制した。減少されたMFIインデックス(未刺激対照を超えるパーセント)によって証明されるように、CD3+細胞は〜50%抑制(図7A)され、一方CD56+細胞は〜85%抑制(図7B)された。
遺伝子クローニングおよび特性決定
C340重鎖遺伝子もしくはC340軽鎖のいずれかを含有するゲノムDNAフラグメントがクローン化され、そして精製された。C340ハイブリドーマ細胞から精製された
ゲノムDNAは、Sau3A制限酵素により部分消化され、そして10−40%スクロース勾配をとおしての遠心分画によってサイズ選別された。サイズ範囲15−23kbのDNAフラグメントがバクテリオファージベクター、EMBL3[市販?]中にクローン化され、そしてファージ粒子中にパッケージされた。数回のパッケージング反応が、100万のバクテリオファージクローンのライブラリーをもたらした。ライブラリーからの約600,000クローンが、プローブとしてヒトIgG1重鎖定常部配列もしくはヒトκ軽鎖定常部配列のいずれかを含有する32P標識ゲノムDNAフラグメントを用いて、プラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。13の重鎖および9の軽鎖クローンが検出された。これらの内、3重鎖クローンおよび4軽鎖クローンが、2回のさらなるスクリーニングによって精製された。重鎖クローンの1つおよび軽鎖クローンの2つは、バクテリオファージDNAのPCR解析によってコーディング配列の5’および3’末端を含有することが示された。重鎖(HC)クローンH4におけるDNAインサートは、サイズ16kbであり、そして5’フランキングの3.6kbおよび3’フランキング配列の少なくとも2kbを含んだ。軽鎖(LC)クローンLC1におけるDNAインサートは、サイズ15kbであり、そして5’フランキングの4.4kbおよび3’フランキング配列の6.0kbを含んだ。完全なインサートは、SalIフラグメントとしてバクテリオファージベクターから除去され、そしてgpt選択マーカー遺伝子を備えたプラスミド発現ベクターp1351のXhoIおよびSalI部位間にクローン化された。重鎖可変部コーディング配列中に内部SalI部位が存在するので、2つのSalIフラグメントは、バクテリオファージH4からp1351発現ベクターへ転移されねばなかった。得られる重鎖および軽鎖発現プラスミドは、それぞれp1560およびp1558と命名された。p1351ベクター配列に較べてこれら2つのプラスミドにおける重鎖および軽鎖遺伝子の配向が、それぞれ制限酵素解析およびPCRを用いて決定された。両方の場合、配向は、Ab遺伝子フラグメントの5’末端がgpt遺伝子の3’末端に近接しているような配向であった。クローン化遺伝子のコーディング領域の両鎖が配向決定された。プラスミドp1560およびp1558の配列が、それぞれ図11A−11Kおよび図13A−13Jに提示される。
組み換え細胞系の作成
重鎖プラスミドp1560がPvuI制限酵素による消化によって線状化され、そして軽鎖プラスミドp1558がSalI制限酵素を用いて線状化された。p3X63Ag8.653(653)およびSP2/0−Ag14(SP2/0)細胞が、エレクトロポレーションによって予め線状化したプラスミドにより別々にトランスフェクションされ、そして細胞が培養され、トランスフェクタントが記述されるようにミコフェノール酸を用いて選択された(Knight,et al.,Molcular Immunology
30:1443(1993))。ミコフェノール酸耐性コロニーからの細胞上澄液が、約2週間後、ヒトIgG(すなわち、組み換えC340(rC340))についてアッセイされた。このためには、細胞上澄液が、ヒトIgGのFc部分に特異的なヤギ抗体でコーティングされた96穴ELISAプレートにおいてインキュベートされた。コーティングされたプレートに結合するヒトIgGは、記述されているように、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトIgG(重鎖+軽鎖)抗体およびアルカリホスファターゼ基質を用いて検出された(Knight,et al.,Molcular Immunology
30:1443(1993))。より高い生産性クローンの細胞が、標準培地において24穴培養皿に移植され、そして拡大された(IMDM,5%FBS,2mMグルタミン,ミコフェノール酸選択混合液)。産生された(すなわち、培養後の培地中に分泌された)抗体量が、標準として精製C340mAbを用いるELISAによって注意深く定量された。選択されたクローンは、次いで、T75フラスコにおいて拡大され、そしてこれらのクローンによるヒトIgGの生産がELISAによって定量された。これらの値に基づいて、6種の独立した653トランスフェクタントと3種の独立したSP2/0トランス
フェクタントがサブクローン化され(96穴プレートにおいて1ウェル当たり平均1細胞を接種することによって)、サブクローンによって生産される抗体量は、個々のサブクローンコロニーからの上澄液をアッセイ(ELISA)することによって決定された。3種のサブクローン、653トランスフェクタント19−20(C379B)およびSP2/0トランスフェクタント84−81(C381A)および22−56(C389A)がさらなる分析によって選択された。
前記選択された細胞をサブクローニングする前に、3種の親系(653トランスフェクタントのクローン2とクローン18およびSP2/0トランスフェクタントクローン1)からの細胞上澄液が、rC340の抗原結合特性を試験するために使用された。3種の細胞上澄液サンプル中のrC340の濃度はELISAによってまず決定された。上澄液サンプルまたは精製されたC340ポジティブ対照の滴定量が、次に、ヒトIL−122μg/mlでコーティングされた96穴プレートにおいてインキュベートされた。次いで、結合したmAbが、アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトIgG(重鎖+軽鎖)抗体および適当なアルカリホスファターゼ基質を用いて検出された。図8に示されるように、rC340は、元のC340mAbと区別できない様式でヒトIL−12に特異的に結合した。
増殖曲線解析が、C379B、C381AおよびC389Aに関して、標準培地またはSFM−5血清不含培地において初発細胞密度2X105細胞/mlをT75フラスコに接種し、次いで、培養液が終了するまで毎日、細胞数およびrC340濃度を追跡することによって実施された。標準培地における培養結果は図9A−9Cに示される。C379B、C381AおよびC389Aの最高C340mAb生産レベルは、それぞれ135μg/ml、150μg/mlおよび110μg/mlであった。C379B細胞をSFM−5培地に適応させる試みは成功しなかった。C381A細胞は、標準培地におけると同様にSFM−5培地において同量のrC340を産生したが、C389A細胞は、標準培地における量の半分しかSFM−5培地においてrC340を産生しなかった。
する、1.記載のIL−12抗体。
(a)配列番号:7もしくは8を含有する少なくとも1つの可変部を有する少なくとも1つの単離された哺乳類抗IL−12抗体の有効量を含んでなる組成物を、該細胞、組織、臓器もしくは動物と接触させるかまたはそれに投与することを含む方法。
膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸内、子宮内、膀胱内、丸薬、膣、肛門、頬、舌下、鼻内もしくは経皮から選ばれる少なくとも1つの方式により実施される、12.記載の方法。
合する、21.記載のIL−12抗体。
(a)(i)配列番号:7,8および9の重鎖CDRアミノ酸配列のすべて;または(ii)配列番号:10,11および12の軽鎖CDRアミノ酸配列のすべて、のいずれかを有する少なくとも1つの単離された哺乳類抗IL−12抗体の有効量を含んでなる組成物を、該細胞、組織、臓器もしくは動物と接触させるかまたはそれに投与することを含む方法。
合する、41.記載のIL−12抗体。
(a)配列番号:1,2,3,4,5もしくは6の少なくとも1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳類抗IL−12抗体の有効量を含んでなる組成物を、該細胞、組織、臓器もしくは動物と接触させるかまたはそれに投与することを含む方法。
薬、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンもしくは類似体、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストから選ばれる少なくとも1つの化合物またはタンパク質の有効量を含んでなる少なくとも1つの組成物を、該(a)接触または投与の前、同時または後に、さらに投与することを含む、52.記載の方法。
合する、61.記載のIL−12抗体。
(a)配列番号:1,2,3,4,5もしくは6の少なくとも1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つの重鎖または軽鎖CDRを含んでなる抗体として、IL−12タンパク質の同じ領域に結合する少なくとも1つの単離された哺乳類抗IL−12抗体の有効量を含んでなる組成物を、該細胞、組織、臓器もしくは動物と接触させるかまたはそれに投与することを含む方法。
または後に、さらに投与することを含む、72.記載の方法。
合する、81.記載のIL−12抗体。
・ビトロ、イン・ビボもしくはイン・サイチューの条件下で84.記載の核酸を翻訳することを含む、少なくとも1つの抗IL−12抗体を生産する方法。
(a)該抗体が、配列番号:9の少なくとも1−3から全アミノ酸配列までを含む少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、少なくとも1つのヒトCDRを有する少なくとも1つの単離された哺乳類抗IL−12抗体の有効量を含んでなる組成物を、該細胞、組織、臓器もしくは動物と接触させるかまたはそれに投与することを含む方法。
Claims (2)
- アミノ酸配列が1又は2個の同類アミノ酸置換、アミノ酸欠失および/または挿入を有する、配列番号7に記載されたアミノ酸配列の重鎖可変部(VH)及び配列番号8に記載されたアミノ酸配列の軽鎖可変部(VL)を含んでなり、IL−12タンパク質の活性を中和する、単離された抗IL−12抗体であって、
該抗体が、少なくとも10-10 Mの親和性によりIL−12を結合する、上記抗IL−12抗体。 - アミノ酸配列が1又は2個の同類アミノ酸置換、アミノ酸欠失および/または挿入を有する、配列番号7に記載されたアミノ酸配列の重鎖可変部(VH)及び配列番号8に記載されたアミノ酸配列の軽鎖可変部(VL)を含んでなり、IL−12タンパク質の活性を中和する、単離された抗IL−12抗体であって、該抗体が、少なくとも10-10 Mの親和性によりIL−12を結合する、上記抗体、
および少なくとも1つの製薬的に許容しうるキャリヤーもしくは希釈剤、を含んでなる組成物。
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