ES2323760T3 - Anticuerpos anti-il-12, composiciones, metodos y usos. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de mamífero anti-IL-12 que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
Description
Anticuerpos
anti-IL-12, composiciones, métodos y
usos.
La presente invención se refiere a anticuerpos
específicos para la proteína interleuquina-12
(IL-12), así como a ácidos nucleicos que codifican
tales anticuerpos anti-IL-12,
células huésped, y formulaciones terapéuticas y usos de los
mismos.
Interleuquina-12
(IL-12) es una citoquina heterodimérica que consiste
en cadenas polipeptídicas glicosiladas de 35 y 40 kD que están
unidas por puentes disulfuro. La citoquina es sintetizada y
secretada por las células presentadoras de antígeno incluyendo
células dendríticas, monocitos, macrófagos, células B, células de
Langerhans y queratinocitos así como células citolíticas naturales
(NK). IL-12 media una variedad de procesos
biológicos y se ha denominado como factor estimulador de células NK
(NKSF), factor estimulador de células T, factor de maduración de
linfocitos T citotóxicos y factor de línea de células B
transformadas por EBV (Curfs, J.H.A.J et al., Clinical
Microbiology Reviews, 10:742-780 (1997)).
Interleuquina-12 se puede unir
al receptor de IL-12 expresado en la membrana
plasmática de células (por ejemplo, células T, célula NK),
alterando de esta manera (por ejemplo, iniciando, previniendo)
procesos biológicos. Por ejemplo, la unión de IL-12
al receptor de IL-12 puede estimular la
proliferación de células T y células NK preactivadas, aumentar la
actividad citolítica de células T citotóxicas (CTL), células NK y
células LAK (células citolíticas activadas por linfoquina), inducir
producción de interferón gamma (IFN GAMMA) por células T y células
NK e inducir diferenciación de células Th0 indiferenciadas a células
Th1 que producen IFN GAMMA e IL-2 (Trinchieri, G.,
Annual Review of Immunology, 13:251-276 (1995)). En
particular, IL-12 es esencial para la generación de
células citolíticas (por ejemplo, NK, CTL) y para montar una
respuesta inmune celular (por ejemplo, una respuesta inmune mediada
por células Th1). De esta manera, IL-12 es
críticamente importante en la generación y regulación tanto de
inmunidad protectora (por ejemplo, erradicación de infecciones) como
respuestas inmunes patológicas (por ejemplo, autoinmunidad)
(Hendrzak, J.A. y Brunda, M.J., Laboratory Investigation,
72:619-637 (1995)). Según esto, una respuesta inmune
(por ejemplo, protectora o patogénica) se puede aumentar, suprimir
o prevenir mediante manipulación de la actividad biológica de
IL-12 in vivo, por ejemplo, por medio de un
anticuerpo.
Los anticuerpos de mamíferos no humanos,
quiméricos, policlonales (por ejemplo, anti-sueros)
y/o monoclonales (Mab) y fragmentos (por ejemplo, productos de
digestión proteolítica o proteínas de fusión de los mismos) son
agentes terapéuticos potenciales que se están investigando en
algunos casos para intentar tratar ciertas enfermedades. Sin
embargo, tales anticuerpos o fragmentos pueden provocar una
respuesta inmune cuando se administran a seres humanos. Tal
respuesta inmune puede producir una depuración mediada por complejos
inmunes de los anticuerpos o fragmentos de la circulación y hace la
administración repetida no adecuada para terapia, reduciendo por lo
tanto el beneficio terapéutico para el paciente y limitando la
readministración del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la
administración repetida de anticuerpos o fragmentos que comprenden
partes no humanas puede producir enfermedad del suero y/o
anafilaxia. Para evitar estos y otros problemas, se han tomado un
número de propuestas para reducir la inmunogenicidad de tales
anticuerpos y partes de los mismos, incluyendo la quimerización y
humanización, como es bien sabido en la técnica. Estos y otros
enfoques, sin embargo, aún pueden producir anticuerpos o fragmentos
que tiene alguna inmunogenicidad, baja afinidad, baja avidez, o con
problemas en cultivo celular, aumento a escala, producción y/o
rendimientos bajos. De esta manera, tales anticuerpos o fragmentos
pueden ser menos que idealmente adecuados para la fabricación o uso
como proteínas terapéuticas.
Según esto, existe una necesidad para
proporcionar anticuerpos anti-IL-12
o fragmentos que superen uno o más de estos problemas, así como
mejoras sobre anticuerpos conocidos o fragmentos de los mismos.
WO 99/37682 se refiere anticuerpos
anti-IL-12 humana específicos del
heterodímero p75 que se dice que están caracterizados por una
potencia mayor y eficacia mejor en neutralizar la bioactividad de
IL-12 humana que los anticuerpos monoclonales
contra IL-12 específicos del heterodímero. Los
anticuerpos específicos del heterodímero se dice que reconocen uno
o más epítopos del heterodímero p75 de IL-12 humana,
pero que no se unen a la subunidad p40 sola. Los anticuerpos contra
IL-12 específicos del heterodímero se dicen que
neutralizan la bioactividad de IL-12 de mono Rhesus
con una potencia similar a su potencia para neutralizar la
bioactividad de IL-12 humana haciendo de ellos
antagonistas útiles de IL-12.
La presente invención proporciona anticuerpos
anti-IL-12 aislados humanos, de
primates, roedores, mamíferos, quiméricos, humanizados y/o
injertados con CDR, composiciones de anticuerpos
anti-IL-12, ácidos nucleicos que
los codifican, células huésped, composiciones, y usos de las mismas,
como se describe y permite aquí, en combinación con lo que es
conocido en la técnica.
\newpage
El anticuerpo según la presente invención se
define en la reivindicación 3. Un anticuerpo de la invención puede
derivar de cualquier mamífero, tal como pero no limitado a un ser
humano, un ratón, un conejo, una rata, un roedor, un primate, o
cualquier combinación de los mismos y similares.
La presente invención también proporciona el
ácido nucleico definido en la reivindicación 1; la célula huésped
definida en la reivindicación 2; la composición definida en la
reivindicación 6; y los anticuerpos o composiciones definidas en
las reivindicaciones 7-9.
La presente especificación divulga moléculas
aisladas de ácido nucleico que comprenden, complementario a, o que
hibrida con, un polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo
anti-idiotipo contra IL-12, que
comprende al menos una secuencia, dominio, parte o variante
especificada del mismo. La presente especificación además divulga
vectores recombinantes que comprenden dichas moléculas de ácido
nucleico que codifican el anticuerpo anti-idiotipo
contra IL-12, células huésped que comprenden tales
ácidos nucleicos y/o vectores recombinantes, así como métodos para
hacer y/o usar tales ácidos nucleicos de anticuerpos
anti-idiotipo, vectores y/o células huésped.
La presente especificación también divulga al
menos un método para expresar al menos un anticuerpo
anti-IL-12, o un anticuerpo
anti-idiotipo de IL-12, en una
célula huésped, que comprende cultivar la célula huésped como se
describe aquí en condiciones en donde al menos se expresa un
anticuerpo anti-IL-12 en cantidades
detectables y/o recuperables.
La presente invención también proporciona al
menos una composición que comprende (a) un anticuerpo aislado como
se describe aquí; y (b) un soporte o diluyente adecuado. El soporte
o diluyente puede ser opcionalmente farmacéuticamente aceptable,
según soportes o diluyentes conocidos. La composición puede
opcionalmente comprender además al menos un compuesto, proteína o
composición adicional.
La presente especificación además divulga al
menos un método o composición de un anticuerpo
anti-IL-12, para administrar una
cantidad terapéuticamente eficaz para modular o tratar al menos una
afección relacionada con IL-12 en una célula,
tejido, órgano, animal o paciente, y/o antes de, posterior a, o
durante una afección relacionada, como se describe aquí.
La presente especificación también divulga al
menos una composición, dispositivo y/o método de distribución de
una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de al menos un
anticuerpo anti-IL-12, según la
presente invención.
La presente especificación divulga además al
menos un método o composición de un anticuerpo
anti-IL-12, para el diagnóstico de
al menos una afección relacionada con IL-12 en una
célula, tejido, órgano, animal o paciente, y/o antes de, posterior
a, o durante una afección relacionada, como se describe aquí.
La presente especificación también divulga al
menos una composición, dispositivo y/o método de distribución para
el diagnóstico de al menos un anticuerpo
anti-IL-12, según la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1A y 1B son gráficos que muestran la
unión dependiente de la concentración de mAb humano
anti-IL-12 a IL-12
humana inmovilizada. Se hicieron diluciones en serie de los
anticuerpos anti-IL-12 en BSA al
1%/PBS y se incubaron en placas recubiertas de
IL-12 hr durante 1 hora a 37ºC. Las placas se
lavaron dos veces con Tween 20 al 0,02% (monolaurato sorbitano de
polioxietileno (20)), solución salina 0,15 M y después se ensayaron
con anticuerpo específico anti-IgG kappa humano de
cabra marcado con peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo, se
desarrollaron con sustrato o-fenilendiamina (OPD) y
se midió la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 490 nm.
Figura 2: Los carriles de izquierda a derecha en
las figuras A y B contienen IL-12 humana, p40 de
IL-12 humana, IL-12 murina, y
marcadores de peso molecular preteñidos. La figura 2A muestra bandas
teñidas a partir de proteína total. Las bandas principales en cada
carril son IL-12 humana (75 kd),
IL-12 humana p40 (40 kd), e IL-12
murina (75 kd). La figura 2B muestra una inmunotransferencia
preparada de un gel idéntico al mostrado en la figura 2A. La
membrana se hizo reaccionar con C340 seguido por IgG
anti-humana de cabra marcada con HRP y se detectó
específicamente IL-12 humana (monómero y multímeros)
e IL-12 p40 humana solo. Una membrana control (no
mostrado) que se hizo reaccionar IgG anti-humana de
cabra marcada con HRP no mostró ninguna banda.
Figura 3: Análisis por transcripción
inversa-PCR de la expresión del gen de IFN\gamma
en PBL humanos tratados con IL-2,
IL-12, IL-2+IL-12
con y sin anticuerpo anti-IL-12
C340, 8.6.2, anticuerpo isotipo control. Se hizo una transcripción
inversa del ARN total, se amplificó mediante PCR usando cebadores
específicos del gen. También se determinó el nivel del ARNm de
\beta-actina en cada muestra que sirvió como
control para la integridad y contenido de ARNm.
La figura 4 es un histograma que muestra que el
mAb humano anti-IL-12 (C340) inhibe
la producción de interferón-\gamma (IFN\gamma)
por células monocíticas de sangre periféricas (PBMC) CD3+ con
monocitos eliminados estimuladas con IL-2 más
IL-12. Las PBMC se cultivaron durante cinco horas en
medio control (sin citoquinas añadidas, medio suplementado con
IL-12 (0,1 ng/ml) más IL-2 (50
UI/ml) (IL-12/IL-2), medio control
que contenía mAb C340
(10 \mug/ml) y medio IL-12/IL-2 que contenía mAb C340 (10 \mug/ml). El IFN\gamma intracelular se midió mediante inmunotinción de dos colores con CD3-PE e IFN\gamma-FITC. Se muestran los datos para un donante.
(10 \mug/ml) y medio IL-12/IL-2 que contenía mAb C340 (10 \mug/ml). El IFN\gamma intracelular se midió mediante inmunotinción de dos colores con CD3-PE e IFN\gamma-FITC. Se muestran los datos para un donante.
La figura 5 es un gráfico que muestra la
inhibición dependiente de la dosis de la secreción de IFN\gamma
por linfocitos de sangre periférica estimulados con
IL-2 más IL-12 con dos lotes
diferentes de un mAb humano
anti-IL-12 (C340). Se cultivaron los
PBL humanos (8 x 106/ml) durante 24 horas con IL-2
10 U/ml, IL-2 más IL-12 400 pg/ml,
o IL-2 más IL-12 y mAb C340 como se
indica. Los sobrenadantes del cultivo se recogieron y se ensayaron
para IFN\gamma mediante EIA.
La figura 6 es un histograma que muestra la
inhibición dependiente de dosis de la citotoxicidad de células LAK
inducidas con IL-12 más IL-2 por un
mAb humano anti-IL-12 (C340). Las
células efectoras LAK (PBL humanas,
8 x 106/ml) se cultivaron durante 24 horas con IL-12 (400 ng/ml) más IL-2 (10 U/ml) y mAb C340 (5000 ng/ml ó 50 ng/ml, como se indica). Las células efectoras LAK se lavaron y se cultivaron con células diana Raji marcadas con 51Cr durante cuatro horas a una relación de efector a diana (E:T) de 80:1, y se midió la cantidad de 51Cr liberado en el medio tras la lisis de las células Raji. Los resultados se expresan como la media de tres donantes normales y error estándar. El control positivo de IL-12 (IL-12) son células efectoras incubadas con IL-12 y sin anticuerpo. El fondo (FONDO) es células efectoras incubadas sin IL-12 ni anticuerpo.
8 x 106/ml) se cultivaron durante 24 horas con IL-12 (400 ng/ml) más IL-2 (10 U/ml) y mAb C340 (5000 ng/ml ó 50 ng/ml, como se indica). Las células efectoras LAK se lavaron y se cultivaron con células diana Raji marcadas con 51Cr durante cuatro horas a una relación de efector a diana (E:T) de 80:1, y se midió la cantidad de 51Cr liberado en el medio tras la lisis de las células Raji. Los resultados se expresan como la media de tres donantes normales y error estándar. El control positivo de IL-12 (IL-12) son células efectoras incubadas con IL-12 y sin anticuerpo. El fondo (FONDO) es células efectoras incubadas sin IL-12 ni anticuerpo.
Las figuras 7A y 7B son histogramas que muestran
que la expresión de CD95 inducida por IL-12 más
IL-2 en células mononucleares CD3+ de sangre
periférica se inhibe por mAb humano
anti-IL-12 (C340). Se cultivaron las
PBMC durante 72 horas en medio que contenía 0,1 ng/ml de
IL-12 y una dosis subóptima de IL-2
(50 UI/ml) en presencia o ausencia del mAb C340 (10 \mug/ml). La
expresión de CD95 se midió mediante citometría de flujo de las
células teñidas con anti-CD95-FITC.
La selección de poblaciones se realizó usando análisis de dos
colores (CD3 ó CD56-PE frente a
CD95-FITC) y dispersión de la luz frontal frente a
ortogonal.
La figura 8 es un gráfico que muestra que los
anticuerpos humanos recombinantes
anti-IL-12 humana (rC340) se unen a
IL-12 inmovilizada en una manera que es
indistinguible del mAb C340 purificado. Se determinó la
concentración de rC340 en los sobrenadantes de tres líneas celulares
productoras de rC340, y los sobrenadantes se evaluaron para la
unión a IL-12 en un ELISA. Las placas se cubrieron
con IL-12 humana 2 \mug/ml y se incubaron con mAb
C340 purificado del hibridoma original (estándar) o los
sobrenadantes de las líneas celulares recombinantes. Se detectó el
anticuerpo unido a IL-12 usando IgG (cadena pesada +
cadena ligera) anti-humana de cabra conjugada con
fosfatasa alcalina.
Las figuras 9A-9C son gráficos
que muestran la cinética de crecimiento y la cantidad de anticuerpo
secretado por tres subclones de células recombinantes productoras
de rC340 derivados independientemente (Figura 9A, subclon C379B;
figura 9B, subclon C381A; Figura 9C, subclon C389A). Las células
recombinantes se sembraron en botellas T75 a una densidad inicial
de 2 x 10^{5} células/ml en medio estándar. A varios tiempos, las
células se resuspendieron y se determinó el número de células vivas
y la cantidad (\mug/ml) de rC340 en el medio.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona anticuerpos
anti-IL-12 aislados, recombinantes
y/o sintéticos humanos, de primate, roedor, mamífero, quiméricos,
humanizados o injertados con CDR, así como composiciones y moléculas
de ácido nucleico codificantes que comprenden al menos un
polinucleótido que codifica al menos un anticuerpo
anti-IL-12 de la invención. La
presente invención incluye además, pero no está limitada a, usos de
tales anticuerpos, por ejemplo en composiciones diagnósticas y
terapéuticas, métodos y dispositivos.
Como se usa aquí, un "anticuerpo
anti-interleuquina-12",
"anticuerpo anti-IL-12",
"parte de anticuerpo
anti-IL-12" o "fragmento de
anticuerpo anti-IL-12" y/o
"variante de anticuerpo
anti-IL-12" y similares incluye
cualquier molécula que contiene proteína o péptido que contiene al
menos una parte de una molécula de inmunoglobulina, tal como pero
no limitada a al menos una región determinante de complementariedad
(CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de unión al ligando
de la misma, una región variable de una cadena pesada o una cadena
ligera, una región constante de una cadena pesada o una cadena
ligera, una región marco, o cualquier parte de la misma, o al menos
una parte de un receptor o proteína de unión a
IL-12, que se puede incorporar en un anticuerpo de
la presente invención. Tal anticuerpo opcionalmente además afecta a
un ligando específico, tal como pero no limitado a donde tal
anticuerpo modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga,
alivia, bloquea, inhibe, abroga y/o interfiere con al menos una
actividad o unión de IL-12, o con la actividad o
unión de receptor de IL-12, in vitro, in
situ y/o in vivo. Como ejemplo no limitante, un
anticuerpo anti-IL-12 adecuado,
porción o variante especificada de la presente invención se puede
unir al menos a una IL-12, o partes especificadas,
variantes o dominios de las mismas. Un anticuerpo
anti-IL-12 adecuado, parte
especificada, o variante también puede opcionalmente afectar al
menos a una actividad o función de IL-12, tal como
pero no limitada a síntesis de ARN, ADN o proteína, liberación de
IL-12, señalización del receptor de
IL-12, corte de IL-12 de membrana,
actividad de IL-12, producción y/o síntesis de
IL-12. El término "anticuerpo" se pretende
además que abarque anticuerpos, fragmentos de digestión, partes
especificadas y variantes de los mismos, incluyendo miméticos de
anticuerpos, o que comprenden partes de anticuerpos que mimetizan la
estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o
parte del mismo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y
fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen
fragmentos de unión a antígeno que se unen a IL-12
de mamífero. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de
unirse a IL-12 o partes de la misma, incluyendo,
pero no limitados a fragmentos Fab (por ejemplo, mediante digestión
con papaína), Fab' (por ejemplo, mediante digestión con pepsina y
reducción parcial) y F(ab')_{2} (por ejemplo, mediante
digestión con pepsina), fabc (por ejemplo, mediante digestión con
plasmina), pFc' (por ejemplo, mediante digestión con pepsina o
plasmina), Fd (por ejemplo, mediante digestión con pepsina,
reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (por ejemplo,
mediantes técnicas de biología molecular), están abarcados por la
invención (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology,
supra).
Tales fragmentos se pueden producir mediante
corte enzimático, técnicas sintéticas o recombinantes, como se sabe
en la técnica y/o como se describe aquí. Los anticuerpos también se
pueden producir en una variedad de formas truncadas usando genes de
anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de
terminación 5' del sitio natural de terminación. Por ejemplo, se
puede diseñar un gen combinación que codifique una parte de cadena
pesada F(ab')_{2} para incluir secuencias de ADN que
codifiquen el dominio CH_{1} y/o la región bisagra de la cadena
pesada. Las diferentes partes de los anticuerpos se pueden unir
químicamente mediante técnicas convencionales, o se pueden preparar
como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería
genética.
Como se usa aquí, el término "anticuerpo
humano" se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente cada
parte de la proteína (por ejemplo, CDR, marco, dominios C_{L},
C_{H} (por ejemplo, C_{H}1, C_{H}2, C_{H}3), bisagra,
(V_{L}, V_{H})) es sustancialmente no inmunogénica en seres
humanos, con sólo cambios o variaciones minoritarios de secuencia.
De forma similar, los anticuerpos designados de primate (mono,
babuino, chimpancé, etc.), de roedor (ratón, rata, conejo, cobaya,
hámster, y similares) y de otros mamíferos designan tales
anticuerpos específicos de especie, subgénero, género, subfamilia,
familia. Además, los anticuerpos quiméricos incluyen cualquier
combinación de los anteriores. Tales cambios o variaciones
opcionalmente y preferiblemente retienen o reducen la
inmunogenicidad en seres humanos u otras especies relativos a los
anticuerpos no modificados. De esta manera, un anticuerpo humano es
distinto de un anticuerpo quimérico o humanizado. Se señala que un
anticuerpo humano se puede producir por un animal no humano o célula
procariota o eucariota que es capaz de expresar genes de
inmunoglobulina humana (por ejemplo, cadena pesada y/o cadena
ligera) funcionalmente reorganizados. Además, cuando un anticuerpo
humano es un anticuerpo de cadena sencilla, puede comprender un
péptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos nativos
humanos. Por ejemplo, un Fv puede comprender un péptido enlazador,
tal como de dos hasta alrededor de ocho glicinas u otros residuos de
aminoácidos, que une la región variable de la cadena pesada y la
región variable de la cadena ligera. Tales péptidos enlazadores se
considera que son de origen humano.
También se pueden usar anticuerpos
biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados o similares que
son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o
humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos
antígenos diferentes. En el presente caso, una de las
especificidades de unión es para al menos una proteína
IL-12, la otra es para cualquier otro antígeno. Los
métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la
técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos
biespecíficos se basa en la co-expresión de dos
pares de cadena pesada-cadena ligera de
inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature 305:537
(1983)). Debido a la variedad al azar de cadenas pesadas y ligeras
de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una
mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las
cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La
purificación de la molécula correcta, que normalmente se hace
mediante pasos de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda,
y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares
se divulgan, por ejemplo en WO 93/08829, Patentes de EE.UU. Nos.
6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902,
5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706,
5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO
92/00373, EP 03089, Traunecker et al., EMBO J. 10:3655
(1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210
(1986).
Los anticuerpos
anti-IL-12 (también denominados
anticuerpos IL-12) de la presente invención se
pueden caracterizar opcionalmente mediante unión de alta afinidad a
IL-12 y opcionalmente y preferiblemente como que
tienen baja toxicidad. En particular, un anticuerpo de la
invención, donde los componentes individuales, tal como la región
variable, la región constante y marco, individualmente y/o
colectivamente, opcionalmente y preferiblemente poseen
inmunogenicidad baja, es útil en la presente invención. Los
anticuerpos que se pueden usar en la invención se caracterizan
opcionalmente por su capacidad para tratar pacientes durante
periodos extensos con mejora medible de síntomas y toxicidad baja
y/o aceptable. Inmunogenicidad baja o aceptable y/o afinidad alta,
así como otras propiedades adecuadas, pueden contribuir a los
resultados terapéuticos alcanzados. "Inmunogenicidad baja" se
define aquí como que aumenta las respuestas HAHA, HACA o HAMA
significativas en menos de alrededor del 75%, o preferiblemente
menos de alrededor del 50% de los pacientes tratados y/o que aumenta
títulos bajos en el paciente tratado (menos de alrededor de 300,
preferiblemente menos de alrededor de 100 medido con un
inmunoensayo enzimático de doble antígeno) (ver, por ejemplo,
Elliott et al., Lancet 344:1125-1127
(1994)).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención se pueden usar para la producción de al menos un
anticuerpo anti-IL-12 o variantes
especificadas del mismo, que se pueden usar para medir o efectuar en
una célula, tejido, órgano o animal (incluyendo mamíferos y seres
humanos), para diagnosticar, seguir, modular, tratar, aliviar,
ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de, al
menos una afección de IL-12, seleccionada de, pero
no limitada a, al menos un trastorno o enfermedad inmune, un
trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o enfermedad
infecciosa, maligna y/o neurológica, u otras afecciones conocidas o
especificadas relacionadas con IL-12.
Tal método puede comprender administrar una
cantidad eficaz de una composición o una composición farmacéutica
que comprende al menos un anticuerpo
anti-IL-12 a una célula, tejido,
órgano, animal o paciente en necesidad de tal modulación,
tratamiento, alivio, prevención o reducción en los síntomas, efectos
o mecanismos. La cantidad eficaz puede comprender una cantidad de
alrededor de 0,001 a 500 mg/kg por administración individual (por
ejemplo, bolus), múltiple o continua, o para alcanzar una
concentración en suero de 0,01-5000 \mug/ml de
concentración en suero por administración individual, múltiple o
continua, o cualquier intervalo eficaz o valor en el mismo, como se
hace y determina usando métodos conocidos, como se describe aquí o
se conoce en las técnicas relevantes.
Todas las publicaciones o patentes citadas aquí
muestran el estado de la técnica en el momento de la presente
invención y/o proporcionan descripción y ejecutabilidad de la
presente invención. Las publicaciones se refieren a cualquier
publicación científica o de patente, o cualquier otra información
disponible en cualquier formato incluyendo todos los formatos
registrados, electrónicos o impresos. Se mencionan específicamente
las siguientes referencias: Ausubel, et al., ed., Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY
(1987-2001); Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, NY
(1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols
in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY
(1994-2001); Colligan et al., Current
Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,
(1997-2001).
Al menos un anticuerpo
anti-IL-12 de la presente invención
se puede opcionalmente producir por una línea celular, una línea
celular mezclada, una célula inmortalizada o una población clónica
de células inmortalizadas, como se sabe bien en la técnica. Ver,
por ejemplo, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY
(1987-2001); Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor, NY
(1989); Harlow y Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols
in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY
(1994-2001); Colligan et al., Current
Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,
(1997-2001).
Se pueden preparar anticuerpos humanos que son
específicos para proteínas IL-12 humanas o
fragmentos de los mismos contra un antígeno inmunogénico apropiado,
tal como proteína IL-12 aislada y/o proteína
IL-12 o una parte de la misma (incluyendo moléculas
sintéticas, tal como péptidos sintéticos). Se pueden hacer de forma
similar otros anticuerpos de mamíferos específicos o generales. La
preparación de antígenos inmunogénicos, y la producción de
anticuerpos monoclonales se pueden realizar usando cualquier técnica
adecuada.
En un planteamiento, se produce un hibridoma
fusionando una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una
línea celular de mieloma tal como, pero no limitada a, Sp2/0,
Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1,
L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5,
U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI,
K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60,
MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, o similares, o heteromielomas, productos
de fusión de los mismos, o cualquier célula o célula fusionada
derivada de las mismas, o cualquier otra línea celular adecuada
conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com, y similares, con células productoras de
anticuerpos, tal como, pero no limitado a células que contienen
células inmunes o B aisladas o clonadas de bazo, sangre periférica,
linfa, amígdala u otras células, o cualquier otra célula que expresa
secuencias constantes o variables o marco o CDR de cadena pesada o
ligera, como ácido nucleico endógeno o heterólogo, como ADN
recombinante o endógeno, vírico, bacteriano, de alga, procariota, de
anfibio, insecto, reptil, pez, mamífero, roedor, equino, ovino, de
cabra, oveja, primate, eucariota, genómico, ADNc, ADNr, ADN o ARN
mitocondrial, ADN o ARN de cloroplasto, ARNhn, ARNm, ARNt,
monocatenario, bicatenario, tricatenario, hibridado, y similares o
cualquier combinación de los mismos. Ver, por ejemplo, Ausubel,
supra, y Colligan, Immunology, supra, capítulo 2.
También se pueden obtener células productoras de
anticuerpo de sangre periférica o, preferiblemente de bazo o
ganglios linfáticos, de seres humanos u otros animales adecuados que
se han inmunizado con el antígeno de interés. También se puede usar
cualquier otra célula huésped adecuada para expresar ácidos
nucleicos endógenos o heterólogos que codifican un anticuerpo,
fragmento especificado o variante del mismo, de la presente
invención. Las células fusionadas (hibridomas) o células
recombinantes se pueden aislar usando condiciones selectivas de
cultivo u otros métodos adecuados conocidos, y clonar mediante
dilución limitante o separación de células, u otros métodos
conocidos. Se pueden seleccionar las células que producen
anticuerpos con la especificidad deseada mediante un ensayo
adecuado (por ejemplo, ELISA).
Se pueden usar otros métodos adecuados de
producir o aislar anticuerpos de la especificidad precisa,
incluyendo, pero no limitado a, métodos que seleccionan anticuerpos
recombinantes de una librería de péptidos o proteínas, por ejemplo,
pero no limitado a, bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN,
ADNc, o similar, librería de presentación; por ejemplo, disponible
de Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys,
Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Escocia, UK:
BioInvent, Lund, Suecia; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma,
Berkeley, CA; Ixsys. Ver, por ejemplo, EP 368684, PCT/GB91/01134;
PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US
08/350260 (5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662;
PCT/GB97/
01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754;
(Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4704692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); o péptidos o proteínas generados estocásticamente - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, ahora Applied Molecular Evolution (AME) o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998), así como patentes y solicitudes relacionadas) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la técnica y/o como se describe aquí. Tales técnicas, incluyen, pero no están limitadas a, presentación en ribosomas (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (Mayo 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologías de producción de anticuerpo por célula individual (por ejemplo, método de anticuerpo de linfocito seleccionado ("SLAM") (patente de EE.UU. No. 5627052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); selección de células B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Ámsterdam, Países Bajos (1988)).
01835; (CAT/MRC); W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754;
(Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (BioInvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4704692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); o péptidos o proteínas generados estocásticamente - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, ahora Applied Molecular Evolution (AME) o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol. 93:154-161 (1998), así como patentes y solicitudes relacionadas) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se conoce en la técnica y/o como se describe aquí. Tales técnicas, incluyen, pero no están limitadas a, presentación en ribosomas (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (Mayo 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologías de producción de anticuerpo por célula individual (por ejemplo, método de anticuerpo de linfocito seleccionado ("SLAM") (patente de EE.UU. No. 5627052, Wen et al., J. Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848 (1996)); microgota de gel y citometría de flujo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)); selección de células B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Ámsterdam, Países Bajos (1988)).
También se pueden usar métodos para manipular o
humanizar anticuerpos no humanos o humanos y son bien conocidos en
la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado o manipulado
tiene uno o más residuos de aminoácidos de una fuente que es no
humana, por ejemplo, pero no limitado a ratón, rata, conejo, primate
no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos humanos
con frecuencia se denominan residuos "importados", que
típicamente se toman de un dominio variable constante u otro
"importado" de una secuencia humana conocida. Las secuencias
de IgG humanas conocidas se divulgan, por ejemplo, en
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;
www.atcc.org/phage/hdb.html;
www.sciquest.com/;
www.abcam.com/;
www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;
www.public.iastate.edu/\simpedro/research_tools.html;
www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html;
www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;
www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;
www.path.cam.ac.uk/\simmrc7/mikeimages.html;
www.antibodyresource.com/;
mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.
www.immunologylink.com;
pathbox.wustl.edu/\simhcenter/index.html;
www.biotech.ufl.edu/\simhcl/;
www.pebio.com/pa/340913/340913.html;
www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;
www.m.ehime-u.ac.jp/\simyasuhito/Elisa.html;
www.biodesign.com/table.asp;
www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html;
www.biotech.ufl.edu/\simfccl/protocol.html;
www.isacnet.org/sites_geo.html;
aximt1.imt.uni-marburg.de/\simrek/AEPStart.html;
baserv.uci.kun.nl/\simjraats/links1.html;
www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/int-doc/public/INTRO.html;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;
imgt.cnusc.fr:81041/;
www.biochem.ucl.ac.uk/\simmartin/abs/index.html;
antibody.bath.ac.uk/;
abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;
www.unizh.ch/\simhonegger/AHOseminar/Slide0l.html;
www.cryst.bbk.ac.uk/\simubcg07s/;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;
www.path.cam.ac.uk/\simmrc7/humanisation/TAHHP.html;
www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;
www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;
www.cryst.bioc.cam.ac.uk/\simfmolina/Web-pages/Pept/spottech.html;
www.jerini.de/fr_products.htm;
www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud de EE.UU.
(1983). Tales secuencias importadas se pueden usar para reducir la
inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar la unión, afinidad,
asociación, disociación, avidez, especificidad, vida media, o
cualquier otra característica adecuada, como se sabe en la técnica.
Generalmente parte o todas las secuencias CDR no humanas o humanas
se mantienen mientras que las secuencias no humanas de las regiones
variables y constantes se cambian con aminoácidos humanos u otros.
Los anticuerpos también se pueden opcionalmente humanizar con
retención de la alta afinidad por el antígeno y otras propiedades
biológicas favorables. Para alcanzar este fin, los anticuerpos
humanizados se pueden preparar opcionalmente mediante un proceso de
análisis de las secuencias parentales y varios productos
humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las
secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales
de las inmunoglobulinas están normalmente disponibles y son
familiares para los expertos en la materia. Hay disponibles
programas de ordenador que ilustran y muestran estructuras
conformacionales tridimensionales probables de secuencias
candidatas de inmunoglobulinas seleccionadas. La inspección de estas
presentaciones permite el análisis de los posibles papeles de los
residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de la
inmunoglobulina, es decir, el análisis de residuos que tienen
influencia en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse
a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar
residuos FR a partir de las secuencias consenso e importadas de
modo que se alcance la característica deseada del anticuerpo, tal
como afinidad aumentada para el/los antígeno(s) diana. En
general, los residuos CDR están directamente y más sustancialmente
implicados en influenciar la unión al antígeno. Se puede realizar la
humanización o manipulación de anticuerpos de la presente invención
usando cualquier método conocido, tal como pero no limitado a los
descritos en, Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986);
Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et
al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol.
151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987),
Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992);
Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), patentes de
EE.UU. Nos: 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192,
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5585089, 5225539; 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978,
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GB92/01755; W090/14443, W090/14424, W090/14430, EP 229246.
El anticuerpo
anti-IL-12 también se puede generar
opcionalmente mediante inmunización de un animal transgénico (por
ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano, y similares) capaz
de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se describe
aquí y/o como se conoce en la técnica. Las células que producen un
anticuerpo humano anti-IL-12 se
pueden aislar de tales animales e inmortalizar usando métodos
adecuados, tal como los métodos descritos aquí.
Se pueden producir ratones transgénicos que
pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos que se unen a
antígenos humanos mediante métodos conocidos (por ejemplo, pero no
limitados a las patentes de EE.UU. Nos. 5770428, 5569825, 5545806,
5625126, 5625825, 5633425, 5661016 y 5789650 concedida a Lonberg
et al.; Jakobovits et al. WO 98/50433, Jakobovits
et al. WO 98/24893, Lonberg et al. WO 98/24884,
Lonberg et al. WO 97/13852, Lonberg et al. WO
94/25585, Kucherlapate et al. WO 96/34096, Kucherlapate et
al. EP 0463 151 B1, Kucherlapate et al. EP 0710 719 A1,
Surani et al., patente de EE.UU. No. 5545807, Bruggemann
et al. WO 90/04036, Bruggemann et al. EP 0438 474 B1,
Lonberg et al. EP 0814 259 A2, Lonberg et al. GB 2
272 440 A, Lonberg et al. Nature 368:856-859
(1994), Taylor et al., Int. Inmunol.
6(4)579-591 (1994), Green et al.,
Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez et
al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Taylor
et al., Nucleic Acids Research
20(23):6287-6295 (1992), Tuaillon et al.,
Proc Natl Acad Sci USA 90(8):3720-3724
(1993), Lonberg et al., Int Rev Immunol
13(1):65-93 (1995) y Fishwald et al., Nat
Biotechnol 14(7): 845-851 (1996).
Generalmente, estos ratones comprenden al menos un transgén que
comprende ADN de al menos un locus de inmunoglobulina humana que
está funcionalmente reorganizado, o que puede sufrir reorganización
funcional. Los loci endógenos de inmunoglobulina en tales ratones se
pueden desorganizar o delecionar para eliminar la capacidad del
animal de producir anticuerpos codificados por genes endógenos.
Se puede realizar de forma conveniente el
cribado de anticuerpos para unión específica a proteínas o
fragmentos similares usando librerías de presentación de péptidos.
Este método implica el cribado de grandes colecciones de péptidos
para miembros individuales que tienen la función o estructura
deseada. El cribado de anticuerpos de librerías de presentación de
péptidos es bien conocido en la técnica. Las secuencias de péptidos
presentadas pueden tener desde 3 a 5000 o más aminoácidos de
longitud, frecuentemente de 5-100 aminoácidos de
longitud, y con frecuencia desde alrededor de 8 a 25 aminoácidos de
longitud. Además de métodos químicos de síntesis para generar
librerías de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN
recombinante. Un tipo implica la presentación de una secuencia
peptídica en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada
bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia peptídica particular presentada. Tales
métodos se describen en las publicaciones de patentes PCT Nos.
91/17271, 91/18980, 91/19818, y 93/08278. Otros sistemas para
generar librerías de péptidos tienen aspectos tanto de síntesis
química in vitro como de métodos recombinantes. Ver, las
publicaciones de patente de PCT Nos. 92/05258, 92/14843 y 96/19256.
Ver también, las patentes de EE.UU. Nos. 5658754; y 5643768. Las
librerías de presentación de péptidos, vectores y kits de cribado
están comercialmente disponibles de tales suministradores como
Invitrogen (Carlsbad, CA), y Cambridge Antibody Technologies
(Cambridgeshire, UK). Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos.
4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621,
5656730, 5763733, 5767260, 5856456, cedidas a Enzon; 5223409,
5403484, 5571698, 5837500, cedidas a Dyax, 5427908, 5580717, cedidas
a Affymax; 5885793, cedida a Cambridge antibody Technologies;
5750373, cedida Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435,
5693493, 5698417, cedidas a Xoma, Colligan, supra; Ausubel,
supra; o Sambrook,
supra.
supra.
También se pueden preparar los anticuerpos de la
presente invención usando al menos un ácido nucleico que codifica
un anticuerpo anti-IL-12 para
proporcionar animales o mamíferos transgénicos, tales como cabras,
vacas, caballos, ovejas, y similares, que produzcan tales
anticuerpos en su leche. Tales animales se pueden proporcionar
usando métodos conocidos. Ver, por ejemplo, pero no limitado a, las
patentes de EE.UU. nos. 5827690; 5849992; 4873316; 5849992;
5994616; 5565362; 5304489, y similares.
Los anticuerpos de la presente invención se
pueden preparar además usando al menos un ácido nucleico que
codifica un anticuerpo anti-IL-12
para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales
cultivadas (por ejemplo, pero no limitado a tabaco y maíz) que
producen tales anticuerpos, partes especificadas o variantes en las
partes de la planta o en células cultivadas de ellas. Como ejemplo
no limitante, se han usado con éxito hojas de tabaco transgénico
que expresan proteínas recombinantes para proporcionar grandes
cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo usando un
promotor inducible. Ver, por ejemplo, Cramer et al, Curr.
Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 (1999) y las
referencias citadas allí. Además, se ha usado maíz transgénico para
expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comercial,
con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros
sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Ver, por
ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol.
464:127-147 (1999) y las referencias citadas allí.
También se han producido anticuerpos en grandes cantidades a partir
de semillas de plantas transgénicas incluyendo fragmentos de
anticuerpos, tal como anticuerpos de cadena sencilla (scFv),
incluyendo semillas de tabaco y tubérculo de patata. Ver, por
ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol.
38:101-109 (1998) y las referencias citadas allí. De
esta manera, los anticuerpos de la presente invención también se
pueden producir usando plantas transgénicas, según métodos
conocidos. Ver también, por ejemplo, Fischer et al.,
Biotechnol. Appl. Biochem. 30:99-108 (Oct., 1999),
Ma et al., Trends Biotechnol. 13:522-7
(1995); Ma et al., Plant Physiol. 109:341-6
(1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans.
22:940-944 (1994); y las referencias citadas
allí.
Los anticuerpos de la invención se pueden unir a
IL-12 con un amplio rango de afinidades (K_{D}).
En una forma de realización preferida, al menos un mAb humano de la
presente invención se puede unir opcionalmente a
IL-12 humana con gran afinidad. Por ejemplo, un mAb
humano se puede unir a IL-12 con una K_{D} igual a
o menor de alrededor de 10^{-7} M, tal como pero no limitada a
0,1-9,9 (o cualquier rango o valor dentro) X
10^{-7}, 10^{-8}, 10^{-9}, 10^{-10}, 10^{-11}, 10^{-12},
10^{-13} o cualquier rango o valor dentro del mismo.
La afinidad o avidez de un anticuerpo por un
antígeno se puede determinar experimentalmente usando cualquier
método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al.,
"Antibody-Antigen Interactions", En
Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva
York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and
Company: Nueva York, NY (1992); y los métodos descritos allí). La
afinidad de una interacción anticuerpo-antígeno
particular medida puede variar si se mide en condiciones diferentes
(por ejemplo, concentración de sal, pH). De esta manera, las
medidas de afinidad y otros parámetros de unión a antígeno (por
ejemplo, K_{D}, K_{a}, K_{d}) se hacen preferiblemente con
soluciones normalizadas de anticuerpo y antígeno, y un tampón
normalizado, tal como el tampón descrito aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la información proporcionada aquí, se
puede obtener una molécula de ácido nucleico de la presente
invención que codifica al menos un anticuerpo
anti-IL-12 usando métodos descritos
aquí o conocidos en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNhn, ARNt
o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluyendo, pero no
limitado a, ADNc y ADN genómico obtenidos mediante clonación o
producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El
ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o
cualquier combinación de los mismos. Cualquier parte de al menos una
hebra del ADN o ARN puede ser la hebra codificante, también
conocida como la hebra sentido, o puede ser la hebra no
codificante, también denominada hebra
anti-sentido.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas
divulgadas aquí incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden
un marco abierto de lectura (ORF), opcionalmente con uno o más
intrones, por ejemplo, pero no limitado a, al menos una parte
especificada de al menos una CDR, como CDR1, CDR2 y/o CDR3 de al
menos una cadena pesada (por ejemplo, SEQ ID NOS:
1-3) o cadena ligera (por ejemplo, SEQ ID NOS:
4-6); moléculas de ácido nucleico que comprenden la
región codificante de un anticuerpo
anti-IL-12 o región variable (por
ejemplo, SEQ ID NOS: 7, 8); y moléculas de ácido nucleico que
comprenden una secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente
de las descritas anteriormente pero que, debido a la degeneración
del código genético, todavía codifican al menos un anticuerpo
anti-IL-12 como se describe aquí y/o
como se conoce en la técnica. Por supuesto, el código genético es
bien conocido en la técnica. De esta manera, sería rutinario para el
experto en la materia generar tales variantes degeneradas de ácido
nucleico que codifican anticuerpos
anti-IL-12 específicos de la
presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel et al.,
supra. Ejemplos no limitantes de moléculas aisladas de ácido
nucleico incluyen SEQ ID NO: 8, correspondiente a ejemplos no
limitantes de un ácido nucleico que codifica, respectivamente, HC
CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, región variable
de HC y región variable de LC.
Como se indica aquí, las moléculas de ácido
nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico
que codifica un anticuerpo
anti-IL-12 pueden incluir, pero no
están limitadas a, aquellas que codifican la secuencia de
aminoácidos de un fragmento de anticuerpo, por sí mismo; la
secuencia codificante del anticuerpo entero o una parte del mismo;
la secuencia codificante de un anticuerpo, fragmento o parte, así
como secuencias adicionales, tal como la secuencia codificante de
al menos un péptido señal líder o de fusión, con o sin las
secuencias codificantes anteriormente mencionadas, tal como al menos
un intrón, junto con secuencias adicionales no codificantes,
incluyendo, pero no limitadas a, secuencias no codificantes 5' y 3',
tal como las secuencias transcritas no traducidas que desempeñan un
papel en la transcripción, procesamiento de ARNm, incluyendo señales
de ayuste y poliadenilación (por ejemplo - unión a ribosomas y
estabilidad de ARNm); una secuencia codificante adicional que
codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan
funcionalidades adicionales. De esta manera, la secuencia que
codifica un anticuerpo se puede fusionar a una secuencia marcadora,
tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la
purificación del anticuerpo fusionado que comprende un fragmento o
parte de anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente especificación divulga ácidos
nucleicos aislados que hibridan en condiciones selectivas de
hibridación con los polinucleótidos divulgados aquí. De esta
manera, se pueden usar los polinucleótidos para aislar, detectar
y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden tales
polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden usar los polinucleótidos
para identificar, aislar, o amplificar clones parciales o completos
en una genoteca depositada. En algunos casos, los polinucleótidos
son secuencias de ADN genómico o ADNc aisladas, o de otra manera
complementarias a, un ADNc de una genoteca de ácido nucleico humano
o de mamífero.
Preferiblemente, la genoteca de ADNc comprende
al menos el 80% de secuencias completas, preferiblemente al menos
el 85% o el 90% de secuencias completas, y más preferiblemente al
menos el 95% de secuencias completas. Las genotecas de ADNc se
pueden normalizar para aumentar la representación de especies
infrecuentes. Típicamente, pero no exclusivamente, se emplean
condiciones de hibridación poco rigurosas o moderadas con secuencias
que tienen una identidad de secuencia reducida respecto a las
secuencias complementarias. Opcionalmente se pueden emplear
condiciones moderadas y muy rigurosas para secuencias de mayor
identidad. Las condiciones poco rigurosas permiten la hibridación
selectiva de secuencias que tienen alrededor del 70% de identidad de
secuencia y se pueden emplear para identificar secuencias ortólogas
o parálogas.
Opcionalmente, los polinucleótidos codificarán
al menos una parte de un anticuerpo codificado por los
polinucleótidos descritos aquí. Los polinucleótidos abarcan
secuencias de ácidos nucleicos que se pueden emplear para la
hibridación selectiva a un polinucleótido que codifica un
anticuerpo de la presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel,
supra; Colligan, supra.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención se pueden hacer usando (a) métodos recombinantes, (b)
técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación, o combinaciones
de las mismas, como es bien sabido en la técnica.
Los ácidos nucleicos pueden comprender de forma
conveniente secuencias además de un polinucleótido de la presente
invención. Por ejemplo, se puede insertar un sitio de
multi-clonación que comprende uno o más sitios de
endonucleasas de restricción en el ácido nucleico para ayudar en el
aislamiento del polinucleótido. Además, se pueden insertar
secuencias traducibles para ayudar en el aislamiento del
polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una
secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un
medio conveniente para purificar las proteínas de la presente
invención. El ácido nucleico de la presente invención - excluyendo
las secuencias codificantes - es opcionalmente un vector, adaptador
o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de
la presente invención.
Se pueden añadir secuencias adicionales a tales
secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en
la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del
polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido
en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de
expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido en la
técnica. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook,
supra).
\vskip1.000000\baselineskip
Las composiciones aisladas de ácido nucleico de
esta invención, tales como ARN, ADNc, ADN genómico, o cualquier
combinación de los mismos, se pueden obtener de fuentes biológicas
usando cualquiera de las metodologías de clonación conocidas por
los expertos en la materia. En algunas formas de realización, se
usan sondas de oligonucleótidos que hibridan de forma selectiva, en
condiciones rigurosas, con los polinucleótidos de la presente
invención para identificar la secuencia deseada en una genoteca de
ADNc o ADN genómico. El aislamiento de ARN y la construcción de
genotecas de ADNc o genómico, es bien conocido para el experto en la
materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook,
supra).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede cribar una genoteca de ADNc o genómico
usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido de la
presente invención, tales como los divulgados aquí. Se pueden usar
las sondas para hibridar con secuencias de ADN genómico o ADNc para
aislar genes homólogos en el mismo o en diferentes organismos. Los
expertos en la materia apreciarán que se pueden emplear varios
grados de rigor de hibridación en el ensayo; y bien el medio de
hibridación o el de lavado puede ser riguroso. Cuando las
condiciones de hibridación se hacen más rigurosas, debe haber un
mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para se
produzca la formación de un dúplex. Se puede controlar el grado de
rigor mediante uno o más de temperatura, fuerza iónica, pH y la
presencia de un solvente parcialmente desnaturalizante tal como
formamida. Por ejemplo, el rigor de la hibridación se varía
convenientemente cambiando la polaridad de la reacción reactiva
mediante, por ejemplo, la manipulación de la concentración de
formamida dentro del intervalo del 0% al 50%. El grado de
complementariedad (identidad de secuencia) requerido para la unión
detectable variará según el rigor del medio de hibridación y/o del
medio de lavado. El grado de complementariedad será óptimamente del
100%, o del 70-100%, o cualquier intervalo o valor
dentro del mismo. Sin embargo, se debe entender que se pueden
compensar las variaciones minoritarias de secuencia en las sondas y
cebadores reduciendo el rigor del medio de hibridación y/o de
lavado.
Los métodos de amplificación de ARN o ADN se
conocen bien en la técnica y se pueden usar según la presente
invención sin experimentación excesiva, basado en las enseñanzas y
directrices presentadas aquí.
Los métodos conocidos de amplificación de ADN o
ARN incluyen, pero no están limitados a, reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (ver por
ejemplo las patentes de EE.UU. Nos. 4683195, 4683202, 4800159,
4965188, a Mullis, et al.; 4795699 y 4921794 a Tabor, et
al; 5142033 a Innis; 5122464 a Wilson, et al.; 5091310 a
Innis; 5066584 a Gyllensten, et al; 4889818 a Gelfand, et
al; 4994370 a Silver, et al; 4766067 a Biswas; 4656134 a
Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN antisentido a
la secuencia diana como molde para la síntesis de ADN bicatenario
(Patente de EE.UU. No. 5130238 a Malek et al., con el nombre
comercial de NASBA). (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o
Sambrook, supra).
Por ejemplo, se puede usar la tecnología de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias
de polinucleótidos de la presente invención y genes relacionados
directamente de genotecas de ADN genómico o ADNc. La PCR y otros
métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles,
por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican
proteínas a ser expresadas, para hacer ácidos nucleicos para usar
como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras,
para la secuenciación de ácidos nucleicos, o para otros fines. Los
ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a los expertos a
través de métodos de amplificación in vitro se encuentran en
Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel,
supra, así como en Mullis, et al., patente de EE.UU.
No. 4683202 (1987); e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to
Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA
(1990). En la técnica se conocen kits comercialmente disponibles
para la amplificación genómica por PCR. Ver, por ejemplo,
Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Además,
por ejemplo, se puede usar la proteína 32 del gen de T4 (Boehringer
Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR
largos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención también se pueden preparar mediante síntesis química
directa por métodos conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel, et
al., supra). La síntesis química generalmente produce un
oligonucleótido monocatenario, que se puede convertir a ADN
bicatenario mediante hibridación con una secuencia complementaria,
o mediante polimerización con una ADN polimerasa usando la cadena
sencilla como molde. El experto en la materia reconocerá que
mientras la síntesis química de ADN puede estar limitada a
secuencias de alrededor de 100 o más bases, se pueden obtener
secuencias más largas mediante la ligación de secuencias más
cortas.
cortas.
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La presente invención proporciona además casetes
de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la
presente invención. Se puede usar una secuencia de ácido nucleico de
la presente invención, por ejemplo un ADNc o una secuencia genómica
que codifica un anticuerpo de la presente invención, para construir
un casete de expresión recombinante que se puede introducir en al
menos una célula huésped deseada. Un casete de expresión
recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido de la
presente invención operativamente unido a secuencias reguladoras
del inicio de la transcripción que dirigirán la transcripción del
polinucleótido en la célula huésped deseada. Se pueden emplear
promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir,
endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la
presente invención.
En algunas formas de realización, se pueden
introducir ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor,
potenciador, u otros elementos en la posición adecuada (5', 3', o en
un intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la
presente invención de modo que aumente o disminuya la expresión de
un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, se pueden
cambiar los promotores endógenos in vivo o in vitro
mediante mutación, deleción y/o sustitución.
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La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico de la
presente invención, células huésped que están genéticamente
manipuladas con los vectores recombinantes, y la producción de al
menos un anticuerpo anti-IL-12
mediante técnicas recombinantes, como se sabe bien en la técnica.
Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel,
et al., supra.
Los polinucleótidos se pueden unir opcionalmente
a un vector que contiene un marcador de selección para su
propagación en un huésped. Generalmente, se introduce un vector
plasmídico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de
calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un
virus, se puede empaquetar in vitro usando una línea celular
empaquetadora apropiada y después transducir en las células
huésped.
El inserto de ADN debe estar operativamente
unido a un promotor apropiado. Las construcciones de expresión
contendrán además sitios para el inicio de la transcripción, la
terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión a
ribosomas para la traducción. La parte codificante de los
transcritos maduros expresados por las construcciones
preferiblemente incluirá un inicio de traducción al principio y un
codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) colocado
apropiadamente al final del ARNm a ser traducido, con UAA y UAG
preferidos para expresión en células de mamíferos o eucariotas.
Los vectores de expresión incluirán
preferiblemente, pero opcionalmente, al menos un marcador de
selección. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero no están
limitados a, resistencia a metotrexato (MTX), dihidrofolato
reductasa (DHFR, patentes de EE.UU. Nos. 4399216; 4634665; 4656134;
4956288; 5149636; 5179017), ampicilina, neomicina (G418), ácido
micofenólico, o glutamina sintetasa (GS, patentes de EE.UU. Nos.
5122464; 5770359; 5827739) para cultivo de células eucariotas, y
genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina para cultivar en
E. coli y otras bacterias o procariotas. Los medios y
condiciones de cultivo apropiados para las células huésped
descritas anteriormente son conocidos en la técnica. Los vectores
serán fácilmente aparentes al experto en la materia. La
introducción de una construcción de vector en una célula huésped se
puede realizar mediante transfección con fosfato de calcio,
transfección medida por DEAE-dextrano, transfección
mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción,
infección u otros métodos conocidos. Tales métodos están descritos
en la técnica, tal como Sambrook, supra, capítulos
1-4 y 16-18; Ausubel, supra,
capítulos 1, 9, 13, 15, 16.
Se puede expresar al menos un anticuerpo de la
presente invención en una forma modificada, tal como una proteína
de fusión, y puede incluir no solo señales de secreción, sino
también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo,
se puede añadir una región de aminoácidos adicionales,
particularmente aminoácidos cargados, al extremo N de un anticuerpo
para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula huésped,
durante la purificación, o durante el manejo y almacenamiento
posteriores. Además, se pueden añadir grupos peptídicos a un
anticuerpo de la presente invención para facilitar la purificación.
Tales regiones se pueden eliminar antes de la preparación final de
un anticuerpo o al menos un fragmento del mismo. Tales métodos se
describen en muchos manuales estándar de laboratorio, tal como
Sambrook, supra, capítulos 17.29-17.42 y
18.1-18.74; Ausubel, supra, capítulos 16, 17
y 18.
El experto en la materia está informado de los
numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un
ácido nucleico que codifica una proteína de la presente
invención.
De forma alternativa, los ácidos nucleicos de la
presente invención se pueden expresar en una célula huésped
mediante encendido (mediante manipulación) en una célula huésped que
contiene ADN endógeno que codifica un anticuerpo de la presente
invención. Tales métodos son bien conocidos en la técnica, por
ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. Nos. 5580734,
5641670, 5733746, y 5733761.
Ilustrativo de cultivos celulares útiles para la
producción de anticuerpos, partes especificadas o variantes de los
mismos, son células de mamífero. Los sistemas de células de mamífero
con frecuencia estarán en forma de monocapas de células aunque
también se pueden usar suspensiones o biorreactores de células de
mamífero. Se han desarrollado en la técnica un número de líneas de
células huéspedes adecuadas capaces de expresar proteínas
glicosiladas intactas, e incluyen, las líneas celulares
COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650),
COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651),
HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por
ejemplo, ATCC CRL 1610), y BSC-1 (por ejemplo, ATCC
CRL-26), células Cos-7, células CHO,
células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células
293, células HeLa y similares, que están fácilmente disponibles de,
por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Va
(www.atcc.org). Las células huésped preferidas incluyen células de
origen linfoide tal como células de mieloma y linfoma. Células
huésped particularmente preferidas son células P3X63Ag8.653 (número
de acceso de ATCC CRL-1580) y células
SP2/0-Ag14 (número de acceso de ATCC
CRL-1851). En una forma de realización
particularmente preferida, la célula recombinante es una célula
P3X63Ag8.653 o una célula SP2/0-Ag14.
Los vectores de expresión para estas células
pueden incluir uno o más de las siguientes secuencias de control de
la expresión, tal como, pero no limitadas a un origen de
replicación; un promotor (por ejemplo, los promotores tardío o
temprano de SV40, el promotor de CMV (patentes de EE.UU. Nos.
5168062, 5385839) un promotor tk de HSV, un promotor pgk
(fosfoglicerato quinasa), un promotor EF-1 alfa
(patente de EE.UU. No. 5266491), al menos un promotor de
inmunoglobulina humana; un potenciador, y/o sitios de información de
procesamiento, tal como sitios de unión a ribosomas, sitios de
ayuste de ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de
adición de poli A del Ag T grande de SV40), y secuencias de
terminación de la transcripción. Ver, por ejemplo, Ausubel et
al., supra; Sambrook et al., supra. Otras
células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas
de la presente invención son conocidas y/o están disponibles, por
ejemplo, del catálogo de la Colección Americana de Cultivos Tipo de
Líneas Celulares e Hibridomas (www.atcc.org) o de otras fuentes
comerciales conocidas.
Cuando se emplean células huésped eucariotas,
típicamente se incorporan en el vector secuencias de poliadenilación
o de terminación de la transcripción. Un ejemplo de una secuencia
terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la
hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir secuencias
para un ayuste exacto del transcrito. Un ejemplo de una secuencia
de ayuste es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, et al., J.
Virol. 45:773-781 (1983)). Además, se pueden
incorporar en el vector secuencias génicas para el control de la
replicación en la célula huésped, como se sabe en la técnica.
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Se puede recuperar y purificar un anticuerpo
anti-IL-12 de cultivos de células
recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo, pero no
limitados a, purificación con proteína A, precipitación con sulfato
de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía
de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía
de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. También se puede
emplear cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para
la purificación. Ver, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in
Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley
& Sons, NY, NY, (1997-2001), por ejemplo, los
capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10.
Los anticuerpos de la presente invención
incluyen productos purificados naturalmente purificados, productos
de procedimientos de síntesis química, y productos producidos
mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota,
incluyendo, por ejemplo, células de levadura, vegetales superiores,
insecto y mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un
procedimiento de producción recombinante, el anticuerpo de la
presente invención puede estar glicosilado o puede estar no
glicosilado, con glicosilado preferido. Tales métodos se describen
en muchos manuales estándar de laboratorio, tal como Sambrook,
supra, secciones 17.37-17.42, Ausubel,
supra, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein
Science, supra, capítulo, 12-14.
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Los anticuerpos aislados de la presente
invención comprenden un anticuerpo codificado por cualquiera de los
polinucleótidos de la presente invención como se discute más
completamente aquí, o cualquier anticuerpo aislado o preparado.
Preferiblemente, el anticuerpo humano se une a IL-12
humana y, de esta manera neutraliza parcial o sustancialmente al
menos una actividad biológica de la proteína. Un anticuerpo que
neutraliza parcialmente o preferiblemente sustancialmente al menos
una actividad biológica de al menos una proteína
IL-12 o fragmento se puede unir a la proteína o
fragmento y de esta manera inhibe la actividad mediada a través de
la unión de IL-12 al receptor de
IL-12 o través de otros mecanismos dependientes o
mediados por IL-12. Como se usa aquí, el término
"anticuerpo neutralizante" se refiere a un anticuerpo que puede
inhibir una actividad dependiente de IL-12 en
aproximadamente el 20-120%, preferiblemente en al
menos aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 55, el
60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 91, el 92, el 93,
el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 98, el 99, el 100% o más
dependiendo del ensayo. La capacidad de un anticuerpo
anti-IL-12 para inhibir una
actividad dependiente de IL-12 se evalúa
preferiblemente mediante al menos un ensayo adecuado de proteína o
receptor de IL-12, como se describe aquí y/o como se
conoce en la técnica. Un anticuerpo humano de la invención puede
ser de cualquier clase (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) o isotipo y
puede comprender una cadena ligera kappa o lambda. En una forma de
realización, el anticuerpo humano comprende una cadena pesada IgG o
fragmento definido, por ejemplo, al menos uno de los isotipos IgG1,
IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos de este tipo se pueden preparar
empleando un ratón transgénico u otro mamífero transgénico no humano
que comprende al menos un transgén de cadena ligera humana (por
ejemplo, IgG, IgA e IgM (por ejemplo, \gamma1, \gamma2,
\gamma3, \gamma4) como se describe aquí y/o como se sabe en la
técnica. En otra forma de realización, el anticuerpo humano
anti-IL-12 humana comprende una
cadena pesada IgG1 y una cadena ligera IgG1.
Al menos un anticuerpo de la invención se une a
al menos un epítopo especificado específico para al menos una
proteína IL-12, subunidad, fragmento, parte o
cualquier combinación de las mismas. El al menos un epítopo puede
comprender al menos una región de unión a anticuerpo que comprende
al menos una parte de dicha proteína, epítopo que preferiblemente
comprende al menos una parte extracelular, soluble, hidrofílica,
externa o citoplásmica de dicha proteína. El al menos un epítopo
especificado puede comprender cualquier combinación de al menos una
secuencia de aminoácidos de al menos 1-3 aminoácidos
a la parte especificada entera de aminoácidos contiguos de la SEQ
ID
NO: 9.
NO: 9.
El anticuerpo de la presente invención se define
en la reivindicación 3.
Tales anticuerpos se pueden preparar uniendo
químicamente las diferentes partes (por ejemplo, CDR, marco) del
anticuerpo usando técnicas convencionales, preparando y expresando
una (es decir, una o más) molécula de ácido nucleico que codifica
el anticuerpo usando técnicas convencionales de tecnología de ADN
recombinante o usando cualquier otro método adecuado.
El anticuerpo
anti-IL-12 comprende una región
variable de cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7 y
una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ
ID NO: 8. Se pueden preparar anticuerpos que se unen a
IL-12 humana y que comprenden un región variable de
cadena pesada o ligera definida usando métodos adecuados, tal como
presentación en fagos (Katsube, Y., et al., Int J Mol Med,
1(5):863-868 (1993)) o métodos que emplean
animales transgénicos, conocidos en la técnica y/o descritos aquí.
Por ejemplo, se puede inmunizar un ratón transgénico, que comprende
un transgén de cadena pesada de inmunoglobulina humana
funcionalmente reorganizado y un transgén que comprende ADN de un
locus de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana que puede
sufrir reorganización funcional, con IL-12 humana o
un fragmento de la misma para provocar la producción de
anticuerpos. Si se desea, se pueden aislar las células productoras
de anticuerpos y se pueden preparar hibridomas u otras células
inmortalizadas productoras de anticuerpo como se describe aquí y/o
como se sabe en la técnica. De forma alternativa, el anticuerpo, la
parte especificada o variante se puede expresar usando el ácido
nucleico codificante o la parte del mismo en una célula huésped
adecuada.
Una sustitución conservadora de aminoácido se
refiere al cambio de un primer aminoácido por un segundo aminoácido
que tiene propiedades químicas y/o físicas (por ejemplo, carga,
estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofili-
cidad) que son similares a las del primer aminoácido. Las sustituciones conservadoras incluyen el cambio de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparragina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y). K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptófano (W), metionina (M), cisteína (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.
cidad) que son similares a las del primer aminoácido. Las sustituciones conservadoras incluyen el cambio de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparragina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y). K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptófano (W), metionina (M), cisteína (C) y glicina (G); F, W e Y; C, S y T.
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Los aminoácidos que hacen los anticuerpos
anti-IL-12 de la presente invención
con frecuencia se abrevian. Las designaciones de aminoácidos se
pueden indicar designando el aminoácido mediante su código de una
letra, su código de tres letras, nombre, o codón(es) de tres
nucleótidos como está bien entendido en la técnica (ver Alberts,
B., et al., Molecular Biology of The Cell, Tercera
Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994):
Un anticuerpo
anti-IL-12 de la presente invención
puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones de
aminoácidos, bien de mutaciones naturales o por manipulación humana,
como se especifica aquí.
Por supuesto, el número de sustituciones que
haría el experto en la materia depende de muchos factores,
incluyendo los descritos anteriormente. En términos generales, el
número de sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos
para cualquier proteína, fragmento o variante
anti-IL-12 derivada de Ig no será
más de 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7,
6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como de 1-30 o cualquier
intervalo o valor dentro del mismo, como se especifica aquí.
Los aminoácidos en un anticuerpo
anti-IL-12 de la presente invención
que son esenciales para la función se pueden identificar mediante
métodos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida o
mutagénesis de barrido con alanina (por ejemplo, Ausubel,
supra, capítulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science
244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento
introduce mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la
molécula. Las moléculas mutantes resultantes se ensayan después
para su actividad biológica, tal como, pero no limitada a al menos
una actividad neutralizante de IL-12. Los sitios que
son críticos para la unión al anticuerpo también se pueden
identificar mediante análisis estructural tales como cristalización,
resonancia magnética nuclear o marcaje de fotoafinidad (Smith,
et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de
Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
Como apreciará el experto en la materia, la
presente invención incluye al menos un anticuerpo biológicamente
activo de la presente invención. Los anticuerpos biológicamente
activos tienen una actividad específica de al menos el 20%, el 30%,
o el 40%, y preferiblemente de al menos el 50%, el 60%, o el 70%, y
lo más preferiblemente de al menos el 80%, el 90%, o el 95%-100% de
la del anticuerpo nativo (no sintético), endógeno o afín y conocido.
Los métodos de ensayar y cuantificar medidas de actividad
enzimática y especificidad de sustrato, son bien conocidos para el
experto en la materia.
En otro aspecto, la invención se refiere a
anticuerpos humanos, como se describe aquí, que están modificados
mediante la unión covalente de un grupo orgánico. Tales
modificaciones pueden producir un anticuerpo con propiedades
farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, vida media en suero in
vivo aumentada). El grupo orgánico puede ser un grupo
polimérico hidrofílico lineal o ramificado, un grupo ácido graso, o
un grupo éster de ácido graso. En formas de realización
particulares, el grupo polimérico hidrofílico puede tener un peso
molecular desde alrededor de 800 hasta alrededor de 120.000 Dalton
y puede ser un polialcano glicol (por ejemplo, polietilenglicol
(PEG), polipropilenglicol (PPG)), polímero de hidrato de carbono,
polímero de aminoácido o polivinilpirrolidona, y el grupo ácido
graso o éster de ácido graso puede comprender desde alrededor de
ocho hasta alrededor de cuarenta átomos de carbono.
Los anticuerpos modificados de la invención
pueden comprender uno o más grupos orgánicos que están unidos de
forma covalente, directa o indirectamente, al anticuerpo. Cada grupo
orgánico que está unido a un anticuerpo de la invención puede ser
independientemente un grupo polimérico hidrofílico, un grupo ácido
graso, o un grupo éster de ácido graso. Como se usa aquí, el
término "ácido graso" abarca ácidos monocarboxílicos y ácidos
dicarboxílicos. Un "grupo polimérico hidrofílico", como se usa
aquí el término, se refiere a un polímero orgánico que es más
soluble en agua que en octano. Por ejemplo, polilisina es más
soluble en agua que en octano. De esta manera, un anticuerpo
modificado mediante la unión covalente de polilisina está abarcado
por la invención. Los polímeros hidrofílicos adecuados para
modificar los anticuerpos de la invención pueden ser lineales o
ramificados e incluyen, por ejemplo, polialcano glicoles (por
ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG),
PPG y similares), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano,
celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de
aminoácidos hidrofílicos (por ejemplo, polilisina, poliarginina,
poliaspartato y similares), óxidos de polialcanos (por ejemplo,
óxido de polietileno, óxido de polipropileno y similares) y
polivinilpirrolidona. Preferiblemente, el polímero hidrofílico que
modifica el anticuerpo de la invención tiene un peso molecular
desde alrededor de 800 hasta alrededor de 150.000 Dalton como
entidad molecular separada. Por ejemplo, se pueden usar
PEG_{5000} y PEG_{20.000}, en donde el subíndice es el peso
molecular medio del polímero en Dalton. El grupo polimérico
hidrofílico puede estar sustituido con uno hasta alrededor de seis
grupos alquilo, ácido graso o éster de ácido graso. Los polímeros
hidrofílicos que están sustituidos con un grupo ácido graso o éster
de ácido graso se pueden preparar empleando métodos adecuados. Por
ejemplo, se puede acoplar un polímero que comprende un grupo amina
a un carboxilato del ácido graso o el éster de ácido graso, y se
puede acoplar un carboxilato activado (por ejemplo, activado con
N,N-carbonildiimidazol) en un ácido graso o éster de
ácido graso a un grupo hidroxilo en un polímero.
Los ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos
adecuados para modificar los anticuerpos de la invención pueden ser
saturados o pueden contener una o más unidades de insaturación. Los
ácidos grasos que son adecuados para modificar los anticuerpos de
la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato
(C_{12}, laurato), n-tetradecanoato (C_{14},
miristato), n-octadecanoato (C_{18}, estearato),
n-eicosanoato (C_{20}, araquidato),
n-docosanoato (C_{22}, behenato),
n-triacontanoato (C_{30}),
n-tatracontonoato (C_{40}),
cis-\Delta9-octadecanoato (C_{18},
oleato), todo
cis-\Delta5,8,11,14-eicosatetraenoato
(C_{20}, araquidonato), ácido octanedioico, ácido
tetradecanedioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico, y
similares. Los ésteres de ácidos grasos adecuados incluyen
monoésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo alquilo
inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede
comprender desde uno hasta alrededor de doce, preferiblemente desde
uno hasta alrededor de seis, átomos de carbono.
Los anticuerpos humanos modificados se pueden
preparar usando métodos adecuados, tal como mediante reacción con
uno o más agentes modificadores. Un "agente modificador" como
se usa el término aquí, se refiere a un grupo orgánico adecuado
(por ejemplo, polímero hidrofílico, un ácido grado, un éster de
ácido graso) que comprende un grupo activador. Un "grupo
activador" es un grupo químico o grupo funcional que puede, en
las condiciones adecuadas, reaccionar con un segundo grupo químico
formando de esta manera un enlace covalente entre el agente
modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos
activadores que reaccionan con amina incluyen grupos electrofílicos
tal como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, yodo),
ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y
similares. Los grupos activadores que pueden reaccionar con tioles
incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acrilolilo,
disulfuros de piridilo, tiol del ácido
5-tiol-2-nitrobenzoico
(TNB-tiol), y similares. Un grupo funcional
aldehído se puede acoplar a moléculas que contienen amina o
hidracida, y un grupo azida puede reaccionar con grupos de fósforo
trivalente para formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Los
métodos adecuados para introducir grupos activadores en moléculas
son conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Hermanson, G.T.,
Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA
(1996)). Un grupo activador se puede unir directamente al grupo
orgánico (por ejemplo, polímero hidrofílico, ácido graso, éster de
ácido graso), o mediante un grupo enlazador, por ejemplo un grupo
divalente de C_{1}-C_{12} en donde se pueden
cambiar uno o más átomos de carbono por un heteroátomo tal como
oxígeno, nitrógeno o azufre. Los grupos enlazadores adecuados
incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH_{2})_{3}-,
-NH-(CH_{2})_{6}-NH-,
-(CH_{2})_{2}-NH-
y -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que comprenden un grupo enlazador se pueden producir, por ejemplo, haciendo reaccionar mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato del ácido graso. El grupo protector Boc se puede eliminar del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato como se describe, o se puede hacer reaccionar con anhídrido maleico y ciclar el producto resultante para producir un derivado maleimido activado del ácido graso. (Ver, por ejemplo, Thompson et al., WO 92/16221).
y -CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que comprenden un grupo enlazador se pueden producir, por ejemplo, haciendo reaccionar mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre y el carboxilato del ácido graso. El grupo protector Boc se puede eliminar del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato como se describe, o se puede hacer reaccionar con anhídrido maleico y ciclar el producto resultante para producir un derivado maleimido activado del ácido graso. (Ver, por ejemplo, Thompson et al., WO 92/16221).
Los anticuerpos modificados de la invención se
pueden producir haciendo reaccionar un anticuerpo humano con un
agente modificador. Por ejemplo, los grupos orgánicos se pueden unir
al anticuerpo en una forma no específica de sitio empleando un
agente modificador que reacciona con amina, por ejemplo, un éster
NHS de PEG. Los anticuerpos humanos modificados también se pueden
preparar reduciendo los puentes disulfuro (por ejemplo, puente
disulfuro intra-cadena) de un anticuerpo. El
anticuerpo reducido se puede hacer reaccionar después con un agente
modificador que reacciona con tiol para producir el anticuerpo
modificado de la invención. Los anticuerpos humanos modificados que
comprenden un grupo orgánico que está unido a sitios específicos de
un anticuerpo de la presente invención se pueden preparar usando
métodos adecuados, tal como proteólisis inversa (Fisch et al.,
Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen
et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994);
Kumaran et al., Protein Sci.
6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al.,
Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996);
Capellas et al., Biotechnol. Bioeng.,
56(4):456-463 (1997)), y los métodos
descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques,
Academic Press: San Diego, CA (1996).
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Además de los anticuerpos
anti-IL-12 monoclonales o
quiméricos, la presente especificación también divulga un
anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id)
específico para tales anticuerpos de la invención. Un anticuerpo
anti-Id es un anticuerpo que reconoce determinantes
únicos generalmente asociados con la región de unión al antígeno de
otro anticuerpo. Se puede preparar el anti-Id
inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por
ejemplo, cepa de ratón) que la fuente del anticuerpo Id con el
anticuerpo o una región que contiene la CDR del mismo. El animal
inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos
del anticuerpo inmunizante y producirá un anticuerpo
anti-Id. El anticuerpo anti-Id
también se puede usar como un "inmunógeno" para inducir una
respuesta inmune en aún otro animal, produciendo un denominado
anticuerpo anti-anti-Id.
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La presente invención también proporciona al
menos una composición de anticuerpo
anti-IL-12 que comprende al menos
uno, al menos dos, al menos tres, al menos, cuatro, al menos cinco,
al menos seis o más anticuerpos
anti-IL-12 de los mismos, como se
describe aquí y/o como se sabe en la técnica que se proporcionan en
una composición, mezcla o forma no natural.
Las composiciones de anticuerpos
anti-IL-12 de la presente invención
pueden además comprender al menos uno de cualquier cantidad
adecuada y eficaz de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo,
pero no limitado a un anticuerpo contra TNF o fragmento, un
receptor soluble de TNF o fragmento, proteínas de fusión de los
mismos, o antagonistas de TNF de molécula pequeña), un
antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofín, aurotioglucosa,
azatioprina, etanercept, tiomalato de sodio y oro, sulfato de
hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalcina), un relajante
muscular, un narcótico, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un
analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un
bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo,
aminoglucósido, un antifúngico, un antiparasítico, un antivírico,
un carbapenemo, cefalosporina, una fluroquinolona, un macrólido,
una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro
antimicrobiano), un antisoriático, un corticosteriode, un esteroide
anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un
nutriente, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona
relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusígeno, un
antiemético, un antiúlcera, un laxante, un anticoagulante, una
eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por
ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim
(GM-CSF, Leukine), una inmunización, una
inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab,
ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de
remplazo hormonal, un modulador de receptor de estrógeno,
midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un
antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un
antidepresivo, un antimaniaco, un antipsicótico, un ansiolítico, un
hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina,
una medicación contra el asma, un agonista beta, un esteroide
inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina, un
cromolín, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una
citoquina o un antagonista de citoquina. Ejemplos no limitantes de
tales citoquinas incluyen, pero no están limitados a, cualquiera de
IL-1 a IL-23. Las dosis adecuadas
son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Wells et
al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2ª Edición, Appleton y
Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket
Pharmacopoeia 2000, Edición Deluxe, Tarascon Publishing, Loma
Linda, CA (2000).
Tales anticancerosos o antiinfecciosos también
pueden incluir moléculas de toxinas que se asocian, unen, coformulan
o coadministran con al menos un anticuerpo de la presente
invención. La toxina puede opcionalmente actuar para aniquilar
selectivamente la célula o tejido patológico. La célula patológica
puede ser una célula cancerosa u otra. Tales toxinas pueden ser,
pero no están limitadas a, toxina purificada o recombinante o
fragmento de toxina que comprende al menos un dominio citotóxico
funcional de la toxina, por ejemplo, seleccionado de al menos uno
de ricina, toxina de la difteria, una toxina de veneno, o una toxina
bacteriana. El término toxina también incluye tanto endotoxinas
como exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus natural,
mutante o recombinante que pueden producir cualquier afección
patológica en seres humanos y otros mamíferos, incluyendo choque
tóxico, que puede producir la muerte. Tales toxinas pueden incluir,
pero no están limitadas a, enterotoxina lábil al calor de E.
coli enterotoxigénica (LT), enterotoxina estable al calor (ST),
citotoxina de Shigella, enterotoxinas de Aeromonas,
toxina-1 del síndrome de choque tóxico
(TSST-1), enterotoxina A (SEA), B (SEB), ó C (SEC)
de Staphylococcus, enterotoxinas de Streptococcus y
similares. Tales bacterias incluyen pero no están limitadas a,
cepas de una especie E. coli enterotoxigénica (ETEC), E.
coli enterohemorrágica (por ejemplo, cepas de serotipo
0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella
(por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella
boydii, y Shigella sonnei), especies de Salmonella
(por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella
cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies
de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens,
Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de
Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni,
Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter, (por
ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas
(por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas
caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica,
especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae,
Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella,
Pseudomonas aeruginosa, y Streptococci. Ver, por
ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3ª ed., pp.
1-13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans
et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology
and Control, 2ª. Ed.; pp. 239-254, Plenum Medical
Book Co., Nueva York (1991); Mandell et al, Principles and
Practice of Infectious Diseases, 3ª. Ed., Churchill Livingstone,
Nueva York (1990); Berkow et al, eds., The Merck
Manual, 16ª edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood
et al, FEMS Microbiology Immunology,
76:121-134 (1991); Marrack et al, Science,
248:705-711 (1990).
Los compuestos, composiciones o combinaciones de
anticuerpo anti-IL-12 de la presente
invención pueden comprender además al menos uno de cualquier
auxiliar adecuado, tal como, pero no limitado, diluyente,
aglutinante, estabilizador, tampones, sales, solventes lipofílicos,
conservantes, adyuvantes o similares. Los auxiliares
farmacéuticamente aceptables son preferidos. Los ejemplos no
limitantes de, y métodos de preparación de tales soluciones
estériles son bien conocidos en la técnica, tal como, pero no
limitados a Gennaro. Ed., Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18^{a} Edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA)
1990. Los soportes farmacéuticamente aceptables se pueden
seleccionar rutinariamente que sean adecuados para el modo de
administración, solubilidad y/o estabilidad de la composición del
anticuerpo anti-IL-12 como es bien
sabido en la técnica o como se describe aquí.
Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles
en la presente composición incluyen pero no están limitados a,
proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, e hidratos de carbono
(por ejemplo, azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra-
y oligosacáridos; azúcares derivados tales como alditoles, ácidos
aldónicos, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o
polímeros de azúcares), que pueden estar presentes de forma
individual o en combinación, comprendiendo solo o en combinación
del 1-99,99% en peso o volumen. Los excipientes
proteicos de ejemplo incluyen seroalbúmina tal como seroalbúmina
humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina,
caseína, y similares. Aminoácidos/componentes de anticuerpo
representativos, que también pueden funcionar en capacidad
amortiguadora, incluyen alanina, glicina, arginina, betaína,
histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina,
leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartamo, y
similares. Un aminoácido preferido es glicina.
Los excipientes de hidratos de carbono adecuados
para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos
tal como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa,
D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tal
como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares;
polisacáridos, tal como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas,
dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol,
xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucidol),
mioinositol y similares. Los excipientes de hidratos de carbono
preferidos para su uso en la presente invención son manitol,
trehalosa, y rafinosa.
Las composiciones de anticuerpo
anti-IL-12 también pueden incluir un
tampón o un agente para ajustar el pH; típicamente, el tampón es
una sal preparada de un ácido orgánico o una base. Los tampones
representativos incluyen sales de ácidos orgánicos tal como sales
de ácido cítrico, ácidos ascórbico, ácido glucónico, ácido
carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido
ftálico; tampones Tris, clorhidrato de trometamina o fosfato. Los
tampones preferidos para su uso en la presente invención son sales
de ácidos orgánicos tales como citrato.
Además, las composiciones de anticuerpo
anti-IL-12 de la invención pueden
incluir excipientes/aditivos poliméricos tales como
polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico), dextratos
(por ejemplo, ciclodextrinas, tal como
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina),
polietilenglicoles, agentes saborizantes, agentes antimicrobianos,
edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, agentes
tensoactivos (por ejemplo, polisorbatos, tal como "TWEEN 20" y
"TWEEN 80"), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos
grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol), y agentes quelantes
(por ejemplo, EDTA).
Estos y excipientes y/o aditivos farmacéuticos
adicionales conocidos adecuados para su uso en las composiciones de
anticuerpo anti-IL-12 según la
invención son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se enumeran
en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19ª
ed., Williams & Williams, (1995), y en "Physician's Desk
Reference", 52ª ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998). Los
materiales de soporte o excipiente preferidos son hidratos de
carbono (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y tampones (por
ejemplo, citrato) o agentes poliméricos.
Como se ha observado anteriormente, la invención
proporciona formulaciones estables, que es preferiblemente un
tampón fosfato con solución salina o una sal elegida, así como
soluciones conservadas y formulaciones que contienen un conservante
así como formulaciones multiuso conservadas adecuadas para uso
farmacéutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo
anti-IL-12 en una formulación
farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas
contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente
seleccionado del grupo que consiste en al menos un fenol,
m-cresol, p-cresol,
o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito
fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro
de magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metil,
etil, propil, butil y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de
benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal, o mezclas de los
mismos en un diluyente acuoso. Se puede usar cualquier concentración
o mezcla adecuada como se sabe en la técnica, tal como
0,001-5% o cualquier intervalo o valor dentro del
mismo, tal como, pero no limitado a 0,001, 0,003, 0,005, 0,009,
0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,
0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0,
2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3,
3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, o
cualquier intervalo o valor en el mismo. Ejemplos no limitantes
incluyen, sin conservante, m-cresol al
0,1-2% (por ejemplo, al 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9,
1,0%), alcohol bencílico al 0,1-3% (por ejemplo, al
0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%) timerosal al
0,001-0,5% (por ejemplo, al 0,005, 0,01), fenol al
0,001-2,0% (por ejemplo, al 0,05, 0,25, 0,28, 0,5,
0,9, 1,0%), alquilparabeno(s) al 0,0005-1,0%
(por ejemplo, al 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075,
0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9,
1,0%), y similares.
Como se ha indicado anteriormente, la invención
proporciona un artículo de fabricación, que comprende material de
empaquetamiento y al menos un vial que comprende una solución de al
menos un anticuerpo anti-IL-12 con
las tampones y/o conservantes prescritos, opcionalmente en un
diluyente acuoso, en donde dicho material de empaquetamiento
comprende una etiqueta que indica que tal solución se puede mantener
durante un periodo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36,
40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o más. La invención comprende además
un artículo de fabricación, que comprende material de
empaquetamiento, un primer vial que comprende al menos un
anticuerpo anti-IL-12 liofilizado, y
un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de tampón o
conservante prescrito, en donde dicho material de empaquetamiento
comprende una etiqueta que instruye a un paciente a reconstituir el
al menos un anticuerpo anti-IL-12 en
el diluyente acuoso para formar una solución que se puede mantener
durante un periodo de veinticuatro horas o más.
El al menos un anticuerpo
anti-IL-12 usado según la presente
invención se puede producir por medios recombinantes, incluyendo a
partir de células de mamíferos o preparaciones transgénicas, o se
puede purificar de otras fuentes biológicas, como se describe aquí
o como se sabe en la técnica.
El intervalo del al menos un anticuerpo
anti-IL-12 en el producto de la
presente invención incluye cantidades que producen tras la
reconstitución, si es en un sistema húmedo/seco, concentraciones
desde alrededor de 1,0 \mug/ml hasta alrededor de 1000 mg/ml,
aunque concentraciones menores y mayores son operativas y dependen
del vehículo de administración deseado, por ejemplo, las
formulaciones en solución serán diferentes de los parches
transdérmicos, métodos pulmonares, transmucosa, o bombas osmóticas o
microbombas.
Preferiblemente, el diluyente acuoso
opcionalmente comprende además un conservante farmacéuticamente
aceptable. Los conservantes preferidos incluyen aquello
seleccionados del grupo que consiste en fenol,
m-cresol, p-cresol,
o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico,
alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de
benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y
timerosal, o mezclas de los mismos. La concentración de conservante
usado en la formulación es una concentración suficiente para
producir un efecto anti-microbiano. Tales
concentraciones dependen del conservante seleccionado y se
determinan fácilmente por el experto en la materia.
Se pueden añadir opcionalmente y preferiblemente
al diluyente otros excipientes, por ejemplo, agentes de
isotonicidad, tampones, antioxidantes, potenciadores de
conservantes. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa
normalmente a concentraciones conocidas. Preferiblemente se añade un
tampón fisiológicamente tolerado para proporcionar un control del
pH mejorado. Las formulaciones pueden cubrir un amplio rango de pH,
tal como desde alrededor de pH 4 hasta alrededor de pH 10, y rangos
preferidos desde alrededor de pH 5 hasta alrededor de pH 9, y un
rango más preferido de alrededor de 6,0 hasta alrededor de 8,0.
Preferiblemente las formulaciones de la presente invención tienen
un pH entre alrededor de 6,8 y alrededor de 7,8. Los tampones
preferidos incluyen tampones fosfato, lo más preferiblemente
fosfato de sodio, particularmente solución salina tamponada con
fosfato
(PBS).
(PBS).
Opcionalmente se pueden añadir a las
formulaciones o composiciones otros aditivos, tal como un
solubilizante farmacéuticamente aceptable como Tween 20
(monolaurato sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 40
(monopalmitato sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 80
(monooleato sorbitano de polioxietileno (20)), Pluronic F68
(copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno), y PEG
(polietilenglicol) o agentes tensoactivos no iónicos tales como
polisorbato 20 ó 80 o poloxámero 184 ó 188, polioles Pluronic®,
otros copolímeros en bloque, y agentes quelantes tales como EDTA y
EGTA para reducir la agregación. Estos aditivos son particularmente
útiles si se usa una bomba o envase de plástico para administrar la
formulación. La presencia de agentes tensoactivos farmacéuticamente
aceptables mitiga la propensión de las proteínas de agregar.
\newpage
Las formulaciones de la presente invención se
pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos
un anticuerpo anti-IL-12 y un
conservante seleccionado del grupo que consiste en fenol,
m-cresol, p-cresol,
o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico,
alquilparabeno (metil, etil, propil, butil y similares), cloruro de
benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y
timerosal, o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La
mezcla del al menos un anticuerpo
anti-IL-12 y conservante en un
diluyente acuoso se lleva a cabo usando procedimiento
convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una formulación
adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos
un anticuerpo anti-IL-12 en solución
tamponada con el conservante deseado en una solución tamponada en
cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el
conservante en las concentraciones deseadas. El experto en la
materia reconocería variaciones de este proceso. Por ejemplo, el
orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos
adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la
formulación, son todos factores que se pueden optimizar para la
concentración y medios de administración usados.
Las formulaciones reivindicadas se pueden
suministrar a pacientes como soluciones transparentes o como viales
duales que comprenden un vial de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 liofilizado que se
reconstituye con un segundo vial que comprende agua, un conservante
y/o excipientes, preferiblemente un tampón fosfato y/o solución
salina y una sal elegida, en un diluyente acuoso. Bien un vial de
una solución individual o un vial dual que requiere reconstitución
se pueden reutilizar múltiples veces y puede ser suficiente para un
ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento del paciente y de
esta manera puede proporcionar una pauta de tratamiento más
conveniente que las actualmente disponible.
Los presentes artículos de fabricación
reivindicados son útiles para la administración durante un periodo
de inmediatamente a veinticuatro horas o más. Según esto, los
artículos de fabricación ahora reivindicados ofrecen ventajas
significativas al paciente. Las formulaciones de la invención
opcionalmente se pueden almacenar de forma segura a temperaturas
desde alrededor de 2 hasta alrededor de 40ºC y mantienen la
actividad biológica de la proteína durante periodos de tiempo
extensos, de esta manera, permiten una etiqueta de empaquetamiento
que indica que la solución se puede mantener y/o usar durante un
periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ó 96 horas o más. Si se usa
diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir el uso hasta
1-12 meses, medio año, uno y medio y/o dos.
Las soluciones de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 en la invención se pueden
preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos un
anticuerpo en un diluyente acuoso. La mezcla se lleva a cabo usando
procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Para preparar
un diluyente adecuado, por ejemplo, se combina una cantidad medida
de al menos un anticuerpo en agua o tampón en cantidades suficientes
para proporcionar la proteína y opcionalmente un conservante o
tampón a las concentraciones deseadas. El experto en la materia
reconocería variaciones de este proceso. Por ejemplo, el orden en
que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la
temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son todos
factores que se pueden optimizar para la concentración y medios de
administración usados.
Los productos reivindicados se pueden
suministrar a pacientes como soluciones transparentes o como viales
duales que comprenden un vial del al menos un anticuerpo
anti-IL-12 liofilizado que se
reconstituye con un segundo vial que comprende el diluyente acuoso.
Bien un vial de una solución individual o un vial dual que requiere
reconstitución se pueden reutilizar múltiples veces y puede ser
suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento de
paciente y de esta manera puede proporcionar una pauta de
tratamiento más conveniente que las actualmente disponible.
Los productos reivindicados se pueden
suministrar indirectamente a pacientes proporcionando a farmacias,
clínicas, u otras instituciones e instalaciones, soluciones
transparentes o viales duales que comprenden un vial de al menos un
anticuerpo anti-IL-12 liofilizado
que se reconstituye con un segundo vial que contiene el diluyente
acuoso. La solución transparente en este caso puede ser de hasta un
litro o incluso mayor en tamaño, proporcionando una gran reserva de
la que se pueden retirar partes más pequeñas de la solución del al
menos un anticuerpo una o múltiples veces para su transferencia a
viales más pequeños y ser suministrada por la farmacia o clínica a
sus clientes y/o pacientes.
Los dispositivos reconocidos que comprenden
estos sistemas de viales individuales incluyen aquellos dispositivos
de inyectores de pluma para la administración de una solución tal
como BD Pens, BD Autojector®, Humaject® NovoPen®,
B-D®Pen, AutoPen®, y OptiPen®, GenotropinPen®;
Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon
Pen®, Biojector®, iject®, J-tip
Needle-Free Injector®, Intraject®,
Medi-Ject®, por ejemplo fabricados o desarrollados
por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com),
Disetronic (Burgdorf, Suiza, www.disetronic.com; Bioject, Portland,
Oregón (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical
(Peterborough, UK, www.weston-medical.com),
Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com).
Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de viales
dual incluyen aquellos sistemas de inyectores de pluma para
reconstitución de un fármaco liofilizado en un cartucho para
administración de la solución reconstituida tal como
HumatroPen®.
Los productos ahora reivindicados incluyen
material de empaquetamiento. El material de empaquetamiento
proporciona, además de la información requerida por las agencias
reguladoras, las condiciones en que el producto se puede usar. El
material de empaquetamiento de la presente invención proporciona
instrucciones al paciente para reconstituir el al menos un
anticuerpo anti-IL-12 en el
diluyente acuoso para formar una solución y para usar la solución
durante un periodo de 2-24 horas o mayor para el
producto en dos viales, húmedo/seco. Para el vial individual, el
producto en solución, la etiqueta indica que tal solución se puede
usar durante un periodo de 2-24 horas o mayor. Los
productos ahora reivindicados son útiles para uso de producto
farmacéutico en seres humanos.
Las formulaciones de la presente invención se
pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar al menos
un anticuerpo anti-IL-12 y un tampón
seleccionado, preferiblemente un tampón fosfato que contiene
solución salina o una sal elegida. La mezcla del al menos un
anticuerpo anti-IL-12 y tampón en un
diluyente acuoso se lleva a cabo usando procedimiento
convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una formulación
adecuada, por ejemplo, se combina una cantidad medida de al menos
un anticuerpo anti-IL-12 en agua o
tampón con el agente tamponante en agua en cantidades suficientes
para proporcionar la proteína y el tampón en las concentraciones
deseadas. El experto en la materia reconocería variaciones de este
proceso. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si
se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se
prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar
para la concentración y medios de administración usados.
Las formulaciones estables o conservadas
reivindicadas se pueden suministrar a pacientes como soluciones
transparentes o como viales duales que comprenden un vial de al
menos un anticuerpo anti-IL-12
liofilizado que se reconstituye con un segundo vial que comprende
un conservante o tampón y excipientes en un diluyente acuoso. Bien
un vial de una solución individual o un vial dual que requiere
reconstitución se pueden reutilizar múltiples veces y puede ser
suficiente para un ciclo único o ciclos múltiples de tratamiento de
paciente y de esta manera puede proporcionar una pauta de
tratamiento más conveniente que las actualmente disponibles.
Se puede administrar a un paciente al menos un
anticuerpo anti-IL-12 en las
formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas aquí
según la presente invención a través de una variedad de métodos de
distribución incluyendo inyección SC o IM; transdérmica, pulmonar,
transmucosa, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, u
otros medios que aprecia el experto en la materia, como es bien
sabido en la técnica.
El anticuerpo o composición de la invención
puede ser para modular o tratar al menos una enfermedad inmune, en
una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluyendo, pero no
limitada a, al menos uno de artritis reumatoide, artritis
reumatoide juvenil, artritis reumatoide sistémica de inicio juvenil,
artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica,
artropatías seronegativas, artrosis, enfermedad inflamatoria del
intestino, colitis ulcerosa, lupus eritematoso sistémico, síndrome
antifosfolípido, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, fibrosis
pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener,
sarcoidosis, orquitis/procedimientos reversos de vasectomía,
enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema,
dermatitis de contacto alérgica, conjuntivitis alérgica, neumonitis
hipersensible, trasplantes, rechazo al trasplante de órganos,
enfermedad de injerto contra el huésped, síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica, síndrome séptico, septicemia por gram
positivos, septicemia por gram negativos, septicemia de cultivo
negativo, septicemia fúngica, fiebre neutropénica, urosepticemia,
meningococcemia, traumatismo/hemorragia, quemaduras, exposición a
radiación ionizante, pancreatitis aguda, síndrome de dificultad
respiratoria aguda, artritis reumatoide, hepatitis inducida por
alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología
de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrosis, enfermedades
atópicas, reacciones hipersensibles, rinitis alérgica, fiebre del
heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma,
urticaria, anafilaxia sistémica, dermatitis, anemia perniciosa,
enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo de injerto de
cualquier órgano o tejido, rechazo a trasplante de riñón, rechazo
al trasplante de corazón, rechazo al trasplante de hígado, rechazo
al trasplante de páncreas, rechazo al trasplante de pulmón, rechazo
al trasplante de médula ósea (BMT), rechazo a aloinjerto de piel,
rechazo al trasplante de cartílago, rechazo al injerto de hueso,
rechazo al trasplante de intestino delgado, rechazo al implante de
timo fetal, rechazo al trasplante de paratiroides, rechazo a
xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo de aloinjerto,
reacciones de hipersensibilidad anti-receptor,
enfermedad de Graves, enfermedad de Raynoud, diabetes resistente a
insulina de tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidad mediada por
anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, lupus
eritematoso sistémico, síndrome POEMS (polineuropatía,
organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de
cambios en la piel), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía,
gammopatía monoclonal, síndrome de cambios en la piel, síndrome
antifosfolípido, pénfigo, escleroderma, enfermedad mezclada de
tejido conjuntivo, enfermedad idiopática de Addison, diabetes
melitus, hepatitis crónica activa, cirrosis biliar primaria,
vitíligo, vasculitis, síndrome de cardiotomía
post-IM, hipersensibilidad de tipo IV, dermatitis
de contacto, neumonitis por hipersensibilidad, rechazo de
aloinjerto, granulomas debido a organismos intracelulares,
sensibilidad a fármacos, metabólico/idiopático, enfermedad de
Wilson, hemacromatosis, deficiencia en
alfa-1-antitripsina, retinopatía
diabética, tiroiditis de Hashimoto, osteoporosis, evaluación del
eje hipotalámico-pitutaria-adrenal,
cirrosis biliar primaria, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia,
fibrosis quística, enfermedad del pulmón neonatal crónica,
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), linfohistiocitosis
hematofagocítica familiar, afecciones dermatológicas, soriasis,
alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular,
insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, toxicidad,
preeclampsia, terapia okt3, terapia anti-cd3,
terapia de citoquina, quimioterapia, terapia de radiación (por
ejemplo, incluyendo, pero no limitada a astenia, anemia, caquexia,
y similares), intoxicación de salicilato crónica, y similares. Ver,
por ejemplo, The Merck Manual, 12ª-17ª ediciones, Merck &
Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999),
Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., eds., Segunda
edición, Appleton y Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).
El anticuerpo o composición puede ser para
modular o tratar al menos una enfermedad cardiovascular en una
célula, tejido, órgano, animal o paciente.
El anticuerpo o composición se puede administrar
antes, al mismo tiempo, y/o después de al menos uno seleccionado de
al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un
anticuerpo contra TNF o fragmento, un receptor soluble de TNF o
fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista de
TNF de molécula pequeña), un antirreumático (por ejemplo,
metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept,
tiomalato de sodio y oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida,
sulfasalcina), un relajante muscular, un narcótico, un
antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico,
un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un
antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antifúngico, un
antiparasítico, un antivírico, un carbapenemo, cefalosporina, una
fluroquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una
tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriático, un
corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente relacionado con
diabetes, un mineral, un nutriente, un agente tiroideo, una
vitamina, una hormona relacionada con calcio, un antidiarreico, un
antitusígeno, un antiemético, un antiúlcera, un laxante, un
anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un
filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un
sargramostim (GM-CSF, Leukine), una inmunización,
una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab,
ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco
de remplazo hormonal, un modulador de receptor de estrógeno,
midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un
antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un
antidepresivo, un agente antimaniaco, un antipsicótico, un
ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante,
donepezil, tacrina, una medicación contra el asma, un agonista beta,
un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una
metilxantina, un cromolín, una epinefrina o análogo, dornasa alfa
(Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina. Las dosis
adecuadas son bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo, Wells
et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2ª Edición, Appleton
y Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket
Pharmacopoeia 2000, Edición Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda,
CA (2000).
Los antagonistas de TNF adecuados para la
presente invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos
anti-TNF, fragmentos de unión a antígeno de los
mismos, y moléculas de receptor que se unen específicamente a TNF;
compuestos que previenen y/o inhiben la síntesis de TNF, la
liberación de TNF o su acción en células diana, tal como
talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo,
pentoxifilina y rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b
y potenciadores del receptor de adenosina A2b; compuestos que
previenen y/o inhiben la señalización del receptor de TNF, tal como
los inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógenos
(MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben el corte de TNF de
membrana, tal como los inhibidores de metaloproteinasa; compuestos
que bloquean y/o inhiben la actividad de TNF, tal como inhibidores
de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo,
captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o
síntesis de TNF, tal como inhibidores la MAP quinasa.
Como se usa aquí, un "anticuerpo contra el
factor de necrosis tumoral", "anticuerpo contra TNF",
"anticuerpo de TNF", o fragmento y similares disminuye,
bloquea, inhibe, abroga o interfiere con la actividad de TNF in
vitro, in situ y/o preferiblemente in vivo. Por
ejemplo, un anticuerpo humano contra TNF adecuado de la presente
invención se puede unir a TNF\alpha e incluye anticuerpos
anti-TNF, fragmentos de unión al antígeno de los
mismos, y mutantes o dominios especificados de los mismos que se
unen específicamente a TNF\alpha. Un anticuerpo o fragmento
contra TNF adecuado también puede disminuir, bloquear, abrogar,
interferir, prevenir y/o inhibir la síntesis de ARN, ADN o proteína
TNF, la liberación de TNF, la señalización del receptor de TNF, el
corte de TNF de membrana, la actividad de TNF, la producción y/o
síntesis de TNF.
El anticuerpo quimérico cA2 consiste en la
región variable de unión al antígeno del anticuerpo de ratón
neutralizante de alta afinidad IgG1
anti-TNF\alpha humano, designado A2, y las
regiones constantes de una inmunoglobulina kappa IgG1 humana. La
región Fc de IgG1 humana mejora la función efectora del anticuerpo
alogénico, aumenta la vida media circulante en suero y disminuye la
inmunogenicidad del anticuerpo. La avidez y especificidad del
anticuerpo quimérico cA2 deriva de la región variable del anticuerpo
murino A2. En una forma de realización particular, una fuente
preferida de ácidos nucleicos que codifican la región variable del
anticuerpo murino A2 es la línea celular de hibridoma A2.
A2 quimérico (cA2) neutraliza el efecto
citotóxico tanto del TNF\alpha humano natural como recombinante
en una manera dependiente de la dosis. De los ensayos de unión del
anticuerpo quimérico cA2 y TNF\alpha humano recombinante, se
calculó que la constante de afinidad del anticuerpo quimérico era de
1,04x10^{10} M^{-1}. Los métodos preferidos para determinar la
especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal mediante
inhibición competitiva se pueden encontrar en Harlow, et al.,
antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988; Colligan et al.,
eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing
Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York,
(1992-2000); Kozbor et al., Immunol. Today,
4:72-79 (1983); Ausubel et al., eds. Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York
(1987-2000); y Muller, Meth. Enzymol.,
92:589-601 (1983).
En una forma de realización particular, el
anticuerpo monoclonal murino A2 es producido por una línea celular
designada c134A. El anticuerpo quimérico cA2 es producido por una
línea celular designada c168A.
Ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales
anti-TNF que se pueden usar en la presente invención
se describen en la técnica (ver por ejemplo, la patente de EE.UU.
No. 5231024; Möller, A. et al., Cytokine
2(3):l62-169 (1990); Solicitud de EE.UU. No.
07/943852 (presentada el 11 de septiembre 1992); Rathjen et
al., Publicación International No. WO 91/02078 (publicada el 21
de febrero de 1991); Rubin et al., publicación de patente
EPO No. 0 218 868 (publicada el 22 de abril de 1987), Yone et
al., Publicación de Patente EPO No. 0 288 088 (26 de
octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm.
137:847-854 (1986); Meager, et al.,
Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al.,
Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, et al.,
Hybridoma 6:489-507 (1987); y Hirai, et al.,
J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987).
Las moléculas de receptor de TNF preferidas
útiles en la presente invención son aquellas que se unen a TNF con
gran afinidad (ver, por ejemplo, Feldmann et al., publicación
International No. WO 92/07076 (publicada el 30 abril de 1992);
Schall et al., Cell 61:361-370 (1990); y
Loetscher et al., Cell 61:351-359 (1990) y
opcionalmente poseen baja inmunogenicidad. En particular, los
receptores de TNF de la superficie celular de 55 kDa (p55
TNF-R) y de 75 kDa (p75 TNF-R) son
útiles en la presente invención. Las formas truncadas de estos
receptores, que comprenden los dominios extracelular (ECD) de los
receptores o partes funcionales de los mismos (ver, por ejemplo,
Corcoran et al., Eur. J. Biochem. 223:831-840
(1994)), también son útiles en la presente invención. Las formas
truncadas de los receptores de TNF, que comprenden el ECD, se han
detectado en orina y suero como proteínas inhibidoras de unión a
TNF de 30 y 40 kDa (Engelmann, H. et al., J. Biol. Chem.
265:1531-1536 (1990)). Las moléculas
multiméricas de receptor de TNF y las moléculas inmunorreceptoras
de fusión de TNF, y derivados y fragmentos o partes de las mismas,
son ejemplos adicionales de moléculas de receptor de TNF que son
útiles en los métodos y composiciones de la presente invención. Las
moléculas de receptor de TNF que se pueden usar en la invención se
caracterizan por su capacidad para tratar pacientes durante periodos
extensos con mejora de síntomas de buena a excelente y baja
toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o alta afinidad, así como
otras propiedades no definidas, pueden contribuir a los resultados
terapéuticos alcanzados.
Las moléculas multiméricas de receptor de TNF
útiles en la presente invención comprenden todo o una parte
funcional del ECD de dos o más receptores de TNF unidos a través de
uno o más enlazadores polipeptídicos u otros enlazadores no
peptídicos, tal como polietilenglicol (PEG). Las moléculas
multiméricas pueden comprender además un péptido señal de una
proteína secretada para dirigir la expresión de la molécula
multimérica. Estas moléculas multiméricas y los métodos para su
producción se han descrito en La solicitud de EE.UU. No. 08/437533
(presentada el 9 de mayo de 1995).
Las moléculas inmunorreceptoras de fusión de TNF
útiles en la presente invención comprenden al menos una parte de
una o más moléculas de inmunoglobulina y todo o una parte funcional
de uno o más receptores de TNF. Estas moléculas inmunorreceptoras
de fusión se pueden ensamblar como monómeros, o hetero- u
homo-multímeros. Las moléculas inmunorreceptoras de
fusión también pueden ser monovalentes o multivalentes. Un ejemplo
de tales moléculas inmunorreceptoras de fusión es la proteína de
fusión receptor de TNF/IgG. Las moléculas inmunorreceptoras de
fusión de TNF y los métodos para su producción se han descrito en la
técnica (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol.
21:2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991);
Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489
(1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:215-219 (1994); Butler et al., Cytokine
6(6):616-623 (1994); Baker et al., Eur. J.
Immunol. 24:2040-2048 (1994); Beutler et
al., patente de EE.UU. No. 5447851; y solicitud de EE.UU. No.
08/442133 (presentada el 16 de mayo de 1995). También se pueden
encontrar métodos para producir moléculas inmunorreceptoras de
fusión en Capon et al., patente de EE.UU. No. 5116964; Capon
et al., patente de EE.UU. No. 5225538; y Capon et al.,
Nature 337:525-531(1989).
Un equivalente funcional, derivado, fragmento o
región de la molécula del receptor de TNF se refiere a la parte de
la molécula del receptor de TNF, o la parte de la secuencia de la
molécula del receptor de TNF que codifica una molécula de receptor
de TNF, que es de tamaño y secuencias suficientes para parecerse
funcionalmente a moléculas del receptor de TNF que se pueden usar
en la presente invención (por ejemplo, se une a TNF con gran
afinidad y posee baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional de
la molécula del receptor de TNF también incluye moléculas
modificadas del receptor de TNF que se parecen funcionalmente a las
moléculas del receptor de TNF que se pueden usar en la presente
invención (por ejemplo, se une a TNF con gran afinidad y posee baja
inmunogenicidad). Por ejemplo, un equivalente funcional de una
molécula de receptor de TNF puede contener un codón
"SILENCIOSO" o una o más sustituciones, deleciones o adiciones
de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de un aminoácido ácido por
otro aminoácido ácido; o sustitución de un codón que codifica un
aminoácido hidrofóbico igual o diferente por otro codón que
codifica un aminoácido hidrofóbico). Ver, Ausubel et al., eds.
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc. y Wiley Interscience, Nueva York
(1987-2000).
Las citoquinas incluyen cualquier citoquina
conocida. Ver, por ejemplo, www.CopewithCytokines.com. Los
antagonistas de citoquinas incluyen, pero no están limitados a,
cualquier anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor
soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de molécula
pequeña, o cualquier combinación de los mismos.
Tratamientos terapéuticos. El anticuerpo
o composición de la invención se puede usar en un método para tratar
un trastorno mediado por IL-12, que comprende
administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o composición a una
célula, tejido, órgano, animal o paciente en necesidad. Tal método
puede opcionalmente comprender además la coadministración o terapia
de combinación para tratar tales enfermedades inmunes, en donde la
administración de dicho anticuerpo o composición comprende además
administrar, antes, al mismo tiempo, y/o después, al menos uno
seleccionado de al menos uno de al menos uno seleccionado de al
menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero no limitado a un
anticuerpo contra TNF o fragmento, un receptor soluble de TNF o
fragmento, proteínas de fusión de los mismos, o un antagonista de
TNF de molécula pequeña), un antirreumático (por ejemplo,
metotrexato, auranofín, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept,
tiomalato de sodio y oro, sulfato de hidroxicloroquina,
leflunomida, sulfasalcina), un relajante muscular, un narcótico, un
antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un
anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante
neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un
antifúngico, un antiparasítico, un antivírico, un carbapenemo,
cefalosporina, una fluroquinolona, un macrólido, una penicilina,
una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un
antisoriático, un corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente
relacionado con diabetes, un mineral, un nutritivo, un agente
tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con calcio, un
antidiarreico, un antitusígeno, un antiemético, un antiúlcera, un
laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo,
epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF,
Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukine), una
inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo,
basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento,
un fármaco de remplazo hormonal, un modulador de receptor de
estrógeno, midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un
antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofármaco, un
antidepresivo, un agente antimaniaco, un antipsicótico, un
ansiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante,
donepezil, tacrina, una medicación contra el asma, un agonista
beta, un esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una
metilxantina,
un cromolín, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina.
un cromolín, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citoquina o un antagonista de citoquina.
Típicamente, el tratamiento de afecciones
patológicas se efectúa administrando una cantidad o dosis eficaz de
al menos una composición de anticuerpo
anti-IL-12 que totaliza, de media,
un intervalo de al menos alrededor de 0,01 hasta 500 miligramos de
al menos un anticuerpo anti-IL-12
por kilo de paciente por dosis, y preferiblemente desde al menos
alrededor de 0,1 a 100 miligramos de anticuerpo/kilo de paciente por
administración individual o múltiple, dependiendo de la actividad
específica contenida en la composición. De forma alternativa, la
concentración eficaz en suero puede comprender
0,1-5000 \mug/ml de concentración en suero por
administración individual o múltiple. Las dosis adecuadas son
conocidas para los médicos y, por supuesto, dependerán del estado
particular de la enfermedad, la actividad específica de la
composición que se administra, y el paciente particular que se
somete a tratamiento. En algunos casos, para alcanzar la cantidad
terapéutica deseada, puede ser necesario proporcionar
administración repetida, es decir, administraciones individuales
repetidas de una dosis controlada o medida particular, donde las
administraciones individuales se repiten hasta alcanzar la dosis
diaria o efecto deseado.
Las dosis preferidas pueden incluir
opcionalmente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100-500
mg/kg/administración, o cualquier intervalo, valor o fracción de
las mismas, o para alcanzar una concentración en suero de 0,1, 0,5,
0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0,
4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5,
8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9,
13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9,
7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11,
11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 15, 15,5,
15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5,
19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35,
40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400,
500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000,
4500, y/o 5000 \mug/ml de concentración en suero por
administración individual o múltiple, o cualquier intervalo, valor o
fracción de las mismas.
De forma alternativa, la dosis administrada
puede variar dependiendo de factores conocidos, tal como las
características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y
vía de administración; edad, salud y peso del receptor; naturaleza
y extensión de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente,
frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. Normalmente una
dosis de principio activo puede ser alrededor de 0,1 a 10 mg por
kilogramo de peso corporal. Normalmente de 0,1 a 50, y
preferiblemente de 0,1 a 10 mg por kilo por administración o en
forma de liberación sostenida es eficaz para obtener los resultados
deseados.
Como ejemplo no limitante, se puede proporcionar
el tratamiento de seres humanos o animales como una dosis de una
vez o periódica de al menos un anticuerpo de la presente invención
de 0,1 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 mg/kg,
por día, en al menos un día del día 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ó 40, o de forma
alternativa o adicional, al menos una de la semana 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,
41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, ó 52, o de forma
alternativa o adicional, al menos uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 años, o cualquier
combinación de los mismos, usando dosis individuales, infusión o
repetidas.
Las formas farmacéuticas (composición) adecuadas
para la administración interna generalmente contienen desde
alrededor de 0,1 miligramo hasta alrededor de 500 miligramos de
principio activo por unidad o envase. En estas composiciones
farmacéuticas el principio activo normalmente estará presente en una
cantidad desde el 0,5-99,999% en peso basado en el
peso total de la composición.
Para la administración parenteral, el anticuerpo
se puede formular como una solución, suspensión, emulsión, o polvo
liofilizado en asociación, o suministrados de forma separada, con un
vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de
tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer,
solución de dextrosa, y seroalbúmina humana al
1-10%. También se pueden usar liposomas y vehículos
no acuosos tal como aceites no volátiles. El vehículo o polvo
liofilizado pueden contener aditivos que mantienen la isotonicidad
(por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por
ejemplo, tampones y conservantes). La solución se esteriliza
mediante técnicas conocidas o adecuadas.
Los soportes farmacéuticos adecuados se
describen en las ediciones más recientes de Remington's
Pharmaceutical Science, A. Osol, un texto estándar de referencia en
este campo.
Se pueden usar muchos modos conocidos y
desarrollados según la presente invención para administrar
cantidades farmacéuticamente eficaces de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 según la presente
invención. Mientras que se usa la administración pulmonar en la
siguiente descripción, se pueden usar otros modos de administración
según la presente invención con resultados adecuados.
Los anticuerpos de IL-12 de la
presente invención se pueden distribuir en un soporte, como una
solución, emulsión, coloide o suspensión, o como un polvo seco,
usando cualquiera de una variedad de dispositivos y métodos
adecuados para la administración mediante inhalación u otros modos
descritos aquí o conocidos en la técnica.
Las formulaciones para la administración
parenteral pueden contener como excipientes comunes agua o solución
salina estéril, polialquilenglicoles tal como polietilenglicol,
aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las
soluciones acuosas u oleaginosas para inyección se pueden preparar
usando un emulsionante o humectante apropiado y un agente
suspensor, según métodos conocidos. Los agentes para la inyección
pueden ser un agente diluyente no tóxico no oralmente administrable
tal como una solución acuosa o una solución o suspensión inyectable
estéril en un solvente. Como vehículo o solvente utilizable, se
permiten agua, solución de Ringer, solución salina isotónica, etc.;
como solvente normal, o solvente de suspensión, se puede usar un
aceite no volátil estéril. Para estos fines, se puede usar cualquier
tipo de aceite y ácido graso no volátil, incluyendo aceites grasos
o ácidos grasos naturales o sintéticos o semisintéticos; mono- o di-
o tri-glicéridos naturales o sintéticos o
semisintéticos. La administración parenteral se conoce en la técnica
e incluye, pero no está limitada, medios de inyección
convencionales, un dispositivo de inyección sin aguja con gas
presurizado como se describe en la patente de EE.UU. No. 5851198, y
un dispositivo perforador por láser como se describe en la patente
de EE.UU. No. 5839446.
La invención se refiere además a la
administración de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 por medio parenteral,
subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular,
intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso,
intracavitario, intraceliaco, intracelebelar,
intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico,
intrahepático, intramiocardiaco, intraosteal, intrapélvico,
intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático,
intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal,
intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino,
intravesical, bolus, vaginal, rectal, bucal, intranasal, o
transdérmico. Se puede preparar al menos una composición de
anticuerpo anti-IL-12 para su uso
para administración parenteral (subcutánea, intramuscular o
intravenosa) o cualquier otra administración particularmente en
forma de soluciones o suspensiones líquidas; para su uso en
administración vaginal o rectal particularmente en formas
semisólidas tal como, pero no limitadas a, cremas y supositorios;
para administración oral o yugal tal como, pero no limitadas a, en
forma de comprimidos o cápsulas; o por vía intranasal tal como,
pero no limitado a, la forma de polvo, gotas nasales o aerosoles o
ciertos agentes; o por vía transdérmica tal como pero no limitado a
un gel, pomada, loción, suspensión o sistema de distribución de
parche con potenciadores químicos tal como dimetilsulfóxido para
modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración
de fármaco en el parche transdérmico (Junginger, et al. En
"Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., pp.
59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994), o con
agentes oxidantes que permiten la aplicación de formulaciones que
contienen proteínas y péptidos sobre la piel (WO 98/53847), o la
aplicación de campos eléctricos para crear vías transitorias de
transporte tal como electroporación, o para aumentar la motilidad
de fármacos cargados a través de la piel tal como iontoforesis, o la
aplicación de ultrasonido tal como sonoforesis (patentes de EE.UU.
Nos. 4309989 y 4767402).
Para la administración pulmonar, preferiblemente
se distribuye al menos una composición de anticuerpo
anti-IL-12 en un tamaño de
partícula eficaz para alcanzar las vías respiratorias bajas del
pulmón o senos. Según la invención, se puede distribuir al menos un
anticuerpo anti-IL-12 mediante
cualquiera de una variedad de dispositivos de inhalación o nasales
conocidos en la técnica para la administración de un agente
terapéutico mediante inhalación. Estos dispositivos capaces de
depositar formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o alveolos
de un paciente incluyen inhaladores de dosis medidas,
nebulizadores, generadores de polvo seco, aerosoles y similares.
Otros dispositivos adecuados para dirigir la administración
pulmonar o nasal de anticuerpos también son conocidos en la
técnica. Todos esos dispositivos pueden hacer uso de formulaciones
adecuadas para la administración para dispensar anticuerpos en un
aerosol. Tales aerosoles pueden estar comprendidos en soluciones
(tanto acuosas como no acuosas) o partículas sólidas. Los inhalador
de dosis medidas, como el inhalador de dosis medida Ventolin®,
típicamente usan un gas propelente y requieren actuación durante la
inspiración (ver, por ejemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Los
inhaladores de polvo seco como Turbuhaler^{TM} (Astra),
Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros^{TM}
(Dora), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, y el
inhalador en polvo Spinhaler® (Fisons), usan
respiración-actuación de un polvo mezclado (US
4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552
Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Los nebulizadores como
AERx^{TM} Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), y el
nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (US 5404871
Aradigm, WO 97/22376), las referencias anteriores enteramente
incorporadas aquí mediante referencia, producen aerosoles de
soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medidas,
inhaladores de polco seco, etc., generan aerosoles de partícula
pequeña. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación
comercialmente disponibles se pretende que sean una representación
de dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta
invención, y no se pretenden como limitantes del ámbito de la
invención. Preferiblemente, se distribuye una composición que
comprende al menos un anticuerpo
anti-IL-12 mediante un inhalador de
polvo seco o un pulverizador. Hay varias características deseables
de un dispositivo de inhalación para administrar al menos un
anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, la distribución
por el dispositivo de inhalación es de forma ventajosa fiable,
reproducible y exacta. El dispositivo de inhalación puede distribuir
opcionalmente partículas secas pequeñas, por ejemplo, de menos de
alrededor de 10 \mum, preferiblemente de alrededor de
1-5 \mum, para una buena respirabilidad.
Se puede producir un aerosol que incluya una
composición proteica de anticuerpo IL-12 forzando
una suspensión o solución de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 a través de una boquilla
a presión. El tamaño y la configuración de la boquilla, la presión
aplicada, y la velocidad de alimentación del líquido se pueden
elegir para alcanzar la emisión y tamaño de partícula deseados. Se
puede producir un electrospray, por ejemplo, mediante un campo
eléctrico en unión con un capilar o boquilla de alimentación. De
forma ventajosa, las partículas de la proteína de composición de al
menos un anticuerpo anti-IL-12
distribuidas mediante un pulverizador tienen un tamaño de partícula
de menos de alrededor de 10 \mum, preferiblemente en el intervalo
de alrededor de 1 \mum hasta alrededor de 5 \mum, y lo más
preferiblemente alrededor de 2 \mum hasta alrededor de 3
\mum.
Las formulaciones de composición proteica de al
menos un anticuerpo anti-IL-12
adecuadas para su uso con un pulverizador típicamente incluyen
composición proteica de anticuerpo en un solución acuosa a una
concentración de alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 100 mg de
una composición proteica de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 por ml de solución o
mg/gm, o cualquier rango o valor dentro de la misma, por ejemplo,
pero no limitado a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó
100 mg/ml ó mg/gm. La formulación puede incluir agentes tal como un
excipiente, un tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un
agente tensoactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulación
también puede incluir un excipiente o agente para la estabilización
de la proteína de la composición de anticuerpo, tal como un tampón,
un agente reductor, una proteína de masa, o un hidrato de carbono.
Las proteína de masa útiles en la formulación de las proteínas de
composición de anticuerpo incluyen albúmina, protamina, o similares.
Los hidratos de carbono típicos útiles en formular las proteínas de
composición de anticuerpo incluyen sacarosa, manitol, lactosa,
trehalosa, glucosa, o similares. La formulación de la proteína de
la composición de anticuerpo también puede incluir un agente
tensoactivo, que puede reducir o prevenir agregación inducida por la
superficie de la proteína de la composición de anticuerpo producida
por la atomización de la solución al formar un aerosol. Se pueden
emplear varios agentes tensoactivos convencionales, tales como
ésteres de ácidos grasos y polioxietileno y alcoholes, y ésteres
sorbitoles de ácidos grasos y polioxietileno. Las cantidades
generalmente variarán entre el 0,001 y el 14% en peso de la
formulación. Agentes tensoactivos especialmente preferidos para los
fines de esta invención son monooleato sorbitano de polioxietileno,
polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. También se pueden
incluir agentes adicionales conocidos en la técnica para la
formulación de una proteína tal como anticuerpos
anti-IL-12, o partes especificadas
o variantes en la formulación.
Se puede administrar la composición proteica de
anticuerpo mediante un nebulizador, tal como un nebulizador de
chorro o un nebulizador ultrasónico. Típicamente, en un nebulizador
de chorro se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro
de aire de gran velocidad a través de un orificio. Cuando el gas se
expande más allá de la boquilla, se crea una región de baja
presión, que arrastra la solución de proteína de la composición de
anticuerpo a través de un tubo capilar unido a depósito de líquido.
La corriente de líquido desde el tubo capilar se rompe en
filamentos y gotas inestables según sale del tubo, creando el
aerosol. Se pueden emplear un rango de configuraciones, velocidades
de flujo, y tipos de separadores para alcanzar las características
de realización deseadas de un nebulizador a chorro determinado. En
un nebulizador ultrasónico, se usa energía eléctrica de alta
frecuencia para crear energía vibratoria, mecánica, típicamente
empleando un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite
a la formulación de la proteína de la composición de anticuerpo
directamente o través de un líquido de acoplamiento, creando un
aerosol que incluye la proteína de la composición de anticuerpo. De
forma ventajosa, las partículas de la proteína de la composición de
anticuerpo distribuidas por un nebulizador tienen un tamaño de
partícula de menos de alrededor de 10 \mum, preferiblemente en el
intervalo de alrededor de 1 \mum hasta alrededor de 5 \mum, y lo
más preferiblemente alrededor de 2 \mum hasta alrededor de 3
\mum.
Las formulaciones de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 adecuadas para su uso con
un nebulizador, de chorro o ultrasónico, típicamente incluyen una
concentración de alrededor de 0,1 mg hasta alrededor de 100 mg de
la proteína de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 por ml de solución. La
formulación puede incluir agentes tal como un excipiente, un
tampón, un agente de isotonicidad, un conservante, un agente
tensoactivo, y, preferiblemente, zinc. La formulación también puede
incluir un excipiente o agente para la estabilización de la proteína
de la composición de al menos un anticuerpo
anti-IL-12, tal como un tampón, un
agente reductor, una proteína de masa, o un hidrato de carbono. Las
proteínas de masa útiles en la formulación de las proteínas de
composición de anticuerpo incluyen albúmina, protamina, o
similares. Los hidratos de carbono típicos útiles en formular al
menos un anticuerpo anti-IL-12
incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o
similares. La formulación de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 también puede incluir un
agente tensoactivo, que puede reducir o prevenir agregación
inducida por la superficie de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 producida por la
atomización de la solución al formar un aerosol. Se pueden emplear
varios agentes tensoactivos convencionales, tal como ésteres de
ácidos grasos y polioxietileno y alcoholes, y ésteres sorbitoles de
ácidos grasos y polioxietileno. Las cantidades generalmente
variarán entre el 0,001 y el 4% en peso de la formulación. Agentes
tensoactivos especialmente preferidos para los fines de esta
invención son monooleato sorbitano de polioxietileno, polisorbato
80, polisorbato 20, o similares. También se pueden incluir agentes
adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una
proteína tal como una proteína de anticuerpo en la formulación.
En un inhalador de dosis medidas (MDI), un
propulsor, al menos un anticuerpo
anti-IL-12, y cualquier excipiente
u otros aditivos, están contenidos en un bote como una mezcla
incluyendo un gas comprimido licuado. La actuación de la válvula de
medida libera la mezcla como un aerosol, preferiblemente conteniendo
partículas en el intervalo de tamaño de menos de alrededor de 10
\mum, preferiblemente de alrededor de 1 \mum hasta alrededor de
5 \mum, y lo más preferiblemente alrededor de 2 \mum hasta
alrededor de 3 \mum. El tamaño de partícula de aerosol deseado se
puede obtener empleando una formulación de composición proteica de
anticuerpo producida por varios métodos conocidos para los expertos
en la materia, incluyendo micronización, secado por rociado,
condensación a punto crítico, o similares. Los inhaladores de dosis
medidas preferidos incluyen los fabricados por 3M o Glaxo y que
emplean propulsor de hidrofluorocarbono.
Las formulaciones de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 para su uso con un
dispositivo inhalador de dosis medidas generalmente incluirán un
polvo finamente dividido que contendrá al menos un anticuerpo
anti-IL-12 como una suspensión en
un medio no acuoso, por ejemplo suspendido en un propulsor con ayuda
de un agente tensoactivo. El propulsor puede ser de cualquier
material convencional empleado para este propósito, tal como
clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un
hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, incluyendo
triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano,
HFA-134a
(hidrodrofluoroalcano-134a), HFA-227
(hidrodrofluoroalcano-227), o similares.
Preferiblemente, el propulsor es un hidrofluorocarbono. Se puede
elegir el agente tensoactivo para estabilizar el al menos un
anticuerpo anti-IL-12 como una
suspensión en el propulsor, para proteger el principio activo
contra la degradación química, y similares. Los agentes tensoactivos
adecuados incluyen trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido
oleico, o similares. En algunos casos se prefieren aerosoles que
usan solventes tal como etanol. También se pueden incluir agentes
adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una
proteína tal como una proteína en la formulación.
El experto en la materia reconocerá que los
métodos de la presente invención se pueden alcanzar mediante
administración pulmonar de composiciones de al menos un anticuerpo
anti-IL-12 a través de dispositivos
no descritos aquí.
Las formulaciones orales se basan en la
coadministración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y agentes
tensoactivos no iónicos tal como polioxietileno oleil éter y
n-hexadecilpolietileno éter) para aumentar
artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así
como la coadministración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo,
inhibidores de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato
(DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. El
compuesto constituyente activo de la forma farmacéutica de tipo
sólido para la administración oral se puede mezclar con al menos un
aditivo, incluyendo sacarosa, lactosa, celulosa, manitol,
trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos,
quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanto, goma arábiga,
gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímeros sintéticos o
semisintéticos, y glicéridos. Estas formas farmacéuticas también
pueden contener otro(s) tipo(s) de aditivos, por
ejemplo, agente diluyente inactivo, lubricante tal como estearato
de magnesio, parabeno, agente conservante tal como ácido sórbico,
ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal
como cisteína, desintegrador, aglutinante, espesante, agente
amortiguador, agente edulcorante, agente saborizante, agente
perfumante, etc.
Los comprimidos y píldoras se pueden procesar
adicionalmente en preparaciones entéricas recubiertas. Las
preparaciones líquidas para la administración oral incluyen
preparaciones en emulsión, jarabe, elixir, suspensión y solución
permisible para uso médico. Estas preparaciones pueden contener
agentes diluyentes inactivos normalmente usados en dicho campo, por
ejemplo, agua. También se han descrito liposomas como sistemas de
distribución de fármacos para insulina y heparina (patente de
EE.UU. No. 4239754). Más recientemente, se han usado microesferas de
polímeros artificiales de aminoácidos mezclados (proteinoides) para
distribuir productos farmacéuticos (patente de EE.UU. No. 4925673).
Además, se usan compuestos soporte descritos en la patente de EE.UU.
No. 5879681 y la patente de EE.UU. No. 55871753 para distribuir
agentes biológicamente activos por vía oral son conocidos en la
técnica.
Para la absorción a través de las superficies de
la mucosa, las composiciones y métodos de administrar al menos un
anticuerpo anti-IL-12 incluyen una
emulsión que comprende una pluralidad de partículas submicrónicas,
una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo, y una fase
acuosa continua, que fomentan la absorción a través de las
superficies de mucosas alcanzado la mucoadhesión de las partículas
en emulsión (patente de EE.UU. No. 5514670). Las superficies
mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones de la
presente invención pueden incluir vías de administración corneal,
conjuntiva, yugal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal,
intestinal y rectal. Las formulaciones para administración vaginal o
rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como
excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de
cacao, y similares. Las formulaciones para administración
intranasal pueden ser sólidas y contener como excipientes, por
ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas u oleaginosas de
gotas nasales. Para la administración yugal los excipientes
incluyen azúcares, estearato de calcio, estearato de magnesio,
almidón pregelatinizado, y similares (patente de EE.UU. No.
5849695).
Para la administración transdérmica, el al menos
un anticuerpo anti-IL-12 se
encapsula en un dispositivo de distribución tal como un liposoma o
nanopartículas poliméricas, micropartículas, microcápsula o
microesferas (denominadas colectivamente como micropartículas a
menos que se especifique de otra manera). Se conocen un número de
dispositivos adecuados, incluyendo micropartículas hechas de
polímeros sintéticos tal como ácidos polihidroxi tal como ácido
poliláctico, ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos,
poliortoésteres, polianhídridos, y polifosfacenos, y polímeros
naturales tal como colágeno, poliaminoácidos, albúmina y otras
proteínas, alginato y otros polisacáridos, y combinaciones de los
mismos (patente de EE.UU. No. 5814599).
Algunas veces puede ser deseable distribuir los
compuestos de la presente invención al sujeto a lo largo de
periodos prolongados de tiempo, por ejemplo, durante periodos de una
semana a un año a partir de una administración única. Se pueden
utilizar varias formas farmacéuticas de liberación lenta, depósito o
implante. Por ejemplo, una forma farmacéutica puede contener una
sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de los compuestos que
tiene un grado bajo de solubilidad en líquidos corporales, por
ejemplo, (a) una sal de adición ácida con un ácido polibásico tal
como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido
tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido
poliglutámico, ácidos naftaleno mono- o
di-sulfónico, ácido poligalacturónico, y similares;
(b) una sal con un catión metálico polivalente tal como zinc,
calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel,
cadmio y similares o con un catión orgánico formado de por ejemplo,
N,N'-dibencil-etilendiamina o
etilendiamina; o (c)combinaciones de (a) y (b), por ejemplo,
una sal de tanato de zinc. Además, los compuestos de la presente
invención o, preferiblemente, una sal relativamente insoluble tal
como las que se acaban de describir, se pueden formular en un gel,
por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio con, por ejemplo,
aceite de sésamo, adecuado para inyección. Sales particularmente
preferidas son sales de zinc, sales de tanato de zinc, sales de
pamoato, y similares. Otro tipo de formulación en depósito de
liberación lenta para inyección contendría el compuesto o sal
dispersado para encapsular en un polímero no antigénico, no tóxico,
de degradación lenta tal como un polímero de ácido
poliláctico/ácido poliglicólico por ejemplo como se describe en la
patente de EE.UU. No. 3773919. Los compuestos, o preferiblemente,
sales relativamente insolubles tales como las descritas
anteriormente también se pueden formular en pellas silásticas de
matriz de colesterol, particularmente para uso en animales. En la
bibliografía se conocen formulaciones adicionales de liberación
lenta, depósito o implante, por ejemplo liposomas de gas o líquidos
(patentes de EE.UU. No. 5770222 y "Sustained and Controlled
Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel
Dekker, Inc., N.Y., 1978).
Habiendo descrito la invención en general, la
misma se entenderá más fácilmente mediante referencia a los
siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no
se pretende que sean limitantes.
Se usa el vector pC4 para la expresión del
anticuerpo de IL-12. El plásmido pC4 es un derivado
del plásmido pSV2-dhfr (No. de acceso de la ATCC
37146). El plásmido contiene el gen DHFR de ratón bajo el control
del promotor temprano de SV40. Se pueden seleccionar células de
ovario de hámster chino u otras que carecen de actividad
dihidrofolato que se transfectan con estos plásmidos haciéndolas
crecer en un medio selectivo (por ejemplo MEM alfa menos, Life
Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con el agente
quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHFR
en células resistentes a metotrexato (MTX) está bien documentada
(ver, por ejemplo, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem.
253:1357-1370 (1978); J.L. Hamlin y C. Ma, Biochem.
et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M.J. Page y
M.A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las
células crecidas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan
resistencia al fármaco sobreproduciendo la enzima diana, DHFR, como
resultado de la amplificación del gen DHFR. Si un segundo gen está
unido al gen DHFR, normalmente se coamplifica y se sobreexpresa. Se
sabe en la técnica que este planteamiento se puede usar para
desarrollar líneas celulares que llevan más de 1000 copias del
gen(es) amplificado(s). Posteriormente, cuando se
retira el metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen
el gen amplificado integrado en uno o más cromosoma(s) de la
célula huésped.
El plásmido pC4 contiene para expresar el gen de
interés el promotor fuerte de la repetición terminal larga (LTR)
del virus del sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec. Cell.
Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento aislado
del potenciador del gen inmediato temprano del citomegalovirus
humano (CMV) (Boshart, et al., Cell
41:521-530 (1985)). En 3' del promotor hay sitios de
corte de enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718 que permiten
la integración de los genes. Tras estos sitios de clonación el
plásmido contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del
gen de la preproinsulina de rata. También se pueden usar para la
expresión otros promotores de alta eficacia, por ejemplo, el
promotor de la b-actina humana, los promotores
temprano o tardío de SV40 o las repeticiones terminales largas de
otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI. Se pueden usar los
sistemas de expresión génica de Clontech Tet-Off y
Tet-On y sistemas similares para expresar
IL-12 de una manera regulada en células de
mamíferos (M. Gossen, y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5547-5551 (1992)). Para la poliadenilación del ARNm
se pueden usar también otras señales, por ejemplo, de los genes de
la hormona de crecimiento o la globina humanas. También se pueden
seleccionar líneas celulares estables que llevan un gen de interés
integrado en los cromosomas tras cotransfección con un marcador de
selección tal como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más
de un marcador de selección al principio, por ejemplo G418 más
metotrexato.
El plásmido pC4 se digiere con enzimas de
restricción y después se desfosforila usando fosfatasa de intestino
de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El
vector se aísla después de un gel de agarosa al 1%.
Se usa la secuencia de ADN que codifica el
anticuerpo contra IL-12 completo, por ejemplo, como
se presenta en SEQ ID NOS: 7 y 8, correspondientes a las regiones
variables de HC y LC de un anticuerpo contra IL-12
de la presente invención, según pasos de métodos conocidos. También
se usa el ácido nucleico asilado que codifica una región constante
humana adecuada (es decir regiones HC y LC) en esta construcción
(por ejemplo, proporcionado en el vector p1351).
El ADN que codifica la región variable y
constante aislado y el vector desfosforilado se ligan después con
ADN ligasa de T4. Se transforman células de E. coli HB 101 o
XL-1 Blue y se identifican las bacterias que
contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 usando, por
ejemplo, análisis con enzimas de restricción.
Se usan células de ovario de hámster chino (CHO)
que carecen de un gen DHFR activo para la transfección. Se
contransfectan 5 g de plásmido de expresión pC4 con 0,5 g del
plásmido pSV2-neo, usando lipofectina. El plásmido
pSV2neo contiene un marcador de selección dominante, el gen neo de
Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de
antibióticos incluyendo G418. Las células se siembran en MEM alfa
menos suplementado con G418 1 g/ml. Después de 2 días, las células
se tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridoma
(Greiner, Alemania) en MEM alfa menos suplementado con 10, 25 ó 50
ng/ml de metotrexato más G418 1 g/ml. Después de alrededor de
10-14 días se tripsinizan colonias individuales y
después se siembran en placas petri de 6 pocillos o botellas de 10
ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM,
200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las
concentraciones más altas de metotrexato se transfieren después a
placas nuevas de 6 pocillos que contienen concentraciones de
metotrexato incluso más altas (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Se
repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que
crecen a una concentración de 100-200 mM. Se
analiza la expresión del producto del gen deseado, por ejemplo,
mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia o mediante
análisis de HPLC de fase reversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han usado ratones transgénicos que contienen
genes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana para
generar anticuerpos monoclonales de alta afinidad, completamente
humanos, que se pueden usar de forma terapéutica para inhibir la
acción de IL-12 para el tratamiento de una o más
enfermedades mediadas por IL-12. Se inmunizan
ratones híbridos (CBA/J x C57/BL6/J)F_{2} que contienen
transgenes humanos de la región variable y constante de anticuerpo
tanto para la cadena pesada como ligera con IL-12
humana recombinante (Taylor et al., Intl. Immunol.
6:579-591 (1993); Lonberg, et al., Nature
368:856-859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech.
14:826 (1996); Fishwild, et al., Nature Biotechnology
14:845-851 (1996)). Varias fusiones produjeron uno o
más paneles de anticuerpos monoclonales IgG completamente humanos
que reaccionan con IL-12. Los anticuerpos
anti-IL-12 completamente humanos se
caracterizan adicionalmente. Todos son IgG1. Se determina que tales
anticuerpos tienen constantes de afinidad de alrededor de entre
1x10^{9} y 9x10^{12}. Las afinidades inesperadamente altas de
estos anticuerpos monoclonales totalmente humanos los hacen
candidatos adecuados para aplicaciones terapéuticas en
enfermedades, patologías o trastornos relacionados con
IL-12.
BSA - seroalbúmina bovina
CO_{2} - dióxido de carbono
DMSO - dimetilsulfóxido
EIA - inmunoensayo enzimático
SBF - suero bovino fetal
H_{2}O_{2} - peróxido de hidrógeno
HRP - peroxidasa de rábano
ID - intradérmico
Ig - inmunoglobulina
IL-12 -
interleuquina-12
IP - intraperitoneal
IV - intravenoso
Mab - anticuerpo monoclonal
DO - densidad óptica
OPD - Diclorhidrato de
o-fenilenediamina
PEG - polietilenglicol
PSA - penicilina, estreptomicina,
anfotericina
RT - temperatura ambiente
SC - subcutáneo
v/v - volumen por volumen
p/v - peso por volumen
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones transgénicos que pueden expresar
anticuerpos humanos son conocidos en la técnica (y están
comercialmente disponibles (por ejemplo, de GenPharm International,
San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, y otros) que expresan
inmunoglobulinas humanas pero no IgM o Ig de ratón. Por ejemplo,
tales ratones transgénicos contienen transgenes de secuencias
humanas que padecen unión V(D)J, cambio de clase de
cadena pesada, y mutación somática para generar un repertorio de
inmunoglobulinas de secuencia humana (Lonberg, et al., Nature
368:856-859 (1994)). El transgén de la cadena
ligera puede derivar, por ejemplo, en parte de un clon de cromosoma
artificial de levadura que incluye casi la mitad de la región V de
la línea germinal humana. Además, el transgén de la cadena pesada
puede codificar tanto la región constante humana \mu como humana 1
(Fishwild, et al., Nature Biotechnology
14:845-851 (1996)) y/o 3. Se pueden usar ratones
derivados de linajes genotípicos apropiados en los procesos de
inmunización y fusión para generar anticuerpos monoclonales
totalmente humanos contra IL-12.
Se pueden usar uno o más programas de
inmunización para generar los hibridomas humanos
anti-IL-12. Se pueden realizar las
primeras fusiones diversas según el siguiente protocolo de
inmunización ejemplar, pero se pueden usar otros protocolos
similares conocidos. Varios ratones transgénicos hembras y/o machos
quirúrgicamente castrados de 14-20 semanas de edad
se inmunizan IP y/o ID con 1-1000 \mug de
IL-12 recombinante humana emulsionada con un
volumen igual de TITERMAX o adyuvante completo de Freund en un
volumen final de 100-400 \muL (por ejemplo, 200).
Cada ratón puede recibir también opcionalmente de
1-10 \mug en 100 \muL de solución salina
fisiológica en cada uno de 2 sitios SC. Los ratones se pueden
inmunizar después 1-7, 5-12,
10-18, 17-25 y/o
21-34 días después IP (1-400 \mug)
y SC (1-400 \mug x 2) con IL-12
emulsionada con un volumen igual de TITERMAX o adyuvante incompleto
de Freund. Los ratones se pueden sangrar 12-25 y
25-40 días después mediante punción
retro-orbital sin anticoagulante. La sangre se deja
coagular a temperatura ambiente durante una hora y se recoge y
titula el suero usando un ensayo EIA de IL-12 según
métodos conocidos. Se realizan las fusiones cuando las inyecciones
repetidas no producen que los títulos aumenten. A este tiempo, se
les puede dar a los ratones una inyección de recuerdo IV final de
1-400 \mug de IL-12 diluida en 100
\muL de solución salina fisiológica. Tres días después, los
ratones se pueden sacrificar mediante dislocación cervical y recoger
los bazos de forma aséptica y sumergirlos en 10 mL de solución
salina tamponada con fosfato (PBS) fría que contiene penicilina 100
U/mL, estreptomicina 100 \mug/mL, y anfotericina B 0,25 \mug/mL
(PSA). Se recogen los esplenocitos mediante perfusión estéril del
bazo con PSA-PBS. Las células se lavan una vez en
PSA-PBS frío, se cuentan usando exclusión del
colorante azul de tripano y se resuspenden en medio RPMI 1640 que
contiene Hepes 25 mM.
La fusión se puede llevar a cabo a una
proporción de 1:1 hasta 1:10 de células de mieloma murino a células
viables del bazo según métodos conocidos, por ejemplo, como se sabe
en la técnica. Como ejemplo no limitante, se pueden precipitar
juntas las células del bazo y las células de mieloma. El precipitado
se puede después resuspender lentamente, a lo largo de 30 segundos,
en 1 mL de solución PEG al 50%/PBS (p/v) (peso molecular de PEG
1.450, Sigma) a 37ºC. La fusión se puede detener añadiendo
lentamente 10,5 mL de medio RPMI 1640 que contiene Hepes 25 mM
(37ºC) a lo largo de 1 minuto. Las células fusionadas se centrifugan
durante 5 minutos a 500-1500 rpm. Las células se
resuspenden después en medio HAT (medio RPMI 1640 que contiene Hepes
25 mM, suero fetal de clon I (Hyclon) al 10%, piruvato de sodio 1
mM, L-glutamina 4 mM, gentamicina 10 \mug/mL,
suplemento de cultivo origen (Fisher) al 2,5%, medio condicionado
RPMI 1640/Hepes-653 al 10%,
2-mercaptoetanol 50 \muM, hipoxantina 100 \muM,
aminopterina 0,4 \muM, y timidina 16 \muM) y se siembran a 200
\muL/pocillo en quince placas de cultivo de 96 pocillos de fondo
plano. Las placas se colocan en un incubador humidificado a 37ºC
que contiene CO_{2} al 5% y aire al 95% durante
7-10 días.
Se puede usar EIA de fase sólida para cribar
sueros de ratón para anticuerpos humanos IgG específicos para
IL-12 humana. Brevemente, las placas se pueden
recubrir con IL-12 a 2 \mug/mL en PBS durante la
noche. Después de lavar en solución salina 0,15 M que contiene
Tween 20 al 0,02% (v/v), los pocillos se pueden bloquear con BSA al
1% (p/v) en PBS, 200 \muL/pocillo durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las placas se usan inmediatamente o se congelan a -20ºC
para su uso futuro. Se incuban las diluciones del suero de ratón en
las placas recubiertas de IL-12 a 50 \muL/pocillo
a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavan y después
se ensayan con 50 \muL/pocillo de IgG anti-humano
de cabra marcado con HRP, específico de Fc diluido 1:30.000 en BSA
al 1%-PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se
pueden lavar de nuevo y se añaden 100 \muL/pocillo de la solución
de sustrato citrato-fosfato (ácido cítrico 0,1 M y
fosfato de sodio 0,2 M, H_{2}O_{2} al 0,01% y OPD 1 mg/mL)
durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añade después solución
de parada (ácido sulfúrico 4 N) a 25 \muL/pocillo y se leen las
DO a 490 nm por medio de un espectrofotómetro de placas
automatizado.
Se pueden detectar hibridomas de crecimiento
positivo que secretan inmunoglobulinas completamente humanas usando
un EIA adecuado. Brevemente, se pueden recubrir placas de 96
pocillos extraíbles (VWR, 610744) con 10 \mug/mL de IgG de cabra
anti-humana Fc en tampón carbonato de sodio durante
la noche a 4ºC. Las placas se lavan y se bloquean con BSA al 1% en
PBS durante 1 hora a 37ºC y se usan inmediatamente o se congelan a
-20ºC. Se incuban los sobrenadantes de hibridoma sin diluir en
placas durante una hora a 37ºC. Las placas se lavan y se ensayan
con kappa anti-humana de cabra marcada con HRP
diluida 1:10.000 en BSA al 1% en PBS durante una hora a 37ºC. Las
placas se incuban después con solución de sustrato como se ha
descrito anteriormente.
Los hibridomas, como anteriormente, se pueden
ensayar simultáneamente para la reactividad a IL-12
usando un RIA adecuado u otro ensayo. Por ejemplo, se incuban los
sobrenadantes en placas con IgG de cabra anti-humana
Fc como anteriormente, se lavan y después se ensayan con
IL-12 radiomarcada con cuentas por pocillo adecuadas
durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan dos
veces con PBS y se cuantifica la IL-12 radiomarcada
unida usando un contador adecuado.
Los hibridomas que secretan IgG1 humana
anti-IL-12 se pueden expandir en
cultivo celular y subclonar serialmente mediante dilución
limitante. Las poblaciones clónicas resultantes se pueden expandir y
crioconservar en medio de congelación (SBF al 95%, DMSO al 5%) y
almacenar en nitrógeno líquido.
Se puede realizar la determinación del isotipo
de los anticuerpos usando un EIA en un formato similar al usado
para cribar los sueros inmunes de ratón para títulos específicos. Se
pueden recubrir placas de 96 pocillos con IL-12
como se ha descrito anteriormente y se puede incubar el anticuerpo
purificado a 2 \mug/mL en la placa durante una hora a temperatura
ambiente. La placa se lava y se ensaya con IgG_{1}
anti-humana de cabra marcada con HRP o IgG_{3}
anti-humana de cabra marcada con HRP diluida 1:4000
en BSA al 1% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. La
placa se lava de nuevo y se incuba con solución de sustrato como se
ha descrito anteriormente.
Las características de unión para anticuerpos se
pueden evaluar adecuadamente usando un EIA de captura de
IL-12 y tecnología BIAcore, por ejemplo. Se pueden
evaluar concentraciones graduadas de anticuerpos humanos de
IL-12 purificados para la unión a placas de EIA
cubiertas con 2 \mug/mL de IL-12 en ensayos como
se describe anteriormente. Se pueden presentar las DO como gráficas
semi-logarítmicas que muestren las eficacias de
unión relativa.
Se pueden obtener las constantes de unión
cuantitativas, por ejemplo, como sigue, o mediante cualquier otro
método adecuado conocido. Se coloca un chip CM-5
(carboximetil) de BIAcore en una unidad BIAcore 2000. Se hace fluir
tampón HBS (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, agente tensoactivo
P20 al 0,005% v/v, pH 7,4) sobre una célula de flujo del chip a 5
\muL/minuto hasta que se obtiene una línea base estable. Se añade
una solución (100 \muL) de 15 mg de EDC (clorhidrato de
N-etil-N'-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida)
en 200 \muL de agua a 100 \muL de una solución de 2,3 mg de NHS
(N-hidroxisuccinimida) en 200 \muL de agua. Se
inyectan cuarenta (40) \muL de la solución resultante en el chip.
Se inyectan seis \muL de una solución de IL-12
humana (15 \mug/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4,8) en el chip,
produciendo un aumento de ca. 500 UR. Se cambia el tampón a tampón
de carrera TBS/Ca/Mg/BSA (Tris 20 mM, cloruro de sodio 0,15 M,
cloruro de calcio 2 mM, acetato de magnesio 2 mM, Triton
X-100 al 0,5%, BSA 25 \mug/mL, pH 7,4) y se deja
fluir sobre el chip durante la noche para equilibrarlo y para
hidrolizar o bloquear cualquier éster se succinimida sin
reaccionar.
Los anticuerpos se disuelven en el tampón de
carrera a 33,33, 16,67, 8,33 y 4,17 nM. La velocidad de flujo se
ajusta a 30 \muL/min y la temperatura del instrumento a 25ºC. Se
usan dos células de flujo para las carreras de cinética, una en la
que se ha inmovilizado IL-12 (muestra) y una
segunda, célula de flujo sin derivar (blanco). Se inyectan 120
\muL de cada concentración de anticuerpo en las células de flujo a
30 \muL/min (fase de asociación) seguido por 360 segundos
ininterrumpidos de flujo de tampón (fase de disociación). La
superficie del chip se regenera (complejo
interlequina-12/anticuerpo disociado) mediante dos
inyecciones secuenciales de 30 \muL cada una de tiocianato de
guanidina 2 M.
El análisis de los datos se hace usando
evaluación BIA 3.0 ó CLAMP 2.0, como se sabe en la técnica. Para
cada concentración de anticuerpo se resta el sensograma del blanco
del sensograma de la muestra. Se hace un ajuste global tanto para
la disociación (k_{d}, seg^{-1}) como para la asociación
(k_{a}, mol^{-1}seg^{-1}) y la constante de disociación
(K_{D}, mol) se calcula (k_{d}/k_{a}). Donde la afinidad del
anticuerpo es lo suficientemente alta que las RU del anticuerpo
capturado sean >100,
se corren diluciones adicionales del anticuerpo.
se corren diluciones adicionales del anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizan varias fusiones y cada fusión se
siembra en 15 placas (1440 pocillos/fusión) que producen varias
docenas de anticuerpos específicos para IL-12
humana. De estos, se determina que algunos consisten en una
combinación de cadenas de Ig humanas y de ratón. Los hibridomas
restantes secretan anticuerpos
anti-IL-12 que consisten solamente
en cadenas pesadas y ligeras humanas. De los hibridomas humanos se
espera que todos sean IgG1.
El análisis por ELISA confirma que el anticuerpo
purificado de la mayoría o todos estos hibridomas se une a
IL-12 de una manera dependiente de la concentración.
Las figuras 1-2 muestran los resultados de la
eficacia relativa de unión de estos anticuerpos. En este caso, se
mide la avidez del anticuerpo por su antígeno afín (epítopo). Se
debe advertir que la unión de IL-12 directamente a
la placa de EIA puede producir desnaturalización de la proteína y
las afinidades aparentes de unión no pueden reflejar la unión a la
proteína desnaturalizada. Se encontró un cincuenta por ciento de
unión en un intervalo de concentraciones.
Se obtienen constantes cuantitativas de unión
usando el análisis por BIAcore de los anticuerpos humanos y revela
que varios de los anticuerpos monoclonales humanos tienen gran
afinidad con K_{D} en el intervalo de 1x10^{-9} a
7x10^{-12}.
Se realizan varias fusiones usando esplenocitos
de ratones híbridos que contienen transgenes de regiones variables
y constantes de anticuerpos humanos que se inmunizan con
IL-12 humana. Se generan una serie de anticuerpos
monoclonales IgG completamente humanos que reaccionan con
IL-12. Los anticuerpos
anti-IL-12 completamente humanos se
caracterizan adicionalmente. Varios de los anticuerpos generados
tienen constantes de afinidad entre 1x10^{9} y 9x10^{12}. Las
afinidades inesperadamente altas de estos anticuerpos monoclonales
completamente humanos los hacen adecuados para aplicaciones
terapéuticas en enfermedades, patologías o afecciones relacionadas
dependientes de
IL-12.
IL-12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mostró que la bioactividad de
IL-12 se neutralizaba por C340 en una variedad de
ensayos de actividad dependientes de IL-12. Puesto
que IL-12 aumenta la producción de IFN GAMMA por
células NK y linfocitos T, se examinó el efecto del anticuerpo C340
sobre el aumento del ARNm de IFN GAMMA y el efecto de C340 sobre la
producción de proteína IFN GAMMA (Trinchieri, G., Current Opinion
in Immunology, 9:17-23 (1997), Morris, S.C., et
al., Journal of Immunology, 152:1047-1056
(1994)). También se investigó en estos estudios la capacidad de C340
de neutralizar de la actividad celular de aniquilación activada por
linfoquina (LAK) dirigida por IL-12 (Kutza, J. y
Murasko, D.M., Mechanisms of Ageing and Development,
90:209-222 (1996), Stern, A.S., et al.,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.,
87:6808-6812 (1990)). Por último, se ensayó el
efecto de C340 sobre la regulación por ascenso de la expresión de
CD95 en la superficie celular de células T y NK mediada por
IL-12 (Medvedev, A.E., et al., Cytokine,
9:394-404 (1997)).
\newpage
Para determinar si C340 inhibe la transcripción
del gen de IFN GAMMA inducida por IL-12,
IL-2 en PBL humanos, se realizó un ensayo de
transcripción inversa-PCR. Se usaron cebadores
específicos para \beta-actina (un control para la
integridad y contenido de ARNm) e IFN GAMMA para amplificar el ADNc
obtenido de PBL humanos estimulados. La figura 3 muestra que C340
disminuye el ARNm de IFN GAMMA en PBMC activadas con
IL-12/IL-2 (2 horas).
En respuesta a varias señales y como una medida
de activación, se puede inducir que las células T y las células NK
secreten citoquinas. Más específicamente, PBL tratados con
IL-2 e IL-12 inician síntesis
sustancial de IFN gamma en 4-8 horas tras la
estimulación. Esta producción se puede detectar en el citoplasma de
PBL tratados con brefeldina-A mediante citometría
de flujo. La figura 4 demuestra una reducción del 60% en la
producción de IFN GAMMA en tales cultivos cuando C340
IL-12 se añadió junto con IL-12
durante cinco horas.
La figura 5 claramente muestra que dos lotes
diferentes de C340 inhibieron la secreción de IFN GAMMA por
linfocitos de sangre periférica en una manera dependiente de la
dosis. Se premezclaron cuatrocientos picogramos de
IL-12 con cantidades variables de C340 y después se
añadieron a cultivos de PBL estimulados con IL-2.
Cuando se midió el IFN GAMMA mediante EIA después de una incubación
de 18-24 horas, se detectaron cantidades
marcadamente disminuidas de IFN GAMMA con tan poco como 1 ?g/mL de
anticuerpo C340.
Las células Raji, una línea celular derivada de
linfoma de Burkitt sensible a IL-12, es una línea
celular resistente a células NK, sensible a células LAK. Se
cultivaron células Raji, en triplicado, durante cuatro horas con
células LAK que se habían activado con IL-12 400
pg/mL e IL-2 10 U/mL en presencia o ausencia del
anticuerpo monoclonal humano C340 (5000 ng/mL ó 50 ng/mL). La figura
6 muestra los resultados de tres donantes normales, sanos. La
activación por IL-12 + IL-2 de las
células efectoras produjo un aumento en la actividad citotóxica
sobre la de las células activadas con IL-2 sola. El
anticuerpo C3410 inhibió este efecto dependiente de
IL-12. La magnitud de la inhibición estaba
relacionada con la concentración del anticuerpo, reduciendo la
máxima concentración ensayada la citotoxidad a niveles de fondo.
Se ha descrito en informes el aumento de CD95
inducido por IL-12 en la superficie de PBL CD56+ muy
purificados. Como se puede ver en la figura 7A y 7B, el análisis
distribucional de citometría de flujo reveló que la expresión de
CD95 estaba significativamente aumentada en células T CD3+ y células
NK CD56+ después del tratamiento con IL-12 más
IL-2 durante 72 horas. El tratamiento
anti-IL-12 concomitante inhibió la
expresión de CD95 tanto en poblaciones CD3+ como CD56+. Las células
CD3+ se inhibieron en \sim50% (Figura 7A), mientras que las
células CD56+ se inhibieron en \sim85% (Figura 7B), como se
evidencia por un índice MFI disminuido (porcentaje mayor que el
control sin estimular).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonaron y purificaron fragmentos de ADN
genómico que contenían el gen de la cadena pesada de C340 o el de
la cadena ligera de C340. El ADN genómico purificado de las células
de hibridoma de C340 se digirió parcialmente con la enzima de
restricción Sau3A y se seleccionó por tamaño mediante
fraccionamiento por centrifugación mediante un gradiente de
sacarosa del 10-40%. Los fragmentos de ADN en el
intervalo de tamaño de 15-23 kb se clonaron en el
vector bacteriófago, EMBL3, [disponible comercialmente?] y se
empaquetaron en partículas de fago. Varias reacciones de
empaquetamiento produjeron una genoteca de 1 millón de clones de
bacteriófagos. Aproximadamente se cribaron 600.000 clones de la
genoteca mediante hibridación en placa usando como sonda fragmentos
de ADN genómico marcados con 32P que contenían secuencias de la
región constante de la cadena pesada de IgG1 humana o secuencias de
la región constante de la cadena ligera kappa humana. Se detectaron
trece clones de cadena pesada y nueve de cadena ligera. De estos,
se purificaron tres clones de cadena pesada y cuatro clones de
cadena ligera mediante dos rondas más de cribado. Se mostró que uno
de los clones de cadena pesada y dos de los clones de cadena ligera
contenían los extremos 5' y 3' de las secuencias codificantes
mediante análisis por PCR del ADN del bacteriófago. El inserto de
ADN en el clon de cadena pesada (HC) H4 tenía 16 kb de tamaño e
incluye 3,6 kb de secuencia flanqueante 5' y al menos 2 kb de
secuencia flanqueante 3'. El inserto de ADN en el clon de cadena
ligera (LC) LC1 tenía 15 kb de tamaño e incluía 4,4 kb de secuencia
flanqueante 5' y 6,0 kb de secuencia flanqueante 3'. Se sacaron los
insertos completos del vector bacteriófago como fragmentos SalI y
se clonaron entre los sitios XhoI y SalI del vector plasmídico de
expresión p1351, provisto de un gen de marcador de selección gpt.
Debido a que hay un sitio SalI interno en la secuencia codificante
de la región variable de la cadena pesada, se tuvieron que
transferir dos fragmentos SalI del bacteriófago H4 al vector de
expresión p1351. Los plásmidos de expresión de la cadena pesada y
ligera resultantes se denominaron p1560 y p1558, respectivamente.
Se determinaron las orientaciones de los genes de la cadena pesada y
ligera en estos dos plásmidos respecto a las secuencias del vector
p1351 usando análisis con enzimas de restricción y PCR,
respectivamente. En ambos casos, las orientaciones eran tales que el
extremo 5' del fragmento del gen del Ab estaba próximo al extremo
3' del gen gpt. Se secuenciaron ambas hebras de las regiones
codificantes de los genes clonados. Las secuencias de los plásmidos
p1560 y p1558 se presentan en las figuras 11A-11K y
las figuras 13A-13J, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido de la cadena pesada p1560 se
linealizó mediante digestión con la enzima de restricción PvuI y el
plásmido de cadena ligera p1558 se linealizó usando la enzima de
restricción SalI. se transfectaron células p3X63Ag8.653 (653) y
SP2/0-Ag14 (SP2/0) separadamente con los plásmidos
linealizados premezclados mediante electroporación y las células se
cultivaron y se seleccionaron los transfectantes usando ácido
micofenólico como está descrito (Knight, et al., Molecular
Immunology 30:1443 (1993)). Se ensayaron los sobrenadantes celulares
de las colonias resistentes a ácido micofenólico aproximadamente
dos semanas después para IgG humana (es decir, C340 recombinante
(rC340)). Para ello, los sobrenadantes celulares se incubaron en
placas de 96 pocillos de ELISA que estaban recubiertos con
anticuerpos de cabra específicos para la parte Fc de IgG humana. Se
detectó la IgG humana que se unió a la placa recubierta usando
anticuerpo de cabra anti-IgG humana (cadena pesada
+ cadena ligera) conjugada con fosfatasa alcalina y sustratos de
fosfatasa alcalina como se ha descrito (Knight, et al.,
Molecular Immunology 30:1443 (1993)). Se transfirieron células de
los clones de mayor producción a placas de cultivo de 24 pocillos
en medio estándar y se expandieron (IMDM, SBF al 5%, glutamina 2 mM,
mezcla de selección de ácido micofenólico). La cantidad de
anticuerpo producido (es decir, secretado en el medio de cultivos
agotados) se cuantificó cuidadosamente mediante ELISA usando mAb
C340 purificado como estándar. Los clones seleccionados se
expandieron después en botellas T75 y la producción de IgG humana
por estos clones se cuantificó mediante ELISA. Basado en estos
valores, se subclonaron seis transfectantes independientes 653 y
tres transfectantes independientes SP2/0 (sembrando una media de una
célula por pocillo en placas de 96 pocillos), se determinó la
cantidad de anticuerpo producido por los subclones ensayando (ELISA)
los sobrenadantes de las colonias de los subclones individuales. Se
seleccionaron tres subclones, el transfectante de 653
19-20 (C379B) y los transfectantes de SP2/0
84-81 (C381A) y 22-56 (C389A) para
análisis adicionales.
Antes de subclonar las líneas celulares
seleccionadas como se ha descrito anteriormente, se usaron los
sobrenadantes celulares de las tres líneas parentales
(transfectantes de 653 clon 2 y clon 18 y transfectante de SP2/0
clon 1) para ensayar las características de unión a antígeno de
rC340. Primero se determinaron las concentraciones de rC340 en las
muestras de los tres sobrenadantes celulares mediante ELISA. Después
se incubaron cantidades de titulación de las muestras de
sobrenadante, o control positivo de C340 purificado, en placas de 96
pocillos recubiertos con 2 \mug/ml de IL-12
humana. Se detectó el mAb unido con anticuerpo de cabra
anti-IgG humana (cadena pesada + cadena ligera)
conjugada con fosfatasa alcalina y sustratos adecuados de fosfatasa
alcalina. Como se muestra en la figura 8, rC340 se unió
específicamente a IL-12 humana en una manera
indistinguible del mAb C340 original.
Se realizaron análisis de curvas de crecimiento
en C379B, C381A y C389A sembrando botellas T75 con una densidad
celular inicial de 2 x 105 células/ml en medio estándar o medio
SFM-5 sin suero y después controlando el número de
células y la concentración de rC340 a diario hasta que los cultivos
se agotaron. Los resultados de los cultivos en medio estándar se
muestran en las figuras 9A-9C. Los niveles máximos
de producción de mAb C340 para C379B, C381A y C389A fueron de 135
\mug/ml, 150 \mug/ml y 110 \mug/ml, respectivamente. Los
intentos de adaptar las células C379B al medio
SMF-5 no tuvieron éxito. Las células C381A
produjeron la misma cantidad de rC340 en medio
SFM-5 que en medio estándar, mientras que las
células C389A produjeron sólo la mitad de rC340 en medio
SFM-5 que en medio estándar.
Se evaluó la estabilidad de la producción de mAb
C340 a lo largo del tiempo para los tres subclones cultivando las
células en placas de 24 pocillos con medio estándar o medio estándar
sin selección de ácido micofenólico durante periodos variables de
tiempo. Se observó que las líneas C379B y C381A produjeron de forma
estable rC340 en presencia o ausencia de selección durante un
periodo de 30 días (el tiempo máximo ensayado) y 75 días,
respectivamente. La línea C389A era inestable y después de 43 días
de cultivo produjo solo el 20% de anticuerpo que al principio del
estudio.
Estará claro que la invención se puede practicar
de otra forma a como se ha descrito particularmente en la
descripción y ejemplos anteriores.
<110> Shealy, David; Knight, David;
Scallon, Bernie; Giles-Komar, Jill; Peritt,
David
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS CONTRA
IL-12, COMPOSICIONES, MÉTODOS Y USOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CEN248
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm10
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm13
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<210> 12
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
\hskip1cm14
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<210> 13
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 13
\hskip1cm15
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 15
\hskip1cm17
Claims (9)
1. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo
de mamífero anti-IL-12 que tiene una
región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una región
variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
2. Una célula huésped procariota o eucariota que
comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.
3. Un anticuerpo de mamífero
anti-IL-12 que comprende una región
variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 7 y una región variable de
cadena ligera de SEQ ID NO: 8.
4. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la
célula huésped de la reivindicación 2, o el anticuerpo de la
reivindicación 3, en donde el anticuerpo es humano.
5. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la
célula huésped de la reivindicación 2, o el anticuerpo de la
reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el anticuerpo tiene
una constante de afinidad entre 1x10^{9} y 7x10^{12}.
6. Una composición que comprende (a) un
anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones
3-5 y (b) un soporte o diluyente farmacéuticamente
aceptable.
7. El anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 3-5, o la composición de la
reivindicación 6, para su uso en diagnóstico o terapia.
8. El anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 3-5, o la composición de la
reivindicación 6, para su uso para tratar psoriasis.
9. El anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 3-5, o la composición de la
reivindicación 6, para su uso para tratar artritis psoriásica,
sarcoidosis o patología de Crohn.
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