JP2016528236A - 生物学的試料において改善された性能を有するｔｉｍｐ２のためのアッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、特に腎臓傷害の評価に用いられた場合に、改善された臨床性能を有するＴＩＭＰ２イムノアッセイを提供する。該イムノアッセイは、生体液などの複雑な臨床標本の中で用いられた場合、そして特にラテラルフロー検査デバイスなどの迅速なアッセイ形式で用いられた場合に、改善されたアッセイ性能を示す抗体および抗体対の選択および使用に依存する。【選択図】なし

Description

本出願は、全ての表、図、および特許請求の範囲をはじめとし、全体として本明細書に組み入れられる、２０１３年８月７日出願の米国特許仮出願第６１／８６３，０７３号の優先権を主張するものである。

背景
以下に示す本発明の背景の議論は、単に本発明を理解する際に読み手を援助するために提供されており、先行技術を説明または構成するために本発明に含めることを許可されるものではない。

メタロプロテイナーゼ阻害剤２（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１６０３５、「メタロプロテイナーゼ２の組織阻害物質」および「ＴＩＭＰ２」としても公知）は、分泌タンパク質であり、触媒性の亜鉛コファクターへの結合によりメタロプロテイナーゼと複合体化してそれらを不可逆的に不活性化させる。ＴＩＭＰ２は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６およびＭＭＰ−１９に作用することが公知である。ＴＩＭ２は、報告によれば、内皮細胞の増殖を抑制する。その結果、そのコードされたタンパク質が、血管形成因子に応答して休止組織の増殖を抑制することにより、そしてリモデリングを受けている組織のプロテアーゼ活性を阻害することにより、組織ホメオスタシスの維持において役割を有することが示唆された。

加えて、それぞれが全ての表、図、および特許請求の範囲をはじめとし、全体として参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１０／０４８３４６号およびＷＯ２０１１／０７５７４４号には、対象の腎臓状態を個別およびマルチマーカーパネルの両方で評価するためのＴＩＭＰ２の使用が記載されている。特に、イムノアッセイにより測定されたＴＩＭＰ２レベルは、腎臓状態のリスク層別化、診断、ステージング、予後、分類およびモニタリングに相関することが示されている。

イムノアッセイなどの特異的結合アッセイから得られたシグナルは、１種または複数の結合種（例えば、抗体）と標的生体分子（即ち、被分析物）と該抗体が結合する必須のエピトープ（複数可）を含むポリペプチドとの間に形成された複合体の直接的な結果である。イムノアッセイは、多くの場合、被分析物を「検出すること」が可能であるが、抗体エピトープが８アミノ酸程度であるため、マーカー配列に関係するポリペプチドがアッセイで用いられる抗体または複数の抗体に結合するのに必要なエピトープ（複数可）を含む限りは、該当するマーカーを検出するように構成されたイムノアッセイによって、それらのポリペプチドも検出されるであろう。そのようなアッセイは、全長バイオマーカーを検出することができ、該アッセイ結果は、該当するバイオマーカーの濃度として表されるが、該アッセイからのシグナルは、実際には試料中に存在するそのような「免疫反応性」ポリペプチド全ての結果である。結合タンパク質、レセプター、ヘパリン、脂質、糖などのさらなる種が結合種と標的生体分子の間の結合を妨害しないのであれば、そのような結合アッセイは、そのようなさらなる種に複合体化された、生物学的試料中に存在する免疫反応性ポリペプチドも検出し得る。しかし典型的には特異的結合アッセイは、精製された被分析物を利用して構成され、複合体形成および断片化パターンは考慮されない。このことは、そのような追加の結合種の同一性が未知である場合に特にあてはまる。

概要
本発明の目的は、特に腎臓傷害の評価に用いられた場合に、改善された臨床性能を有するＴＩＭＰ２イムノアッセイを提供することである。具体的には、本発明者らは、生体液などの複雑な臨床標本の中で用いられた場合、そして特に迅速なアッセイ形式で用いられた場合に、改善されたアッセイ性能を示す抗体および抗体対の選択および使用を記載する。

第一の態様において、本発明は、ヒトＴＩＭＰ２と特異的に結合する１種または複数の単離されたモノクローナル抗体であって、各単離されたモノクローナル抗体が、ポリペプチドに少なくとも１０^８Ｍ^−１の親和性で結合し、該ポリペプチドの配列が、
ＱＡＦＣＮＡＤＶＶＩＲＡＫＡＶＳＥＫＥＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、
ＳＳＰＤＥＣＬＷＭＤＷＶＴＥＫＮＩＮＧＨＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、および
ＣＡＷＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
からなる群から選択される配列からなる、１種または複数の単離されたモノクローナル抗体に関する。

請求された方法において用いられる抗体は、様々な種から得ることができる。例えば本発明の抗体は、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、ラマもしくはラクダの配列、またはそれらの配列の組み合わせ（いわゆる、キメラ抗体）である免疫グロブリン配列を含み得る。そのような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明で用いられる抗体を、イムノアッセイにおける性能により同定し、その後、その性能に関連するエピトープを理解するために、エピトープマッピングによりさらに特徴づけることができる。

エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性を有する表面分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が喪失し後者への結合が喪失しないことで識別される。好ましくはエピトープは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜９の中で選択され、それらはそれぞれ、ヒトＴＩＭＰ２配列から得られた配列である。本発明における使用に好ましい抗体は、これらのペプチドのうちの１つまたは複数に特異的に結合する。

そのようなモノクローナル抗体は、シグナル発生要素（ｓｉｇｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）にコンジュゲートされ得るか、または固相担体に固定され得る。加えて、そのような抗体は、複数の競合アッセイおよびサンドイッチアッセイ形式で用いられ得る。

例として、競合形式において、これらの好ましい抗体の１種または複数は、シグナル発生要素にコンジュゲートされて検出可能に標識された抗体を提供し得る。生物学的試料中のＴＩＭＰ２は、検査デバイスの所定のゾーンに固定されたＴＩＭＰ２と、抗体への結合をめぐって競合することができ、所定のゾーンで得られたシグナル量は、試料中のＴＩＭＰ２の量と反比例するであろう。あるいはＴＩＭＰ２は、シグナル発生要素にコンジュゲートされて、検出可能に標識された被分析物を提供し得る。生物学的試料中のＴＩＭＰ２は、検査デバイスの所定のゾーンに固定された抗体への結合をめぐって競合することができ、所定のゾーンで得られたシグナル量は、同じく試料中のＴＩＭＰ２の量と反比例するであろう。

サンドイッチアッセイの例において、第一の抗体（検出可能に標識）および第二の抗体（検査デバイスの所定のゾーンに固定）が、検査デバイスの所定のゾーンで、試料中のＴＩＭＰ２とサンドイッチ複合体を形成する。サンドイッチアッセイにおいて、第一の抗体と第二の抗体は、同一であっても（特にポリクローナル抗体が用いられる場合）、または異なっていてもよい。したがって本発明の抗体は、サンドイッチペアで用いられてもよく、または個別に、ポリクローナル抗体またはアプタマーなどの、モノクローナル抗体でない別の結合物体と共に用いられてもよい。

本発明の抗体は、生物学的試料中のＴＩＭＰ２を検出するための検査キット内の試薬として用いることができる。そのような検査キットは、例えば生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係する検出可能なシグナルを発生するように構成されたディスポーザブル検査デバイスを含み得る。あるいはそのような検査キットは、ディスポーザブル検査デバイスを使用しない臨床分析装置でアッセイを実施するように構成され得る。好ましくは該検査キットは、インビトロ診断のものである。本明細書で用いられる用語「インビトロ診断のもの」は、単独で用いられるか、または組み合わせて用いられるかにかかわらず、単にヒトの体から得られた血液および組織ドネーションをはじめとする標本の検査のため、あるいは基本的に生理学的もしくは病理学的状態に関する情報または先天性異常に関する情報を提供する目的で、あるいは安全性および潜在的レシピエントとの適合性を決定するため、あるいは治療的指標をモニタリングするために、インビトロでの使用を製造業者に意図される試薬、試薬生成物、キャリブレータ、制御材料、キット、機器、装置、設備、またはシステムである医療デバイスを指す。

特定の実施形態において、該イムノアッセイは、ラテラルフロー形式で実施される。ラテラルフロー検査は、検査試料が吸湿性または非吸湿性多孔質固体基板に沿ってクロマトグラフィー方式で流れる、イムノアッセイの形態である。ラテラルフロー検査は、競合形式またはサンドイッチ形式のいずれかのアッセイとして操作することができる。好ましいラテラルフローデバイスは、ディスポーザブル単回使用検査デバイスである。試料が検査デバイスの適用ゾーンに適用され、基板を通過し、そこで抗体または抗原で前処理されたラインまたはゾーンに接触する。本明細書で用いられる用語「検査ゾーン」は、該当する被分析物の存在または量に関してシグナルを発生させるために、調査されるラテラルフロー検査ストリップ上の不連続の場所を指す。検出可能なシグナルは、視覚的に読み取られること、またはディスポーザブル検査デバイスを反射率計、フルオロメータもしくは透過率光度計（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｈｉｏｎ ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）などの分析機器に挿入することにより得ることができる。このリストは、限定を意味するものではない。試料は、前処理せずに適用ゾーンに適用されてもよく、または適用前に１種または複数のアッセイ試薬と予備混合されてもよい。後者の場合、抗体が、ディスポーザブル検査デバイスから独立した容器に提供され得る。

試料がティスポーザブル検査デバイス内の表面に接触すると、抗体が試料に溶解するように、本発明の抗体が、該表面に拡散的に固定されていてもよい。サンドイッチアッセイ形式において、この拡散的に結合された抗体は、試料中の同族抗原に結合し、その後、抗原が検出ゾーンに非拡散的に結合された第二の抗体によって結合されると、検出ゾーンで固定され得る。競合形式において、試料中の同族抗原が、アッセイ試薬として提供された標識抗原と、拡散的に結合された抗体への結合をめぐって競合し得る。

本発明のキットは、検出可能なシグナルをＴＩＭＰ２の濃度に関係づけるためのキャリブレーションをさらに含み得る。例として、ＲＯＭチップ、フラッシュドライブ、ＲＦＩＤタグなど、ディスポーザブル検査デバイスを収容する分析機器により読み取られる電子記憶デバイスに、検量線が提供され得る。あるいは２Ｄバーコードなど光学的に読み取られる、またはネットワークの接続により送信されるコード化された標識に、検量線が提供され得る。その後、分析機器でこの検量線を利用して、アッセイからの検出可能なシグナルをＴＩＭＰ２濃度に関係づけることができる。

特定の実施形態において、本発明の１種または複数の抗体を用いて実施されたアッセイ方法は、生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係するシグナルを提供し、該アッセイ方法におけるＴＩＭＰ２の最小検出可能濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下である。

関係する態様において、本発明は、生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量を決定する方法であって、
一緒になってヒトＴＩＭＰ２とサンドイッチ複合体を形成する第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体を用いて、該生物学的試料のイムノアッセイを実施し、該イムノアッセイが、該サンドイッチ複合体中で結合した生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係する検出可能なシグナルを提供すること、ならびに
該検出可能なシグナルを、該生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係づけること、
を含む、方法を提供する。好ましくは、該イムノアッセイにおけるＴＩＭＰ２の最小検出可能濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以下である。

特に好ましい実施形態において、第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体の一方または両方は、ヒトＴＩＭＰ２に特異的に結合するより単離されたモノクローナル抗体であり、各単離されたモノクローナル抗体が、ポリペプチドに少なくとも１０^８Ｍ^−１の親和性で結合し、該ポリペプチドの配列が、
ＱＡＦＣＮＡＤＶＶＩＲＡＫＡＶＳＥＫＥＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
ＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
ＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
ＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
ＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、
ＳＳＰＤＥＣＬＷＭＤＷＶＴＥＫＮＩＮＧＨＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、および
ＣＡＷＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
からなる群から選択される配列からなる。

好ましいアッセイ方法は、ヒトＴＩＭＰ２を検出するイムノアッセイを実施することを含む。そのようなイムノアッセイは、前記体液試料を、マーカーを検出する抗体と接触させること、およびその抗体への結合を検出すること、を含み得る。本発明は、イムノアッセイに関して一般的に記載されているが、イムノグロブリンスカフォールドに基づかない他の結合物体（例えば、アプタマー）が、そのような方法において抗体の代わりに用いられ得る。好ましくは該体液試料は、尿、唾液、血液、血清、および血漿からなる群から選択され、最も好ましくは尿である。

本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載に示す。本開示の他の特色、目的および利点は、該記載および図面、ならびに特許請求の範囲から明白となろう。

詳細な説明
定義

本明細書で用いられる用語「メタロプロテイナーゼ阻害物質２」および「ＴＩＭＰ２」は、メタロプロテイナーゼ阻害物質２前駆体（ヒト前駆体：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１６０３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０））から得られた生物学的試料中に存在する１種または複数のポリペプチドを指す。
１０ ２０ ３０
ＭＧＡＡＡＲＴＬＲＬ ＡＬＧＬＬＬＬＡＴＬ ＬＲＰＡＤＡＣＳＣＳ

４０ ５０ ６０
ＰＶＨＰＱＱＡＦＣＮ ＡＤＶＶＩＲＡＫＡＶ ＳＥＫＥＶＤＳＧＮＤ

７０ ８０ ９０
ＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱ ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫ ＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹ

１００ １１０ １２０
ＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶ ＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹ ＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧ

１３０ １４０ １５０
ＫＭＨＩＴＬＣＤＦＩ ＶＰＷＤＴＬＳＴＴＱ ＫＫＳＬＮＨＲＹＱＭ

１６０ １７０ １８０
ＧＣＥＣＫＩＴＲＣＰ ＭＩＰＣＹＩＳＳＰＤ ＥＣＬＷＭＤＷＶＴＥ

１９０ ２００ ２１０
ＫＮＩＮＧＨＱＡＫＦ ＦＡＣＩＫＲＳＤＧＳ ＣＡＷＹＲＧＡＡＰＰ

２２０
ＫＱＥＦＬＤＩＥＤＰ

以下のドメインが、メタロプロテイナーゼ阻害物質２において同定されている：
残基 長さ ドメインＩＤ
１−２６ ２６ シグナルペプチド
２７−２２０ １９４ メタロプロテイナーゼ阻害物質２

本明細書において他に具体的に断りがなければ、用いられる用語の定義は、医薬科学の技術分野で用いられる標準的定義である。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明白な断りがなければ、複数形の指示対象を包含する。したがって例えば「医薬担体」の指示対象は、２種以上のそのような担体の混合物などを包含する。

本明細書で用いられる用語「対象」は、ヒトまたは非ヒト生物体を指す。したがって本明細書に記載された方法および組成物は、ヒトおよび獣医学の両疾患に適用可能である。さらに、対象は好ましくは生存する生物体であるが、本明細書に記載された発明は、死亡後の分析においても用いられ得る。好ましい対象は、ヒトで、最も好ましくは「患者」であり、それは本明細書で用いられる通り、疾患または病状のために医療ケアを受けている生存するヒトを指す。これは、疾病が確定されておらず、病気の兆候について調査されている人を包含する。

好ましくは被分析物は、試料中で測定される。そのような試料は、対象から得られてもよく、または対象に提供される予定の生物学的材料から得られてもよい。例えば試料は、対象への移植の可能性を評価されている腎臓、および既存の損傷について腎臓を評価するために用いられる被分析物の測定から得られてもよい。好ましい試料は、体液試料である。

本明細書で用いられる用語「体液試料」は、患者または移植ドナーなどの該当する対象の診断、予後、分類または評価の目的で得られた体液の試料を指す。特定の実施形態において、そのような試料は、継続中の病状の転帰、または病状への処置レジメンの効果を決定する目的で得られてもよい。好ましい体液試料としては、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水が挙げられる。加えて、特定の体液試料が、分画または精製手順、例えば全血から血清または血漿成分への分離に続いてより即座に分析されることは、当業者に理解されよう。

本明細書で用いられる用語「診断」は、患者が所与の疾患または病状に罹患しているかどうかの可能性（「尤度」）を当業者が推定および／または決定し得る方法を指す。本発明の場合、「診断」は、場合により他の臨床特性と共に、本発明の腎臓傷害マーカーのためのアッセイ、最も好ましくはイムノアッセイの結果を利用して、試料を採取し、アッセイした対象について急性腎臓傷害またはＡＲＦの診断（即ち、発生または非発生）に到達することを含む。そのような診断は、「決定」されており、診断が１００％正確であることの示唆を意味するものではない。多くのバイオマーカーは、複数の病状を示す。熟練の臨床医は、情報不足でのバイオマーカー結果を使用せず、むしろ検査結果を他の臨床指標と共に用いて診断に到達する。したがって所定の診断閾値の一方の側の測定バイオマーカーレベルが、所定の診断閾値の他方の側の測定レベルに比較して、対象の疾患発生のより大きな尤度を示す。

同様に、予後リスクは、所与の経過または転帰が起こる確率（「尤度」）を知らせる。予後指示物質のレベルまたはレベル変動は、疾病の高確率（例えば、腎臓機能の増悪、将来のＡＲＦまたは死亡）にも関連し、患者における有害転帰の「高尤度の指標」と称される。

本明細書で用いられる用語「ラテラルフロー」は、実質的に平坦な多孔質材料を通る長手方向の試薬の流れを指す。そのような多孔質材料は、該材料の厚さが長さおよび幅寸法の１０％以下であれば、「実質的に平坦」である。

デバイスの第一の領域に関して本明細書で用いられる用語「下流領域」は、流体が既に第一の領域に到達した後に流体の流れを受ける領域を指す。

本明細書で用いられる用語「試料適用領域」は、該当する液体試料がその成分を決定する目的で投入されるアッセイデバイスの部分を指す。

マーカーアッセイ

一般にイムノアッセイは、該当するバイオマーカーを含有する、または含有する疑いのある試料を、バイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１種の抗体と接触させることを含む。その後、試料中のポリペプチドを抗体に結合させることにより形成された複合体の存在または量を示すシグナルが発生する。その後、シグナルを試料中のバイオマーカーの存在または量に関係づける。数多くの方法およびデバイスが、バイオマーカーの検出および分析に関する当業者に周知である。例えば、全ての表、図、および特許請求の範囲をはじめとし、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；および同第５，４８０，７９２号、ならびにＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ， ｅｄ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４を参照されたい。

当該技術分野で公知のアッセイデバイスおよび方法では、様々なサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または非競合アッセイ形式を利用して、該当するバイオマーカーの存在または量に関係するシグナルを発生させることができる。適切なアッセイ形式としては、クロマトグラフィー法、質量分析法、およびタンパク質「ブロッティング」法も挙げられる。加えて、バイオセンサーおよび光学イムノアッセイなどの特定の方法およびデバイスは、標識された分子を必要とせずに被分析物の存在または量を決定するために用いられ得る。例えば、全ての表、図、および特許請求の範囲をはじめとし、全体として参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６３１，１７１号、および同第５，９５５，３７７号を参照されたい。非限定的にＢｅｃｋｍａｎ ＡＣＣＥＳＳ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ ＡＸＳＹＭ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ ＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＳＴＲＡＴＵＳ（登録商標）システムをはじめとするロボット機器が、イムノアッセイを実施することが可能なイムノアッセイ分析装置の１つであることも、当業者に認識される。しかし任意の適切なイムノアッセイでは、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイなどが利用され得る。

抗体または他のポリペプチドが、アッセイでの使用のために様々な固相担体上に固定され得る。特異的結合部材を固定するために用いられ得る固相としては、固相結合アッセイで固相として開発および／または使用されたものが挙げられる。適切な固相の例としては、メンブランフィルター、セルロース系の紙、ビーズ（ポリマー、ラテックスおよび常磁性粒子など）、ガラス、シルコンウェハー、マイクロ粒子、ナノ粒子、ＴｅｎｔａＧｅｌ、ＡｇｒｏＧｅｌ、ＰＥＧＡゲル、 ＳＰＯＣＣゲル、およびマルチウェルプレートが挙げられる。固相担体上のアレイ内に抗体または複数の抗体をコーティングすることにより、アッセイストリップを調製することができる。このストリップを、その後、検査試料に浸漬し、その後、洗浄および検出ステップを通して迅速に処理して、着色スポットなどの測定可能なシグナルを発生させることができる。抗体または他のポリペプチドを、アッセイデバイス表面に直接コンジュゲートさせること、または間接的に結合させることのいずれかにより、アッセイデバイスの特異的ゾーンに結合させることもできる。後者の場合の実施例において、抗体または他のポリペプチドが、粒子または他の固相担体に固定され、その固相担体がデバイス表面に固定されていてもよい。

生物学的アッセイは、検出方法を必要とし、結果を定量するための最も一般的方法の１つは、試験されている生物系の成分の１つに親和性を有するタンパク質または核酸に検出可能な標識をコンジュゲートさせることである。検出可能な標識は、それ自体が検出可能である分子（例えば、蛍光部分、電子化学的標識、金属キレートなど）、および検出可能な反応生成物（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）の生成により、またはそれ自体が検出可能になり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセナート、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）により、間接的に検出され得る分子を含み得る。

固相および検出可能な標識のコンジュゲートの調製は、多くの場合、化学的架橋剤の使用を含む。架橋試薬は、少なくとも２つの反応基を含み、一般にホモ官能基型架橋剤（同一反応基を含む）およびヘテロ官能基型架橋剤（非同一反応基を含む）に分別される。アミン、スルフヒドリルを通してカップリングする、または非特異的反応するホモ二官能基架橋剤は、多くの商業的供給源から入手できる。マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、α−ハロアシル、ならびにピリジルジスルフィドは、チオール反応基である。マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、ならびにα−ハロシルは、スルフヒドリルと反応してチオールエーテル結合を形成するが、ピリジルジスルフィドは、スルフヒドリルと反応してジスルフィド混合物を生成する。ピリジルジスルフィド生成物は、切断可能である。イミドエステルは、タンパク質−タンパク質架橋にとっても非常に有用である。それぞれが良好なコンジュゲーションのために異なる属性を組み合わせている、様々なヘテロ二官能基架橋剤が、市販されている。

特定の態様において、本発明は、記載されたマーカーの分析のためのキットを提供する。該キットは、少なくとも１種の検査試料の分析のために、マーカーに特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む試薬を含む。該キットはまた、本明細書に記載された診断および／または予後相関性の１つまたは複数を実施するためのデバイスおよび説明書を含み得る。好ましいキットは、被分析物についてサンドイッチアッセイを実施するための抗体対、または競合アッセイを実施するための標識種を含むことになろう。好ましくは抗体対は、固相にコンジュゲートされた第一の抗体と、検出可能な標識にコンジュゲートされた第二の抗体と、を含み、第一の抗体および第二の抗体のそれぞれは、腎臓傷害マーカーに結合する。最も好ましくは抗体のそれぞれは、モノクローナル抗体である。キットの使用のため、および相関を実施するための説明書は、ラベル表示の形態であり得、それはキットに付着されているか、さもなければ製造、輸送、販売または使用の間のいずれかの時間にキットに添付される、任意の記載もしくは記録された材料を指す。例えば用語：ラベル表示は、広告ビラおよびパンフレット、包装材、説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピュータディスク、ならびにキットに直接インプリントされた記載を包含する。

特定の実施形態において、該マーカーアッセイは、単回使用のディスポーザブル検査デバイスを用いて実施される。そのような検査デバイスは、多くの場合、店頭販売される妊娠検査の一般的使用により現在では熟知されているラテラルフローデバイスの形をとる。一般にこれらのアッセイデバイスは、試料添加領域と評価領域が区別され得る細長い基層を有する。典型的な使用において、試料は、試料添加領域に適用され、基層に並行して走る液体輸送路に沿って流れ、その後、評価領域内へ流れ込む。捕捉試薬が評価領域内に存在し、捕捉された被分析物は、捕捉された被分析物に関連する可視部分を検出するための様々なプロトコルにより検出され得る。例えば該アッセイは、生物学的試料中の被分析物の存在または非存在を示す際に、変色、蛍光、発光などの視覚的シグナルを生じ得る。

試料添加領域は、例えばハウジング内のオープンチャンバーの形態、吸収パッドの形態などで提供することができる。試料添加領域は、様々な形態、即ち、円、楕円、正方形の口であり得るか、または該領域は、デバイスのくぼみであり得る。

フィルター要素は、試料添加領域の中、その表面、またはそれに隣接して配置されていて、血漿がデバイス内をさらに移動し得るように血液から血液細胞を除去または阻止するなど、試料から微粒子をろ過することができる。ろ液は、その後、フィルターに流動的に連結された多孔質部材に移動し得る。血中に存在する細胞材料を除去または阻止するための適切なフィルターは、当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，４７７，５７５号;同第５，１６６，０５１号;同第６，３９１，２６５号;および同第７，１２５，４９３号（それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。多くの適切な材料が、当業者に公知であり、グラスファイバー、合成樹脂繊維、孔径が約６５〜約１５μｍで変動する非対称膜フィルターをはじめとする様々なタイプの膜、およびそのような材料の組み合わせを挙げることができる。加えてフィルター要素は、血漿からの赤血球細胞の分離を容易にする１種または複数の化学物質を含み得る。そのような化学物質の例は、トロンビン、レクチン、カチオン性ポリマー、１種または複数の赤血球細胞表面抗原への抗体などである。血漿からの赤血球細胞の分離を容易にするそのような化学物質（複数可）は、共有結合的手段、非特異的吸収などによりフィルター要素中に提供され得る。

特定の実施形態において、標識ゾーンは、試料受けゾーンの下流に設置され、該当する被分析物に結合する、または結合種への結合をめぐって該当する被分析物と競合する、拡散的に設置されている標識された試薬を含有する。あるいは該標識された試薬が、試料と予備混合された後に試料受けゾーンに適用される場合、該標識ゾーンは設けなくてもよい。検出ゾーンが、標識ゾーンの下流に配設され、該当する被分析物に結合する固定された捕捉試薬を含む。

本発明において使用される膜の最適な孔径は、約１０〜約５０μｍである。該膜は、典型的には約１ミル〜約１５ミルの厚さであり、典型的には５〜１０ミルの範囲内であり、最大２００ミルおよびそれ以上の厚さであってもよい。該膜は、Ｍｙｌａｒ（登録商標）ポリエステルフィルム（ＤｕＰｏｎｔ Ｔｅｉｊｉｎ Ｆｉｌｍｓ）などの概ね水不浸透性の層によって裏打ちされていてもよい。裏打ちが用いられる場合、それは、一般に３Ｍ ４４４両面接着テープなどの接着材により膜に留められている。典型的には水不浸透性の裏打ちは、厚さの薄い膜に用いられる。アッセイ成分に非特異的に結合せず、試料の流れを妨害しないのであれば、非常に様々なポリマーを用いることができる。例示的ポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられる。あるいは該膜は、自立型であってもよい。ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、酢酸ビニルと塩化ビニルの共重合体、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリスチレンなどの他の非吸湿性膜もまた、用いることができる。様々な実施形態において、標識ゾーンの材料は、ブロッキング剤および安定化剤を含む溶液で前処理され得る。ブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化ＢＳＡ、カゼイン、脱脂粉乳が挙げられる。該デバイスはまた、例えば緩衝剤、ＨＡＭＡ阻害物質、洗浄剤、塩（例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウムなどの塩化物および／または硫酸塩）、およびタンパク質性成分（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、ミルクプロテインなど）をはじめとする追加の成分を含み得る。このリストは、限定を意味するものではない。

該デバイスは、検査デバイスが適切に運転されたことを判断するために読み取られる様々な制御場所をさらに含み得る。例として、試料の流れが予測通りであることを確証するために、手順制御ゾーンがアッセイ検出ゾーンと離れて提供され得る。該制御ゾーンは、好ましくは空間的に異なる領域であり、適切な試薬の流れを示すシグナルが発生され得る。手順制御ゾーンは、被分析物アッセイで用いられる過剰な標識抗体が結合し得る該当する被分析物、またはその断片を含有し得る。操作の際、該当する被分析物が検査試料中に存在しない場合でも、標識化試薬が制御ゾーンに結合する。制御ラインの使用は、陰性の結果であっても、制御ライン内のシグナルの出現が検査結果を読み取り得る時間を示すという点で役に立つ。したがって予測されたシグナルが制御ライン内に出現すれば、捕捉ゾーン内のシグナルの存在または非存在に気づくことができる。該デバイスは、陰性制御エリアをさらに含み得る。この制御エリアの目的は、検査デバイスが適切に働いていないことを使用者に警告することである。適切に働いていない場合、シグナルまたはマークが、陰性制御エリアで視覚化されなければならない。

そのようなアッセイデバイスの外箱またはハウジングは、様々な形をとり得る。典型的にはそれには、細長い筐体があり、それは複数の嵌合部品を有し得る。特に好ましい実施形態において、該ハウジングは、上部カバーおよび底部支持体を含む。該上部カバーは、適用穴および観察口を含む。好ましい実施形態において、該ハウジングは、水分不浸透性固体材料、例えばプラスチック材料で作製されている。非限定的にビニル、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカルボナート、ポリスルファン、ポリエステル、ウレタン、およびエポキシをはじめとする様々な市販のプラスチックを、ハウジングを構成するために用い得ることが企図される。ハウジングは、当該技術分野で周知であり使用されている標準的成形技術などの従来の方法論により調製され得る。該ハウジングは、非限定的に、射出成形、圧縮成形、トランスファー成形、吹込成形、押出成形、発泡成形および熱成形などの成形技術により製造され得る。前述の成形技術は、当該技術分野で周知であり、そのため本明細書では詳細に議論しない。例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｒ． Ａ． Ｌｉｎｄｓｂｅｒｇ （１９８３） Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｒｏｎ ｐｐ． ３９３−４３１を参照されたい。

必要に応じて、用いられる検出可能な標識の発色、発光または蛍光強度を、その後、標識に適した機器で評価し得る。例として、蛍光光度計を用いて、蛍光標識を検出することができ、反射率系を用いて、光を吸収する標識を検出することができる、などである。試料中の該当する被分析物の濃度は、測定された応答を、試料液中の被分析物の量に相関させることにより決定され得る。

アッセイの相関

アッセイにおけるバイオマーカーの測定に関連して本明細書で用いられる用語「相関させること」および「関係づけること」は、アッセイから得られたシグナルに基づいて試料中のバイオマーカーの存在、またはより好ましくは量を決定することを指す。多くの場合これは、アッセイに関係する１つの種で検出可能な標識から発生したシグナルを、該シグナルをバイオマーカーの濃度または閾値量に変換するために用いられ得る所定の標準曲線と比較すること、の形をとる。

診断または予後のためのバイオマーカーの使用に関連して本明細書で用いられる用語「相関すること」および「関係すること」は、患者のバイオマーカー（複数可）の存在または量を、所与の病状に罹患したことが分かっている、もしくはそのリスクがあることが分かっている人、または所与の病状を有さないことが分かっている人におけるその存在または量と比較することを指す。多くの場合これは、バイオマーカーの濃度の形態でのアッセイ結果を、疾患の発生もしくは非発生、または幾つかの将来の転帰の尤度を示すように選択された所定の閾値と比較すること、の形をとる。

診断閾値を選択することは、中でも、疾患の確率、異なる検査閾値での真および偽診断の分布、ならびに診断に基づく処置結果（または処置不能）の推定を含む。例えば高度に有効性があり、低レベルのリスクを有する特異的治療薬の投与を考慮する場合、臨床医は実質的な診断不確実性を許容し得るため、検査はほとんど必要とならない。その一方で、処置選択があまり効果的でなく、よりリスクがある状況では、臨床医は多くの場合、より高度の診断確実性を必要とする。したがってコスト／利益分析は、診断閾値の選択に関与する。

適切な閾値は、様々な方法で決定され得る。例えば心臓トロポニンを用いた急性心筋梗塞の診断のための１つの推奨された診断閾値は、正常な母集団において認められる濃度の９７．５パーセンタイルである。別の方法は、同じ患者からの連続の試料を観察することであってもよく、この場合先行の「ベースライン」結果を用いて、バイオマーカーレベルの時間的変動をモニタリングする。

母集団試験を用いて、決定閾値を選択することもできる。受信者操作特性（「ＲＯＣ」）は、レーダ画像の解析のために第二次世界大戦時に開発されたシグナル検出理論の分野から生まれたもので、ＲＯＣ解析は多くの場合、「疾患のある」亜集団を「非疾患の」亜集団と最も上手く区別することが可能な閾値を選択するために用いられる。この場合の偽陽性は、ある人が陽性と検査されたが実際には疾患を有さない場合に生じる。その一方で偽陰性は、ある人が陰性と検査され、健常であると示された、実際には疾患を有する場合に生じる。決定閾値は、連続して変動するため、ＲＯＣ曲線を描くためには、真陽性率（ＴＰＲ）および偽陽性率（ＦＰＲ）が決定される。ＴＰＲは、感受性と等しく、ＦＰＲは、１−特異性と等しいため、ＲＯＣグラフは、感受性対（１−特異性）プロットと呼ばれる場合がある。完璧な検査（ｐｅｒｆｅｃｔ ｔｅｓｔ）は、１．０のＲＯＣ曲線下面積を有し、ランダム検査（ｒａｎｄｏｍ ｔｅｓｔ）は、０．５の面積を有するであろう。閾値は、許容し得るレベルの特異性および感受性を提供するように選択される。

この文脈において「疾患のある」は、１つの特徴（疾患もしくは病状の存在、または幾つかの転帰の発生）を有する集団を指すことを意味し、「非疾患の」は、その特徴がない集団を指すことを意味する。１つの決定閾値は、そのような方法の最も簡単な適用であるが、複数の決定閾値が用いられてもよい。例えば第一の閾値未満では、疾患の非存在が、相対的に高い信頼性を持って割り付けられ得、第二の閾値よりも上では、疾患の存在が、同じく相対的に高い信頼性を持って割り付けられ得る。２つの閾値の間は、不確定と判断され得る。これは、本質的に例示に過ぎないことを意味する。

閾値比較に加えて、アッセイ結果を患者の分類（疾患の発生または非発生、転帰の尤度など）に相関させる他の方法には、決定木、ルールセット、ベイズ法、および神経回路網法がある。これらの方法により、対象が複数の分類のうちの１つの分類に属する度合いを表す確率値が得られる。

検査の正確度の測定は、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２９： １０４３−５１， ２００３に記載された通り得ることができ、所与のバイオマーカーの有効性を決定するために用いることができる。これらの指標には、感受性および特異性、予測値、尤度比、診断オッズ比、ならびにＲＯＣ曲線面積がある。ＲＯＣプロットの曲線下面積（「ＡＵＣ」）は、分類子が無作為に選択された陽性例を無作為に選択された陰性例よりも高くランクづけする確率と等しい。ＲＯＣ曲線下面積は、群が連続データのものであるかどうかを判断された２つの群の中で得られたスコア間の中央値差について検定するマンホイットニーのＵ検定、またはウィルコクソンの順位和検定と等しいと考えることができる。

先に議論された通り、適切な検定は、これらの様々な測定で以下の結果の１つまたは複数を示し得る：０．５を超える、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５の特異性と、対応する０．２を超える、好ましくは０．３を超える、より好ましくは０．４を超える、より好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは０．６、より好ましくは０．７を超える、より好ましくは０．８を超える、より好ましくは０．９を超える、最も好ましくは０．９５を超える感受性；０．５を超える、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．７、より好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５の感受性と、対応する０．２を超える、好ましくは０．３を超える、より好ましくは０．４を超える、より好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは０．６、より好ましくは０．７を超える、より好ましくは０．８を超える、より好ましくは０．９を超える、最も好ましくは０．９５を超える特異性；少なくとも７５％の特異性と併せた少なくとも７５％の感受性；０．５を超える、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは０．７、より好ましくは少なくとも０．８、より好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５のＲＯＣ曲線下面積；１、好ましくは少なくとも約２以上または約０．５以下、より好ましくは少なくとも３以上または約０．３３以下、より好ましくは少なくとも約４以上または約０．２５以下、より好ましくは少なくとも約５以上または約０．２以下、最も好ましくは少なくとも約１０以上または約０．１以下だけ異なるオッズ比；１を超える、少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、より好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも１０の陽性尤度比（感受性／（１−特異性）として算出）；および１未満、０．５以下、より好ましくは０．３以下、最も好ましくは０．１以下の陰性尤度比（（１−感受性）／特異性として算出）。

抗体

本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗原またはエピトープに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片に由来する、それらの後にモデル化された、またはそれらにより実質的にコードされた、ペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９３）； Ｗｉｌｓｏｎ （１９９４； Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：２６７−２７３； Ｙａｒｍｕｓｈ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：８５−９７を参照されたい。用語：抗体は、抗原結合部分、即ち（ｉ）Ｆａｂ断片、つまりＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨｌドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片 、つまりヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨｌドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の片腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、をはじめとする抗原に結合する能力を保持する「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を包含する。一本鎖抗体もまた、用語「抗体」の指示対象に含まれる。

好ましい治療抗体は、ＩｇＧ抗体である。本明細書で用いられる用語「ＩｇＧ」は、認識された免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされた抗体の分類に属するポリペプチドを意味する。ヒトにおいてこの分類は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。マウスにおいてこの分類は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。抗体のＩｇＧ分類のうちの既知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬである。ＩｇＧは、幾つかの実践的理由により治療抗体の好ましい分類である。ＩｇＧ抗体は、安定していて容易に精製され、医薬品サプライチェーンにとって実践的な条件下で保存することが可能である。インビボにおいてそれらは、長期の生物学的半減期を有し、それはサイズの関数ではなく、いわゆるＦｃ受容体（またはＦｃＲｎ）との相互作用の結果でもある。この受容体は、ＩｇＧの細胞内異化を防止すると考えられ、それを再度血漿にリサイクルする。

抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスなどのほとんどの哺乳動物において、抗体は、ポリぺプチド重鎖とポリペプチド軽鎖との対合により構築される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗体間で顕著な配列多様性を示し、標的抗原への結合を担う。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって一般的用語：免疫グロブリンは、そのようなタンパク質に用いられる。

先に注目された通り、抗体は、抗体が結合するエピトープ（複数可）を提示する任意のポリペプチドに結合するため、用語「特異的に結合する」は、抗体が専ら意図するターゲットにのみ結合することを示す意図はない。むしろ、意図するターゲットへの親和性が適切なエピトープ（複数可）を提示しない非標的分子への親和性に比較して約５倍を超えていれば、抗体は「特異的に結合する」。好ましくは抗体の親和性は、非標的分子への親和性よりも標的分子に関して少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、より好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍以上であろう。好ましい実施形態において、好ましい抗体は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、好ましくは約１０^８Ｍ^−１〜約１０^９Ｍ^−１、約１０^９Ｍ^−１〜約１０^１０Ｍ^−１、または約１０^１０Ｍ^−１〜約１０^１２Ｍ^−１の親和性によって結合する。

親和性は、Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ（ｋ_ｏｆｆは、解離速度定数であり、ｋ_ｏｎは、会合速度定数であり、Ｋ_ｄは、平衡定数である）として算出される。親和性は、標識されたリガンドの結合分率（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｂｏｕｎｄ）（ｒ）を様々な濃度（ｃ）で測定することにより平衡で決定することができる。データは、スキャッチャードの式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）（式中、ｒ＝平衡での結合リガンドのモル数／受容体のモル数、ｃ＝平衡での遊離リガンド濃度、Ｋ＝平衡会合定数；ｎ＝受容体分子あたりのリガンド結合部位の数）を用いてグラフ化される。グラフの分析により、ｒ／ｃは、Ｘ軸でのｒに対してＹ軸にプロットされ、それによりスキャッチャードプロットが作成される。スキャッチャード分析による抗体親和性の測定は、当該技術分野で周知である。例えば、vａｎ Ｅｒｐ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ １２： ４２５−４３， １９９１； Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｒｉｓｗｏｌｄ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ． ２７： ６５−８， １９８８を参照されたい。

本明細書に記載されたイムノアッセイにおいて最大の臨床用途を有する抗体およびエピトープが選択され得るように、本発明の抗体をエピトープマッピングによりさらに特徴づけることができる。用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することが可能な抗原決定基を指す。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性を有する表面分子群からなり、通常、特異的な三次元構造特性および特異的電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が喪失し、後者への結合が喪失しないことで識別される。好ましくは、標的分子上に存在するが、非標的分子上には部分的または完全に存在しないエピトープが、標的となる。

幾つかの実施形態において、抗体スカフォールドは、異なる種から得られた配列の混合物であり得る。そのため、抗体が１種の抗体であれば、そのような抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般に「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」は両者とも、１つを超える種から得られた領域を組み合わせた抗体を指す。例えば「キメラ抗体」は、伝統的にマウス（または幾つかの例ではラット）から得られた可変領域（複数可）およびヒトから得られた定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は、一般に、ヒト抗体中に見出される配列にスワップされた可変ドメインフレームワーク領域を有した非ヒト抗体を指す。一般にヒト化抗体において、ＣＤＲを除く全抗体が、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされているか、またはＣＤＲ内を除きそのような抗体と同一である。ＣＤＲは、それらの一部または全てが非ヒト生物体内で発生する核酸によりコードされており、ＣＤＲをヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植することで、移植されたＣＤＲにより特異性が決定される抗体を作製する。そのような抗体の作製は、例えばＷＯ９２／１１０１８号、Ｊｏｎｅｓ， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５， Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆突然変異」は、多くの場合、初期移植構築物内で喪失している親和性を回復する必要がある（米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，８２１，３３７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第６，４０７，２１３号）。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含み、それにより典型的にはヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体は、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて作製することもできる。Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０：６３９−６５４。非ヒト抗体をヒト化して再形成するための様々な技術および方法は、当該技術分野で周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ， ２００４， Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ， ５３３−５４５， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ）、およびそれに引用された参考資料を参照）。ヒト化方法としては、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８； Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６； Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８６：１００２９−３３； Ｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： １０２９−１０３５； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５−９， Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９； Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：４１８１−４１８５； Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１−８に記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト化、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減する他の方法は、例えばＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９６９−９７３に記載された通り、リサーフェシング法を含み得る。一実施形態において、親抗体は、当該技術分野で公知の通り、親和性成熟されている。構造に基づく方法は、例えば米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載された通り、ヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、非限定的にＷｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９４：１５１−１６２； Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１６）：１０６７８−１０６８４； Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３７）： ２２６１１−２２６１８； Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： ８９１０−８９１５； Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １６（１０）：７５３−７５９に記載された方法をはじめとし、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟するのに用いられ得る。他のヒト化方法は、非限定的に米国特許出願第０９／８１０，５０２号；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：１１１９−１１２５； Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９：３０７６−３０８４に記載された方法をはじめとし、ＣＤＲのほんの一部の移植を含み得る。

一実施形態において、該抗体は、全ヒト抗体である。「全ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」は、ヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を指す。全ヒト抗体は、例えばトランスジェニックマウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８：４５５−４５８）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９：１０２−１０８）を用いて、得てもよい。

抗体の生成

モノクローナル抗体調製物を、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術の利用、またはそれらの組み合わせをはじめとする当該技術分野で公知の非常に様々な技術を用いて生成することができる。例えばモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知であり、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８８）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ， ｐｐ． ５６３−６８１ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１）（両者とも、全体として参照により本明細書に組み入れられる）に教示された技術などのハイブリドーマ技術を利用して生成することができる。本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、真核生物、原核生物、またはファージクローンをはじめとする単一クローンに由来する抗体を指し、それを生成する方法ではない。

ラットおよびマウス以外の動物に由来するモノクローナル抗体は、特有の利点を提供する。シグナル伝達および疾患に関連する多くのタンパク質ターゲットは、マウスとラットとヒトの間で高度に保存されており、それゆえマウスまたはラット宿主により自己抗原として認識されて、それらを低い免疫原性にする可能性がある。この問題は、宿主動物としてウサギを使用する場合には回避され得る。例えばＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， １２４， ２９５−３０２， ２００５を参照されたい。

ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成およびスクリーニングする方法は、日常的であり、当該技術分野で周知である。非限定的例において、マウスは、該当する抗原またはそのような抗原を発現する細胞により免疫化することができる。例えば抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫反応が検出されれば、マウス脾臓を回収して、脾臓細胞を単離する。脾臓細胞は、その後、周知技術により任意の適切な骨髄細胞に融合する。ハイブリドーマを選択して、限界希釈によりクローニングする。ハイブリドーマクローンを、その後、抗原に結合することが可能な抗体を分泌する細胞に関して当該技術分野で公知の方法によりアッセイする。マウスに陽性ハイブリドーマクローンを腹腔内接種することにより、一般には高レベルの抗体を含有する腹水液を作製することができる。

抗体作製の方法において用いられ得るアジュバントとしては、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば全細菌（ＢＣＧ、コリネバクテリウム・パルバム、サルモネラ・ミネソタ）、ならびに細胞壁骨格、トレハロースジミコール酸、モノホスホリル脂質Ａ、結核菌のメタノール抽出性残渣（ＭＥＲ）、完全または不完全フロイントアジュバントをはじめとする細菌成分；ウイルスアジュバント；化学的アジュバント、例えば水酸化アルミニウム、ヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシナート；ネイキッドＤＮＡアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法で用いられ得る他のアジュバントとしては、コレラ毒、パロポクスタンパク質（ｐａｒｏｐｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；参照により本明細書に組み入れられるＢｉｅｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “ＧＡＤ６５ Ａｎｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｂ Ｃｈａｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ （９−２３） Ａｒｅ Ｎｏｔ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｏｆ Ｔｈｅ ＢＢ Ｒａｔ，” Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３１（１）：１５−２４も参照）、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；参照により本明細書に組み入れられる、Ｌｏｄｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （２０００） “ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｉｃｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ： Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｏｕｔｅ Ｏｆ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ （ＭＰＬ），” Ｖａｃｃｉｎｅ， １８： １０５９−１０６６； Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “３−Ｏ−Ｄｅｓａｃｙｌ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４２： ４６４０−４６４９； Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） “Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ （ＭＰＬ） Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９： １０３−１０７も参照）、ＲＣ−５２９アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｉｘａのアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）化学ライブラリーから得られたリード化合物。ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍも参照）、およびＤＥＴＯＸ（商標）アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（モノホスホリル脂質Ａ）およびマイコバクテリア細胞壁骨格を含む；参照により本明細書に組み入れられる、Ｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） “Ａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｂ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｗｈｏｌｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｐｌｕｓ ＤＥＴＯＸ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ，” Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４（３）：６１９−６２７；およびＧｕｐｔａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） “Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ， Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，” Ｖａｃｃｉｎｅ， １３（１４）： １２６３−１２７６も参照）。

数多くの発行物で、選択された被分析物への結合に関するポリペプチドライブラリーを生成およびスクリーニングするファージディスプレイ技術の使用が議論されている。例えば、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ６３７８−８２， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ４０４−６， １９９０， Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−８８， １９９０；およびＬａｄｎｅｒらの米国特許第５，５７１，６９８号を参照されたい。ファージディスプレイ法の基本的概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするＤＮＡとそのポリペプチドの間の物理的会合の確立である。この物理的会合は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するカプシドの一部としてポリペプチドを提示するファージ粒子により提供される。ポリペプチドとそれらの遺伝子材料の間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチドを有する非常に多数のファージの同時マススクリーニングを可能にする。ターゲットへの親和性を有するポリペプチドを提示するファージが、そのターゲットに結合し、これらのファージが、ターゲットへの親和性スクリーニングにより濃縮される。これらのファージから提示されたポリペプチドの同一性を、それらの各ゲノムから決定することができる。これらの方法を利用して、所望のターゲットへの結合親和性を有するとして同定されたポリペプチドが、その後、従来の手段により大量に合成され得る。例えば、全ての表、図、および特許請求の範囲をはじめとし、全体として本明細書に組み入れられる、米国特許第６，０５７，０９８号を参照されたい。

これらの方法により作製された抗体は、その後、該当する精製ポリペプチドとの親和性および特異性について第一のスクリーニングを行うこと、そして必要に応じて、その結果を、結合から除外されることが望ましいポリペプチドと該抗体との親和性および特異性と比較すること、により選択することができる。スクリーニング手順は、マイクロタイタープレートの個別のウェルにおいて精製ポリペプチドを固定化することを含み得る。潜在的な抗体または抗体群を含有する溶液を、その後、各マイクロタイタープレートに入れて、約３０分〜２時間インキュベートする。その後、マイクロタイターウェルを洗浄して、標識された二次抗体（例えば、増加した抗体がマウス抗体であれば、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗マウス抗体）をウェルに添加して約３０分間インキュベートし、その後、洗浄する。基質をウェルに添加し、固定されたポリペプチド（複数可）への抗体が存在すれば、有色反応が現れる。

そのように同定された抗体は、その後、選択されたアッセイデザインにおいて親和性および特異性についてさらに分析され得る。標的タンパク質についてのイムノアッセイの開発において、精製された標的タンパク質が、選択された抗体を用いたイムノアッセイの感受性および特異性を判定する標準物質として作用する。様々な抗体の結合親和性は、異なる場合があり、特定の抗体対（例えば、サンドイッチアッセイにおいて）は、互いに立体的に干渉する場合があることなどにより、抗体のアッセイ性能は、抗体の絶対的な親和性および特異性よりも重要な指標になり得る。

抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないがヒト免疫グロブリン遺伝子は発現し得るトランスジェニックマウスを使用して、生成することもできる。例えばヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えにより、マウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、およびダイバーシティ領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）をマウス胚性幹細胞にも導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に非機能性にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体の生成を防止する。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを作製する。その後、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生する。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全てまたは一部で、従来の方法論を利用して免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を利用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが抱えるヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化の間に再構成し、次にクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがってそのような技術を用いれば、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能になる。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概要については、全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９５） “Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術、ならびにそのような抗体を生成するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９６／３４０９６号、およびＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国公開第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フリーモント）およびＭｅｄａｒｅｘ（ニュージャージー州プリンストン）などの会社は、先に記載された技術と類似の技術を利用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するよう契約することができる。

抗体の組換え発現

本発明の抗体をコードする核酸配列が得られたら、抗体生成のためのベクターを、当該技術分野で周知の技術を利用した組換えＤＮＡ技術により生成することができる。当業者に周知である方法を用いて、抗体をコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、
インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， １９９０， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．， １９９８， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ参照）。

抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、従来の技術（例えば、電子穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降法）により宿主細胞に導入することができ、トランスフェクトされた細胞を、その後、従来の技術で培養して、本発明の抗体を生成する。具体的な実施形態において、抗体の発現は、構成プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異性プロモーターにより調節される。

本発明の組換え抗体を発現するために用いられる宿主細胞は、特に全組換え免疫グロブリン分子の発現の場合、大腸菌などの細菌細胞、または好ましくは真核細胞のいずれかであり得る。特に、ヒトサイトメガロウイルスから得られる重要な中間体：初期遺伝子プロモーター要素などのベクターが一体化されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、免疫グロブリンの効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８６） “Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｕｎｉｔ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ．” Ｇｅｎｅ ４５：１０１−１０５； Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） “Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６６２−６６７）。

様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体を発現させてもよい。そのような宿主発現系は、抗体のコード配列を生成し、続いて精製し得るビヒクルに相当するが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合には、本発明の抗体をインサイチュで発現し得る細胞にも相当する。これらには、免疫グロブリンコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物（例えば、大腸菌およびＢ．サブチリス）；免疫グロブリンコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス・ピキア）；免疫グロブリンコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；免疫グロブリンコード配列を含む、組換えウイルス発現ベクターを感染させた（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））もしくは組換えプラスミド発現ベクターで形質転換された（例えば、Ｔｉプラスミド）植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を抱える哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ管細胞（米国特許第５，８０７，７１５参照）、Ｐｅｒ Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたラット網膜細胞））が挙げられるが、これらに限定されない。

細菌系において、複数の発現ベクターが、有利には発現される抗体で意図される用途に応じて選択され得る。例えば多量のそのようなタンパク質が、生成されることになる場合、抗体の医薬組成物の作製のために、即座に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指揮するベクターが、望ましくなり得る。そのようなベクターとしては、抗体コード配列がｌａｃ Ｚコード配列を有するフレーム内で個別にベクターにライゲートされて融合タンパク質が生成され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） “Ｅａｓｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅｓ，” ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１−１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ． （１９８５） “Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｌｐｐ Ｇｅｎｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３１０１−３１１０； Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，” Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４：５５０３−５５０９）などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに用いられ得る。一般にそのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスであるグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合と、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位を含むことでクローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように設計されている。

昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現させる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞内で生育する。抗体コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下で配置させることができる。

哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、該当する抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列にライゲートされ得る。このキメラ遺伝子は、その後、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すれば、生存していて、感染された宿主において免疫グロブリン分子を発現することが可能な組換えウイルスをもたらすであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） “Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｏｆ ｍＲＮＡｓ Ｌａｔｅ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ８１：３６５５−３６５９参照）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的翻訳に必要になり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接の配列を含む。さらに該開始コドンは、挿入物全体を確実に翻訳するために、所望のコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写増強要素、転写ターミネーターなどの含有により、高めることができる（Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１６−５４４参照）。

加えて、挿入された配列の発現を調整する、または所望の特異的用式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要になり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系が、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的に向けて、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞内機構を有する真核宿主細胞が、用いられ得る。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０ならびにＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられるが、これらに限定されない。

組換えタンパク質の長期にわたる高収率の生成のためには、安定した発現が好ましい。例えば本発明の抗体を安定して発現する細胞株が、遺伝子操作され得る。複製のウイルス起源を含む発現ベクターを利用するよりもむしろ、宿主細胞を適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの誘導に続いて、遺伝子操作された細胞を濃縮培地中で１〜２日間生育させ、その後、選択培地に交換してもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択への耐性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して取り込むことができ、発育して増殖層を形成し、細胞株にクローニングして増殖させることができる。この方法は、有利には本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子操作するために用いられ得る。そのような遺伝子操作された細胞株は、本発明の抗体と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用になり得る。

非限定的に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７７） “Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｔｏ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌｓ，” Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトリアンスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ． （１９６２） “Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｓｓ Ｌｉｎｅ． ＩＶ． ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｒａｉｔ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ４８：２０２６−２０３４）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ． （１９８０） “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＤＮＡ： Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｈｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ａｐｒｔ Ｇｅｎｅ，” Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３）遺伝子をはじめとする複数の選択系を用いることができ、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞内で用いられ得る。同じく、代謝拮抗物質耐性も、以下の遺伝子を選択する基本原理として使用され得る:メトトレキサートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８０） “Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｍｐｌｆｉａｂｌｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７７：３５６７−３５７０； Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） “Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｂｙ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７８：１５２７−１５３１）;ミコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８１） “Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈａｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｉｎｇ Ｆｏｒ Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７８：２０７２−２０７６）； アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するｎｅｏ（Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） “Ａｌｔｅｒｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｈｕｍａｎ−Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ Ｂｙ ｐＳＶ２−Ｎｅｏ Ｇｅｎｅ，” Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（３）：２１９−２２６； Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ （１９９３） “Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｏｎｃｅｐｔｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｉａｌｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，” Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６； Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９９３） “Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２；およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） “Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，” Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７）。使用され得る、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般的に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， １９９３， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０， ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；およびＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）， １９９４， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ．； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８１） “Ａ Ｎｅｗ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４に記載されている；およびハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９８４） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ Ａｎｄ Ｇ４１８ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｓ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌ Ｃｅｌｌｓ，” Ｇｅｎｅ ３０：１４７−１５６）。

本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇させることができる(総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ， “Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｍａｍｍａｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，” ｉｎ ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ｖｏｌ． ３． （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）を参照されたい)。抗体を発現するベクター系の中のマーカーが、増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質のレベルが上昇すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加するであろう。増幅された領域は、抗体のヌクレオチド配列と関連するため、抗体の生成も増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ，” Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２５７−２６６）。

宿主細胞は、本発明の２種の発現ベクター、即ち、重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクターでコトランスフェクトされ得る。該２種のベクターは、同一の選択マーカーを含み、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にし得る。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが用いられ得る。そのような状況において、重鎖より先に軽鎖を配置して、有毒な遊離重鎖が過剰になることが回避されなければならない（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ （１９８６） “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ，” Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５６２−５６５； Ｋｏｈｌｅｒ （１９８０） “Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃｈａｉｎ Ｌｏｓｓ Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｌｉｎｅｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．） ７７：２１９７−２１９９）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。

本発明の抗体分子が、組換えによって発現されたら、抗体精製のための当該技術分野で公知の任意方法により、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡ後の特異的抗原への親和性によるもの、およびサイズにより選別するカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、差示溶解度、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的技術により、抗体を精製し得る。

実施例
実施例１：ウサギにおけるモノクローナル抗体生成

雌ニュージーランドウサギを、抗原／アジュバントエマルジョンの皮下注射（ＳＱ）により免疫化した。一次免疫化は、完全フロイントアジュバントで実施し、不完全フロイントアジュバントは、続くブースト全てに用いた。ウサギに１匹あたり２５０μｇタンパク質の抗原を３週間ごとにＳＱ注射した（臀部と肩甲骨の２部位を交替に）。検査血を、二回目のブーストの７日後に辺縁耳静脈から採取した。この検査血（免疫血清）を、間接的ＥＬＩＳＡアッセイにより検査して、ウサギの免疫反応がモノクローナル抗体の生成に十分であるかどうかを決定した。最良に応答したウサギに最後のＳＱブーストを施し、４日後に失血により安楽死させた。全血を心穿刺により採取した。該当する抗体を生成するＢ細胞を、標的抗原での間接的ＥＬＩＳＡにより同定して、免疫グロブリン遺伝子を単離した。重鎖および軽鎖を別の哺乳動物発現ベクターにクローニングして、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトし（一過性トランスフェクション）、ウサギモノクローナル抗体を含む組織培養上清を回収した。

実施例２：マウスにおけるモノクローナル抗体の生成

雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６０日齢）を、標準的操作手順での抗原／アジュバントエマルジョンの腹腔内注射（ＩＰ）により免疫化した。一次免疫化は、完全フロイントアジュバントで実施し、不完全フロイントアジュバントは、続くブースト全てに用いた。マウスに１匹あたり２５μｇの抗原を３週間ごとにＩＰ注射した（１匹あたりの合計容量１２５μＬ）。検査血を二回目のブーストの７〜１０日後に伏在静脈穿刺により実施した。この検査血（免疫血清）を、間接的ＥＬＩＳＡアッセイにより検査して、マウスの免疫反応が融合に十分であるかどうかを決定した。２匹の最良に応答したマウスに、外側尾静脈から滅菌生理食塩水中の１０μｇ／匹の抗原による最後の静脈内ブーストを施した。ＩＶブーストの４日後に、マウスを安楽死させて、脾臓を回収した。脾臓から単離されたリンパ球を融合工程に用いて、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．； Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ． （１９７５）． ”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｓｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”． Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （５５１７）： ４９５−４９７の方法を利用してハイブリドーマを生成させた。ハイブリドーマは、ＰＥＧ１５００融合工程を利用して作製した。

実施例３：患者試料を用いた抗体のスクリーニング（マイクロタイターに基づくＥＬＩＳＡ法）

材料
９６ウェル高結合能ＥＬＩＳＡプレート−Ｃｏｓｔａｒ ３５９０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡコーティングバッファー：ＰＢＳ
ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー：０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ
ＥＬＩＳＡ ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号Ｎ５０２）
ＥＬＩＳＡ試薬希釈液：２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１％ ＢＳＡ（ＢｉｏＦｘ）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．１
Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１００１）
１−Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４０２８）
停止溶液：２Ｎ硫酸
捕捉抗体
ビオチンがコンジュゲートされた検出抗体
組換えヒトＴＩＭＰ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号４１０−０２）
ＥＸＬｘ４０５プレートウォッシャー（Ｂｉｏｔｅｋ）
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）

検査手順

精製された組換えＴＩＭＰ２被分析物を、試薬希釈液に添加して系列希釈し、一定濃度範囲に及ぶ標準試料セットを作製した。凍結された単回使用の患者試料アリコットを、室温の水浴で１０分間解凍し、その後、試薬希釈液で所望のレベルに希釈した。

コーティングバッファーで調製された５μｇ／ｍＬ捕捉抗体溶液１００μＬを９６ウェル高結合能ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加して、室温（２２℃〜２５℃）で一晩インキュベートした。各ウェルを吸引して、オートウォッシャーを用いて洗浄バッファー３００μＬで３回洗浄した。その後、ＥＬＩＳＡブロッキングバッファー２５０μＬを各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベートした後、先に記載された吸引／洗浄ステップを再度行った。

標準液または患者試料１００μＬを調製されたプレートの各ウェルに添加して、水平オービタルシェーカーにて室温でインキュベートした。２時間のインキュベーション後に、プレートを先に記載された通り洗浄した。その後、試薬希釈液で調製された０．１μｇ／ｍＬ検出抗体溶液１００μＬを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰコンジュゲートの０．１μｇ／ｍＬ溶液を試薬希釈液中に調製し、この溶液１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートして、洗浄した。１−ｓｔｅｐ ｕｌｔｒａ ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに添加して、遮光下、室温で１０分間インキュベートした後、停止溶液５０μＬを添加した。各ウェルの光学濃度を、４５０ｎｍ波長に設定されたマイクロプレートリーダーで測定した。

実施例４：患者試料での抗体のスクリーニング（ラテラルフロー形式のストリップ検査法）

材料：
ニトロセルロース膜
裏打ちカード
試料パッド
ウィッキングパッド
膜ブロッキングバッファー：１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％スクロース、０．１％ＢＳＡ、０．２％ＰＶＰ−４０、ｐＨ８．０
試料パッドブロッキングバッファー：５ｍＭホウ酸塩、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２５％ ＰＶＰ−４０、０．５％ ＢＳＡ、ｐＨ ８．５
ランニングバッファーＪ：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２％ １０Ｇ、０．３５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２５％ ＰＶＰ−４０， ｐＨ ８．５
蛍光コンジュゲート抗体
検査ライン抗体
ヤギ抗マウス陽性対照抗体
組換えヒトＴＩＭ２

ストリップの構成

ＡＤ３０５０アスピレートディスペンスシステムを用いて、ニトロセルロース膜に検査ライン抗体を縞模様に塗布し（ｓｔｒｉｐｅｄ）、膜ブロッキングバッファーでブロックして、３７℃で３０分間乾燥させた。デシケーター内で一晩硬化させた後、縞模様に塗布されてブロックされたニトロセルロース膜を、ウィッキングパッドと、試料パッドブロッキングバッファーで前処理された試料パッドと共に、裏打ちカード上に積み重ねた。カードを５ｍｍ幅の検査ストリップに切り裂き、その後、カートリッジに入れた。

試料の調製

精製された組換えＴＩＭＰ２被分析物をランニングバッファーＪに添加して系列希釈し、一定濃度範囲に及ぶ標準試料セットを作製した。凍結された単回使用の患者試料アリコットを、室温の水浴で１０分間解凍し、その後、ランニングバッファーＪで所望のレベルに希釈した。

検査手順

ＰＢＳ中の蛍光コンジュゲート抗体（０．０２５μｇ／μＬ）１０μＬを試料１００μＬに添加した。この溶液１００μＬをカートリッジの投入口に入れた。蛍光リーダーおよび関連のソフトウェアを用いて、結果をｔ＝２０分に読み取った。

実施例５：ペプチドマッピング

材料：９６ウェル高結合能マイクロタイタープレート、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、ビオチン化ペプチド、非コンジュゲート抗体、マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲートにコンジュゲートされたＨＲＰコンジュゲート、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート、抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲート、ＴＭＢ基質、２Ｎ硫酸を、エピトープマッピング実験に用いた。

Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを９６ウェル高結合能マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて固定した。プレートを洗浄して、未反応のＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを除去した後、ブロッキングステップを実施した。ビオチン化ペプチドを水性バッファーで１０μｇ／ｍＬの濃度に溶解した。Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎをコーティングしたマイクロタイタープレートの各ウェルに、ペプチド溶液５０μＬを添加した。これらのプレートを室温で１時間インキュベートし、その後、洗浄して非結合ペプチドを除去した。非コンジュゲートマウスおよびウサギ抗体を５μｇ／ｍＬに希釈して、プレートに１００μｇ／ウェルで添加した。抗マウスＩｇＧ（マウス抗ＴＩＭＰ２中）または抗ウサギＩｇＧ（ウサギ抗ＴＩＭＰ２の場合）を、陰性対照として隣のウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートして、洗浄した。抗マウスＩｇＧにコンジュゲートされたＨＲＰ（マウス抗ＴＩＭＰ２およびマウスＩｇＧ陰性対照の場合）、および抗ウサギＩｇＧにコンジュゲートされたＨＲＰ（ウサギ抗ＴＩＭＰ２およびウサギＩｇＧ陰性対照の場合）を０．２μｇ／ｍＬに希釈して、プレートの各ウェルに添加した。これらのプレートを室温で２０分間インキュベートして、洗浄した。露光を回避しながら、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加して、プレートを２０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルの停止溶液（２Ｎ硫酸）を各ウェルおよびプレートに添加して、反応を停止させた。４５０ｎｍで光学濃度を測定するように設定された分光光度法９６ウェルマイクロプレートリーダーで、吸光度を読み取った。

実施例６：アラニンスキャニングペプチドマッピング

アラニンスキャニングは、広く用いられている突然変異誘発アプローチであり、部位特異的突然変異誘発により、選択された位置のアラニンを標的タンパク質中の残基で体系的に置換し、発現させて、機能についてアッセイするものである。アラニン残基での置換は、主鎖の立体配座を変化させず、または立体的もしくは静電的作用を誘導せずに、側鎖相互作用を排除する。自動突然変異誘発プロトコルを利用して、標的ポリペプチドの各残基をアラニンに変換し、各抗体結合ドメインを含む重要な残基を決定することができる。

実施例７：結果

アラニンスキャニングとペプチドマッピングの結果を組み合わせて用いると、特有のＴＩＭＰ２モノクローナル抗体が、同定および選択された。これらの抗体の結合に関与するエピトープは、市販のＴＩＭＰ２モノクローナル抗体では過去に観察されていない。

本発明を作製および使用するために当業者に十分詳細に記載および例示したが、様々な代替、修正および改良が、本発明の趣旨および範囲を逸脱せずに明白になるはずである。本明細書に提供された実施例は、好ましい実施形態の代表で、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書内の修正および他の用途は、当業者に想起されるであろう。これらの修正は、本発明の主旨に含まれ、特許請求の範囲により定義される。

本明細書における「または」の使用は、他に断りがなければ、「および／または」を意味する。同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、互換性があり、限定を意図するものではない。

さらに、様々な実施形態の記載が用語「含んでいる」を使用する場合、当業者が幾つかの具体的例において、実施形態が代わりに言語「本質的に〜からなる」または「〜からなる」を用いて記載され得ることは、理解されるべきである。

他に断りがなければ、本明細書で用いられた全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同一の任意の方法および試薬が、開示された方法および組成物の実践で用いられ得るが、例示的方法および材料をここに記載している。

本明細書で述べられた全ての発行物は、その発行物中に記載され、本明細書の記載と一緒に用いられ得る方法論を記載および開示する目的で、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書で述べられた全ての特許および発行物は、本開示の出願日以前に本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示している。本明細書には、本発明者らが先行の開示のおかげで本開示よりも先行する権利を与えるものではないという承認としてみなすべきである。

様々な交換および修正が、本発明の範囲および主旨から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に施され得ることは、即座に明白となろう。

本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素または複数の要素、限定または複数の限定を用いずに適宜、実践され得る。したがって例えば本明細書の各例において、用語「含んでいる」、「本質的に〜からなる」、および「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと交換され得る。用いられた用語および表現は、説明の用語として用いられており、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において図示および記述された特色またはその一部の任意の均等物の排除を意図するものではなく、様々な修正が請求された本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態により具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の選択的な特色、修正および変形が当業者によって再分類され得ること、ならびにそのような修正および変形が添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内のものと見なされることが、理解されなければならない。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に示される。

Claims (26)

1. ヒトＴＩＭＰ２と特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、前記モノクローナル抗体が、ポリペプチドに少なくとも１０^８Ｍ^−１の親和性で結合し、前記ポリペプチドの配列が、
   ＱＡＦＣＮＡＤＶＶＩＲＡＫＡＶＳＥＫＥＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
   ＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
   ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
   ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
   ＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
   ＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
   ＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、
   ＳＳＰＤＥＣＬＷＭＤＷＶＴＥＫＮＩＮＧＨＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、および
   ＣＡＷＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
   からなる群から選択される配列からなる、単離されたモノクローナル抗体。
2. シグナル発生要素（ｓｉｇｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）にコンジュゲートされる、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
3. 固相担体に固定されている、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
4. 生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係する検出可能なシグナルを発生するように構成されたディスポーザブル検査デバイスをさらに含むキット中の試薬として提供されている、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
5. 前記ディスポーザブル検査デバイスが、ラテラルフロー検査デバイスである、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
6. 前記ディスポーザブル検査デバイス内の表面に固定されている、請求項４または５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
7. 前記ディスポーザブル検査デバイスから独立した容器に提供されている、請求項４または５に記載の単離されたモノクローナル抗体。
8. 前記キットが、ヒトＴＩＭＰ２と特異的に結合する第二の抗体をさらに含み、前記単離された抗体および前記抗体が、ヒトＴＩＭＰ２とサンドイッチ複合体を形成する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
9. 前記第二の抗体が、ポリペプチドに少なくとも１０^８Ｍ^−１の親和性で結合するモノクローナル抗体であり、前記ペプチドの配列が、
   ＱＡＦＣＮＡＤＶＶＩＲＡＫＡＶＳＥＫＥＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
   ＩＹＧＮＰＩＫＲＩＱＹＥＩＫＱＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、
   ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、
   ＹＥＩＫＱＩＫＭＦＫＧＰＥＫＤＩＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、
   ＥＦＩＹＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、
   ＴＡＰＳＳＡＶＣＧＶＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、
   ＳＬＤＶＧＧＫＫＥＹＬＩＡＧＫＡＥＧＤＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、
   ＳＳＰＤＥＣＬＷＭＤＷＶＴＥＫＮＩＮＧＨＱ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、および
   ＣＡＷＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥＤＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
   からなる群から選択される配列からなる、
   請求項８に記載の単離されたモノクローナル抗体。
10. 前記キットが、前記検出可能なシグナルをＴＩＭＰ２の濃度に関係づけるためのキャリブレーションをさらに含む、請求項４〜９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
11. 前記キャリブレーションが、電子記憶デバイスにより提供される検量線である、請求項１０に記載の単離されたモノクローナル抗体。
12. インビトロ診断における試薬として提供される、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
13. 前記キットが、生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係するシグナルを提供するアッセイ方法を実施するように構成されており、前記アッセイ方法におけるＴＩＭＰ２の最小検出可能濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
14. ウサギ、マウス、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、ラマまたはラクダ抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
15. ウサギ抗体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
16. 生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量を決定する方法であって、
    一緒になってヒトＴＩＭＰ２とサンドイッチ複合体を形成する第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体を用いて、前記生物学的試料のイムノアッセイを実施し、前記イムノアッセイが、前記サンドイッチ複合体中で結合した前記生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関係する検出可能なシグナルを提供すること、ならびに
    前記検出可能なシグナルを、前記生物学的試料中のヒトＴＩＭＰ２の前記存在または量に関係づけること
    を含む、方法。
17. 前記イムノアッセイにおけるＴＩＭＰ２の最小検出可能濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ以下である、請求項１１に記載の方法。
18. 前記第一のモノクローナル抗体および第二のモノクローナル抗体の一方または両方が、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体である、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記イムノアッセイが、ラテラルフロー形式で実施される、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記イムノアッセイが、インビトロ診断である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記イムノアッセイが、前記ヒト患者試料をディスポーザブル検査デバイスに適用することにより実施され、前記検出可能なシグナルが、前記ディスポーザブル検査デバイスを分析機器に挿入することにより得られ、前記第一および第二の抗体を含む前記サンドイッチ複合体が、前記ディスポーザブル検査デバイスの所定のゾーンでの検出のために固定されており、前記分析機器が、前記固定されたサンドイッチ複合体を検出して前記検出可能なシグナルを提供する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記第一の抗体が、シグナル発生要素にコンジュゲートされている、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記第一の抗体が、前記ヒト患者試料と共に反応混合物を形成し、前記反応混合物を前記ディスポーザブル検査デバイスに適用することにより、前記ヒト患者試料が前記ディスポーザブル検査デバイスに適用される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記第二の抗体が、固相担体の所定のゾーンに固定されている、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 前記第一および第二の抗体のそれぞれが、ウサギ、マウス、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、ラマまたはラクダ抗体である、請求項１１〜１８の１項に記載の方法。
26. 前記第一および第二の抗体のそれぞれが、ウサギ抗体である、請求項１１〜１８の１項に記載の方法。