RS50477B

RS50477B - Anti-il-12 antitela, kompozicije, metode i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS50477B
Application number: YUP-93/03A
Authority: RS
Inventors: Jill Giles-Komar; David M. Knight; David Peritt; Bernard Scallon; David Shealy
Original assignee: Centocor Inc.
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2010-03-02
Also published as: IL154325A0; US20190248884A1; DK2090657T3; WO2002012500A3; US20120063998A1; US20050002937A1; CY1122505T1; EP3178934A1; EA006673B1; SI2090657T1; EP3178934B1; DE122009000025I1; US20050112127A1; US9676848B2; US20110082190A1; KR100823576B1; LTPA2020001I1; LUC00066I2; PL360258A1; US20170029496A1

Abstract

Nukleinska kiselina koja kodira anti-IL-12 antitelo sisara koje ima promenjivi region teškog lanca SEQ ID NO: 7 i promenjivi region lakog lanca SEQ ID NO: 8.Prijava sadrži još 3 nezavisna i 5 zavisnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na antitela specifična za protein interleukin-12 (IL-12), kao i na nukleinsku kiselinu koja kodira ovakva anti-IL-12 antitela, ćelije domaćina i terapeutske formulacije i njihovu upotrebu.

Stanje tehnike

Interleukin-12 (IL-12) je heterođimerni citokin koji se sastoji od glikozilovanih polipeptidnih lanaca od 35 i 40 kDa koji se međusobno povezani disulfidnom vezom. Citokin sintetišu i sekretuju antigen prezentujuće ćelije uključujući dendrične ćelije, monocite, makrofage, B ćelije, Langerhansove ćelije i keratinocitekao i ćelije prirodne ubice (NK-natural killer cells). IL-12 posreduje u mnogobrojnim biološkim procesima i i pripisuje mu se da je NK ćelijski stimulatorni faktor (NKSF), citotoksični maturacioni faktor T-limfocita i faktor EBV transformisane B-ćelijske linije (Curfs, J. H. A. J., et al., Clinical Microbiologv Reviews, 10:742-780 (1997)).

Interleukin-12 može da se veže za IL-12 receptor koji se eksprimira na plazma membrani ćelija (e. g., T ćelija, NK ćelija) i tako menjajući (e. g., inicirajući, sprečavajući) biološke procese. Na primer, vezivanje IL-12 za IL-12 receptor može da stimuliše proliferaciju preaktiviranih T ćelija i NK ćelija, pojača citotolitičnu aktivnost citotoksičnih T ćelija (CTL), DNK ćelija i LAK (limfokinom aktivirane ubice) ćelije, indukuje proizvodnju gama interferona (IFN GAMMA) od strane T ćelija i NK ćelija i da indukuje diferencijaciju naivnih ThO ćelija u Thl ćelije koje proizvode IFN Gamma i IL-2 (Trinchieri, G., Annual Review of Immunologv, 13:251-276 (1995)). Posebno IL-12 je od vitalnog značaja za generisanje citolitičkih ćelija (npr., NK, CTL) i za rast ćelijskog imunog odgovora (npr., Thl ćelijski posredovani imuni odgovor). Zato je IL-12 neophodan za generisanje i regulaciju oba zaštitna imuniteta (e. g., iskorenjivanje infekcije) i patološke imune odgovore (npr., autoimunost) (Hendrzak, J. A. and Brunda, M. J. Laboratorv Investigations 72:619-637 (1995)). Na osnovu ovoga, imuni odgovor (e. g., zaštitni ili patogeni)može se pojačati, suprimirati ili sprečiti manipulacijom biološke aktivnosti IL-12in vivo,na primer u smislu antitela.

Nehumana sisarska, himerna, poliklonalna (npr., anti-serum) i/ili monoklonalna antitela (Mabs) (Ma) i fragmenti (npr., proteolitičke digestije ili njihovi fuziono proteinski proizvodi) su potencijalni terapeutski agensi koji se istražuju u nekim slučajevima pokušaja lečenja određenih bolesti. Međutim, ovakva antitela ili fragmenti mogu izaivati imuni odgovor kada se daju ljudima. Ovakav imuni odgovor može rezultirati u uklanjanju antitela ili fragmenta iz cirkulacije posredovanom kompleksom, i tako ponavljanje administarcije čini nepogodnim za terapiju, i tako smanjujući terapeutsku dobrobit za pacijenta i limitirajući readministarciju antitela ili fragmenta. Na primer, ponavljanje davanja antitela ili fragmenata sa ne humanim delovima može dovesti do serumske bolesti i/ili anafalaksije. Da bi se izbegli ovi i drugi problemi, primenjen je veći broj pristupa da bi se smanjila imunogenost ovakvih antitela i njihovih delova, uključujući himerizaciju i humanizaciju kao što je poznato u ovoj oblasti. Ovi kao i drugi pristupi, međutim mogu i dalje rezultirati u antitelima ili fragmentima sa nekom imunogenošću, niskim afinitetom, niskom "aviditv", ili sa problemima vezanim za ćelijske kulture, "scale up", proizvodnju, i/ili nizak prinos. Tako ovakva antitela ili fragmenti mogu biti manje idealni za proizvođače ili za upotrebu kao terapeutskih proteina.

Na osnovu ovoga, postoji potreba da se obezbede anti-IL-12 antitela ili fragmenti koji prevazilaze jedan ili više ovih problema, kao poboljšanja kod poznatih antitela ili njihovih fragmenata.

WO 99/37682 odnosi se na p75 hetrodimerna specifična anti-humana II.-12 antitela za koja je rečeno da se karkaterišu većom jačnim i većom efikasnošću u neutalizaciji humane IL-12 bioaktivnosti nego poznata heterodimerna specifična IL-12 monoklonalana antitela. Rečeno je da heterodimerna specifična antitela prepoznaju jedan ili više epitopa na humanom IL-12 p75 heterodimeru. a ne vežu se samo za p40 podjedinicu. Rečeno je da heterodimerna specifična IL-12 antitela neutrališu bioaktivnost IL-12 rezus majmuna sa jačnom sličnom njihovoj jačni pri neutralizaciji humane IL-12 bioaktivnosti i što ih čini korisnim antagonistima IL-12.

Suština pronalaska

Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana humana, primatna, glodarska, sisarska, himerna, humanizovana, i/ili CDR-presađena (grafted) anti-IL-12 antitela, kompozicije anti-IL-12 antitela, kodirajuće nukleinske kiseline, ćelije domaćine, kompozicije, i njihovu upotrebu, kao što je ovde opisano i omogućeno, u kombinaciji sa onim što je poznato u ovoj oblasti tehnike.

Antitelo na osnovu ovog pronalaska je definisano u zahtevu 3. Antitelo iz ovog pronalaska može biti derivat od bilo kog sisarskog, ali ne limitiran na humano, misije, zečije, pacovsko, glodarsko ili bilo koja njihova kombinacija, i slično.

Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu defnisanu u zahtevu 1; ćeliju domaćina detlnisanu u zahtevu 2. kompoziciju definisanu u zahtevu 6; i antitela ili kompozicije definisane u zahtevima 7-9.

Ovde je opisan izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži komplementarni, ili sa kojim može da hibridizuje, polinukleotid koji kodira makar jedno IL-12 anti-idiotipsko antitela, koji sadrži makar jednu njegovu specificiranu sekvencu, domen, deo ili varijantu. Ovde je dalje opisan rekombinantne vektore koji sadrže molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju pomenuta IL-12 anti-idiotipsko antitela, ćelije domaćine koji sadrže ovakve nukleinske kiseline i/ili rekombinantne vektore, kao i metode za pravljenje i/ili upotrebu ovakvih nukleinskih kiselina antitela, vektore i/ili ćelije domaćine.

Ovde je takođe opisana makar jedna metodu za eksprimiranje makar jednog anti-IL-12 antitela, ili IL-12-anti idiopatskog antitela, u ćeliji domaćinu, koja obuhvata gajenje ćelija domaćina kao što je ovde opisano u uslovima naznačeno time da se makar jedno anti-IL-12 antitelo eksprimira u količinama koje se mogu detektovati i/ili povratiti.

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jednu kompoziciju koja sadrži (a) izolovano antitelo kao što je ovde opisano; i (b) pogodan nosač ili razblaživač. Nosač ili razblaživač mogu opcionalno biti farmaceutski prihvatljivi, na osnovu poznatih nosača ili razblaživača. Kompozicija može dalje opcionalno da sadrži makar još jedno jedinjen je, protein ili kompoziciju.

Ovde je opisan makar jedan postupak ili kompozicija, za administraciju terapeutski efektivne količine anti-IL-12 antitelo da bi se modulisalo ili lečilo makar jedno stanje povezano sa IL-12 u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu i/ili pre, posle ili za vreme povezanog stanja, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili je ovde opisano.

Ovde je opisana makar jedna kompozicija, sredstvo i/ili metod za dostavu terapeutski ili profilaktički efektivne količine makar jednog anti-IL-12 antitela, na osnovu ovog pronalaska.

Ovde je opisana makar jedna anti-IL-12 antitelo metoda ili kompozicija za dijagnosticiranje makar jednog stanja povezanog sa IL-12-om u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu i/ili pre, posle ili za vreme povezanog stanja, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kao što je ovde opisano.

Ovde je opisana makar jedna kompozicija, uređaj i/ili metoda za dostavu za dijagnosticiranje makar jednog anti-IL-12 antitela, na osnovu ovog pronalaska.

Opis slika

Slike 1A i 1B su grafici koji prikazuju zavisno od koncentracije vezivanje humanih antilL-12-antitela za imobilisani IL-12. Anti-IL-12 antitela su razblažena u 1%BSA/PBS i inkubirana na pločama obloženim sa rhIL-12 jedan sat na 37°C. Ploče su isprane dva puta sa 0.02% Tvveen20 (polioksietilen(20) sorbitan monolaureat), 0.15 M fiziološkim rastvorom i zatim su urađene probe sa kozijim anti-humanim IgG kappa specifičnim antitelima koja su obeležena sa peroksidazom iz rotkvice (HRP-horse radish peroxidase) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane, razvijene sa o-fenilendiaminom (OFD) substratom i izmcrena je optička gustina(OD) na 490 nm za svaki bunarčić.

Slika 2: Kolone od levo na desno na slikama A i B sadrže humani IL-12, humani IL-12 p40, misiji IL-12, i unapred obojene molekulske markere. Slika 2A prikazuje obeležene trake iz ukupnih proteina. Primarne trake u svakoj koloni su humani IL-12 (75 kDa), p40 humani IL-12 (40 kDa) i misiji IL-12 (75 kDa). Slika 2B prikazuje western blot pripremljen iz gela identičan sa onim sa slike 2A. Blot je reagovao sa C340 pa zatim sa kozijim anti-humanim IgG obeleženim sa HRP i i specifično su detektovani samo humani IL-12 (monomer i multimeri) i humani IL-12 p40. Kontrolni blot (nije prikazan) koji je reagovao sa kozijim anti-humanim IgG obeleženim sa HRP nije davao nijednu traku.

Sika 3: Analiza reverzne transkripcije-PCR-a IFNy ekspresije IFNy gena u huamnim PBL tretiranim sa IL-2JL-12, IL-2+IL-12 sa ili bez anti-IL-12 antitela C340, 8.6.2, izotipnog kontrolnog antitela. Urađena je reverzna transkripcija totalne RNK, zatim je amplifikovana PCR-om pomoću prajmera specifičnih za gen. Određen je takođe nivo (3-aktinskog iRNK za svaki uzorak što je služilo kao kontrola intgriteta i sadržaja iRNK.

Slika 4 je histogram koji prikazuje da humana anti-IL-12 mAb (Ma) (C340) inhibiraju proizvodnju interferona-y (IFNy) od strane monocit raspadnutih CD3+ mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC-monocyte depleted CD3+ peripheral mononuclear cells) stimulisan sa IL-2 plus IL-12. PBMC su gajene tokom 5 sati u kontrolnom medijumu (bez dodatka citokina), medijumu sa IL-12 (0.1 p.g/ml) i IL-12/IL-2 medijumu koji sadrži mAb C340 (10 ug/ml). Intracelularni IFNy izmeren je pomoću imunobojenja sa dve boje sa CD3-PE i IFNy-FITC. Podaci su prikazani za jednog donora.

Slika 5 je grafik koji pokzauje dozno zavisnu inhibiciju IFNy sekrecije od strane IL-12 plus IL-2 stimulisanih limfocita periferne krvi sa dve grupe (lots) humanih anti-IL-12 mAb (Ma) (C340). Humani PBL (8 X lOVml) su gajene 24 sata sa lOU/ml IL-2, IL-2 plus 400 pg/ml IL-12, ili IL-2 plus IL-12 i mAb (Ma) C340 kao što je pokazano. Supernatanti kultura su uklonjeni i urađeni su testovi za IFNy pomoću E1A.

Slika 6 je histogram koji prikazuje dozno zavisnu inhibiciju IL-12 plus IL-2 indukovane citotoksičnosti LAK ćelija od strane humanih anti-IL-12 mAb (Ma)

(C340). LAK efektorne ćelije (humani PBL, 8xl0<6>/ml) su kultivisane 24 časa sa IL-12 (400 pg/ml) plus IL-2 (lOU/ml) i mAb (Ma) C340 (5000 ng/ml ili 50 ng/ml kao što je naznačeno). LAK efektorne ćelije su isprane i gajene sa Raji ciljnim ćeliojama obeleženim sa 5 lCr tokom 4 sata pri odnosu efektor.target (E:T) 80:1, i izmerena je količina 51Cr koja se oslobodila u medijum posle lize Raji ćelija. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost tri starndardne greške normalnog donora. IL-12 pozitivna kontrola (IL-12) su efektorne ćelije inkubirane sa IL-12 i bez antitela. Pozadina (PZD) su efektorne ćelije inkubirane bez IL-12 ili antitela.

Slike 7A i 7B su histogrami koji prikazuju da je IL-12 plus IL-2 indukovana ekspresija CD95 na CD3+ mononuklearnim ćelijama periferne krvi inhibirana humanim anti IL-12 mAb (Ma) (C340). PBMC su gajene 72 sata u medijumu sa 0.1 ng/ml IL-12 i suboptimalnim dozama IL-2 (50 U/ml) u prisustvu ili odsustvu mAb (Ma) C340 (10 u.g/ml). "Gating" je izveden pomoću dvobojne analize (CD3 ili CD56-PE naspram CD95-FITC) i dalje vs ortogonal ligh scatter (ortogonalno rasipanje svetlosti).

Slika 8 je grafik koji pokazuje da se rekombinantna humana anti-humana IL-12 antitela (rC340) vezuju za imobilisan IL-12 na način koji se ne razlikuje od prečišćenih mAb (Ma) C340. Određene je koncentracija rC340 u supernatantima tri rekombinantne ćelijske linije koje proizvode rC340, i supcrnatannti su procenjeni za vezivanje IL-12 pomoću ELISA. Ploče su obložene sa 2 u.g/ml humanog IL-12 i inkubirane sa prečišćenim mAb (Ma) C340 iz originalnog hibridoma (standard) ili supernatanta rekombinovanih ćelijskih linija. Antitela sa vezanim IL-12 su detektovana upotrebom kozijim anti-humanim IgG konjugovanim sa fosfatazom (teški lanac + laki lanac).

Slike 9A-9C su grafici koji prikazuju kinetiku rasta i količinu antitela koja se sekretuju od strane tri nezavisno izvedena rekombinantna ćelijska subklona koja proizvode rC340 (slika 9A. subklon C379B; Slika 9B, subklon 381A; slika 9C subklon C389A). Rekombinantne ćelije su zasejane u T75 flaskove sa početnom gustinom 2 X 105 ćelija /ml u standardnom medijumu. U različitim vremenskim intervalima ćelije su resuspendovane i određeni su brod živih ćelija i količina (u,g/ml) rC340 u medijumu.

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovana, rekombinantna i/ili sintetička anti-IL-12 humana, primatna, glodarska, sisarska, himerna, humanizovana ili CDR presađena antitela, kao i kompozicije i kodirajuće molekule nukleinskih kiselina koje sadrže najmanje jedan polinukleotid koji kodira makar jedno anti-IL-12 antitelo prema pronalasku. Ovaj pronalazak dalje obuhvata, ali nije time limitiran, upotrene tih antitela na primer u dijagnostičkim i terapeutskim kompozicijama, postupcima i uređajima.

Kao što je ovde korišćeno, "anti-Interleukin-12 antitelo"," anti-IL-12 antitelo", "deo anti-IL-12 antitela" ili "fragment anti-IL-12 antitela" i/ili "varijanta anti-IL-12 antitela" i slično, uključuju bilo koji protein ili molekul sa peptidom koji sadrži makar deo imunoglobinskog molekula, kao stoje, ali nije njime limitiran, makar jedan region za određivanje komplementarnosti (complementaritv deternining region-CDR) teškog ili lakog lanca ili deo za vezivanje Uganda, varijabilan region teškog ili lakog lanca, konstantan region teškog ili lakog lanca, framevvork region, ili njegov deo, ili najmanje jedan deo IL-12 rcceptora ili vezujućcg proteina, koji se može ugraditi u antitelo iz ovog pronalaska. Ovakvo antitelo opcionalno dalje utiče na specifičan ligand, tako što, ali nije limitiran time, antitelo moduliše, smanjuje, povećava, antagonizuje, angonizuje, ublažava, povišava, olakšava, blokira, inhibira, ukida i/ili utiče na makar jednu aktivnost IL-12 ili na njegovo vezivanje, ili na aktivnost i vezivanje receptora za IL-12,in vitro, in situi/iliin vivo.Kao nelimitirajući primer odgovarajuće anti-IL-12 antitelo, određeni delovi ili varijanta ovog pronalaska, može da veže makar jedanIL-12, ili njegove određene delove, varijante ili domene. Odgovarajuće anti-IL-12 antitelo, određeni delovi ili varijante mogu takođe opcionalno da utiču makar na jednu funkciju ili aktivnost IL-12, kao što je, ali nije time limitirana, sinteza RNK, DNK ili proteina, oslobađanje IL-12, receptorski "signaling" IL-12, sečenje membrane sa IL-12, aktivnost IL-12, proizvodnja i/ili sinteza IL-12. Izraz "antitelo" ima za nameru da dalje obuhvati antitela, digestione fragmente, njihove određene delov i varijante, uključujući oponašanje antitela ili obuhvatajući delove antitela koja oponašaju strukturu i/ili funkciju antitela ili njivovog fragmenta ili dela, uključujući jednolančana antitela i njihove fragment. Funkcionalni fragmenti obuhvataju antigen vezujuće fragmente koji se vezuju za sisarski IL-12. Na primer, fragmenti antitela koji su sposobni da se vežu za IL-12 ili njegov deo, uključujući, iako nisu time limitirani, Fab (npr., digestijom papainom), Fab' (npr., digestijom sa pepsinom i delimičnom redukcijom) i F(ab')2(npr., digestijom sa pepsinom), facb (npr., digestijom sa plazminom), pFc' (npr., digestijom sa pepsinom ili plazminom), Fd (npr., digestijom sa pepsinom, parcijalnom redukcijom i ponovnom agregacijom), Fv ili scFv (npr., tehnikama molekularne biologije) fragmente, koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom (videti, npr., Colligan Immunologv, supra).

Ovakvi fragmenti mogu se dobiti sečenjem sa enzimima, sintetičkim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kao stoje ovde opisano. Antitela se takođe mogu proizvesti u različitim skraćenim oblicima upotrebom gena za antitela u koje je jedan ili više stop kodona ubačeno uzvodno od prirodnog stop kodona. Na primer, kombinacija gena koji kodiraju deo teškog lanca F(ab')2može se dizajnirati tako da se uključe DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i/ili zglobni (hinge) region teškog lanca, različiti delovi antitela mogu se spojiti hemijskim putem konvencionalnim tehnikama, ili se mogu pripremiti kao jedan protein od nastavljajućih različitih delova pomoću tehnika genetičkog inžinjerstva.

Kao što se ovde koristi, izraz "humano antitelo" odnosi se na antitelo u okviru koga u suštini svaki deo proteina (npr., CDR, framework, CL, CHdomeni(npr., CH1, CH2, CH3), zglob (VL, VH)), je u suštini neimunogen za čoveka, sa minornim promenama u sekvenci ili varijantama. Slično, antitela namenjena primatima (majmunu, babunu, šimpanzi itd.), glodarima (mišu, pacovu, zecu, morskom prasetu, hrčku, i sličnim) i drugim sisarima označava antitela specifična za podvrstu, pod rod, rod, podfamiliju, familiju. Dalje himerna antitela uključuju bilo koju kombinaciju gore opisanih. Ovakve promene ili varijante opcionalno i poželjno je da zadr.avaju ili redukuju imunogenost u ljudima ili drugim vrstama u odnosu na nemodifikovano antitela. lako humano antitelo je različito od himernog ili humanizovanog antitela. Naglašeno je da se humano antitelo takođe može proizvesti u ne-humanoj životinji ili prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji koja je sposobna da eksprimira funksionalno preuređene humane imunoglobulinske (npr., težak lanac i/ili lak lanac). Dalje, kada je humano antitelo jednolančano antitelo, ono sadrži linker peptid koji se ne nalazi u nativnim humanim antitelima. Na primer, Fv može da sadrži linker polipeptid, od dva do oko osam glicina ili drugih amino kiselinskih ostataka, koji povezuje varijabilan region teškog lancai varijabilan region lakog lanca, aovskvi linker peptidi se smatraju da su humanog porekla.

Bispecifična, heterospecifična ili slična antitela mogu se takođe koristiti, ona koja su monoklonalna, poželjno je da su humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za makar dva različita antigena. U ovom slučaju jedna od specifičnosti vezivanja je za protein IL-12, dok je druga za bilo koji drugi antigen. Metode za proizvodnju bispecifičnih antitela poznate su u ocoj oblasti nauke, tradicionalno rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se bazira na koekspresiji dva imunoglobulinska težak lanac-lak lanac para, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305:537 (1983)). Zbog slučajnog odabiranja i slaganja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od koji samo jedno ima odgovarajuću bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje potrebnog pravog molekula, koje se odigrava najčešće kroz korake afinitativne hromatografije, je poprilično trško, i prinos proizvoda je nizak. Otkrivene su slične procedure, npr., u WO 93/08829, US Patent Nos, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

Anti-IL-12 antitela (nazivaju se i IL-12 antitela) prema ovom pronalasku, mogu opcionalno imati osobine kao što su visoki afinitet vezivanja za IL-12 i opcionalno i poželjno nisku toksičnost. Posebno je korisno u ovom pronalasku, antitelo prema pronalasku, gde pojedinačne komponente, kao što su varijabilan region, konstantan region i framework, pojedinačno i/ili kolektivno, opcionalno i poželjno sa niskom imunogenošću. Antitela koja se mogu koristiti u ovom pronalasku opcionalno karakteriše njihova sposobnost da se koriste u lečenju pacijenata tokom dužeg vremenskog perioda sa merljivim ublažavanjem simptoma, i niska i/ili prihvatljiva toksičnost. Niska ili prihvatljiva imunogenost i/ili visoki afinitet, kao i druga odgovarajuća svojstva, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima. "Niska imunogenost" je ovde defmisan kao značajan porast HAHA, HACA ili HAMA odgovora kod manje od oko 75% ili što je poželjnije kod manje od 50% pacijenata koji su lečeni i/ili porast niskog titra kod tertiranih pacijenata (manje od 300, poželjno manje od oko 100 izmerenih pomoću duplog antigenskog enzimskog imunotestova) (Elliott et al., Lancet 344:1125-1127(1994).

Upotreba

Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu se iskoristiti za proizvodnju najmanje jednog anti-IL-12 antitela ili njegove specificirane varijante, koje se može koristiti za merenje ili proizvodnju u ćeliji, tkivu, organu ili životinji (uključujući sisare i ljude), za dijagnostificiranje, monitoring, modulaciju, lečenje, ublažavanje, pomoć u prevenciji incidence, ili redukciji simptoma, najmanje jednog stanja povezanog za IL-12. selektovanog od, ali ne njime limitirano, makar jednog imunog poremećaja ili bolesti, kardiovaskularnog poremećaja ili bolesti, infekcije, malignog oboljenja, i/ili neurološkog poremećaja ili bolesti, ili nekog drugog poznatog ili specificiranog stanja povezanog sa IL-12.

Ovakav metod može da obuhvata administraciju effektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži makar jedan IL-12 u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, kome treba modulacija, olakšavanje, umanjenje, prevencija ili redukcija simptoma; efekata i mehanizama. Efektivna količina može da oduhvati količine od oko 0.001 do 500 mg/kg za pojedinačno (npr., bolus (za gutanje)), više puta ili kontinuirano davanje, ili da bi se dostigla koncentracija seruma od 0.01-5000 u.g/ml serumske koncentracije za pojedinačno, više puta i kontinuirano davanje, ili bilo koji efektivan opseg ili vrednost istih, kao što se radi i određuje upotrebom poznatih metoda, što je ovde opisano ili je poznato upućenima u ovu oblast.

Citati

Sve publikacije i pomenuti patenti pokazuju kakva je situacija u ovoj oblasti tenhike bila u momentu ovog pronalaska i/ili čine opis i omogućavaju ovaj pronalazak. Publikacije se odnose na bilo koje naučne publikacije ili publikacije pacijenata, ili informacijekoje su dostupne u bilo kom medijskom formatu, uključujući sve zabeležene, elektronske i štampane formate. Specifično navodimo sledeće reference: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY (1989); Harlovv and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NY

(1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001).

Antitela prema ovom pronalasku

Makar jedno anti-IL-12 antitelo iz ovog pronalaska može biti opcionalno proizvedeno od strane ćelijske linije, mešovite ćelijske linije, besmrtnih ćelija ili klonalne populacije besmrtnih ćelija, što je poznato u ovoj oblasti nauke. Videti npr., Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, NY (1989); Harlovv and Lane, antibodies, a Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour, NY (1989): Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunologv, John Wiley & Sons, Ine, NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Ine, NY, NY (1997-2001).

Humana antitela koja su specifična za IL-12 protein ili njegov fragment, mogu se izazvati protiv odgovarajućeg imunogenog antigena, kao što je izolovani i/ili IL-12 protein ili njegov deo (uključujući sintetičke molekule, kao što su sintetički peptidi). Druga specifična ili opŠta sisarska antitela mogu se dobiti na sličan način. Priprema imunogenih antigena, i proizvodnja monoklonalnih antitelamože se izvesti primenom bilo koje pogodne tehnike.

Po jednom pristupu, hibridoma se proizvodi fuzijom pogodnih besmrtnih ćelijskih linija (npr., ćelijske linije mieloma kao što su, ali nisu njima limitirane, Sp2/0, Sp2/0-AG14,1MSO, NS1, NS2, AE-1, 1.5, veće od 243, P3X63Ag8.653, Sp2MAl, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, MH 3T3, HL-69, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ili slične, ili heteromilome (heteromylomas), njihovi fuzioni proizvidi, ili bilo koja ćelija ili fuziona ćelija izvedena iz njih, ili neka druga odgovarajuća linija koja je poznata u ovoj oblasti. Videti, npr..www.atcc.lifetech.com. sa ćelijama koje proizvode antitela, kao što su, bez ograničavanja na njih, izolovane ćelije slezine, iz periferalne krvi, limfe, krajnika, ili druge imune ćelije ili one koje sadrže B Iimfocite, ili bilo koje ćelije koje eksprimiraju konstantne, varijabilne ili framework iki CDR sekvence teškog ili lakog lanca, ili kao endogene ili heterologne nukleinske kiseline, kao rekombinantne ili endogene viralne, bakterijske, od algi, prokariotske, od vodozemaca, insektske, od gmizavaca, riblje, sisarske, glodarske, konjske, goveđe, jareće, ovčije, primtne, eukariotske, genomske DNK, cDNK, mitohondrijska DNK ili RNK, hloroplastna DNK ili RNK, hnRNK, iRNK, tRNK, jedno, dvo ili trolančana, hibridizovana, ili bilo koja njihova kombinacija. Videti Ausubel, supra, and Collingan, immunologv, supra, Chapter 2.

Ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti iz periferne krvi ili što je poželjnije iz slezine, limfnih čvorava, poreklom od čoveka ili drugh odgovarajućih životinja, koje su imunizovane sa antigenom od interesa. Može se koristiti bilo koja odgovarajuća ćelija domaćin za ekspresiju heterolognih ili endogenih nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo, njegov specificiran fragment ili varijantu, iz ovog pronalaska. Fuzionisane ćelije (hibridome) ili rekombinantne ćelije mogu se izolovati pomoću uslova selektivnih kultura ili nekim drugim poznatim prigodnim metodama, i takođe mogmogu biti klonirane pomoću ograničavanja razblaženja ili odabira ćelija, ili nekih drugih poznatih metoda. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim specifičnostima mogu se selektovati odgovarajućim testom (npr., ELISA metodom).

Druge pogodne metode za proizvodnju ili izolaciju antitela željene specifičnosti mogu se koristiti, ukjučujući, ali nisu njima ograničene, metode koje selektuju rekombinantno antitelo izpeptidne ili proteinske biblioteke (npr., ali nisu njima limitirane, bakteriofagne, ribozomalne, oligonukleotidne, RNK, cDNK ili slične izložene biblioteke; npr., kao što su dostupne iz Cambridge antibodv Technologies, Camridgeshire, UK; MorphoSvs, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Svveden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berlkelv, CA; Ixsus. Videti npr., EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO90/14443; VVO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; NV092/16619; WO96/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSvs); WO95/l6027 (BioInvent);WO88/06630; WO90/3890 (Dyax); US 4,704,692 (Ezon); PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400;(Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys);; ili stohaksički dobijeni peptidi ili proteini - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, sada AppliedMolecular Evolution (AME)) ili retko po imunizaciji transgenih životinja (npr., SCID miševi, Ngyuen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 91996); Eren et al., Immunol. 93;154-161 (1998)) koji su sposobni za proizvodnju repertoara humanih antitela, kao što je poznato u ovoj oblasti i/ili kako je ovde opisano. Takve tehnike, uključuju, ali nisu njima limitirane, "ribosomal displav" (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)(; tehnologije proizvodnje pojedinačne ćelije (npr., metod selektovanog limfocitnog antitela (selected lvmphocvte antybody method -"SLAM") (US pat. No. 5,627,052, wen et al., J. Immunol.'17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996); "gel microdroplet" i "flovv" citometrija (Powel et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Immun.Meth. 182:155-163 (1995) Kenney et al., Bio/Technol. 13: 787-790 (1995)); selekcija B-ćelija (Steenbakkers et a]., Molec.Biol.Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)).

Metode za inžinjering humanizovanih ne-humanih ili huamnih antitela se takođe može koristiti i dobro je poznata u ovoj oblasti. Uopšteno, humanizovana ili isprojektovano antitelo poseduje jdan ili više amino kiselinski ostataka iz izvora ne-humanog porekla, npr., ali nije limitirana samo na miša, pacova, zeca, ne-humanog primata ili druge sisare. Ovi humani amino kiselinski ostaci često se označavaju kao "import" (uvezen)i) ostaci, koji se tipično uzimaju od "import" varijabilnog, konstantnog ili nekog drugog domena poznate humane sekvence. Poznate huamne Ig sekvence su otkrivene, npr., www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.htlm; ww.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antybodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/- pedro/research.tooIs.html;www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html;

www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;

wwwlibrary.thinkquest.org/12429/immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/m ikeimages.html; wwwantibodyresource.com/; wwwharvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/-hcenter/indeks.html; www.biotech.ufl.edu/-hct/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html;wwwnal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.rn.ehime-u.ac.jp/-yasuhito/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/links.html; www.biotesh.ufl.edu/-fcc/protocol.htmI; www.isacnet.org/sites.geo.html;aximtl .imt.uni-marburg.de/-rek/AEPStart.html; baserv.uci. kun.nl/-jraats/loinks. htm;www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V. mice.html; imgt.cnusc.fr.8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/-martin/abs/index.htlm; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; wwwunizh.cn/- honegger/AHOseminar/SlideO 1 .html; www.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/- mrc7/humanisation/TAHHP.htlm; www.ibt.unam.mx/vir/struvture/stat.aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/-

fmolina/web-pages/pept/spottech.htmI; www.jerin.de/fr.products.htm; www.patents.ibm.com/ibm.htm; kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, US. Dept. Health (1983). Ovako importovane sekvence mogu se koristaiti za smanjenje imunogenosti ili za redukciju, pjačavanje ili modifikovanje vezivanja, afinitativnosti, "on-rate", "off-rate", aviditv, specifičnosti, polu-života ili bilo koje druge poželjne karakteristike, što je poznato u ovoj oblasti, generalno deo ili čitave nečhumane CDR sekvence sezadržavaju dok se ne-humane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona zamenjuju sa humanim ili drugim amino kiselinama. Antitela mogu takođe opcionalno biti humanizovane uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i drugih željenih biološkij osobina. Da bi se ovo postiglo, humanizovana antitela mogu se opcionalno pripremiti procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunogiobulina su dostupni svima i poznati onima koji se bave ovim delom nauke. Dostupni su kompjuterski programi koji prikazuju i ilustruju pretpostavljene trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu pretpostavljene uloge u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, i.e., analizu ostataka koji utiču na mogućnost imunoglobulinskog kandidata da se veže za antigen. Na ovaj način, Fr ostaci mogu se selektovati i kombinovati iz konsenzusnih i importovanih sekvenci tako da je dobiju željene karakteristike antitela kao što je na primer povećan afinitet za ciljni antigen(e). Generalno ostaci CDR su direktno suštinski uključeni u procese koji utiču na vezivanje antigena. Humanizacija ili konstrukcija antitela iz ovog pronalaska može se uraditi poznatim metodama, kao što suoni opisani u, ali nisu njima limitirani, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., nature 332:323 (1988); verhoeven et al., science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chotia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Čarter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.US A) 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), US patent Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089. 5225539,; 4816567, PCT/:US98/16280,US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246.

Anti-IL-12 antitelo takođe se može dobiti imunizacijom transgene životinje (npr., miša, pacova, hrčka, ne-humanog primata, i sličnih) koje su sposobne da proizvedu repertoar humanih antitela, kao što je ovde opisano i/ili ka što je poznato u ovoj oblasti. Ćelije koje proizvode humano anti-IL-12 antitelo mogu se izolovati iz ovakvih životinja i prevesti u besmrtno stanje pomoću odgovarajućih metoda, kao što su one opisane ovde.

Transgeni miševi koji su sposobni da proizvode repertoar humanih antitela koja se vezuju za humane antigene, može se proizvesti poznatim metodama (npr., ali nije limitirana njima, U.S.Pat.Nos:5,770,428, 5,569,825, 5,545,806, 5,625,825, 5,633,425, 5,661,016 i 5,789,650 izdati Londberg et al.,; Jakobovits et al., WO98/50433, Jakobovits et al., VV098/24983, Londberg et al., WO 98/24884, Londberg et al., WO 97/13852, Londberg et al., WOV 94/25585, Kucherlapten et al„ WO 96/34096, Kucherlapten et al., EP 0463 151 BI, Kucherlapten et al., EP 0710 719 Al, Surani et al., US. Pat. No. 5,545,807, Bruggemann et al., WO 90/04036, Bruggemann et al., EP 0438 474 BI, Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), Tavlor et al., Int. Immunol. 6(4)579-591 (1994), Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et al., Nature Genetics 15:146-159 (1997), Tavlor et al., nucleic Acids Research 20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(8):3720-3724 (1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol 13(1)65-93 (1995) i Fisgwald et al., Nat Biotechnol 14(7)845-851

(1996)). Uopšteno, ovi miševi sadrže makar jedan transgen koji ima DNK iz makar jednog humanog imunoglobulinskog lokusa koji je funkcionalno rearanžiran, ili koji može podleći funkcionalnom rearanžiranju. Endogeni imunoglobulinski lokusi kod ovakvog miša mogu biti prekinuti ili deletirani da bi se eliminisala moguživotinje da proizvodiantitela koja su kodirana endogenim genima.

Pregled (screening) antitela na specifično vezivanje za slične proteine ili fragmente može se konvencionalno postići pomoću(peptide displav libraries) biblioteka izloženih peptida. Ovaj metod obuhvata skrining ogromnih kolekcija peptida radi pronalaženja pojedinačnih članova koji imaju potrebne funkcije ili strukturu. Skrining antitela preko biblioteka izloženih peptida dobro je poznato u ovoj oblasti. Izložene peptidne sekvence mogu biti dugačke 3 do 5000 ili više amino kiselina, najčešće 5-100 amino kiselina, i često od 8 do oko 25 amino kiselina. Kao dodatak da bi se usmerili hemijske sintetičke metode za dobijanje peptidnih biblioteka, opisano je nekolikometoda rekombinante DNK. Jedan tip uključuje izlaganje peptidne sekvence na površini bakteriofaga ili ćelije. Svaki bakteriofag ili ćelija sadrži nuklrotidnu sekvencu koja kodira određenu izloženu peptidnu sekvencu. Ovakve metode su opisane u PCT Patent Publications Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818 i93/08278. Drugi sistemi za dobijanje biblioteka peptida imaju aspekte obe, i hemijske sinteze i rekombinantnih metoda. Videt PCT Patent Publications Nos 92/05258, 92/14843 i 96/19256. takođe videti US Patent Publications Nos 5,658,754; i 5.643,768. Biblioteke izloženih peptida, vektor i kitovi za skrining su komercijalni i dostupni od snabdevača kao što su Invitrogen (Carlsbad, CA) i Cambridge antibodv Technologies (Cambridgeshire, UK). Videti npr., U.S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, dodeljeno Enzon-u; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, dodeljeno Dyax-u; 5427908, 5580717, dodeljeno Affymax-u; 5885793 dodeljeno Cambridge antibody Technologies;5750373 dodeljeno Genetech-u; 5618920, 5595898,5576195, 5693493, 5698417, dodeljeno Xoma-i, Colligan-u, supra; Ausbel-, supra; ili Sambrook-u, supra.

Antitela iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremiti upotrebom najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-IL-12 antitelo da bi se obezbedile transgene životinje ili sisari, kao koze, krave, konji, ovce, i slične, koje proizvode ovakva antitela u svom mleku. Ovakve životinje se mogu obezbediti pomoću poznatih metoda.Videti npr., bez limitiranja na njih, US Patent nos. 5,827,690, 5,849,992, 4,873,316, 5,849,992, 5,994,616, 5,563,362, 5,304,489, i slične.

Antitela iz ovog pronalaska mogu se dodatno pripremiti pomoću najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira anti-IL-12 antitelo da bi se dobile transgene biljke i gajene biljne ćelije (npr., bez limitiranja na njih, duvan i kukuruz) koji proizvode takva antitela, specifične delove ili varijante u biljnim defovima ili ćelijskim kulturama od njih. Kao nelimitirajući primer, listovi transgenog duvana koji eksprimiraju rekombinantne proteine uspešno se koriste za dobijanje velikih količina rekombinantnih proteina, npr., korišćenjem inducibilnog promotora, videti, npr., Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. immunol. 240:95-118 (1999) i reference citirane u tom radu. takođe transgeni kukuruz korišćrn je za ekspresiju sisarskih proteina za potrebe komercijalne proizvodnje, sa biološkim aktivnostima ekvivalentnim onima proizvedenim u drugim rekombinantnim sistemima ili prečišćenim iz prirodnog izvora. Videti, npr., Mood et al., Adv. Exp. med. Biol. 464:127-147 (1999) i reference koje su tu citirane.Takođe su antitela proizvedena u velikim količinama iz semena transgenih biljaka uključujući fragmente antitela, kao što su jednolančana antitela (scFv's) uključujući semena duvana i krtole krompira. Videti npr., Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:101-109

(1998) i reference koje su tu citirane. Tako antitela iz ovog pronalaska mogu biti proizvedena takođe pomoću transgenih biljaka, na osnovu poznatih metoda. Videti takođe,npr.. Fisher et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct. 1999); Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7 (1995); Ma et al., Plant Phvsiol. 109:341-6 (1995);Whitelam et al, Biochem. Soc. Trans. 22:940-944 (1994); i reference koje su tu citirane.

Antitela iz ovog pronalaska mogu vezati humani IL-12 sa širokim opsegomafiniteta (KD). U poželjnijem ostvarenju, najmanje jedno humano MA (monoklonalno antitelo) iz ovog pronalaska može opcionalno da veže humani IL-12 sa visokim afinitetom. Na primer, humano MA može vezati humani IL-12 sa Kd jednakim ili manjim od 10<7>M, kao , bez limitiranja na njega; 0.1-9.9 (ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga) X IO<7>, IO<8>, 10<9>, 10 l0, 10", IO '2, IO"<13>, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ovoga.

Afinitet ili aviditv antitela za antigen može se eksperimentalno odrediti pomoću bilo koje prigodne metode. (Videti, na primer, Berzofskv, et al., "Antibodv-Antigen Interactions," U Fundamental Immunologv, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984) Kuby, Janis, Immunologv, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); i metode opisane u njima). Izmeren afinitet određenog antitela određene antitelo-antigen interakcije može da varira pod različiti uslovima (npr., koncentracija soli, pH). Zato je poželjno da se merenje afiniteta i drugih parametara vezivanja antigena (npr., KD, Ka, Kd) izvodi u standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i sa standardizovanim puferom, kao što je pufer koji je opisan ovde.

Molekuli nukleinskih kiselina

Koristeći informacije koje su ovde date, molekul nukleinske kiseline prema ovom pronalasku koji kodira najmanje jedno anti-JL-12 antitelo mogu se dobiti pomoću ovde opisanih postupaka ili onih koji su poznati u ovoj oblasti.

Molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska mogu biti u formi RNK, ka iRNK, hnRNK, tRNK ili drugoj formi, ili u formi DNK, uključujući, ali ne limitirana njima, cDNK i genomska DNK dobijene kloniranjem ili proizvedene sintetički, ili bilo koja njihova kombinacija. DNK može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja njihova kombinacija. Bilo koji deo makar jednog lanca DNK ili RNK može biti kodirajući lanac, poznat kao "sense" lanac, ili može biti nekodirajući, poznat kao "anti-sense" lanac.

Izolovani molekuli nukleinskih kiselina ovde opisani mogu uključiti molekule nukleinskih kiselina koje sadrže otvoren okvir čitanja (ORF, open reading frame), opcionalno sa jednim ili više introna, npr., ali nisu njima limitirani, makar jedan specificirani deo makar jedne CDR, kao CDR1. CDR2 i/ili CDR3 makar jednog teškog lanca (npr., SEQ ID NOS: 1-3), ili lakog lanca (npr., SEQ ID NOS:4-6); molekuli nukleinskih kiselina koji sadrže kodirajuće sekvence za anti-IL-12 antitelo ili variajbilni region (npr., SEQ ID NOS:7,8); i molekuli nukleinskih kiselina koje obuhvataju sekvence suštinski različite od ovde opisanih u tekstu iznad, ali koje usled izrođenosti genetskog koda, ipak i dalje kodiraju anti-IL-12 antitelo kao što je ovde opisano i/ili je poznato u ovoj oblasti. Naravno, genetski kod je dobro poznat u nauci. Zato bi bila rutina za nekoga koje obuče za ovu oblast nauke da generiše ovakav izrođene varijante nukleinskih kiselina koje kodiraju specifična anti-IL-12 antitela iz ovog pronalaska. Videti npr., Ausubel et al., supra. Nelimitirajući primeri izolovanih molekula nukleinskih kiselina uključuju SEQ ID NOS: 1-8, koji odgovaraju nelimitirajućim primerima kodiranja nukleinskih kiselina, istim redom, HC CDR1. HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC varijabilan regioni LC varijabilni region.

Kao što je ovde ukazano, molekuli nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira anti-IL-12 antitelo može da uključi, ali ne da bude time limitiran, one koje same kodiraju amino kiselinske sekvence fragmenta antitela; kodirajuću sekvencu za celo antitelo ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za antitelo, njegov deo, fragment, kao i dodatne sekvence, kao one kodirajuće sekvence za makar jedan "signal leader" (signalni/lider peptid) ili fuzioni peptid, sa ili bez napred navedenih dodatnihkodirajućih sekvenci, kao mšto je makat jedan intron, zajedno sa dodatnim, nekodirajućim sekvencam, uključujući, bez limitiranja na njih, nekodirajuće 5' i 3' sekvence, kao transkribovane (one koje se prepisuju), netranslantovane (one koje se ne prevode)sekvence koje imaju ulogu u transkripciji, procesovanju (obradi) iRNK, uključujući splajsing i poliadenilacione signale (na primer-vezivanje ribozoma i stabilnost iRNK); dodatna kodirajuća sekvenca koja kodira za dodatne amino kiseline, kao one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Tako sekvenca koja kodira dodatne amino kiselinemože se fuzionisati sa marker sekvencom, kao što je sekvenca koja kodira peptid koji olakšava prečišćavanje fuzionisanog antitela koje sadrži njegov deo ili fragment.

Polinukleotidi koji selektivno hibridizuju sa polinukleotidom kao što je ovde opisano

Ovde su opisane izolovane nukleinske kiseline koje hibridizuju pod selektivnim uslovima hibridizacije za polinukleotid koji je ovde predstavljen. Tako polinukleotidi mogu se koristiti za izolaciju, detekciju, i/ili kvantiifkaciju nukleinskih kiselina koje sadrže ovakve polinukleotide. Na primer, polinukleotidi mogu se koristiti za identifikaciju, izolaciju, ili umnožavanje delimičnih klonova, ili onih čitave dužine u deponovanim bibliotekama. U nekim slučajevima, polinukleotidi su genomske ili cDNK sekvence izolovane, ili na drugi način komplementarne cDNK iz biblioteka nukleinskih kiselina čoveka ili sisara.

Poželjno je da cDNK biblioteka sadrži najmanje 80% sekvenci kompletne dužine, poželjno najmanje 85% ili 90% sekvenci kompletne dužine, i najpoželjnije 95% sekvenci kompletne dužine. cDNK biblioteka može se normalizovati tako da se poveća prisustvo retkih sekvenci. Uslovi hibridizacija niske ili umerene jačine (stringencv) se tipično, ali ne isključivo primenjuju kod sekvenci sa smanjenom identičnošću u odnosu na komplementarne sekvence. Uslovi hibridizacija umerene ili jačine se mogu opcionalno upotrebiti za sekvence sa većom identičnošću. Uslovi niske jačineomogućavaju selektivnu hibridizaciju sekvenci sa 70% identičnosti u sekvenci i mogu se upotrebiti za identifikacijuortologih ili paralogih sekvenci.

Opcionalno, polinukleotidi će kodirati makar deo antitela koje je kodirano polinukleotidima koji su ovde opisani. Polinukleotidi obuhvataju sekvence nukleinskih kiselina koje se mogu koristiti za selektivnu hibridizaciju za polinukleotidom koji kodira antitelo iz ovog pronalaska. Videti, npr., Ausubel, supra; Colligan, supra.

Konstruisanje nukleinskih kiselina

Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se dobiti pomoću (a) rekombinantnih metoda (b) sintetičkim tehnikama (c) tehnikama prečišćavanja, ili njihovim kombinacijama, što je poznato u ovoj oblasti.

Nukleinske kiseline mogu zgodno da sadrže sekvence, dodatne u odnosu na polinukleotid iz ovog pronalaska. Na primer, polilinker, mesto za kloniranja koje sadrži jedno ili više restrikcionih mesta za endonukleaze, može se ubaciti u nukleinsku kiselinu da bi se pomoglo izolaciji polinukleotida. Takođe sevence koje se prevode u procesu translacije mogu se ubaciti da bi se olakšala izolacija translatovanog polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer heksa-histidin marker sekvenca obezbeđuje zgodan način za prečišćavanje proteina iz ovog pronalaska.

Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska isključujući kodirajuću sekvencu, je opcionalno vektor, adapter, ili linker za kloniranje i/ili ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska.

Dodatne sekvence mogu se dodati ovim sekvencama za kloniranje i/ili ekspresiju da bi se optimizovala njihova funkcija u kloniranju i/ili ekspresiji, da bi se pomogla izolacija polinukleotida, ili poboljšalo unošenje polinukleotida u ćeliju. Upotreba vektora za kloniranje, ekspresionih vektora i linkera je poznata u ovoj oblasti. (Videti, npr., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).

Rekombinantne metode za konstruisanje nukleinskih kiselina

Kompozicija (sastav) izolovanih nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, kao RNK, cDNK, genomska DNK, ili njihova kombinacija, može se dobiti iz bioloških izvora koristeći različit broj metodologija poznatih onima koji se bave ovom oblašću. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidne probe koje selektivno hibridizuju, pod "stringent" (strogim) uslovima, sa polinukleotidima iz ovog pronalaska, koriste se za identifikaciju željene sekvence u bibliotekama cDNK ili genomske DNK. Izolacija RNK, i konstruisanje biblioteka cDNK i genomske DNK, je dobro poznat onima sa običnim znanjem u ovoj oblasti (Videti, npr., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).

Metode skrinovanja i izolacije nukleinskih kiselina

cDNK i genomske biblioteke mogu se skrinovati pomoću probe koja se bazira na sekvenci polinukleotida iz ovog pronalaska, kao što su one otkrivene ovde. Probe se mogu koristiti za hibridizaciju sa sekvencama genomske DNK ili cDNK da bi

se izolovali homologi geni u istom ili drugim organizmima. Oni koji se bave ovom oblašću biće zadovoljni time što se može u testu upotrebiti različiti stepeni "stringencv" (strogosti) hibridizacije; ili hibridizacijaili medijum za ispiranje mogu biti "stringent". Kako uslovi za hibridizaciju postaju sve više "stringent"

(strogi), mora postojati viši stepen komplementarnosti između probe i targeta da bi se dogodilo formiranje dupleks formacije. Stepen "stringencv" može se kontrolisati jednim ili više parametrom, temperaturom, jonskom jačinom, pH i prisustvom delimično denaturisanim rastvaračem kao što je formamid. Na primer "stringencv" (strogost) hibridizacije se zgodno menja promenom polariteta rastvora raktanta (reactant solution), kroz na primer manipulaciju koncentracije formamida u opsegu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identitet sekvence) koji je potreban za vezivanje koje se može detektovati variraće u skladu sa "stringencv" hibridizacionog medijuma i/ili medijuma za ispiranje. Stepen komplementarnosti bi bio optimalan 100%, ili 70-100%, ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru ove. Međutim treba da se razume da male varijacije u sekvenci probe i prajmera mogu se kompenzovati redukcijom "stringencv" medijuma za hibridizaciju i/ili ispiranje.

Metode za umnožavanje RNK ili DNK su dobro poznate u ovoj oblasti i mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska bez preteranog eksperimentisanja, bazirane na učenjima i vodstvu koje je ovde predstavljeno.

Poznate metode DNK ili RNK umnožavanja uključuju ali nisu njima limitirana, reakciju lančane polimeraze (PCR- Polimerase Chain Reaction) i srodni proceci amplifikacije (npr.., U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, za mullis et al,; 4,795,699 i 5,921,794 za Tabor, et al,; 5,142,033, za Innis; 5,122,464 za Wilson et al,; 5,091,310 za Innis; 5.066,584 za Gvllensten, et al,; 4.889,818 za Gelfand et al,; 4.994,370 za Silver et al; 4,766,067 za Bisvvas; 4,656,134 za Ringold) i RNK posredovana amplifikacija koja upoterbljava anti-sense RNK za ciljnu sekvencu kao matrica za sintezu dvolančane dNK (U.S. Patent No. 5,130,238 za Malek et al sa zaštićenom markom, imenom NASBA), (Videti, npr., Ausubel, supra; ili Sambrook, supra).

Na primer, tehnika lančane reakcije polimeraze (PCR) može da se iskoristi za umnožavanje polinukleotidnih sekvenci iz ovog pronalaska i srodnih gena direktno iz cDNK ili genomskih biblioteka. PCR i drugein vitrometode za umnožavanje mogu takođe biti od koristi na primer, za kloniranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine koji treba da se eksprimiraju, za stvaranje nukleinskih kiselina koje će služiti kao probe za detekciju prisustva željene iRNK u uzorku, za sekvenciranje nukleinskih kiselina, i druge potrebe. Primeri tehnika koje su dovoljne da usmere obučene ljude iz ove oblasti kroz metode amltfikacije mogu se naći u Berger, supra, Sambrook, supra i Ausubel, supra, kao i Mullis te al., U.S Patent No 4,683,202 (1987); i Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Komercijalno dostupni kitovi za genomsko PCR umnožavanje poznati su u ovoj oblasti, videti, npr., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Dodatno, npr., T4gen 32 protein (Boehringer Manheim) može se koristiti da bi se poboljšao prinos dugih PCR proizvoda.

Sintetičke metode za konstruisanje nukleinskih kiselina

Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se takođe pripremiti direktnom hemijskom sintezom pomoću poznatih metoda (videti, npr., Ausubel, et al., supra). Hemijskom sintezom se generalno proizvodi jednolančani oligonukleotid, koji se može prevesti u dvolančanu DNK hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom, ili polimerizacijomsa DNK polimerazom koja koristi kao matricu pojedinačan lanac. Neko iz ove oblasti shvatiće daje hemijska sinteza DNK ograničena na sekvence od oko 100 ili više baza, dok se duže sekvence mogu dobiti ligacijom kraćih sekvenci.

Rekombinantne ekspresione kasete

Dalje ovaj pronalazak obezbeđuje rekombinantne ekspresione kasete koje obuhvataju nukleinske kiseline iz ovog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, na primer cDNK ili genomske sekvence koje kodiraju antitelo iz ovog pronalaska, mogu se koristiti za konstruisanje rekombinacionih ekspresionih kaseta koje se mogu ubaciti u makar jednog željenog domaćina. Rekombinaciona ekspresiona kaseta tipično sadrži polinukleotid iz ovog pronalaska operativno povezanog sa regulatornim sekvencama inicijacije transkripcije koje će diktirati transkripciju polinukleotida u željenoj ćeliji domaćinu. Oba promotora, i heterologi i nehetorologi (i.e. endogeni) mogu se upotrebiti za usmeravanje ekspresije nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.

U nekim ostvarenjima, izolovane nukleinske kiseline služe kao promotor, enhancer (pojačivač) ili neki drugi elementi, mogu se ubaciti na odgovarajućr mesto (uzvodno, nizvodno ili u intron) neheterologe forme polinukleotida iz ovog pronalaska tako da "up" ili "down" regulišu (pojačavaju ili smanjuju) ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska, na primer, endogeni promotori mogu se promenitiin vivoiliin vitromutacijom, delecijom i/ili substitucijom.

Vektori i ćelije domaćini

Ovaj pronalazak takođe se odnosi na vektore koji uključuju izlovane molekule nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska, ćelije domaćine koji su stvorene genetičkim inžeinjerstvom sa rekombinantnim vektorima, i na proizvodnju makar jednog anti -IL-12 antitela rekombinantnim tehnikama, što je poznato u ovoj oblasti. Videti npr., Sambrook, et al., supra; Ausubel, et al., supra.

Polinukleotidi mogu opcionalno spojeni sa vektorom koji sadrži selektivni marker za propagaciju u domaćinu. Generalno, plazmidni vektor se unosi u precipitat, kao što je precipitat kalcijum fosfata, ili u kopmleksu sa naelektrisanim lipidom. Ako je vektor virus, može se upakovatiin vitropomoću odgovarajuće ćelije za pakovanje i zatim se procesom transdukcije ubaciti u ćelije domaćine.

Ubačen deo DNK trebalo bi biti operativno povezano sa odgovarajućim promotorom. Ekspresioni konstrukti dalje sadrže mesta za inicijaciju transkripcije, terminacije, i region koji se prepisuje (trenskribuje), mesto za vezivanje ribozoma u procesu translacije. Kodirajući deo zrelog transkripta koji se eksprimira od strane konstrukata uključiće (poželjno je) na početku mesto za inicijaciju translacij i terminacioni kodon (npr., UAA, UAG ili UGA), pozicioniran na odgovarajućem mestu na kraju iRNK koja se prevodi, poželjno sa UAA i UAG za sisarsku ili eukariotsku ekspresiju.

Biće poželjno ali opcionalno da ekspresioni vektori sadrže makar jedan selektivni marker. Ovakvi markeri uključuju rezistenciju na, npr., ali nisu limitirani samo na njih, metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, U.S. Patent Nos. 4,399,216, 4,634,665, 4,656,134, 4,956,288, 5,149,636; 5,179,017, ampicilin, neomicin (G418), mikofenolna kiselina, ili glutamin sintetaza (GS, UP,Pat.Nos. 5,122,464, 5,770,359; 5,827,739) za kulture eukariotskih ćelija, i gene za rezistenciju na tetraciklin ili ampicilinza gajenjeE. colii drugih bakterija ili prokariota. Odgovarajući medijumi za gajenje i uslovi za gore opisane ćelije domaćine poznati su u ovoj oblasti nauke. Pogodni vektori biće već očigledni onima koji se bave ovom oblašću. Na ubacivanje vektorskog konstrukta u ćeliju domaćina može se uticati sa kalcijum fosfatnom transfekcijom, DEAE-dekstran posredovanom transfekcijom, katjonsko lilidno posredovanom transfekcijom, elektroporacijom, transdukcijom infekcijom ili drugim poznatim metodama. Ove metode su opisane u ovoj oblasti kao kod Sambrook, supra, Poglavlja 1-4 i 16-18; Ausubel, supra, Poglavlja 1,9, 13, 15, 16.

Najmanje jedno antitelo iz ovog pronalaska može se eksprimirati u modifikovanoj fm i, kao fuzioni protein, i može uključiti ne samo sekrecione signale, već i dodatne heterologe funkcionalne regione. Na primer, region sa dodatnim amino kiselinama, pogotovu onih sa naelektrisanjem, može se dodati na N-terminus antitela da bi se poboljšala stabilnost i otpornost u ćeliji domaćinu, tokom prčišćavanja, ili tokom kasnijih faza manipulacija i skladištenja. Takođe, peptidne polovine (moieties) mogu se dodati antitelu iz ovog pronalaska da bi se olakšalo prečišćavanje. Ovakvi regioni mogu se ukloniti pre finalne pripreme antitela ili makar njihovi delovi. Ovakve metode su opisane u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima kao kod Sambrook, supra. Poglavlja 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, supra, Poglavlja 16, 17, i 18.

Oni koji se bave osnovnim problemima u ovoj oblasti su upućeni u ekspresione sisteme koji su dostupni, za ekspresiju nukleinsku kiselinu koja kodira protein, iz ovog pronalaska.

Alternativno nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati u ćeliji domaćinu pretvaranjem (manipulacijom) u ćeliji domaćinu koja sadrži endogenu DNK koja kodira antitelo iz ovog pronalasku. Ovakve metode su poznate u ovoj oblasti, npr., kao što su opisane u US Patent Nos. 5,580,734, 5,641,670, 5,733,746 i 5,733,761.

Sisarske ćelije predstavljaju ilustraciju ćelijskih kultura koje su korisne za proizvodnju antitela, njihovih specificiranih delova ili varijanti. Sisarski ćelijski sestemi često će biti u formi "monolavers" tj. ćelija koje su rasporođene u jednom sloju, ali mogu se koristiti i suspenzije ćelija ili bioreaktori. Veliki broj pogodnih domaćinskih ćelijskih linija koje su sposobne da eksprimiraju intaktne glikozilovane proteine razvijeno je u ovoj oblasti, i uključuje COS-1 (npr., ATCC CRL 1650), COS-7 (npr., ATCC CRL1651), HEK293, BHK21 (npr., ATCC CRL -10), CHO (npr., ATCC CRL 1610), I BSC-1 (npr, ATCC CRL -26) ćelijske linije, cos-7 ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćelije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, 293 ćelije, HeLa ćelije i slične, koje su već dostupne i mogu se nabaviti od na primer, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.attc.org). Poželjne domaćinske ćelijske linije uključuju one koje vode poreklo iz limfnih organa kao ćelije mieloma ili limfoma. Poželjnije domaćinske ćelijske linije su P3X63Ag8.653 ćelije (ATTC Acession number CRL-1580) i SP2/0-Agl4 (ATTC Acession number CRL-1851).U naročito poželjnijem ostvarenju rekombinantna ćelija je P3X63Ag8.653 ćelija ili SP2/0-Agl4 ćelija.

Ekspresioni vektori za ove ćelije uključuju jednu ili više od sledećih kontrolnih sekvenci, kao što je, ali nisu limitirqane na "origin" replikacije; promotor (npr, kasne ili rane SV40 promotore, CMV promotor (US. Patent Nos. 5,168,062; 5,385,839), HSv tk promotor, pgk (fosfoglicerat kinaza) promotor, EF-1 alfa promotor (US. Patent No. 5,266,491), makar jedan humani imunoglobulinski promotor; enhancer, i/iliinformativna mesta za obradu (processing information sites), kao mesto vezivanja ribozoma, mesta "splajsovanja" RNK, poliadenilovana mesta (npr, SV40 velika T Ag poli A dodatno mesto - large T Ag poly A adition site), i sekvence za terminaciju transkripcije. Videti, npr, Ausubelet al, supra; ili Sambrook et al, supra. Druge ćelije koje se mogu koristiti za proizvodnju nukleinskih kiselina ili proteina iz ovog pronalaskatakođe su poznate i/ili dostupne, kao na primer, kod American Tyoe Collection catalogue of cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ili nekog drugog poznatog izvora.

Kada se upotrebljavaju eukariotske domaćinske ćelije, karakteristično je da se u vektor ubacuju sekvence za poliadenilaciju ili terminaciju. Primer za ssekvencu za terminaciju je poliadenilatna sekvenca iz goveđeg gena za hormon rasta, takođe se mogu uključiti i sekvence za tačno "splajsovanje" transkripta. Primer za sekvencu za splajsovanje je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781

(1983)). Dodatno genske sekvence za kontrolu replikacije u ćeliji domaćinu takođe se mogu ugraditi u vektor, kao stoje poznato u ovoj oblasti.

Prečišćavanje antitela

Anti-IL-12 antitelo može se izdvojiti i prečistiti iz kultura rekombinantnih ćelija poznatim metodama, uključujući, ali ne njima limitiran, prečišćavanje proteinom A, precipitacija amnijum sulfatom ili etanolom, kiselinska ekstrakcija, hromatografija izmenom anjona i katjona, fosfocelulozna hromatograflja, hromatografija pomoću hidrofobne interakcije, afinitativna hromatografija, hidroksilapatit hromatografija i lecitinska hromatografija. High performance liquid chromatographv (HPLC) (tečna hromatografija visoke performanse), može se takođe upotrebiti. Videti, npr, Colligan Current Protocols in Immunologv, ili Current Protocols in Protein Science, John Wiley& Sons, NY, NY (1997-2000), npr. Poglavlja 1, 4, 6, 8, 9, 10.

Antitela iz ovog pronalaska obuhvataju prirodno prečišćene proizvode, proizvode dobijene hemijskim sintetičkim procedurama, i proizvode dobijene rekombinantnim tehnikama iz eukariotskog domaćina, uključujući, na primer ćelije kvasca, viših biljaka, insekata i sisara. U zavisnosti koji se domaćin koristi u procedurama rekombinantne proizvodnje, antitelo iz ovog pronalaska može biti glikozilovano ili može biti neglikozilovano, ali je glikozilovano poželjnije. Ovakve metode opisane su u mnogim laboratorijskim priručnicima, ka Sambrook, supra, odeljci 17.37-17.42; Ausubel, supra, poglavlja 10, 12, 13, 16, 18 i 20, Colligan, Protein Science, supra, poglavlja 12-14.

Anti-IL-12 antitela

Izolovana antitela iz ovog pronalaska sadrže amino kiselinske sekvence antitela otkrivene ovde koje su kodirane pogodnim polinukleotidom ili bilo kojim izolovanim ili pripremljenim antitelom. Poželjno je da humano antitelo, da vezuje humani IL-12, i tako delimično ili u potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost proteina. Antitelo, koji delimično ili poželjnije u potpunosti neutrališe makar jednu biološku aktivnost makar jednog IL-12 proteina ili njegovog fragmenta, može da vezuje protein ili fragment i tako inhibira aktivnosti posredovane kroz vezivanje IL-12 za receptor za IL-12 ili kroz druge IL-12-zavisne ili posredovane mehanizme. Ovde upotrebljen izraz "neutrališuće antitelo" odnosi se na antitelo koje može da inhibira bilo koju IL-12 zavisnu aktivnost za oko 20-120%, poželjno za oko 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ili više u zavisnosti od testa. Kapacitet anti-IL-12 antitela da inhibira IL-12 zavisnu aktivnost poželjno je da se proceni makar jednim IL-12 protein ili receptor testom kao što je ovde opisano i/ilije poznato u ovoj oblasti. Humano antitelo iz ovog pronalaska može pripadati bilo kojoj klasi (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, itd) ili izotop i može da sadrži kappa ili lambda laki lanac. U jednom ostvarenju, humano antitelo sadrži IgG teški lanac ili njegov definisan deo, na primer, makar jedan od izotipova, IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4. Antitela ovog tipa mogu se pripremiti upotrebom transgenog miša ili drugog transgenog ne-humanog sisara koje sadrži makar jedan humani transgeni lak lanac (npr, IgG, IgA i IgM (npr, yl, y2, y3, y4)) kao što je ovde opisano i/ili poznato u ovoj oblasti. U drugom ostvarenju anti-human IL-12 humano antitelo sadrži IgGl teški lanac i IgGl laki lanac.

Makar se jedno antitelo iz ovog pronalaska vezuje za makar jedan specificiran epitop koji je specifičan za makar jedan IL-12 protein, njegovu subjedinicu fragment, deo ili bilo koju kombinaciju istih. Makar jedan epitop može da sadržimakar jedan region za vezivanje antitela koji sadrži makar jedan deo pomenutog proteina, poželjno je de taj epitop sadrži makar jedan ekstracelularan, solubilan, hidrofilan, eksterni ili citoplazmatski deo pomenutog proteina, makar jedan specificirani epitop može da sadrži bilo koju kombinaciju makar jedne amino kiselinske sekvence od najmanje 1-3 amino kiseline os sveukupnog specificiranog dela susednih amino kiselina od SEQ ID NOS: 9, 16 ili 17.

Antitelo prema ovom pronalasku je definisano prema zahtevu 3. Ovakva antitela mogu se pripremiti hemijskim pripajanjem različitih delova (npr, CDR-a, framevvork) antitela pomoću konvencionalnih tehnika pripremom i ekspresijom (jednog ili više) molekula anuklinskih kiselina koje kodiraju antitelo pomoću konvencionalnih tehnika rekombinantne DNK tehnologije ili pomoću bilo koje druge odgovarajuće metode.

Anti-IL-12 antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca, koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOS:7 i/ili varijabilnih region lakog lanca, koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOS:8. Antitela koja se vezuju za humani IL-12 i koji obuhvataju definisan varijabilnih region teškog lanca ili lakog lancamogu se pripremiti odgovarajućim metodama, kao što je izlaganje faga (phage displav) (Katsube, Y, et al, Int. J. Mol. Med, l(5):863-868 (1998)) ili pomoću metoda sa transgenim životinjama kao one poznate u ovoj oblasti i/ili koje su ovde opisane. Na primer transgeni miš, koji sadrži funkcionalno rearanžiran transgen za težak lanac humanog imunoglobulina i transgen koji sadrži DNK iz humanog imunoglobulinskog lokusa za lak lanac koji može podvrći funkcionalnom rearanžiranju, može biti imunizovan sa humanim IL-12 ili njegovim fragmentom da bi se izivala produkcija antitela. Ako je potrebno ćelije koje proizvode antitela mogu se izolovati i hibridome ili druge besmrtne ćelije koje proizvode antitela mogu se pripremiti kao što je ovde opisano iOili kao što je poznato u ovoj oblasti. Alternativno, antitelo, specificiran deo ili varijanta mogu se eksprimirati pomoću nukleinske kiseline ili njenog dela u pogodnoj domaćinskoj ćeliji.

Konzervativne substitucije amino kiselina odnose se na zamenu prve amino kiseline drugom amino kiselinom koja poseduje hemijske i/ili fizičke osobine (npr, šarža, struktura, polaritet, hidrofobnost/hidrofilnost) slične onima koje poseduje prva amino kiselina. Konzervativne substitucije uključuju zamenu jedne amino kiseline sa drugom u okviru sledećih grupa: lizin (K), arginin (R) i histidin (H); aspartat (D) i glutamat (E); asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), K, R, H, D i E; alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (P), triptofan (W), metionin (M), cistein (C) i glicin (G); F, W i Y; C, S i T.

Amino kiselinski kodovi

Amino kiseline koje ulaze u satav anti-IL-12 antitela iz ovog pronalaska se često predstavljaju skraćenicama. Označavanje amino kiselina može biti usmereno ka tome da se svaka amino kiselini predstavi kodom od jednog slova, tri slova, imenom, ili kodonom(ima) od tri nukleotida kao što se radi u ovoj oblasti (see Alberts, B, et al, Molecular Biologv of The Cell, Third Ed, Garland Publishing, Ine, New York, 1994)

Anti-IL-12 antitelo iz ovog pronalaska može da uključi jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija, ili usled prirodnih mutacija ili zbog čovekove manipulacije, kao što je ovde specificirano.

Naravno, obučena osoba učiniće da broj amino kiselinskih substitucija zavisi od mnogih faktora, uključujući gore opisane. Uopšteno govoreći broj amino kiselinskih substitucija, insercija ili delecija za bilo koje dato anti-IL-12 antitelo neće biti veće od 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, kao 1-30 ili bilo koji opseg u okviru tih vrednosti kao što je ovde specificirano.

Amino kiseline iz anti-IL-12 antitela iz ovog pronalaska, koje su esencijalne za njegovo funkcionisanje, mogu se identifikovati metodama koje su poznate u ovoj oblasti, kao što je "site directed" mutageneza ili 2alanine-scanning" mutageneza (npr, Ausubel, supra, Poglavlje 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Na osnovu druge procedure uvode se pojedinačne alaninske mutacije na svakom ostatku molekula. Mutantni molekuli koji se dobiju, zatim im se testiraju biološke aktivnosti, kao na primer ali nisu njime limitirane, neutrališuća aktivnost IL-12. Mesta koja su kritična za vezivanje antitela mogu se takođe identifikovati strukturnom analizom kao kristalizacijom, nukleaernom magnetnom rezonancom ili fotoafinitativnim obeležavanjem (Smith, et al, J. Mol Biol. 224:899-904 (1992) i de Vos et al, Science 255:306-312 (1992)).

Oni iz ove oblasti ceniće što ovaj pronalazak uključuje makar jedno biološki aktivno antitelo iz ovog pronalaska. Biološki aktivna antitela imaju specifičnu aktivnost od 20%, 30%, ili 40%, poželjno je 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije 80%, 90%, ili 95%-1000% od nativnog i (ne-sintetičkog), endogenog ili srodnog i poznatog antitela. Metodi testa i kavantifikovanje rezultata enzimatske aktivnostii substratne specifičnosti, poznate su onima koji se bave ovom oblašću.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na humana antitela, kao što je ovde opisano, koja se modifikovana tako što je kovalentnim vezivanjem dodata organska polovina. Ovakve modifikacije modu proizvesti antitelo sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama (npr, produženin vivopoluživot seruma). Organska polovina (deo) može biti linearna ili razgranata hidrofilna polimerna grupa, masno kiselinska grupa, ili masno kiselinska estarska grupa. U posebnom ostvarenju, hidrofilna polimerna grupa može imati molekulsku težinu od 800 do oko 120,000 Daltona i može biti polialkan glikol, (npr, polietilen glikol (PEG)), polipropilen glikol (PPG), karbohidratni polimer, amino kiselinski polimer ili polivinilni pirolidon, i masna kiselina ili estar masne kiseline množe obuhvatiti od osam do oko četrdeset atoma ugljenika.

Modifikovana humana antitela iz ovog pronalska mogu da sadrže jedan ili više organskih delova koji su kovalentno vezani, direktno ili indirektno, za antitelo. Svaki organski deo koji je vezan za antitelo prema ovom pronalasku može nezavisno biti hidrofilna polimerna grupa, grupa masne kiseline, ili estarska grupa masne kiseline. Kao što se ovde koristi izraz "masna kiselina" obuhvata monokarboksilne kiseline i dikarboksilne kiseline. "Hidrofilna polimerna grupa", izraz koji se ovde koristi, odnosi se na organski polimer koji je bolje rastvorljiv u vodi nego u oktanu. Tako antitelo modifikovano kovalentnim vezivanjem polizina je obuhvaćeno ovim pronalaskom. Hidrofilni polimeri pogodni za modifikovanjc antitela ovog pronalaska mogu biti linrarni ili razgranati, i oduhvataju na primer, polialkan glikole (npr, PEG, monometoksi-polietilen glikol (mPEG), PPG i slične), ugljene hidrate (npr, dekstran, celuloza, oligosaharidi, polipropilen oksid i slični) i polivinil pirolidin. Poželjno je da hidrofilni polimer koji modifikuje antitelo iz ovog pronalaska ima molekulsku težinu od oko 800 do oko 150,000 Daltona kao odvojen molekularni entitet. Može se koristiti na primer PEG500oi, PEG2o,ooo, naznačeno time da je zbir (subscript) prosečna molekularna težine polimera u daltonima. Hidrofilna polimerna grupa može se zameniti sa jednom ili oko šest alkil grupa, grupa masnih kiselina ili grupa estara masnih kiselina. Hidrofilni polimeri koji su subtituisani sa grupama masnih kiselina ili estarskim grupama mogu se pripremiti pomoću odgovarajućih metoda. Na primer, polimer koji sadrži amino grupu može se povezatisa karboksilatom masne kiseline ili estra masne kiseline, i aktiviran karboksilat (npr, aktiviran sa N,N-karbonil diimidazolom) iz masne kiseline ili estra masne kiseline može se povezati hidroksilnom grupom na polimeru.

Masne kiseline ili estri masnih kiselina koji su pogodni za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska mogu biti saturisani ili sadrže jednu ili viže jedinica nesturacije. Masne kiseline koje su pogodne za modifikovanje antitela iz ovog pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (C,2, laurat), n-tetradekanoat (C,4, arahidat), n-oktadekanoat (CiS, stearat), n-eikosanoat (C20, arahidat), n-dokosanoat (C22, behenat), n-triakontanoat (C30), n-tetrakontanoat (C40), c«-A9-oktadekanoat (Cis, oleat), svi cis-A5,8,l 1,14-eikosatetraenoat (C20, arahidonat), oktandioična kiselina, tetradekandioična kiselina, oktadekandioična kiselina, dokosandioična kiselina, i slične. Pogodni estri masnih kiselina uključuju mono-estre dikarboksilnih kiselina koje sadrže linearnu ili granajuću nižu alkil grupu, niža alkil grupa može da obuhvati od jedan do oko dvanaest, poželjno je jedan do oko šest atoma ugljenika.

Modifikovana humana antitela mogu se pripremiti pogodnom metodom, kao što je reakcija sa jednim ili više modifikujućih agensa. "Modifikujući agens", izraz koji se koristi ovde, odnosi se na pogodnu organsku grupu (npr, hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline) koja sadrži aktivirajuću grupu. "Aktivirajuća grupa" je hemijski deo ili funkcionalna grupa koja može pod odgovarajućim uslovima, može da reaguje sa drugom hemijskom grupom i tako formira kovalentnu vezu između modifikujućeg agensa i druge hemijske grupe. Na primer, amin reaktivne aktivirajuće grupe uključuju elektrofilne grupe kao što su tozilat, mezilat, halo (hloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroksisukcinimidil estri (NHS) i slični. Aktivirajuće grupe koje mogu reagovati sa tiolima, uključuju, na primer, maleimid, jodoacetil, akrilolil, piridil disulfide, tiol 5-tiol-nitrobenzoične kiseline (TNB-tiol), i slični. Aldehidna funkcionalna grupa može se povezati sa molekulima koji sadrže amin- ili hidrazid, i azidna grupa može da reaguje sa trovalentnom fosforskom grupom i dobija se fosforamidatna ili fosforimidna povezivanja. Pogodne metode za ubacivanje aktivirajućih grupa u molekule poznati su u ovoj oblasti (videti na primer, Hermanson, G. T, Bioconjugate Tchniques, Academic Press; san Diego, CA (1996)). Aktivirajuća grupa može direktno biti vezana za organsku grupu (npr, hidrofilni polimer, masna kiselina, estar masne kiseline), ili preko linkerskog dela, na primer dvovalentne Ci-C,2grupe, naznačeno time da se jedan ili više atoma ugljenika mogu zameniti heteroatomom kao što je, kiseonik, azot ili sumpor. Pogodan linkerski deo uključuje na primer, tetraetilen glikol , -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH i - CH2-0-CH2-CHrO-CH2-CH2-0-CH2-NH-. Modifikujući agensi koji sadrže linkerski deo mogu se proizvesti, na primer, reakcijom mono-Boc-alkildiamina (npr, mono-Boc-etilenđiamin, mono-Boc-diaminoheksan) sa masnom kiselinom u prisustvu l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) da bi se formirala amidna veza između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boe zaštitna grupa može se ukloniti iz produkta tretiranjem sa trifluoracetilnom kiselinom (TFA) da bi se otkrio primarni amin koji se može povezati sa drugim karboksilatom kao stoje opisano, ili može da reaguje sa maleičnim anhidridom i dobijeni proizvod je preveden u cikličan oblik (cvelized) da bi se dobio aktiviran malemido derivat masne kiseline. (Videti za primer, Thompson, et al, WO 92/16221).

Modifikovana antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti reakcijom humanog antitela sa modifikujućim agensom. Na primer organski delovi mogu se vezati za antitelo na "non- site" specifični način upotrebom amin-reaktivnog modifikujućeg agensa, na primer, NHS estar ili PEG. Modifikovana humana antitela mogu se takođe pripremiti redukujući disulfidne veze (npr, disulfidne veze između lanaca) antitela. Redukovano antitelo može reagovati sa tiol-reaktivnim modifikujućim agensom da bi se proizvelo modifikovano antitelo iz ovog pronalaska. Modifikovana humana antitela koja sadrže organski deo koji je vezan za specifično mesto na antitelu iz ovog pronalaska mogu se pripremiti uz pomoć pogodnih metoda, kao što je reverzna proteoliza (Fisch et al, Bioconjugate Chem. 3:147-153 (1992; Werlen et al, Bioconjugate Chem. 5:411-417 (1994); Kumaran et al. Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al, Bioorg. Chem, 24(l):59-68

(1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng, 56(4):456-463(1997)), i metode opisane u Hermanson, G. T, Bioconjugate Tehniques, Academic Press:San Diego, CA (1996).

ANTI-IDIOTIPSKA ANTITELA NA KOMPOZICIJE PROTEINA IZVEDENIH IZ ANTI-IL-12 IG

Pored monoklonalnih ili himernih anti-IL-12 antitela, ovde je takođe opisano anti-idiotipsko (anti-Id) antitelo koje je specifično za takva antitela iz pronalaska. Anti-Id antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje su generalno povezane sa regionom za vezivanje antigena drugog antitela. Anti-Id se može pripremiti imunizacijom životinje iste vrste i genetičkog tipa (npr, misija linija) kao što je i izvor Id antitela sa antitelom ili njegovim regionom koji sadrži CDR. Imunizovana životinja će prepoznati i odgovoriti na idiotipske determinante imunizujućeg antitela i proizvoditi anti-Id antitelo. Anti-Id antitelo može se takođe upotrebiti kao "imunogen" za indukciju imunog odgovora u nekoj drugoj životinji, i tako će se proizvesti takozvano anti-anti-Id antitelo.

KOMPOZICIJE PROTEINA IZVEDENIH IZ ANTI-IL-12 IG

Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje makar jedan sastav anti-IL-12 antitela koji sadrži makar jedno, makar dva, makar tri, makar četiri, makar pet, makar šest ili više anti-IL-12 anitela od njih, kao stoje opisano ovde, i/ili poznato u ovoj oblasti, koja su obezbeđena u kompoziciji, mešavini ili formi koja se ne pojavljuje u prirodi.

Kompozicije iz ovog pronalaska anti-IL-12 antitela dalje mogu da obuhvate makar jednu od pogodnih i efektivnih količina makar jednog TNF antagonista (npr, ali bez limitacije na TNF antitelo ili fragment, solubilan TNF receptor ili fragment, njegov fuzioni protein, ili mali molekul TNF antagonista), antireumatika (npr, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatioprin, etanercept, zlato natrijum tiomaiat, hidroksihiorokin sulfat, leflunomid, sulfasalzin), mišićnog relaksanta, narkotika, ne steroidnog anti-inflaminatornog leka (NSAID), analgezika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromišićnog blokatora, antimikrobialnog (npr, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (npr, epoetin alfa), "filgastrim" (npr, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (ežg, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitoraza leukotriena, metilksantina, kromolinaepinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokina ili citokin antagonista ili antitela. Nelimitirajući primeri ovakvih citokina uključuju ali nisu njima limitirani, bilo koji IL-1, 1L-23, IL-6, anti tumorska antitela, hemoterapeutske agense, ili radiacione terapije. Pogodne doze su poznate u ovoj oblasti. Videti, npr, Wells et al, eds, Pharmacotherapv handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000) ; PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia (2000), Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

Ovakve anti-kancerogene ili anti-infektivne mogu uključiti molekule toksina koji su povezani, vezani, ko-formulisani, zajedno se daju, sa makar jednim antitelom iz ovog pronalaska. Toksin opcionalno može da selektivno ubije patološku ćeliju ili tkivo. Ovakvi toksini mogu biti ali nisu njima limitirani, prečišćeni ili rekombinantni toksini ili njihovi fragmenti koji sadrže makar jedan citotoksični domen toksina, npr, selektovan od jednog od sledećih: toksin ricina, difterije, "venom" (iz zmije, pauka, škorpije i sličnih životinja) toksin, ili bakterijski toksin. Izraz toksin takođe uključuje oba endotoksine i egzotoksine koje proizvodi bilo koja prirodna, mutantna ili rekombinantna bakterija ili virusi, koji mogu da izazovu bilo koje patološko stanje u čoveku ili drugim sisarima, uključujući toksinski šok, koji može da se završi smrću. Ovakvi toksini mogu da uključe, ali nisu njima limitirani, enterotoksikogeni toplptno osetljiv enterotoksinE. coli(LT), toplotno stabilan enterotoksin (ST), citotoksin izShigella,enterotoksini izAeromonas- a,toksin-1 toksičnog šok sindroma (TSST-1), stafilokokni enerotoksin A (SEA), B (SEB), ili C (SEC), streptokokni enterotoksini i slični. Ovakve bakterije uključuju, ali nisu njima limitirane, bakterijske sojeve vrsta enteroksigenskaE. coli(ETEC), enterohemoralgičnaE. coli(npr, sojevi serotipa 0157:H7),Staphyllococcusspecies (npr,Staphyllococcus aureus, Staphyllococcus pyogenes), Shigellaspecies ( npr,Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydiiiShigella sonnei), Salmonellaspecies (npr,Salmonellalyphi, Salmonella cholera- suis, Salmonella eneritidis), Clostridiumspecies (npr,Closlridium perfringes, dificile, Clostridium botulinum), Camphlobacterspecies (npr,Camphlobacter• jejuni, Camphlobacter fetus), Helicobacterspecies (npr,Helicobacter pylori), Aeromonasspecies (npr,Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophylla, Aeromonas caviae), Pleisomonasshigelloides, Yersinia enterocolitica,Vibriosspecies (npr, Vibrios cholerae,Vibrios parachemolyticus), Klebsiellaspecies,Pseudomonas aeruginosa,iStreptococci.Videti npr, Stein, ed, INTERNAL MEDICINE, 3rd ed, pp 1-13, Little, Brown and Co, Boston

(1990); Evans et al, eds, Bacterial Infectious of Humans: Epidemiologv and Control, 2nd ed, pp 239-254, Plenum Medcal Book Co, New York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3rd Ed, Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow et al, eds, The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co, Rahvvav, NJ, 1992; Wood et al, FEMS Microbiologv Immunologv, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990).

Anti- IL-12 antitelo, tj njegova jedinjenja, sastav ili njihova kombinacija iz ovog pronalaska može dalje da sadrži makar jedan od pomoćnih delova kao što je, ali nije njime limitiran na razblaživač, onaj koji vezuje "binder", stabilizator, puferi, soli, liofilizovani rastvarači, prezervativi, adjuvant ili slični. Farmaceutski prihvatljivi pomoćnih tvari je poželjna. Nelimitirjući primeri i metode za pripremanje ovakvih sterilnih rastvora poznae su u ovoj oblasti, kao na primer, ali bez limitiranja, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sc iencee, 18th Edition, Mack publishing Co. (Easton, PA) 1990. Farmaceutski prihvatljivi nosači mogu se rutinski selektovani, koji su pogodni za načine administracije, solubilnost i/ili stabilnost kompozicija anti-IL-12 antitela kao što je poznato u ovoj oblasti ili je ovde opisano.

Farmacutski ekspicijeni i aditivi korisni za ovde opisanu kompoziciju uključujuu, bezi limitiranja, proteine, peptide, amino kiseline, lipide, i ugljene hidrate (npr, šećeri, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra- i oligosaharide; derivate šećera kaošto su alditoli, aldolne kiseline, esterifikovane šećere i slične; i polisaharide ili polimere šećera), koji mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji, sadržavajući sami ili u kombinaciji 1-99.99% po težini ili zapremini. Egzamplarni proteinski ekspicijenti uključuju serum albumin ka humani serum albumin (HSA), rekombinantni humani albumin (rHA), želatin, kazein, i slični. Reprezentativne komponente amino kiseline/antitela, koje takođe mogu funkcionisati u puferskom kapacitetu (buffer capacitv), uključuju alanin, glicin, arginin, betain, histidin, glutaminska kiselina, aspartanska kiselina, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam, i slične. Jedna amino kiselina koja je poželjna je glicin.

Ugljeno-hidratni ekspicijenti pogodni za upotrebu u ovom pronalasku uključuju, na primer, monosaharide kao fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza D-manoza, sorboza i slični; disaharide kao laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slične; polisaharide, kao rafinoza, melezitoza, maltodekstrini, dekstriani, škrobovi, i slični; i alditoli, kao manitol, ksilitol, maltitol, lacitol, ksilitol sorbitol (glucitol), mionozitol i slični. Poželjni ugljeno-hidratni ekspicijenti za upotrebu u ovom pronalasku su manitol, trehaloza i rafinoza.

Kompozicije anti-IL-12 antitela može takođe uključiti pufer ili pH agens; tipično pufer je so pripremljena iz organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi uključuju soli organskih kiselina kao soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, tartarne kiseline, sukcinilne kiseline, sirćetne kiseline, ili ptalične kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid ili fosfatni puferi. Poželjni puferi za upotrebu u ovoj kompoziciji su soli organskih kiselina kao na primer citrat.

Dodatno, kompozicije anti-IL-12 iz ovog pronalaska mogu uključiti polimerne ekspicijente /aditive kao polivinilpirolidoni, fikolo (polimerni šećer), dekstarti (npr, ciklodekstrini, kao 2-hidroksipropiI-p-ciklodekstrin), polietilen glikoli, agensi za ukus (flavoring agensi), antimikrobijalni agensi, zaslađivači, antioksidanti, antistatički agensi, "surfactans" (agensi koji kvas)(npr, polisorbati kao "TWEEN 20" i "TWEEN 80"), lipidi (npr, fosfolipidi, masne kiseline), steroidi (npr, holesterol), helti (npr, EDTA).

Ovi i drugi dodatni farmaceutski ekspicijeni i/ili aditivi pogodni za upotrebu za satav anti-IL-12 antitela, na osnovu pronalaska poznati su ovoj oblasti, npr, navedeno kao "Remington: Science & Practice of Pharmacv" 19th cd, Williams& Williams, (1995), i u "Phvsicianžs Desk reference", 52nd ed, Medical Economics, Montvale, NJ (1998).Poželjni nosači ili ekspicijentni materijali su ugljeni hidrati (npr, saharidi i alditoli) i puferi (npr, citratni) ili polimerni agensi.

Formulacije

Kao što je notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije, poželjno je fosfatni pufer sa fiziološkim rastvorom ili odabranom soli, kao i konzervirane rastvore koje sadrže konzervanse kao i višenamenske sačuvane formulacije pogodne za upotrebu u farmaciji ili veterini, koji se satoje od makar jednog anti-IL-12 antitela u formulaciji koja je farmaceutski prihvatljiva. Konzervirane formulacije sadrže makar jedan poznati konzervans ili opcionalno odabran iz grupe koja se satoji od makar jednog fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, fenilživinog nitrata, fenoksietanola, formaldehida, hlorobutanola, magnezijum hlorida (npr, heksahidrat), alkilparabena (metil, etil, propil, butil i slični), benzalkonijum hlorida, benzetonijum hlorida natrijum dehidroacetat i timerosala, ili njihove me.avine u vodenomrastvaraču. Bilo koja pogodna koncentracija ili mešavina može se upotrebiti kao što je poznato u ovoj oblasti, kao 0.001-5% ili bilo koji opseg ili vrednost u okviru toga, kao ali bez limitiranja, 0.001, 0.003, 0.005, 0.009, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9,2.0,2.1,2.2,2.3, 2.4, 2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, koji opseg ili vrednost u okviru toga. Nelimitirajući primeri uključuju, bez konzervansa, 0.1-2% m-krezol (npr, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), 0.1-3% benzil alkohol (npr, 0.5, 0.9, 1.1, 1.5, 1.9, 2.0, 2.5%), 0.001-0.5% timerosal (npr, 0.005, 0.01), 0.001-2% fenol (0.05. 0.25, 0.28, 0.5. 0.9, 1.0%(, 0.0005-1.0% alkilparabeni (npr, 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%) i slični.

Kao što je notirano u tekstu iznad, ovaj pronalazak obezbeđuje član proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje i makar jedne vajle koja sadrži rastvor makar jednog anti-IL-12 antitela sa preporučenim puferima i/ili prezervativima, opcionalno u vodenom rastvaraču, naznačeno time da pomenuti materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje na to da se ovakav rastvor može držati tokom perioda od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 sata ili duže.

Ovaj pronalazak dalje obuhvata član proizvođača, koji se sastoji od materijala za pakovanje, prve vajle koja sadrži liofilizovano makar jedno anti-IL-12 antitelo i drugu vajlu sa vodenim rastvaračem preporučenih pufera ili konzervansa, naznačeno time da materijal za pakovanje ima etiketu na kojoj se ukazuje pacijentu da rekonstituiše makar jedno anti-IL-12 antitelo u vodenom rastvaraču da bi se formirao rastvor koji se može držati tokom perioda od 24 časa ili duže.

Makar jedno anti-IL-12 antitelo upotrebljeno u skladu sa ovimpronalaskom, može se proizvesti rekombinantnim načinima, uključujući iz ćelija sisara ili pripremom trensgena, ili može biti pročišćeno iz nekog drugog biološkog izvora, kao što je ovde opisano ili poznato u ovoj oblasti.

Opseg makar jednog anti-IL-12 antitela u proizvodu iz ovog pronalaska uključuje količine dobijene po rekonstituciji, u vlažno/suvo sistemu, koncentracije od oko 1.0 ug/ml do oko 1000 mg/ml, iako se može raditi i sa nižim i višim koncentracijama koje zavise od vozila za dostavu sa kojim se namerava da radi, npr, formulacije rastvora će se razlikovati kod transdermalnih flastera, pulmonarnog, transmukoznog ili osmotskog ili metoda mikro pumpe.

Poželjno je da, opcionalno vodeni rastvarač dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. Poželjni konzervansi uključuju one selektovane iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propil, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije. Koncentracija konzervansa upotreblejnih u formulaciji je koncentracija dovoljna da dovede do anti-mikrobijalnog efekta. Ovakve koncentracije zavise od konzervansa koji je sclektovan i već su određene od strane obučenih u ovoj oblasti.

Drugi ekscipijenti, npr, izotonični agensi, puferi, antioksidanti, enhanceri konzervansa, mogu se opcionalno, a i poželjno je, dodati rastvaraču. Izotonični agens, kao što je glicerin, Često se upotrebljava u poznatim koncentracijama. Fiziološki tolerantan pufer poželjno je dodati da bi se obezbedila bolja kontrola pH. Formulacije mogu pokriti širok opseg pH, kao od oko pH 4 do oko pH 10, i poželjnije opsege od oko pH 5 do oko pH 9, i najpoželjnije opseg od oko 6.0 do oko pH 8.0. Poželjno je da formulacije ovog pronalaska imaju pH između oko 6.8 do oko 7.8. Poželjni puferi uključuju fosfatne pufere, najpoželjnije natrijum fosfat, pogotovu fosfat puferovan u fiziološkom rastvoru (phosphate buffered saline

PBS).

Drugi aditivi, kao farmaceutski prihvatljivi rastvarači kao Tween20 (poliksietilen (20) sorbitan monolaurat), Tvveen 40 (poliksietilen (20) sorbitan monopalmitat, Tween 80 (poliksietilen (20) sorbitan monooelat), Pluronic F68 (polietilksilen polioksipropilen blok kopolimeri), i PEG (polietilen glikol) ili ili nejonski "surfactants" (površinski aktivni agensi) kao polisorbat 20 ili 80 ili poloksamer 184 ili 188, Pluronic<R>polis, drugi blok ko-polimeri, i helatori kao EDTA i EGTA, mogu se opcionalno dodati formulaciji ili kompoziciji da bi se smanjila agregacija. Aditivi su pogotovo korisni ako je pumpa ili plastični kontejner upotrebljen za administraciju formulacije. Prisustvo farmaceutski prihvatljivih "surfctant" ublažuje tendenciju proteina da agregira.

Formulacije iz ovog pronalaska mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-IL-12 antitela i konzervansa odabranog iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metil, etil, propil, butil, i slični), benzalkonium hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili njihove kombinacije u vodenom rastvoru. Mešanje makar jednog anti-IL-12 antitelo sa konzervansom u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodna formulacija, na primer, izmerena količina makar jednog anti-IL-12 antitela u rastvoru pufera se kombinuje sa željenim konzervansom u rastvoru pufera u količinama koje su dovoljne da obezbede željene koncentracije proteina i konzervansa. Varijacije u ovom procesu će prepoznati svako koje obučen u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.

Formulacije za koje je prijavljen patentni zahtev mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili dve vajle, od jedne vajlče liofilizovanog makar jednog anti-IL-12 antitela koji se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži vodu, konzervans i/ili ekscipijent, poželjno je fosfatni pufer i/ili slani rastvor i odabrana so, u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.

Predmeti koji se ovde prijavljuju od strane proizvodjača mogu se upotrebiti za administraciju od momentalnog do 24 časa ili dužeg perioda. Na osnovu toga ovde prijavljeni predmeti od strane proizvodjača pružaju značajne prednosti pacijentu. Formulacije ovog pronalaska mou se opcionalno bezbedno čuvati na temperaturama od oko 2 do 40°C i mogu zadržati biološku aktivnost proteina tokom produženog vremenskog perioda i tako omogućavajući obeležavanje paketa na kome se ukazuje da se rastvor može držati i/ili upotrebiti tokom perioda od 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ili 96 sati ili duže. Ako se upotrebljkava konzervisani rastvarač, ovakva nalepnica može uključiti upotrebu od 1 do 12 meseci, pola, jedne i po i/ili dve godine.

Rastvori makar jednog anti-IL-12 antitela mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog antitela u vodenom rastvaraču. Mešanje se vrši pomoću konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da bi s pripremio pogodan rastvarač, na primer, odmerena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu se kombinuje u količinama dovoljnim da se obezbedi željena koncentracija proteina i opcionalno konzervansa i pufera. Varijacije ovih procesa biće prepoznate od strane osobe obučene u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled po kome se komponente dodaju, da li se koriste dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se priprema formulacija, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i načine administracije koje se upotrebljavaju.

Prijavljeni proizvodi mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvori ili kao duple vajle koje se sastoje od vajle sa liofilizovanim makar jednim anti-IL-12 antitelom, koje se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži vodeni rastvarač. Čisti rastvori u ovom slučaju mogu biti veličine od jednog litra ili više, obezbeđujući veliki rezrevoar iz koga se mogu uzimati manje porcije makat jednog rastvora antitela, jedan ili više puta za transfer u manje vajle i tako kupce i/ili pacijente obezbediti od strane apoteka ili klinika.

Priznata sredstva koja obuhvataju sistem od jedne vajle uključuju ona "pen injector" naprave za dostavu rastvora kao što su BD Pens, BD Autojector<R>, Humaject<R>, NovoPen<R>, B-D<R>Pen, AutoPen<R>, i OptiPen<R>, GenotropinPen<R>, Genotronorm Pen<R>, HumatroPen<R>, Reco-Pen<R>, Roferon Pen<R>, Biojector<*>, iject<R>, J-tip Needle-Free Injector<R>, Intraject<R>, Medi-Ject, npr, napravljeni ili razvijeni od strane Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.becktondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject,Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston medical (Peterbourgh, UK, www.Weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com). Poznata sredstva koja sadrže sistem duple vajle uključuju one "pen-injector" sisteme za rekonstituciju liofilizovanog leka u pakovanju za dostavu rekonstituisanog rastvora kao stoje HumatroPen<R>.

Proizvodi koji se ovde prijavljuju uključuju matrijal za pakovanje. Materijal za pakovanje obezbeđuje, dodatno informaciji koja se zahteva od strane regulatornih agencija, uslov pod kojim se proizvod može koristiti. Materijal za pakovanje ovog pronalaska obezbeđuje uputstva pacijentu kako da rekonstituiše makar jedno anti-IL-12 antitelo u vodenom rastvaraču u cilju formiranja rastvora i potrebe da se rastvor iskoristi tokom perioda od 2 do 24 sata ili više za proizvod iz dve vajle, vlažno/suvo. Za pojedinačnu vajlu, proizvod koji je rastvor, nalepnica ukazuje da se ovakav rastvor može upotrebiti tokom perioda od 2 do 24 časa ili više. Ovde prijvljeni proizvodi su korisni za humanu upotrebu farmaceutičkih proizvoda.

Formulacije ovog proizvoda mogu se pripremiti procesom koji obuhvata mešanje makar jednog anti-IL-12 antitela i odabranog pufera, poželjno je fosfatnog pufera, fiziološkog rastvora ili odabrane soli. Mešanje mara jednog antitela i pufera u vodenom rastvaraču izvodi se pomoću konvencionalnih metoda rastvaranja i mešanja. Da bi se pripremila pogodna formulacija, na primer, odmerena količina makar jednog antitela u vodi ili puferu s kombinuje sa .cijenim puferskim agensom u vodi, u količinama dovoljnim da se obezbede željene koncentracije proteina i pufera. Varijacije ovog procesa biće prepoznate od osobe koja je obučena u ovoj oblasti nauke. Na primer, redosled komponenti koje se dodaju da li se upotrebljavaju dodatni aditivi, temperatura i pH na kojoj se formulacija priprema, sve su to faktori koji se mogu optimizovati za koncentraciju i način administracije koji je upotrebljen.

Prijavljene stabilne ili konzervirane formulacije mogu se obezbediti pacijentu kao čisti rastvor ili kao duple vajle koje obuhvataju jednu vajlu liofilizovanog makar jednog anti-IL-12 antitela koja se rekonstituiše sa drugom vajlom koja sadrži konzervans ili pufer i ekscipijent u vodenom rastvaraču. Vajla sa jedinstvenim rastvorom ili dve vajle koje zahtevaju rekonstituciju mogu se više puta koristiti i mogu zadovoljiti jedan ili viš ciklusa lečenja pacijenta i tako obezbediti bolju režim lečenja nego što je trenutno dostupan.

Makar jedno anti-IL-12 antitelo u stabilnoj ili konzervisanoj formulaciji ili rastvoru koji su ovde opisani može se dati pacijentu u skladu sa ovim pronalaskom preko različitih metoda dostave, uključujući SC ili IM injektiranje; transdermalno, pulmonarno, transmukozalno, kao impalnt, osmotska pumpa, kaseta, mikropumpa ili drugi načini koji korist obučeni u ovoj oblati kao i oni poznati u ovoj oblasti nauke.

Terapeutske primene

Antitelo ili kompozicija prema pronalasku mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne bolesti vezane za imunitet, u ćeilji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, bez limitiranja, makar jedan od reumatidnog artritisa, juvenilnog reumatidnog artritisa, sistemskog "onset" (uključivanja) juvenilnog reumatidnog artritis, psoijatični artritis, ankilozni spondilitis, čir na želudcu, seronegativnma artropatijeza, osteo artritis, infiaminatorna crevna bolest, ulcerativni kolitis, sistemski lupus eritromatozis, ntifosfolipidni sindrom, iridociklitis/uveistis/optički neuritis, idiopatska plućna fibroza, sistemski vaskulitis/Vegnerova granulomatoza, sarkoidoza, orhitis/reverzne procedure vazektomije, alergijske/atopijske bolesti, astma, alergijski rimitis, ekcema, alergijski kntaktni dermatitis, alergijski konjuktivitis, hipersenzitivni pneumonitis, transplanti, odbacivanje transplantiranog organa, presadjeno tkivo-versus-domaćin obolenje, sindrom sistemskog inflaminatornog odgovora, sindrom sepse, grampozitivna sepsa, gram negativna sepsa, kulturno negativna sepsa, gljivična sepsa, "neutropenic fewer", urosepsa, meningokokemija, trauma/krvarenje, opekotine, izlaganje jonizujućem zračenju, akutni pankreatitis, adultni respiratorni "distress" sindrom, reumatoidni artritis, alkoholom indukovan hepatitis, hronične inflaminatorne patologije, sarkoidoza, kronova patologija, srpasta anemija, dijabetes, nefroza, atopične bolesti, hipersenzitivne reakcije, alergijski rimitis, polenska groznica, perenialni rinitis, konjuktivitis, endometrioza, astma, urtikarija, sistemska anafalaksija, dermatitis, "perniciosus" anemija, hemolitička bolest, trombocitopenija, odbacivanje bilo ko presadjenog organa ili tkiva, odbacivanje presadjenog bubrega, odbacivanje presadjenog srca, odbacivanje presadjene jetre, odbacivanje presadjenog pankreasa, odbacivanje presadjenih pluća, odbacivanje presadjene kosne srži (BMT), odbacivanje kožnog "alograft"-a, odbacivanje presadjene hrskavice, odbacivanje kosnog grafita 9presađenog tkiva), odbacivanje presadjenog dvanaestopalačnog creva, odbacivanje fetalnog timus implanta. odbacivanje paratiroidnog transplanta, odbacivanje ksenografta bilo kog organa ili tkiva, odbacivanje alografta, anti-receptorna hipersenzitivna reakcija, Gravova bolest, Rejnudova bolest, insulin rezistentan dijabetes tipa B, astma, miastenija gravis, citotoksičnost posredovano antitelom, hipersenzitivne reakcije tipa 3, sistemski lupus eritematozus, POEMS sindrom (polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sinrdom promene kože), polineuropatija organomegalija, endokrinopaija, monoklonalna gamopatija, i sindrom promene kože, antifosfolipidni sindrom, "pemphigus", skleroderma, bolest pomešanog vezivnog tkiva, idiopatska Adisonova bolest, dijabetes mellitus, hronični aktivni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, vitiligo, vaskulitis, post-MI kardiotomni sindrom, hipersenzitivnost tipa IV, kontaktni dermatitis, hipersenzitivni pneumonitis, odbacivanje alografta, granulome usled intracelularnih organizama, senzitivnost na lek, metabolički/idiopatski, Vilsonova bolest, hemakromatozis, alfa-l-antitripsin deficijencija, dijabetska retinopatija, Hašimotov tiroiditis, osteoporoza, procena hipotalamične-hipofizne-adrenalne ose, primarna bilijarna ciroza, tiroiditis, encefalomialitis, kaheksija, cistična fibroza, neonatalna hronična bolest pluća, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD), familijarna hematofagocitična limfohistiocitoza, dermatološka stanja, psorijaza, alopecija, nefrotični sinđom, nefritis, glomerularni nefritis, akutni renalni prestanak rada, hemodijaliza, uremija, toksičnost, preeklamsija, okt3 terapija, anti-cd3 terapija, terapija citokininom, hemoterapija, radiaciona terapija (npr. uključujući, bez limitiranja, "toast hernija", anemija, kaheksija, i si.), hronična salicilna intoksikacija i slično. Videti, npr, The Macrck Manual, 12th-17th editions, Merck & Coampanv, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook. Wells et al, Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

Antitelo ili kompozicija mogu biti za modulaciju ili lečenje makar jedne kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu.

Antitelo ili kompozicija mogu biti davani pre, za vreme, i/ili posle, makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (npr, ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNF antagonist), antireumatika (npr, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialni (npr, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida. agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (npr, epoetin alfa), "filgastrim" (npr, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacija, imunoglobulina, imunosupresora, (npr, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozvme), citokin ili citokin antagonist.Videti, npr, Wells et al, eds, Pharmacotherapv Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000).

TNF antagonisti pogodni za ovaj pronalazak obuhvataju, ali nisu limitirana na njih, anti-TNF antitela, njihove fragmente za vezivanje antigena, i receptorne molekule koji se specifično vezuju za TNF; jedinjenja koja sprečavaju i/ili inhibiraju sintezu TNF-a, oslobađanje TNF-a ili njegovo delovanje na ciljne ćelije kao što su talidomid, tenidap, inhibitori fosfodiesteraza (npr, pentoksifilin i rolipam), agonisti A2b adenozinski receptora i enhanseri A2b adenozinski receptora; jedinjenja koja sprečacaju i/ili inhibiraju signalizaciju TNF receptora, kao inhibitori mitogen aktivirajućih protein kinaza (MAP) jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju TNF sečenje membrane, kao što su inhibitori metaloproteinaza; jedinjenja koja blokiraji i/ili inhibiraju aktivnost TNF-a, kao što su inhibitori enzima koji prevodi angiotenzin (ACE angiotensin converting enzvme) (npr, kaptopril); i jedinjenja koja blokiraju i/ili inhibiraju proizvodnju TNF-a i/ili njihovu sintezu, kao što su inhibitori MAP kinaze.

Kao što se ovde koristi "antitelo faktora nekroze tumora", "TNF antitelo", TNFa antitelo", ili njegov fragment i slično, smanjuje, blokira, ukida ili interferira sa TNFa aktivnošćuin vitro, in situi/ili poželjno jein vivo.Na primer pogodno TNF humano antitelo iz ovog pronalaska može da veže TNFa i uključuje anti-TNF antitela, njihovih fragmenata za vezivanje antigena, i specificirane mutante ili domene koji se vezuju specifično za TNFa. Pogodno TNF antitelo ili njegov fragment, može takođe da smanjuje, blokira, ukida ili interferira spreči i/ili inhibira sintezu TNF RNK, DNK ili proteina, oslobađanje TNF-a, signalizaciju TNF receptora, membransko TNF sečenje, aktivnost TNF-a, proizvodnju i/ili sintezu TNF-a.

Himerno antitelo cA2 sastoji se od antigen vezujućeg varijabilnog regiona mišijeg neutrališućeg visokoafinitativnog anti-humanog TNFa IgGl, označen kao A2, i konstantnog regiona humanog IgGl, kappa imunoglobulina. Humani IgGl Ec region poboljšava efektornu funkciju alogenog antitela, povećava polu život cirkulišućeg seruma i smanjuje imunogenost antitela. Aviditv i specifičnost epitopa himernog cA2 antitela je izvedena iz varijabilnog regiona mišijeg antitela A2. U posebnom ostvarenju poželjan izvor nukleinske kiseline koja kodira varijabilan region mišijeg A2 antitela je A2 hibridomaćelijska linija.

Himerno A2 (cA2) neutrališe citotoksični efekat oba, i prirodnog i rekombinantnog humanog TNFa na način koji zavisi od doze. Iz testa za vezivanje himernog cA2 antitela i rekombinantnog humanog TNFa, izračunato je daje konstanta afinitativnosti himernog antitela cA2 1.04 X 10<IC>M"'. Poželjne metode za određivanje specifičnosti i afinitativnosti monoklonalnog antitela kompetitivnom inhibicijom može se naći u Harlovv, et al, antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbour Laboratorv Press, Cold Spring Harbour, New York, 1988; Colligan et al, eds, Current Protocols in Immunologv, Green Publishing Assoc, and Wiley Interscience, New York, (1992-2000); Kozber et al, Immunol. Today, 4:72-79 (1983); Ausubel et al, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nevv York (1987-2000); i Muller, Metod. Enzymol, 92:589-601 (1983).

U posebnom ostvarenju m misije monoklonalno A2 antitelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl34A. Himerno cA2 antitelo se proizvodi od strane ćelijske linije označene kao cl68A.

Dodatni primeri monoklonalnih anti-TNF antitela koji se mogu upotrebiti u ovom pronalasku opisani su u ovoj oblasti (videti, npr, U.S. Patent No. 5,231,024; Moller, A. et al, Cytokine 2(3): 162-169 (1990); U.S Application No. 07/943,852 (popunjen 11 septembra, 1992); Rathjen et al, International Publication No WO 91/02078 (objavljeno 21 februara 191); Rubin et al, EPO Patent Publication No 0 218 868 (objavljeno 22 aprila, 1987); Liang et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager et al, Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al, Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman et al, Hybridoma, 6:489-507 (1987); i Hirai et al, J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).

TNF receptorski molekuli

Poželjni TNF receptorski molekuli korisni za ovaj pronalazak su oni koji vezuju TNFa sa visokim afinitetom (videti npr, Feldman, et al, International Publication No WO 92/07076 (objavljeno 30 aprila 1992); Schall et al, Cell, 61:361-370

(1990); i Loetcher et al, Cell 61:351-359 (1990)) i opcionalno poseduju nisku imunogenost. Posebno su korisni za ovaj pronalazak, 55 kDa (p55TNF-R) i 75 kDa (p75TNF-R) ćelijski površinski receptori. Skraćene forme ovih receptora koji sadrže ekstracelularne domene (ECD) receptora ili njegovih funkcionalnih delova (npr, Corcoran, et al, Eur. J. Biochem. 223:831 840 (1994)), takođe su korisni za ovaj pronalazak. Isečene forme ovih receptora, koji sdrže ECD, detektovana se u mokraći i serumu kao TNFa inhibitorni vezujući proteini od 30 kDa i 40 kDa (Engelman, H. et al, J. biol. Chem. 265:1531-1536 (1990)). Multimerni molekuli TNF receptora i TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli, i njihovi derivati i fragmenti, su dodatni primeri TNF receptorskih molekula koji su korisni za metode i kompozicije iz ovog pronalaska. Molekuli TNF receptora koji se mogu koristiti u ovom pronalasku karakterišu se sposobnošću da lece pacijente tokom produžeg vremenskog perioda sa dobrim do odličnim ublažavanjem simptoma i niskom toksičnošču. Niska imunogenost i/ili visoka afinitativnost, kao i druge nedefinisane osobine, mogu da doprinesu ostvarenim terapeutskim rezultatima.

Multimerni molekuli TNF receptora koji su korisni za ovaj pronalazak sadrže sve ili funkcionalni deo ECD jednog ili više TNF receptora povezanih preko jednog ili više polilinkera ili nepeptidnih linkera, kao što je polietilen glikol (PEG). Multimerni molekuli dalje mogu da sadrže signalni peptid sekretovanog proteina koji usmerava ekspresiju multimernog molekula. Ovi multimerni molekuli i metode za njihovu proizvodnju opisane su u U.S. Application No. 08/437,533 (popunjen 9 maja 1995).

TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli koji su korisni u ovom pronalasku obuhvataju makar jedan deo jednog ili više imunoglobulinskoih molekula ili ceo ili funkcionalni deo jednog ili više TNF receptora. Ovi imunoreceptorski fuzioni molekuli mogu se sastaviti kao monomeri, ili hetero- ili homo-multimeri. Imunoreceptorski fuzioni molekuli mogu biti takođe monovalentni ili multivalentni. Primer za ovakav TNF imunoreceptorski fuzioni molekul je TNF receptorski/IgG fuzioni protein. TNF imunoreceptorski fuzioni molekuli i metode za njihovo dobijanje opisani su u ovoj oblasti (Lesslauer, et al, Eur. J. Immunol. 21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10353-10359 (1991); Peppel et al, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991); Kolls qe ql„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994); Butler et al, Cvtokine 6(6):616-623 (1994); Baker et al, Eur. J. Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et al, U.S. Patent No. 5,447.851; i U.S Application No. 08/442.1333 (popunjen 16 maja 1995). Metode za proizvodnju imunoreceptorskih fuzionih molekula mogu se takođe naći u Capon et al, U.S. Patent No. 5,116,964; Capon et al, U.S. Patent No. 5,225,538; i Capon et al. Nature 337:523-531 (1989).

Funkcionalni ekvivalent, derivat, fragment ili region TNF receptorskog molekula odnosi se na deo TNF receptorskog molekula, ili deo sekvence za TNF receptorski molekul koja kodira TNF receptorski molekul, koja je dovoljna po veličini i sekvencama da funkcionalno liči na TNF receptorski molekul koji se može koristiti u ovom pronalasku (npr, da se veže za TNFa sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula takođe uključuje modifikovane receptorske molekule koji funkcionalno liče TNF receptorskim molekul ima koji se mogu koristiti u ovom pronalasku (npr, da se veže za TNFa sa visokim afinitetom i da poseduje nisku imunogenost). Na primer, funkcionalni ekvivalent TNF receptorskog molekula može da sadrži "SILENT" kodon ili jednu ili više amino kiselinskih substitucija, delecija ili adicija (npr, substitucija jedne kisele amino kiseline drugom kiselom amino kiselinom; ili substitucija jednog kodona koji kodira istu ili različitu hidrofobnu amino kiselinudrugim kodonom koji kodira hidrofobnu amino kiselinu. Videti Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York (1987-2000).

Citokini uključuju bilo koji poznati citokin. Videti, npr,www.CopewithCytokines.com. Antagonisti citokina uključuju, ali nisu njima limitirani, bilo koje antitelo, njegov fragment ili onaj koji ga oponaša, bilo koji solubilni receptor, fragment ili onaj koji ga oponaša (mimetic), bilo koji mali molekul antagonist, ili njihova kombinacija.

Terpeutski tretmani.Antitelo iti kompozicija prema pronalasku mogu biti korišćeni u postupku lečenja poremećaja posredovanih IL-12, koja se sastoji od davanja efektivne količine antitela ili kompozicije ćeliji, organu, tkivu, životinji ili pacijentu koji ima potrebu. Ovakva metoda može opcionalno dalje da obuhvati ko-administraciju ili kombinovanu terapiju za lečenje ovakvih obolenja imuniteta, gde administracija pomenutog antitela,ili kompozicije dalje obuhvata administraciju, pre, za vreme, i/ili posle, makar jednog selektovanog iz makar jednog makar jednog selektovanog od makar jednog TNF antagonista (npr, ali nije limitiran na TNF antitelo ili fragment, solubilni TNF fragment, njegov fuzioni protein, mali molekul TNfF antagonist), antireumatika (npr, metotreksat, auranofin, aurotioglukoza, azatiopiren, etanercept, zlato natrijum tiomalat, hidroksihlorokinsulfat, leflunomid, sulfasazlin), mišićni relaksant, narkotik, nesteroidni anti-inflaminatorni lek (NSAID), analgezik, anestetik, sedativ, lokalni anestetik, neuromišićni blokator, antimikrobialnog (npr, aminoglikozid, antifungalni, antiparazitski, antiviralni, karbapenem, cefalosporin, flurorkinolon, makrolid, penicilin, sulfonamid, tetraciklin, drugi antimikrobijski), antipsoriatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, mineralnog, hranljivog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona vezanog za kalcijum, antidiarealnog, antitusivnog (antitussive), "antiemetic", antiulceroznog, laksativnog, antikoagulantnog, eritropieitina (npr, epoetin alfa), "filgastrim" (npr, G-CSF, Neupogen), sargamostina (GM-CSF, Leukine), imunizacije, imunoglobulina, imunosupresora, (npr, basilixmab, ciklosporin, daklizumab), hormona rasta, lek za zamenu hormona, modulator hormona za estrogen, midriatik, cikloplegik, alkilirajući agens, antimetabolit, ihibitor mitoze, radiofarmaceutikala, antidepresiva, antimanijačnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulanata, donepezil, takrin, lekova za astmu, beta antagonista, steroida za udisanje, inhibitora za leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaze alfa (pulmozyme), citokina ili citokin antagonista.

Tipično, na lečenje patoloških stanja utiče administracija efektivne količine ili doze makar jedne kompozicije anti-IL-12 antitela koja ukupno u prošeku, je u opsegu od oko 0.01 do 500 miligrama makar jednog anti IL-12 antitela po kilogramu pacijenta po jednoj dozi, i poželjno je od oko 0.1 do 100 miligrama antitela/kilogramu pacijenta po jednoj ili više administracija, u zavisnosti od specifične aktivnosti koja se nalazi u kompoziciji. Alternativno, efektivna koncentracija seruma može da obuhvati 0.1-5000 (o.g/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administracija. Pogodne doze poznate u lekarima i zavisiće naravo, od određenog stanja bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja se daje, i naročito tretmana pod kojim je pacijent. U nekim slučajevima da bi se postigla željena terapeutska količina, neophodno je obezbediti ponavljanje administracije, i.e, ponavljanje pojedinačnog davanja određene monitorovane ili odmerene doze, gde se pojedinačna davanja ponavljaju dok se ne postigne željena dnevna doza ili željeni efekat.

Poželjne doze ocionalno uključuju 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 67, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i/ili 100-500 mg/kg/davanju, ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment, da bi se ostvarila serumsk koncentracija od 0.1, 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.5, 1.9, 2.0, 2.9, 3.0, 3.5, 3.9, 4.0, 4.5, 4.9, 5.0, 5.5, 5.9, 6.0, 6.5, 6.9, 7.0, 7.5, 7.9, 8.0, 8.5, 8.9, 9.0, 9.5, 9.9, 10.0, 10.5, 10.9, 11.0, 11.5, 11.9, 12.0, 12.5, 12.9, 13.0, 13.5, 13.9, 14.0, 14.5, 14.9, 15.0, 15.5, 15.9, 16.0, 16.5, 16.9, 17.0, 17.5, 17.9, 18.0, 18.5, 18.9, 19.0, 19.5, 19.9, 20.0, 20.5, 20.9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, loo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 i/ili 5000 u.g/ml koncentracije seruma po jednoj ili više administracija ili bilo koji njihov opseg, vrednost ili fragment.

Alternativno, doza koja se dostavlja može da varira u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamičke karakteristike određenog agensa, i od načina i puta administracije; godina, zdravlja, i težine recipijenta; priroda i stepen simptoma, vrste uporednog tretmana, frekvence tretmana, i željenog efekta. Uobičajeno doza aktivnog sastojka može biti oko 0.1 do 100 miligrama po kilogramu telesne mase. Uobičajeno 0.1 do 50, poželjno 0.1 do 10 miligram po kilogramu po administraciji ili u formi za odloženo oslobađanje, je dovoljno za dobijanje željenih rezultata.

Kao nelimitirajući primer, lečenje ljudi ili životinja može se obezbediti kao jednokratna ili periodična doza makar jednog antitela iz ovog pronalaska 0.1 do 100 mg/kg, kao stoje 0.5, 0.9, 1.0, 1.1, 1,5, 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/kg, po danu, na makar jedan dan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili 40, ili alternativno ili dodatno, makar jedne od nedelje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ili 52 ili alternativno ili dodatno, makar jedne od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 godina ili bilo koje njihove kombinacije, upotrebom jednokratne ili infuzione ili ponovljenih doza.

Forme daza (kompozicija) pogodne za administraciju generalno sadrže od oko 0.1 miligrama do oko 500 miligramaaktivnog sastojkapo jedinici ili kontejneru. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni satojak uobičajeno će biti prisutni u količini od 0.5-99.999% po težini bazirano na ukupnoj težini kompozicije.

Za parenteralnu administraciju, antitelo se može formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovan prah u asocijaciji, ili posebno obezbeđen, sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim prevoznim sredstvom (vehicle). Primeri za ovakva prevozna sredstva su voda, fiziološki rasvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i 1-10% humani serum albumin. Takođe se mogu koristiti lipozomi i nevodena prevozvozna sredstva kao fiksirana ulja. Prevozno sredstvo ili liofilizovani prah mogu sadržati aditivi koji održavaju izotoničnost (npr, natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (npr, puferi i konzervansi). Formulacija se steriliše poznatim ili pogodnim tehnikama.

Pogodni farmaceutski nosači opisani su u najnovijem izdanju Remingtonove Pharmaceutical Sciences, A. Osol, standardni referentni tekst u ovom polju.

Alternativne administracije

Mnoge poznate i razvijene metode mogu se koristiti, na osnovu ovog pronalaska, za administraciju farmaceutski efektivnih količina makar jednog anti-IL-12 antitela na osnovu ovog pronalaska. Dok se pulmonarna adminisracija koristi u opisu koji sledi, drugi oblici administracije sa pogodnim rezultatima mogu se koristiti na osnovu ovog pronalaska. IL-12 antitela iz ovog pronalaska mogi se dostaviti u nosaču, kao rastvor, emulzija, koloid ili suspenzija, ili kao suvi prah, koristeći bilo koji od mnogih sredstava i metoda pogodnih za administraciju putem inhalacije ili drugih načina opisanih ovde ili poznatih u ovoj oblasti.

Parenteralne formulacije i administracije

Formulacije za parenteralnu administraciju mogu da sadrže poznate ekspicijente sterilnu vodu ili fiziološki rastvor, polialklen glikole kao što su polietilen glikol, ulja biljnog porekla, hidrogenizovani naftaleni i slični. Vodene ili uljane suspenzije za injektiranje mogu se pripremiti upotrebom odgovarajućeg emulzifikatora ili ovlaživača i rastvarača agensa na osnovu poznatih metoda. Agensi za injeciranje mogu biti ne-toksični, agens za rastvaranje koji se ne administrira oralno kao vodeni rastvor ili sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u rastvaraču. Kao rastvarač ili prevozno sredstvo koje se koristi, dozvoljeni su vođa, Ringerov rastvor, izotonični fiziološki rastvor, itd; kao običan rastvarač ili suspending rastvarač, može se koristiti sterilno "involatile" (esencijalno) ulje. Za ove potrebe mogu se koristiti bilo koja vrsta esencijalnog ulja i masnih kiselina uključujući prirodna ili sintetička ili polusintetička masna ulja ili masne kiseline; prirodni, sintetički ili polusintetički mono-, ili di-, ili tri-gliceridi. "Parental" administracija je poznata u ovoj oblasti i uključuje ali nije njima limitirana, konvencionalne načine injekciranja, sredstvo za injeciranje bez igle pod pritiskom gasa kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,851,198 i sredstvo za lasersku perforaciju kao što je opisano u U. S. Pat. No. 5,839,446.

Alternativnedostave

Ovaj pronalazak dalje se odnosi na administraciju makar jednog anti-IL-12 antitela na sledeće načine: subkutanozno, intramuskularno, intravensko, intrartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, intrahrskavičavo, intracavitarno, intracelijarno, intracerebelarno, intracerebroventrikularno, intrakolikalno, intracervikalno, intraintragastrikalno, intrahepatikalno, intramiokardijalno, intraostealno, intrapelvikalno, intraperikardijalno, intraperitonealno, intrapleurealno, intraprostatno, intrapulmonarno, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauteralno, intravezikularno, bolus, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno, ili transdermalno. Makar jedna kompozicija anti-IL-12 antitela može se pripremiti za parenteralnu upotrebu (subkutanoznu, intramuskularnu ili intravensku) ili bilo koju drugu administraciju pogotovu u obliku tečnih rastvora ili suspenzija: za upoterbu za vaginalnu ili rektalnu administraciju pogotovu u poličvrstom stanju kao što su, ali bez limitiranja na njih, kreme i supozitorije; za bukafnu ili sublingvalnu administraciju, kao što su, ali bez limitiranja na njih, u obliku tableta ili kapsula; ili intranazalno kao što su, ali bez limitiranja na njih, forme praha, nazalne kapljice ili aerosoli ili određeni agensi; ili transdermalno, kao što su, ali bez limitiranja na njih, gel, mast, losion, suspenzija ili flasterski sistemi dostave koji sa hemijskim enhanserima kao što je dimetil sulfoksid da bi se ili modifikovala kožna struktura ili povećala koncentracija leka u transdermalnom flasteru (Junginger, et al, u "Drug Permation Enhancement", Hseih, D. S. Eds, pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), ili sa oksidujućim agensom koji omogućava primenu formulacija koje sadrže proteine i peptide na koži (WO 98/53847), ili primene električnih polja za kreiranje tranzijentnih transportnih puteva kao što je elektroporacija, ili za povećanje mobilnosti naelektrisanih lekova kroz kožu kao jontoforeza, ili primenu ultrazvuka kao stoje sonoforeza (U. S. Pat. Nos. 4,309,989 i 4,767, 402).

Pulmonarna/nazalnaadministracija

Za pulmonarnu administraciju, poželjno je da se dostavi makar jedna kompozicija anti-IL-12 antitela, određene veličine koja je efektivna za dosezanje nižih disajnih puteva pluća ili sinusa. Na osnovu pronalaska, makar jedno anti-IL-12 antitelo može se dostaviti pomoću različitih naprava za inhalaciju ili pomoću nazalnih naprava koje su poznate u ovoj oblasti, za administraciju terapeutskog agensa putem inhaliranja. Ova sredstva za deponovanje aerosolnih formulacija u sinusnu šupljinu ili alveole pacijenta, uključuju aerosolne pumpice (metered dose inhalors), nebulizatore (nebulizers), generatori suvog praha, sprejevi, i slični. Druga sredstva koja su pogodna za usmeravanje plućne ili nazalne administracije antitela poznati su uvoj oblasti. Sva ova sredstva mogu koristiti formulacije pogodne za administraciju za određivanje/raspoređivanje (dispensing) antitela u aerosolu. Ovakvi aerosoli mogu sadržati ili rastvore (obe, i vodene i ne-vodene) ili čvrste čestice. Aerosolne pumpice kao Ventoli<R>Metered dose inhalers, tipično koriste propellent gas i zahteva podstrek tokom inspiracije (videti, npr, WO 94/16970, WO 98/35888). lnhalatori suvog praha kao Turbuhaler* (Astra), Rotahaler1* (Glaxo), Diskus<R>(Glaxo), Spiros™ inhalator (sredstva označena od strane Inhale Terapeutics, i Spinhaler<R>inhalator praha (Fision)m upotreba "breath actuation" mešanih prahova (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 548135 Inhale, WO94/06498 fisons). Nebulajzeri kao AERx™ Aradigm, Ultraven<R>nebulajzer (Mallinckrodt), i AkronII<R>nebulajzer (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), gore pomenute reference su upotpunosti ovde obuhvaćene referencom, proizvode aerosol iz rastvora, dok aerosolne pumpice, inhalatori suvog praha itd generišu male čestice aerosola. Ovi specifični primeri komercijalno dostupnih sredstava za inhalaciju imaju za cilj da budu predstavnici specifičnih sredstava pogodnih za primenu u ovom pronalasku, i nisu namenjeni da limitiraju područje ovog pronalaska. Poželjno je da se kompozicija koja sadrži makar jedno anti-IL-12 antitelo dostavi pomoću inhalatora suvog praha ili spreja. Postoji nekoliko poželjnih osobina koje poseduje sredstvo za inhaliranje za administraciju makar jednog antitela iz ovog pronalaska. Na primer, dostava pomoću sredstva za inhalaciju ima prednost u pouzdanosti, reproducibilnosti i tačnosti. Sredstva za inhalaciju mogu opcionalno da dostave male čestice, npr, manje od 10 p.m, poželjno 1-5 urn, za dobru repiratornost.

Administracija kompozicije IL-12 antitela u obliki spreja

Sprej sa IL-12 antitelom proteinskom kompozicijom može se proizvesti ušpricavanjem pod pritiskom suspenzije ili rastvora makar jednog anti-IL-12 antitela kroz nosnu šupljinu. Veličina i konfiguracija nosa, primenjeni pritisak, i stopa ubacivanja tečnosti (liquid feed), mogu se odabrati da bi se postigao željeni "output" i veličina čestica. Elektrosprej može se proizvesti, na primer, pomoću električnog polja koji je povezan sa kapilarnim ili nosnim ubacivanjem (feed). Sa prednošću, čestice makar jednog kompozicionog proteina anti-IL-12 antitela koje se dostavljaju pomoću spreja imaju čestice veličine makar 10 um, poželjno u opsegu od oko lu.m do oko 5u.m, i najpoželjnije od oko 2 u.m do oko 3 um.

Formulacija kompozicionog proteina anti-IL-12 antitela pogodnog za upotrebu u spreju tipično uključuju kompozicioni protein antitela u vodenom rastvoru u koncentracijama od oko 0.1 mg go 100 mg makar jednog kompozicionog proteina anti-IL-12 antitela po mililitru rastvora ili mg/ml, ili bilo kog drugog opsega ili vrednosti u okviru toga, e.g, ali bez limitiranja na .1, .2, .3, .4, .5, . 6, .7, .8, .9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100 mg/ml ili mg/gm. formulacija može da uključi agenseb, kao što su ekspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactanf' (površinski aktivni agensi), i poželjno cink. Formulacija takođe može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina antitela, kao što je pufer, redukujući agens,<;>'bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju albumin, protamin, ili slično, tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Formulacija kompozicionog proteina anti-IL-21 antitela može takođe da uključi "surfactant" (površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju proteinske kompozicije antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi)mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 14% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" (površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao što je IL-12 antitelo, ili njegove specificirane varijante ili delovi, mogu se takođe uključiti u formulaciju.

Administracija kompozicije IL-12 antitela pomoću nebulizatora (Nebulizer)

Kompozicioni protein antitela može se administratirati pomoću nebulizatora, kao što je mlazni nebulizatoir ili ultrazvučni nebulizator. Tipično, u mlaznom nebulizatora, izvor kompresovanog vazduha se koristi za stvaranje mlaza vazduha velike brzine kroz otvor. Kako se gas širi van nosa, stvara se region niskog pritiska, koji izvlači rastvor kompozicionog protein antitela kroz kapilarnu cev koja je spojena sa rezervoarom sa tečnošću. Struja tečnosti iz kapilarne cevi se raspodeljuje u nestabilne filamente i kapljice kako napušta cev. stvarajući aerosol. Opseg konfiguracija, stopa proticanja, i tipovi prepreka (baffle) mogu se upotrebiti da bi se postigle željene karakteristike izvođenja iz datih mlaznih nebulizatora. Kod ultrazvučnog nebulizatora, koristi se električna energija visoke frekvence da bi se stvorila vibraciona, mehanička energija, tipično se koristi piozoelektrični transducer (provodnik). Ova energija se šalje formulaciji kompozicionog protein antitela bilo direktno ili kroz "coupling" tečnost, stvarajući aerosol uključujući kompozicioni protein antitela. Kao prednost, čestice kompozicionog protein antitela dostavljene pomoću nebulizatora imaju veličinu čestice manje od 10 p.m, poželjno u opsegu od oko 1 uxn do oko 5 u.m, i najpoželjnije oko 2 u.m do oko 3 um.

Formulacije makar jednog anti-IL-12 antitela pogodne za upotrebu sa nebulizatorom, bilo mlaznim ili ultrazvučnim, tipično uključuje koncentracije od oko 0.1 do oko 100 mg makar jednog proteina anti-IL-12 antitela po ml rastvora. Formulacija takođe može da uključi agense kao što su, akspicijent, pufer, izotonični agens, konzervans, "surfactant"(površinski aktivni agens), i poželjno je cink. Formulacija takođe može da uključi ekpicijent ili agens za stabilizaciju kompozicionog proteina anti-IL-12 antitela, kao što je pufer, redukujući agens, "bulk" (veliki) protein, ili ugljeni hidrat. "Bulk" (veliki) proteini korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-IL-12 antitela uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni za formulaciju kompozicionih protena anti-IL-12 antitela uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu i slične. Makar jedna formulacija anti-IL-12 antitela može takođe da uključi "surfactant" (površinski aktivni agens), koji može da redukuje ili spreči površinski- izazvanu agregaciju makar jednog anti-IL-12 antitela izazvane atomizacijom rastvora pri formiranju aerosola. Različiti konvencionalni "surfactants" (površinski aktivni agensi) mogu se upotrebiti, kao estri poliksietilen masnih kiselina i alkohola, i stri poliksietilen sorbitol masnih kiselina. Količina će generalno varirati u opsegu između 0.001 i 4% po težini formulacije. Posebno poželjni "surfactants" (površinski aktivni agensi) za potrebe ovog pronalaska su poliksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slični. Dodatni agensi poznati u ovoj oblasti za formulaciju proteina kao što je protein antitelo, mogu se takođe uključiti u formulaciju.

Administracija kompozicije IL-12 antitela pomoću aerosolnih pumpica

(Metered Dose inhalors)

Kod aerosolnih pumpica (metered dose inhalors-MDI), "propellent"(pokretač), makar jedno anti-IL-12 antitelo, i bilo koji ekspicijenti ili aditivi nalaze se u kanisteru, kao mešavinam uključujući gas pod pritiskom u tečnom stanju. Aktivacija tj odvrtanje ventila za merenje (metering) oslobađa mešavinu u obliku aerosola, poželjno je da su čestice koje on sadrži u opsegu veličine manje od oko 10 u.m, poželjno oko lv do oko 5v, i najpoželjnije oko 2p.m do oko 3p.ni. Željena veličina čestica aerosola može se dobiti upoterbom formulacije kompozicionog proteina antitela, koji se proizvodi različitim metodama poznatim onima koji se bave ovom oblašću nauke, uključujući mlazno drobljenje (jet-milling) u ovoj oblasti, isušivanje sprejom (spray drying), kondenzacija na kritičkoj tački (critical point condensation), i slično. Poželjne aerosolne pumpice uključuju one proizvedene od strane 3M ili Glaxo i upotrebljavaju hidrofluorougljenični propellant.

Formulacije makar jednog anti-IL-12 antitela za upotrebu sa "metered dose" sredstvom za inhaliranje će generalno da sadrži fino razdvojen prah koji sadrži makar jedno anti-IL-12 antitelo kao suspenziju u ne-vodenom medijumu, na primer, rastvoreno u propellant-u uz pomoć surfactant-a (površinskog aktivnog agensa). Propellant može biti bilo koji kanvencionalni materijal koji se koristi u i tu svrhu, kao hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ili hidrougljenik, uključujući trihlorofluoromrtan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoretan, HFA-134a (hidrofluoroalkan-134a), HFA-227 (hidrofluoroalkan-227) i slični. Poželjno je da je propellant hidrofluorougljenik. Surfactant (površinski aktivni agens) može biti odabran da stabiliše makar jedno anti-IL-12 antitelo kao suspenziju u propelantu, da bi se zaštitio aktivni agens od hemijske degradacije, i sličnog. Pogodne surfactans predstavljaju sorbitan trioleat, sojin lecitin, oleinska kiselina, i slični. U nekim slučajevima poželjno je upotrebiti rastvarači ka što je etanol. Dodatni agensi koji su poznati u ovoj oblasti, mogu se uključiti u formulaciju proteina kao protein, takođe se mogu uključiti u formulaciju.

Neko ko se bavi ovom oblašću prepoznaće da se metode iz ovog pronalaskase mogu ostvariti plućnom administracijom kompozicije makar jednog anti-IL-12 antitela preko sredstava koja nisu ovde opisana.

Oralne formulacije i administracije

Formulacije za oralno oslanjaju se na ko-administraciju adjuvanta (npr, resorcinoli i nejonski surfactants (površinski aktivni agensi) kao polioksietilen oleil etar i n-heksadecilpolietilen etar) da bi se veštački povećala propustljivost zidova creva, kao i na ko-administraciju enzimskih inhibitora (npr, inhibitori pankreasnog tripsina, diizopropilfluorofosfat (DFF) i trazilol)) da bi se inhibirala degradacija enzima. Aktivna konstitutivna substanca čvrstog tipa forme doze (solid-type dosage form) za oralnu administraciju može se pomešati sa najmanje jednim aditivom, uključujući saharozu, laktozu, celulozu, manitol, trehalozu, rafinozu, maltitol, dekstran, škrobove, agar, arginate, hitine, hitosane, pektine, "gum tragacath", "gum arabic", želatin, kolagen, kazein, albumin, sintetičke i polusintetičke polimere, i glicerid. ove forme doza mogu takođe da sadrže drugi(e) tip(ove) aditiva, npr, inaktivni diluirajući agens, lubrikant kao magnezij um stearat, paraben, konzervans kao sorbinska kiselina, askorbinska kiselina, alfa-tokoferol, antioksidant kao cistein, dezintegrator, vezivač, podebljivač, puferski agens, zaslačivački agens, agens za ukus, parfemski agens itd.

Tablete i pilule mogu se dalje obraditi i od njih se mogu napraviti obloženi enterosolventni (enteric-coating) preparati. Tečni preparati za oralnu administraciju uključuju emulziju, sirup, suspenziju i rastvor, preparati koji su dozvoljeni za medicinsku upotrebu. Ovi preparati mogu sadržati inaktivne diluirajuće agense koji se obično koriste u pomenutoj oblasti, e.g voda. Lipozomi su takođe opisani kao sistemi za dostavu lekova, insulina i heparina (U.S. Pat. No. 4,239,754). Skorije, mikrosfere veštačkih polimera mešovitih amino kiselina (protenoidi) korišćeni su za dostavu farmaceutskih sredstava (U.S. Pat. No. 4,925,673). Dalje, jedinjenja nosači opisani u U.S. Pat. No.5,879,681 i U.S. Pat. No. 5,5,871,753 koriste se za dostavu biološki aktivnih agenasa oralnim putem i poznati su u ovoj oblasti.

Mukozne formulacije i administarcija

Za obsorbciju kroz mukoznu površinu, kompozicije i metode adminstracije makar jednog anti-IL-12 antitela uključuju emulziju koja sadrži mnoštvo submikronskih čestica, mukoadhezivne makromolekule, bioaktivne peptide, i vodenu kontinuiranu fazu, koja potpomaže absorbciju kroz mukozalne površine ostvarujući mukoadheziju čestica emulzije (U.S.Patmo. 5,514,670). Mukozne površine pogodne za primenu emulzija iz ovog pronalaska mogu da uključe kornealni, konjuktivalni, bukalni, sublingvalni, nazalni vaginalni, plućni, želudačni, intestinalni, i rektalni put administracije. Formulacije vaginalne ili rektalne administracije, npr, supozitorije, mogu da sadrže ekcipijente, na primer, polialkenglikole, vazeline, kakao puter, i slične. Formulacije za intestinalnu administraciju mogu biti čvrsti i sadržati ekpicijente, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori nazalnih kapi. Za bukalnu administraciju ekspicijenti uključuju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizirani škrob, i slične, (U.S.Pat.No. 5,849,695).

Transdermalne formulacije i administarcija

Za transdermalnu administraciju, makar jedno anti-IL-12 antitelo je inkapsulirano u sredstvu za dostavu kao što je lipozom ili polimerne nanočestice, mikročestice, makrokapsule, ili mikrosfere (odnosu se kolektivno na mikročestice ukoliko nije drugačije naznačeno). Poznat je veliki broj pogodnih sredstava, uključujući mikročestice napravljene od sintetičkih polimera, kao polihidroksilne kiseline, kao poliaktička kiselina, poliglikolna kiselina, i njihovi kopolimeri, poliortoestri, polianhidridi, polifosfazeni, i prirodni polimeri kao kolagen, poliamino koseline, albumin i drugi proteini, alginat i drugi polisaharidi, i njihove kombinacije (U.S.Pat.Nos.5,814,599).

Produžena administarcija i formulacije

Ponekad može da bude poželjno da se jedinjenja iz ovog pronalaska dostave subjektu tokom produženog vremenskog perioda, na primer, tokom perioda od jedne nedelje do jedne godine, iz pojedinačne administracije. Različite forme doza koje se sporo otpuštaju, depo ili implant forme doza mogu se upotrebiti. Na primer, forma doze može da sadrži farmaceutsko prihvatljivu ne-toksičnu so jedinjenja koje poseduje nizak stepen rastvorljivosti u telesnim tečnostima, na primer, (a) kiselina dodata soli sa polibaznom kiselinom kao što je fosforna kiselina, sumporna kiselina, limunska kiselina, tartarna kiselina, tanična kiselina, pamoična kiselina, algininska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalen mono-ili di- sulfonska kiselina, poligalakturonska kiselina i slične (b) so sa polivalentnim katjonom metala kao što je cink, kalcijum, bizmut, barijum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmijum i slični, ili sa organskim katjonom iz npr, N, N'-dibenzil-etilenamid ili etilendiamin; ili (c) kombinacija od (a) i (b) npr, so cink tanat (zine tannate salt). Dodatno, jedinjenja iz ovog pronalaska ili poželjno relativno nerastvorljiva so kao one koje su upravo opisane, mogu biti formulisane u gelu, na primer aluminijum stearat gel sa npr, sezamovim uljem, pogodni za injektiranje. Posebno su poželjne soli, cink tanat soli, pamoatne soli, i slične. Još jedan tip formulacije za sporo otpuštanje depoa za injektiranje sadržao bi jedinjenje ili so dispergovane za enkapsulaciju u sporo razlažućem, ne-toksičnom, ne-antigenom polimeru kao što je polimer polisirćetne kiseline/poliglikolne kiseline na primer kao što je opisano u U.S. Pat. No. 3,773,919. Jedninjenja ili poželjnije relativno nerastvorljive soli, kao one opisane u tekstu iznad, mogu biti formulisana u holesterol matriks silikatnim talozima (pellets), pogotovu za upoterbu u životinjama. Dodatno sporo oslobađanje, formulacija za depo ili implant, npr, gasni ili tečni lipozomi poznati su u literaturi (U.S. Pat.Nos. 5,770,222 i "Sustained and Controlled release Drug Delverv svstem", J. R. Robinson ed, Marcel Dekker, Ine, N.Y,1978).

Pošto smo opisali pronalazak, isti će se bolje razumeti pomoću referenci iz primera koji slede, koji su dopunjeni sa ilustracijama koje nisu limitirajuće.

Vektor pC4 se koristi za ekspresiju IL-12 antitela. Plazmid pC4 je derivat plazmida pSV-dhfr (ATCC Acession No 37146). Plazmid sadrži misiji DHFR gen koji stoji pod kontrolom SV40 ranog promotora. Ćelije jajnika kineskog hrčka - ili druge kojima nedostaje dihidrofolatna aktivnost koje se transfektuju sa ovim plazmidima mogu se selektovati gajenjem ćelija na selektivnom medijumu (npr, alfa minus MEM, Life technologies, Gaithersburg, MD) kome je dodat hematoterapeutski agens metotreksat. Amplifikacija DHFR gena u ćelijama rezistentnim na metotreksat (MTX) dobro je dokumentovana (videti, npr, F. W. Alt et al, J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); J. L. Hamlin i C. Ma, Biochem. et Biophvs. Acta 1097:107-143 (1990); i M. J. Page i M. A. Svdenham, Biotechnologv 9:64-68 (1991)). Ćelije gajene u povišenoj koncentraciji MTX razvile su rezistenciju na lek previše (over) produkujući ciljni enzim, DHFR, kao rezultat amplifikacije DHFR gena. Ako je drugi gen povezan sa DHFR genom, najčešće se on ko-umnožava i over-eksprimira. Poznato je u oblasti da se ovaj pristup može koristiti za razvoj ćelijskih linija koje nose više od 1,000 kopija amplifikovanog(ih) gena. Zatim, kada se povuče metotreksat, dobijene ćelijske linije sadrže umnožen gen koji je integrisan u jedan ili više hromozoma domaćinske ćelije.

Plazmid pC4 sadrži za ekspresiju gena od interesa, jak promotor dugih terminalnih ponovaka (LTR) Raus sarkoma virusa (Cullen, et al, Molec.Cell.Biol. 5:438-447

(1985)) plus fragment izolovan iz enhancera iz momentalnog ranog gena humanog citomegalovirusa (CMV) (Boshart, et al, Cell 41:521-530 (1985)). Nizvodno od promotora su restrikciona mesta za restrikcione enzime BamHI, Xbal i Asp718 koja omogućavaju integraciju gena. Iza ovih mesta za kloniranje plazmid sadrži 3' intron i poliadenilaciono mesto iz pacovskog preproinsulinskog gena. Drugi visoko efikasni promotori mogu se koristiti za ekspresiju, npr, promotor humanog b-aktina, SV40 rani ili kasni promotori ili dugi terminalni ponovci iz drugih retrovirusa, npr, HIV i HTLVI. Clontech-ovi Tet-on i Tet-off genski ekspresioni sistemi i slični sistemi mogu se iskoristiti za ekspresiju IL-12 na regulisan način u sisarskim ćelijama (M. Gossen, and H. Bujard. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Za poliadenilaciju iRNK mogu se koristiti drugi signali npr, iz humanog hormona rasta ili globinskih gena. Stabilne ćelijske linije koje nose gen od interesa integrisan u hromozome, mogu se takođe selektovati po kotransfekciji sa sa selekcionim markerom kao gpt, G418 ili higromicin. Upotreba više od jednog selektivnog markera u početku, npr, G418 plus metotreksat pokazuje prednost.

Plazmid pC4 se seče (digerira) sa restrikcionim enzimima i zatim defosforiliše pomoću fosfataze iz creva teleta procedurom poznatom u ovoj oblasti. Vektor se tada izoluje iz 1% agaroznog gela.

Upotrebljena je DNK sekvenca koja kodira kompletno IL-12 antitelo, npr, kao što je prezentovano u SEQ ID NOS : 7 i 8 koje odgovaraju varijabilnim regionima teškog i lakog lanca IL-12 antitela ovog pronalaska, na osnovu poznatih koraka u metodama. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira pogodni humani konstantni region (i.e, HC-teški lanac i LC-laki lanac regione) su takođe korišćeni u ovom konstruktu (npr, kao što je obezbeđeno u vektoru pl351).

Izolovana DNK koja kodira varijabilni i konstantni region i defosforilovani vektor se zatim ligiraju sa T4 DNK ligazom.E. coliHB101 ili XL-1 Blue ćelije se zatim transformišu i bakterije koje sadrže plazmid pC4 sa ubačenim fragmentom se detektuju na primer, restrikcionom analizom.

Ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO) kojima nedostaje DHFR gen korite se za transfekciju. 5 g ekspresionog plazmida pC4 se kotransfektuje sa o.5 g plazmida

pSV2-neo pomoću lipofektina. Plazmid pSV2neo sadrži dominantan selektibilni marker, neo gen iz Tn5 koji kodira enzim koji potvrđuje rezistenciju na grupu antibiotika uključujući G418. Ćelije se zasejavaju u alfa minus MEM sa 1 g/ml G418. Posle dva dana ćelije se tripsiniziraju i zasejavaju u hibridoma pločama za kloniranje (Greiner, Germanv) u alfa minus MEM sa dodatkom 10, 25 ili 50 ng/ml metotroksata plus 1 g/mi G418. Posle oko 10-14 dana pojedinačni klonovi se tripsinizuju u zasejavaju na petri šoljama sa 6 bunarčića ili flaskovima od 10 ml upotrebljavajući različite koncentracije metatroksata (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Klonovi koji rastu na najvećim koncentarcijama metotreksatase zatim prebacuju na nove šolje sa 6 bunarčića koje sadrže još veće koncentracije metotreksata (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Ista procedura se ponavlja sve dok se ne dobiju klonovi koji rastu na koncentracijama od 100-200 mM. Ekspresija željenog genskog proizvoda se analizira, na primer, pomoću "SDS-PAGE" ili "Western blot" analizom ili "reverse phase HPLC" analizom.

Primer 2: Generisanje visoko afinitativnih humanih IgG monoklonalnih antitela reaktivnih sa humanim IL-12 pomoću transgenih miševa Sadržaj

Za generisanje visoko afinitativnih, potpuno humanih, monoklonalnih antitela, koji se mogu upotrebiti terapeutski za inhibiciju akcije IL-12-aza lečenje jedne ili više IL-12-posredovanih obolenja. (CBA/JxC57/BL6/J)F2 hibridni miševi koji sadrže humane transgene za varijabilni i konstantni region antitela i za teške i lake lance su imunizovani sa humanim rekombinantnim IL-12 (Tavlor et al, International lmmunology 6:579-591 (1993); Lonberg et al. Nature 368:856-859

(1994); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Fishvvild et al. Nature Biotechnology 14:845-851 (1996). Nekoliko fuzija dovelo je do jednog ili više grupa kompletnih humanih IL-12 reaktivnih IgG monoklonalnih antitela. Kompletna humana anti-IL-12 antitela su dalje okarakterisana. Svi su IgGl. Za ova antitela utvrđeno je da imaju konstantu afiniteta negde između 1x10' i 9xl0'<2>. Ovakve neočekivano visoke vrednosti afiniteta ovih potpuno humanih monoklonalnih antitela čini ih pogodnim kandidatima za terapeutsku primenu kod IL-12-obolenja, patologija ili poremećaja.

SKRAĆENICE

BSA - serum albumin govečeta

C02 -ugljen dioksid

DMSO - dimetil sulfoksid

E1A -enzimski imunotest

FBS -fetalni serum govečeta

H202 - vodonik peroksid

HC - težak lanac

HRP - peroksidaza rotkvice

Ig - imunoglobulin

IL-12- Interleukin-12

IP - intraperitonealno

IV - intravensko

Mab - monoklonalno antitelo (Ma)

OD - optička gustina

OPD - o-fenilenediamin dihidrohlorid

PEG - polietilen glikol

PSA - penicilin, tetraciklin, amfotercin

ST - sobna temperatura

SQ - subkutanozno

v/v - zaprem i na po zaprem ini

w/v - težina po zapremini

MATERIJALU METODE

ŽIVOTINJE

Transgeni miševi koji mogu da eksprimiraju humana antitela poznati su u ovoj oblasti ( i komercijalno su dostupna) (npr, od GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, i drugi) koja eksprimiraju hu humane imunoglobuline ali ne i misije IgM ili Ig . Na primer, ovakvi transgeni miševi sadrže humane sekvence transgena koji podležu V(D)J sastavljanju, menjanju klasa teškog lanca, somatskim mutacijama da bi se generisao repertoar humanih sekvenci imunoglobulina (Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994)). Transgen za laki lanac može seizvesti, npr, delom iz klona veštačkog hromozoma kvasca koji uključuje skoro pola germline (geminativna ćelijska linija) humanog V regiona. Dodatno, transgen za teški lanac može da kodira oba i humani u. i humani l(Fiashwald et al. Nature Biotechnologv 14:854-851 (1996)) i/ili 3 konstantne regione. Miševi izvedeni iz odgovarajućih genotipskih linija mogu se iskoristiti za imunizaciju i fuzione procese da bi se generisala potpuno humana monoklonalna antitela za IL-12.

Imunizacija

Jedan ili više rasporeda za imunizaciju mogu se iskoristiti za generisanje anti-IL-12 humanih hibridoma. Prvih nekoliko fuzija mogu se izvesti nakon sledećih protokola za imunizaciju koji služe za primer, ali se mogu upotrebiti i drugi slični protokoli. Nekoliko ženki i/ili hirurški kastriranih transgenih miševa starih 14-20 nedelja imunizovano je IP i/ili ID sa 1-1000 u.g rekombinantnog humanog IL-12 emulzifikovanog sa istom zapreminom TITERMAX ili kompletnog Freundovog adjuvanta u finalnoj zapremini od 100-400 uJ (npr., 200). Svaki miš takođe može opcionalno da primi 1-10 pg u 100 pj fiziološkog rastvora na svaka od dva SQ mesta. Miševi mogu tada biti imunizovani 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 i/ili 21-34 dana kasnije IP (1-400 u.g)( i SQ (1-400 ug x 2) sa lL-12-om emulzifikovanim sa istom zapreminom TITERMAX ili nekompletnog Freundovog adjuvanta. Miševi su iskrvavljeni 15-25 i 25-40 dana kasnije pomoću retro-orbitalnog punkture bez antikoagulansa. Krv je puštena da se zgruša na ST tokom jednog sata i sakupljen je serum i titriran pomoću IL-12 EIA testom na osnovu poznatih metoda. Fuzije su izvedene kada ponovljene injekcije nisu dovodile do povećanja titra. U to vreme, miševima se mogla davati finalna IV "booster" injekcija (revakcinacija) od 1-400 pg IL-12-a razblaženog u 100 pl fiziološkog rastvora. Tri dana kasnije, miševi su eetanazirutanazirani cervikalnom dislokacijom i aseptički je uklonjena slezina i potpoljena u 10 p.1 hladnog fosfatom puferovanog fiziološkog rastvora (PBS) koji sadrži 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml streptomicina, i 0.25 ug/ml amfotercina B (PSA). Splenocite (ćelije slezine) su pokupljene sterilnim dodavanjem tečnosti, PSA-PBS (perfusing) u slezinu. Ćelije su zatim isprane u hladnom PSA-PBS, prebrojane pomoću ekskluzije Tripan blue bojom i resuspendovane u RPMI 1640 medijumu sa 25 mM HEPES.

Ćelijske fuzije

Fuzija se može izvesti u odnosu 1:1 do 1:10 mišijih mieloma ćelija naspram ćelija slezine na osnovu poznatih metoda, npr, kao što je poznato u ovoj oblasti. Kao nelimitirajući primer, ćelije mieloma i ćelije slezine mogu zajedno da formiraju ćelijski talog (pellet). Talog se zatim može lagano resuspendovati tokom 30 sekundi, u 50% rastvoru (w/v) PEG/PBS (PEG molekulska težina 1,450, Sigma) na 37C. Fuzija se tada može zaustaviti lagano dodatkom 10,5 ml RPMI 1640 medijuma koji sadrži 25 mM HEPES (37C) tokom 1 minuta. Fuzionisane ćelije se centrifugiraju tokom 5 minuta na 500-1500 rpm. Ćelije se zatim resuspenduju u HAT medijumu (RPMI 1640 medijum koji sadrži 25 mM Hepes, 10% fetalni klon I serum (Hvclone), 1 mM natrijum piruvat, 4 mM L-glutamin, 10 mg/ml gentamicin, 2.5% Origen dodatak za kultivisanje - Origen culturing supplement (Fisher), 10% 653-conditioned RPMI 1640/Hepes medijum, 50 uM 2-merkaptoetanol, 100 u.M hipoksantin, 0.4 u.M aminopterin, i 16 pM timidin) i zatim naneseno na ploče po 200 pl/bunarčiću na 15 ploča za gajenje tkiva sa ravnim dnom i 96 binarčića. Ploče su zatim stavljene u inkubator sa regulisanom vlažnošću, na 37C sa 5% C02 i 95% vazduhom tokom 7 dana.

Detekcija humanih IgG anti-IL-12 antitela u mišijem serumu

EIA čvrste faze može se koristiti za skrinovanje mišijeg seruma za humana IgG antitela specifična na humani IL-12. Ukratko, ploče se mogu obložiti sa IL-12 ug/ml u PBS-u preko noći. Posel ispiranja u 0.15 M fiziološkom rastvoru koji sadrži 0.02% (v/v) Tvveen 20, bunarčići su blokirani sa 1% (w/v) BSA u PBS, 200uJ/bunarčiću tokom 1 h na ST. Ploče su isprane i zatim urađene probe sa 50 uL/bunarčiću HRP-obeleženim kozijim anti-humanim IgG, Fc specifičnim razblaženi 1:30,000 u 1% BSA-TBS tokom 1 sata na 37C. Ploče mogu biti ponovo isprane i 100 j.il/bunarčiću sa rastvorom citratnog fosfatnog pufera (0.1 M limunska kiselina i 0.2 M natrijum fosfat, 0.01% H2O2i 1 mg/ml OPD) dodato je tokom 15 minuta na ST. Stop rastvor (4N sulfurna kiselina) je tada dodat po 25 u.l/bunarčiću i očitan je OD na 490 nm preko automatskog plate spektorofotometra.

Detekcija kompletnih humanih imunoglobulina u supernatantima hibridoma

Hibridome sa pozitivnim rastom koje sekretuju kompletno humane imunoglobuline mogu se detektovati pomoću odgovarajućeg EIA. Ukratko, "pop out" ploče sa 96 bunarčića (VWR, 610744) mogu se obložiti sa 10 u.g/ml kozijih anti-humanih IgGFc u natrijum karbonatnom puferu preko noći na 4C. Ploče suisprane i blokirane sa 1% BSA-PBS tokom 1 sata na 37°C i odmah iskorišćene ili zamrznute na -20°C. Nerazblaženi supernatanti hibridoma su inkubirani na pločama tokom 1 sata na 37°C. Ploče su isprane i urađene su probe sa HRP obeleženim kozijim anti-humanim kappa razblaženim 1:10,000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na 37°C. Ploče su zatim inkubirane sa substratnim rastvorom kao što je ovde opisano.

Određivanje reaktivnosti potpuno humanih anti-IL-12

Hibridome kao one opisane u tekstu iznad, mogu biti istovremeno proverene u testu za reaktivnost sa IL-12 pomoću odgovarajućeg RIA ili drugih testova. Na primer, supernatantise inkubiraju na pločama sa anti-humanim IgGFc, isprane i zatim su urađene probe sa radioaktivno obeleženim IL-12 sa odgovarajući "count" po bunarčiću tokom 1 sata na ST. Bunarčići su isprani dva puta sa PBS i vezani radioaktivni obeleženi IL-12 je kvantifikovan pomoću odgovarajućeg brojača. Hibridome koje sekretuju huamni IgG anti IL-12 mogu se proširiti u ćelijskoj kulturi i serijski subklonirati limitirajućim razblaženjima. Dobijene populacije klonova mogu se proširiti i krio-sačuvati u medijumu za zamrzavanje (95% FBS, 5%DMSO) i čuvati u tečnom azotu.

Određivanje izotipova

Određivanje izotipova antitela može se postići uz pomoć EIA formata sličnog onom koji se koristi za skrining mišijeg imunog seruma za specifične titre. IL-12 može da obloži bunarčiće u pločama sa 96 bunarčića kaošto je gore opisano i prečišćena antitela 2 u.g/ml mogu se inkubirati na pločai tokom 1 sata na ST. Ploča se ispiraju i urade se probe sa HRP obeleženim kozijim anti-humanim IgGl ili HRP obeleženi koziji anti-humani IgG3 razblažen 1:4000 u 1% BSA-PBS tokom 1 sata na ST. Ploča se ponovo ispira i inkubira sa substratnim rastvorom kao što je gore opisano.

Kinetika vezivanja humanih anti-IL-12 antitela sa humanim IL-12

Karakteristike vezivanja antitela mogu se zgodno proceniti pomoću "capture"

(zadržavanja) EIA i BIAcore tehnologije, na primer. Stupnjevi koncentracija prečišćenih humanih IL-12 antitela mogu se proceniti za vezivanje za EIA ploče koje su obložene sa 2 u.g/ml IL-12 u testovima kao stoje gore opisano. OD mogu tada biti predstavljeni kao semi logaritamske PLOTS koji pokazuju relativnu efikasnost.

Kvantitativna konstanta vezivanja može se dobiti, npr, kao što sledi, ili bilo kojom pogodnom poznatom metodom. BIAcore CM-5 (karboksimetil) čip je smešten u BIAcore 2000 jedinicu. HBS pufer (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v P20 surfactant, pH7.4) je pušten preko protočne ćelije čipa 5uL/min dok se nije dobila stabilna bazna linija. Rastvor (100 uL) 15 mg EDC (N-etil-N'-(3-dimetil-aminopropil)-karbodiimid hidrohlorid u 200 pL vode dodat je u 100 uL rastvora 2.3 mg NHS (N-hidroksisukcinimid) u 200 uL vode. Četrdeset (40) pL dobijenog rastvora se injekcira u čip. Šest uL rastvora humanog IL-12 (15 p.g/ml u 10 mM natrijum acetatu, pH4.8) se injecira u čip, što rezultira u povišenju ca.500RU. Pufer se menja u TBS/Ca/Mg/BSA "running" pufer (20 mM Tris, 0.5 M natrijum hlorid, 2 mM kalciju hlorid, 2 mM magnezijum acetat, 0.5% Triton-X-100, 25 u.g/ml BSA, pH 7.4) i pušta da teče preko čipa preko noći da se ekvilibriše i hibridizuje ili zadrži bilo koji neizreagovani estri sukcinimida.

Antitela se rastvaraju u "running" pufreru na 33.33, 16.67, 8.33 i 4.17 nM. Nivo protoka je podešen na 30 p.g/min i temperaturu instrumenta na 25°C. Dve protočne ćelije su upotrebljene za kinetičke RUNS, jedna u kojoj je IL-12 imobilisan (uzorak) i drugi nederivatna protočna ćelija (blank). 120 pL svake knocentracije antitela se injecira preko protočnih ćelija pri 30 uL/min (asocoaciona faza) zatim je sledilo 360 sekundi neprekidnog protoka pufera (disociaciona faza). Površina čipa se regernerisala (faktor nekroze tkiva alfa/kompleks antitela disocirani) pomoću dve, jedna za drugom injekcije 30 uL 2 M guaniđin tiocijanata.

Analiza podataka urađena je pomoću BIA evaluation 3.0 ili CLAMP 2.0, kao što je poznato u ovoj oblasti. Za svaku koncentraciju antitela blank sensogram je oduzet od sensograma uzorka. "Global fit" je urađen za obe disocijaciju (kd, sec-1) i asocijaciju (ka, mol-lsec-1) i disociaciona konstanta (Kd, mol) proračunato (kd/ka). Tamo gde je afinitet antitela dovoljno veliki da RU uhvaćenih antitela je veći od 100, puštena su dodatna razblaženja antitela.

Rezultati i diskusija

Generisanje anti-humanih IL-12 monoklonalnih antitela

Urađeno je nekoloko fuzija i svaka fuzija je posejana na 15 ploča (1440 bunarčića/fuziji) koji su doveli do nekoliko desetina antitela specifičnih za humani IL-12. Za neke od ovih je pronađeno da sadrže kombinaciju humanih i mišijih Ig lanaca. Ostale hibridome sekretuju anti-IL-12 antitela koja se sastoje samo od humanih teških i lakih lanaca. Za sve humane hibridome se očekuje da su IgGl.

Kinetika vezivanja humanih anti-humanih IL-12 antitela

ELISA analiza je potvrdila da prečišćena antitela iz većine ili svih hibridoma vezuju IL-12 na način zavistan od koncentracije. Slike 1-2 prikazuju rezultate relativne efikasnosti vezivanja ovih antitela. U ovom slučaju izmerena je aviditv antitela za srodni antigen (epitop). Treba naglasiti da vezivanje IL-12 direktno za EIA ploču može dovesti do denaturacije proteina i vezivanja koja se odigraju ne mogu biti prava slika vezivanja nedenaturisanog proteina. Pedeset posto vezivanja je spadalo u opseg koncentracija.

Konstanta kvantitativnog vezivanja se dobija pomoću BIAcore analize humanih antitela i otkriva nekoliko humanih monoklonalnih antitela koja imaju visoku KD u rasponu od IXIO9 do 7X10'n.

Zaključci

Izvedeno je nekoliko fuzija pomoću splenocita (ćelije slezine) iz hibridnih miševa koji sadrže humane transgene za varijabilan i konstantan region antitela koji su imunizovani sa humanim IL-12. Generisanje set nekoliko kompletno humanih IL-12 reaktivnih IgG monoklonalnih antitela IgG izotipa. Kompletno humana anti-IL-12 antitela su dalje okarakterisana. Nekoliko generisanih antitela imaju konstante afiniteta izmeĆu 1X10<9>i 9X10<n>. Neočekivano visoki afiniteti ovih potpuno humanih monoklonalnih antitela čini ih pogodnim za terapeutske primene kod IL-12-povezanih obolenja, patologija ili povezanih stanja.

Primer 3: C340 je neutrališuće humano monoklonalno antitelo

Pokazano je da se bioaktivnost IL-12 može neutralisati od strane C340 različitim IL-12 zavisnim testovima aktivnosti. Pošto IL-12 pojačava proizvodnju IFN GAMMA proizvodnju od strane NK ćelija i T limfocita, ispitan je efekat C340 antitela na "UP"~regulaciju IFN Li GAMMA iRNK i efekat C340 na proizvodnju IFN 11 GAMMA (Trinchieri, G, Current Opinion in Immunologv, 9:17-23 (1997), Morris, S.C., et al, Journal of Immunologv, 152:1047-1056 (1994)). Takođe je u ovim studijama ispitana sposobnost C340 da neutrališe vođenu IL-12 indukciju aktivnosti limfokinom aktiviranih ćelija ubica (Lvmphokine activated killer (LAK)) (Kutza, J. and Murasko, D. M, Mechansimsm of ageing and development, 90:209-222 (1996), Stern, A.S, et al, Proceedings of the National Academy of sciences of the U. S. A, 87:6808-6812 (1990)). Na kraju je testiran efekat C340 na "UP" regulaciju, posredovanu sa IL-12, ekspresije CD95 na površini T i NK ćelija (Medvedev, A. E, et al, Cvtokine, 9:394-404 (1997)).

Inhibicija transkripcije IFN gamma i RNK

Da bi se odredilo da li C340 inhibira transkripciju IFN GAMMA indukovanu sa IL-12 IL-2 u humanom PBL, izveden je test PCR reverzne transkripcije. Specifični prajmeri za P-aktin (kontrola za sadržaj i integritet iRNK) i INF GAMMA su korišćeni za umnožavanje cDNK dobijene iz stimulisanih humanih PBL. Slika 3 prikazuje kako C340 "đown" reguliše IFN GAMMA iRNK u IL-12/IL-2 aktiviranim (dva sata) PBMC.

Inhibicija intracelularnog INF GAMMA izmerena protočnom (flow) citometrijom

Kao odgovor na različite signale i kao mera aktivacije, T ćelije i NK ćelije mogu biti indukovane da sekretuju citokine. Još detaljnije, PBL tretirani sa IL-2 i IL-12 iniciraju suštinsku sintezu IFN gamma u toku 4-8 sata posle stimulacije. Produkcija se može detektovati u citoplazmi PBL tretiranih sa Brefeldinom-A pomoću protočne citometrije. Slika 4 demonstrira 60% redukciju proizvodnje IFN GAMMA u ovakvim kulturama kada se doda C340 IL-12 u kombinaciji sa ILI2 tokom 5 časova.

Inhibicija sekrecije IFN GAMMA indukovane sa IL-12

Slika 5 jasno pokazuje dve različite grupe C340 koje inhibiraju sekreciju IFN Li GAMMA! j od strane limfocita periferne krvi i to na dozno zavistan način. Četiri stotine pikograma IL-12 je unapred pomešano sa različitim količinama C340 i zatim je dodavano u kulture PBL stimulisane sa IL-2. Kada je izmeren IFN GAMMA li pomoću EIA posle 18-24 časa inkubacije, detektovane su značajno smanjene količine IFNHGAMMA i to 1 ?g/mL C340 antitela.

Inhibicija LAK ćelijske citotoksičnosti indukovane sa IL-12

Raji ćelije, IL-12 senzitivne izvedene ćelijske linije Burkitovog limfoma, su rezistrentne na NK ćelije. LAK ćelija senzitivna ćelijska linija. Raji ćelije u triplikatu, su gajene četiri sata sa LAK ćelijama koje su aktivirane sa 400 pg/mL IL-12 i 10 U/mL IL-2 u prisustvu i odsustvu humanog monoklonalnog antitela C340 (5000 ng/mL ili 50 ng/mL). Slika 6 pokauje rezultate iz tri normalna, zdrava donora. IL-12+IL-2 aktivacija efektirnih ćelija je rezultirala u povišenoj citotoksičnoj aktivnostikod ćelija koje su aktivirane smo sa IL-2. C340 antitela su inhibirala ovaj efekta zavistan od IL-12. Veličina inhibicije je bila povezana sa koncentracijom antitela, gde je najveća testirana koncentracija redukovala citotoksični efekat do osnovnog nivoa.

Inhibicija CD95 "up" regulacije

U izveštajima je opisana "up" regulacija CD95 indukovana sa IL-12 na površini visoko prečišćenih CD56+PBL. Kao što se može videti na slikama 7A i 7B, distribuciona analiza protočnom citometrijom je otkrila da je ekspresija CD95 značajno "up" regulisana na CD3+T ćelijama i CD56+NK ćelijama posle tretiranja sa IL-12 plus IL-2 tokom 72 sata. Dodatna tretiranja sa anti-IL-12 inhibirala su ekspresiju CD95 u obe populacije i CD3+ i CD56+. CD3+ ćelije inhibirane 50% (slika 7A). gde su CD56+ ćelije inhibirane 85% (slika 7B), kao što je dokazano smanjenim MFI indeksom (veći procenat nego kod nestimulisane kontrole).

Primer4: Kloniranje gena i njihova karakterizacija

Klonirani su i prečišćeni ragmenti genomske DNK koji sadrže ili C340 gen za težak lanac ili C340 gen za laki lanac. Genomska DNk prečišćena iz C340 hibridoma ćelija je delimično isečena na Saul restrikcionim enzimom i odabrane su po veličini fragmenti pomoću frakcionacije centrifugiranjem u gradijentu saharoze 10-40%. DNK fragmenti veličine 15-23 kb su klonirani u bakteriofagni vektor EMBL3 (komercijalan vektor?) i upakovan u fage. Nekoliko reakcija pakovanja rezultiralo je bibliotekom od 1 miliona klonova bakteriofaga. Oko 600,000 klonova iz biblioteke su pregledani plaknom hibridizacijom (plaque hibridization) pomoću genomskih fragmenata obeleženih sa 32P koji su sadržalikao probe sekvence ili konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG ili konstantnog regiona humanog kappa lakog lanca. Detektovano je trinaest klonova teškog lanca i trinaest klonova lakog lanca. Od ovih je odabrano tri klona teškog lanca i četiri klona lakog lanca i prečišćeno je sa dodatne dve runde skrininga. Za jedan od klonova za teški lanac i dva klona lakog lanca pokazano je da sadrže 5' i 3' krajeve kodirajućih sekvenci pomoću PCR analize bakteriofagne DNK. DNK insert u klonu teškog lanca (heavy chain HC) H4 je bio veličine 16 kb i uključivao je 3.6 kb okolne 5' i najmanje 2 kb okolne 3' sekvence. DNK insert u klonu lakog lanca (light chain LC) LC1 je bio veličine 15 kb i uključivao je4.4 kb okolne 5' i 6 kb okolne 3' sekvence. Kompletni inserti su uklonjeni iz bakteriofagnog vektora kao Sali fragmenti i klonirani između XhoI i Sali mesta plazmidnog ekspresionog vektora pl351, koji je obezbedio gpt selektivni gen marker. Pošto je u okviru kodirajuće sekvence za varijabilni region teškog lanca postojalo Sali mesto, dva Sali fragmenta su morala da se prebace iz bakteriofaga H4 u p 1351 ekspresioni vektor. Dobijeni ekspresioni plazmidi sa teškim i lakim lancem su nazvani pl560 i pl558. Orjentacije gena za teški i laki lanac u ova dva plazmida u odnosu na sekvencu p 1351 vektora određene su resrikcionom analizom i PCR-om. U oba slučaja orjentacija je bila takva daje 5' kraj fragmenta Ab gena bio ispred 3' kraja gpt gena. Oba lanca kodirajućih regiona kloniranih gena su sekvencirana. Sekvence plazmida p!560 i p pl558 su prikazane na slikama 11A-11K i slikama 13A-13J.

Primer 5: Priprema rekombinantnih ćelijksih linija

Plazmid teškog lanca pl560 je linearizovan sečenjem sa Pvul restrikcionim enzimom i plazmid lakog lanca pl588 je linearizovan sa Sali restrikcionim enzimom. p3X63Ag8.653 (653) i SP2/0-Agl4 (SP2/0) ćelije su odvojeno transfektovane sa unapred pomešanim plazmidima pomoću elektroporacije i ćelije su gajene i transfektanti selektovani pomoću monofenolne kiseline kao što je opisano (Knight, et al, Molecular lmmunology 30:1443 (1993)). Za supernatante ćelija iz kolonija rezistantnih na fenolnu kiselinu su urađeni testovi za humani IgG (i.e, rekombinantni C340 (rC340)) približno dve nedelje kasnije. Za ovu potrebu ćelijski supernatanti su inkubirani na ELISA pločama sa 96 bunarčića koji su obloženi sa kozijim antitelima specifičnim za Fc deo humanog IgG. Humani IgG koji su se vezivala za obložene ploče detektovana su pomoću kozijeg anti-humanog IgG antitela (težak lanac + laki lanac) koji je konjugovano sa alkalnom fosfatazom i substrata za alkalnu fosfatazu kao što je opisano (Knight, et al, Molecular Immunologv 30:1443 (1993)). Ćelije iz klonova koji su više produktivne prebačene su na šolje za gajenje sa 24 bunarčića u standardni medijum i razvijane (IMDM, 5% FBS, 2mM glutamin, selekcioni miks mikofenolne kiseline). Količina proizvedenih antitela (i.e, sekretovana u medijum potrošene kulture) je pažljivo kvantifkovana ELISA testom pomoću prečišćenog C340 mAb (Ma) kao standarda. Odabrani klonovi su razvijeni u T75 flaskovima i proizvodnja humanog IgG od strane ovih klonova je kvantifikovana pomoću ELISA testa. Na osnovu ovih vrednosti subklonirano je šest nezavisnih 653 transfektanata i tri nezavisna SP2/0 transfektanata (zasejavanjem u prošeku jednog semena po bunarčiću u pločama sa 96 bumarčića), količina proizvedenih antitela je određena testom (ELISA) supernatanta od pojedinačnih kolonija subklonova. Tri subklona, 653 transfektant 19-20 (C379B) i SP2/0 transfektanti 84-81 (C381) i 22-56 (C389A) selektovanio su za dalju analizu.

Test za vezivanje antigena rC340

Pre subkloniranja selektovane ćelijske linije koje su gore opisane, ćelijski supernatanti od tri roditeljske linije (653 transfektantski klon 2 i klon 18 i SP2/0 transfektantski klon 1) su iskorišćene za testiranje antigenskih vezujućih karakterisktika rC340. Koncentracije rC340 u tri uzorka ćelijskih supernatanta, ili prečišćene C340 pozitivne kontrole su zatim inkubirane na pločama sa 96 bunarčića koje su obložene sa 2 pg/ml humanog IL-12. Vezana mAb (Ma) su zatim detektovana pomoću kozijeg anti-humanog IgG antitela (težak lanac + laki lanac) koji je konjugovano sa alkalnom fosfatazom i odgovarajućih substrata za alkalnu fosfatazu. Kao što je prikazano na slici 8, rC340 se specifično vezivao za humani IL-12 na način koji se nije razlikovao od originalnog C340 mAb (Ma).

Karakterizacija selektovanih ćelijskih linija

Izvedene su analize krivi rasta za C379B, C381A i C389A zasejavanjem u T75 flaskove sa početnom ćelijskom gustinom od 2 X 10<5>ćelija/ml u standardnom medijumu ili SFM-5 medijumu bez seruma i zatim je posmatran broj ćelija i koncentracoja rC340 svakog dana sve dok se kulture nisu potrošile. Rezultati kultura u standardnom medijumu su prikazani na slikama 9A-9C. Maksimalni nivoi proizvodnje C379B, C381A i C389A su bili 135 p.g/ml, 150 pg/ml, i 110 ug/ml. Pokušaji da se C379B ćelije prilagode na SFM-5 medijum nisu bili uspešni. Ćelije C381A su proizvodile istu količinu rC340 u SFM-5 medijumu kao i u standardnom medijumu, dok su C389A ćelije proizvodile samo polovinu rC340 u SFM-5 medijum u odnosu na standardni medijum.

Stabilnost proizvodnje rC340 mAb (Ma) tokom vremena za tri klona je procenjena gajenjem ćelija na šoljama sa 24 bunarčića sa standardnim medijumom ili standardnim medijumom bez selekcije sa mikofenolnom kiselinom tokom različitih vremenskih perioda. Zapaženo je za linije C379B i C381A da stabilno produkuju rC340 u prisusutvu i odsusutvu selekcije tokom perioda od 30 dana (maksimalno vreme testiranja) i 75 dana. Linija C389A je bila nestabilna i posle 43 dana gajenja proizvela je samo 20% više antitela u odnosu na početak studija.

Biće jasno da ovaj pronalazak može da se primeni na drugi način nego što je opisano u ovim opisima i primerima.

Claims

1. Nukleinska kiselina koja kodira anti-IL-12 antitelo sisara koje ima promenjivi region teškog lanca SEQ ID NO: 7 i promenjivi region lakog lanca SEQ ID NO: 8.

2. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 1.

3. Anti-IL-12 antitelo sisara koje sadrži promenjivi region teškog lanca SEQ ID: 7 i promenjivi region lakog lanca SEQ ID NO:8.

4. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1, ćelija domaćina prema zahtevu 2 ili antitelo prema zahtevu 3 gde je antitelo humano.

5. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1, ćelija domaćina prema zahtevu 2 ili antitelo prema zahtevu 3 ili zahtevu 4, gde antitelo ima konstantu afiniteta između 1 x IO9 i 7x1012.

6. Kompozicija koja sadrži (a) antitelo prema bilo kom od zahteva 3-5 i (b) farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 3-5, ili kompozicija prema zahtevu 6 za primenu u dijagnozi ili terapiji.

8. Antitelo prema bilo kom od zahteva 3-5, ili kompozicija prema zahtevu 6 za primenu u lečenju psorijaze.

9. Antitelo prema bilo kom od zahteva 3-5, ili kompozicija prema zahtevu 6, za primenu u lečenji psorijatičnog artritisa, sarkoidoze ili Kronove patologije.