HU228009B1 - Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses - Google Patents

Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses Download PDF

Info

Publication number
HU228009B1
HU228009B1 HU0302378A HUP0302378A HU228009B1 HU 228009 B1 HU228009 B1 HU 228009B1 HU 0302378 A HU0302378 A HU 0302378A HU P0302378 A HUP0302378 A HU P0302378A HU 228009 B1 HU228009 B1 HU 228009B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
human
antibodies
cells
cell
Prior art date
Application number
HU0302378A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill Giles-Komar
David M Knight
David Peritt
Bernard Scallon
David Shealy
Original Assignee
Centocor
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27397221&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU228009(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centocor filed Critical Centocor
Publication of HUP0302378A2 publication Critical patent/HUP0302378A2/hu
Publication of HU228009B1 publication Critical patent/HU228009B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P23/00—Anaesthetics
    • A61P23/02—Local anaesthetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

Ez a bejelentés részben a 2000. augusztus 7-én benyújtott, 60/223 358. számú, és a 2000. szeptember 29-én benyújtott, 60/236 827 számú amerikai egyesült államokbeli Ideiglenes bejelentésen alapút és azok elsőbbségét igényli, amelyek mindegyike teljes mértékben hivatkozás útján a kitanitás részét képezi.
A találmány tárgyát ellenanyagok képezik - beleértve specifikus részleteket és variánsokat - legalább egy interleukin-12 (IL-12) fehérje vagy annak íragmense ellen, valamint ilyen anti-IL-12 ellenanyagokat kódoló nukleinsavak, komplementer aokleinsavak, vektorok, gazdasejtek, és eljárások azok előállítására és alkalmazására, beleértve terápiás készítményeket, a beadásukat és eszközöket.
Az mterleukin-12 (IL-12) egy heterodírner citokin, amely diszulfid híddal összekötött, 35 és 40 kDa méretű glikozilált pohpeptldiáncokhói áh. A eltekint antígénprezenfáló sejtek, köztük deadrfes sejtek, moaociták, makrofágok, B-sejtefc, I,angerhans-sejek és keratinochák, valamint természetes ölősejtek (NK sejtek) szintetizálják és szekreíálják. Az IL-12 számos biológiai folyamatot közvetít, és úgy Is nevezték, hogy NK-sejt stimuláló faktor (NKSFj, Tsejt stimuláló faktor, citotoxikus T-íimfttcIta matorációs faktor és EB V-transzformált Bsejtvonal faktor [Curfs, és mtsai., Clirúeal Mlcrohiology Reviews, 10, 742-780 old.
(1997)).
Az interl.eukin.-I2 képes kötődni a sejtek (például T-sejtek, NK- sejtek.) plazmamembránján expresszálódó IL-l 2-recepíorhoz, és ezáltal megváltoztat (például iniciál megakadályoz) biológiai folyamatokat. Például az IL-12 kötődése IL-12-reeeptorhoz stimulálhatja előaktivált T-sejtefc és NK-sejtek proliferádöját, fokozhatja citotoxikus T-sejtek (CTL), /NK-sejíek és LAK (límfokin-aktiváit Ölő) sejtek citotoxikus aktivitását, indukálhatja gamma-interferon (ΙΡΝ-γ) T-sejtek általi és NK-sejtek általi termelését, és Indukálhatja naiv
ThO-sejtek Thl-sejtekké történő dilíérencíadóját, amelyek IFN-y-t és IL-12-1 termelnek [Trinehieri, ö,, Annual Keview of Immtmology, 13, 251-276·. old. (1995)j, Közelebbről az IL12 létfontosságú eitoliíikus sejtek (például NK-sejtek; CTL) létrehozásában, és sejtes Immunválasz (például Thl-sejtek által közvetített immunválasz) kialakításában,. Az IL-12 kritikus fontosságú mind a védő immunitás (például fertőzések megszönteíese), mind a patológiás Immunválaszok (például autói ntm unitás) kialakításában és szabályozásában [Hendrzak, I A. és Brunda, M. 1, Lafooratory Investigaíba 72, 619-Ö37. old. (1995)]. Ennek megfelelően egy immunválasz (például védő vagy patogén) fokozható, szuppresszálható vagy megelőzhető IL-12 biológiai aktivitásának in vwo, példá manipulálásával.
/ag útján történő
Nem-humán emlős, kiméra, pohklonális (például antiszérumok) és/vagy monoklonális ellenanyagok (Mabs) és fragmensek (például azok proteolitikns emésztési vagy fúziós fehérje termékei) potenciába terápiás ágensek, amelyeket tanulmányoznak bizonyos esetekben bizonyos betegségek kezelésének megpróbál ására. Azonban az ilyen ellenanyagok vagy fragmensek immunválaszt válthatnak ki, amikor beadják azokat embereknek. Az ilyen immunválasz az ellenanyagok vagy fragmensek immunkomplex által közvetített kiürítését eredményezheti a keringésből, és az ismétek beadást alkalmatlanná teheti terápiás célra, ezáltal csökkentve a páciensre gyakorolt jótékony terápiás hatást, és korlátozhatja az ellenanyag vagy fragmens újbóli beadását. Például nem humán részleteket tartalmazó ellenanyagok vagy fragmensek ismételt beadása szérumbetegséghez és/vagy túlérzékenységhez vezethet. Annak érdekében, hogy elkerüljük ezeket és más problémákat, számos megközelítési módot megkíséreltek, hogy csökkentsék az ilyen ellenanyagok és ezek részleteinek az írnrmmogemtását, beleértve a kimerizálást és humanizálást, amint az jól ismert a szakterületen. Ezek és más megközelítési módok azonban még mindig olyan ellenanyagokat vagy fragmenseket eredményezhetnek, amelyeknek még mindig van valamennyi immunogenítása, alacsony az affinitása, alacsony az avidítása, vagy problémásak sejttenyészetben, felnagyításban, gyártásban, és/vagy alacsony a kitermelésük. Ily módon az Ilyen ellenanyagok vagy fragmensek az ideálisnál kevésbé alkalmasak gyártásra vagy terápiás fehérjeként történő alkalmazásra.
Ennek megfelelően igény van olyan aníi~IL~12 ellenanyagok vagy fragmensek biztosítására, amelyek ezen problémák közül egyre vagy többre megoldást nyújtanak, valamint igény van az ismert ellenanyagok vagy azok fragmensei javítására.
A találmány tárgyát izolált humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált és/vagy CDR-grafroh anti-lL-12 ellenanyagok, immunglobulinok, hasítási termékek és azok más specifikus részletei és variánsai képezik, valamint antí-lL-12 ellenanyag-készítmények, kódoló vagy komplementer nukleínxavak., vektorok, gazdasejtek, készítmények, kiszerelések, eszközök, transzgenikus állatok, transzgenikus növények, és eljárások előáll hasára és alkalmazására, amint ezeket a leírásban leírjuk és feltárjuk, kombinálva mindazzal, ami ismert.
a szakterületen.
A találmány tárgyát képezi legalább egy izolált, találmány szerinti antÍ-lL-12 ellenanyag is. Találmány szerinti ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy pepíidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például * * « ♦ * φ φ * < * ♦ ♦»*» r* «« >»
- 3 sem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyülánc legalább' egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak Hgandumkötö részletét, nehéziáne vagy könnyülánc variábilis régióját, nehéziáne vagy könnyülánc állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletép amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyálból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy ezek bármilyen kombinációjából, és hasonlókból.
A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nokleinsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan specifikus anti-H..-12 ellenanyagokat kódoló polmukleoíidot, vagy komplementerek azzal vagy hibtidizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza.. A találmány tárgyát képezik továbbá az anti-ÍL-12 ellenanyag nukleinsav-moíekulákaí tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nnkleinsavafcaí és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen ellenanyag-nnkleissavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epiíópboz, amely specifikus legalább egy IL-12 fehérjére, alegységre, íragmensre, részletre vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp tartalmazhat legalább egy ellenanyagkötő régiót, amely legalább egy részletét tartalmazza a fehérjének, amely epitóp előnyösen annak legalább egy részletének legalább 1-5 aminosavából áll, mint például nem korlátozó példaként a fehérje legalább egy funkcionális, extraeelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy eitoplazmatikus doménját, vagy annak bármely részletet.
A legalább egy ellenanyag adott esetben tartalmazhatja legalább egy komplementaritást meghatározó régió {CDR} (például a nehéz vagy könnyű lánc variábilis régió ODRI, CDR2 vagy CBR3 részlete) legalább egy meghatározott részletét és/vagy legalább egy állandó vagy variábilis vázregiót vagy annak bármilyen részletét. A legalább egy ellenanyag amínosav-szekveneia továbbá adott esetben tartalmaz legalább egy meghatározott szubsztitúciót', inzereiót vagy deléciőt, amim azt a leírásban feltárjuk vagy ismert, a szakterületet!.
A találmány tárgyát képezi legalább egy találmány szerinti izolált anti-IL-12 ellenanyag is, ahol az ellenanyagnak van legalább egy aktivitása, mint például nem korlátozó példaként. <i) ÍL-12-indukált IFN-y szekréció; (ii) LÁK-sejíes citotoxieitás gátlása; (fii) íFN-γ mRNS transzkripciójának gátlása; (ív) iníracelluiáris IFN-γ CD3t· sejtek gátlása; és/vagy (v) CD95 expresszió [lásd például Chan és mtsai., .1 Immunoi. 148, 92-98. old. (.1992); Chan és mtsai., 1. Exp. Med. 173, 8Ö9-879. old. (1991); Chehimí és mtsai., 3. Lxp, Med. 175, 789-796. old. (1992); Medvedev és mtsai., Cyíokine 9, 394-404. old, (1997)]. Egy anti4L-l2 ellenanyagot tehát szkrinelhetünk megfeleld aktivitásra ismert módszerek szerint, mint például nem korlátozó példaként legalább egy, IL42 fehérje iránti biológiai aktivitásra.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy EL42 anti-idiotipus ellenanyag legalább egy találmány szerinti 11-12 ellenanyag ellen. Az anti-idiotipus ellenanyag bármilyen olyan fehérje- vagy peptidtartalmú molekula, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy könnyűlánc. legalább egy komplementaritást meghatározó régióját (CDR) vagy annak ligandnmkötö részletét, nehézlánc vagy könnyűlánc variábilis régióját, nehéziánc vagy kőnnyűiáne állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét amely beépíthető találmány szerinti ellenanyagba. Találmány szerinti ellenanyag tartalmazhat vagy származhat bármilyen emlősből, mint például nem korlátozó példaként emberből, egérből, nyúlból, patkányból, rágcsálóból, főemlősből, vagy hasonlókból.
A találmány tárgyát egy megvalósítási mód szerint olyan izolált nukleínsav-molekulák képezik, amelyek tartalmaznak olyan, legalább egy IL-12 anti-ídiotípus ellenanyagot kódoló pölinukleotídot, vagy komplementerek azzal vagy hibridizálnak ahhoz, amely legalább egy meghatározott szekvenciát, domént, részletet vagy annak variánsát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik továbbá az £L-12 anti-idiotipus ellenanyagot kódoló nuklelnsav-molekulákat tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen nnkleinsavakat és/vagy rekombináns vektorokat tartalmazó gazdasejtek, valamint eljárások ilyen anti-idiotipus eUenanyag-nukleinsavak, vektorok és/vagy gazdasejtek előállítására és/vagy alkalmazására.
A találmány tárgyát képezi legalább egy eljárás is legalább egy antÍ-BL~i2 ellenanyag vagy IL-I2 anti-idiotipus expresszáltatására gazdasejtben, amely szerint találmány szerinti gazdasejtet tenyésztünk olyan körülmények között, ahol legalább egy anti-IL-42 ellenanyag expresszálödik detektálható és/vagy visszanyerhető mennyiségben.
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény is, amely (a) találmány szerinti zat és/vagy ellenanyagot és (b) megfelelő izolált anti-IL-12 ellenanyagot kódoló hordozót vagy oldószert tartalmaz, A hordozó vagy oldószer adott esetben gyógyászatilag elfogadható lehet, mint például ismert hordozók vagy oldószerek. A készítmény adott esetben továbbá tartalmazhat, legalább egy további vegyületet, fehérjét vagy készítményt.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy készítmény, gyógyászatilag hatásos mennyiségben történő beadásra, hogy moduláljunk vagy kezeljünk legalább egy ÍL-12-vel összefüggő állapotot sejtben, szövetben,
4 * * *4 ♦» ♦ ? * * * * *
4X44 44 4«.
-5szervben,.-állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt. követően vagy annak során, amint azt a jelen leírásban feltárjuk.
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy eljárás is, legalább egy találmány szerinti antí-IL-12 ellenanyag győgyászatilag vagy profilaktikusan hatásos mennyiségben történő beadására.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot alkalmazó eljárás vagy' készítmény, legalább egy EL- 12-vel összefüggő állapot diagnosztizálására sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben egy kapcsolódó állapotot megelőzően, azt követően vagy annak során, amint azt a. jelen leírásban feltárjuk,
A találmány tárgyát képezi legalább egy készítmény, eszköz és/vagy beadást eljárás is, legalább egy találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag diagnosztizálására.
Az 1A, és 18. ábrákon humán astí-lL-12 monoklonális ellenanyagok koncentrációföggő kötődését, mutatjuk be immobílizálí humán IL-lz-höz, Ánti-IL-12 ellenanyagokat sorozatosan hígítottunk 1% BSA/PBS púderben és inkubáltuk rhIL-I2-veI bevont mikrotiterlemezeken 1 órán keresztül 37 °€~on. Á lemezeket kétszer mostuk 0,02% Tween 20 tölioxie (20) szorbítán monolaurát) tartalmazó 0,15M sóoldattal, és azután próbázmk tormaperoxidázzal (HRF) jelzett kecske aníi-humán-lgG-kappa-speciflkus ellenanyaggal 1 órán keresztül szobahőmérsékleten, A lemezeket ismét mostok előhívtok o-téniiéndlamin (OPD) szubsztráttai, és megmértük az. egyes mérőhelyek optikai denzitását (OD) 490 nm-en.
A 2. ábrán az A és a B ábrákon a sávokban balról jobbra humán 11.-12, humán EL-12 p4Ö. egér EL.-12 és előretestett molekulatömeg-markerek elemzését mutatjuk be, Á 2 A. ábrán összfehérjére festett csíkokat mutatunk be. Áz elsödlegescsik az egyes sávokban a humán IL12 (75 kDa), p40 humán IL-12 (40 kDa) és egér ÍL-12 (75 kDa). A 2B. ábrán a 2A. ábrán bemutatottal azonos gélről készített Westem-bbtot mutatunk be, A bbtot C34Ö~neí reagáltattuk, maid HRP-vel jelzett kecske anti-humán-IgG-vel, és csak a humán IL-12-1 (monomer és multímerek) és a humán 1L-12 p40~et detektáltuk specifikusan. HPR-vel jelzett kecske anti-hornán-lgG-vel reagáltatok kontroll biot (nem mutatjuk be) nem mutatott semmilyen csíkot.
A 3. ábrán ÍFN-γ genevpresszló reverz-transzkripeiós elemzését mutatjuk be humán
PBL-ekhen, amelyeket IL~2~vel, IL-1.2-vei, IL-2+IL- 12-vel kezeltünk, C34Ö,8.6.2 anti-IL-12 ellenanyaggal és izotípus kontroll ellenanyaggal, valamint azok nélkül. Az össz-RNS-t reverztranszkripelőval átírtuk; és PCR-rel amplifíkábuk génspecífikus láncíndiíoKkal. A β-aktin * χ Φ * «· ♦ ♦ «φφ. «φ »
6RNS szintjét meghatároztuk mindegyük mintában, arai az mRNS integritásának és mennyiségének kontrolijául szolgált.
A 4, ábrán olyan jisztogramot mutatnak be, amely azt ábrázolja, hogy IL-12 monoklonális ellenanyag (€340) gátolja az ímerféton-y (ÍFN-γ) keletkezését H,~2-vel és IL~
12-vel stimulált, monooitákra kimerített €B3+ perifériás mononukleáris vérsejtekben (PBMC), PBMC-t tenyésztettünk 5 órán keresztül kontroll tápközegben (hozzáadott ciíokinek nélkül), íL-12-vel (0,1 ng/ml) plusz H,-2~vei (50 lU/ml) kiegészített tápközegben (II,- 12/IL2), €340 monoklonális ellenanyagot tartalmazó (1Ö pg/ml) kontroll tápközegben és C340 monoklonális ellenanyagot tartalmazó (10 gg/ml) IL-12/IL-2 tápközegben. Mértük az infraeeHuiáris IFN-y-t kétszínű immunfestéssek CD3-PE és ÍFN-y-FÍTC alkalmazásával. Eav donor adatait
Az 5. ábrán az IPN-y-szekréció dózisfüggő gátlását ábrázoló grafikont mutatunk be ÍL-2-vel plusz IL-12-vei stimulált perifériás Km&cítákhan humán anti-lL~12 monoklonális ellenanyag (€340) két különböző lotjávai., Humán PBL~t (S x löNrnl} tenyésztettünk 24 órán keresztül lö U/ml IL-2-vei, ΙΙ,-2-ve.l plusz 400 pg/ml IL-12-vel vagy IL-2-vel plusz IL- 12-vel és €340 jelű monoklonális ellenanyaggal, amint jelezzük. A tenyészetek felölúszoit eltávolhottuk, és mértük EIA-val IFN-y-ra.
A 6, ábrán IL-l2-vel plusz IL~2~vel indukált LAK-sejtek eítotoxicitásának humán antlIL-12 monoklonális ellenanyag (€340) általi dózisföggő gátlását ábrázoló hisztogramoí mutatunk be.. LAK effektor sejteket (humán PBL, 8 x 10é/mI) tenyésztettünk 24 órán keresztül IL-12-vel (400 pg/ml) plusz IL-2-vel (10 O/ml) és €340 monoklonális ellenanyaggal (.5000 ng/ml vagy 50 ng/ml, amint jelezzük). A LAK effektor sejteket mostuk.
és tenyésztettük '‘'Cr-jelzetí Raji célsejtekkel 4 órán keresztül 80.1 effektor:célsejt (E.'T) arány mellett, és megmértük a Rali sejtek lizise következtében a tápközegbe felszabaduló '*€? mennyiségét. Az eredményeket három normális donor átlaga és szórása alakjában fejezzük ki. Az Π..-12 pozitív kontroll (IL-12) effektor sejt IL-12-vel inkubálva ellenanyag nélkül. .A háttér (BKOD) effektor sejt ÍL-12 és ellenanyag nélkül inkubálva.
A 7A. és 7B. ábrákon olyan hisztogramokat mutatunk be, amelyek azt mutatják, hogy a CD95 expresszió}» R,~ 12-vel plusz Η,-2-vel Indukált CD3+ perifériás mononukleáris verseiteken gátolt humán aüí.i~!L~12 mtonoklónáüs ellenanyag (€340) által. PBMC-t tenyésztettünk 72 órán keresztül 0,1 ng/ntl lL-12-t és szuboptimáhs dózisú IL-2-t (50 HJ/mí) tartalmazó tápközegben €340 monoklonális ellenanyag (lö pg/ml) jelenlétében vagy hiányában,, A €095 exgressziojáí áramlási eitometriával mértük anti-€D95-kll'C-od festett sejteken. A kapuzást kétszínű elemzéssel (€D3 vagy CO56-PE vs. CD95-FITC) végeztük, és elülső vs. ortogonális fényszórással.
A 8. ábrán olyan grafikont mutatunk be, amely azt mutatja, hogy humán anti-humáaIL-12 ellenanyagok (r€340) a tisztítok €340 monöklonális ellenanyagtól megküiönböz5 telhetetlen módon kötődnek az ímmolizált IL-12-höz, Meghatároztuk az r€34Ő koncentrációja három, r€34O~et termelő rekombináns sejtvonal felülúszőjában, és a felüiúszókat BLISA-ban értékeltük JL-12 kötésére. Mikrotiterlemezeket vontunk be 2 pg/ml IL- 12-vek és az eredeti hibridóma (standard) vagy a rekombináns sejtvonalak felülüszójáböl tisztított C340 monoklonálís ellenanyaggal ínkubáltuk. Az IL- 12-höz kötődött ellenanyagot alkalikus fbszfatázzal jelzett kecske anfi-hnmán-IgG (nehézdánc+könnyüláne) alkalmazásával detektáltok.
A 9Á-9C. ábrákon három függetlenül előállított, r€340-et termelő rekombináns sejtszubklón (9A. ábra, C379B jelű szubklón, $B. ábra. €38 IÁ jelű szubklón; 9€. ábra, 389A jelű szubklón) által szekretált ellenanyag mennyiségét és növekedési kinetikáját ábrázoló grafikonokat mutatunk be.. Rekombináns sejteket oltottunk T75-edényekbe 2 x lö5 sejt/ml kiindulási sűrűségben standard tápközegben. At varínus times, eells were resnspended and the number of live eells and the quantity (, ug/ml) of rC340 in the média were A találmány tárgyát izolált, rekombináns és/vagy szintetikus .anti-IL-12' humán, főemlős, rágcsáló, emlős, kiméra, humanizált vagy €DR~graflolt ellenanyagok és azok elleni lL-12 anti-idiobpus ellenanyagok képezik, valamint készítmények és kódoló nukleinsavmolekulák, amelyek legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot vagy anti-idiotípus ellenanyagot kódoló legalább egy polmukleotid tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi továbbá nem korlátozó példaként eljárások ilyen nukleinsavak és ellenanyagok és anfí-idiolipus ellenanyagok előállítására és alkalmazására, beleértve diagnosztikai és terápiás készítményeket, eljárásokat és eszközöket.
A leírás szerinti értelemben „interleukin-12 ellenanyag”, „anti-IL-12 ellenanyag”, „anti-IL-12 ellenanyag vagy „aoíí~IL~12 ellenanyag fragmens” és/vagy „anti-IL-12 ellenanyag variáns” és hasonlók alatt bármilyen olyan fehérje- vagy pepfidtartalmú molekulát értünk, amely immunglobulin molekula legalább egy részletét tartalmazza, mint például nem korlátozó példaként nehézlánc vagy körmyűíáne legalább egy kompíementarifásf meghatározó régióját. (CDR) vagy' annak ligandumköfö részletét, nehézlánc vagy kőnnyüláne variábilis régióját, nehéziáne vagy kőnnyüláne állandó régióját, vázrégiót, vagy azok bármely részletét, vagy IL-12~receptor vagy kötofehérje legalább egy részletét, amely beépíthető találmány φ
-8szerinti ellenanyaga. Ilyen ellenanyag adott esetben továbbá hat egy specifikus tigandumra, mint például nem korlátozó példaként amikor egy ellenanyag modulál, csökkent, növel, antagonlzál, agonizál, csillapít, enyhít, gátol, inhlbeál, befolyásol és/vagy zavar legalább egy IL-12 aktivitást vagy kötődést, vagy 1L,~ 12-recepiöf aktivitást vagy kötődést, m vi&v, m <»/» vagy ú? w. Nem korlátozó példaként megfelelő találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyag, meghatározott részlet vagy variáns kötődhet legalább egy IL- 12-höz, vagy annak meghatározott részletéhez, variánsához vagy doménjához, -Egy megfelelő aníi-IL-12 ellenanyag, meghatározott részelt vagy variáns adott esetben befolyásolhat legalább egy IL-12 hutást vagy funkciót is, mint például nem korlátozó példaként RNS-, DNS- vagy
I0 fehérjeszintézist, H-12-felszafeadulást, IL-12-reeeptor jeltovábbítást, membrán-IL-12-hasítást, lL-I2-aktivlt.ást, fL-12-termelést és/vagy szintézist. Az „ellenanyag” kifejezés alatt értünk továbbá ellenanyagokat, azok emésztési fragmenseít, meghatározott részleteit és variánsait, beleértve ellenanyag mimetikumokat vagy ellenanyagok olyan részleteit tartalmazókat, amelyek utánozzák egy ellenanyag vagy annak meghatározott ífagmensének vagy részletének
a. szerkezet ét és/vagy funkcióját, beleértve az egy l áncú ellenanyagokat és azok fragmenseít .
Funkcionális fragmensek közé tartoznak olyan ellenanyagkőtő fiagmensek, amelyek emlős IL-12-höz kötődnek. IL-12-höz vagy annak részletéhez kötődni képes ellenanya,g-feagmensek találmány tárgykörébe tartozó nem korlátozó példái közé tartozik az Fab (példáid papaines emésztéssel), Fab’ (például pepszlnes emésztéssel és részleges redukcióval) és F(a.b!)2 (például pepszines emésztéssel), fach (például plazminos emésztéssel), pFc’ (például pepszines vagy plazminos emésztéssel), Fd (például pepszlnes emésztéssel, részleges redukcióval és reaggregáeíőval), Fv vagy scFv (például molekuláris biológiai módszerekkel) Ífagmens (lásd például Colligan, „Immunology”, mint fent).
Ilyen feagmenseket enzimatikus hasítással, szintetikus vagy rekombínáns módszerekkel állíthatunk elő, amint az ismert, a szakterületen és/vagy a leírásban feltárjuk. Ellenanyagok előállíthatok különféle csonkolt formákban is, olyan ellenanyag-gének alkalmazásával, amelyekbe egy vagy több stopkodon lett beépítve a természetes stopkodon helyétől leolvasással ellentétes irányban Például tervezhetünk F(ab’)2 nehézlánc· részletet kódoló kombinációs gént úgy, hogy tartalmazza a nehézlánc CFF doménját és/vagy csuklórégióját kódoló DNS-szekveneiákat, Ellenanyagok különféle részleteit összekapcsolhatjuk hagyományos kémiai módszerekkel, vagy összefüggő fehérjeként állíthatjuk elő azokat génsebészeti módszerek alkalmazásával,
A leírás szerinti értelemben a „humán ellenanyag” kifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amelyben a fehérjének lényegében minden részlete [például CDR, vázrégió, Cu
Φ β Α » χ χ X ν Μ
Μ X Φ»χ Λ : χχ » # φ ν * V **** \ **φ x ii φ-φ χν domének (például CH?, C%, CHi), csukló (Vt, Vh)} lényegében nem immunogén emberekben, és csak apró szekvencia-változásokat vagy variációkat tartalmaznak. Hasonlóképpen, főemlős (majom, pávián, csimpánz,, stb.), rágcsáló (egér, patkány, nyúl, tengerimalac, hörcsög és hasonlók) és egyéb emlős megjelölés alatt ilyen faj, aínemzetség, nemzetség, alcsalád és család ellen specifikus ellenanyagokat értünk. Ezenkívül kiméra ellenanyagok alatt értjük a. fentiek bármilyen kombinációját, ilyen változások és variációk adott esetben és előnyösen megtartják vagy csökkentik az ímmunogenitást emberekben vágymás fajokban a nem módosított ellenanyagokhoz képest. By módon egy humán ellenanyag különbözik egy kiméra vagy humanizált ellenanyagtól. Megjegyezzük, hogy humán ellenanyagot elő lehet állítani nem humán állatban vagy olyan prokariofa vagy eukarióta sejtben, amely képes funkcionálisan átrendeződött humán immunglobulin (például nehézíánc és/vagy könnyulánc) gének expresszáiására. Ezenkívül amikor egy humán ellenanyag egyláncú ellenanyag, az tartalmazhat· olyan kapesolópeptidet, amely nem található meg a természetben megtalálható humán ellenanyagokban. Például egy Fv tartalmazhat kapesolópeptidet, mint például kettő és körülbelül nyolc közötti számú glicint vagy más aminosav-oldaíláncöt, amelyek összekötik a nehéziánc variábilis régióját és a könnyűlánc variábilis régióját, Ilyen kapcsolöpeptideket humán eredetűnek tekintünk,
Bispecifikus, heterospeeifikus, heterokonjugált vagy hasonló ellenanyagokat is alkalmazhatunk, amelyek lehetnek monoklonáiis, előnyösen humán vagy humanizált ellenanyagok, amelyeknek legalább két különböző antigén iránt van. kötóspecífifása, Á jelen esetben az egyik kötöspecifitás legalább egy IL-12 fehérje ellen van, és a másik egy másik antigén ellen. Bispecifikus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen, Hagyományosan a bispecifikus ellenanyagok rekombináns előállítása két immunglobulin nehéziáne-kőnnyűíáne pár együttes expressziöján alapszik, ahol a két nehézláncnak különböző a specifitása [Milstein és Cúello, Natúré 305, 537. old. (1983)]. Az immunglobulin nehéz és könnyőiánook véletlenszerű választéka miatt ezekben a híbríáómák (kvadrómák) 10 különböző ellenanyag-molekula potenciális keverékét termelik, amelyek közül csak egynek van meg a helyes bispecifikus szerkezete, A helyes molekula tisztítása, ámít általában affinitást kromatográfiás lépésekkel végeznek eléggé fáradságos, és a termék kitermelése alacsony. Hasonló eljárásokat tárnak, fel például a WO 93/08829. számú nemzetközi közzétételi iratban, a 6 210 668., 6 193 96?., 6 132 992., 6 106 833., 6 060 285.,
037 453.., 6 010 902., 5 989 53Ő„ 5 959 084., 5 959 083., 5 932 448., 5 833 985 ,5 821 333.,
807 706., 5 643 759., 5 601 819., 5 582996., 5496549., 4676980. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, a WO 91/00360., WO 92/00373. számú
V
10nemzetközi közzétételi iratokban, az EP O3OS9, számú európai szabadalmi iratban, Traunecker és mtsai., RMBO I 10, 3655. old. (1991), Suresfe és mtsai., Methods ín Enzymolögy 121, 210. old (19Ső), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi).
A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható antí-IE-12 ellenanyagok (amelyeket 11-12 ellenanyagoknak is nevezünk) adott esetben a 1L-12 iránti magas affinitással ís jellemezhetők, és adott esetben és előnyösen alacsony a toxicításuk. Közelebbről találmány szerinti ellenanyag, meghatározott tragmens vagy variáns hasznos a találmány szerint, ha az egyedi komponenseknek - mint például a variábilis régiónak, állandó lö régiónak és· vázrégiónak - egyedileg és/vagy együttesen adott esetben és előnyösen alacsony az inununogcnitása. Á találmány szerint alkalmazható ellenanyagokat adott esetben az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül tartó kezelésére a tünetek mérhető enyhítésével és alacsony és/vagy elfogadható toxicitással Az alacsony vagy elfogadható ímmunogenítás és/vagy magas affinitás, valamint más megfelelő tulajdonságok hozzá)ájulhatnak az elért terápiás eredményekhez. Az „alacsony immunogenítááM úgy definiáljuk a leírás szerinti érteiémhen, hogy szignifikáns HAHA, HÁGA. vagy HAMA választ vált ki a kezelt pácienseknek kevesebb, mint körülbelül 75%-ában, vagy előnyösen kevesebb, mint körülbelül 50%-ában, és/vagy alacsony litert hoz létre a kezelt páciensekben (kevesebb, mint. körülbelül 300-at, előnyösen kevesebb, mint körülbelül 100-at kettős antigén enzimes immunológiai vizsgálati eljárással mérve) [lásd például Elliott és mtsai,, Láncét 344, 1125-1127, old. (1994), amely hivatkozás útján teljes terjedelmében a kifanitás részét képezi).
/1 Ikaim/izhatóság
A találmány szerinti izolált nukíeinsavak alkalmazhatók legalább egy anti-IL-I2 ellenanyag vagy annak meghatározott variánsának az előállítására, amely alkalmazható legalább egy ít-12-áÍapol - amely nem korlátozó példaként legalább egy immunológiai rendellenesség vagy betegség, szív- és érrendszeri rendellenesség vagy betegség, fertőző, rosszindulatú és/vagy idegrendszeri rendellenesség vagy betegség bármelyike, vagy bármilyen egyéb ismert IL-12-vel kapcsolatos állapot - mérésére vagy kiváltására egy sejtben, szövetben, szervben vagy állatban (beleértve az emlősöket és az embert), diagnosztizálására, monitorozására, modulálására, kezelésére, enyhítésére, előfordulása megelőzésének elősegítésére vagy tüneteinek a csökkentésére.
Ilyen eljárás szerint legalább egy anh-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati, készítmény hatásos mennyiségét beadjuk egv sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba ' ff * > * V A » ff v *<or^r ff χ v <· » $ * * ν Λ
*.Z’* ' ***\
- Πvagy páciensbe, amelynek szüksége van tünetek, hatások vagy mechanizmusok ilyen modulálására, kezelésére, enyhítésére, megelőzésére vagy csökkentésére. A hatásos mennyiség tartalmazhat körülbelül 0,001-590 mg/kg mennyiséget egyetlen (példád bólusz), többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy 0,01-5000 eg/ml szérumkoncentráciő eléréséhez egyetlen, többszörös vagy folyamatos beadásban, vagy bármilyen hatásos tartományt vagy értéket ezek között, amist azt Ismeri eljárások alkalmazásával elvégezzük és meghatározzuk a leírás szerint, vagy ismert az Idevágó szakterületeken.
Az összes, leírásban idézett publikáció és szabadalom teljes terjedelmében hivatkozás utján, a kitanítás részét képezi, minthogy a technika állását mutatják be a jelen találmány idején és/vagy a találmány leírását és megvalósíthatóságát biztosítják·.. Publikáció alatt bármilyen tudományos vagy szabadalmi publikációt értünk, vagy bármilyen egyéb hozzáférhető információt bármilyen média formátumban, beleértve minden rögzített, elektronikus· vagy nyomtatott formátumot. Az alábbi referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.· .„Current Protocols Ín Moleeular Blology”, szerk.: Ausubél, és mtsai., kiad.; John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1087-2001); „Moleeular Cloning.: A Laboraíory Manual”, szerk.; Sambrook és mtsai., 2. kiadás, kiad,; Cold Spring Harbor, NY (1089}, Harlow and tané, „Antibodies: A Laboratory Manual”, kiad.: Cold
Spring Harbor, NY (1989); .„Current Protocols in Immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Som, Inc., NY (1994-2001); „Current Protocols ín Protein Science”, szerk.: Colligan és mtsaí., kiad.: John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001).
A &?L?/n?ány .sccr/m/
Legalább egy találmány szerinti IL-12 ellenanyagot előállíthatunk adott esetben egv sejtvonallal, kevert sejtvonallal, immortalizált. sejttel vagy immortalizált sejtek klonális populációjával, amint az jól ismert a szakterületen [lásd például „Current Protocols in Moleeular Biology”, szerk.: Ausubel, es mtsai., kiad.: John Wiley & Sons,. Inc.., NY, NY (1987-2001}; „Moleeular Cloning; A Laboraíory Manual”, szerk,. Santbrook és mtsai., 2. kiadás, kiad.·. Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, „Antibodíes: A'Laboraíory Manual’’, kiad.: Cold Spring Harbor, NY (1989), „Cüírent Protocols in immunology”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad.: John Wiley & Sons, Inc., NY (.1994-2001); „Current Protocols in Protein Science”, szerk. . Colligan és mtsai., kiad. ; John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a. kitanitás részét képezi].
« *
Humán IL-12 fehérjékre vagy azok tfagmenseire specifikus humán ellenanyagokat termeltethetünk egy megfelelő immunogén antigén ellen, mint például izolált IL-12 fehérje vagy annak részlete ellen (beleértve szintetikus molekulákat, mint például szintetikus peptideket). Más- specifikus vagy általános emlős ellenanyagokat hasonlóképpen termeltethetünk. Immunogén antigének előállításét és monoklonális ellenanyagok termelését bármilyen megfelelő módszer alkalmazásával végrehajthatjuk.
Egy megközelítési mód szerint hibridőmát állítunk elő alkalmas immortalizák sejtvonal (például mielóma sejtvonal, mint például nem korlátozó példaként Sp2/ÍX Sp2/ÖAöl 4» NSO, N.S1, NS2, AE-I, L.5, >243, P3X63AgS,ő53, S-p2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSL Sp2 SA5-, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JLRKAT, WBHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, RL-óö, MLA 144, HAM AIWA, NEDRO 2 A vagy hasonlók, vagy heteromielómák, azok fúziós termékei, vagy bármilyen azokból származó sejt. vagy fúziós sejt, vagy bármilyen, a szakterületen ismert alkalmas sejtvonal, lásd például www.afcc.org,www-.lifetech.com és hasonlók) fúzionáhatásával e.lfenanyag-termeiő sejtekkel, mint például nem korlátozó példaként izolált vagy klónozott lép, perifériás vér, nyirok, mandula vagy egyéb immun vagy B-sejtet tartalmazó sejtekkel, vagy bármilyen más sejtekkel, amelyek- nehéz vagy' könnyűlánc állandó vagy variábilis vagy vázrégió vagy CDR szekvenciákat expresszálnak, akár endogén, akár heterolőg nukleinsavakként, mint rekombináns vagy endogén, vitális, bakteriális, alga, prokariota, kétéltű, rovar, hulló, hal, emlős, rágcsáló, ló-féle, juhfele, kecske, juh, főemlős, eukarióta, genomiális DNS, cDNS, rDNS, mitokondriális DNS vagy RNS, kioropiaszfisz DNS vagy RNS, hnRNS, mRNS, tRNS, egyszálú, kétszálú vagy háromszálú, híhridizált és hasonló, vagy ezek kombinációja formájában ( lásd például Ausnbel és mtsai., mint fent és Coliígan, „Immunoiogy”, mint fent, 2. fejezet, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanitás részét képezik].
Ellenanyag-termelő sejteket előállíthatunk jelentőséggel bíró antigénnek immunizált emberek vagy más alkalmas állatok perifériás véréből is, vagy előnyösen a lépükből vagy nyirokcsomóiból. Bármilyen egyéb alkalmas gazdasejtet is alkalmazhatunk heterolőg vagy endogén, találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott ffagmensét vagy variánsát kódoló nukleinsav espresszáltatására. A fezionáltatott sejteket (hibridómák) vagy rekombináns sejteket szelektiv tenyésztési körülmények között vagy más alkalmas módszerekkel izolálhatjuk, és korlátozó hígítással vagy sejtválogafássál vagy más ismert eljárásokkal klónozhatjuk. A kívánt specifnású ellenanyagokat termelő sejteket alkalmas vizsgálati eljárással (például EEISÁ-val) szelektálhatjuk ki.
< φ
Más, kívánt speciöfcású ellenanyagok előállítására vagy Izolálására alkalmas okát is alkalmazhatunk, nem korlátozó példaként olyan eljárásokat, amelyek rekombináns ellenanyagot választanak ki pepiid vagy fehérje könyvtárból (például nem korlátozó példaként bakteriofág, ríboszoma, oiigonukleotid, RNS, cDNS vagy hasonló .5 prezentációs könyvtárból; például amelyek beszerezhetők az alábbi cégektől: Cambridge Antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Seotiand, UK; Biolnvent, Lund, Swden; Dyax Corp., Enzon, Afíyraax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. lásd például az EP 368 684. számú európai szabadalmi iratot, a PCT/GB91/01134.; PCT/GB92/01755.; PCT/GB92/00224Ö.;
PCT/GB92/OÖ88.3.; PCT/GB93/ÜÖ6Ö5. számú nemzetközi bejelentéseket; a 08/350260. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést (1994.12.5); a PCT/GB94/01422.; PCT/GB94/02662.; PCT/ÖB97/Ö1835. számú nemzetközi bejelentéseket; (CAT/MRC); a WO 90/14443.; WO 90/14424.; WO 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratokat; a PCT/US94/1234. számú nemzetközi bejelentési; a WO 92/18619.; WO 96/07754. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Seripps); az EP 614 989. számú európai szabadalmi iratot (MorphoSvs); a WO 95/16027. számú nemzetközi közzétételi irat (Biolnvent); WO 88/06630.; WO 90/3809. számú nemzetközi közzétételi iratokat (Dyax); a 4 704 692. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Enzon); a PCT/US91/02989, számú nemzetközi bejelentést (Afíymax); a WO 89/06283. számú nemzetközi közzétételi iratot; az
EP 371 998.; EP 550 400. számú európai szabadalmi iratokat (Koma); az EP 229 046. számú európai szabadalmi Iratot; a PCT/US9I/07149. számú nemzetközi bejelentést (Ixsys) j; vagy véletlenszerűen létrehozott peptldeket vagy fehérjéket - lásd az 5 72.3 323., 5 763 192., 5 814 476., 5 817 483., 5 824 514., 5 976 862 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat, a WÖ 86/05803. számú nemzetközt közzétételi iratot, az BP 590 689.
számú európai szabadalmi iratot {Ixsys, jelenleg Applied Moleeular Evolűtiön·, AME) amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi], vagy amelyek olyan transzgenikus állatok [például SCÍD egerek, Nguyen és mtsai., Micróbiol. immunoi. 41, 901-907. old. (1997); Sandhu és mtsai,, Crit. Rév. Biotechnoi. 16, 95-118. old. (1996); Erén és mtsai, immunoi. 93, 154-161. old. (1998), amelyek mindegyike, valamint a kapcsolódó szabadalmak és bejelentések teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanilás részét képezi) immunizálásán alapulnak, amelyek képesek humán ellenanyagok készletét előállítani, amint, az ismert a szakterületen és/vagy feltárjuk a leírásban. Ilyen módszerek nem korlátozó példaként a riboszonta prezentáció (Hanes és mtsai., Proc. Natl. Aead. Sci. USA, 94, 4937-4942. old. (1997), Hanes és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 14130-14135.
* *
ΙΟ old. (1998)]; egysejtes, ellenanyagot előállító technológiák [például a szelektált límfocíta ellenanyag eljárás f SLAM) (5 627 052. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Wen és mtsai., J. Immunoi. 17, 887-892. old. (1987); Babcook és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sri, USA 93, 7843-7848. old. (1996)}; gél-mikrocsepp és áramlási citometria [Pöwell és mtsai., Biotechnol. 8, 333-337. old. (1990); One Celi Systems, Cambridge, MA; Gray és mtsai., 1 Imm, Meth. 182, 155-163. old, (1995); Kenny és mtsai., BtoZTechnol 13, 787-790, old. (1995)}; B-sejt szelekció [Steenbakfcers és mtsai., Molee. Biot 'Reporta 19, 125-134. oki. (1994); Jónak és mtsai., „Frogress Biotech”, 5, kötet, „In Vitro Immunizatlon in Hyhridoma Technology”, szerk.; Borrebaeek, kiad.: Elsevier Science Publíshers Β. V., Amsterdam, Netherlands (1988)}.
Nem humán vagy humán ellenanyagok génsebészeti úton történő módosítására és humanizálására szolgáló eljárásokat is alkalmazhatunk, amelyek jól ismertek a szakterületen. Általában humanizált vagy génsebészeti úton módosított ellenanyag egy vagy több nem humán forrásból származó amínosav-oldalláncöt tartalmaz, például nem korlátozó példaként egérből, patkányból, nyúl ból, nem humán főemlősből vagy más emlősből származót. -Ezeket a humán aminosav-oidaiiáncokat gyakran „import” oldalláncúknak nevezzük, amelyek tipikusan egy ismeri humán szekvencia „import’' variábilis, állandó vagy más doménjából származnak. Ismert humán lg szekvenciákat tárnak, fel az alábbi helyeken: www..ncbi.nlm.nib.gov/entrez/query.fcgi; wwwatcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest-com/; www.abcam.com/; twwaníibodyresouree.eormkmhnecomp.htud:, www.public.íastate.edw’-pedro/researehtools.htmkwww.mgen.uniheídelberg.de/SD/lT/IT.html; www.whfreeman..com7immunologyZCH05/kubyG5.htm;
www.Bbrary.thinkquest.org/I2429/lmm.une/Aniibody. Mmí;
www. hhmi. orgZgrants/lectures/1996/vÍahZ; www.path. cam.ac. uk/~mrc7/mikei mages. html;
www.antibodyresouree.com/;
www. immu nologylink.com/;
www. biotech. ufl:. eduZ~hdZ;
www. nal. u-sda. gov/awicZpubsZantibodyZ;
www.biodesign.com/tahle.asp;
meh.harv&rd. edmBioLínks/'ímmnnology.html; pathbox. wustl. eduZ-hcenter/í ndex. html; www.pebio .com/pa/340913/340913. html; wn-w.m.ehime-u.ac.jp/'-yasuhfUxTilisa.html; www. ionét, uk/axp/íaes/davies/ímks, html;
www .biotech. ufl. eduÁ· fed/protocol. html; www. tsae/net. org/sit.es „geo. html; aximii. imt. uni marburg,de/-rek/ÁEP:Start.html; baserv uci.kun.ni/~}reats./hnk$I. bírni; www.recab.uni~ hd.de,rimmuno.hme nwu.edu/; www. mrc-cpe cam.ac.uk./ímt-doc/public/'INTRO. html;
www. Ibi. .unam.mx/virZ V__miee.hl.mi; imgl.enusc.tr:8104/;
www. biochem.ucl.ac,uk/~-m8rtim'abdindcx. bírni; antibodv.bath.ac.uk/;
abgen, cvm. tamu. edu/iab/vAv wabgen. ht m 1;
ww.utazh.ch/'--honegger/AHOsemjnar/Slid€Öl..htoí; vww.cryst.M>fc.ac.«kZ'-ubog07s/;
ww. nimr..mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htta;.
ww. path cam, se, uk/--me?/ humán! sation/T AHHP. fetml;
wwwdbt.uawi.íax/vÍr/stnicture/stat ...aim.html; vvtw.biosct.missonri.edu/smíthgp/índex.htmk www. cryst. bioc. cam. ac. ukMrooUna/ Web-pagea/Pepf/spotteeh.híml; www..jerim.d-e/frj>rodací.s..htm; www.patents.ibm.com/ibm.htmi, Kábát és mtsai,, „Sequeaces ofWotdas of Immunologicaí Interest”, kiad. : U. S. Dept. Health (1983), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képeid. Ilye» importált szekvenciákat alkalmazhatunk az ímmunogemtas csökkentésére, vagy a kötődés, affinitás, „on” sebesség, „of?’ sebesség, aviditás, specifitás, féléletidő, vagy bármely más alkalmas jellemző csökkentésére, fokozására vagy módosítására, amint az- ismert a szakterületen. Általában a nem humán vagy humán üDR-szekvencíák részét vagy egészét megtartjuk; mig a variábilis és állandó régiók nem humán szekvenciáit helyettesítjük humán vagy más amino savakkal.
Ellenanyagokat adott esetben humanizálhatunk' az antigén iránti magas affinitás és egyéb kedvező biológiai tulajdonságok megtartásával. Is. Ezen -cél elérése érdekében humanizált ellenanyagokat adott esetben a szülői szekvenciák és különféle konceptuális humanizált termékek elemzése útján állithatunk elő, a szülői és humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeinek alkalmazásával. Háromdimenziós immunglobulin modellek általánosan hozzáférhetők és ismertek a szakember számára. Beszerezhetők olyan számítógépi programok, amelyek bemutatják és ábrázolják a kiválasztott potenciális immunglobulinszekvenciák valószínű háromdimenziós konformációs szerkezeteit. Ezen ábrázolások tanulmányozása lehetővé teszi az. oldalláneok valószínű szerepének az elemzését a potenciális immunglobulin-szekvencia működésében, azaz azon oldalláneok elemzése, amelyek .25 befolyásolják a potenciális immunglobulin képességét az antigénjéhez való kötődésre Ily módon ER.-oldalláncúkat választhatunk ki, és kombinálhatjuk azokat, a konszenzus és import szekvenciákból,, oly módon, hogy elérjük a kívánt ellenanyag-tulajdonságot, mint például a megnövekedett affinitást a céianiigén(ek) Iránt. Általánosságban a CDR-oldalláncok közvetlenül és leglényegesebb módon részt vesznek az antigénkötés befolyásolásában. A találmány szerinti ellenanyagok humanizálását és génsebészeti úton történő módosítását bármilyen ismert eljárás alkalmazásával elvégezhetjük, mint például nem korlátozó példaként az alábbi irodalmi helyeken leírtakkal,· Winter (Jones és mtsai.. Natúré 32.1, 522. old. (1986); Riechmarm és mtsai. Natúré 332, 323, old. (1988); Verhoeyen és mtsaí., Science 239, 1534. old. (1988), Sims és mtsai., .1 Immunoi. 151, 2296. old. (1993); Chothia és Lesk, I. Mól. Bioi.
196, 901. old. (1987), Oarter és mísai, Proc,. Had. Acad. Sci. USA 89, 4285. old, (1992); Presta és mísai., 1 Immunoi. 151, 2623. old. (1993). 5723323,5976802, 0,5824514, 5 824 514., 5 817 483., 5 814 476., 5 763 192., 5 723 323, 5 766 886., 5 714 352.,
0,6180370, 6 180 370., 5 693 762, 5 530 101, 5 5SS 089, 5 225 539.; 4 816 567. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok, PCT/US98/16280, PCT/US96/18978, PCT/US9I/09630, PCWS91/05939, PCT/US94/01234, PCT/GB89/01334,
PCT/GB91701134, PCT/GB92/01755, számú nemzetközi bejelentések; WO 90/14443, WO 90/14424, WÖ 90/14430. számú nemzetközi közzétételi iratok, EP 229246. számú európai szabadalmi írat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét képezi, beleértve az azokban idézett referenciákat is.
Az artti~íL-12 ellenanyagot adott esetben előállíthatjuk olyan transzgenikus állat (például egér, patkány, hörcsög, nem humán főemlős és hasonlók) immunizálásával is, amely képes humán ellenanyagok készletének termelésére, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert & szakterületen, Humán and-lt-12 ellenanyagot termelő sejteket izolálhatunk ilyen állatokból, és immortalízálhaíjuk azokat megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például a leírásban feltárt eljárásokkal.
Humán antigénekhez kötődő humán ellenanyagok készletét termelő transzgenlkus egereket ismert eljárásokkal állíthatunk elő {például nem korlátozó példaként az 5 770 428., 5 569 825., 5 545 806, 5 625 126, 5 625 825, 5 633 425, 5 661 016. és 5. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok (Lonberg és mtsai.); Jakobovits és mtsai, WO 98/50433, számú nemzetközi közzétételi irat, Jakobovíts és mtsai. WO 98/24893. számú nemzetközi közzétételi irat, Lonberg és mtsai., WÖ 98/24884. számú nemzetközi közzétételi irat, .Lonberg és mtsai., WO 97/13852. számú nemzetközi közzétételi irat Lonberg és mtsai, WO 94/2558.5. számú nemzetközi közzétételi irat, Kucheriapate és mtsai., WO 96/34996.
számú nemzetközi közzétételi írat, Kucheriapafe és mtsai, EP0463 151 Bl. számú európai szabadalmi irat, Kucheriapate és mtsai, EP 0710 719 Al. számú európai szabadalmi irat, Surani és mtsai, 5 545 807. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Bruggemann és mtsai, WÖ 90/04036. számú nemzetközi közzétételi irat, Bruggema»» és mtsai, EP 0438 474 BL számú európai szabadalmi irat, Lonberg és mtsai, EP 0814 259 A2.
számú európai szabadalmi irat, Lonberg és rntsai, GB 2 272 440 A. számú brit szabadalmi írat; Lonberg és mtsai., Natúré 368, 856-859. old. (1994), Taylor és mtsai. Int. Immunoi. 6,
579-591. old. 0994), Green és mtsai, Natúré Genetics 7, 13-21. old. (1994), Mendez és mtsai., Natúré Geneties 15, 146-156. old. (1997), Taylor és mtsai, Nucleio Aeids Research
20, 6287-6295. old. (1992), Tuaillon és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3720-3724.
17old. (1993), Lonberg és mtsai., lm. Rév. Immunoi 13, 65-93, old. (1995) és Eíshwald és mtsai, Nat. Bíoteehnoí .14, 845-851. old. (1996), .amelyek mindegyike telejs terejdelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi}. Általában ezek az egerek, legalább egy transzgént tartalmaznak, amely legalább egy humán immunglohulin-lókuszról származó DNS-t tartalmaz, amely funkcionálisan át van rendezve, vagy amely funkcionális átrendeződésen mehet át, Áz endogén ímmungiohukn-lókusz az. ilyen egerekben megzavarható vagy deletálhatő, hogy elímináljnk az. állat képességét endogén gének által kódolt ellenanyagok termelésére.
Hasonló- fehérjékhez vagy ífagmensekhez specifikusan kötődő ellenanyagok szkrineléséf kényelmesen elérhetjük pepíidprezentáeíós könyvtárak alkalmazásával. Ez az eljárás magában foglalja peptidek nagy gyűjteményeinek a szkrineléséí kívánt funkciójú vagy szerkezetű egyedi tagokra. Peptidkönyvtársk ellenanyag-szkrioelése jól ismert a szakterületen. A prezentált peptidszekvencíák lehetnek 3-5000 vagy több aminosav hosszúságúak, gyakorta 5-100 aminosav hosszúságúak, és gyakran körülbelül .8-25 aminosav hosszúságúak. A peptidkönyvtárak létrehozására szolgáló közvetlen kémia szintetikus eljárások mellett számos rekombináns DNS módszert is leírtak. Az egyik típus peptidszekvencia prezentálását foglalja magában bakteriofág vagy sejt felszínén. Mindegyik bakteriofág vagy sejt tartalmazza az adott prezentált peptidszekvénei át kódoló nukleotidszekvenciát. Ilyen eljárásokat tárnak fél a WO 91/17271,, WO 91,/18980., WO 91/19818. és WO 93/08278, számú nemzetközi közzétételi iratok. Peptidek könyvtárainak létrehozására szolgáló más rendszereknek vannak m νήΑ> kémiai szintézis és rekombináns vonatkozásai is.
<.zs
Lásd a WO 92/05258., WO 92/14843. és WO 96/19256. számú nemzetközi közzétételi iratokat Lásd még az 5 658 754-. és 5 643 768. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat. Peptidprezentácíós könyvtárak, vektorok és szkrtnelő reagenskészletek beszerezhetők kereskedelmi forgalomban olyan cégektől mint például az Invrtrogen (Carísbad, CA) és a Cambridge antíbody Technologies (Cambridgeshire, UK). Lásd például a
704 692., 4 939 666-., 4 946 778., 5 260 203., 5 455 030., 5 518 889., 5 534 621., 5 656 730,,
763 733., 5 767 260,, 5 856 456, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Enzon); 5 223 469.., 5 403 484., 5 571 698., 5 837 560. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Dyax), 5 427 908., 5 580 717. számú amerikai egyesült, államokbeli szabadalmi iratokat (Áflyma.x); 5 885 793. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Cambridge antíbody Technologies), 5 750 373. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Genentcch), 5 618 920., 5 595 898, 5 576 195, 5 698 435., 5 693 493, 5 698 4-17. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Xoma), ColUgan, mint ·** ♦ fent; Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent, amely szabadalmak és publikációk mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a. kitanitás részét képezi.
tegai egy anti-lt-12
Á találmány szerinti ellenanyagokat anyagot kódoló nukieinsav alkalmazásával is, transzgenikus állatot előállítva, mint 5 kecskéket, szarvasmarhákat, lovakat, juhokat es hasonlókat, amelyek ilyen el termelnek a tejükben. Ilyen állatokat ismert eljárások alkalmazásával biztosíthatunk [ rasu például nem korlátozó példaként az 5 827 690.; 5 849 992.; 4 877316,; 5 849 992., 5 994 6lő.; 5 565 362.; 5 304 4S9. számú amerikai- egyesült államokbeli szabadalmi iratokat és hasonlókat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részéi képezi}.
Találmány szerinti ellenanyagokat továbbá előállíthatunk legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot kódoló nukieinsav alkalmazásával, transzgenikus növényeket és növényi sejteket (például nem korlátozó példaként dohányt és kukoricát) biztosítva, amelyek ilyen ellenanyagokat, meghatározott részleteket és variánsokat termeinek, a növényi részekben vagy az azokból kitenyésziett sejtekben. Nem korlátozó példaként rekombínáns fehérjét expresszáió transzgenikus dohányleveleket sikeresen alkalmaztak nagy mennyiségű rekombínáns fehérje biztosítására, például indukálható promóter alkalmazásával [lásd például Cramer és mtsai., Curr. Top. Mierobol. Immunoi. 240, 95-118. oki. (1999), és az abban idézett hivatkozásokat], Ezenkívül transzgenikus kukoricát alkalmaztak emlős fehériék exp-resszáltatására kereskedelmi mennyiségben, más rekombínáns expressziós rendszerekben előállított vagy természetes ferráshól tisztított fehérjékével ekvivalens aktivitással (lásd például Hood és mtsai., .Adv.. Exp. Med. Bioi. 464, 127-147. old, (1999), és az abban idézett hivatkozásokat]. Ellenanyagokat nagy mennyiségben előállítottak transzgenikus növényi magvakból is, beleértve ellenanyag fragurenseket, mint például egyláneó ellenanyagokat (scFv), például dohánymagokban és burgonyagutnőkban [lásd például Conrad és mtsai., Plánt Mól Bioi. 38, 101-109. old. (1998), es az abban idézett hivatkozásokat}. Ily módon a találmány szerinti ellenanyagokat előállíthatjuk transzgenikus növények alkalmazásával Is, ismert eljárások alkalmazásával (lásd még például Físcher és mtsai., Biotechnol, Appl. Bioehem. 30, 99-108. old. (1999), Ma és mtsai., Trends Biotechnol. 13, 522-527. old. (1995);
Ma és mtsai., Plánt Physiol 109, 341-346. old. (1995); Whitelam és mtsai., Bioehem. Soc.
Trans. 22, 940-944. old. (1994); és az azokban idézeti hivatkozásokat]. Lásd továbbá az általánosságban a növényi ellenanyag-expressziős rendszerek nem korlátozó példájaként, A fent idézett referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét isii}
A találmány szerinti ellenanyagok széles tartományban lévő affinitással (Ko) képesek kötődni humán tt-12-höz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint legalább egy találmány szerinti humán monoklonális ellenanyag képes adott esetben magas affinitással kötődni humán ít- 12-höz. Például humán monoklonális ellenanyag 10'7 M vagy kisebb K^-vel kötődhet humán ft-12-höz, mint például nem korlátozó példaként 0,1-9,9 (vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül) X 10'7, 10's, lö*9, 1O'!ÍJ, ÍO*n, lÖi2, lö*13 vagy bármilyen tartomány vagy érték azon belül.
Egy ellenanyag antigén iránti affinitását vagy avíditását kísérletesen határozhatjuk meg bármilyen megfelelő eljárás alkalmazásával (lásd például Berzofsky és mtsai., „Antibody-Antigén ínteracdons”, „Fundamental Immunology”, szerit..: Paul, W. £., kiad.: Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis, „Immnnology”; kiad.: W. H. .Freeman and Company: New York, NY (1992); és az. azokban leírt eljárások). Egy adott ellenanyagantigén kölcsönhatás mért affinitása változhat, ha különböző körülmények között mérjük (például sökoneenlráció, pH}. Sy módon az affinitás és egyéb antigén-kötési paraméterek (például Κπ, K, K) mérését előnyösen ellenanyag és antigén standardizált oldataival végezzük, és standardizált pufferrel, mint például a leírásban Ismertetett pufferrel.
A találmány szerinti isformáció, mint például az 1 , 2., 3., 4., 5., 6., 7.,
8. azonosítószámú szekvenciák, azok meghatározod íragmensei, variánsai és konszenzus szekvenciái közül legalább egynek az összefüggő ammosavaínak legalább 70-100%-át kódoló nnkleoiid-szekvendák. vagy legalább egy ilyen szekvenciát, tartalmazó letétbe helyezett vektor alkalmazásával legalább egy antí-IL-12 ellenanyagot kódoló találmány szerinti nukleinsav-molekula előállítható a leírásban feltárt, vagy a szakterületen Ismert eljárás alkalmazásával.
Találmány szerinti nükleínsav-molekulák lehetnek RNS formájában, mint például mRNS, hnRNS, tRHS vagy bármilyen más forma, vagy DNS formájában, nem korlátozó példaként klónozással nyert vagy szintetikusan előállított cDNS vagy genomiáüs DNS forma, vagy ezek bármilyen kombinációja, A DNS lehet háromszálú, kétszálú vagy egyszáiü, vagy ezek bármilyen kombinációja. A DNS vagy RNS legalább egy szálának bármely részlete lehet a kódoló szál, amit szensz szálként ís ismerünk, vagy lehet a nem kódoló szál, amit anliszensz szálnak is nevezünk,
Találmány szerinti izolált nukleínsav-molekulák közé tartozhatnak olyan nukleinsavmolekulák, amelyek tartalmaznak egy nyílt leolvasási fázist (0RF), adod esetben egy vagy több intronnak például nem korlátozó példaként legalább egy nehézláne (például 1-3, φ ** φ* φ φ * * »· *
ΦΦΧ ** ** 'X
-20azoRoslíősztoú szekvencia) vagy legalább egy könnyúlánc (például 4-6. azonosítószámú szekvencia) legalább egy CDR-jének, mint például CDR.1, CBR2 és/vagy CDR3 legalább egy megbatározott részletét; anti-IL-12 ellenanyag vagy variábilis régió (például ?., 8. azonosítószámú szekvencia) kódoló szekvenciáját tartalmazó nukleínsav-molekuiákaí; és olyan nukieinsav-molekulákaL amelyek a fent bemutatottaktól lényegesen különbőznek, de amelyek a genetikai kőd degeneráltsága miatt még mindig legalább egy találmány szerinti és/vagy a szakterületen Isméid anti-IL-12 ellenanyagot kódolnak. Természetesen a genetikai kód jól ismert a szakterületen. Ily módón a szakember számára rutin lenne olyan degeneráh nukieinsav-variánsokaf előállítani, amelyek találmány szerinti specifikus anti-IL-12 ellenanyagokat kódolnak (lásd például Ausuhel és mtsai., mint fent), és ilyen nukleinsavvartánsok a találmány tárgyát képezi . Találmány szerinti nukieinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak a 10-15. azonosítószámú szekvenciák, amelyek sorrendben a HC CDR.1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDRÍ, LC CDR2, LC CDRX HC variábilis régiókat és az LC variábilis régiót kódoló nem korlátozó nnkieinsavaknak felelnek meg.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát izolált nukieinsav-molekulák képezik, amelyek olyan anti-TNF ellenanyagot kódolnak, amelynek az aminosavés néven és szekvenciáját a
ATCC letéti számon,
-án letétbe helyezett plazmidofcban található nukleinsav kódolja.
Amint a leírásban jelezzük, anti-IL~12 ellenanyagot kódoló nukleínsavat tartalmazó találmány szerinti nukieinsav-molekulák nem korlátozó példái közé tartoznak azok, amelyek magának az eHenanyag-ífagniensnek az amínosav-szekvenciáját kódolják; egy teljes ellenanyag vagy részletének a kódoló szekvenciáját, ellenanyag, rfagmens vagy részlet, valamim további szekvenciák kódoló szekvenciáját, mint például legalább egy szígnálszekvencia vagy fúziós fehérje kódoló szekvenciáját, a fent említett további szekvenciákkal vagy azok nélkül, mint például legalább egy intronnal, együtt további nem kódoló szekvenciákkal, nem korlátozó példaként beleértve átírt nem kódoló 5’ és 3’ szekvenciákat; azokat a nem kódoló szekvenciákat, amelyek szerepet játszanak a transzkripcióban, mRNS-fekloigozáshan, beleértve a „splicíng”-et és poliadenilációs szignálokat (például riboszóma-kötés és mRNS stabilitása), további aminosavakat kódoló további szekvencia, mint például amelyek további funkciókat biztosítanak. Ily módon egy ellenanyagot kódoló szekvenciát fezionáltathatunk egy jelző szekvenciához, mint például olyan pepiidet kódoló szekvenciához, amely elősegíti az elienanyag-fragmenst vagy részletet tartalmazó .tüzíonáltaíott ellenanyag tisztítását.
-21 Találmány szerinti poibukleotidhoz szelektíven hihridizáfó polínukleetídok
A találmány tárgyát izolált nükleiusavak képezik, amelyek hibridizálnak szeletóv hibridizációs körülmények között találmány szerinti pohnukieotidhoz. ily módon az ezen megvalósítási mód szerinti polinukleotídok alkalmazhatók ilyen poKnukleotidokat tartalmazó nuklemsavak Izolálására, detektálására és/vagy mennyiségi meghatározására, Például találmány szerinti polbukleotidok alkalmazhatók részleges vagy teljes hosszúságú kiónok azonosítására, izolálására vagy aniphfrkálására letétbe helyezett könyvtárban:. Bizonyos megvalósítási módok szerint a pohnukleotidok izolált, vagy humán vagy emlős nukleinsavkönyvtárból származó cBNS-sel másképpen komplementer genomíális szekvenciák vagy eDN S-szekvenci ák.
Előnyösen a eDNS-köayvtár legalább 80% teljes hosszúságú szekvenciát előnyösen legalább 85% vagy 90%· teljes hosszúságú szekvenciát, és előnyösebben legalább 95% teljes hosszúságú szekvenciát tartalmaz.. A cBNS-könyviáraí normalizálhatjuk, hogy növeljük a ritka szekvenciák reprezentációját. Tipikusan, de nem kizárólagosan alacsony vagy közepes sztringensségü hibridizációs körülményeket alkalmazunk olyan szekvenciákkal, amelyeknek csökkentett a szekvencia-azonossága komplementer szekvenciákhoz viszonyítva. Adott esetben közepes és magas sztringensségü körülményeket alkalmazhatunk nagyobb azonosságé szekvenciák esetében, .Az alacsony sztringensségü körülmények lehetővé teszik körülbelül 70% szekvencia-azonosságé szekvenciák szelektív hibridizálását, és alkalmazhatók ottológ vagy paralóg szekvenciák azonosítására.
Adott esetben találmány szerinti polbukleoúdok találmány szerinti polbukleotidok által kódolt ellenanyag legalább egy részletét kódolhatják. A találmány szerinti poli.nokieotidok olyan nuklemsav-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek alkalmazhatók találmány szerinti ellenanyagot kódoló pohnukieotidhoz való szelektív hibridizációra lásd például
Ausubel, mint fent; Colligan, mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
N afctebsav&fc előállítása
A találmány szerinti izolált nukieinsavakat (a) rekombináns eljárások, (b) szintetikus módszerek, (c) tisztítási módszerek, vagy azok kombinációjával állíthatjuk elő, amint az jól ismert a szakterületen.
A nukleinsavak kényelmesen tartalmazhatnak szekvenciákat a találmány szerinti polinukieotid mellett. Például egy vagy több endonnkleáz restrikciós helyet tartalmazó többszörös klónozó helyet inzertáihaíunk a nukleinsavba, hogy elősegítsük a polinukieotid izolálását Ezenkívül transzlálható szekvenciákat ínzertálhatunk a találmány szerinti transziáit.
„t.
polimxkieolíd izolálásának elősegítésére.. Például egy hexa-hisztidín jelzőszekvenoía kényelmes lehetőséget biztosit találmány szerinti fehérjék tisztítására. A találmány szerinti nukleinsav kódoló szekvenciája mellett megtalál ható nukleinsav adott esetben egy vektor, vagy kapcsolómolekula a találmány szerinti polinukleotid klónozására és/vagy expresszáítatására.
További szekvenciákat is alkalmazhatunk, mint példáid klónozó és/vagy expressziós szekvenciákat, hogy optimalizáljuk azok funkcióját a klónozásban és/vagy expresszáltatásban, hogy elősegítsük a polinukleotid Izolálását, vagy hogy javítsuk a poiinukleotídnak sejtbe történő bejuttatását. Klónozó vektorok, expressziós vektorok, adapterek és kapcsolómolekulák alkalmazása jói ismert a szakterületen (lásd például Áusubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent)
Rekombináns eljárások nukíeinsavak előállítására
A találmány szerinti izolált nuklemsav-készítmények, mint például RNS, eDNS, genomiális DNS vagy azok bármilyen kombinációja előállítható biológiai forrásokból, a .15 szakember számára ismert számos klónozás? módszer alkalmazásával. Bizonyos megvalósítási módok szerint olyan okgonukleotid-próbákal alkalmazunk a kívánt szekvencia azonosítására cDNS- vagy genomiális könyvtárban, amelyek sztringens körülmények között szelektíven bibridizáltiak a találmány szerinti polinukleotídökhoz. §NS izolálása és eDNS- és genomiális könyvtárak készítése jól ismert a. szakember szántára (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Sambrook, mint fent)
A’nktóusav szkrínslési és izoíálásí eljárások eDNS- vagy genomiális könyvtárat találmány szerinti polinukleotid szekvenciáján alapuló próbával szkrinelbeiünk, mint például amilyeneket feltárunk a leírásban. Próbákat alkalmazhatunk genomiális DNS-sel vagy cDNS-szekvenciákkal történő hibridizáiásra, hogy homológ géneket izoláljunk ugyanabban vagy különböző organizmusokban, A szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző sztringensségü hibridizációt alkalmazhatunk a vizsgálati eljárásban, és vagy a hibridizációs, vagy a mosási közeg lehet, szíri ágens. Ahogyan a hibridizációs körülmények sztringensébbé válnak, nagyobb mértékű komplementaritásnak' kell lennie a próba és a célszekveneís között, hogy kialakuljon a duplex, A sztríngensség mértékét a hőmérséklet, ionerősség, pH és részlegesen denaturáló oldószerek, mint például lörmamid közül egv vagy több alkalmazásával szabályozhatjuk. Például a hibridizáció szíri ngensségét kényelmesen változtathatjuk a reagensoldat polaritásának változtatásával, például a formásaid koncentrációjának manipulálásával 0% és 50% közötti tartományban. A.
ι,
-23 detektálható kötődéshez szükséges komplementaritás mértéke (szekvencia-azonosság) változhat a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének megfelelően. A komplementaritás mértéke optimális esetben 100%, vagy 70-100%, vagy bármely tartomány vagy érték azok között, Azonban nyilvánvaló, hogy a próba és a Iáncinditők kisebb szekvencia-variációit kompenzálhatjuk a hibridizációs közeg és/vagy mosási közeg sztringensségének csökkentésével.
RNS vagy DNS amplifikálására szolgáló eljárások jói ismertek a szakterületen, és alkalmazhatók a találmány szerint, indokolatlan kísérletezés nélkül, a leírás szerinti kitanítás és iránymutatás alapján.
Ismert. DNS vagy RNS ampílfikáctós eljárások nem korlátozó példái közé tartozik a polimeráz-láncreakció (PCR) és azzal rokon ampllrikációs eljárások [lásd például a 4 683 195., 4 683 202., 4 795,699.., 4 965 188. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokat (Muilis és mtsai..); a 4. és 4 921 794. szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi Iratokat ('labor és mtsai.); az 5 142,033. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Intés); az 5. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Wílson és mtsai.); az 5 091 310, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (hmls); az 5 Öóő 584. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gyilensten és mtsai.); a 4. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Gelhwd és mtsai ); a 4 994 370, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Silver és mtsai.); a
4 766 067. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Bisvvas); a 4 656 134.
számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Rlngold)] , és RNS-közvetített ampihikáeíö, amely a céhzekveneia elleni antiszensz RNS-t alkalmaz templátként a kétszálú DNS szintéziséhez [5 130 238, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Malek és mtsai ), kereskedelmi neve HASSA], amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi (lásd például Ausubel, mint fent; vagy Samhrook, mint fent).
Például polimeráz-lánereakeiő (PCR) technológiát, alkalmazhatunk találmány szerinti polinukieotidok és rokon gének szekvenciáinak az ampl ifíkálására. közvetlenül genomíális DNS vagy cDNS-könyvtárakhól A PCR és egyéb in rirro amplifíkációs eljárások szintén hasznosak lehetnek, például olyan nuklainsav-szekveneiák klónozására, amelyek expresszálandó fehérjéket kódolnak, kívánt mRNS mintában való jelenlétének detektálására szolgáló próbák, készítésére, nnkleinsav-szekvenálásra, vagy más célokra. Szakember számára az íz? ví/zö amplifíkációs eljárások tekintetében elegendő útmutatást nyújtó módszerek példái találhatók az alábbi irodalmi helyeken. Berger, mint fent, Samhrook, mint lent, és Áusnbel, mint fent, valamint Muöis és mtsai,, 4 68.3 202, számú amerikai egyesült államokbeli ♦ *
- 24 szabadalmi irat (1987); és Innis és mtsai, ”PCR Protocols A Guide to Methods and Applications”, kiad.; Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészletek genomtálís PCR. amphfíkáeióra ismertek a szakterületen [lásd például Jrótzomgo-GC Genom/c OO (Ciontech)]. Ezenfelül például a 52 .fehérje (Boehringer Mannheim) alkalmazható a hosszú P€R~termékek kitermelésének javítására,
Szintetikus eljárások nukleinsavak előállítására
A találmány szerinti izolált nukleinsavakat előállíthatjuk közvetlen kémiai szintézissel is, ismert eljárások alkalmazásával (lásd például Ausnbel, és mtsai., mint fent). A kémiai szintézis általában egvszálú oligonukleotíd eredményez, amelyet átalakíthatunk kéfszálú
DNS-sé komplementer szállal történő hibridizálás útján, vagy DNS-polímerázzal történő pohmerizácioval, az egvszálú DNS-t terápiáiként alkalmazva. Szakember számára nyilvánvaló, hogy míg a DNS kémiai szintézise korlátozott lehet körülbelül 100 vagy több bázis hosszúságú szekvenciákra, hosszabb szekvenciákat előállít hatunk rövidebb szekvenciák Ugatásával.
Rekombínáns expressziós kazetták
A találmány tárgyát képezik továbbá találmány szerinti mklemsavat tartalmazó rekombináns expressziős kazetták, Találmány szerinti nukleínsavat, például találmány szerinti ellenanyagot kódoló cDNS-t vagy genomíális szekvenciát alkalmazhatunk olyan rekombináns expressziós kazetta előállítására, amelyet bejuttathatunk legalább egv kívánt gazdasejtbe. Egy rekombináns expressziós kazetta tipikusan találmány szerinti poHnukleoíídot tartalmazhat működőképesen kapcsolva transzkripciós iniciációs szabályozó szekvenciákhoz, amelyek irányiíhaíják a pohnukleotid transzkripcióját a tervezett gazdasejthen. Mind heterológ, mind nem heterológ (azaz endogén) promótereket alkalmazhatunk találmány szerinti nukleinsavak expresszáitatásának irányítására,
Bizonyos megvalósítási módok szerint promóterként, enhancerként vagy más elemként szolgáló izolált nukleinsavakat juttathatunk be megfelelő pozícióban (leolvasással ellentétes hányban, leolvasással megegyező irányban vagy latronként) a találmány szerinti polínukleofid nem heterológ formájához képest, hogy serkentsük vagy gátoljuk találmány szerinti pohnukleotid expresszióját Például endogén promótereket módosíthatunk »? w vagy ín vúro, mutációval, delérióval és/vagy szubsztitúcióval,
Vektorok és gazdasejtek
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan vektorok Is, amelyek találmány szerinti izolált nukleínsav-molekuiákat tartalmaznak, gazdasejtek, amelyek génsebészeti úton módosítva vannak a rekombináns vektorokkal, és legalább egy anti-íL-12 ellenanyag
0-4 9 0
ΙΟ rekombináns módszerekkel történő előállítása, amint az jól ismert a szakterületen ( lásd például S&mbrook és mtsai,, mint fent; Ausubel és mtsai., mint fent, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi).
Á poiinukleolidokaí adott esetben összekapcsolhatjuk egy szelektálható markért tartalmazó vektorral, gazdában való szaporítás céljából. Általában plazmíd vektort. csapadékban juttatunk be, mint például kalcium-foszfátos kiesapássai, vagy töltött lipiddel alkotott komplexben. Ha vektor egy vírus, azt ú? ríme csomagolhatjuk egy megfelelő csomagoló sejtvonal alkalmazásával, és azután transzdukálhatjuk gazdasejtekbe.
A DNS-inzertnek működőképesen kapcsolva kell lennie egy megfelelő promóterhez. Az expressziós konstrukciók továbbá tartalmazhatnak helyeket a transzkripció iniciálására, terminálására, és az átírt régióban egy riboszóma-kötő helyet a transzlációhoz. A konstrukciók által expresszált érett transzkriptumok kódoló részlete előnyösen tartalmazhat egy transzlációs inieíátort az elején, és egy terminációs kodon! (például UAA, UGÁ vagy UAG) megfelelőéit elhelyezve a transzlálandő mRNS végénél, ahol az UAA és UAG előnyös· emlős vagy eukariőta sejtes expresszíő esetében.
Expressziós vektorok előnyös - de csak opcionálisan - tartalmazhatnak legalább egy szelektálható markért. Ilyen ntarkerek nem korlátozó példái közé tartozik a metotrexát (MTX), dihidrofoláí-reduktáz
399 216.; 4 634 665.; 4.; 4 956 288.; 5 149 636.;
179 017. számú amerikai egyesölt államokbeli szabadalmi iratok), ampicillin, neomicin (G418), mikofenolsav vagy giuíamin-szmteíáz (GS, 5 122 464.; 5 770 359,;: 5 827 739. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok) rezisztencia eukariőta sejttenyészet esetén, és tetraeiklin vagy ampicdhn rezisztenciagén £.. coh'-ban, vagy más baktériumokban vagy prokariótákban történő klónozás esetén (a fenti szabadalmak teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik). Megfelelő tenyésztő tápközegek és körülmények ismertek a szakterületen a fent ismertetett gazdasejtek számára. Alkalmas vektorok nyilvánvalóak a szakember számára. Vektor konstrukció g&zdasejibe történő bejuttatását kahrimn-íosxtáíos transzfekcióval; DEAB-dextrán-közvetltett transzfekcióval, kationos lipld által közvetített Iranszfekcióvak elektroporácíóvah trahszdnkclőval, fertőzéssel vagy más eljárásokkal hajthatjuk végre. Ilyen eljárásokat leírtak a szakirodalomban, mint például Sambrook; mint
3(1 fent, 1-4... és 16-18. fejezet; Ausubel, mint fent, 19., 13., 15. és 16. fejezet.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyagot expresszáltathatunk módosított formában, mint például fúziós fehérjeként, és nemcsak szekréciós szignálokat alkalmazhatunk, hanem további heterelóg funkcionális régiókat is. Például további aminosavak, különösen töltött aminosavak egy szakaszát adhatjuk egy ellenanyag Nterminálisából, hogy javítsuk a stabilitását és megmaradását a gazdasejtben, a tisztítás folyamán vagy az azt követő kezelés és tárolás folyamán. Ezenkívül peptid-ntolekuiarészekeí is hozzáadhatunk a találmány szerinti ellenanyaghoz, hogy elősegítsük a tisztítását. Az. ilyen régiókat eltávolíthatjuk az ellenanyag, vagy legalább annak egy fragmensének végső elkészítését megelőzően. Ilyen eljárásokat sok standard laboratóriumi kézikönyvben ismertettek, mint például Samhrook, mint fent, 17.29-17.42. és 18.1-18.74. fejezet; Ausubel, mint. fent, 16., 17, és 18. fejezel.
Az átlagos tudású szakember járatos a találmány szerinti fehérjét kódoló nukieinsav expresszálfafására beszerezhető számos expresszíós rendszerben.
Más megoldásképpen találmány szerinti nukleinsavakat sxpresszáltathatuak gazdasejtben, találmány szerinti ellenanyagot kódoló endogén DNS-t tartalmazó gazdasejt (manipuláció útján történő) bekapcsolásával Ilyen eljárások jól ismertek a szakterületen, mint például az 5 580 734., 5 641 670.. 5 733 746. és 5 733 761, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok feltárása, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét képezi.
Az ellenanyagok, meghatározott részeik vagy variánsaik termeltetésére alkalmas szemléltető sejftenyészetek az emlős sejtek. Az emlős sejtes rendszerek gyakran sejtek egysejt.es rétegének formájában lehetnek, habár emlőssejt-szuszpenziók vagy bíoreaktorok is alkalmazhatók. Számos, intakt ghkozilált fehérjék expresszálására képes megfelelő gazdasejt20 vonalat kifejlesztettek a szakterületen, mint például a COS-1 (például ATCC CRL 1650), COS-? (például ATCC CRL-lőSI), ΗΕΚ293, BHK21 (például ATCC CRL-10), CHO (például ATCC CRL- 1610) és BSC-1 (például ATCC CRL-26) sejtvonalakat. Cos-? sejteket, CHO sejteket, hep G2 sejteket, P3X63Ag8.653, S'P2ZG*Agl4s 293 sejteket, HeLa sejteket és hasonlókat, amelyek könnyen beszerezhetők például az ’American Type Culture ColíeeliotC25 tói (Manassas, Va, wW.atco. org). Előnyös gazdasejtek közé tartoznak a nyírokeredetu sejtek, mint például míelóma és limföma sejtek. Különösen előnyös gazdasejtek a P3X63Ag8.653 sejtek (ATCC CRL-158Ö) es SP2/b-Ag14 sejtek (ATCC CRL-1851). Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns sejt P3X63Áb8.653 vagy SP2/0AgI4 sejt.
Áz ezekben a sejtekben alkalmazható expressziös vektorok tartalmazhatnak az alábbi nem korlátozó példaként szolgáló expresszíós szabályozó szekvenciák közül egyet vagy többet: replíkációs origó, promóter (például a késői vagy korai SV40 protnóter, az CMV promöter (5 168 ÖŐ2. és 5 385 839. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok), HSY tk promöter, pgk (föszfoglicerál-kmáz) promöter, EF-1 alfa promöter (5 266 491. számú
·. *
X-lfV λ
Φ *
Φ S * * * ** ** # φ ♦ Φ * ««φ Μ»Φ **
-27amerikaí egyesült államokbeli szabadalmi irat), legalább egy humán immunglobulin promóter]; enhancer és/vagy feldolgozási információs hely, mint például riboszóma-kötő hely, RNS ’spltcing’ hely, poliaderóláciős hely (példán! S-V4Ö nagy T antigén poíí-A addíciós hely), és transzkripciós terminátor szekvenciák (lásd például Ausubel, -és mtsai., mint fent;
Sambrook és mtsai., mint fent). Találmány szerinti nukleinsavak vagy fehérjék előállítására alkalmas egyéb sejtek ismertek -és/vagy beszerezhetők például az 'American Type Culíure Colleetion Catalogue of Cell Lines and Hybridomas’-toi (ww; atcc.org) vagy más Ismert vagy kereskedelmi forrásokból.
Amikor eukarióía gazdasejteket alkalmazunk, tipikusan políadenílácios vagy l ö transzkripciós terminátor szekvenciákat építünk be a vektorba Terminátor szekvencia egy példája a szarvasmarha növekedési hormon génjéből származó poiiadenílációs szekvencia. Szintén alkalmazhatunk a íranszkripíum pontos „sphcing”jére szolgáló szekvenciákat is, ’Splicíng” szekvencia egy példája az SV4ö-böl származó VP1 intron [Spragué, és mtsai., J. Viroi. 45, 773-781, old, (1983)]. Ezenkívül a gazdasejtben történő replikáció szabályozására í 5- szolgáló génszekvenciákat i-s beépíthetünk a vektorba,, amint az ismeri a szakterületen.
Ellenanyag tisztítása
Ánti~iL~12 ellenanyagot jól ismert eljárások alkalmazásával nyerhetünk vissza és tisztíthatunk rekombínáns sej tteny eszet ékből, nem korlátozó példaként proteín-A tisztítással, ammóníum-szulfátos vagy etanoios kícsapással, savas extrakcíóval anion- vagy kationcserélő kromatográfiával feszfccelluíóz kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, affiniíási kromatográfiával, hidroxilapuik kromatográfiával és lekfin kromatográfiával. Nagyteljesítményű tólvadékkromatográfiát {„HPLC”) is alkalmazhatunk a tisztításra [lásd például Colligan, „Current Protocols in Immunology”, vagy „Current Protocols in Protein
Science”, kiad.: John Wiíey Sons, NY, NY, (1997-2001), például az T, 4., 6„ 8.,. 9., 10. fejezet, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét képezi],
A találmány szerinti ellenanyagok természetes úton tisztított termékek, kémiai szintézis eljárások termékei, és rekombínáns módszerekkel eukarióta gazdából, többek között például élesztő, magasabbrendu növényi, rovar és emlős sejtekből előállított termékek, A rekombínáns tenyésztési előállítási alkalmazott gazdától függően a találmány szerinti ellenanyag lehet glikozilált vagy lehet ghkoziláiatlan, ahol a glikozilált előnyös. Ilyen eljárásokat leírtak sok standard laboratóriumi kézikönyvben, mint például Sambrook, mint fent, 17.37-17.42. szakaszok; Ausubel mint fent, 10., 12., 13., ló., 18. és 20. szakaszok, Colligan, * . Λν *♦ ♦* « :·»· V » s X * * * * « ν'*» »Κ ♦ ♦ * „ « « * .*- *
- 28 „Protein Science”, mini fent, 12-14, szakaszok, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás álján a kitanítás részét képezi,
JI-12 elteiMmyag&k
A találmány szerinti Izolált ellenanyagok a találmány szerinti polinukleotidok bármelyike által kódolt ellenanyagot tartalmaznak, amint a leírásban részletesebben is izolált vagy el k; vagy ellenanyagot. Előnyösen a humán ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens humán IL- 12-t köt, és ezáltal részlegesen vagy lényegében semlegesíti a fehérje legalább egy biológiai aktivitását. Ellenanyag vagy annak meghatározott részlete vagy variánsa, amely részlegesen vagy előnyösen lényegében semlegesíti legalább 10 egy IL-12 fehérje vagy fragmens legalább egy aktivitását, kötheti a fehérjét vagy fragmenst, és ezáltal gátolhatja a IL-12-nek az Η,-12-recepíofhoz. való kötődésén vagy más IL-12~től függő vagy azáltal közvetített mechanizmuson keresztül történő aktivitását. A leírás szerinti értelemben „semlegesítő ellenanyag” alatt olyan ellenanyagot értünk, amely képes gátolni egy TNF-fúggö aktivitást körülbelül 2Ö-12ö%-kal, előnyösen legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 15 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 0,94, 96, 97, 98, 99, 100%-kal vagy jobban, a vizsgálati eljárástól függően. Egy anti-IL-12 ellenanyag képességét ΙΕ-12-iuggo aktivitás gátlására előnyösen legalább egy alkalmas IL-12-febérje vagy -receptor vizsgálati eljárással állapítjuk meg, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Találmány szerinti humán ellenanyag bármilyen osztályba (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, stb.) vagy 20 izotipusba tartozhat, és tartalmazhat kappa vagy lamhda könnyűláncot. Egy megvalósítási mód szerint a humán ellenanyag IgG nehézláncot vagy meghatározott fragmenst tartalmaz, például az IgGL, lgG2, IgG3 vagy ígG4 izotípusok legalább egyikét. Ilyen típusú ellenanyagokat transzgenikus egerek vagy más transzgenikus nem humán emlősök alkalmazásával állíthatunk elő, amelyek legalább egy humán kőnnyüláne [például IgG, IgA és 25 IgM (például yl, y2, ye, y4)j transzgént tartalmaznak, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen. Bgy másik megvalósítási mód szerint, az anti-bumán IL-12 ellenanyag IgGl nehézláneot és IgGl könnyűláncot tartalmaz.
Legalább egy találmány szerinti ellenanyag kötődik legalább egy meghatározott epitóphoz, amely specifikus legalább egy IL-12 fehérjére, alegységre, fragmensre, részletre 30 vagy azok bármilyen kombinációjára. A legalább egy epitóp legalább egy ellenanyag-kötő régiót tartalmazhat, amely a fehérje legalább egy olyan részletét, tartalmazza, amely epitóp előnyösen a fehérje legalább egy extracelluláris, oldható, hidrofil, külső vagy citoplazmafíkus részletét tartalmazza. A legalább egy meghatározott epitóp a 9. azonosítószámú szekvencia
4» * . 4 » X ·*·*· * 4 * * ' *
-29összefüggő aminosavainak teljes meghatározott részletének legalább egy 1-3 aminosav hosszúságú legalább egy amlnosav-szekvencíájának bármilyen kombinációját tartalmazhatja.
Általában a találmány szerinti hunián ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens olyan antigén-kötő régiói tartalmazhat, amely legalább egy humán komplementaritást meghatározó régiót (€DR1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy nehézlánc variábilis régió variánsát és legalább egy humán komplementaritást meghatározó régiót (CDR 1, CDR2 vagy CDR3), vagy legalább egy könnyuiánc variábilis régió variánsát tartalmazhatja. Nem korlátozó példaként az ellenanyag vagy antigén-kötő részlet vagy variáns tartalmazhat legalább egy 3. azonosítószámú szekvencia szerinti nehézlánc CDR3-at és/vagy 6, azonosítószámú szekvencia szerinti könnyülánc -CDR3-at. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens tartalmazhat egy olyan antigén-kötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő L, 2. -és/vagy 3. CDR (például 1., 2, és/vagy 3 azonosítószámú szekvencia) amlnosav-szekvenciaiával rendelkező nehézlánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigen-köíö részlet vagy variáns tartalmazhat egy olyan antigénkötő régiót, amely legalább egy, a megfelelő L, 2. és/vagy 3, CDR (például 4.» 5. és/vagy ó. azonosítószámú szekvencia) aminösav-szekvencíájával rendelkező könnyülánc CDR (azaz CDR1, CDR2 és/vagy CDR3) legalább egy részletét tartalmazza. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az ellenanyag vagy antigén-kötő fragmens három nehézlánc CDR-jének és a három könnyülánc CDR-jének a.z aminosav-szekvenciája a leírásban feltárt I2B75, €340, vagy bármely egyéb monoklonális ellenanyagok legalább egyikének a megfelelő CDR aminosav-szekvenciája. Ilyen ellenanyagokat előállíthatunk az ellenanyag különböző részleteinek (például CDR, vázrégió) kémiai összekapcsolásával, hagyományos módszerek alkalmazásával, az ellenanyagot kódoló (egy vagy több) nukleínsav-molekula előállításával és expresszáltatásával, rekombináns DNS technológia hagyományos módszereinek alkalmazásával, vagy bármely más alkalmas eljárás alkalmazásával.
Az anti-IL-12 ellenanyag legalább egy. megbatározott aminosav-szekvenelájú nehéz vagy könnyülánc variábilis régiót tartalmazhat. Például egy előnyös megvalósítási mód szerint az anti-IL-12 ellenanyag legalább egy nehézlánc variábilis régió - amelynek adott esetben a 7 azonosítószámú szekvencia szerinti a szekvenciája - és/vagy legalább egy könnyülánc variábilis régió - amelynek adott esetben a 8. azonosítószámú szekvencia, szerinti a szekvenciája -- legalább egyikét tartalmazza. Humán Π.,-12-höz kötődő ellenanyagok, amelyek meghatározott nehéz és könnyülánc variábilis régiót tartalmaznak, alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatók elő, mint például fagprezentáclóva! [Katsube,. Y. és mtsai ., ♦****«* * » '*»·*- *♦- „'**.,
..-· m * 9 * 'X *
Λ·Α'*ί .««<-» ** X··
... 31 Név.......
Hármas nukleotid kodon(ok) j Egy betűs kód | Hárombetűs kód A í Áh
Alanin IGCA, GCC, GCG, GCü
Ciszteín
UGÜ
Ászparagínsav i€, GAV
Glu I Glutaminsa
Phe j Fenilanío
Gly I Gliein
Kis 1 Hisztiéin
He j Izoleucin
Lys 1 Lizm
Metlo-nín Aszparagin 1 AAC, AAU
UUC, UGU ggáT'ggc; ggg, ggg fcACTCÁÖ' j ÁGáTaÜCAlJlT ΓαααΓααο
Jija7w jÁÜG
Asn
P Pro Prolin
Q R Gin Árg Giutamin Arginin
S 1 Ser Szerin Treonin
T j Tar
V 1 Val Valin
W | Trp Tripfotán
Tyr
CCA ccc, CCG, CCG caa’caö
AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGG
TAöCWüe^ |aga7acc7acgacü |güa7^c”güg^üü
IGAC, GAÜ
Találmány szerinti asti-IL-12 ellenanyag tartalmazhat, egy vagy több aminosavszubsztitúciót, deléciót vagy addieíót, akár természetes mutáció, akár emberi manipuláció eredményeképpen, amint a leírásban feltárjuk.
Természetesen azon arninosav-szubsztítúciók száma, amit -a szakember végezne, sok tényezőtől fögg, beleértve a lent leírtakat, Általánosságban, az aminosav-szubszíitúeiók, iszerdók vagy deléciók szánra bármely adott anti-IL-12 ellenanyag, fragmens vagy variáns esetében nem több, mint 4Ö, 30, 20, 19, 13, 17, 16, IS, 14, 13, 12, 11, lö, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,, 1, mint például 1-3Ö, vagy bármely tartomány vagy érték azok között, amint a leírásban
Találmány szerinti anti-í.L-12 ellenanyag funkció szerint esszenciális amínosavait azonosíthatjuk a szakteriileten ismert eljárások alkalmazásával, mint például helyspecifikus10 , 9^· ♦♦ .*♦. ** x * r. a $ * * · *' $ ··♦*...* '* to mutagenezisse! vagy alanin-pásztáző mutagenezisse! [például Ausubel, mint fent, 8., 15. fejezet; Cutmingh-am és Wells, Science 244, 1081-1085. old. (1989)]. Áz utóbbi eljárás egyedi •aiaaia mutációkat épít be a molekula minden egyes oldallánca helyett. A kapott mutáns molekulákat azután teszteljük biológiai aktivitásra, mint például nem korlátozó példaként legalább egy IL-12-1 semlegesítő aktivitásra. Áz ellenanyag-kötés szempontjából kritikus, helyeket azonosíthatjuk szerkezet elemzéssel is, mint például kristályosítással, magmágneses rezonanciával vagy fotoaíTmilási jelöléssel [Smitfe és mtsai., í. Mól. Siói. 224, 899-904. old. (1992) és de Vos és-mtsai., Science 255, 306-312. old. (1992)].
Találmány szerinti antí-IL-12 ellenanyag tartalmazhatja -·· de nem kizárólag - az 1., 2., 3., 4., .5.., 6. azonosítószámú szekvenciák legalább egyikének 5-től az összes összefüggő amínosavának számáig terjedő számú legalább egy részletét szekvenciáját vagy kombináTalálmány szerinti IL-12 -ellenanyagok vagy meghatározott részletek vagy variánsok tartalmazhatják -de nem 'kizárólag - az I. azonosítószámú szekvencia legalább 3-5 összefüggő aminosavát; a 2. azonosítószámú szekvencia 5-17 összefüggő amínosavál; a 3. azonosítószámú .szekvencia 5-10 összefüggő aminosavat; a 4. .azonosítószámú szekvencia 511 összefüggő aminosavat; az 5. azonosítószámú szekvencia 5-7 összefüggő aminosavat; a 6. azonosítószámú szekvencia 5-9 összefüggő amínosaváf; a 7 azonosítószámú szekvencia Leu21,!..ys76, Met83, Ser&5 auúnosavaif
Anfi-IL-12 ellenanyag továbbá tartalmazhatja adott esetben az. !.., 2., 3., 4., 5., 6., 7, vagy 8. azonosítószámú szekvenciák 5,17, lö, 11, 7, 9, 119 vagy 108 összefüggő aminosava legalább egyikének legalább 70-190%~át tartalmazó polipeptidet.
Egy megvalósítási mód szerint immunglobulin lánc vagy részlete (például variábilis régió, CDR) amínosav-szekvenciája körülbelül ?ő- 10054-ban (például 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%,. vagy bármely tartomány vagy érték ezek között) azonos a 7. vagy 8. azonosítószámú szekvenciák legalább egyike megfelelő láncának, aminosav-szekvencíájával. Például egy könnyúlánc variábilis régió anúnosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 8. azonosítószámú szekvenciával, vagy egy nehézlánc CDR3 ammosav-szekvenciáját összehasonlíthatjuk a 3 azonosítószámú szekvenciával. Előnyösen -a 70-100% aminosav-azonosságot (azaz 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, vagy bármely tartományt vagy értéket ezek között) alkalmas számítógép! algoritmus alkalmazásával határozhatjuk meg, amint az ismert a szakterületen.
Szemléltető nehézlánc és könnyúlánc variábilis régió szekvenciákat mutatunk be a 7, és 8. azonosítószámú szekvenciákon. A találmány szerinti ellenanyagok vagv azok
meghatározott variánsai tartalmazhatnak bármilyen számú összefüggő aminosav-o Idái láncot egy találmány szerinti ellenanyagból, ahol ez a szám egy ami-IL-12 ellenanyag összefüggő oldalláncúi számának 10-10ö%-a közötti egész számok bármelyike. Adott esetben az összefüggő aminosavak ezen szubszekveneiája legalább körülbelül 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100, 110 120 130 140 150 160,170, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210,
220, 230, 240, 250 vagy több aminosav hosszúságú, vagy bármely tartomány vagy érték ezek között. Ezenkívül az ilyen szubszekvenciák száma lehet bármilyen egész szám az 1 és 20 közöd, mint például legalább 2, 3, 4 vagy 5.
Amint & szakember számára nyilvánvaló, a találmány tárgya legalább egy, találmány 10 szerinti biológiailag aktív ellenanyag. A biológiailag aktív ellenanyagoknak az aktivitása legalább 20%-a, 30%-a vagy 40%-a, és előnyösen legalább 50%-a, 60%-a vagy 70%-a,. és legelőnyösebben legalább 80%-a, 90%-a. vagy 95%-10íM3%-a a natív (nem szintetikus), endogén vagy rokon és ismeri formának. Enzímatikus aktivitás és szubsztrát-speeifnás mérésére és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárások jól ismertek a szakember számára.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát humán ellenanyagok és antigén-kötő iragmensek képezik, amint azokat a leírásban feltárjuk, amelyek egy szerves molekularész kovalens kapcsolásával módosítva vannak Az ilyen módosítások olyan ellenanyagot vagy antigén-kötő íragmenst eredményezhetnek, amelynek javítottak a farmakokinetikai paraméterei (például megnövekedett m tró szérum-féléleíídó). A szerves molekularész lehet lineáris vagy elágazó hidrofil polimer-csoport., zsírsav-csoport vagy zsírsav-észter-esoport. Előnyös megvalósítási módok szerint a hidrofil polimer-csoportnak a molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 120000 Dalion között lehet, és az polialkángiikoi [például poheíilén-glikol (PEö), pohpropilén-glikol (PPG)], szénhidrát polimer, aminosav polimer vagy pobviml-pirtolidon lehet, és a zsírsav vagy zsírsav-észter csoport körülbelül 8 és körülbelül 40 közötti számú szénatomot tartalmazhat.
A találmány szerinti módosított, ellenanyagok és antigén-kötő íragmensek tartalmazhatnak egy vagy több szerves molekularészt, amely kovalensen kötődik az. ellenanyaghoz, akár közvetlenül, akár közvetetten. A találmány szerinti ellenanyaghoz vagy antigén-kötő tragmenshez kötött minden egyes szerves molekularész egymástól függetlenül lehet hidrofil polimer-csoport, zsírsav-csoport, vagy zsirsav-észter-csöport, A leírás szerinti értelemben a „zsírsav” kifejezés alatt monokarboxíl-savakat és dikarboxil-savakat értünk. A leírás szerinti értelemben „hidrofil polimer-csoport” kifejezés alatt olyan szerves polimert értünk, amely jobban oldódik vízben, mint ©klánban. Például a políiizin jobban oldódik
- 34vlzben, mint ötónban. Ily módon polilizin kovalens kapcsolásával módosított ellenanyag a taiábuány tárgykörébe tartozik., A találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas hidrofil polimerek lehetnek lineárisak vagy elágaznak, mint például políaikámgHkobk (példád PEG, monometoxj-políeriléö-glikol. (rnPEG), PPG és hasonlók], szénhidrátok (például dextrán, cellulóz, oligoszacharídok, poliszaeharidok és hasonlók), aminosavak polrmerjej (például polilizin, poliargínin, poííaszpartát és hasonlók), oxidok (például polietilén-oxíd, poliprolílén-oxid és hasonlók) és polivínil-pkrolídon. Előnyösen a találmány szerinti ellenanyagot módosító hidrofil polimer molekulatömege körülbelül 800 és körülbelül 150000 Dalion között van különálló molekuláris entitásként.
lö Például PBGsnoa és PEGnw· alkalmazható, ahol az alsó index a polimer Oaltonhan méri átlagos molekulatömege. A hidrofil polimer-csoport szubsztítuálva lehet körülbelül l~ő alkil-, zsírsav- vagy zsírsav-észter-csoporttal. Zsírsav- vagy zsírsav-észter-esoporttal szubsztítnált hidrofil polimereket megfelelő eljárások alkalmazásával állíthatunk elő. Például amiscsoportot tartalmazó polimert kapcsolhatjuk a zsírsav vagy zsírsav-észter karboxil15 csoportjához, és zsírsav vagy zsírsav-észter aktíváit karboxílját (például N,N-karbomldíimidazollal aktivált) kapcsolhatjuk a polimer hidroxil-esoportjához.
Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak és zsírsav-észterek lehetnek telítettek, vagy tartalmazhatnak egy vagy több telítetlen kötést. Találmány szerinti ellenanyagok módosítására alkalmas zsírsavak például az alábbiak: n-dodekanoát (Cn> laurát), n-tetradekanoát (Cu, mirísztát), n-octadekanoát (Cj«, sztearát), n-eíkozanoál (C20, arachidáí) n-dokozauoát (C22, bchenát), n-triakontanoát (C30), n-tetrakontanoát (C^), cisz-A9~ oktadekanoát (€«, oleát), összes cisz- Á5,SJ 1,14~eikozáttraenoát (C20, araohidonát), oktandionsav, tetradekándionsav, oktadekándíonsav, dokozándíonsav, és hasonlók. Alkalmas zsírsav-észterek közé tartoznak díkarboxílsavak olyan monoészíetei, amelyek lineáris vagy elágazó, kisebb szénatomszámó alkll-csoportot tartalmaznak, A kisebb szénatomszámú alkilcsoport tartalmazhat körülbelül 1-12, előnyösen körülbelül 1-6 szénatomot.
A módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő fragmenseket alkalmas eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, mint például egy vagy több módosító reagenssel történő reagáltatással. A leírás szerinti értelemben „módosító ágens” kifejezés alatt alkalmas szerves csoportot (például hidrofil polimert, zsírsavat, zsírsav-észter) értünk, amely aktiváló csoportot tartalmaz. Az „aktiváló csoport” olyan kémiai molekularész vagy funkciós csoport, amely megfelelő körülmények között - képes reagálni egy második kémiai csoporttal, és ezáltal kovalens kötést kialakítani a módosító ágens és a második kémiai csoport között. Például aniin-reaktiv aktiváló csoportok közé tartoznak elektrofil csoportok, mint például a toziláí.
mezilát, haló (Idoro,. hromo, ftuoro, jodo), N-hitboxászaikcinimídíl-észterek (NHS) és hasonlók. Ttotokkal reagáló aktiváló csoportok közé tartozik például a m&leimíd, jodoacetil.
akrítoil, pirídil-diszulfidök, 5~ttof~2-nitrobeazoesav-4íol (TNB-troí)·, és funkciós csoportot kapcsolhatunk amint vagy hidrazídof. tartalmazó molekulákhoz, és csoport reagáltatható trivalens foszfor-csoporttal, foszforamidát vagy fo sztorim! d kialakítva. Megfelelő eljárások aktiváló csoportok molekulákba történő beépítésére ismertek a szakiért!leien [lásd például Hermámon, G, T., „Bioconjugate Techníques,”, kiad,; Ácademíe Press. San Diego, CA (199ő)J. Aktiváló csoport köthető közveíienfíl a szerves csoporthoz (például hidrofil polimerhez, zsírsavhoz vagy zsírsav-észterhez), vagy kapcsoiömolekulán keresztül, például divalens Ci-Cn csoporton keresztül, amelyben egy vagy több szénatom helyettesíthető heteroatommal, mint például oxigénnel, nitrogénnel vagy kénnel Megfelelő kapcsolómolekulák közé tartozik például a tetraetilén-glikol, ~(C%)3-, -NH-ÍCHjL-NH-, -(CH2>NH- és -Clb-O-CHj-CHa-O-CHj-CH-O-CH-NB-. KapcsofómoiekuUt tartalmazó módosító ágenseket előállíthatunk például mono-Boc-alkíldiamín (például mono-Boe15 etiléndiamin, mono-Boc-diaminohexán) zsírsavval történő reagáltatásával l-etíl-3~(3dimetíiammopropil)~karbodíimid (EDC) jelenlétében, amid-kotést kialakítva a szabad amin és a zsírsav karboxilja között. A Boc védőcsoportot eltávolíthatjuk a termékről trifluoreeetsavval (TFA), szabaddá téve a primer amint, amely kapcsolható egy másik karboxilhoz, amint feltártuk, vagy reagáltatható maleinsav-auhidridtíek és a kapott terméket ciklízálhatjuk, a zsírsav aktivált maleimido-származékáí előállítva (lásd például Thompson és rntsai., WO-92/1622í. számú nemzetközi közzétételi írat, amelynek kitanítása teljes teriedeimében hivatkozás útján a kitamtás részét képezi).
A találmány szerinti módosított ellenanyagokat előállíthattok humán ellenanyag vagy antigén-kötő ífagmens módosító ágenssel történő reagáltatásával Például a szerves rnolekuiarészekei köthetjük az ellenanyaghoz nem specifikus módon, amin-reaktiv módosító ágens alkalmazásával, például PEG NHS-észterével. Módosított humán ellenanyagokat vagy antigén-kötő íragmenseket előállíthatunk ellenanyag vagy antigén-kötő ífagmens díszulíídkötéseinek (például láncon belüli díszuífid-köféseinek) redukálásával. A redukált ellenanyagot vagy antigén-kötő ífagmenst azután reagálíaíhatjuk tiol-rsaktív módosító ágenssel, találmány szerinti módosított ellenanyagot előállítva. Találmány szerinti ellenanyag specifikus helyeihez kötött szerves molekuiarészi tartalmazó módosított humán ellenanyagokat és antigén-kötő íragmenseket előállíthatunk megfelelő eljárások alkalmazásával, mint például reverz proteolízissel [Fisch és misai, Bioconjugate Chem. 3, 147-153. old.
(1992); Werien és rntsai, Bioconjugate Chem. 5, 411-417. old. (1994); Kumaran és rntsai., ♦ ·* ί ·>
- 36 Protein Sci. 6, 2233-2241, old. (1997); ltok és mtsai., Bioorg. Chem. 24,: 59-68. old, (1996); Capellas és mtsai.., Bíotechnol Bioeng. 56, 456-463. old. (1997)] és a Hermapson, G T. által leírt eljárásokkal („Bioconjugaíe Techuiques.''\ kiad.; Academtc Press; San Diego, CA (1996)].
Monoklonális és tóméra. anti-IL-12 ellenanyagok mellett a találmány tárgyát képezi ilyen találmány szerinti ellenanyagokra specifikus anti-idiotípus ellenanyag. Egy antiidiotípus ellenanyag olyan ellenanyag, amely általában egy másik ellenanyag antigén-kötő régiójával kapcsolatos egyedi determinánsokat ismer fel. Az anti-ídíotípust forrásként az ellenanyaggal vagy annak CDR-t tartalmazó régiójával azonos fajba tartozó és genetikai típusú állat (például egértörzs) immunizálásával állíthatjuk elő. Az immunizált állat felismeri és válaszol az ímmunnizáló ellenanyag idiotípikus determinánsaira, és anti-ddíotlpns ellenanyagot termel. Az anti-idiotípus ellenanyag alkalmazható „immunogénként” is egy másik állatban történő immunválasz índukálására, úgynevezett anti-anti-idiotípus ellenanyagot termelve.
Anti-IL- 12-ig eredetű A találmány tárgyát, képezi legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény is, amely legalább egy, legalább kettő, legalább három, legalább négy, legalább öt, legalább hat vagy több találmány szerinti anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amint azt a leírásban feltárjuk és/vagy ismert a szakterületen, és amelyek természetben nem előforduló készítményben, keverékben vagy formában varrnak. .Az. ilyen készítmények természetben nem előforduló készítmények, amelyek az/ 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. vagy 8. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott íragmensei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 70-100%-a bármelyike szerinti anti-EL-12 ellenanyag aminosav-szekvencia legalább egy vagy kettő, teljes hosszúságú, C- és/vagy N-terminális delécíós variánsát, doménját, fragmersét vagy meghatározott variánsát tartalmazzák. Előnyös aníi~IL~12 eredetű fehérje, Ifagmens vagy variáns készítmények tartalmaznak, legalább egy vagy kettő teljes hosszúságú CDR-tartalmú részletet, amelyek 1,2., 2., 3., 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia, annak meghatározott fragmeosei, doménjai vagy variánsai összefüggő aminosavai 7ö-!0Ö%-a bármelyike szerinti anti-IL-12 ellenanyag armnosav-szekvencia részletet tartalmaznak. További előnyős készítmények az L, 2,, 3„ 4., 5. vagy 6. azonosítószámú szekvencia vagy annak meghatározott fragmensei, doménjai vagy variánsai 70-100%-a legalább egyikének 40-99%át tartalmazzák. Az ilyen százalékokat folyékony vagy szilárd oldatok, keverékek.
*
- 37 szuszpenziók, emulziók vagy kolloidok tömege, térfogata, koncentrációja, moiaritása vagy tnolalitása alapján számítjuk, amint az ismert a szakterületen vagy a leírásban feltárjuk.
Találmány szerinti ellenanyag készítmények továbbá tartalmazhatják legalább egy olyan készítmény vagy gyógyászati készítmény alkalmas és hatásos mennyiségét, amely .5 legalább egy antÍ-ÍL-12 ellenanyagot tartalmaz, ilyen modulálást, kezelést vagy terápiát igénylő sejt, szövet, szerv,, állat vagy páciens számára, és adott, esetben továbbá tartalmaz legalább egyet az alábbiak közül; IL-12 antagonísta (például nem korlátozó példaként IL-12 ellenanyag vagy Iragmens, oldható IL-12-receptor vagy tragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás IL-12 antagonísta), antireumatikum (például metofrexát, auranofin, aurotioglükóz, azatloprin, etanercept, arany-nátrium-tiomalát, hidroxíkloroqüin-szulfát, lefiunomid, szulfaszalzin), izomrdaxáns, narkotikum, nem szterold antíinflammatorikus drog (NSAID), tájdalomcsdlapitó, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuiáris gátlőszer, mikrobaellenes szer (például amlnoglikozíd, gombaelíenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, eeíálosporin, flurorquinolon, makrolid, penicillin, szulfouamíd, tetraeiklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör elleni szer, koítikoszíeroíd, anabollkus szterold, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmárígy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropoietin (például epoetín-aifa), filgrasztim (például G-CSF, Neupogen), szargramosztim (GM-CSF,
Leukin), immunizáló szer, immunglobulin, Immunszuppresszáns (például hasiliximab, ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, horntonheiyeítesííő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágltó szer, cikioplegiás szer, alkiláló ágens, antimetabolit, mitótíkus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, aráim ániás ágens, antipsziehotikus szer, anxiolíiikum, hipnotlkum, szimpatomimetikum, stimuláns, donepezü, taksán, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szféráid, bukóidén inhibitor, metílxantin, kroraölin, epineírín vagy analógia, domáz-alfa (Pulmozyme), citokin vagy citokin .antagonísta. Ilyen cítokinek nem korlátozó példaként lehetnek IL-1 és IL-23 között bármelyik. A megfelelő dózisok jól ismertek a szakterületen [ lásd például „Pharmacotherapy Handbook”, 2. kiadás, szerk.; Wells és mtsai., kiad.; Áppleton and Lángé, Stamíbrd, CT (2000); „PDR
Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharntacopoela 2000, Dehixe. Ediíion”, kiad.; Tarascon Publishing, Lorna Linda, CA (20ÖÖ), amely referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét képezi.
Az ilyen rákellenes vagy fertőzésellenes szerek tartalmazhatnak- toxín molekulákat is, amelyek kapcsolódnak, kötve vannak, együtt vannak kiszerelve vagy együtt vannak beadva
- 38 legalább egy, találmány szeráfi ellenanyaggal. A toxin adott esetben hathat úgy, hogy szelektíven elpusztítja a patológiás sejtet vagy szövetet. A patológiás sejt lehet ráksejt vagy egyéb sejt. Ilyen toxin lehet nem korlátozó példaként, tisztított vagy rekombináns toxin vagy toxin-firagmens, amely toxín - például ricín, différiatoxin, venomtoxín vagy bakteriális toxin 5 legalább egy funkcionális citotoxíkus doménját. tartalmazza. A toxín kifejezés magában foglal mind endoíoxinokat, mind exotoxinokat, amelyeket bármely természetben előforduló, mutáns vagy rekombináns baktérium vagy vírus termel, és amelyek bármilyen patológiás állapotot okozhatnak emberekben és egyéb emlősökben, mint például toxín sokkot, ami halált is eredményezhet. Ilyen toxinok nem korlátozó példái enterotoxígén £. co/i hőlabilis enterotoxin (LT), hőstabil, enterotoxin (ST), Pkige&z cítotoxín, Xeromonas enterotoxínok, toxikus sokk szindróma toxín-1 (TSST-l), Sfápftyfacoecus enterotoxin A (SEA), B (SEB) vagy C (SEC), Streptöcocctts enterotoxínok és hasonlók. Ilyen baktériumok sem korlátozó példái enterotoxígén £ coli (ETEC), enferobemorrágíás £ coli fajok törzsei (például a O157:H7 szerotípus törzsei), Slcphylocőccas fajok (például Smpbyl&cöccvs aureu.y Pföp&yloeoccíís pyogenes), Sfágef&i fajok (például Sfáge&t dyscn/crlae, Sőíge/fo flexxeri, Sfege/áx boydii és Shígeliö sonaei), Őri/mo?te/.b fajok (például ScAmonclla typhi, Satmonella eftofera-sws, SafaíoneiPi eíPerirári), Closlridhim fajok (például CioiPidiam per/rmgens, Clostriilhan diföcile, Cfostridmm boíidinum), Cattipfá&beeter fajok (például Camphíobacter j&futti, Camphlobacier jeh&j, Hehobacter fajok (például ffeliobacier gytori), Aeromonas fajok
2Ö (például Aeromofias sobria, Aeronxmas hydrophila, Aeromonas· cawae), Pletsamows sófgeOokfes, Persim enterecvli&ct, Pibríos fajok például Pibrios choierae, Pibrios panihemafyiícasy Plebsiella fajok, Pseudomonas aeruginosa és sztreptokokkuszok [ lásd például „INTERNÁL MEDICINE”, 3. kiadás, szerk.: Steín, 1-13. old., kiad.: Little, Brown and Co·., Boston, (1990); „Bacterial ínfeetions of Humans; Epidemíoiogy and Control”, 2.
kiadás, szerk,'. Evans és mtsaí., 239-254. old., kiad.: Plenum Medtcal Book Co., New York (1991); Mandell és mtsai., „Prácíples- and Pracfioe of Infectious Dtseases”, 3. kiadás, kiad.: Churchill Livingstone, New York (1990); „The Merck Manual”, 16, kiadás, szerk.' Berkow és mtsaí., kiad.; Merck and Co., Rahway, N.l (1992); Wood és mfsai, FEMS Microbioiogy ímraunoiogy 76, 121-134.old. (1991); Marrack és mtsai., Science 248, 705-711. old. (1990), amely referenciák teljes tartalma hivatkozás utján a kitarafás részét képezi}
Találmány szerinti anfi-IL-12 ellenanyag vegyüietek, készítmények és kombinációk továbbá tartalmazhatnak legalább egy megfelelő kiegészítő anyagot, mint például nem korlátozó példaként oldószert, kőtószeri, stabllizálószert, puffereket sókat, lipotil oldószereket, tartósítószereket, adjuvánsokaí és hasonlókat. Gyögyászatilag elfogadható « 4
- 39kiegészítő anyagok az előnyösek. Ilyen steril oldatok, és előállításukra szolgáló eljárások nem korlátozó példái jól ismertek a szakterületeik például nem korlátozó példaként „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, IS. kiadás, szerk.: Gennaro, kiad.: Mack Publlshíng Co., Easton, PA (1990). .Rutinszerűen választhatunk ki olyan gyögyászatilag elfogadható hordozókat, amelyek alkalmasak az anti-IL-12 ellenanyag, fragmens vagy variáns készítmény beadásának módja, oldhatósága és/vagy stabilitása szerint, amint az jól ismert a szakterületen vagy feltárjuk a leírásban.
A találmány szerinti készítményben hasznos gyógyászati kötőanyagok és adalékanyagok nem korlátozó példái közé tartoznak fehérjék, peptidek, aminosavak, lipidek és szénhidrátok (például cukrok, köztük monoszacharidok, dl-, tri-, tetra- és oligoszacharídok; derivarizált cukrok, mint például alditolok, aldonsavak, észterifíkált cukrok és hasonlók, és pölíszacharidok vagy cukorpolímerek), amelyek egyedül vagy kombinációban lehetnek jelen, 1-99,99% mennyiségben egyedül vagy kombinációhan tömeg vagy térfogat szerint. Szemléltető fehérje kötőanyagok lehetnek a szémmalbu minők, mint például humán szérumalbumin (HSA), rekombináns humán albumin (rHA), zselatin, kazein és hasonlók. Reprezentatív ammosav/ellenanyag komponensek - amelyek pufféiként is működhetnek lehetnek alanln, glicin, arginín, bétáin, hisztidin, glutamínsav, aszparaginsav, ciszteín, lízin, leucin, izoleuein, valin, metionm, íeoilalanin, aszpartárn és hasonlók. Egy előnyös amínosav a glicin.
A találmány szerint megfelelően alkalmazható szénhidrát kötőanyagok például a monoszacharidok., mint például fruktóz, maitóz, galaktóz, glükóz, D-mannoz, szőrhöz és hasonlók; diszacharídok, mint például Iaktóz, szuktóz, trehalóz, cellofoióz és hasonlók; püliszacharidök, mint például raffinóz, melezilóz, maltödexírinek, dextránok, keményítők és hasonlók; és alditolok, mint például mannitoi, xilitol, makitól, lakaitól, xilitol szorbitol (gluchol), miomozitol és hasonlók. A találmány szerinti alkalmazható előnyös szénhidrát kötőanyagok a mannitoi, trehalóz és rafímőz.
Anti-IL-12 ellenanyag készitmények tartalmazhatnak: puffért vagy pH-állitó ágenseket is; tipikusan a puffét szerves savból vagy bázisból készített só. Reprezentatív pufferek közé tartoznak szerves savak sói, mint például citromsav, aszkorbinsav, glukonsav, szénsav, borkősav, borostyánkősav, eeetsav vagy frálsav sói, Trís, trometamb-hidroklorid vagy foszfát pufferek. A találmány szerinti készítményekben történő alkalmazásra előnyös pufferek szerves savak sói, mint például citrát.
Ezenfelül a találmány szerinti anti-TNF ellenanyag készitmények. tartalmazhatnak polimer kötőanyagokat/adalékanyagokat, mint például políviml-pírrohdonokaf hcoll-okat
4010 (polimer cukor), dextránokat (például eiklodextrineket, mint például 2~hidroxípropll~áciklodextrint), polietílén-glíkofekak ízesítőszerekéi, mikrobaeOenes szereket, édesítőszereket, antioxidánsokat, antisztatikus ágenseket, felületaktív anyagokat (például poliszorbátokat, mint például „TWEEN 2Ö’’~at és „TWEEN 80”-at), lipldeket (például foszfolipideket, zsírsavakat), sxteroidokat (például koleszterint) és komplexképző ágenseket (például EDTA-t).
Ezek és további, találmány szerinti anti-TNF ellenanyag, részlet vagy variáns készítményekben történő alkalmazásra megfelelő. Ismert gyógyászati kőtőszerek és/vagy adalékanyagok ismertek a szakterületen, például amint a „Remington: The Science & Praetice of Pharmaey” [19. kiadás szerk: Williams & Williams (1995)3 a „Physlciasfs Desk Referense” [52. kiadás, kiad.: Medinai Eennomics, Montvale, NJ (1998)) felsorolja, amely referenciák teljes tartalma hivatkozás útján a kitanítás részét képezi. Előnyös hordozó vagy kötőszer anyagok szénhidrátok (például szacharidok és aíditoiok). és pufferek (például eitrát) vagy polimer ágensek.
Amint fent megjegyeztük, a találmány tárgyát stabil készítmények képezik, and előnyösen foszfát-pufíér sóoldaítal vagy egy kiválasztott sóval, valamint tartósított oldatok és kiszerelések, amelyek tartósítószert valamim többszörös felhasználású tartósított kiszereléseket tartalmaz, amelyek alkalmasak gyógyászati vagy állatgyógyászati alkalmazásra, és amelyek legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható kiszerelésben. Tartósított kiszerelések legalább egy Ismert tartósítószert tartalmaznak, vagy adott esetben legalább egyet az alábbiak közül: fenol, m-krezol, p-krezol, o-krezol, kíorokrezol, benzilalkohol, fenil-hígany-nitrit, fenoxietanol, formaldehid, klorobutanol, magnézium-klorid (például besahidrát), alkílparahén (metil, etil, propíl, butil és hasonlók), henzalkóniunvkíorid, benzetómtsn-kloríd, nátrium-dehidroaeetát vagy timerozál, vagy azok keveréke vizes oldószerben Bármilyen megfelelő koncentrációt vagy keveréket alkalmazhatunk, amint az ismert a szakterületen, mint például 0,001-5%, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, mint például nem korlátozó példaként 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5,0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3,
1.4, 1,5, 6,1, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2,: 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4,
3.5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek közöd. Nem korlátozó példa lehet: tartósítószer nélkül, 0,1-2% m-krezol (például 0,2, 0,3, 0,4, 0,3, 0,9, l,0%X 0,1-3% benzü-alköhol (például 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9,. 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% timerozál (például 0,005, 0,01), 0,001-2,0% fenol (például 0,05, 0,25, 0,28, 0,5,
-41 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% dkilparabén(ek) (például 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2,0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), és hasonlók.
Amint lent megjegyeztük, a találmány tárgyát képezi gyártott termék, amely csomagolóanyagot és legalább egy fiolát tartalmaz, amely fiola legalább egy anti-tt-12 ellenanyagot tartalmaz az előirt pufierekkel és/vagy tartósítószerekkel, adott esetben vizes oldószerben, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely jelzi azt, hogy az. oldat tárolható 1, 2, 3, 4, 5 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, óő, 72 órán keresztül vagy tovább, A találmány tárgyát képezi továbbá gyártod termék, amely csomagolóanyagot, egy első, legalább egy honlízált anil-IL~12 ellenanyagot tartalmazó fiolát, és egy második, előírt pufféi vagy tartósítószer vizes oldatát tartalmazó fiolát tartalmaz, és a csomagolóanyag olyan címkét tartalmaz, amely utasítja a pácienst arra, hogy oldja fel a legalább egy anfi~IL~l2 ellenanyagot a vizes oldószerben olyan oldatot előállítva, amely 24 órán keresztül vagy tovább tárolható.
A találmány szerint alkalmazott legalább egy anti-ÍL-12 ellenanyagot rekombináns 15 úton állíthatjuk elő, beleértve emlős sejtekből vagy transzgeníkus készítményekből, vagy tisztíthatjuk más biológiai fonásokból, amint azt, a leírásban feltárjuk vagy ismert a szakterületen.
A találmány szerinti termékben található legalább egy anti-ÍL-12 ellenanyag koncentráció-tartománya olyan mennyiségeket tartalmaz, hogy egy nedves/száraz rendszerben a feloldást követően az körülbelül 1,0 pg/m! és körülbelül 100(1 mg/ml között van, habár alacsonyabb és magasabb koncentrációk is működőképesek, és a tervezett bejuttató eszköztől függenek, például oldat kiszerelések különbözhetnek transzdermális, pulmonárís, nyálkahártyái vagy ozmotikus pumpa vagy míkropumpa eljárások esetében.
Előnyösen a vizes oldószer adott esetben továbbá tartalmaz győgyászatilag elfogadható tartósítószert is. Előnyös tartósítószerek közé tartoznak az m-krezol, p-ferezol, okrezol, klorokrezoL benzii-alkohoi, alkllparabén (metil, etil, propil, butit és hasonlók), benzalkónium-kiorid, henzetóníom-kiorid, nátrium-dehidroacetát vagy timerozál, vagy ezek keverékei. Á kiszerelésben alkalmazott tartósítószer koncentrációja olyan, bogy elegendő legyen míkrobaellenes hatás kifejtéséhez. Az ilyen koncentráció függ a kiválasztott tartósítószertől, és szakember számára könnyedén meghatározható.
Más kötőanyagok, például izotóniás ágensek, pufiérek, antíoxidánsok, tartósítószert segítő anyagok adhatók adott, esetben és előnyösen az oldószerhez, Izotóniás ágenst, mim például glicerint általánosan alkalmaznak ismert koncentrációkban Előnyösen fiziológiailag tolerált pufier ís adhatunk javított pH-szabályozás biztosítására. A kiszerelések széles pH30 « w*XX
-42· tartományt felölelhetnek, mint például körülbelül tartomány a körülbelül pH 5 és körülbelül pl és körülbelül pH 10 között, és előnyös [9 közötti, és legelőnyösebb tartomány a körülbelül 6,0 és körülbelül 8,ö közötti. Előnyösen a találmány szerinti kiszerelések pH-ja körülbelül 6,8 és körülbelül 7,8 közötti. Előnyös pufferek közé tartoznak a foszfál-pufferek, 5 legelőnyösebben nátrium-foszfát, különösen előnyösen a foszfát-pufferelt sőoldal (PBS).
Más adalékanyagok, mint például gyógyászatilag elfogadható szölubilizáló szerek, mint például Tween20 [pohoxietilén (20) szorbitan monolaurát], 'Tween 40 [polioxietílén (20) szorbitan monopalmitátj, Tween 80 [polioxietilén (20) szorbitan monooleát], Pluronic F68 (polioxieítlén polioxiproptlén blokk-kopöhmerek) és PEG (poüeulémglíkol) vagy nem Ionos lö felületaktív anyagok, mint például pollszorbát 20 vagy 80 vagy poloxamer 184 vagy 188, Pluronic^ polioloL egyéb blofck-kopoli merek és komple.xképzok, mint például EDTA és EGTA adható adott esetben hozzá a kiszerelésekhez vagy kompozíciókhoz az aggregáció csökkentésére. Ezek az adalékanyagok különösen hasznosak, ha pompás vagy műanyag tartályt alkalmazunk a kiszerelés beadására. A gyógyászatilag elfogadható felületaktív anyag 15 jelenléte csökkenti a fehérje aggregádóra való hajlamát.
A találmány szerinti kiszereléseket olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy aníi-IL-12 ellenanyagot összekeverünk vizes oldószerben az alábbi tartósítószerek bármelyikével: fenol, m-krezol, p-ktezoi. o-krezol, klorokrezol, benzíi-alkohol, alfcilparabén (metil, etil, propil, hut.il és hasonlók), benzalkónium-kloríd, benzetónium-kiorid, 20 nátrium-dehidroaeeíát vagy timerozál vagy ezek keverékei. A legalább egt·' anti-IL-12 ellenanyag és tartósítószer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. .Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy antí-IL-12 ellenanyag puffereit oldatban lemért mennyiségét, kombináljuk puffereit oldatban lévő kívánt íartósltószerrd olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje 25 és a tartósítószer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében,
A találmány szerinti kiszereléseket, áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy lioftlízáll anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amelyet feloldandó egy' második fiolában, amely vizet, tartósítószert és/vagy kötőanyagokat tartalmaz, előnyösen foszfát-puffért -és/vagy sóoldaiot vagy kiválasztott sót vizes oldószerben Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola
43újrafelhasználható több alkalommal, és- elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tehet lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
Á találmány szerinti gyártott termékek azonnalitól 24 órán beiül vagy később történő 5 beadásra alkalmazhatók. Ennek megfelelően a találmány szerinti gyártott termékek szignifikáns előnyöket biztosítanak a páciens számára. A találmány szerinti kiszereléseket adott esetben biztonságosan tárolhatjuk körülbelül 2 és körülbelül 40°C között, és megtartják a fehérje biológiai aktivitását hosszú időn keresztük ily módon lehetővé tesznek egy olyan címkét a-csomagon, amely azt jelzi, hogy az oldat tárolható és/vagy felhasználható 6, 12, 18, 10 24, 36, 48, 72 vagy 96 órán keresztül vagy tovább. Ha tartósított oldószert alkalmazunk, az ilyen címke 1-1.2 hónapos, fél éves, másfél éves és/vagy két -éves felhasználást tartalmazhat.
A legalább egy találmány szerinti antí-IL-12 ellenanyag oldatait olyan eljárással állíthatjuk elő, amely során legalább egy ellenanyagot elkeverünk vizes oldószerben. Az elkeverést hagyományos feloldási, és keverési módszerek alkalmazásával hajtjuk végre. Alkalmas oldószer előállításához például legalább egy ellenanyag mért mennyiségű vizes vagy pufferes oldatát kombináljuk olyan mennyiségben, amely megfelelő a fehérje és adott esetben tartósítószer vagy poffer kívánt koncentrációjának biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, 20- amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti termékeket áttetsző oldatként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy hofilizált antí-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Akár az 25 egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehetővé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A találmány szerinti termékeket közvetve biztosíthatjuk a páciensek számára gyógyszertárak, klinikák vagy egyéb ilyen intézetek és intézmények utján, áttetsző oldatként
3-9 vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy hofilizált antí-IL-12 ellenanyagot tartalmaz, amely feloldandó egy második fiolában, amely vizes oldószert tartalmaz. Ebben az esetben az ártetsző oldat akár egy liter vagy több is lehet, nagyobb készletet biztosítva, amelyből a legalább egy ellenanyag kisebb részleteit ki lehet venni egy vagy több
X * * φ
φ V < φ φ ««?« χ V β * * * < φ φ * * * φφφ ♦> ♦♦ φ φ ί φ. * _ 44 ~ alkalommal, kisebb fiolákba áttéve, és a gyógyszertár vagy klinika biztosítja azokat a vásárlóik: és/vagy pácienseik számára.
Ezeket az egyszeres fiolákat tartalmazó ismert eszközök közé tartoznak az oldat bejuttatására szolgáló toli-injektoros eszközök, mint például Ff) Pest, £?& Aufejector®,. /ürmq/eí’t·®, ABeoFév?>®, F-JMFe.u, ArrtoPezH?) és GpóFerí®, (.ícnufropótFcrr®, (Amoíromírm Fen®, Fez?®, Feco-Fezt®, Fí^étw F««®, Fájthoz®, //eenk), Λφ A’áeH/e-Free fipéetoz®, /«ö-u/eot®, amelyka például az alábbi cégek készítenek és fejlesztettek ki: Secton Diekensen (Franklin, Lakos, NI, wvw.bectondlekenson.com), Dísetronie (Burgdorf, Swítzerland, ww.áisetrerúe.com): Bioject {Fortíand, Oregon, wwv. bioject.com); National Medical Products, Wesion Medical (Peterborough, UK, www. weston-nwdical.com), Medi-Ject Corp. (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Dupla fioiás rendszert tartalmazó ismert eszközök a liofilizált drog kazettában történő feloldására, és az oldat bejuttatására szolgáló ioH-injektor rendszerek, mint például a Bm«öíroFe«®,
A találmány szerinti termékek csomagolóanyagot tartalma . Á CSC hatóságok által megkövetelt információk mellett -·· ismerteti azokat a körülményeket, amelyek között a termék alkalmazható. A találmány szerinti csomagolóanyag utasításokat biztosit a páciens szántára a legalább egy aníi-IL-í2 ellenanyag feloldására a vizes oldószerben oldat kialakítása végek, és az oldat alkalmazására 2-24 órás vagy hosszabb időtartamon belül a kétfiolás, nedves/száraz termék esetén. Az egyfiolás, oldat termék esetében a címke jelzi, 20 hogy az ilyen oldat 2-24 órán keresztül vagy tovább is felhasználható. A találmány szerinti termékek alkalmazhatók humán gyógyászati alkalmazásra.
A találmány szerinti kiszereléseket legalább egy anti-SL-12 ellenanyag és kiválasztott puffer, előnyösen sóoldatot vagy kiválasztott sót tartalmazó foszfát-puffer összekeverését tartalmazó eljárással lehet előállítani. A legalább egy ellenanyag és puffer vizes oldószerben történő összekeverését hagyományos feloldási és keverési módszerekkel hajtjuk végre. Alkalmas kiszerelések előállításához például legalább egy ellenanyag vizes vagy pufferes lemért mennyiségét kombináljuk a kívánt pnfferelő ágenssel olyan mennyiségben, hogy az megfelelő legyen a fehérje és a puffer kívánt koncentrációjának a biztosítására. Ezen eljárás variációi nyilvánvalóak az átlagos képességű szakember számára. Például a komponensek hozzáadásának a sorrendje, további adalékanyagok alkalmazása, a hőmérséklet és a pH, amelyen a kiszerelést előállítjuk, mind olyan tényezők, amelyek optimalizálhatok a koncentráció és az alkalmazott beadási mód függvényében.
A találmány szerinti stabil vagy tartósitcít kiszereléseket áttetsző oldatokként biztosíthatjuk a páciensek számára, vagy dupla fiolaként, amelyek egyike legalább egy »* ** * 4 9 ·>
nx* **
-45iiofilizált anti-IL-12 ellenanyagot -tartalmaz, amelyet feloldandó egy második fiolában, amely tartósítószert vagy pufe és kötőanyagokat tartalmaz vizes- oldószerben. Akár az egyetlen oldószeres fiola, akár a feloldást igénylő dupla fiola újrafelhasználható több alkalommal, és elegendő lehet a páciens kezelésének több ciklusára, és ily módon kényelmesebb kezelési rendet tesz lehető vé, mint a jelenleg rendelkezésre állók.
A legalább egy, találmány szerinti stabil vagy tartósított kiszerelésekben vagy oldatokban lévő aníí-IL-12 ellenanyagot a találmány szerint beadhatjuk a páciensnek számos különféle beadási eljárás alkalmazásával, mint például SC vagy IM injekcióval; transzdermális, pulmonáris, transzmukózális, impianíátuni, ozmotikus pumpa, kazetta,
W mikropumpa, vagy egyéb, szakember szántára ismeri módon, amint az ismert a szakterületen. Terápiás alkalmazások
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy immunológiát betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egye reumatoid artritisz, fiatalkori reumatoid artritisz, szisztémás kialakulású fiatalkori reumatoid artritisz, sömörös artritisz, összenövéses esigolyagyulladás, gyomorfekély, szeronegaíív izületi betegségek, oszteoartritísz, gyulladásos bélbetegség, fekélyes bélgyulladás, szisztémás iupusz erítematozns, anli-foszfiofipid szindróma, szívárványhártya gytúiadás/uveiíisz/szemideg gyulladás, idiopátlás pulmonáris fibrózis, szisztémás érgyulladásAVegener-íéle granulomatózis, szarkoidózis, heregyul20 ladás/vazekiöodát megfordító eljárások, allergiádat ópíás betegségek, asztma, allergiás orrnyálkahártya gyulladás, ekcéma, allergiás érintéses börgyuliadás, allergiás kötőhártya gyulladás, hiperszensitivifásos födőgyulladás, transzplaníálás, szervátültetési kilökődés, „graft-versus-bost” betegség, szisztémás gyulladásos szindróma, szepszis szindróma, grampozitív szepszís, gram-negatív szepszis, tenyésztésre negatív szepszis, gombás szepszis, neutropéniás láz, uroszepszis, meningokokcémia, trauma/vérzés, égések, ionizáló sugárzás hatása, heveny hasnyálmirigy gyulladás, felnőttkori légzőszerv! disztressz szindróma, reumatoid artritisz, alkohol-indukált hepatitisz, krónikus gyulladásos betegségek, szarkoidózis, Crohn-féle betegség, sarlósejtes vérszegénység, diabétesz, nefrózis, atopíás betegségek, hiperszenzitivításí reakciók, allergiás orrnyálkahártya gyulladás, szénanátha, állandó orrnyálkahártya gyulladás, kötőhártya gyulladás, méhnyáikahártya gyulladás, asztma, csalánkiütés, szisztémás anafilaxis, börgyuliadás, vészes vérszegénység, hemolitikos betegség, trombociíopénia, szöveti vagy szervi grafi kilökődése, vese transzplantátum kilökődése, szív transzplantátum kilökődése, máj transzplantátum kilökődése, hasnyálmirigy transzplantátum kilökődése, födő transzplantátum kilökődése, csontvelő transzplantátum (BMT) kilökődése, bőr allograft kilökődése, porc transzplantátum kilökődése, csont grafi kilökődése, vékonybél transzplantátum kilökődése, magzati csecsemőmirigy inplantátum kilökődése, mellékpajzsmirigy transzplantátum kilökődése, szöveti vagy szervi xenograd kilökődés, aliograft kilökődése, ami-receptor hiperszenzitivítási reakciók, Ckaves-betegség,
Raynoud-féle betegség, B típusú inzulín-rezisztens diabétesz, asztma, miaszténia grávísz, ellenanyag-közvetített eltotoxichás, Hl típusú hiperszenzííivitási reakciók, szisztémás lupusz. eritematózus, PÖEMS szindróma (polineuropátia, organomegália, endokrinopátia, monoklonális gammopátia és bőrelváltozási szindróma), polineuropátia, organomegália, endokrinopátia, monoklonális gammopátia, bőrelváltozási szindróma, anti-fosztoiipid szindróma, pemfígusz, szkieroderma, kevert kőíöszőved betegség, ídíopátiás Addíson-féie betegség, diabétesz mellííusz, krónikus aktív hepatitisz, elsődleges epezsugorodás, vitíligo, érgyulladás, poszt-Ml cardiotónúás szindróma, IV. típusú kiperszenzitivitás, érintéses hőrgyuiladás, feíperszenzitivitásos tüdőgyulladás, aliografi kilökődése, intracellularis organizmusok miatti grannlómák, gyógyszerérzékenység, metabolikus/idiopátiás, Wílson-féle
IS betegség, hemaáromatözis, alfa~l-aníííripszio hiány, diabetikus retinopátia, Hashimoíö-féie pajzsmirigy gyulladás, oszteoporózis, hipotalamtkns-hlponzis-adrenálís tengely értékelése, elsődleges epezsugorodás, pajzs-mirigy gyulladás, enkefalomíeliíisz, cachexia, cisztás fibrózls, csecsemőkori krónikus tüdőbetegség, krónikus obstruktfv tüdőbetegség (COPD), örökletes hematofagocitikus hmíöbisziiocitózis, bőrgyógyászati betegségek, pikkelysömör, hajhullás, neifózisos szindróma, vesegyulladás, giomeruláris vesegyulladás, heveny veseelégtelenség, hemodíalizis, urémia, toxicitás, rángógörcs,. okt3 terápia, anii-€D3 terápia, citokin terápia, kemoterápia, radioterápia (például nem korlátozó példaként toaszíénia, anémia, cachexia és hasonlók), krónikus szállodát mérgezés, és hasonlók [lásd például „Merck Maneal”, 12-17. kiadások, kiad.·. Merck & Company, Rahway, NJ (1.972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), „Pharmacotberapy Handhook”, szerk.·. Wells és mtsai., 2. kiadás, kiad.: Appleton and Lángé, Stamford, Conn. (1998,2000), amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitárni ás részét képezi].
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy szív- és érrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtbem szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozót példája az alábbiak, közül legalább egy. szívbénulás szindróma, szívinfarktus, szívszélhűdés, szélütés, isémiás szélütés, vérzés, arterioszklerózls, ateroszkierózis, resztenózis, diabetikus aterioszkierózisos betegség, magas vérnyomás, artériás magas vérnyomás, renovaszkuláris magas vérnyomás, szivkihagyás, sokk, szív- és érrendszeri szifilisz, szívelégtelenség, coz-/ΛοβΛ, elsődleges tüdői magas vér-nyomás, szív * / χΧ »ϊ» ~4 aritmia, álriálís ektópiás .szívverés, átriális szívdobogás, átriális fibrillácíó (állandó vagy rohamokban fellépő), petiuziő utáni szindróma, kardlopulmonáris bypass gyulladásos reakció, kaotikus vagy tőbbközpontú átriális tachikardia, szabályos szűk QRS tachikardia, specifikus aritmia, ventrikuláris fjbrilláció. His-kőteg aritmia, atrioventrikuláris blokk, kötegelágazás blokk, miokardíális isémiás rendellenességek, koszorúér betegség, angina pektorisz, szívinfarktus, kardiomiopátia, kitágult vértolulásos kardiomiopátia, korlátozott kardiomiopátia, billentyűi szívbetegségek, eadokarditisz, períkardíális betegség, szívdaganatok, aurai és perifériás aneurízmus, aortatneíszés, aorta gyulladása, abdomináhs aorta és ágainak elzáródása, perifériás érrendszeri rendellenességek, artériaelzáródásos rendellenességek, perifériás aíerloszklerózisos betegség, tromboangitisz obliteransz, funkcionális perifériás artériás rendellenességek, Raynaud-féle jelenség és betegség, akrocianózis, eritromélalgia, vénás betegségek, vénás trombózis, viszértágulás, arteriovenőzus fisztuk limfödema, lipödema, nem stabil angina, reperfózíós sérülés, pumpa utáni szindróma, isémiás reperfúziós sérülés és hasonlók, ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy aníÍ-IL~12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy fertőző betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: heveny vagy krónikus bakteriális fertőzés, heveny vagy krónikus paraziiikus vagy fertőző folyamatok, köztük bakteriális, vitális és gombás fertőzések, HlV-feriőzés/MlV-neuropátia, meningitisz, hepatitisz (A, B vagy C, vagy hasonlók), szeptikus artrltlsz, peritonitisz, tüdőgyulladás., gégefőgyulladás, A. eo/í ÖI5?:h7, bemolitikus uremlás színdróma/írombohtikus trombocitopéna purpura, malária, dengne hemorrágíás láz, ieismaníázis, lepra, toxikus sokk szindróma, sztreptckokkuszos izomgyulladás., gázos üszkösödés, Mpcobnetemms mbeeevlaős, Myeohöcrermm óvóm? intraceliulare, /bieemoevsks ami tüdőgyulladás, medencei gyulladásos betegség, heregv'ulladás./me.llékheregyuliadás, Lyme betegség, influenza Á, Epsteín-Barr vírus, virális hemafagoeitótíkus szindróma, vitális enkefalitisz/aszeptikus meningitisz, és hasonlók
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy rosszindulatú betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egv: leukémia, heveny leukémia, heveny limfŐhlasztikus leukémia (ALL),. R-sejtes, T-sejtes vagy FAB ALL, heveny raielold
48leukémia (ΑΜΕ), krónikus mietótikus leukémia (CML), krónikus íimfocitikus leukémia (CLL), szorsejt leukémia, mielodiplasztíkus szindróma (MDS), Iirnfőma, Hodgkm-betegség, rosszindulatú iirnfőma, nem-bodgkín-iimfóma, Surkitt-limíóma, tőbsszörös mieióma, Kaposiszarkőma, kolorektális karcmáma, pankreatíkus kareinóma, nazoíarmgeális karcínóma, rosszindulatú hísztiocitőzis, paraneoplasztikus szindróma/rosszíndülatú elváltozás biperkalcémiája, szilárd daganatok, aáenokarcinőmák, szarkómák, rosszindulatú melanóma, hemangióma, áttétes betegség, rákkal kapcsolatos csontfetóvódás, rákkal kapcsolatos esontfájdalom, és hasonlók.
A találmány tárgyát képezi eljárás is legalább egy idegrendszeri betegség modulálására vagy kezelésére sejtben, szövetben, szervben, állatban vagy páciensben, amelynek nem korlátozó példája az alábbiak közül legalább egy: neurodegenerat.lv betegségek, szklerózls multiplex, migrénes fejfájás, AIDS. demencia komplex, demielináciös betegségek, mint például szklerózls multiplex és heveny transzverz mielítisz; extrapiramídáiis és cerebelláris rendellenességek, mint például a kortíkospinális rendszer sérülései; a hazáiig gangüonok rendellenességei vagy cerebelláris rendellenességek; hiperkiuetikus mozgási rendellenességek, mint például Huntmgton-féle vitostánc és öregkori vítustáne; gyögyszerindukált mozgási rendellenességek, mint például a CNS dopsmin-receptorokat gátló gyógyszerekkel indukáltak:; hipokinetíkus mozgási rendellenességek, mint például Parkínsonkór; progresszív szupranukieáris bénulás; a cerebellnm szerkezeti sérülései; spmo-cerebelláris degenerációk, mint például spínális ataxía, Friedreich-féle ataxia, cerebelláris koriikálís degenerációk, több rendszert érintő degenerációk (Mencel, Dejerihe-Thomas, Shí-Drager és Machado-Joseph); szisztémás rendellenességek (Refsum-féle betegség, abetalipoprotémla, ataxia, telangiektázia és mifökondriábs több rendszert érintő rendellenességek); demielmációs mag rendellenességek, mint például szklerózls multiplex, heveny transzverz mielítisz; és a motoros egységek rendeilenességeí, mint például nenrogén muszkuláris atrőfiák (anteríor szarvsejtek degenerációja, mint például amiotrofikus laterális szklerózis, gyermekkori spinálís muszkuláris atrófia és .fiatalkori spinálís rnuszkuiáris atrófia); Alzheímer-kőr; középkorban fellépő Down szindróma; diffúz Lewy-féle testbelegség; öregkori Lewy-féle elmebaj; Wenúeke-Korsakoff szindróma; krónikus alkoholizmus; Creutzíéldt-Jakob betegség; szubakut szkleróztsos panenkefelitísz, Hallerrorden-Spatz betegség és dementia pugilistica, és hasonlók. Ilyen eljárás adott esetben tartalmazhatja legalább egy TW ellenanyagot vagy megbatározott részletet vagy variánst tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe.
LA
,. χ» -l· *’ < X ..
xY X «.* * »x x y
-49amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára lásd például '’Merck Manna!”, 16 kiadás, kiad.: Merck & Compaay, Rahwav, NI 0992)].
Bármilyen találmány szerinti eljárás tartalmazhatja legalább egy antí~IL~12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény Itatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag, annak megbatározott részlete vagy variánsa beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak Iö közül: IL-12 antagonisía (például nem korlátozó példaként ÍL-12 ellenanyag vagy fragmens, oldható IL-12-receptor vagy fragmens, azok fúziós fehérjéje vagy kismolekulás ÍL-12 antagomsta), andreumstskrsm (például meíotrexát, awásofm, auroíioglükóz, azatíoprln, etanercept, arany-nátrinm-iiomalát, htdroxikloroqnin-sznlfát, leílunoniid, szulfaszalzin), ízomrelaxáns, narkotikum, nem szteroid antíinriantmatorikus drog (HSAID), fiydalom15 csillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkülárts gátlószer, mikrobaellenes szer (például antlnoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, vírusellenes szer, karbapenem, eeíalosporin, flurorquinoloö, makrotíd, penicillin, szulfonatnid, íetraciklin, egyéb mikrobaellenes szer), pikkelysömör ellent szer, kortikoszteroid, anabolikus szteroid, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmírlgy ágens, 20 vitamin, kalciummal kapcsolatos hormon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritropotetin (például epoetm-alfá), filgraszttm (például O-CSF, Neupogen), szargramosztsm (GM-CSF, Lenkin), immunizáló szer, immunglobnhn, Ímmunszuppresszáns (például basillximah, ciklosportn, dadlzumah), növekedést hormon, hormonhelyettesítő drog, öszírcgén-reeepíor modulátor, pupíilatágitó 25 szer, cikloplegiás szer, alkiláló ágens, antünetabolit, mitótíkus inhibitor, radloíerápiás szer, antídepresszáns, antimániás ágens, antipszíchotíkus szer, anxiolítikum, hipnoí.ikum, szinipaíomirnetikum, stimuláns, donepezil, takrin, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalált szteroid, leukotrién inhibitor, metikantm, kromolin, epinefrin vagy analógja, domáz-alfá (Pulmozyme), citokin vagy citokin aníagonista. Á megfelelő dózisok jól ismertek a 30 szakterületen [ lásd például „Pharmacoíherapy Handhook”, 2. kiadás, szerk.; Wells és mtsai.. kiad.. Áppleien and Lángé, Starntbrd, CT (2000); „POR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edltion”, kiad.; Tarascon lAíblishing, Loma Linda, CA. (2000), amely referenciák mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
«« ·♦
- 50 Találmány szerinti készítményekben, kombinációs terápiákban, eszközökben és/vagy eljárásokban alkalmazható TNF-antagonisták (amelyek, továbbá tartalmaznak legalább egy találmány szerinti ellenanyagot, annak meghatározott részletét vagy variánsát) nem korlátozó példái közé tartoznak aníi-TNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fragmensei, és olyas.
receptor-molekulák, amelyek specifikusan kötődnek TNF-hez; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják TNF szintézisét, TNF felszabadulását vagy annak hatását célsejteken, mint például thalidomide, tenidap, foszfödiészteráz inhibitorok (például pentoxifylhne vagy roiípram), Axb-adenozin-reeeptor agonlsták és ASb-adenozín-reeepíor enbaneerek; olyan vegyületek, amelyek megelőzik és/vagy gátolják a TNF-receptor lö jeltovábbítását, mint például a rnítogén-aktivált protein ~{MAP)- klnáz inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a. membrán-TNF hasítását, mint például metalloproteináz Inhibitorok; olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF aktivitását, mint például angiotenzin-konveríáló-enzim (ACE) inhibitorok (például eaptopril); és olyan vegyületek, amelyek blokkolják és/vagy gátolják a TNF termelését és/vagy szintézisét, mint például MAP-kmáz inhibitorok.
A leírás szerinti értelemben „tumomekrózis-íáktor ellenanyag”, „TNF ellenanyag'’, „TNF~á ellenanyag” vagy fragmens és hasonló csökkenti, blokkolja, gátolja, megszünteti vagy zavarja a TNF aktivitását m ri/ro, /» <riü# és-vagy előnyösen m vrw. Például megfelelő találmány szerinti TNF humán ellenanyagok kötődhetnek TNF-u-hoz, és lehetnek anti-TNF ellenanyagok, azok antigén-kötő fragmensei, és azok meghatározott mutánsai vagy doménjai, amelyek specifikusan kötődnek a l'NF-tt-hoz, Megfelelő TNF ellenanyag vagy fragmens csökkentheti, blokkolhatja, megszüntetheti, zavarhatja, megelőzheti és/vagy gátolhatja TNF RNS~, DNS- vagy fehérjeszintézisét, TNF felszabadulását, TNF-receptor jeltovábbítását, memhrán-TNF hasítását. TNF aktivitását, TNF termelését és/vagy szintézisét,
A cA2 kiméra ellenanyag tartalmazza az Á2 jelű, magas affinitású semlegesítő egér anti-humán-TNF-á IgGl ellenanyag antigén-kötő variábilis régióját, és a humán IgGl kappa Immunglobulin állandó régióját. A humán IgGl Fc-régiö javítja az ellenanyagok allögeneíkus eSektor fimkciőít növeli a keringési feléietídejüket és csökkenti az immunogenitásukat A cÁ2 kiméra ellenanyag avidkása és epitőp-specifitása az A2 egér ellenanyag variábilis régiójától származik. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér ellenanyag variábilis régióját kódoló nukleinsav előnyös forrása az A2 bihridóma sejtvonal.
Á kiméra A2 ellenanyag (cA2) dözisíüggö módon semlegesití mind a természetes eredetű, mind a rekombináns humán TNF-u citotoxíkus hatásait. A cA2 kiméra ellenanyag és rekombináns humán TNF-ö· kötési vizsgálataiból a cA2 kiméra ellenanyag affinitás! állandója *4* ♦ ♦ X* »« < * » » φ ♦ * > φ « φ y χ « * ♦ ♦ « * X * ν *♦ α 4 4 * y * ** φφ
-51 1,04χ10ίδ Μ’ értékűnek adódott. Monoklonális ellenanyag specitnásáuak és affinitásának meghatározására szolgáló előnyös kompetitív ínhíbiciós eljárások megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken·. Harlow és mtsai., „Anlibodies: A Laboratory Manuaf’, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Oarbor, New York, (1933); „Current Protocols in
Itnnmnolögy”, szerk.: Colligan és mtsai., kiad,: Greene Publishing Assoc. and Wiíey Interscíenee, New York (1992-2000); Kosbor és mtsai., Immunok Today, 4, 72-79. old. (1983); „Current Protocols ín Molecular Biology”, szerk: Ausnbel és mtsai., kiad.: Wíley Interscíenee, New York (1987-2000); és Muller, Meth. Enzymol, 92, 589-601, old. (1983), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik.
lö Egy előnyös megvalósítási mód szerint az A2 egér monoklonális ellenanyagot a cl34Ájelű sejtvonal termeli. A cÁ2 kíméra ellenanyagot a el 68Á jelű sejtvonal termeli.
A találmány szerint alkalmazható monoklonális anti-TNF ellenanyagok további példáit feltárják a szakirodalomban [lásd például a 5 231 024. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot: Moher A, és mtsai., Cytokme 2, 162-169. old. (1990);
07/943 852. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1992.
szeptember 11-én); Rathjen és mtsai., WO 91/02078, számú nemzetközi közzétételi írat (közzétéve 1991. február 21-én); Rubin és mtsai., 0 218 868. számú európai közzétételi írat (közzétéve 1987. április 22-én); Yené és mtsai. , 0 283 088. számú európai közzétételi irat (közzétéve 1988. október 26-án); Idang és mtsai., Biocbem. Bíophys. Rés. Comm. 137, 84720 854. old, (1986); Meager és mtsai., Hybrídoma 6, 305-311. old. (1987); Fendly és mtsai., .Hybridoma 6, 359-369. old. (1.987), Brmgman és mtsai., Hybridoma 6, 489-507. old. (1987), és ffirai és mtsai., J. Immunoi. Meth. 96, 57-62. old (1987), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanitás részét képezik],
TNF-reeepior molekulák
A találmány szerint alkalmazható előnyős TNF-receptor molekulák azok, amelyek magas affinitással kötődnek a TNF-hez [lásd példáid Feldmann és mtsai., WO 92/07076. számú nemzetközi közzétételi, irat (közzétéve 1992. április 30-án); Schalí és mtsai., Cell 61, 361-370. old. (1990); és Loetscher és mtsai., Cell 61, 351-359.old. (1990), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanitás részét képezik] , és adott esetben alacsony ímmunogenitásúak. Közelebbről az 55 kDa (p55 TNF-R) és a 75 kDa (p75 TNF-R) sejtfelszíni TNF-receptorok alkalmazhatók a találmány szerint. Ezeknek a receptoroknak a csonkolt formát, amelyek a receptorok extraceduláris dománjaít (ECD) vagy azok funkcionális részleteit tartalmazzák [lásd például Coreoran és mtsai, Eur. 3. Biochetn. 223,
831-340 old. (1994)], szintén alkalmazhatók a találmány szerint. A TNF-receptorok ECD-t tartalmazó csonkolt formáit detektálták vizeletben és szénámban, mint 30 kDa és 40 kDa TNF ishibiíorikus kötőfehérjéket (Engeimamr H. és mtsai.., 1 Bioi. Chem. 265, 153l~I53ő.oid. (1990)}. Mulíimer TNF-recepfor molekulák és TNF-damimreeeptor fúziós molekulák· és azok származékai és fragmeaséi vagy részletei további példái a találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNF~receptor molekuláknak. A találmány szerint alkalmazható TNF-receptor molekulákat, az jellemzi, hogy képesek páciensek hosszú időn keresztül történő kezelésére, a tünetek jó és kiváló enyhítésével és alacsony toxicitássaí. Az alacsony immunogenitás és/vagy magas affinitás, valamint más meg nem határozott tulajdonságok hozzájárulhatnak az elért terápiás eredményekhez.
A találmány szerint alkalmazható TNF-recepfor multimer molekulák tartalmazzák két vagy több TNF-receptor ECD-jének az egészét vagy funkcionális részletét egy vagy több polipeptid kapcsolómolekulával vagy nem peptid kapcsolómolekulával, mint például pohetilén-glikolla! (PEG) összekötve. Á multimer molekulák továbbá tartalmazhatják szekretáit fehérje szígnálpeptidjét, hogy az irányítsa a multimer molekula expressziéi át, .15 Ezeket a multimer molekulákat és az előállításukra szolgáló eljárásokat a 08/437 533. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben tárták lél (benyújtva 1995. május 9én), amelynek a tartalma teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanítás részét képezi.
A találmány szerinti eljárásokban és készítményekben alkalmazható TNFimmunreceptor fúziós molekulák egy vagy több inununglobulín molekula legalább egy részletét, és egy vagy több TNF-receptor egészét vagy fimkcíonálls részletét tartalmazzák.. Ezeket sz Ímmunreceptor fúziós molekulákat monomerekként vagy hetero- vagy homomultimerekkent állithaijuk össze. Az ímmunreceptor föziós molekulák lehetnek monovalensek vagy multívalensek is. Ilyen TNF-ímm«örecq>tor fúziós molekula egy példája a TNF-receploblgG fúziós fehérje. TNFMnununreceptör föziós molekulákat és azok előállítására szolgáló eljárásokat feltártak a szakirodalomban fLesslauer és mtsai., Eur. J. Immunoi. 21, 2883-2886. old. (1991); Ashkenazi és mtsai., Proe, Natl. Aead. Scí. USA 88, 19535-19539, old. (1991); Peppel és mtsai., I Exp. Med. 174, 1483-1489, old. (1991); Kolis és mtsai., Proe. Natl. Aead. Sci. USA 91, 21S~219.old. (1994); Buíier és mtsai., Cytokine 6, 616-623. old. (1994); Baker és mtsai., Eur. i, immunoi. 24, 2049-2948. old. (1994); Beufler és mtsai., 5 447 851 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és 08/44.2.133.
számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1995. május 16-áni, amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás álján a kitanitás részét képezik). Eljárások
Ímmunreceptor lúziós molekulák előállítására megtalálhatók az alábbi irodalmi helyeken is:
Capon és mtsai., 5 116 964, számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat; Gapon és ~ 53 mtsai., 5 225 538. számú amerikai egyesült, államokbeli szabadalmi irat; és Capon és mtsai., Natúré 337, 525-531, old. -(1.989), amely referenciák teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitan Itás részét képezik.
TNF-receptor molekula funkcionális ekvivalense, származéka vagy régiója alatt a 5 TNF-receptor molekula olyan részletét, vagy a TNF-reeeptor molekulát kódoló l'NF-receptor molekula szekvencia olyan részletét értjük, amely elegendő mérető és szekvenciája ahhoz, hogy fenkeionálisan hasonlítson találmány szerint alkalmazható TNF-reeeptor molekulákhoz (például magas affinitással köti a TNF-et és alacsony az ímmunogenítása). TNF-reeeptor molekula funkcionális ekvivalense lehet módosított TNF-receptor molekula is, amely funkcionálisan hasonlít találmány szerint alkalmazható TNF-reeeptor molekulákra (például magas affinitással köti a TNF-et és alacsony az immunogenitása). Például TNF-reeeptor molekula funkcionális ekvivalense tartalmazhat. „SILENT” kodont vagy egy vagy több aminosav-szufesztífúciót, delécíót vagy addíclót (például egy savas aminosav szubsztitúcióját egy másik savas aminosavval; vagy -azonos vagy különböző hidrofób aminosavat kódoló kodon szubsztitúcióját hidrofób aminosavat kódoló másik kodonnal). [lásd Ausubel és mtsai., „Current Protocols ín Molecular B-i-ology”, kiad.: Greenc Publishing Assoc. and WileyInterscíence, New York (1987-2ÖCX))].
Citokin lehet bármilyen ismert eitokin (lásd például vww.Copewi0tCyto.kines.com).. Citokín antagonísták nem korlátozó példái közé tartozik bármilyen ellenanyag, íragmens vagy mírnetíkum, bármilyen oldható receptor, fragtnens vagy mímetíkum, bármilyen kísmolekulás antagonista, vagy ezek bármilyen kombinációja.
Terápiás kezelések.· Bármilyen találmány szerinti eljárás lehet IL-12-közvetíteP rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás, amely tartalmazza legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készítmény vagy gyógyászati készítmény hatásos mennyiségének a beadását egy sejtbe, szövetbe, szervbe, állatba vagy páciensbe, amelynek szüksége van ilyen modulálásra, kezelésre vagy terápiára. Ilyen eljárás adott esetben továbbá tartalmazhat Ilyen immunológiai betegségek kezelésére szolgáló együttes beadást vagy kombinált terápiát, amely esetben a legalább egy anti-Í.L-12 ellenanyag, annak, meghatározott részlete vagy variánsa beadása előtt, azzal egy időben és/vagy azután legalább egyet beadunk az alábbiak közül: IL-12 anlagonísta (például nem korlátozó példaként IL-12 ellenanyag vagy íragmens, oldható Η..-12-receptor vagy íragmens, azok fúziós fehérjéié vagy kísmolekulás IL-12 antagonísta), astíreumatikum (például metotrexát, auraaofm, aurotioglükóz, azatlopri-n, etanercept, arany-nátrium-tiomaláf, hídroxíkloroquín-szulfát, lerlunomid, szulfaszalzin), izomreiaxáns, narkotikum, nem szteroid antimfiammatorikus drog (NSAID),
- 54 fájdalomcsillapító, érzéstelenítő, nyugtató, helyi érzéstelenítő, neuromuszkuláris gátlószer, mikrobaellenes szer (például aminoglikozid, gombaellenes szer, parazitaellenes szer, víruséi lenes szer, karbapertem, cefalospnrin, fiarorquinolon, makrolíd, penicillin, szülfonanfid, teíraciklin, egyéb nd krohaeí lenes szer), pikkelysömör elleni szer, korókoszteroid, anabolikus szteroíd, diabétesszel kapcsolatos ágens, ásványi anyag, tápanyag, pajzsmtrigy ágens, vitamin, kalciummal kapcsolatos bonnon, hasmenés elleni szer, köhögés elleni szer, hányás elleni szer, fekély elleni szer, hashajtó, antikoaguláns, eritrppotetia (például epoetis-aliá), ftlgraszdm (például G-CSF, Heupogen), szargratnoszdm (GM-CSF, Lenkin), immunizáló szer, immunglobulin, ímmunszrtppresszáns (például basilixíntab, lö ciklosporin, daclizumab), növekedési hormon, hoononhelyettesítő drog, ösztrogén-receptor modulátor, pupillatágítö szer, cikloplegiás szer, alfciláíó ágens, antlmetabolit, nntótikus inhibitor, radioterápiás szer, antidepresszáns, andtn&niás ágens, antipszichotikus szer, anxíoHtíkum, hipnotikum, szimpalomimeokitm, stimuláns, donepez.il, lakna, asztmagyógyszer, béta agonista, inhalák szteroíd, leukotrién inhibitor, metilxantin, krotnolin, epinefrin vagy analógja, dornáz-alfa (Pulmozyme), eitokín vagy eítokin antagonista.
Tipikusan patológiás állapot kezelését legalább egy anti-ík-12 ellenanyag készítmény hatásos mennyiségének vagy dózisának beadásával végezzük, amelynek az összmennylsége átlagosan legalább körülbelül 0,01 és 500 mg közötti tartományba esik legalább egy anti-IL12 ellenanyagra vonatkoztatva a páciens kg-jaíta dózisonként, és előnyösen legalább körülbelül 0,1 és 100 mg eltenanyag/kg közötti egyszeri vagy többszöri beadásonként, a készítményben található specifikus aktivitástól függően, Más megoldásképpen a hatásos· széntmkoncentráciö -0,1-5000 gg/ml széruntkonceníráció lehet egyszeri vagy többszöri beadásonként. A megfelelő dózisok ismertek a gyakorló orvos számára, és - természetesen függhetnek az adott betegség állapotától, a beadott készítmény specifikus aktivitásától és a kezelés alatt álló pácienstől. Bizonyos esetekben a kívánt terápiás mennyiség eléréséhez szükséges lehet ismételt beadást alkalmazni, azaz egy monitorozotí vagy mért dózis ismételt egyedi beadásaira van szükség, amikor az egyedi beadásokat addig ismételjük, amíg a kívánt napi dózist vagy hatást el nem énük.
Előnyös dózisok adott esetben tartalmazhatnak 0,1, 0,2, 0,3,0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 0, lő, 11,12, 13, 14, 15, ló, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, Ö4, Ő5, őő, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 és/vagy 100-500 mg/kg-ot beadásonként, vagy bánmlyen tartományi vagy értéket ezek között, vagy 0,1, 0,5,
0,9, LO, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9. 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, B,0,
13.5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5,, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0; 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 1.4,5, 15, 0,15, 15,9, 16,
16.5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, .55, 60, 65, 70, 75, 80,. 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1.500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 és/vagy 5000 pg/ml széru-mkoncentrició· eléréséi egyszeri vagy többszöri beadásonként, vagy bármilyen tartományt vagy értéket ezek között.
Más megoldásképpen a beadott dózis változhat ismert tényezők függvényében, mint például az adott ágens farmakodinarnikai jellegzetességei, a beadásának módja és útja; a befogadó kora, egészségi állapota és tömege; a tünetek természete. és mértéke, az egyidejű kezelések típusa, a kezelés gyakorisága, és a kívánt hatás. Általában a hatóanyag dózisa körülbelül 0,1-100 mg/testtömeg-kg lehet. Rendszerint 0,1-50, és előnyösen 0,1-10 mg/kg/beadás vagy fenntartott felszabadulása forma hatásos a kívánt eredmények elérésére.
Nem korlátozó példaként emberek vagy állatok kezelését biztosíthatjuk legalább egy, találmány szerinti ellenanyag egyszeri vagy periodikus dózisával 1-100 mg/kg között, mini például 0, 5, 0,9, 1,0, l,L 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, W, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/kg naponta, legalább az 1., 2,3., 4., 5., 6., 7„ 8., 9, 10., 11., 12., 13., 14., 15., 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39. vagy 40. nap legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25 , 26, 27 , 28, 29, 36,
31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.
vagy 52. hét legalább egyikén, vagy más megoldásképpen vagy ezenfelül az 1, 2, 3, 4, 5, 6, , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, lő, 17, 18, 19. vagy 20. év legalább egyikén, vágyezek bármilyen kombinációján, egyszeri, infúziós vagy ismétel dózis alkalmazásával.
A belsőleg történő beadásra alkalmas adagolási alak (készítmény) általában körülbelül 0,1 mg és körülbelül 500 mg hatóanyagot tartalmaz egységenként vagy tartályonként. Ezekben a gyógyászati készitményekben a hatóanyag rendszerint körülbelül 0,5-99,999 tömeg% mennyiségben lehet jelen a készítmény össztömege alapján.
Parenterális beadás esetében az ellenanyagot oldat, szuszpenzió» emulzió vagy liofilizálf por formájában -szerelhetjük ki, együtt vagy külön gyógyászatilag elfogadható parenterális hordozóeszköztől. Ilyen hordozóeszközök példái a víz, sóoldat, Rínger-oldat, « *
- 56 dextróz oldat és 1-10% humán szérumalhurain. Liposzómákat és nemvizes hordozóeszközöket, mint példánl rögzíted olajokat is alkalmazhatunk. A hordozóeszköz vagy liofilizálí por tartalmazhat olyan adalékanyagokat, amelyek fenntartják az. izotóníásságot (például nátrium-klorid, manóitól) és a kémiai stabilitást (például pnfferek és tartósítószerek).
A kiszereléseket ismert vagy megfelelő módszerekkel sterilizáljuk.
Megtelelő gyógyászati hordozókat ír ie a Remington’s Pharmaceutical Sciences” című könyv (A. Osol), amely egy a szakterületen alkalmazott szokásos kézikönyv.
Alternatív beadási módok
IS
A találmány szerint sok ismert és kifejlesztett módot alkalmazhatunk legalább egy találmány szerinti antí-IL-12 ellenanyag gyógyászatilag hatásos mennyiségeinek a beadására. Míg pulmonáris beadást alkalmazunk a következő leírásban, a beadás más módjait Is alkalmazhatjuk megfelelő eredménnyel a találmány szerint.
Találmány szerinti IL-12 ellenanyagokat bejuttathatunk hordozóban oldatként, emulzióként, kolloidként vagy szuszpenziókém, vagy száraz porként, bármilyen, Inhaláeíós vagy más módon történő beadásra alkalmas különféle eszközök és eljárások alkalmazásával.
amint azt feltárjuk a leírásban vagy ismert a szakterületen.
. és beadás
Parenterális beadásra szolgáló kiszerelések közönséges kötőanyagot, mint például steril vizet vagy sőoldatot, pollalkán-glikólókat, mint például poiletilén-glíkolt, növényi eredetű olajokat, hidrogénezett nafíaléneket és hasonlókat tartalmazhatnak. Injektálásra szolgáló vizes vagy olajos szuszpenziőkat megfelelő emulgeálószer vagy nedvesitószer és szuszpendáló ágens alkalmazásával állíthatunk elő ismert eljárások szerint. Injektálásra szolgáló ágensek lehetnek nem toxikus, nem orálisan beadható hígító ágensek, mint például vizes oldat vagy steril injektálható oldat vagy szuszpenzió egy oldószerben. Alkalmazható hordozóeszközként vagy oldószerként víz, Rmger-oldat, Izotóniás sóoldat, stb. engedélyezett, szokványos oldószerként vagy szuszpendáló oldószerként steril nem illékony olajat alkalmazhatunk. Ezekre a célokra bármilyen típusú nem illékony olajat és zsírsavat alkalmazhatunk, beleértve természetes vagy szintetikus vagy szemíszintetíkus zsrrolajokat vagy zsírsavakat, természetes vagy szintetikus vagy szemiszintetikus mono- vagy di~ vagy triglícerideket. A parenterális beadás Ismert a szakterületen, és magában foglalja nem korlátozó példaként az injekciók hagyományos formáit, gáznyomásos tőmentes injekciós eszközt, amint azt az 5 851 198, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja, és lézer perforátor eszközt, amint az 5 839 446.. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat föltárja, amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kítanítás részét sík.
A találmány tárgyát képezi továbbá legalább egy antí-ík-12 ellenanyag beadása parenterális, szubkután, íntramuszkuláris, intravénás, íntrartikulárís, intrabronchiális, intrsahdommáhs, mtrakapsztdaris, intrakartílagíális, intrakavitál'is, intraeeliálís, intraeeiebelláris, imracerehröventríkrdáris, intrakolikus, mtraeervikálís, íntragasztrikus, intrahepatikas, íntramíokardíálís, intraoszteális, imrapeivíkns, miraperíkardíális, íotraperifoneális, ínfraplemáhs, imraprosz.fatik.us, inírapulmonáris, íntrarektáíís, intrarenáüs, íntrarednális, intraspinálís, ínfraszinovíális., intraioracikus, imrauíerin, ínfravezikábs, bólusz, vaginálís, rektális, bukkális, szuhlingváíis, intranazális vagy transzdermális úton. Legalább egy anti-1L-12 ellenanyag készítményt előállíthatunk parenterális (szubkután, intranruszkulárís vagy intravénás) beadásra, vagy bármilyen egyéb beadásra, előnyösen folyékony oldatok vagy szuszpenzíők formájában; vaginálís vagy rektális beadásra, előnyösen íélszílárd formában, mint például nem korlátozó példaként krém vagy kúp formájában; bukkális vagy szüblbgvális beadásra, mint például nem korlátozó példaként tabletták vagy kapszulák formájában; vagy Intranazális beadásra, mint például nem korlátozó példaként porok, orreseppek vagy aeroszolok vagy bizonyos ágensek formájában; vagy transzdermális beadásra, mint például nem korlátozó példaként gél, kenőcs, lemosó, szuszpenzió vagy tapasz bejuttatás! rendszer formájában, kémiai enhaneerekkel, mint például dírneiil-sztdfoxiddal, hogy módosítsuk a bőr szerkezetéi vagy hogy növeljük a drog koncentrációját a transzdermális tapaszban [Jungínger és mtsai., „Drog Permeation Enhancemení”, szerk.: Hsieh, D.S., 59-90. old, kiad.: Mareeí Dekker, Inc New York (1994), amely teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanltás részét képezi], vagy oxidálószerekkei, amelyek lehetővé teszik fehérjéket és peptideket tartalmazó kiszerelések bőrre történő bejuttatását (Wö 98/53847, számú nemzetközi közzétételi irat), vagy elektromos mezők alkalmazását, hogy tranziens transzport útvonalat hozzunk létre, mint. például elektroporációval, vagy hogy növeljük a feltöltött drogok mobilitását a boron keresztül, mint például íontoforézlssel, vagy ultrahang alkalmazását; mint például szonoforézissel (4 309 989. és 4 767 402. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi íratok) (a fenti publikációk és szabadalmak teljes terjedelműkben hivatkozás útján a kitanítás részét képezik)
Pulmonám/rtazális beadás
Pulmonárís beadás esetén előnyös legalább egy anti-ÍL-12. ellenanyag készítményt bejuttatunk olyan méretű részecskékben, amelyek hatásosak a tüdő vagy a szinuszok alsó fogytáinak elérésére. A találmány szerint legalább egy antí-IE-12 ellenanyagot a szakterüieien terápiás ágens inhaláeióval történő bejuttatására ismert bármilyen inhalációs vagy nazális eszköz alkalmazásával. Aeroszoüzált kiszereléseknek a páciens szinuszüregeibe vagy alveokjsaifea történő bejuttatására képes ilyen eszközök közé tartoznak mért dózisú inhalátorok; nebulizátorok, szárazpor generátorok, permetezők és hasonlók. Ellenanyagok pulmonáris vagy nazális beadását irányító más alkalmas eszközök szinten ismertek a szakterületen. Minden ilyen eszköz az, ellenanyagnak aeroszolban történő eloszlatásával történő beadásra alkalmas kiszerelést alkalmaz. Ilyen aeroszolok vagy oldatokat (mind vizes, mind nem vizes), vagy szilárd részecskéket tartalmazhatnak. Mért dózisú inhalátorok, mint lö például a Fen&tóW mért dózisú inhalátor tipikusan hajtógázt alkalmaznak, és meghajtást igényelnek a belégzés során (lásd például a Wö 94/1Ő97Ö., WO 98/35888. számú nemzetközi közzétételi iratokat). A száraz poros inhalátorok, mint a rurfatba&r1® (Astra), (Glaxo), .Dritet® (Glaxo), Ő/rtros™ inhalátor (Dara), az Inhale Therapeuiies által forgalmazott eszközök és a ópirtóo/ez® poros inhalátor (Fisom), kevert por lélegzettel való meghajtását alkalmazzák [4 668 218, szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Astra), EP 237 507. számú európai szabadalmi irat (Astra), WO 97/25086, szántó nemzetközi közzétételi irat (Glaxo), WO 94/08552. számú nemzetközi közzétételi írat (Dura). 5 458 135. szántó amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Inhale), WO 94/06498. számú nemzetközi közzétételi irat (Eisons). amelyek teljes terjedelmükben hivatkozás útján a kitanitás részét képezik). Nebulizátorok, mint az az Í/Aranem® nebuíizátor (Maliinckrodt) és az Acö/v? nebuíizátor (Marqnest Medinai Products) (5 404 871. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat, Aradigm, WO 97/22376. számú nemzetközi közzétételi irat, amelyek mindegyike teljes terjedelmében hivatkozás útján a kitanitás részét képezi) aeroszolokat hoznak létre folyadékokból, míg a mért. dózisé inhalátorok, száraz poros inhalátorok, stb. kis résxeeskeméretű aeroszolokat hoznak létre. A kereskedelmi forgalomban kapható inhalációs eszközök ezen specifikus példáit csak a találmány gyakorlatba vételéra alkalmas specifikus eszközök reprezentációjának szánjuk, és nem a találmány oltalmi körét korlátozónak. Előnyösen a legalább egy antí-IL-12 ellenanyagot tartalmazó készitményt száraz poros inhalátorral vagy permetezővel juttatjuk be. A találmány szerinti legalább egy ellenanyag beadására szolgáló inhalációs eszköznek számos kívánatos tulajdonsága van.
Például az inhalációs eszköz általi bejuttatás előnyösen megbízható, reprodukálható és pontos.
Az inhalációs eszköz adott esetben kis száraz részecskéket juttathat be, például kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen körülbelül 1-5 pm, a jó iélegezhetőség érdekében .5..
5915
IL-12 ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmazó sprayt előállíthatunk legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmazó szuszpenzió vagy oldat fuvókán keresztül nyomás alatt történő átpréselésévd. A fóvőka méretét és konfigurációját, az alkalmazott nyomást és a folyadék adagolási sebességét úgy választhatjuk meg, hegy a kívánt kimenetét és részecskeméretet kapjuk. Elekríosprayí állíthatunk dó például kapilláris©» vagy fúvókén keresztüli áramlattal kapcsolatban lévő elektromos mezővel. Előnyösen a porlasztóval bejuttatott, legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül I pm és körülbelül 5 pm közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.
A porlasztóval történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény fehérje kiszerelései vizes oldatban lévő ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmaznak az oldat ml-eiként a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag készítmény körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncenírádójában, vagy rng/g, vagy bármilyen tartomány vagy érték ezek között, például nem korlátozó példaként I,. 2.,. 3,. 4,. 5,, ő,. 7,. 8,.
0,9, I, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, IX 14, 15, lő, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 vagy 100 mg/ml vagy mg/g. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kötőszert, puffért, izotőniás ágenst, tartósítószert felületaktív anyagot és - előnyösen - cinket. A kiszerelés tartalmazhat az ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst Is, mint például puffért, redukálószert, fehérjét vagy szénhidrátot. Ellenanyag-készítmények kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumin, protamln vagy hasonlók. Ellenanyag-készítmény fehérjék kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, rnannitol, laktóz, írehaióz, glükóz vagy hasonlók. Az ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot .25 is, amely csökkentheti vagy megelőzheti az ellenanyag-készítmény fehérje felszíni aggregáeióját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizádója okoz. Különféle hagyományos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például polioxietilénzslrsav-észiereket és -alkoholokat, és polioxi^.léfí-szorbitoi-zsírsav>^zterek.et A mennyiségük általában a 0,001 és 14 tömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti alkalmazásra a polioxletilén-monooleát, pohszorbát 80, pohszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például ÍL-12~ellenanyagok vagy azok meghatározott részletei vagy variánsai kiszerelésének a szakterületén Ismert további ágensek Is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Λ * Φ * χ .« Φ
IL-12 ellenanyag-készítmények beadása nebulizátorrai
Ellenanyag-készítmény fehérjét beadhatunk nebulizátorrai, mint például sugárhajtású nebnlizátorra! vagy ultrahangos nehulizáíorral. Tipikusan egy sugárhajtású nebulízátorban kompresszált levegő forrást' alkalmazunk nyíláson keresztül kilépő nagysebességű levegősugár létrehozására. Ahogyan' a gáz kitágul a íúvóka után, alacsony nyomású régió jön létre, anú ellenanyag-készítmény fehérje oldatát szívja át a folyadéktartályhoz kapcsolódó fcapillárisesövön. A. kapilláriscsöből kilépő fblyadékátam instabil szálakká és cseppeké nyíródik szét, aeroszolt hozva létre. Különféle konfigurációkat; áramlási sebességeket és tereiötlpusökat alkalmazhatunk egy adott sugárhajtású nebulizátor kívánt teljesítményi
W jellemzőinek eléréséhez. Ultrahangos nebulízatórfean magas frekvenciájú elektromos energiát alkalmazunk mechanikus rezgési energia létrehozására, tipikusan piezoelektromos transzduktor alkalmazásával. Ezt az energiát visszük át az eUenanyag-készhmény fehérje kiszerelésre akár közvetlenül, akár kapcsolófolyadékon keresztül, az ellenanyag-készítmény fehérjét tartalmazó aeroszolt hozva létre, Előnyösen a nehuüzátorral bejuttatott ellenanyag15 készítmény fehérje részecskéinek a részecskemérete kisebb, mint körülbelül 10 prn, előnyösen a körülbelül 1 prn és körülbelül 5 gm közötti tartományban van, es l egeiőnyö sebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 pm közötti.
A nebulizátorrai - akár sugárhajtású, akár ultrahangos - történő alkalmazásra megfelelő legalább egy anti-IL-12. ellenanyag kiszerelései tipikusan az oldat ml-elként a.
legalább egy anü-lL-12 ellenanyag-készítmény fehérje körülbelül 0,1 mg és körülbelül 100 mg közötti koncentrációjában. A kiszerelés tartalmazhat ágenseket, mint például kolöszert, puliért, izotöniás ágenst, tartósítószert, felületaktív anyagot, és - előnyösen - cinket. A kiszerelés tartalmazhat a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag-készítmény fehérje stabilizálására szolgáló kötőszert vagy ágenst is, mint például puffért, redukálószert., fehérjét vagy szénhidrátot. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag-készítmény kiszerelésében alkalmazható fehérjék közé tartozik az albumín, protamm vagy hasonlók. A legalább egy antí-IL-12 ellenanyag kiszerelésében alkalmazható tipikus szénhidrátok közé tartozik a szukróz, mannitoi, Iaktóz, trehalóz, glükóz vagy hasonlók. A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag kiszerelés tartalmazhat felületaktív anyagot is, amely csökkentheti vagy megelőzheti a legalább egy anti-IL-12 ellenanyag felszíni aggregációját, amelyet az oldat aeroszol létrehozása során bekövetkező atomizáciőja okoz. Különféle hagyományos felületaktív anyagokat alkalmazhatunk, mint például políoxietilén-zsírsav-észterekei és -alkoholokat, és polioxietilén-szorbitöl-zsírsav-észterekei. A mennyiségük általában a 0,001 és 4 íömeg% közötti tartományba eshet. Különösen előnyös felületaktív anyag a találmány szerinti * X ~ 61 .
alkalmazásra a políoxíetilén-tnonooleáf, pollszorbát 80, pollszorbát 20 vagy hasonlók. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén Ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben,
IL-12 ellenanyag» készítmény ek beadása mért dózisé inhalátorral 5 Mért dózisu inhalátorban (ΜΒΪ) bajtógáz, legalább egy antí-IL-12 ellenanyag, és bármilyen kötőszer vagy egyéb adalékanyag található fémdobozban, cseppfolyósított kompresszált gázt tartalmazó keverékként. A mérőszelep beindítása a keveréket aeroszolként szabadítja fel, amely előnyösen kisebb, mint körülbelül 10 pm, előnyösen a körülbelül 1 um és körülbelül 5 unt közötti tartományban van, és legelőnyösebben körülbelül 2 pm és körülbelül 3 μτη közötti méretű részecskéket tartalmaz. Á kívánt aeroszol részecskeméretet előállíthatjuk szakember szántára Ismert különféle módokon - mint például „jeí~millíng”, spray-száritás. kritikus ponti kondenzáció vagy hasonlók - előállított ellenanyag-készítmény fehérje kiszerelés alkalmazásával. Előnyös mért dózisé inhalátorok köze tartoznak a 3M és Glaxo által gyártottak, amelyekben hidroriuorokarhon hajtógázt alkalmaznak.
A legalább egy anti-IL-12 ellenanyag mért dózisé inhalátor eszközzel történő alkalmazására szolgáló kiszerelései általában finom eloszlású port tartalmazhatnak, amely legalább egy anti-IL-12 ellenanyagot tartalmaz szuszpenzióként nem vizes közegben, például fehzuszpendálva a hajtógázban felületaktív anyag segítségével. A bajtógáz lehet bármilyen erre a célra hagyományosan alkalmazott anyag, mint példáid klorofluorokarbon, hidroklorofiuorokarbon, hidroüuorokarbon vagy szénhidrogén, beleértve trikJoröfiuorometánt, diklorodífiuorometánt, dikloroteíraflnoroetanoit és 1,1,1,2-letrafluoroetánt, HFA134a-t (hidrofiuroalkán~í34a), BF.A-227-et (bidrofiuroalkán-227), vagy hasonlókat. Előnyösen a hajtőgáz bldroduorokarbon. .A felületaktív anyagot úgy választhatjuk meg, hogy stabilizálja a hajtógáz-szuszpenzióban a legalább egy antí-IL-12 ellenanyagot, védje a.
hatóanyagot a kémiai degradációvai szemben, és hasonlók Alkalmas felületaktív anyagok közé tartozik a szorbitán-trioleaí, szóíalecitín, olajsav vagy hasonlók. Bizonyos esetekben oldat aeroszolok előnyösek, oldószerként, például etanol alkalmazásával. Fehérje, mint például ellenanyag fehérje kiszerelésének a szakterületén ismert további ágensek is alkalmazhatók a kiszerelésben.
Átlagos képességű szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásokat megvalósíthatjuk legalább egy anti-IL-12 ellenanyag a leírásban nem feltárt eszközzel történő putoonáris beadásával Is,
I» * * * * * * « * »>
V Μ *Κ *♦ * * * * V « » **«« ίΨΨ* <%· ' *flk '
-62Orális beadásra szolgáló kiszerelések adjuvánsok (például rezorcinolok és nentfonos felületaktív anyagok, mint például polioxieúlén-oleil-éter és n-hexadecil-poiietilén-étef) együttes beadásán alapulnak; amelyek mesterségesen növelik a bélrendszer falának a permeabilítását, valamint enzim inhibitorok [például hasnyálmirigy tripszin inhibitorok, díizopropii-fluorofoszíát .(DFP) és trazilol] együttes beadásán alapulnak, amelyek gátolják az esizímatikus degradációt. Orális beadásra szolgáló szilárd adagolási forma hatóanyag komponensét összekeverhetjük legalább egy adalékanyaggal, mint például szukrózzai, laktözzai, cellulózzal, nianniiollal, frehalózzaJ, rafbnozzal, maltitollal, dextránnal, keményítőkkel, agarrai, arginátokkal, kitinekkel, kitozánokkal, pektinekkel, tragakant gumival, gumiarábikummal, zselatinnal, kollagénnel, kazeinnel, albummnal, szintetikus vagy szemiszlntetifcus polimerekkel és glicerídekkel. Ezek az adagolási formák tartalmazhatnak más típusú adalékanyagokat is, például inaktív hígító ágenseket, kenőanyagokat, mint például magnézium-sztearátot, parabént, tartósító ágenseket, mint például szorbinsavaí, aszkorhin15 savat alfa-tokoferolt, antioxidánst, mint például eiszteint, bomlasztoszert, kötőanyagot, púderek» ágenst, édesítőszert, ízesítőszert, illatosító szert, stb.
Tablettákat és pirulákat továbbá lakíthatunk enterikus bevonatú készítményekké. .Az orális beadásra szolgáló folyékony készítmények közé tartoznak a gyógyászati alkalmazásra engedélyezhető emulzió, szirup, eiixír, szuszpenzió és oldat készítmények. Ezek a készítmények a szakterületen rendszeresen alkalmazott inaktív bigiiö ágenseket tartalmazhatnak; mint például vizet. Liposzómákat is leírtak drogszállitó rendszerként inzulin és heparín esetéhen (4 239 754. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Újabban, kevert aminosavak mesterséges polímerjeiböl (proteinoid) készült mikrogömböket is alkalmaztak gyógyászati készítmények bejuttatására (4 9.25 673. számú amerikai egyesült
2.5 államokbeli szabadalmi hat), Ezenkívül az 5 879 681, és 5 871 753. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban feltárt hordozóvegyületeket is alkalmazzák, biológiailag aktív ágensek orális bejuttatására.
Mukózálís kiszerelések és beadás
A nyálkahártyái felszíneken keresztül történő abszorpció esetében a legalább egy anti30 II.-12 ellenanyag beadására szolgáló készítmények és eljárások tartalmazhatnak olyan emulziót, amely sok sznbmikron részecskét, mukoadhezív makromolekulát, bioaktiv pepiidet, és egy összefüggő vizes fázist tartalmaz, ami elősegíti a nyáíkahártya-feisxineken keresztül történő abszorpciót, az emulzió részecskéinek mukoadhéziójának elérésével (5 514 670. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi irat). A találmány szerinti emulziók
- 63 * Φ Φ * φ Φ W φ Φ Φ - <9 >*» φφ Φφ φ φ ***** »<«# φΧΛ-φ Φφ Χχτ Χφ felvitelére alkalmas nyálkahártya-felszínek lehetnek szaruhártyal, kötőhártyai, bukkális, szubhngváhs, nazális, vagínális, pulmonáris, gyomorbelí, imesztináhs és rektálls beadási utak. Vagináhs vagy rektális beadásra szolgáló kiszerelések, például kúpok tartalmazhatnak kötőszereket, például polialkán-glikofokat, vazelint, kakaóvajat és hasonlókat. Intraoazális beadásra szolgáló kiszerelések lehetnek szilárdak, és kötőszert tartalmazhatnak, mint például Íaktózt, vagy lehetnek vizes vagy olajos orreseppek, Bufckáhs beadás esetén a kötőszerek lehetnek cukrok, kalciurn-sztearál, magnézium-sztearát előre zselaíinízált keményítő és hasonlók (5 849 695. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi írat).
Transzdermális kiszerelések és beadás
Transzdermális beadás esetében a legalább egy antí~IL~12 ellenanyagot szállítóeszközbe, mint például liposzómába vagy polimer nanorészecskékbe, mikrorészecskébe, mikrokapszulába vagy mikrogömbökbe (amelyeket, együttesen mikrorészecskéknek nevezünk, amennyiben másképp nem jelezzük) burkoljuk he. Számos alkalmas eszköz ismert, például szintetikus polimerekből, mint például polihidroxi-savakból, mint például poli15 tejsavból, poligiikoisavbói és azok kopohmerjeiből, políortoészterekből, pohanhidridekböl és poíífoszíazénekből, és természetes polimerekből, mint például kollagénből, poliatninosavakból, albuminból és egyéb fehérjékből, alginátból és egyéb poltszacharidokbóL és ezek kombinációiból készített mikrorészecskék (5 S14 599. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat),
Tartós beadás és kiszerelések
Bizonyos esetekben kívánatos lehet a találmány szerinti vegyületeket hosszan tartó időszakon keresztül beadni az alanynak, például egy beadásból egy hét és egy év közötti időtartam alatt. Különféle lassú felszahadulásu., depó és implantátum formákat alkalmazhatunk. Például egy adagolási forma tartalmazhatja a vegyület gyögyászatilag elfogadható nem toxikus sóját, amelynek alacsony az oldhatósága a testfolyadékokban, például (a) savaddiciös sö políbázisos savval, mint például foszforsavval, kénsavval, citromsavval, borkősawal, csersawál» panroinsavval, algasavval,, polígluíaminsavval, naftalén-mono- vagy diszulfonsavval, polígálakturonsavva.l és hasonlókkal; (b) pohvalens fémkation sója, mint például cink, kalcium, blzmnt, bárium, magnézium, alumínium, réz, kobalt, nikkel, kadmium és hasonlók, vagy szerves kation sója, például HNMÍbsnzíI-etiléndiamin vagy etiléndíamín; vagy (c) (a) és (b) kombinációi, mint például cink csersav sója, Ezenkívül a találmány szerinti vegyületeket - vagy előnyösen - egy előbb ismertetett viszonylag oldhatatlan sót kiszerelhetünk gélben, például aiumínium-monosztearát gélben, például injektálásra alkalmas szezámolajjal. Különösen előnyős sók a cink sók, cink csersav sók, pamoát sók és hasonlók.
ΐ * 9 4Λ * > ·» » » M « *♦·$ X^ * <
X « 6 ♦ * *' Φ »*’♦« «·ΦΛχ *< *<©
- 64 Az injektálásra szolgáló lassú felszabadulású depó kiszerelések egy másik 'típusa a vegyületet vagy sót diszpergálva tartalmazná lassan degradálódó, nem toxikus, nem antigénhatású polimerben, mint például polilakáLpöiíglikolát polimerben, például ahogyan a 3 773 919. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat feltárja. A vegyületeket vagy - előnyösen 5 a feltárt viszonylag oldhatatlan sókat szibsztikus koleszterin pelletben is kiszerelhetjük, különösen állati alkalmazásra. További lassú folszabadulású, depó vagy implantáíum kiszerelések, például gáz vagy folyadék liposzőmák ismertek a szakirodalomban [5 770 222. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat és „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, szerk.; I R. Robinson, kiad.; Mareel Dekker, Inc., N. Y. (1978)].
A találmány általános ismertetését kővetően az. könnyebben is érthető lesz a következő példákra való hivatkozással, amelyeket a szemléltetés érdekében mutatunk be, és nem tekintjük azokat korlátozónak.
1. példa: 11.-12 ellenanyag klónozása és expresszáitatása emlős sejtekben
Egy tipikus emlős expressziős vektor legalább egy promóter elemet tartalmaz, amely irányítja az mRNS-nek, az ellenanyag kódoló szekvenciájának és a transzkripció termmáeiojáboz és a transzkripten poliadenílációjához szükséges szignálok transzkripciójának az iniciáeióját. További elemek közé tartoznak euhaneerek, Kozák-szekvenciák, és RNS~splícing-re szolgáló donor és akeeptor helyekkel szegélyezett közbenső szekvenciák.
Nagyon hatékony transzkripciót érhetünk el az SY4Ö~ből származó korai és késői promóterekkel, a retrovírusok; például RSV, HTLV1, fflVl hosszú terminális ismétlődéseivel (LTR) és a citomegalo vírus (CMV) korai proméí erével. Azonban sejtbeli elemeket is alkalmazhatunk, (például a humán aktin-promótert.). Megfelelő expressziós vektor a találmány gyakorlatba vételéhez például olyan vektorok, mint a pIRESlneo, pRetro-Olf, pRetro-On, PLXSN vagy pLNCX (Cionetech Labs, Pafo AIío, CA), pcDNA3,.l (+/-), pcDNA/Zeo (Ή-) vagy peDNA3.1/Hygro (+/-) (invitrogen), PSVL és PMSG (Pharmacia, üppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSVSdhfr (ATCC 37146) és pBC12MI (ATCC 671Ő9). Az alkalmazható emlős gazdasejtek közé tartoznak a humán Hela 293, H9 és Jurkat sejtek, egér NIH3T3 és Cl27 sejtek, Cos 1, Cos 7 és CV 1, íurj QC3-3 sejtek, egér L sejtek és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek.
Más megoldásképpen a gént stabil sejtvonalakban is expresszáltathatjuk, amelyek tartalmazzák a gént a kromoszómába integrálódva. Együttes Iranszfektálás szelektálható markerrel - mint például dhfr, gpt, neomicin vagy bigromicin - lehetővé teszi a transzfektált sejtek azonosítását és izolálását.
*»
A iranszfekláit géneket amplifikálhatjuk is, hogy a kódolt ellenanyag nagy mennyiségét expresszáltassuk. A DHFR (dihidrofbláí-reduktáz) marker alkalmazható olyan sejtvonalak kifejlesztésére, amelyek a jelentőséggel bíró gén több száz. vagy több ezer példányát hordozzák. Egy másik alkalmazható szelekciós marker a glutamin-színtáz (GS) enzim [Murphy és mtsai., Biochem. 1 2.27, 277-279. old. (1991); Bebbington és mtsai., Bío/Teehnology 10, 1Ő9-Í75. old. (1992)]. Ezeknek a markereknek az alkalmazásával az emlős sejteket szelektív tápközegben tenyésztjük, és legmagasabb rezísztenciájó sejteket szelektáljuk ki. Ezek a sejtvonalak az amplifikák gént a kromoszómába integrálódva tartalmazzák. Kínai hörcsög petefészek (CHO) és NSO sejteket gyakran alkalmaznak ellenanyagok termeltetésére.
A pCl és pC4 expressziós vektorok a Rons Sarcoma Vírus erős promóterét (LTR) tartalmazzák [Colién és mtsai., Moíec.. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)] és a CMVenhancer egy íragmenséí [Boshait és mtsai., Cell 41, 521-530. old. (1985)]. Többszörös klónozó helyek, például a BamHI, Xbal és Asp718 helyeket tartalmazók elősegítik a jelentőséggel bíró gén klónozását. A vektorok ezenfelül tartalmazzák a patkány preproinzulín génjének a .3’ intronját, políadeniláciős és termínációs szignálját.
A pC4 vektort alkalmazzuk 1E-12 ellenanyag expresszáliatására. A pC4 píazmid a pSV2-dhfr (ATCC elérési szám: 37146) származéka. A píazmid tartalmazza az egér DHFR génjét az SV4Ö korai promóterének a szabályozása alatt. Kínai hörcsög petefészek sejtek, vagy más, dihidrofolát aktivitás nélküli sejtek, amelyek transzíektálva vannak ezekkel a plazmidöfckal, szelektálhatok a sejteknek metotrexát kemoterápiás szerrel kiegészített szelektív tápkőzegen (például alfa mínusz MÉM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) történő tenyésztésével. A DHFR gének amplifíkáeióját metotrexátra (MTX) rezisztens sejtekben részletesen dokumentálták [lásd például F, W. Alt és mtsai., J. Bioi. Chem. 253, 1357-1370. old. (1978); j L. Kamiin és C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097, 107443. old. (1990); és Μ. I Page és M. A. Sydenham, Bioteehnology 9, 64-68. old. (1991)]. Növekvő koncentrációjú MTX-en tenyésztett sejtekben rezisztencia alakul a drogra a célenzim, a DHFR túltermelése mellett, a DHFR gén amplífikácíója eredményeképpen. Ha egy másik gén is kapcsolódik a DHFR génhez, akkor általában az is együtt amplífikálődik és túltermelödlk. Ismert a szakterületen, hogy ez a megközelítési mód alkalmazható az amplifikáít gén(ek) több mint 1000 példányát hordozó sejtvonalak kifejlesztésére. Azt követően - amikor a metotrexátot elvonjuk - olyan sejtvonalakat kapunk, amelyek tartalmazzák az amplitlkált gént a gazdasejt egy vagy több kromoszómájába integrálódva.
* * * «> * φ « * X * φ «Κ ¥ « fc * > * A
4Λ + 9 ««*« »« «* *«
- óő A pG4 plazmid a jelentőséggel bíró gén expresszáltatásához tartalmazza a Rous Sarcoma Vírus hosszú terminális ismétlődésének (LTR) az erős promóterét (Ctillea és mtsai <, Moiec. Cell. Bioi. 5, 438-447. old. (1985)] és egy izolált fragmenst a humán oitomegalovirus (CMV) azonnali korai génjének az enhaneeréhől ((Boshart és mtsai., Cell 41, 521-530. óid.
(1985}]. A promótertőí leolvasással megegyező irányban RamHL Xbal és Asp718 restrikciós enzim helyek találhatók, amelyek lehetővé teszik a gének integrálását. Ezek mögött a klónozó helyek mögött a plazmid a patkány preproinzuli» génjének a 3’ intronját és poliademiációs helyét tartalmazza. Más nagyon hatékony prornóterekeí is alkalmazhatunk az expresszáltatásra, mint például a humán á-aktin promótert, az SV40 korai vagy késői promóterét, vagy a hosszú terminális ismétlődéseket más retrovímsokból, például HIY-ből és HTLVI-bőL A Cloníeeh 7éf-í')jf és léí-ön génexpressziős rendszerei és hasonló expressziős rendszerek Is alkalmazhatók IL-12 szabályozott expresszáltatására emlős sejtekben [M Gossen és B, Bujáid, Proe. Natl. Acad. Sei. USA 89, 5547-5551. old. (1992)]. Az raRNS poliadenilálására más szignálokat, például a humán növekedési hormon génből vagy globin génekből származókat is alkalmazhatunk. A jelentőséggel bíró gént. a kromoszómákba integrálódva hordozó stabil sejtvonalakat kiszelektálhatunk szelektálható markerrel, mint például gpí-vel, G418-cal vagy higromteinnel történő együtt transzfektálást követően. Előnyös kezdetben egynél több szelektálható markert alkalmazni, például G418~a.t és metotrexátot.
A pC4 piazmidot restrikciós enzimekkel emésztjük, és azután defoszforiláljuk borjú intesztinális foszíatázzal a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával. A vektort azután 1%-os agarózgélböl izoláljuk. Az IL-12 ellenanyag teljes szekvenciáját kódoló DN8-szekvencíát alkalmazzuk ismert eljárási lépések szerint, amint azt például az I. azonosítószámú szekvencián és a 2.
azonosítószámú szekvencián bemutatjuk, amelyek sorrendben megfelelnek egy találmány szerinti 11.,-12 ellenanyag HC és LC variábilis régiójának. Megfelelő humán állandó régiókat (azaz HC és LC régiókat) kódoló izolált nukleinsavakat is alkalmazunk ebben a konstrukcióban (például a pl351 vektorban)
A variábilis és állandó régiót kódoló izolált DNS-t és a detbszforílált vektort azután
T4 DNS-hgázzal összeligáljuk. Azután A cuő HB 101 vagy XL-l Blue sejteket transzformálunk, és olyan baktériumokat azonosítunk például restrikciós enzimes elemzés alkalmazásával, amelyek tartalmazzák a fragmenst a pC4 plazmidba inzertálva,
Aktív DHFR. gént nem tartalmazó kínai hörcsög. petefészek (CHO) sejteket alkalmazunk a transziektáláshoz. A pC4 expressziós plazmid .5 g-ját együtt transzfektáljuk 0,5 *
*.·*
-67» g pSV2-neo plazmiddal lipofekítn alkalmazásával A pSVZneo plazmid egy domináns szelektálható markert tartalmaz, a Tn5 neo génjét; amely antibiotikumok egy csoportjára, köztük a G4I8-ra való rezisztenciát okoz. A sejteket 1 g/ml G4I8~ea! kiegészített alfa mínusz MÉM tápkőzegre oltjuk le. Két nap múlva a sejteket íripsztnizáljuk, és leoltjuk hibridóma klónozó lemezekre (Greiner, Germany) 1.0, 25 vagy 50 ng/ml metotrexáttal és 1 g/ml G418cal kiegészített alfa mínusz MÉM tápközegben. Körülbelül 10-14 nap elteltével egyedi ki-ónokat tripszinizálunk, és azután leoltjuk azokat ő-méröhelyes csészékre vagy lö ml-es edényekbe metotrexát különböző koncentrációinak (50 nM, 100 nM, 200 n.M, 400 nM, 800 nM) az alkalmazásával. A metotrexát legmagasabb koncentrációján növekvő kiónokat azután átvisszük új ó-mérőhelyes lemezekre, amelyek metotrexát még magasabb koneentrációját (I miM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) tartalmazzák Ugyanezt az eljárást ismételjük addig, amíg olyan kiónokat állítunk elő, amelyek növekednek 100-200 mM koncentráción. Elemezzük a kívánt gén expresszióját, például SDS-FAGE és Western-bloí vagy fordított fázisú -HPLC elemzéssel .
2. példa: Humán TföMeS reagáló magas affinitása humán IgG monoklonális ellenanyagok előállítóba transzgenikus egerek alkalmazásával
Összefoglalás
Humán nehéz és könnyűlánc immunglobulin géneket tartalmazó transzgenikus egereket alkalmaztunk magas affinitású, teljesen humán monoklonális ellenanyagok létrehozására, amelyek terápiásán alkalmazhatók a IL-12 hatásának gátlására egy vagy több TNF által közvetített betegség kezelésében. (A nehézlánc és könnyűlánc humán variábilis és állandó régió erieoanyag-transzgénjeit tartalmazó (CBA/J x C57/BL6/J) P-? hibrid egereket immunizáltunk humán rekombínáns IL- 12-vel fTsyíor és mtsai., Inti. Immunoi, 6, 579-591. old. (1993); Lonherg és mtsai.. Natúré 368, 856-859. old. (1994), Neuberger, M., NatúréBiotech. 14, 826. old. (1996); Fishwíld és mtsai., Natúré Biotechnology 14, 845-851. old. (1996)]. Számos fúzió eredményezett, egy vagy több teljesen humán, ÍL- 12-vel reagáló IgG monoklonális ellenanyag-panelt A teljesen humán antí-IL-Pk ellenanyagokat tovább jellemezzük. Az ilyen ellenanyagokról azt találjuk, hogy az affinitást állandójuk valahol IxlO9 és -9xí012 között van. Ezeknek az teljesei: humán monoklonális ellenanyagoknak a váratlanul magas affinitása alkalmas jelöltté teszí azokat terápiás alkalmazásokban IL-12-vel kapcsolatos betegségek, patológiák vagy rendellenességek esetében.
W ·**
-68BSA ~ mát haszérum-album in €0; - szén-droxid DMSO - dlmetil-szullóxid
EIA - enzimes immunológiai vizsgálati eljárás
BBS - magzati. marhaszérum H2O2 - hidrogén-peroxid HRP - tormaperoxidáz ID - mteradermális lg - immunglobulin
IL-12 - .mterleukln-12 IP - mtraperltoneálís IV - intravénás
Mao - monoklonális ellenanyag
OD - optikai denzltás
ÖP.D - o-feniléndiamln dihidrokloríd PBO - püíietílén-giikol PSA - penicillin, sztreptomleim amfoterícin RT - szobahőmérséklet
SQ - szabkután v/v -- térfogat/térfogat w/v - tömeg/tédógat
Anyagok és eljárások
Állatok
Humán ellenanyagok expresszálására képes transzgeníkus egerek ismertek a szakterületen (és kereskedelmi forgalomban kaphatók például az alábbi cégektől: GenPharm International, San 3ose, CA; Abgenix, Preemont, CA, és mások), amelyek humán Immunglobulinokat expresszálnak, és egér IgM-et vagy Ig-t nem. Például ilyen transzgeníkus egerek V(D)J kapcsoláson, nehézlánc osztály változásán és szomatikus mutációkon keresztülmeno humán szekvenciájú transzgéneket tartalmaznak, humán szekvenciája immunglobulinok készletét hozva létre ÍLonherg és misai., Natúré 368, 856-859. old. (1994)). A kőnnyülánc transzgéneket például részben élesztő mesterséges kromoszómáról származtathatjuk, amely tartalmazza a csíravonal humán V-régiónak majdnem a felét.
- 69 *'# ** ♦·». Jí·* * * * 4 Λ v # ? * * *.> ** ··*. ·4«- »2 '‘.»« transzgén mind humán μ, mind humán 1 [Físhwíld és mtsai., Natúré fogy 14, 845-851. old. (1996)] és/vagy 3 állandó régiókat kódolhat. Megfelelő genotípusos leszármazási vonalból származó egereket alkalmazhatunk az immunizálásban és fúziós eljárásokban, teljesen humán IL-12 elleni monoklonális ellenanyagokat hozva létre, lás
Egy vagy több Immunizálási rendet alkalmazhatunk az anti-IL-12 humán hibridómák létrehozásához. Az első néhány fúziót az alábbi szemléltető immunizálási protokoll szerint hajthatjuk végre, de más hasonló ismert protokollokat is alkalmazhatunk. Számos 14-20 hetes nőstény és/vagy műtétileg Ivaitalanítofí transzgenikus hím egeret immjunlzálunk IP és/vagy
ID 1-1000 pg rekombínáns humán IL-l2-vel, azonos térfogain TJJH^á/LV-szal vagy komplett Freund-féle adjuvánssal emulgeálva 100-400 pl (például 200 pl) végférfogatban. Mindegyik egér opcionálisan kaphat 1-10 pg-ot 109 pl fiziológiás sőoldatban a 2 SQ hely mindegyikén. Az egereket azt kővetően immunizálhatjuk 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 és/vagy 2134 nappal később IP (1-400 pg) és SQ (1-400 pg x 2) ΙΕ-12-veL azonos térfogain
777L7óyA.¥-szai vagy inkompleti Freund-féle adjuvánssal emulgeálva. Az egereket 12-25 és 25-40 nappal később veregethetjük retro-orbítális szúrással, véralvadás elleni szer nélkül. A vért azután hagyjuk megakadni RT egy órán keresztül, és a szérumot összegyűjtjük és tátraijuk IL-12 BIA vizsgálati eljárás alkalmazásával ismert módszerek szerint. Akkor végezzük el a fúziót, amikor a megismételt injekciók nem okozzák a literek, emelkedését.
Ekkor az egerek egy végső IV megerősítő Injekciót kaphatnak 1-400 pg IL- 12-vel, 100 pl fiziológiás sőoldatban hígítva. Három nappal később az egerek eutanizálhatjuk a nyak kit ekerésével, és a lépeket aszeptikusán eltávolítjuk és 10 ml, hideg foszfát-puff'erelt sóoidatha (PBS) tesszük, amely 100 U/ml penicillint, 100 gg/ml sztreptomieint és 0,25 pg/rnl amíóteriein B-t (PS.A) tartalmaz, A lépsejteket sterilen begyűjtjük a lépnek PSÁ-PBS-sel történő perfúziójával, A sejteket egyszer megmossuk hideg PSÁ-PBS-sel, megszámoljuk tripánkék festékkizárás alkalmazásával, és újra fél szuszpendáljuk 25 mM líepes-t tartalmazó RPM1 1640 tápközegben.
A fúziót L l - L. 10 arányban lévő egér mielőma sejt és életképes lep-sejí alkahna30 zásával hajthatjuk, végre ismert módszerek szerint, például amint, az ismert a szakterületen. Nem korlátozó példaként lépsejteket és mieióma sejteket együtt csapadékba vihetünk. A csapadékot azután lassan újra félszuszpendálhafjuk - 30 másodpere alatt - 1 ml 50% (w/v) PEG/PBS oldatban (a PEG molekulatömege L Sigma) 37 X-on. A fúziót azután leállíthatjuk 10,5 ml, 25 mM Hepes-t tartalmazó R.PMI 1640 tápközeg lassú, I percen keresztül történő
- 70 hozzáadásával (37 Ώ€~οη). A. íuzíonáltatolt sejteket leceniriíugáljuk 5 percen keresztül 5001500 rpm-en. A sejteket azután újra felszeszpendáljuk HAT tápközegben (RPMI 1640 tápközeg, amely 25 ®M Hepes-t, 10% .Fed?/ CTcw / szérumot (Tlyclone), 1 raM nátriumpiruvátot, 4 mM L-glutamint, 10 pg/ml gentamicint, 2,5% GAge» «riüzAng .rnyzp/emerk-et (Fisherk 10'% 653-kondlcionált RPMí 1640/Hepes tápközeget, 50 μΜ 2-merkaptoetanoh., 100 μΜ hlpoxantim, 0,4 μΜ amrnopterint és 16 pM Íimidiní tartalmaz), és azután szélesztjük azokat 200 pi/méröhely mennyiségben 15 darab 96-mérőhelyes, lapos fenekű szövettenyésztő mikrotíterlemezre, A lemezeket azután 7-10 napra párásítóit 37°C-ös inkubátorba helyezzük, amely 5% GCM és 95% levegőt tartalmaz.
Humán IgG antMüL~Í2 ellenanyagok detektálása egér szérumban
Szilárdfázisü EIÁ~t alkalmazhatunk az egérszérumok humán IE~I2~re specifikus humán IgG ellenanyagokra történő szkrinelésére. Röviden, lemezeket vonhatunk be 2 pg/rnl koncentrációjú IL- 12-vel éjszakán keresztül PB5~ben. Miután mossuk 0,02% (v/v) Tween 20aí tartalmazó 0,15 M sóoidattal, a mérőhelyeket blokkolhatjuk 1% (w/v) BSA-val PBS-ben, 200 μΙ/mérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket azonnal felhasználjuk, vagy lefagyasztjuk -2Ö*€-on későbbi alkalmazásra. Egérszérum hígításokat inkubálunk az IL- 12-vel bevont lemezeken 50 pl/mérőhely mennyiségben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezeket mossuk, és azután, próbázzuk 50 μΙ/méröhely HRP-vel jelölt, Fc-speciHkus kecske anti-humán-ígG-vel, L3Öööö~sz.eres hígításban 1% BSA-PBSben, 1 órán keresztül szobahőmérsékleten A lemezeket megint moshatjuk, és 100 p.lAnérőhely citrát-foszfát szubsztrát-oldatot (0,1 M cítromsav és 0,2 M nátrium-foszfát 0,0.1% HAL és 1 mg/ml OPD) adunk hozzájuk 15 percre szobahőmérsékleten. Azután leállító oldatot (4 N kénsav) adunk a mérőhelyekre 25 μΐ/tnérőhely mennyiségben, és leolvassuk az ÖD~t490 nm-en automatikus spektrofotométer alkalmazásával.
Teljesen humán Immuugtobulinöh detektálása hibridóma felölőszókfean Teljesen humán immungiobulmokat szekretáló, pozitív növekedésű hibridómákat megfelelő E1A alkalmazásával detektálhatunk. Röviden, 96-mérőhelyes ’pop-out5 mikrotiterlemezeket (VWR, 610744) 10 gg/ml kecske antí-hurnán-IgG-Fc-vel vonhatunk be nátrium-karbonát pufiferben éjszakán kérésziül 4'-!C-on. A lemezeket mossuk és blokkoljuk 1% BSA-PBS-sel 1 órán keresztül 37;'C-on, és azonnal felhasználjuk vagy -20 °C~on lefagyasztjuk, A higitatlan híbrldőma felüiúszókaf inkubáljuk a lemezen, 1 órán keresztül 37 °C-on. A lemezeket mossuk, és próbázzuk. HRP-vel jelölt kecske anii-humán-kappával, L LööOö-szeresre hígítva 1% BSA-PBS-ben, 1 órán keresztül 37 e€~on. A lemezeket azután szubsztrát oldattal inkubáljuk, amint fent leírtuk.
sasa
A híhridómákat - mint fent - egyidejűleg vizsgálhatjuk IL-12 ellem reaktivitásra ís megfelelő RXA vagy egyéb vizsgálati eljárás alkalmazásával Például felülúszókat infcubálwnk kecske anti-humán-IgG-Fc lemezeken mini fent, mossuk azokat, és próbázzuk mérőhelyenként megfelelő beütésszámú radíoaktlvan jelelt IL-12-vel 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. Á mérőhelyeket kétszer mossuk PBS-sel, és a kötődött tadioakfivan jelölt IL12 mennyiségét meghatározzuk megfelelő számláló alkalmazásával.
Anti-IL-12 humán IgGl-et szekretáló hibridómákat sejttenyészetben feíszaporíthatunk, és sorozatosan szüLkkinozhatunk korlátozó híghássai. A kapott klonális populációkat felszaporithatjuk és fagyasztva tartósíthatjuk fagyasztó tápközegben (95% FBS, 5% DMSO), és folyékony nitrogénben tárolhatjuk.
Az. ellenanyagok izotipusának meghatározását El A alkalmazásával hajthatjuk végre, az egérszérumok specifikus títereinek szkrínelésérs alkalmazotthoz hasonló formátumban. 9615 mérőhelyes mikrotiterlemezeket IL-12-vel vonhatunk be, amint fent leírtuk, és 2 pg/ml koncentrációjú tisztított ellenanyagot inkuhálhatunk a lemezen 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. A lemezt mossuk, és proházznk HRP-vel jelölt kecske anti-humán-ígGr-gyet vagy HRP-vei jelölt kecske antí-humán-IgGj-mal 1 órán keresztül szobahőmérsékleten LdŐöO-szeresre hígítva 1% BSA-PBS-ben. A lemezt ismét mossuk, és sznbszírát oldattal.
inknbáijuk, amint fent leírtuk.
Barnán anís-h«i»án-IL-12 ellenanyag kötési kinetikája humán ÍL-12-hnz Ellenanyagok kötési jellegzetességeit alkalmasan megállapíthatjuk például IL-12befogást EIA-val és BlAcore technológiával. Tisztított humán lL-12-eílenanyagok mért koncentrációit értékelhetjük 2 pg/ml IL- 12-vel bevont EIA-lemezekhez való kötődés tekintetében, a fent leírt vizsgálati eljárásokban. Az OB-kat azután szemí-iogaritrníkus grafikonokon ábrázolhatjuk, mutatva a relatív kötési hatékonyságokat.
Kvantitatív kötési állandókat nyerhetünk például az alábbiak szerint, vagy bármilyen megfelelő ismert eljárás alkalmazásával. Egy BZrieon? C&/-5 (karboximei.il) chípet helyezünk f&to-e 2<W készülékbe. HBS pufiért (9,91 M HEPES, 9,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v P29 felületaktív anyag, pH 7,4) áramoltatunk át a chíp átfolyó küvettáján, 5 él/perc sebességgel, amíg stabil alapvonalat nem kapunk. 15 mg EDC [N-etil-NMS-dimetíIaminopropilj-karbodiímid hidrokiorid] 200 pl vízben készített oldatát (109 μΙ-t) hozzáadjuk 2,3 mg NHS (N-hidroxiszukcmimid) 209 pl vízben készített oldatához (190 pl-hez). A kapott oldat 49 μί-ét injektáljuk a chipre. Humán IL-12 oldatának (15 pg/ml 10 mM nátrium- 71 acélaiban, pH 4,8) 6 μΐ-ét injektáljuk a ehipre, körülbelül 500 RU növekedést eredményezve. A pufiért lecseréljük TBS/Ca/Mg/BSÁ futtató pufere (20 mM Tris, 0.15 M nátrium-klorid, 2 mM kalcium-kloríd, 2 mM magnézium-acetít, 0,5% Triton X-1Ö0, 25 gg/ml BSA, pH 7,4), és áíáraraoltatjufc a chipen éjszakán keresztül, hogy ekvilibráljuk azt, és hidrolizáljunk vagy blokkoljunk minden el nem reagált xznfceinimid-észtert.
Ellenanyagot oldunk fel a futtató pofeben 33,33, 16,67, 8,33 és 4,17 nM koncentrációban. Az áramlási sebességet 30 uV'perere állítjuk be, és a készülék hőmérsékletét 25°C-ra, Két átfolyó küvettát alkalmazunk a kinetikus mérésekhez, az egyikhez 1L-I2~t immohílizáltunk (minta), és egy második, nem reagáltatott átfolyó küvettát (vak). Mindegyik ellenanyag-koncentrációból 120 pírt injektálunk az átfolyó küvettábs 30 pl/perc sebességgel (asszociációs fázis), majd megszakítás nélkül 360 másodpercen keresztül pufiért áramoltatunk (disszociációs fázis). A chíp felszínét regeneráljuk (az. inleríeukin~l2/el!enanyag komplex dísszodálódik) 30 pl 2 M guanidin-íiodanát két egymást követó injekciójával.
Az adatok elemzését a 21X4 evufertoo 3.Ö vagy' fX4MP 2 alkalmazásával végezzük, amint az ismert a szakterületen. Mindegyik ellenanyag-koncentrációra a vak szenzogramjáf kivonjuk a minta szenzogramjábol. Globális illesztést végzünk mind a disszociációra (ka, sec' !), mind az. asszociációra (L, molSec'1}, és kiszámítjuk (kd/ka) a disszociációs állandót (KB, mól). Ha az ellenanyag affinitása olyan magas, hogy a befogod ellenanyag RU-értéke >100, az ellenanyag további hígításait is megfuttatjuk.
Eredmények és diszkusszió
Áoti-humá»-iL-12 munoklunális ellenanyagok létrehozása
Számos fúziót végzünk, és minden egyes fúziót 15 mikrotíterlemezre oltunk le (1440 rnéröhely/fuzió), ami több tucat humán lL-12-re specifikus ellenanyagot eredményez. Ezek közül néhányról azt találjuk, hogy humán és egér fg-láncok kombinációját tartalmazza, A fennmaradó hibrídómák kizárólag humán nehéz- és könnyüláncokaf tartalmazó anfi-IL~12 ellenanyagokat szekretáinak. A humán hibridómáktól azt várjuk, hogy mindegyik IgGl legyen.
Humán asH-feuntán-í.L-12 ellenanyagok kötési kinetikája
JELJSA elemzés megerősíti, hogy ezeknek a hihtídómáknak a legtöbbjéből fisztitott ellenanyag koncenfráció-tuggő módon kötődik 1L-12-höz. Az 1.-2. ábrán ezeknek az ellenanyagoknak a reiativ kötési hatékonyságát mutatjuk be. Ebben az esetben az ellenanyagnak a hozzátartozó antigénjéhez (epitópjához) való avidifását mérjük. Meg kell jegyeznünk, hogy az fL-12 közvetlen kötődése az El A mikrotiferlemezhez a fehérje denaturációját okozhatja, és a látszólagos kötési affinitások nem tükrözhetik a denaíurálatlan fehérjéhez való kötődést Ötvenszázalékos kötődést találtunk a koncentrációk egy tartományában.
Kvantitatív kötési állandókat nyerünk a humán ellenanyagok BÍAcore elemzésének alkalmazásával, és kiderül, hogy több humán monoklonális ellenanyag nagyon magas affinitása, lx 10s és 7x 1 ö'u közötti K»-veí.
Több fúziót végzünk humán variábilis és állandó régiós ellenanyag transzgéneket tartalmazó, humán ÍL-I2-vel immunizált hibrid egerekből származó lépsejtek alkalmazásával Számos, IL-12-re reagáló, teljesen humán, IgGl Izotípusba tartozó ÍgG monoklonális ellenanyagot hozunk létre. A teljesen humán anti-IL-12 ellenanyagokat tovább jellemezzük. A keletkezett ellenanyagok közül többnek Ixlö9 és S'xíO2 között van az affinitást állandója. Ezeknek az teljesen humán monoklonális ellenanyagoknak a váratlanul magas affinitása alkalmassá teszi azokat terápiás alkalmazásokra IL-12~függö betegségek, patológiák vagy kapcsolódó állapotokban .
3x példa: A C34Ö egy semlegesítő humán mouöktonálís ellenanvm
Kimutattuk, hogy az IL-12 hioaktivltását semlegesíti a C34Ö különféle IL-I2~tuggő aktivitási vizsgálati eljárásokban. Mivel az IL-12 fokozza az NK-sejtek és T-llmfocíták IFNγ-termelését, megvizsgáltuk a C34Ö ellenanyag hatását az IEN-γ mRNS szabályozására és az íFN-γ fehérje termelésére [Trinekteri, G., Current öpinion in ímmuhoiogy 9, 17-23. old. (1997), Morris, S, C, és mtsai., Journal of immunoiogy 152, 1047-1056. old. (1994)]. Szintén vizsgáltuk ezekben a vizsgálatokban a C34Ö képességét, a límfokin-aktlvált ölősejtek (LAK) aktivitásának íL~12-irányltotí indukál ására [Kutza, I és Murasko, D. M., Mechanisras of Ageing and Deveiopmeut' 90, 209-222. old, (1996), Stem, A. S. és mtsai., Proceedings of íhe
National Academy of Sciences of íhe U.S.A, 87, 6808-6812. old. (1990)]. Végezetül, teszteltük a €340 hatását CD95 sejtelszíní expressziójának iL-12-közvetített serkentésére T~ és NK~sejíeken [Medvedev, A E. és mtsai., Cytoktne 9,394-404. old. (1997)].
Az IFM-γ mRNS transzkripciójának gátlása
Annak meghatározására, hogy a C340 gátolja-e az IL-12-, !L~2-indukált ΙΤΝ-γ géníranszktipcíóí humán PBL-ben, reverz-transzkripeiós PCR-t hajtottunk végre, β-aktinra (kontroll az mRNS integritására és mennyiségére) és ΪΡΝ-γ-ra specifikus iáncíndítókat alkalmaztunk a stimulált PBL-hoi származó cDNS amplifikálására. A 3. ábrán azt mutatjuk be, hogy a 340 gátolja az ÍFN-y mRNS-ί IL-12/11-2-vei aktivált (2 órán keresztül) PBMCben.
Φ « φ
< φφ
-74 íntracelluláris IFN-y gátlása áramlási cítometriával mérve
Különféle jelekre adott válaszként és az aktiválás mérésére 'T-sejteket és NK~sejtéket indukálhatunk citokínek szekretálására. Közelebbről It-2-vel és ÍL-12-vet kezelt PBL IFN-y tekintélyes mértékű szintézisét indája meg 48 órán belül a stimnlálást követően.. .Ezt a termelést detektálhatjuk iré%ré/í//«~,4~val kezelt PBL cltopiazmájáhan áramlási átometriával, A 4. ábrán azt mutatjuk be, hogy az ilyen tenyészetekben 60%-kal csökkent az IFN-ytennelés, amikor C340 IL-12 ellenanyagot adtunk IL-12-vel együtt 5 órán keresztül.
Az lL~12~vei indukált IFN-y-szekrécíó gátlása
Az 5. ábrán világosan láthatjuk, hogy a C340 két különböző ’lot’-ja dózisfüggö módon ló gátolta az IFN-y szekrécióját períteriás limfocitákban. 400 pg IL-12-t előzetesen összekevertünk különböző mennyiségű C34G~nel, és azután hozzáadtuk ΪΕ-2-vel stimulált PBL-tenyészetekhez. Amikor mértük 18-24 órás inkubálás után EIA-val az IFN-y-t, kifejezetten csökkent mennyiségű IFN-y-t detektáltunk, még akár csak 1 ug/nti (1340 ellenanyaggal ís.
Az IL- 12 gátié sa LÁK-sejtes cíf of oxicítást indukált
A Raji sejtek - amely egy IL-12-re érzékeny. Burkitt-hmlöma eredtö sejtvonal - egy NK~sejtekre rezísztens, LAK-sejtekre érzékeny sejtvonal Raji sejteket - három párhuzamosban - tenyésztettünk 4 órán keresztül LAK-sejtekkel, amelyeket előzőleg aktiváltunk 40Ö pgúnl 1L- 12-vel és 10 U/mL IL-2-veí C34Ő humán monoklonális ellenanyag jelenlétében (5OO0 ng/ml vagy 50 ng/ml) vagy amikul. A 6. ábrán három normális, egészséges donor eredményeit, mutatjuk he. Az ellektor sejtek IL-12 +· IL-2 aktiválása megnövekedett citotoxikus aktivitást eredményezett az egyedül csak IL-2-vel aktíváit sejtekhez viszonyítva, A C34Ö ellenanyag gátolta ezt az íL-12-íuggö hatást. A gátlás nagyságrendjét összefüggésbe hoztuk az ellenanyag koncentrációjával, és a legmagasabb tesztelt koncentráció a citotoxichást a háttér szintjére csökkentette.
CD9S serkentésének gátlása
Beszámoltak a CD95 IL-12-indukálí serkentéséről nagyon tiszta CD56+ PBL felszínén. .Amint a 7Á. és 7B. ábrákon láthatjuk, az eloszlási áramlási cítometriás elemzés feltárta, hogy a €D95 expresszié szignifikánsan serkentett CD3+ T-sejteken és CD56F NK30 sejteken, 72 órás kezelés után IL-12-veI plusz lL-2-vel. Egyidejű IL-12-kezelés gátolta a CD95 expressziót mind ÜD3+, mind CD654- populációkban, A CD3+ sejtek 50%-kal gátoltak (7A, ábra), míg a CD56+ sejtek 85%-kai voltak gátoltak (7B. ábra), amit a lecsökkent MPI index is bizonyít (százalékkal nagyobb, mint a síimulálaf lan kontroll).
-7510
A C340 nehézlánc génjét vagy a C340 könnyülánc génjét tartalmazó geaomiáíis DNSfragmenseket klónoztunk és tisztítottunk. C34Ö híbrldóma sejtekből tisztított genontiális DNS-t részlegesen emésztettünk Sau3Á restrikciós enzimmel, és méret szerint elválasztottuk centrifugális frakeionálással 10-40% szukróz-gradlensen. 1.5-23 kb mérető DNS-fragmenseket klónozítmk az EMBL3 bakteriofág vektorba, és fágrészecskékbe. pakoltuk. Több pakolást reakció 1 millió bakteriofág klánt tartalmazó könyvtárat eredményezett. A könyvtár megközelítőleg 60Ö0Ő0 kiónját szkríneltük tarfolt-bíbridizációval, S2P~veI jelzett genomíábs DNS-fragmensek alkalmazásával, amelyek vagy humán IgGl nehézláne állandó régió szekvenciákat, vagy humán kappa könnyülánc állandó régió szekvenciákat tartalmaztak próbaként. 13 nehézláne és 9 könnyülánc kiónt detektáltunk. Ezek közöl 3 nehézláne és 4 könnyülánc kiónt megtisztítottunk két további szkrlnelési menettel. A nehézláne kiónok egyikéről és kettőről a könnyülánc klónak közöl kimutattuk a bakteriofág DNS PCRelemzésével, hogy tartalmazzák a kódoló szekvencia 5’ és 3y végét. A 114 nehézláne (HC> klón DNS-inzertje 16 kb mérető volt, és egy 3,6 kb mérető 5’ szegélyező és legalább 2 kb méretű 3’ szegélyező szekvenciát tartalmaz. Az LC1 nehézláne (LC) klón DNS-inzertje 15 kb méretű volt, és egy 4,4 kb mérető 5’ szegélyező és ö,0 kb mérető .3’ szegélyező szekvenciát tartalmaz. Az egész inzerteket eltávoütöttük a bakteriofág vektorokból Sáli fiagtnenskéní, és a pl351 expressziős vektor Xhol és Sáli helyei közé klónoztuk, ami biztosítja a gp? szelektálható markergént. Mivel volt egy* belső Sáli hely a nehézláne variábilis régió kódoló szekvenciájában, két Sáli fragmenst kellett átvinni a H4 bakteriofág vektorból a pl 351 expressziős vektorba. A kapott nehézláne és könnyülánc expressziős plazmidokat sorrendben pl5őö-nak és pl558-nak neveztük. A nehézláne és könnyülánc gének pí351 vektorszekvenciákhoz viszonyított irányítottságát a két plazmádban sorrendben restrikciós enzimes elemzés és PCR alkalmazásával határoztuk meg. Mindkét esetben olyan volt az irányítottság, hogy az Ab génfragmens 5 ’ vege a g/rt gén 3’ vége mellett volt. A klónozott .gének kódoló régióinak mindkét szálát megszekvenáltuk. A pl560 és pl558 plazmldok szekvenciáit sorrendben a 1IÁ-1 IK. ábrákon és 13A-13J. ábrákon mutatjuk be.
5. példa: Rekombináns sejtvonal előállítása
A p!56Ö nehézláne plazmidot Pvul restrikciós enzimes emésztéssel línearizáltuk, és a pl 558 könnyülánc plazmidot Sáli restrikciós enzim alkalmazásával hnearízáliuk, p3Xö3Ag8.653 (65.3) és SP2/G~Agl4 (SP2/0) sejteket külön-külön transzfektáltuk az előzetesen összekevert linearizált plazmidokkal elektroporáciőval, a sejteket tenyésztettük, és
7őtranszfoktánsokat szelektáltunk ki mikofcnolsav alkalmazásával, amist azt leírták [Knight és mtsai,, Molecular Immunology 30, 1443-1453. old. (1993)]. A mikofenólsavra rezisztens sejtfélüiúszó kolóniákat megközelítőleg két héttel később lemértük humán IgG-re [azazrekombináns C340-nel (rC340)]. Ebből a célból sejtfelülúszókat 96-mérohelyes ELISÁ mikrotíterlemezeken, amelyeket humán IgG Fc-részletére specifikus kecske ellenanyagokkal voltak bevonva, A bevont lemezekhez kötődő humán IgG-t alkallkus foszfatázzal konjugált kecske anti-humán-IgG (nehézlánc τ könnyűlánc) ellenanyag és alkalikus foszfatáz, szubsztrát alkalmazásával detektáltuk, amint leírták [Kn.ig.ht és mtsai., Molecular Immunology 30, 14431453. old. (1993)]. A jobban termelő kiónok sejtjeit átvittük 24 -mérőhelyes tenyésztő tálcákra standard tápkőzegben, és felszapor.itott.uk azokat (IMDM, 5% FBS, 2 mM. glutamut, mikofenolsav szelekciós keverék). A termelt (azaz a kimerült tenyészetek tápközegébe szekretált) ellenanyag mennyiségét körültekintően meghatároztuk ELISA-val, amelyben tisztított €340 ntonoklonális ellenanyagot alkalmaztunk standardként. Azután kiválasztott kiónokat leiszaporítottunk T75-edényekben, és ezen klánok humán IgG termelését EIJSA-val meghatároztuk. Ezen értékek alapján hat független 653~as transzfekránst és három független 8P2/Ö transzlektánst szubklőnoztunk (átlagosan mérőhelyenként egy sejtet leoltva 96mérőheíves lemezeken), és meghatároztuk a szubklónok által termelt ellenanyag mennyiségét az egyedi szubklón kolóniákból származó felűlúszők (ELISA) mérésével. Három szubklónt, a 653-as transzfektáns 19-2Ö~at (C379B) és az. SP2/0 transzfektáns 84-8.1-et (€381 A) és 22-5620 ót (€3 89A) választottunk ki további elemzésre. r€340 antigén-kötésének vizsgálata
A fent kiválasztott sejtvonal szubklónozásáí megelőzően a három szülői vonaltól (a 653-aminosav transzfektáns 2-es és 18-as klón és az, SP2/Ö transzfektáns í-es klón) származó feíülúszokal alkalmaztunk az r€340 antigén-kötési tulajdcmságainak meghatározására. Az 25 r€340 koncentrációját a három sejtfelülószó mintáiban először ELÍSA-val határoztuk meg.
Azután a felülő szó-minták vagy tisztított €340 pozití v kontroll títráiási menny iségeit .inkuháltuk 2 pg/ml humán 11» 12-vel bevont 96-mérőhelyes míkroliteriemezeken. A kötött monoklonálís ellenanyagot azután alkallkus foszfatázzal konjugált kecske anti-humán-IgG (nehéziánc e kőnnyűiáne) ellenanyaggal és a megfelelő alkallkus foszfatáz szubsztráttal detektáltuk. Amint a 8. ábrán bemutatjuk, az r€34Ö specifikusan kötődött a humán IL~12~hőz.
megkülönböztethetetlen módon az eredeti €340 mortoklonális ellenanyagtól.
A kiválasztott sejtvonalak jellemzése
Növekedési görbe elemzést végeztünk a C379B, C381A és €389A sejtvonalakon T75edények beoltásával 2 X HL sejí/ml kezdeti söröség mellett standard tápközegben vagy SFM77 szérummeníes tápközeghen, és azután naponta követtük a sejtek számát és az r€34ö koncentrációját, mindaddig, amíg a tenyészetek kimerültek. A standard tápközegben lévő tenyészetek eredményeit a 9A-9C. ábrákon mutatjuk be. Á. €37913, C381A és C389A maximális €340 monoklonáíis ellenanyag termelés szintje sorrendben 135 pg/ml, 150 pg/ml és 110 pg/ml volt. A próbálkozások a C379B sejtek adaptálására SFM-5 tápközeghez nem voltak sikeresek. A C381A sejtek ugyanolyan mennyisége r€340-et termeltek. SFM-5 tápközegben, mint standard tápközegben, míg a €389A sejtek csak feleannyi r€34ö-et termeltek SFM-5 tápközegben, mint standard tápközegben.
Áz. rC34ö monoklonáíis ellenanyag termelésének időbeli stabilitását a három sznbklón lő esetében a sejteknek 24-méróhelyes lemezeken különböző időn keresztül történő tenyésztésével állapitottuk meg standard tápközeggel vagy mikofenolsavas szelekció nélküli standard tápközeggel. Azt figyeltük meg, hogy a C379B és €381A sejt vonalakat stabilan termelik az r€340-et szelekció jelenlétében vagy hiányában sorrendben 30 napon és 75 napon keresztül (ez volt a maximális tesztelt idő). A C389A sejtvonal instabil volt, és 43 napnyi tenyésztés elteltével csak 20%-át termelte, mint a vizsgálat kezdetekor.
Nyilvánvaló, hogy a találmányt másképpen is gyakorlatba lehet venni, mint ahogyan azt részletesen feltártuk a fenti leírásban és példákban,
A találmány számos módosítása és variációja lehetséges a fenti kítanítás fényében, és ezek a csatolt igénypontok oltalmi körébe esnek.

Claims (9)

  1. L Izolált nukleinsav, amely SEQ, ID. NO,: 7 szerinti nehéziáne variábilis régióval és
    SEQ. ID, NO.: 8 szerinti könnyülánc variábilis régióval rendelkező emlős anti-IL-12 ellenanyagot kódol,
  2. 2. Prokarióta vagy eukarióta gazdasejt amely 1, igénypont szerinti izolált nukleinsavaí tartalmaz.
  3. 3. Emlős anti-It-12 ellenanyag. amely SEQ. ID, NO.: 7 szerinti nehéziáne variábilis régiét és SEQ, HX NO.: 8 szerinti bőnnyöláne variábilis régiót tartalmaz,
  4. 4. .Az L igénypont szerinti nukleinsav, a 2, igénypont szerinti gazdasejt vagy a 3. igénypont szerinti ellenanyag, ahol az ellenanyag humán,
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav, a 2. igénypont szerinti gazda-sejt vagy a X vagy 4, igénypont szerinti ellenanyag, áltól az ellenanyag affinitás! állandója 1x10'' és 7xKfs közötti,
    ő.
  6. Készítmény, amely (a) 3-5, igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagot és (b) győgyászatilag elfogadható hordozót vagy oldószeri, tartalmaz.
  7. 7. A 3-5, igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag vagy a 6. igénypont szerinti készítmény, diagnózisban vagy terápiában történő alkalmazásra.
  8. 8. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag vagy a 6. igénypont szerinti készítmény, pikkelysömör kezelésében történő- alkalmazásra,
  9. 9. A 3-5, igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag vagy a ó. igénypont szerinti készítmény, sömörös artrítisz, szarkoidőzis vagy Crohn-betegség kezelésében történő alkalmazásra.
HU0302378A 2000-08-07 2001-08-07 Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses HU228009B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22335800P 2000-08-07 2000-08-07
US23682700P 2000-09-29 2000-09-29
US09/920,262 US6902734B2 (en) 2000-08-07 2001-08-01 Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
PCT/US2001/024720 WO2002012500A2 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0302378A2 HUP0302378A2 (hu) 2003-10-28
HU228009B1 true HU228009B1 (en) 2012-08-28

Family

ID=27397221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0302378A HU228009B1 (en) 2000-08-07 2001-08-07 Anti-il-12 antibodies, compositions, methods and uses

Country Status (33)

Country Link
US (15) US6902734B2 (hu)
EP (5) EP2090657B1 (hu)
JP (4) JP4731094B2 (hu)
KR (1) KR100823576B1 (hu)
CN (2) CN101550190B (hu)
AR (1) AR030134A1 (hu)
AT (1) ATE431412T1 (hu)
AU (2) AU8113701A (hu)
BR (1) BRPI0113109B8 (hu)
CA (1) CA2418961C (hu)
CL (1) CL2009000575A1 (hu)
CY (7) CY1109149T1 (hu)
DE (2) DE60138711D1 (hu)
DK (4) DK2090657T3 (hu)
EA (1) EA006673B1 (hu)
ES (4) ES2647220T3 (hu)
FR (1) FR09C0021I2 (hu)
HK (1) HK1135991A1 (hu)
HR (1) HRP20030087B1 (hu)
HU (1) HU228009B1 (hu)
IL (1) IL154325A (hu)
LT (6) LT2090657T (hu)
LU (3) LU91584I2 (hu)
ME (1) ME00326B (hu)
MX (1) MXPA03001229A (hu)
MY (1) MY133377A (hu)
NL (1) NL300390I2 (hu)
NO (3) NO330903B1 (hu)
NZ (2) NZ524145A (hu)
PT (4) PT2090657T (hu)
RS (1) RS50477B (hu)
SI (4) SI2305817T1 (hu)
WO (1) WO2002012500A2 (hu)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US6706264B1 (en) * 1994-03-14 2004-03-16 Genetics Institute, Llc Use of IL-12 antagonists in the treatment of conditions promoted by an increase in levels of IFN-y
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US7883704B2 (en) 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
US6902734B2 (en) * 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US20050249735A1 (en) * 2000-08-07 2005-11-10 Centocor, Inc. Methods of treating ankylosing spondylitis using anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
AU2003220557A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-13 Centocor, Inc. Multiple sclerosis-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
AU2003218432A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-13 Centocor, Inc. Diabetes-related immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US20040033228A1 (en) 2002-08-16 2004-02-19 Hans-Juergen Krause Formulation of human antibodies for treating TNF-alpha associated disorders
US7273889B2 (en) * 2002-09-25 2007-09-25 Innovative Drug Delivery Systems, Inc. NMDA receptor antagonist formulation with reduced neurotoxicity
CN101824088B (zh) * 2002-10-30 2012-05-30 健泰科生物技术公司 Il-17产生的抑制
US20070178082A1 (en) * 2002-11-08 2007-08-02 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) * 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US20100003253A1 (en) * 2002-11-08 2010-01-07 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
EP2258392A1 (en) * 2002-11-08 2010-12-08 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides
TWI395756B (zh) * 2003-07-18 2013-05-11 Amgen Inc 對肝細胞生長因子具專一性之結合劑
GB0329146D0 (en) * 2003-12-16 2004-01-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
NZ548897A (en) * 2004-02-17 2009-07-31 Schering Corp Methods of modulating IL-23 activity; related reagents
AR051805A1 (es) 2004-12-21 2007-02-07 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-12, epitopos, composiciones, metodos y usos
US7736650B2 (en) * 2004-12-21 2010-06-15 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibody based vectors, host cells, and methods of production and uses
US7785595B2 (en) 2005-04-18 2010-08-31 Yeda Research And Development Company Limited Stabilized anti-hepatitis B (HBV) antibody formulations
CN103145838A (zh) * 2005-06-30 2013-06-12 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
JP2007172129A (ja) * 2005-12-20 2007-07-05 Sony Corp 不揮発性メモリアクセス制御装置および不揮発性メモリ制御システム
WO2007137328A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Apollo Life Sciences Limited An isolated il-12 molecule or chimeric molecules thereof
WO2008070647A1 (en) * 2006-12-07 2008-06-12 Wyeth Methods and compositions for assessing il-12 or the neutralization of il-12 in a sample
KR20090100461A (ko) 2007-01-16 2009-09-23 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
CA2681752A1 (en) * 2007-03-29 2008-10-09 Abbott Laboratories Crystalline anti-human 1l-12 antibodies
US20090181027A1 (en) * 2007-09-28 2009-07-16 Paul Dal Monte Anti-IL-12/23p40 Antibodies, Epitopes, Formulations, Compositions, Methods and Uses
MX2010005783A (es) 2007-11-27 2010-08-10 Ablynx Nv Secuencias de aminoacidos dirigidas contra citoquinas heterodimericas y/o sus receptores y polipeptidos que comprenden las mismas.
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
SG188909A1 (en) 2008-03-18 2013-04-30 Abbott Lab Methods for treating psoriasis
NZ600584A (en) * 2008-05-05 2014-05-30 Novimmune Sa Anti-il 17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
JP5856845B2 (ja) 2008-10-20 2016-02-10 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗体精製中におけるウイルスの不活性化
BRPI0919547A2 (pt) * 2008-10-20 2015-12-08 Abbott Lab anticorpos que se ligam a il-12 e métodos de purificação do mesmo
KR20110096553A (ko) * 2008-11-28 2011-08-30 아보트 러보러터리즈 안정한 항체 조성물 및 이의 안정화 방법
MX2011011729A (es) 2009-05-05 2012-04-10 Novimmune Sa Anticuerpo anti il-17f y metodos de uso de los mismos.
KR20120112384A (ko) * 2009-09-14 2012-10-11 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 건선을 치료하는 방법
EP2552967A4 (en) 2010-04-02 2014-10-08 Amunix Operating Inc BINDING FUSION PROTEINS, BINDING FUSION PROTEIN MEDICINAL CONJUGATES, XTEN MEDICAMENT CONJUGATES, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
TW201309330A (zh) * 2011-01-28 2013-03-01 Abbott Lab 包含糖基化抗體之組合物及其用途
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP4015005A1 (en) 2011-10-03 2022-06-22 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
SG11201402666WA (en) 2011-12-16 2014-10-30 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2791172B1 (en) 2011-12-16 2017-07-19 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243955B2 (en) 2012-04-02 2018-02-22 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CA2872908C (en) * 2012-05-10 2023-11-14 Gerhard Frey Multi-specific monoclonal antibodies
ES2729603T3 (es) 2012-06-27 2019-11-05 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos IL-23 antihumanos cristalinos
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US9603775B2 (en) 2013-04-24 2017-03-28 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
CN105980401A (zh) 2013-10-03 2016-09-28 现代治疗公司 编码低密度脂蛋白受体的多核苷酸
WO2016036918A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compound targeting il-23a and tnf-alpha and uses thereof
WO2016172359A2 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
CN115636880A (zh) * 2015-10-23 2023-01-24 辉瑞有限公司 抗il-2抗体及其组合物和用途
CN109071653A (zh) * 2016-03-29 2018-12-21 詹森生物科技公司 用增加的抗-il12和/或-23抗体给药间隔治疗牛皮癣
WO2018024770A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Formycon Ag Production of biosimilar ustekinumab in cho cells
JP2020502261A (ja) * 2016-11-16 2020-01-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ２３特異的抗体で乾癬を治療する方法
WO2018106931A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018112232A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor released using an ingestible device
EP3573658A4 (en) 2017-01-30 2021-07-21 Janssen Biotech, Inc. ANTI-TNF ANTIBODIES, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR TREATMENT OF ACTIVE PSORIATIC ARTHRITIS
KR20190115042A (ko) 2017-02-07 2019-10-10 얀센 바이오테크 인코포레이티드 활성 강직성 척추염의 치료를 위한 항-tnf 항체, 조성물, 및 방법
EP3635093A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Polpharma Biologics S.A. Improved methods of cell culture
TW201922780A (zh) * 2017-09-25 2019-06-16 美商健生生物科技公司 以抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗體治療狼瘡之安全且有效之方法
WO2019106206A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fyb 202 Project Gmbh Stable, low viscosity, high concentration liquid formulations of an anti-il-12/23p40 antibody
EP3793521A4 (en) 2018-05-18 2022-02-23 Janssen Biotech, Inc. SAFE AND EFFECTIVE METHOD OF TREATING LUPUS WITH AN ANTI-IL12/IL23 ANTIBODY
TR201808283A2 (tr) * 2018-06-11 2018-07-23 Centurion Ilac San Ve Tic A S Sulu farmasöti̇k etenersept bi̇leşi̇mi̇
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
WO2019246271A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor
US20200061015A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Janssen Biotech, Inc. Lipase Degradation Resistant Surfactants for Use in Large Molecule Therapeutic Formulations
LT3883606T (lt) 2018-09-24 2023-09-11 Janssen Biotech, Inc. Saugus ir veiksmingas opinio kolito gydymo būdas anti-il12/il23 antikūnu
CN116726361A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
BR112021009287A2 (pt) 2018-11-20 2021-10-26 Janssen Biotech, Inc. Método seguro e eficaz para tratar psoríase com anticorpo específico anti-il-23
AU2020208828A1 (en) 2019-01-15 2021-08-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibody compositions and methods for the treatment of juvenile idiopathic arthritis
EP3914618A1 (en) 2019-01-23 2021-12-01 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions for use in methods for the treatment of psoriatic arthritis
MA55283A (fr) 2019-03-14 2022-01-19 Janssen Biotech Inc Procédés de production de compositions d'anticorps anti-tnf
EP3938390A1 (en) 2019-03-14 2022-01-19 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
CN113840837A (zh) 2019-03-14 2021-12-24 詹森生物科技公司 用于产生抗tnf抗体组合物的方法
JP2022526493A (ja) * 2019-03-18 2022-05-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｉｌ１２／ｉｌ２３抗体を用いた小児被験者の乾癬の治療方法
EP3972690A4 (en) 2019-05-23 2023-07-05 Janssen Biotech, Inc. METHOD OF TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE USING COMBINATION THERAPY OF ANTIBODIES TO IL-23 AND TNF-ALPHA
EP3976648A1 (en) 2019-06-03 2022-04-06 Janssen Biotech, Inc. Anti-tnf antibody compositions, and methods for the treatment of psoriatic arthritis
MX2021014882A (es) 2019-06-03 2022-03-25 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-tnf, composiciones y métodos para el tratamiento de la espondilitis anquilosante activa.
CN112079922B (zh) * 2019-07-30 2022-08-12 中山康方生物医药有限公司 抗人p40蛋白域抗体及其用途
WO2021028752A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tfn antibodies for treating type i diabetes
EP3870261B1 (en) 2019-12-13 2024-01-31 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
CN115135671A (zh) 2019-12-20 2022-09-30 新石生物制药有限公司 抗白介素-23 p19的抗体及其使用方法
AU2021315081A1 (en) * 2020-07-30 2023-03-30 Janssen Biotech, Inc. Method of treating psoriasis in pediatric subjects with anti-IL12/IL23 antibody
US20230040065A1 (en) 2021-07-09 2023-02-09 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing Methods for Producing Anti-TNF Antibody Compositions
WO2023281463A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Janssen Biotech, Inc. Manufacturing methods for producing anti-tnf antibody compositions
US20240117030A1 (en) 2022-03-03 2024-04-11 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
US20240059799A1 (en) 2022-05-11 2024-02-22 Pfizer Inc. Anti-tl1a antibodies and methods of use thereof

Family Cites Families (179)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US122464A (en) 1872-01-02 Improvement in cheese-hoops
US941234A (en) 1909-02-25 1909-11-23 Frank De Clercq Syrup-percolator.
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
FR2374910A1 (fr) 1976-10-23 1978-07-21 Choay Sa Preparation a base d'heparine, comprenant des liposomes, procede pour l'obtenir et medicaments contenant de telles preparations
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3590766T (hu) 1985-03-30 1987-04-23
SE448277B (sv) 1985-04-12 1987-02-09 Draco Ab Indikeringsanordning vid en doseringsanordning for lekemedel
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8517895D0 (en) 1985-07-16 1985-08-21 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
US4870163A (en) 1985-08-29 1989-09-26 New York Blood Center, Inc. Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5576195A (en) 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
SE453566B (sv) 1986-03-07 1988-02-15 Draco Ab Anordning vid pulverinhalatorer
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
JP2876058B2 (ja) 1986-08-18 1999-03-31 エミスフィア・テクノロジーズ・インコーポレイテッド 薬物送達システム
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
DE3631229A1 (de) 1986-09-13 1988-03-24 Basf Ag Monoklonale antikoerper gegen humanen tumornekrosefaktor (tnf) und deren verwendung
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
DE3852304T3 (de) 1987-03-02 1999-07-01 Enzon Labs Inc., Piscataway, N.J. Organismus als Träger für "Single Chain Antibody Domain (SCAD)".
EP0288088B1 (en) 1987-04-24 1994-03-09 Teijin Limited Detection of tumor necrosis factor; monoclonal antibody and kit
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US4939666A (en) 1987-09-02 1990-07-03 Genex Corporation Incremental macromolecule construction methods
ES2058199T3 (es) 1987-09-23 1994-11-01 Bristol Myers Squibb Co Heteroconjugados de anticuerpos para la eliminacion de celulas infectadas por el vih.
ATE140731T1 (de) 1988-01-11 1996-08-15 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US4987893A (en) 1988-10-12 1991-01-29 Rochal Industries, Inc. Conformable bandage and coating material
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
ATE140483T1 (de) 1988-11-10 1996-08-15 Genetics Inst Natürlicher killerzellen-stimulationsfaktor
US5811523A (en) 1988-11-10 1998-09-22 Trinchieri; Giorgio Antibodies to natural killer stimulatory factor
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
DE10399036I1 (de) 1989-08-07 2004-04-01 Peptide Technology Ltd Bindeligande für Tumornekrosisfaktor.
ES2118066T3 (es) 1989-10-05 1998-09-16 Optein Inc Sintesis y aislamiento, exentos de celulas, de nuevos genes y polipeptidos.
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
ATE369383T1 (de) 1989-12-22 2007-08-15 Hoffmann La Roche Monoklonale antikörper spezifisch für den zytotoxischen lymphozyten-reifefaktor
US5780597A (en) 1989-12-22 1998-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Monoclonal antibodies to cytotoxic lymphocyte maturation factor
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
TW212184B (hu) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
ATE160818T1 (de) 1990-06-01 1997-12-15 Chiron Corp Zusammensetzungen und verfahren zur identifizierung von molekülen mit biologischer wirksamkeit
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992005258A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 La Trobe University Gene encoding barley enzyme
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
JPH06508022A (ja) 1991-02-21 1994-09-14 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 生体分子に特異的なアプタマーおよび生産方法
US5404871A (en) 1991-03-05 1995-04-11 Aradigm Delivery of aerosol medications for inspiration
ES2199935T3 (es) 1991-03-15 2004-03-01 Amgen Inc. Pegilacion de polipeptidos.
DE69233367T2 (de) 1991-04-10 2005-05-25 The Scripps Research Institute, La Jolla Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
ATE189124T1 (de) 1991-07-02 2000-02-15 Inhale Inc Verfahren und vorrichtung zum abgeben von medikamenten in aerosolform
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5733761A (en) 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
AU4829593A (en) 1992-09-23 1994-04-12 Fisons Plc Inhalation device
WO1994008038A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
BR9307270A (pt) 1992-10-19 1999-06-01 Dura Pharma Inc Inalador de pó seco
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5849695A (en) 1993-01-13 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Parathyroid hormone analogues useful for treatment of osteoporosis and disorders of calcium meatabolism in mammals
EP0680451B1 (en) 1993-01-19 1998-11-04 Glaxo Group Limited Aerosol dispenser and method of manufacture
US5300478A (en) * 1993-01-28 1994-04-05 Zeneca Limited Substituted fused pyrazolo compounds
EP1978095A1 (en) 1993-02-12 2008-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptor proteins for controlling signal transduction and ligands binding thereto
EP0614989A1 (en) 1993-02-17 1994-09-14 MorphoSys AG A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
US5770428A (en) 1993-02-17 1998-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113101T3 (es) * 1993-04-30 1998-04-16 Tokyo Tanabe Co Metodo para purificar polipeptidos hidrofobos.
DE4315127A1 (de) 1993-05-07 1994-11-10 Behringwerke Ag Arzneimittel enthaltend die Untereinheit p40 von Interleukin-12
CA2125763C (en) * 1993-07-02 2007-08-28 Maurice Kent Gately P40 homodimer of interleukin-12
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
SE9304060D0 (sv) 1993-12-06 1993-12-06 Bioinvent Int Ab Sätt att selektera specifika bakteriofager
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
CA2183268C (en) 1994-03-07 2001-05-15 Edward D. Ball Bispecific molecules having clinical utilities
ZA95960B (en) 1994-03-14 1995-10-10 Genetics Inst Use of interleukin-12 antagonists in the treatment of autoimmune diseases
DE69522965T2 (de) 1994-04-22 2002-04-04 Corixa Corp., Seattle Verbindungen und methoden für die stimulierungen und die erhöhung von schutzimmunantworten und il-12 herstellung
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US6086875A (en) * 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5891680A (en) 1995-02-08 1999-04-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
KR100654645B1 (ko) * 1995-04-27 2007-04-04 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5853697A (en) 1995-10-25 1998-12-29 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health & Human Services Methods of treating established colitis using antibodies against IL-12
GB9526100D0 (en) 1995-12-20 1996-02-21 Intersurgical Ltd Nebulizer
ES2167987T3 (es) 1996-01-03 2002-05-16 Glaxo Group Ltd Dispositivo inhalador.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
DE19624387C2 (de) 1996-06-19 1999-08-19 Hatz Motoren Kaltstartvorrichtung
ES2169299T3 (es) 1996-09-03 2002-07-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Procedimiento para la destruccion de celulas tumorales contaminantes en transplantes de celulas madre utilizando anticuerpos especificos.
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
WO1998034635A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 The Wistar Institute Methods and compositions for the inhibition of interleukin-12 production
US5879681A (en) 1997-02-07 1999-03-09 Emisphere Technolgies Inc. Compounds and compositions for delivering active agents
US5921447A (en) 1997-02-13 1999-07-13 Glaxo Wellcome Inc. Flow-through metered aerosol dispensing apparatus and method of use thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
CN100374466C (zh) 1998-01-23 2008-03-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 人il-12抗体
ES2251248T3 (es) 1998-12-09 2006-04-16 Protein Design Labs, Inc. Uso de anticuerpos contra il-12 para tratar la psoriasis.
US6914128B1 (en) * 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
BR0009323A (pt) 1999-03-25 2002-01-08 Knoll Gmbh Anticorpos humanos que ligam a il-12 humana e métodos para a produção
WO2001019373A2 (en) 1999-09-17 2001-03-22 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
US6902734B2 (en) * 2000-08-07 2005-06-07 Centocor, Inc. Anti-IL-12 antibodies and compositions thereof
US20040014198A1 (en) 2002-05-23 2004-01-22 Craft David L. Non-revertible beta-oxidation blocked candida tropicalis
DE102007030072A1 (de) 2007-06-29 2009-01-02 BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH Elektrischen Antriebseinrichtung für ein Wasserführendes Haushaltsgerät
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP5155355B2 (ja) 2010-04-07 2013-03-06 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 無線基地局の自律的な負荷調整が可能な無線端末装置
US9619256B1 (en) 2012-06-27 2017-04-11 EMC IP Holding Company LLC Multi site and multi tenancy
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9205258B2 (en) 2013-11-04 2015-12-08 ElectroCore, LLC Nerve stimulator system
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
MEP44408A (en) 2011-02-10
RS50477B (sr) 2010-03-02
CL2009000575A1 (es) 2009-07-17
CA2418961A1 (en) 2002-02-14
US20200062841A1 (en) 2020-02-27
EP2090657A3 (en) 2011-12-28
YU9303A (sh) 2006-05-25
CY1122505T1 (el) 2020-05-29
NZ524145A (en) 2004-11-26
PL360258A1 (en) 2004-09-06
US20130064760A1 (en) 2013-03-14
DE60138711D1 (de) 2009-06-25
CY1119650T1 (el) 2018-04-04
CN101550190A (zh) 2009-10-07
ME00326B (me) 2011-05-10
US20080090290A1 (en) 2008-04-17
US8084233B2 (en) 2011-12-27
CY1109149T1 (el) 2012-01-25
EP1309692B1 (en) 2009-05-13
EP2090657A2 (en) 2009-08-19
NL300390I1 (en) 2009-07-01
AU2001281137B2 (en) 2007-03-15
CY2020003I2 (el) 2020-05-29
US10259867B2 (en) 2019-04-16
MXPA03001229A (es) 2003-10-15
LU91584I9 (hu) 2019-01-03
PT2090657T (pt) 2017-05-03
JP2015061835A (ja) 2015-04-02
NO2011023I1 (no) 2011-10-17
EP3178934B1 (en) 2019-07-24
LTPA2018007I1 (lt) 2018-04-10
IL154325A (en) 2010-12-30
CY2009007I2 (el) 2012-01-25
US9409984B2 (en) 2016-08-09
AU8113701A (en) 2002-02-18
CA2418961C (en) 2009-11-03
BRPI0113109B1 (pt) 2017-02-07
EP2305817B1 (en) 2017-09-27
BR0113109A (pt) 2004-02-03
HRP20030087A2 (en) 2005-10-31
NO330903B1 (no) 2011-08-15
LT3178934T (lt) 2019-09-25
EA200300137A1 (ru) 2003-08-28
EP2305817A2 (en) 2011-04-06
US6902734B2 (en) 2005-06-07
HRP20030087B1 (en) 2012-07-31
WO2002012500A2 (en) 2002-02-14
NL300390I2 (en) 2010-03-01
CY2009007I1 (el) 2012-01-25
ES2647220T3 (es) 2017-12-20
LT2305817T (lt) 2017-11-27
ES2624502T3 (es) 2017-07-14
US20190248884A1 (en) 2019-08-15
US20180334500A1 (en) 2018-11-22
CN101550190B (zh) 2016-04-13
EA006673B1 (ru) 2006-02-24
LUC00066I1 (hu) 2018-03-23
DK2090657T3 (en) 2017-06-06
PT2305817T (pt) 2017-10-26
JP2004527212A (ja) 2004-09-09
EP2090657B1 (en) 2017-03-01
LTC1309692I2 (lt) 2020-06-25
JP2011173884A (ja) 2011-09-08
US20120063998A1 (en) 2012-03-15
US10519231B2 (en) 2019-12-31
US11078267B2 (en) 2021-08-03
ATE431412T1 (de) 2009-05-15
NO2011023I2 (no) 2011-10-04
DK1309692T3 (da) 2009-06-15
US20110082190A1 (en) 2011-04-07
PT3178934T (pt) 2019-10-14
KR20030034133A (ko) 2003-05-01
NO2020005I1 (no) 2020-03-11
MY133377A (en) 2007-11-30
SI1309692T1 (sl) 2009-08-31
SI3178934T1 (sl) 2019-10-30
EP3597752A1 (en) 2020-01-22
ES2323760T3 (es) 2009-07-24
DK3178934T3 (da) 2019-09-30
LT2090657T (lt) 2017-07-25
SI2090657T1 (sl) 2017-06-30
LUC00066I2 (hu) 2018-05-25
CY2020003I1 (el) 2020-05-29
US8703141B2 (en) 2014-04-22
NZ535865A (en) 2007-01-26
HK1135991A1 (zh) 2010-06-18
PT1309692E (pt) 2009-05-21
SI2305817T1 (en) 2018-02-28
EP2305817A3 (en) 2011-12-28
KR100823576B1 (ko) 2008-04-21
LTPA2020001I1 (lt) 2020-02-10
US20030124123A1 (en) 2003-07-03
AR030134A1 (es) 2003-08-13
LU91584I2 (fr) 2009-09-10
CY2018010I2 (el) 2018-09-05
LTPA2009002I1 (lt) 2020-03-25
US20050214293A1 (en) 2005-09-29
IL154325A0 (en) 2003-09-17
US20090274707A1 (en) 2009-11-05
US7166285B2 (en) 2007-01-23
US8329171B2 (en) 2012-12-11
LTC2305817I2 (lt) 2021-04-26
DE122009000025I1 (de) 2009-09-17
CY2018010I1 (el) 2018-09-05
DK2305817T3 (en) 2017-12-04
HUP0302378A2 (hu) 2003-10-28
BRPI0113109B8 (pt) 2021-05-25
CY1118901T1 (el) 2018-02-14
JP6076303B2 (ja) 2017-02-08
EP1309692A2 (en) 2003-05-14
US20140178295A1 (en) 2014-06-26
US20050196838A1 (en) 2005-09-08
US20050002937A1 (en) 2005-01-06
NO20030614L (no) 2003-04-02
US20050112127A1 (en) 2005-05-26
CN1468309A (zh) 2004-01-14
EP3178934A1 (en) 2017-06-14
LUC00145I2 (hu) 2021-08-13
FR09C0021I2 (fr) 2010-06-11
US7063964B2 (en) 2006-06-20
FR09C0021I1 (hu) 2009-09-25
ES2747573T3 (es) 2020-03-10
JP4731094B2 (ja) 2011-07-20
NO20030614D0 (no) 2003-02-07
WO2002012500A3 (en) 2003-01-03
US9676848B2 (en) 2017-06-13
US7279157B2 (en) 2007-10-09
US7887807B2 (en) 2011-02-15
JP2012025779A (ja) 2012-02-09
US20170029496A1 (en) 2017-02-02
US7560247B2 (en) 2009-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11078267B2 (en) Method for treating lupus by administering an anti-IL-12 antibody
JP2004510414A (ja) 抗−デュアルインテグリン抗体（ａｎｔｉ−ｄｕａｌｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、組成物、方法及び使用
WO2002097048A2 (en) ANTI-p40 IMMUNOGLOBULIN DERIVED PROTEINS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
ZA200301867B (en) Anti-IL-12 antibodies, compositions, methods and uses.

Legal Events

Date Code Title Description
AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: USTEKINUMAB; REG. NO/DATE: EU/1/08/494/001-002 20090116

Spc suppl protection certif: S1200027

Filing date: 20121026

Expiry date: 20210807

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: USTEKINUMAB; REG. NO/DATE: EU/1/08/494/001-002 20090116

Spc suppl protection certif: S1200027

Filing date: 20121026

Expiry date: 20210807

Extension date: 20240117

GB9A Succession in title

Owner name: JANSSEN BIOTECH, INC., US

Free format text: FORMER OWNER(S): CENTOCOR, INC., US