JP2003530871A

JP2003530871A - インテグリン／接着因子アンタゴニスト

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Publication number: JP2003530871A
Application number: JP2001578464A
Authority: JP
Inventors: フアイゲ，ウルリツヒ; コウノ，タダヒコ; レイシー，デイビツド・リー; ブーン，トーマス・チヤールズ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2003-10-21
Also published as: US20020168363A1; WO2001081377A2; WO2001081377A3; EP1274730A2; CA2407086A1; MXPA02010351A; AU2001257174A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、インテグリン、セレクチン、細胞接着分子またはそれぞれの受容体のアンタゴニストとして作用するペプチド配列と、半減期を延長させるビヒクル、好ましくはＦｃドメインとの融合に関する。ビヒクルに結合させると、非結合のときにはｉｎｖｉｖｏで速やかに分解するペプチドの半減期が延長される。ペプチドは既存のペプチドでもよく、または、ファージディスプレー、大腸菌ディスプレー、リボソームディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的−ペプチドスクリーニングまたはその他の方法によって選択されたペプチドでもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）抗インテグリン活性を有している組換えられたまたは修飾された治療用物質が
要望されている。

【０００２】組換えタンパク質は新しいクラスの治療用物質である。このような組換え治療
学はタンパク質の製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及び化学的修飾に進歩をも
たらした。このような修飾は、主として治療用タンパク質がタンパク質分解酵素
に接触することをブロックすることによって治療用タンパク質を保護し得る。タ
ンパク質の修飾はまた、治療用タンパク質の安定性を改善し、循環時間を延長し
、生物活性を増加させる。タンパク質の修飾及び融合タンパク質について概説的
に記述している論文としてはＦｒａｎｃｉｓ（１９９２），ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ３：４−１０（Ｍｅｄｉｓｃｒｉｐｔ，Ｌｏｎ
ｄｏｎ）がある。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。

【０００３】有益な１つの修飾は抗体の“Ｆｃ”ドメインとの組合せである。抗体は機能的
に独立した２つの部分、即ち、抗原に結合する“Ｆａｂ”として知られた可変ド
メインと、補体活性化及び食細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関連す
る“Ｆｃ”ドメインとして知られた定常ドメインとを含む。Ｆｃは血清半減期が
長いが、Ｆａｂは寿命が短い。Ｃａｐｏｎら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ３３
７：５２５−３１。Ｆｃドメインを治療用タンパク質と組合せて構築したとき、
半減期を延長させたり、または、Ｆｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合
のような機能を組込んだりすることができ、また場合によっては、胎盤転移のよ
うな機能をも組込むことができるであろう。前出文献。当業界で使用されている
公知のＦｃ融合物を表１に要約する。

【０００４】

【表１】

【０００５】別の全く異なる治療用物質開発方法はペプチドライブラリースクリーニングで
ある。タンパク質リガンドとその受容体との相互作用はしばしば比較的大きいイ
ンターフェースで生じる。しかしながら、ヒト成長ホルモンとその受容体との場
合に判明したように、結合エネルギーの大半を与えるのはインターフェースの僅
か数個の基幹残基だけである。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３−６。タンパク質リガンドの嵩高さ（ｂｕｌｋ）は単に、正
しいトポロジーの結合エピトープを表しているか、または、結合に無関係な機能
を果たしている。従って、“ペプチド”の長さ（２−４０アミノ酸）しかない分
子が所与の大きいタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合できる。このよ
うなペプチドは大きいタンパク質リガンドの生物活性を模倣するか（“ペプチド
アゴニスト”）、または、競合的結合を介して大きいタンパク質リガンドの生物
活性を阻害し得る（“ペプチドアンタゴニスト”）。

【０００６】ファージディスプレーペプチドライブラリーはこのようなペプチドアゴニスト
及びペプチドアンタゴニストを同定する有力な方法として浮上した。例えば、Ｓ
ｃｏｔｔら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６；Ｄｅｖｌｉｎら（
１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４；１９９３年６月２９日許諾の米
国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日許諾の米国特許第５，７
３３，７３１号；１９９６年３月１２日許諾の米国特許第５，４９８，５３０号
；１９９５年７月１１日許諾の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８
月１６日許諾の米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日許諾の
米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開の国際特許ＷＯ
９６／４０９８７；１９９８年４月１６日公開の国際特許ＷＯ９８／１５８３３
参照（これらの文献は各々が参照によって本発明に含まれるものとする）。この
ようなライブラリーでは、ランダムなペプチド配列が繊維状ファージのコートタ
ンパク質との融合によってディスプレーされている。典型的には、ディスプレー
されたペプチドは、抗体に固定化された受容体の細胞外ドメインに親和溶出する
。親和精製及び増殖再開を連続的に繰り返すことによって保持されたファージを
濃縮し得る。最も結合性のペプチドを配列決定し、構造的に近縁の１つまたは複
数のペプチドファミリー内部の基幹残基を同定する。例えば、Ｃｗｉｒｌａら（
１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１６９６−９参照。該文献では、異なる
２つのファミリーが同定されている。ペプチド配列はまた、残基がアラニン走査
またはＤＮＡレベルの突然変異誘発によって安全に置換され得ることを示唆する
。最も優れた結合分子の配列をもっと最適化するために突然変異誘発ライブラリ
ーを作製してスクリーニングしてもよい。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４。

【０００７】複数の別の方法によりファージディスプレーと同等のペプチドを探索し得る。
ペプチドライブラリーはｌａｃリプレッサーのカルボキシ末端に融合し、大腸菌
中で発現され得る。大腸菌に基づく現在の方法では、ペプチドグリカン結合リポ
タンパク質（ＰＡＬ）に融合させることによって細胞の外膜にディスプレーさせ
得る。以後の記載では、これらの方法及び類縁の方法を集合的に“大腸菌ディス
プレー”と呼ぶ。可溶性ペプチド混合物をスクリーニングするための別の生物学
的方法は、発現及び分泌のために酵母を使用する。Ｓｍｉｔｈら（１９９３），Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３：７４１−８参照。以後の記載では、Ｓｍｉ
ｔｈらの方法及び類縁の方法を“酵母に基づくスクリーニング”と呼ぶ。一つの
方法では、リボソーム遊離の前にランダムＲＮＡの翻訳を停止させ、結合ＲＮＡ
の結合が維持されたポリペプチドのライブラリーを得る。以後の記載では、この
方法及び類縁の方法を集合的に“リボソームディスプレー”と呼ぶ。別の方法で
は、ＲＮＡに対するペプチドの化学的結合を使用する。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ
＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１２２９７−３０３参照。以後の記載では、この方法及び類縁の
方法を集合的に“ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング”と呼ぶ。ポリエチレンロッ
ドまたは溶媒透過性樹脂のような安定な非生物材料にペプチドが固定化されてい
る化学誘導ペプチドライブラリーも開発された。化学誘導ペプチドライブラリー
の別の例では、ガラススライドに固定化されたペプチドを走査するためにフォト
リソグラフィーを使用する。以後の記載では、これらの方法及び類縁の方法を集
合的に“化学的ペプチドスクリーニング”と呼ぶ。化学的ペプチドスクリーニン
グの利点は、Ｄ−アミノ酸及びその他の非天然類似体並びに非ペプチド要素を使
用し得ることである。生物学的方法及び化学的方法の双方はＷｅｌｌｓ＆Ｌ
ｏｗｍａｎ（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３
５５−６２に概説されている。

【０００８】既知の生物活性ペプチドの場合、有利な治療特性をもつ完全なペプチドリガン
ドが理論的設計によって得られる。このような方法では、ペプチド配列の段階的
変化を生じさせ、ペプチドの生物活性または予測された生物物理学的特性（例え
ば、溶液構造）に対する置換の効果を観察する。以後の記載ではこれらの技術を
集合的に“理論的設計”と呼ぶ。このような技術の１つでは、一度に１つの残基
をアラニンで置換しながら一連のペプチドを作製する。この技術は通常は“アラ
ニンウォーク”または“アラニン走査”と呼ばれている。２つの残基（連続する
残基または離間した残基）が置換されているときは、“ダブルアラニンウォーク
”と呼ぶ。生じたアミノ酸置換物を単独使用または組合せ使用すると、有利な治
療特性をもつ新規なペプチド完全体が得られる。

【０００９】また、大きいタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを推測するた
めにタンパク質−タンパク質相互作用の構造解析を使用してもよい。このような
解析では、大きいタンパク質リガンド中のペプチドの設計に必須である残基の種
類及び相対配向を結晶質構造から推測し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら（１
９９７），ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１５：１２６６−７０。以後の記載
では、これらの方法及び類縁の方法を“タンパク質構造解析”と呼ぶ。これらの
解析方法はまた、受容体タンパク質とファージディスプレーによって選択された
ペプチドとの間の相互作用を研究するために使用され、結合親和性を改善するた
めのペプチドの別の修飾を示唆し得る。

【００１０】概念的にはファージディスプレー及び上述のその他の方法を使用して任意のタ
ンパク質のペプチド模擬物を発見し得る。これらの方法は、エピトープマッピン
グのため、タンパク質−タンパク質相互作用に必須なアミノ酸を同定するため、
及び、新しい治療用物質の発見を先導する手段として使用されてきた。例えば、
Ｃｏｒｔｅｓｅら（１９９６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６
１６−２１。ペプチドライブラリーはエピトープマッピングのような免疫学的研
究で最も頻繁に使用されてきた。Ｋｒｅｅｇｅｒ（１９９６），ＴｈｅＳｃｉｅｎｔｉｓｔ１０（１３）：１９−２０。

【００１１】本発明では特に、インテグリン、セレクチン、細胞接着分子またはそれらの夫
々の受容体を阻害するペプチドを発見するためにペプチドライブラリー及びその
他の技術を使用することを考察する。当業界で同定された多くのこのようなペプ
チドを表２に要約する。ランダムに得られたペプチドについて、典型的にはイン
テグリンリガンド（例えばα４β１）の受容体に対する結合に基づいてペプチド
ライブラリーをスクリーニングした。本出願の目的に適うこれらの分子を集合的
に“インテグリン／接着因子アンタゴニスト”と呼ぶ。

【００１２】表２では、この表の左側の欄に示したタンパク質は対応ペプチドによって結合
されるかまたは対応ペプチドによって模倣される。ペプチドの構造及び活性は表
に挙げた刊行物に記載されている。各刊行物の記載内容全体が参照によって本発
明に含まれるものとする。中央の欄はペプチドの薬理学的活性を記述しており、
いくつかの場合にはその略称を括弧に入れて示している。

【００１３】

【表２】

【００１４】ペプチドライブラリースクリーニングによって同定されたペプチドは、治療用
物質自体ではなく、治療用物質を開発するための“先導手段”であると考えられ
てきた。別のタンパク質及びペプチドと同様に、これらのペプチドはｉｎｖｉ
ｖｏで腎濾過、細網内皮細胞系の細胞クリアランスメカニズムまたはタンパク質
溶解性分解によって速やかに除去されるであろう。Ｆｒａｎｃｉｓ（１９９２）
，ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ３：４−１１。それ故、
当業界の現状では、同定されたペプチドが正しい薬物ターゲットを確認するため
に使用されるか、または、化学的ライブラリースクリーニングで容易にまたは迅
速に同定できなかった有機化合物を設計する骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として使
用されている。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４；Ｋａｙら（１９９８），ＤｒｕｇＤｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ３：３７０−８。

【００１５】（発明の概要）本発明は、既知ペプチドの活性のようなインテグリンアンタゴニスト活性を改
善された医薬特性（例えば半減期）で有している治療用物質に関する。本発明に
よれば、このような化合物は、ａ．インテグリン／接着因子アンタゴニストペプチドと、ｂ．ポリマー（例えばＰＥＧまたはデキストラン）または好ましくはＦｃドメイ
ンのようなビヒクルと、から成り、化合物中でビヒクルがインテグリン／接着因子アンタゴニストに共有
結合している。ビヒクルとインテグリン／接着因子アンタゴニストとは後述する
ようにインテグリン／接着因子アンタゴニストのＮ末端またはＣ末端を介して結
合し得る。好ましいビヒクルはＦｃドメインであり、好ましいＦｃドメインはＩ
ｇＧＦｃドメインである。インテグリン／接着因子アンタゴニストは、ファー
ジディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング及び本文中に記載のその他の
技術によって製造され得る。

【００１６】本発明はまた、１つまたは複数の生物活性ペプチドのｉｎｖｉｖｏ半減期を
ビヒクルとの融合によって延長させる方法に関する。本発明においては、薬理学
的活性化合物を、（ａ）少なくとも１つのインテグリン／接着因子アンタゴニストペプチドを選択
する段階と、（ｂ）選択されたペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に共有結合した少な
くとも１つのビヒクルを含む薬理学的物質を製造する段階と、から成る方法によって製造する。

【００１７】好ましいビヒクルはＦｃドメインである。段階（ａ）でスクリーニングしたペ
プチドを好ましくはファージディスプレーライブラリー中で発現させる。ビヒク
ルとペプチドとは後述するようにペプチドまたはビヒクルのＮ末端またはＣ末端
を介して結合し得る。好ましいアンタゴニストドメインは後出の配列番号：７−
２１並びに表３、４及び５に記述したアミノ酸配列を含む。追加のアンタゴニス
トドメインは、理論的設計、酵母に基づくスクリーニング、理論的設計、タンパ
ク質の構造解析、ファージディスプレー及びＲＮＡ−ペプチドスクリーニングの
ような技術によって作製し得る。上記化合物の誘導体（後述）も本発明に包含さ
れる。

【００１８】本発明化合物は標準合成法、組換えＤＮＡ技術または他の何らかのペプチド及
び融合タンパク質の製造方法によって製造し得る。非ペプチド部分を含む本発明
化合物は、標準有機化学反応を標準ペプチド化学反応に適宜組合わせて合成し得
る。

【００１９】考えられる主な用途は治療用または予防用の物質である。ビヒクルに結合した
ペプチドは天然リガンドまたは既知のペプチドと同等であるかまたはそれ以上に
もなり得る活性を有している。更に、天然リガンドを主体とする治療用物質は、
患者自身の内因性リガンドに対する抗体を誘発するであろう。ビヒクルに結合し
たペプチドは、天然リガンドとの配列一致が殆どないかまたは典型的には全くな
いのでこのような危険が避けられる。

【００２０】本発明化合物は適当な医薬用担体材料と共に製剤化され、治療を要するヒト（
または別の哺乳動物）のような患者に有効量を投与することによって治療目的ま
たは予防目的で使用され得る。関連するその他の特徴も本発明に包含される。

【００２１】本発明の多くのその他の特徴及び利点は図面及び発明の詳細な説明から明らか
であろう。

【００２２】（図面の簡単な説明）図１は、ＩｇＧ１抗体から誘導され得る代表的なＦｃダイマーを示す。図中の
“Ｆｃ”は本文中の“Ｆｃドメイン”の意味に包含されるＦｃ変異体のいずれか
を表す。“Ｘ^１”及び“Ｘ^２”は、以後に本文中で定義するようなペプチドまた
はリンカー−ペプチド組合せを表す。個々のダイマーを以下に説明する：Ａ、Ｄ：１つのジスルフィド結合で結合されたダイマー。ＩｇＧ１抗体は典型的
には定常ドメインと可変ドメインとの間のヒンジ領域に２つのジスルフィド結合
を有している。図２Ａ及び２Ｄ中のＦｃドメインは、２つのジスルフィド結合部
位の欠損によって形成されるかまたはシステイニル残基を非反応性残基（例えば
アラニル）で置換することによって形成される。図２ＡではＦｃドメインがペプ
チドのアミノ末端に結合している。図２ＤではＦｃドメインがカルボキシ末端に
結合している。Ｂ、Ｅ：２つのジスルフィド結合で結合されたダイマー。このＦｃドメインは、
Ｆｃドメイン鎖の２つのシステイニル残基を保持する親抗体の欠損によって形成
されるかまたはこのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物からの発
現によって形成される。図２ＢではＦｃドメインがペプチドのアミノ末端に結合
している。図２ＥではＦｃドメインがカルボキシ末端に結合している。Ｃ、Ｆ：非共有結合ダイマー。このＦｃドメインは欠損または置換によってシス
テイニル残基を除去することによって形成され得る。これらのシステイニル残基
と宿主細胞中に存在する別のタンパク質のシステイニル残基との反応によって不
純物が形成されることを防止するためにシステイニル残基の除去が望ましいであ
ろう。Ｆｃドメインの非共有結合はダイマーを十分に相互保持する。異なるタイプの抗体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）に由来のＦｃドメインを使用す
ることによって別のダイマーを形成してもよい。

【００２３】図２は、薬理学的に活性のペプチドのタンデム反復配列を特徴とする本発明の
好ましい化合物の構造を示す。図２Ａは、一本鎖分子を示し、また分子のＤＮＡ
構築物を表す。図２Ｂは、リンカー−ペプチド部分がダイマーの１つの鎖だけに
存在するダイマーを示す。図２Ｃは、双方の鎖にペプチド部分を有するダイマー
を示す。幾つかの宿主細胞では図２Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡが発現す
るときに図２Ｃのダイマーが自然に形成されるであろう。別の宿主細胞では、ダ
イマーの形成に有利な条件下に細胞を維持できる。または、ダイマーをｉｎｖ
ｉｔｒｏで形成できる。

【００２４】図３は、本発明に使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの代表的な核酸配列及びアミ
ノ酸配列（それぞれ配列番号：１及び２）を示す。

【００２５】図４Ａ及び４Ｂは、固相結合アッセイでエキスタチン−Ｆｃがヒトαｖβ３に
高い親和性で結合することを示す。このアッセイは実施例１でより詳細に後述す
る。

【００２６】図５Ａ及び５Ｂは、エキスタチン−ＦｃがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するルテ
ニウム標識ヒトフィブリノーゲン（フィブリノーゲン−ｒｕ）の結合を阻害する
ことを示す。これらの実験は実施例１でより詳細に後述する。

【００２７】（詳細な説明）用語の定義本明細書に使用した用語は特殊な場合に異なる定義によって限定されていない
限り以下のように定義される。

【００２８】 “含む”という用語は、化合物が所与の配列のＮ末端またはＣ末端の一方また
は双方に追加のアミノ酸を含み得ることを意味する。勿論、これらの追加のアミ
ノ酸が化合物の活性に有意に干渉してはならない。

【００２９】 “ビヒクル”という用語は、治療用タンパク質の分解の防止、及び／または、
半減期の延長、毒性の低減、免疫原性の低減または生物活性の増加に役立つ分子
を意味する。代表的なビヒクルは、Ｆｃドメイン（好ましいビヒクルである）、
直鎖状ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デ
キストラン、など）；分枝状ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日許諾のＤ
ｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月
２０日許諾のＴａｍの米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８
日公開のＦｒｅｃｈｅｔらの国際特許ＷＯ９３／２１２５９参照）；脂質；コレ
ステロール群（例えばステロイド）；糖質またはオリゴ糖；または、サルベージ
受容体に結合する任意の天然または合成のタンパク質、ポリペプチドまたはペプ
チドである。ビヒクルに関してはより詳細に後述する。

【００３０】 “天然型Ｆｃ”という用語は、モノマー形態であるかマルチマー形態であるか
に関わりなく、完全抗体の消化によって得られた抗原非結合性フラグメントの配
列を含む分子または配列を意味する。天然型Ｆｃの出発免疫グロブリンのソース
は好ましくはヒト起原であり、どの免疫グロブリンでもよいが、ＩｇＧ１及びＩ
ｇＧ２が好ましい。天然型Ｆｃは、共有結合（即ちジスルフィド結合）的及び非
共有結合的な結合によってダイマー形態またはマルチマー形態に結合し得るモノ
マーポリペプチドから構成され得る。天然型Ｆｃ分子のモノマーサブユニット間
の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）ま
たはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２
）次第で１−４個の範囲である。天然型Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化に
よって得られたジスルフィド結合ダイマーである（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２
），ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：４０７１−９）。本文中で使
用された“天然型Ｆｃ”という用語はモノマー、ダイマー及びマルチマーの形態
を包含する上位概念を表す。

【００３１】 “Ｆｃ変異体”という用語は、天然型Ｆｃからは変異しているが、サルベージ
受容体ＦｃＲｎに対する結合部位を維持している分子または配列を意味する。国
際特許出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）及びＷＯ９６／
３２４７８は、代表的なＦｃ変異体及びそれらとサルベージ受容体との相互作用
を記載しており、参照によって本発明に含まれるものとする。従って“Ｆｃ変異
体”という用語は、ヒト以外の天然型Ｆｃからヒト化された分子または配列を包
含する。更に、天然型Ｆｃは、本発明の融合分子に不要な構造的特徴または生物
活性を与えるので除去したほうがよい部位を含んでいる。従って、“Ｆｃ変異体
”という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞と
の不適合性、（３）選択された宿主細胞中で発現したときのＮ末端不均一性、（
４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦ
ｃ受容体との結合、または、（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を
及ぼすかまたは関与する１つまたは複数の天然型Ｆｃ部位または残基が欠如した
分子または配列を意味する。Ｆｃ変異体に関しては更に詳細に後述する。

【００３２】 “Ｆｃドメイン”という用語は、上記に定義のような天然型Ｆｃ及びＦｃ変異
体の分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然型Ｆｃの定義の場合と同様に
、“Ｆｃドメイン”という用語は、完全抗体から消化されたかまたは別の手段に
よって産生されたかに関わりなく、モノマー形態またはマルチマー形態の分子を
包含する。

【００３３】ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に使用された“マルチマー”とい
う用語は、分子に２個またはそれ以上のポリペプチド鎖が共有結合的もしくは非
共有結合的に結合しているかまたは共有結合と非共有結合との双方の相互作用に
よって結合しているような分子を意味する。ＩｇＧ分子は典型的にはダイマーを
形成し、ＩｇＭはペンタマーを形成し、ＩｇＤはダイマーを形成し、ＩｇＡはモ
ノマー、ダイマー、トライマーまたテトラマーを形成する。マルチマーは、Ｆｃ
の天然型Ｉｇソースの配列及び得られる活性を使用することによって、または、
このような天然型Ｆｃを（後述する手順で）誘導体化することによって形成し得
る。

【００３４】ＦｃドメインまたはＦｃドメインを含む分子に使用された“ダイマー”という
用語は、共有結合的または非共有結合的に結合した２つのポリペプチドを有する
分子を意味する。従って本発明の範囲内の代表的なダイマーは図１に示すダイマ
ーである。

【００３５】 “誘導体化する”、“誘導体”または“誘導体化された”という用語は、以下
の（１）−（６）にそれぞれ該当する化合物を得る方法及び得られた化合物を意
味する：（１）化合物が環状部分を有している；例えば、化合物内部で複数のシ
ステイニル残基が互いに架橋している；（２）化合物が架橋しているかまたは架
橋部位を有している；例えば、化合物がシステイニル残基を有しており従って培
養物中またはｉｎｖｉｖｏで架橋ダイマーを形成している；（３）１つまたは
複数のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置換されている；（４）Ｎ末
端が−ＮＲＲ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ^１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基、または、置換もしくは未置
換のベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−で置換されており、ここにＲ及びＲ^１と
環置換基とは以後の本文中に同義されている；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２ま
たは−ＮＲ^３Ｒ^４で置換されており、ここにＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４は以後の本文中
に定義されている；（６）選択された側鎖または末端残基と反応し得る物質で処
理することによって化合物の個々のアミノ酸部分が修飾されている。誘導体に関
してはより詳細に後述する。

【００３６】 “ペプチド”という用語は、２−６０アミノ酸、好ましくは３−２０アミノ酸
、最も好ましくは６−１５アミノ酸から成る分子を意味する。代表的なペプチド
は、上記に引用した方法のいずれかによってランダムに製造されるか、ペプチド
ライブラリー（例えばファージディスプレーライブラリー）に含まれているか、
または、タンパク質の消化によって得られる。

【００３７】ペプチド配列に関して使用された“ランダム化”という用語は、完全ランダム
配列（例えばファージディスプレー法によって選択される）及び天然産生分子の
１つまたは複数の残基が天然産生分子の同じ位置に出現しないアミノ酸残基によ
って置換された配列を意味する。ペプチド配列の代表的な同定方法は、ファージ
ディスプレー、大腸菌ディスプレー、酵母に基づくスクリーニング、リボソーム
ディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、理論
的設計、タンパク質の構造解析、などである。

【００３８】 “薬理学的に活性の”という用語は、このように記述された物質が医療パラメ
ーター（例えば血圧、血算、コレステロールレベル）または病態（例えば癌、自
己免疫疾患）に影響を及ぼす活性を有すると判断されることを意味する。従って
、薬理学的に活性のペプチドは以下に定義するようなアゴニストペプチドまたは
模擬ペプチド及びアンタゴニストペプチドを包含する。

【００３９】 “アンタゴニストペプチド”または“インヒビターペプチド”という用語は、
結合対象タンパク質の生物活性を阻止するかまたは何らかの方法で妨害するペプ
チド、あるいは、結合対象タンパク質の既知のアンタゴニストまたはインヒビタ
ーと同等の生物活性を有しているペプチドを意味する。

【００４０】 “インテグリン／接着因子アンタゴニスト”という用語は、インテグリン、セ
レクチン、細胞接着分子、インテグリン受容体、セレクチン受容体または細胞接
着分子の受容体の活性を阻害するかまたは下方調節するペプチドを意味する。代
表的なインテグリン／接着因子アンタゴニストは、ラミニン、エキスタチン、以
後の記載で配列番号：７−２１で記述されるペプチド、後出の表３、４及び５の
ペプチド、表２の参考文献に記載のペプチドである。当業者がこれらの各々を参
照し、開示された手順に従って種々のペプチドライブラリーを処理することによ
って本文中に実際に開示されたペプチド以外のペプチドを選択し得ることは平均
的な当業者に理解されるであろう。

【００４１】更に、本発明化合物の生理的に許容される塩も本発明に包含される。“生理的
に許容される塩”という用語は、医薬として許容されることが判明していたかま
たは後から判明した任意の塩を意味する。幾つかの特定例としては、酢酸塩、ト
リフルオロ酢酸塩、塩酸塩及び臭化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、並び
に、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、シュウ酸塩がある。

【００４２】化合物の構造概論本発明に従って製造される物質組成物中で、ペプチドはペプチドのＮ末端また
はＣ末端を介してビヒクルに結合され得る。従って、本発明のビヒクル−ペプチ
ド分子は以下の式Ｉによって記述できる：（Ｘ^１）_ａ−Ｆ^１−（Ｘ^２）_ｂ〔式中、Ｆ^１はビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり、Ｘ^１及びＸ^２は各々が独立に−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３、及び
、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４、から選択され、Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々が独立にインテグリン／接着因子アンタゴニス
トペプチドの配列であり、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３及びＬ^４は各々が独立にリンカーであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各々が独立に０または１を表し、但し、ａ及びｂの
少なくとも一方が１である〕。

【００４３】従って式Ｉの化合物は、式ＩＩＸ^１−Ｆ^１〔式中、Ｆ^１はＦｃドメインでありＸ^１のＣ末端に結合している〕の好ましい化
合物及びそのマルチマー、式ＩＩＩＦ^１−Ｘ^２〔式中、Ｆ^１はＦｃドメインでありＸ^２のＮ末端に結合している〕の好ましい化
合物及びそのマルチマー、式ＩＶＦ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１〔式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１のＮ末端に結合している
〕の好ましい化合物及びそのマルチマー、式ＶＦ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２〔式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり−Ｌ^１−Ｐ^１−Ｌ^２−Ｐ^２のＮ末端に結合し
ている〕の好ましい化合物及びそのマルチマーを含む。

【００４４】ペプチド任意の数のインテグリン／接着因子アンタゴニストペプチドを本発明と共に使
用し得る。腫瘍ホーミングペプチド、細胞型特異的ペプチドなどのようなターゲ
ッティングペプチドも対象となる。これらのクラスのペプチドはいずれも本明細
書に引用した参考文献及びその他の参考文献に記載された方法によって見出すこ
とができる。

【００４５】ファージディスプレーは本発明に使用し得るペプチドを製造するために特に有
用である。ランダムペプチドのライブラリーからの親和選択が任意の遺伝子産物
の任意の部位のペプチドリガンドを同定するために使用できることは明記されて
いた。Ｄｅｄｍａｎら（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０
２５−３０。ファージディスプレーは細胞表面受容体のような対象タンパク質ま
たは直鎖状エピトープを有する任意のタンパク質に結合するペプチドを同定する
ために特に好適である。Ｗｉｌｓｏｎら（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙら（１９９８），ＤｒｕｇＤｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ３：３７０−８。このようなタンパク質に関しては、Ｈｅｒｚら（
１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＆ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＲｅｓ．１７（５）：６７１−７７６に広く概説されている。該文献は参
照によって本発明に含まれるものとする。このような対象タンパク質は本発明で
好ましく使用される。

【００４６】本発明によるペプチド製造のターゲットとして特定される対象タンパク質はイ
ンテグリン、接着分子、及び、インテグリンもしくは接着分子の受容体である（
例えばαｖβ３、αＶβ１）。

【００４７】本発明で使用するために特に有益なペプチドは、配列：ＹＩＧＳＲ（配列番号：７）をもつラミニン、配列：ＥＣＥＳＧＰＣＣＲＮＣＫＦＬＫＥＧＴＩＣＫＲＡＲＧＤＤＭＤＤＹＣＮ
ＧＫＴＣＤＣＰＲＮＰＨＫＧＰＡＴ（配列番号：８）をもつエキスタチン、配列ＲＸ１ＥＴＸ２ＷＸ３（配列番号：９）配列ＲＸ１ＥＴＸ２ＷＸ３（配列番号：１０）配列ＣＸ１Ｘ２ＲＬＤＸ３Ｘ４Ｃ（配列番号：１１）配列ＣＸＸＲＧＤＣ（配列番号：１２）配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６（配列番号：１３）配列ＣＸ２ＣＲＧＤＣＸ５Ｃ（配列番号：１４）配列Ｘ１Ｘ２ＤＤＸ４Ｘ５Ｘ７Ｘ８（配列番号：１５）配列Ｘ１Ｘ２ＸＤＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号：１６）をもつＲＧＤ、ＮＧＲ及びそれらの誘導体である。配列中の置換基Ｘ_１、Ｘ_２、
Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７及びＸ_８は、１９９５年６月１日公開の国際特許
出願ＷＯ９５／１４７１４及び１９９７年３月６日公開のＷＯ９７／０８２０３
に定義されている。これらの特許出願は参照によって本発明に含まれるものとす
る。

【００４８】また、式ＲＫＸＮＸＸＷＴＷＶＧＴＸＫＸＬＴＥＥ（配列番号：１７）ＣＸＸＸＹＴＸＬＶＡＩＱＮＫＸＥ（配列番号：１８）ＲＫＸＸＸＸＷＸＷＶＧＴＸＫＸＬＴＸＥ（配列番号：１９）ＡＸＮＷＸＸＸＥＰＮＮＸＸＸＥＤ（配列番号：２０）ＸＫＸＫＴＸＥＡＸＮＷＸＸ（配列番号：２１）を有しているビンキュリン結合ペプチド及びセレクチンアンタゴニストペプチド
も本発明で使用するために特に有益なペプチドである。式中の“Ｘ”は天然産生
の任意のアミノ酸残基を意味する。

【００４９】代表的な本発明のペプチドを以下の表３、４、５及び６に示す。これらのペプ
チドは当業界で開示されている方法によって製造できる。アミノ酸の１文字略号
を使用している。これらの配列中（及び、特殊な例で異なる定義が明記されてい
ない限り本明細書全体中）のＸは、２０個の天然産生アミノ酸残基のいずれが存
在してもよいことを意味する。これらのペプチドのいずれかはリンカーを介在さ
せるかまたは介在させずに、同じ配列または異なる配列のペプチドとタンデム（
即ち順次的に）結合し得る。システイニル残基を含有するペプチドは別のＣｙｓ
含有ペプチドと架橋し得る。これらのペプチドの一方または双方がビヒクルに結
合し得る。架橋ペプチドの少数の例が表に示されている。２個以上のＣｙｓ残基
を有するペプチドはまた、ペプチド内ジスルフィド結合を形成し得る。“配列番
号”の欄の“ＮＲ”は所与の配列に対する配列表を示すことが全く不要であるこ
とを意味する。

【００５０】

【表３】

【００５１】

【表４】

【００５２】

【表５】

【００５３】

【表６】

【００５４】ビヒクル本発明では、いずれか１つのアミノ酸残基のＮ末端、Ｃ末端または側鎖を介し
てペプチドに結合した少なくとも１つのビヒクル（Ｆ^１、Ｆ^２）の存在が必要で
ある。複数のビヒクルを使用してもよい。例えば、各末端にＦｃ′が存在しても
よく、または、１つの末端にＦｃが存在し、他方の末端もしくは側鎖にＰＥＧ基
が存在してもよい。

【００５５】好ましいビヒクルはＦｃドメインである。ＦｃドメインはペプチドのＮ末端も
しくはＣ末端に融合してもよくまたはＮ末端及びＣ末端の双方に融合してもよい
。ＴＰＯ−模擬ペプチドの場合、分子のペプチド部分のＮ末端に融合したＦｃド
メインを有している分子は別の融合物よりも生物活性が大きい。従って、融合は
Ｎ末端で生じるのが好ましい。

【００５６】上記に指摘したように、Ｆｃ変異体は本発明の範囲内の適当なビヒクルである
。サルベージ受容体との結合性が維持されているという条件付で、本発明のＦｃ
変異体を形成するために天然型Ｆｃを広範囲に修飾し得る。例えばＷＯ９７／３
４６３１及びＷＯ９６／３２４７８参照。このようなＦｃ変異体では、本発明の
融合分子に不要な構造的特徴または機能的活性を与える１つまたは複数の部位を
天然型Ｆｃから除去してもよい。これらの部位は例えば、残基を置換もしくは欠
失させる、該部位に残基を挿入する、または、該部位を含む部分を欠損させる、
などによって除去し得る。挿入または置換された残基は、ペプチド模擬体または
Ｄ−アミノ酸のような改造アミノ酸でもよい。多くの理由からＦｃ変異体が望ま
しい。幾つかの理由については後述する。代表的なＦｃ変異体としては以下のよ
うな分子及び配列がある。

【００５７】１．ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去された分子及び配列。このよ
うな除去によって、本発明の分子を産生させるために使用した宿主細胞中に存在
する別のシステイン含有タンパク質との反応を回避し得る。このような除去のた
めには、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを欠損させるか、または、システイ
ン残基を欠失させるかもしくは別のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置
換するとよい。より特定的には、配列番号：２のＮ末端の２０アミノ酸のセグメ
ントを欠損させるか、または、配列番号：２の７位及び１０位のシステイン残基
を欠失もしくは置換させるとよい。システイン残基が除去されていても、一本鎖
Ｆｃドメインは、非共有結合的に相互保持されるダイマーＦｃドメインを形成す
る能力を維持している。

【００５８】２．選択された宿主細胞に対する適合性を増すように天然型Ｆｃが修飾された
分子及び配列。例えば、典型的な天然型ＦｃのＮ末端近傍のＰＡ配列を除去して
もよい。ＰＡ配列はプロリンイミノペプチダーゼのような大腸菌中の消化酵素に
よって認識され得る。また、特に分子が大腸菌のような細菌宿主中で組換え発現
されるときには、Ｎ末端メチオニン残基を付加してもよい。配列番号：２（図３
）のＦｃドメインはこのようなＦｃ変異体の１つである。

【００５９】３．選択された宿主細胞中で発現されたときのＮ末端不均一性を防止するため
に天然型ＦｃのＮ末端の一部分が除去された分子及び配列。このような除去のた
めには、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び
５位のアミノ酸残基を欠失させるとよい。

【００６０】４．１つまたは複数のグリコシル化部位が除去された分子及び配列。典型的に
グリコシル化された残基（例えばアスパラギン）は細胞溶解レスポンスを与える
であろう。このような残基は欠失させるかまたは非グリコシル化残基（例えばア
ラニン）によって置換するとよい。

【００６１】５．Ｃｌｑ結合部位のような補体との相互作用に関与する部位が除去された分
子及び配列。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるかまたは置換する
とよい。補体リクルートメントは本発明の分子には有利でない。従ってこのよう
なＦｃ変異体には避けたほうがよい。

【００６２】６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体に対する結合に影響を及ぼす部位が除
去された分子及び配列。天然型Ｆｃは本発明の融合分子に必要でないある種の白
血球に相互作用する部位を有しているので、このような部位は除去するとよい。

【００６３】７．ＡＤＣＣ部位が除去された分子及び配列。ＡＤＣＣ部位は当業界で公知で
ある。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関してはＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照するとよい。これらの部位はま
た本発明の融合分子にも不要なので除去するとよい。

【００６４】８．天然型Ｆｃがヒト以外の抗体に由来する場合、天然型Ｆｃをヒト化すると
よい。典型的には、天然型Ｆｃをヒト化するために、ヒト以外の天然型Ｆｃ中の
選択された残基をヒトの天然型Ｆｃに普通に見出される残基で置換する。抗体ヒ
ト化技術は当業界で公知である。

【００６５】好ましいＦｃ変異体は以下の置換を含む。配列番号：２（図３）では、１５位
のロイシンがグルタメートによって、９９位のグルタミンがアラニンによって、
１０１位及び１０３位のリシンがアラニンによって置換されている。更に、１つ
または複数のチロシン残基がフェニルアラニン残基によって置換され得る。

【００６６】代替的なビヒクルは、サルベージ受容体に結合する能力をもつタンパク質、ポ
リペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメントまたは小分子（例えばペプチド
模擬化合物）であろう。例えば、１９９８年４月１４日に許諾されたＰｒｅｓｔ
ａらの米国特許第５，７３９，２７７号に記載のようなポリペプチドをビヒクル
として使用し得る。ペプチドはまた、ＦｃＲｎサルベージ受容体に結合させるフ
ァージディスプレーによって選択できる。このようなサルベージ受容体結合化合
物も“ビヒクル”に含意されるので本発明の範囲内である。このようなビヒクル
は半減期の延長に基づいて（例えばプロテアーゼによって認識される配列を避け
ることによって）、及び、免疫原性の低減に基づいて（例えば抗体ヒト化で見出
されたような非免疫原性配列を利用することによって）選択されるべきである。

【００６７】上記に指摘したように、ポリマービヒクルもＦ^１及びＦ^２に使用し得る。ビヒ
クルとして有用な化学的部分を結合させるために公然と利用できる種々の手段が
存在する。例えば、“Ｎ−ＴｅｒｍｉｎａｌｌｙＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＭｏ
ｄｉｆｉｅｄＰｒｏｔｅｉｎＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓａｎｄＭｅｔｈ
ｏｄｓ，”という名称のＰａｔｅｎｔＣｏｏｐｅｒａｔｉｏｎＴｒｅａｔｙ
（“ＰＣＴ”）国際公開ＷＯ９６／１１９５３参照。該文献の記載内容全部が参
照によって本発明に含まれるものとする。このＰＣＴ公開は特に、タンパク質の
Ｎ末端に対する水溶性ポリマーの選択的結合を開示している。

【００６８】好ましいポリマービヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥ
Ｇ基は好都合な任意の分子量を有していればよく、直鎖状でも分枝状でもよい。
ＰＥＧの平均分子量は好ましくは約２キロダルトン（“ｋＤ”）から約１００ｋ
Ｄａの範囲、より好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲、最も好ましく
は約５ｋＤａから約１０ｋＤａの範囲であろう。ＰＥＧ基は一般に本発明化合物
の反応性基（例えばアルデヒド、アミノまたはエステル基）に対するＰＥＧ部分
の反応性基（例えばアルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）によるア
シル化または還元性アルキル化を介して本発明の化合物に結合されるであろう。

【００６９】合成ペプチドをＰＥＧ化するために有効な戦略は、互いに反応性の特定官能基
を各々が有しているペプチドとＰＥＧ部分とを溶液中で複合連鎖を形成すること
によって組合せることから成る。ペプチドは慣用の固相合成によって容易に製造
できる（例えば図５及び図６とこれらの図面に関する本文中の説明参照）。ペプ
チドを特定部位の適当な官能基によって“プレ活性化”する。ＰＥＧ部分と反応
させる前に、前駆物質を精製し完全に特性決定する。ペプチドとＰＥＧとの結合
は通常は水相中で行い、逆相分析用ＨＰＬＣによって容易にモニターできる。Ｐ
ＥＧ化したペプチドは分取用ＨＰＬＣによって容易に精製でき、分析用ＨＰＬＣ
、アミノ酸解析及びレーザー脱着質量分析法によって特性決定できる。

【００７０】タンパク質修飾のために使用し得る別の種類の水溶性ポリマーは多糖ポリマー
である。デキストランは、主としてα１−６連鎖によって結合されたグルコース
の個別サブユニットから成る多糖ポリマーである。デキストラン自体は多くの分
子量範囲で入手でき、約１ｋＤ−約７０ｋＤの分子量で容易に入手できる。デキ
ストランは本発明でビヒクルとして使用し得る適当な水溶性ポリマーであり、単
独で使用してもよくまたは別のビヒクル（例えばＦｃ）と併用してもよい。例え
ば国際特許ＷＯ９６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９参照。治療用または
診断用の免疫グロブリンに複合化したデキストランの使用は報告されていた。例
えば、欧州特許公開０３１５４５６参照。該文献は参照によって本発明に含
まれる。デキストランを本発明によるビヒクルとして使用するときは約１ｋＤ−
約２０ｋＤのデキストランが好ましい。

【００７１】リンカー “リンカー”基は随意選択である。リンカーが存在するとき、リンカーは主と
してスペーサーとして機能するのでその化学構造を厳密に限定しなくてもよい。
リンカーは好ましくは、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸から構
成される。従って、好ましい実施態様では、ペプチド結合によって結合した１−
２０個のアミノ酸からリンカーを構成し、これらのアミノ酸は２０種類の天然産
生アミノ酸から選択する。当業者には容易に理解されるであろうが、これらのア
ミノ酸の幾つかはグリコシル化されていてもよい。より好ましい実施態様では、
１−２０個のアミノ酸を、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グル
タミン及びリシンから選択する。もっと好ましくは、リンカーを構成するアミノ
酸の大半をグリシン及びアラニンのような立体障害のないアミノ酸から構成する
。従って、好ましいリンカーはポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）_４、（Ｇｌｙ）_５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーのその他の特定
例は、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号：３）（Ｇｌｙ）_３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）_２（配列番号：４）（Ｇｌｙ）_３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）_４（配列番号：５）及びＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号：６）である。上記の命名法を説明すると、例えば、（Ｇｌｙ）_３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）_４はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味す
る。ＧｌｙとＡｌａとの組合せも好ましい。ここに示したリンカーは代表例であ
る。より長いリンカーまたは別の残基を含むリンカーも本発明の範囲に包含され
る。

【００７２】非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_Ｓ−Ｃ（Ｏ）
−〔ここに、ｓ＝２−２０〕のようなアルキルリンカーも使用できる。これらの
アルキルリンカーが更に、低級アルキル（例えばＣ_１−Ｃ_６）、低級アシル、ハ
ロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ_２、フェニルなどのような立体障害さ
れない基によって置換されていてもよい。代表的な非ペプチドリンカーは式ＶＩ
：

【００７３】

【化１】〔式中、ｎはリンカーが分子量１００−５０００ｋＤ、好ましくは１００−５０
０ｋＤを有するような値である〕のＰＥＧリンカーである。ペプチドリンカーが
誘導体を形成するようにペプチドリンカーを上記と同様にして改造してもよい。

【００７４】誘導体本発明の発明者はまた、化合物のペプチド及び／またはビヒクル部分の誘導体
化を考察する。このような誘導体は化合物の溶解度、吸収性、生物学的半減期な
どを改善し得る。これらの部分は化合物の望ましくない副作用などを選択的に除
去するかまたは減衰させるであろう。代表的な誘導体としては以下の化合物があ
る。１．化合物またはその何処かの部分が環状である。例えば、ペプチド部分が、ジ
スルフィド結合によって環化し得る２個またはそれ以上のＣｙｓ残基を（例えば
リンカー中に）含むように修飾されてもよい。環化誘導体の製造に関する参考文
献の引用としては表２を参照するとよい。２．化合物が架橋されているかまたは分子間架橋できるようになっている。例え
ば、ペプチド部分が１個のＣｙｓ残基を含むように修飾しこれによって同種分子
と分子間ジスルフィド結合を形成できるようにしてもよい。また、以下の式ＶＩ
Ｉ：

【００７５】

【化２】に示す分子のように化合物がそのＣ末端を介して架橋してもよい。３．４．１つまたは複数のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連鎖（結合）が非ペプチ
ジル連鎖によって置換されている。代表的な非ペプチジル連鎖は−ＣＨ_２−、カ
ーバメート［−ＣＨ_２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ_２−スルホ
ンアミド［−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ−］、ウレア［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、
−ＣＨ_２−第二級アミン及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ^６−］である
。ここにＲ^６は低級アルキルを表す。５．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端をアシル化するかまたは
修飾して置換アミンにする。代表的なＮ末端誘導体基は、−ＮＲＲ^１（−ＮＨ_２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ^１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ^１、−ＮＲＳ（Ｏ）_２Ｒ１、
−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ^１、スクシンイミドまたはベンジルオキシカルボニル−Ｎ
Ｈ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）である。ここにＲ及びＲ^１の各々は独立に水素または低
級アルキルを表し、フェニル環は、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ
、クロロ及びブロモから成るグループから選択された１−３個の置換基で置換さ
れていてもよい。６．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端をエステル化または
アミド化する。例えば、当業界に記載の方法を使用してＣ末端に配列番号：５０
４−５０８のいずれかを有している本発明の化合物に（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−
ＮＨ_２）_２を付加してもよい。同じく当業界に記載の方法を使用して、Ｃ末端に
配列番号：９２４−９５５、９６３−９７２、１００５−１０１３または１０１
８−１０２３のいずれかを有している本発明の化合物に−ＮＨ_２を付加してもよ
い。代表的なＣ末端誘導体基として例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ^２〔ここにＲ^２は低級
アルコキシ〕または−ＮＲ^３Ｒ^４〔ここにＲ^３及びＲ^４は独立に水素またはＣ_１ −Ｃ_８アルキル（好ましくはＣ_１−Ｃ_４アルキル）〕がある。７．ジスルフィド結合を別の、好ましくはより安定な架橋部分（例えばアルキレ
ン）で置換する。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９９３）ＴｈｉｒｔｅｅｎｔｈＡｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９参照。８．１つまたは複数の個別アミノ酸残基を修飾する。詳細に後述するように、種
々の誘導体化剤は選択された側鎖または末端残基と特異的に反応することが知ら
れている。

【００７６】リシニル残基及びアミノ末端残基は、コハク酸無水物またはリシニル残基の電
荷を反転させる別のカルボン酸無水物と反応し得る。アルファ−アミノ含有残基
を誘導体する別の適当な試薬は、メチルピコリンイミデートのようなイミドエス
テル；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；クロロボロヒドレート；トリ
ニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオンで
あり、また、トランスアミナーゼに触媒されるグリオキサレートとの反応も使用
できる。

【００７７】アルギニル残基は、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−
シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンのような複数の慣用の試薬のいずれか１
つまたは組合せと反応させることによって修飾し得る。アルギニル残基を誘導体
化するためには、グアニジン官能基が高いｐＫａを有しているので、反応をアル
カリ性条件下で行わせることが必要である。更に、これらの試薬はリシンのグル
ープ及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。

【００７８】特にチロシル残基の修飾に関しては広く研究されており、芳香族ジアゾニウム
化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトルラベルをチロシル
残基に導入する方法が特に注目されている。Ｎ−アセチルイミダゾール及びテト
ラニトロメタンを使用してそれぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導
体を形成する方法が最も知られている。

【００７９】カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルホリニル）−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチ
ル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのような
カルボジイミド（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）との反応によって選択的に修飾され
得る。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反
応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換され得る。

【００８０】グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は脱アミド化によって対応するグル
タミル残基及びアスパルチル残基にできる。あるいは、これらの残基を弱酸性条
件下で脱アミド化してもよい。これらの残基の双方の形態が本発明の範囲に包含
される。

【００８１】ジスルフィド結合の形成を排除するためまたは逆に架橋の形成を安定させるた
めシステイニル残基をアミノ酸残基または別の部分によって置換できる。例えば
、Ｂｈａｔｎａｇａｒら（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４
−９参照。

【００８２】二官能性物質による誘導体化は、ペプチドまたはそれらの官能誘導体を水不溶
性支持マトリックスまたは別の巨大分子ビヒクルに架橋するために有効である。
常用の架橋剤は例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン
、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４
−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能イミドエステル類、例えば、３，
３′−ジチオチビス（スクシニミジルプロピオネート）のようなジスクシニミジ
ルエステル類、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能マレイ
ミド類である。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデ
ートのような誘導体化剤は光の存在下で架橋を形成し得る光活性化性の中間体を
生じる。あるいは、シアノゲンブロミド活性化糖質のような反応性の水不溶性マ
トリックスと米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４
，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号及び第
４，３３０，４４０号に記載されているような反応性基質とを使用してタンパク
質を固定化する。

【００８３】糖質（オリゴ糖）基はタンパク質中のグリコシル化部位であることが判明して
いる部位に好都合に結合し得る。一般に、Ｏ結合オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）残
基またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、Ｎ結合オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−
Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ〔ここに、Ｘはプロリン以外のいかなるアミノ酸でもよい〕
の一部を構成しているアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは好ましくは
１９種類の天然産生アミノ酸のうちのプロリン以外の１つである。Ｎ結合オリゴ
糖及びＯ結合オリゴ糖の構造及びそれぞれに見出される糖残基は異なっている。
双方に共通に見出される１種類の糖はＮ−アセチルノイラミニン酸（シアル酸と
呼ばれる）である。シアル酸は通常はＮ結合オリゴ糖及びＯ結合オリゴ糖の双方
の末端残基を形成し、負の電荷を有しているのでグリコシル化化合物に酸性の特
性を与える。（１つまたは複数の）このような部位が本発明化合物のリンカーに
取込まれ、好ましくはポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞（例えばＣＨＯ
、ＢＨＫ、ＣＯＳのような哺乳動物の細胞）によってグリコシル化される。しか
しながら、このような部位は当業界で公知の合成手順または半合成手順によって
更にグリコシル化され得る。

【００８４】その他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基
またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中のイオウ原子の酸
化、リシン側鎖、アルギニン側鎖及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメ
チル化がある。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ
＆Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）。

【００８５】また、本発明化合物をＤＮＡレベルで変異させてもよい。化合物のいずれかの
部分のＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞に対する適合性が改善されたコドンに
変更し得る。例えば、好ましい宿主細胞である大腸菌の場合、最適化されたコド
ンは当業界で公知である。制限部位を除去するため、または、選択された宿主細
胞中のＤＮＡのプロセシングを支援するサイレント制限部位を含ませるためにコ
ドンを置換してもよい。ビヒクル、リンカー及びペプチドのＤＮＡ配列を上記の
配列変異のいずれかを含むように修飾してもよい。

【００８６】製造方法本発明化合物の多くは、組換えＤＮＡ技術を使用して形質転換宿主細胞中で製
造し得る。このために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を作製する。こ
のようなＤＮＡ分子の作製方法は当業界で公知である。例えば、ペプチドをコー
ドする配列を適当な制限酵素を使用してＤＮＡから切出してもよい。あるいは、
ホスホラミデート法のような化学合成技術を使用してＤＮＡ分子を合成してもよ
い。また、これらの技術を併用してもよい。

【００８７】本発明はまた、適正な宿主中でペプチドを発現させ得るベクターを包含する。
ベクターは、適正な発現調節配列に作動可能に連結されたペプチドをコードする
ＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前または挿入した後にこの
ような作動可能な連結を生じさせる方法は公知である。発現調節配列としては、
プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、開始シグ
ナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び、転写
または翻訳の調節に関与するその他のシグナルがある。

【００８８】得られたＤＮＡ分子含有ベクターを使用して適正な宿主を形質転換させる。こ
の形質転換は当業界で公知の方法で行うとよい。

【００８９】本発明を実施するために、入手可能な多くの公知宿主細胞のいずれかを使用す
るとよい。特定宿主の選択は、当業界で認識されている多くの要因に左右される
。これらの要因の例は、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によっ
てコードされたペプチドの毒性、形質転換速度、ペプチドの回収容易性、発現特
性値、生体安全性及びコストである。特定のＤＮＡ配列を発現するために必ずし
も全部の宿主が同等に有効ではないことを理解した上でこれらの要因の均衡をは
かることが必要である。上記のような一般的指針に沿って使用し得る微小な生物
宿主は、細菌（例えば大腸菌種）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種
）及びその他の真菌類、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）の細胞培養物また
は当業界で公知のその他の宿主である。

【００９０】次に、形質転換細胞を培養し、精製する。所望の化合物が発現されるように宿
主細胞を慣用の発酵条件下で培養するとよい。このような発酵条件は当業界で公
知である。最後に、当業界で公知の方法によってペプチドを培養物から精製する
。

【００９１】また、化合物を合成法によって製造してもよい。例えば、固相合成技術を使用
し得る。適当な技術は当業界で公知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３）
，Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａ
ｎｎｉｓａｎｄＰａｎａｙｏｔｉｓｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（
１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら（１
９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ
ａｎｄＹｏｕｎｇ（１９６９），ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら（１９７６
），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）２：１０５−２５３；及びＥ
ｒｉｃｋｓｏｎら（１９７６），ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄｅｄ．）
２：２５７−５７２に記載された技術がある。固相合成は、最も費用効果的な小
ペプチドの製造方法なので、個別ペプチドの好ましい製造技術である。

【００９２】誘導体化されたペプチドを含有するかまたは非ペプチド基を含有する化合物は
公知の有機化学技術によって合成し得る。

【００９３】化合物の用途本発明化合物は、上述のようにラミニン、エキスタチン、インテグリンのアン
タゴニスト、細胞／接着因子アンタゴニスト、当業界で公知のセレクチンアンタ
ゴニストとなる用途を有している。より特定的には、本発明化合物は以下の病態
の治療に有用である：・血小板凝集阻害のような凝集阻害によって有効に治療される病態；・血管新生の阻害によって有効に治療される病態（例えば、腫瘍増殖、腫瘍転
移）；・炎症性自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎）；・種々の形態の骨粗鬆症、例えば： −原発性骨粗鬆症； −閉経後及び加齢関連の骨粗鬆症； −内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、上皮小体機能亢進症、クッシング
症候群、末端肥大症）； −遺伝性形態及び先天性形態の骨粗鬆症（例えば、骨形成不全症、ホモシス
チン尿症、メンクス症候群及びライリー・デイ症候群）； −末端固定化による骨粗鬆症： −血色素症、高プロラクチン症、神経性食欲不振、甲状腺中毒症、真性糖尿
病、腹腔病、炎症性腸疾患、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ様関節炎、強直性脊
椎炎、多発性骨髄腫、リンパ増殖性疾患、全身性肥満細胞症のような別の疾患に
続発する骨粗鬆症； −外科手術（例えば、胃切除）、または、化学療法、抗痙攣療法、免疫抑制
療法、凝固防止療法のような薬物療法に続発する骨粗鬆症；など。

【００９４】治療的用途に加えて、本発明化合物は、本発明化合物の結合対象タンパク質の
機能不全を特徴とする疾患の診断に有用である。１つの実施態様では、活性化さ
れ得る結合対象タンパク質（例えば受容体）を生物サンプル中で検出する方法が
、（ａ）サンプルを本発明化合物に接触させる段階と、（ｂ）結合対象タンパク
の活性化を化合物によって検出する段階と、を含む。生物サンプルは、組織標本
、完全細胞またはその抽出物である。本発明化合物は、生物サンプル中で本発明
化合物の結合対象タンパク質の存在を検出するための診断用キットの一部として
使用し得る。このようなキットは、検出可能ラベルが付着された本発明化合物を
使用する。

【００９５】医薬組成物概論本発明はまた、本発明化合物を医薬組成物として使用する方法を提供する。こ
のような医薬組成物は、注射によって投与されるか、または、経口、肺内、鼻腔
内、経皮またはその他の投与形態で投与され得る。一般に、本発明は、有効量の
本発明化合物を医薬として許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジ
ュバント及び／または担体と共に含む医薬組成物を包含する。このような組成物
は様々な濃度、ｐＨ及びイオン強度のバッファ（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸塩
、リン酸塩）から成る希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、トゥイーン８
０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸
ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソール、ベンジルアルコール）及び増量
（嵩上げ）用物質（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤を含み
、これらは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒状
調製物またはリポソームに取込まれている。また、ヒアルロン酸も使用でき、ヒ
アルロン酸は循環中の持続時間の延長を促進する効果を有している。このような
組成物は本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎｖｉｖｏ
放出速度及びｉｎｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすことができる。例
えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃ
ｅｓ，１８ｔｈｅｄ．（１９９０，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．
，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）ｐｐ．１４３５−１７１２参照。該文献は
参照によって本発明に含まれるものとする。組成物は液体形態で製造されてもよ
く、または、凍結乾燥形態のような乾燥粉末であってもよい。また、経皮製剤の
ような留置可能な持効性製剤も考えられる。

【００９６】経口剤形本発明では経口固体剤形の使用が考察されている。この剤形に関してはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９９
０），１８ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．Ｅａｓｔｏ
ｎＰＡ１８０４２の８９章に概説されている。該文献は参照によって本発明
に含まれるものとする。固体剤形には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤ま
たは菱形ドロップ剤、カシェ剤またはペレット剤がある。また、リポソームまた
はプロテイノイドの被包を本発明組成物の製剤化に使用してもよい（例えば、プ
ロテイノイド微小球は米国特許第４，９２５，６７３号に記載されている）。リ
ポソーム被包を使用でき、リポソームを種々のポリマーによって誘導体化し得る
（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療薬の可能な固体剤形に関す
る記載は、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓによって編纂された
Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．，ＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７
９）の１０章に見られる。該文献は参照によって本発明に含まれるものとする。
製剤は一般に、本発明化合物と、生物活性物質を胃内の環境から保護し腸内で放
出させ得る不活性成分とを含むであろう。

【００９７】上記のような本発明化合物の経口剤形についてより詳細に考察する。必要なら
ば、経口デリバリーが効率よく行われるように化合物を化学的に修飾してもよい
。一般に、考察される化学的修飾は、（ａ）タンパク質分解を阻害でき、（ｂ）
胃または腸から血流に吸収され得る少なくとも１つの部分を化合物分子自体に付
着させることである。また、化合物の全体的安定性及び体内循環時間の延長も望
まれる。共有結合的に付着された本発明のビヒクルとして有用な部分もこの目的
に使用し得る。このような部分の例は、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレ
ングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンである。例えば、
ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉａｎｄＤａｖｉｓ，ＳｏｌｕｂｌｅＰｏｌｙｍｅｒ −ＥｎｚｙｍｅＡｄｄｕｃｔｓ，ＥｎｚｙｍｅｓａｓＤｒｕｇｓ（１９８
１），ＨｏｃｅｎｂｅｒｇａｎｄＲｏｂｅｒｔｓ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ３６７−８３；Ｎｅ
ｗｍａｒｋら（１９８２），Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−９参
照。使用できる別のポリマーはポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３６
−チオキソカンである。上記に指摘したような医薬用途に好ましい部分はＰＥＧ
部分である。

【００９８】経口デリバリー剤形の場合にはまた、本発明の治療用化合物の吸収を増進する
担体としてＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリ
ウム（ＳＮＡＣ）のような修飾された脂肪アミノ酸の塩を使用することも可能で
ある。ＳＮＡＣを使用するヘパリン製剤の臨床効率は、ＥｍｉｓｐｈｅｒｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行われたフェーズＩＩ試験で証明された。米国
特許第５，７９２，４５１号“Ｏｒａｌｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｃｏｍ
ｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｔｈｏｄｓ”参照。

【００９９】本発明化合物は粒度約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態の微細多粒子として
製剤中に含有され得る。また、カプセル投与するための物質は粉末、軽度に圧縮
したプラグまたは錠剤の形態に製剤化され得る。治療薬は圧縮によって製造し得
る。

【０１００】着色剤及び香味剤はすべて使用し得る。例えば、タンパク質（または、誘導体
）を（例えばリポソームまたは微小球の被包によって）製剤化し、更に、着色剤
及び香味剤を含有する清涼飲料のような食品に含有させてもよい。

【０１０１】本発明化合物を不活性材料によって希釈または増量してもよい。これらの希釈
剤としては、糖質類、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セ
ルロース、スクロース、改質デキストラン及び澱粉がある。また、三リン酸カル
シウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムのようなある種の無機塩を充填剤
として使用してもよい。市販の希釈剤の幾つかの例としては、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ
、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅ
ｌｌがある。

【０１０２】固体剤形に製剤化された治療薬は崩壊剤を含有し得る。崩壊剤として使用され
る材料の非限定例は、澱粉を基材とする市販の崩壊剤Ｅｘｐｌｏｔａｂのような
澱粉である。グリコール酸ナトリウム澱粉、アンバーライト、カルボキシメチル
セルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチ
ン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベント
ナイトなどはすべて使用し得る。別の形態の崩壊剤は不溶性カチオン交換樹脂で
ある。粉末ガムは崩壊剤及び結合剤として使用できる。これらの例は寒天、カラ
ヤゴムまたはトラガカントゴムのような粉末ガムである。アルギン酸及びそのナ
トリウム塩も崩壊剤として有用である。

【０１０３】結合剤は、治療用物質を相互保持して硬質錠剤を形成するために使用され、ア
ラビアゴム、トラガカントゴム、澱粉及びゼラチンのような天然物質由来の材料
から成る。その他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）
及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）がある。ポリビニルピロリドン（Ｐ
ＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の双方は治療薬を
顆粒化するためにアルコール溶液中で使用できる。

【０１０４】製剤化プロセス中の粘着を防止するために治療用製剤に摩擦防止剤が含まれて
もよい。潤滑剤は治療薬とダイ壁面との間の層として使用してもよく、これらの
非限定例は、ステアリン酸とそのマグネシウム塩及びカルシウム塩、ポリテトラ
フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及びロウである。また
、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエ
チレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００のような可溶性潤
滑剤も使用し得る。

【０１０５】製剤化中の薬物の流動性を改善し圧縮中の再配列を促進する滑沢剤も添加し得
る。滑沢剤としては澱粉、タルク、熱分解法シリカ及び水和シリコアルミネート
がある。

【０１０６】水性環境中の本発明化合物の溶解を助けるために、湿潤剤として界面活性剤を
添加してもよい。界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルス
ルホコハク酸ナトリウム及びジオクチルスルホン酸ナトリウムのようなアニオン
性界面活性剤がある。カチオン性界面活性剤を使用してもよく、その例はベンズ
アルコニウムクロリドまたはベンズエトニウムクロリドである。製剤中に界面活
性剤として含ませることができる有力な非イオン性界面活性剤としては、ラウロ
マクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素
化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グルセロール、ポリソルベー
ト４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及
びカルボキシメチルセルロースがある。これらの界面活性剤はタンパク質または
誘導体の製剤中に単独でまたは種々の割合の混合物として存在し得る。

【０１０７】また、化合物の吸収を増進させる添加剤を製剤中に含有させてもよい。この特
性を潜在的に有している添加剤は例えばオレイン酸、リノール酸及びリノレン酸
のような脂肪酸である。

【０１０８】調節放出型の製剤が望ましいこともあろう。拡散または浸出メカニズムによっ
て物質を放出し得る不活性マトリックス例えばガムに本発明化合物を取込ませる
とよい。また、アルギン酸塩、多糖のようなゆっくりと分解するマトリックスを
製剤に取込ませてもよい。本発明化合物の別の調節放出形態はＯｒｏｓ治療系（
ＡｌｚａＣｏｒｐ．）に基づく方法によって得られる。即ち、水を侵入させ浸
透圧作用によって単一の小開孔から薬物を押し出すことができる半透膜で薬物を
包囲する。ある種の腸溶性コーティングも放出遅延効果を有している。

【０１０９】製剤に別のコーティングも使用し得る。これらのコーティングは、コーティン
グパンで塗布できる様々な糖から成る。治療用物質はまたフィルムコーティング
錠として与えられてもよく、この場合に使用される材料は２つのグループに分け
られる。第一グループは非腸溶性材料であり、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ−エチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ナトリ
ウムカルボキシ−メチルセルロース、プロビドン及びポリエチレングリコール類
である。第二グループは腸溶性材料から成り、例えば、常用のフタル酸エステル
類である。

【０１１０】最適なフィルムコーティングを得るために材料ミックスを使用してもよい。フ
ィルムコーティングの形成はパンコーターまたは流動床中で行われてもよく、圧
縮コーティングによって行われてもよい。

【０１１１】肺デリバリー形態本文中では本発明タンパク質（またはその誘導体）の肺デリバリーも考察する
。タンパク質（または誘導体）は吸入しながら哺乳動物の肺にデリバリーされ、
肺の上皮性内膜を透過して血流に入る。（肺デリバリーに関する別の研究は、Ａ
ｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５−９；Ａｄｊｅｉ
ら（１９９０），Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ６３
：１３５−４４（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：ｓ．１４
３−１４６（エンドテリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら（１９８９），ＡｎｎａｌｓＩｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６−１２（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔ
ｈら，（１９８９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１
−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎら（Ｍａｒｃｈ１９９０），“Ａｅｒｏｓ
ｏｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＩＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ
（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）、Ｐｌａｔ
ｚら、米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）に報告され
ている）。

【０１１２】治療薬品を肺にデリバリーするように設計された多様な機械的デバイスが本発
明を実施するために使用できると考えられる。これらのデバイスの非限定例は、
ネブライザー、計量薬用量吸入器、粉末吸入器であり、当業者はこれらの全部に
ついて熟知している。本発明の実施に適当な市販デバイスの幾つかの特定例は、
Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製
のＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；ＭａｒｑｕｅｓｔＭｅｄｉｃａｌＰｒ
ｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ製のＡｃｏｒｎＩＩネ
ブライザー；ＧｌａｘｏＩｎｃ．，ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰ
ａｒｋ，ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ製のＶｅｎｔｏｌｉｎ計量薬用量吸入器
；ＦｉｓｏｎｓＣｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製
のＳｐｉｎｈａｌｅｓ粉末吸入器である。

【０１１３】このような全てのデバイスで使用するためには、本発明化合物が計量供給に適
した製剤の形態でなければならない。典型的には、各製剤が使用デバイス型に特
異的であり、治療に有用な希釈剤、アジュバント及び／または担体に加えて適正
な噴射用物質の使用が含まれるであろう。

【０１１４】肺の末端まで極めて有効にデリバリーするためには、本発明化合物を平均粒度
１０μｍ（またはミクロン）未満、極めて好ましくは０．５−５μｍの微粒形態
に調製するのが最も有利であろう。

【０１１５】医薬として許容される担体は、トレハロース、マンニトール、キシリトール、
スクロース、ラクトース及びソルビトールのような糖質である。製剤に使用され
るその他の成分としては、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣがある。
天然または合成の界面活性剤を使用し得る。（タンパク質または類似体を誘導体
化する目的以外で）ＰＥＧを使用し得る。シクロデキストランのようなデキスト
ランを使用し得る。胆汁酸及びその他の類縁のエンハンサーを使用し得る。セル
ロース及びセルロース誘導体を使用し得る。バッファ製剤（ｂｕｆｆｅｒｆｏ
ｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に使用するようなアミノ酸を使用し得る。

【０１１６】また、リポソーム、マイクロカプセル、微小球、包接複合体またはその他の形
態の担体を使用することも考えられる。

【０１１７】ジェット式または超音波式のネブライザーで使用するのに適した製剤は典型的
には、溶液１ｍＬあたり約０．１−２５ｍｇの生物活性タンパク質を含む濃度で
水に溶解した本発明化合物から成る。製剤はまた、バッファ及び単糖を（例えば
、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節のために）含み得る。ネブライザー用製
剤は更に、エアロゾル形成中の溶液の噴霧化を原因としてタンパク質の凝集が表
面に誘発されることを抑制または防止するために界面活性剤を含有している。

【０１１８】計量薬用量吸入デバイスによって使用される製剤は一般に、界面活性剤の支援
によって噴射剤中に懸濁した本発明化合物を含有する微細粉末から成る。噴射剤
は噴射目的に使用されるいかなる慣用の物質でもよく、例えば、クロロフルオロ
カーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボンがあり、ま
た、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフ
ルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンのような炭化水素
、または、それらの組合せがある。適当な界面活性剤としては、ソルビタントリ
オレエート及び大豆レシチンがある。また、オレイン酸も界面活性剤として有用
であろう。

【０１１９】粉末吸入デバイスから吐出される製剤は、本発明化合物を含有する乾燥微細粉
末を含み、更に、ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレ
ハロースまたはキシリトールのような増量剤を、デバイスから粉末が容易に分散
できる量、例えば、製剤の５０−９０重量％の量で含有し得る。

【０１２０】鼻腔内デリバリー形態本発明化合物の鼻腔内デリバリーも考えられる。鼻腔内デリバリーでは、治療
薬品が鼻孔に投与された後、タンパク質が血流中に直接流入できるので、薬品が
肺に沈積する必然性がない。鼻腔内デリバリー用製剤はデキストランまたはシク
ロデキストランを含む。別の粘膜を通って輸送するデリバリーも考えられる。

【０１２１】口腔内デリバリー形態本発明化合物の口腔内デリバリー形態も考えられる。種々のペプチドに関する
口腔内デリバリー用製剤は当業界で公知である。

【０１２２】投与用量上述の病態の治療方法で使用する投与計画は、薬物の作用を変更する種々の要
因、例えば、患者の年齢、病態、体重、性別及び食事、感染の重篤度、投与時間
及びその他の臨床的要因を考慮して主治医が決定するであろう。計画される１日
あたりの用量は、一般に体重１ｋｇあたり０．１−１，０００μｇ、好ましくは
０．１−１５０μｇ／ｋｇの範囲でなければならない。

【０１２３】特定の好ましい実施態様本発明の発明者らはビヒクルに結合した種々のペプチド配列を有する好ましい
分子を考察している。例えば、好ましい分子は以下の配列を含み得る：Ｆ１−Λ−ＹＩＧＳＲ−Λ−ＲＧＤ（配列番号：９５）ＹＩＧＳＲ−Λ−ＲＧＤ−Λ−Ｆ１（配列番号：９６）。ここに“Ｆ^１”は本文中で前述したようなＦｃドメインであり、“Λ”は本文中
で前述したようなリンカーである。

【０１２４】本発明のすべての化合物は１９９９年１０月２２日出願の国際特許出願ＷＯ９
９／２５０４４に記載の方法によって製造できる。該特許出願の記載内容全部が
参照によって本発明に含まれるものとする。

【０１２５】次に本発明を以下の処理実施例によって更に詳細に説明する。これらの実施例
は限定例でなく代表例である。以下の処理実施例中のすべての情報は処理及びア
ッセイを含めて本発明の範囲内の別の化合物に適応する。

【０１２６】実施例１エキスタチンＦｃ−ペプチド構築物の作製エキスタチンをコードする合成遺伝子を５グリシンリンカーを介してヒトＩｇ
Ｇ１分子のＦｃ部分のＣ末端にＰＣＲによって融合させた。２段階ＰＣＲ反応の
エキスタチン鋳型を形成するために以下のオリゴヌクレオチドを使用した（Ｊａ
ｙａｒａｍａｎＫ，ＰｕｃｃｉｎｉＣＪ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
１９９２，Ｍａｒ；１２（３）：３９２−３９８。一方の鎖だけを表すオリゴヌ
クレオチドの組立を含むＰＣＲによる遺伝子合成戦略）。

【０１２７】

【化３】

【０１２８】以下に示す架橋用オリゴヌクレオチドを使用して一本鎖鋳型を組立てた：

【０１２９】

【化４】

【０１３０】この鋳型混合物を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ処理
した：

【０１３１】

【化５】

【０１３２】構築物のＦｃ部分は、Ａｍｇｅｎ菌株＃３７２８（２０００年５月４日公開の
ＷＯ００／２４７７０参照）を鋳型として以下のオリゴヌクレオチドプライマー
を使用するＰＣＲによって得られた：

【０１３３】

【化６】

【０１３４】オリゴヌクレオチド２３０５−２６及び２３０５−２７は完全に相補的であり
、外部プライマー１２１６−５２及び２３０４−５１を使用する第三の反応で上
記ＰＣＲ産物を組合せることによって２つの遺伝子を正しい読み枠で相互に融合
させ得る。最後のＰＣＲ遺伝子産物（全長融合遺伝子）を制限エンドヌクレアー
ゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１（後述）に結
合させ、電気穿孔によってコンピテント大腸菌株２５９６（ＧＭ２２１、本文中
に記載）を形質転換させた。組換えタンパク質産物の産生能力及び正しいヌクレ
オチド配列をもつ融合遺伝子の有無に基づいてクローンをスクリーニングした。
１つのこのようなクローンを選択し、Ａｍｇｅｎ菌株＃４５９２と命名した。

【０１３５】得られた融合タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号：１０８）及びアミノ
酸配列（配列番号：１０９）を以下に示す。

【０１３６】

【化７】

【０１３７】大腸菌中の発現大腸菌ＧＭ２２１中のＦｃ−エキスタチン融合構築物の培養物をルリアブイヨ
ン培地中、３７℃で増殖させた。合成オートインデューサーＮ−（３−オキソヘ
キサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを培養培地に最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ
まで添加した後でｌｕｘＰＲプロモーターから遺伝子産物発現が誘発された。培
養物を３７℃で更に３時間インキュベートした。３時間後、細菌培養物中の封入
体の存在を鏡検によって観察し、次いで細菌培養物を遠心によって収集した。誘
発された培養物中で不応性の封入体が観察された。これは、融合タンパク質が大
腸菌に不溶性の画分中で産生された可能性が大きいことを表す。１０％β−メル
カプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファに再懸濁させるこ
とによって細胞ペレットを直接溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にクーマシーブルーで鮮やかに染色された適正分子量の
バンドが観察された。

【０１３８】ｐＡＭＧ２１発現プラスミドｐＡＭＧ２１はＡｍｇｅｎの発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（
ＡＴＣＣ＃６９５７６）に由来し、該ベクターは米国特許第４，７１０，４７３
号に記載されたＡｍｇｅｎの発現ベクター系に由来する。ｐＣＦＭ１６５６プラ
スミドは、（米国特許第４，７１０，４７３号に）記載されたｐＣＦＭ８３６プ
ラスミドから以下の処理によって得られる：（ａ）Ｔ４ポリメラーゼ酵素で末端を埋め戻し、次いで平滑末端を結合すること
によって２つの内在性ＮｄｅＩ制限部位を破壊する；（ｂ）合成ＰＬプロモーターを含む非反復のＡａｔＩＩ制限部位とＣｌａＩ制限
部位との間のＤＮＡ配列をＰＬプロモーター（後出の配列番号：１１０参照）を
含むｐＣＦＭ６３６（米国特許第４，７１０，４７３号）から得られた同様のフ
ラグメントによって置換する；及び、（ｃ）非反復のＣｌａＩ制限部位とＫｐｎＩ制限部位との間の短いＤＮＡ配列を
配列番号：１１１に示す配列を有するオリゴヌクレオチドによって置換する。

【０１３９】

【化８】

【０１４０】次に、ＰＣＲオーバーラップオリゴの突然変異誘発及びＤＮＡ配列の置換によ
って一連の部位特異的塩基変化を生じさせることによってｐＣＦＭ１６５６から
発現プロモーターｐＡＭＧ２１が得られる。プラスミド複製プロモーターＰｃｏｐＢの５′に直接に隣接するＢｇｌＩＩ部位（プロモーターｂｐ＃１８０）を起
点としてプラスミド複製遺伝子の方向で以下の表７に示すような塩基対の変化が
生じる。

【０１４１】

【表７】

【０１４２】非反復のＡａｔＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中の＃４３６４位）制限部位とＳａｃＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６中の＃４５８５位）制限部位との間のＤＮＡ配列を以下
に示すＤＮＡ配列（配列番号：１１２）によって置換する。

【０１４３】

【化９】

【０１４４】この置換ＤＮＡ配列の付着末端の結合中に、外部のＡａｔＩＩ部位及びＳａｃＩＩ部位が破壊される。置換ＤＮＡ中に非反復のＡａｔＩＩ部位及びＳａｃＩＩ
部位が存在する。

【０１４５】ＧＭ２２１（Ａｍｇｅｎ＃２９５６）Ａｍｇｅｎ宿主菌株＃２５９６はＡｍｇｅｎ菌株＃３９３に由来する大腸菌Ｋ
−１２株である。これは初期ｅｂｇ領域に感熱性ラムダリプレッサーｃＩ８５７
ｓ７を含み、後期ｅｂｇ領域（６８分）にｌａｃＩ^Ｑリプレッサーを含むように
修飾されている。これらの２つのリプレッサー遺伝子が存在するのでこの宿主を
多様な発現系に使用できるが、これらのリプレッサーの双方はｌｕｘＰ_Ｒからの
発現には適していない。形質転換されない宿主は抗生物質抵抗性を全く有してい
ない。

【０１４６】ｃＩ８５７ｓ７遺伝子のリボソーム結合部位は強化ＲＢＳを含むように修飾さ
れていた。これを、ｅｂｇ介在配列の欠失したｅｂｇオペロンのＧｅｎｂａｎｋ
登録番号Ｍ６４４４１ＧｂＢａのヌクレオチド１１７０位と１４１１位との間
に挿入した。インサートの配列を以下に示す。下側の小文字は以下のインサート
（配列番号：１１３）にフランキング（隣接）するｅｂｇ配列を表す。

【０１４７】

【化１０】

【０１４８】ＭＭｅｂｇ−ｃＩ８５７ｓ７ｅｎｈａｎｃｅｄＲＢＳ＃４と名付けた組換えフ
ァージを使用して構築物をＦ′ｔｅｔ／３９３の染色体に移入した。組換え及び
再溶解の後で上記の染色体インサートだけが細胞中に残存する。これを新たにＦ
′ｔｅｔ／ＧＭ１０１と命名した。次に、ｅｂｇ介在配列の欠失したｅｂｇオペ
ロンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ６４４４１ＧｂＢａのヌクレオチド２４９３
０位と２９３７位との間にｌａｃＩ^Ｑを移入することによってＦ′ｔｅｔ／ＧＭ
１０１を修飾した。インサートの配列を以下に示す。下側の小文字は以下のイン
サート（配列番号：１１４）にフランキング（隣接）するｅｂｇ配列を表す。

【０１４９】

【化１１】

【０１５０】ＡＧｅｂｇ−ＬａｃＩＱ＃５と名付けた組換えファージを使用して構築物をＦ
′ｔｅｔ／ＧＭ１０１の染色体に移入した。組換え及び再溶解の後で上記の染色
体インサートだけが細胞中に残存する。これを新たにＦ′ｔｅｔ／ＧＭ２２１と
命名した。ＬＢ中で２５μｇ／ｍｌの濃度のアクリジンオレンジを使用して菌株
からＦ′ｔｅｔエピソームを除去した。除去した菌株をテトラサイクリン感受性
として同定し、ＧＭ２２１として保存した。

【０１５１】ビトロネクチンの精製Ｙａｔｏｈｇｏら（１９８８）Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．１３：２８１−９
２によって記載された方法に修正を加えた方法で古いヒト血漿からビトロネクチ
ンを調製した。クエン酸塩管に収集した正常なヒト血液を遠心し、ＣａＣｌ_２を
加えて一夜凝固させた。血餅を遠心し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、１
０ｍＭのＮａＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１３ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．７で
平衡させたヘパリンセファロースカラムに導入した。カラム通過液を単一プール
として収集し、尿素を最終濃度８Ｍまで加えて、一夜撹拌した。次に、１０ｍＭ
のＮａＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、８Ｍの尿素，ｐＨ７．７（バッファＡ）で平
衡させたヘパリンセファロースカラムと共にサンプルを一夜インキュベートした
。遠心によってヘパリンセファロースを液体から分離し、バッファＡ、バッファ
Ａ＋０．１３ＭのＮａＣｌ及びバッファＡ＋０．１３ＭのＮａＣｌと１０ｍＭの
ＢＭＥとをそれぞれ用いて１回ずつ洗浄した。バッファＡ＋０．５ＭのＮａＣｌ
によってビトロネクチンをカラムから溶出させた。ビトロネクチンを含有する画
分をＰＢＳにバッファ交換し、−７０℃で保存した。

【０１５２】ビトロネクチン及びフィブリノーゲンのルテニレーション精製したヒトビトロネクチンまたは精製したヒトフィブリノーゲン（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ）を５０ｍＭのホウ酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ８．０に透
析した。ルテニウム（ＩＩ）トリスビピリジンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（ＯｒｉｇｅｎＴＡＧ^ＲＴＭＥｓｔｅｒ，ＩｇｅｎＩｎｃ．Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の予製液を、１５０μｇのＯｒｉｇｅｎＴＡＧ−
ＮＨＳエステルに５０μＬのＤＭＳＯを添加することによって新しく調製した。
２５℃で１時間のインキュベーション後、５０μＬの２Ｍグリシンを加えて反応
を停止させた。取込まれなかったルテニウム及び余剰のグリシンをＰＢＳ、０．
０５％ＮａＮ_３に透析することによって除去した。Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡ（Ｐｉｅ
ｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してタンパク質濃度を測定した。Ｏｒ
ｉｇｅｎＴＡＧの取込みを４５５ｎｍ（ｅ＝１３，７００Ｍ^−１ｃｍ^−１）で
評価した。ビトロネクチン−Ｒｕ及びフィブリノーゲン−Ｒｕを必要になるまで
−７０℃で保存した。

【０１５３】血小板フィブリノーゲン受容体αＩＩｂβ３の精製１２単位の古い血小板をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、低速遠
心して赤血球（ＲＢＣ）を除去した。洗浄した血小板を２０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ，ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのペファ
ブロック、３％のオクチルグルコシド中に穏やかに撹拌しながら４℃で２時間維
持することによって溶解させた。溶解液を１００，０００×ｇで１時間遠心する
と不溶性の細胞破片がペレット化した。得られた上清をレンズ豆レクチン（ＥＹ
ｌａｂｓ）カラムに導入し、１％のオクチルグルコシド（結合用バッファ）を
含有する溶解バッファによって安定なＵＶ基線量に達するまで洗浄した。１０％
のデキストロースを含有する結合用バッファによって精製αＩＩｂβ３をカラム
から溶出させた。精製αＩＩｂβ３を必要になるまで−７０℃で保存した。

【０１５４】 αｖβ３及びαｖβ５の精製凍結した胎盤を４℃で一夜解凍し、１ｃｍの切片に裁断し、５０ｍＭのトリス
−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ，ｐＨ７．５（バッファＡ
）で洗浄した。次に３％（ｗ／ｖ）のオクチルグルコシドを加えたバッファＡ中
で胎盤を一夜インキュベートした。抽出したタンパク質を遠心によって全組織か
ら分離した。抽出物を次に０．４５μｍのフィルターで濾過し、ＮａＮ_３を最終
濃度０．０２％まで添加した。次にサンプルを抗αｖβ３または抗αｖβ５アフ
ィニティカラムに充填し、１％（ｗ／ｖ）のオクチルグルコシドを加えたバッフ
ァＡで洗浄し、ＧｅｎｔｌｅＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ^ＲＴＭ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ）で溶出させた。αｖβ３またはαｖβ５を含有する画分を１％のオクチル
グルコシドを加えたバッファＡに交換し、−７０℃で保存した。また、精製αｖ
β３またはαｖβ５はまたＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩ
ｎｃ．から購入した。

【０１５５】常磁性ビーズ上のαｖβ３、αｖβ５またはαＩＩｂβ３の取込み αｖβ３、αｖβ５またはαＩＩｂβ３をコートした常磁性ビーズを非コート
の４．５μのＤｙｎａｂｅａｄｓ^ＲＴＭ（Ｄｙｎａｌ^ＲＴＭＬａｋｅＳｕｃ
ｃｅｓｓ，ＮＹ）から調製した。非コートのＤｙｎａｂｅａｄｓ^ＲＴＭをリン酸
塩緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、５０ｍＭのトリス−Ｈ
Ｃｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＣａＣｌ_２及び１
ｍＭのＭｎＣｌ_２，ｐＨ７．５（バッファＡ）に再懸濁させた。精製した受容体
αｖβ３、αｖβ５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）またはαＩＩｂβ３を速やかにバッフ
ァＡに希釈し、非コートのＤｙｎａｂｅａｄｓ^ＲＴＭに１０^７ビーズあたり５０
μｇのタンパク質の割合で添加した。ビーズ懸濁液を４℃で撹拌しながら一夜イ
ンキュベートした。ビーズをバッファＡ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ
）で３回洗浄し、バッファＡ＋３％ＢＳＡに再懸濁させた。４℃で３時間維持し
た後、ビーズをバッファＡ、１％ＢＳＡ、０．０５％アジドで３回洗浄し、必要
になるまで−７０℃で保存した。

【０１５６】固相結合アッセイ全部の化合物を１００％ＤＭＳＯに溶解し系列希釈した後、ビトロネクチン−
Ｒｕまたフィブリノーゲン−Ｒｕ及び適正なインテグリンをコートした常磁性ビ
ーズを含有するアッセイバッファＡ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、
１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ_２、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１％ＢＳＡ
、０．０５％のトゥイーン−２０）に最終希釈した。アッセイ混合物を２５℃で
撹拌しながら２時間インキュベートし、次いでＯｒｉｇｅｎＡｎａｌｙｚｅｒ^ＲＴＭ（ＩｇｅｎＩｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で読み取った。
１μＭのビトロネクチン、１μＭのフィブリノーゲンまたは５ｍＭのＥＤＴＡを
使用して非特異的結合を測定した。ＬｅｖｅｎｂｕｒｇＭａｒｑｕａｒｄｔア
ルゴニズムによる４パラメーター適合（ＸＬｆｉｔ^ＲＴＭＩＤＢｕｓｉｎｅ
ｓｓＳｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用してデータを作成した。Ｋｉ値はＣｈｅｎｇ
ａｎｄＰｒｕｓｏｆｆ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２２：３０９９−３１０８の等式を使用して計算した。

【０１５７】実施例２ラミニン−Ｆｃ融合物の製造以下のラミニン近縁ペプチドをヒトＩｇＧ１分子のＦｃ部分のＮ末端にＰＣＲ
によって融合させた。ＭＹＩＧＳＲＧＧＧＧＧ（配列番号：１１５）ＭＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲ（配列番号：１１６）ＭＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲＹＩＧＳＲ（配列番号：１１７）ＭＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳＶＧＬＭＷＷＭＬＡＲＧＧＧＧＧ（配列番号：１１８）ＭＹＩＧＳＲＲＥＤＶＥＩＬＤＶＰＤＳＧＲＧＧＧＧＧ（配列番号：１１９）ＭＲＧＤＲＧＤＹＩＧＳＲＲＧＤＧＧＧＧＧ（配列番号：１２０）これらの融合物を製造するためには、非近縁のＦｃ−ペプチド融合物（ＴＨＦ
ガンマ２−Ｆｃ）をＰＣＲ鋳型として使用した（Ａｍｇｅｎ菌株＃４４９０、２
０００年５月４日公開のＷＯ００／２４７８２に記載）。以下に与えたセンスオ
リゴヌクレオチドの各々を標準ＰＣＲ反応でアンチセンスオリゴヌクレオチド１
２００−５４と共に使用するとＦｃに対する所望ペプチドのインフレーム融合物
が得られた。

【０１５８】

【化１２】

【０１５９】ＰＣＲ遺伝子産物（全長融合遺伝子）の各々を制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、次いでベクターｐＡＭＧ２１（前述）に結合させ、
電気穿孔によってコンピテント大腸菌株２５９６（ＧＭ２２１、本文中に記載）
を形質転換させた。組換えタンパク質産物の産生能力及び正しいヌクレオチド配
列をもつ遺伝子融合物の有無に基づいてクローンをスクリーニングした。各融合
タンパク質の発現及び精製は上述の手順で行った。

【０１６０】ラミニン活性アッセイ：ＨＴ−１０８０ヒト繊維肉腫細胞のアポトーシスヒト繊維肉腫に由来のＨＴ−１０８０細胞を１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシン及び１００単位／ｍｌのペニシリンを補給したＤＭ
ＥＭ中で培養した。培養は５×１０^４細胞／プレートで開始した。種々の濃度の
Ｆｃ−ペプチド（Ｆｃ−ＹＩＧＳＲ、Ｆｃ−（ＹＩＧＳＲ）_２、ＹＩＧＳＲ−Ｆ
ｃまたは（ＹＩＧＳＲ）_２−Ｆｃ））を各プレートに加え、１６時間後に細胞を
採取して、５６０ｎｍの吸光度のクリスタルバイオレット溶液でアポトーシスを
鑑定した。また、１．５％のアガロースゲル中のアポトーシスの程度を評価する
ためにＤＮＡフラグメント化分析を行って、臭化エチジウム染色によって可視化
した。

【０１６１】実施例３追加のラミニンペプチド体（Ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）の製造本文中の表６に示した追加の２つのラミニンペプチド（ＹＩＧＳＲ）_３及び（
ＹＩＧＳＲ）_５をヒトＩｇＧ１に融合させた。得られた融合ペプチドをラミニン
−３（（ＹＩＧＳＲ）_３−Ｆｃ）及びラミニン−５（（ＹＩＧＳＲ）_５−Ｆｃ）
と命名した。精製したペプチド−Ｆｃ融合物がＨＴ１０８０細胞の増殖に与える
効果を実施例１に記載の手順で試験した。合成ペプチド（ＹＩＧＳＲ）_３のＩＣ
１００は２．９μＭであったが、（ＹＩＧＳＲ）_３−ＲｃのＩＣ１００は５５ｎ
Ｍであった。ヒトＩｇＧ１に融合後に５０倍の強化が観察された。

【０１６２】ラミニン−５中ではある程度のタンパク質分解が観察されたので、ラミニン−
５のＩＣ１００を正確に評価することはできなかった。分解はいずれもアルギニ
ン残基の後（ＹＩＧＳＲ反復配列間の接合部）で生じた。分解を排除するために
、複数の異なるペプチドを設計し、合成した。これらのペプチドの幾つかはＨＴ
１０８０細胞増殖の阻害を示した。最も優れたペプチドの２つは、ＲＥＤＶＥＩＬＤＶＹＩＧＳＲＰＤＳＧＲ（配列番号：１３６）、及び、ＹＩＧＳＲＲＥＤＶＥＩＬＤＶＰＤＳＧＲ（配列番号：１３７）であった。

【０１６３】実施例４血漿クリアランスの鑑定Ｉｏｄｏｇｅｎ法によって合成ペプチド及びＦｃ−ペプチドを^１２５Ｉでヨウ
化する。ＨＴ−１０８０細胞に対するヨウ化分子の阻害効果を非ヨウ化分子の阻
害効果から識別することはできない。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにヨウ化ペプチド／
Ｆｃ−ペプチドを静注及び皮下注射し、種々の時点で採血する。血液の放射能を
γ−カウンターで測定し、注射した分子の薬物動態プロフィルを鑑定する。

【０１６４】実施例５実験的肺転移アッセイ高度に転移性及び侵襲性のＢ１６−ＢＬ６黒色腫細胞を０．１％ＢＳＡ含有Ｍ
ＥＭ培地に浮遊させる（１．５×１０^６細胞／ｍｌ）。細胞溶液（０．１ｍｌ）
をＣ５７ＢＬ／６マウスに静注によって接種する。腫瘍接種後に複数の濃度のペ
プチド及び種々のＦｃ−ペプチドを静注する。腫瘍接種の２週または３週後にマ
ウスを殺し、肺表面のコロニーを鑑定する。

【０１６５】上記によって本発明を十分に説明した。本文中に開示したような本発明の要旨
及び範囲を逸脱しない多くの変更及び修正が当業者に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩｇＧ１抗体から誘導され得る代表的なＦｃダイマーを示す。図中の“Ｆｃ”
は本文中の“Ｆｃドメイン”に含意されるＦｃ変異体のいずれかを表す。“Ｘ^１ ”及び“Ｘ^２”は、本文中で以後に定義するようなペプチドまたはリンカー−ペ
プチド組合せを表す。個々のダイマーを以下に説明する：Ａ、Ｄ：１つのジスルフィド結合によって結合されたダイマー。ＩｇＧ１抗体は
典型的には定常ドメインと可変ドメインとの間のヒンジ領域に２つのジスルフィ
ド結合を有している。Ａ及びＤ中のＦｃドメインは、２つのジスルフィド結合部
位の欠損によって形成されるかまたはシステイニル残基を非反応性残基（例えば
アラニル）で置換することによって形成される。ＡではＦｃドメインがペプチド
のアミノ末端に結合している。ＤではＦｃドメインがカルボキシ末端に結合して
いる。Ｂ、Ｅ：２つのジスルフィド結合によって結合されたダイマー。このＦｃドメイ
ンは、Ｆｃドメイン鎖の２つのシステイニル残基を保持する親抗体の欠損によっ
て形成されるかまたはこのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築物か
らの発現によって形成される。ＢではＦｃドメインがペプチドのアミノ末端に結
合している。ＥではＦｃドメインがカルボキシ末端に結合している。Ｃ、Ｆ：非共有結合ダイマー。このＦｃドメインは欠損または置換によってシス
テイニル残基を除去することによって形成され得る。これらのシステイニル残基
と宿主細胞中に存在する別のタンパク質のシステイニル残基との反応によって不
純物が形成されることを防止するためにシステイニル残基の除去が望ましいであ
ろう。Ｆｃドメインの非共有結合はダイマーを十分に相互保持する。異なるタイプの抗体（例えばＩｇＧ２、ＩｇＭ）に由来のＦｃドメインを使用す
ることによって別のダイマーを形成してもよい。

【図２】薬理学的に活性のペプチドのタンデム反復配列を特徴とする本発明の好ましい
化合物の構造を示す。図２Ａは、一本鎖分子を示し、また分子のＤＮＡ構築物を
表す。図２Ｂは、リンカー−ペプチド部分がダイマーの１つの鎖だけに存在する
ダイマーを示す。図２Ｃは、双方の鎖にペプチド部分を有するダイマーを示す。
幾つかの宿主細胞では図２Ａに示す一本鎖をコードするＤＮＡが発現するときに
図２Ｃのダイマーが自然に形成されるであろう。別の宿主細胞では、ダイマーの
形成に有利な条件下に細胞を維持できる。または、ダイマーをｉｎｖｉｔｒｏ
で形成できる。

【図３Ａ】本発明に使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの代表的な核酸配列及びアミノ酸配列
（それぞれ配列番号：１及び２）を示す。

【図３Ｂ】本発明に使用し得るヒトＩｇＧ１Ｆｃの代表的な核酸配列及びアミノ酸配列
（それぞれ配列番号：１及び２）を示す。

【図４Ａ】Ａ及びＢは、固相結合アッセイでエキスタチン−Ｆｃがヒトαｖβ３に高い親
和性で結合することを示す。このアッセイは実施例１でより詳細に後述する。

【図４Ｂ】Ａ及びＢは、固相結合アッセイでエキスタチン−Ｆｃがヒトαｖβ３に高い親
和性で結合することを示す。このアッセイは実施例１でより詳細に後述する。

【図５Ａ】Ａ及びＢは、エキスタチン−ＦｃがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するルテニウム
標識ヒトフィブリノーゲン（フィブリノーゲン−ｒｕ）の結合を阻害することを
示す。これらの実験は実施例１でより詳細に後述する。

【図５Ｂ】Ａ及びＢは、エキスタチン−ＦｃがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対するルテニウム
標識ヒトフィブリノーゲン（フィブリノーゲン−ｒｕ）の結合を阻害することを
示す。これらの実験は実施例１でより詳細に後述する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 35/04 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 19/00 // Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者コウノ，タダヒコアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、リツキー・コート・3197 (72)発明者レイシー，デイビツド・リーアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、パセオ・ビスタ・ 614 (72)発明者ブーン，トーマス・チヤールズアメリカ合衆国、カリフオルニア・91320、ニユーベリー・パーク、デイアー・バレー・アベニユー・3010 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 CA07 CA20 DA06 EA04 FA02 GA14 GA19 4B064 AG01 CA02 CC01 CC24 CD04 DA01 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA03 BB01 BB04 BC01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 CA59 NA14 ZA542 ZA972 ZB152 ZB262 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA20 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ．インテグリン／接着因子アンタゴニストペプチドと、ｂ．ビヒクルと、を含む物質組成物。
【請求項２】式（Ｘ^１）_ａ−Ｆ^１−（Ｘ^２）_ｂ〔式中、Ｆ^１はＦｃドメインであり、Ｘ^１及びＸ^２は各々が独立に−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１、−（Ｌ^１）^ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３、及び
、−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２−（Ｌ^３）_ｅ−Ｐ^３−（Ｌ^４）_ｆ−Ｐ^４、から選択され、Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３及びＰ^４は各々が独立にインテグリン／接着因子アンタゴニス
トペプチドの配列であり、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３及びＬ^４は各々が独立にリンカーであり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各々が独立に０または１を表し、但し、ａ及びｂの
少なくとも一方が１である〕の組成物及びそのマルチマー。
【請求項３】式Ｘ^１−Ｆ^１またはＦ^１−Ｘ^２で表されることを特徴とする請求項１に記載の物質組成物。
【請求項４】式Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１で表されることを特徴とする請求項３に記載の物質組成物。
【請求項５】式Ｆ^１−（Ｌ^１）_ｃ−Ｐ^１−（Ｌ^２）_ｄ−Ｐ^２で表されることを特徴とする請求項３に記載の物質組成物。
【請求項６】Ｆ^１がＦｃドメインであることを特徴とする請求項２に記載
の物質組成物。
【請求項７】Ｆ^１がＩｇＧＦｃドメインであることを特徴とする請求項
２に記載の物質組成物。
【請求項８】Ｆ^１がＩｇＧ１Ｆｃドメインであることを特徴とする請求
項２に記載の物質組成物。
【請求項９】Ｆ^１が配列番号：２の配列を含むことを特徴とする請求項２
に記載の物質組成物。
【請求項１０】Ｘ^１及びＸ^２が配列番号：７−２１から選択される１つま
たは複数の配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の物質組成物。
【請求項１１】物質組成物が配列番号：２２−９４から選択された１つま
たは複数の配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の物質組成物。
【請求項１２】物質組成物が配列番号：７及び９−１６から選択された１
つまたは複数の配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の物質組成物。
【請求項１３】物質組成物が表３、４、５及び６（配列番号：２２−９４
、１２８−１３７）から選択された１つまたは複数の配列を含むことを特徴とす
る請求項２に記載の物質組成物。
【請求項１４】請求項６から１３のいずれか一項に記載の物質組成物をコ
ードしているＤＮＡ。
【請求項１５】請求項１４に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１６】請求項１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする請求項１６に記
載の細胞。
【請求項１８】（ａ）少なくとも１つのランダム化インテグリン／接着因
子アンタゴニストペプチドを選択する段階と、（ｂ）１つまたは複数の選択されたペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に
共有結合した少なくとも１つのＦｃドメインを含む薬理学的物質を製造する段階
と、を含む薬理学的活性化合物の製造方法。
【請求項１９】酵母に基づくスクリーニング、理論的設計、タンパク質の
構造解析、及び、ファージディスプレーライブラリー、大腸菌ディスプレーライ
ブラリー、リボソームライブラリーまたは化学的ペプチドライブラリーのスクリ
ーニングから選択された１つまたは複数の技術から成る方法によってペプチドを
選択することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】薬理学的物質の製造が、（ａ）選択されたペプチドをコードする核酸配列とＦｃドメインをコードする核
酸配列とを含む遺伝子構築物を作製する段階と、（ｂ）遺伝子構築物を発現させる段階と、によって行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】遺伝子構築物を大腸菌細胞中で発現させることを特徴とす
る請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】ＦｃドメインがＩｇＧＦｃドメインであることを特徴と
する請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】ビヒクルがＩｇＧ１Ｆｃドメインであることを特徴とす
る請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】ビヒクルが配列番号：２の配列を含むことを特徴とする請
求項１８に記載の方法。
【請求項２５】配列番号：１３２−１３７から選択されたアミノ酸配列を
含む物質組成物。